ES2639122T3 - Composiciones inmunogénicas de glucoproteína G de virus Hendra y Nipah - Google Patents

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Abstract

Una vacuna que comprende: a. un fragmento soluble de la glucoproteína G de Hendra, consistiendo dicho fragmento en los aminoácidos 73 a 604 de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia al menos 95 % idéntica a la misma; b. un complejo inmunoestimulante (ISC, del inglés immunostimulatory complex), comprendiendo dicho ISC una saponina; un fosfolípido seleccionado del grupo que consiste en fosfatidilcolina (PC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), ácido fosfatídico (fosfatidato) (PA), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol fosfato (PIP), fosfatidilinositol bifosfato (PIP2), fosfatidilinositol trifosfato (PIP3), fosforilcolina (SPH), fosforiletanolamina de ceramida (Cer-PE) y fosfoglicerol de ceramida; y colesterol; y c. uno o más excipientes; para su uso en la prevención de una infección causada por virus Hendra y/o Nipah en un caballo o un cerdo, en donde dicha vacuna se administra a dicho caballo o dicho cerdo en una primera dosis y una segunda dosis, en donde cada una de dichas dosis comprende 50-100 μg de dicho fragmento soluble de la glucoproteína G de Hendra.

Description

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La identidad de secuencia u homología a nivel de secuencia de aminoácidos se puede determinar mediante análisis BLAST (del inglés, Basic Local Alignment Search Tool) que usa el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Altschul (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 y Karlin (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268) que se adaptan a la búsqueda de similitud de secuencia. La estrategia usada por el programa BLAST es considerar primer los segmentos similares, con espacios (no contiguos) y sin espacios (contiguos), entre una secuencia de consulta y una base de datos de secuencias, para evaluar después la significación estadística de todas las coincidencias que se identifican y finalmente extraer solo aquellas coincidencias que satisfacen un umbral de significación preseleccionado. Para un tratamiento de aspectos básicos en búsquedas de similitud de secuencia en bases de datos, véase Altschul (1994) Nature Genetics 6, 119-129. Los parámetros de búsqueda para histogramas, descripciones, alineamientos, esperanza (es decir, el umbral de significación estadística para comunicar coincidencias con las secuencias de la base de datos), límite, matriz y filtro (baja complejidad) están en los valores por defecto. La matriz de puntuación por defecto usada por blastp, blastx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), recomendado para secuencias de consulta de más de 85 aminoácidos de longitud.
La vacuna y las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación pueden comprender adicionalmente proteínas G de HeV y/o NiV de diferentes cepas que pueden potenciar adicionalmente los métodos de inmunización de la divulgación.
B. Complejos inmunoestimulantes
De manera general, la presente divulgación proporciona composiciones inmunogénicas, que incluyen composiciones de vacuna, que comprenden formas solubles de glucoproteína G de la envoltura proteica de HeV y/o NiV en combinación con un complejo inmunoestimulante (ISC) y a métodos para usar estas composiciones para la prevención y el tratamiento de infecciones por HeV y/o NiV en un sujeto. En la presente divulgación, la composición de vacuna y/o inmunogénica comprende un complejo inmunoestimulante que actúa como un adyuvante. Tal como se usa en el presente documento, "adyuvante" se refiere a un agente que, aunque no tiene ningún efecto antigénico específico por sí mismo, puede estimular el sistema inmunitario, aumentando la respuesta para un antígeno.
ISC tiene una serie de características que lo hacen un adyuvante ideal para determinadas aplicaciones:
Ahorro de antígeno: Tal como se indica por ejemplo en Wee (2008) Mucosal Immunol. 1, 489-496 en situaciones en las que la disponibilidad de antígeno es limitada o los costes del antígeno son elevados, ISC ha demostrado que permite un ahorro de antígeno de 10 a 100 veces. Muy probablemente esto es debido a una combinación de mayor eficacia o a un mecanismo de acción más apropiado comparado con otros adyuvantes.
Presentación cruzada: Tal como se indica por ejemplo en Schnurr (2009) J. Immunol. 182, 1253-1259, la presentación de antígeno por células presentadoras de antígeno (CPA) normalmente sigue una o dos vías. El antígeno externo normalmente es engullido por las CPA y posteriormente procesado y reexpresado en la superficie de CPA en el entorno de las moléculas de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Entonces son detectables por los linfocitos y, si están presentes los factores/señales coestimuladores correctos, responden de manera apropiada. Los antígenos propios o de cáncer y los antígenos vírico se procesan y se expresan normalmente en el entorno de las moléculas de Clase I, ya que están presentes en el citoplasma de las CPA. La inmunidad eficaz para los antígenos de cáncer y víricos requiere el acceso a la vía de clase I. Esto tiene lugar de manera natural durante la infección vírica o la homeostasis celular (renovación celular de antígenos internos). Los antígenos (víricos o propios) introducidos como vacunas necesitan encontrar su vía desde fuera de la célula hasta la maquinaria de procesamiento de antígenos de la célula y la entrada en la ruta de clase II a la ruta de clase I. Esto puede tener lugar de manera natural en células dendríticas (CD -CPA especializadas) o se puede lograr mediante vacunas con antígenos mezclados con ISC como adyuvante. Este proceso de antígeno de procedencia externa que encuentra su vía para la ruta de Clase I de presentación de antígeno se denomina presentación cruzada. El mecanismo preciso mediante el cual ISC logra una presentación cruzada de antígeno no se ha elucidado por completo, pero puede radicar en la perturbación de membrana de los componentes de ISC.
Respuestas humoral y mediada por células: Tal como se indica, por ejemplo en Maraskovsky (2009) Immunol. Cell Biol. 87, 371-376), en virtud del mecanismo de acción de ISC tanto la parte humoral como la celular del sistema inmune adaptativo están comprometidos. En algunas especies esto es paralelo al perfil de citocinas estimuladas mediante vacuna con este adyuvante. Las respuestas inmunitarias de tipo 1 caracterizadas por la expresión de interleucina-2 y IFN-gamma y la protección frente a patógenos intracelulares (bacterias, protozoos y virus) y las respuestas de tipo 2 caracterizadas por la expresión de interleucina-4 y la generación de anticuerpos neutralizantes para la inmunidad relacionada con la antitoxina y el antipatógeno. ISC proporciona un perfil de citocinas equilibrado entre estos dos extremos, permitiendo una mayor amplitud de la respuesta inmunitaria. Además, una serie de estudios ha demostrado que ISC puede ser eficaz si las vacunas se administran por vía intranasal. Esto permite la sensibilización de las superficies mucosas y por tanto, proporciona una inmunidad relevante en el lugar de entrada del patógeno, de relevancia particular en este caso (inmunidad de la mucosa), véase también Sjölander (2001) Vaccine 19, 4072-4080.
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Criterios de filtración estéril y de fabricación consistente: El tamaño de la partícula de ISC es habitualmente de 40 nm de diámetro, permitiéndola pasar a través de filtros usados para esterilizar preparaciones posteriores en la formulación. Además, se ha aprovechado la tendencia natural de las saponinas triterpenoides, tal como se encuentra en Quil A, a asociarse con colesterol y fosfolípidos en el desarrollo de métodos de fabricación para ISC. Las especies de Quil A que no forman partículas de ISC se extraen por diálisis del producto final. Controlando las proporciones de los componentes, se genera un producto consistente a partir de un espectro heterogéneo de saponinas de Quil A. Esta proporción es importante, ya que la desviación lleva a estructuras que no son las partículas características de 40 nm (hélices, láminas, etc.). La naturaleza del fluido libre del coloide ISC y su capacidad para ser medido usando microscopía electrónica de transmisión, HPLC y otras técnicas hacen que este adyuvante sea susceptible al desarrollo de ensayos de liberación y otras medidas de calidad.
Por tanto, basándose en lo anterior, en algunas realizaciones de la divulgación, la formulación de un complejo inmunoestimulante con una cantidad óptima de glucoproteína G incluye una saponina, un fosfolípido y una molécula de esteroide. En algunas realizaciones de la divulgación, la proporción molar de saponina, fosfolípido, y molécula esteroide está en una proporción 5:1:1. Un complejo inmunoestimulante puede contener, por ejemplo, del 5 al 10 % en peso de saponina, del 1 al 5 % de molécula esteroide y fosfolípido y lo restante comprendiendo glucoproteína G. La glucoproteína G se puede incorporar en el complejo inmunoestimulante bien directamente o mediante acoplamiento químico a una proteína de vehículo (por ejemplo, proteína quimérica o de fusión) tras la incorporación de complejos inmunoestimulantes. Se debería entender que la referencia a un complejo inmunoestimulante incluye la referencia a derivados, equivalentes químicos y análogos del mismo. En algunas realizaciones de la divulgación, el ISC se mezcla por separado de la glucoproteína G de HeV y/o NiV después se mezcla la glucoproteína G con el ISC. En algunas realizaciones de la divulgación, la glucoproteína G se mezcla directamente con la saponina, el fosfolípido y la molécula de esteroide.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la saponina para su uso en la presente invención puede ser Quil A y/o sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina y fue la primera que se describió como que tiene actividad adyuvante por Dalsgaard (1974) Saponin adjuvants, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, pp. 243-254. Se han aislado fragmentos purificados de Quil A mediante HPLC que conservan la actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (EP 0362278), por ejemplo QS7 y QS21 (también conocido como QA7 y QA21). Q21 es una saponina natural derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina que induce linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL), linfocitos Th1 y una respuesta de anticuerpo IgG2a predominante y es una saponina para uso en el contexto de la presente invención. Otras saponinas adecuadas para su uso en el ISC incluyen, pero sin limitación, las subporciones QH-A, QH-B y QH-C de Quil A, aquellas de otras especies que no sean Quillaia saponaria tales como las del género Panax (ginseng), Astragalus, Achyranthes, soja, acacia y Conodopsis. En algunas realizaciones, la saponina se aísla de una especie que no sea Quillaia saponaria.
Los ejemplos no limitantes de fosfolípidos para su uso en las composiciones inmunogénicas y de vacuna de la divulgación incluyen moléculas con estructuras de diacilglicéridos y fosfoesfingolípidos. Los ejemplos no limitantes de fosfolípidos con estructuras de diacilglicéridos incluyen ácido fosfatídico (fosfatidato) (PA), fosfatidiletanolamina (cefalina) (PE), fosfatidilcolina (lecitina) (PC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) o fosfatidilserina (PS). Otro ejemplo no limitante de fosfolípidos con estructuras de diacilglicérido incluye fosfoinositidas. Las fosfoinositidas ejemplares incluyen, pero sin limitación, fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol fosfato (PIP), fosfatidilinositol bifosfato (PIP2) o fosfatidilinositol trifosfato (PIP3). Los ejemplos no limitantes de fosfoesfingolípidos incluyen, ceramida de fosforilcolina (esfingomielina) (SPH), ceramida de fosforiletanolamina (esfingomielina) (CerPE) o ceramida de fosforilglicerol.
Las moléculas esteroides para su uso en las composiciones inmunogénicas y de vacuna de la divulgación incluyen moléculas que incorporan un esteroide como parte de su estructura. Los ejemplos no limitantes de moléculas de esteroides incluyen colesterol, pregnenolona, 17-alfa-hidroxipregnenolona, deshidroepiandrosterona, androstenediol, progesterona, 17-alfa-hidroxiprogesterona, androstenediona, testosterona, dihidroxitestosterona, desoxicorticosterona, 11-desoxicorticosterona, cortisol, corticosterona, aldosterona, estrona, estradiol o estriol.
En algunas realizaciones de la divulgación, los complejos inmunoestimulantes son típicamente, pero sin limitación, estructuras de tipo jaula pequeña de 30-40 nM de diámetro. En algunas realizaciones de la divulgación, la formulación de un complejo inmunoestimulante tiene una proporción molar de Quil A, colesterol, fosfatidilcolina y glucoproteína G en una proporción de 5:1:1. Un complejo inmunoestimulante puede contener, por ejemplo, del 5 al 10 % en peso de Quil A, del 1 al 5 % de colesterol y fosfolípidos y el resto comprendiendo glucoproteína G. La glucoproteína G se puede incorporar en el complejo inmunoestimulante bien directamente o bien mediante acoplamiento a una proteína de vehículo (por ejemplo una proteína quimérica o de fusión) tras la incorporación de proteína en los complejos inmunoestimulantes. Se debería entender que la referencia a un complejo inmunoestimulante incluye la referencia a derivados, equivalentes químicos y análogos del mismo. Por ejemplo, la referencia a un derivado de un complejo inmunoestimulante incluye la referencia a un complejo inmunoestimulante en el que uno o más de Quil A, colesterol, fosfatidilcolina o proteína, por ejemplo, se delecionan, sustituyen por, o en donde el componente en adición a Quil A, colesterol, fosfatidilcolina o proteína se añade al complejo. El equivalente funcional de un complejo inmunoestimulante puede ser un complejo inmunoestimulante en el que uno o más de sus
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La composición inmunoestimulante (250 µg/ml) se combina después con cantidades apropiadas de glucoproteína G soluble de HeV (por ejemplo, 5, 50, 100 µg/ml) y se ajusta al volumen en BIS.
Ejemplo 5: Primer experimento clínico en caballos
Vacuna de ensayo 1: Glucoproteína soluble (sG) de virus Hendra recombinante a 100 µg/dosis adyuvada con 250 µg de complejo inmunoestimulante; el volumen se ajusta a 1 ml/dosis con solución salina.
Vacuna de ensayo 2: Glucoproteína soluble (sG) de virus Hendra recombinante a 50 µg/dosis adyuvada con 250 µg de complejo inmunoestimulante; el volumen se ajusta a 1 ml/dosis con solución salina.
Vacuna de ensayo 3: Glucoproteína soluble (sG) de virus Hendra recombinante a 5 µg/dosis adyuvada con 250 µg de complejo inmunoestimulante; el volumen se ajusta a 1 ml/dosis con solución salina.
Se han recogido datos serológicos y de protección frente a las exposiciones de caballos de dos conjuntos de caballos a los que se les ha dado las vacunas que contienen los niveles más altos de antígeno (50 μg/dosis y 100 μg/dosis).
Serología: Se inmunizaron dos caballos con dos dosis de vacuna (100 μg de sG con ISC) con 21 días de diferencia. La serología posprimovacunación y preexposición confirmó la seroconversión inducida por vacuna a HeV (Tabla 1). Los niveles de anticuerpo neutralizante del virus preexposición fueron comparables con los que habían resultado ser protectores en gatos expuestos a una dosis de otro modo letal del virus estrechamente relacionado con Nipah. El caballo que recibió solo adyuvante (control negativo) no desarrolló anticuerpos para HeV antes de la exposición al virus.
Tabla 1
Caballo n.º
Título de partida Título posprimovacunación Título preexposición
V1
<2 32 1024
V2
<2 32 512
V3 (Control)
<2 <2 <2
Por consiguiente, cada caballo se expuso a HeV vivo en una instalación de contención de NBS4 27 días después de recibir la inmunización de refuerzo. El virus se administró por vía intranasal (DICT50 de 1 x 10 6 ) y por vía oral (DICT50 de 1 x 10 6 ). En el momento de la exposición y durante el período de observación posterior, la identidad del caballo control no fue sabida por el personal implicado en esta parte del trabajo.
Observaciones clínicas para V1: Este caballo permaneció clínicamente bien durante el período de observación tras la exposición a HeV aparte de una infección localizada del sitio de entrada del catéter yugular permanente observado el día 8 después de la exposición. Esto no se asoció con ningún síntoma constitucional de la enfermedad. El caballo fue electivamente eutanasiado el día 9 después de exposición vírica. Las anormalidades en el examen post mortem bruto se limitaron a un lipoma mesentérico de 10 cm (hallazgo incidental) y a una ligera dilatación de los vasos linfáticos en la punta ventral del lóbulo pulmonar cardíaco izquierdo que se atribuyó a los barbituratos. En el examen inicial de los tejidos no se ha encontrado evidencia de lesiones o antígeno de HeV en este caballo.
Observaciones clínicas para V2: Este caballo desarrolló una secreción nasal transitoria leve en el día 3, pero luego permaneció de otro modo bien hasta un aumento de temperatura en el día 6 asociado con una reacción inflamatoria localizada en el sitio de su catéter yugular permanente. Se retiró el catéter, pero la lesión continuó aumentando y el caballo se volvió bastante irritable, de modo que al día siguiente (d 7) la yegua fue tratada con penicilina de acción prolongada. Tanto su temperatura como su temperamento habían vuelto a la normalidad en el día 8 y ella fue eutanasiada electivamente. Las anormalidades en el examen post mortem bruto se limitaron a la dilatación leve de los vasos linfáticos en la punta ventral del lóbulo pulmonar cardíaco derecho que se atribuyó a los barbituratos. En el examen inicial de los tejidos no se ha encontrado evidencia de lesiones o antígeno de HeV en este caballo; El examen detallado se está completando actualmente.
Observaciones clínicas para V3: Este caballo desarrolló una secreción nasal transitoria leve en el día 4, pero luego permaneció de otra manera bien hasta un aumento de temperatura en el día 6 sin signos de localización. Su ritmo cardíaco también había aumentado, y tenía una ligera inclinación de la piel consistente con una deshidratación suave y una apariencia retorcida. Esta constelación de signos es típica de la infección aguda por HeV en las condiciones de laboratorio de los inventores. Su temperatura y frecuencia cardíaca continuaron aumentando durante las siguientes 12 horas (Figura 1 y 2), ella estaba ligeramente deprimida, y por lo tanto fue eutanasiada por motivos humanitarios en el día 7. En el examen post mortem hubo una dilatación moderadamente severa de los vasos linfáticos en los lóbulos cardíacos del pulmón con afectación ventral de 8-10 cm acompañada de engrosamiento pleural y edema.
En el examen histológico hubo vasculitis pulmonar con necrosis fibrinoide de paredes vasculares, edema de septos interlobulares y alveolitis focal necrotizante. Hubo una extensa deposición de antígeno de HeV en el endotelio y en el medio de los vasos sanguíneos en el pulmón; Meninges; Parénquima cerebral; Ganglio trigeminal; Submandibular, bronquial, inguinal y nódulos linfoides renales; bazo; hígado; corazón; paladar blando; glándula suprarrenal;
5 Glomérulos renales; Intestinos delgado y grueso; ovario; Faringe y cornetes, así como centros germinales en el bazo y ocasionalmente miocitos cardíacos. La médula espinal, la bolsa gutural, la vejiga y el bulbo olfativo del cerebro fueron negativos. La histología e inmunohistología fue consistente con infección hiperaguda por HeV.
Análisis molecular de muestras clínicas. No hubo evidencia de desempaquetamiento de HeV en ninguna muestra
10 biológica tomada de los caballos inmunizados V1 y V2 durante el período de observación clínica. De manera específica, no se recuperó genoma de los frotis nasales profundos o de la sangre en ningún día tras la exposición.
Por el contrario, en el caballo V3 no inmunizado, se detectó genoma vírico en los frotis nasales desde el día 3 tras la exposición. Los valores de Ct en disminución en los posteriores días de muestreo sugieren la replicación vírica en
15 las vías respiratorias superiores y es consistente con las primeras observaciones en el laboratorio de los inventores tras la exposición de los caballos no expuestos anteriormente a HeV Redlands 2008. El hallazgo de genoma vírico en la sangre inmediatamente antes de la aparición de fiebre y en todas las secreciones desde entonces, coincidiendo con el reconocimiento más temprano de otros síntomas clínicos tales como depresión es consistente con las primeras observaciones.
20 Tabla 2
Muestras diarias
Día de la muestra
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Caballo n.º V1
Frotis oral
U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U N/A U U U U U 41,4
Frotis rectal
Frotis nasal
Orina
Heces
sangre con EDTA
Caballo n.º V2
U U U U U U U U U U U 41,7/U U U U U U U U U U U U U U 42,0/U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U N/A U U U U U U
Frotis oral
Frotis rectal
Frotis nasal
Orina
Heces
sangre con EDTA
Caballo n.º V3
U U U U U U U U U U U U U U 40,5 U U U U U U U U U 39,9/U U U U U U 42,2/U U U U U 40,3/U 41,9/U
Frotis oral
Frotis rectal
Frotis nasal
Orina
Heces
sangre con EDTA
Muestras post mortem. La PCR de TaqMan (gen N de HeV) confirmó la replicación del virus de exposición en V3 (Control) con diseminación de la infección a múltiples tejidos (Tabla 3). Los niveles más altos de replicación
25 parecieron estar presentes en el pulmón, bazo, riñón, miocardio y tejidos linfoides asociados con las vías respiratorias superiores e inferiores tal como se ha documentado anteriormente. No hubo evidencia de replicación vírica en tejidos de caballos inmunizados (V1 y V2).
Tabla 3
Resultados de TaqMan de gen N de HeV
Tipo de tejido Caballo n.º V1 Caballo n.º V2 Caballo n.º V3
Adrenal U U Vejiga U U Cerebro U U LCR UUU Bolsa gutural U Corazón de caballo U Riñón de caballo U Intestino grueso U Hígado U Pulmón U Linfoide-bronquial U Linfoide-cabeza U
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Resultados de TaqMan de gen N de HeV
Tipo de tejido Caballo n.º V1 Caballo n.º V2 Caballo n.º V3 Linfoide-inguinal U U Linfoide-mandibular U U Linfoide-renal U U Meninges U U Corneta nasal U U Nervioso U U Olfativo U U Lóbulo U U Ovarios
imagen14U Faringe U U Intestino delgado U U Médula espinal U U Bazo UU Ganglio trigeminal U U Útero U U
imagen15
U= Negativo (sin amplificación)
Serología posexposición. Los caballos inmunizados V1 y V2 no tuvieron un refuerzo de título tras la exposición con
5 HeV (Tabla 4). Esto es consistente con una replicación no significativa del virus de exposición en estos animales. No se detectaron anticuerpos en el caballo de control V3 en el momento de la eutanasia en el día 7 posexposición. Se considero que hubo tiempo insuficiente entre la exposición al virus y la muerte de este animal par la generación de anticuerpos detectables, y es consistente con las observaciones previas en el laboratorio de los inventores con HeV Redlands en el caballo.
10 Tabla 4
Caballo n.º
Título de partida Título posprimovacunación Título preexposición Título terminal
V1
<2 32 1024 128, 128 (día 9)
V2
<2 32 512 128, 256 (día 8)
V3 (Control)
<2 <2 <2 <2, <2 (día 7)
Dos caballos (V1 y V2) que se vacunaron con 100 de sG + adyuvante de ISC en un régimen de primovacunaciónrefuerzo seroconvertido para HeV antes de la exposición a HeV. Un caballo (V3) que recibió solo ISC permaneció
15 seronegativo a la exposición vírica.
Tras la exposición con una dosis de otra manera letal de HeV, los caballos inmunizados permanecieron clínicamente bien durante el período de observación, que sobrepasó el tiempo de aparición de HeV en todos los casos inducidos de manera experimental en caballos. Al caballo sin evidencia serológica de inmunidad (V3) se le practicó la
20 eutanasia tras desarrollar signos clínicos consistentes con infección aguda por HeV. No se detectó un refuerzo en el título de anticuerpos tras la exposición en los caballos inmunizados, consistente con la no replicación del virus de exposición en estos animales.
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mediante PCR de TaqMan en uno de los dos pocillos de réplica con el segundo pocillo sin mostrar amplificación (Tabla 6). De manera específica, no se recuperó genoma de los frotis nasales profundos o de la sangre en ningún día tras la exposición.
Tabla 6
Resultados de TaqMan de gen N de HeV
Muestras diarias
Día de la muestra
0 1 2 3 4 5 6 U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U
7 U U U U U U 8 U U U U U U 9 U U U U U U
Caballo n.º V4
Frotis oral
Frotis rectal
Frotis nasal
Orina
Heces
sangre con EDTA
Caballo n.º V5
U 41,9/U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U
Frotis oral
Frotis rectal
Frotis nasal
Orina
Heces
sangre con EDTA
Caballo n.º V6
U U U U U U U U U U 36,2/U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U N/A N/A N/A N/A N/A N/A U U U U U N/A U U U U U N/A U U U U U U
Frotis oral
Frotis rectal
Frotis nasal
Orina
Heces
sangre con EDTA
Código de colores: Negativo (sin amplificación)
Intermedio (Ct 40 45)
Muestras post mortem. No hubo evidencia de replicación vírica en los tejidos de los caballos inmunizados V4, V5 o V6. En una cobaya (la n.º 3) se detectó genoma vírico en sangre (Ct 34,2), cerebro, pulmón y bazo en el día 5 tras la exposición, que corrobora los hallazgos clínicos, histológicos e inmunohistológicos de infección aguda por HeV en
10 este animal (Tabla 7).
Tabla 7
Resultados de taqMan del gen N de HeV
Tipo de tejido
Caballo n.º V4 Caballo n.º V5 Caballo n.º V6 Cobaya n.º 3
Adrenal
U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U 41,4/U U U U U U U U U U U U U U U U U N/A U U U U U U U U U U U
Vejiga
Cerebro
35,6
LCR
Bolsa gutural
Corazón de caballo
Riñón de caballo
Intestino grueso
Hígado
Pulmón
33
Linfoide-bronquial
Linfoide-cabeza
Linfoide-inguinal
Linfoide-mandibular
Linfoide-renal
Meninges
Corneta nasal
Nervioso
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formulación de vacuna también contenía Allhydrogel™ (Accurate Chemical & Scientific Corporation) y oligodesoxinucleótidos CpG (ODN) 2006 (Invivogen) que contienen una estructura principal completa de fosforotioato. Se formularon dosis de vacunas que contienen cantidades fijadas de ODN 2006, cantidades variables de sGHeV e ion de aluminio (en una proporción de peso de 1:25) tal como sigue: dosis de 100 µg: 100 µg de sGHeV, 2,5 mg de ion de aluminio y 150 µg de ODN 2006; dosis de 50 µg: 50 µg de sGHeV, 1,25 mg de ion de aluminio y 150 µg de ODN 2006; y dosis de 10 µg: 5 µg de sGHeV, 250 µg de ion de aluminio y 150 µg de ODN 2006. Para todas las dosis, se mezcló primero Alhydrogel™ y sGHeV antes de que se añadiese ODN 2006. Cada dosis de vacuna se ajustó a 1 ml con PBS y las mezclas se incubaron en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante al menos dos o tres horas antes de la inyección. Cada sujeto recibió la misma dosis de 1 ml para la primera vacuna y el refuerzo y todas las dosis de vacuna se pusieron mediante inyección intramuscular.
Animales. Diez monos verdes africanos (MVA) adultos (Chlorocebus aethiops), que pesaban 4-6 kg (Three Springs Scientific Inc) se enjaularon de manera individual. A los sujetos se les anestesió mediante inyección intramuscular de ketamina (10-15 mg/kg) y se vacunaron con sGHeV en el día -42 (primera vacuna) y en el día -21 (refuerzo). Tres sujetos recibieron dos dosis de 10 µg (MVA 16, MVA 17, MVA 18), tres sujetos recibieron dos dosis de 50 µg (MVA 13, MVA 14, MVA 15), tres animales recibieron dos dosis de 100 µg (MVA 10, MVA 11, MVA 12) y un sujeto (MVA 9) recibió solo adyuvante. En el día 0, se anestesió a los sujetos y se les inoculó por vía intratraqueal con un DICT50 de 1 x 105 (mediana de dosis infecciosa de cultivo tisular) de NiV en 4 ml de medio mínimo esencial de Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich). Se anestesió a los sujetos para examen clínico incluyendo temperatura, frecuencia respiratoria, radiografías de tórax, extracción de sangre y frotis nasal, oral y de mucosa rectal en los días 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 28 posinfección (p.i.). Al sujeto de control (MVA 9) se le practicó la eutanasia en el día 10 tras la infección de acuerdo con los puntos finales humanos aprobados. Todos los otros sujetos sobrevivieron hasta el final del estudio y se les practicó la eutanasia en el día 28 tras la infección. Tras la necropsia, se tomaron diversos tejidos para virología e histopatología. El muestreo de tejidos incluye: conjuntiva, amígdala, oro/nasofaríngeo, mucosa nasal, tráquea, bronquio derecho, bronquio izquierdo, lóbulo superior del pulmón derecho, lóbulo medio del pulmón derecho, lóbulo inferior del pulmón derecho, lóbulo superior del pulmón izquierdo, lóbulo medio del pulmón izquierdo, lóbulo inferior del pulmón izquierdo, nódulo linfático (NL) bronquial, corazón, hígado, bazo, riñón, glándula suprarrenal, páncreas, yeyuno, colon transverso, cerebro (frontal), cerebro (cerebelo), tronco encefálico, médula espinal cervical, glándula pituitaria, NL mandibular, NL salivar, NL inguinal, NL axilar, NL mesentérico, vejiga urinaria, testículos u ovarios, médula ósea femoral. La vacunación se realizó en contención de NBS2. Una línea temporal de las pautas de vacunación, exposición y días de recogida de muestras biológicas se muestra en la Figura 4.
Vacunación y exposición a NiV. Anteriormente, los inventores han demostrado que la inoculación intratraqueal de los MVA con una DICT50 de 105 (mediana de la dosis infecciosa de cultivo tisular) de NiV provocó un resultado letal de manera uniforme (Rockx y col. (2010) J. Virol. 84, 9831). En esos estudios se observó una enfermedad clínica de rápida progresión; los signos clínicos incluyeron depresión severa, enfermedad respiratoria que lleva a una dificultad respiratoria aguda, enfermedad neurológica severa y movilidad severamente reducida; y el tiempo para alcanzar los criterios humanos aprobados para la eutanasia varió de 7 a 12 días. En este punto, los inventores trataron de determinar si la vacunación con sGHeV podría prevenir la infección por NiV y la enfermedad en MVA. Las dosis de 10, 50 o 100 µg de sGHeV se mezclaron con alumbre y los restos de CpG tal como se describe en los Procedimientos. Cada formulación de vacuna se administró por vía subcutánea a tres sujetos en el día 0 (primera vacuna) y de nuevo en el día 21 (refuerzo) y un sujeto de control (MVA 9) recibió una primera vacuna y un refuerzo de solo adyuvante en los mismos días. En el día 42, todos los sujetos se inocularon por vía intratraqueal con una DICT50 de 105 de NiV. El sujeto de control (MVA 9) presentó una pérdida de apetito, cambios severos de comportamiento sostenido (depresión, disminución de la actividad, postura encorvada), disminuciones en el número de plaquetas y un aumento gradual de la frecuencia respiratoria en la etapa final de la enfermedad. Posteriormente, el MVA 9 desarrolló una dificultad respiratoria aguda y se le tuvo que practicar la eutanasia en el día 10 de acuerdo con los puntos finales humanos aprobados. Por el contrario, ninguno de los sujetos vacunados tuvo enfermedad clínica y todos sobrevivieron hasta el final del estudio. En la Figura 5 se muestra un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier.
Enfermedad mediada por NiV en el sujeto de control. Los cambios macroscópicos en el sujeto de control fueron consistentes con los hallados previamente en los MVA infectados por NiV (Geisbert y col. (2010) PLoS One 5, e10690). La esplenomegalia y la congestión de los vasos sanguíneos en la superficie del cerebro estaban presentes y todos los lóbulos pulmonares estaban húmedos y pesados. El ARN del NiV y los virus infecciosos no se recuperaron de las muestras de sangre de MVA 9 y no hubo evidencia de viremia. El MVA 9 tenía niveles significativos de IgM específica de NiV niveles detectables de IgG e IgA específicas de NiV. Los análisis adicionales de muestras de tejido revelaron un extenso tropismo tisular de NiV similar a la infección por NiV de amplia extensión vista anteriormente en los MVA (Geisbert y col. (2010) PLoS One 5, e10690). El MVA 9 tuvo ARN de NiV en la mayoría de los tejidos tal como se indica y el virus infeccioso se recuperó de numerosos tejidos. Las lesiones significativas incluyeron pneumonía intersticial, encefalitis subaguda y necrosis y hemorragia dela pulpa blanca del bazo. Los espacios alveolares se llenaron con líquido de edema, fibrina, desechos cariofrénicos y celulares y macrófagos alveolares. La encefalitis multifocal se caracterizó por la expansión del espacio de Virchiw-Robins mediante números moderados de linfocitos y algunos neutrófilos. Un número menor de estas células inflamatorias se extendió hacia el parénquima adyacente. Numerosas neuronas se hincharon y se llenaron de vacuolas (degeneración) o se fragmentaron con cariolisis (necrosis). Los centros germinales multifocales de los folículos en la
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