CN116024151B - 一种禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株及其应用，所述菌株为FY32Δs078，其保藏编号为CCTCC NO：M 20221364，其分类命名为大肠杆菌Escherichia coli FY32Δs078，现保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明的基因缺失菌株FY32Δs078遗传背景明确，传代后性状稳定，并且具有良好的生物安全性。该基因缺失菌株免疫保护性较好，且毒性较弱，可用于制备禽致病性大肠杆菌弱毒活疫苗和灭活疫苗，有助于预防禽致病性性大肠杆菌感染。本发明基因缺失菌株FY32Δs078制备的弱毒活疫苗，针对禽致病性大肠杆菌感染具有免疫保护效果，市场应用前景广阔。

Description

一种禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株及其应用。

背景技术

禽致病性大肠杆菌(APEC)是危害养禽业的重要细菌性病原，主要通过呼吸道感染禽类，致病力较强的APEC病原可以突破肺脏的免疫防御进入血液，引起败血症，从而导致禽类的多系统混合感染，甚至引起禽急性死亡。该病的发病率为11％～69％，死亡率为3.8％～72.9％，对养禽业造成严重损失，对食品安全构成极大威胁。APEC和人类肠道外致病性大肠杆菌(ExPEC)在基因型、血清群、毒力基因等具有相似性，表现出人畜共患潜力。目前APEC的致病机制尚未阐明，且无有效的疫苗来防疫禽大肠杆菌病，仅依靠抗生素等药物控制禽大肠杆菌病，导致APEC分离株耐药性不断增加及禽产品存在药物残留的风险。因此，针对禽致病性大肠杆菌的感染，迫切需要开发有效的疫苗来进行防治。

近年来，研究发现致病菌毒力因子的表达调控同样发生在mRNA翻译水平，这种调控被称为转录后调控(Post-transcriptional Regulation)，而操纵转录后调控的元件是一类小的非编码调控性RNA(Small Non-coding Regulatory RNAs)，简称sRNA。sRNA作为转录后调节分子普遍发现于原核生命体，不同种类的sRNA碱基长度不同，但长度范围普遍在50bp至500bp之间。sRNA通常分为两大类：顺式和反式编码的sRNA。sRNA能参与细胞重要生理调节过程，如对应激条件的适应和生物膜的形成。

尽管传统的灭活疫苗和亚单位疫苗一直在沿用，但由于其保护效率较低，免疫接种不方便而逐渐被弱毒活疫苗所取代。而弱毒活疫苗的研制需要具有良好免疫原性、毒力较低的疫苗株。因此我们需要筛选筛选合适的毒力基因，然后对菌株毒力进行致弱、减毒从而获得弱毒活疫苗株。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株及其应用，该菌株可以明显减毒，并保持良好的免疫原性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株，所述菌株为FY32Δs078，其保藏编号为CCTCC NO：M 20221364，其分类命名为大肠杆菌Escherichia coli FY32Δs078，现保藏于中国典型培养物保藏中心。

上述的禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株FY32Δs078在制备疫苗中应用。

优选地，所述疫苗为禽致病性大肠杆菌基因缺失疫苗。

优选地，所述疫苗为禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失疫苗。

一种禽致病性大肠杆菌灭活疫苗，包含上述的禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株FY32Δs078。

一种禽致病性大肠杆菌弱毒活疫苗，包含上述的禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株FY32Δs078。

一种禽致病性大肠杆菌弱毒活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤1)配制细菌液：将禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株FY32Δs078在固体LB培养基上划线培养，挑取单菌落接种于液体LB培养基培养，直到活菌浓度达到5.0×10⁹CFU/mL；

步骤2)配制明胶保护剂：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶9g，充分融化后，置高压锅于115℃，30min灭菌后保存备用；

步骤3)按细菌液：明胶保护剂的体积比为7:1的比例进行配制菌液，按2.0mL/瓶分装于灭菌冻干瓶，置真空冷冻干燥机中冻干，冻干36h后进行压盖，用10％铝胶生理盐水溶解后进行活菌计数，并确定没有杂菌污染，保存于-20℃，即得。

优选地，所述禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株FY32Δs078在所述弱毒活疫苗中的浓度为1.0×10⁶CFU/0.1mL。

本发明的有益效果如下：

本发明的禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株FY32Δs078具有较好的免疫保护效果，且毒力较弱，对免疫动物无任何不良副作用，安全性较高。此外，本发明的禽致病性大肠杆菌sRNAs078基因缺失菌株FY32Δs078遗传背景明确，传代后性状稳定，并且具有良好的生物安全性。因此，该基因缺失菌株FY32Δs078制备的禽大肠杆菌病疫苗，市场应用前景广阔。同时，该基因缺失菌株FY32Δs078不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

附图说明

图1为实施例1中sRNA s078的二级结构预测结果；

图2为实施例1中Northern blot检测FY32野生株及sRNAs078缺失株中s078RNA转录水平；

图3为实施例3中比较缺失株FY32Δs078与禽致病性大肠杆菌野生株FY32对DF-1细胞的黏附能力；

图4为实施例3中比较缺失株FY32Δs078与禽致病性大肠杆菌野生株FY32对雏鸡肺脏的定殖能力；

图5为实施例3中比较缺失株FY32Δs078与禽致病性大肠杆菌野生株FY32对雏鸭肺脏的定殖能力；

图6为实施例6中雏鸡二次免疫FY32Δs078弱毒活疫苗后血清中抗体滴度。

具体实施方式

以下通过附图与具体实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员容易理解，实施例描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。

实施例1sRNA二级结构预测及northern blot验证

1、通过RNAfold WebServer预测sRNAs078的二级结构

对APEC强毒株FY32，进行全基因组测序，通过TSS-seq对FY32进行起始转录组谱测序，从而获取FY32全基因操纵子转录信息，以及各转录本5’非转录区(UTR)位置信息。分析起始转录组数据对FY32基因间区sRNA进行预测，在FY32基因间区鉴定出两百多个sRNA，FY32 sRNA长度在84bp到553bp范围之间，这其中有34个sRNA是已知功能的E.coli sRNA，比如ArcZ、CsrB、RybB和RyfA等，其余的sRNA功能有待被鉴定。对这些未知sRNA进行编号，对这些sRNA进行基因缺失。研究发现第78个sRNA，即s078，这个新发现的sRNA是APEC重要的毒力因子。如图1所示，sRNAs078二级结构具有典型的茎环结构。

新发现sRNAs078的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

GCCTACATACTTCCTGCAATATGTTGAATTTGCAAAATCTTGTAGGACG GATAAGGCGTTCACGCCGCATCCGGCATAAACAACGCGCACTTTGCCAACA ATCTGAAGGGCCGCATTTGCGGCCCTTCTCACAAAGCATCTTAC。

sRNA s078对应的RNA序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

GCCUACAUACUUCCUGCAAUAUGUUGAAUUUGCAAAAUCUUGUAGGACGGAUAAGGCGUUCACGCCGCAUCCGGCAUAAACAACGCGCACUUUGCCAACAAUCUGAAGGGCCGCAUUUGCGGCCCUUCUCACAAAGCAUCUUAC。

2、Northern blot实验

为了鉴定sRNA s078是否在野生株FY32与缺失株(即基因缺失菌株，下同)FY32Δs078中存在，通过northern blot实验进行验证。

(1)实验步骤

将过夜培养的野生株FY32，缺失株FY32Δs078接入LB液体培养基，于37℃，180r/min培养。收集3mL菌液离心富集，弃上清，加入100μL溶菌/TE Buffer重悬菌体后涡旋30s，于30℃水浴锅孵育10min(每2min涡旋一次)。然后加入350μL Buffer BRK/2Me试剂，涡旋5min后离心5min，取400μL上清液转移至无RNA酶的1.5mL EP管中，加入400μL 75％乙醇并混匀后加到HiBind mini柱上离心，10000×g、60s，弃去收集管中液体加入300μLRNA Wash BufferⅠ，10000×g、60s，弃去管中废液。再次加入500μL RNA Wash BufferⅠ，10000×g、60s，弃去管中废液。加入500μL RNA Wash BufferⅡ，洗涤两次，弃去废液。将HiBind />mini柱置于新的无RNA酶的1.5mL EP管中，用40μL，55℃预热的无RNA ddH₂O洗脱测量浓度。利用试剂盒去除gDNA。将10μg总RNA加入至6％的聚丙烯酰胺变性凝胶，用0.5×TBE在300V条件下进行凝胶电泳，结束后将RNA转移至NC膜，以120mJ/cm²的条件对NC膜进行紫外交联固定。合成5’端生物素标记的DNA探针，用Ultra-Hyb杂交缓冲液在42℃条件下与标记的探针杂交过夜。用试剂盒进行洗膜并检测。

(2)检测结果

如图2所示，在野生型菌株FY32中鉴定出sRNA s078，在缺失株FY32Δs078中则未鉴定到。

实施例2禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株的构建

1、主要培养基、试剂及仪器

细菌培养基包括：LB培养基，SOC培养基，PBS缓冲液。

需要用的试剂包括：DNAGel Purification Kit(Omega)、2×PCR PreMix(南京诺唯赞生物科技公司)、抗生素(Invitrogen)等。

相关仪器包括：电转仪(MicroPulser，Bio-Rad)、酶标仪(MultiskanGO，BIO-RAD)、分光光度计(SmartSpec Plus，Thermo Scientific)和凝胶成像系统(ChemiDoc MP，BIO-RAD)等。

2、基因缺失操作步骤

通过Red同源重组的方法构建菌株FY32的s078基因缺失株。

(1)制备线性DNA打靶片段，使用带有s078基因同源臂的引物(表1中s078-P1和s078-P2)，以pKD4质粒为模板扩增DNA打靶片段，然后进行胶回收纯化目的片段。

表1缺失株构建及鉴定引物

(2)将线性DNA打靶片段电转化入感受态细胞，方法步骤：在LB中培养含有pKD46质粒的FY32菌株至对数前期，在培养基中加入L-阿拉伯糖，使其终浓度为1mM/L，诱导Red重组酶的表达。培养至对数期后收集菌体，用ddH₂O洗一遍，用10％甘油洗两遍，制备成电转化FY32-pKD46感受态细菌。然后将线性DNA打靶片段加入到感受态细菌，以2300V、200Ω和25μF的电击条件进行电转化，将s078基因打靶片段电转化入FY32感受态细菌。立即加入预热的SOC培养基至电转化后的感受态菌体，置于30℃摇床复苏培养2h，离心收集菌体，均匀涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，置于30℃培养过夜。挑取单菌落于含有卡那抗性的培养基中培养，通过s078基因前后引物(表1中s078-up-F和s078-down-R)PCR鉴定缺失菌株。最后将pCP20质粒电转化至鉴定正确的菌株，挑选成功去除卡那霉素抗性基因的菌株，此为s078基因缺失株FY32Δs078。

构建得到的菌株为禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株FY32Δs078，保藏编号为CCTCC NO：M 20221364，分类命名为大肠杆菌Escherichia coli FY32Δs078，已于2022年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。

实施例3缺失sRNA s078基因对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为验证本发明中缺失sRNA s078基因对于菌株感染的减毒作用，通过多种动物感染试验，包括鸡胚感染试验、雏鸡感染试验和雏鸭感染试验等，测定野生株和缺失株对鸡和鸭致死量的影响。同时还检测野生株和缺失株感染鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)的能力，以及感染雏鸡时各个内脏中细菌的定殖水平。具体如下：

1、鸡胚致死试验

通过鸡胚致死试验来测定野生株FY32和缺失株FY32Δs078的致病力。

将菌株培养至对数期，收集菌体沉淀并用PBS洗两次，将50μL约500CFU的细菌通过尿囊腔注射12日龄的SPF鸡胚(济南赛斯家禽科技有限公司)，每组20只鸡胚，将经大肠杆菌MG1655(无毒株，编号ATCC 47076，购自中国微生物菌种保藏中心)注射的鸡胚作为阴性对照组。攻毒后连续观察4天，并记录每组中鸡胚的死亡情况。

表2基因缺失株对鸡胚的致死率

表2中：a数据表示死亡(或出现症状)的鸡胚数/测试的鸡胚总数，下同；

b表示阴性对照无毒株。

检测结果：通过鸡胚致死试验(ELA)鉴定缺失sRNA s078基因对禽致病性大肠杆菌对禽宿主的致病力的影响，如表2所示，野生型FY32攻毒组的鸡胚致死率显著高于阴性对照组MG1655攻毒组(P＜0.05)，而缺失株FY32Δs078的鸡胚致死率明显低于野生株FY32。结果表明，缺失sRNA s078基因显著降低禽致病性大肠杆菌对鸡胚的感染力，缺失株FY32Δs078是一个弱毒株。

2、雏鸡致死试验

通过雏鸡(商品肉鸡)致死试验评估野生株FY32和缺失株FY32Δs078引起禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)的能力。

将菌株培养至对数期，用PBS洗两遍。通过气管注入雏鸡，每只0.1mL菌液(5.0×10⁶CFU)，每组20只，无毒株MG1655注射组作为阴性对照组。攻毒后连续观察7天，并记录雏鸡的死亡情况。对所有雏鸡在攻毒死亡后或观察七天后进行解剖，并检查病变，以是否出现气囊炎(1分)、心包炎(2分)和肝周炎(3分)进行评分。并将攻毒雏鸡的组织(气囊、心脏内血液和脑组织)接种麦康凯培养基，于37℃过夜培养，第二天观察有无菌落生长，如果有细菌生长，则表示细菌感染能分别发生气囊炎、败血症或脑膜炎。

表3基因缺失株对1日龄雏鸡的致病力

检测结果如表3所示，对每个攻毒组和对照组的鸡的致死率、器官分离率和病变评分进行了评估，结果与ELA的试验类似，野生株FY32的致死率和其他致病率明显高于阴性对照组MG1655(P＜0.05)，而缺失株FY32Δs078的致病能力明显较弱，以上结果证实缺失株FY32Δs078是一个弱毒株。

3、雏鸭致死试验

通过雏鸭致死试验评估野生株FY32和缺失株FY32Δs078引起禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)的能力，将菌株培养至对数期，用PBS洗两遍。通过腹腔注入7日龄的雏鸭(樱桃谷鸭)，每只0.2mL菌液，攻毒剂量为1.0×10⁷CFU/duck，每组20只，无毒株MG1655作为阴性对照。攻毒后连续观察7天，并记录雏鸭的死亡情况。对所有雏鸭在攻毒死亡后或观察七天后进行解剖，并检查病变，以是否出现气囊炎(1分)、心包炎(2分)和肝周炎(3分)进行评分。并将攻毒雏鸭的组织(气囊、心脏内血液和脑组织)接种麦康凯培养基，于37℃过夜培养，第二天观察有无菌落生长，如果有细菌生长，则表示细菌感染能分别发生气囊炎、败血症或脑膜炎。

表4基因缺失株对7日龄雏鸭的致病力

检测结果如表4所示，野生型FY32攻毒组雏鸭的死亡率为100％，明显高于对照组MG1655(P＜0.01)，而相同剂量下，缺失株FY32Δs078攻毒组的雏鸭死亡率仅25％。结果表明缺失株FY32Δs078致雏鸭大肠杆菌病的能力显著降低，证实缺失株FY32Δs078是一个弱毒株。

4、测定菌株对DF-1细胞的黏附能力

(1)DF-1细胞培养

从液氮罐中取出保存的DF-1细胞，于37℃水浴锅中快速转动2min，直至融化，离心去除上清，收集细胞，加入添加了10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，用巴氏吸管吹打混匀，将细胞培养液转接于培养瓶中，在37℃的CO₂培养箱内培养，仔细观察，待细胞状态良好时，用不含钙、镁离子的PBS缓冲液冲洗2次，加入胰酶消化，显微镜观察细胞，如果细胞出现圆缩现象时弃去胰酶，用DMEM营养液(10％FBS)重悬，吹打均匀，用台盼蓝细胞计数法进行细胞计数，将DF-1细胞均匀铺在24孔板中，在37℃，CO₂培养箱内培养，直至细胞长满单层时，取出24孔板并用PBS缓冲液洗涤3次备用。

(2)细菌处理和黏附试验

将野生型FY32和缺失株FY32Δs078分别在LB中培养至对数期，用PBS洗两遍。将菌液以DF-1细胞数量的100倍菌数(感染比为1:100)加入细胞培养孔中，以无菌DMEM作为阴性对照，每株菌株重复4次，用台式离心机，200×g转速进行离心5min，37℃的CO₂细胞培养箱中孵育2h，用1×PBS缓冲液洗涤3次，去除未黏附的细菌，然后加入0.1％ TritonX-100裂解细胞后，用PBS进行10倍比稀释，涂布于LB平板上，37℃培养过夜后进行细菌计数，并计算统计结果。

(3)缺失sRNA s078基因对FY32黏附能力的影响

测定野生型FY32和缺失株FY32Δs078对DF-1鸡胚成纤维细胞的黏附能力，如图3所示，相比于野生株FY32的黏附能力，缺失株FY32Δs078的黏附能力显著降低至21.1％(P＜0.01)，以上结果表明缺失sRNA s078基因显著降低FY32的黏附能力，缺失株FY32Δs078的黏附能力相对较弱。

5、测定细菌在雏鸡、鸭肺脏内定殖能力

(1)雏鸡体内定殖试验

将野生型FY32和缺失株FY32Δs078在LB培养基中培养至对数期，用PBS洗2遍，重悬菌体并调整浓度至1.0×10⁸CFU/mL，通过气管对雏鸡进行攻毒，每只0.2mL，每组10只，感染24h后处死雏鸡，于超净台内解剖分离脑和肺等组织，匀浆后用PBS进行10倍比稀释并涂布于LB平板，37℃培养过夜后进行细菌计数并统计结果。

检测结果如图4所示，雏鸡肺脏内定殖试验结果表明，在感染雏鸡早期24hpi时，缺失株FY32Δs078在雏鸡肺脏内定殖水平明显低于野生型FY32。

(2)雏鸭体内定殖试验

将野生型FY32和缺失株FY32Δs078分别培养至对数期，用PBS洗2遍，重悬菌体并调整浓度，以2.0×10⁶CFU/duck剂量攻毒，每组10只雏鸭，通过气管对雏鸭进行攻毒，每只0.2mL，攻毒24h后处死雏鸭，于超净台内解剖分离脑和肺等组织，匀浆后用PBS进行10倍比稀释并涂布于LB平板，37℃培养过夜后进行细菌计数并统计结果。

检测结果如图5所示，通过雏鸭感染模型说明缺失sRNAs078基因显著降低FY32对雏鸭肺脏的定殖能力。

以上结果表明，缺失株FY32Δs078具有相对较弱的体内定殖能力，充分说明缺失株FY32Δs078是一个弱毒株。

本实施例的结果表明，缺失SRNAs078基因显著降低禽致病性大肠杆菌致病力，缺失株FY32Δs078是一个弱毒株。

实施例4禽致病性大肠杆菌sRNAs078基因缺失疫苗

对禽致病性大肠杆菌s078基因缺失菌株FY32Δs078进行鉴定，将其在LB琼脂平板上划线培养并观察菌落颜色，并用禽致病性大肠杆菌的基因来对传代的菌株进行检测，鉴定缺失株的遗传稳定性。经多次传代后发现FY32Δs078仍然保持基因缺失的特征，经鉴定菌株仍然缺失了s078基因，并且遗传性状稳定。基于此进行弱毒活疫苗的制备，具体如下：

(1)将该sRNAs078基因缺失株FY32Δs078在固体LB培养基上划线培养，挑取单菌落接种于液体LB培养基培养，直到活菌浓度达到5.0×10⁹CFU/mL。

(2)配制明胶保护剂，明胶保护剂配制方法为：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶9g，充分融化后，置高压锅于115℃，30min灭菌后保存备用。

(3)按细菌液：明胶保护剂(体积比)为7:1的比例进行配制菌液。按2.0mL/瓶分装于灭菌冻干瓶，置真空冷冻干燥机中冻干，冻干36h后进行压盖，用10％铝胶生理盐水溶解后进行活菌计数(CFU)，并确定没有杂菌污染，保存于-20℃，其为研制的弱毒活疫苗菌株。

实施例5禽致病性大肠杆菌基因缺失疫苗FY32Δs078安全性评价

将实施例4制得的FY32Δs078弱毒活疫苗对雏鸡的安全性进行评价，具体如下：

(1)选择7日龄雏鸡40只，分为2组，每组20只。试验之前检测雏鸡是否感染大肠杆菌，选择阴性的雏鸡进行试验。每只雏鸡通过腿部肌肉注射接种0.1mL(含1.0×10⁷CFU活菌数)FY32Δs078基因缺失疫苗。接种后观察雏鸡状态，发现雏鸡未见死亡。精神状态良好，食欲正常，未见异常变化。接种后可以在雏鸡体内检测到大肠杆菌抗体。

(2)按照同样的方法接种野生型FY32菌株，接种后雏鸡出现精神萎靡，食欲不振，背毛粗乱等症状，接种第二天开始死亡，7天之内全部死亡。剖检后发现具有典型的大肠杆菌感染病理变化。

综上结果证明实施例4所制备的FY32Δs078弱毒活疫苗是安全的。

实施例6基因缺失菌株FY32Δs078对雏鸡的免疫保护性评价

1、雏鸡的免疫程序

(1)将7日龄雏鸡分成2组，分别对每组免疫弱毒活疫苗FY32Δs078(1.0×10⁶CFU活菌数的疫苗)和PBS(对照组)，间隔14天后进行第二次免疫，二免一周后对雏鸡进行采血，分离血清并保存于-20℃。

(2)将FY32菌体蛋白作为大肠杆菌检测抗原，通过ELISA方法检测二免后雏鸡血清中的抗体滴度。具体步骤如下：

野生株FY32用LB培养至对数期，离心，PBS洗涤后以每孔0.5μg/well在4℃条件下过夜包被抗原；用1×PBST洗涤液洗3次(每孔加满，用力拍干)，于37℃加封闭液封闭2h，用1×PBST洗3次，每次3～5min，拍干；鸡血清用1×PBST稀释，设置阴性对照，于37℃孵育2h后洗涤，以HRP标记的抗鸡IgG作为二抗(1:4000稀释)，于37℃孵育1h后洗涤，每孔加TMB溶液，室温避光显色15min左右，加入终止液(2mol/L H₂SO₄)终止反应，使用酶标仪读取450nm处的OD值，以确定血清抗体水平。二免后十天(雏鸡抗体效价明显上升)对雏鸡进行攻毒，通过气管注射野生株FY32(5.0×10⁸CFU/只)，在攻毒24h后从每组随机选取10只雏鸡进行FY32肺脏定殖数量测定。同时连续观察7天，记录各组雏鸡的存活状态。

2、FY32Δs078基因缺失疫苗免疫雏鸡的保护性试验

雏鸡免疫接种FY32Δs078基因缺失疫苗后，对雏鸡进行攻毒试验，探究基因缺失疫苗接种对雏鸡是否具有免疫保护力。

攻毒后与阴性对照组(死亡率100％)相比，免疫组雏鸡的存活率为100％。如图6所示，雏鸡二次免疫后血清中的抗大肠杆菌抗体的滴度基本达到10⁴，表明FY32Δs078基因缺失疫苗能够刺激机体产生高滴度的IgG抗体。雏鸡体内定殖试验结果表明FY32Δs078基因缺失疫苗免疫雏鸡后能够降低FY32在感染雏鸡肺脏内的定殖能力。

以上实验结果证实FY32Δs078基因缺失疫苗具有免疫原性，接种后对雏鸡具有免疫保护力。

根据上述实施例验证的结果可知，本发明敲除基因的肠道外致病性大肠杆菌(禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株FY32Δs078)具有较好的免疫保护作用，可以作为弱毒活疫苗使用，其中该基因缺失菌株FY32Δs078在弱毒活疫苗中的浓度可以为1.0×10⁶CFU/0.1mL。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株，其特征在于，所述菌株为FY32Δs078，其保藏编号为CCTCC NO：M 20221364，其分类命名为大肠杆菌Escherichia coliFY32Δs078，现保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.一种禽致病性大肠杆菌弱毒活疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株。

3.权利要求2所述的一种禽致病性大肠杆菌弱毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1）配制细菌液：将权利要求1所述的禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株在固体LB培养基上划线培养，挑取单菌落接种于液体LB培养基培养，直到活菌浓度达到5.0×10⁹ CFU/mL；

步骤2）配制明胶保护剂：每100 mL去离子水中加蔗糖40 g，明胶9 g，充分融化后，置高压锅于115℃，30 min灭菌后保存备用；

步骤3）按细菌液：明胶保护剂的体积比为7:1的比例进行配制菌液，按2.0 mL/瓶分装于灭菌冻干瓶，置真空冷冻干燥机中冻干，冻干36 h后进行压盖，用10% 铝胶生理盐水溶解后进行活菌计数，并确定没有杂菌污染，保存于-20℃，即得。

4.根据权利要求2所述的一种禽致病性大肠杆菌弱毒活疫苗，其特征在于，所述禽致病性大肠杆菌sRNA s078基因缺失菌株在所述弱毒活疫苗中的浓度为1.0×10⁶ CFU/0.1 mL。