CN1359388A - 用于提高蛋白质稳定性和产量的方法以及可用于生产这种稳定蛋白质的细胞系 - Google Patents

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Abstract

一种通过应激蛋白和产生的蛋白质产物加强对蛋白质产生的控制和稳定性,从而提高病毒、病毒蛋白质、和其它相关生物学物质的产量的方法。本发明还致力于用于选择或改造生产这种稳定性增强产物的细胞系的方法。更具体的说,本发明的例示性实施方案致力于用于提高病毒剂产量、产生展示永久遗传修饰的细胞系、产生许可性真核细胞系、和提高功能性重组产物产量的方法,以及这些方法的产物。

Description

用于提高蛋白质稳定性和产量的方法 以及可用于生产这种稳定蛋白质的细胞系
                            发明背景
本申请要求相同发明人于1999年5月28日提交的、共同未决的美国临时申请流水号60/136,676的利益。
本发明涉及功能性生物学物质的生产及稳定，诸如蛋白质、病毒剂、或其它生物学剂或产物，包括，但不限于，酶、激素、生长因子、结构蛋白、肿瘤抑制剂、核酸和核酸探针、疫苗、抗原、抗生素、脂质、简单和复合的碳水化合物、醇类及其它溶剂、和这些方法的产品。这些功能性生物学物质可用于例如制造疫苗和诊断性测定法或测试。
然而，可用于制造诸如疫苗和诊断性测定法等产品的病毒、病毒抗原、和其它病毒产物的生产是昂贵的，耗时的，还需要高水平的专门技术。病毒必须在活的真核细胞中增殖。能被一种特定病毒感染的真核细胞称为对该病毒是“许可性的”。但是，大多数真核细胞不是对任何给定病毒都是许可性的，而且没有预测许可性的技术。另外，对病毒生产允许的细胞可能具有不同水平的许可性。有些细胞系可产生大量病毒，而其它细胞系可能只允许低水平的病毒复制。因此，为了确定用于病毒生产的最佳细胞，必须对许多细胞系进行经验研究，这种研究有时是大型的，通常是耗时的。更为复杂的是，最佳细胞系可能不是来自获得病毒的宿主(如病毒影响的患者的人细胞)。来自特定宿主的病毒常常没有合适的细胞系。
因为其稳定性、永生性、已知特征、和通过长期经验确定的行为，细胞系优选来自宿主的原代细胞培养物。在病毒生产中使用这些细胞系的需求已导致用于生产各种病毒的大量外来细胞系的开发。例如，犬瘟热病毒(CDV)、麻疹病毒在Vero细胞(即非洲绿猴肾细胞)中生长得很好，但在狗细胞中则不增殖；而牛白血病病毒(BLV)则由衍生自蝙蝠肺组织的细胞系生产。
不幸的是，病毒在与通常感染的宿主和组织相差甚远的细胞系中的生长可引起这些病毒以远离其正常行为的方式发生作用。
此外，病毒的复杂病理学可使病毒的制造极其困难。例如，CDV和人疱疹病毒(HMV)是密切相关的病毒。在感染它们各自的犬和人宿主时，这两种病毒作用相似，都产生脑炎和长期后遗症，其中中枢神经系统遭到损伤或破坏。在最初感染CDV多年后在狗中发生的中枢神经系统疾病称为老狗脑炎(ODE)。在人中，相应的状况是亚急性硬化性全脑炎(SSPE)。ODE和SSPE的病因与疾病的脑炎期中产生的病毒体和受影响的细胞的数目直接相关。这继而与脑细胞对病毒的许可性和宿主免疫系统对病毒的快速应答能力直接相关。脑病毒滴度达到异常高水平的狗或人在多年后可形成这些长期后果。事实上，在有些感染患者中的高病毒滴度可导致在脑细胞中永久生成病毒蛋白质，甚至在感染已被清除后。即使已多年未生成有活力的病毒，免疫系统仍将病毒蛋白质识别为外来的并继续攻击它。最终，宿主免疫系统与这些异常细胞之间的战斗造成足以破坏宿主认知能力的损伤。通常对患有ODE的狗施以安乐死。人患上SSPE的后果是进行性痴呆，最终死亡。由于这种复杂的病理生理学原因，制造的病毒和病毒产物在体内刺激免疫力的应用中未获成功。
既然许多病毒(诸如CDV和HMV)感染脑细胞，那么脑细胞系的许可性在产生的疾病之病理生理学研究中和在诊断剂和正确模拟自然感染过程中病毒特征的疫苗之生产中具有重要作用。然而，很少存在神经细胞系，而且它们只产生低水平的CDV或HMV。因此，这些细胞系产生的病毒水平不足以供应研究，而且尤其不适用于抗原或疫苗生产。因而需要修饰这些细胞或细胞系以支持高水平的病毒复制和病毒产物的方法以及细胞系自身。
除了与生产有用滴度的已知病毒有关的问题外，寻找未知病毒是极其困难的，因为未知病毒复制所需的细胞类型其自身也是未知的。例如，存在可能由未发现的病毒剂所引起的大量中枢神经系统疾病。克雅病(Creutzfield-Jacob Disease，CJD，影响人)、瘙痒病(影响羊)、和牛海绵状脑病(影响牛)这些退化性疾病都是非常慢的神经退化性疾病，其病因仍然未知。直至今日，仍未鉴定出引起这些疾病的物质，也未由感染的人或动物脑组织繁殖出任何病毒剂。这促进了关于疾病病因的多种非正统假定，包括提出某种特定蛋白质(称为“朊病毒”，有人提出它是无需任何遗传物质而能够引起感染并繁殖的因子)可能作为感染性因子。然而，没有哪种(甚至高水平)产生朊病毒的细胞系显示具有感染性。经修饰产生朊病毒的转基因小鼠不具有感染性，即使当它们呈现疾病的诊断性特点时。因此，没有用于鉴定感染性因子的方法，就不能产生用于这些疾病的好的诊断测试，而且疫苗生产也是不可能的。
最近，对用于开发诊断性测试和潜在疫苗的改良方法的迫切需要变得非常重要。例如，最近，英国的牛被喂以包含绵羊和其它动物废弃物的饲料。随后首次在这些牛中认识到牛海绵状脑病。大量的人由于食用受感染的牛肉而受到感染-这构成了过去从未认识的感染途径(现在称为“CJD新变体”或nvCJD)。除了感染病人的悲惨结果外，对牛的屠宰造成了巨大的经济损失。nvCJD的发现还产生了政治影响，涉及可能来自被感染牛的食品和其它动物产品的进口、出口、和销售。因此，需要开发好的诊断性测试，以及生产有效的疫苗。为了实现这些以及类似目的，需要能够繁殖造成慢性痴呆病因的神经趋向剂(像CJD和nvCJD)的许可性细胞系。
由于国家人口平均年龄的增长，疾病状态(像阿尔茨海默症(进行性老年痴呆症))的发生也有所增加。阿尔茨海默症是必需对病人进行困难的长期照料的一种慢性痴呆病。这种长期衰弱性疾病的相关花费可能是毁灭性的。并不认为阿尔茨海默症是感染性的。然而，阿尔茨海默症的某些特性令人推测，感染某种非传统病毒剂(类似nvCJD)可能引起这种疾病。也有可能是，神经营养剂(像HMV)或相关麻疹病毒样病毒引起这种破坏精神活动的慢性疾病。若阿尔茨海默症是由感染剂引起的，则这一点对疾病的管理、预防、诊断、和治疗(如果可能)将具有巨大的影响。那么，例如，有可能需要开发用于预防阿尔茨海默症的好的疫苗。然而，正如由非传统因子(诸如ODE和SSPE)引起痴呆的其它情况，这里也不存在权威性的诊断性测试。因此，由被感染脑组织分离病毒将成为诊断和(可能的)治疗这种疾病患者的一个里程碑式的步骤。因此，对麻疹样病毒更为许可的细胞系可能能够分离尚未发现的神经趋向剂(像CDV和HMV)。
使用重组DNA技术由真核细胞系生产蛋白质用于疫苗、诊断性试剂盒、或其它目的，具有与病毒生产有关的相同限制和问题。必须由真核细胞系生产重组蛋白质以确保正确的折叠、糖基化、和对蛋白质的正确功能和稳定性(或作为诊断试剂或疫苗的免疫原性具有决定性作用)的其它组成型因子。大量生产这些蛋白质同时维持正确构象的能力是困难的。在许多情况中，可以在细胞系中以可接受水平生成重组蛋白质，但是由于构象上的有些经常性细微改变，或是没有免疫反应性(作为诊断试剂或疫苗)，或是不能发挥其预期功能。例如，在真核细胞系中以商业上可行的水平遗传克隆并生产犬细小病毒(CDV)。用这些重组抗原接种的狗通过产生在体外能够中和感染性(野生型)细小病毒的抗体而发生应答。不幸的是，用重组抗原接种的所有狗都在暴露于感染性CDV后死亡。可能是有些细微的构象变化阻止了重组疫苗对狗的保护。
因此，重组蛋白质的生产是昂贵的、需要技术的、耗时的、且效率非常低的。在许多情况中，重组蛋白质可能具有有效作用，但是由于其生产成本而不能应用。例如，已知大量的抗肿瘤肽具有有利作用，包括明显削弱或治疗癌症(例如血管生成阻断剂)。最近有报道称，angiostatin和endostatin可治疗小鼠中的癌症。然而，生产这些肽的成本(单一疗程所需药量费用可能高达500-2000万美元)阻止了它们在癌症治疗中的应用。因此，非常需要用于生产重组肽或蛋白质又维持其功能(酶的、抗原的、或其它功能特性)的高效价方法。
许多组成型生成的蛋白质和肽具有密切相关的“辅助蛋白质”，其帮助诱导或维持正确形态。由于这些辅助蛋白质伴随蛋白质经历生成过程，因此它们常常称为“侣伴”。其中的有些侣伴蛋白结合到其它蛋白质以防止由于环境压力而造成的变性(失去构象)或其它退化。例如，细胞应答高于正常水平的热度而生成热休克蛋白(诸如hsp70和hsp90)。这种热休克蛋白结合细胞内其它蛋白质，对它们起稳定作用，由此帮助所结合的蛋白质维持正确构象和功能。这些蛋白质和应答其它应激而生成的其它类似蛋白质通常称为应激蛋白。
这种应激蛋白的结构和功能似乎在整个自然界中高度保守，其中多种应激蛋白似乎在原核和真核细胞中具有相似的侣伴作用。这已经导致了关于这种蛋白质的大量研究和建议用途。例如，文献中的大量工作为这种蛋白质描述了以在体外使多种生物学物质与外源生成应激蛋白相接触为基础的应用。将下文概述的这些工作收入本文作为参考：
Neupert等人(美国专利5,302,518)提出，组成型热休克蛋白质可能在体内介导蛋白质的正确折叠，诸如分别存在于大肠杆菌和真核线粒体中、形式和功能似乎几乎相同的GroEL和hsp60。Neupert由此描述了以这些变性重组蛋白质与分离自细胞的大量热休克蛋白的体外接触为基础，对重组蛋白质折叠进行修饰的方法。
Berberian等人(美国专利5,348,945)描述了在施加应激的条件下提高细胞存活率的方法，这些方法包括将外源生成并纯化的热休克蛋白(诸如hsp70)在体外或在体内应用(即添加)于这些应激细胞。
Jacob等人(美国专利5,474,892)提出，通过大量添加某些热休克蛋白(诸如hsp90)可以在水溶液中稳定某些蛋白质。Jacob等人由此描述了通过这些变性蛋白质与大量分离并纯化的热休克蛋白的体外接触，用于修饰多种蛋白质和其它生物学物质的折叠的后加工方法。
Srivastava(美国专利5,750,119；美国专利5,830,464；美国专利5,837,251)提出，通过给哺乳动物接种得自某些肿瘤成分与多种组成型或外源应激蛋白的关联的抗原化合物，可抑制这些哺乳动物中的肿瘤增殖。Srivastava由此描述了用于使用多种肿瘤标本分离或配制这些应激蛋白/肿瘤复合物，并随后给哺乳动物患者接种这些制剂以刺激这些患者体内的抗肿瘤应答的方法。
Liu等人(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)13：30704，1998)描述了关于几种热休克蛋白(诸如hsp40和hsp70)在增强蛋白质功能中的作用的研究。据报道，在体外向变性蛋白质中添加外源生成并纯化的热休克蛋白，导致蛋白质功能增强。还注意到了hsp40与hsp70的共侣伴作用。
将关于应激蛋白质功能的其它有关参考文献收入本文作为参考，包括：
McGuire等人(美国专利5,188,964和美国专利5,447,843)描述了在肿瘤组织中存在的多种组成型产生应激蛋白(包括热休克蛋白hsp27、hsp70、和hsp90，以及葡萄糖调控蛋白grp78和grp94)水平的测量，和这些测量法作为这些肿瘤复发可能性的预测方法的应用。
Williams等人(临床研究杂志(J.Clin.Invest.)92：503，1993)描述了通过转染hsp70基因，用于可能保护细胞和组织免受多种代谢压力(诸如局部缺血)的方法。具体而言，引入小鼠细胞的组成型表达的人hsp70提高了这些修饰细胞在应用代谢应激后的存活率。然而，由于持续表达代谢负担，这些组成型基因的添加确实显得消极影响细胞增殖，甚至在无应激条件下也是如此。
Vasconcelos等人(病毒遗传学(J.Gen.Virol.)79：1769，1998)描述了在用HMV感染许可性Vero细胞系导致瞬时形成大噬斑表型HMV变体之前，诱导组成型应激蛋白表达提高的方法。发现，施加应激12小时后(选择这种时间间隔是为了使细胞恢复正常的生理学能力，同时假设在这种时间间隔内维持诱导的热休克蛋白水平)感染的细胞展示HMV生成水平略微提高(特征为病毒滴度升高达4倍)。
Vasconcelos等人(病毒遗传学(J.Gen.Virol.)79：2239，1998)描述了通过用编码组成型hsp72表达的载体转染许可性细胞系(诸如人星细胞瘤细胞)，瞬时提高应激蛋白表达的其它方法。用HMV感染后，展示摄入hsp72基因的克隆细胞系显示病毒滴度有所升高。然而，这些克隆细胞系不展示永久修饰，却展示自发退化成野生型形式的显著趋势。此外，未提出用于控制组成型hsp72基因表达的方法，导致修饰的细胞系持续表达。此工作中产生的克隆细胞的适用性限制于HMV-用于产生其它病毒产物(例如CDV)的尝试未获成功。联系修饰的瞬时特性，这暗示了这种方法的有限适用性。
Yokoyama等人(美国专利5,827,712)描述了用于在经修饰(通过转染)或选择用于组成型过度表达某些侣伴蛋白(包括DnaJ和DnaK)的大肠杆菌中提高转谷氨酰胺酶(TG)重组产物产量的方法。这种过度表达用于稳定和溶解功能重组TG。修饰方法包括将应激蛋白载体和TG载体与大肠杆菌一起温育，将联合的应激蛋白载体/TG载体与大肠杆菌一起温育，和将TG载体与展示组成型过度表达应激蛋白的大肠杆菌菌株一起温育。值得注意的是，这些方法有可能产生瞬时修饰，其中这些应激蛋白持续生成，并由于持续表达应激蛋白的代谢负担，消极影响细胞增殖。
现有技术的这些范例清楚确定了多种应激蛋白(诸如hsp27、hsp40、hsp60、hsp70(包括hsp72和hsp73)、hsp90、GroEL、GroES、GrpE、grp78、grp94、DnaJ和DnaK)作为辅助物提高功能性生物学物质(诸如蛋白质、病毒剂、或其它生物学因子或产物，包括酶、激素、生长因子、结构蛋白、和肿瘤抑制剂)的产量和稳定性的作用和效用。然而，这些范例中所教导的方法和概念，包括用于添加外源产生的应激蛋白和用于诱导瞬时组成型生成这些蛋白质的方法，其不足以有效且灵活的提高多种生物学因子或产物的常规生产产量，也不足以有效的发现新的生物学因子或产物。例如，制造并纯化有用量的应激蛋白用于添加或修饰产物，将通常过于费时费钱。此外，除非掺入合适的控制元件，否则用编码组成型生成应激蛋白的应激蛋白表达载体转染细胞，将导致这些细胞时刻生成这些应激蛋白，与这些细胞生成期望生物学产物发生竞争。因此，需要更有效的新方法用于控制这些应激蛋白的能力和应用。
                     发明概述
本发明致力于用于在功能性生物学物质(诸如蛋白质、病毒剂、或其它生物学因子或产物，包括，但不限于，酶、激素、生长因子、结构蛋白、肿瘤抑制剂、核酸和核酸探针、疫苗、抗原、抗生素、脂质、简单和复杂的碳水化合物、醇类和其它溶剂、以及这些方法的产品)的生产和稳定中控制应激蛋白的能力和应用的更有效的新方法。本发明关于应激蛋白的范例包括，但不限于，hsp27、hsp40、hsp60、hsp70(包括hsp72和hsp73)、hsp90、GroEL、GroES、GrpE、grp78、grp94、DnaJ、和DnaK。在本发明一个实施方案中，与向细胞中添加hsp相反，本发明使细胞生成这些hsp。
本发明具体的优选实施方案包括通过选择性诱导这些应激蛋白的组成型表达，或者通过将这些应激蛋白基因瞬时或永久导入原核或真核细胞或细胞系，用于使多种非许可性细胞系变成许可性的，用于提高多种生物学产品的产量，或用于发现并生产多种未知感染性因子的方法。
例如，带有这些细胞或细胞系的这些实施方案的应用引起原核或真核细胞系中的重组产物产量显著提高。这是令人惊讶的，因为从直觉上预测，在生产过程中增加细胞压力将导致生产力的下降。然而，本发明的发明人发现，通过用某些特殊方法对细胞施加应激或以其它方法诱导细胞应激反应，由此导致应激蛋白基因的受控表达，可提高功能性生物学产品的产量。
本发明致力于这些方法并包括本文具体例示的5个优选实施方案。然而，本发明并不限于这5个实施方案的细节，而包括本发明精神和范围之内的更改和替代，以及本领域技术熟练技术人员参照此说明显而易见的其它实施方案。
在第一个优选实施方案中，使用真核细胞系的瞬时应激来提高病毒滴度。对许可性真核细胞施加瞬时应激足以刺激一种或多种应激蛋白的生成的一段时间。在施加应激后，添加预期病毒原液以感染该应激的真核细胞。感染后温育一段时间，然后收获产生的上清液，其中含有期望的病毒诱导产物。
在第二个优选实施方案中，通过游离型(episomal)插入应激蛋白表达载体对真核细胞系进行瞬时遗传修饰，随后选择一个或多个展示表达载体永久插入宿主DNA的这些修饰的细胞系子集，用来产生展示永久遗传修饰的细胞系。这些细胞系可用于提高期望病毒或病毒产物的产量。
在第三个优选实施方案中，通过将应激蛋白表达载体插入非许可性真核细胞系中，产生新的许可性真核细胞系。然后，将新的许可性细胞系用于有效生产病毒剂，即用感染性或潜在感染性物质接种细胞系，随后温育并收获由此产生的病毒或病毒产物。这些细胞系优选用于促进以前难以培养和从未培养过的神经剂的复制。因此，这些细胞系既可用作病毒猎人，又可用于生产或制造有用量的介质。
在第四个优选实施方案中，通过将一种或多种应激蛋白表达载体插入经遗传工程改造的原核细胞系中，提高这些细胞系生产功能性重组产物的产量。优选的是，选择并使用重组细胞。但是，也可选择克隆细胞。更优选的是，这些插入的应激蛋白表达载体包含一种或多种可诱导启动子。或者，可使用组成型启动子。这些应激蛋白表达载体在这些细胞系中的表达(或通过诱导或通过组成型表达)导致一种或多种所编码应激蛋白的生成，这些表达的应激蛋白由此有助于提高功能性重组产物的产量。
在第五个优选实施方案中，通过将一种或多种应激蛋白表达载体插入经遗传工程改造的真核细胞系中，提高这些细胞系生产功能性重组产物的产量。可在为了生成期望重组产物而遗传修饰的细胞系之前或之后进行这种插入。优选的是，这些应激蛋白表达载体包含一种或多种可诱导启动子。或者，可使用组成型启动子。
               附图概述
在描述优选实施方案时提到了下列附图：
图1是根据本发明对许可性真核细胞系施加瞬时应激来提高病毒滴度的应用的示意图；
图2是根据本发明通过瞬时遗传修饰对许可性真核细胞系进行永久遗传修饰的示意图；
图3是根据本发明用于产生新的许可性真核细胞系的方法的示意图；
图4a是根据本发明用于提高经遗传工程改造的原核细胞系中重组产物产量的方法的示意图；和
图4b是根据本发明用于提高经遗传工程改造的原核细胞系中重组产物产量的另一方法的示意图。
              目前优选的实施方案的详述
本发明致力于用于提高病毒剂的产量、产生展示永久性遗传修饰的细胞系、产生许可性真核细胞系、和提高功能性重组产物产量的方法，以及这些方法的产品，如下文实施方案和实施例所示，它们并非意欲限制本发明，而只是作为例示。第一个优选实施方案
用于生产期望病毒或病毒产物的许可性真核细胞的生产力通常可能不足。然而，本发明的发明人发现，如图1和此实施方案所示，通过应用瞬时应激可瞬时提高这些细胞系的生产力。
一般而言，在此实施方案中，对真核细胞系施加瞬时应激以提高病毒滴度。具体而言，使用传统选择方法选择期望病毒的许可性真核细胞。在标准条件下培养这些细胞至近乎汇合，然后施加瞬时应激，其时间足以刺激一种或多种应激蛋白的生成。可应用的应激因素包括热应激(诸如升高或降低温育温度)、化学应激(诸如升高或降低pH)、氧化水平应激(诸如升高或降低O2水平)、营养素更改(诸如减少或增加必需培养基成分)、和可诱导瞬时应激并导致应激蛋白表达的任何其它这类因素(诸如暴露于有毒物质)。在施加这类应激后，加入期望病毒的原液以感染应激真核细胞。优选的是，以多次感染0.001-1000病毒体/细胞(或更优选1-4病毒体/细胞)进行此加入步骤，且在施加应激后0-12小时(或更优选施加应激后立即)进行此加入步骤。感染后温育一段时间，然后收获产生的上清液，其中包含期望的病毒诱导产物。优选的是，在转染后温育1-2或更长时间(或更优选感染后5天)进行此收获步骤。实施例1.对真核细胞系施加瞬时应激以提高病毒滴度
实施例1例示了第一个实施方案的范例。然而，本发明和第一个实施方案不限于实施例1的细节。
选择期望病毒(诸如犬瘟热病毒、水貂瘟热病毒、或人麻疹病毒)的许可性真核细胞(诸如Vero细胞或其它许可性真核细胞系)。这些细胞允许的其它病毒包括，但不限于，狂犬病病毒、细小病毒、马立克氏病毒、HIV、HTLV、HSV、和冠形病毒。在标准条件(诸如37℃、5％CO2)下培养这些细胞至大约90％(或更多)汇合。然后对细胞施加瞬时应激达几小时，例如通过于43℃、无CO2温育，由此在培养物中产生过热碱性条件。将此瞬时应激理想地应用大约1-5小时。由此在这些细胞中诱导多种应激蛋白(诸如hsp70)的产量提高。若随后用病毒感染这些细胞，则升高的应激蛋白水平将用来稳定并提高这些应激细胞的病毒诱导蛋白质的产量(见例如表3)。
可根据两种相关因素：细胞生存力和病毒滴度为具体的细胞/病毒系统确定最佳应激条件。虽然瞬时应激的应用通常降低细胞生存力(在应激时期存活的细胞部分)，这类应激的应用通常提高应激蛋白的产量(由细胞产生的平均蛋白质相对量)。因此，当细胞生存力展示最小降低而应激蛋白产量展示蛋白质表达显著增加时，存在最佳应激条件。在此之后，降低的生存力可消极影响全面产量，因为生产性细胞数目的显著损失可降低培养物的全面蛋白质生产能力。例如，表1比较了Vero细胞在多种应激条件下的生存力。表2比较了CDV感染的Vero细胞在例示应激条件下的蛋白质产量。
在下文表1中，使用中性红染色，随后测量产生的样品在570nm处的吸光率，由此评价了Vero细胞培养物的生存力。相对生存力(未规格化)以吸光率单位表述，对应于应用瞬时应激后存活细胞的大致水平。测试条件包括在碱性条件(无CO2)下将细胞培养物暴露于指定温度指定时间。
    表1.瞬时应激的严重程度和持续时间对细胞生存力的影响
       测试条件 相对生存力
稳定温度 持续时间 A570nm
 37℃ 1.5小时 0.25±0.03
 37℃ 3小时 0.23±0.03
 37℃ 5小时 0.21±0.03
 40℃ 1.5小时 0.25±0.10
 40℃ 3小时 0.22±0.03
 40℃ 5小时 0.19±0.09
 43℃ 1.5小时 0.21±0.03
 43℃ 3小时 0.18±0.03
 43℃ 5小时 0.13±0.03
在下文表2中，将指定应激条件应用于Vero细胞培养物达2小时，随后直接用CDV感染。在此瞬时应激时期后在标准条件(37℃、5％CO2)下温育感染细胞培养物。通过在包含新鲜汇合Vero培养物的96孔板中系列稀释(每步10x稀释)收获的上清液来测定滴度。然后将这些感染样品温育4小时，随后用中性缓冲的福尔马林固定。然后用缀合荧光素的抗CDV抗体染色产生的固定化细胞，并通过细胞荧光光度术读数。滴度结果表示导致阳性病毒感染的稀释步骤次数。
    表2.瞬时应激对病毒产物产量的影响
测试条件 log10(病毒滴度)
 37℃+碱性(pH7.6) 3
 40℃+碱性(pH7.6) 5
 43℃+碱性(pH7.6) 8
表1和表2所示实施例结果比较指出，于43℃时Vero细胞中的病毒滴度相对于较弱应激培养条件显著增加，而且在这些条件下暴露3小时或更短时间不显著削弱测试培养物的生存力。因此，对于这种细胞/病毒组合，最佳条件大致是紧临病毒感染前于43℃、0％CO2施加应激2小时。另外，通过更详细的评价多种应激条件，不具体限于本文所述条件或范围，有可能精炼这些条件。此外，对于其它细胞/病毒组合，将有可能最优化其它参数。然而，这些实施例清楚示范了用于这种最优化的一般方法。使用这种方法，熟练的专业人员可容易的确定用于具体细胞/病毒组合的最佳条件。
最理想的是，在应激期后立即向细胞中加入期望病毒原液(如CDV)，但是可在应激后24小时或更长时间感染这些细胞。以多次感染(MOI)0.001-1000病毒体/细胞或更优选1-4病毒体/细胞加入病毒原液，后一种水平是更理想的。可根据细胞系和生成的病毒改变MOI。在最终的温育期后，最理想的是在感染后几天收获上清液。对于用CDV感染的Vero细胞，最理想的是在感染后5天进行收获，但是在有些条件下，可能需要1-21天或者更长时间。通过测量病毒滴度，作为收获时间的函数，可确定最佳条件。如表3所示，由此产生的病毒滴度将增加10-100倍甚至更多(例如，由大约105的最初滴度升高至107-8的滴度)。在下文表3中，通过在碱性条件下(无CO2)将温度升高至43℃，在CDV感染前2小时对Vero细胞培养物施加应激。在这个瞬时应激期后，于37℃、5％CO2维持感染培养物。对照条件：于37℃、5％CO2维持未施加应激的培养物。以上文表2所示方式获得滴度结果。
    表3.由瞬时应激产生的CDV滴度
感染条件 log10(病毒滴度)
对照(未施加应激) 4.7
施加应激后0小时 8.5
施加应激后2小时 7
施加应激后6小时 7
施加应激后12小时 5
第二个优选实施方案
通常，用于生成期望病毒或病毒产物的许可性真核细胞(诸如Vero细胞或其它许可性真核细胞系)的生产力不足。然而，本发明的发明人发现，如图2和此实施方案所示，可遗传修饰这些细胞以提高期望病毒感染后的产量。
在此实施方案中，如图2所示，通过应激蛋白病毒载体的游离型插入，及随后选择展示表达载体永久插入宿主DNA的一个或多个修饰的细胞系(由应激蛋白病毒载体的插入产生)子集，由此使用真核细胞系的瞬时遗传修饰来生成展示永久遗传修饰的细胞系。
更具体的说，使用传统选择方法选择期望病毒的许可性真核细胞，并在标准条件下培养这些细胞至近乎汇合。通过混和应激蛋白表达载体与脂质/磷脂制剂以产生含大约0.01-100μg载体/104-106靶细胞的转染剂，由此制备用于这些细胞的DNA转染剂。优选的是，这种脂质/磷脂制剂包括阳离子脂质或磷脂，更优选的是，包括二油酰缩醛磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidalethanolamine)。然后将这种转染剂投递至许可性细胞培养物，使转染得以发生。转染后，将细胞在新鲜培养基中温育。为了提高转染率，可随后重复转染步骤。然后通过选择展示高产量表达转染的应激蛋白且增殖期望病毒的能力提高的细胞系，纯化产生的遗传异源细胞培养物。通过选择展示表达载体自发重组至宿主DNA中的细胞系，由这一部分进行进一步纯化。展示这种重组的细胞系由此是永久遗传修饰的，并保存用于重组蛋白质或病毒生产。实施例2.经瞬时遗传修饰的许可性真核细胞系的永久遗传修饰
实施例2例示了第二个实施方案的范例。然而，本发明和第二个实施方案不限于实施例2的细节。
选择期望病毒的许可性真核细胞，并在标准条件(诸如37℃、5％CO2)下培养至大约90％(或更多)汇合。
通过混和应激蛋白表达载体(诸如病毒、粘粒、质粒、噬菌体、转座子、或可插入真核细胞DNA并由此在转染这些细胞后增加真核细胞的应激蛋白表达的任何其它可遗传载体，包括DNA或RNA)与脂质/磷脂制剂以产生含大约0.01-100μg载体/104-106靶细胞的转染剂，由此制备用于这些真核细胞的DNA转染剂。如上所述，优选的是，这种脂质/磷脂制剂包括阳离子脂质或磷脂，更优选的是，包括二油酰缩醛磷脂酰乙醇胺。然而，可与一种或多种阳离子脂质联合使用任何其它相容磷脂。然后在无血清培养基中稀释这种转染剂，并在许可性真核细胞上温育10-60分钟或更长时间，使转染得以发生。然后由细胞培养物除去上清液，并加入新鲜培养基，诸如浓度为大约10％(v/v)的胎牛血清。然后将此培养物温育几个小时或更长时间，诸如过夜。最后，为了进一步提高转染率，可在24-48小时后重复这一脂质转染步骤。脂质转染是用于诱导应激蛋白表达载体(例如用于表达hsp70、hsp90、或其它应激蛋白或陪伴蛋白)最佳方法，但是也可使用其它标准技术，像电穿孔。也可使用病毒插入型载体的遗传修饰。
上述转染方法产生了遗传异源细胞培养物，其中一部分细胞经历瞬时遗传修饰(应激蛋白表达载体染色体外插入细胞而没有显著的该载体自发重组进入细胞遗传物质)。这种培养物将展示瞬时遗传修饰(特征为游离型载体的表达)，但是通常不会有显著部分的细胞展示永久修饰。既然游离型载体不掺入宿主细胞遗传物质，那么这种培养物可通过逐出这种游离型遗传物质而自发回复成未感染形式。
因此，为了获得展示永久修饰的稳定培养物，必需选择并增殖这些细胞的子集。例如，转染细胞可能由于瞬时遗传修饰而展示瞬时、高产量的应激蛋白(诸如hsp70)表达。若将转染细胞培养物胰酶消化，则可在例如96孔培养板中系列稀释释放细胞至消失。收获在接近消失点的孔中出现的细胞培养物，它们被认为是纯系的。然后测试这些遗传修饰细胞提高病毒水平的能力(例如如实施例1所述)并测量提高的应激蛋白表达(例如使用用于测定具体应激蛋白(诸如hsp70)表达水平的标准酶联免疫吸收测定法(ELISA))。然后使用标准测定法(诸如用于分离核酸的凝胶电泳及随后的Southern印迹测定法)对通过这些测试的细胞系探查表达载体经自发重组事件插入宿主DNA的情况。注意这种插入是以大约1个重组事件/1×103细胞分裂的比率自发发生的。然而，根据使用的具体载体和细胞系，重组效率可能低得多，并由此可能必需额外的选择步骤。可保存展示稳定插入宿主细胞遗传物质并由此永久遗传修饰的重组细胞系，作为重组蛋白质或病毒生产系。作为掺入应激蛋白基因和应激蛋白生成相称的改进的结果，这种细胞系将在期望病毒或病毒产物的产量中展示期望改进。第三个优选实施方案
通常，生产期望介质(诸如病毒或病毒产物)必需的许可性真核细胞的生产力不存在或不足。例如，培养影响中枢神经系统的因子可能是非常困难的，因为很少的细胞允许这种因子。具体而言，因为缺乏适当的许可性细胞系，诸如克雅病因子、瘙痒病、Kuru(苦鲁病，新几内亚震颤病)、狂犬病、和牛海绵状脑病(nvCJD)等因子难以或者不可能在体外培养。因此，需要产生用于这类因子的允许细胞系的新方法。
在此实施方案中，遗传修饰非许可性真核细胞变成许可性的，而且通过将应激蛋白表达载体插入非许可性真核细胞系来实现新的许可性真核细胞系的产生。然后通过用感染性或潜在感染性物质接种细胞系，随后温育并收获由此产生的病毒或病毒产物，由此将新的许可性细胞系用于有效地生产病毒剂。这种细胞系优选用于促进难以培养的神经许可性和以前从未培养过的介质的复制。因此，这种细胞系既可作为病毒猎人使用，又可用于生产或制造有用量的介质。实施例3.新的许可性细胞系的产生
实施例3例示了第三个实施方案的范例。然而，本发明和第三个实施方案不限于实施例3的细节。
在此实施例中，如图3所示，遗传修饰非许可性真核细胞(诸如昆虫细胞)变成对期望病毒许可性的。如实施例2所述，可用应激蛋白表达载体转染神经细胞系(诸如成神经细胞瘤、星细胞瘤、或成视网膜细胞瘤细胞系)。由此产生可有效生产病毒剂的新细胞系。在这种方法中优选的是，选择重组细胞系用于随后应用。或者，也可使用克隆细胞系。然后用感染性或潜在感染性物质(诸如已知或怀疑含有感染性介质的动物废弃物)接种这些遗传修饰的细胞系。这种细胞系将促进难以培养的神经因子(像狂犬病)和以前从未培养过的因子(例如nvCJD)的复制，而且既可作为病毒猎人使用(用于生产可表征量的可疑感染性因子)，又可用于制造大量的因子(例如生产新疫苗)。表4显示了由非允许细胞系产生新的许可性细胞系的范例。
在下文表4中，显示了在天然(未处理)的非许可性细胞系(A细胞系，成神经细胞瘤；B细胞系，成视网膜细胞瘤)中与在经处理插入hsp70应激蛋白表达载体的相同细胞系中产生的人麻疹病毒(HMV)滴度的比较结果。处理后滴度的升高指示这些细胞对HMV的允许程度显著提高。在多种细胞系中滴度的提高指示这种方法对多种候选细胞系和感染性因子的普遍适用性。
    表4.插入应激蛋白表达载体对病毒滴度的影响
细胞系 处理 log10(病毒滴度)
 A 否 1.10
 A 是 6.70
 B 否 1.60
 B 是 6.30
第四个优选实施方案
原核细胞系常常用于经重组方法生产蛋白质或其它生物学物质，即将编码用于生成期望产物的遗传物质引入细胞系，导致由原核细胞生成期望产物。例如，可使用经遗传过程改造的细菌生产人胰岛素，即通过引入编码用于生成期望胰岛素蛋白质的必需人类基因。不幸的是，这种重组产物常常不能展示与组成型生成物质(即经天然方法生成的物质)相同的生物学功能。这常常是重组生成过程中不完全或不正确折叠(或影响构象的其它相似因素中的变化)的结果。折叠或构象中的这种变化常常导致变性蛋白质，消极影响产物的正确功能。因此，需要用于提高功能性重组产物的方法。
在此实施方案中，通过将一种或多种应激蛋白表达载体插入细胞系，提高了经遗传工程改造的原核细胞系的功能性重组产物产量。优选的是，选择重组细胞用于随后的应用。或者，也可使用克隆细胞系。更优选的是，这种插入应激蛋白表达载体包含一种或多种可诱导启动子。或者，可使用组成型启动子。这种应激蛋白表达载体在这种细胞系中的表达，或是通过诱导方法或是通过组成型方法，导致一种或多种所编码的应激蛋白的生成，其中表达的这种应激蛋白由此有助于提高功能性重组产物的产量。这种提高最理想的是通过插入及随后诱导合适应激蛋白表达载体实现的，诸如hsp70或hsp90，但是也可应用任何其它应激蛋白表达载体。这种插入最理想的是通过转染实现的。然而，也可使用电穿孔或其它类似技术，以及经暴露于一种或多种病毒插入载体的细胞系感染。这种提高方法可用于提高先前修饰的细胞系的功能产物产量，诸如经修饰生成人胰岛素的细胞系。或者，可修饰早就展示导致或促进一种或多种应激蛋白生成的稳定插入的原核细胞，用于生成病毒或其它重组产物，诸如蛋白质、酶、胰岛素、或其它期望的生物学产物。实施例4.提高原核细胞系的重组产物产量
实施例例示了第四个实施方案的范例。然而，本发明和第四个实施方案不限于实施例4的细节。
正如此实施方案和实施例所示，本发明的发明人发现了用于提高功能性重组产物产量的方法，包括在原核细胞系中诱导一种或多种应激蛋白，诱导的应激蛋白有助于重组产物的正确折叠或其它构象变化，由此导致功能性重组产物产量的提高。这种诱导最理想的可通过将合适的应激蛋白表达载体(诸如hsp70或hsp90)插入重组原核细胞系(诸如经遗传工程改造的大肠杆菌)来实现。这种插入最理想的是通过转染实现的。或者，也可使用电穿孔或其它类似技术。图4a和4b例示了这种通用方法。注意，也可使用多种病毒插入载体来插入用于编码或促进应激蛋白生成的期望遗传元件。如图4a所示，应激蛋白表达载体的插入可导致应激蛋白表达载体重组插入宿主遗传物质；或者如图4b所示的游离型插入。然后使用标准流程筛选产生的转染细胞，以选择展示高水平应激蛋白表达的那些细胞。如图4a所示，使用与用于真核细胞系可比的方法，诸如实施例2中所述，选择稳定插入宿主遗传物质的重组细胞系。或者，如图4b所示，可使用展示游离型插入的克隆。以这种方式可以将应激蛋白表达载体插入先前修饰的细胞系，诸如经修饰生成人胰岛素的细胞系。或者，可修饰早就展示导致或促进一种或多种应激蛋白生成的稳定插入的原核细胞，用于生成病毒或其它重组产物，诸如蛋白质、酶、胰岛素、或其它期望的生物学产物。
在图4a和4b所示实施例中优选的是应激蛋白表达载体包含一种或多种可诱导启动子。或者，可使用组成型启动子。更期望可诱导启动子，因为它们使细胞得以增殖至高水平而不展示所插入的应激蛋白表达载体的显著表达(这种表达往往与期望重组产物的表达竞争)。一旦这种细胞系达到期望水平的重组产物生成，可通过诱导可诱导应激蛋白表达载体使细胞系的生成改向至应激蛋白，由此确保重组产物生成水平与功能产物产量中的最佳效率。可诱导启动子的范例包括，但不限于，β-半乳糖苷酶启动子、逆转录病毒类固醇敏感启动子、和重金属可诱导启动子。相反，若使用组成型启动子，则细胞系往往将显著部分的生成能力投入于持续的或几乎持续的应激蛋白生成。这种生成将产生高比例的功能产物，但是往往与最佳细胞系增殖和重组产物总产量水平竞争。第五个优选实施方案
真核细胞系可用于经重组方法生产期望蛋白质或其它生物学物质或产物，即将编码用于生成期望产物的遗传物质引入细胞系，导致由真核细胞生成期望产物。例如，可使用经遗传过程改造的真核细胞系生产人血管发生阻断肽，即通过引入编码用于生成期望产物的必需人类基因。不幸的是，这种重组方法常常不能产生具有期望产量或可接受量的期望产物。此外，这种产物可能不能展示与组成型生成物质相同的生物学功能。因此，需要用于提高功能性重组产物的生成水平或产量的方法。
在此实施方案中，通过将一种或多种应激蛋白表达载体插入细胞系，提高了经遗传工程改造的真核细胞系的功能性重组产物产量。可在遗传修饰的细胞系以生成期望重组产物之前或之后进行这种插入。优选的是，这种应激蛋白表达载体包含一种或多种可诱导启动子。或者，可使用组成型启动子。实施例5.提高真核细胞系的重组产物产量
实施例例示了第五个实施方案的范例。然而，本发明和第五个实施方案不限于实施例5的细节。
正如此实施方案和实施例所示，本发明的发明人发现了用于提高功能性重组产物产量的方法，包括在真核细胞系中诱导一种或多种应激蛋白，诱导的应激蛋白有助于重组产物的正确折叠或其它构象变化，由此导致功能性重组产物产量的提高。例如，可以在用编码用于生成应激蛋白的应激蛋白表达载体遗传修饰的细胞系之前或之后，将用于生成期望生物学产物(诸如阻断或增强血管发生的肽序列)的表达载体插入真核细胞系(转染哺乳动物、昆虫、或其它细胞系，更优选S-9昆虫细胞系)。通过实施例2所述方法进行应激蛋白表达载体(诸如hsp70或hsp90)的这种修饰。这种应激蛋白表达载体可优选包含一种或多种可诱导启动子。或者可使用组成型启动子。由此诱导的应激蛋白(作为这种修饰的结果)有助于提高期望重组产物的产量和稳定性。最理想的是，将这种流程用于生成一种或多种肽，但是也可用于内部稳定合成和装配非肽产物或其它生物学物质(诸如诊断性核酸探针、疫苗、抗原、酶、激素、生长因子、结构蛋白、肿瘤抑制物、介质、抗生素、脂质、核酸、简单和复杂的碳水化合物、醇类、和其它溶剂)所需蛋白质。
只是为了例示目的而提高此描述，而非意欲限制本申请的发明。
要求受到专利保护的新的且期望的内容列于所附权利要求。

Claims (68)

1.一种用于提高病毒剂产量的方法，所述方法包括下列步骤：
选择并增殖许可性真核细胞；
对所述细胞瞬时施加应激一段时间以产生展示至少一种应激蛋白产量提高的应激真核细胞；
引入病毒原液感染所述应激真核细胞；
将所述感染的应激真核细胞温育；并
收获由所述感染的应激真核细胞生成的病毒剂。
2.权利要求1的方法，其中所述瞬时应激该细胞的步骤是通过选自下组的应激而诱导的：热应激、化学应激、氧化水平应激、营养素更改、和毒性应激。
3.权利要求1的方法，其中所述瞬时应激该细胞的步骤是通过于43℃、无CO2下对细胞施加应激而进行的。
4.权利要求1的方法，其中所述瞬时应激该细胞的步骤进行大约1-5小时。
5.权利要求1的方法，其中所述瞬时应激该细胞的步骤是于大约43℃、大约0％CO2下对Vero细胞进行大约1-3小时。
6.权利要求1的方法，其中所述应激蛋白选自：hsp27、hsp40、hsp60、hsp70、hsp72、hsp73、hsp90、GroEL、GroES、GrpE、grp78、grp94、DnaJ、和Dnak。
7.权利要求1的方法，其中所述许可性真核细胞是Vero细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述病毒原液是多次以每细胞感染0.001-1000个病毒体而引入的。
9.权利要求8的方法，其中所述病毒原液是多次以每细胞感染1-4个病毒体而引入的。
10.权利要求1的方法，其中所述导入病毒原液的步骤是在所述瞬时应激该细胞的步骤之后进行长达大约24小时。
11.权利要求10的方法，其中所述瞬时应激该细胞的步骤是在所述瞬时应激该细胞的步骤之后立即进行的。
12.权利要求1的方法，其中产生的病毒剂是在感染后大约1-21天收获的。
13.权利要求1的方法，其中产生的病毒剂是在感染后大约5天收获的。
14.权利要求1的方法，其中用于收获产生的病毒剂的最佳条件是通过测量作为收获时间函数的病毒滴度而确定的。
15.权利要求1的方法，其中所述病毒剂选自：犬瘟热病毒、水貂瘟热病毒、人麻疹病毒、狂犬病病毒、细小病毒、马立克氏病毒、HIV、HTLV、HSV、冠形病毒、和牛白血病病毒。
16.一种用于产生展示永久遗传修饰的细胞系的方法，所述方法包括下列步骤：
选择并增殖许可性真核细胞；
向所述许可性真核细胞引入转染剂以产生转染的真核细胞；
将所述转染的真核细胞温育；并
由所述转染的真核细胞选择至少一种展示高产量表达蛋白质的一级细胞系，其中表达的蛋白质作为所述转染剂转染的结果。
17.权利要求16的方法，其中至少一种二级细胞系是由所述至少一种一级细胞系产生，方法是通过选择展示应激蛋白表达载体自发重组进入宿主DNA的一部分所述一级细胞系。
18.权利要求16的方法，其中所述转染剂是DNA转染剂。
19.权利要求16的方法，其中所述转染剂是由应激蛋白表达载体与至少一种脂质或磷脂形成的。
20.权利要求16的方法，其中所述转染剂具有大约0.01-100μg载体/104-106靶细胞的浓度。
21.权利要求16的方法，其中所述应激蛋白表达载体选自：病毒、粘粒、质粒、噬菌体、转座子、和能够插入真核细胞DNA的其它核酸。
22.权利要求19的方法，其中所述脂质或磷脂包括选自阳离子脂质的脂质和磷脂。
23.权利要求19的方法，其中所述脂质或磷脂包括二油酰缩醛磷脂酰乙醇胺。
24.权利要求16的方法，其中所述转染的真核细胞温育大约10-60分钟。
25.权利要求16的方法，还包括由所述转染的真核细胞除去上清液并加入新鲜培养基，和再次温育所述转染的真核细胞的步骤。
26.权利要求25的方法，其中所述新鲜培养基是浓度为大约10％(v/v)的胎牛血清。
27.权利要求25的方法，其中所述再次温育进行几个小时。
28.权利要求16的方法，其中所述引入转染剂的步骤重复进行。
29.权利要求19的方法，其中所述应激蛋白表达载体选自：hsp70、hsp72、hsp73、hsp90、GroEL、GroES、GrpE、grp78、grp94、DnaJ、和Dnak。
30.一种用于产生许可性真核细胞系的方法，所述方法包括下列步骤：
将应激蛋白表达载体插入非许可性真核细胞系以产生至少一种许可性真核细胞系；并
由所述许可性真核细胞系选择至少一种一级细胞系。
31.权利要求30的方法，其中所述至少一种所选的一级细胞系用于生产病毒剂，且所述方法还包括下列步骤：
向所选的细胞系中引入感染性物质以产生至少一种感染的许可性真核细胞系；
将所述至少一种感染的细胞系温育；并
由所述感染的细胞系收获至少一种产生的病毒剂。
32.权利要求31的方法，其中所述生产是用于发现至少一种未知病毒剂。
33.权利要求30的方法，其中所述非许可性真核细胞系选自：成神经细胞瘤、星形细胞瘤、和成视网膜细胞瘤细胞系。
34.权利要求30的方法，其中所述的插入步骤是通过转染进行的。
35.权利要求30的方法，其中所述应激蛋白表达载体选自：hsp70、hsp72、hsp73、hsp90、GroEL、GroES、GrpE、grp78、grp94、DnaJ、和Dnak。
36.权利要求30的方法，其中所述至少一种许可性真核细胞系对于所述应激蛋白表达载体而言是重组的。
37.权利要求30的方法，其中所述至少一种许可性真核细胞系对于所述应激蛋白表达载体而言是克隆的。
38.权利要求31的方法，其中所述感染性物质是含有感染剂的动物废弃物。
39.一种用于提高功能性重组产物产量的方法，其中事先已将遗传物质引入原核细胞系以形成所述重组产物，所述方法包括下列步骤：
将至少一种应激蛋白表达载体插入所述原核细胞系以形成修饰的细胞系；并
由所述修饰的细胞系选择至少一种展示期望的功能性重组产物产量提高的一级细胞系。
40.权利要求39的方法，其中通过选择展示应激蛋白表达载体自发重组进入宿主DNA的一部分所述一级细胞系，从所述一级细胞系中产生至少一种二级细胞系。
41.权利要求39的方法，其中所述至少一种应激蛋白表达载体包含至少一种可诱导启动子。
42.权利要求41的方法，其中所述可诱导启动子选自β-半乳糖苷酶启动子、逆转录病毒类固醇敏感启动子、和重金属可诱导启动子。
43.权利要求39的方法，其中所述至少一种应激蛋白表达载体包含组成型启动子。
44.权利要求39的方法，其中所述的插入步骤是通过选自下组的方法实现的：转染、电穿孔、和病毒插入载体。
45.权利要求39的方法，其中所述应激蛋白表达载体选自：hsp70、hsp72、hsp73、hsp90、GroEL、GroES、GrpE、grp78、grp94、DnaJ、和Dnak。
46.权利要求39的方法，其中所述原核细胞系是大肠杆菌。
47.权利要求39的方法，其中通过选择展示应激蛋白表达载体游离型插入宿主的一部分所述一级细胞系，从所述一级细胞系中产生至少一种二级细胞系。
48.一种用于提高功能性重组产物产量的方法，其中将编码这种产物的遗传物质引入展示应激蛋白表达提高的原核细胞系。
49.权利要求48的方法，其中所述表达是可诱导的。
50.权利要求48的方法，其中所述原核细胞系包含含有至少一种可诱导启动子的表达载体。
51.权利要求48的方法，其中所述表达是组成型的。
52.权利要求48的方法，其中所述原核细胞系包含含有至少一种组成型启动子的表达载体。
53.一种用于提高功能性重组产物产量的方法，所述方法包括下列步骤：
将至少一种应激蛋白表达载体插入真核细胞系以产生修饰的细胞系；
由所述修饰的细胞系选择至少一种展示期望的功能性重组产物产量提高的一级细胞系；
其中向所述真核细胞系中添加遗传物质以形成所述重组产物。
54.权利要求53的方法，其中所述向真核细胞系插入至少一种应激蛋白表达载体的步骤发生于向所述真核细胞系中添加所述遗传物质之后。
55.权利要求53的方法，其中所述向真核细胞系插入至少一种应激蛋白表达载体的步骤发生于向所述真核细胞系中添加所述遗传物质之前。
56.权利要求53的方法，其中通过选择展示应激蛋白表达载体自发重组进入宿主DNA的一部分所述一级细胞系，从所述一级细胞系中产生至少一种二级细胞系。
57.权利要求53的方法，其中所述应激蛋白表达载体包含至少一种可诱导启动子。
58.权利要求53的方法，其中所述应激蛋白表达载体包含组成型启动子。
59.权利要求53的方法，其中所述真核细胞系选自哺乳动物和昆虫细胞系。
60.权利要求53的方法，其中所述应激蛋白表达载体选自：hsp70、hsp72、hsp73、hsp90、GroEL、GroES、GrpE、grp78、grp94、DnaJ、和Dnak。
61.权利要求53的方法，其中所述方法用于生产选自下组的功能性重组产物：肽、蛋白质、诊断性核酸探针、疫苗、抗原、酶、激素、生长因子、结构蛋白、肿瘤抑制剂、抗生素、脂质、核酸、简单的碳水化合物、复杂的碳水化合物、醇类、和溶剂。
62.一种通过下列步骤产生的病毒剂：
选择并增殖许可性真核细胞系；
对所述细胞瞬时应激一段时间以产生展示至少一种应激蛋白产量提高的应激的真核细胞；
引入病毒原液感染所述应激的真核细胞；
将所述感染的应激真核细胞温育；并
收获由所述感染的应激真核细胞产生的病毒剂。
63.一种选择用于展示永久遗传修饰的细胞系，包括：
展示高产量表达转染的应激蛋白作为用一种或多种这种蛋白质表达载体转染的结果的许可性真核细胞系。
64.一种通过下列步骤产生的展示永久遗传修饰的细胞系：
选择并增殖许可性真核细胞；
向所述许可性真核细胞引入转染剂以产生转染的真核细胞；
将所述转染的真核细胞温育；并
由所述转染的真核细胞选择至少一种展示高产量表达应激蛋白作为所述转染的结果之一级细胞系。
65.一种许可性真核细胞系，包括：
已插入应激蛋白表达载体的非许可性真核细胞系。
66.一种由下列步骤产生的许可性真核细胞系：
将应激蛋白表达载体插入非许可性真核细胞系以形成至少一种许可性真核细胞系；并
选择所述许可性真核细胞系。
67.一种由下列步骤产生的功能性重组产物：
将编码用于表达所述重组产物的遗传物质引入原核细胞系；
将至少一种应激蛋白表达载体插入所述原核细胞系以形成修饰的细胞系；
由所述修饰的细胞系选择至少一种展示期望的功能性重组产物产量提高的一级细胞系；
增殖所述一级细胞系；并
收集由所述增殖的一级细胞系产生的功能性重组产物。
68.一种由下列步骤产生的功能性重组产物：
将至少一种应激蛋白表达载体插入真核细胞系以形成修饰的细胞系；
由所述修饰的细胞系选择至少一种展示期望的功能性重组产物产量提高的一级细胞系；
增殖所述一级细胞系；并
收集由所述增殖的一级细胞系产生的功能性重组产物。
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