CN105765071A - 重组马立克氏病病毒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组病毒及其用途。更具体来说，本发明涉及编码目标多肽的新的重组马立克氏病病毒，以及它们在表达这种多肽或将这种多肽递送到动物、尤其是家禽中的用途。本发明特别适合于给家禽接种疫苗以对抗禽类病原体。

Description

重组马立克氏病病毒及其用途
技术领域
本发明涉及重组病毒及其用途。更具体来说，本发明涉及编码目标多肽的新的重组马立克氏病病毒，以及它们在表达这种多肽或将这种多肽递送到动物、尤其是家禽中的用途。本发明特别适合于给家禽接种疫苗以对抗禽类病原体。
背景技术
家禽的肉和蛋是重要的食物来源，它们的消费量由于人口增长和它们极大的性价比而持续增加。最近禽流感的流行使公共舆论聚焦于家禽健康以及食品安全和保障。家禽疫苗技术变得在世界范围内受到关注。
表达病原体蛋白的重组病毒常常被用作对抗目标病原体的家禽疫苗。包含这些病毒的疫苗引起外来病原体蛋白或其片段在被感染细胞内表达，这随后可以诱导特异性和保护性的体液免疫和细胞介导的免疫。
已知不同病毒可以在被感染动物体内以潜伏或持续感染的状态存活。因此，这些已整合有源自于病原体的外来基因的病毒，已被开发用作以病毒为载体的疫苗，增加被免疫接种的动物的免疫持续时间。
这些病毒载体(或重组病毒)通常是基于禽痘病毒例如禽痘(EP-A-0,517,292)、疱疹病毒例如血清1、2和3型马立克氏病病毒(HVT)(例如WO-A-87/04463、5,980,906、5,853,733)或可选地新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒。
这些重组禽病毒展现出各种不同的保护水平。表达IBDVVP2的重组HVT显示出超过经典IBD疫苗(IBD)的优点。引起注意的其他HVT载体表达NDV(ND)或ILTV(LT)抗原。
基于HVT的重组病毒的现实问题之一是当将几种病毒组合使用以提供针对不同病原体的免疫原性时它们的干扰。事实上，当将表达不同抗原的两种不同rHVT混合时，引起至少针对一种疾病的较低的保护(参见例如SlacumG等，2009，HVT重组体与其他马立克氏病病毒的相容性(ThecompatibilityofHVTrecombinantswithotherMarek'sdiseasevaccines)，58thWesternPoultryDiseaseConference,Sacramento,CA,USA,3月23日至25日,p84)。
因此，对于在动物尤其是家禽中改进疫苗接种，允许同时针对几种疾病提供保护的新方法，存在着需求。
已开发了多价HVT载体，其可以表达两种不同的抗原肽(参见PCT/EP2013/056839)。
本发明公开了新的重组病毒，其适合于在动物中诱导强的免疫保护，并且此外可以与其他病毒疫苗组合使用以产生扩展的免疫。
发明概述
本发明涉及可以编码一种或几种目标多肽的重组马立克氏病病毒(“MDV”)。更具体来说，本发明公开了包含β-肌动蛋白来源的启动子的改进的MDV病毒，并且令人吃惊地显示，在这些病毒的情形中，这样的构建体允许高度提高的表达并诱导强的保护性免疫。本发明还显示，这样的病毒对于与不同的禽疱疹病毒组合使用以诱导针对不同抗原性病原体的提高的免疫应答而没有显著的交叉干扰来说，是相容的。
因此，本发明的目的在于一种重组马立克氏病病毒(“rMDV”)，其包含可操作连接到源自于鸡β-肌动蛋白启动子的启动子的编码目标多肽的重组核苷酸序列。
本发明的另一个目的是一种重组马立克氏病病毒，其包含：(1)包含鸡β-肌动蛋白启动子的核心序列的启动子，以及(2)在所述启动子控制下编码多肽的重组核苷酸序列。
所述重组核苷酸序列可以被插入到病毒基因组的各种不同区域中，优选在对于病毒复制或感染来说非必需的区域中，优选在US2基因中。正如将要讨论的，本发明的rMDV可以包含编码不同目标多肽的一个或几个重组核苷酸序列。所述目标多肽更具体来说是抗原肽，通常是禽类病原体的抗原肽。本发明的重组马立克氏病病毒(rMDV)优选为血清1型(MDV1)。
本发明的另一个目的在于一种组合物，其包含如上所定义的重组马立克氏病病毒和任选地可药用或可兽医用赋形剂或载体和/或适合的佐剂。
本发明的另一个目的涉及包含如上所定义的重组马立克氏病病毒的疫苗组合物。这样的疫苗可用于例如为禽类例如家禽免疫接种。
本发明的另一个目的在于如上所定义的重组马立克氏病病毒或组合物，其用于给禽类、优选为鸡接种疫苗。
本发明的另一个目的在于如上所定义的重组马立克氏病病毒或组合物，其用于在禽类、优选为鸡中诱导或刺激免疫应答。
本发明的另一个目的是如上所定义的重组MDV1，其用于与不同血清型的并表达不同抗原的另一种重组疱疹病毒组合使用，通过同时给药、分开地顺序给药或交替给药，来给禽类、优选为鸡接种疫苗。
另一方面，本发明提供了一种给动物接种疫苗的方法，所述方法包括至少一次给药如上所定义的组合物或病毒。
另一方面，本发明提供了一种用于在动物中诱导针对一种或多种禽类病原体的免疫原性或保护性应答的方法，所述方法包括至少一次给药如上所定义的组合物或病毒。
本发明的另一个目的是一种生产重组马立克氏病病毒的方法，所述方法包括：(i)将在包含鸡β-肌动蛋白启动子的核心序列的启动子控制下编码多肽的重组核苷酸序列引入到马立克氏病病毒的基因组的非必需区中，(ii)任选地复制所述病毒，以及(iii)任选地收集所述病毒。
本发明的另一个目的涉及一种包含马立克氏病病毒的基因组或其片段的重组核酸分子，其中所述基因组或片段包含通过插入重组核苷酸序列进行修饰的US2基因，所述重组核苷酸序列包含在启动子控制下编码多肽的序列，所述启动子包含鸡β-肌动蛋白启动子的核心序列。
本发明还涉及包含如上所定义的核酸分子的质粒。
本发明的另一个目的是包含如上所定义的核酸分子或质粒或病毒的宿主细胞，或这种细胞的培养物。
本发明还涉及一种对禽类进行免疫接种的方法，所述方法包括向所述禽类给药免疫接种有效量的本发明的疫苗或组合物或病毒。
本发明还提供了一种对禽类进行免疫接种的疫苗接种试剂盒，其包含有效量的本发明的疫苗和用于将所述疫苗给药到所述禽类的工具。
本发明可用于在任何动物中表达多肽，优选地用于禽类的疫苗接种，并且它适合于表达任何多肽或肽，特别是禽类病原体的任何免疫原性肽。
附图说明
图1示出了Rispens基因组的示意图和被克隆区域的位置，包括US2基因内的插入位点。
图2示出了重组Rispens/IBD基因组的图解，指示了在PCR反应中被扩增以验证病毒的基因组结构的连接部1和连接部2的位置。
图3是检测重组Rispens/IBD病毒的IBDVVP2蛋白表达的蛋白质印迹分析。
图4示出了在用重组Rispens/IBD疫苗接种的SPF鸡中使用商品化IBDELISA试剂盒获得的IBDVELISA滴度。
图5示出了在用重组Rispens/IBD疫苗接种的商品化白来亨鸡中使用商品化IBDELISA试剂盒获得的IBDVELISA滴度。
图6A和6B示出了在用重组Rispens/IBD和重组HVT/ND疫苗接种的商品化白来亨鸡中使用商品化IBDELISA试剂盒和商品化NDELISA试剂盒获得的IBDV和NDVELISA滴度。
图7示出了由本发明的重组病毒提供的针对IBDV的长持续时间的免疫力。
发明详述
本发明总的来说涉及rMDV，其包含置于鸡β-肌动蛋白来源的启动子的转录控制之下的编码目标产物的重组核苷酸序列。本发明还涉及包含这种rMDV的组合物及其在动物、特别是家禽的疫苗接种中的用途。
通过参考下面的定义，本公开将被最好地理解：
定义
术语“病毒”特别是指包含包封在衣壳或包膜中的核酸分子(例如基因组)的病毒粒子。术语“病毒”还指病毒载体或分离的病毒基因组。
术语“重组体”是指使用遗传技术产生、设计或修饰的分子。对于病毒来说，该术语更具体来说是指已通过插入至少一个异源核酸、即在所述病毒的基因组中不天然存在或在所述基因组中天然存在但采取不同形式或处于不同位置的核酸(例如DNA)，对其基因组进行过修饰的病毒。重组病毒可以通过各种不同方法来制造，并且一旦被制造之后，不进一步使用遗传技术即可进行繁殖。对于核酸(例如基因)来说，术语“重组体”是指不天然存在，或者已被操作或克隆或重排以例如使其侧面带有不天然存在于所述序列侧面的序列的构建体。
在本说明书中，术语“核酸”或“核苷酸序列”可互换使用，并且是指具有确定序列的核酸分子，其可以是脱氧核糖核苷酸(DNA)和/或核糖核苷酸(RNA)。核苷酸序列可以首先通过例如重组技术、酶技术和/或化学技术来制备，随后在宿主细胞或体外系统中复制。核苷酸序列优先包含编码目标产物例如多肽(例如肽、蛋白质等)或RNA的开放阅读框。核苷酸序列可能含有另外的序列，例如转录终止子、信号肽、IRES、内含子等。
当在本文中使用时，术语“非翻译区”是指不具有ORF并且不定义将要通过翻译表达的蛋白质的氨基酸序列的核苷酸区域，或其中的ORF不参与任何转录、翻译或蛋白质表达的核苷酸区域。
术语“禽类物种”打算涵盖所有种类的禽类，例如鸟纲的鸟类，即具有羽毛、具有翅膀、两足、恒温并且产卵的脊椎动物。在本发明的情形中，禽类或禽类物种更具体来说是指具有经济和/或农业重要性的鸟类，例如家禽(例如鸡和火鸡)、水生家禽(例如鸭和鹅)和观赏鸟类(例如天鹅和鹦鹉)。
当在本文中使用时，术语“疫苗”是指可用于在生物体中引起、刺激或放大免疫应答的药剂。
“目标产物”包括但不限于多肽(例如肽、蛋白质等)以及RNA(例如反义RNA、干扰RNA、适体等)。
“免疫应答”是指在宿主中发展出针对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括特异性针对目标组合物或疫苗中包含的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，免疫应答是保护性的，以便增强对新感染的抵抗力和/或减轻疾病的临床严重性。
马立克氏病病毒
马立克氏病病毒是禽疱疹病毒。在本领域中已报道了MDV的各种不同血清型，特别是血清1型马立克氏病病毒例如CVI988/Rispens株和血清2型马立克氏病病毒例如SB1株。本发明的优选马立克氏病病毒源自于对目标动物(例如禽类)物种来说非致病的血清型或病毒株。本发明的最优选MDV是重组的血清1型MDV。
MDV已在出版物中公开(参见例如Kingham等，“火鸡的疱疹病毒的基因组：与马立克氏病病毒的比较性分析”(Thegenomeofherpesvirusofturkeys:comparativeanalysiswithMarek’sdiseaseviruses)，JournalofGeneralVirology(2001)82,1123-1135)，并且通常可以从保藏中心获得。MDV的基因组序列也可以在基因文库中获得(GenBank登记号DQ530348和AF291866)。
本发明涉及其中重组核苷酸序列可操作连接到β肌动蛋白来源的启动子的任何rMDV产品或组合物。事实上，发明人已显示，这样的构建体允许高度提高的表达并诱导强的保护性免疫。本发明还显示，这样的病毒对于与不同的禽疱疹病毒组合使用以诱导针对不同抗原性病原体的提高的免疫应答而没有显著的交叉干扰来说，是相容的。正如在实施例中证实的，发明人已令人吃惊地发现，在rMDV的情形中，这种启动子引起多肽的更高的和长期持续的表达，并且这种表达不被不同禽疱疹病毒载体的共同给药改变，从而允许同时针对几种不同抗原的免疫接种。
β肌动蛋白启动子
鸡β肌动蛋白启动子的序列在本领域中已被报道，并且可以在公共基因库上获得。示例性的序列显示在SEQIDNO：12中。
“源自于”鸡β肌动蛋白启动子的启动子是包含鸡β肌动蛋白启动子的功能性片段的序列、优选为鸡β肌动蛋白启动子的转录活性片段的序列的启动子。所述启动子可以进一步包含另外的残基或功能域，其可以是人造的和/或从不同启动子获得。源自于鸡β肌动蛋白启动子的启动子通常包含所述鸡β肌动蛋白启动子的序列的至少50个连续核苷酸，或者包含与其具有至少90％序列同一性、优选地至少96、97、98或99％序列同一性的序列，并且单独地或当与其他结构域组合时表现出转录活性。
用于本发明的鸡β肌动蛋白来源的启动子序列更优选为至少包含鸡β肌动蛋白启动子的核心序列的序列。所述核心序列通常位于天然启动子的-1200至-900位核苷酸之间、甚至更优选地-1192至-922位核苷酸之间的区域中。鸡β肌动蛋白启动子的核心序列的具体实例显示在SEQIDNO：5中：
TATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGT
在特定实施方式中，在本发明中使用的启动子含有鸡β-肌动蛋白启动子的核心序列，其包含(i)SEQIDNO：5或(ii)与SEQIDNO：5具有至少90％序列同一性、优选地与SEQIDNO：5具有至少96、97、98或99％序列同一性，并且表现出转录启动子活性的序列。
在特定实施方式中，本发明涉及一种rMDV，其包含可操作连接到包含SEQIDNO：12的启动子的核酸。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种rMDV，其包含可操作连接到包含SEQIDNO：5的启动子的核酸。
目标多肽
本发明的rMDV可用于递送和/或表达任何目标多肽，例如生物活性多肽或免疫原性(即抗原性)多肽。在优选实施方式中，所述目标多肽是抗原肽，甚至更优选为源自于能够在动物、优选为禽类中引起感染的病原生物体的抗原的肽或多肽。在禽类中引起感染的病原体的实例包括病毒、细菌、真菌、原生动物等。所述免疫原性(多)肽优选地可以是(源自于)所述病原体的表面蛋白、分泌蛋白或结构蛋白，或它们的片段。所述多肽可以源自于任何来源，例如病毒、原核生物、真核生物，或者是合成的。
在优选实施方式中，所述核酸编码鸟类病原性因子的抗原肽。
病原性因子的具体实例包括但不限于禽流感病毒、也称为新城疫病毒(NDV)的1型禽副粘病毒、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒、也称为传染性法氏囊病病毒(IBDV)的甘保罗病病毒、传染性喉气管炎病毒(ILVT)、传染性支气管炎病毒(IBV)、大肠埃希式杆菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonella)物种、多杀巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)、鼻气管鸟杆菌(Ornithobacteriumrhinotracheale)、鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum)、滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae)、感染禽类物种的支原体微生物或球虫。
优选地，所述免疫原性多肽选自NDV的F蛋白、IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白、鸡毒支原体的40K蛋白和禽流感病毒的表面蛋白血细胞凝集素(HA)，或它们的免疫原性片段。
在本发明的情形中，术语蛋白的“片段”优选是指包含所述蛋白的至少5个、甚至更优选地5-100个连续氨基酸残基的片段。在优选实施方式中，这样的片段包含至少一个表位和/或在体内是免疫原性的，即能够引起结合全长蛋白的抗体的产生。
免疫原性肽的具体实例包括例如包含完整VP2的1-453位氨基酸残基的肽。
病毒构建
基因克隆和质粒构建对于本领域普通技术人员来说是公知的，并且基本上可以通过标准的分子生物学技术来进行(《分子克隆：实验指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)第四版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,USA,2012)。
正如上面指示的，本发明的rMDV包含通常克隆到病毒基因组的非必需区中的重组序列。所述克隆可以通过本身在本领域中已知的技术来实现。通常，重组病毒可以通过病毒基因组与构建体(例如质粒)之间的同源重组来制备，所述构建体包含待插入的核酸，并在两侧带有来自于插入位点的核苷酸以允许重组。克隆可以在缺失或不缺失内源序列的情况下进行。在特定实施方式中，所述重组序列被克隆以代替所述基因组的至少一部分序列，例如至少50个或更多个核苷酸。这样的缺失例如提高了载体的克隆容量。
为此目的，通常首先将含有靶区域的序列克隆到适合的载体中。根据本发明，这样的靶区域优选为对于病毒复制或感染来说非必需的区域例如非编码(或非翻译)区，或非必需基因。这样的区域的优选实例是US2基因。载体的实例包括质粒如pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8或pUC9，噬菌体例如λ噬菌体和M13噬菌体，或粘粒例如pHC79。
按照常规克隆方法将靶区域整合到载体中。使用的靶区域序列优选具有足够长度，以允许随后与病毒基因组进行体内同源重组。优选地，被克隆的靶区域应该具有至少约100个核苷酸，通常超过300，例如1000至2000个核苷酸之间的长度。
将用于插入到病毒中的编码序列和启动子序列插入到克隆在载体中的病毒基因组的靶区域中。插入优选地应该以在克隆的插入片段的每一侧留下长度足以允许进行同源重组(例如至少50个核苷酸、优选地至少100个核苷酸)的一部分靶区域的序列的方式进行，所述编码序列和启动子序列可以通过经典的限制性酶和连接程序导入到克隆的靶区域中。如果适合，可以在靶区域的特定位点处进行突变，以产生用于限制性酶的新的切割位点。本领域技术人员公知的常规诱变技术可用于此目的，例如体外诱变或PCR。
可以使用已知技术例如电穿孔、磷酸钙法、基于脂质体的方法等将如上获得的、编码序列和启动子序列已被插入到靶区域中的载体导入到MDV感染的细胞或MDV基因组转染的细胞中。由此通过所述细胞中MDV-DNA与载体的同源区之间的重组产生重组病毒。当载体的量在0.1至1000μg的范围内时，重组病毒的产生效率被特别优化。
可以使用已知的选择技术通过基因型或表型对得到的重组病毒进行选择，例如通过杂交、检测由随着重组核酸序列一起整合的基因所编码的酶活性或免疫学检测由重组病毒表达的抗原肽。可以将选择到的重组病毒在细胞培养物中大规模培养，随后，可以收集含有肽的重组病毒。
优选的rMDV
本发明的优选rMDV包含插入到US2基因中，更优选地替换至少一部分US2基因，甚至更优选地在从起始密码子起第248至494位核苷酸之间的至少一个重组核酸。
本发明的最优选的rMDV是基于血清1型MDV。
此外，本发明的优选rMDV编码选自NDV的F蛋白、IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白、鸡毒支原体的40K蛋白和禽流感病毒的表面蛋白HA、或其片段的抗原肽。
根据特定实施方式，本发明涉及一种重组MDV1，其包含插入到US2基因中，在包含鸡β肌动蛋白启动子的核心序列的启动子控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的核苷酸序列。
本发明的这种rMDV的具体实例包括RR013、RR030和RR031。
在RR013中，抗原肽序列位于插入到MDV1的US2基因中的SEQIDNO：12的Bac启动子的控制之下。
在RR030和RR031中，抗原肽序列位于插入到MDV1的US2基因中的SEQIDNO：5的Coa5启动子的控制之下。
细胞培养物
本发明的重组病毒可以在任何感受态细胞培养物中繁殖。在实现病毒的所需生长后，可以使用刮刀或使用胰蛋白酶使细胞从孔脱下，并可以通过离心使被感染的细胞与上清液分离。
感受态细胞的实例包括CEF、含胚卵、鸡肾细胞等。可以将细胞或病毒在培养基例如Eagle'sMEM、Leibowitz-L-15/McCoy5A(1:1混合物)培养基中，在约37℃培养3至6天。通常将被感染的细胞悬浮在含有10％二甲基亚砜(DMSO)的培养基中并在液氮下冷冻保存。
组合物和疫苗
本发明还涉及包含本发明的一种或多种重组MDV的组合物，例如疫苗。
本发明的组合物可以在可药用或可兽医用载体或赋形剂中包含rMDV。所述组合物可以另外地或可选地包含适合的佐剂。
本发明的rMDV可以以活的形式使用(例如制备活疫苗)，或者以失活的、减毒的或杀死的形式使用。这些形式的生产在本领域中是已知的。
本发明的疫苗还可以包含适合的溶剂，例如水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。优选地，所述疫苗还包含添加剂。本发明的添加剂可以从众多来源中的任一个来源获得，包括源自于动物的各种蛋白和肽(例如激素、细胞因子、共刺激因子)和源自于病毒和其他来源的新核酸(例如双链RNA、CpG)等，其与疫苗一起以足以提高免疫应答的量给药。此外，上述物质的任何数量的组合可能提供免疫增强效果，因此可以形成本发明的免疫增强剂。
本发明的疫苗可以进一步与一种或多种其他添加剂一起配制以维持等渗性、生理pH和稳定性，例如缓冲剂如生理盐水(0.85％)、磷酸盐缓冲的盐水(PBS)、柠檬酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、Tris缓冲的盐水等，或抗生素例如新霉素或链霉素等。
给药途径可以是任何途径，包括口、眼(例如通过滴眼液)、使用气溶胶的眼-鼻给药、鼻内、泄殖腔、饲料中、水中或通过喷雾、卵内、表面或通过注射(例如静脉内、皮下、肌肉内、眶内、眼内、真皮内和/或腹膜内)疫苗接种。专业技术人员将容易地改变疫苗组合物的配方以适应于每种类型的给药途径。
每个疫苗药剂可以含有足以在禽类物种中引发保护性免疫应答的适合剂量。这种剂量的优化在本领域中是公知的。每剂的抗原量可以通过已知方法使用抗原/抗体反应来确定，例如通过ELISA方法。
取决于疫苗接种方案，本发明的疫苗可以作为单剂量给药或以重复剂量给药。
本发明的疫苗的另一个优点在于它们为鸟类物种提供针对目标禽类病原体的高达80％的保护。
本发明还涉及如上所述的疫苗在免疫接种禽类物种例如家禽中的用途，以及通过给药免疫有效量的本发明的疫苗对禽类物种进行免疫接种的方法。有利的是，所述疫苗的给药可以真皮内、皮下、肌肉内、经口、卵内、通过粘膜给药或经眼-鼻给药。
本发明还涉及用于对禽类物种进行免疫接种的疫苗接种试剂盒，其包含有效量的如上所述的多价疫苗和用于将所述组分给药到所述物种的工具。例如，这种试剂盒包含装填有本发明的疫苗的注射装置和用于真皮内、皮下、肌肉内或卵内注射的说明书。或者，试剂盒包含装填有本发明的疫苗的喷雾/气溶胶或滴眼装置，以及用于眼-鼻给药、经口或粘膜给药的说明书。
本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中公开，所述实验部分说明了所请求保护的发明。
实施例
在实验中生产并使用了几种重组病毒，它们被如下命名(病毒/插入位点/插入的基因)：
RR013：Rispens/US2/Bac-VP2stc
RR024：Rispens/US2/RSV-VP2stc
RR025：Rispens/US2/SV40-VP2stc
RR030：Rispens/US2/Coa5-VP2stc
RR031：Rispens/US2/Coa5-VP2stc2
FW023(重组HVT/IBD对照)：HVT/UL45-46/Bac-VP2stc
FW029(重组HVT/ND对照)：HVT/UL45-46/Pec-F
实施例1：同源载体的构建
质粒构建基本上通过标准的分子生物学技术来进行(《分子克隆：实验指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第四版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,USA,2012)。
pRisUS2Sfi的构建
通过PCR反应克隆位于目标插入位点(在US2基因内)两侧的Rispens基因组的2.2-kbDNA片段，缺失US2基因的一部分(0.2-kb)并在插入位点处添加SfiI识别位点(图1)。简单来说，使用从Rispens提取的DNA作为模板，进行两个PCR反应。使用的引物对是SEQNO.1(5’-AAACGAATTCGAAGCTTGCATGCCCCGCTAAGGAC-3’)和SEQNO.2(5’-GCCACCAGATGGAACTGGGGCCAATAAGGCCGGTATGCCGTGGGCC-3’)，以及SEQNO.3(5’-GGCCCACGGCATACCGGCCTTATTGGCCCCAGTTCCATCTGGTGGC-3’)和SEQNO.4(5’-GATTACGAATTCGCCCTTTTACATGCTGCCCCAA-3’。使用来自上述两个PCR反应的PCR产物的混合物作为模板，SEQNO.1和SEQNO.4作为引物，进行另一个PCR反应。将获得的PCR片段在用EcoRI和HindIII消化后克隆到pUC18载体(GenBankAcc.No.L09136)中，产生pRisUS2Sfi。
同源载体的构建
利用质粒pRisUS2Sfi，构建含有启动子和来自于标准激惹株(VP2-STC)的IBDVVP2基因的各种同源载体。使用这些同源载体构建重组Rispens/IBD(RR013、RR024、RR025、RR030和RR031)。首先，将pRisUS2Sfi用SfiI切开并用希瓦氏菌(Shewanellasp.)S1B1重组碱性磷酸酶(PAP)(Funakoshi#DE110)去磷酸化。通过用BglI消化p45/46bacVP2-STC#11(美国专利号6,764,684)获得Bac启动子-VP2-STC盒式元件(cassette)并将其插入到SfiI消化的pRisUS2Sfi中，产生pRisUS2bacVP2stc。使用该质粒pRisUS2bacVP2stc构建重组Rispens/IBDRR013。也构建了含有Bac启动子的部分核心序列(SEQNo.5)(Coa5启动子)的同源质粒。Coa5启动子从质粒pGICOA(美国专利号6,866,852)通过BglI和XbaI消化获得，并与p45/46bacVP2-STC#11的XbaI-EcoRI片段(6.3-kb)和EcoRI-BglI片段(0.1-kb)连接，产生p45/46COA5VP2-STC#11。然后通过BglI消化将Coa5启动子-VP2-STC盒式元件从p45/46COA5VP2-STC#11切下，并与SfiI消化的pRisUS2Sfi连接，产生pRisUS2Coa5VP2stc。将该质粒pRisUS2Coa5VP2stc用于构建RR030。构建了另一个具有Coa5启动子的同源载体，其在Coa5启动子与VP2-STC基因之间具有不同序列。在使用pRisUS2Coa5VP2stc作为模板和SEQNo.6(5’-GTGGGGACCCGAGGATTTTG-3’)和SEQNo.7(5’-GCGTCTAGAGGATCGATCCACCGGTCGCCACCATGACAAACCTGCAAGATCA-3’)作为引物进行PCR后，将获得的DNA片段用XbaI和SalI消化，然后插入到pRisUS2Coa5VP2stc的XbaI-SalI片段(5.2-kb)中。将得到的质粒pRisUS2Coa5VP2stc2用于制造RR031。通过用BglI分别消化p44-45d46RsvVP2和p44-45d46SV40VP2(EP专利12305390)，获得RSV启动子-VP2-STC盒式元件和SV40启动子-VP2-STC盒式元件。将这些片段与SfiI消化的pRisUS2Sfi连接，产生pRisUS2RSVVP2stc和pRisUS2SV40VP2stc。将这些质粒分别用于构建RR024和RR025。
实施例2：重组Rispens的构建
通过在培养的细胞或大肠杆菌中同源重组来进行重组Rispens的构建。对于在培养的细胞中的同源重组来说，如Morgan等(AvianDiseases,34:345-351,1990)所述制备野生型Rispens病毒的病毒DNA。使用NucleofectorII(Lonza,Basel,Switzerland)，通过电穿孔将约2μg的RispensDNA和1μg的同源载体之一转染到约107个CEF细胞中。将转染的细胞添加到Leibovitz’sL-15(LifeTechnologiesCorp.,Cat.#41300-39)、McCoy’s5A培养基(LifeTechnologiesCorp.,Cat.#21500-061)(1:1)和4％小牛血清[LM(+)培养基]中，在96孔组织培养板中铺板，然后在4-5％CO2中在37℃温浴5-7天，直至Rispens噬斑变得可见。然后通过胰蛋白酶处理将细胞从板脱离，等量地转移到两块带有CEF的96孔板并温浴4至6天，直至观察到噬斑。筛选通过黑斑测定法来进行，所述测定法只染色表达IBDVVP2蛋白的噬斑。简单来说，将两块板之一用甲醇：丙酮混合物(1:2)固定，并与抗IBDVVP2单克隆抗体R63(ATCC#:HB-9490)一起温浴。接下来，与生物素标记的抗小鼠IgG抗体(VectorLaboratories,Cat#BA-9200)一起温浴，然后使用VECTASTAINABC-AP试剂盒(VectorLaboratories,Cat#AK-5000)，通过添加NBT/BCIP溶液(RocheAppliedScience,Cat#1681451)对表达VP2蛋白的噬斑染色。鉴定含有染色的重组噬斑的孔，并对来自于另一块96孔板上相应的孔的细胞进行胰蛋白酶处理。然后将细胞在新鲜的次级CEF细胞中稀释并转移到96孔板，以完成第一轮纯化。重复所述纯化程序直至所有噬斑在黑斑测定法中阳性染色。对于在大肠杆菌中的同源重组来说，将携带作为细菌人工染色体(BAC)的Rispens基因组和质粒pKD46(GenBankAcc.No.AY048746)的大肠杆菌DH10B菌株在通过添加10mML-阿拉伯糖诱导重组酶后用1μg同源载体之一转染。转染通过电穿孔，使用GenePulserXcell(Bio-RadLaboratories)在1.75kV、25μF和200欧姆下进行。在转染后，将大肠杆菌在Luria-Bertani(LB)琼脂平板上铺板，并在37℃温浴过夜。使用扩增Rispens基因组的VP2基因与插入位点区之间的区域的引物对，通过PCR鉴定带有适合的含有VP2基因的插入片段的大肠杆菌克隆。引物是SEQNO.6和SEQNO.8(5’-TGAACTACACAAAATTGATACTGA-3’)。从含有插入片段的克隆提取RispensBACDNA，并使用NucleofectorII(Lonza)将它转染到CEF中。将转染的CEF在96孔板中铺板，并在4-5％的CO2中在37℃温浴5-7天，直至Rispens噬斑变得可见。如上所述纯化表达VP2蛋白的噬斑。
实施例3：基因组结构的验证
通过扩增被插入的基因的每个末端处的连接部区域(连接部1和连接部2)的两个PCR反应来验证重组Rispens/IBD的基因组结构。图2示出了连接部1和连接部2位于重组病毒基因组中的位置。在PCR反应中使用的引物对是用于连接部1的SEQNO.9(5’-GAGGCGGACGTAAATGGAGA-3’)和SEQNO.8，以及用于连接部2的SEQNO.10(5’-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3’)和SEQNO.11(5’-TATGAGCGGCAGTTATCGTGT-3’)。对于所有重组Rispens来说观察到了预期的PCR产物尺寸，证实了这些重组Rispens具有预期的基因组结构。
实施例4：插入的抗原被重组Rispens的表达
通过黑斑测定法和蛋白质印迹分析来证实重组Rispens/IBD对VP2蛋白的表达。黑斑测定法的程序描述在实验2中。使用用重组病毒感染的CEF细胞和抗IBDVVP2单克隆抗体R63来进行蛋白质印迹。简单来说，将6孔板中的CEF细胞用重组病毒之一或亲本Rispens株以约0.1的感染复数进行感染。接种后3天，用胰蛋白酶收获细胞并以913xg离心5分钟。将细胞沉淀物用PBS洗涤并用100μlPBS重悬浮。在加入相同体积的2xSDS样品缓冲液(130mMTris-Cl(pH6.8)，6％SDS，20％甘油，10％2-巯基乙醇和0.01％溴酚蓝)后，将细胞悬液煮沸5分钟。使用12％聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分离样品并将它转移到PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)。将膜完全干燥，然后与R63单克隆抗体温浴。在洗掉R63抗体后，加入生物素标记的抗小鼠IgG抗体(VectorLaboratories,Cat#BA-9200)，然后使用VECTASTAINABC-AP试剂盒(VectorLaboratories,Cat#AK-5000)。通过添加NBT/BCIP溶液(RocheAppliedScience,Cat#1681451)进行与R63单克隆抗体结合的蛋白的可视化。如图3中所示，只在使用重组病毒感染的细胞的道中观察到具有40千道尔顿(kDa)(其为VP2蛋白的预期尺寸)的蛋白条带。具有完整或部分Bac启动子的重组Rispens即RR013、RR030和RR031，与具有RSV启动子的RR024相比表达更多的VP2蛋白。
实施例5：重组Rispens在鸡中的效能——β肌动蛋白启动子提供高度优越的保护
针对毒性IBDV激惹评估了表达IBDVVP2基因的重组Rispens病毒的效能。使用了三种重组Rispens/IBD病毒(RR013、RR024和RR025)，其中抗原的表达由不同启动子驱动。将1日龄的无特定病原体(SPF)白来亨鸡分成6组，并将第3至5组中的鸡用约3000噬斑形成单位(pfu)/0.2ml的重组Rispens之一(第3组，RR013；第4组，RR024，第5组，RR025)进行皮下疫苗接种。将第6组中的鸡用作为重组HVT/VP2对照的FW023(rHVT/IBD-STC#11；美国专利6,764,684)进行疫苗接种。保留第1组中的鸡(未免疫接种、未激惹的阴性对照)和第2组中的鸡(未免疫接种、激惹的阳性对照)不进行疫苗接种。在2至7周龄之间每周对鸡取血，用于评估针对IBDV的体液免疫。使用商品化IBDVELISA试剂盒(IdexxLaboratories,FlockChekIBD)定量抗IBDV抗体。在7周龄时，将除了第1组之外的所有鸡用103平均胚胎感染剂量(EID50)的毒性IBDV标准激惹(STC)毒株经口途径激惹。每日观察鸡的与IBD相关的临床征兆，例如消沉和死亡。激惹后7天，对鸡进行尸检并观察特别可观察到的法氏囊病变例如水肿、变色、萎缩、出血和黄色或凝胶状渗出物。在尸检时也测量身体和法氏囊的重量以计算B/B指数，所述指数是激惹的鸟类的法氏囊重量和体重之间的比率除以未激惹的鸟类的同一比率。
表1概述了结果。
表1.在SPF鸡中重组Rispens针对毒性IBDV激惹的保护(效能试验1)
NINC＝未免疫接种、未激惹的阴性对照
NICC＝未免疫接种、激惹的阳性对照
RR013：Rispens/US2/Bac-VP2stc
RR024：Rispens/US2/RSV-VP2stc
RR025：Rispens/US2/SV40-VP2stc
FW023(重组HVT/IBD对照)：HVT/UL45-46/Bac-VP2stc
第2组(激惹的阳性对照)中的所有鸡发展出IBD典型的法氏囊眼观病变，而第1组(未激惹的阴性对照)中的所有鸡保持没有这些病变。由RR013(第3组)提供的保护为87％(13/15)，它等同于来自于FW023重组HVT/IBD对照(第6组)的保护。第3组的B/B指数为0.95，表明在法氏囊中没有显著萎缩。令人吃惊的是，RR024(第4组)和RR025(第5组)仅给出部分保护(53％和3％)。所有接种疫苗的组从3周龄开始给出更高的IBDELISA滴度(图4)。RR013疫苗接种的鸡中的滴度始终比RR024或RR025疫苗接种的鸡中的滴度高，这与激惹后的保护结果相一致。
总而言之，具有Bac启动子的RR013与含有非Bac启动子的RR024和RR025两者相比，提供明显优越的体液和保护性免疫。
实施例6：重组Rispens在鸡中的效能——不同的β肌动蛋白来源的启动子的活性
在具有母体抗体的商品化产蛋(白来亨)鸡中调查了均含有完整或部分Bac启动子的RR013、RR030和RR031的效能。将1日龄的鸡分成6组，并将第3至5组中的鸡用约3000噬斑形成单位(pfu)/0.2ml的重组Rispens之一(第3组，RR013；第4组，RR030，第5组，RR031)进行皮下疫苗接种。将第6组中的鸡用作为重组HVT/VP2对照的FW023进行疫苗接种。保留第1组中的鸡(未免疫接种、未激惹的阴性对照)和第2组中的鸡(未免疫接种、激惹的阳性对照)不进行疫苗接种。在1至7周龄之间每周对鸡取血，并使用商品化IBDVELISA试剂盒(IDEXXIBDAb检测:IDEXXLaboratories)试验抗IBDV抗体的存在。在5周龄和7周龄时进行两次激惹。每个组中一半的鸡在5周龄时激惹，另一半在7周龄时激惹。对于激惹来说，将103EID50的毒性IBDVSTC毒株通过口服途径给药。以与实施例5中相同的方式进行激惹后的观察和评估。
表2和3概述了结果。
表2.在商品化产蛋鸡中重组Rispens针对5周龄时毒性IBDV激惹的保护(效能试验2)
NINC＝未免疫接种、未激惹的阴性对照
NICC＝未免疫接种、激惹的阳性对照
RR013：Rispens/US2/Bac-VP2stc
RR030：Rispens/US2/Coa5-VP2stc
RR031：Rispens/US2/Coa5-VP2stc2
FW023(重组HVT/IBD对照)：HVT/UL45-46/Bac-VP2stc
表3.在商品化产蛋鸡中重组Rispens针对7周龄时毒性IBDV激惹的保护(效能试验2)
在5周龄时激惹后，所有用含有BAC启动子的重组Rispens疫苗接种的组给出出色的保护(对于RR013来说90％，对于RR030来说95％，对于RR031来说95％)，而未免疫接种的激惹的阳性对照(第2组)中的所有鸡发展出IBD典型的法氏囊眼观病变(表2)。FW023重组HVT/IBD对照给出81％的保护，其低于重组Rispens组。第1组(未激惹的阴性对照)中的所有鸡保持没有这些病变。在未免疫接种的激惹阳性对照(第2组)中高的B/B指数并同时在法氏囊中表现出典型的IBD眼观病变，可能指示残余的母体来源的抗体的参与，导致法氏囊病变的发生延迟。在7周龄时激惹后，用同样含有BAC启动子的重组Rispens疫苗接种的所有组给出出色的保护(对于RR013来说84％，对于RR030来说91％，对于RR031来说80％)，而未免疫接种的激惹的阳性对照(第2组)中的所有鸡发展出IBD法氏囊眼观病变(表3)。接种疫苗的组的B/B指数高于0.91，表明在法氏囊中没有显著萎缩。IBDVELISA结果显示，在从1周至4周母体来源的抗体衰减后，所有接种疫苗的组都给出更高的IBDELISA滴度(图5)。在5和7周龄之间，RR030和RR031疫苗接种的鸡中的滴度高于FW023疫苗接种的鸡中的滴度。
概括来说，在1日龄疫苗接种后，均含有与VP2基因组合的完整或部分Bac启动子的RR013、RR030和RR031在5和7周龄的具有母体抗体的商品化白来亨产蛋鸡中给出出色的保护。
实施例7：本发明的重组Rispens的稳定性
在本实施例中，评估了RR030和RR031在细胞培养物中(体外)和鸡中(体内)的稳定性。对于体外稳定性来说，将病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)中传代20次。对于体内稳定性来说，将病毒接种到1日龄的商品化产蛋(白来亨)鸡，然后在5和7周龄时通过将鸡的外周血淋巴细胞接种到CEF上，从接种疫苗的鸡重新分离病毒。通过PCR和使用R63抗IBDVVP2单克隆抗体的黑斑测定法，试验体外传代后的病毒和从接种疫苗的鸡分离的病毒。
对于所有被试验的样品来说，PCR测定法检测到预期条带，表明在病毒基因组中没有可检测的缺失或变化。对于所有被试验的样品来说，在使用R63抗IBDVVP2单克隆抗体的黑斑测定法后，所有噬斑被染成黑色。
因此，RR030和RR031在体外和体内在遗传和表型上稳定。
实施例8：Rispens/IBD的免疫力的持续时间
为了调查由Rispens/IBD赋予的针对IBDV的免疫力的持续时间，监测用RR030疫苗接种的鸡的IBDVELISA滴度直至41周龄。更具体来说，将1日龄的具有母体抗体的商品化产蛋(白来亨)鸡用约3000pfu/0.2ml的重组Rispens/IBD(RR030)进行皮下疫苗接种。在1至7周龄之间每周对鸡取血，在其后每两周取血。使用商品化IBDVELISA试剂盒(IDEXXIBDAb检测:IDEXXLaboratories)试验血清中抗IBDV抗体的存在。如图7中所示，在到3周龄时针对IBDV的母体抗体消逝后，ELISA滴度开始增加。到25周龄时，滴度继续增加直至S/P值超过2.5，并且高水平的IBDVELISA滴度维持直至41周龄。这一结果证实，Rispens/IBD提供了格外长的针对IBDV的免疫力持续时间。
实施例9：重组Rispens在鸡中的效能——与不同的HVT无干扰
在本实施例中，调查了含有BAC启动子的重组Rispens/IBD(RR030)与重组HVT/ND(FW029)(rHVT/NDV，美国专利6,866,852)之间的相容性。将具有母体抗体的1日龄商品化产蛋(白来亨)鸡分成6组并接种疫苗。第1组用约3000pfu/0.2ml的重组Rispens/IBD(RR030)单独进行皮下疫苗接种。第2组接受均为3000pfu/0.2ml的RR030和重组HVT/ND(FW029)的混合物。一组鸡(第3组)仅用FW029进行疫苗接种。第4组中的鸡用作为重组HVT/VP2对照的FW023进行疫苗接种。留下第5组(未免疫接种、激惹的阳性对照)和第6组(未免疫接种、未激惹的阴性对照)中的鸡不进行疫苗接种。在2至7周龄之间每周对鸡取血，使用商品化IBDVELISA试剂盒(IDEXXIBDAb检测:IDEXXLaboratories)试验抗IBDV抗体的存在，并使用商品化NDVELISA试剂盒(IDEXXNDVAb检测:IDEXXLaboratories)试验抗NDV抗体的存在。在7周龄时使用毒性IBDV或毒性NDV进行激惹。第1组(单独的RR030)和第4组(单独的FW023)中的所有鸡，以及第2组(RR030+FW029)和第5组(未免疫接种、激惹的阳性对照)中一半的鸡，经口服途径接受使用103EID50的毒性IBDVSTC毒株的IBDV激惹，而第3组(单独的FW029)中的所有鸡以及第2组(RR030+FW029)和第5组(未免疫接种、激惹的阳性对照)中另一半的鸡，通过肌肉内注射到股区中接受使用103EID50的非常烈性的(嗜神经组织强毒性)NDVTexasGB毒株的NDV激惹。以与实施例5和6中相同的方式进行IBDV激惹后的观察和评估。对于NDV激惹来说，在14日内每日观察鸡的嗜神经组织强毒性ND典型的临床征兆例如消沉、神经症状和死亡。
结果概述在表4中。
表4.在商品化产蛋鸡中重组Rispens/IBD与重组HVT/NDV之间的相容性(效能试验3)
RR030：Rispens/US2/Coa5-VP2stc
FW029(重组HVT/ND对照)：HVT/UL45-46/Pec-F
FW023(重组HVT/IBD对照)：HVT/UL45-46/Bac-VP2stc
NICC＝未免疫接种、激惹的阳性对照
NINC＝未免疫接种、未激惹的阴性对照
与FW029组合的RR030(第2组)提供了针对IBD和ND激惹两者的出色的保护。在IBDV激惹后，与FW029组合的RR030(第2组)提供了94％(15/16)的保护，这与由单独的RR030(第1组)提供的88％(15/17)的保护相当。在用FW023疫苗接种的第4组中，94％的鸡受到保护。未免疫接种、激惹的阳性对照(第5组)中的所有鸡发展出法氏囊眼观病变。在NDV激惹后，在第2组(与FW029组合的RR030)中观察到88％(15/17)的保护，而单独的FW029(14/16)提供88％的保护。激惹的阳性对照(第5组)中的所有鸡显示出ND的临床征兆。ELISA结果也证实，当将RR030和FW029这两种病毒组合时，由RR030或FW029引起的体液免疫不降低(图6A和6B)。
总而言之，本实施例证实了在含有Bac构建体的重组Rispens/IBD与重组HVT/ND之间不存在干扰。

Claims (18)

1.一种血清1型重组马立克氏病病毒，其包含(1)由鸡β-肌动蛋白来源的启动子构成的启动子，以及(2)在所述启动子控制之下编码多肽的重组核苷酸序列。
2.权利要求1的重组MDV1，其中所述启动子由鸡β-肌动蛋白启动子的核心序列构成。
3.权利要求1至2任一项的重组MDV1，其中所述鸡β-肌动蛋白启动子的核心序列包含SEQIDNO：5或与SEQIDNO：5具有至少90％序列同一性并表现出转录启动子活性的序列。
4.前述权利要求任一项的重组MDV1，其中所述启动子和所述重组核苷酸序列被插入到所述病毒的非必需区中，优选插入到所述病毒的US2基因中。
5.前述权利要求任一项的重组MDV1，其中所述重组核苷酸序列编码抗原肽。
6.权利要求5的重组MDV1，其中所述抗原肽是来自于禽类病原体的抗原肽。
7.权利要求6的重组MDV1，其中所述抗原肽选自1型禽副粘病毒的抗原肽、优选为新城疫病毒(NDV)的F蛋白或其片段，甘保罗病病毒的抗原肽、优选为传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2蛋白或其片段，传染性喉气管炎病毒(ILTV)的抗原肽、优选为gB蛋白或其片段，鸡毒支原体的抗原肽、优选为40K蛋白或其片段，以及禽流感病毒的抗原肽、优选为表面蛋白血细胞凝集素(HA)或其片段。
8.权利要求7的重组MDV1，其中所述抗原肽是IBDV的VP2蛋白或其免疫原性片段。
9.前述权利要求任一项的重组MDV1，其中所述病毒包含编码不同的多肽的另外的重组核苷酸序列。
10.前述权利要求任一项的重组MDV1，其中所述MDV1包含插入到非必需区中的在启动子控制下编码抗原肽的重组核苷酸序列，所述启动子包含SEQIDNO：5或与SEQIDNO：5具有至少90％序列同一性并表现出转录启动子活性的序列。
11.一种组合物，其包含权利要求1至10任一项的重组马立克氏病病毒和任选的可药用或可兽医用赋形剂或载体和/或适合的佐剂。
12.权利要求1至10任一项的重组MDV1或权利要求11的组合物，其用于给禽类、优选为鸡接种疫苗。
13.权利要求1至10任一项的重组MDV1，其表达第一抗原，用于与表达不同的第二抗原的不同的重组禽病毒组合，通过同时给药、分开地顺序给药或交替给药，来给禽类、优选为鸡接种疫苗。
14.用于权利要求13的用途的重组MDV1，其中所述MDV1表达VP2蛋白，并且不同的禽病毒是表达不同抗原的HVT。
15.一种生产权利要求1至10任一项的重组MDV1的方法，所述方法包括：(i)将在包含鸡β-肌动蛋白启动子的核心序列的启动子控制下编码多肽的重组核苷酸序列引入到MDV1病毒的基因组的非必需区中，(ii)任选地复制所述病毒，以及(iii)任选地收集所述病毒。
16.一种包含MDV1的基因组或其片段的重组核酸分子，其中所述基因组或片段包含通过插入重组核苷酸序列进行修饰的US2基因，所述重组核苷酸序列包含在启动子控制下编码多肽的序列，所述启动子包含鸡β-肌动蛋白启动子的核心序列。
17.一种质粒，其包含权利要求16的核酸分子。
18.一种宿主细胞，其包含权利要求16的核酸分子或权利要求17的质粒。
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