CN102952173A

CN102952173A - 组织保护活性新多肽的制备方法及在治疗牛乳腺炎中的应用

Info

Publication number: CN102952173A
Application number: CN2011102351051A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2013-03-06

Abstract

本发明公布了一种具有组织保护活性的新多肽。本发明公布了该多肽的序列，结构以及制备方法。本发明多肽可作为一种饲料添加剂。本发明多肽喂饲奶牛，对奶牛乳腺炎症，具有良好的治愈和预防作用。

Description

组织保护活性新多肽的制备方法及在治疗牛乳腺炎中的应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域。本发明涉及了一种新的具有组织保护活性的多肽。本发明公布了采用本发明多肽配方奶牛饲料添加剂的方法，以及对于奶牛乳腺炎的治疗，预防方法。本发明涉及多肽固相化学合成、多肽大规模纯化及冻干、理化性质测定、治疗应用等技术。

背景技术

奶牛乳腺炎是当前危害奶牛业发展，制约奶牛生产的一种重要疾病，值得奶牛生产者及畜牧工作者的高度重视和关注。发病情况及发病率的发生已成为一个世界性的问题。我国奶牛的发生更高，中国农业科学院兰州中研究所对我国西北、华北、东北、中南、西南地区22个城市32个奶牛场的10371头成年泌乳牛进行了调查，临床型平均发病率为33.41％(9.7％～55.6％)，并对其中5个地区20个奶牛场的3384头泌乳期奶牛进行了隐性检查。结果表明隐性头平均阳性检出率73.91％(62.07％～93.95％)，乳区平均阳性检出率为44.74％(35.29％～72.81％)，两类的发病率均高于国外报道。

目前国内外对牛乳腺炎的治疗主要是抗生素和疫苗，但抗生素在治疗牛乳腺炎症中存在诸多不利的因素。基于以上原因，本发明公布了一种具有组织保护活性的新的多肽。临床实验可以评估本发明多肽对牛乳腺炎组织有保护治疗作用。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前在牛乳腺炎症的治疗中存在的诸多不利因素，公布了一种新的多肽。本发明公布了此多肽的具体合成方式，纯化方式。同时公布了采用本发明多肽配制奶牛饲料添加剂的方法以及这种多肽对于奶牛乳腺的保护作用和对乳腺炎的治疗，预防作用。虽然具体的作用机理还不明确，本发明的多肽以多种方式给予很低剂量(通常为毫克或纳克/公斤体重)时即对几乎所有的器官和组织显示出保护作用。多项动物实验表明本发明的多肽可以削弱由化学诱导引起的肝、肺、结肠和胃等组织的损伤，抑制炎性反应，减少消化道溃疡，减少肝脏和胆道的损伤，还具有抗焦虑和抗抑郁作用。可以促进血管生成、促进创伤愈合等，可以逆转由神经毒素MPTP诱导的帕金森症模型中的异常。另外，对于胃粘膜具有显著的保护作用，还可以缓解炎症反应。

本发明的多肽对于各种组织炎症都有很好的治疗和缓解作用。

本发明公布的多肽序列具有以下结构通式：

【Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa】

或者：

[Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]，

其中Xaa是中性脂肪族氨基酸残基，特别是Ala、bAla、Leu、Ile、Gly、Val、Nle或Nva，

Yaa是碱性氨基酸残基，特别是Lys、Arg、Om或His，

Zaa是酸性氨基酸残基，特别是Glu、Asp、Aad或Apm。

本发明多肽的氨基酸序列具体组合是序列表中记载的SEQ ID No.1所示氨基酸序列、SEQ ID No.2所示氨基酸序列或SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多肽。

本发明的多肽合成后，可以做成游离态形式，也可以做成阳离子盐，如：TFA盐(三氟乙酸盐)，HCl盐(盐酸盐)，醋酸盐形式。

本发明的多肽，可以选择和一种或多种药物载体组合，制成多种药物剂型，用于治疗。这些药物剂型涵盖：注射溶液、片剂、霜剂、胶囊、软膏、洗剂、舌含片等剂型局部或全身给药。剂量优选在10^-5～10^-2mg/kg体重的范围内，以0.1％-0.5％的较高浓度全身或局部给药。对于具体治疗的最佳剂量的确定是本领域技术人员熟知的。

具体实施方法

下面结合具体的实施方法对本发多肽的合成、纯化及理化性能及在牛乳腺炎症中的治疗做进一步的阐述。

实施例1：多肽的化学合成及纯化：

以SEQ ID No.2所示的氨基酸序列为例化学合成多肽。采用Fmoc固相法合成：

采用固相合成仪器，选用0.5克的val-2氯三苯甲基树脂为起始树脂，合成反应管中依次加入：

Fmoc-leu，Fmoc-gly，Fmoc-ala，Fmoc-Asp(otbu)fmoc-asp(otbu)，Fmoc-ala，Fmoc-pro，Fmoc-lys(boc)，FMoc-gly，FMoc-pro，Fmoc-pro，FMoc-pro，Fmoc-Glu(otbu)，Fmoc-gly.

试剂瓶中加入DIC/DMF溶液和HOBT/DMF溶液和DMF溶液。启动合成仪器连接电脑，输入合成程序，开始合成。

合成的后处理：

把树脂从合成反应柱中取出，放入一底部有烧结玻璃滤片的玻璃容器中，分别依次用DMF(二甲基甲酰胺)，DCM(二氯甲烷)，MeOH(甲醇)，DCM，MeOH5-10倍的树脂体积冲洗树脂。冲洗后的树脂冷冻干燥。

树脂冲洗完毕，另取一带玻璃塞的试管，配置20毫升裂解试剂，配置方式如下：

(1)：加17.5毫升TFA(三氟乙酸)于试管中；(TFA有强腐蚀性和挥发性，应在通风厨中操作)

(2)：加EDT0.5毫升

(3)：加thioanisole 1毫升

(4)：加anisole 0.4毫升

以上试剂都加入后，轻微震荡混匀，加入放入树脂的玻璃容器中。反应2.5小时。待反应完毕，用真空抽滤的办法分离树脂和裂解试剂。把裂解试剂放入一球形烧瓶中，用旋转蒸发的办法减压蒸去液体物质，只留下固体。

另取100毫升的冷乙醚加入球形烧瓶中，此时有大量的白色沉淀物质，为粗多肽。离心分离乙醚和多肽。丢弃上清乙醚，多肽继续用冷乙醚洗涤，离心，得到多肽粗品。

多肽粗品用冻干机冻干，用于下一步纯化。合成产物的纯化：

多肽粗品1克，溶于5毫升的纯水中，过滤，上制备级高效液相色谱。色谱配40*250mm的C18反相柱。

流动相：A相0.1％的TFA+水

B相0.1％的TFA+乙腈。

采用程序：B在40分钟内从5％上升到55％，收集主峰，得到溶于流动相的多肽纯品。

上述溶液状态的多肽，采用低温旋转蒸发方式初步浓缩，然后用冻干机冷冻干燥。得到纯品。

纯品的质谱图1及HPLC图2见说明书附图。

实施例2：稳定性试验

将本发明多肽于40℃保温76天和120天测试其稳定性。稳定性试验采用HPLC方法进行测定。水溶液中多肽的浓度为0.2％(w/v)：柱，Kromasil100，5u，250x 4.6mm；流动相，0.1％三氟乙酸的水/乙睛溶液(0至50vol.％)，在25分钟内梯度洗脱，流速1ml/min；检测：UV，218nm。

为了进行比较，使用游离的多肽及其单乙酸盐。

表1

从表1数据可以表明，本发明多肽稳定性非常高。其溶液在40度，120天后依然具有97％以上的目标物质。

实施例3：本发明多肽的毒性

采用小鼠灌胃和注射方式测定本发明多肽的急性毒性。溶液配制：

采用本发明多肽25毫克，加灭菌水至20毫升，配置成浓度为1.25毫克/毫升的溶液，供口服灌胃。

采用本发明多肽25毫克，加灭菌水至10毫升，配置成浓度为2.5毫克/毫升的溶液，供腹腔注射用。给药剂量计算：

小鼠口服灌胃给药体积为40毫升/公斤体重，故给药剂量为：1.25mg/ml*40ml/kg＝50m/kg。

小鼠腹腔注射给药体积为20毫升/公斤体重，故给药剂量为：2.5mg/ml*20ml/kg＝50mg/kg。

取健康小鼠80只，分四组实验。给药后，在第7天和14天，观察，称重。并于实验结束后称重，处死，解剖观察内部器官。

结论：

1、小鼠一日一次口服灌胃给药，给药剂量50毫克/公斤体重，未见明显急性毒性反应。LD50＞50mg/kg。

2、小鼠一日一次腹腔注射给药，给药剂量50毫克/公斤体重，未见明显急性毒性反应。LD50＞50mg/kg。

由上所述，本发明多肽在50毫克每公斤体重剂量下未见明显急性毒性表现。

实施例4：含本发明多肽的饲料添加剂的制备。

配方一

配方二

配方三

具体实施过程中，先把多肽和淀粉或者黄糊精一起喷粉干燥或者冷冻干燥，然后和其他的配料混合均匀。

实施例5：含本发明多肽的饲料的制备。

实施例6：对牛乳腺炎症的治疗作用

本发明多肽对于奶牛乳腺炎有明显的治疗作用，同时对奶牛乳房组织和细胞有明显的保护，恢复和治疗作用。

引言：

奶牛乳腺炎是奶牛饲养中的一种常见病和顽固病症。通过对奶牛泌乳中的体细胞计量，可以评估本发明多肽对于奶牛乳腺组织的保护治疗作用。

材料和方法：

1.在奶牛饲养场，选取有临床症状的乳腺炎发病奶牛40头为一组，共两组。一组喂饲本发明多肽8毫克/头.天。一共21天。另一组采用常规治疗办法治疗。

2.在奶牛饲料厂，选取临界临床症状的亚健康奶牛40头为一组，共4组。其中两组喂饲本发明多肽，4毫克/头.天。一共21天。另两组采用常规喂养。

3.在奶牛饲料厂，选取正常健康奶牛40头为一组，共4组。其中两组喂饲本发明多肽，2毫克/头.天。一共21天。另两组采用常规喂养。

喂饲过程中，第一组对照组，观察临床症状的改善，同时每次取乳后，计量牛乳中体细胞的数目。第二组和第三组观察临床症状是否产生，同时同时每次取乳后，计量牛乳中体细胞的数目。

结果：

在第一组具有临床症状的对照组中间。喂饲过本发明多肽的对照组平均乳腺炎治愈时间为8天，对照

组采用抗生素治疗，平均治愈时间为11大。喂饲过程中，喂饲组的平均牛乳体细胞数量为76万每毫升。对照组为160万每毫升。

在第二组具有亚临界症状的亚健康的牛中间，两组喂饲本发明多肽的牛中间，只有一头发病，并且症状不明显。对照组两组中，有7头发病，需要治疗。喂饲组在喂养前，测量体细胞数目：最高为139万每毫升，最低为87万每毫升，平均为110万每毫升。喂饲后，最高为67万每毫升，最低为29万每毫升，平均为45万每毫升。对照组在实验前，测量体细胞数目：最高为127万每毫升，最低为93万每毫升，平均为119万每毫升。试验后，最高为145万每毫升，最低为102万每毫升，平均为123万每毫升。

第三组健康奶牛，两组喂饲本发明多肽的牛中间，没有一头发病或进入亚临界状态。对照组两组中，有8头进入临界状态，同时有3头发病，需要治疗。喂饲组在喂养前，测量体细胞数目：最高为119万每毫升，最低为67万每毫升，平均为81万每毫升。喂饲后，最高为69万每毫升，最低为25万每毫升，平均为39万每毫升。对照组在实验前，测量体细胞数目：最高为123万每毫升，最低为83万每毫升，平均为91万每毫升。试验后，最高为121万每毫升，最低为92万每毫升，平均为108万每毫升。

由上述结果可以看出，采用本发明多肽喂饲的奶牛组，在体细胞数目上明显小于对照组。在治愈和预防牛乳腺炎症状上，明显好于对照组。

Claims

1.一种多肽，其特征是，该多肽的氨基酸序列是具有序列表中记载的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列、SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的多肽。

2.权利要求1记载的多肽，其特征是，含有8-15个氨基酸残基、分子量为900-1600道尔顿并且具有多种组织保护活性。所述多肽具有通式：【Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa】或者：[Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]，

Yaa是碱性氨基酸残基，特别是Lys、Arg、Om或His，

Zaa是酸性氨基酸残基，特别是Glu、Asp、Aad或Apm。

3.一种药物制剂，其特征是，权利要求1或2记载的多肽，选择与一种或多种药物载体组合，制成多种药物剂型。这些药物剂型涵盖：注射溶液、片剂、霜剂、胶囊、软膏、洗剂、舌含片等剂型局部或全身给药。

4.一种饲料，其特征是，权利要求1、2或3记载的多肽或药物制剂，添加入饲料或以饲料添加剂等各种方式制备的饲料。

5.权利要求1或2记载的多肽或药物制剂用于组织炎症的治疗。

6.权利要求1、2或3记载的多肽、药物制剂或饲料，用于奶牛乳腺炎的治疗。

7.权利要求1、2或3记载的多肽、药物制剂或饲料，用于动物、宠物的治疗及保健。

8.权利要求1、2或3记载的多肽、药物制剂或饲料，以任何形式(或者添加形式)喂饲动物或者宠物。

9.权利要求1、2或3记载的多肽、药物制剂或饲料，作为兽药形式治疗动物或者宠物。