TW202334182A - 針對冠狀病毒的免疫原性融合蛋白 - Google Patents

針對冠狀病毒的免疫原性融合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
TW202334182A
TW202334182A TW111140268A TW111140268A TW202334182A TW 202334182 A TW202334182 A TW 202334182A TW 111140268 A TW111140268 A TW 111140268A TW 111140268 A TW111140268 A TW 111140268A TW 202334182 A TW202334182 A TW 202334182A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
protein
fusion protein
seq
amino acid
antigen
Prior art date
Application number
TW111140268A
Other languages
English (en)
Inventor
吳嘉茂
Original Assignee
薩摩亞商柏沛生醫股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 薩摩亞商柏沛生醫股份有限公司 filed Critical 薩摩亞商柏沛生醫股份有限公司
Publication of TW202334182A publication Critical patent/TW202334182A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

一種針對冠狀病毒的免疫原性融合蛋白。本發明所揭露的融合蛋白包含CD40結合結構域；SRAS-CoV2的抗原；位於該CD40結合結構域及該抗原之間的易位域及/或位於該CD40結合結構域及該易位域之間的弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點。該易位域為志賀毒素(Stx)易位肽，且該抗原位於該融合蛋白的N端。該易位域為假單胞菌外毒素A(PE)易位肽，且該CD40結合結構域位於融合蛋白的N端。本發明亦揭露該融合蛋白的醫藥組成物、表現載體及用於引起抗原特異性細胞介導之免疫反應及/或在有此需要的個體減少、抑制、治療及/或改善由SARS-CoV2感染引起之症狀的用途。

Description

針對冠狀病毒的免疫原性融合蛋白
本發明整體係關於融合蛋白，尤係針對SARS-CoV2引起抗原特異性細胞介導之免疫反應的免疫原性融合蛋白。
在2019年12月，於中國武漢首次確認引發全球大流行的嚴重急性呼吸道症狀群冠狀病毒2型(SARS-CoV2)，其在全世界感染了數億人且導致數百萬人死亡。SARS-CoV2的結構蛋白為棘蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)。棘蛋白S1和S2次單元經常作為疫苗開發的主要目標。
包含輝瑞/BioNTech(Pfizer，COMIRNATY®；mRNA疫苗)、莫德納(Moderna，SPIKEVAX®；mRNA疫苗)、阿斯特捷利康(AstraZeneca，VAXZEVRIA®；腺病毒載體疫苗)、嬌生(Janssen，Ad26.COV2.S；腺病毒載體疫苗)、科興(Sinovac，CoronaVac；不活化病毒疫苗)、國藥(Sinopharm，BBIBP-CorV；不活化病毒疫苗)及諾瓦瓦克斯(Novavax，NVX-CoV2373；次單元疫苗)等數家公司業已開發針對SARS-CoV2之疫苗。所有這些疫苗皆設計為靶向 棘蛋白(Franz X.Heinz et al.(2021),npj Vaccines,6：104)。然而，仍然需要開發更有效的疫苗來對抗這種流行病。
在一態樣中，本發明係關於一種融合蛋白，係包含：(a)CD40結合結構域；(b)嚴重急性呼吸道症狀群冠狀病毒2型(SARS-CoV2)的抗原；(C)位於該CD40結合結構域及該抗原之間的易位域及(d)一位於該CD40結合結構域及該易位域之間的弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點。
在另一態樣中，本發明係關於DNA片段及包含該DNA片段的表現載體，該DNA片段係編碼本發明之融合蛋白。本發明復關於包含本發明的融合蛋白和藥學上可接受的載劑及/或佐劑的醫藥組成物或疫苗組成物。
該醫藥組成物或疫苗組成物可復包含免疫檢查點抗體，該免疫檢查點抗體能活化T細胞。
本發明復關於包含(a)免疫檢查點抗體；及(b)本發明的融合蛋白之組合或醫藥組成物。
在另一態樣中，本發明係關於該融合蛋白、組合或醫藥組成物於製備引發針對SARS-CoV2感染的抗原特異性細胞介導之免疫反應或在有此需要的個體中減少、抑制、治療及/或改善由SARS-CoV2感染所引起之症狀的藥物之用途。該個體可為人類。
本發明亦關於融合蛋白、組合、醫藥組成物或疫苗組成物於引發針對SARS-CoV2感染的抗原特異性細胞介導之免疫反應的用途，或在有此需要的個體中減少、抑制、治療及/或改善由SARS-CoV2感染所引起之症狀的用途。
或者，本發明係關於引發針對SARS-CoV2感染的抗原特異性細胞介導之免疫反應或在有此需要的個體中減少、抑制、治療及/或改善由SARS-CoV2感染所引起之症狀的方法，該方法包含向有此需要的個體施用治療有效量之根據本發明的融合蛋白、組合、醫藥組成物或疫苗。
圖1A至1D為載體圖譜。圖2A至2D為載體圖譜。
圖3A至3F為說明本發明之各種實施態樣的示意圖。
圖4顯示免疫計畫(immunization scheme；上部)、動物群組和各自的施用計畫(下部)。
圖5係顯示每一動物群組中CD4+記憶型T細胞中IFN-γ誘導(induction)的圖。
圖6係顯示每一動物群組的CD4+記憶型T細胞中IL-2誘導的圖。
圖7係顯示來自每一動物群組的脾細胞中IFN-γ+免疫斑點結果的圖。
圖8係顯示每一動物群組中的SARS-CoV2抗原特異性抗體之水平的圖。
圖9顯示預防性給予本發明之融合蛋白的感染SARS-CoV2之動物中的肺病毒效價。
圖10顯示以瑞德西韋(remdesivir)或本發明之融合蛋白治療感染SARS-CoV2之動物的肺病毒效價。
圖11顯示以瑞德西韋或本發明的融合蛋白治療的感染SARS-CoV2之動物的存活率。
定義
專職性抗原呈現細胞(APC)及非專職性抗原呈現細胞(APC)使用主要組織相容複合體(MHC)I類分子以在細胞膜上顯示內源性肽。相對於藉由使用主要組織相容性複合體(MHC)II類分子之專職性抗原呈現細胞(APCs)的外源性肽，這些肽衍生自細胞本身。細胞毒性CD8+ T細胞可以與MHC I類分子呈現的抗原相互作用。
CD40係在表現抗源呈現細胞(例如，樹突狀細胞、巨噬細胞和B細胞)的共刺激蛋白質。CD40L至CD40的結合活化抗源呈現細胞及誘發多個下游效應。CD40係用於癌症免疫治療的藥物目標。
術語「CD40結合結構域(CD40 binding domain)」係指可辨認CD40並與CD40結合之蛋白質。CD40結合結構域可選自以下一者：CD40配體(CD40L)或其功能性片段、抗CD40抗體或其功能性片段。
術語「CD40L」、「CD40配體」及「CD154」可互換使用。CD40L與抗原呈現細胞(APC)之CD40(蛋白)結合，導致多種取決於標靶細胞類型之效應。CD40L在經由T細胞啟動之免疫反應的共刺激及調節以及CD40表現免疫細胞之活化中發揮關鍵作用。美國第5,962,406號專利揭露CD40L之核苷酸及胺基酸序列。
術語「抗CD40抗體」、「CD40特異性抗體」及「特異針對CD40的抗體」可互換使用。
當術語「實質上由...組成」用於揭示多肽之胺基酸序列，其意指該多肽可具有或不具有位於N端之作為多肽一部分的起始胺基酸「M」(轉譯自起始密碼子AUG)，取決於蛋白質轉譯要求。例如，當第二抗原與第一抗原融合時，第二抗原的起始胺基酸「M」可被省略或保留。
如本文所用，「易位域(translocation domain)」為一具有生物學活性的多肽，其將融合或連接之抗原跨胞內體膜(endosomal membrane)易位到細胞的細胞質中。易位域引導或促進抗原朝向第I類主要組織相容複合體(MHC-1)途徑(亦即，細胞毒性T細胞途徑)以進行抗原呈現。
術語「假單胞菌(Pseudomonas)外毒素A(PE)易位肽(TPE)」指稱PE域II肽或其功能性片段，其在易位中具有生物學活性。
術語「志賀毒素(Stx)易位肽(TStx)」指稱Stx易位域或其功能性片段，其在易位中具有生物學活性。
術語「弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L」或「弗林蛋白酶/組織蛋白酶L」可互換使用。
術語「弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點(furin and/or cathepsin L cleavage site)」係指具有至少4個可被弗林蛋白酶或組織蛋白酶L或同時被弗林蛋白酶及組織蛋白酶L裂解的短肽序列。所述裂解位點係弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L敏感位點。其可為包含被引入融合蛋白中裂解位點的肽連接子。此外，弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點可以係存在於融合蛋白的易位結構域中或附近的PE或Stx內在蛋白酶裂解位點。
術語「抗原」和「免疫原」可互換使用。抗原係指衍生自SARS-CoV2的抗原性蛋白質或多肽。所述抗原包含用於誘發所欲免疫反應的至少一抗原決定位(epitope)。在一些實施態樣中，該抗原係至少8個胺基酸之長度的多肽，其衍生自SARS-CoV2的棘(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白及核衣殼(N)蛋白。
術語「抗原SARS-CoV2」、「SARS-CoV2抗原」和「SARS-CoV2病毒蛋白質抗原」可互換使用。
術語「選自(selected)」及「衍生自(derived)」可互換使用。因此，術語「選自蛋白質的多肽」、「選自蛋白質區域的多肽」及「衍生自蛋白質的多肽」可互換使用。
分化簇28(CD28)係T細胞特異性表面醣蛋白質。在T細胞與抗原呈現細胞接觸期間CD28受體受到刺激，其功能涉及T細胞活化、細胞增殖、誘導細胞因子產生以及促進T細胞存活。
術語「有效量」或「治療有效量」指於經治療之個體賦予治療效果所需的活性融合蛋白之量。如所屬技術領域中具通常知識者所認知的，取決於給藥途徑、賦形劑之使用及與其他治療方法共同使用(co-usage)的可能性，治療劑量可能產生改變。
術語「治療(treating)」或「療法(treatment)」指稱給藥有效量之融合蛋白至有此需要之個體，該個體患有癌症或感染或具有朝向該疾病之症狀或傾向性，目的為治癒、緩解、減輕、補救、改善或預防疾病、疾病之症狀或朝向疾病之傾向性。該個體可以由醫療衛生專業人士基於任意合適之診斷方法的結果進行識別。
「0至12重複」或「2至6重複」意指「0至12」或「2至6」範圍內之全部整數單位量作為本發明之一部分而具體揭露。因此，包含「0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12」或「2、3、4、5和6」單位量作為本發明之實施態樣。
縮寫：MCS，多複製位點；a.a.，胺基酸；抗-PD-1，抗-細胞程序性死亡-1；抗-PD-L1，抗-細胞程序性死亡配體-1；Rap1，Ras-近似蛋白-1或Ras-相關蛋白1；CD40，分化簇40；CDR，互補決定區；SARS-CoV2，嚴重急性呼吸道症狀群冠狀病毒2型。
融合蛋白
在一方面，本發明係關於包含以下的融合蛋白：(a)CD40結合結構域；(b)SARS-CoV2的抗原；(c)位於該CD40結合結構域與該抗原之間的易位域；以及(d)位於該CD40結合結構域與該易位域之間的弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點。
本發明之融合蛋白可以引起經由第I類MHC抗原呈現途徑的抗原特異性T細胞免疫反應，其等具有共同作用機制。使用CD40L-TPE-Ag(Ag表示任何適合的抗原)作為實施例，該作用機制係如以下：
(1)CD40L-TPE-Ag結合至CD40呈現細胞(例如，樹突狀細胞或巨噬細胞)並經由CD40介導之胞吞作用被內化；
(2)胞內體中的弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L蛋白酶裂解CD40L-TPE-Ag，從而分離CD40L片段與TPE-Ag片段；
(3)TPE-Ag片段易位穿過胞內膜(endosomal membrane)並進入細胞質；
(4)TPE-Ag片段被細胞質蛋白酶體消化(digest)以生成具有抗原決定位的小抗原；
(5)遞送該小抗原至第I類MHC途徑以進行抗原呈現；以及
(6)藉由T細胞辨識此等經呈現之抗原而予以誘導或增強CD8+ T細胞特異性免疫反應。
上揭相同作用機制適用於Ag-TStx-CD40L，其中弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解將CD40L片段與Ag-TStx片段分離。因此，該Ag-TStx片段被跨胞內體之胞內體膜易位至細胞質，被細胞質蛋白酶體消化以生成具有抗原決定位之小抗原。該小抗原被遞送至第I類MHC途徑以進行抗原呈現，以及，CD8+ T細胞特異免疫反應藉由藉由T細胞辨識此等經呈現之抗原而予以誘導(induced)或增強(enhanced)。
在本發明的融合蛋白中的抗原及易位域之間，沒有弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點存在。弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點的存在及其在融合蛋白中的位置允許在弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解之後，CD40結合結構域從融合蛋白的拔除。
在一實施態樣中，該弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點包含或由4至20個胺基酸所組成，較佳4至10個胺基酸及更佳4至6個胺基酸。在另一實施態樣中，該弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點包含、由以下組成或為SEQ ID NO：1或2。
在另一實施態樣中，本發明之融合蛋白進一步包含位於該CD40結合結構域及該易位域之間的肽連接子，其中該弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點係存在於所述肽連接子。該肽連接子可包含：(a)一剛性連接子 (EAAAAK)n或(SEQ ID NO：38)n；及(b)一包含弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點的可裂解連接子，其中n係0至12的整數，較佳2至6，更佳3至4，且所述弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點包含SEQ ID NO：1或2。在一實施態樣中，該肽連接子包含(EAAAAK)3及RX1RX2X3R(SEQ ID NO：2；其中X1為A，X2為Y，X3為K)。在另一實施態樣中，該肽連接子包含RX1X2R(SEQ ID NO：1；其中X1為V，X2為A)及(EAAAAK)3。
該易位域及抗原係位於融合蛋白內，這種方向及/或關係允許易位域將抗原跨胞內體的膜易位及進入細胞質及促進抗原朝向MHC I類途徑，用於在所述CD40表現細胞中的抗原呈現。
該易位域可選自假單胞菌外毒素A(PE)或志賀毒素(Stx)。在一實施態樣中，該易位域包含或係假單胞菌外毒素A(PE)易位肽(TPE)，附帶限制條件為該CD40結合結構域位於融合蛋白的N端。在另一實施態樣中，該易位域包含或係志賀毒素(Stx)易位肽(TStx)，附帶限制條件為該抗原位於融合蛋白的N端。
在一實施態樣中，本發明的融合蛋白依次(從N端到C端)包含：(a)CD40結合結構域；(b)弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點；(c)包含PE易位肽(TPE)的易位域；及(d)SARS-CoV2的抗原。在另一實施態樣中，本發明的融合蛋白依次(從N端到C端)包含：(a)CD40結合結構域；(b)包含弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點的肽連接子；(c)包含PE易位肽(TPE)的易位域；及(d)SARS-CoV2的抗原。在另一實施態樣中，本發明的融合蛋白依次(從N端到C端)包含：(a)SARS-CoV2的抗原；(b)包含Stx易位肽(TStx)的易位域；(c)弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點； 以及(d)CD40結合結構域。在另一實施態樣中，本發明的融合蛋白依次(從N端到C端)包含：(a)SARS-CoV2的抗原；(b)包含Stx易位肽(TStx)的易位域；(c)包含弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點的肽連接子；以及(d)CD40結合結構域。
該TPE或TStx係在易位中具有生物學活性的功能部分體。該弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點可選自下列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或在或衍生自PE或Stx之內在弗林蛋白酶裂解位點。在一實施態樣中，該PE易位肽係假單胞菌外毒素A蛋白(全長度PE，SEQ ID NO：4)的域II(a.a.殘基253至364；SEQ ID NO：9)或其功能性部分體。在另一實施態樣中，該PE易位肽(TPE)由26至112個a.a.殘基的長度組成。該PE易位肽(TPE)包含GWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSW(SEQ ID NO：5)的最小功能性片段。在一實施態樣中，該PE易位肽(TPE)包含與SEQ ID NO：5、6、7、8或9至少95%、97%或99%之同一性的胺基酸序列。在另一實施態樣中，TPE包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：5、6、7、8及9。在另一實施態樣中，TPE係PE280-305(SEQ ID NO：5)、PE280-313(SEQ ID NO：6)、PE268-313(SEQ ID NO：7)、PE253-313(SEQ ID NO：8)或PE253-364(SEQ ID NO：9；全長度PE域II)。
在一實施態樣中，該Stx易位肽(TStx)係志賀毒素(Stx)次單元A(SEQ ID NO：10)或類志賀毒素I(Slt-I)次單元A(SEQ ID NO：11)的功能性片段。Stx易位肽有易位功能，但沒有次單元A之細胞毒性效果。志賀毒素(Stx)次單元A與Slt-I次單元A的序列的同一性為99%，而且該兩種蛋白質只有一胺基酸之差異。在另一實施態樣中，該Stx易位肽(TStx)由8至84個a.a. 殘基的長度組成。該Stx易位肽(TStx)包含LNCHHHAS(SEQ ID NO：12)之最小功能性片段。在另一實施態樣中，該Stx易位肽(TStx)由8至84個a.a.殘基的長度組成。該Stx易位肽(TStx)包含LNCHHHAS(SEQ ID NO：12)之最小功能性片段。在一實施態樣中，該Stx易位肽(TStx)包含與SEQ ID NO：12、13、14、15或16具有至少95%、97%或99%之同一性的胺基酸序列。在另一實施態樣中，該TStx包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：12、13、14、15及16。在另一實施態樣中，TStx係Stx次單元A的Stx240-247(SEQ ID NO：12)、Stx240-251(SEQ ID NO：13)、Stx211-247(SEQ ID NO：14)、Stx211-251(SEQ ID NO：15)或Stx168-251(SEQ ID NO：16)。
CD40結合結構域允許本發明之融合蛋白結合至在CD40表現細胞(例如，樹突狀細胞或巨噬細胞)的CD40受體。CD40結合結構域可以係選自由下組成之群組的一者：(i)CD40配體(CD40L)或其功能性片段；及(ii)CD40特異性抗體或其功能性片段。在一實施態樣中，該CD40L的功能性片段係全長度CD40L1-261蛋白(SEQ ID NO：17)之基本上缺乏跨膜的經截短之CD40L及全長度CD40L1-261蛋白(SEQ ID NO：17)之細胞質區。
在另一實施態樣中，該CD40L或其功能性片段由154至261個a.a.殘基的長度組成。在又一實施態樣中，該CD40L包含SEQ ID NO：19的最小功能性片段。在再一實施態樣中，該CD40L或其功能性片段由154至261個a.a.殘基的長度組成且所述CD40L包含SEQ ID NO：19的最小功能性片段。在一實施態樣中，該CD40L包含與SEQ ID NO：17、18或19具有至少95%、97%或99%之同一性的胺基酸序列。在另一實施態樣中，該CD40選自由下列組成之群組：CD40L1-261(SEQ ID NO：17)、CD40L47-261(SEQ ID NO：18)及CD40L108- 261(SEQ ID NO：19)。在另一實施態樣中，該CD40結合結構域係CD40特異性抗體(或抗CD40抗體)。CD40特異性抗體係特異性辨認並與CD40蛋白質結合的抗體。CD40特異抗體可以結合至表現CD40之細胞上的CD40蛋白質。
在一實施態樣中，該CD40特異性抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變域(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；且該VL包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列。在另一實施態樣中，該CD40特異性抗體選自由以下組成之群組：單鏈可變片段(scFv)、雙抗體(diabody；dscFv)、三抗體(triabody)、四抗體(tetrabody)、雙特異性scFv、scFv-Fc、scFc-CH3、單鏈抗原結合片段(scFab)、抗原結合片段(Fab)、Fab2、微小抗體(minibody)及完全抗體。在另一實施態樣中，該CD40結合結構域係包含重鏈可變域(VH)、輕鏈可變域(VL)及連接VH及VL柔性連接子(flexible linker；L)的CD40特異scFv(抗CD40 scFv)。在一實施態樣中，該CD40特異scFv包含SEQ ID NO：20或21。
在另一實施態樣中，該CD40結合結構域係(i)CD40特異性抗體或其結合片段；或(ii)CD40特異性單鏈可變片段(scFv)或其結合片段；包含VH及VL的所述CD40特異性抗體或所述CD40特異scFv，其中：(a)該VH包含SEQ ID NO：22；及(b)該VL包含SEQ ID NO：23。
在另一實施態樣中，該CD40特異性抗體或CD40特異scFv包含VH及VL，該VH包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3；且該VL包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中：(i)該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：24、25及26；及(ii)該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：27、28及29。
在另一實施態樣中，該CD40結合結構域係包含VH及VL的CD40特異性scFv，其中：(a)該VH包含SEQ ID NO：22；且(b)該VL包含SEQ ID NO：23。
在另一實施態樣中，本發明之融合蛋白進一步包含位於該抗原之C端的內質網(ER)滯留序列，限制條件為易位域包含PE易位肽(TPE)。該ER滯留序列可包含SEQ ID NO：30、31、32、33或34。在一實施態樣中，該ER滯留序列係SEQ ID NO：30。
在另一實施態樣中，本發明之融合蛋白進一步包含位於CD40結合結構域以及弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點之間的CD28活化肽。
在另一實施態樣中，該CD28活化肽由28至53個a.a.殘基的長度組成。在另一實施態樣中，該CD28活化肽包含SEQ ID NO：35的最小功能性片段。在另一實施態樣中，該CD28活化肽由28至53個a.a.殘基的長度組成且所述CD28活化肽包含SEQ ID NO：35的最小功能性片段。
在另一實施態樣中，該CD28活化肽包含與SEQ ID NO：35、36或37具有至少95%、97%或99%之同一性的胺基酸序列。在另一實施態樣中，該CD28活化肽包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：35、36及37。在另一實施態樣中，該CD28活化肽係SEQ ID NO：35、36或37。
在一實施態樣中，該SARS-CoV2係NCBI參考編號為NC_045512.2的Wuhan-Hu-1菌株或其變體。
在另一實施態樣中，SARS-CoV2係包含至少一個如以下所列胺基酸突變的病毒變體：
(a)該在棘蛋白的至少一胺基酸突變選自由L5F、S12F、S13I、L18F、T19R、T20N、P26S、Q52R、A67V、DEL69/70、V70F、G75V、T76I、D80G、D80A、T95I、D138Y、DEL141/143、G142D、DEL144/145、Y144S、Y145N、W152R、W152C、E154Q、E154K、DEL157/158、F157S、R190S、D215G、A222V、DEL241/243、DEL243/244、DEL247/253、D253G、W258L、Y265C、R346K、R346S、K417N、K417T、N439K、L452R、L452Q、S477N、T478K、E484K、E484Q、F490S、N501Y、K558N、A570D、D614G、H655Y、Q677H、P681R、P681H、A688V、A701V、T716I、D796H、S813N、T859N、F888L、A899S、D950N、D950H、Q957R、S982A、T1027I、Q1071H、E1072K、E1092K、H1101Y、H1101D、D1118H、I1130V、D1139H及V1176F所組成的群組，其中突變的參考序列係S蛋白的SEQ ID NO：39；
(b)該在包膜蛋白的至少一胺基酸突變選自由L21F、S68F及P71L所組成的群組，其中突變的參考序列係E蛋白的SEQ ID NO：44；
(c)該在膜蛋白的至少一胺基酸突變選自由L29F、A63T、I82T、I82S及H125Y所組成的群組，其中突變的參考序列係M蛋白的SEQ ID NO：45；以及
(d)該在核衣殼蛋白的至少一胺基酸突變選自由D3L、DEL3、D3Y、A12G、P13L、D63G、P67S、P80R、A119S、I157V、P199L、S202R、R203M、R203K、G204R、G204P、T205I、DEL209、G212V、G214C、G215C、M234I、S235F、K256R、T366I及D377Y所組成的群組，其中突變的參考序列係N蛋白的SEQ ID NO：46。
於上述每一突變，號碼表示在蛋白質序列中相應的胺基酸(a.a.)位置。與數字相鄰的大寫字母為單一字母胺基酸代碼(Single-Letter Amino Acid Code)。該與數字相鄰的大寫字母「DEL」代表在相應位置的a.a.刪除。因此，突變「D3L」係指在所示蛋白質序列的位置3的a.a從D(天門冬胺酸)突變為L(白胺酸)。突變「DEL3」係指在所示蛋白質序列位置3的a.a.被刪除。
根據WHO標示，SARS-CoV2病毒變體包括，但不限於：(1)需要注意的變體，如Alpha變體(B.1.1.7)、Beta變體(B.1.351)、Gamma變體(P.1)、Delta變體(B.1.617.2)及Omicron變體(BA.1、BA.2、BA.5或其它譜系)及(2)感興趣的變體，如Eta變體、Iota變體、Kappa變體、Lambda變體及Mu變體。與Wuhan-Hu-1菌株(NCBI參考編號NC_045512.2)相比，每個變體包含至少一胺基酸突變。在一實施態樣中，所述變體至少在棘蛋白中包含D614突變。本發明的融合蛋白讓使用選自SARS-CoV2或其變體的合適抗原或保留區對於製備疫苗用以誘導在變體之間的強烈適應性免疫反應成為可能。
本發明的融合蛋白中抗原可包含選自下列SARS-CoV2(包括Wuhan-Hu-1菌株或其任何病毒變體)多肽：棘(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白或核衣殼(N)蛋白。
在一實施態樣中，該抗原包含選自由下列組成的群組的至少一種多肽：
(a)選自棘蛋白之SEQ ID NO：39的區域的8至1273個a.a.殘基的多肽，其中該多肽任選地包含選自由L5F、S12F、S13I、L18F、T19R、T20N、P26S、Q52R、A67V、DEL69/70、V70F、G75V、T76I、D80G、D80A、T95I、D138Y、DEL141/143、G142D、DEL144/145、Y144S、Y145N、 W152R、W152C、E154Q、E154K、DEL157/158、F157S、R190S、D215G、A222V、DEL241/243、DEL243/244、DEL247/253、D253G、W258L、Y265C、R346K、R346S、K417N、K417T、N439K、L452R、L452Q、S477N、T478K、E484K、E484Q、F490S、N501Y、K558N、A570D、D614G、H655Y、Q677H、P681R、P681H、A688V、A701V、T716I、D796H、S813N、T859N、F888L、A899S、D950N、D950H、Q957R、S982A、T1027I、Q1071H、E1072K、E1092K、H1101Y、H1101D、D1118H、I1130V、D1139及V1176F所組成群組之至少一種胺基酸突變；
(b)選自包膜蛋白之SEQ ID NO：44的區域的8至75個a.a.殘基的多肽，其中該多肽任選地包含選自由L21F、S68F及P71L所組成群組之至少一種胺基酸突變；
(c)選自膜蛋白之SEQ ID NO：45的區域的8至222個a.a.殘基的多肽，其中該多肽任選地包含選自由L29F、A63T、I82T、I82S及H125Y所組成群組之至少一種胺基酸突變；以及
(d)選自核衣殼蛋白之SEQ ID NO：46的區域的8至491個a.a.殘基的多肽，其中該多肽任選地包含選自由D3L、DEL3、D3Y、A12G、P13L、D63G、P67S、P80R、A119S、I157V、P199L、S202R、R203M、R203K、G204R、G204P、T205I、DEL209、G212V、G214C、G215C、M234I、S235F、K256R、T366I及D377Y所組成群組之至少一種胺基酸突變。
在一實施態樣中，該抗原係8至1273個a.a.殘基的經截短之棘蛋白，較佳100至800個a.a.殘基，及更佳200至700個a.a.殘基。該經截短之棘蛋白可選自SEQ ID NO：40、41、42或43。
該抗原可為包含獨立衍生自SARS-CoV2的棘蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和N蛋白中選擇的兩種不同蛋白的至少兩多肽的融合抗原。例如，於融合蛋白CD40L-TPE-E/M(SEQ ID No：49)中的抗原係融合抗原，其包含獨立衍生自SARS-CoV2的包膜蛋白及膜蛋白的兩個多肽。
在一實施態樣中，該抗原包含胺基酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID No：39、40、41、42、43、44、45或46具有至少80%、85%、95%或99%之同一性的胺基酸序列。在另一實施態樣中，該抗原係與SEQ ID No：39、40、41、42、43、44、45或46具有至少80%、85%、95%或99%之同一性的胺基酸序列。在另一實施態樣中，該抗原係為SEQ ID No：39、40、41、42、43、44、45或46。該抗原包含用於誘導所需的免疫反應的至少一抗原決定位，較佳含有1至50個抗原決定位，更佳含有1至20個抗原決定位。
為了開發SARS-CoV2肽疫苗，由電腦模擬設計並研究許多候選抗原決定位(epitope)，以了解其等誘導B細胞及/或T細胞免疫反應的活性(例如，美國專利第10973908 B1號；美國專利第10973909B1號；Christof C.Smith et al.,(2021),Genome Medicine,13：101)。這些抗原決定位可以用作本發明融合蛋白中使用的抗原的一部分。
本發明的抗原攜帶融合蛋白融合蛋白預期引起強烈的免疫反應，而非簡單直接地使用這些抗原/抗原決定位。合適的抗原/抗原決定位的實施例可以選自以下SARS-CoV2蛋白質的每一參考序列中的相應位置(例如，S488-525表示對應於所述棘蛋白序列的位置488至525的胺基酸序列)：
(a)S488-525、S450-469、S231-245、S265-279、S865-879、S1014-1028、S446-460、S448-462、S449-463、S451-465、S453-467、S454-468、S456-470、S458-472、S461-475、S468-482、S570-584、 S579-593、S799-813、S800-814、S84-104、S225-245、S261-281、S865-885、S966-986、S1008-1028、S448-468、S453-473、S462-482、S564-584、S579-599、S580-600、S799-819、S809-829、S38-64、S261-287、S297-323、S857-883、S975-1001、S1000-1026、S447-473、S451-477、S456-482、S558-584、S579-605、S788-814、S809-835、S22-51、S35-64、S76-105、S98-127、S253-282、S391-420、S683-712、S701-730、S893-992、S898-729、S1091-1120，其中參考序列係棘蛋白的SEQIDNO：39，且進一步其中該抗原/抗原決定位任選地包含選自由L5F、S12F、S13I、L18F、T19R、T20N、P26S、Q52R、A67V、DEL69/70、V70F、G75V、T76I、D80G、D80A、T95I、D138Y、DEL141/143、G142D、DEL144/145、Y144S、Y145N、W152R、W152C、E154Q、E154K、DEL157/158、F157S、R190S、D215G、A222V、DEL241/243、DEL243/244、DEL247/253、D253G、W258L、Y265C、R346K、R346S、K417N、K417T、N439K、L452R、L452Q、S477N、T478K、E484K、E484Q、F490S、N501Y、K558N、A570D、D614G、H655Y、Q677H、P681R、P681H、A688V、A701V、T716I、D796H、S813N、T859N、F888L、A899S、D950N、D950H、Q957R、S982A、T1027I、Q1071H、E1072K、E1092K、H1101Y、H1101D、D1118H、I1130V、D1139H及V1176F所組成群組之至少一種胺基酸突變；
(b)E45-74，其中參考序列係包膜蛋白的SEQ ID NO：44，且進一步其中該抗原/抗原決定位任選地包含選自由L21F、S68F及P71L所組成群組之至少一種胺基酸突變；
(c)M34-48、M39-53、M40-54、M95-109、M99-113、M34-54、M65-85、M93-113、M59-85、M95-121、M93-122，其中參考序列係膜蛋白的SEQIDNO：45，且進一步其 中該抗原/抗原決定位任選地包含選自由L29F、A63T、I82T、I82S及H125Y所組成群組之至少一種胺基酸突變；以及
(d)N104-118、N264-278、N302-316、N310-324、N322-336、N326-340、N389-403、N104-124、N147-167、N304-324、N310-330、N320-340、N328-348、N388-408、N102-128、N301-327、N305-331、N310-336、N324-350、N383-409、N36-65、N225-284、N290-319、N384-413，其中參考序列係核衣殼蛋白的SEQ ID NO：46，且進一步其中該抗原/抗原決定位任選地包含選自由D3L、DEL3、D3Y、A12G、P13L、D63G、P67S、P80R、A119S、I157V、P199L、S202R、R203M、R203K、G204R、G204P、T205I、DEL209、G212V、G214C、G215C、M234I、S235F、K256R、T366I及D377Y所組成群組之至少一種胺基酸突變。
抗原可為單一抗原或其抗原片段或包含融合在一起之至少兩個抗原多肽且兩個抗原多肽之間有或沒有連接子的融合抗原。
融合抗原可具有連接兩個不同抗原多肽的剛性連接子(EAAAAK)n，其中n係0至12的整數，較佳2至6，更佳3至4。換言之，該剛性連接子包含序列EAAAAK(SEQ ID NO：38)的0至12重複、2至6重複或3至4重複。
本發明的融合蛋白還可包含在CD40結合結構域和弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點之間的剛性連接子。該剛性連接子包含胺基酸序列EAAAAK(SEQ ID NO：38)的0到12重複。該剛性連接子可為(EAAAAK)n或(SEQ ID NO：38)n，其中n係0至12的整數，較佳2至6，更佳3至4。在一實施態樣中，該剛性連接子包含SEQ ID NO：38的2至6重複或3至4重複。
在另一實施態樣中，本發明的融合蛋白包含或實質上由與SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53或54具有至少90%、95%或99%同一性的胺基酸序列所組成。在另一實施態樣中，該融合蛋白包含或實質上由選自由SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53及54所組成群組之胺基酸序列所組成。
醫藥組成物/疫苗
本發明進一步關於醫藥組成物或疫苗，其包含：
(a)本發明之融合蛋白；以及(b)藥學上可接受的載劑及/或佐劑。
根據本發明的疫苗係預防性及/或治療性疫苗。
術語「載劑」或「藥學上可接受的載劑」包括任何和所有溶劑、分散介質、塗層、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩定劑、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料等及其組合，如所屬領域技術中具有通常知識者所知(參照例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329)。
合適的佐劑包含但不限於基於皂苷的(saponin-based)佐劑和類鐸受體(TLR)促效佐劑。該基於皂苷的佐劑可以係GPI-0100、Quil A或QS-21。該TLR促效佐劑可以選自TLR3、TLR4或TLR9促效劑，例如，Poly I：C(TLR3促效劑)、單磷醯脂質A(MPL；TLR4促效劑)或CpG寡核苷酸(TLR9促效劑)。該CpG寡核苷酸佐劑包含但不限於，A類CpG(亦即，CpG1585、CpG2216或CpG2336)、B類CpG(亦即，CpG1668、CpG1826、CpG2006、CpG2007、CpGBW006或CpG D-SL01)及C類CpG(亦即，CpG2395、CpG M362或CpG D-SL03)。另一合適的CpG佐劑係CpG1018(Dynavax)。在一實施態樣中，該佐劑係CpG寡核苷酸。
該醫藥組成物/疫苗可為腸內(enteral)劑型或腸外(parenteral)劑型，適合用於透皮、跨黏膜、鼻咽部、肺內投予或直接注射、或適用於全身性(例如，腸胃外)或局部(例如，腫瘤內或病灶內注射)給藥。腸胃外注射可以藉由靜脈內(iv.)、腹膜內(i.p.)、肌肉內(im.)、皮下(s.c.)或皮內(i.d.)途徑。該醫藥組成物亦可經口給藥，例如，以片劑、包衣片劑、菱錠劑、硬明膠膠囊和軟明膠膠囊之形式。
該融合蛋白之劑量可改變，取決於待調控之疾病、患者之年齡及個別情況以及給藥方式。在每種特定情況下，可將劑量匹配於個體要求以獲得達成所欲之治療性反應的本發明之融合蛋白的治療性有效量。
對於成年患者，開始考慮約0.1至50mg，尤其係約0.1至5mg之單次劑量。取決於疾病之嚴重程度及精確之藥物動力學曲線，可將融合蛋白以每週、每兩週或每月投予一個劑量，並且每個週期總計給出1至6個劑量單位，以滿足該療法。
在一實施態樣中，本發明提供套組或包含本發明的融合蛋白及其使用說明之包裝醫藥組成物，在有其需要的個體中治療由SARS-CoV2感染引起之一個或多個症狀。
組合治療
進一步在另一實施態樣中，本發明的醫藥組成物進一步包含能夠活化T細胞的免疫檢查點抗體。
在另一方面，本發明係關於組合或醫藥組成物包含：(a)能夠活化T細胞的免疫檢查點抗體；及(b)根據本發明的融合蛋白。免疫檢查點抗體包含但不限於抗PD-1拮抗劑抗體或抗CD137促效劑抗體。
在另一方面，本發明係關於用於引起抗原特異性細胞介導的免疫反應，在有其需要的個體中治療由SARS-CoV2引起之疾病的一個或多個症狀的組合或醫藥組成物。
在一實施態樣中，該免疫檢查點抗體係抗PD-1抗體，例如，KEYTRUDA®(pembrolizumab)、OPDIVO®(nivolumab)、LIBTAYO®(cemiplimab)或JEMPERLI®(dostarlimab)。在一實施態樣中，該免疫檢查點抗體係抗PD-L1抗體，例如，TECENTRIQ®(atezolizumab)、IMFINZI®(durvalumab)或BAVENCIO®(avelumab)。在一實施態樣中，該免疫檢查點抗體係抗CTLA-4抗體，例如，YERVOY®(ipilimumab)。在一實施態樣中，該免疫檢查點抗體係抗L-AG3抗體，例如，Relatlimab(BMS-986016)。在一實施態樣中，該免疫檢查點抗體係抗TIGIT抗體，例如，tiragolumab。在一實施態樣中，該免疫檢查點抗體係抗CD137抗體，例如，LVGN6051或Urelumab(BMS-663513)。在一實施態樣中，該免疫檢查點抗體係抗OX40抗體，例如，PF-04518600、BMS-986178或MEDI6469。在一實施態樣中，該免疫檢查點抗體係CD137/PD-L1雙特異性抗體，例如，FS222。在一實施態樣中，該免疫檢查點抗體係CD137/OX40雙特異性抗體，例如，FS120。
在另一實施態樣中，該免疫檢查點抗體包含完整抗體、單鏈可變片段(scFv)、雙抗體(dscFv)、三抗體、四抗體、雙特異性-scFv、scFv-Fc、 scFc-CH3、單鏈抗原結合片段(scFab)、抗原結合片段(Fab)、Fab2、微型抗體(minibody)或包含一個或多個CDR的抗體類似物。
實施例
材料與方法
表1顯示SEQ ID編號以及對應的多肽及融合蛋白。
Figure 111140268-A0202-12-0023-2
Figure 111140268-A0202-12-0024-3
Figure 111140268-A0202-12-0025-4
Figure 111140268-A0202-12-0026-5
流式細胞分析術
於37℃，以抗原刺激劑刺激脾細胞(用於增強在本發明之融合蛋白中使用的針對特異性抗原的免疫反應)2小時，接著在37℃用50μg/ml之布雷菲德菌素A(Brefeldin A)和孟寧素(Monensin)治療2小時。採集細胞，用含有0.5%BSA的PBS洗滌，並且同時用下列抗體染色：APC/Cy7接合之抗CD3抗體、PerCP/Cy5.5接合之抗CD4抗體、FITC接合之抗CD8抗體、PE接合之抗CD44抗體及APC接合之抗CD62L抗體。洗滌後，將細胞透化、固定並同時使用PE接合之抗IFN-γ抗體、PE/Cy7接合之抗IL-2抗體和efluor450接合之抗TNF-α抗體進行染色。藉由Gallios流式細胞儀及Kaluza軟體進一步分析具有CD8+或CD4+記憶T細胞表現型(CD3+CD44hiCD62Llo)之脾細胞的細胞內細胞激素特徵(IFN-γ、IL-2或TNF-α)。
酵素結合免疫斑點(Enzyme-linked immunospot，ELISpot)檢定
在抗原性刺激物存在或不存在下，將脾細胞以2×105個細胞/孔之密度重複三次接種在經預治療之鼠IFN-γ捕獲96孔板(CTL IMMUNOSPOT®)中。在37℃培育24小時後，丟棄細胞。洗滌之後，藉由生物素接合之抗鼠IFN-γ抗體於室溫對所捕獲之IFN-γ進行2小時之檢驗，並且根據製造商之說明書， 將IFN-γ免疫點顯影。藉由IMMUNOSPOT® S5微分析儀(CTL)掃描並計數IFN-γ免疫點之。
間接免疫吸附檢定(ELISA)
將所收集之全血樣本於4℃靜置30至60分鐘，並以5,000g離心10分鐘以沉澱凝塊。將血清樣本於-20℃儲存。將用於抗原特異性抗體結合的經純化之蛋白在胍被覆緩衝液(2M鹽酸胍、500mM Na2HPO4、25mM檸檬酸鹽，pH 4.0-4.4)中稀釋，並以1μg/孔分配至96孔板中。於4℃過夜培育之後，於37℃用1% BSA在PBS中之溶液將該96孔板封閉1小時。將血清樣本融化，接著在具有1% BSA的PBS中進行10倍連續稀釋。於37℃，將經被覆之蛋白與100μl的經1000倍稀釋之血清樣本培育2小時。用磷酸鹽緩衝鹽水TWEEN®-20(PBST)洗滌4次後，藉由辣根過氧化物酶(HRP)接合之山羊抗鼠IgG(稀釋度為1：10,000，Cat#31430，Theimo Fisher Science)在37℃培育30分鐘而檢驗抗原特異性抗體。用PBST洗滌4次之後，在100μL之TMB受質存在下催化HRP媒介之顯色，並用100μL之1N HCl淬滅。藉由450nm之吸光度測定血清樣本中抗原特異性抗體的相對效價。
統計分析
使用t檢驗，當p<0.05時，將結果視為顯著。
實施例1
表現載體的構建
CD40L-TPE-SRBD、CD40L-TPE-E/M及CD40L-TPE-N
構建載體CD40L-TPE-SRBD(圖1A)以產生CD40L-TPE-SRBD(SEQ ID NO：47；圖3A)融合蛋白，其包含：(a)經截短之CD40配體CD40L108-261 (SEQ ID NO：19)；(b)包含(EAAAAK)3(SEQ ID NO：3)及RX1RX2X3R(SEQ ID NO：2；其中X1為A，X2為Y，X3為K)的可裂解肽連接子；(c)PE易位肽PE280-305(SEQ ID NO：5)；以及(d)為作抗原之SARS-CoV2棘蛋白的受體結合結構域(SRBD；SEQ ID NO：41)。圖3A至3F顯示根據本發明的融合蛋白之各種實施態樣。
簡而言之，包含CD40L108-261、可裂解連接子和PE易位肽(PE280-305)的編碼 HindIII CD40L-連接子-PE NcoI,XhoI,SalI的DNA片段係經PCR合成，藉由HindIII/SalI消化，接著連接到具有HindIII/XhoI裂解位點的質體pTAC-MAT-Tag-2(編號E5405，Sigma-Aldrich)以獲得質體P07-His-pNC(圖1B)。藉由限制酵素NcoI/XhoI，將帶有His標籤之編碼該抗原SARS-CoV2 SRBD的另一DNA片段插入質體P07-His-pNC(圖1B)中，以產生表現載體CD40L-TPE-SRBD(圖1A)。
可裂解連接子允許弗林蛋白酶/組織蛋白酶切割本發明之融合蛋白，以自該融合蛋白釋放TPE-SRBD片段。
使用上揭之類似的方法，可以其他來自SARS-CoV2的任何感興趣抗原替代抗原SRBD並插入到圖1B的質體中，以產生用於表現包含感興趣抗原之融合蛋白的表現載體，其類似於圖1A。
同樣地，以SARS-CoV2包膜(E)蛋白(SEQ ID NO：44)及SARS-CoV2膜(M)蛋白(SEQ ID NO：45)組成的融合抗原E/M取代該抗原SRBD，以構建產生CD40L-TPE-E/M(SEQ ID NO：49；圖3B)融合蛋白的表現載體(圖1A)。以SARS-CoV2核衣殼(N)蛋白(SEQ ID NO：46)取代抗原SRBD，以 類似地構建產生CD40L-TPE-N(SEQ ID NO：50；圖3C)融合蛋白的表現載體(圖1D)。
SRBD-TStx-CD40L、E/M-TStx-CD40L及N-TStx-CD40L
構建載體SRBD-TStx-CD40L(圖2A)以產生SRBD-TStx-CD40L(SEQ ID NO：51；圖3D)融合蛋白，其包含：(a)作為抗原之SARS-CoV2棘蛋白(SRBD；SEQ ID NO：41)的受體結合結構域；(b)Stx易位肽Stx211-247(SEQ ID NO：14)；(c)包含RX1X2R(SEQ ID NO：1；其中X1為V，X2為A)及(EAAAAK)3(SEQ ID NO：3)的可裂解肽連接子；以及(d)經截短之CD40配體CD40L108-261(SEQ ID NO：19)。
簡而言之，包含Stx易位肽(Stx211-247)、可裂解連接子及CD40L108-26之編碼 HindIII,XhoIStx-連接子-CD40L SalI的DNA片段係經PCR合成，藉由HindIII/SalI消化，並連接到具有HindIII/XhoI裂解位點的質體pTAC-MAT-Tag-2主鏈，以產生質體P08(RP)-His-pNC(圖2B)。藉由NcoI/XhoIvu限制酶將帶有His標籤之編碼該抗原SARS-CoV2 SRBD的另一DNA片段插入質體P08(RP)-His-pNC(圖2B)中，以產生表現載體SRBD-TStx-CD40L(圖2A)。
因為可裂解連接子允許弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L切割融合蛋白，以從該融合蛋白釋放SRBD-TStx片段，故該可裂解連接子對本發明之融合蛋白而言係重要的。
使用上述類似的方法，可以來自SARS-CoV2的任何其他感興趣抗原替代抗原SRBD並插入圖2B的質體中，以產生如圖2A的表現載體，以表現包含該感興趣抗原之融合蛋白。
類似地，藉由以SARS-CoV2包膜(E)蛋白(SEQ ID NO：44)及SARS-CoV2膜(M)蛋白(SEQ ID NO：45)組成的融合抗原E/M取代抗原SRBD，以同樣構建產生E/M-TStx-CD40L(SEQ ID NO：53；圖3E)融合蛋白的表現載體(圖2C)。藉由以SARS-CoV2核衣殼(N)蛋白(SEQ ID NO：46)取代抗原SRBD類似地構建產生N-TStx-CD40L(SEQ ID NO：54；圖3F)融合蛋白的另一表現載體。
實施例2
蛋白質表現
含有蛋白質表現載體N-TStx-CD40L之大腸桿菌BL21細胞於37℃下在含有選擇性抗生素的ZY培養基(10g/L胰蛋白腖和5g/L酵母萃取物)中生長。當培養物達到早期對數期(OD600=2至5)時，藉由異丙基-1-硫基-β-D-半乳吡喃糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside，IPTG)(0.5至2mM)誘導融合蛋白之表現。在IPTG誘導4小時後，收集細胞並藉由超音波進行破壞。分離包涵體並溶解於溶解緩衝液(6M鹽酸胍、20mM磷酸鉀、500mM NaCl、20mM咪唑、1mM DTT，pH 7.4)中，以回收過量表現之融合蛋白。純化之後，在4℃下用20倍至50倍體積之透析緩衝液(10mM PBS)透析過夜以進行融合蛋白之再折疊(refold)。在還原(具有二硫蘇糖醇；+DTT)及非還原(不具有二硫蘇糖醇；-DTT)條件下，對經再折疊之融合蛋白進行SDS-PAGE分析以評估其等是否經適當地再折疊。
藉由使用如上文所揭示之類似方法，表現、純化並再折疊融合蛋白CD40L-TPE-CP204L-E183L、CD40L-TPE-CP204L、CD40L-TPE-E183L、CP204L-E183L-TStx-CD40L、CP204L-TStx-CD40L、E183L-TStx-CD40L及E2-NS3p-TStx- CD40L。選擇N-TStx-CD40L作為根據本發明之融合蛋白的代表，並進一步進行各種測試以評估免疫原性和治療效果。
實施例3
融合蛋白之免疫原性分析
將5至6週齡之C57BL/6JNarl母小鼠隨機分成4組(每組n=5)：(1)安慰劑群組；(2)3劑群組；(3)2劑群組；及(4)單劑群組。安慰劑群組在第0、7及14天時皮下(s.c.)注射PBS。3劑群組於第0、7及14天時接種疫苗，2劑群組於第7及14天時接種疫苗，單劑群組於第14天時接種融合蛋白。為了向小鼠接種疫苗，融合蛋白N-TStx-CD40L(100μg)佐以CpG1826 ODN(50μg)，並根據圖4顯示的給藥計畫進行皮下注射。在第0、7、14和21天收集血液樣本。在第21天時犧牲動物，收集並培養脾細胞。
藉由流式細胞術，使用脾細胞以分析CD4+記憶T細胞中之細胞內細胞激素的誘導(IFN-γ及IL-2)。此外，藉由使用酵素結合免疫斑點(ELISpot)分析法分析分泌IFN-γ之脾細胞的頻率。藉由ELISA分析血液樣本中血清抗原特異性抗體的水平。
圖5顯示使用或不使用抗原刺激物(涵蓋整個SARS-CoV2N蛋白質的32個a.a.肽庫)刺激脾細胞後之IFN-γ誘導結果。相較於安慰劑群組，來自接受3劑或2劑的N-TStx-CD40L的動物之CD4+記憶T細胞中的IFN-γ細胞激素誘導顯示顯著的增加。值得注意的是，單劑N-TStx-CD40L融合蛋白足以誘導有效力的IFN-γ陽性CD4+記憶T細胞。
圖6顯示使用或不使用抗原刺激物(如上所述的32個a.a.肽庫)刺激脾細胞後之IL-2誘導結果。IL-2誘導情形與IFN-γ的誘導相似。相較於安 慰劑群組，來自接種N-TStx-CD40L融合蛋白的動物群組(3劑、2劑或單劑)之CD4+記憶T細胞中的IL-2細胞激素誘導顯著增加。值得注意的是，單劑融合蛋白足以誘導強效的IL-2陽性CD4+記憶T細胞。
圖7顯示在體外使用或不使用如上述抗原刺激物刺激脾細胞後的IFN-γ+免疫斑點的結果。相較於安慰劑群組，來自接種N-TStx-CD40L融合蛋白的動物(3劑、2劑或單劑)的IFN-γ分泌脾細胞顯著增加。單劑融合蛋白足以顯著增加誘導分泌IFN-γ之脾細胞。此結果與上述IFN-γ+CD4+記憶T細胞的發現一致。
在接種三劑N-TStx-CD40L融合蛋白的動物中，N蛋白質特異性抗體水平於第二次注射(第7天)後開始顯著增加，並融合蛋白的第三次注射(第14天)後進一步增加。在第21天，接種三劑群組中的血清SARS-CoV2特異性抗體水平為動物群組中最高者(圖8)。
類似地，免疫原性分析融合蛋白CD40L-TPE-SRBD、CD40L-TPE-E/M、CD40L-TPE-N、SRBD-TStx-CD40L及E/M-TStx-CD40L。基於相同的作用機制，本發明之攜帶抗原的融合蛋白預期能誘導強力的免疫反應，如誘導抗原特異性抗體、T細胞活化和誘導IFN-γ、IL-2和TNF-α。
能合理地推論的是，本發明的融合蛋白能有效引發強效的T細胞免疫反應，增加IFN-γ和IL-2表現，並產生SARS-CoV2抗原特異性抗體反應。
實施例4
倉鼠模型中之融合蛋白的預防效果
在倉鼠模型中測試N-TStx-CD40L融合蛋白，以評估其對病毒感染的預防效果。在第0天和第7天，向6至7週齡的母黃金倉鼠(Golden Syrian Hamster；n=5)皮下注射PBS(安慰劑)、高劑量(200μg)或低劑量(100μg)之佐以CpG1826 ODN(50μg)的融合蛋白，接著於第14天以SARS-CoV2變體B.1.617.2(Delta)(100μl，鼻內)的1x104TCID50進行攻擊。感染後每天記錄倉鼠體重。病毒攻擊後第3天犧牲倉鼠。將左肺上葉固定在10%多聚甲醛中進行組織病理學檢查，收集肺的其餘部分以進行病毒載量測定(TCID50檢測)。
於含有2% FBS和1%青黴素/鏈黴素的4ml DMEM中均質化來自動物的中肺葉、下肺葉和後腔靜脈肺葉，以進行TCID50檢測。離心組織均質液並收集上清液用於活病毒滴定。將每個樣本的10倍系列稀釋液以二重複(duplicate)添加到Vero E6細胞單層上，培育4天，每天藉由顯微鏡觀察細胞。以自來水洗滌孔板並針對感染進行評分。藉由Reed和Muench方法計算50%的組織培養物感染劑量(TCID50)/ml。
圖9顯示來自接受不同劑量之融合蛋白N-TStx-CD40L的動物中肺病毒效價的水平。相較於安慰劑，在高劑量及低劑量群組的病毒效價顯著下降。此結果表明本發明之融合蛋白能強力減少並抑制SARS-CoV2病毒感染。
在上述倉鼠模型中測試融合蛋白CD40L-TPE-SRBD、CD40L-TPE-E/M、CD40L-TPE-N、SRBD-TStx-CD40L及E/M-TStx-CD40L。基於本發明之融合蛋白的相同作用機制，此等攜帶抗原的融合蛋白預期能於倉鼠模型中有效地減少和抑制SARS-CoV2病毒感染。
實施例5
融合蛋白在hACE2基因轉殖小鼠模型中的治療效果
在hACE2基因轉殖小鼠中測試N-TStx-CD40L融合蛋白以評估本發明之融合蛋白的治療效果。簡而言之，在第0天治療前2小時以1x103PFU的 SARS-CoV2變種B.1.617.2(Delta)攻擊來自Jackson實驗室的8週齡K18-hACE2基因轉殖C57BL/6J公小鼠。經過病毒攻擊後，將小鼠分群並分別以(A)安慰劑(N=3)；(B)瑞德西韋(1mg/劑；n=5)；(C)融合蛋白(200μg/劑；n=5)進行治療。從第0天至第6天每日注射安慰劑(皮下注射PBS)及瑞德西韋(i.v.注射)1劑。在第0及7天皮下注射佐以CpG1826 ODN(50μg)之融合蛋白N-TStx-CD40L(100μg)。病毒攻擊後每日紀錄小鼠體重。病毒感染後第12天犧牲所有存活的老鼠。將左肺上葉固定在10%多聚甲醛中進行組織病理學檢查，使用TCID50檢測並收集肺之其餘部分以測定病毒載量。
圖10顯示分別以安慰劑、瑞德西韋及融合蛋白N-TStx-CD40L治療的SARS-CoV2感染動物群組中的肺病毒效價。相較於安慰劑，此結果表明，N-TStx-CD40L及瑞德西韋治療顯著減少經治療的小鼠中的肺病毒載量。瑞德西韋係治療SARS-CoV2感染的第一線藥物。於融合蛋白治療群組及瑞德西韋治療群組中，每組5隻小鼠中的4隻小鼠顯示低病毒載量，亦即，低於檢測水平(LOD)。結果表明本發明之融合蛋白能有效地清除病毒，並表現出相當或類似於瑞德西韋的治療效果。
圖11顯示動物群組中的存活機率。安慰劑群組中的所有小鼠於感染後第7天皆死亡。瑞德西韋治療群組中小鼠的存活率於感染後第9天下降至20%。值得注意的是，融合蛋白治療群組的小鼠於第9天維持100%之存活率，且該存活率在感染後第10天降至60%。該結果顯示本發明之融合蛋白於增加SARS-CoV2感染動物的存活率相較於瑞德西韋具有更佳表現。
在上述基因轉殖模型中測試融合蛋白CD40L-TPE-SRBD、CD40L-TPE-E/M、CD40L-TPE-N、SRBD-TStx-CD40L及E/M-TStx-CD40L。基於本發明之融 合蛋白相同的作用機制，這些攜帶抗原的融合蛋白預期能有效減少病毒載量、增加存活率及治療SARS-CoV2感染。
本說明書中引據和討論的所有參考文獻均藉由引用以其整體及如同各參考文獻藉由單獨引用之相同程度併入本文中。
TW202334182A_111140268_SEQL.xml

Claims (15)

  1. 一種融合蛋白，係包含：
    (a)CD40結合結構域；
    (b)嚴重急性呼吸道症狀群冠狀病毒2型(SARS-CoV2)之抗原；
    (c)位於該CD40結合結構域及該抗原之間的易位域；及
    (d)位於該CD40結合結構域及該易位域之間的弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點。
  2. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該易位域為志賀毒素(Stx)易位肽，且該抗原係位於該融合蛋白的N端。
  3. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該易位域係為8至84個胺基酸殘基之長度所組成的Stx易位肽，且該易位域包含與SEQ ID NOs：12、13、14、15或16具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
  4. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該易位域係為單胞菌外毒素A(PE)易位肽，且該CD40結合結構域係位於該融合蛋白的N端。
  5. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該易位域係為26至112個胺基酸之長度所組成的單胞菌外毒素A易位肽，且該易位域包含與SEQ ID NOs：5、6、7、8或9具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
  6. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該弗林蛋白酶及/或組織蛋白酶L裂解位點包含SEQ ID NO：1或2的胺基酸序列。
  7. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該CD40結合結構域係為CD40配體(CD40L)或其功能性片段，或為特異性針對CD40的抗體或其功能性片段。
  8. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該CD40結合結構域為154至261個胺基酸殘基的長度所組成的CD40配體，且該CD40包含與SEQ ID NO：17、18或19具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
  9. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該SARS-CoV2係為具有NC_045512.2之NCBI參考編號的Wuhan-Hu-1菌株或其病毒變體。
  10. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該抗原包含選自SARS-CoV2之棘(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白或核衣殼(N)蛋白之至少一種多肽。
  11. 如請求項10所述的融合蛋白，其中，該抗原包含選自由下列所組成群組的至少一種多肽：
    (a)選自棘蛋白之SEQ ID NO：39的區域之8至1273胺基酸殘基的多肽，其中，該多肽任選地包含選自由L5F、S12F、S13I、L18F、T19R、T20N、P26S、Q52R、A67V、DEL69/70、V70F、G75V、T76I、D80G、D80A、T95I、D138Y、DEL141/143、G142D、DEL144/145、Y144S、Y145N、W152R、W152C、E154Q、E154K、DEL157/158、F157S、R190S、D215G、A222V、DEL241/243、DEL243/244、DEL247/253、D253G、W258L、Y265C、R346K、R346S、K417N、K417T、N439K、L452R、L452Q、S477N、T478K、E484K、E484Q、F490S、N501Y、K558N、A570D、D614G、H655Y、Q677H、P681R、P681H、A688V、A701V、T716I、D796H、S813N、T859N、F888L、A899S、D950N、D950H、Q957R、S982A、T1027I、Q1071H、E1072K、E1092K、H1101Y、H1101D、 D1118H、I1130V、D1139及V1176F所組成群組之至少一種胺基酸突變；
    (b)選自包膜蛋白之SEQ ID NO：44的區域之8至75胺基酸殘基的多肽，其中，該多肽任選地包含選自由L21F、S68F及P71L所組成群組之至少一種胺基酸突變；
    (c)選自膜蛋白之SEQ ID NO：45的區域之8至222胺基酸殘基的多肽，其中，該多肽任選地包含選自由L29F、A63T、I82T、I82S及H125Y所組成群組之至少一種胺基酸突變；以及
    (d)選自核衣殼蛋白之SEQ ID NO：46的區域之8至491胺基酸殘基的多肽，其中，該多肽任選地包含選自由D3L、DEL3、D3Y、A12G、P13L、D63G、P67S、P80R、A119S、I157V、P199L、S202R、R203M、R203K、G204R、G204P、T205I、DEL209、G212V、G214C、G215C、M234I、S235F、K256R、T366I及D377Y所組成群組之至少一種胺基酸突變。
  12. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該抗原係包含獨立選自SARS-CoV2之棘蛋白、包膜蛋白、膜蛋白或核衣殼蛋白的至少兩種多肽。
  13. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，該SARS-CoV2係包含如以下所示之至少一種胺基酸突變的病毒變體：
    (a)於棘蛋白中選自由L5F、S12F、S13I、L18F、T19R、T20N、P26S、Q52R、A67V、DEL69/70、V70F、G75V、T76I、D80G、D80A、T95I、D138Y、DEL141/143、G142D、DEL144/145、Y144S、Y145N、W152R、W152C、E154Q、E154K、DEL157/158、F157S、R190S、D215G、A222V、DEL241/243、DEL243/244、DEL247/253、D253G、W258L、Y265C、 R346K、R346S、K417N、K417T、N439K、L452R、L452Q、S477N、T478K、E484K、E484Q、F490S、N501Y、K558N、A570D、D614G、H655Y、Q677H、P681R、P681H、A688V、A701V、T716I、D796H、S813N、T859N、F888L、A899S、D950N、D950H、Q957R、S982A、T1027I、Q1071H、E1072K、E1092K、H1101Y、H1101D、D1118H、I1130V、D1139H及V1176F所組成群組之至少一種胺基酸突變，其中，突變的參考序列係為該棘蛋白的SEQ ID NO：39；
    (b)於包膜蛋白中選自由L21F、S68F及P71L所組成群組之至少一種胺基酸突變，其中，突變的參考序列係為該包膜蛋白的SEQ ID NO：44；
    (c)於膜蛋白中選自由L29F、A63T、I82T、I82S及H125Y所組成群組之至少一種胺基酸突變，其中，突變的參考序列係為該膜蛋白的SEQ ID NO：45；以及
    (d)於核衣殼蛋白中選自由D3L、DEL3、D3Y、A12G、P13L、D63G、P67S、P80R、A119S、I157V、P199L、S202R、R203M、R203K、G204R、G204P、T205I、DEL209、G212V、G214C、G215C、M234I、S235F、K256R、T366I及D377Y所組成群組之至少一種胺基酸突變，其中，突變的參考序列係該核衣殼蛋白的SEQ ID NO：46。
  14. 一種醫藥組成物，係包含：
    (a)如請求項1至13中任一項所述的融合蛋白；以及
    (b)藥學上可接受的載劑及/或佐劑。
  15. 一種如請求項1至13中任一項所述的融合蛋白或如請求項14所述的醫藥組成物於製備引發針對SARS-CoV2感染之抗原特異性細胞介導的 免疫反應及/或在有此需要的個體中減少、抑制、治療及改善由SARS-CoV2感染所引起之症狀的藥物之用途。
TW111140268A 2021-10-26 2022-10-24 針對冠狀病毒的免疫原性融合蛋白 TW202334182A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163271982P 2021-10-26 2021-10-26
US202163271987P 2021-10-26 2021-10-26
US63/271,987 2021-10-26
US63/271,982 2021-10-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202334182A true TW202334182A (zh) 2023-09-01

Family

ID=86158872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111140268A TW202334182A (zh) 2021-10-26 2022-10-24 針對冠狀病毒的免疫原性融合蛋白

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202334182A (zh)
WO (1) WO2023076820A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2520026T3 (es) * 2006-09-18 2014-11-11 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Composiciones y métodos para potenciar respuestas inmunitarias
US20120258104A1 (en) * 2009-07-22 2012-10-11 Cenix Bioscience Gmbh Delivery System and Conjugates For Compound Delivery Via Naturally Occurring Intracellular Transport Routes
US11130787B2 (en) * 2020-06-11 2021-09-28 MBF Therapeutics, Inc. Alphaherpesvirus glycoprotein d-encoding nucleic acid constructs and methods

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023076820A1 (en) 2023-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2019857B1 (en) Cd40 agonist antibody/type1 interferon synergistic adjuvant combination, conjugates containing and use thereof as a therapeutic to enhance cellular immunity
US9381237B2 (en) Neutralizing immunogen (NimIV) of rhinovirus and its uses for vaccine applications
US20230212231A1 (en) Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) polypeptides and uses thereof for vaccine purposes
US20080095798A1 (en) Ii-key enhanced vaccine potency
US20230149537A1 (en) Vaccines, adjuvants, and methods of generating an immune response
US20080085261A1 (en) Vaccine Adjuvant
TW202334182A (zh) 針對冠狀病毒的免疫原性融合蛋白
TWI817113B (zh) 用於針對癌症及傳染病之免疫療法之融合蛋白
WO2012040266A2 (en) Gene-based adjuvants and compositions thereof to increase antibody production in response to gene-based vaccines
TW202413440A (zh) 針對感染性動物疾病的免疫性融合蛋白質
US20240141016A1 (en) Immunogenic fusion proteins against infectious animal diseases
JP7086000B2 (ja) 体液性親和性の加速に関する方法及び組成物
US20160114028A1 (en) Dna motif compounds and methods for inducing specific antibodies and cellular immunity
KR20240019213A (ko) 코로나바이러스를 위한 바이러스 유사 입자 백신
TW202333782A (zh) 抗癌症及感染性疾病的組合療法