CN114106156B - 非洲猪瘟病毒cp312r蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明提供的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。根据本发明提供的单克隆抗体的可变区序列能特异性、保守性地结合非洲猪瘟病毒CP312R蛋白，并且可高效价地用于多个组织的免疫组化检测且背景干净，具有广阔的应用前景。

Description

非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病，以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为临床特征(与猪瘟表现相似)，病程短、发病率高、病死率高(可高达100％)，特别地传染源多、传播途径多、传播方式多，一旦发生损失惨重。ASF于1921年在肯尼亚首次被发现，随后在非洲南部和东部的许多国家均发现ASFV的存在。自2018年8月3日中国确诊首例发生于辽宁省沈阳市沈北新区的非洲猪瘟疫情以来，非洲猪瘟迅速在国内各省市蔓延，疫情持续扩大，一旦确诊就要采取封锁、扑杀、无害化处理、消毒等处置措施，对整个行业的影响是地震级的。ASF为世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病，为我国规定的动物一类疾病，受到世界各国的高度重视。
ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是目前已知的唯一一种DNA虫媒病毒，是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒，其基因组长约170kb-193kb，是动物病毒中基因组最大的病毒之一，其基因组是口蹄疫病毒的24倍、猪瘟病毒的15倍。非洲猪瘟病毒CP312R蛋白(ASFV CP312R蛋白)是由ORF CP312R基因编码的一大小为37kD的蛋白，是ASFV未分类蛋白，具体功能不是很清楚。ASFV主要感染猪和野猪，可同时在脊椎动物和无脊椎动物中复制。目前缺乏有效疫苗和特异性治疗手段，使ASF成为目前危害养猪业的最严重疫病之一。对ASF的控制目前只能依赖快速诊断、对发病动物的捕杀，以及采取有效的检疫措施和严格的卫生措施。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种特异性结合非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的单克隆抗体及其应用。
本发明的第一方面提供了一种特异性结合非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的抗体或抗体片段的可变区序列，所述可变区序列包括SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列或其保守性变异体和SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列或其保守性变异体。
根据本发明，氨基酸序列的保守性变异体可以经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得。
根据本发明，所述可变区序列能够特异性结合非洲猪瘟病毒CP312R蛋白。
根据本发明的一些实施方式，所述抗体为单克隆抗体或基因工程抗体。
根据本发明的优选实施方式，所述抗体为单克隆抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述抗体为单链抗体，所述单链抗体的重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.ID No.5所示序列或其简并序列编码。
根据本发明的一些实施方式，所述基因工程抗体包括选自单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和猪源单克隆抗体中的一种或多种。
本发明的第二方面提供了一种特异性结合非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包括SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列或其保守性变异体的重链可变区和SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列或其保守性变异体的轻链可变区。
根据本发明，氨基酸序列的保守性变异体可以经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得。
根据本发明，所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的能力。
根据本发明的一些实施方式，所述抗体为单克隆抗体或基因工程抗体。
根据本发明的优选实施方式，所述抗体为单克隆抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述抗体为单链抗体，所述单链抗体的重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.ID No.5所示序列或其简并序列编码。
根据本发明的一些实施方式，所述基因工程抗体包括选自单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和猪源单克隆抗体中的一种或多种。
本发明的第三方面提供了一种杂交瘤细胞，其产生根据第二方面所述的抗体或抗体片段。
根据本发明的一些实施方式，所述杂交瘤细胞分泌本发明的特异性结合非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的抗体。
本发明的第四方面提供了一种单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。
根据本发明的一些实施方式，所述单克隆抗体与非洲猪瘟病毒CP312R蛋白特异性结合。
根据本发明的一些实施方式，所述单克隆抗体对ASFV CP312R蛋白的ELISA效价为1∶2048000，具有良好的反应性，还可用于免疫组化对不同组织的检测。
根据本发明的一些实施方式，所述重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID No.3所示的碱基序列或其简并序列编码。
根据本发明的一些实施方式，所述轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID No.5所示的碱基序列或其简并序列编码。
本发明的第五方面提供了一种杂交瘤细胞，其产生根据第四方面所述的单克隆抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述杂交瘤细胞分泌所述单克隆抗体。所述杂交瘤细胞能有效分泌单克隆抗体，且分泌的单克隆抗体纯度较高。
本发明的第六方面提供了一种试剂盒，其包括根据第四方面所述的单克隆抗体。
本发明的第七方面提供了一种根据第四方面所述单克隆抗体或根据第六方面所述的试剂盒在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的应用。
根据本发明提供的单克隆抗体对于非洲猪瘟病毒ASFV CP312R蛋白的特异性良好，并且可高效价地用于多个组织的免疫组化检测且背景干净，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
术语“非洲猪瘟病毒”(African swine fever virus,ASFV)是目前已知的唯一DNA虫媒病毒，是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒，其基因组长约170kb～193kb。
术语“非洲猪瘟”(African swine fever,ASF)由ASFV引发猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染病，以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为临床特征，且病程短、病死率高(可高达100％)。ASF的临床症状与猪瘟非常相似，自然感染的潜伏期为3～5天，也可延长至19天，个别可长达28天。根据病毒毒力和感染途径不同，其表现可分为最急性、急性、亚急性和慢性4种类型：最急性型，该型一般由毒力较强的毒株引起，往往未见到明显临床症状就倒地死亡，有时可见惊厥、食欲消失，数小时内即出现死亡；急性型：病猪表现为无食欲，体温升高至40～40.9℃，稽留3～5天后，体温下降，临死前呈深度昏迷状态，1～2天出现心跳加速，呼吸急促，皮肤出血，死亡率高；亚急性型：病猪呈现鼻、耳、腹肋部发绀，有出血斑，时而咳嗽，眼、鼻有浆液性和粘液性分泌物，后肢无力，出现短暂性的血小板和白细胞减少；慢性型：怀孕母猪感染后出现流产、腹泻、呕吐，粪便中有血液、粘液，时有呼吸改变及低病死率等症状。
术语“ASFV CP312R蛋白”，是由ORF CP312R基因编码的一大小为37kD的蛋白，是ASFV未分类蛋白，具体功能不是很清楚。
术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
术语“抗体片段”是指IgG经蛋白酶水解所形成的片段。例如，木瓜蛋白酶水解IgG形成2个相同的Fab段和1个Fc段；胃蛋白酶水解IgG形成1个F(ab′)2段和若干多肽碎片(pFc′)。若F(ab′)2重链间二硫键断裂，可形成2个Fab′片段，后者可进一步被酶解成Fv片段。
术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与非洲猪瘟病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
术语“活性片段”是指保持其母本的天然分子活性的单克隆抗体片段，能够保持与非洲猪瘟病毒特异性结合。
术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
术语“基因工程抗体”均能够通过基因工程的方法由适当的宿主细胞表达。本发明可使用多种表达宿主细胞，如原核宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等的菌株；真核宿主，包括但不限于曲霉属、酵母菌等的菌株，以及哺乳动物细胞、植物细胞等。本发明并不局限于具体的表达载体和表达宿主，只要其能够表达本发明所述的基因工程抗体或其保守性变异体。
术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1非洲猪瘟病毒CP312R蛋白表达
1.非洲猪瘟病毒CP312R蛋白片段的扩增
根据Genbank公布的非洲猪瘟病毒CP312R基因序列(登录号：MH766894.1)作为参考，通过对非洲猪瘟病毒CP312R蛋白核苷酸序列进行密码子优化(经验证，未进行密码子优化的非洲猪瘟病毒CP312R蛋白核苷酸序列无法通过重组杆状病毒进行表达)，得到优化后的CP312R序列，如序列1所示。通过委托苏州金唯智生物科技有限公司完成非洲猪瘟病毒CP312R蛋白核苷酸序列合成。
利用引物CP312R-F和CP312R-R扩增CP312R基因1-308氨基酸。引物见表1，PCR体系见表2，PCR反应条件见表3。
表1 CP312R蛋白片段扩增引物
Figure GDA0002806368670000061
表2 PCR体系
2×PrimeSTAR GC buffer 25μL
CP312R合成基因 1μL
primers(10pM) 1μL/1μL
dNTPs(2.5mM) 4μL
PrimeSTAR(2.5U/μL) 0.5μL
ddH2O 17.5μL
表3 PCR反应条件
Figure GDA0002806368670000071
2.非洲猪瘟CP312R蛋白表达供体质粒的构建
将步骤1中扩增的PCR产物进行胶回收，利用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切(酶切体系见表4)，37℃水浴2小时，与同样经双酶切处理pFastBacI载体连接(连接体系见表5)，22℃水浴2小时，将连接产物转化大肠杆菌Trans 5α感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素筛选抗性平板，挑取单克隆菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒，经酶切鉴定筛选阳性重组质粒(双酶切鉴定体系见表6)。选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。鉴定正确的阳性质粒命名为pFastBac-CP312R。
表4 PCR产物及载体双酶切体系
ddH2O 补至50μL
10×buffer 5μL
DNA样品 2μg
BamHI/HindIII 2.5μL/2.5μL
表5连接体系
10×T4连接buffer 1μL
T4连接酶 1μL
目的片段 6μL
载体 2μL
表6双酶切鉴定体系
ddH2O 补至20μL
10×buffer 2μL
重组质粒 1μg
BamHI/HindIII 1μL/1μL
3.重组Bacmid的构建
将5μL重组质粒pFastBac-CP312R转化到DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴60s，然后冰浴2min，后加入400μl的SOC培养基37℃，200rpm培养4h，取100μL菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落接于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板二次划线，37℃培养至少12h，挑取白色单一菌落至含卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板，利用引物Bac13F和Bac13R进行菌液PCR鉴定。PCR产物经鉴定正确，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组Bacmid的提取，命名为Bac-CP312R。
4.重组杆状病毒的获得及传代
参考CellfectinⅡReagent转染试剂盒操作说明，将重组Bacmid Bac-CP312R转染sf9昆虫细胞，置于27℃恒温培养箱培养大约72h，细胞病变明显后，收获细胞上清，标记为rBac-CP312R P1。
将P1代重组杆状病毒按1:20-1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，4℃冰箱避光保存。重复此步骤按照1:100-1:200比例接种获得P3、P4代重组杆状病毒。
5.蛋白的表达及纯化
将传至P4的重组杆状病毒按照1:10-1:100的体积比接种1L体积sf9细胞，接种48h-72h
收获细胞，1000×g离心10min收集感染细胞，用细胞裂解液(25mM NaHCO3，pH8.3)裂解细胞沉淀，10000×g，4℃离心10min获得裂解上清，进行Western Blot确认目的蛋白得到表达。用镍柱进行亲和层析及分子筛纯化，获得单一条带的目的蛋白，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，ASFV CP312R蛋白的浓度为2.0mg/ml。
实施例2非洲猪瘟病毒CP312R蛋白单克隆抗体的制备、纯化与鉴定
2.1非洲猪瘟病毒CP312R蛋白单克隆抗体的制备和纯化
将纯化的CP312R蛋白皮下多点免疫4-6周龄雌性BALB/c小鼠，200μl/只。每次免疫均用100μg蛋白与等体积的佐剂混匀乳化后进行。首次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次免疫用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔2周。用纯化CP312R蛋白建立的间接ELISA方法检测三免后的小鼠血清抗体效价，效价为1∶51200。
间接ELISA方法：将纯化的CP312R蛋白稀释至0.5μg/mL，加至酶标板，100μl/孔，2～8℃孵育16～24h。洗板，每孔加入150μl封闭液，37℃封闭2h。洗板，以100μl/孔加入稀释后的样品，同时设置阴性对照和阳性对照，37℃孵育1h。洗板，以100μl/孔加入1∶20000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育30min。洗板，依次以50μl/孔加入显色剂A、B液，37℃显色15min；以50μl/孔加入2mol/L H2SO4终止反应，10min内用酶标仪测定各孔OD450nm值。阴性对照OD450nm＜0.2时，试验成立；S/N(待检样品OD450nm/阴性对照OD450nm)≥2.1，判为阳性；S/N＜2.1，判为阴性；以阳性孔对应的样品最高稀释度，作为待检样品的效价。
挑选抗体效价最高的小鼠，腹腔注射100μg不加佐剂的CP312R蛋白进行冲击免疫，3日后取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合，将融合后细胞铺置于含小鼠腹腔巨噬细胞的96孔细胞板中，于37℃5％CO2培养箱培养9-11日，取上清用间接ELISA方法检测，将阳性细胞用有限稀释法进行亚克隆，直至全部为阳性，得到6株杂交瘤细胞，采用IFA方法对单克隆抗体进行病毒性反应检测，结果均为阴性，将6株假阳性杂交瘤细胞全部舍弃。
考虑到单独的非洲猪瘟病毒CP312R蛋白免疫小鼠所产生的效价较低，不利于筛选有效的单克隆抗体，故考虑增加免疫增强剂进行尝试。将ASFV CP312R蛋白与弗氏完全佐剂等体积，并添有安必奇生物科技有限公司的Magic佐剂10μl，混合乳化后按CP312R蛋白40μg/只200μl的量免疫小鼠1次，之后每隔2周将ASFV CP312R蛋白与弗氏不完全佐剂等体积、10μl Magic佐剂混合乳化后按CP312R蛋白40μg/只200μl的量免疫小鼠2次。将免疫后的小鼠血清用ASFV CP312R建立的间接ELISA方法评价小鼠血清的抗体效价，选取抗体效价最高的小鼠在融合前3天腹腔注射不含佐剂的CP312R蛋白80μg进行加强免疫，测定小鼠血清ELISA效价为1∶102400，并对该小鼠进行细胞融合，通过有限稀释法进行杂交瘤细胞的亚克隆筛选，最后获得6株阳性杂交瘤细胞，采用IFA方法对单克隆抗体进行病毒性反应检测，结果均为阴性，将6株假阳性杂交瘤细胞全部舍弃。
以上实验结果分析发现免疫增强剂可一定程度提高小鼠血清的效价，但仍不利于筛选有效的单克隆抗体，故考虑将小鼠免疫程序进行调整并跟踪。将ASFV CP312R蛋白与弗氏完全佐剂等体积，并添有安必奇生物科技有限公司的Magic佐剂10μl，混合乳化后按CP312R蛋白40μg/只200μl的量免疫小鼠1次，之后间隔1周、间隔3周(分为2组)将ASFVCP312R蛋白与弗氏不完全佐剂等体积、10μl Magic佐剂混合乳化后按CP312R蛋白40μg/只200μl的量免疫小鼠2次。将免疫后的小鼠血清用ASFV CP312R建立的间接ELISA方法评价小鼠血清的抗体效价，选取抗体效价最高的小鼠在融合前3天腹腔注射不含佐剂的CP312R蛋白80μg进行加强免疫，测定间隔1周的小鼠血清ELISA效价为1∶2048000、而间隔3周的小鼠血清ELISA效价为1∶102400(未明显上升)，选取间隔1周的小鼠进行细胞融合，通过有限稀释法进行杂交瘤细胞的亚克隆筛选，最后获得10株阳性杂交瘤细胞，其中仅有4株(1B5、4F11、3E5、4B1)细胞上清的ELISA效价≥1∶6400，其余效价偏低、反应性不好故舍弃。
将4株杂交瘤细胞1B5、4F11、3E5、4B1分别于小鼠体内制备腹水。用Protein G亲和层析法纯化单克隆抗体1B5、4F11、3E5、4B1的腹水，再用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，单克隆抗体1B5、4F11、3E5、4B1的纯度均不低于85％；用BCA蛋白定量试剂盒按照说明书进行定量分析，单克隆抗体1B5、4F11、3E5、4B1的浓度分别为0.8mg/ml、0.9mg/ml、4.2mg/ml、0.7mg/ml，其中3株1B5、4F11、4B1单克隆抗体纯化后的得率较低。
2.2单克隆抗体鉴定
2.2.1单克隆抗体类型和亚型的鉴定
用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体3E5的亚型进行鉴定，结果：单克隆抗体3E5的重链亚类分别为IgG1，轻链亚类为kappa。
2.2.2单克隆抗体特异性的鉴定
用间接免疫荧光方法，分别取单克隆抗体对猪瘟病毒CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、猪伪狂犬病病毒PRV、猪圆环病毒2型PCV2、猪乙型脑炎病毒JEV、猪细小病毒PPV进行检测，以判断其特异性，结果：单克隆抗体3E5检测为阴性，说明单克隆抗体3E5的特异性良好。
2.2.3单克隆抗体反应性的评价
用间接ELISA方法(包被原ASFV CP312R蛋白的包被量为0.1μg/ml、100μl/孔)测定单克隆抗体3E5的ELISA效价，结果为1∶2048000。
2.2.4单克隆抗体可变区序列测定
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计单克隆抗体3E5重链可变区引物序列：
P1：GGGAATTCATGRAATGSASCTGG
P2：CCAGGGRCCARKGGATARACN
设计单克隆抗体3E5轻链可变区引物序列：
P3：ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATG
P4：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGG
收集杂交瘤细胞，提取RNA后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增，将扩增产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果：单克隆抗体3E5的重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ.ID No.2、SEQ.ID No.4所示；单克隆抗体3E5的重链可变区、轻链可变区的碱基序列分别如SEQ.ID No.3、SEQ.ID No.5所示。
实施例3非洲猪瘟病毒CP312R蛋白单克隆抗体与病毒反应性
采用IFA方法对单克隆抗体进行检测，将购自欧洲非洲猪瘟参考实验室(Centrode Investigación en Sanidad Animal(CISA-INIA),Madrid,Spain)的非洲猪瘟病毒抗原板回温，PBS洗涤1次，加入单克隆抗体3E5，同时设置加PBS的阴性对照，置于37℃培养箱作用1h；PBS洗涤3次，加入FITC标记的兔抗鼠IgG二抗，37℃作用50min；PBS洗涤3次后于荧光显微镜下观察。结果：单克隆抗体3E5的细胞孔中可见明显的黄绿色荧光，而阴性对照孔无黄绿色荧光，表明单克隆抗体3E5可与非洲猪瘟病毒反应。
实施例4非洲猪瘟病毒CP312R蛋白单克隆抗体在免疫组化的应用
采集经PCR取样检测ASFV感染的阳性猪只的扁桃体、肺、淋巴结、脾、肾、肝等组织样品，迅速置于福尔马林固定，按常规方法制作石蜡切片。固定后经流水冲洗后再用自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，用包埋机包埋后切片、展片、裱片于已处理的玻片上，烤片。将玻片脱蜡至蒸馏水，滴加3％H2O2静置以抑制内源性酶。用抗原热修复如高压热修复、煮沸热修复、微波热修复，或酶消化法处理烤片后的玻片以修复抗原。用磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加封闭液如马血清或牛血清白蛋白BSA封闭。吸去封闭液后加入稀释的一抗(单克隆抗体3E5稀释液，同时用多抗进行比较)，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟或2-8℃孵育过夜；用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入酶标的羊抗鼠抗体作为酶标二抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入AEC或DAB显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明，封片、镜检。结果判定：阴性对照本底清晰、背景无非特异着染，阳性对照组织的细胞呈红色着染，试验成立；被检组织细胞呈红色着染，即为ASFV抗原阳性，否则为阴性。
将单克隆抗体3E5及多抗按1:100-1:3200的2倍倍比稀释后进行免疫组化检测，结果(见表7)：单克隆抗体3E5与多抗相比均可高效价地用于多个组织的免疫组化检测且背景干净，特别地单克隆抗体3E5稀释1:3200-1:6400还可用于多个组织的检测。
表7免疫组化应用比较结果
Figure GDA0002806368670000121
应当注意的是，以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 洛阳普泰生物技术有限公司
<120> 非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的单克隆抗体及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 924
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒CP312R蛋白(人工序列)
<400> 1
atgactaccc acatcttcca cgctgacgac ctgctgcagg ccctgcagca ggctaaggct 60
gagaagaact tttcctccgt gttctccctg gactgggaca agctgcgcac cgctaagcgt 120
aacacaaccg tgaagtacgt gactgtgaac gtgatcgtta agggaaaaaa ggcccctctg 180
atgttcaact tccagaacga aaagcacgtg ggcactatcc ctccttcaac cgacgaggag 240
gttatccgta tgaacgctga gaacccaaag ttcctggtga agaagcgtga ccgtgaccct 300
tgtctccagt tcaacaagta caaaatctct ccacctctgg aggacgacgg actgaccgtg 360
aagaagaacg agcagggtga agaaatctac cctggtgacg aggaaaagag caagctgttc 420
cagatcatcg aactgctgga agaagccttt gaggacgctg ttcaaaaggg accagaggcc 480
atgaagacta agcacgtgat caagctgatc cagcgtaaaa tctctaactc cgctgtgaag 540
aacgccgaca agcctctccc taacccaatc gcccgcatcc gtatcaagat caaccctgct 600
acatccatcc tgacccctat cctgctggac aagaacaagc ctatcaccct gcaaaacgga 660
aagacttcct tcgaagaact gaaggacgaa gacggcgtta aggccaaccc tgacaacatc 720
cacaagctga tcgaatcaca ctctatccac gacggaatca tcaacgctag atccatctgc 780
atcagcaaca tgggaatcag cttccctctg tgtctcgaaa tgggtgtggt gaaggttttc 840
gaaaagaaca acggaatcga tgtgaactcc atctacggtt cagacgacat cagcaccctg 900
gtgaaccaaa tcgctatcgc ttaa 924
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 重链可变区(人工序列)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Pro Trp Gly Leu Thr Thr Phe Thr Gly Thr Ser Met Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 3
<211> 360
<212> DNA
<213> 重链可变区(人工序列)
<400> 3
caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaggc ctgggacttc aatgaagatt 60
tcctgcaagg cttctggcta taccttcctc acctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggacag atttttcctg caagtggtaa tactaactac 180
aatgagatgt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctaa gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc cccttggggg 300
ttaactacct ttactggtac ttcgatgtgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 轻链可变区(人工序列)
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 322
<212> DNA
<213> 轻链可变区(人工序列)
<400> 5
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaactact gatttattgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atcctctcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa ac 322

Claims (6)

1.一种特异性结合非洲猪瘟病毒CP312R蛋白单克隆的抗体或抗体片段，其重链可变区为SEQ. ID No.2所示的氨基酸序列和轻链可变区为SEQ. ID No.4所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体、嵌合单克隆抗体和猪源单克隆抗体中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID No .3所示的碱基序列或其简并序列编码；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID No .5所示的碱基序列或其简并序列编码。
4.根据权利要求3所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述单克隆抗体与非洲猪瘟病毒CP312R蛋白特异性结合。
5.根据权利要求4所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述单克隆抗体对非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的ELISA效价为1∶2048000。
6.一种试剂盒，其包括根据权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体。
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