CN102000331A

CN102000331A - 囊素三肽作为猪瘟疫苗佐剂的应用

Info

Publication number: CN102000331A
Application number: CN 201010535567
Authority: CN
Inventors: 卢宇; 侯继波; 邓碧华; 张金秋
Original assignee: NATIONAL CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICALS ENGINEERING RESEARCH
Current assignee: NATIONAL CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICALS ENGINEERING RESEARCH
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2011-04-06

Abstract

本发明涉及一种囊素三肽作为猪瘟疫苗佐剂的应用。囊素三肽以溶液方式作为猪瘟疫苗的稀释液，或作为猪瘟疫苗组合物的组分，直接与猪瘟疫苗及脱脂奶粉进行配苗和分装，制成冻干粉待用。动物实验结果表明，囊素三肽能提高猪瘟弱毒疫苗的免疫应答。添加佐剂的试验组免疫后42天的猪瘟抗体转阳率可达90％以上，显著高于无佐剂的对照组转阳率(50％-60％)，从而提高猪预防病毒感染和抗病的能力。

Description

囊素三肽作为猪瘟疫苗佐剂的应用

技术领域

本发明涉及囊素三肽作为猪瘟弱毒疫苗佐剂的应用。

背景技术

法氏囊素(bursin，BS)是从禽类的法氏囊(bursa of fabricius，BF，为禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官)中分离出来的一种活性三肽物质，其氨基酸组成顺序是Lys-His-Gly-NH₂，故又称之为囊素三肽。大量的研究证明：囊素三肽具有很好的免疫增强作用，并且在抗肿瘤研究和动物增重中有一定效果。1986年Audhya报道从鸡法氏囊中提取的天然三肽能诱导禽类和哺乳类动物的前体B细胞的分化，使B细胞选择性分化激素，可增加人的Daudi B细胞系中cAMP、cGMP的浓度，但不能导致前体T细胞的分化，同时证实人工合成的囊素三肽也有相同的作用。有研究表明，天然提取和人工合成的囊素三肽均能提高新城疫弱毒苗所诱导产生的血清抗体水平，试验组比对照组平均高1～2个滴度。

发明内容

本发明目的是提供囊素三肽作为猪瘟疫苗佐剂的应用。

本发明囊素三肽作为猪瘟疫苗佐剂的应用包以下两种方式：

1.囊素三肽以溶液方式作为猪瘟疫苗的稀释液，囊素三肽溶液由以下方法制得：

将囊素三肽的冻干粉用生理盐水或无菌水溶解配成浓度12.5-100μg/mL的溶液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。可现配现用，每头猪注射1.0-2.0mL。

2.囊素三肽作为猪瘟疫苗组合物的组分：该组合物由以下方法制得：

每1mL猪瘟病毒培养液中加入5％脱脂奶粉3.75mL、合成囊素三肽冻干粉1.25～500mg或从鸡法氏囊中提取的天然囊素三肽50mL，混匀，冷冻干燥。

本发明以囊素三肽作为猪瘟弱毒疫苗的免疫佐剂，按0.02mL猪瘟疫苗/头份，囊素三肽佐剂以溶液的方式作为疫苗的稀释液使用时，可现配现用，每头猪注射囊素三肽溶液1.0-2.0mL；当囊素三肽以疫苗组合物方式为佐剂时，每头份加囊素三肽的冻干粉为25-200μg，动物实验结果表明，囊素三肽能提高猪瘟弱毒疫苗的免疫应答。添加佐剂的试验组免疫后42天的猪瘟抗体转阳率可达90％以上，显著高于无佐剂的对照组转阳率(50％-60％)，从而提高猪预防病毒感染和抗病的能力。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。

实施例中采用国际通用的化学分子式，各分子式代表的化学名为如下所示：

DCM：二氯甲烷

FMOC：9-芴甲氧羰基

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

Lys：赖氨酸

His：组氨酸

Gly：甘氨酸

TBTU：1-氧-3-双二甲胺羰基苯肼三氮唑四氟化硼盐

BOC：叔丁氧羰基

HOBt：1-羟基-苯并-三氮唑

TFA：三氟乙酸

Phenol：苯酚

Thioanisole：苯甲硫醚

EDT：乙二硫醇

TIS：三异丙基硅

实施例1囊素三肽的固相化学合成制备

(1)反应柱的前处理

在合成反应之前，用适量的DCM浸泡反应柱3-4小时，用量以能浸没反应柱体积的2/3为宜。

(2)树脂的活化

取200g FMOC Rink-Amide MBHA树脂，用1.5L的DMF浸泡30min，压滤去除DMF，再用20％哌啶的DMF浸泡15min，装柱。用异丙醇洗涤2次，DMF洗3次。

(3)链接Lys

取100g的FMOC-Lys(BOC)-OH、92g的TBTU、2.0L的DMF和152mL的HOBt(2M)，混匀后再加入52mL的DIEA混匀，加入树脂柱中室温、氮气保护下反应2.0h。反应完毕后，用异丙醇洗涤树脂两次，然后用DMF洗涤树脂三次。

(4)依次链接His和Gly

按照从C端向N端延伸多肽的顺便，分别取106g的FMOC-His-OH和59g的FMOC-Gly-OH，和上述(3)的条件相同，每次反应后脱除FMOC保护基团。重复脱保护-洗涤-缩合的过程至剩余的氨基酸连接完毕，完成多肽的连接。

(5)合成肽的收获

配制TFA/Phenol/H₂O/Thioanisole/EDT/TIS的混合液作为切割液，其体积比为80∶5∶5∶5∶3∶2。首先用氮气将多肽、树脂复合物吹干，放入5L的容器中，加入100mL的切割液4℃密闭搅拌反应2h，在加入3.0L的冰乙醚4℃静置2h。离心收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤、干燥重复处理3次，然后用无菌纯水溶解，放置-40℃冷冻。最后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机，冻干至恒重即得。

(6)合成肽的纯度和分子量测定

采用高压液相法测定样本的纯度和出峰时间。用C18柱，以溶液A(含0.1％三氟乙酸乙酯的100％乙腈)和溶液B(含0.1％三氟乙酸乙酯的100％水)按表1进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长220nm，进样量为20μl。目的产物在2.685min出峰，峰面积是7006711.500，有少许杂峰，目的产物比重占88.45％。

表1梯度洗脱流程

采用ESI液质联用法测定合成肽的分子量，经H离子轰击后，出现[M+H]+为339.34的物质，则合成肽的分子量为338，与囊素三肽分子量相符，且此物质占样品比重较大，接近100％，证实合成所得的多肽为囊素三肽。

实施例2囊素三肽配制的疫苗稀释液对猪瘟弱毒疫苗的佐剂功能试验

(1)材料准备：

①合成囊素三肽，由实施例1制备。用生理盐水稀释成浓度为12.5、25和100μg/mL的3个浓度，再用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

②猪瘟抗体检测试剂盒购自IDEXX公司，4℃保存备用。

③猪瘟弱毒疫苗(细胞源)，20头份/瓶，批号：099010，购自南京天邦生物科技有限公司。

④囊素三肽提取物，自制，从20日龄健康雏鸡的法氏囊器官中提取，用双缩脲法测定多肽含量为2.0mg/mL，4℃保存备用。

⑤健康仔猪35头，23～28日龄，购自浙江省十里坪生态养殖总公司，按窝分圈饲养。

(2)试验方法：

按自然窝将试验组随机分为A-F共6组，

组A、B和C为合成囊素三肽的试验组，分别用12.5、25和100μg/mL的囊素三肽各40mL，稀释猪瘟弱毒疫苗(细胞源)各1瓶备用；

组D为囊素三肽提取物对照组，用40mL的囊素三肽提取物稀释猪瘟弱毒疫苗(细胞源)1瓶备用；

组E为无佐剂疫苗对照组，用40mL的生理盐水稀释猪瘟弱毒疫苗(细胞源)1瓶备用；

组F为非免疫空白对照组，40mL生理盐水备用。

各组猪均隔离饲养，于仔猪30日龄，各组对应用以上制剂分别颈部肌肉注射，每头猪2.0mL，(分组和处理情况见表2)。于免疫后2w、4w和6w，即仔猪44、58和72日龄采血，分离血清，用猪瘟抗体检测试剂盒测定抗体的ELISA值，计算阳性率。

表2分组和处理情况表

组别	头数	稀释液配方	疫苗稀释方法
				A	6	合成的囊素三肽，12.5μg/mL	疫苗1瓶，加40mL稀释液稀释

B	6	合成的囊素三肽，25μg/mL	疫苗1瓶，加40mL稀释液稀释
				C	6	合成的囊素三肽，100μg/mL	疫苗1瓶，加40mL稀释液稀释
D	6	提取的囊素三肽	疫苗1瓶，加40mL稀释液稀释
				E	6	生理盐水	疫苗1瓶，加40mL生理盐水稀释
F	5	生理盐水	40mL生理盐水，无疫苗

(3)试验结果：

由表3的结果可见，免疫后4周，采用囊素三肽为佐剂的A、B、C、D的4个试验组中，猪抗体均有显著上升，转阳率均高于免疫对照组(组E)，其中以组C的转阳率最高80％，组B和D次之；免疫后6周，抗体阳性率最高为组C，达100％，次之为组B，达83.3％，组A和组D相当，均为66.7％，组E仅为50％。说明无论是合成的还是提取的囊素三肽均有明显的促进猪瘟抗体产生的生物活性；天然提取的囊素三肽的活性(1.0mg/mL)与本合成的12.5μg/mL相当，合成的囊素三肽25μg/mL可以将猪瘟抗体转阳率由50％提高至80％以上，说明化学合成的囊素三肽纯度高、活性高，具有巨大的临床应用价值。

表3首免后2、4、6周各组抗体转阳率

实施例3囊素三肽与猪瘟弱毒抗原配伍的疫苗组合物免疫反应试验

(1)猪瘟弱毒疫苗组合物制备：

首先按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)的“猪瘟活疫苗制造及检验规程(II)”中所述的方法和标准制备合格的病毒培养液2.0mL(100头份，0.02mL/头份)。按如下方法制备各疫苗组合物：

疫苗组合物A：取病毒液0.4mL，5％脱脂奶粉1.5mL，加入实例1制备的合成囊素三肽0.5mg，混匀，然后冷冻干燥；

疫苗组合物B：取病毒液0.4mL，5％脱脂奶粉1.5mL，加入实例1制备的合成囊素三肽1.0mg，混匀，冷冻干燥；

疫苗组合物C：取病毒液0.4mL，5％脱脂奶粉1.5mL，实例1制备的合成囊素三肽4.0mg，混匀，冷冻干燥；

疫苗组合物D：取病毒液0.4mL，5％脱脂奶粉1.5mL，加入如实例2④自制的提取的囊素三肽20mL，混匀，冷冻干燥；

疫苗组合物E：取病毒液0.4mL，5％脱脂奶粉1.5mL，混匀，冷冻干燥。

(2)其它主要材料准备：

①猪瘟抗体检测试剂盒，购自IDEXX公司，4℃保存备用。

②猪瘟弱毒疫苗(细胞源)，20头份/瓶，批号：099010，购自南京天邦生物科技有限公司。

③健康仔猪41头，23～28日龄，购自浙江省十里坪生态养殖总公司，按窝分圈饲养。

(3)试验方法：

按自然窝将试验组随机分为7组(组A-G)，组A-E分别用20mL生理盐水稀释对应的疫苗组合物，于仔猪30日龄，免疫对应疫苗，各组每头颈部肌肉注射1.0mL；组F(应是E？)为猪瘟商品疫苗对照组，用20mL的生理盐水稀释，于仔猪30日龄，每头颈部肌肉注射1.0mL免疫；组F为非免疫空白对照组，每头注射生理盐水1.0mL；各组均隔离饲养(分组和处理方法见表4)。于免疫后2w、4w和6w，即仔猪44、58和72日龄采血，分离血清，用猪瘟抗体检测试剂盒测定抗体的ELISA值，计算阳性率。

表4分组和处理情况表

组别	头数	1.0mL注射液中抗原含量	1.0mL注射液中佐剂	1.0mL注射液中佐剂含量
					A	6	1头份	合成的囊素三肽	25μg
B	6	1头份	合成的囊素三肽	50μg
					C	6	1头份	合成的囊素三肽	200μg
D	6	1头份	提取的囊素三肽	1.0mg
					E	6	1头份	无	0
F	6	1头份	无	0
					G	5	0	无	0

(4)结果：

由表5的结果可见，免疫后4周疫苗组合物C的转阳率最高66.7％，疫苗组合物D次之50％，其余试验组与对照组无显著差异；免疫后6周，组C的抗体阳性率为100％最高，组B为83.3％次之，组A和组D相当，均为66.7％，组E仅为50％。说明无囊素三肽(无论是合成的还是提取的)均有明显的促进猪瘟抗体产生的生物活性；天然提取的囊素三肽的活性(1.0mg/mL)与本发明的12.5μg/mL相当，合成的囊素三肽50μg/头份添加可以将猪瘟抗体转阳率由50％提高至80％以上，说明化学合成的囊素三肽纯度高、活性高，具有巨大的临床应用价值。

表5首免后2、4、6周各组抗体转阳率

Claims

1.囊素三肽作为猪瘟疫苗佐剂的应用。

2.根据权利要求1的应用，其特征是囊素三肽以溶液方式作为猪瘟疫苗的稀释液，

囊素三肽溶液由以下方法制得：

将囊素三肽的冻干粉用生理盐水或无菌水溶解配成浓度12.5-100μg/mL的溶液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

3.根据权利要求1的应用，其特征是囊素三肽作为猪瘟疫苗组合物的组分：该组合物由以下方法制得：