DE3587214T2

DE3587214T2 -

Info

Publication number: DE3587214T2
Application number: DE85901936T
Authority: DE
Inventors: Leigh Michael Kew Vic 3101 Dyall-Smith; Hamilton Ian Canterbury Vic 3126 Holmes
Original assignee: University of Melbourne
Current assignee: University of Melbourne
Priority date: 1984-04-27
Filing date: 1985-04-29
Publication date: 1993-07-01
Anticipated expiration: 2005-04-30
Also published as: EP0180603A1; US5395759A; JPS61501958A; AU4297085A; CA1339735C; DE3587214D1; EP0180603B1; WO1985005122A1; AU591058B2; US5741698A; EP0180603A4

Description

Diese Erfindung betrifft Rotaviren, Gene, Gensegmente, klonierte Gene und daraus erhaltene clonierte Segmente und Produkte, einschließlich diagnostischer Reagenzien und Impfstoffe.
Der Rotavirus wird nun von der Weltgesundheits-Organisation als Hauptursache kindlicher Gastroentheritis angesehen, wobei der Kontrolle dieser Krankheit durch Herstellung geeigneter Impfstoffe hohe Priorität eingeräumt wurde (1). Kreuzneutralisierungs-Untersuchungen zeigen vier (oder möglicherweise fünf) (2-4) Serotypen humaner Rotaviren, wobei Tierstudien anscheinend darauf hinweisen, daß gegen die verschiedenen Serotypen nur wenig gemeinsamer Schutz vorhanden ist (5). Infolgedessen sollte ein eventueller Impfstoff all die bekannten Serotypen umfassen. Kürzlich wurde gezeigt, daß der Serotyp des Virus durch das äußere Hauptglycoprotein der Hülle (6-10; ein Virusoberflächenprotein) bestimmt wird, und die dieses Protein codierenden Gensegmente eines Kalb- (UK) und eines Affen-(SA11) Rotavirus wurden vor kurzem sequenziert (11, 12). Bis heute wurde jedoch kein solches Gen des humanen Rotavirus analysiert. Wir clonierten und sequenzierten infolgedessen das dieses Protein codierende Gen eines humanen Rotavirus. Hu/5 (in Melbourne, Australien isoliert) gehört zum Serotyp 2. Der humane Rotavirus Hu/Australia/5/77 wurde ausführlich in Dyall-Smith & Holmes, Nucleic Acid Research 12 (1984), 3973, und Albert & Bishop, J. Med. Virol. 13 (1984), 377-383, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Gen eines humanen Rotavirus, ein cloniertes Gen eines Rotavirus, die Verwendung derartiger Gene, um Expression antigener viraler Proteine in bakteriellen/procaryontischen oder eucaryontischen Expressionssystemen zu erhalten und das erhaltene Expressionsprodukt und weiter daraus erhaltene Impfstoffe und diagnostische Reagenzien zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt auch das doppelsträngige RNA (dsRNA)-Gensegment, das das äußere Hauptglycoprotein der humanen Rotavirus-Hülle codiert, wobei dieser humane Rotavirus, unbeschadet der Verallgemeinerung des vorher Gesagten, dieser Rotavirus Hu/Australia/5/77 sein kann (Serotyp 2), eine DNA Kopie davon, einen Clon davon oder einen Vektor oder eine diesen Vektor enthaltende Wirtszelle, davon abgeleitete Peptidsequenzen zur Verfügung. Von besonderem Interesse sind Vectoren wie beispielsweise daraus erhaltene Plasmide, und Wirtszellen, die diese enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Material zur Verfügung, welches eine Nucleotidsequenz, die wenigstens einen Teil des äußeren Hauptglycoproteins eines Rotavirus codiert.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung wenigstens eine der Nucleotidsequenzen von Nucleotid Nummer 291- 357, 480-513 und 657-720 des äußeren Hauptglycoprotein-Gens eines Rotavirus zur Verfügung.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung wenigstens eine der Aminosäurensequenzen von Aminosäure Nummer 82-103, 144-155 und 204-224, die durch die Nucleotidsequenzen des äußeren Hauptglycoprotein-Gens eines Rotavirus codiert werden zur Verfügung.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Material zur Verfügung, das eine eine Aminosäuresequenz codierende Nucleotidsequenz, oder eine Aminosäuresequenz ist, wobei die Aminosäuresequenz
a) eine Aminosäuresequenz von 22 Aminosäuren ist, welche mit CLYYP anfängt und mit TLS endet, b) eine Aminosäuresequenz von 12 Aminosäuren ist, welche mit YD anfängt und mit SEL endet, oder
c) eine Aminosäuresequenz von 21 Aminosäuren ist, welche mit GIGC anfängt und mit EKL endet, und von einer Nucleotidsequenz, die das äußere Hauptglycoprotein eines Rotavirus codiert abgeleitet wurde.
Spezifische Teile der clonierten Gene werden durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt, und die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Produkte, die daraus erhalten werden, einschließlich Antisera oder Antikörper, die unter Verwendung derartiger Aminosäurensequenzen hergestellt wurden.
Die Erfindung wird durch die folgende Beschreibung beispielhaft beschrieben.

MATERIAL UND METHODEN

Viruswachstum und Reinigung

Der humane Rotavirus Hu/Australia/5/77 (13) wurde in MA104 Zellen gezüchtet und wie zuvor beschrieben (14) gereinigt.

Clonieren der Rotavirus cDNA

Das Herstellungsverfahren der cDNA aus der dsRNA des Rotavirus und dessen Clonierung in die Pstl-Schnittstelle des Plasmids pBR322 wurde kürzlich durch Dyall-Smith et al. (15) beschrieben.

Identifizierung clonierter Kopien des äußeren Haupt-Hüllglycoprotein-Gens des Hu/5-Rotavirus

Da das das äußere Haupthüllglycoprotein codierende UK Kälber- Rotavirusgen (Gen 8 dieses Virus) zuvor cloniert worden war (11), wurde dieses zum Absuchen nach Hu/5-Clonen verwendet. Zur Entfernung von pBR322-Sequenzen, wurde der UK-Gen-8 Clon mit PstI gespalten und das Insert mittels Agarosegelelektrophorese abgetrennt. Das Insert wurde anschließend mittels Nick-Translation mit ³²P markiert (16) und zur Hybridisierung mit lysierten, an Nitrocellulose gebundenen Bakterienkolonien verwendet (17).

Northern blot Analyse

Hu/5-dsRNA wurde auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt und wie zuvor beschrieben (7) an Aminophenylthioether (APT)-Papier immobilisiert, mit der Ausnahme, daß die RNA oben auf das Gel (das nicht durch Vertiefungen unterteilt war) aufgetragen wurde. Nach Transfer wurde der Blot (in der Länge) in Streifen geschnitten und mit der ³²P-markierten cDNA oder der Nicktranslatierten DNA-Sonden hybridisiert. Markierte cDNA wurde aus den Hu/5-Segmenten 7, 8 und 9 der dsRNA (mittels Elektrophorese auf Agarosegelen isoliert) unter Verwendung Reverser Transkriptase (Life Sciences Inc. U.S.A) und unspezifischer Primer-DNA (aus Kälber-Thymus DNA hergestellt (18)) hergestellt. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie folgt: die Blots wurden 15 min lang bei 60ºC in 5x Denhardts Lösung, welche 10 mM HEPES (pH 7,0), 0,1% SDS, 3x SDS, 10 ug/ml E.coli t-RNA und 18 ug/ml Hering-Sperma-DNA enthielt vorhybridisiert, und anschließend mit der entsprechenden DNA- Sonde hybridisiert (18 Stunden, 65ºC). Die Blots wurden zweimal 15 min lang bei 60ºC in 0,2xSSC, das 0,1% SDS enthielt, gewaschen, und einem Röntgenfilm exponiert.

DNA-Seguenzierung

Der pBR322-Clon wurde mit PstI gespalten, und das Insert in die Pstl-Schnittstelle von M13 mp8 cloniert (19). Die Sequenzen wurden aus der einzelsträngigen M13-Matrizen- DNA mittels der Kettenabbruchmethode (20) unter Verwendung von Exonuclease III behandelten Restrictionsfragmenten als Primer (außer dem EcoRI/Taql-Fragment) bestimmt. Ein zu dem 3'-Ende des mRNA-Sinn-Stranges komplementärer synthetischer Primer (5'-dGGTCACAT-3') wurde ebenfalls verwendet.

Elektrophorese der Rotavirus-dsRNA

Doppelsträngige RNA (dsRNA) wurde aus gereinigten Viruspräparationenen unter Verwendung einer vereinfachten Methode nach Herring et al. (22) extrahiert. In Kürze, 5 ul einer gereinigten Virus-Suspension wurde zu 200 ul 1% Natrium Dodecylsulfat (SDS) enthaltenden 0,1 M Natrium-Acetatpuffer zugegeben, und 1 Minute lang mit einem gleichen Volumen einer Phenol/Chloroform-Mischung fest geschüttelt. Die Phasen wurden mittels kurzer Zentrifugation (2', 10.000g) getrennt, und ein Aliquot der wäßrigen Phase (5-20 ul) mit 20 ul Probenpuffer (25% (v/v) Glycerin, 0,2% Bromphenolblau, 0,4 M Tris-HCI (pH 6,8)) gemischt, und auf einem 10%igen Polyacrylamidgel (Dicke 0,75 mm) unter Verwendung des Lämmli-Puffers (aber ohne SDS) analysiert. Das Gel wurde gemäß der Methode von Hering et al. (22) mit Silber gefärbt, mit der Ausnahme, daß die Incubation in Silbernitrat 30 Minuten anstatt 2 Stunden lang durchgeführt wurde und in der Entwicklungslösung kein Natriumborhydrid enthalten war. Entgasen der Lösungen war ebenfalls unnötig.

Ergebnisse und Diskussion

Es wird auf die beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen, in denen:
Fig. 1 eine Polyacrylamidgelelektrophorese von aus A, WA; B, Hu/5; und C, UK Viren extrahierter Rotavirus-dsRNA. Die elf Gensegmente des WA-Virus wurden vom ausgehend Größten zum Kleinsten nummeriert.
Fig. 2 stellt Northern-blot Hybridisierungen dar, in denen das Gensegment 8 des Hu/5-Rotavirus als das das äußere Haupt-Hüllglycoprotein codierende Gensegment identifiziert wurde. Spur A zeigt einen Teil des mit Ethidiumbromid gefärbten Polyacrylamidgels mit Hu/5-dsRNA (nur die Segmente 5- 11 sind gezeigt). Die RNA Banden wurden auf APT-Papier überführt und dieses anschließend in Streifen (der Länge nach) geschnitten. Die Blots wurden mit mit ³²P-markierten DNA- Sonden, die aus B den RNA Fragmenten 7, 8 und 9 des Hu/5-Virus (zur genauen Lokalisierung dieser Banden), C einem pBR322-Clon des UK-Virus Segment-8 (das Gen, das die äußere Haupt- Hüllglycoprotein dieses Virus codiert), und D einem pBR322- Clon des Glycoproteingens des Hu/5-Virus hergestellt wurden, hybridisiert.
Fig. 3 ist eine Zusammenfassung der zur Bestimmung der Nucleotidsequenz der clonierten DNA-Kopie des dsRNA- Gensegmentes des Hu/5-Rotavirus verwendeten Sequenzierungstrategie. Die Zahl der Nucleotide ist unter der den Clon anzeigenden Linie angegeben, und die zur Herstellung von Sequenzprimern verwendeten Restrictionsschnittstellen sind unmittelbar darunter angegeben. (AluI, EcoRI, Taql, BglIII, HincII). Ein synthetischer, zu dem 3'-Ende der Sinn-mRNA complementärer Primer (5'-dGGTCACAT-3'; Primer P) wurde ebenfalls verwendet. Die Orientierung des Clons ist dergestalt, daß der mRNA-Sinn DNA-Strang in der 5'- 3' Richtung angegeben ist.
Fig. 4 stellt eine Nucleotidsequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des Sinn-mRNA DNA-Stranges des Clons von Segment-8 des Hu/5-Rotavirus dar. Die sich im Leseraster befindlichen Terminationscodons sind unterstrichen.
Fig. 5 stellt einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz eines Teils des äußeren Haupt-Hüllglycoproteins von Hu/5 mit den entsprechenden Bereichen des SA11- und UK- Rotavirus dar.
Das Rotavirusgenom besteht aus elf dsRNA-Segmenten, die bei einer Gelelektrophorese ein charakteristisches Bandenmuster ausbilden; den Virus-Elektropherotyp (24). Das Gelmuster genomischer RNA des humanen Rotavirus Hu/5 (Hu/Australia/5/77) (13), Wa- (25) (humaner Serotyp 1) und UK- Viren (26) sind in Fig. 1 gezeigt und zeigen deutlich, daß Hu/5, verglichen mit den "langen" Gelmustern der anderen zwei ein "kurzes" Muster (infolge der Positionen der Segmente 10 und 11( (27, 14) aufweist. Das "kurze" Muster wurde kürzlich mit den humanen Rotaviren des Serotyps 2 in Verbindung gebracht (27-29) und es wurde tatsächlich, als der Hu/5-Virus in diesem Labor gemäß der Methode von Thouless et al. (30) (unter Verwendung von freundlicherweise von M. Thouless und WA zur Verfügung gestellter typisierender Antisera gegen 52 (31) und SA11 (32) als Serotypen 1-, 2- und 3-Referenzstämme) serotypisiert wurde (4, 33) gefunden, daß dieser dem Serotyp 2 (Daten nicht gezeigt) angehören.
Hu/5 genomische dsRNA wurde in DNA umgewandelt und in die PstI Schnittstelle von pBR322 wie zuvor für den UK-Rotavirus beschrieben (15) cloniert. Clone des äußeren Haupt- Hüllglycoproteins wurden unter Verwendung einer von dem clonierten Gen des Glycoproteins des UK-Kälber-Rotavirus (11) hergestellter Sonde (mittels Nick-Translation mit ³²P markiert) identifiziert. Die Identität von einem dieser Clone wurde mittels Northern Blot Analyse, mittels der dieses Gen auch dem Segment-8 des humanen Hu/5-Rotavirus (Fig. 2) zugeordnet werden konnte, bestätigt. Dieser Clon wurde gemäß der in Fig. 3 gezeigten Strategie sequenziert; die gesamte Sequenz ist in Fig. 4 gezeigt. Der Clon stellte eine Kopie des Glycoproteingens in voller Länge dar, da sie a) die gleiche Länge (d. h. 1062 bp) wie die entsprechenden UK- und SA11-Gene aufweist, und b) die charakteristischen konservierten 5'- und 3'- terminalen Sequenzen (34, 35) besitzt. Sie besitzt einen offenen Leserahmen (die anderen Leserahmen besitzen mehrere Stop-Codons), der ein Protein von 326 Aminosäuren codieren kann, und 5'- und 3'- nichtcodierende Regionen von 48 bzw. 36 bp Länge. Diesbezüglich ist sie mit den UK- und SA11-Glycoproteingenen identisch (11, 12). Die Homologie der Basensequenzen der Hu/5-, SA11- und UK-Glycoproteingene sind wie folgt: Hu/5 UK oder Sall = 74%, und UK : SA11 = 77,6%. Sie sind offensichtlich eng miteinander verwandt.
Bei Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Hu/5-Glycoproteingens mit denen von UK und SA11 (Fig. 5) wurde sogar ein noch größeres Ausmaß an Ähnlichkeiten beobachtet. Die paarweisen Vergleiche der Aminosäuresequenz-Homologien sind: Hu/5 : UK = 75,8%, Hu/5 : SA11 = 75,2%, UK : SA11 = 85,6%. Untersuchungen der UK- und SA11-Viren ergaben, daß die Glycosylierung dieser Proteine via Asparagin erfolgt und aus einfachen ("hoch-Mannose") Oligosaccharid-Resten besteht (36- 38). Untersuchungen zeigen, daß alle drei Proteine eine mögliche Glycosylierungstelle (des Typs Asn-X-Thr/Ser) bei dem Rest 69 besitzen, die im Falle von SA11 die einzige derartige Stelle darstellt. Die Hu/5- und UK-Proteine besitzen ebenfalls mögliche Stellen bei den Resten 238 (beide), 146 (Hu/5) und 318 (UK), wobei jedoch die Verteilung der Kohlenhydrate in diesen Proteinen nicht bekannt ist.
In Eucaryonten benötigen alle Glycoproteine eine Signalsequenz zum gerichteten Transport durch das Endoplasmatische Reticulum (39). Unter Verwendung allgemeiner, von Perlman und Halvorson vorgeschlagener Regeln (40) kann eine typische Signalsequenz in den ersten 25 Resten der 3 Rotavirus-Glycoproteine erkannt werden. Ihre wahrscheinlichen hydrophoben Kernsequenzen (Reste 6-19) folgen einem geladenen Glut (Rest 5). Die wahrscheinlichen Schnittstellen befinden sich nach Serin an Position 15 oder nach Position 25 (Ser/Thr). Kürzlich durchgeführte Studien mit dem SA11-Virus (41) zeigten, daß eine abgespaltene Signalsequenz dieses Proteins, das ein Molekulargewicht aufweist (1.500 MW), das mit der zuvor vorhergesagten Schnittstelle übereinstimmt. Es ist interessant, daß die ersten 25 Reste aller drei Glycoproteine höher konserviert sind, als die nachfolgenden 25 Reste.
Obwohl die Glycoproteine von Hu/5, UK und SA11 in ihrer Aminosäuresequenz ziemlich ähnlich sind, müssen sie sich in wichtigen antigenen Bereichen unterscheiden, da sich die drei Viren vom Serotyp her unterscheiden, d. h. Hu/5 ist ein menschlicher Serotyp 2 Virus, UK gehört zu einem Kälberserotyp (33), und SA11 ist serologisch gesehen, obwohl er vom Affen abstammt, ein humaner Serotyp 3 (33). Ergebnisse von Verdrängungsexperimenten, die unter Verwendung monoclonaler, gegen SA11 gerichteter Antikörper durchgeführt wurden zeigten, daß nur ein oder möglicherweise zwei Epitope bei der Neutralisation eine Rolle spielen (42).
Um die wichtigsten antigenen Regionen des Glycoproteins zu lokalisieren, wurden SA11-Rotavirus neutralisierende monoclonale Antikörper verwendet. Durch Selektion von gegen Neutralisierung resistenter Mutanten und Sequenzierung ihrer Glycoproteingene war es möglich, drei (A, B und C) wichtige Regionen (M.L. Dyall-Smith, I. Lazdins, G.W. Tregear und I.H. Holmes, Manuskript zur Veröffentlichung in Vorbereitung) zu identifizieren. Diese sind die Aminosäuren 82-103(A), 144- 155(B) und 204-224(C), wobei die Region C als am wichtigsten erscheint. Eine Mutation in der C-Region bei Aminosäure 211 bewirkte, daß ein polyclonales antivirales Serum den Virus nur noch zehnfach schwächer neutralisieren konnte, was anzeigt, daß dies die wichtigste Stelle im Hinblick auf Antigenität darstellt.
Die Sequenzdaten (vorstehend) unterstützen die Vielfalt serologischer Beweise (43-45), daß Rotaviren eine eng miteinander verwandte Gruppe darstellen. Tatsächlich scheinen sie viel mehr miteinander verwandt zu sein, als die drei Serotypen der Säuger-Reoviren, die vom Aufbau und epidemiologisch den Rotaviren ähneln (46). Die das Serotyp spezifische Protein der drei Reovirus-Serotypen codierenden Gene sind nur zu 1-12% miteinander verwandt (47). Die Tatsache, daß die Affen-Rotaviren, SA11 und Rhesus (MM18006) serologisch eng miteinander verwandt sind (33), jedoch im Abstand von 20 Jahren isoliert wurden (48, 49) läßt ebenfalls vermuten, daß Rotavirus-Serotypen, nicht wie Influenza-A- Subtypen, die einen Antigen-Drift aufweisen (50), bezüglich der Antigene ziemlich stabil sind. Obwohl noch viele der das Glycoprotein codierenden Rotavirengene untersucht werden müssen, ermutigt die begrenzte Anzahl bis jetzt entdeckter humaner Serotypen und das anscheinend geringe Ausmaß der Antigen-Drift zur Entwicklung von Impfstoffen gegen humane Rotaviren.
Zur Herstellung von Impfstoffen wird es im allgemeinen das Beste sein, das erfindungsgemäße genetische Material der Rotaviren dieser Erfindung in ein Bakterium einzubringen, was gemäß dem Verfahren von Formal et al. (51), Silhavy et al. (52) oder Roberts et al. (53) durchgeführt werden kann.

Literaturstellen

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Die Ansprüche stellen einen Teil dieser Beschreibung dar. Veränderungen und Anpassungen an das oben Beschriebene können durchgeführt werden, ohne von der Zielsetzung und dem Bereich dieser Erfindung abzugehen, was jedes neue Merkmal und Kombination der hierin offenbarten Merkmale einschließt.

Claims

1. Isolierte DNA-Sequenz, die das äußere Haupt-Hüllglycoprotein eines humanen Rotavirus codiert, wobei die Sequenzen im wesentlichen die folgende Nucleotidsequenz umfaßt:

und biologisch funktionelle Varianten davon.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin das äußere Haupt- Hüllglycoprotein vom humanen Serotyp 2 ist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 2, worin der Rotavirus vom humanen Serotyp 2 Hu/Australia/5/77 ist.

4. Fragment der DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei das Fragment wenigstens eine Nucleotidseguenz ausgewählt aus den Nucleotiden 291 bis 357; 480 bis 513; oder 657 bis 720 ist.

5. Isoliertes Polypeptid, das das äußere Haupt-Hüllglycoprotein eines humanen Rotavirus ist, und eine Aminosäuresequenz besitzt, welche im wesentlichen umfasst:

und biologisch funktionelle Varianten davon.

6. Das isolierte Polypeptid nach Anspruch 5, das das äußere Haupt-Hüllglycoprotein eines humanen Rotavirus vom Serotyp 2 des humanen Rotavirus Hu/Australia/5/77 ist.

7. Isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens eine der Sequenzen aufweist, ausgewählt aus:

CLYYPAEAKNEISDDEWENTLS,

YDNTSELDASEL, oder

GIGCKTTDVNTFEIVASSEKL.

8. Isoliertes genetisches Material, das ein äußeres Haupt-Hüllglycoprotein-Polypeptid eines humanen Rotavirus codiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus:

a) einer Aminosäuresequenz von 22 Aminosäuren, welche mit CLYYP anfängt und mit TLS endet;

b) einer Aminosäuresequenz von 12 Aminosäuren, welche mit YD anfängt und mit SEL endet, oder

c) einer Aminosäuresequenz von 21 Aminosäuren, welche mit GIGC abfängt und mit EKL endet.

9. Isoliertes Polypeptidmaterial nach Anspruch 5, wobei die Aminosäuresequenz von dem äußeren Haupt-Hüllglycoprotein eines humanen Rotavirus abstammt (Hu/Australia/5/77 (Serotyp 2).

11. Impfstoffzusammensetzung zur Behandlung rotavialer Gastroentheritis umfassend ein isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 5 bis 9 in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern.

11. Mit genetischem Material eines humanen Rotavirus transformiertes Bakterium, das zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 5, 6, 7, 8 oder 9 befähigt ist.

12. Vector oder Wirtszelle, die eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthalten.

13. Polypeptid umfassend ein Fragment eines äußeren Haupt-Hüllglycoproteins eines humanen Rotavirus, wobei das Fragment eine Aminosäuresequenz von wenigstens 12 Aminosäuren nach Anspruch 5 umfasst.

14. Diagnostisches Reagenz, dadurch gekennzeichnet, daß es die gesamte oder einen Teil der Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 umfasst.