BRPI1005349B1 - Proteína de fusão para imunocastração, sequências de dna, vacina veterinária e uso da mesma, processo para produção de uma vacina veterinária e processo para preparar uma proteína de fusão - Google Patents

Abstract

proteína de fusão para imunocastração, sequências de dna, vacina veterinária e uso da mesma, processo para produção de uma vacina veterinária e processo para prepara uma proteína de fusão. a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que incorpora o hormônio liberador de gonadotrofinas (gnrh) para a imunocastração de mamíferos, sequências de dna que codificam a referida proteína de fusão, vacina que compreende a referida proteína de fusão, e processo para prepara a proteína de fusão. a proteína de fusão incorpora a sequência aminoacídica do hormônio gnrh fundida a uma de acordo com a seq id nº 14, não derivada de patógeno, com capacidade imunogênica e que contém sítios de o-glicosilação.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se ao campo da Engenharia

Genética e Biotecnologia, e em particular ao uso de um polipeptídio que incorpora a sequência de aminoácidos do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH-I) para a imunocastração de mamíferos. Breve Sumário da Invenção

[0002] O polipeptídio da presente invenção é um polipeptídioquimérico ou glicopeptídio, formado pela fusão da sequência de aminoácidos do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH-I) ou suas variantes, e uma sequência teórica não derivada de patógeno que melhora a imunogenicidade de GnRH. A presente proteína de fusão, sua versão glicosilada, assim como suas repetições em tandem, podem ser utilizadas, em conjunto com diferentes tipos de adjuvantes para a imunoneutralização do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH-I) gerando um bloqueio da esteroidogênese, ovogênese e espermatogênese em diferentes espécies animais.

Comentários da Técnica Anterior

[0003] As capacidades reprodutivas de ambos os sexos namaioria das espécies animais sofrem flutuações cíclicas temporais graças aos efeitos gerados pelos hormônios sexuais sobre as gônadas e o sistema reprodutor em geral. O hormônio liberador de gonadotrofinas ou GnRH desempenha um papel central neste processo.

[0004] O hormônio GnRH-I é um decapeptídio que possui umasequência de aminoácidos evolutivamente muito conservada e comum para a maioria dos mamíferos. O GnRH-I é liberado a partir da porção mesobasal do hipotálamo e penetra na corrente sanguínea, onde na hipófise induz a liberação de LH e FSH das células gonadotróficas. Há vários anos vem se tratando de gerar imunoneutralização do hormônio GnRH como controle da esteroidogênese, ovogênese e espermatogênese. O bloqueio de GnRH e a concomitante diminuição nos níveis de gonadotrofinas têm várias aplicações, e portanto na medicina humana a diminuição na produção de andrógenos em pacientes com carcinoma de próstata é branco de tratamento há vários anos. Por outro lado, na medicina veterinária o bloqueio da capacidade reprodutiva com efeitos secundários mínimos em animais de estimação ou espécies silvestres que possam significar pragas tem sido um amplo tema de investigação e desenvolvimento. No âmbito da produção animal, a castração cirúrgica de machos é um procedimento rotineiro para evitar um comportamento sexual agressivo ou para evitar que a carne adquira características organolépticas indesejáveis devido ao efeito de feromonas. Em todos estes cenários, a utilização de uma vacina capaz de bloquear a função do hormônio GnRH-I constitui uma importante ferramenta.

[0005] O efeito de diferentes vacinas contra o hormônio GnRH foiavaliado em um grande número de espécies animais, utilizando um variado tipo de moléculas associadas ao GnRH em conjunto com diferentes tipos de adjuvantes. A maioria desses enfoques baseia-se na síntese química de haptenos unindo GnRH a uma molécula altamente imunogênica como albumina bovina (BSA), ovalbumina (OVA), toxoide tetânico (TT) ou hemocianina (KLH)(Sad, Chauhan et al. 1993; Beekman, Schaaper et al. 1999; Dunshea, Colantoni et al. 2001; Miller, Gionfriddo et al. 2008). No entanto, foi descrito um fenômeno de dominância antigênica, no qual estas proteínas "veículo" suprimem a resposta para epítopos da molécula de interesse depois de sucessivas imunizações, em um mecanismo de tolerância ao antígeno GnRH(Sad, Gupta et al. 1991; Sad, Gupta et al. 1991; Sad, Talwar et al. 1991). A supressão de epítopos pode ser resultado de um defeito na apresentação do hapteno por linfócitos B específicos desenvolvendo uma resposta imune do tipo "auxiliar" 2 (Th2) (Renjifo, Wolf et al. 1998). A exclusão de epítopos com alta antigenicidade, como apresentado na presente invenção, reduz o risco de supressão antigênica e favorece uma resposta imune a favor do antígeno GnRH, o que permite sua utilização em repetidas imunizações eficientemente. Outras desvantagens do uso do modelo de proteínas "veículo" é o alto custo na síntese e conjugação dos antígenos.

[0006] A tecnologia de DNA recombinante tem sido usada paracriar moléculas de GnRH repetidas em tandem, unidas a diferentes sequências proteicas como imunógenos para linfócitos T auxiliares (Hannesdottir, Han et al. 2004; Jinshu, Jingjing et al. 2004; Khan, Ferro et al. 2007; Zhang, Xu et al. 2007; Khan, Ogita et al. 2008). Proteínas recombinantes com múltiplos enxertos de GnRH demonstraram que a imunogenicidade aumenta com o número de sequências GnRH enxertadas [15], e esta vantagem pode ser utilizada ao se incorporar um maior número de repetições do peptídio de fusão na formulação. Múltiplos epítopos de células B ou T como lipopeptídios (Pam3Cys) ou diferentes sequências peptídicas de patógenos como Plasmodium falsiparum, Mycobacterium, vírus sincicial respiratório ou vírus influenza, flanqueando sequências de GnRH já foram utilizados em vários modelos "vacinais" e mostraram eficácia (Khan, Ferro et al. 2007). Neste contexto, o presente antígeno não incorpora sequências de patógenos que possam interferir no desencadeamento de uma resposta imune contra a sequência de GnRH, uma vez que a sequência intergênica utilizada entre as repetições de GnRH foi desenhada para melhorar a antigenicidade da sequência de GnRH.

[0007] Neste sentido, o documento US 2005/0239701 A1 refere-seao uso como vacina de multímeros de GnRH unidos a proteínas "veículo" ou a fragmentos das mesmas como toxinas bacterianas, e ao uso de vetores recombinantes que incorporam sequências genéticas que codificam para multímeros de GnRH, isolados ou em combinação com sequências genéticas que codificam proteínas "veículo" tais como o fragmento da toxina tetânica C. Os referidos vetores recombinantes destinam-se a modificar a conduta sexual, a fertilidade ou ambos, nos vertebrados por meio da indução de uma resposta imune que altera a função sexual fisiológica normal. A presente invenção não incorpora sequências gênicas ou peptídicas de proteínas "veículo", tampouco corresponde a multímeros de GnRH isolados, já que incorpora uma sequência intergênica não associada a patógenos ou proteínas "veículo" que funciona melhorando a imunogenicidade de GnRH como antígeno, e além disso esta sequência tem o potencial de ser glicosilada quando a proteína recombinante é expressa em sistemas eucariotas capazes de realizar modificações pós-traducionais nas proteínas.

[0008] A publicação internacional WO 01/85763 divulga peptídiosquiméricos com eficácia imunogênica que compreendem a sequência do hormônio GnRH e misturas de epítopos para células T "auxiliares" obtidos de diferentes patógenos ou peptídios com imunogenicidade conhecida como a toxina tetânica, Plasmodium falciparum, ou a proteína F do vírus do sarampo, para a produção de títulos de anticorpos anti-GnRH.

[0009] Em geral, a maioria das publicações nas quais seapresenta a utilização de proteínas de fusão, o método consiste na utilização de sequências de patógenos que funcionam como epítopos de linfócito T-auxiliar, unidos a um número diferente de repetições de GnRH ou como no caso de uma síntese química as repetições de GnRH unidas a uma molécula imunogênica per se. Um exemplo disto é o documento "Use of recombinant gonadotropina-releasing hormone antigens for immunosterilizacion of beef heifers", Journal of Animal Science, 2006; 84(2): 343-50, Geary TW, Grings EE, MacNeil MD, de Avila DM, Reeves JJ.

[00010] Um grande número de estudos já foi realizado em porcos e gado para investigar o uso da imunização contra GnRH como método para melhorar a taxa de crescimento e a carne produzida obtida dos animais. Vide por exemplo, Adams and Adams, J. Animal Sci. (1992) 70:1691-1698; Caray and Bonneau, C.R. Acad. Sc. Paris (1986) 303:673-676; Chaffaux et al, Recueil de Medicine Veterinaire (1985) 161:133-145; Finnerty et al., J. Repro. Fertil. (1994) 101:133-343. A castração elimina a fonte de esteroides anabólicos endógenos e a conversão alimentícia se torna menos eficiente, os animais precisam comer mais para gerar canais de mesmo peso e produzem maior cobertura adiposa. Neste sentido, já foi demostrado que o crescimento de um animal inteiro é mais eficiente que o de um animal castrado. A presença de esteroides sexuais no animal funciona como anabólicos naturais, permitindo que este animal tenha um melhor desempenho no crescimento e desenvolvimento muscular, graças a uma melhora substancial na eficiência de conversão alimentícia. A melhor eficácia na conversão alimentícia tem ainda implicações ambientais positivas a nível mundial uma vez que ela se traduz em um menor consumo de alimento com menos pressão para as terras agrícolas e redução na produção de despejos, promove uma indústria mais sustentável usando menos alimento e gerando menos despejos por cada quilo de carne produzido. O objetivo de muitos desses estudos era permitir que os animais crescessem como machos na sua forma intacta aproximando-se do final da etapa de engorda para então serem submetidos a uma castração imunológica. O uso de vacinas anti- GnRH foi proposto como uma alternativa viável para manter em produção machos sem castração, os quais são vacinados ao final da etapa produtiva, permitindo a metabolização dos hormônios sexuais e seu olor associado. Já foram concedidas várias patentes que abordam esta problemática (Patente US N° 4.975.420 1990; Patente US N° 6.045.799 2000; Patente US N° 6.761.890 B1 2004; entre outras) no entanto, nestas patentes as moléculas utilizadas como antígenos são conjugações químicas da sequência de aminoácidos do hormônio GnRH a uma molécula "veículo". Neste sentido, o pedido de patente US 2005/0239701 A1 protege o uso de um esquema de vacinação com duas doses 4 a 8 semanas antes do sacrifício do animal para assegurar a eficácia da vacina, por um curto período de tempo, isto limita a aplicação de vacinas contra GnRH que tenham pouca eficácia e que requeiram revacinações para atingir os títulos de anticorpos neutralizantes para bloquear o efeito hormonal.

[00011] Da mesma forma, os seguintes artigos científicos também se referem à conjugação da sequência GnRH e uma molécula "veículo":

[00012] Beekman, N.J., W.M. Schaaper, et al. (1999). "Highly immunogenic and fully synthetic peptide-veículo constructs targeting GnRH." Vaccine 17 (15-16): 2043-50 indicam que para usar peptídios como vacinas sintéticas elas precisam ser acopladas a uma proteína "veículo" para torná-las mais imunogênicas. Entretanto, a eficiência do acoplamento entre a proteína "veículo" e uma proteína é difícil de controlar com relação à densidade de carga do peptídio. Isto faz com que estas proteínas "veículo" sejam pouco adequadas na prática. Já foram reportadas tentativas para encontrar moléculas "veículo" ou sistemas de distribuição que permitem um acoplamento fácil ou a incorporação de peptídios, densidade de carga reproduzível e produtos bem definidos. Os autores compararam várias construções promissoras ou sistemas de distribuição por imunização de porcos macho utilizando um peptídio GnRH em tandem como construção polilisina ramificada, um lipo-tioéster, uma lipo-amida ou um conjugado KLH em CFA, e o peptídio lipoamida em um complexo imunossimulador (ISCOM). Os autores verificaram que as construções de lipo-tioéster e de polilisina ramificada constituíam as moléculas "veículo" mais eficazes para a indução de anticorpos contra GnRH e imunocastração em porcos.

[00013] Khan, M.A., K. Ogita, et al. (2008). "Immunisation with a plasmid DNA vaccine encoding gonadotrophin releasing hormone (GnRH-1) and T-auxiliar epitopes in saline suppresses rodent fertility." Vaccine 26 (10): 1365-74 relatam que a investigação em imunização ativa contra o hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH-I) obteve aceitação como meio para controlar a reprodução e o comportamento em animais de curral, de estimação ou selvagens. Muitos estudos descrevem o uso de múltiplas cópias do mesmo peptídio em alineação e conjugação com uma proteína "veículo" maior para aumentar a resposta imune do peptídio. Entretanto, os problemas que resultam da supressão do epítopo da proteína "veículo" diminuíram o interesse no uso de materiais genéticos que iniciam uma resposta imune ótima. No estudo realizado pelos autores, uma vacina de 533 bases de pares de DNA foi construída em pcDNAV5-HisB codificando para 18,871 kDa GnRH-I-T-auxiliar-V5 epítopos de proteínas de fusão. Foram encontradas células transfectadas COS1 com a construção de vacina que liberam proteína de fusão no sobrenadante de cultura. A construção de vacina (100 μg/camundongo) em solução salina administrada no músculo quadríceps anterior de camundongos ICR machos e fêmeas estimulou a resposta ao anticorpo IgG antígeno específico. Os níveis de testosterona nos machos vacinados foram significativamente reduzidos (p = 0,021). Foi observada uma redução significativa nos implantes uterinos depois do acasalamento entre machos imunizados e fêmeas de controle (p = 0,028) como também em fêmeas imunizadas e machos de controle (p = 0,004). O exame histológico das gônadas tanto dos machos como das fêmeas em estudo na semana 13 mostrou atrofia do epitélio seminífero e supressão de foliculogênese.

[00014] Miller, L.A., J.P. Gionfriddo, et al. (2008). "The single-shot GnRH immunocontraceptive vaccine (GonaCon) in White-tailed deer: comparison of several GnRH preparations." Am J Reprod Immunol 60 (3): 214-23 Indicam que o problema é a necessidade de uma injeção de um agente GnRH contraceptivo que seja única, eficaz, multianual para controlar a reprodução na população sobreabundante de veado de rabo branco. O método de estudo nesta investigação refere-se a dois conjugados GnRH, GonaCon (GnRH-KLH) e GonaCon-B (proteína GnRH-Blue®), que foram preparados em emulsão como formulações de vacina imunocontraceptivas de uma injeção e duas injeções. Além disso, o conjugado de proteína GnRH-KLH foi liofilizado e suspenso no adjuvante AdjuVac para produzir uma formulação de quinta vacina. Cada formulação foi administrada a um grupo de cinco veados de rabo branco fêmeas adultas em cativeiro. O desempenho reprodutivo das fêmeas tratadas foi monitorado por 5 anos para determinar a eficácia comparativa dos diferentes tratamentos. O resultado obtido do estudo indica que a longevidade da resposta contraceptiva (2 a 5 anos) foi fortemente influenciada pelo desenho do antígeno conjugado, o adjuvante utilizado, e a forma de distribuição da vacina. Os autores concluíram que as formulações de uma e duas injeções de GonaCon e GonaCon-B produzem contracepção multianual em veado de rabo branco fêmeo adulto. GonaCon-B produz um efeito contraceptivo mais duradouro.

[00015] Sad, S., V.S. Chauhan, et al. (1993). "Synthetic gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) vaccines incorporating GnRH and synthetic T-auxiliar epitopes." Vaccine 11 (11): 1145-50Referem-se ao desenvolvimento de uma vacina contra o hormônio que libera a gonadotrofina (GnRH) como método imunológico para o tratamento de hipertrofia da próstata, com base na observação de que a imunização ativa contra GnRH leva à produção de anticorpos anti- GnRH que resultam na diminuição da glândula prostática. Os autores investigaram a regulação das respostas de anticorpos anti-GnRH pelas moléculas "veículo". Em estudos anteriores, os autores demostraram que o uso de moléculas de grandes proteínas como "veículos" limita o uso de tais vacinas devido aos problemas potenciais da supressão anti-haptênica induzida pelo veículo. Neste estudo, os autores demonstram que os epítopos T-auxiliares sintéticos podem ser utilizados como "veículos" para a geração de resposta de anticorpos anti-GnRH.

[00016] No entanto, de acordo com a presente invenção, o uso de adjuvantes imunopotencializadores permitiu obter efeitos "vacinais" de longo prazo utilizando uma única dose de vacina, por conseguinte, a utilização do antígeno da presente invenção em diferentes formulações permite modificar o esquema de vacinação.

Breve Descrição das Figuras

[00017] Figura 1. Mostra a resposta imune contra a proteína recombinante denominada GnRXG/Q, da presente invenção, medida pela técnica de ELISA, como um aumento de imunoglobulinas IgG, nos animais vacinados versus o controle, observados como densidade ótica específica contra o peptídio recombinante GnRXG/Q em animais imunizados, utilizando um adjuvante aquoso na formulação. A diluição de soro utilizada foi de 1:250 e o tamanho da amostra foi de 10 indivíduos por grupo. Os animais foram imunizados no dia 0 e 15. Na figura 1 -■- corresponde a Controle PBS e -A- corresponde a GNRXG/Q + Adjuvante.

[00018] Figura 2. Mostra a diminuição na concentração sérica de testosterona, medida pela técnica de ELISA, em animais imunizados com a proteína recombinante denominada GnRXG/Q, da presente invenção, versus controle nos dias 0 e 15 em um número de 10 indivíduos por grupo. Na figura 2 -■- corresponde a Controle PBS e -A- corresponde a GNRXG/Q + Adjuvante.

[00019] Figura 3. Mostra a resposta imune contra a proteína recombinante denominada GnRXG/Q, da presente invenção, como um aumento de imunoglobulinas específicas, medido pela técnica de ELISA, utilizando diferentes adjuvantes na formulação, em um ensaio de 15 semanas. Os animais (n=5) foram imunizados no dia 0 e 30 e o aumento em imunoglobulinas foi avaliado até o dia 110. Na figura 3 -■corresponde ao controle PBS, -A- corresponde a GNRXG/Q + Chi-H MW, -Δ- corresponde a GNRXG/Q + Chi-L MW, e -•- corresponde a GNRXG/Q + CFA.

[00020] Figura 4. Mostra a atrofia testicular provocada pela imunização com a proteína recombinante denominada GnRXG/Q da presente invenção e um adjuvante em sua formulação. Em A vemos testículos de um camundongo de controle (1) e de um camundongo imunizado com o peptídio GnRX G/Q (2) na parte inferior da fotografia se observa uma escala em centímetros; em B vemos cortes histológicos dos testículos em dois níveis de amplificação.

[00021] Figura 5. Mostra a diminuição na concentração de testosterona sérica, medida pela técnica de ELISA, em cães imunizados com o peptídio recombinante denominado GnRXG/Q, da presente invenção, em associação com um adjuvante. Os animais (n=7) foram imunizados no dia 0 e 30 e o efeito da vacina foi avaliado durante 3 meses.

[00022] Figura 6. Gel de poliacrilamida SDS a 10% no qual se mostra a proteína recombinante denominada GnRX G/Q da presente invenção, repetida em tandem, purificada a partir de um extrato total de proteínas bacterianas, com um peso aproximado de 29 quiloDalton. Descrição Detalhada da Invenção

[00023] A presente invenção compreende o desenho, a expressão e a purificação da seguinte proteína recombinante (Sequência SEQ ID NO: e Sequência SEQ ID NO: 2, vide listagem de sequências) com uma estrutura primária que incorpora a sequência de aminoácidos do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH-I) fundida a uma sequência teórica glicosilável e com atividade imunogênica, que não inclui sequências de patógenos ou de proteínas "veículo" em sua estrutura.

[00024] Nas sequências SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2, observa-se em negrito a sequência peptídica do hormônio GnRH-I de 10 aminoácidos, fundida à sequência teórica glicosilável de 14 aminoácidos, este peptídio quimérico de 24 aminoácidos foi denominado GnRX G/Q.

[00025] Outro aspecto da invenção compreende a vacina que compreende o peptídio denominado GnRX G/Q, para ser utilizado isolado ou em uma repetição em tandem, o procedimento para produzir a vacina, seu uso e método para a imunocastração de mamíferos.

[00026] A sequência "teórica" pode estar flanqueando a sequência de GnRH-I em qualquer ordem (extremidade amino ou carboxila do peptídio, Sequência SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2).

[00027] Outro aspecto da invenção compreende a construção, vide sequência SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4 da listagem de sequências, formada pelo peptídio quimérico GnRX G/Q repetido em tandem 10 vezes e que é visto como proteína recombinante migrando electroforeticamente em um gel de SDSPAGE a 10 % na figura 6.

[00028] Outro aspecto da invenção compreende sequências nucleotídicas e os vetores correspondentes. As sequências nucleotídicas foram desenhadas por genética inversa para serem utilizadas como modelos na expressão recombinante do peptídio GnRX G/Q, as quais foram inseridas em vetores de expressão procariotas e eucariotas (sequências SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 6, vide listagem de sequências), resultando na proteína da sequência SEQ ID N°: 7 (vide listagem de sequências) que está indicada na listagem de sequências.

[00029] A presente proteína foi concebida como uma proteína de fusão recombinante ou quimérica, na qual de pode encontrar a sequência de aminoácidos de GnRH como uma porcentagem da molécula total (40%), a porcentagem restante (60%) correspondendo a uma sequência desenhada a partir da análise bioinformática de diferentes peptídios, desenhando-se uma sequência única que permite melhorar a imunogenicidade do segmento correspondente à sequência de GnRH, evitando a incorporação de segmentos imunodominantes como imunógenos derivados de patógenos, toxinas ou proteínas "veículos", o que a diferencia de outras moléculas patenteadas na técnica anterior.

[00030] A sequência desenhada possui uma hidrofobicidade notável e incorpora uma sequência consenso que pode ser O-glicosilada em sistemas de expressão proteica eucariota como leveduras ou células de inseto. Esta modificação está voltada a melhorar a antigenicidade do peptídio para aumentar a capacidade de ser reconhecida pelo sistema imune. Além disso, a incorporação deste segmento glicosilável diferencia a presente proteína de outras proteínas de fusão, que incorporam GnRH, por tratar-se o presente glicopeptídio de um proteoglicano. Em consequência, o sistema imune reconhecerá integralmente a molécula como um hapteno e não somente um segmento imunogênico da mesma.

[00031] Outro aspecto da invenção compreende o procedimento para preparar a proteína de fusão, no qual a sequência nucleotídica que codifica para a proteína recombinante (sequência SEQ ID NOs: 5 e 6) foi inserida em um vetor de expressão com promotor induzível para bactérias E. coli Bl21(pQE 80l, Qiagen) ou um vetor com promotor induzível para levaduras S. serveciae (pYES, invitrogen). A proteína foi purificada por cromatografia de afinidade em colunas de Ni sefarose, o que permite eliminar possíveis contaminantes do sistema de expressão, principalmente pirogênios, tais como(Lipopolissacarídeo (LPS).

[00032] Esta sequência "teórica" foi desenhada utilizando os seguintes 10 algoritmos bioinformáticos que avaliam as propriedades de hidrofobicidade, hidrofilicidade e antigenicidade de uma sequência peptídica: 1) Algoritmo de Hidrofobicidade Fauchere-Pliska, o qual gera um perfil de propriedades utilizando uma escala de hidrofobicidade baseada em partições experimentais octanol/água de amidas de N-acetil aminoácidos de cada resíduo a pH neutro; 2) Algoritmo de hidrofilicidade de Goldman/Engelman/Steitz, o qual gera um perfil de propriedades calculando os resíduos não polares nas hélices α; 3) algoritmo de hidrofobicidade de Janin, o qual gera um perfil de propriedades de hidrofobicidade baseado na fração molar de ocorrências de resíduos ocultos ou expostos em proteínas conhecidas; 4) algoritmo de hidrofobicidade de Kyte Doolittle, o qual gera um perfil de propriedades de hidrofobicidade e hidrofilicidade baseado em valores de kyte doolittle para resíduos individuais em regiões internas ou externas de uma proteína globular; 5) Algoritmo de hidrofobicidade de Manavalan, o qual gera um perfil de propriedades baseado na hidrofobicidade de um resíduo individual modificado pela presença de outros resíduos em um raio de 8 angstrom; 6) Algoritmo de hidrofilicidade de von Heijne, o qual gera um perfil de propriedades usando uma escala que reflete a energia livre de transferência estimada quando uma hélice α se desloca de uma fase aquosa para uma fase não polar; 7) algoritmo de antigenicidade de Hopp and Woods, a escala de Hopp-Woods foi desenhada para prever a localização de determinantes antigênicos em uma proteína, presumindo-se que estes estão expostos na superfície de uma proteína e ficam localizados onde existem regiões hidrofílicas; 8) algoritmo de antigenicidade de Parker, esta ferramenta prevê a presença de determinantes antigênicos pela presença de áreas de grande hidrofobicidade local usando uma escala baseada nos tempos de retenção em HPLC de peptídios modelos; 9) Algoritmo de antigenicidade de Protrusion Index, esta ferramenta gera um perfil de propriedades utilizando um índice de protrusão que é uma escala de antigenicidade baseada no estudo de proteínas com estrutura 3D conhecida; e 10) algoritmo de antigenicidade de Welling, esta ferramenta calcula um valor de antigenicidade como o log do quociente entre a porcentagem de uma amostra com regiões antigênicas conhecidas e a porcentagem de proteínas média.

[00033] Diferentes sequências de aminoácidos foram avaliadas em sua potencial capacidade de melhorar a antigenicidade e a hidrofilicidade da sequência para GnRH-I quando estão fundidas na extremidade terminal amino ou carboxila de GnRH, assim como em repetições em tandem, sendo comparadas com uma sequência de GnRH-I repetida em tandem sem a presença de sequências intergênicas. Utilizando-se os parâmetros acima mencionados, foi desenhada a sequência de aminoácidos NH2-GPPFSGGGGPPFSA- COOH, que apresenta um escore de hidrofobicidade na maioria dos algoritmos, superior a 0 e maior que aquele da sequência GnRH-I. Da mesma forma por sua condição hidrófoba, apresenta uma escassa antigenicidade permitindo, ao se analisar a molécula global, que a antigenicidade da sequência GnRH-I melhore consideravelmente comparada com uma sequência de GnRH-I repetida em tandem sem sequências intergênicas. Em seu desenho foi incorporada a sequência sinalizadora de consenso SGGG, que corresponde a um sítio de O- glicosilação, que é suscetível de receber esta modificação pós- translacional quando a proteína é expressa em leveduras ou outras células eucariotas. Este tetrapeptídeo que possui a sequência geral Ser-Gly-Xaa-Gly (em que Xaa pode ser qualquer aminoácido) corresponde a um sítio de reconhecimento para a incorporação de um glicosaminoglicano (Burdon M., et al., 1987). Por último no desenho desta sequência foi considerada a exclusão de semelhanças com sequências de patógenos ou proteínas "veículo". Para tanto, foi efetuada uma análise de busca e alinhamento desta sequência em bancos de dados presentes no GenBank utilizando a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Toll). Em nenhum deles foi encontrada a sequência 1a e 1b da presente invenção.

[00034] Para a fabricação e expressão da proteína recombinante, a sequência nucleotídica de cordão duplo foi ligada para obter repetições em tandem, e posteriormente, inserida em vetores de expressão procariotas e eucariotas induzíveis por IPTG ou glicose. A proteína recombinante obtida possui um marcador de 6 repetições de histidina, o que permite sua purificação a partir de outras proteínas endógenas do hospedeiro por meio de cromatografia de afinidade com níquel ou cobalto.

[00035] Outro aspecto da invenção compreende as sequências nucleotídicas nas quais o códon a ser utilizado na tradução é variado, que podem gerar o mesmo peptídio quimérico, como se observa nas sequências SEQ ID NOs: 8-13 da listagem de sequências.Antecedentes Técnicas da Invenção

[00036] Para testar a efetividade da proteína da presente invenção, especificamente aquela da Sequência SEQ ID N°: 7 em suacapacidade de bloquear a esteroidogênese, ovogênese e espermatogênese em animais de laboratório, através da imunoneutralização de GnRH, a proteína gerada e purificada mencionada acima foi inoculada em animais de laboratório em quantidades de 50 a 500 μg em um adjuvante oleoso, particularmente o adjuvante completo ou incompleto de Freund ou um adjuvante experimental, especificamente quitosano, sendo analisados diferentes parâmetros como a capacidade dos animais de formar anticorpos contra a proteína, sua atividade reprodutiva, espermatogênese, ovogênese e níveis de andrógenos.

Experimento 1

[00037] A molécula como vacina foi testada em um tamaho de amostragem de 18 animais de laboratório obtendo-se diferenças significativas (p<0,01) em termos do efeito fisiológico esperado e resposta imune adaptativa com o grupo de controle, utilizando diferentes adjuvantes. (Vide figuras 1 a 4).

[00038] Dez camundongos machos de 8 semanas de idade foram imunizados com 100 μg da proteína recombinante GnRX G/Q (sequência SEQ ID N°: 7) em 100 μl de um adjuvante comercial, particularmente adjuvante completo de Freund, nos dias 0 e 15 por via subcutânea. Sangue foi coletado dos animais a cada 15 dias para avaliar a efetividade da vacina e sua capacidade para elevar os títulos de imunoglobulinas contra o hormônio GnRH-I. Na figura 1 vemos o aumento nos níveis de imunoglobulinas específicos contra o hormônio GnRH-I, medido pela técnica de ELISA, dos animais imunizados, em relação ao controle. Na figura 2 vê-se a redução nos níveis de testosterona sérica, medida pela técnica de ELISA, dos animais imunizados com a proteína recombinante GnRX G/Q mencionada acima comparados com um grupo de controle. Ao término do ensaio os animais foram sacrificados e ambos os testículos foram comparados macroscópica e microscopicamente com um grupo de animais de controle (figura 4.).

Experimento 2

[00039] Quinze camundongos machos de 8 semanas de idade foram imunizados com 100 μg da proteína recombinante GnRX G/Q em 200 ul de um adjuvante comercial, especificamente adjuvante completo de Freund, e 2 adjuvantes experimentais, particularmente quitosano de alto e baixo peso molecular, a 0,5% em v/v, nos dias 0 e 30 da experiência. Sangue foi coletado dos animais a cada 15 dias, avaliando-se o efeito da vacina no aumento de imunoglobulinas específicas contra o hormônio GnRH-I no tempo medido pela técnica de ELISA (figura 3).

Experimento 3

[00040] Sete cães machos adultos mestiços foram imunizados com 200 μg da proteína recombinante GnRX G/Q (sequência SEQ ID N°: 7) em 1 ml de um adjuvante comercial, particularmente adjuvante incompleto de Freund, nos dias 0 e 30. Sangue foi coletado dos animais a cada 30 dias para avaliar o efeito da vacina nos níveis plasmáticos de testosterona. Na figura 5 vemos a redução nos níveis de testosterona com o tempo para valores próximos ao da castração cirúrgica (0,1 ng/ml), medida pela técnica de ELISA.

Claims (13)

1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende:(i) a sequência de aminoácidos primária do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) como definida por Gln-His-TrpSer-Tyr-Gly-Leu- Arg-Pro-Gly, fundida com:(ii) uma sequência com capacidade imunogênica, que contém sítios de O-glicosilação como definida por Gly-Pro-Pro-PheSer-Gly-Gly-Gly- Gly-Pro-Pro-Phe-Ser-Ala,em que a referida proteína de fusão compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs 1 e 2, ou uma ou mais repetições das mesmas.

2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 7.

3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizada pelo fato de que compreende a sequência sinalizadora SGGG, correspondente a um sítio de O-glicosilação, capaz de receber a modificação pós-translacional quando a proteína é expressa em levedura ou outras células eucariotas.

4. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é uma proteína de fusão re- combinante ou quimérica, em que a sequência de aminoácidos de GnRH corresponde a 40% da molécula total e a sequência O-glicosilada corresponde a 60% da molécula total.

5. Sequência de DNA caracterizada pelo fato de que apresenta uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8 a 13.

6. Vacina veterinária, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou sequência de DNA, como definida na reivindicação 5 , e um ou mais adjuvantes veterinariamente aceitáveis.

7. Vacina veterinária, de acordo com a reivindicação 6, caracte- rizada pelo fato de que compreende entre 50 a 500 μg da proteína de fusão, como definida na reivindicação 1.

8. Vacina veterinária, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende entre 100 a 200 μg da proteína de fusão, como definida na reivindicação 1.

9. Vacina veterinária, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende 100 μg da proteína de fusão, como definida na reivindicação 1.

10. Vacina veterinária, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende 200 μg da proteína de fusão, como definida na reivindicação 1.

11. Uso da vacina veterinária, como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de composições para a imunocastração de animais.

12. Processo para produção de uma vacina veterinária, como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende misturar a proteína de fusão, como definida na reivindicação 1, ou a sequência de DNA, como definida na reivindicação 5, com um ou mais adjuvantes veterinariamente aceitáveis.

13. Processo para preparar uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende fundir a sequência de aminoácidos do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH-I) como definida por GlnHis-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-rg- Pro-Gly, com uma sequência que contém sítios de O-glicosilação tendo atividade imunogênica e consistindo na sequência de aminoácidos Gly-Pro- Pro-Phe-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-ProPro-Phe-Ser-Ala, para obter uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs 1 e 2, ou uma ou mais repetições das mesmas.

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