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Die Erfindung betrifft eine Pseudorabies Virusmutante (PRV) mit einem
funktionsunfähig gemachten Proteinkinasegen.
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Pseudorabies ist eine Krankheit aller Haustiere mit Ausnahme von Pferden und
verursacht schwere Schäden, insbesondere bei Schweinen und Rindern. Das Schwein ist
der natürliche Wirt des Pseudorabies Virus, ein Herpesvirus, der auch Aujesky's
Krankheitsvirus genannt wird. Bei Schweinen kann eine Infektion mit PRV eine Erkrankung
der Atemorgane und Enzephalitis verursachen und eventuell zum Tod führen.
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Tiere werden durch PRV infiziert auf dem Weg über die Nase. Nach einer
ursprünglichen Multiplikation des Virus in den Schleimmembranen des oberen Teils der
Atem- und Verdauungstrakte, breitet sich das Virus über die Nerven zum Gehirn aus. Die
Schwere der Infektion kann von akut bis subklinisch schwanken und ist in der Hauptsache
abhängig von der Virulenz des Virus und dem Alter des infizierten Tieres.
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Um den ökonomischen Schaden zu begrenzen, der durch Tod und
Wachstumsverzögerung der infizierten Tiere verursacht wird, werden Impfungen
durchgeführt. Zu diesem Zweck sind Impfstoffe auf der Basis von verdünntem lebenden
Virus und Impfstoffe auf der Basis von inaktiviertem Virus verfügbar. Impfstoffe aus
verdünntem lebenden Virus werden im allgemeinen bevorzugt, weil sie leichter hergestellt
werden können und somit weniger teuer sind, als Impfstoffe aus inaktiviertem Virus.
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Die ursprünglich entwickelten Impfstoffe auf der Basis von verdünntem lebenden
Virus haben verschiedene Nachteile. So werden im allgemeinen diese Impfstoffe produziert
durch Serienpassagen von virulenten Stämmen in Gewebekulturen (50-900 Passagen),
wodurch unkontrollierte Mutationen im Virus erzeugt werden. Als ein Ergebnis war die
Zusammensetzung solcher Impfstoffe nicht homogen. Die Gemische enthielten Virus von
Varianten von unbekannter Virulenz und unbekanntem Schutzvermögen. Außerdem bestand
mit solchen Impfstoffen das Risiko der Rückkehr zur Virulenz.
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Die Entwicklung von Techniken für die Manipulation von genetischem Material hat die
Möglichkeit eröffnet, Impfstoffe aus verdünntem Lebendvirus zu erhalten unter Vermeidung
dieser Nachteile. Die Struktur des PRV Genoms wird in der Literatur beschrieben (Virology
97, 151-163 (1979)). Das PRV Genom enthält etwa 150.000 Nukleotidpaare. Es enthält zwei
invertierte Sequenzwiederholungen und zwei nur einmal vorkommende Sequenzen, eine
kurze und eine lange, die Us und UI genannt werden. Auf der Basis der in Frage
kommenden DNA Sequenz ist PRV klassifiziert worden als ein D-Herpesvirus.
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Das Genom des virulenten PRV Stammes NIA-3 wird schematisch in Fig. 1 gezeigt,
die die Restriktionsstellen von HindIII und BamHI zeigt. Die invertierten
Sequenzwiederholungen werden gezeigt als IRI und IRr. Außerdem werden die langen und
kurzen nur einmal vorhandenen Sequenzen, UI und Us gezeigt.
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J. gen. Virol. 68, 523-534 (1987) beschreibt von NIA-3 abstammende PRV
Deletionsmutanten. Diese Mutanten besitzen eine stark reduzierte Virulenz, induzieren
jedoch noch ausreichend hoch neutralisierte Antikörpertiter, wodurch die Mutanten zur
Verwendung in Impfstoffen geeignet sind. Die Deletionen befinden sich im MluI-BgIII
Fragment vom BamHI Fragment 7. Es ist nun ersichtlich geworden, daß diese Mutationen
die Funktionsunfähigmachung der Gene verursacht haben, die für Glykoproteine gl und gp63
kodieren. Die beschriebenen Mutanten besitzen außerdem Deletionen um die Enden des
HindIII Fragments B, welche allein genommen eine nur schwach verringerte Virulenz
verursachen.
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Es wurde nun gefunden, daß PRV Mutanten mit einem Genom, das im Vergleich mit
dem Genom von PRV des Wildtyps eine Proteinkinase und/oder 28K Gen aufweisen, die
durch genetische Manipulation funktionsunfähig gemacht wurden, Viren sind, die zur
Replikation befähigt sind.
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Es wurde außerdem gefunden, daß PRV Mutanten, deren Genom ein
funktionsunfähig gemachtes Proteinkinasegen enthält, eine Virulenz zeigen, die im Vergleich
mit Stämmen des Wildtyps herabgesetzt ist und gute Immunogenizität besitzen. Andererseits
hat die Funktionsunfähigmachung des 28K Gens keinen nachweisbaren Einfluß auf die
Virulenz und die Immunogenizität.
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Die Tatsache, daß das Proteinkinasegen und das 28K Gen von PRV keine
wesentlichen Funktionen in der Replikation des Virus aufweist, gestattet die Einführung von
vorteilhaften Mutationen in die Regionen dieser Gene. Somit betrifft die Erfindung ein
Pseudorabies Virus, das nicht in der Natur vorkommt und ein Gen hat, das eine Mutation in
der Proteinkinasegen Region und/oder in der 28K Gen Region aufweist, Impfstoffe, die
dieses Virus enthalten, als auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz
von Schweinen gegen Pathogene, indem ein Pseudorabies Virus gemäß der Erfindung zu
einer pharmazeutischen Zusammensetzung verarbeitet wurde mit immunisierenden
Eigenschaften.
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Unter einer Mutation wird verstanden eine Änderung der genetischen Information in
den vorstehend genannten Regionen mit Bezug auf die vorliegende genetische Information
in diesen Regionen des Genoms von natürlich vorkommendem Pseudorabies Virus. Die
Mutation ist beispielsweise eine Nukleinsäuresubstitution, -deletion, -insertion oder -
inversion oder eine Kombination davon. Insbesondere ein Pseudorabies Virus gemäß der
Erfindung besitzt eine Deletion und/oder eine Insertion in einer oder in beiden der vorstehend
genannten Regionen.
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Das Proteinkinasegen ist lokalisiert im BamHI Fragment 10, d. h. stromaufwärts der
Sequenz, die für Glykoprotein gX kodiert. Die für das 28K Protein kodierende Sequenz liegt
stromabwärts des 11K Gens (Transition von BamHI Fragment 7 zu Fragment 12).
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Die DNA Sequenz des Proteinkinase (PK) Gens ist bestimmt worden und wird in
Fig. 2 wiedergegeben. Die Startpositionen für die Transkription werden darin durch
horizontale Pfeile angezeigt. TATA box Konsensus-Sequenzen sind unterstrichen. IR
bedeutet invertierte Sequenzwiederholung. Der Start-Codon des gX Gens ist in Position
1395.
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Die DNA Sequenz des 28K Gens ist in Fig. 3 wiedergegeben. Die Startposition der
Transkription ist ebenfalls darin angegeben durch einen horizontalen Pfeil. Die TATA box
Konsensus-Sequenz ist unterstrichen. Die Poly-A-Position hat eine doppelte
Unterstreichung. Die invertierte Sequenzwiederholung ist wieder durch IR angezeigt. DR
zeigt eine direkte Sequenzwiederholung an (26 bp). Der Terminator-Codon für das 11 K Gen
befindet sich in Position 7.
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Fig. 4 zeigt die Position der sieben Gene in der Us Region von PRV wie zur Zeit
bekannt. Fig. 4A beschreibt schematisch das HindIII Fragment B einer Insertionsmutante
mit einem funktionsunfähig gemachten PK Gen, das im nachstehenden weiter beschrieben
wird. Fig. 4B zeigt schematisch das HindIII Fragment B einer Deletionsmutanten mit einem
funktionsunfähig gemachten 28K Gen, das weiter unten beschrieben werden wird.
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In Fig. 4 sind die Restriktionsstellen von BamHI durch B angezeigt, die von BgIII mit
Bg und die von HindIII mit H.
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Die Positionen der DNA Sequenzen, die für PK und für das 28K Protein kodieren sind
wie folgt bestimmt worden.
Proteinkinase
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Der offene Leseraster (im nachfolgenden als ORF bezeichnet) von 1170 Nukleotiden
stromaufwärts von gX liegt vollständig in der Us Region (Fig. 2). In einem in vitro
Transkriptions/Translationsversuch wurde das Vorliegen dieses ORF bestätigt. Davon
ausgehend, daß der erste ATG Codon in Position 163 als Translationsstart Codon
funktioniert, ergibt dies ein Protein mit 390 Aminosäuren (43K). Jedoch zeigen mRNA
Kartierungsversuche, daß wahrscheinlich das Dritte ATG Codon in Position 325 der
wichtigste Start der Translation ist. Das Protein würde dann eine Länge von 336
Aminosäuren (37K) haben.
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Schon zwei Stunden nach der Infektion können Transkripts aus dieser Region in
Gewebezellen nachgewiesen werden, die mit PRV infiziert wurden. Das 5'Ende dieser 2,7
kb mRNA's wurde genau bestimmt mit Hilfe von Primer Extensionsversuchen. Zwei
Transkriptionsstartstellen wurden gefunden: Mehr als 95% der mRNA's starten in Position
258, 260 oder 261 (mit C, U bzw. A) wobei sie für das 37K Produkt kodieren. Der restliche
Teil der mRNA's startet in Position 99 (mit A), wobei sie für das 43K Produkt kodieren.
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Das Protein enthält konservierte Domänen einer Serin/Threoninproteinkinase
(Science 241, 42-52 (1988)) und ist homolog zu der Proteinkinase, die durch Us3 des
Herpessimplexvirus Typ-1 (HSV-1) kodiert (J. Mol. Bil. 181, 1-13 (1985)). Somit ist es
wahrscheinlich, daß dieses PRV Protein die 38K Proteinkinase ist (PRV-PK), die in PRV
infizierten Zellen gefunden wurde (Eur. J. Biochem. 152, 57-65 (1985) und Eur. J. Biochem.
167, 507-512 (1987)).
28K Protein
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Der ORF von 768 Nukleotiden stromabwärts von 11 K kodiert ein Protein von 256
Aminosäuren (28K) (Figur3). Die Existenz dieses ORF ist genauso bestätigt worden in einem
in vitro Transkriptions-/Translationsversuch. Das 28K Protein ist in einem geringen Maß
homolog zu dem Us2 Protein von HSV-1 (J. Mol. Biol. 1981, 1-13 (1985)).
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Schon zwei Stunden nach Infektion von Gewebekulturzellen sind mRNA's spezifisch
für 28K feststellbar. Fünf Stunden nach Infektion hat sich der Transkriptionsspiegel jedoch
beachtlich erhöht. Das 5'Ende dieser 1,15 kb mRNA wurde bestimmt mit Hilfe von Primer
Extensionsversuchen. Die mRNA's starten bei Position 146, 147, 148 oder 149 (mit C, A, C
bzw. A). Fig. 3 zeigt außerdem einen kleinen Teil der invertierten Sequenzwiederholung.
Sie enthält fünf direkte Wiederholungen von 26 bp (und einer kürzeren von 24 bp).
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Die Regionen von PRV gemäß der Erfindung, worin eine Mutation vorliegen kann,
sind gekennzeichnet durch eine Nukleinsäuresequenz, enthaltend das Gen, das das PK
Protein kodiert als auch Nukleinsäuresequenzen an den 5' und 3' Enden dieser Gene,
wodurch diese flankierenden Sequenzen kein Polypeptid kodieren. Folglich enthalten diese
Regionen auch die Sequenzen, die wichtig sind für die Regulierung und Expression der
beteiligten Gene.
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Erfindungsgemäß kann solch eine Mutation in der PK Gen Region vorliegen, die
gekennzeichnet ist durch Nukleinsäuresequenz 1-1394 wie in Fig. 2 angegeben ist.
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Vorzugsweise liegt die Mutation in dem Gen vor, das das PK Protein kodiert und in
dem Gen das 28K Protein kodiert. Eine sehr geeignete Region für die Insertion ist
Nukleinsäuresequenz 163-1332, gezeigt in Fig. 2.
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Eine geeignete Mutation ist beispielsweise die Insertion einer Nukleinsäuresequenz
eines Gens, das von einem oder mehreren in Schweinen gefunden Pathogenen abstammt
jedoch unterschiedlich von PRV ist. Dies sind nämlich Nukleinsäuresequenzen, die
genetische Informationen enthalten, die relevant sind für die Induktion einer schützenden
Immunantwort. Nach Impfung eines Tieres mit einem solchen rekombinanten Virus der
Erfindung kann das Virus in der infizierten Zielzelle sich vermehren, und dadurch eine große
Vielzahl von Vektorpartikeln freisetzen, die die fremde genetische Information enthalten.
Folglich kann dieses Virus wiederum Zielzellen infizieren und dadurch eine neue
Vermehrungsrunde starten. Das Ergebnis ist, daß größere Dosen des fremden
Genproduktes dem fremden Immunsystem des Wirtes angeboten werden, als allgemein
nach der Impfung mit einem Untereinheitsimpfstoff erhältlich.
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Vorzugsweise ist der PRV Vektor in dem Genom, in das fremde
Nukleinsäuresequenzen in das Proteinkinasegen eingeführt worden sind, ein PRV, das
durch eine Deletion in dem Glykoprotein gl Gen und/oder in dem Thymidinkinasegen
verdünnt wurde.
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Die genetische Information, die zur Insertion in einen PRV Vektor vorgesehen ist,
kann beispielsweise von Viren stammen, wie Hausschweincholeravirus, Parvovirus,
übertragbarem Gastroenteritisvirus, endemischem Schweinediarrhoevirus und Influenzavirus
oder von bakteriellen Pathogenen wie Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica,
Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteria,
Escherichia coli und Leptospira, oder von Mycoplasmata, wie M. hyopneumoniae und M.
lyorhinis etc.
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Die Techniken des Klonens von Nukleinsäuresequenzen von Pathogenen in PV
subgenomen Fragmenten und anschließende Integrierung derselben in das Genom eines
PRVs sind allgemein bekannt. Als Beispiel sei in diesem Zusammenhang auf die Methode
Bezug genommen, die die Regeneration von rekombinanter PRV aus subgenomen
Fragmenten anwendet, beschrieben durch M. von Zijl et al. in J. Virol. 62, 2191-2195 (1988).
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Bei der Erforschung des Einflusses der Funktionsunfähigmachung der PRV
Proteinkinase auf die Replikation und die virologischen Eigenschaften wurden die
betroffenen genomen Regionen mutiert durch eine Insertion eines Oligonukleotids mit
translationalen Stopsignalen und außerdem enthaltend eine Restriktionsseite für ein Enzym,
die nicht in NIA-3 vorhanden ist. Das verwendete Oligonukleotid hat die Formel
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5'TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3'
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3'ATCCGATCTTAAGATCGGAT-5'
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Dieses Oligonukleotid enthält drei Translationsstop-Codons, TAG, in jedem der
möglichen drei Leserastern und in beiden Richtungen. Außerdem enthält es eine EcoRI
Erkennungsstelle, GAATTC, und weiterhin ist das Oligonukleotid ein Palindrom. Insertion
dieses doppelsträngigen Oligonukleotids in irgendein Gen, das ein Protein kodiert in
irgendeiner Richtung, in irgendeinen Leseraster führt zur Termination der Translation der
mRNA dieses Gens. Das Vorliegen der EcoRI Erkennungsstelle (das in dem NIA-3 Genom
nicht vorhanden ist) in dem Oligonukleotid vereinfacht die Bestimmung dieser Insertionsstelle
des Oligonukleotids als auch weitere Manipulation des Klons, in dem das Oligonukleotid
insertiert worden ist.
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Das vorstehend genannte Oligonukleotid kann auf bekannte Weise durch Synthese
erhalten werden mit Hilfe der Phosphoramiditmethode.
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Im nachstehenden werden die Konstruktion und die biologischen Eigenschaften
einiger erfindungsgemäßer Mutanten im einzelnen beschrieben.
1. Konstruktion eines Klons des HindIII Fragmentes B von PRV Stamm NIA-3.
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Ein Derivat des Plasmidvektors pBR322 wurde konstruiert, worin die EcoRI-Stelle
deletiert wurde durch Behandlung mit dem Klenow Fragment von DNA Polymerase I in
Gegenwart von dATP und dTTP. Das 27 kbp HindIII Fragment B vom PRV-Stamm NIA-3
(Fig. 1) wurde geklont in der HindIII-Stelle des letzteren Vektors.
2. Linearisierung des Klons an quasi Zufallsstellen.
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Kovalent geschlossene zirkulare DNA (25 ug) des HindIII-B Klons wurde teilweise
durch Inkubation digestiert während 15 Minuten bei einer Temperatur von 37ºC in
Gegenwart von in jedem Falle einem der folgenden Restriktionsenzyme: FnuDII, HaeIII und
RsaI. Die Digestionen wurden durchgeführt in einer Lösung, die ein Volumen von 125ul
aufwies und die DNA enthielt zusammen mit entweder 2 U FnuDII in 20mM Tris-HCL, pH
7,5, 8mM MgCl&sub2;, 50 ug Ethylbromid (EtBr) oder zusammen mit 1 U HaeIII in 20mM Tris-HCL,
pH 7,5, 50 mM NaCl, 8 mM MgCl&sub2;, 5 ug/ml EtBr oder zusammen mit 0,5 U RsaI in 20mM
Tris-HCL, pH 7,5, 50mM NaCl, 8mM MgCl&sub2;,,5 ug/ml EtBr.
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Diese teilweisen Digestionen resultierten in der Bildung von etwa 30% linearen DNA
Fragmenten voller Länge, wie mit Hilfe von Agarosegel-Elektrophorese festgestellt wurde.
Da die verwendeten Restriktionsenzyme Erkennungsstellen aufweisen, die durch das
gesamte DNA Fragment verstreut sind, kann diese Fraktion als Linearisiert erachtet werden
an quasi Zufallsstellen innerhalb des Klons. Diese lineare DNA wurde gereinigt durch
Zentrifugierung in einem Dichtegradienten von Cäsiumchlorid (EtBr) zur Eliminierung von
nicht digestierter geschlossener zirkularer DNA, gefolgt durch präparative Agarosegel-
Elektrophorese zur Eliminierung von Molekülen mit Einzelstrangschnitten und Molekülen, die
mehr als einmal geschnitten worden waren.
3. Insertion des Oligonukleotids in den linearisierten HindIII-B Klon.
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Von jeden dieser drei partiellen Digestionen wurde 1 ug der linearisierten DNA
ligasiert mit 0,03 ug des Kinase behandelten Oligonukleotids (ein fünfzigfacher molarer
Überschuß) in einem Volumen von 15 ul.
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Koncatemere des ligasierten HindIII-B Fragmentes und Oligonukleotide wurden mit
EcoRI digestiert unter Bildung von Fragmenten voller Länge mit Oligonukleotidhälften an
jedem Ende. Diese Fragmente wurden isoliert durch präparative Agarosegel-Elektrophorese
und Elektroeluierung. Dann wurden die drei DNA Präparate, die aus den drei partiellen
Digestionen stammten kombiniert. Von dieser DNA wurden 0,5 ug rezirkuliert durch
Ligasierung der halben EcoRI Erkennungsstellen an beiden Enden der Linearen HindIII-B
Fragmente in einem Volumen von 400 ul. DNA wurde aus diesem Ligasierungsgemisch
ausgefällt und in 10 ul 10 mM Tris-HCL, pH 7,5, 1 mM EDTA gelöst. Ein E. coli Stamm DH5
wurde transformiert mit dieser DNA unter Anwendung der Methode von Hanahan (DNA
Cloning, a Practical Approach, LR. L. Press Ltd., U. K. vol. 1, S. 119-135 (1985)). Dies
resultierte in einer Reiche von mutanten HindIII-B Klonen, wobei jeder das Oligonukleitid an
der quasi Zufallsstelle insertiert hatte.
4. Analyse der rekombinanten Klone.
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Die Integrität der rekombinanten Klone wurde untersucht mit Hilfe von Digestion mit
Restriktionsenzymen BamHI und HindIII gefolgt durch Agarosegel-Elektrophorese. Die
Insertionsstelle des Oligonukleitids in jedem dieser rekombinanten Klone wurde bestimmt mit
Hilfe von Doppeldigestionen mit Restriktionsenzymen BamHI + EcoRi und BgIII + EcoRI,
gefolgt durch Agarosegel-Elektrophorese.
5. Rekonstruktion von mutantem Pseudorabies Virus.
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Das Klonen von viralen subgenomen Fragmenten in dem Kosmidvektor pJBF und
Regeneration von PRV von subgenomen Fragmenten wurde durchgeführt wie beschrieben
durch Van Zijl et al., J. Virol. 62, 2191-2195 (1988). Das Klonen von Us, enthaltend HindIII-B
Fragment von PRV Stamm NIA-3 wurde beschrieben durch Quint et al., J. Gen. Virol. 68,
523-534 (1987).
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Um die viralen Inserts frei von Vektorsequenzen zu erhalten wurde das Kosmid DNA
digestiert mit EcoRI und das Plasmid DNA wurde digestiert mit HindIII, gefolgt durch
Reinigung der viralen Inserts durch Glyzeringradientzentrifugierung. Die viralen Inserts von
den Kosmind Klonen C-179, C-27 und C-443 als auch das HindIII Fragmend B wurden
verwendet für die Konstruktion der Wildtyp PRV cosNIA-3. Diese kombinierten Fragmente
enthalten die vollständige genetische Information von PRV.
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Für die Konstruktion der mutanten Viren, wurden Kosmid Klone C-179, C-27 als auch
entweder C-443 für die Konstruktion der Δ28K Mutante oder C-447 (Kosmid mit einer
Deletion von 8 kbp wegen der die Überlappung mit dem HindIII Fragment B reduziert ist) für
die Konstruktion der PK Mutante und schließlich die Mutante HindIII Fragmente B verwendet.
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In Fig. 5 werden diese Konstruktionen schematisch gezeigt in Relation zu der
Restriktionsmappe von NIA-3. Die vertikalen Pfeile zeigen die Instertionsstellen des
Oligonukleotids an.
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Kotransfektion von PK15 Zellen mit diesen Fragmenten ergaben nach homologer in
vivo Rekombination zwischen den überlappenden Enden diese Fragmente infektiösen Virus
mit der eingeführten Mutation in dem HindIII Fragment B. Das auf dieser Weise erhaltene
mutante Virus wurde drei mal der Plaquereinigung in SK6 Zellen unterworfen. Dann wurde
DNA von diesen mit diesen Mutanten infizierten SK6 Zellen isoliert, gefolgt durch Digestion
dieser DNA mit BamHI und BamHI + EcoRI. Diese DNA Präparate als auch DNA, die von
NIA-3
infizierten Zellen isoliert war und auf die gleiche Weise digestiert war wurden durch
Agarose-Elektrophorese analysiert.
6. Konstruktion von NIA-3 PK und Δ28K Mutanten.
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Unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Technik wurde das mutante Virus
M110 (PK&supmin;) erhalten durch Rekombination von Fragmenten C-179, C-27, C-447 und HindIII-
B Klon 549 mit einer Insertion in dem Translations-Terminations-Oligonukleotid in dem 5'
Ende des Proteinkinasegens (Fig. 4A). Das Vorliegen des Oligonukleotids verursacht eine
frühe Termination der Translatin der PK&supmin; mRNA.
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Die Integrität des Oligonukleotids und der flankierenden viralen DNA Sequenzen als
auch die genaue Position der Insertion des Oligonukleotids innerhalb des PK Gens wurden
bestimmt durch DNA Sequenzanalyse unter Anwendung der Methode von Sanger und
Coulson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)).
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Zu diesem Zweck wurde DNA des HindIII-B Klons 549 digestiert mit den
Restriktionsenzymen Sau3A + EcoRI und insertiert in den Vektor M13mp11, der mit BamHI +
EcoRI digestiert worden war. Sequenzanalyse dieses rekombinanten Plasmids ergab, daß
keine Deletionen an irgendeiner Seite der Insertionsstelle des Oligonukleotids vorlagen. Die
Insertionsstelle des Oligonukleotids befand sich zwischen Basispaaren 457 und 458
bezogen auf das 5'ende des PK Transkripts, wie in Fig. 2A durch vertikale Pfeile angezeigt
wird.
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In einem zweiten Versuch wurde die Rekonstruktion der PRV PK&supmin; Insertionsmutante
wiederholt. Der Versuch wurde durchgeführt wie vorstehend beschrieben. Dies resultierte im
mutanten Virus M119 (PK&supmin;).
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Oligonukleotidinsertionsmutagenese des HindIII-B Fragmentes ergab ebenfalls drei
Klone mit dem Oligonukleotid insertiert an zwei Positionen im 28K Gen (HindIII-B-351 und
357). Diese wurden verwendet, um eine Mutante zu erhalten, in der das 28K Gen zum
größten Teil deletiert ist. Zu diesem Zweck wurde das mutante HindIII-B Fragment 351 als
auch das Fragment 357 mit BgIII + EcoRI digestiert. Beide Enzyme schnitten einmal in
diesen Klonen (BgIII im gp50 Gen und EcoRI im insertierten Oligonukleotid, Fig. 4B), was
zwei DNA Fragmente nach der Digestion zur Folge hatte. Das 4,9 kbp BgIII-EcoRI Fragment
des Mutanten Klons 357 wurde ersetzt durch das 4, 4 kbp BgIII-EcoRI Fragment und Klon
351 mit dem Ergebnis eines Mutanten HindIII-B-Fragmentes mit einer Deletion von etwa 0,5
kbp zwischen den Oligonukleotidinsertionsstellen von 351 und 357. Dies resultierte in der
Deletion des größeren Teils des 28K gens (Fig. 4B). Unter Anwendung der vorstehend
beschriebenen Technik unter 5 wurde ein mutantes Virus weiter bezeichnet als Stamm M113
(Δ28K) erhalten mit Klon 351-357.
7. Wachstum von PK&supmin; und 28K Mutanten in Gewebekulturzellen.
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In SK6 Zellen zeigte der 28K mutante PRV Stamm ein Wachstum, vergleichbar zu
dem von NIA-3. Die PK&supmin; Mutante hatte ein langsameres Wachstum als NIA-3.
Pathogenizität und Immunogenizität
Beschreibung der Versuche
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In Versuchen 1 und 2 wurde die Pathogenizität und Immunogenizität der
Insertionsmutanten M110 (PK&supmin;) und der Deletionsmutante M113 (Δ28K) in 10 Wochen alten
Ferkeln geprüft, die frei von Antikörpern gegenüber PRV waren. 10&sup5; PFU wurde intranasal
verabreicht. Gruppen bestanden aus 8 bis 9 Ferkeln. In Versuch 1 wurde Mutante M110
untersucht, in Versuch 2 Mutante M113. In jedem Versuch waren zwei Kontrollgruppen, d. h.
eine Gruppe (C) infiziert mit Stamm M209 (cosNIA-3) und eine nicht infizierte Gruppe (A).
Acht Wochen nach der Impfung wurden alle Ferkel mit Stamm NIA-3 infiziert, um die
Immunogenizität zu bestimmen. Die 18 Wochen alte nicht infizierte Gruppe (A) wurde als
Kontrolle verwendet.
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Stamm M209 (cosNIA-3) ist ein virulentes PRV, regeneriert von Kosmidfragmenten
C-179, C-27, C-443 und HindII-B Fragment von NIA-3.
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In Versuch 3 wurde die Pathogenizität von M119 (PK&supmin;) in 3 Wochen alten Ferkeln
erforscht, die frei von Antikörpern gegenüber PRV waren. Ebenfalls getestet wurde die
Pathogenizität von PRV PK&spplus; (M120), wobei dieses Virus erhalten wurde nach Reparatur des
Defektes im PK Gen von M119 (PK&supmin;). Diese Rettung erfolgte durch Cotransfektion in SK-6
Zellen des M119 Virus DNA und BamHI Fragment 10 des NIA-3 Virus DNA. BamHI
Fragment 10 überlappt das PK Gen. Wenn die Insertion des PK Gens der einzige Grund der
Pathogenizitätsherabsetzung ist, die im Versuch 1 beschrieben wird, muß die Rettung des
PK Gens zu einem Virus, M120 (PK&spplus;) führen, daß die Virulenzeigenschaften des
Kontrollstammes M209 (cosNIA-3) hat. Die Testgruppen A, B und C bestanden in jedem Fall
aus 5 Wochen alten SPF Ferkeln frei von Antikörpern gegenüber PRV. Die Ferkel von
Gruppen A, B und C wurden intranasal infiziert mit 105 PFU des Virusstammes M118 (PK&supmin;),
M120 (PK&spplus;), bzw. M209 (cosNIA-3).
Pathogenizität
Ergebnisse der Versuche 1 und 2
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Nach "Impfung" mit M209 (cosNIA-3) wurden die normalen klinischen Symptome
beobachtet wie kein oder stark verringerter Appetit, Lethargie, Erbrechen, Nießen, nasale
Exkretion und Fieber. Einige der Tiere zeigten auch neurologische Phenomene zum
Zeitpunkt der Beobachtung. In beiden Versuchen starben zwei von den sechs Tieren. Die
folgende Tabelle faßt die Virulenzdaten zusammen.
Tabelle A Versuch 1.
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*) Neurologische Symptome
(Ataxy, Paralyse, Tremor)
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In der Gruppe, die mit mutanter M110 (PK&supmin;) geimpft worden war, blieben die
klinischen Symptome nach der Impfung begrenzt auf Lethargie, Appetitverlust bei einigen
Tieren und Ansteigen der Körpertemperatur. Die Körpertemperaturen, die nach der Impfung
mit M110 (PK&supmin;) beobachtet wurden, waren deutlich niedriger als nach der Infektion mit M209
(cosNIA-3).
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Ernstliche Symptome von Erkrankungen, zu denen neurologische Symptome
gehören, traten nach der Infektion mit Stamm M113 (Δ28K) auf. In der M113 Gruppe starben
5 von 7 Ferkeln. Drei starben am Tag 7 und zwei am Tag 8. Von den übrig gebliebenen
Ferkeln blieb eins chronisch krank.
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Der mittlere Gewichtsanstieg der mit M110 (PK&supmin;) infizierten Gruppe war vergleichbar
mit demjenigen der nicht infizierten Kontrollgruppe. Dies ist in Übereinstimmung mit den
leichten klinischen Befunden nach Impfung mit dieser Mutante.
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Gewichtsverlust wurde beobachtet nach Infektion mit Mutantem M113 (Δ28K). Die
Gewichtskurve der M113 Gruppe ist das Ergebnis der Gewichtskurven der zwei Ferkel, die
nach der Infektion überlebt hatten. Eines dieser Ferkel blieb chronisch krank und sein
Gewicht verringerte sich nach und nach. Das Gewicht der anderen Ferkel stieg wieder an,
beginnend am Tag 9 nach der Infektion.
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Eine Verringerng der Menge an ausgeschiedenem Virus wurde nach der Impfung mit
M110 (PK&supmin;) beobachtet.
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Vier Tage nach der Impfung wurden zwei Ferkel von jeder Gruppe getötet und
verschiedene Gewebe/Organe (insgesamt 19 je Ferkel) wurden als Proben für
Virusisolierung verwendet. Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse wird in Tabelle B
wiedergegeben.
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Die Ergebnisse zeigen somit, daß in 10 Wochen alten Schweinen Stamm M110 (PK&supmin;)
eine Virulenz zeigt, die beachtlich verringert ist verglichen mit dem älteren Virus. Im
Gegensatz dazu hat Stamm M113 (Δ28K) eine Virulenz, die mit derjenigen des älteren
Stammes vergleichbar, ist.
Tabelle B
Virus Replikation in Organen (4 Tage nach der Impfung) Versuch 1.
Ergebnisse von Versuch 3
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Nach intranasaler Impfung von 3 Wochen alten seronegativen Ferkeln in Gruppe C
mit M209 (cosNIA-3) wurden klinische Symptome, charakteristisch für eine virulente PRV
Infektion, beobachtet. Diese waren nicht nur allgemeine Symptome von Krankheit, wie
Fieber - die mittlere Körpertemperatur der Gruppe betrug über 40ºC während 6 Tagen -
verringerter Appetit, Lethargie, Erbrechen, Nießen, nasale Exkretion, sondern auch
neurologische Symptome wie Krämpfe, Zittern, Koordinationsstörungen und paralytische
Symptome. Vier von den fünf geimpften Ferkeln starben an Pseudorabies am Tag 6, 6, 7
bzw. 7 (Durchschnittszeit bis zum Tod 6,5 Tage). Die Ferkel von Gruppe B, die mit M120
(PK&spplus;) infiziert worden waren, zeigten die gleichen allgemeinen und neurologischen
Symptome wie in Gruppe C beobachtet. In Gruppe B starben drei von fünf infizierten Ferkeln
an Pseudorabies am Tag 6, 7 bzw. 12 (Durchschnittszeit bis zum Tod 8,3 Tage). In Gruppe
A, die mit M119 (PK&supmin;) infiziert worden war wurden nur schwache allgemeine Symptome von
Krankheit am Tag drei und vier nach der Impfung beobachtet: Die fünf Ferkel hatten eine
mittlere Körpertemperatur über 40ºC und ein Ferkel war am fünften Tag nach der Impfung
lethargisch. Appetitsverlust wurde nicht beobachtet und der Gewichtsanstieg zwischen Tag 1
und Tag 18 war unverändert im Vergleich mit demjenigen der Kontrollferkel.
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Die Ferkel in Gruppen A, B und C schieden das Virus in der Speichelflüssigkeit vom
Tag 1 bis einschließlich zum Tag 9 nach der Infektion aus. Die Durchschnittsmenge an
beobachtetem Virus zwischen den Tagen 1 und 9 in den Mundrachen-Abstrichen der Ferkel
von jeder Gruppe zeigt ebenfalls keine großen Unterschiede.
Immunogenizität
Ergebnisse von Versuch 1
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Ferkel, die mit M110 (PK&supmin;) und M209 (cosNIA-3) "geimpft" worden waren, erwiesen
sich als sehr gut geschützt gegen eine Herausforderungsinfektion mit NIA-3 acht Wochen
nach "Impfung". Wachstumsverzögerung, klinische Symptome, signifikanter Anstieg der
Körpertemperatur und Verringerung der Nahrungsaufnahme wurden nicht beobachtet. Die
Kontrollferkel zeigten nach der Herausforderung die normalen klinischen Symptome wie
verringerter Appetit, Lethargie, Erbrechen, Nießen, nasale Exkretion und Fieber. Alle
Kontrollferkel überlebten die Herausforderungsinfektion. Die Wachstumsverzögerung der
Kontrollferkel betrug 15 Tage.
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Es ist beachtenswert, daß die Ferkel, die mit mutantem Virus M110 (PK&supmin;) geimpft
worden waren das Virus während sieben Tagen nach der Herausforderung ausschieden. Die
sehr hohen neutralisierenden Antikörpertiter (höher als 1000) im Blut verringerten den
Zeitraum und den Spiegel der Virusausschüttung, waren jedoch nicht in der Lage letztere
vollständig zu verhindern. Die beobachtete Virusreplikation wurde bestätigt durch das
Ansteigen des Serum Neutralisationstiters nach der Herausforderung.