KR20230035060A - 세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 치료 용도의 cd1 펩티드-에피토프 - Google Patents

세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 치료 용도의 cd1 펩티드-에피토프 Download PDF

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Abstract

세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 치료 용도의 CD1 펩티드-에피토프
세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 치료 용도의 CD1 펩티드-에피토프, 상기 CD1 펩티드-에피토프의 동정 방법, 상기 CD1 펩티드-에피토프를 포함하는 약제학적 키트 및 상기 CD1 펩티드-에피토프로의 백신접종에 기초하여 세포내 병원체에 의해 유발된 질병에 대해 환자를 치료하거나 그러한 감염을 예방하는 방법.

Description

세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 치료 용도의 CD1 펩티드-에피토프
본 발명은 세포독성 T 세포에 의해 지배되는 강한 세포독성 반응에 따른 세포내 병원체의 특이적 치료를 위한 면역학 분야에 관한 것이다.
바이러스나 박테리아와 같은 세포내 병원체는 실제로 강력한 특정 해결책이 존재하지 않기 때문에 주요 관심사이다.
실제로, 바이러스 감염에 대한 반응은 CD8 계통의 T 세포와 자연 살해(natural killer, NK) 세포에 의해 지배되는 강력한 세포독성 성분의 활성화를 필요로 한다. 이것은 Toll-유사 수용체(Toll-like receptors, TLRs), RIG-유사 수용체(RIG-like receptors, RIGs) 및 Nod-유사 수용체(Nod-like receptors, NLRs)를 포함하는 숙주의 다수의 패턴 인식 수용체(pattern-recognition receptors, PPRs)에 의한 막-결합 및 세포질-분포 병원체-관련 분자 패턴(PAMPS)의 인식에 의해 자연적으로 얻어진다. 이것은 사이토카인, 특히 타입 I 및 타입 III 인터페론의 생성으로 끝나는 NF-kB 및 IRF를 포함하는 다양한 신호 경로의 활성화로 이어진다.
그러나, 사실상 이러한 활성화 경로의 각 단일 단계는 바이러스 간섭 또는 단백질 분해의 표적이 될 수 있으며, 그 결과 선천적 및 세포독성 면역 반응이 약화된다. 병원체이 감염 직후 면역 체계로 빠져나가면, 면역 체계에 보이지 않거나 숙주 세포를 조절하여 면역 체계를 벗어날 수 있는 저항성을 가지게 된다.
강력한 항생제와 항바이러스 분자를 포함한 화학 요법은 해결책을 나타내지만, 상당한 부작용과 관련이 있으며, 종종 숙주 세포나 저장소 역할을 하는 조직 틈새에 숨겨진 모든 병원체를 죽일 수 없다. 즉, 예를 들어 이러한 부작용으로 인한 환자의 주요 문제를 피하기 위해 치료를 중단해야 하는 경우 병원체가 다시 성장하여 환자의 다른 세포 또는 조직을 감염시킬 수 있다.
예방적 또는 치유적(치료적) 백신 접종조차도 모든 세포내 병원체에 대한 올바른 면역 반응을 유도할 만큼 충분히 강력하지 않다: 때로는 백신 개발이 가능했고 때로는 이전의 모든 시도가 실패했다.
백신 접종 전략은 전통적으로 보조제와 함께 투여되는 바이러스 또는 병원체 유래 단백질 또는, 이들의 DNA 또는 RNA 형식의 암호화 서열을 사용한다. 이러한 백신 접종은 CD4+ T 세포 모집의 맥락에서 특정 항체의 생산을 우선적으로 촉진하지만, 세포독성은 거의 발생하지 않는다.
이러한 내재적 한계 외에도, 백신에 대한 반응의 강도는 바이러스 또는 병원체 에피토프를 CD4+ T 세포에 제시하는 MHC 클래스 II 결정인자의 능력에 따라 달라진다. 모집단 내 MHC 클래스 II 결정인자의 큰 다형성은 CD4+ T 세포 활성화의 효능을 개인 간에 매우 다양하게 만들어 백신 효능 및 기억 유도의 예측에 또 다른 불확실성을 더한다. 실제로 바이러스에 대한 항체 반응이 시간이 지남에 따라 사라지는 것은 일반적으로 관찰된다.
따라서, 세포독성 세포에 해를 끼치는 CD4+ T 세포의 우선적 모집을 가능한 한 회피하고, 클래스 II MHC 다형성으로 인한 반응의 고유한 변화에 대처할 백신 전략을 개발하는 것이 시급하다.
한편, 펩티드-에피토프, 특히 특정 위치에서 소수성 모티프를 갖는 펩티드-에피토프를 로딩하는 CD1 분자의 능력은 본 특허 출원의 발명자에 의해 확인되었고 치료 용도로 개발되었으며, 예를 들면 WO 2012/069572, WO 2012/069575, WO 2013/174805 및 WO 2018/189405 특허 출원이 있다.
그러나, CD1 기반 직접 접근법은 여전히 면역학 도구로 널리 인식되지 않고 있다. 사실, 이들 특허 문헌의 주요 목적은 면역 반응을 특이적으로 조절하기 위해 펩티드-에피토프를 변형시키는 것이며, 백신 접종 목적 및/또는 면역 체계를 훈련시키기 위해 천연 형태로 직접 사용하는 것이 아니다.
본 발명은 세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 예방 또는 치료 용도의 CD1 펩티드-에피토프에 관한 것으로서, 여기서:
(i) 상기 질병은 바람직하게는 바이러스에 의해 유발되는 바이러스성 질병이고, 상기 바이러스는 바람직하게는 플라비비리대(Flaviviridae), 코로나비리대(Coronaviridae), 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae), 헤르페스비리대(Herpesviridae) 및 피코르나비리대(Picornaviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
(ii) 상기 CD1 펩티드-에피토프는 상기 세포내 병원체에 의해 발현되는 단백질의 단편이고, 상기 CD1 펩티드-에피토프는 서열 X1X2X3X4X5X6X7을 포함하고, 상기 X2, X3, X4, X5 및 X6은 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고, 상기 X1 및 X7 잔기는 독립적으로 {F;W;T;H 또는 Y}이고, 그리고
(iii) 상기 용도는 불활성화된 형태의 상기 세포내 병원체의 투여 또는 상기 세포내 병원체의 단백질에 기초한 제2 펩티드의 투여를 포함하며, 상기 불활성화된 세포내 병원체 또는 상기 제2 펩티드의 투여는 상기 CD1 펩티드-에피토프의 투여 후에 수행되고, 상기 제2 펩티드는 (ii)에서 정의된 CD1 에피토프 서열 및 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프를 포함한다.
또한, 본 발명은 세포내 병원체에서 CD1 펩티드-에피토프를 동정하는 단계, 및 상기 동정된 CD1 펩티드-에피토프의 Th1-유사 및/또는 세포독성 반응에서 NKT 세포를 활성화시키는 능력을 (in vitro, 시험관내) 측정하는 단계를 포함하는, 세포내 병원체에 대한 Th1 유사(IFNγ 및/또는 IL-12) 및/또는 세포독성 반응에서 NKT 세포를 활성화하기 위한 하나 또는 여러 개의 펩티드-에피토프(들)를 동정하기 위한 (시험관내) 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 이 (시험관내) 방법에서, 상기 NKT 세포 활성화는 표면에 CD1 분자를 발현하는 세포와 함께 상기 펩티드-에피토프를 배양하고, 이어서 NKT 세포 집단의 추가 및 상기 NKT 세포의 활성화 결정(determination of activation)에 의해 측정된다.
바람직하게는, 이 (시험관내) 방법에서, CD1 펩티드-에피토프의 동정은 CD1 분자에 결합하는 세포내 병원체의 펩티드(또는 펩티드 단편)의 능력에 따라 측정된다.
바람직하게는, 이 (시험관내) 방법에서, 상기 동정된 CD1 펩티드-에피토프는 서열 X1X2X3X4X5X6X7을 가지며, 여기서 이들 X2X3X4X5X6은 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고, 여기서 이들 X1 및 X7 잔기는 독립적으로 {F;W;T;H 또는 Y}이고, 여기서 바람직하게는 X4는 {I;V;L 또는 M}이고/이거나, 여기서 바람직하게는 적어도 하나의 X1 또는 X7 잔기는 {F;W 또는 Y}이고/이거나, 여기서 바람직하게는 이 X1X2X3X4X5X6X7 서열은 아마도 CD1에 결합한 후에 알파-나선에 속하고/하거나 알파-나선을 형성한다.
유리하게는, 이 (시험관내) 방법에서, 동정된 CD1 펩티드-에피토프는 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 이 (시험관내) 방법에서, NKT 세포의 활성화는 인터페론(IFN)-γ 및/또는 인터루킨(IL)-12 수준(level)의 정량화에 의해 결정되며, 아마도 IL-4, IFNα 및/또는 IFNβ도 정량화되고, IFNγ/IL-4(또는 IL-12/IL-4) 비율이 측정되며, 여기서 증가는 세포독성 반응을 의미한다.
본 발명의 관련 측면은 질병의 예방 또는 치료 용도의 CD1 펩티드-에피토프이고, 바람직하게는 세포내 병원체에 의해 발생하는 질병, 여기서 상기 질병은 바람직하게는 바이러스성 질병이며, 보다 바람직하게는 플라비비리대, 코로나비리대, 오르소믹소비리대, 헤르페스비리대 및 피코르나비리대로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 이 CD1 펩티드-에피토프는 이 세포내 병원체에 의해 발현되는 단백질의 단편이고, 이 단편은 유리하게는 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하지 않는다.
유리하게는, 이 CD1 펩티드-에피토프(세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한)는 전술한 (시험관내) 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 관련 측면은 상기 기재된 CD1 펩티드-에피토프(유리하게는 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하지 않음)인 제1 펩티드 및 세포내 병원체로부터 유래되고, 다른 에피토프, 유리하게는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프에 더하여 이 제1 펩티드-에피토프를 포함하는 펩티드인 제2 펩티드를 포함하는 부품 키트(질병, 바람직하게는 세포내 병원체에 의해 유발된 질병의 치료에 사용하기 위한 것)이다.
이 부품 키트는 바람직하게는 바이러스 질병의 치료에 사용하기 위한 것이며, 더욱 바람직하게는 플라비비리대, 코로나비리대, 오르소믹소비리대, 헤르페스비리대 및 피코르나비리대로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 이 부품 키트는 상기 제1 펩티드 (CD1 펩티드-에피토프, 유리하게는 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하지 않음)로 백신접종하기 위한 보조제 및/또는 상기 제2 펩티드(유리하게는 CD1 펩티드-에피토프 및 MHC 클래스 II 에피토프, 가능하게는 다른 MHC 클래스 I 또는 II 에피토프도 포함함)로 백신접종하기 위한 보조제를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 이 부품 키트는 CD1 펩티드-에피토프에 특이적인 IgG1 및/또는 IgG3(또는 전체 IgG1 및/또는 IgG3)을 정량화하는 수단 및/또는 모든 IgG(또는 적어도 IgG2) 또는 CD1 펩티드-에피토프에 특이적인 IgG1 및/또는 IgG3 이외의 IgG(또는 전체 IgG 또는 IgG1 및/또는 IgG3 이외의 IgG, 예컨대 IgG2)를 정량화하는 수단을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 이 부품 키트는 제2 펩티드에 특이적인 IgG1 및/또는 IgG3(또는 전체 IgG1 및/또는 IgG3)을 정량화하는 수단 및/또는 제2 펩티드에 특이적인 모든 IgG(또는 IgG2) 또는 제2 펩티드에 특이적인 IgG1 및/또는 IgG3 이외의 모든 IgG(또는 전체 IgG 또는 IgG1 및/또는 IgG3 이외의 IgG, 예컨대 IgG2)를 정량화하는 수단을 추가로 포함하고, 이들 IgG1 및 IgG3 이외 IgG(IgG2)는 아마도 (제1) CD1 펩티드-에피토프에 대해 비특이적일 수 있다.
유리하게는, {IgG1 및/또는 IgG3}:IgGs(또는 IgG2) 비율이 측정되고/되거나, (특이적) IgG1 및/또는 IgG3의 (상대적) 증가는 면역계의 세포독성 반응을 가리키며, 이는 치료에 대한 올바른 반응을 반영한다.
바람직하게는, 이 부품 키트는 IFNγ 및/또는 IL-12 및/또는 IL-4 및/또는 IFNα 및/또는 IFNβ 수준을 정량화하는 수단을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 관련 측면은 세포내 병원체에 의해 발현되는 단백질에서 CD1 펩티드-에피토프를 동정하는 단계, 상기 동정된 CD1 펩티드-에피토프의 Th1 유사(IFNγ 및/또는 IL-12) 반응에서 NKT 세포를 활성화하고/하거나 세포독성 반응을 유발하는 능력을 측정(시험관내)하는 단계, (본질적으로) 이 CD1 펩티드-에피토프인 제1 펩티드를 바람직하게는 백신 보조제와 함께 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 세포내 병원체에 대한 특정 Th1 유사 또는 세포독성 반응에 대해 환자의 면역계를 조절하는 약제학적 방법이다.
바람직하게는, 이 방법에서, 세포내 병원체에서 CD1 펩티드-에피토프를 동정하는 단계는 상기 CD1 분자에 결합하는 펩티드의 능력을 결정하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 이 방법은 펩티드-에피토프를 CD1을 운반하는 세포와 함께 배양한 다음, NKT 세포 집단을 추가하고 이들 NKT 세포의 활성화를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 이 방법에서, NKT 세포의 (세포독성) 활성화는 IFNγ 및/또는 IL-12 수준(또한 유리하게는 IFNα 및/또는 IFNβ 수준, 가능하게는 IL-4)의 정량화에 의해 결정된다.
바람직하게는, 이 방법에서, 에피토프는 공통 서열 X1X2X3X4X5X6X7을 가지며, 이들 X2X3X4X5X6은 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고, 이들 X1 및 X7 잔기는 독립적으로 {F;W;T;H 또는 Y}이고, 여기서 바람직하게는 X4는 {I;V;L 또는 M}이고/이거나, 여기서 바람직하게는 적어도 하나의 X1 또는 X7 잔기는 {F;W 또는 Y}이고/이거나, 여기서 바람직하게는 상기 X1X2X3X4X5X6X7 서열은 가능하게는 CD1에 결합한 후에 알파-나선에 속하고/하거나 알파-나선을 형성한다.
바람직하게는, 이 방법은 펩티드-에피토프 투여 후 환자로부터의 샘플로부터 상기 에피토프에 대한 특이적 세포독성 반응을 측정하는 단계(생체외, ex vivo)를 추가로 포함한다.
유리하게는, 이 약제학적 방법에서 CD1 에피토프를 포함하는 펩티드는 클래스 II MHC 에피토프를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 이 약제학적 방법은 클래스 II MHC 에피토프를 포함하는 제2 펩티드, 바람직하게는 보조제와 함께인 제2 펩티드, 및 바람직하게는 CD1 펩티드-에피토프를 추가로 포함하고 가능하게는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 에피토프를 포함하는 펩티드인 백신을 환자에게 투여하는 후속 단계를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 이 방법은 가능하게는 (환자의 혈액 샘플에서) IgG1 및/또는 IgG3의 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 가능하게는 CD1 펩티드-에피토프(Class II MHC 에피토프를 포함하지 않음)의 주사 후 및/또는 제2 펩티드(CD1 펩티드-에피토프 및 클래스 II MHC 에피토프 포함) 주입 후에 유리하게 상기 CD1 펩티드-에피토프를 인식할 수 있다.
본 발명자는 당업계에서 전통적으로 행해지는 바와 같이 바이러스를 포함하는 세포내 병원체에 대한 환자의 백신접종이 때때로 비효율적이라는 것을 발견하였다.
한편, 본 발명자는 동일한 바이러스 또는 세포내 병원체의 CD1-제한된 에피토프(또는 암호화하는 뉴클레오티드 서열(encoding nucleotide sequences))의 투여에 의해 백신접종 절차가 선행되는 경우, 보조제와 함께 바이러스 또는 병원체의 펩티드를 (전통적인) 투여하여 백신접종하는 것과 비교할 때, 특정 항체의 농도 및 CD4+ T 세포의 활성화가 상당히 증가함과 함께 바이러스 또는 세포내 병원체에 대한 면역 반응은 CD8+ T 세포, NKT 및 NK 세포를 포함하는 강화된 세포독성으로 강제된다. 즉, 만성 감염(chronic infection)은 대부분 병원체가 적응 면역(adaptive immunity)을 파괴하기 위해 개발한 전략의 결과이지만, 본 발명자는 선천적 반응(innate response)을 강요하는 것이 효율적인 적응 반응(adaptive response)을 촉진한다는 것을 발견하였다.
CD1-펩티드 상호작용(본 발명에서 달리 언급하지 않는 한, "CD1"은 CD1a, CD1b, CD1c 및 CD1d를 총칭하며, CD1e는 포함하지 않음)을 기반으로 면역계를 조절할 수 있는 가능성을 확인한 선구자로서, 발명자는 CD1 에피토프를 가진 환자의 백신접종은 세포독성 기능 및/또는 IFNγ 및/또는 IL-12 사이토카인의 국소 및/또는 특이적인 생성을 수반하는 후속적인 국소 및/또는 특정 Th1 유사 반응을 유도하거나 촉진한다는 것을 발견하였다. 세포독성 반응을 유발하는 NKT 활성화의 또 다른 특징은 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzymes)의 발현 수준이다.
이와 같이, 이 반응은 다른, 더 집중된 기준으로 선택된 펩티드는 면역 체계의 보다 더 예측 가능한 반응을 유도하기 때문에 고전적인 백신 접종에 비해 상당한 부가 가치를 나타내고, 이 경우에는 덜 예측 가능한 반응보다는 집중된 Th1-유사 반응이다.
실제로, 본 발명은 (i) 비선택적 방식으로 면역을 조절하는 외인성 분자(exogenous molecules)뿐만 아니라 (ii) 세포내 병원체에 대한 환자 신체의 부적절한 반응의 해로운 영향을 피하면서 환자에서 세포독성 T 세포에 의해 지배되는 강력한 면역 반응을 유도할 수 있게 한다.
더욱이, 본 발명자는 이러한 CD1-집중(CD1-focused) 백신접종이 반드시 CD1/NKT 및 세포독성 반응에 초점을 맞추지 않는 후속의 보다 전통적인 백신접종 계획과 상승작용을 한다는 것을 발견했는데, 그 이유는 면역 체계가 먼저 올바른 반응을 하도록 조정되었기 때문이다: 후속 백신 접종에 대한 반응이 이제 올바른 방향으로 향하고 강화된다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 예방 또는 치료 용도의 CD1 펩티드-에피토프이고, 여기서
(i) 상기 질병은 바람직하게는 바이러스에 의해 유발되는 바이러스성 질병이고, 상기 바이러스는 바람직하게는 플라비비리대, 코로나비리대, 오르소믹소비리대, 헤르페스비리대 및 피코르나비리대로 이루어진 군으로부터 선택되며,
(ii) 상기 CD1 펩티드-에피토프는 상기 세포내 병원체에 의해 발현되는 단백질의 단편이고, 여기서 상기 CD1 펩티드-에피토프는 서열 X1X2X3X4X5X6X7을 포함하고, 상기 X2, X3, X4, X5 및 X6은 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고, 상기 X1 및 X7 잔기는 독립적으로 {F;W;T;H 또는 Y}이고,
(iii) 상기 용도는 불활성화된 형태의 상기 세포내 병원체의 투여 또는 상기 세포내 병원체의 단백질에 기초한 제2 펩티드의 투여를 포함하며, 상기 불활성화된 세포내 병원체 또는 상기 제2 펩티드의 투여는 상기 CD1 펩티드-에피토프의 투여 후에 수행되고, 여기서, 상기 제2 펩티드는 (ii)에서 정의된 CD1 에피토프 서열 및 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프를 포함한다.
일 구현예에서, X4는 {I;V;L 또는 M}이다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 X1 또는 X7 잔기는 {F;W 또는 Y}이다. 또 다른 구현예에서, 상기 X1X2X3X4X5X6X7 서열은 알파-나선에 속하고/하거나 알파-나선을 형성하거나 형성하는 능력을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 CD1 펩티드-에피토프, 즉 제1 투여에 사용되는 상기 펩티드는 MHC 클래스 I 에피토프를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 상기 CD1 펩티드-에피토프, 즉 제1 투여에 사용되는 상기 펩티드는 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 상기 제2 펩티드, 즉 제2 투여에 사용되는 상기 펩티드는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포내 병원체에 대한 특정 Th1-유사 및/또는 세포독성 반응에 대해 환자의 면역 체계를 조절하는 약제학적 방법이고, 이는 상기 세포내 병원체에서 (인실리코, in silico) (추정되는) CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 펩티드-에피토프를 동정하는 단계, 동정된(추정되는) CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 펩티드-에피토프가 세포독성 반응(IFNγ 및/또는 IL-12 생산, 퍼포린 및 그랜자임 발현; 또한 3H 티미딘 혼입 및/또는 NUR77 발현의 측정)에서 NKT 세포를 활성화시키는 능력을 시험관내 측정하는 단계, 바람직하게는 보조제와 함께 상기 (확인된) CD1 펩티드-에피토프를 환자에게 투여하는 단계(즉, 제1 백신접종 단계, 제1 백신; 제2 백신에 대해서는 하기 참조)를 포함한다.
가능하게는, CD1 펩티드-에피토프를 (직접) 투여하는 대신에, 그러한 CD1 펩티드-에피토프를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 환자에게 투여될 것이다.
바람직한 병원체는 바이러스, 예를 들어 DNA 바이러스, 플라비비리대(웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus)) 또는 코로나비리대와 같은 RNA 바이러스뿐만 아니라, 박테리아 및 마이코박테리아, 예를 들어 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 및 기타 인간 또는 동물 병원성 마이코박테리아, 예르시니아(Yersinia), 브루셀라(Brucella), 클라미디아(Chlamydiae), 마이코플라스마(mycoplasma), 리케차(Rickettsiae)뿐만 아니라, 원생동물 기생충, 예를 들어 리슈마니아 종(Leishamania sp.), 트리파노소마 종(Trypanosoma sp.), 톡소플라스마 종(Toxoplasma sp.), 리스테리아 종(Listeria sp.) 및 히스토플라스마 종(Histoplasma sp.)이다.
인실리코(in silico) 동정은 바람직하게는 먼저 세포내 병원체의 동정, 그 다음 임의로 적합한 단백질의 스크린, 그 다음 CD1 분자(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d)에 의해 결합되기 쉬운 모티프의 스크린으로 달성된다. CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 분자에 결합하는 펩티드((추정적인) 에피토프 포함)의 능력은 유리하게는 시험관내(in vitro)에서 추가로 결정된다.
바람직하게는, 이 방법에서, NKT 세포 활성화는 동정된 (추정되는) 펩티드-에피토프(인실리코 및/또는 상기 시험관내 결합 단계 후)를 CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d)을 운반하는 세포와 함께 배양하고, 이어서 NKT 세포 집단을 추가하고 이들 NKT 세포의 활성화, 예를 들어 리포터 세포에 대한 세포독성 효과를 발휘하는 능력을 결정하여 측정한다.
유리하게는, NKT 세포의 활성화는 (또한) IFNγ 및/또는 IL-12 수준 또는 퍼포린 및/또는 그랜자임 발현 및/또는 NUR77 수준(들), 뿐만 아니라 (NKT 세포에 의한) 3H 티미딘의 혼입의 정량화에 의해 결정된다. 이를 통해 선택된 펩티드-에피토프가 환자에게 주입될 때 올바른 세포독성 면역 반응을 유도할 수 있다.
이 (이의 인실리코 단계) 방법에서, 바람직하게는 펩티드-에피토프는 공통 서열 X1X2X3X4X5X6X7을 갖는 (CD1, 예컨대 CD1d) 펩티드-에피토프이고, 여기서 이러한 X2X3X4X5X6은 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고, 여기서 X1 및 X7 잔기는 독립적으로 {F;W;T;H 또는 Y}이고, 여기서, 바람직하게는 X4는 {I;V;L 또는 M}이고/이거나, 여기서, 바람직하게는 적어도 하나의 X1 또는 X7 잔기는 {F;W 또는 Y}이고/이거나, 여기서, 바람직하게는 X1X2X3X4X5X6X7 서열은 가능하게는 CD1에 결합한 후에 형성하고/하거나 알파-나선(alpha-helix)의 일부이다.
X1 또는 X7에 적어도 하나의 F, W 또는 Y 잔기가 존재하면 CD1에 대한 강력한 고정(anchoring)이 보장된다.
나선형의 구성은 CD1에 대한 우수한 친화력에도 도움이 된다. 이것은 다른 아미노산, 특히 위치 X4의 아미노산이 알파-나선과 호환된다는 것을 의미한다.
알파-나선의 존재는 쉽게 사용할 수 있는 알고리즘을 사용하여 인실리코로 예측할 수 있다. 본 발명에서, 알파-나선을 파괴하는 것으로 알려진 프롤린 또는 글리신과 같은 몇몇 아미노산은 그럼에도 불구하고 특정 위치에서 허용된다. 예를 들어, 잔기 X2, X3, X5 또는 X6의 글리신은 이러한 잔기가 더 많은 유연성을 허용하므로 CD1 고정에 유리하기 때문에 가능하다. 반대로, 프롤린 잔기(예를 들어, 추정 X0 또는 X-1-2-3 위치)는 알파-나선의 첫 번째 아미노산일 수 있다. 한편, 아르기닌(arginine) 또는 트립토판(tryptophan)과 같은 부피가 큰 아미노산은 중간 위치 X2-X6에서 바람직하지 않은 반면, 트립토판은 존재할 수 있고 심지어 X1 및/또는 X7에서 바람직한 아미노산 중 하나이다.
인실리코 스크리닝 외에도, 알파-나선 형성 가능성은 바람직하게는 CD1에 로딩한 후 NMR 또는 X-Ray와 같은 화학적 분석으로 테스트할 수 있다.
따라서, 바람직한 CD1 서열은 X1 및/또는 X7에 W, F 또는 Y 잔기를 가지고, 알파-나선을 형성한다(또는 형성할 수 있는 능력을 갖는다).
또한, 바람직한 CD1 서열은 X1 및/또는 X7에 W, F 또는 Y 잔기를 가지고, X4에 I, L, M 또는 V 잔기를 갖는다.
가장 바람직한 CD1 서열은 X1 및/또는 X7에 W, F 또는 Y 잔기를 가지고, X4에 I, L, M 또는 V 잔기를 가지고, 알파-나선을 형성한다(또는 형성할 수 있는 능력을 갖는다).
이 방법에서, 대안적으로 또는 추가로, 펩티드-에피토프(알파-나선을 형성하거나 형성할 수 있는 능력을 가짐)는 펩티드(예를 들어, 최대 12개 아미노산, 최대 10개, 최대 7개 아미노산의 범위에 걸쳐 최소 2개의 소수성 아미노산, 바람직하게는 최대 12개 아미노산, 최대 10개, 최대 7개 아미노산의 범위에 걸쳐 최소 3개의 소수성 아미노산, 또는 최대 12개 아미노산, 최대 10개, 최대 7개 아미노산에 걸쳐 최소 4개 아미노산) 내 소수성 아미노산의 클러스터링 동정에 기초한 첫 번째 인실리코 스크린닝 단계에 의해 선택된다.
"소수성 아미노산"이라는 용어는 당업자에 의해 잘 이해된다. 본 발명의 맥락에서, 이는 바람직하게는 메티오닌(M), 류신(L), 이소류신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)을 지칭한다.
이 인실리코 스크리닝(X1-X7 인실리코 스크리닝 및 대안적인 인실리코 스크리닝 포함)에서, 바람직하게는 CD1 에피토프는 클래스 II MHC 에피토프를 포함하지 않는다. 이러한 에피토프는 본 발명의 후속 단계(하기 참조)를 포함하는 전통적인 백신접종에서 바람직하지만, 면역 체계의 CD1-구동(CD1-driven) 반응을 감소시킬 수 있고, 잠재적으로 강하게 감소시킬 수 있다.
이를 보장하는 한 가지 편리한 방법은 충분히 짧은 펩티드를 선택하고/하거나 예상되는 클래스 II MHC 에피토프가 존재하지 않는 펩티드를 선택하는 것이다(예를 들어, 추정되는 클래스 II MHC 에피토프가 제거된 절단된 펩티드). 적합한 펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, Poluektov et al. Vaccine 39: 2110-2216, 2021은 SARS-CoV2를 위한 에피토프 선택을 설명한다.
실제로, 클래스 II MHC 에피토프를 피하는 한 가지 편리한 방법은 예를 들어 50개 미만, 40개 미만, 30개 미만, 20개 미만의 아미노산으로 이루어진 이러한 CD1 에피토프를 포함하는 짧은 펩티드를 설계하는 것이다. CD1 에피토프를 포함하는 최소 펩티드는 상기에 묘사된 7-아미노산 컨센서스(consensus)를 포함하여 11개 아미노산의 크기를 가질 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 CD1 펩티드-에피토프는 아미노산 길이가 11개 내지 50개, 예를 들어 11개 내지 40개, 또는 11개 내지 30개, 또는 11개 내지 20개인 세포내 병원체에 의해 발현되는 단백질의 단편(즉, 연속 단편)이다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 CD1 펩티드-에피토프는 세포내 병원체에 의해 발현되는 단백질의 플랭킹 영역(flanking regions)에 상응하지 않는 플랭킹 서열(flanking sequences)을 추가로 포함한다. 따라서, 이러한 구현예들에서, CD1 펩티드-에피토프는 11개 내지 50개 아미노산 길이, 예컨대 11개 내지 40개, 또는 11개 내지 30개 또는 11개 내지 20개 아미노산 길이의 세포내 병원체에 의해 발현되는 단백질의 단편을 포함한다.
실제로, CD1 에피토프가 여전히 알파-나선을 형성하거나 형성할 수 있는 능력을 갖는 것이 바람직하며, 이는 에피토프의 최소 크기 및 그에 따른 플랭킹 잔기(flanking residues)의 존재와 관련하여 일부 생물리학적 제약을 암시한다: 이러한 잔기는 CD1 고정에 직접 관여하지 않지만 전체 서열에 형태를 부여하여 CD1에 결합하는 능력에 영향을 미친다.
예를 들어 더 긴 펩티드를 설계하려는 경우 클래스 II MHC 에피토프를 제외하는 또 다른 방법은 인실리코 분석에 의존하는 것이다.
또 다른 실질적인 방법은 세포가 클래스 II 인간 MHC 일배체형(각각 다른 클래스 II 인간 MHC 일배체형(predominant)으로 형질감염된(transfected) 여러 세포주)으로 형질감염된 다음, CD1 에피토프를 포함하는 펩티드가 클래스 II MHC 에피토프로도 적합한지 확인하고, 그러한 펩티드를 거부하도록 테스트하는 세포 테스트에 의존하는 것이다. 예를 들어, 우세한 MHC 일배체형 중 15~20개를 테스트할 수 있다.
이 방법은 바람직하게는 CD1 에피토프에 대한 특이적 세포독성 반응을 생체외에서 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 이것은 NKT 세포의 직접적인 세포독성 작용 외에, 환자에게 제2 펩티드-에피토프를 투여하기 전에 면역 체계의 올바른 활성화를 보장할 수 있다(아래 제2 백신접종 단계 참조).
이 방법은 바람직하게는 세포내 병원체에 의해 발현되는 CD1 에피토프를 포함하는 동일한 단백질에 기초한 백신을 바람직하게는 보조제와 함께 환자에게 투여하는 후속 제2 백신접종 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 이 백신은 CD1 펩티드-에피토프와 상이한 적어도 하나의 제2 에피토프를 포함하는 제2 펩티드를 포함한다. 바람직하게는 이러한 제2 백신은 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 및 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함한다. 바람직한 제2 백신은 유리하게 제1 백신의 CD1 에피토프와 이 MHC 클래스 II 에피토프를 모두 포함한다. 적합한 MHC 클래스 II 에피토프는 전술한 방법, 즉 인실리코 예측 방법 및/또는 클래스 II 인간 MHC 일배체형을 발현하는 세포주에 대한 시험을 사용하여 동정할 수 있다. 적합한 MHC 클래스 I 에피토프는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 Yang et al. BMC Bioinformatics 22:231, 2021에 개시된 방법에 의해 동정할 수 있다.
이 제2 백신접종 단계는 NKT 세포가 세포독성 반응을 유도하기 위해 제1(CD1-제한된) 백신에 의해 올바르게 활성화되었음을 확인한 후에 수행할 수 있다.
이 제2 백신 접종 단계에 사용되는 에피토프(들) 또는 펩티드(들)는 반드시 CD1 에피토프에 초점을 맞추는 것은 아니다: 다수의 에피토프를 포함하는 펩티드뿐만 아니라 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하는 펩티드가 사용될 수 있고, 사실상 유리하게 사용된다. 이러한 후속 백신접종에 사용되는 펩티드(들)는 또한 (추정적) CD1 에피토프 및 검증된 CD1 에피토프, 바람직하게는 제1 백신접종에 사용되는 CD1 에피토프를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 단계는 세포내 병원체의 전장 단백질, 바람직하게는 CD1 펩티드-에피토프를 또한 포함하는 단백질, 또는 병원체의 불활성화된 형태, 예컨대 생-약독화 바이러스(live-attenuated virus)의 투여를 포함한다.
일 구현예에서, 병원체는 뎅기 바이러스이고, CD1 펩티드-에피토프는 NS 단백질, 바람직하게는 NS5의 단편이고 SEQ ID NO:1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게는, CD1 펩티드-에피토프는 11 내지 50개의 아미노산 길이, 예컨대 11 내지 40개, 또는 11 내지 30개, 또는 11 내지 20개의 아미노산 길이를 가진다. 본원의 추가 구현예에서, 제2 펩티드는 전장(full-length) NS5 단백질이다.
또 다른 구현예에서, 병원체는 콕사키(Coxsackie) B4 바이러스이고, CD1 펩티드-에피토프는 바람직하게는 SEQ ID NO:2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 다단백질의 단편이다. 바람직하게는, CD1 펩티드-에피토프는 11개 내지 50개의 아미노산 길이, 예컨대 11개 내지 40개, 또는 11개 내지 30개, 또는 11개 내지 20개의 아미노산 길이를 가진다. 본원의 추가 구현예에서, 제2 펩티드는 전장 다단백질이다.
또 다른 구현예에서, 병원체는 SARS-CoV2 바이러스이고, CD1 펩티드-에피토프는 S 단백질의 단편이며, 바람직하게는 SEQ ID NO:3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게는, CD1 펩티드-에피토프는 11 내지 50개의 아미노산 길이, 예컨대 11개 내지 40개, 또는 11개 내지 30개, 또는 11개 내지 20개의 아미노산 길이를 갖는다. 본원의 추가 구현예에서, 제2 펩티드는 전장 S 단백질이다.
또 다른 구현예에서, 병원체는 인플루엔자 A 바이러스이고, CD1 펩티드-에피토프는 바람직하게는 SEQ ID NO:4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 헤마글루티닌(hemagglutinin) 단백질의 단편이다. 바람직하게는, CD1 펩티드-에피토프는 11개 내지 50개의 아미노산 길이, 예컨대 11개 내지 40개, 또는 11개 내지 30개, 또는 11개 내지 20개의 아미노산 길이를 갖는다. 본원의 추가 구현예에서, 제2 펩티드는 전장 헤마글루티닌이다.
또 다른 구현예에서, 병원체는 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) 바이러스이고, CD1 펩티드-에피토프는 Vp16 단백질의 단편이며, 바람직하게는 SEQ ID NO:5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게는, CD1 펩티드-에피토프는 11개 내지 50개의 아미노산 길이, 예컨대 11개 내지 40개, 또는 11개 내지 30개, 또는 11개 내지 20개의 아미노산 길이를 갖는다. 본 발명의 추가 구현예에서, 백신접종은 불활성화된 HSV 생백신(live-inactivated HSV vaccine)을 사용한다.
본 발명의 관련된 측면은 세포내 병원체에 대한 (후속) 세포독성 반응(IFNγ 및/또는 IL-12, 퍼포린, 그랜자임 및/또는 NUR77 발현 수준, 3H 티미딘 혼입)을 유도함에 있어서 NKT 세포를 활성화시키는 펩티드-에피토프를 동정하기 위한 시험관내 방법으로서, 이 세포내 병원체에서 CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 에피토프를 동정하는 단계 및 동정된 CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 에피토프가 세포독성 반응에서 NKT 세포를 활성화시키는 능력을 시험관내 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 이러한 시험관내 방법에서, CD1 에피토프(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d 에피토프(들))는 이(이들) CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 분자(들)에 결합하는 펩티드의 능력에 따라 확인된다.
바람직하게는(또는 CD1에 대한 결합에 더하여), 이(이들) CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d 분자(들))에 잠재적으로 결합하는 이 펩티드는 위의 약학적 방법에 묘사된 예비 (인실리코) 단계에서 확인된다(소수성 아미노산 스트레치의 존재 또는 위치 1, 7(F/W/T/H/Y) 및 위치 4(I/L/M/V)에 특정 아미노산이 있는 X1X2X3X4X5X6X7 에피토프의 존재).
바람직하게는, 또는 추가로, 이러한 시험관내 방법에서, NKT 세포 활성화는 CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d)을 운반하는 세포와 함께 펩티드-에피토프의 배양에 이어 NKT 세포 집단의 추가 및 이들 NKT 세포의 활성화 결정에 의해 측정된다.
바람직하게는, 이 방법에서(또한 가능하게는 상기 제약 방법 또는 하기 제약 제품에 대해), NKT 세포의 활성화는, 예를 들어 IFNγ 및/또는 IL-12에 대한 mRNA의 발현 수준 또는 예를 들어 ELISA 측정에 의한 주변 (조절된) 세포 배양 배지의 단백질 양에 기초한 IFNγ 및/또는 IL-12 수준의 정량화에 의해 결정된다. 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzymes) 발현 수준뿐만 아니라, NUR77(mRNA 수준) 또는 3H 티미딘의 혼입(이러한 NKT 세포에서)도 유리하게 측정될 수 있다.
본 발명의 관련된 측면은 세포내 병원체, 바람직하게는 바이러스에 의해 유발되는 질병의 치료 용도의 CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 펩티드-에피토프(백신)이다.
대안적으로, CD1 펩티드-에피토프를 직접 투여하는 대신, 이 CD1 펩티드-에피토프를 발현하는 상응하는 뉴클레오티드 서열을 환자에게 투여할 수 있다.
특정 바이러스 질병 또는 바이러스는 실제로 제한되지는 않지만, 이 바이러스 질병은 바람직하게는 플라비비리대(웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스), 코로나비리대(SARS, 예를 들어 SARS-CoV-2), 오르소믹소비리대(바이러스 원인 바이러스), 헤르페스비리대(엡스타인-바 바이러스(EBV)를 포함한 헤르페스 바이러스) 및 피코르나비리대로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 맥락에서, 바이러스 질병은, 또한 바이러스와 관련된 악성 질병, 예를 들어 EBV와 관련된 림프종, 특히 간 이식과 같은 장기 이식 후에 발생하는 EBV 관련 림프종을 포함한다.
또한 박테리아 및 마이코박테리아, 예를 들어 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 및 기타 인간이나 동물에 병원성인 마이코박테리아, 예르시니아(Yersinia), 브루셀라(Brucella), 클라미디아(Chlamydiae), 마이코플라스마(mycoplasma), 리케차(Rickettsiae)뿐만 아니라, 원생동물 기생충, 예를 들어 리슈마니아 종(Leishamania sp.), 트리파노소마 종(Trypanosoma sp.), 톡소플라스마 종(Toxoplasma sp.), 리스테리아 종(Listeria sp.) 및 히스토플라스마 종(Histoplasma sp.)은 본 발명의 CD1-펩티드 백신접종에 의해 치료될 수 있다.
바람직하게는, 이 CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 펩티드-에피토프는 상기 시험관내 방법에서와 같이 및/또는 NKT 세포를 활성화시키는 펩티드-에피토프를 동정하기 위한 상기 시험관내 방법에서와 동일한 접근법에 따라 얻을 수 있고, 구체적으로, 인실리코 단계(들), 시험관내(CD1 결합) 단계 및/또는 NKT 세포의 활성화를 측정(시험관내) 단계에 따라 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 관련 측면은 CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 펩티드-에피토프(바람직하게는 CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 상기에 기재된 CD1d 펩티드-에피토프 및 클래스 II MHC 에피토프를 포함하지 않음) 및 바람직하게는 세포내 병원체로부터 유래된 클래스 II MHC 에피토프를 포함하는 제2 펩티드, 바람직하게는 이 CD1 펩티드-에피토프를 포함하는 동일한 단백질에 속하며, 보다 바람직하게 제2 펩티드는 적어도 CD1 펩티드-에피토프 및 (하나 또는 여러) 클래스 II MHC 에피토프를 포함한다.
이 부품 키트는 바이러스, 또한 세포내 박테리아(위 참조)와 같은 세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 치료에 사용하기에 유리하다.
바람직하게는, 이 부품 키트는 CD1(CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d) 펩티드-에피토프를 사용한 백신접종을 위한 보조제 및/또는 제2 펩티드를 사용한 백신접종을 위한 보조제를 추가로 포함한다.
바람직한 보조제는 지질 에멀젼(lipidic emulsions)과 같은 염증 반응을 유도하는 능력에 따라 선택된다. 명반 보조제(Alum adjuvant)는 CD1 펩티드-에피토프에 대해 바람직하지 않다.
대안적으로, 본 부품 키트의 CD1 펩티드-에피토프 대신에, 이 CD1 펩티드-에피토프를 발현하는 상응하는 뉴클레오티드 서열이 환자에게 투여될 수 있다.
실시예
1. 뎅기 바이러스 감염(Dengue virus infection)
뎅기열은 열대 및 아열대 지역의 주요 공중 보건 문제이다. 이 ssRNA 외피 플라비바이러스(Flavivirus)는 쇼크 증후군으로 이어지는 심각한 출혈 형태를 채택할 수 있는 발열 증후군의 원인이 된다. 바이러스가 인터페론 a/b 반응을 활성화하고 있지만, 후자는 효율적인 반응을 방해하는 여러 메커니즘에 의해 심각하게 손상된다. 뎅기 바이러스에 대한 강력한 선천적 반응을 유도하는 것은, 보호하는 것으로 알려진 CD8+ T 세포 반응을 유발하는 능력으로 감염을 제어하는 데 도움이 될 것이며, 반면 항체의 정확한 역할은 여전히 논의 중이다.
비구조(non-structural, NS) 단백질은, 바이러스에 대한 효율적인 보호를 형성하기 위해 NS에 대한 면역 반응이 필수적이라는 점을 고려하여 백신 접종 전략을 개발하는 데 사용된다. 따라서, NS5는 인터페론 알파 및 베타 생산에 필요한 신호를 차단하는 중요성에 따라 다음 실험을 위해 선택되었다.
상기 NS5의 서열은 CD1에 결합하는 데 필요한 특성, 즉,
AG-HGQVDNF-SL(SEQ ID NO:1)은 밑줄 친 모티프를 갖는 아미노산 1127 내지 1137에 해당한다.
SEQ ID NO:1의 펩티드는 완전한 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)에 유화시키고, 일련의 C57BL/6 마우스에 100 ㎍의 용량으로 피하 주사하였고, 이어서 2주 후에 불완전 프로인트 보조제에 유화시켜 동일한 주사를 행하였다. 대조군은 보조제만 사용하여 동일한 일정에 따라 주사했다.
마지막 주입 2주 후 마우스의 두 그룹 모두 명반에 NS5 단백질을 2주마다 4회 반복 피하 주입하여 처리했다.
모든 마우스의 비장을 마지막 주사 후 1개월 후에 얻었고, CD3+ 림프구 집단을 FACS 분류로 분리했다.
이어서, 세포는 NS5가 로딩된 항원-제시(antigen-presenting) 세포의 존재 하에 배양되고 활성화된 세포의 비율은 3H-티미딘의 혼입에 의해 6일 후에 번호가 매겨진다.
NS5-특이적 세포의 총 수는 백신접종 전에 CD1-제한된 펩티드를 받은 마우스에서 상당히 더 높은 것으로 나타났다. 이러한 더 높은 숫자는 CD4에서 관찰되며, 가장 중요한 것은 CD8 세포에서 매우 중요하다.
병렬 실험(parallel experiments)에서, CD3+ 세포는 제시 세포로서 JAWS2와 함께 배양된다. 이러한 세포는 높은 수준의 표면 CD1을 발현하지만 클래스 II MHC 복합체는 발현하지 않는다. NS5 특이적 NKT 세포는 PLZF에 대한 항체로 염색하여 검출되며 SEQ ID NO:1의 펩티드로 미리 감작된(pre-sensitized) 마우스 그룹에서만 발견된다.
따라서, 보조제에 CD1-제한된 에피토프를 미리 주입하면 NS5에 대한 전반적인 면역 반응이 크게 증가하지만, 클래스 I-제한된 CD8+ T 세포 및 NKT 세포로 특징지어지는 세포독성 면역 반응을 촉진하는 데 특히 효율적이라고 결론지었다.
C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 NKT 세포 빈도 및 분포 측면에서 차이를 나타내므로, BALB/c 마우스에서 동일한 실험을 반복하여 본질적으로 동일한 결과를 얻었다.
참고로, CD1-제한된 에피토프의 사전 주사에 의해 처리된 그룹 또는 C57BL/6 및 BALB/c 마우스 사이에서 그룹 개별 마우스를 비교할 때, CD4, CD8 및 NKT 세포의 수에서 매우 작은 변화가 관찰된 반면, 각 균주의 대조군의 개별 마우스 사이에서는 큰 변화가 관찰되었다.
CD1-제한된 펩티드로의 사전 면역화는 NS5에 대한 전반적인 면역 반응을 증가시킬 뿐만 아니라, 상이한 균주의 마우스를 비교할 때 일반적으로 관찰되는 차이를 감소시킨다는 결론이 내려진다.
2. 콕사키 B4 감염(Coxsackie B4 infection)
콕사키 B4는 심근염(myocarditis) 및 췌장염(pancreatitis)과 관련된 ssRNA 피코르나바이러스(picornavirus)이다. 마우스에 B4-V와 같은 콕사키의 특정 변종을 복강 내 주사하면 급성 췌장염이 유발되고 즉시 만성 염증이 발생한다. BALB/c 균주에서 급성 염증에서 만성 염증으로의 전이는 전형적인 2형 사이토카인(type 2 cytokine)인 IL-10에 의존하며, IL-10의 결핍은 급성 염증의 중단된 형태와 만성 단계로의 진행을 막는 결과를 초래한다.
콕사키 B4-V가 TLR3, TLR4 및 TLR7을 포함한 선천적 면역을 활성화하지만, 바이러스는 이 선천적 반응을 우회하고 Th2 면역 반응의 맥락에서 췌장 선포(pancreatic acini)에서 복제한다. 세포독성 반응에 대한 면역 반응을 강요하면 감염을 예방하고/하거나, 적어도 급성 췌장염에서 만성 췌장염으로의 진행을 예방할 수 있다.
콕사키 B4 다단백질의 아미노산 서열은 소수성 에피토프를 포함한다.
EK-FRDIRGF-LA(SEQ ID NO:2)는 밑줄 친 모티프를 갖는 아미노산 1619 내지 1629에 해당한다.
BALB/c 마우스는 프로인트 보조제에 유화된 SEQ ID NO:2의 펩티드 100 ㎍을 2주 간격으로 2회 발바닥 주사로 면역화하였다. 대조군에는 보조제만 주사했다.
모든 마우스는 2주 간격으로 투여되는 총 4회의 주사에 대해 주사 당 100 ㎍을 사용하여 명반에 흡착된 전체 다단백질로 면역화하였다.
마지막 주입 3주 후, 모든 마우스는 복막에서 50 PFU의 B4-V 균주로 감염되었다.
감염 후 3일 이내에 마우스의 50%의 췌장을 분리하고 세포 침윤(cellular infiltration)을 검사했다. 대조군의 모든 마우스는 세방에서 단핵 세포에 의한 대량 침윤을 보였다. 펩티드 SEQ ID NO:2의 주사로 처리된 마우스는 그러한 세포로 적당한 침윤을 나타낸다.
그러나, 감염 후 10일째에, 대조군에 남아 있는 모든 마우스는 세포 구조의 소실과 함께 지속적인 세포 침윤을 나타내는 반면, SEQ ID NO:2의 펩티드로 사전 처리된 마우스는 췌장염 징후의 완전한 소실을 나타낸다.
따라서 SEQ ID NO:2의 펩티드로 사전 면역화하면 B4-V 감염으로 인한 급성 선방염(acini inflammation)의 정도가 감소하고, 더 중요하게는 췌장염의 만성 비가역 단계로의 진행을 방지한다고 결론지었다.
3. SARS-CoV-2 감염(SARS-CoV-2 infection)
SARS-CoV-2는 코로나바이러스 질병(2019년 이후)(CoVid-19) 대유행의 원인균이다. 환자의 자발적인 면역 반응에 대해 수행된 관찰은 바람직하지 않은 결과와 관련된 면역 반응 및 염증 모두의 심각한 조절 장애를 나타낸다. SARS-CoV-2는 선천성 면역을 회피하기 위한 몇 가지 전략을 개발하여 인터페론 a/b 생산 부족과 우선적인 Th2 적응 반응을 초래했으며, 보류 중인 면역 병리 및 항체 의존성 향상 위험이 있다.
효율적인 선천적 면역에 대한 반응으로 방향을 바꾸면 상당한 보호를 제공할 뿐만 아니라 이차 합병증도 예방할 수 있습니다.
SARS-CoV-2 세포 유입은 바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)과 안지오텐신 2 수용체(angiotensin 2 receptor, ACE2) 사이의 상호작용에 따라 달라진다. 따라서 S 단백질에 대한 면역 반응의 발달은 감염 통제에 적합한 표적이 될 것이다.
효율적인 S 단백질 특이적 선천적 반응을 일으키기 위한 시도에서, CD1에 의한 제시에 적합한 모티프로 구성된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드는 특허 EP3388447 A1에 설명된 알고리즘을 사용하여 동정된다.
따라서 서열 ATR FASVYAW NRK(SEQ ID NO:3)는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 잔기 353에서 365에 해당하는 모티프(밑줄)를 포함한다.
SEQ ID NO:3의 펩티드는 완전 프로인트 보조제에 유화하여 100 ㎍의 투여량으로 C57BL/6 마우스를 면역화하고, 3주 후에 불완전 프로인트 보조제에 유화한 100 ㎍으로 두 번째 주사하는데 사용하였다. 대조군은 보조제만 받는다.
두 그룹의 마우스는 모두 명반에 있는 S 단백질 100 ㎍을 SEQ ID NO:3의 펩티드(또는 보조제) 주입 후 3주부터 시작하여 2주 간격으로 총 4회 투여하여 면역화하였다.
S 단백질에 대한 면역 반응은 마지막 주사 후 2개월 또는 6개월 후에 회수된 비장 세포(splenocytes)에서 평가되고 특정 항체의 역가는 혈청(serum)에서 평가되었다.
SEQ ID NO:3의 펩티드로 사전 처리된 마우스는 대조군 마우스보다 단백질 S에 대해 상당히 많은 수의 CD3+ 림프구를 갖는 것으로 나타났다. 더욱이, 사전 처리된 그룹에서 CD8+ T 세포의 수는 CD4+ T 세포의 수를 능가하는 것으로 나타난 반면, 대조군에서는 2개월에 그 반대로 나타났다. 중요하게도, 우선적 CD8+ T 세포에 대한 동일한 경향이 6개월 후에도 관찰되었다.
특이적 항-S 단백질 항체 역가는 면역화 프로토콜의 종료 후 2개월 및 6개월에 평가되었고, 두 시점 모두에서 SEQ ID NO:3의 펩티드로 사전 처리된 마우스에서 상당히 더 높은 역가를 나타냈다. 항체의 동형(Isotypic) 분포는 대조군의 IgG1에서 SEQ ID NO:3의 펩티드로 사전 처리된 그룹의 IgG2a로의 급격한 변화를 나타내며, 이러한 변화는 6개월 후에도 유지되었다.
따라서 CD1-호환(CD1-compatible) 모티프를 포함하는 펩티드로 마우스를 사전 처리하면 S 단백질에 대한 면역 반응이 증가하고, 증가된 세포독성 및 Th1-구동 반응에 대한 특성이 변경되며, 시간이 지남에 따라 이러한 면역 반응이 유지된다는 결론을 내렸다.
4. 인플루엔자 바이러스 감염(Influenza virus infection)
인플루엔자 바이러스 감염은 전 세계적으로 큰 영향을 미치고 상당한 사망률을 보인다. 성공적인 백신 접종 전략의 장애물 중 하나는 바이러스의 높은 돌연변이율로 매년 새로운 백신을 설계해야 하는 것이다. 또한 바이러스 노출의 임상 및 면역학적 결과는 개인의 과거력에 따라 결정된다: 백신 및/또는 바이러스에 대한 자연 노출은 "항원 죄(antigenic sin)"라고 하는 현상인 이전 바이러스에 대한 반응을 재활성화 한다. 이 현상으로 인해 바이러스의 일부 결정 요인이 다른 것보다 더 보존되어 이러한 백신접종에 사용될 수 있지만, 현재의 백신접종 전략으로 "범용" 백신을 개발할 가능성이 낮다.
바이러스에 대한 선천적 면역 반응을 유발하기 쉬운 면역 환경을 만드는 것은 범용 백신을 위한 중요한 진전이 될 것이며, 이전에 백신 및/또는 바이러스 노출에 대해 만들어진 반응의 특성과 품질을 대체할 수 있는 속성을 가지고 있다.
따라서, 인플루엔자 A 바이러스의 헤마글루티닌은 잔기 345에서 355에 해당하는 서열을 포함한다:
GL-FGAIAGF-IE(SEQ ID NO:4)는 NKT 세포를 활성화할 수 있는 공통 모티프(consensus motif)(밑줄)를 나타낸다.
SEQ ID NO:4를 포함하는 합성 펩티드는 100 ㎍의 용량으로 사용되고, 프로인트 보조제에 유화되어 발바닥에서 C57BL/6 마우스를 면역화하였다. 이 주사는 2주 후에 반복되지만 불완전한 프로인트 보조제를 사용한다.
마우스 대조군은 유사한 프로토콜을 사용하지만 보조제만 사용하여 주사된다.
마지막 주입 3주 후, 모든 마우스에 명반에 흡착된 100 ㎍ 헤마글루티닌을 주입하고 이 주입을 2주 간격으로 3회 반복하였다.
마지막 주사 1개월 후, 모든 마우스를 희생시키고 비장 및 국소 림프절로부터 림프구 집단을 준비했다.
두 그룹의 마우스 사이에 상당한 양적 및 질적 차이가 관찰되었다. SEQ ID NO:4의 펩티드로 면역화된 마우스의 반응은 계통 특이적 마커에 의해 동정되는 바와 같이 CD8+, NK 및 NKT 세포를 포함하는 헤마글루티닌에 대한 Th1-유사 및 세포독성 반응에 의해 지배되는 반면, 대조군 마우스는 본질적으로 Th2 유형의 세포독성 참여가 거의 없는 면역 반응을 나타낸다. 따라서, 면역화된 마우스 림프구에 의한 사이토카인 생산은 IL-4에 비해 IFN-감마의 높은 비율을 나타내는 반면, 대조군 마우스에서는 벌크 림프구 집단이 헤마글루티닌이 적재된 조직적합성(histocompatible) 항원-제시 세포(antigen-presenting cells)의 존재 하에 배양될 때 그 반대가 관찰된다.
혈청 내 항-헤마글루티닌 항체의 이소형(Isotype) 분포는 SEQ ID NO:4의 펩티드로 면역화된 마우스에서 고농도의 IgG2a를 나타내는 반면, IgG1은 Th2 반응에 대한 Th1-유사의 지배에 따라 대조군 마우스에 의해 이루어진 반응을 지배한다.
따라서 NKT 세포를 활성화하는 펩티드로 사전 면역화하면 Th1-구동 반응 및 세포독성에 대한 헤마글루티닌 투여 후 얻은 면역 반응의 질이 변경된다는 결론을 내렸다.
5. 단순 포진 바이러스 감염(Herpes simplex virus infection)
유형 1 또는 2의 알파 단순 포진 바이러스(HSV)는 감염된 개체의 수명 동안 지속되는 유비쿼터스 병원체이다. 그들은 말초 신경절의 최종적으로 분화된 뉴런에서 잠복 바이러스 풀을 구성한다. 면역 능력이 있는 개별의 재활성화는 강력한 Th1-유사 및 세포독성 면역 반응과 병행되는 자기 제한적 증상을 초래한다. 그러나, 이것은 특히 면역손상된(immunocompromised) 숙주에서 심각한 이환율(morbidity)뿐만 아니라 심각한 증상을 배제하지 않는다. 바이러스가 용해 단계에 진입하면 바이러스 입자가 떨어져 나와 신경절(ganglia) 내의 항원-제시 세포에 흡수된다. T-의존성 세포독성 활동의 강도는 감염을 통제할 수 있는 정도를 결정한다.
흥미롭게도, HSV는 CD1d에 의한 바이러스 제시를 방지하기 위한 전략을 정교화하여 바이러스에 대한 방어에서 이러한 경로의 중요성을 지적했다. 또한, NK 세포에 의한 제거를 피하기 위한 추가 메커니즘이 확인되었으며 감염 부위에서 Th1 세포의 축적은 그러한 감염의 제어에 정비례한다. 전체적으로 바이러스에 대한 CD1 반응을 강제하고 NK 세포 활성화에 미치는 결과는 HSV 감염 통제에서 중요한 진전을 나타낼 것이다.
생약독화 바이러스를 이용한 현재의 백신접종은 B림프구와 T림프구를 모두 유도하지만, 노인에서의 전반적인 활성은 기껏해야 50%에 불과하며 잠복 감염을 유발할 위험은 말할 것도 없다. 따라서 HSV 예방 접종 전략과 관련하여 중요한 미충족 의료 수요가 있다.
HSV Vp16 전사 조절 단백질의 에피토프에는 다음 서열이 포함되어 있다.
VL-FLHLYLF-LT(SEQ ID NO:5)는 아미노산 잔기 179-189에 해당하며 CD1 결합 모티프는 밑줄 그어져 있다.
BALB/c 마우스는 완전 프로인트 보조제에 유화된 SEQ ID NO:5의 펩티드 100 ㎍으로 발바닥에서 면역화되고, 이 주사는 2주 간격 후에 한 번 반복되며, 두 번째 주사는 불완전 프로인트 보조제로 이루어진다. BALB/c 마우스의 대조군은 보조제 단독으로 처리하였다.
그런 다음 모든 마우스는 1개월 간격으로 2회에 걸쳐 생약독화(live-attenuated) HSV의 상업적 제제를 받는다.
마지막 접종 1개월 후, 백신에 대한 면역 반응을 두 그룹 간에 비교했다. SEQ ID NO:5의 펩티드로 사용한 사전 면역화하면, 반응이 세포독성 잠재력을 공유하는 세포, CD8+ T 세포, NK 세포 및 NKT 세포의 상당한 확장을 포함하는 Th1-유사 설정으로 이동시키는 것으로 나타났다. 전체 항-HSV 항체의 농도는 2개 그룹에서 유사하지만, 사전 면역화된 마우스는 직접 결합 ELISA에서 입증된 바와 같이 IgG2a 및 IgG2b 특이적 항체의 생산이 상당히 증가된 것으로 나타났다.
따라서, CD1-결합(CD1-binding) 모티프를 포함하는 펩티드로 면역화하는 것은 HSV 감염의 제어에 도움이 되는 세포독성 특성의 획득 쪽으로 반응을 이동시키기에 충분하다고 결론지었다.
SEQUENCE LISTING <110> Imnate SARL <120> Fine-Tuning of the immune system <130> PAT84208EP00 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CD1 NS Dengue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> CD1 epitope <400> 1 Ala Gly His Gly Gln Val Asp Asn Phe Ser Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Coxsackie B4 CD1 epitope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> CD1 core epitope <400> 2 Glu Lys Phe Arg Asp Ile Arg Gly Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> SARS COVID Spike CD1 epitope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> CD1 core epitope <400> 3 Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Influenza hemagglutinin CD1 epitope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> CD1 core epitope <400> 4 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HSV Vp16 CD1 epitope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> Core CD1 epitope <400> 5 Val Leu Phe Leu His Leu Tyr Leu Phe Leu Thr 1 5 10

Claims (14)

  1. 세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 예방 또는 치료 용도의 CD1 펩티드-에피토프로서, 여기서
    (i) 상기 질병은 바람직하게는 바이러스에 의해 유발되는 바이러스성 질병이고, 상기 바이러스는 바람직하게는 플라비비리대(Flaviviridae), 코로나비리대(Coronaviridae), 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae), 헤르페스비리대(Herpesviridae) 및 피코르나비리대(Picornaviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    (ii) 상기 CD1 펩티드-에피토프는 상기 세포내 병원체에 의해 발현되는 단백질의 단편이고, 여기서 상기 CD1 펩티드-에피토프는 서열 X1X2X3X4X5X6X7을 포함하고, 상기 X2, X3, X4, X5 및 X6은 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고, 상기 X1 및 X7 잔기는 독립적으로 {F;W;T;H 또는 Y}이고, 그리고
    (iii) 상기 용도는 불활성화된 형태의 상기 세포내 병원체의 투여 또는 상기 세포내 병원체의 단백질에 기초한 제2 펩티드의 투여를 포함하며, 여기서 상기 불활성화된 세포내 병원체 또는 상기 제2 펩티드의 투여는 상기 CD1 펩티드-에피토프의 투여 후에 수행되고, 상기 제2 펩티드는 (ii)에서 정의된 CD1 에피토프 서열 및 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프를 포함하는 것인 용도의 CD1 펩티드-에피토프.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 X4는 {I;V;L 또는 M}이고/이거나, 상기 적어도 하나의 X1 또는 X7 잔기는 {F;W 또는 Y}이고/이거나, 상기 X1X2X3X4X5X6X7 서열은 알파-나선에 속하고/하거나 알파-나선을 형성하거나 형성하는 능력을 갖는 것인 용도의 CD1 펩티드-에피토프.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 CD1 펩티드-에피토프는 MHC 클래스 I 에피토프를 포함하지 않는 것인 용도의 CD1 펩티드-에피토프.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD1 펩티드-에피토프는 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하지 않는 것인 용도의 CD1 펩티드-에피토프.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 펩티드는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 추가로 포함하는 것인 용도의 CD1 펩티드-에피토프.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD1 펩티드-에피토프는 세포내 병원체에 대한 Th1-유사 및/또는 세포독성 반응에서 NKT 세포를 활성화시키는 하나 또는 여러 개의 펩티드-에피토프(들)를 동정하기 위한 시험관내(in vitro) 방법에 의해 얻을 수 있고, 상기 시험관내 방법은 하기 단계들을 포함하는 것인 용도의 CD1 펩티드-에피토프:
    - 상기 세포내 병원체에서 CD1 펩티드-에피토프를 동정하는 단계, 및
    - Th1-유사 및/또는 세포독성 반응에서 NKT 세포를 활성화시키는 동정된 CD1 펩티드-에피토프의 능력을 시험관내 측정하는 단계.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 시험관내 방법에서, 상기 NKT 세포 활성화는 표면에 CD1 분자를 발현하는 세포와 함께 상기 펩티드-에피토프를 배양하고, 이어서 NKT 세포 집단의 추가 및 상기 NKT 세포의 활성화 결정에 의해 측정되는 것인 용도의 CD1 펩티드-에피토프.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 시험관내 방법에서, 상기 CD1 펩티드-에피토프의 동정은 상기 CD1 분자에 결합하는 세포내 병원체의 펩티드 능력에 의해 측정되는 것인 용도의 CD1 펩티드-에피토프.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시험관내 방법에서, 상기 NKT 세포 활성화는 인터페론γ(IFNγ) 및/또는 인터루킨-12(IL-12) 수준의 정량화에 의해 결정되는 것인 용도의 CD1 펩티드-에피토프.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CD1 펩티드-에피토프인 제1 펩티드, 및 상기 세포내 병원체로부터 유래되고 다른 에피토프, 바람직하게는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프에 더하여 상기 제1 펩티드-에피토프를 포함하는 펩티드인 제2 펩티드를 포함하는 세포내 병원체에 의해 유발되는 질병의 치료 용도의 부품 키트.
  11. 제10항에 있어서, 바람직하게는 플라비비리대, 코로나비리대, 오르소믹소비리대, 헤르페스비리대 및 피코르나비리대로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스성 질병의 치료 용도의 부품 키트.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 제1 펩티드로의 백신접종을 위한 보조제 및/또는 상기 제2 펩티드로의 백신접종을 위한 보조제를 추가로 포함하는 부품 키트.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD1 펩티드-에피토프에 특이적인 면역글로불린 G(IgGs, 예컨대 IgG2)를 정량하는 수단 및/또는 상기 CD1 펩티드-에피토프에 특이적인 IgG1 및/또는 IgG3을 정량하는 수단을 추가로 포함하는 부품 키트.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-12, IFNγ 및 바람직하게는 IL-4, IFNα 및/또는 IFNβ를 정량화하는 수단을 추가로 포함하는 부품 키트.
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