KR20020028884A

KR20020028884A - 단백질 안정화 방법 및 이러한 안정화된 단백질의 제조에유용한 세포 계통의 제조방법

Info

Publication number: KR20020028884A
Application number: KR1020017015259A
Authority: KR
Inventors: 디스크라이그에이치.; 스몰릭존티.
Original assignee: 스무크 존; 포토겐, 인코포레이티드
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-18
Publication date: 2002-04-17
Also published as: US20010041361A1; US20010041354A1; US6541223B2; JP2003501014A; MXPA01012216A; AU4857000A; CN1359388A; WO2000073319A1; CA2372243A1; AR024122A1; EP1187841A4; US6495360B1; EP1187841A1; US6468777B2; BR0011046A; US20010044146A1; IL146711A0; US6451597B2

Abstract

본 발명은 스트레스 단백질과 단백질 생성물을 통하여 단백질 생성에 있어 안정화와 향상된 조절로써 바이러스, 바이러스성 단백질 및 이와 관련된 다른 생물학적 물질의 생성 수율을 증가시키는 방법과, 이러한 개선되고 안정화된 생성물의 수율을 세포 계통을 설계 또는 선발하기 위한 방법을 제공하며, 더욱 더 상세하게는 바이러스성 물질의 제조, 영구적인 유전자 변형을 나타내는 세포 계통의 제조, 허용가능한 진핵세포 계통의 제조, 재조합된 기능성 생성물 수율 등을 향상시킬 수 있는 방법과, 이러한 방법을 통해 얻어진 생성물에 관한 것이다.

Description

단백질 안정화 방법 및 이러한 안정화된 단백질의 제조에 유용한 세포 계통의 제조방법 {Method for enhanced protein stabilization and for production of cell lines useful for production of such stabilized proteins}

백신 및 진단 시약과 같은 약물의 제조에 유용한 바이러스, 바이러스성 항원, 및 다른 바이러스성 약물들은 매우 비싸고, 시간이 많이 소모되고, 고도의 기술적인 지식을 필요로 한다. 바이러스는 반드시 살아있는 진핵세포(eucaryoticcell)로 번식될 수 있어야 한다. 특정의 바이러스에 의해 감염될 수 있는 진핵세포는 그 바이러스에 대하여 "허용가능한(permissive)" 이라고 불려진다. 그러나 대부분의 진핵세포들은 어떠한 주어진 바이러스에 대해서도 자유스럽지 못하며, 이런 허용가능성을 예견할 수 있는 기술이 존재하지 않는다.

또한, 바이러스 제조용 자유로운 세포는 다른 수준의 허용가능성을 가지고 있을 수 있다. 어떤 세포 계통은 많은 양의 바이러스를 생산할 수 있는 반면, 몇몇은 낮은 수준의 바이러스 복제가 가능한 경우도 있다. 따라서, 바이러스 제조를 위한 최적의 세포를 결정하기 위하여 많은 세포 계통을 실험해야 되기 때문에 때로는 많은 시간의 소비와 실험적인 연구를 필요로 한다.

더욱이, 복잡한 문제에 있어서 최적의 세포계통은 얻어진 바이러스로부터의 호스트(host)(예를 들면, 인간에게 영향을 끼치는 바이러스는 인간 세포인 것처럼)로부터 얻어지는 것이 아닐 수도 있다. 종종, 적절한 세포계통은 특정한 호스트로부터 얻어진 바이러스로 존재하지 않는다.

세포 계통은 이들을 오랜 기간동안 실험에 의해 정의되어 온 안전성, 영속성(immortality), 알려진 특성 및 작용들 때문에 호스트로부터 일차적인 세포배양에 의한 것이 바람직하다. 바이러스 제조에 사용되는 세포 계통으로 사용하기 위해서는 다양한 바이러스를 제조하기 위하여 많은 수의 외래의 세포계통의 개발이 필요하다. 예를 들면, 개의 디스탬퍼 바이러스(Canine Distemper Virus, CDV), 홍역 바이러스(morbillivirus)는 베로 세포(Vero cells)(예를 들면, 비리칸 그린 멍키 키드니 세포(Virican Green Monkey kidney cells) 내에서 잘 자라지만, 개의 세포에서 번식된 것이 아니다. 반면 소의 루커미아 바이러스(Bovine Leukemia Virus, BLV)는 폐 조직으로부터 유도된 세포계통으로부터 생성된 것이다.

불행하게도, 호스트로부터 훨씬 많이 제거된 세포계통에서의 바이러스 번식과 감염된 조직은 이들의 정상의 작용으로부터 훨씬 많이 제거되는 양상으로 작용하기 때문에 이러한 바이러스들이 생성되는 것이다.

또한, 바이러스의 복잡한 병리학은 바이러스의 제조를 매우 어렵게 만들 수 있다. 예를 들면, CDV와 인간 홍역 바이러스(Human Measles Virus, HMV)는 밀접하게 관련된 바이러스이다. 두 바이러스 모두 이들 각자의 개와 인간 몸에 감염되었을 때는 비슷하게 반응한다. 이들 모두 간염(encephalitis)을 유발시키고 중추 신경계통을 손상시키거나 파괴시킴으로써 오랜기간의 후유증을 유발시킨다. 이러한 중추 신경계통의 질병은 늙은 개 뇌염(Old Dog Encephalitis, ODE)이라고 불리는 초기 CDV 감염 후 몇 년에 걸쳐서 개에게 발생된다.

이와 관련한 인간에게 나타나는 이상 질병은 아급성 경화증에 걸린 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis, SSPE)이다. ODE 및 SSPE의 원인은 뇌염 상태로 있는 동안 감염된 세포와 생성된 비리온(virion)의 숫자와 직접적으로 관련된 질병이다. 이것은 차례로 두뇌세포의 허용가능성과 바이러스에 빠르게 응답하는 호스트의 면역시스템의 능력에 직접적으로 관련된다. 개 또는 인간의 두뇌 바이러스성 적정량(titer)은 매우 높은 농도에 도달하여 오랜 기간의 영향력으로 몇 년 후에 나타날 수 있다.

사실상, 높은 바이러스성 적정량은 환자에게 다소의 영향을 미치므로 감염이완전히 사라진 후에라도 두뇌 세포내의 바이러스성 단백질을 영구적으로 생산할 수 있게 된다. 면역 시스템은 이질적인 것으로서 바이러스성 단백질을 인식하여 수년에 걸쳐서 생존가능한 바이러스가 제조되지 않는다 하더라도 그 공격은 계속된다. 결국, 호스트의 면역체계와 비정상적인 세포간의 쌍무은 호스트의 인식 능력을 손상시키거나 파괴하기에 충분하도록 계속 생성된다. 인간에게 있어서 SSPE는 이러한 복잡한 질병의 이상생리학으로 진보성 치매로 이어져 결국은 죽음에까지 이르게 되어, 제조된 바이러스와 바이러스성 약물의 사용은 생체내 면역성을 고무하는 데 성공적이지 못하다.

CDV와 HMV와 같은 많은 바이러스들이 두뇌 세포를 감염시키기 때문에 두뇌 세포 계통의 허용가능성이 관련 질병의 이상생리학 연구 및 자연적으로 감염되는 동안 의태된 바이러스를 정확하게 특징짓는 진단학 및 백신용 바이러스를 제조하는 데 매우 중요하다. 그러나, 신경계 세포계통은 아주 소량으로 존재하며, 이들은 매우 낮은 수준의 CDV 또는 HMV를 생성한다. 따라서, 이러한 세포계통은 연구용 바이러스 수준으로는 부적당하며, 특히 항원 또는 백신 제조용으로는 부적합하다. 이러한 세포 또는 세포 계통, 및 세포 계통 자체를 변형시키는 방법은 바이러스와 바이러스성 약물을 높은 수준까지 복제하기 위하여 필요하다.

유용한 적정량까지 알려진 바이러스를 제조하는 것과 관련된 문제와 함께, 알려지지 않은 바이러스를 찾아내는 것도 매우 힘든 일이다. 왜냐하면, 알려지지 않은 바이러스의 복제에 필요한 세포 형태 그 자체 또한 알려지지 않았기 때문이다. 예를 들면, 중추신경 계통과 관련된 많은 질병들의 대부분이 발견되지 않은 바이러스성 물질에 의해 발생된다. 크루츠필드-자코브 질병(Creutzfield-Jacob Disease, CJD, 인간에게 영향을 미치는)의 퇴행성 질병, 진전병(scrapie) 및 소의 스폰지폼 뇌사(bovine spongiform encephalophathy, 소에게 영향을 미치는)는 모두 매우 느린 신경퇴행성 질병이지만, 이에 대한 원인은 아직 알려지지 않고 있다.

최근까지, 이러한 질병의 원인이 되는 약물이 밝혀진 것이 없으며, 감염된 인간 또는 동물의 두뇌 조직으로부터 진행된 어떠한 바이러스성 물질도 없었다. 이것은 감염성 약물로 공급될 수 있다는 특이한 단백질("프리온(prion)"이라고 불리는 것으로서, 어떠한 유전적 물질없이 재생산되고 감염에 의해 발생될 수 있는 약물로 추정되는 것임)을 연상하는 것을 포함하는 질병 병인학에 관한 다양한 이단의 가설의 주창에 기인한 것이다.

그러나, 높은 수준의 감염성을 가진 것으로 보이는 프리온을 생성한 세포 계통은 없었다. 프리온을 생성하기 위하여 변형된 유전자전이 쥐는, 어떤 질병에 있어서 이들이 진단학적으로 성질우량증명(hallmark)을 보이더라도 감염되지는 않는다. 따라서, 감염성 물질의 확인을 위한 방법이 없이는 이러한 질병을 위한 좋은 진단 방법은 없으며, 또한 백신의 제조도 불가능하다.

최근, 진단 시약과 가능성있는 백신의 개발을 위한 개선된 방법에 대한 필요성은 더욱 긴급하고 중요하게 대두되고 있다. 예를 들면, 최근 영국에서의 소는 양 이나 다른 동물성 쓰레기로 구성된 사료를 먹이고 있다. 소의 스폰지폼 뇌사(bovine spongiform encephalophathy)가 이러한 소들에게 실제로 처음 인정된 것이다.

많은 사람들이 이전에 인정(지금은 "새롭게 변형된 CJD(new variant CJD)" 또는 nv CJD라고 함.)하지 않았던 감염 경로를 통해 선정된 감염된 소로부터 얻어진 고기를 섭취함으로 감염되었다. 이외에도 인간에게 감염되어 나타나는 비참한 결과로 소가 도살됨으로써 막대한 경제적인 손상을 입히고 있는 실정이다.

또한, 새롭게 변형된 CJD의 연구는 감염된 소로 인한 다른 육류 제품과 식량의 수입, 수출 및 판매에 따른 정치적인 영향에 의해 수행되었다. 따라서, 효능있는 백신의 제조와 관련된 좋은 진단 시약을 개발하는 것이 필요하다. 이러한 목표를 수행하기 위해서는, 허용가능한 세포계통이 필요하고, CJD와 새롭게 변형된 CJD와 같은 느린 치매의 병인학에 수용가능한 신경친화성 약제의 보급이 허용될 것이다.

각국 인구의 평균 연령이 증가함에 따라, 알츠하이머병과 같은 질병의 발생이 증가되고 있다. 알츠하이머 병은 서서히 진화하는 치매이기 때문에 환자를 오랜 기간동안 돌봐야 하는 어려움이 있다. 또한 이렇게 오랜 기간동안 인간을 쇠약하게 하는 데 드는 비용은 과히 파괴적이다.

한편, 알츠하이머 병은 감염되기 쉬운 병으로 생각되지는 않았다. 그러나, 알츠하이머 병에서 나타나는 특이한 양상은 질병을 유발시키는 양식화되지 않은 바이러스성 물질(새롭게 변형된 CJD와 비슷한)에 의한 감염으로 추측하고 있다. 이것은 HMV와 같은 신경친화성 물질 또는 이와 관련된 홍역 바이러스가 인간의 정신작용을 파괴시킴으로 인해 상기 질병이 천천히 진행될 가능성도 있다는 것이다.

만일 알츠하이머 병이 감염성 물질에 의해 발생되는 것이라면, 이것은 질병의 처리, 예방, 진단 및 치료(가능하다면)는 매우 중요하게 된다. 예를 들면, 알츠하이머 병의 예방을 위해서는 우수한 백신의 개발이 필요할 것이다. 그러나, 양식화되지 않은 물질(ODE 및 SSPE와 같은)에 의해 발생된 다른 치매의 경우에는, 명확한 진단방법이 없다.

두뇌 조직으로부터 감염된 바이러스의 단리(isolation)는 이러한 질병을 가진 인간의 치료와 진단에 있어서 경계표가 되는 단계가 될 것이다. 따라서, 홍역과 같은 바이러스에 보다 많은 허용가능성은 아직 개발되지 않은 신경친화성 물질(CDV 및 HMV와 같은)에 의한 것이다.

백신, 진단용 도구 또는 다른 목적으로 사용하기 위한 재조합형 DNA 기술을 사용한 진핵 세포 계통으로부터 단백질을 제조하는 것은 바이러스를 제조하는 것과 같은 문제의 한계를 가지고 있다. 단백질의 재조합은 적절한 폴딩(folding), 글리코실화 반응, 및 단백질의 기능 및 안정성에 적절하거나 또는 이들의 진단 시약 또는 백신으로서의 면역원성에 결정적인 다른 구성적 요소들을 확실하게 하기 위한 진핵세포 계통에 의해 제조되어야 한다.

정확한 형태를 유지하면서 이러한 단백질을 대량으로 제조하는 기술은 매우 어렵다. 많은 경우에 있어서, 단백질의 재조합은 수용가능한 수준에서의 세포 계통에서 제조될 수 있으나, 변형에서 미묘한 차이가 자주 있기 때문에 진단용 항원으로서의 비-면역활성이거나 백신이거나 또는 원하는 기능을 수행하는 데 실패하게 된다. 예를 들면, 유전학적으로 복제될 수 있으며 진핵 세포 계통 수준으로 제조될 수 있는 개의 파보 바이러스(Canine Parvo Virus, CPV)는 통상적으로 실행가능하다. 이러한 재조합된 항원으로 백신 접종을 한 개(dogs)는 감염성(야생 형태)의 파보 바이러스를 시험관 내에서 중성화시키는 항체를 생산하게 된다. 불행하게도 이러한 재조합된 항원으로 백신 접종을 한 모든 개들이 감염성 CPV에 노출되어 있다는 것이다. 다소의 미약한 변형은 개들을 보호하는 재조합된 백신으로부터 제지당하게 된다.

따라서, 재조합된 단백질의 제조비용은 비싸고, 고도의 기술을 요하며, 시간이 많이 소비되고, 매우 비효율적이다. 많은 경우에 있어서, 단백질의 재조합은 유용한 효과를 가진다. 그러나 이를 제조하는 데 수반되는 비용 때문에 사용할 수 없는 것이다. 예를 들면, 다수의 항암성 펩타이드는 암(예를 들면, 맥관형성 차단제)의 치료 또는 명백히 감소시킬 수 있는 많은 효과들을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

최근에 청구된 것은 쥐의 암종양을 치료하는 안지오스타틴(angiostatin) 및 엔도스타틴(endostatin)에 관한 것이다. 그러나, 이러한 펩타이드(단일의 치료 부위를 치료하기 위해 필요한 약물의 양은 5백만∼2천만 달러로 높음)를 제조하는 데 드는 비용이 너무 비싸기 때문에 암종양 치료에 이러한 약물을 사용하는 데는 많은 제한이 있다. 따라서, 그들의 기능(효소로서의, 항원으로서의 또는 다른 기능적 특성)을 유지하는 펩타이드 또는 단백질의 재조합하는 데 있어 비용 면에서 효과적인 방법이 매우 필요한 실정이다.

많은 구성요소를 가지고 제조된 단백질과 펩타이드는 적절한 모양을 유지하거나 유도하도록 도울 수 있는 "보조 단백질(helper protein)"과 밀접한 관계를 가진다. 이러한 보조단백질들은 종종 제조과정을 통하여 단백질을 수반하기 때문에 "차페론(chaperones)" 이라고 불린다. 이러한 차페론 단백질의 일부는 환경적인 스트레스 때문에 발생되는 다른 악화(deterioration) 또는 변성(denaturation, 구조적 손실)을 예방하기 위하여 다른 단백질과 결합한다. 예를 들면, 열충격 단백질(heast shock protein)(hsp 70 및 hsp 90과 같은)들은 정상적인 열 수준보다 더 높은 수준으로 응답하는 세포에 의해 제조된다.

이러한 열충격 단백질은 세포 내의 다른 단백질과 결합함으로써 이들을 안정화시키고, 결합된 단백질의 기능과 정확한 형태를 유지할 수 있도록 도와주는 역할을 한다. 다른 스트레스에 응답할 수 있도록 제조된 이들 및 다른 비슷한 단백질들을 일반적으로 스트레스 단백질이라고 부른다.

이러한 스트레스 단백질의 구조적 또는 기능적 역할은 자연물 내에서 많이 유지하는 것으로 나타나며, 다양한 스트레스 단백질들은 원핵 세포(procarytic cell) 및 진핵세포(eucaryotic cell) 모두에서의 차페론이 하는 역할과 비슷한 작용을 하는 것으로 나타난다. 예를 들면, 많은 연구들에서 이러한 단백질은 외성적으로 제조되는 스트레스 단백질을 가지고 다양한 생물학적 재료의 시험관 내(in vitro) 관찰에 유용하게 사용했다고 기록하고 있다. 이러한 연구들은 본 발명의 참고자료로 병합되었으며 다음과 같이 요약하였다:

미합중국 특허 제 5,302,518호 (Neupert et al.)에서는 단백질의 적절한 접힘(folding)은 BroEL 및 hsp 60(이들은 각각 E. coli 와 진핵의 미토콘드리아에서 발생되며, 실질적으로는 형태와 기능이 동일함)과 같은 생체내(in vivo) 열충격 단백질의 구성성분에 의해 중재될 수 있다는 것을 제안하였다.

Neupert는 세포로부터 단리된 다량의 열충격 단백질을 가진 이러한 변성된 재조합된 단백질을 시험관 내 (in vitro)로 접촉에 기초하여 재조합된 단백질의 접힘(folding)에 의한 후제조 변형법(post-production modification)을 기술하고 있다.

미합중국 특허 제 5,348,945호 (Berberian et al.)에서는 스트레스를 받은 조건에서 살아남을 수 있는 개선된 세포를 제조하는 기술을 제시하였는 바, 시험관 내 또는 생체내 응용성이 있는 이러한 방법은 hsp 70과 같은 이러한 스트레스를 가한 세포 내에서 열충격 단백질을 정제하여 외생적으로 얻어진다.

미합중국 특허 제 5,474,892호 (Jacob et al.)에서는 다량의 특정 열충격 단백질(hsp 90과 같은)을 첨가함에 따라 수용액에서의 특정 단백질이 안정화되는 것을 제시하였다. Jacob 등은 다양한 단백질과 단리되고 정제된 다량의 열충격 단백질을 가진 변성된 단백질과의 시험관내 접촉을 통한 다른 생물학적 재료의 접힘 또는 다른 안정화를 위한 변형을 위해 후-제조 방법을 기술하고 있다.

미합중국 특허 제 5,750,119; 5,830,464; 및 5,873,251 호 (Strivastava)에서는 포유류에서 암종양의 증식은, 특정의 암 성분 과 다양한 구성성분 또는 외생의 스트레스 단백질과의 관계로부터 기인한 항원 화합물의 주입을 통하여 예방될 수 있다고 제시하고 있다. Srivastava는 이러한 스트레스 단백질/암종양 복합체의 격리 또는 제제의 제조방법을 다양한 암종양 시편을 이용하였으며, 이어서 포유류 환자에게 주입하여 이러한 환자에게 비-암 응답성을 고무시키는 목적으로 제조되었다.

또한, Liu 등은 Journal of Biological chemistry, 13(1998) 30704 에서 hsp 40과 hsp 70과 같은 단백질 기능을 향상시킬 수 있는 다양한 열충격 단백질의 작용에 대해 연구한 것을 제시하였다. 변성된 단백질 속으로 외형으로 제조된 열충격 단백질을 정제하여 시험관 내에 첨가한 결과, 단백질 기능을 향상시킬 수 있었다는 결과를 발표하였다. hsp 40과 hsp 70의 상호-차페론 작용을 기술하고 있다.

스트레스 단백질의 기능에 대한 다른 관련된 참고자료는 여기에 병합될 것이며 다음의 것들을 포함한다:

미합중국 특허 제 5,188,964 호와 제 5,447,843호(McGuire et al.) 에서는 다양한 구성요소로 제조된 스트레스 단백질(hsp 27, hsp 70 및 hsp 90과 같은 열충격 단백질; 및 grp 78과 grp 94와 같은 글루코스 조절 단백질을 포함하는)의 레벨의 측정을 제시하였는 바, 상기 단백질은 암종양 조직 내에 존재하는 것으로 이러한 측정방법을 사용함으로써 상기 암종양의 재발 확률을 예견하는 방법으로 사용되었다.

또한, Williams 등은 J. Clin. Invest. 92 (1993) 503에서 hsp 70 유전자의 트랜스팩션(transfection)에 의한 국소빈혈(ischemia)과 같은 다양한 신진대사의 스트레스로부터 조직과 세포를 보호할 수 있는 방법을 제시하였다. 특히, 휴먼 hsp 70으로 표현되는 약물이 쥐과동물(murine)의 세포에 도입되면 신진대사에 의한 스트레스의 적용으로 이렇게 변형된 세포의 생존가능성을 개선시키는 것이다. 그러나, 이러한 구성적인 유전자의 첨가는 스트레스가 없는 조건에서조차도 빈번한 형질발현 대사의 부담 때문에 세포 증식에 부정적인 영향으로 나타난다.

또한, Vasconcelos 등은 J. Gen. Viro. 79 (1998) 1769에서 큰 플라크 표현형 변형 (plaque phenotype variant)의 경과적인 제조를 선두한 HMV와 허용가능한 베로(Vero) 세포 계통의 감염에 앞서 구성적 스트레스 단백질의 형질 발현의 유도를 개선시킬 수 있는 방법을 제시하였다. 12시간 후의 스트레스에 감염된 세포는(이러한 시간적 간격은 세포가 정상적인 생리능력을 회복할 수 있는 시간으로서, 다만 유도된 열충격 단백질 레벨은 이러한 간격을 초과하여 유지될 수 있다고 가정한다.) 다소 개선된 HMV 생성 레벨(바이러스성 적정 농도에서 네 번-접힘까지 관찰됨)을 보이는 것으로 관찰되고 있다.

또한, Vasconcelos 등은 J. Gen. Viro. 79 (1998) 2239 에서 구성적인 hsp 72 형질발현용 벡터 부호(vector coding)를 이용하여 허용가능한 세포 계통(인간의 성상세포종(astrocytoma) 세포와 같은)의 트랜스펙션을 통한 스트레스 단백질 발현의 일시적 개선을 위한 방법을 추가로 제시하였다. hsp 72의 빨아올림을 보이는 영양계(clonal) 세포 계통은 HMV로 감염된 바이러스의 적정량까지 증가됨을 보인다. 그러나, 이러한 영양계 세포 계통은 영구적인 변형을 보인다기 보다는 와일드 타입의 형태로 자발적으로 역행하는 경향을 나타내는 것으로 관찰되었다.

더욱이, 변형된 세포계통에 의한 계속된 발현을 이끌 수 있는 구성 hsp 72 유전자의 발현을 조절할 수 있는 방법을 제한하지는 못하였다. 이 논문에서 제조된 영양계 세포의 적응성은 HMV에 한정되는 것이며, CDV와 같은 다른 바이러스성 약물에 시도하는 것은 성공적이지 못했다. 변형의 일시적인 본질과 관계된 이러한 제안들은 이러한 시도를 적용하는 데 한계가 있다.

또한, 미합중국 특허 제 5,827,712호(Yokoyama et al.)에서는 DnaJ 와 DnaK를 포함한 특정의 차페론 단백질의 구성 과다발현을 선택하고 E. coli 변형(트랜스펙션을 통한)에서 트랜스글루타민분해효소(트랜스글루타미나스)를 재조합시켜 제조하는 개선된 방법을 제시하였다. 이러한 과다발현은 재조합된 기능성 TG를 안정화하고 용해시키기 위하여 사용된다. 변형시키는 방법은 스트레스 단백질 벡터와 E. coli를 가진 TG 벡터의 배양을 포함한다. 조합된 스트레스 단백질 벡터/E. coli를 가진 TG 벡터의 배양 및 E. coli를 가진 TG 벡터의 배양은 스트레스 단백질의 구성 과다발현의 출현을 변형시킨다. 특히, 이러한 방법들은 일시적인 변형을 나타내는 것이며, 여기에서는 이러한 스트레스 단백질이 구성적으로 제조되며 빈번한 스트레스 단백질 발현의 신진대사의 부담으로 인해 세포증식에는 부정적인 영향을 미치게 된다.

이러한 종래기술로 예를 든 문헌들은 기능성 생물학적 재료(단백질, 바이러스성 물질, 또는 다른 생물학제 또는 효소, 호르몬, 성장 인자, 구조단백질 및 암종양 억제유전자 물질을 포함하는 생성물과 같은)의 안정화 및 제조를 개선함으로써 hsp 27, hsp 40, hsp 60, hsp70(hsp 72와 hsp 73을 포함), hsp 90, GroEL, GroES, GrpE, grp 78, grp 94, DnaJ 및 DnaK와 같은 다양한 스트레스 단백질의 용도와 작용을 명확하게 정립하였다.

그러나, 외생으로(exogenously) 제조된 스트레스 단백질을 첨가하는 방법 및 이러한 단백질의 일시적인 구성적인 제조의 유도방법을 포함하는 이러한 종래기술에서 언급한 방법과 이론들은, 효과가 충분하지 않을 뿐만 아니라 다양한 생물학제 또는 생성물의 일반적인 제조를 개선한 것으로는 미약하며, 새로운 생물학제나 생성물의 개발하기에는 미흡하다.

예를 들면, 생성물의 변형 또는 첨가를 위하여 대량의 유용한 스트레스 단백질을 정제하고 제조하는 것은 엄청난 시간을 소비하거나, 경제적으로 매우 비싸기 때문이다. 더욱이, 적절한 조절 요소를 도입하지 않는다면, 구성적으로 제조된 스트레스 단백질용 스트레스 단백질 벡터 부호를 가진 세포의 트랜스팩션은 이러한 세포의 목적하는 생물학적 생성물의 제조에 견줄 수 있는 세포에 의한 스트레스 단백질의 전임의 제조에 앞장설 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 스트레스 단백질의 용도와 능력을 조절하고 이용할 수 있는 보다 효과적인 방법이 필요하다.

본 발명은 동일한 발명자들에 의한 미국 특허 번호 60/136,676(1999년 5월 28일 출원)와 동일한 현안의 잇점을 권리화하고 있다.

본 발명은 단백질, 바이러스성 물질, 또는 다른 생물학적 제제 또는 효소, 호르몬, 성장인자, 조직 단백질, 암 억제유전자 약품, 핵산 소식자(probe), 백신, 항원, 항생물질, 지질, 단체(simple) 및 복합체(complex) 탄수화물, 알콜 및 다른 용매 및 이러한 방법의 생성물 등을 포함하는, 그러나 이에 한정되지 않는, 생성물과 같은 기능성 생물학 재료의 안정화 방법 및 제조에 관한 것이다. 이러한 기능성 생물학적 재료는 백신의 제조 및 진단 시험용 또는 테스트에 유용하다.

보다 바람직한 실시예를 구현하기 위하여, 이에 따르는 도면을 다음과 같이 첨부한다.

도 1은 본 발명에 부합되는 바이러스 적정량 개선을 위하여 허용가능한 진핵세포 계통의 일시적인 스트레스를 가했을 경우를 나타낸 그림이며;

도 2는 본 발명에 부합되는 유전적으로 일시적인 변형된 허용가능한 진핵 세포계통의 유전적으로 영구변형을 나타낸 그림이며;

도 3은 본 발명에 부합되는 새로운 허용가능한 진핵 세포 계통을 제조하기 위한 방법을 나타낸 그림이며;

도 3a는 본 발명에 부합되는 유전적으로 설계된 원핵 세포 계통에서 재조합된 생성물의 수율을 개선시킬 수 있는 방법을 나타낸 그림이며; 및

도 3b는 본 발명에 부합되는 유전적으로 설계된 원핵 세포 계통에서 재조합된 생성물의 수율을 개선시킬 수 있는 대체 방법을 나타낸 그림이다.

따라서, 본 발명은 단백질; 바이러스성 물질; 또는 다른 생물학적 제제; 또는 효소, 호르몬, 성장인자, 조직 단백질, 암 억제유전자 물질, 핵산 및 핵산 소식자(probe), 백신, 항원, 항생물질, 지질, 단체(simple) 및 복합체(complex) 탄수화물, 알콜 및 다른 용매를, 이에 한정되는 것은 아니지만, 포함하는 생성물과 같은 기능성 생물학적 재료의 안정화 및 제조에 있어서 스트레스 단백질의 용도 및 특성을 조절하고 이용하는 새롭고 효과적인 방법과 이러한 방법에 의해 제조된 생성물에 관련된 것이다.

본 발명과 관련된 스트레스 단백질의 예로는 hsp 27, hsp 40, hsp 60,hsp70(hsp 72와 hsp 73을 포함), hsp 90, GroEL, GroES, GrpE, grp 78, grp 94, DnaJ 및 DnaK 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 이들을 세포 속으로 첨가하는 것과는 반대로, 이러한 hsp 관련 단백질을 제조할 수 있는 세포에 기인한 것이다.

본 발명의 특별히 바람직한 실시예에서는, 알려지지 않은 다양한 감염성 물질을 제조하고 개발하는 방법, 다양한 생물학제 생성물의 수율을 증가시키기 위한 방법, 및 허용가능하지 않은 세포 계통을 허용가능하게 만드는 방법으로서, 이러한 스트레스 단백질의 구성 발현의 선택적인 유도; 또는 원핵세포 또는 진핵세포 또는 세포 계통으로 이러한 스트레스 단백질 유전자를 일시적 또는 영구적으로 도입하는 방법을 포함한다.

예를 들면, 이러한 세포 또는 세포 계통을 가진 실시예는 원핵 또는 진핵 세포 계통에서 재조합된 생성물의 수율을 획기적으로 증가시키는 것으로 나타난다. 생산성이 감소되는 동안은 세포의 스트레스는 증가될 것으로 기대되어, 직관적이긴 하지만 매우 놀라운 일이다. 그러나, 본 발명의 발명자들이 발견한 바로는, 어떤 특별한 방법 또는 세포의 스트레스 응답을 유도하는 다른 방법에 의한 이러한 세포의 스트레스에 의한 것은 스트레스 단백질 유전자의 조절된 발현을 선도함으로써 기능성 생물학제의 제조를 개선시킬 수 있다는 것이다.

본 발명은 이러한 방법을 수행하기 위하여 특별히 기술한 다섯 가지의 바람직한 실시예를 포함한다. 그러나, 본 발명이 여기에 기술한 다섯가지의 실시예와 이 발명을 참고로 하여 이 분야에 능숙한 기술자들이 이해하고 응용한 다른 실시예에 특별히 한정되는 것은 아니다.

첫 번째 바람직한 실시예는 바이러스의 적정량을 개선시키기 위하여 사용되는 진핵세포의 일시적인 스트레스에 관한 것이다. 허용가능한 진핵세포는 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질의 제조를 고무시키기에 충분한 기간 동안 일시적으로 응력을 받는 것이다. 목적하는 축적된 바이러스는 스트레스를 받은 진핵세포를 감염시키기 위하여 이러한 스트레스를 적용하는 단계가 추가된다. 감염 후 배양되는 기간을 일정시간 거치면, 원하는 바이러스-유도된 생성물을 가진 상청액 결과물을 얻게 된다.

두 번째 바람직한 실시예는 스트레스 단백질 벡터의 유전자부체(episomal)에 의한 주입을 통한 진핵세포 계통의 일시적인 유전자 변형은, 영구적인 유전자 변형을 나타내는 세포계통을 제조하는 데 사용되는 호스트 DNA 속으로 발현 벡터의 영구적인 주입을 나타내는 이러한 변형된 세포 계통의 1종 또는 2종 이상의 그룹을 선택함으로 이루어진다.

세 번째 바람직한 실시예는, 허용가능하지 않은 진핵세포 계통 속으로 스트레스 단백질 발현 벡터를 주입시킴으로 새로운 허용가능한 진핵세포 계통을 제조하는 데 효과적인 것이다. 이 새로운 허용가능한 세포 계통은 감염성 또는 감염가능성 물질에 의한 세포 계통의 주입을 통한 바이러스성 물질을 제조하는 데 효과적으로 사용되며, 배양 과정을 거쳐 바이러스 결과물 또는 바이러스성 생성물을 제조하게 된다.

이러한 세포계통은 신경제를 성장시키는 데 있어서의 복제 어려움을 용이하게 하는 데 바람직하게 사용되는 것으로서, 종래에 양식화되지 않은 방법이다. 따라서, 이러한 세포 계통은 바이러스 헌터 및 대량의 유용한 약물의 제조 및 생성에 이용될 수 있다.

네 번째 실시예에서는 유전적으로 원핵세포 계통으로 설계된 기능성 재조합 생성물의 제조에 있어서 이러한 세포계통으로 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질 발현 매개체를 주입시킴으로써 개선시켰다. 이렇게 재조합된 세포는 용도에 따라 선택하여 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 클론 세포도 선택될 수 있다. 더욱 더 바람직하기로는, 이렇게 주입된 스트레스 단백질 발현 매개체는 1종 또는 2종 이상의 유도 촉진제(inducible promoter)를 포함한다. 선택적으로, 구성 촉진제(constitutive promoter)를 사용할 수도 있다.

이러한 스트레스 단백질 발현 매개체의 발현은 유도 또는 구성 발현에 의해서 이루어지며, 이러한 세포 계통은 1종 또는 2종 이상의 코드화된 스트레스 단백질이 생성된 결과이며, 여기서 발현된 스트레스 단백질은 기능성 재조합된 생성물의 수율을 개선시킬 수 있는 보조적인 역할을 한다.

다섯 번째 바람직한 실시예는, 유전적으로 설계된 원핵세포 계통을 이용한 재조합된 기능성 생성물의 제조는 이러한 세포 계통 속으로 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질 발현 매개체를 주입시킴으로써 개선될 수 있는 것이다. 이러한 주입은 목적하는 재조합된 생성물을 제조하기 위하여 세포계통의 유전적 변형을 한 후나 그 이전에 하는 것이 효과적이다. 바람직하기로는, 이러한 스트레스 단백질 발현 매개체는 1종 또는 2종 이상의 유도 촉진제를 포함하는 것으로, 선택적으로는구성 촉진제를 사용할 수도 있다.

본 발명은 영구적인 유전자 변형을 나타내는 세포계통의 제조, 재조합된 기능성 생성물의 수율을 개선시킬 수 있는 허용가능한 진핵세포 계통의 제조, 다음의 실시예와 구현예에서 보여지는 방법을 이용한 생성물에 관한 것이며, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에서는 단지 그것을 기술한 것에 불과하다.

첫 번째 바람직한 구현예

통상적으로 목적하는 바이러스 또는 바이러스 생성물을 제조하기 위하여 사용되는 허용가능한 진핵세포를 다량으로 생산하는 것은 부적합할 수 있다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 이러한 세포계통을 다량으로 생산할 수 있는 것을 개발하였으며, 도 1과 본 구현예에서 기술한 것과 같은 일시적인 스트레스를 적용함으로써 개선할 수 있게 되었다.

일반적으로, 본 구현예에서는 진핵세포 계통의 일시적인 스트레스는 바이러스의 적정량을 개선하기 위하여 사용된다. 특히, 목적하는 바이러스를 위한 허용가능한 진핵세포는 종래에 사용되는 방법을 사용하여 선발한다. 이러한 세포들은 최적의 표준조건과 거의 일치하도록 하여 성장시키며, 그 다음 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질을 제조할 수 있도록 고무시킬 수 있는 충분한 양의 시간동안 일시적으로 스트레스를 가한다. 적용되는 스트레스 인자들은 열에 의한 스트레스(인큐베이션 온도를 낮추거나 높이는 것과 같은), 화학적 스트레스(pH를 높이거나 낮추는 것과 같은), 산화 레벨 스트레스(산소의 수치를 낮추거나 높이는 것과 같은),영양 변형(기본적인 배양 조건 요소의 개선 또는 감소시키는 것과 같은), 및 다른 인자들(독성 물질에 노출시키는 것과 같은)을 포함하는 것으로, 이렇게 함으로써 일시적인 스트레스를 유도할 수 있으며, 스트레스 단백질 발현의 결과물은 목적하는 바이러스 군체에 스트레스 받은 진핵세포를 감염시키기 위하여 이러한 스트레스를 추가로 적용한다.

바람직하기로는 이렇게 추가함으로써 다양하게 감염된 (multiplicity of infection) 세포 1개당 0.001∼1000 비리온을 얻을 수 있거나, 보다 바람직하기로는 세포 1개당 1∼4 비리온을 얻을 수 있다. 또한 이러한 추가과정은 스트레스를 가한 후 0∼12시간에서 수행되거나, 더욱 더 바람직하기로는 스트레스를 가한 다음에 바로 수행된다. 목적하는 바이러스-유도된 생성물을 포함한 상청액을 감염후, 바람직하기로는 5일간의 감염 이후의 인큐베이션 기간을 거친 다음 얻을 수 있게 된다.

실시예 1 : 바이러스 적정량의 개선을 위한 진핵세포 계통의 일시적인 스트레스

실시예 1은 첫 번째 구현예의 예로 기술한다. 그러나, 본 발명과 첫 번째 구현예는 실시예 1의 특성에 한정되는 것은 아니다.

목적하는 바이러스(개과의 디스템퍼, 밍크 디스템퍼 또는 인간 홍역 바이러스와 같은)에 사용하기 위한 허용가능한 진핵세포(베로 세포(Vero cell) 또는 다른 허용가능한 진핵세포 계통의)를 선발한다.

이러한 세포에 사용될 수 있는 다른 바이러스로는 광견병 바이러스, 파보바이러스, 마렉 물질(Marek's agent), HIV, HTLV, HSV 및 코로나 바이러스 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 세포들을 37℃의 온도와 5% 이산화탄소와 같은 표준 조건에 근접되는 90% 또는 그 이상의 일정한 조건에서 성장시켰다. 그 다음, 이 세포들을 수시간 이상에 걸쳐 인큐베이션에서 약 43℃의 온도와 이산화탄소 없는 조건에서 일시적으로 스트레스를 가하였다. (따라서, 초고열 염기성 조건에서 제조되도록 함) 이러한 일시적인 스트레스는 약 1∼5시간에 걸쳐서 가해진다. 따라서 hsp 70과 같은 다양한 스트레스 단백질의 개선된 제조방법은 이러한 세포에 의해 유도되는 것이다. 만일 이러한 세포들이 바이러스에 감염된다면, 이렇게 증가된 스트레스 단백질 레벨은 이러한 스트레스를 받은 세포들에 의해 바이러스-유도된 단백질의 생성을 향상시키고 안정화시킬 것이다. (실시예 표 3에서 보는 것처럼)

특정의 세포/바이러스 시스템에 있어서 세포 생존능력과 바이러스의 적정량의 두가지 관련된 인자에 의해 최적의 스트레스 조건이 결정된다. 일반적으로 세포 생존능력(스트레스를 받는 기간 동안 살아남은 세포의 분율)은 일시적인 스트레스를 가함에 따라 감소되는 반면, 스트레스 단백질(세포에 의한 평균적으로 생성된 단백질의 상대적인 양)의 수율은 스트레스를 가함에 따라 증가된다. 따라서, 최적의 스트레스 조건은 세포의 생존능력이 최소로 감소함을 보이고, 스트레스 단백질 수율이 단백질의 발현을 급격하게 향상시키는 시점이라고 할 수 있다.

이 시점을 거치면, 생성된 세포수의 상당한 손실이 성장의 전체적인 단백질 제조 능력을 감소시킴으로 인해 전체적인 수율에 부정적인 영향을 끼쳐 세포의 생존능력이 감소하게 된다. 예를 들면, 다음 표 1에서는 베로 세포(Vero cell)와 다양한 스트레스 조건에서의 생존능력을 비교하였다. 또한 다음 표 2에서는 실시예의 스트레스 조건하에서 CDV-감염된 베로 세포로부터의 단백질 수득률을 비교하였다.

다음 표 1에서는 베로 세포 배양의 생존능력을 결과물 샘플의 흡광도(570 nm)에서 측정된 것으로, 중성의 붉은 착색제를 이용하여 측정하였다. 상대적인 생존능력(표준화하지 않음)은 흡광도 단위로 표현하였으며, 이 값은 일시적인 스트레스를 가함에 따라 생존가능한 세포의 예상 수치와 일치한다. 시험조건은 특정의 조건을 유지하면서 염기성 조건(이산화탄소는 없는 조건)에서 정해진 온도로 세포배양에 노출시킴으로 수행하였다.

시험조건	상대적인 생존능력
온도(℃)	지속 시간	흡광도(570 nm에서의)
37	1.5	0.25±0.03
37	3	0.23±0.03
37	5	0.21±0.03
40	1.5	0.25±0.10
40	3	0.22±0.03
40	5	0.19±0.09
43	1.5	0.21±0.03
43	3	0.18±0.03
43	3	0.13±0.03

다음 표 2에서는, 지시된 스트레스 조건을 베로 세포 배양에 2시간 동안 지속적으로 가하고, 즉시 CDV 감염을 수행하였다. 감염된 세포의 배양은 표준 조건(37℃, 5% 이산화탄소하의)에서 일시적인 스트레스를 주는 조건으로 수행하였다. 적정량은 새롭게 융합된 베로(Vero) 배양을 함유한 96개의 오목한 판으로 얻어진 상청액을 연속적으로 희석(각 단계당 10배로 희석함)시켜 측정하였다. 이렇게 감염된 샘플을 4일 동안 배양시킨 다음, 중성 완충 포르말린에서 고착시켰다. 고착된 결과물을 플루오르세인으로 결합된 항-CDV 항체를 이용하여 염색하고 세포 플루오리메트리에 의해 그 값을 읽었다. 적정량의 결과는 양성의 바이러스 감염의 결과로 나타는 것으로 희석 단계의 숫자를 나타낸다.

시험조건(℃)	log₁₀(바이러스 적정량)
37 + 알칼리도(pH =7.6)	3
37 + 알칼리도(pH =7.6)	5
37 + 알칼리도(pH =7.6)	8

상기 표 1과 2의 결과를 비교해 보면, 베로(Vero) 세포에서 바이러스 적정량은 스트레스가 덜한 배양 조건인 43℃와 3시간 이하로 노출시켰을 때 급격하게 증가되는 것을 볼 수 있는 바, 이러한 조건하에서는 시험 배양의 생존능력을 크게 저하시키지 않기 때문이다. 따라서, 이러한 세포/바이러스의 조합을 위한 최적의 조건은 바이러스가 감염되기 전 즉시 약 2시간 동안, 43 ℃의 온도, 이산화탄소가 없는 조건이라고 할 수 있다.

더욱이, 이러한 조건을 정교화하는 것은 다양한 스트레스 조건을 보다 상세하게 예측함으로써 가능하며, 여기에서 기술된 조건이나 범위들에 특별히 한정되는 것은 아니다.

또한, 다른 세포/바이러스 조합에서는, 다른 인자들이 더 최적일 수도 있다. 그러나, 이러한 예들은 최적화시키기 위해 일반적으로 사용되는 접근방법을 명확하게 나타낸 것이다. 이러한 접근 방법을 사용하여, 이 분야에 종사하는 사람들은 특정의 세포/바이러스 조합을 위한 최적의 조건을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.

최선으로는, 목적하는 바이러스 군체(예를 들면, CDV)를 세포 속으로 첨가할 때는 스트레스 단계 이후에 즉시 행해지는 것이 좋지만, 이러한 세포들은 스트레스 단계 후 24 시간 또는 그 이상까지 감염될 수 있기 때문이다. 바이러스 군체는 세포 1개당 0.001∼1000개의 비리론 또는 보다 바람직하기로는 세포 1개당 1∼4개의 비리론을 다양한 감염(multiplicity of infection, MOI)으로 첨가되며, 후자의 조건으로 수행하는 것이 보다 최적이다.

상기 MOI는 세포 계통과 생성된 바이러스에 따라 다르게 나타난다. 최종 배양 단계를 거치면, 감염된 후 수일이 되면 최적의 상청액을 얻을 수 있다. CDV로 감염된 베로(Vero) 세포의 경우, 이러한 수확물은 감염된 후 5일 때에 최적으로 형성되지만, 몇몇 다른 조건에서는 1∼21 또는 그 이상의 기간이 필요하다. 최적의 조건은 수확 기간의 기능으로서 바이러스 적정량을 측정함으로써 결정되어 질 수 있다. 따라서 생성된 바이러스 적정량은 표 3에서 보는 바와 같이, 10∼100배 또는 그 이상으로 증가될 것이다(예를 들면, 초기 약 10⁵의 적정량으로부터 10^7∼8으로 개선됨).

다음 표 3에서는, 염기성 조건(이산화탄소가 없는 조건) 하에서 43℃의 온도로 높여 CDV 감염시키기 전에 두시간 동안 스트레스를 가한 베로 세포 배양을 나타내고 있다. 감염된 배양은 상기 일시적인 스트레스 단계를 따른 다음, 5% 이산화탄소와 37℃의 온도에서 유지시켰다.

대조구 : 스트레스를 가하지 않은 배양을 37℃의 온도에서, 5%의 이산화탄소를 유지하였다. 적정량은 상기 표 2와 같은 방법으로 측정하였다.

감염조건	log₁₀(바이러스 적정량)
대조구(스트레스 가하지 않음)	4.7
스트레스 후 0시간	8.5
스트레스 후 2시간	7
스트레스 후 6시간	7
스트레스 후 12시간	5

두 번째 바람직한 구현예

목적하는 바이러스 또는 바이러스 생성물을 제조하기 위하여 허용가능한 진핵세포(베로 세포 또는 다른 허용가능한 진핵세포 계통)가 빈번하게 사용된다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 본 구현예를 도식한 도 2에서 보는 바와 같이 수율을 향상시키기 위하여 목적하는 바이러스로 감염시켜 유전적으로 변형시킬 수 있는 세포들을 개발하였다.

이번 구현예에서는, 스트레스 단백질 발현 벡터의 유전체부체 주입을 통한 진핵세포 계통의 일시적인 유전자 변형과, 호스트 DNA 속으로 발현 벡터의 영구적으로 주입된 변형된 세포계통(스트레스 단백질 발현 벡터를 주입시킨 결과)의 1종 또는 2종 이상의 부분을 선택하는 단계를 따르며, 도 2에서 보는 바와 같이 영구적인 유전자 변형을 보이는 세포 계통을 제조하는 데 사용된다. 이러한 세포계통은 목적하는 바이러스 또는 바이러스 생성물을 제조하는 데 사용되는 개선된 방법이다.

특히, 목적하는 바이러스를 위한 허용가능한 진핵세포는 종래의 선발 방법을 사용하여 선발하며, 표준 조건에 근접한 조건에서 번식시킨다. 이러한 진핵세포를 위하여 사용되는 DNA 트랜스팩션 시약은 목표 세포 10⁴∼10⁶당 0.01∼100㎍ 벡터의 농도로 된 트랜스팩션 시약을 제조하기 위하여 지질/인지질과 스트레스 단백질 발현 벡터를 혼합하여 제조한다. 바람직하기로는, 이러한 지질/인지질은 양이온성 지질 또는 인지질이며, 더욱 더 바람직하기로는 디올레오일포스파티알에탄올아민(dioleoylphosphatidalethanolamine)이다.

그 다음, 상기 트랜스팩션 시약은 허용가능한 세포 배지로 전달되어 트랜스팩션이 일어나게 된다. 트랜스팩션이 진행된 다음, 배양은 새로운 배양 배지에서 수행된다. 트랜스팩션 수율을 높이기 위하여, 트랜스팩션 단계를 연속으로 반복하여 수행한다. 유전적으로 불균일 세포 배지 결과물은 목적하는 바이러스를 번식하는 능력이 개선되고, 트랜스팩션된 스트레스 단백질의 고수율 발현을 보이는 이들 세포계통을 선발하기 위하여 정제된다. 분류된 것으로부터, 발현 벡터가 호스트 DNA 속으로 자발적으로 재조합되는 세포계통의 선발을 통해 추가로 정제과정을 수행한다. 이러한 재조합을 나타내는 세포계통은 유전적으로 영구히 변형되게 되며, 재조합된 단백질 또는 바이러스 제조를 위해 유지된다.

실시예 2 : 일시적인 유전적 변형을 통해 허용가능한 진핵세포 계통의 영구적인 유전자 변형

실시예 2는 두 번째 구현예의 예로 기술한다. 그러나, 본 발명과 두 번째 구현예는 실시예 2의 특성에 한정되는 것은 아니다.

목적하는 바이러스용으로 선택된 허용가능한 진핵세포는 37℃의 온도와 5% 이산화탄소와 같은 표준 조건에 근접되는 90% 또는 그 이상의 일정한 조건에서 성장시켰다.

상기 진핵세포용 DNA 트랜스팩션 시약은 스트레스 단백질 발현 벡터(예를 들면, 바이러스, 코스미드(cosmid), 플라스미드(plasmid), 파지(phage), 트랜스포슨(transposon) 또는 DNA 또는 RNA를 포함한 다른 감염성 벡터와 같은 것으로서, 이들은 진핵세포의 DNA 속으로 삽입될 수 있는 것으로 이러한 세포의 트랜스팩션으로 진핵세포의 스트레스 단백질 발현을 증가시키게 됨)와 지질/인지질을 혼합하여 제조하는 바, 목표 세포 10⁴∼10⁶당 0.01∼100㎍의 농도로 트랜스팩션 시약을 제조한다.

상기에서 설명한 바와 같이, 이러한 지질/인지질은 양이온성 지질 또는 인지질을 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하기로는 디올레오일포스파티달에탄올아민(dioleoylphosphatidalethanolamine)을 포함한다. 그러나 1종 또는 2종 이상의 양이온성 지질과 다른 경쟁적인 인지질을 혼합하여 사용하는 것도 가능하다.

이러한 트랜스팩션 시약은 혈청이 없는(serum-free)배양 배지에서 희석시킨다음, 트랜스팩션이 일어날 수 있는 10∼60 분 또는 더 긴 시간동안 허용가능한 진핵세포로 배양시킨다. 상청액은 세포 배양으로부터 제거시킨 다음, 소의 태아 혈청과 같은 새로운 배양 배지를 약 10% v/v 농도로 첨가한다. 그 다음, 이 배지를 하룻밤 등의 수시간 또는 그 이상의 시간동안 배양시킨다.

최종적으로, 추가로 트랜스팩션 수율을 증가시키기 위해서, 이러한 리포팩션(lipofection) 과정을 24∼48 시간 후에 반복 시행할 수 있다. 상기 리포팩션은 스트레스 단백질 발현 벡터(예를 들면, hsp 70, hsp 90 또는 다른 스트레스 또는 차페론 단백질의 발현)를 도입시킬 수 있는 최상의 방법이지만, 일렉트로포레이션(electroporation)과 같은 다른 표준 기술을 사용하는 것도 가능하다. 또한 바이러스 주입을 통한 유전자 변형도 사용할 수 있다.

상기에서 기술한 트랜스팩션 과정은 일시적인 유전자 변형(이러한 벡터가 호스트 세포 유전자 물질로의 자발적인 재조합이 없이, 스트레스 단백질 발현 벡터가 세포 속으로 유전자부체 주입으로 구성됨)을 일으키는 세포 분율인 유전적으로 불균일한 세포 배양을 생성하게 된다.

이러한 배양은 일시적인 유전자 변형(유전자부체 벡터의 발현으로 특징됨)을 나타내지만, 일반적으로 영구적인 변형을 보이는 세포의 중요한 부분은 포함하지 않을 것이다. 유전자부체 벡터는 호스트 세포의 유전자 물질 속으로 영입될 수 없기 때문에, 이러한 배양은 이러한 유전자부체 유전자 물질의 구축을 통하여 감염되지 않은 상태로 자발적으로 되돌아가게 된다.

따라서, 영구 변형을 보이는 안정한 배양을 얻기 위해서는 이러한 세포의 일부를 선별하고 번식시켜야 한다. 예를 들면, 세포감염된 세포들이 일시적인 유전자 변형으로 인하여 고수율의 스트레스 단백질(hsp 70과 같은) 발현을 보일 수 있기 때문이다. 만일, 세포감염된 배양이 트립신화(trypsinize) 된다면, 방출된 세포는 예를 들면, 96개의 배양 우물판에서와 같이 사멸될때까지 심각하게 희석될 수 있다. 사멸 포인트 근처의 우물에서 발생된 세포 배양은 복제되고 수확될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 유전적으로 변형된 세포 계통은 바이러스의 증가된 수준으로 성장시킬 수 있는지의 능력을 시험하게 되고(실시예 1에서 기술한 것과 같이), 스트레스 단백질(예를 들면, 표준 효소-결합된 면역흡착제 분석(ELISA)을 사용하여 hsp 70과 같은 특정의 스트레스 단백질의 발현 레벨을 측정함)의 개선된 발현을 측정하게 된다.

이러한 테스트를 거친 세포 계통은 자발적인 재조합으로 호스트 DNA 속으로 발현 벡터의 주입을 위하여 검사된다. (선발된 핵산의 남향의 얼룩 분석에 따라 겔 일렉트로포레지스와 같은 표준시험 분석을 통하여) 이러한 주입은 1 x 10³개의 세포 분열에서 약 1개의 재조합 비율로 자발적으로 발생된다.

그러나, 재조합 효율은 특정의 벡터와 사용되는 세포계통에 따라 더 낮게 나타날 수도 있으므로, 추가의 선별 과정이 필요할 수도 있다. 호스트 세포의 유전자 물질로 안전하게 주입된 재조합된 세포계통은 유전적으로 영구하게 변형된 것이며, 다른 재조합된 단백질 또는 바이러스 생성 계통을 위하여 저장되게 된다. 이러한 세포계통은 스트레스 단백질 유전자와 공통된 단위를 가진 스트레스 단백질 생성물의 향상된 결과로 목적하는 바이러스 또는 바이러스 생성물의 수율에서 원하는 수준까지 향상된 결과를 보인다.

세 번째 바람직한 구현예

바이러스 또는 바이러스 생성물과 같은 목적하는 물질들을 제조하기 위하여 필요한 허용가능한 진핵세포는 존재하지 않거나 생산하기에 적합하지 않은 경우가 종종 있다. 예를 들면, 소수의 세포만이 이러한 물질에 허용가능하기 때문에 중심 신경 계통에 영향을 줄 수 있는 물질을 배양하는 것은 매우 어렵다. 특히, 크로이츠펠트야곱병(creutzfeldJacob), 진전병(scrapie), 쿠루병(Kuru), 광견병 및 개의 스폰지폼(spongiform) 뇌수(encephalopy)(nvCJD)와 같은 병에 필요한 약품은 적절한 허용가능한 세포 계통이 부족하기 때문에 시험관 내에서 배양하는 것은 불가능하고 매우 어렵다. 따라서, 이러한 약품을 위해서는 허용가능한 세포 계통을 제조하기 위한 새로운 과정이 필요하다.

이번 구현예에서는, 허용가능하지 않은 진핵세포를 허용가능한 세포로 만들기 위하여 유전적으로 변형시킨 것으로서, 새로운 허용가능한 진핵세포 계통의 제조는 스트레스 단백질 발현 벡터를 허용가능하지 않은 진핵세포 계통으로 삽입시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 새로운 허용가능한 진핵세포 계통은 감염가능한 또는 감염가능성이 있는 물질로 세포의 주입을 통하여 바이러스성 물질을 효과적으로 제조하여 사용할 수 있으며, 이것을 배양시키고, 얻어진 바이러스 또는 바이러스 생성물을 수집함으로써 제조된다.

이러한 세포계통은 신경 물질이나 전에 배양되지 않았던 물질을 성장시키는 데 어려움이 있었던 분야에 복제하기 위하여 사용되는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 세포계통은 바이러스 헌터와 대량의 유용한 약품의 제조 또는 생산을 위한 모두에 사용될 수 있다.

실시예 3 : 새로운 허용가능한 세포 계통의 제조

실시예 3은 세 번째 구현예의 예로 기술한다. 그러나, 본 발명과 세 번째 구현예는 실시예 3의 특성에 한정되는 것은 아니다.

이번 실시예에서는, 곤충의 세포와 같은 허용가능하지 않은 진핵세포를 도 3에서 보는 바와 같이 목적하는 바이러스를 위해 허용가능 하도록 제조하기 위하여 유전적으로 변형시키는 것이다. 신경모세포종(neuroblastoma), 성상세포종(astrocytoma) 또는 망막모세포종(retinoblastoma) 신경세포 계통은 상기 실시예 2에서 기술한 바와 같이 스트레스 단백질 발현 벡터로 트랜스팩션될 수 있다.

이것은 바이러스성 물질을 효과적으로 제조할 수 있는 새로운 세포계통을 얻을 수 있는 것을 말한다. 재조합된 세포계통을 수반하여 사용하기 위해 선택되는 이러한 과정은 바람직한 것이다. 선택적으로, 클론 세포 계통이 사용될 수도 있다. 또한 알려지거나 예상할 수 있는 감염된 물질을 함유한 동물 쓰레기와 같은 감염된 재료를 이러한 유전학적으로 변형된 세포계통을 접종하여 사용한다. 이러한 세포계통은 광견병과 같은 신경물질 및 전에 배양된 적이 없는 물질을 성장시키는 등의매우 어려운 분야에 사용하여 복제를 촉진시킬 수 있을 것이며, 바이러스 헌터(감염물질로 예상되는 특정물질을 다량으로 제조하기 위하여 사용되는) 및 이러한 물질(예를 들면, 새로운 백신의 제조)을 대량으로 제조하는 등의 양쪽 모두에 사용할 수 있다.

새로운 허용가능한 세포 계통의 예로는 다음 표 4에서 보여지는 것과 같은 허용가능하지 않은 세포계통으로부터 제조된다. 다음 표 4에서는, 자연적으로(처리하지 않은) 생성된 인간 홍역바이러스(HMV) 적정량, 허용되지 않은 세포계통(A 라인 : 신경모세포종(neuroblastoma), B 라인 : 망막모세포종(retinoblastoma)) 및 hsp 70 스트레스 단백질 발현 벡터에 삽입하기 위하여 처리 과정을 따르는 동일한 세포 계통을 비교한 결과를 나타내고 있다.

처리된 적정량이 증가는 HMV에 이러한 세포의 개선된 허용가능성을 뚜렷하게 나타내는 지표가 된다. 다수의 세포 계통에서의 적정량의 개선으로 이러한 방법의 다양한 세포계통의 후보자와 감염성 물질로서의 일반적인 응용력을 암시하는 것이다.

세포계통	처리 유무	log₁₀(바이러스 적정량)
A	무	1.10
A	유	6.70
B	무	1.60
B	유	6.30

네 번째 바람직한 구현예

원핵세포 계통은 원하는 물질을 제조하기 위하여 유전자 물질 코딩(coding)을 세포계통 속으로 도입시키는 재조합 방법을 통한 단백질 또는 다른 생물학적 물질을 제조하는데 빈번하게 사용되며, 그 결과 원핵 세포에 의해 원하는 물질을 제조할 수 있게 된다. 예를 들면, 인간의 인슐린은 목적하는 인슐린 단백질을 제조하기 위하여 필요한 인간의 유전자 코딩(coding)을 도입함으로써 유전적으로 설계된 박테리아를 통해 제조될 수 있다.

그러나 불행하게도 이러한 재조합된 물질은 구성적으로 제조된 물질(즉, 자연적인 방법을 통해 제조된 물질)로서의 동일한 생물학적 기능을 나타내지 못할 때가 많다. 이것은 재조합되는 과정에서 불완전하거나 부적합한 접힘(folding)(또는 변형을 줄 수 있는 다른 비슷한 인자들에 의한 변화)의 결과로 빈번하게 나타난다. 이러한 접힘 또는 변형은 변성된 단백질로 나타나고, 생성물로서의 적합한 기능을 발현하는 데 부정적인 영향을 미친다. 따라서, 재조합된 기능성 물질의 수율을 향상시킬 수 있는 방법이 필요하다.

이번 구현예에서는, 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터를 이러한 세포 계통 속으로 주입시킴으로써 유전적으로 설계된 원핵세포 계통에 의해 재조합된 기능성 생성물을 제조하는 데 개선된 방법을 제공한다. 계속적인 사용을 위해 재조합된 세포들을 선별하는 것이 바람직하다. 선택적으로, 클론 세포들이 선발되어질 수도 있다.

더 바람직하기로는 이렇게 주입되는 스트레스 단백질 발현 벡터는 1종 또는 2종 이상의 유도 촉진제(inducible promoter)를 포함한다. 선택적으로, 구성 촉진제(constitutive promoter)를 사용할 수도 있다. 이러한 스트레스 단백질 발현 벡터의 발현은 유도 또는 구조적 방법에 의해 실현될 수 있으며, 이러한 세포 계통은 1종 또는 2종 이상의 코드화된 스트레스 단백질을 제조한 결과이며, 여기서 발현된 스트레스 단백질은 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키는 데 돕는 역할을 하게된다.

이러한 향상은 hsp 70 또는 hsp 90과 같은 적합한 스트레스 단백질 발현 벡터의 연속적인 도입과 주입을 통해 최적으로 실현될 수 있지만, 다른 스트레스 단백질 발현 벡터도 가능하다. 이러한 주입은 트랜스팩션을 통해 효과적으로 실현될 수 있다. 그러나, 1종 또는 2종 이상의 바이러스 주입 벡터에 노출시켜 세포계통을 감염시키는 것과 함께 일렉트로포레이션 또는 다른 비슷한 방법도 사용할 수 있다. 이렇게 개선시키는 방법은 인간의 인슐린을 제조하기 위하여 변형된 하나의 예와 같은 이전에 변형된 세포계통으로부터 기능성 생성물의 수율을 향상시킬 수 있는 방법으로 사용된다. 선택적으로, 원핵세포는 이미 안정한 주입을 나타내기 때문에, 바이러스 또는 다른 조합된 생성물(단백질, 효소, 인슐린 또는 다른 목적하는 생물학적 생성물과 같은)을 제조하기 위하여 변형될 수 있는 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질 제조를 촉진하는 역할을 수행한다.

실시예 4 : 원핵세포 계통에서의 재조합된 생성물 수율의 향상

실시예 4는 네 번째 구현예의 예로 기술한다. 그러나, 본 발명과 네 번째 구현예는 실시예 4의 특성에 한정되는 것은 아니다.

본 구현예와 실시예에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 원핵세포 계통에서 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질의 유도를 포함한 재조합된 기능성 수율을 향상시키기 위한 방법을 개발하였다. 여기서 유도된 스트레스 단백질은 재조합된 생성물의 적합한 접힘(folding) 또는 다른 형태적인 변형을 돕는 역할을 하여 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키는 결과를 가져온다.

이러한 유도는 적합한 스트레스 단백질 발현 벡터(예를 들면 hsp 70 또는 hsp 90)를 유전적으로 설계된 대장균(escherichiacoli)과 같은 재조합된 원핵세포 계통 속으로 주입시킴으로써 최상으로 수행된다. 이러한 주입은 트랜스팩션에 의해서 최상으로 수행될 수 있다. 선택적으로, 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 다른 비슷한 방법도 사용할 수 있다.

이러한 일반적인 방법은 다음 도 4a와 4b에 나타내고 있다. 목적하는 유전자 원소 코딩(coding) 또는 스트레스 단백질 제조를 촉진시키기 위해 다양한 바이러스 주입 벡터들이 사용될 수 있다. 스트레스 단백질 발현 벡터의 주입은 스트레스 단백질 발현 벡터를 다음 도 4a에 나타낸 호스트 유전자 물질 또는 도 4b에 나타낸 것과 같은 유전자부체 주입으로의 재조합된 주입의 결과이다.

트랙스팩트된 세포 결과물은 높은 수준의 스트레스 단백질 발현을 보이는 것을 선별하기 위하여 표준과정을 거쳐 스크리닝하게 된다. 실시예 2에서 기술한 것과 같이 진핵세포 계통에 사용된 방법과 비교하여, 재조합된 세포계통을 선발하였으며, 도 4a에서 보는 바와 같이 호스트 유전 물질로 안정한 주입이 이루어졌음을 알 수 있다.

선택적으로, 도 4b에서 보는바와 같이 유전자부체 주입을 나타내는 클론을 사용할 수도 있다. 이 방법에서는 예를 들면 인간의 인슐린을 제조하기 위하여 변형시키는 것과 같이 스트레스 단백질 발현 벡터를 변형된 세포 계통으로 미리 주입시키는 것이다.

선택적으로, 원핵세포는 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질의 제조를 촉진하거나 그 결과로 이미 안정한 주입을 보이며, 바이러스 또는 다른 재조합된 생성물(단백질, 효소, 인슐린, 또는 다른 목적하는 생물학적 생성물)을 제조하기 위하여 변형될 수 있다.

도 4a와 4b에서 나타낸 예에서는 1종 또는 2종 이상의 유도 촉진제를 함유한 바람직한 스트레스 단백질 발현 벡터를 나타내고 있다. 선택적으로, 구성 촉진제를 사용할 수도 있다. 주입된 스트레스 단백질 발현 벡터(이러한 발현은 목적하는 재조합된 생성물의 발현과 경쟁적인 경향이 있음)의 중요한 발현을 보이지 않는 고수준으로 세포 계통이 번식되는 것이 허용되기 때문에 유도촉진제가 보다 더 바람직하다.

이러한 세포계통이 목적하는 재조합된 생성물 제조 단계에 한번 이르게 되면, 유도된 스트레스 단백질 발현 벡터의 유도는 세포 계통이 스트레스 단백질으로의 새로운 방향으로 사용될 수 있으므로, 기능성 생성물의 수율과 재조합된 생성물 제조 수준에서 최적의 효과를 보장할 수 있게 된다. 이러한 유도 촉진제의 예에는 β-갈락토시다제(β-galactosidase), 레트로 바이러스성 스테로이드-민감성 촉진제(retroviral steroid-sensitive promoter) 및 중금속 유도 촉진제가 있으나,이에 한정되는 것은 아니다.

반대로, 구성 촉진제를 사용할 경우에는 세포계통이 스트레스 단백질의 거의 연속적인 생성 또는 연속적인 생성능력에 중요한 부분에 쏟게 되는 경향이 있을 수 있다. 이러한 생성은 기능성 생성물의 비율을 높일 수 있을 것이지만, 재조합된 생성물의 총 생성 수준과 최적의 세포계통 번식이 서로 경쟁하는 경향이 있을 것이다.

다섯 번째 바람직한 구현예

진핵세포 계통은 목적하는 단백질 또는 다른 생물학적 제제 또는 목적하는 생성물의 제조를 위하여 유전자 물질 코딩(coding)을 세포계통 속으로 도입시킨 재조합 방법을 통한 생성물을 제조하는 데 사용되며, 이는 진핵세포에 의해 목적하는 생성물을 제조함에 따른 결과이다. 예를 들면, 인간의 맥관형성(angiogenesis) 차단 단백질은 목적하는 생성물을 제조하기 위하여 필요한 인간의 유전자 코딩(coding)을 도입함으로써 유전적으로 설계된 진핵세포 계통을 제조될 수 있다.

그러나 불행하게도 이러한 재조합된 물질은 구성적으로 제조된 물질로서의 동일한 생물학적 기능을 나타내지 못할 때가 많다. 따라서, 재조합된 기능성 물질의 수율을 향상시킬 수 있는 방법이 필요하다.

이번 구현예에서는, 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터를 이러한 세포게통 속으로 주입시킴으로써 유전적으로 설계된 진핵세포 계통에 의해 재조합된 기능성 생성물을 제조하는 데 개선된 방법을 제공한다. 이러한 주입은 목적하는 재조합된 생성물을 제조하기 위하여 세포계통을 유전적으로 변형시키기 전 또는 후에 수행되는 것이 효과적이다. 또한, 이러한 스트레스 단백질 발현 벡터는 1종 또는 2종 이상의 유도 촉진제를 포함하는 것이 바람직하며, 선택적으로 구성 촉진제를 사용할 수도 있다.

실시예 5 : 진핵세포 계통에서의 재조합된 생성물 수율의 향상

실시예 5는 다섯 번째 구현예의 예로 기술한다. 그러나, 본 발명과 다섯 번째 구현예는 실시예 5의 특성에 한정되는 것은 아니다.

본 구현예와 실시예에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 진핵세포 계통에서 1종 또는 2종 이상의 스트레스 단백질의 유도를 포함하는 재조합된 기능성 수율을 향상시키기 위한 방법을 개발하였다. 여기서 유도된 스트레스 단백질은 재조합된 생성물의 적합한 접힘(folding) 또는 다른 형태적인 변형을 돕는 역할을 하여 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키는 결과를 가져온다.

예를 들면, 목적하는 생물학적 생성물(맥관형성 차단제 또는 단백질 수열(sequence) 향상과 같은)을 제조하기 위한 발현 벡터는 스트레스 단백질을 제조하기 위하여 스트레스 단밸질 발현 벡터 코딩(coding)을 가진 세포계통 속으로 유전적으로 변형시키기 전 또는 후에 진핵세포 계통(포유류, 곤충류 또는 다른 세포계통, 및 보다 바람직하기로는 S-9 곤충의 세포계통과 같은)으로 주입시킬 수 있다.

이러한 스트레스 단밸질 발현 벡터(hsp 70 또는 hsp 90과 같은)를 이용한 변형은, 상기 실시예 2에서 기술한 방법을 사용하는 것이 효과적이다. 이러한 스트레스 단백질 발현 벡터는 1종 또는 2종 이상의 유도 촉진제를 포함하는 것이 바람직하며, 선택적으로 구성 촉진제를 사용할 수 있다. 따라서, 이렇게 유도된(이러한 변형의 결과로) 스트레스 단백질은 목적하는 재조합된 생성물의 안정성과 제조를 촉진시키게 된다.

선택적으로, 이러한 과정은 1종 또는 2종 이상의 단백질을 제조하는 데 사용되지만, 비단백질 생성물 또는 신진대사 핵산 소식자(probe), 백신, 항원, 효소, 호르몬, 성장인자, 조직 단백질, 암 억제유전자 물질, 항생물질, 지질, 핵산, 단체(simple) 및 복합체(complex) 탄수화물, 알콜 및 다른 용매와 같은 다른 생물학적 물질의 조합 및 합성에 필요한 단백질을 내부적으로 안정화시키는 데 사용될 수 있는 방법이다.

상기와 같은 서술은 본 발명의 목적을 표현하기 위하여 제공된 것일 뿐 본 발명이 이러한 분야에만 한정되는 것은 아니다.

새로운 목적하는 청구범위는 다음과 같이 첨부된 청구항에 의해 보호받을 수 있을 것이다.

본 발명은 단백질, 바이러스성 물질, 또는 다른 생물학적 제제 또는 효소, 호르몬, 성장인자, 조직 단백질, 암 억제유전자 약품, 핵산 소식자(probe), 백신, 항원, 항생물질, 지질, 단체(simple) 및 복합체(complex) 탄수화물, 알콜 및 다른 용매 및 이러한 방법의 생성물 등을 포함하는, 그러나 이에 한정되지 않는, 생성물과 같은 기능성 생물학 재료의 안정화 방법 및 제조에 관한 것으로서, 상기 기능성 생물학적 재료는 백신의 제조 및 진단 시험용 또는 테스트에 유용하다.

Claims

허용가능한 진핵세포를 선발하고 번식시키는 단계;

적어도 1종 이상의 스트레스 단백질의 향상된 생성경향을 보여주는 스트레스를 받은 진핵세포를 생성하기 위하여 일정시간 동안 상기 세포에 일시적으로 스트레스를 가하는 단계;

상기 스트레스를 받은 진핵세포를 감염시키기 위하여 바이러스 군체를 도입시키는 단계;

상기 감염된 스트레스를 받은 진핵세포를 배양하는 단계; 및

상기 감염된 스트레스를 받은 진핵세포에 의해 생성된 바이러스성 물질 결과물을 수확하는 단계로 구성된 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 일시적으로 스트레스를 가하는 단계에서의 스트레스는 열적 스트레스, 화학적 스트레스, 산화 레벨 스트레스, 영양물 변형 및 독성 스트레스로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 세포에 일시적으로 스트레스를 가하는 단계는 이산화탄소가 존재하지 않는 43℃의 온도에서 스트레스를 가하는 방법으로 수행되는 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 세포에 일시적으로 스트레스를 가하는 단계는 1∼5 시간 동안 수행되는 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 세포에 일시적으로 스트레스를 가하는 단계는 이산화탄소가 존재하지 않는 43℃의 온도에서, 1∼3 시간 동안 베로 세포(Vero cell)에 대해 수행되는 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 스트레스 단백질은 hsp 27, hsp 40, hsp 60, hsp70, hsp 72, hsp 73, hsp 90, GroEL, GroES, GrpE, grp 78, grp 94, DnaJ 및 DnaK로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 허용가능한 진핵세포는 베로 세포(Vero cell)인 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 바이러스 군체는 세포 1개당 0.001∼1000 비리온(virion)의 MOI(multiplicity of infection)에서 도입되는 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 8항에 있어서, 상기 바이러스 군체는 세포 1개당 1∼4 비리온(virion)의 MOI(multiplicity of infection)에서 도입되는 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 바이러스 군체를 도입시키는 단계는 상기 세포에 일시적으로 스트레스를 가하는 단계를 거친 후 24시간까지 수행되는 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 10항에 있어서, 상기 바이러스 군체를 도입시키는 단계는 상기 세포에 일시적으로 스트레스를 가하는 단계를 거친 후 즉시 수행되는 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 바이러스성 물질 결과물은 감염된 후 1∼21일 만에 얻어지는 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 바이러스성 물질 결과물은 감염된 후 5일 만에 얻어지는 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 바이러스성 물질 결과물을 얻기 위한 최적의 조건은 수확시간에 대한 바이러스 적정량(titer)을 측정하여 계산된 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 바이러스성 물질은 개과의 디스템퍼(Canine Distemper), 밍크 디스템퍼(Mink Distemper), 인간 홍역 바이러스(Human MeaslesVirus), 광견병(Rabies), 파보(Parvo), 마렉 물질(Marek's agent), HIV, HTLV, HSV, 코로나 바이러스(Corona virus), 및 소의 루커미아 바이러스(Bovine Leukemia Virus)로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 바이러스성 물질의 생성을 향상시키기 위한 방법.
허용가능한 진핵세포를 선발하고 번식시키는 단계;

상기 허용가능한 진핵세포를 세포감염된(transfected) 진핵세포로 만들기 위하여 트랜스팩션 시약(transfection reagent) 을 도입시키는 단계;

상기 세포감염된 진핵세포를 배양시키는 단계; 및

상기 트랜스팩션 시약에 의해 세포감염된 결과 단백질 발현에 높은 수율을 나타내는 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포 계통을 상기 세포감염된 진핵세포로부터 선발하는 단계로 구성된 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 16항에 있어서, 적어도 1종 이상의 두 번째 세포 계통은 호스트(host) DNA 내로 스트레스 단백질 발현 벡터의 자발적인 재조합을 나타내는 상기 첫 번째 세포계통의 일부분을 선택하는 방법으로 상기 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포계통으로부터 제조된 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 트랜스팩션 시약은 DNA 트랜스팩션 시약인 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 트랜스팩션 시약은 스트레스 단백질 발현 벡터와 적어도 1종 이상의 지질(lipid) 또는 인지질(phospholipid)로부터 제조된 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 트랜스팩션 시약은 목표 세포 10⁴∼10⁶당 0.01∼100㎍ 벡터의 농도를 갖는 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 스트레스 단백질 발현 벡터는 바이러스, 코스미드(cosmid), 플라스미드(plasmid), 파지(phage), 트랜스포슨(transposon) 및진핵 세포의 DNA 속으로 주입될 수 있는 다른 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 19항에 있어서, 상기 지질(lipid) 또는 인지질(phospholipid)은 양이온성 지질과 인지질로 구성된 그룹으로부터 선택된 지질을 포함하는 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 19항에 있어서, 상기 지질(lipid) 또는 인지질(phospholipid)은 디올레오일포스파티달에탄올아민(dioleoylphosphatidalethanolamine)을 포함하는 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 세포감염된 진핵세포는 10∼60분 동안 배양시키는 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 방법은 추가로 상기 세포감염된 진핵세포로부터 상청액을 제거하는 단계와 새로운 배양 배지(fresh culture medium)를 추가하는 단계를 포함하고, 추가로 상기 세포감염된 진핵세포를 배양하는 단계를 포함하는 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 25항에 있어서, 상기 새로운 배양 배지(fresh culture medium)는 약 10% v/v 농도의 소 태아의 혈청(fetal bovine serum)인 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 25항에 있어서, 상기 추가로 세포감염된 진핵세포를 배양하는 단계는 수시간 동안 수행되는 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 트랜스팩션 시약을 도입시키는 단계는 반복적으로 수행되는 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
제 19항에 있어서, 상기 스트레스 단밸질 발현 벡터는 hsp70, hsp 72, hsp 73, hsp 90, GroEL, GroES, GrpE, grp 78, grp 94, DnaJ 및 DnaK로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 영구적인 유전자 변형을 나타낼 수 있는 세포계통의 제조방법.
스트레스 단백질 발현 벡터를 적어도 1종 이상의 허용가능한 진핵세포로 제조하기 위하여 허용가능하지 않은 진핵세포 계통으로 주입시키는 단계; 및

상기 허용가능한 진핵세포 계통으로부터 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포계통을 선발하는 단계로 구성된 허용가능한 진핵세포 계통의 제조방법.
제 30항에 있어서, 상기 선발된 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포계통은 바이러스성 물질을 제조하기 위하여 사용되는 것이며,

상기 제조방법은 적어도 1종 이상의 감염된 허용가능한 진핵세포 계통을 제조하기 위하여 상기 선발된 세포계통에 감염성 재료(infective material)를 도입시키는 단계;

상기 적어도 1종 이상의 감염된 세포계통을 배양하는 단계; 및

상기 배양된 세포계통으로부터 적어도 1종 이상의 바이러스성 물질 결과물을수확하는 단계를 추가로 포함하는 것임을 특징으로 하는 허용가능한 진핵세포 계통의 제조방법.
제 31항에 있어서, 상기 바이러스성 물질의 제조는 적어도 1종 이상의 알려지지 않은 바이러스성 물질을 개발하기 위한 것임을 특징으로 하는 허용가능한 진핵세포 계통의 제조방법.
제 30항에 있어서, 상기 허용가능하지 않은 진핵세포 계통은 신경모세포종(neuroblastoma), 성상세포종(astrocytoma) 및 망막모세포종(retinoblastoma) 세포계통으로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 허용가능한 진핵세포 계통의 제조방법.
제 30항에 있어서, 상기 주입시키는 단계는 트랜스팩션에 의한 것임을 특징으로 하는 허용가능한 진핵세포 계통의 제조방법.
제 30항에 있어서, 상기 스트레스 단백질 발현 벡터는 hsp70, hsp 72, hsp73, hsp 90, GroEL, GroES, GrpE, grp 78, grp 94, DnaJ 및 DnaK로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 허용가능한 진핵세포 계통의 제조방법.
제 30항에 있어서, 상기 적어도 1종 이상의 허용가능한 진핵세포 계통은 상기 스트레스 단백질 발현 벡터용으로 재조합된 것임을 특징으로 하는 허용가능한 진핵세포 계통의 제조방법.
제 30항에 있어서, 상기 적어도 1종 이상의 허용가능한 진핵세포 계통은 상기 스트레스 단백질 발현 벡터용 클론(clon)인 것임을 특징으로 하는 허용가능한 진핵세포 계통의 제조방법.
제 31항에 있어서, 상기 감염성 재료는 감염성 물질을 함유한 동물의 쓰레기인 것임을 특징으로 하는 허용가능한 진핵세포 계통의 제조방법.
재조합된 기능성 생성물을 제조하기 위하여 유전자 재료를 미리 원핵세포 계통 속으로 도입시켜 재조합된 기능성 생성물의 수율(yield)을 향상시키기 위한 방법에 있어서,

적어도 1종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터를 변형된 세포계통으로 제조하기 위하여 상기 원핵세포 계통으로 주입시키는 단계; 및

목적하는 재조합된 기능성 생성물의 향상된 수율을 보이는 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포 계통을 상기 변형된 세포계통에서 선발하는 단계로 구성된 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 39항에 있어서, 적어도 1종 이상의 두 번째 세포계통은 호스트(host) DNA 내로 스트레스 단백질 발현 벡터의 자발적인 재조합을 나타내는 상기 첫 번째 세포 계통의 일부분을 선택하는 방법으로 선택된 상기 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포계통으로부터 제조된 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 39항에 있어서, 상기 적어도 1종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터는 적어도 1종 이상의 유도 촉진제(inducible promoter)를 포함하는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 41항에 있어서, 상기 유도 촉진제는 β-갈락토시다제(β-galactosidase), 레트로 바이러스성 스테로이드-민감성 촉진제(retroviral steroid-sensitive promoter) 및 중금속 유도 촉진제로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 39항에 있어서, 상기 적어도 1종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터는 구성 촉진제(constitutive promoter)를 포함하는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 39항에 있어서, 상기 주입시키는 단계는 트랜스팩션, 일렉트로포레이션(electroporation), 바이러스성 주입 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법으로 수행되는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 39항에 있어서, 상기 스트레스 단백질 발현 벡터는 hsp70, hsp 72, hsp 73, hsp 90, GroEL, GroES, GrpE, grp 78, grp 94, DnaJ 및 DnaK로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기위한 방법.
제 39항에 있어서, 상기 원핵세포 계통은 대장균(Escherichia coli)인 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 39항에 있어서, 적어도 1종 이상의 두 번째 세포계통은 호스트(host) DNA 내로 스트레스 발현 벡터의 유전자부체(episomal) 주입을 나타내는 상기 첫 번째 세포계통의 일부분을 선택하는 방법으로 상기 첫 번째 세포계통으로부터 제조된 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법에 있어서, 여기서 이러한 생성물을 위한 유전자 재료 코딩(coding)은 향상된 스트레스 단백질 발현을 나타내는 원핵 세포계통 속으로 도입되는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 48항에 있어서, 상기 발현은 유도할 수 있는(inducible) 것임을 특징으로하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 48항에 있어서, 상기 원핵세포 계통은 적어도 1종 이상의 유도 촉진제(inducible promoter)를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 48항에 있어서, 상기 발현은 구성적인(constitutive) 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 48항에 있어서, 상기 원핵세포 계통은 적어도 1종 이상의 구성 촉진제(constitutive promoter)를 포함하는 발현 벡터인 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
변형된 세포계통을 제조하기 위하여 진핵세포 계통 속으로 적어도 1종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터를 주입시키는 단계;

목적하는 재조합된 기능성 생성물의 개선된 수율을 나타내는 상기 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포계통을 상기 변형된 세포 계통에서 선발하는 단계로 구성되며,

여기서 유전자 재료는 재조합된 생성물을 제조하기 위하여 상기 진핵 세포 계통으로 첨가되는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 53항에 있어서, 상기 진핵세포 계통 속으로 적어도 1종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터를 주입시키는 단계는 상기 유전자 재료를 상기 진핵 세포 계통 속으로 첨가시킨 후에 수행되는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 53항에 있어서, 상기 진핵세포 계통 속으로 적어도 1종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터를 주입시키는 단계는 상기 유전자 재료를 상기 진핵 세포 계통 속으로 첨가시키기 전에 수행되는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 53항에 있어서, 적어도 1종 이상의 두 번째 세포계통은 호스트(host) DNA내로 스트레스 단백질 발현 벡터의 자발적인 재조합을 나타내는 상기 첫 번째 세포 계통의 일부분을 선택하는 방법으로 상기 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포계통으로부터 제조된 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 53항에 있어서, 상기 스트레스 단백질 발현 벡터는 적어도 1종 이상의 유도 촉진제(inducible promoter)를 포함하는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 53항에 있어서, 상기 스트레스 단백질 발현 벡터는 구성 촉진제(constitutive promoter)를 포함하는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 53항에 있어서, 상기 진핵세포 계통은 포유류 및 곤충의 세포 계통으로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 53항에 있어서, 상기 스트레스 발현 벡터는 hsp70, hsp 72, hsp 73, hsp 90, GroEL, GroES, GrpE, grp 78, grp 94, DnaJ 및 DnaK로 구성된 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
제 53항에 있어서, 상기 방법은 펩타이드, 단백질, 신진대사 핵산 소식자(probe), 백신, 항원, 효소, 호르몬, 성장인자, 조직 단백질, 암 억제유전자 물질, 항생물질, 지질, 핵산, 단체(simple) 탄수화물, 복합체(complex) 탄수화물, 알콜 및 용매로 구성된 그룹으로부터 선택된 재조합된 기능성 생성물을 제조하기 위하여 사용되는 것임을 특징으로 하는 재조합된 기능성 생성물의 수율을 향상시키기 위한 방법.
허용가능한 진핵세포를 선발하고 번식시키는 단계;

적어도 1종 이상의 스트레스 단백질의 증가된 생성을 나타내는 스트레스를 받은 진핵세포를 생성하기 위하여 일정시간 동안 상기 세포에 일시적으로 스트레스를 가하는 단계;

상기 스트레스를 받은 진핵세포를 감염시키기 위하여 바이러스 군체를 도입시키는 단계;

상기 감염된 스트레스를 받은 진핵세포를 배양하는 단계; 및

상기 감염된 스트레스를 받은 진핵세포에 의해 생성된 바이러스성 물질 결과물을 수확하는 단계를 거쳐 제조된 바이러스성 물질.
단백질 발현을 위해 1종 또는 2종 이상의 벡터로 세포감염시킨 결과물로써 고수율의 세포감염된 스트레스 단백질을 보이는 허용가능한 진핵세포 계통으로 구성된 영구적인 유전자 변형을 나타내기 위하여 선택된 세포계통.
허용가능한 진핵세포를 선발하고 번식시키는 단계;

상기 허용가능한 진핵세포를 세포감염된(transfected) 진핵세포로 만들기 위하여 트랜스팩션 시약을 도입시키는 단계;

상기 세포감염된 진핵세포를 배양하는 단계; 및

상기 트랜스팩션시킨 결과 발현된 고수율의 스트레스 단백질을 나타내는 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포계통을 상기 세포감염된 진핵세포로부터 선발하는 단계를 거쳐 제조된 영구적인 유전자 변형을 나타내는 세포계통.
스트레스 단백질 발현 벡터가 허용가능하지 않은 진핵세포 계통 속으로 주입된 것으로 구성된 허용가능한 진핵세포 계통.
적어도 1종 이상의 허용가능한 진핵세포 계통을 제조하기 위하여 허용가능하지 않은 진핵세포 계통 속으로 스트레스 단백질 발현 벡터를 주입시키는 단계; 및

상기 허용가능한 진핵세포 계통을 선발하는 단계로부터 제조된 허용가능한 진핵세포 계통.
재조합된 생성물의 발현을 위해 원핵세포 계통 코딩(coding) 속으로 유전자 재료를 도입시키는 단계;

변형된 세포계통을 제조하기 위하여 상기 원핵 세포 계통 속으로 적어도 1종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터를 주입시키는 단계;

목적하는 재조합된 기능성 생성물의 향상된 수율을 나타내는 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포계통을 상기 변형된 세포계통으로부터 선발하는 단계;

상기 첫 번째 세포계통을 번식시키는 단계; 및

상기 번식된 첫 번째 세포계통에 의해 제조된 재조합된 기능성 생성물을 수집하는 단계를 거쳐 제조된 재조합된 기능성 생성물.
변형된 세포계통을 제조하기 위하여 진핵 세포 계통 속으로 적어도 1종 이상의 스트레스 단백질 발현 벡터를 주입시키는 단계;

목적하는 재조합된 기능성 생성물의 개선된 수율을 나타내는 적어도 1종 이상의 첫 번째 세포계통을 상기 변형된 세포계통으로부터 선발하는 단계;

상기 첫 번째 세포계통을 번식시키는 단계; 및

상기 번식된 첫 번째 세포계통에 의해 제조된 재조합된 기능성 생성물을 수집하는 단계를 거쳐 제조된 재조합된 기능성 생성물.