CN102321636A - 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测鸭瘟病毒抗体的gG基因重组原核表达检测抗原蛋白以及它的制备方法与应用，该抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其制备方法包括：鸭瘟病毒gG的DNA片段的获得、重组原核表达质粒pET32a-gG的获得、鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的获得三步骤；其可作为制备鸭瘟病毒抗原及亚单位疫苗运用。

Description

鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白及其制备方法与应用

技术领域

 本发明涉及基因工程，特别涉及检测鸭瘟病毒抗体的gG基因重组原核表达检测抗原蛋白以及它的制备方法。

背景技术

鸭瘟(Duck Plague, DP)，又名鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis, DVE)，是由鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV)引起鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、热性、败血性传染病。鸭瘟的临床症状为精神沉郁、高热稽留、共济失调、下痢、畏光流泪和部分病鸭头颈肿大，该病为一种嗜全身性感染的传染病，以急性败血症为主要特征。其病理剖解特征是血管损伤，组织器官出血，消化道出血、炎症和坏死，消化道粘膜某些特定部位疹状损害，淋巴器官受损以及实质器官的退行性变化。该病的流行特征是传播迅速、发病率和死亡率高，且对鸭、鹅和白天鹅易感，是水禽养殖业的一大危害。

过去对鸭瘟病毒血清抗体的检测方法主要是利用全病毒作为抗原进行检测，但传统的病毒分离鉴定方法大约需要4～5d，方法繁琐，费时费力，且纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，导致假阳性结果出现。

发明内容

发明的目的之一在于提供鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，该方法适用于大规模生产。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

A鸭瘟病毒gG的DNA片段的获得

以鸭瘟病毒毒株基因组DNA为模板对gG基因进行PCR扩增，得鸭瘟病毒 gG基因片段，与pMD18-T 的连接，得pMD18-gG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其上游引物如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，下游引物如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

B 重组原核表达质粒pET32a-gG的获得

限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD18-gG质粒和原核表达载体pET32a(+),以重组质粒为模板为模板，PCR扩增, 得重组原核表达质粒pET32a-gG；

 C 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的获得 

将步骤B所得重组原核表达质粒pET-32a-gG转化至表达菌株BL21(DE3)进行诱导表达，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

进一步，将步骤C所得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白进行亲和层析纯化，得纯化的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

 进一步，将步骤B所得重组原核表达质粒pET32a-gG转化至表达菌株BL21(DE3)，在IPTG浓度≥1.0mmol/L,诱导温度为25℃条件下进行诱导表达，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

本发明的目的之二在于提供一种重组表达蛋白，该蛋白具有鸭瘟病毒免疫原性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白，所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的目的之三在于提供鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的两种应用，其为鸭瘟病毒的检测和治疗提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案之一为：

所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗原中的应用。

进一步，所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗体捕获剂中的运用。

 本发明的另一技术方案为：

所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒疫苗中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种鸭瘟病毒抗体的检测方法，该方法操作简单，无需价格昂贵的仪器。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

运用所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白检测鸭瘟病毒抗体的方法，具体包括以下步骤：

A 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白稀释至终浓度为2.5μg/100μL，在酶标板中包被过夜，用封闭液封闭,得固相抗原；

B将待检血清作80倍体积稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

C、将所述酶标二抗作2000倍体积稀释后，与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

D、在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

E、将步骤d所述显色液用酶标仪测测OD_450nm值，待检血清的OD_450nm值＞阴性样品OD_450nm值的临界值(X+3SD)时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品OD_450nm值的均值，SD为阴性样品OD_450nm值的标准方差。

本发明鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白，是利用基因工程技术，鸭瘟病毒（DPV）gG基因完整基因片段（自起始密码子ATG前３个碱基至终止密码杂子TAA）进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌Bl21(DE3)表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是gG/His融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为70kDa，该蛋白设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性。经原核表达系统表达后的产品经Western blot进行鉴定后表面具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。

采用本发明的方法生产的产品可用于：

① 本鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白可作为检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法的检测抗原。

② 可作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。

本发明的产品优点体现在：

① 由于鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白并非全病毒，以此应用该检测抗原进行检测时无散毒危险。

② 作为ELISA抗原检测鸭瘟病毒抗体，特异性强，无交叉反应。

③ 性能稳定、生产成本低，适合工厂化生产，市场应用前景广。

附图说明

     图1为gG基因的琼脂糖凝胶电泳图; 图中M为Ｍarker，其中 ，1-A中，1为gG基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性DNA条带；1-B中，1为重组质粒pMD18-gG 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带；1-C中，1为重组表达质粒pET32a-gG用XhoⅠ单酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的一条特异性条带，2为重组表达质粒pET32a-gG用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。

    图2为鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳图，M为蛋白　　Ｍarker;2-A中，1为空载体pET-32a(+)用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果，2为空载体pET-32a(+)未用IPTG诱导，经SDS-PAGE电泳所得结果，3为重组表达质粒pET32a-gG用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果，4为重组表达质粒pET32a-gG未用IPTG诱导，经SDS-PAGE电泳所得结果，5为重组表达质粒pET32a-gG用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果，6为重组表达质粒pET32a-gG用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得沉淀进行SDS-PAGE电泳的结果；2-B中，1为25℃诱导12h条件下,对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导剂IPTG的终浓度为0 mmol/L，2为25℃诱导12h条件下,对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导剂IPTG的终浓度为0.2 mmol/L，3为25℃诱导12h条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导剂IPTG的终浓度为0.5 mmol/L，4为对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导剂IPTG的终浓度为0.8 mmol/L，5为对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导剂IPTG的终浓度为1.0 mmol/L，6为对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导剂IPTG的终浓度为1.2 mmol/L；2-C中，1为IPTG终浓度1.0mmol/L诱导12h条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导温度为37℃，2为IPTG终浓度1.0mmol/L诱导12h条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导温度为30℃，3为IPTG终浓度1.0mmol/L诱导12h条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导温度为25℃；2-D中，1为IPTG终浓度1.0mmol/L 25℃诱导条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导时间为0h，2为IPTG终浓度1.0mmol/L 25℃诱导条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导时间为2h，3为IPTG终浓度1.0mmol/L 25℃诱导条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导时间为3h，4为IPTG终浓度1.0mmol/L 25℃诱导条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导时间为4h，5为IPTG终浓度1.0mmol/L 25℃诱导条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导时间为5h，6为IPTG终浓度1.0mmol/L 25℃诱导条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导时间为6h，7为IPTG终浓度1.0mmol/L 25℃诱导条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导时间为12h。

    图3为纯化后的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳图，M为蛋白Ｍarker,其中，1为纯化前的gG基因重组原核表达蛋白，2为经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后的gG基因重组原核表达蛋白。

 

具体实施方式

      下述实施例中的稀释方式均以体积为计量单位进行稀释。

     实施例1 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备

一 材料准备

1 菌株、质粒和毒株

质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET32a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5α、表达宿主菌E.coli Bl21(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)和四甲基联苯胺（TMB）均购自美国KPL公司，羊抗鸭IgG-HRP的为冻干剂，分装为0.1mg/瓶，使用时按说明书溶解为1mL。

2 试验动物

10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性。

3 实验方法

3.1 DPV gG基因的克隆

3.1.1引物设计

利用Primer Premier5.0 软件，参考gG基因序列（GenBank登录号：EU071043），由宝生物生物技术有限公司合成。引物DPV-gG F如SEQ ID NO:３所示: 5’-ggatccggtatggcaacaatgatag-3’(划线部分为BamHⅠ 位点)；引物DPV-gG R如SEQ ID NO:４所示: 5’-ctcgagaaacacaagacacacacgtc-3’(划线部分为XhoⅠ 位点)。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20 mmol/L，-20℃保存备用。

3.1.2 DPV基因组DNA的提取

a、正常鸭胚成纤维细胞（DEF）的制作方法：取10d日龄健康鸭胚，分别用体积分数为5％碘酒和体积分数为75％酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成1mm³大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂（体积分数为2.5%胰蛋白酶）150μＬ/胚，于37℃水浴中消化3min。立即将细胞悬液以4000r/min 离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用6层纱布过滤，向滤液中加入体积分数为10％小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于100mL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37℃细胞培养箱中进行培养。

b、 DPV增殖：取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2-3mL覆盖细胞表面进行吸附，37℃吸附1h后弃病毒液，然后加含3％小牛血清和100IU/mL 双抗的MEM 维持营养液，之后37℃培养。同时做未接毒的DEF对照。

c、 DNA提取方法：直接从感染的DEF中提取DPV基因组DNA，具体步骤如下：(1)选取用DPV种毒感染后细胞病变（CPE）达80％的DEF；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500μL的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL，轻轻混匀后，37℃孵育10分钟；(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μL的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；(4)用饱和酚：氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/L NaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20℃放置30-60分钟；(6)13000r/分钟离心20分钟，沉淀用预冷的体积分数为70%的乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1μL RNA酶，37℃作用30分钟，-20℃保存备用。

 

3.1.3 PCR 扩增鸭瘟病毒 gG基因

PCR反应体系为：

轻轻混匀，2000r/分钟瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃ 5min，然后进入94℃ 50s、58℃ 50s、72℃ 90s，共30个循环，最后72℃延伸10 min，于4℃保存备用。取6μＬ PCR 产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增片段的长度。

3.1.4 鸭瘟病毒gG基因PCR产物的回收

按北京赛百盛基因技术有限公司DNA回收试剂盒说明书进行，回收后的DNA 贮存于-20℃保存备用。

3.1.5纯化的gG基因与pMD18-T 的连接

连接反应体系如下：

将上述试剂加入0.2mL 的EP 管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接过夜。

3.1.6 DH5α感受态细胞的制备

采用氯化钙法制备新鲜的DH5α株大肠杆菌感受态细胞，简述如下：(1)无菌挑取平板上新鲜培养的DH5α单克隆菌落接种于5mL LB 培养液中，于37℃振荡培养过夜；(2) 取1mL上述培养液接种于100mL LB培养液中，37℃ 200r/分钟 振荡培养2.5～3小时，使OD600=0.5左右；(3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴10min；(4)于4℃ 4000r/min离心8min，弃上清；(5)加10mL冰预冷的0.1mol/L 的CaCl₂，温和悬起细菌沉淀，冰浴30分钟；(6)于4℃ 4000r/min离心8min，弃上清，加4mL冰预冷的0.1mol/L 的CaCl₂ 再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为200μＬ/管，-4℃冰箱中保存过夜以提高转化效率。

3.1.7转化感受态细胞

将10μL 连接体系全部取出加到200μL DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟；再置于42℃温浴90秒，之后再冰浴2分钟；然后立即加入0.8mL LB 培养基，37℃水浴振荡培养45分钟，取200μL涂于含Amp的培养基上，置37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单个白色菌落接种于含Amp的 LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养18小时后进行质粒抽提。

3.1.8质粒的抽提

按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存于-20℃保存备用。

3.1.9重组质粒的PCR和酶切鉴定

将上一步抽提的重组质粒命名为pMD18-gG，分别以BamHⅠ/XhoⅠ双酶切消化与XhoⅠ单酶切消化，1.0％凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。

3.1.10 鸭瘟病毒gG基因序列测定

将鉴定正确的质粒寄送上海英骏生物有限公司进行测序。

3.2原核表达质粒pET32a-gG的构建、诱导表达与表达条件的优化

3.2.1原核表达质粒pET32a-gG的构建与鉴定

a目的片段的酶切与连接：限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD18-gG质粒和原核表达载体pET32a(+)，酶切体系均为：

37℃水浴4 h，按DNA回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照下列连接体系16℃连接过夜。

b 重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5α感受态细胞。之后，取连接液15μL加到含200μL感受态DH5α的离心管中，混匀后冰浴30分钟；置于42℃水浴90秒，然后迅速冰浴2分钟；加入不含Amp的LB液体培养基800μL，37℃振摇（150r/min）培养1-1.5 小时；取200μL培养物涂布于含Amp的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃培养 12-16小时，同时设立空载体转化组（空载体 10μL +感受态DH5α 200μL）、无载体对照组（灭菌超纯水10μＬ +感受态DH5α 200μL）。

c 重组质粒的酶切和PCR鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用XhoⅠ单酶切、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如下： 

然后，以重组质粒为模板，利用方法3.1.1中的引物进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET32a-gG。

3.2.2重组表达质粒pET32a-gG的诱导表达

a 重组质粒pET32a-gG的提取：挑取已鉴定含阳性重组质粒pET32a-gG的DH5α菌种划线接种于含Amp的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于LB液体培养基上，剧烈振荡培养10-16小时，离心收集菌液，按U1traPureTM质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。

b 重组质粒pET32a-gG转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET32a-gG转化到表达宿主菌E.coli BL21 (DE3)中。

c 重组质粒pET32a-gG的诱导表达：从上述LB固体培养基上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1:50的比例接入含Amp的LB液体培养基中，剧烈振荡培养至OD600=0.4时，分别加入IPTG诱导培养，收集1mL培养菌液，4℃ 13000r/分钟 离心2分钟，弃上清，沉淀中加入40μL超纯水和10μL 10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10分钟，进行质量分数为12%的SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

d 重组质粒pET32a-gG表达产物的可溶性分析：将诱导表达的菌液和未诱导表达的菌液，分别按下步骤处理：4℃，10000r/min 离心5min，菌体沉淀用20mL 20mmol Tris-HCl（pH8.0）悬浮；置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（600w，30sec/次，10次），4℃，10000r/min 离心10min，取上清备用①；沉淀用10mL洗液（10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2% Triton X-100）悬浮，4℃，10000r/min 离心10min后，沉淀再次用10mL 洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解沉淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶液溶解的沉淀②，向其中加入40μＬ超纯水和10μＬ 10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。并将染好色的凝胶经全自动凝胶成像分析系统扫描和Quantity One软件分析诱导菌液中重组蛋白在胞浆（上清①，可溶性）和沉淀中(沉淀②，包涵体形式)的相对百分含量。

3.2.3重组质粒pET32a-gG表达条件的优化

a 诱导剂IPTG的浓度优化：取含重组质粒pET32a-gG的表达宿主菌BL21 (DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中6只试管，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L 25℃诱导培养12小时（8-12小时均可）后，按上述方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。

b 温度条件优化：取含重组质粒pET32a-gG的表达宿主菌BL21(DE3)，接种于含Amp的5mL LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，分别置于25℃、30℃、37℃诱导培养12小时（8-12小时均可），按上述常规方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。

c 诱导时间优化：取含重组质粒pET32a-gG的表达宿主菌BL21 (DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，继续培养至OD600值约0.4时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L ,25℃诱导培养，分别于诱导0、2、3、4、5、6h、12h后，吸取1mL培养液，按上述方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。

3.3重组gG蛋白的大量制备、纯化与复性

3.3.1重组gG蛋白的大量制备（包涵体处理）

将诱导表达的500mL菌液于4℃ 10000r/min 离心10min，将菌体沉淀用40mL 20mmolTris-HCl（pH8.0）悬浮；置-20℃过夜后按1mg/mL加溶菌酶，4℃搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（200w，30sec/次，5～10次），4℃ 10000r/min 离心10min。将沉淀用20mL洗液（10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2% Triton X-100）悬浮，4℃ 10000r/min 离心10min后，用适量尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解沉淀，4℃保存备用。

3.3.2重组gG蛋白的纯化

镍琼脂糖凝胶（Ni²⁺-NAT）亲和层析纯化重组gG蛋白：根据融合蛋白的6-His标签对镍离子特殊的亲和作用，使带有标签的融合蛋白能够结合于镍琼脂糖凝胶上，改变洗脱液的条件将其洗脱，而达到纯化的目的。具体操作步骤为：

（1）装柱：镍琼脂糖凝胶装柱，柱床体积约为40mL；

（2）平衡：用平衡缓冲液Ⅰ约5个床体积平衡层析柱，流速为1mL/min；

（3）上样：将0.45μm滤膜过滤的可溶性包涵体样品约5mL，加入层析柱中，流速为0.5mL/min；

（4）洗涤：用平衡缓冲液Ⅱ再洗2-5个床体积，流速为1mL/min；

（5）洗脱：分别用含50、300、500mmol咪唑的洗脱缓冲液Ⅲ进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各梯度的洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；

（6）清洗：用超纯水洗5个柱床体积，再用25%的乙醇洗3个柱床体积，流速为1mL/min，回收镍琼脂糖凝胶柱，于4℃中保存。

4 实验结果

4.1 鸭瘟病毒gG基因的扩增、T-克隆与鉴定结果

4.1.1 鸭瘟病毒gG基因的PCR扩增结果

以DPV CHv毒株基因组DNA为模板对gG基因进行PCR扩增，其产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约1380 bp的特异性DNA条带（图1-A）。

4.1.2 鸭瘟病毒gG基因T克隆鉴定结果

PCR产物经胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接并转化感受态细胞DH5α，得到的T克隆命名为pMD18-gG。对pMD18-gG进行PCR、酶切（图1-B：重组质粒pMD18-gG 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到两个片段，箭头所示小片段的分子量大小约为1380 bp）和测序鉴定，结果表明，T克隆获得的gG基因核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)同已知的DPV gG基因核苷酸序列完全一致。

4.2 原核表达质粒pET32a-gG的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

4.2.1重组表达质粒pET32a-gG的构建与酶切鉴定

以BamHⅠ和XhoⅠ双酶切T克隆质粒后回收目的片断，与经相同酶切的pET-32a表达载体连接，转化DH5α，得到重组表达质粒pET32a-gG ,经XhoⅠ单酶切后得到的一条片段，BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后得到的两条片段，且大小与理论值相符（见图1-C），表明原核表达载体被成功构建。

4.2.2重组质粒pET32a-gG的诱导表达

如图2-A，未诱导菌株没有特异性蛋白条带出现；诱导空载体pET-32a(+)转化菌株在约20kDa处出现一特异性蛋白条带，为载体本身大小；重组表达质粒pET32a-gG表达的蛋白在约70kDa处，与预期表达的蛋白大小相一致；对诱导的重组表达菌体进行超声波破碎、离心后，分别对沉淀及上清进行SDS-PAGE电泳，结果显示重组蛋白大量存在于沉淀中。

4.2.3重组质粒pET32a-gG表达条件的优化

a IPTG浓度的优化：在25℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L诱导培养12小时，结果显示：未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带；随IPTG浓度的增高，蛋白诱导量逐渐增加，当增加到1.0mmol/L蛋白表达量达到最大；其后再增大IPTG浓度到1.2mmol/L 时，其蛋白表达量与1.0mmol/L时没有明显差别（图2-B）。因此，可选择1.0 mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。

b诱导温度条件的优化：IPTG浓度为1.0mmol/L，分别于25℃、30℃、37℃诱导培养12小时，结果显示，温度在37℃和30℃时，诱导蛋白量较少，25℃时最高（图2-C），因此，选择温度25℃为最佳诱导温度。

c诱导时间的优化：在IPTG浓度为1.0 mmol/L，25℃条件下，分别诱导0h、2h、3h、4h、5h、6h、12h（8-12小时均可），结果2 h时即有特异的蛋白条带产生；诱导2～6 h的重组蛋白表达量相比无明显变化，而诱导12h的重组蛋白表达量较大（图2-D）。因此，选择诱导12h（8-12小时均可）作为最佳诱导时间。

4.3重组gG蛋白的纯化结果

表达产物经过溶菌酶裂解、超声波破碎、尿素洗涤等一系列前处理后，镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组gG蛋白。gG蛋白样品过柱纯化后的UV曲线图显示出3个峰，峰1为穿透峰，峰2为50mmol咪唑洗脱峰，峰3为300mmol咪唑洗脱峰。同时收集不同浓度咪唑洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳，检验纯度及浓度，结果显示：只有300mmol咪唑洗脱峰中含有大量高纯度的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白（图3），其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。将纯化的重组gG蛋白透析复性后，用Bradford法测定蛋白的终浓度，并将其稀释为1mg/mL，分装后备用。

 

实施例2 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗原中的应用

一 实验步骤

1 间接ELISA步骤

① 将纯化的gG重组蛋白用包被液稀释至终浓度为2.5μg/100μＬ，依次加入酶标板中，100μＬ /孔，4℃包被过夜；

② 洗涤三次，弃液体，于每孔中加入200μＬ封闭液，37℃封闭30min；

③ 洗涤三次，弃液体，将各待检血清按体积比为1：80倍稀释后并上样，100μＬ /孔，37℃孵育30min；

④ 洗涤三次，弃液体，于每孔加入1：2000倍体积稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗，100μＬ/孔，37℃孵育30min；

⑤洗涤三次，弃液体，于每孔加入TMB100μＬ，避光显色10 min，然后加入终止液50μＬ /孔，轻拍混匀，用酶标仪测450nm的OD值。

2 阴阳性临界值判定标准的确定

取20份DPV阴性鸭血清，按照上述间接ELISA方法进行检测。将20份阴性样品的OD_450nm值的平均值（X）和3倍标准方差(SD)之和作为阴性样品值的上限，即待检样品的OD_450nm值＞阴性样品0D_450nm值的临界值(X+3SD)时判定为阳性，反之则为阴性。

3 特异性实验

用纯化的gG重组蛋白作为包被抗原，通过上述间接ELISA方法分别将其与鸭瘟病毒阳性血清、鸭病毒性肝炎（Duck virus hepatitis, DHV）阳性血清、禽流感病毒（AIV）阳性血清，鸭传染性浆膜炎（Riemerella anatipestifer infectious，RA）阳性血清、鸭沙门氏菌（Salmonella bacillus，SB）阳性血清、鸭大肠杆菌（E.coli）阳性血清反应，以检测其特异性。

4敏感性试验

用纯化的gG重组蛋白作为包被抗原，将DPV阳性血清分别按1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、l:2560、1:5120进行体积倍比稀释，然后进行检测。

 

二 结果

1 阴阳性临界值判定标准的确定

通过对20份DPV阴性血清样品进行检测，所得结果如表1所示。X值为0.124，SD值为0.032，确定阴阳性临界点为 X+3SD=0.124+3×0.032= 0.22，因此，当待测样品的OD_450nm值大于0.22时判定为阳性，小于或等于时则判定为阴性。

2特异性实验

对包括鸭瘟在内的6种阳性血清分别进行测定，结果如表2所示，除鸭瘟病毒阳性血清以外，其余5种阳性血清的OD_450nm值均小于0.22，表明除鸭瘟病毒阳性血清以外，该抗原不与上述其它5种阳性血清发生交叉反应，由此说明本研究基于gG重组蛋白的鸭瘟病毒抗体捕获间接ELISA法具有较好的特异性。

3敏感性试验

将DPV阳性血清进行一系列倍比稀释后，结果如表3所示，随着DPV阳性血清稀释度的增加，OD_450nm值也明显随之下降，当稀释倍数为1:2560时，血清检测结果低于临界值0.22，因此，本研究建立的基于gG重组蛋白的鸭瘟病毒抗体捕获间接ELISA法可检测到的DPV阳性血清最大稀释倍数为1:1280，具有较好的敏感性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  四川农业大学实验动物工程技术中心

<120>  鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白及其制备方法与应用

<160>  4

 

<210>  1

<211> 460

<212>  PRT

<213>  鸭（Duck）

<220> 

<223>  鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白

<400>  1

Gly Met Ala Thr Met Ile Ala Val Val Leu Val Phe Leu Gly Cys

 1             5              10               15

Val Leu Gly Ile Ala Met Gly Asp Ser Arg Ser Lys Asp Pro Ile

               20               25              30

His Leu Gly Thr trp Asp Asn Ala Thr His Ala Arg Arg Val Val   

               35               40              45

Ile Pro Ala Gly Ala Arg Ala Ile Leu Asp Gly Pro Leu Pro Ile

              50              55                60

Gly Pro Pro Gly Arg Ile Pro Pro His Thr Gly Arg Tyr Glu Asp

              65               70               75

Ile Gly Thr Met Asp Ile Ala Val Gln Trp Cys Asp Leu Thr Leu

               80                 85              90

Leu Ala Pro Ile Ser Ser Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Pro Tyr               

 95              100              105

Asp Met Ser Val Thr Trp Tyr His Ile Thr Ala Asn CysThr Met

              110             115              120

Pro Val Gly Tyr Val Glu Tyr Tyr Asn Cys Ser Gly Asp Gln Pro

             125              130              135               

Ser Val Trp Thr Cys Gly Gly Tyr Ser His Ile Tyr Ser Tyr Tyr

              140              145             150

Ile Asp Gly Gln Met Asp Thr Leu Pro Tyr Gly Thr Gly Leu Ile

               155              160               165

Ile Ser Ser Gly Met Tyr Asn Ser Gly Leu Tyr Lys Phe Ile Leu

              170              175              180

Arg Thr Asp Asn Asn Thr Lys Thr Gly Thr Leu Asn Val Thr Phe

              185              190              195

 

Glu Thr Ser Asp Asp Pro Tyr Cys Val Asn Lys Phe Gly Arg Thr

              200              205              210

Ser Gly Ala Asp Leu Asp Ile Val Asp Ile Gly Thr Trp Met Ser

              215                220            225    

Pro Asp Gly Leu Pro His Pro Asn Thr Tyr Asn Ile Ser Thr Lys

              230              235             240 

Asp Gly Lys Ile Arg Phe Ser Phe Gln Asn Gly Thr Glu Thr Val

               245              250             255

Cys Gln Leu Val Lys Ser Leu Glu Glu Ile Arg Asp Glu Ser Glu

              260               265             270

Ser Trp Asp Glu Arg Asn Val Asp Pro Ala Met Leu Gly Phe Pro

               275              280              285

Arg Cys Gly Tyr Glu Asp Tyr Gly Ser Thr Asp His Gly Ser Glu

              290              295              300

Cys Tyr Asp Asp Ile Asp Asn Glu Cys Val Asn Glu Thr Asp Ile

             305               310              315

Trp Thr Val Pro Lys Thr Asn Ala Asn Phe Arg Asn Gln Thr Gly

             320               325              330

Gly Tyr Leu Leu Leu Ala Ser Phe Met Val His Ser Thr Gly Arg

              335              340              345

Met Pro Arg Ile Gly Leu Lys Met Ala Asn Leu Ser Thr Cys Thr

             350              355               360

Thr Ile Asn Thr Thr Ser Thr His Ser His Gly Ser Tyr His Asn

             365             370              375

His Pro His Pro Pro His Thr Tyr Asp Ser Met Ile Asp Gln Pro

             380              385              390

Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val Glu Asp Ala Arg Arg Cys Ile Gly

               395              400               405

Thr Ser Gly Leu Ile Ala Ile Val Thr Ile Gly Cys Phe Gly Ile

               410             415            420

Val Thr Ile Ile Leu Leu Gly Met Tyr Ile Leu Tyr Leu Arg Ser

            425                430             435  

Val Val Thr Arg Leu Thr Lys His Gln Ser Met Phe Gly Arg Gln

              440              445               450

Asp Leu Lys Phe Gln Arg Val  Pro Leu Val 

               455                460

     

 

<210>  2

<211> 

<212>  DNA

<213>  鸭（Duck）

<220> 

<223> 

<400>  2

ggtatggcaa caatgatagc tgtggtgtta gtttttttgg gatgcgtttt aggcatcgca      60

atgggagata gccgcagcaa ggacccaatt catcttggaa catgggacaa cgctacacat     120

gcaagacgtg tagttatacc agctggcgcc agggctattt tggacggacc gttgccaatc     180

ggaccgcctg ggaggatacc accacacaca ggacgatatg aggacattgg aacgatggat     240

attgcagttc aatggtgcga ccttacactc ctcgcgccta tttccagtgt ttccgccggg     300

aatggtgcgc catatgacat gtctgttact tggtatcaca tcaccgctaa ttgcacgatg     360

cctgttggct acgtggaata ctacaactgc tctggggatc agccgtctgt atggacctgt     420

ggcggctatt cgcatattta ttcctattat attgatggac aaatggacac gctaccatat     480

ggtactggct tgattatatc tagtgggatg tataatagtg gactatataa gtttattcta     540

agaacagaca ataatacgaa gactggaaca ctaaatgtaa cttttgaaac atcagacgat     600

ccttattgcg ttaataaatt tggcagaacg tctggcgctg acctggacat tgttgatata     660

ggtacgtgga tgtctccaga tggtttgccc catcccaata cgtataatat tagtacgaaa     720

gacgggaaga tacgatttag tttccaaaat ggcacagaga ccgtttgtca actggtgaag     780

agtctcgaag aaatcaggga cgagagtgag tcttgggatg aacgcaatgt cgatccggcc     840

atgcttggtt tcccccggtg tggttatgaa gactacggct ctacagatca tggatctgaa     900

tgctatgatg acatagataa tgaatgtgta aatgagacgg acatatggac agtacctaaa     960

accaatgcca atttcagaaa tcaaactggt gggtatttgt tactcgccag tttcatggta    1020

cattctactg gaaggatgcc gcggattggt cttaaaatgg cgaacctatc gacatgtaca    1080

actattaata ccacctcaac acattcgcat ggaagctacc acaatcaccc tcatccccca    1140

catacctatg acagtatgat agatcagcca ctactatttg ccgctctagt agaagatgcg    1200

cggcgctgta tcggtacgag tggtttaatt gcaatagtga ctatcggatg ttttggtatc    1260

gtgacaataa ttcttcttgg gatgtatatt ctatatcttc gatctgttgt tacgcgattg    1320

accaaacatc aatcgatgtt tgggcgccaa gacttgaaat tccaacgcgt tccattagtt    1380

taa                                                                  1383

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物DPV-gG F

<400>  3

ggatccggta tggcaacaat gatag  25

 

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物DPV-gG R

<400>  4

ctcgagaaac acaagacaca cacgtc 26

 

 

 

 

 

 

Claims (8)

1.鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

A鸭瘟病毒gG的DNA片段的获得

以鸭瘟病毒毒株基因组DNA为模板对gG基因进行PCR扩增，得鸭瘟病毒 gG基因片段，与pMD18-T 的连接，得pMD18-gG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其上游引物如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，下游引物如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

B 重组原核表达质粒pET32a-gG的获得

限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD18-gG质粒和原核表达载体pET32a(+),并连接, 得重组原核表达质粒pET32a-gG；

 C 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的获得 

将步骤B所得重组原核表达质粒pET32a-gG转化至表达菌株BL21(DE3)进行诱导表达，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，其特征在于：将步骤C所得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白进行亲和层析纯化，得纯化的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

3.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，其特征在于：将步骤B所得重组原核表达质粒pET32a-gG转化至表达菌株BL21(DE3)，在IPTG浓度≥1.0mmol/L,诱导温度为25℃条件下进行诱导表达8-12小时，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

4.权利要求1-3任一项所述的制备方法所得的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白，其特征在于：所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.权利要求4所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗原中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗体捕获剂中的运用。

7.权利要求4所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒疫苗中的应用。

8.运用权利要求4所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白检测鸭瘟病毒抗体的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白稀释至终浓度为2.5μg/100μL，在酶标板中包被过夜，用封闭液封闭,得固相抗原；

B将待检血清作80倍体积稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

C、将所述酶标二抗作2000倍体积稀释后，与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

D、在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

E、将步骤d所述显色液用酶标仪测OD_450nm值，待检血清的OD_450nm值＞阴性样品OD_450nm值的临界值，即X+3SD时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品OD_450nm值的均值，SD为阴性样品OD_450nm值的标准方差。

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