KR20140053906A - 헨드라 및 니파 바이러스 ｇ 당단백질 면역원성 조성물 - Google Patents

헨드라 및 니파 바이러스 ｇ 당단백질 면역원성 조성물 Download PDF

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마틴 엘하이
크리스토퍼 C. 브로더
진-안 후앙
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조에티스 엘엘씨
더 헨리 엠. 잭슨 파운데이션 포 더 어드벤스먼트 오브 밀리터리 메디신, 인코포레이티드
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Abstract

헨드라 및/또는 니파 바이러스에 대한 직접적인 면역원성 조성물 및 이의 사용 방법을 제공한다. 또한, 헨드라 및/또는 니파 바이러스가 감염된 대상들로부터 본 발명의 면역원성조성물을 백신 접종한 대상을 구별하는 방법을 제공한다.

Description

헨드라 및 니파 바이러스 Ｇ 당단백질 면역원성 조성물{Hendra and Nipah Virus G Glycoprotein Immunogenic Compositions}
본 발명은 헨드라 바이러스(ＨｅＶ) 및/또는 니파 바이러스(ＮｉＶ)의 Ｇ 당단백질을 포함하는 면역원성 및 백신 조성물 및 이와 관련된 사용 방법에 관한 것이다.
최근 니파 바이러스의 재발생(recurrent outbreaks)으로 인한 상당수의 사망자가 문제되어왔다(see e.g. Butler (2000) Nature 429, 7). 또한 헨드라 바이러스(HeV)는 인간 및 동물에 치명적인 것으로 알려져 있으며, 니파 바이러스(NiV)와 유전적 및 면역학적으로 밀접한 관련이 있다. 현재까지 니파 바이러스 또는 헨드라 바이러스에 의한 감염 또는 질환을 예방하기 위한 백신이나 치료제는 없다. 니파 바이러스 및 헨드라 바이러스는 미국, 국립 알레르기 및 감염성 질환 연구소, 생체 방어 정도 카테고리 C 우선 병원체(priority agents)이다. 또한, 상기 바이러스는 동물원성 감염의 생물학적 안전성 4-레벨 병원체(BSL-4)이고, 안전성을 갖는 백신 및/또는 진단제의 생산에 있어 비용이 많이 들고 어렵다. 그러므로, 백신 및/또는 진단제의 고속대량(high throughput) 생산이 가능한 니파 바이러스 또는 헨드라 바이러스 백신 및 진단제가 요구된다.
헨드라 바이러스 및 니파 바이러스와 같은 파라믹소 바이러스(paramyxoviruses)는 바이러스 입자의 막(envelope)에 2가지 주요한 막-결합 당단백질을 갖는다. 하나의 당단백질은 숙주 세포 상의 수용체(receptor)에 비리온(virion)이 부착하는데 요구되고, 이는 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 단백질 또는 H(hemagglutinin) 단백질로 지정되며, 다른 당단백질(G)은 적혈구 응집 및 뉴라미니다제(neuraminidase) 활성이 없다. 부착 당단백질은 분자의 아미노(N) 말단이 세포질을 향하고 카르복시(C) 말단이 세포 밖을 향하는 2형 막단백질이다. 다른 주요 당단백질은 융합(fusion; F) 당단백질로, 두개의 HR(heptad repeat) 부위 및 하나의 소수성 융합 펩타이드를 갖는 3량체의 1형 융합 생성의 막 당단백질이다. 헨드라 바이러스 및 니파 바이러스는 세포의 수용체에 결합한 후 G 당단백질 및 F 단당백질의 일체의 작용을 통해 수용 숙주세포로 pH-의존적 막 융합과정을 통해 세포를 감염시킨다. 헨드라 바이러스 및 니파 바이러스 부착 G 당단백질의 1차 기능은 숙주 세포의 표면상의 적절한 수용체를 끌어오는 것으로, 잘 특징지어진 파라믹소 바이러스는 시알산모이어티(moieties)가 대부분이다. 헨드라 바이러스 및 니파 바이러스의 당단백질은 숙주 세포 단백질 수용체인 에프린(ephrin) B2 또는/및 에프린 B3을 이용하며 G 당단백질에 의한 바이러스 부착을 억제하는 항체가 개발 되었다(WO2006137931, Bishop (2008) J. Virol. 82: 1139811409). 또한, 헨드라 바이러스 및 니파 바이러스에 대한 면역 보호 반응을 발생시키는 수단으로 G 당단백질을 이용한 백신이 개발되었다(WO2009117035).
백신 제조에 있어, 가축 및 사람 양쪽에 대한 Quil A 사용의 도즈-사이트반응성은 주요 고려사항이다. Quil A의 독성을 방지하는 하나의 방법은 면역 자극 복합체를 사용하는 것이다(Rajput (2007) J. Zhejiang Univ. Sci. B, 8: 153-161). Quil A는 면역 자극 복합체에 결합 되었을 때 반응성이 감소하기 때문에, 세포막으로부터 콜레스테롤이 방출되는 것을 감소시키고, 그로 인해 세포 용해가 일어난다. 또한, 적은 양의 Quil A는 보조제(adjuvant)와 유사한 효과를 나타낸다. 면역 자극 복합체와 결합하는 경우에 Quil A 사포닌의 면역 조절 특성 및 상기 사포닌 유래의 추가적인 이점이 WO2000041720에 공지되어 있다.
헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스 G 당단백질과 면역 자극 복합체를 조합한 백신은 보조제의 부작용이 감소되고 면역반응을 개선시키는 가능성을 주는 효과적인 헨드라 바이러스 및 니파 바이러스 백신을 제공한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 대상에 투여한 후 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 대한 중화항체의 생성을 유도 할 수 있는 유효량의 헨드라 및/또는 니파 바이러스 G 단백질, 면역자극 복합체 및 하나 이상의 첨가제를 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 면역원성 조성물은 사포닌, 인지질 및 스테로이드를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 야생 헨드라 G 당단백질(서열목록 제2서열)의 73번째 내지 604번째 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 서열목록 제16서열의 64번째 내지 1662번째 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 이합체 형태로 존재하고, 상기 각 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질 이합체는 하나 이상의 이황화물 결합(disulfide bond)에 의해 연결된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 가용성 헨드라 바이러스 G 단백질은 4량체 형태로 존재한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 4량체 형태는 비-공유적으로 연결 및/또는 하나 이상의 이황화물 결합으로 연결된 이량체의 이량체로 존재한다. 상기 면역원성 조성물에서 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질의 농도는 약 5 내지 10 ㎍/㎖이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 사포닌은 Quillaja saponaria Molina로부터 분리되며, QH-A, QH-B, QH-C 또는 QS21로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인지질은 PC(phosphatidyl choline), DPPC(dipalmitoyl phosphatidyl choline), PA(phosphatidic acid, phosphaidate), PE(phosphatidylethanolamine), PS(phosphatidylserine), PI(phosphatidylinositol), PIP(phosphatidylinositol phosphate), PIP2(phosphatidylinositol bisphosphate), PIP3(phosphatidyl triphosphate), SPH(phosphorylcholine), Cer-PE(ceramide phosphorylethanolamine) 및 세라마이드 포스포릴글리세롤로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 사포닌은 Quil A이고, 상기 인지질은 DPPC이며, 상기 스테로이드는 콜레스테롤이고, Quil A:DPPC:콜레스테롤의 중량비는 5:1:1이다.
본 발명은 또한 중화 항체 반응을 나타내기 위한 본 명세서에 기재된 유효량 및 유효기간으로 상기 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 대한 중화 항체를 생성하는 방법을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 중화 항체 반응은 대상 내 헨드라 및/또는 니파 바이러스의 생식을 감소시키고, 대상 내 헨드라 및/또는 니파 바이러스의 쉐딩(shedding)을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 대상은 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 노출 되었거나, 다른 구현예에 따르면, 헨드라 및/또는 니파바이러스에 감염되었다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 중화 항체 반응을 나타내기 위한 본 명세서에 기재된 유효량 및 유효기간의 상기 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 헨드라 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 생성하는 방법을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 중화 항체 반응을 나타내기 위한 본 명세서에 기재된 유효량 및 유효기간의 상기 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 니파 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 생성하는 방법을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 면역원성 조성물은 근육내(intramuscularly) 주사로 투여한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 면역원성 조성물은 다회 투여 및 단회 투여 할 수 있으며, 다회 투여 시 최초 투여 후 최소 20일 내지 28일 후 2차 투여한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 각 농도는 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질 약 50 또는 약 100 을 포함한다.
본 발명은 대상으로부터 분리된 생물학적 시료 내 융합 단백질(fusion protein), 매트릭스 단백질(matrix protein), 인단백질(phosphoprotein), 거대 단백질(large protein) 및 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스의 단백질에 대한 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 헨드라 및/또는 니파 바이러스가 노출된 대상으로부터 상기 설명한 면역원성 조성물을 접종된 대상을 구별하는 방법을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 상기 면역원성 조성물 및 방법은 인간, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 닭, 개 또는 고양이와 같은 대상에 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 중화 항체 반응을 생성할 수 있는데 유효한 양 및 기간으로 헨드라 바이러스 가용성 G 당당백질을 포함하는 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 인간 내 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 대한 중화 항체 반응의 제조 방법을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 면역원성 조성물은 보조제를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 백신 및 면역원성 조성물은 상기 조성물을 투여한 대상의 최소 하나의 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하거나 HeV 및/또는 NiV의 하나 이상에 의한 HeV 및/또는 NiV 감염의 백신 접종 목적 및/또는 예방에 적절한 투여로 HeV 및/또는 NiV의 최소 하나에 대한 최소 하나의 면역반응을 향상시키는 효과가 있다. 본 발명의 조성물은 필요한 대상에게 앞서 언급한 HeV 및/또는 NiV의 가용성 G 당단백질 및 보조제로 작용하는 면역자극 복합체(ISC)를 포함하는 G 당단백질을 전달한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, G 당단백질의 양은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 또는 250 pg/㎖을 포함하고, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300 pg/㎖ ISC를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, G 당단백질의 양은 5, 50 또는 100 pg/㎖이고, ISC의 양은 250 pg/㎖이다.
A. HeV 및 NiV G 단백질
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 백신 및 면역원성 조성물은 본 명세서에 서술한 하나 이상의 HeV 및/또는 NiV G 당단백질을 포함한다. 용어 단백질은 본 명세서에서 폴리펩타이드 또는 이의 분획을 포함하는 것으로 대략적으로 사용되었다. 예컨대, HeV 당단백질은 Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979 (see also Yu (1998) Virology 251 , 227-233)의 HeV G 당단백질로 가용성 형태 및 73번째 내지 604번째 아미노산을 포함하는 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다른 예로, HeV G 당단백질은 또한 예에 한정되지 않으며, NiV G 당단백질은 Harcourt (2000) Virology 271 : 334-349, 2000 (see also Chua (2000) Science, 288, 1432-1 )의 NiV G 당단백질로 가용성 형태 및 71번째 내지 602번째 아미노산을 포함하는 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일반적으로, HeV 및 NiV G 당단백질의 가용성 형태는 HeV 또는 NiV의 G 당단백질의 엑토도메인(ectodomain, 예컨대, 세포 밖)의 전체 또는 부분을 포함하고, 일반적으로 G 당단백질의 막통과 도메인의 전체 또는 부분 및 G 당단백질의 세포질 꼬리의 전체 또는 부분이 결실되어 생산된다. 예컨대, 가용성 G 당단백질은 HeV 또는 NiV G 당단백질의 완전한 엑토도메인을 포함할 수 있다. 또한 예컨대, 가용성 G 당단백질은 엑토도메인의 전체 또는 일부, 및 HeV 또는 NiV G 당단백질의 막통과 도메인의 일부를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
일반적으로 본 발명의 가용성 HeV 또는 NiV 당단백질은 올리고머 형태 또는 형태로 생산될 수 있는 바이러스의 숙주 세포 수용체에 상호작용하고 결합하는 능력 또는 정상 G 당단백질을 인식할 수 있는 항체(바이러스 중화 항체를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 생성하는 능력과 같은 정상 바이러스의 당단백질에 상응하는 하나 이상의 특징을 갖는다. 추가적인 특징으로, 숙주 세포의 감염을 차단하거나 예방할 수 있는 능력이며 이에 한정되지 않는다. 종래의 방법으로 HeV 또는 NiV G 당단백질의 하나 이상의 특징을 평가하기 위해 사용할 수 있다.
예컨대, 가용성 HeV G 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 Wang (2000) J. Virol. 74, 9972- 9979의 HeV G 당단백질에 대한 아미노산 서열(서열목록 제2서열)의 73번째 내지 604번째 아미노산을 코딩하는 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 또한 예컨대, 가용성 HeV G 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979의 HeV G 당단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열의 9129번째 내지 10727번째 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 덧붙여, HeV G 당단백질에 대한 아미노산 서열(서열목록 제2서열)의 73번째 내지 604번째 아미노산을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 코돈 최적화된 서열은 서열목록 제16서열의 64번째 내지 1662번째 뉴클레오타이드로 구성되거나 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 코돈 최적화된 서열은 IgK 리더 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 서열목록 제16서열로 구성되거나 포함한다.
예컨대, NiV G 당단백질은 가용성 형태일수 있고, Harcourt (2000) Virology 271 , 334-349의 NiV G 당단백질에 대한 아미노산 서열의 71번째 내지 602번째 아미노산을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 무한정의 서열은 Harcourt (2000) Virology 271 , 334-349의 가용성 NiV G 당단백질을 제조할 수 있다. 일반적으로, 어떠한 니파 바이러스 분리주 또는 균주의 G 당단백질 서열도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 전달하는데 사용될 수 있다.
예컨대, 가용성 NiV G 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 Harcourt (2000) Virology 271 , 334- 349의 NiV G 당단백질에 대한 아미노산 서열의 71번째 내지 602번째 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 또한 예컨대, 가용성 NiV G 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 Harcourt (2000) Virology 271 , 334-349의 NiV G 당단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열(서열목록 제4서열)의 234번째 내지 2042번째 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 덧붙여, NiV G 당단백질에 대한 아미노산 서열의 71번째 내지 602번째 아미노산을 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용할 수 있다.
상기 G 당단백질의 기능적 대체물은 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물로 사용될 수 있다. 예컨대, 기능적으로 동등한 폴리펩타이드는 다음의 하나 이상의 특징을 갖으며, 이에 한정되지 않는다: 바이러스의 숙주 세포 수용체와 상호작용 또는 결합할 수 있는 능력, 이량체 또는 4량체 또는 형태로 제조 될 수 있는 능력, 정상 G 당단백질을 인식하여 항체(HeV 및/또는 NiV 바이러스 중화 항체를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 생성하는 능력 및 또는 숙주 세포의 감염을 차단하거나 예방할 수 있는 능력.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 G 당단백질은 이량체 및/또는 4량체 형태일 수 있다. 상기 이량체는 G 당단백질 내 시스테인 잔기 사이에 형성되는 이황화물 결합의 형성에 의존적이다. 항원성을 향상시키는 G 당단백질의 이량체 및/또는 4량체를 형성하기 위해 HeV 또는 NiV의 표면에 발현되는 경우 또는 G 당단백질의 위치(예컨대, 아미노산 서열 내 시스테인 위치의 변화) 또는 존재가 변화한 경우에 상기 이황화물 결합은 정상 G 당단백질(예컨대, 불변의 시스테인 위치) 내 형성된 것과 상응할 수 있다. 추가적으로, 본 발명 내의 비-이량체 및 4량체 형태는 또한 G 당단백질은 수많은 형태-의존적 에피토프(예컨대, 3차 3D 구조에서 발생된) 및 중화 항체 반응을 부여하기 위한 다수의 중화 에피토프 보존을 재고려한다.
본 발명의 HeV 면역원성 및 백신 조성물은 서열목록 제2서열의 73번째 내지 604번째 아미노산 잔기를 포함하는 다양한 길이의 단백질을 함유하고 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 외막 단백질(envelope protein)은 서열목록 제2서열(73번째 내지 604번째 아미노산 포함)의 HeV 당단백질과 최소 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98 또는 99% 일치한다. 따라서, 본 발명의 HeV G 당단백질은 구조적 에피토프를 생성하기 위한 아미노산 서열의 충분한 수를 갖는 정상 HeV G 당단백질의 면역원성 분획을 포함한다. 면역원성 분획의 무한정적 예는 최소 530, 531 , 532, 533, 534 또는 535 또는 그 이상의 길이의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, HeV G 당단백질은 서열목록 제2서열 또는 Igx 리더 서열(서열목록 제15서열)을 포함하는 합성 컨스트럭트로 구성되거나 포함한다.
본 발명의 NiV 면역원성 및 백신 조성물은 서열목록 제4서열의 71번째 내지 602번째 아미노산 잔기를 포함하는 다양한 길이의 단백질을 함유한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 외막 단백질은 서열목록 제4서열의 NiV 당단백질(71번째 내지 602번째 아미노산 포함)과 최소 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 일치한다. 따라서, 본 발명의 NiV G 당단백질은 구조적 에피토프를 생성하기 위한 아미노산 서열의 충분한 수를 갖는 정상 HeV G 당단백질의 면역원성 분획을 포함한다. 면역원성 분획의 무한정적 예는 최소 528, 529, 530, 531 , 532 또는 533 또는 그 이상의 길이의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, NiV G 당단백질은 서열목록 제4서열 또는 리더 서열을 추가적으로 포함하는 합성 컨스트럭트로 구성되거나 포함한다.
본 명세서의 면역원성 분획은 항원의 최소 하나의 에피토프를 포함하고 HeV 및/또는 NiV 항원성을 나타낼 것이며 예컨대 다른 HeV 및/또는 NiV 항원과 융합되거나 담체에 나타났을 때의 정상 항원에 대한 직접적인 면역반응과 같은 적절한 컨스트럭트가 제시되면 면역 반응이 향상될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 면역원성 분획은 HeV 및/또는 NiV 항원의 최소 20개의 근접한 아미노산을 포함한다. 예컨대, 상기 HeV 및/또는 NiV 항원의 최소 50, 75 또는 100개의 근접한 아미노산이다.
HeV 및 NiV G 당단백질 예는 추가적으로 정상 HeV 또는 NiV G 당단백질에 대하여 최소 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 정상 HeV 또는 NiV G 당단백질 아미노산 서열과 일치할 수 있고, 정상 HeV 또는 NiV G 당단백질 아미노산 서열과 비교하여 확실한 정수의 아미노산 변화를 포함할 수 있으며, 상기 변화는 최소 하나의 아미노산 결실, 보존적 및 비-보존적 치환을 포함하는 치환 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되고 상기 변화는 표준 폴리펩타이드 서열의 아미노- 또는 카르복실-말단 위치 또는 말단 위치의 어디든, 표준 서열 내 아미노산 개별적으로, 또는 정상 HeV 또는 NiV G 당단백질 아미노산 서열 내의 근접한 군에서 중간중간 일어날 수 있다.
아미노산 서열 수준의 서열 유사성 또는 상동성은 서열 유사성 검색에 맞는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx (Altschul (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 and Karlin (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268)을 이용한 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)로 결정할 수 있다. BLAST 프로그램을 사용한 접근법은 문의 서열 및 데이터베이스 서열 사이의 비-근접한 차이를 갖고 근접한 차이를 갖지 않는 유사한 분절을 우선적으로 고려한다. 확인한 모든 결과의 통계적인 유의성을 평가하기 위해 최종적으로 유의성의 미리 선택된 한계점(preselected threshold)에 만족하는 결과를 요약한다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색의 기본적인 사안의 논의를 위해, Altschul (1994) Nature Genetics 6, 119-129를 본다. 히스토그램, 설명, 얼라인먼트, 예상(예컨대, 데이터베이스 서열의 보고된 매치에 대한 통계적으로 유의한 한계점), 컷오프, 매트릭스 및 필터(낮은 복잡도)는 기본값이다. blastp, blastx, tblastn 및 tblastx에 사용된 기본값 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62 매트릭스(Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919)이고 문의 서열로 85개 이상의 아미노산 길이가 권장된다.
본 발명의 백신 및 면역원성 조성물은 본 발명의 면역 방법을 추가적으로 효과를 증가시키는 다른 주(strains)의 HeV 및/또는 NiV G 단백질을 추가적으로 포함할 수 있다.
B. 면역자극 복합체
일반적으로, 발명은 면역자극 복합체와 조합된 HeV 및/또는 NiV G 당단백질 외막 단백질의 가용형을 포함하는 백신 조성물을 포함하는 면역원성 조성물 및 대상의 HeV 및/또는 NiV 감염을 예방 및 치료하기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명에서, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 보조제로 작용하는 면역자극 복합체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 “보조제(adjuvant)"는 그 자신은 어떠한 특이적인 항원 효과를 갖지 않고 면역 시스템을 자극하여 항원에 대한 반응을 증가시키는 제제를 의미한다.
ISC는 정확한 사용에 대한 이상적인 보조제의 몇 가지 특징을 갖는다:
항원 스파링(antigen sparing): Wee (2008) Mucosal Immunol. 1 , 489-496을 예로 들면, 항원 유효성이 한정되거나 항원 비용이 높은 경우에 ISC는 항원 스파링을 10 내지 100 폴드 정도되게 한다. 아마도 이는 다른 보조제와 비교하여 효율 또는 작용의 보다 적절한 기작의 조합에 기인한다.
크로스-프리젠테이션: Schnurr (2009) J. Immunol. 182, 1253- 1259를 예로 들면, 항원제시세포(antigen presenting cells; APCs)에 의한 항원의 제시는 보통 둘 중 하나의 경로를 따른다. 외부 항원은 대개 APCs에 의해 완전히 에워싸이고 가공되어 APC의 표면에 MHC(major histocompatibility complex) Ⅱ형 분자와 재-발현된다. 이는 림프구에 의해 인식 될 수 있고, 만일 적절한 자극 인자/신호가 나타나면, 적절하게 반응된다. 자가 또는 암 항원 및 바이러스 항원은 정상적으로 APCs의 세포질 내 존재하는 Ⅰ형 분자와 가공되어 발현된다. 암 및 바이러스 항원에 대한 효과적인 면역은 Ⅰ형 경로로의 접근을 요구한다. 이는 바이러스 감염이나 세포 항상성(내부 항원의 세포 전도) 동안 자연적으로 일어난다. 백신으로 도입된 항원(바이러스 또는 자가)은 세포외부로부터 세포의 항원 가공 시스템으로의 경로를 찾아야하고, Ⅱ 형 경로에서 Ⅰ 형 경로로 침투해야한다. 이는 수지상세포(dendritic cells; DCs, 특히 APCs)에서 자연적으로 일어날 수 있고, 보조제인 ISC와 함께 혼합된 항원을 접종함으로써 달성할 수 있다. 외부에서 유래한 항원이 항원 제시의 Ⅰ 형 경로를 찾는 과정을 크로스-프리젠테이션이라고 한다. ISC가 항원의 크로스-프리젠테이션을 이루는 정확한 기작은 완전히 밝혀지지 않았지만 ISC 요소의 막 동요(membrain perturbation)에 의존적인 것일 것이다.
체액성 및 세포 매개 반응: 예컨대, Maraskovsky (2009) Immunol. Cell Biol. 87, 371-376)에 기재된 바와 같이, ISC의 작용의 기작의 이점에 의해 적응 면역 체계(adaptive immune system)의 체액성 및 세포성 양쪽이 성립된다. 몇몇 종에서, 이는 보조제를 갖는 백신 접종에 의해 자극된 사이토카인의 프로필이 유사하다. 1형 면역 반응은 인터루킨-2 및 IFN-γ 발현 및 세포내 병원체(박테리아, 원생동물 및 바이러스)에 대한 방어가 특징이고, 2형 반응은 인터루킨-4 및 항독성 혈청 및 항-병원균 관련 면역을 위한 중화 항체의 생성이 특징이다. ISC는 면역반응의 증폭해주는 양극 사이의 안정된 사이토카인 프로필을 제공한다. 또한, 다수의 연구는 백신을 비강내로 전달하는데 ISC가 효과적임을 보여주었다. 이는 점막 면역력에 특히 관련된 경우에, 점막 표면이 감작되어 병원균 침입 부위에서의 관련 면역력을 제공하게 한다(참조, Sjolander (2001 ) Vaccine 19, 4072-4080).
여과 가능한 살균 및 일관된 제조기준: ISC 입자의 크기는 제조 후반의 살균 제조하는데 사용되는 필터를 통과할 수 있는 대략 직경 40 ㎚이다. 또한, 콜레스테롤 및 인지질과 결합하기 위한, Quil A에서 발견된 트리테르페노이드 사포닌의 자연적 특성은 ISC를 제조하는 방법을 개발하는데 이용되었다. 투석을 통해 ISC 입자로 형성되지 않는 Quil A를 최종 산물에서 제거하였다. 상기 요소들의 비율을 조절하여 Quil A 사포닌의 이질적 스펙트럼으로부터 일관성 있는 산물을 제조하였다. 상기 비는 특징적인 40 ㎚ 입자가 아닌 구조를 의미하는 편차에 중요하다(helices, sheets etc.). ISC 콜로이드의 자유-유동성 특징 및 투과 전자현미경, HPLC 및 다른 기술들을 이용하여 측정될 수 있는 능력은 방출 분석 및 품질의 다른 측정을 개발할 수 있는 보조제가 되게 한다.
그러므로, 상기 내용을 토대로, 일 구현예에 따르면, 적정양의 G 당단백질을 갖는 상기 면역자극 복합체의 배합은 사포닌, 인지질 및 스테로이드 분자를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 사포닌, 인지질, 스테로이드 분자의 몰비는 5:1:1이다. 예컨대, 면역자극 복합체는 5 내지 10 중량% 사포닌, 1 내지 5 중량% 스테로이드 분자 및 인지질을 포함할 수 있고 나머지는 G 당단백질을 포함한다. G 당단백질은 면역자극 복합체에 직접적 또는 면역자극 복합체에 단백질이 혼합된 다음 담체 단백질(예컨대, 키메릭(chimeric) 또는 융합 단백질)에 화학적으로 결합하여 포함될 수 있다. 면역자극 복합에 대한 기재는 유도체, 화학적 등가물 및 유사체에 대한 기재를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 ISC는 HeV 및/또는 NiV G 당단백질과 따로 분리하여 혼합한 다음, 상기 G 당단백질과 ISC를 혼합한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 G 당단백질은 상기 사포닌, 인지질 및 스테로이드 분자와 직접적으로 혼합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용하는 상기 사포닌은 Quil A 및/또는 이의 유도체이다. Quil A는 남미 Quillaja saponaria Molina에서 분리하여 제조된 사포닌이며, Dalsgaard (1974) Saponin adjuvants, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, pp. 243-254에서 보조제 활성을 갖는다는 것이 최초로 공지되었다. Quil A의 정제물은 Quil A(EP 0362278), 예컨대 (QA7 및 QA21로도 알려진) QS7 및 QS21과 관련된 독성은 없고 보조제 활성을 갖도록 HPLC에 의해 분리되었다. QS21은 Quillaja saponaria Molina의 나무껍질에서 유래한 천연 사포닌으로, CD8+ 세포독성(cytotoxic) T 세포(CTL), Th1 세포 및 우세한 IgG2A 항체 반응을 유도하고, 본 발명의 전반에 사용된 사포닌이다. 상기 ISC로 사용하는데 적합한 다른 사포닌은 Quil A의 QH-A, QH-B 및 QH-C 추출, Quillaia saponaria와 같은 Panax (ginseng), Astragalus, Achyranthes, Soy bean, Acacia 및 Codonopsis 속 유래의 사포닌 외의 종 유래의 사포닌을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 사포닌은 Quillaia saponaria 외의 종으로부터 분리된다.
본 발명의 상기 면역원성 및 백신 조성물에 사용된 인지질의 무한정적 예는 디아실글리세라이드 구조 및 인산스핑고지질 분자를 포함한다. 디아실글리세라이드 구조를 갖는 인지질의 무한정적 예는 PA(phosphatidic acid, phosphaidate), PE(phosphatidylethanolamine), PC(phosphatidyl choline), DPPC(dipalmitoyl phosphatidyl choline) 및 PS(phosphatidylserine)를 포함한다. 디아실글리세라이드 구조를 갖는 인지질의 또다른 무한정적 예는 포스포이노시티드(phosphoinositides)를 포함한다. 전형적인 포스포이노시티드는 PI(phosphatidylinositol), PIP(phosphatidylinositol phosphate), PIP2(phosphatidylinositol bisphosphate) 또는 PIP3(phosphatidylinositol triphosphate)를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 인산스핑고지질의 무한정적 예는 SPH(ceramide phosphorylcholine, Sphingomyelin), Cer-PE(ceramide phosphorylethanolamine, Sphingomyelin) 또는 세라마이드 포스포릴글리세롤을 포함한다.
본 발명의 상기 면역원성 및 백신 조성물에 사용된 스테로이드 분자는 구조 중 일부에 스테로이드가 포함된 분자를 포함한다. 스테로이드 분자의 무한정적 예는 콜레스테롤, 프레그네놀론, 17-α-히드록시 프레그네놀론, 디하이드로에피안드로스테론, 안드로스테네디올, 프로게스테론, 17-α-히드록시 프로게스테론, 안드로스테네디온, 테스토스테론, 디하이드록시테스토스테론, 디옥시코르티코스테론, 11-디옥시코르티코스테론, 코티솔, 코르티코스테론, 알도스테론, 에스트론, 에스트라디올 또는 에스트리올을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 면역자극 복합체는 일반적으로 직경 30-40 nM의 작은 우리(cage) 구조를 갖으며 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 면역자극 복합체의 배합은 5:1:1의 Quil A, 콜레스테롤, DPPC 및 G 당단백질 몰비를 갖는다. 예컨대, 면역자극 복합체는 5-10% 콜레스테롤 및 인지질, 및 나머지는 G 당단백질을 포함할 수 있다. G 당단백질은 면역자극 복합체에 직접적 또는 면역자극 복합체에 단백질이 혼합된 다음 담체 단백질(예컨대, 키메릭(chimeric) 또는 융합 단백질)에 화학적으로 결합하여 포함될 수 있다. 면역자극 복합에 대한 기재는 유도체, 화학적 등가물 및 유사체에 대한 기재를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 면역자극 복합체의 유도체에 대한 기재는 Quil A, 콜레스테롤, 포스파티딜콜린 또는 단백질 중 하나 이상의 면역자극 복합체, 예컨대, 결실되고, 치환되거나 Quil A, 콜레스테롤, 포스파티딜콜린 또는 단백질이 복합체 외에 첨가된 것에 대한 기재를 포함한다. 면역자극 복합체의 기능적 등가물은 4가지 요소 중 하나 이상이 기능적 등가물로 치환된 면역자극 복합체일 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 면역자극 복합체의 G 당단백질 요소는 결실되었다. 면역자극 복합체의 이러한 형태는 단백질-프리 면역자극 복합체를 의미한다.
본 발명의 일 구현예는 인 비트로 다수의 HeV 및/또는 NiV 균주에 대한 교차반응성 중화 항-혈청의 생성을 유도할 수 있는 분리 HeV 또는 NiV G 단백질을 포함하는 면역원성 조성물 및 Quil A, DPPC 및 콜레스테롤을 포함하는 보조제를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 상기 조성물은 5, 50 또는 100 pg 가용성 HeV 또는 NiV G 단백질, 및 Quil A, DPPC 및 콜레스테롤의 적정양을 포함한다. 면역자극 복합체 및 이의 제조방법의 추가적인 실시예는 EP 0242380B1 및 EP 0180564B1 , 또한 WO2000041720(예컨대, 3 및 9쪽), Cox & Coulter (1992) Advances in Adjuvant Technology and Application in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Chapter 4, Yong (ed.), CRC Press; Dalsgard (1974) Gesamte Virusforsch, 44, 243-254; Australian Patent Specification Nos. 558258, 589915, 590904 & 632067에 기재되어 있다. 또한 면역자극 복합체가 이의 단백질 항원에 사용되어 질 수 있음이 공지된 U.S. Patent 6,506,386의 대표적인 프로토콜 및 이의 참고자료는 바로 제조되거나(EP 0109942B1), 대신에, 미리 제조된 면역자극 복합체가 백신을 제조하기 위한 항원의 분획에 각각 첨가되어 혼합되어 제공되는 것을 포함한다(EP 0436620B1).
일반적인 기술상식에서 볼 수 있듯이, 상기 단백질 항원은 또한 면역자극 복합체와 공유적으로 결합할 수 있다(EP 0180564B1). 당업계의 일반적인 기술상식에서 볼 수 있듯이, 면역자극 복합체는 점막 백신 접종(Mowat (1991) Immunology 72, 317-322)으로 투여될 수 있고, 본 발명의 면역자극 복합체는 막 표적 단백질을 포함하여 점막 백신 접종이 추가적으로 개선될 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 분리 인 비트로 다수의 HeV 및/또는 NiV 균주에 대한 교차반응성 중화 항-혈청의 생성을 유도할 수 있는 HeV 또는 NiV G 단백질을 포함하는 면역원성 조성물 및 Quil A, DPPC 및 콜레스테롤을 포함하는 보조제를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 상기 조성물은 5, 50 또는 100 pg 가용성 HeV 또는 NiV G 단백질, 및 Quil A, DPPC 및 콜레스테롤의 적정양을 포함한다. 면역자극 복합체의 추가적인 구현예는 WO200004 720에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 구혀예에 따르면, 상기 백신 및 면역원성 조성물은 약제학적 조성물의 일부일 수 있다. 본 발명의 상기 약제학적 조성물은 작용 부위로 전달하기 위해 약제학적으로 사용될 수 있는 활성 화합물의 처리를 가능하게 하는 첨가제 및 보조제( auxiliary)를 포함하는 적절한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
C. 첨가제
본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 첨가제 및/또는 안정제(예컨대, Remington: The Science and practice of Pharmacy (2005) Lippincott Williams)를 동결건조 또는 수용액의 상태로 추가적으로 포함할 수 있다. 허용가능한 담체, 첨가제 또는 안정제는 상기 용량 및 농도에서 대상에 무해하고, 인산염, 시트르산 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(Mercury((o-carboxyphenyl)thio)ethyl sodium salt (THIO E SAL), 옥타데실다이메틸벤질(octadecyldimethylbenzyl) 염화 암모늄; 염화 헥사메토늄(hexamethonium chloride); 염화 벤즈알코늄(benzalkonium chloride), 염화 벤제토니움(benzethonium chloride); 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜(catechol); 레조르시놀(resorcinol); 시클로헥사놀(cyclohexanol); 3-펜타놀(3-pentanol); 및 m-크레졸); 혈청알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트란을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 수크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온(salt-forming counter ion); 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 PEG(polyethylene glycol), TWEEN 또는 PLURONICS와 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 복용량을 담기 충분한 부피의 적절한 약제학적 용제 또는 담체에 현탁된 제제일 수 있다. 일반적으로, 담체, 보조제 및 기타 같은 종류의 것을 포함하는 최종 부피는 최소 1.0 ㎖이다. 상한은 투여되는 양의 실현가능성에 의해 조절되고, 일반적으로 0.5 ㎖ 내지 2.0 ㎖을 넘지 않는다.
사용 방법
본 발명은 본 발명의 상기 면역원성 및 백신 조성물을 포유류 대상에 투여하는 단계를 포함하는 헨드라 및/또는 니파 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법을 포함한다. 본 명세서에서 서술한 HeV 및/또는 NiV G 당단백질과 보조제를 예방 접종하여 유도된 활성 면역은 프라임 또는 부스트 세포성 또는 체액성 면역반응일 수 있다. 상기 HeV 및/또는 NiV G 당단백질 또는 면역원성 분획의 유효량은 백신을 제조하기 위해 보조제와 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 가용성 HeV 및/또는 NiV G 당단백질 또는 당단백질 자신과 조합되거나 인간에 사용하는데 적합한 최소 하나의 보조제와 조합된 상기 당단백질을 포함하는 상기 면역원성 및/또는 백신 조성물을 포유류 대상에 투여하는 단계를 포함하는 헨드라 및/또는 니파 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법을 포함한다. 인간에 사용하기 적합한 보조제는 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다. 예컨대, 인간에 사용하기 적합한 보조제는 알루미늄 염을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 알루미늄 염은 수산화알루미늄, 수산화알루미늄 겔(Alhydrogel™), 인화 알루미늄, 일럼(황삼 알루미늄 칼륨) 또는 혼합된 알루미늄 염을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 인간에 사용하기 적합한 보조제의 추가적인 예는 유중수적형(water-in-oil) 에멀전, 수중유적형(oil-in-water) 에멀전 및 ASO4(수산화알루미늄 및 MPL(monophosphoryl lipid A)의 조합) 및 CpG 올리고디옥시뉴클레오타이드을 포함하며 이에 한정되지 않는다. CpG 올리고디옥시뉴클레오타이드는 부분 서열 콘텍스트(CpG 모티프)의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 CpG 모티프는 포유류 DNA와 비교하여 박테리아 DNA에서 20-폴드 자주 나타난다. CpG 올리고디옥시뉴클레오타이드는 TLR9(Toll-like recepter 9)에 의해 인식되어 강한 면역자극 효과를 유도한다.
본 명세서에 서술된 하나 이상의 보조제를 갖는 HeV 및/또는 NiV G 당단백질을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 예방 또는 치료 목적일 수 있다. 본 발명의 일 양태인 상기 조성물은 예방 목적에 유용하다. 예방 목적으로 제공되는 경우에, 상기 백신 조성물은 HeV 및/또는 NiV 감염의 어떠한 검출 및 증상보다 앞서 제공된다. 상기 화합물의 유효량의 예방을 위한 투여는 후일의 HeV 및/또는 NiV 감염을 억제하거나 약화시켜 준다.
치료 목적으로 제공되는 경우에, 백신은 실제 감염 증상의 검출될 때 유효량으로 제공된다. 조성물은 이의 투여가 대상에 의해 용인되는 경우에 “약제학적으로 허용가능” 하다고 한다. 상기 조성물은 생리학적으로 유의하게 투여된 양인 경우에 “치료적으로 또는 예방적으로 유효량”이 투여된다고 한다. 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 예컨대, HeV 및/또는 NiV의 하나이상의 균주에 대한 광범위하게 반응하는 체액성 또는 세포성 면역 반응이 향상되는 것과 같이 조성물로 인해 대상 환자의 생리학에 검출 가능한 변화가 일어나는 경우에 생리학적으로 유의하다. 예방은 완전하게 제공될 필요가 없고(예컨대, HeV 또는 NiV 감염이 완전히 예방되거나 근절되거나 할 필요는 없다), 대조 파퓰레이션에 대해 통계학적으로 유의한 개선이 있으면 된다. 예방은 질환의 증상의 심한 정도 및 발병시기의 신속 정도를 경감하는 것이 한정적일 수 있다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 HeV 및/또는 NiV의 다중 균주에 대한 내성을 부여할 수 있다. 본 명세서에서 사용하였듯이, 백신은 투여 시 투여 대상의 감염 증상이나 상태의 전체 또는 부분적인 약화 또는 감염에 대한 개인의 전체 또는 부분으로 면역되게 하여 감염을 예방하거나 약화(예컨대, 억제)시키는 것을 말한다.
본 발명의 최소 하나의 백신 또는 면역원성 조성물은 본 명세서에서 서술한 약제학적 조성물을 사용하여 의도하는 목적을 달성하기 위해 어떠한 경로로 투여될 수 있다. 예컨대, 상기 조성물의 투여는 피하, 정맥내, 피내, 근육내, 복강내, 비강내, 피부를 통한, 또는 구강 경로와 같은 다양한 비경구 경로일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 피하 투여된다. 비경구 투여는 일회 주입 또는 시간에 걸친 점진적 관류일 수 있다.
활성 특이 세포 면역치료에 의한 세포성 변역 반응에 의해 완화 시킬 수 있는 질환 또는 상태의 예방, 경감 또는 치료를 위한 전형적인 요법은 앞서 언급된 백신 조성물의 유효량을 1주 내지 약 24개월의 기간에 걸쳐 단회, 반복 또는 부스터 용량을 투여하는 것을 포함한다. 최초 투여 후 2차 투여의 무한정적 예는 최초 투여(0일) 후 최소 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일 후에 2차 투여하는 것을 포함한다. 면역원성 또는 백신 조성물의 투여 용량은 0일의 최초 투여 용량보다 적거나, 동일하거나, 많을 수 있다.
본 발명에 따르면, 백신 또는 면역원성 조성물의 “유효량”은 적어도 HeV 및/또는 NiV의 하나 이상의 균주에 대한 세포성 또는 체액성 면역 반응의 원하는 생물학적 효과를 달성하기 충분한 양이다. 유효량은 대상의 나이, 성별, 건강 및 체중, 병행치료가 있을 시 치료의 빈도 및 원하는 효과의 특성에 의존적일 것이라 생각되고 있다. 하기 제공되는 유효량의 범위는 본 발명에 한정되지 않으며, 본 발명의 면역원성 조성물에 알맞은 용량 범위의 예를 나타낸다. 그러나, 용량은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 이해 및 결정되어 개개의 대상에 맞춰질 수 있다.
본 발명의 백신 및 면역원성 조성물의 수용 대상은 HeV 및/또는 NiV에 대한 세포성 또는 체액성 반응을 통한 특정 면역을 얻을 수 있는 어떠한 대상이 될 수 있으며, 상기 세포성 반응은 MHC Ⅰ형 또는 Ⅱ형 단백질에 의해 매개된다. 포유류 가운데, 수용 대상은 영장목(인간, 침팬지 유인원 및 원숭이 포함)의 포유류 일 수 있다. 본 발명의 일 구현예는 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물로 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 실험적 연구에서처럼, 상기 대상은 HeV 및/또는 NiV에 감염되었거나 HeV 또는 NiV 감염 모델이 제공될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 대상은 말, 소, 황소, 물소, 양, 돼지(Mingyi(2010) Vet, Res. 41, 33), 염소, 개(Biosecurity Alert - Hendra Virus Update, 27 July 2011 , Press Release, Biosecurity Queensland) 또는 고양이를 포함하는 길들여진 포유류이며, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 대상은 닭을 포함하는 가금류이다.
본 발명의 백신은 또한 헨드라 바이러스 감염에 대한 예방에 사용된 용량에서 니파 바이러스 감염에 대한 교차예방(cross-protection)을 제공하므로 니파 바이러스에 대한 유효한 백신 접종을 제공한다.
유효한 면역 반응은 유익한 예방적 또는 치료적 효과를 유도하는 직접적 또는 간접적 면역반응을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 기재한 바와 같이, HeV 또는 NiV 당단백질을 포함하는 면역원인 경우에, 상기 반응은 동물 내 바이러스의 생식 및/또는 바이러스 쉐딩의 차단 및/또는 질환 증상의 감소를 포함한다. 순환 항체의 존재가 반드시 상기 순환 항체의 바이러스 생식 및 쉐딩을 억제하는 능력을 가리키는 것이 아니므로, 효험은 기능적인 측정으로 이해되어야 하고, 이는 항-HeV 및/또는 항-NiV 항체 역가 단독에 대한 의미로 정의되어서는 안된다.
예로서, 본 발명의 가용성 G 단백질 폴리펩타이드는 면역 반응을 증가시키기 위해 헨드라 또는 니파에 감염되거나 감염되었다고 의심되는 대상에 투여될 수 있고, 및/또는 수동적 면역치료의 형태로 본 발명의 항체가 다른 치료적 제제(예컨대, 항-바이러스 제제)를 추가적으로 포함할 수 있는 조성물이 투여되며 이에 한정되지 않는다.
하기 실시예 4는 백신 접종된 말에 사용하기 위한 바람직한 조성에 대한 정보를 제공한다. 헨드라 바이러스가 감염될 수 있는 다른 동물 및 이러한 헨드라 및 니파 바이러스 감염으로부터 동물 및 인간을 보호할 수 있는 백신 접종을 보증하는 것에 대해, 하기 정보는 일반적으로 적용가능하고 당업자에 의해 용이하게 적응될 수 있다.
일반적으로 말하면, 반려동물(개 또는 고양이)은 약 25 마이크로그램의 헨드라 항원을 보증하고, 본 명세서에 개시된 구성 요소의 종류의 어느 하나를 사용하는 것이 아닌 바람직한 ISC 조성물에 해당하는 사포닌, 인지질 및 스테롤이 5:1:1의 비를 갖는 25-150 마이크로그램 범위의 ISC 보조제로 유익할 수 있다. 바람직하게는, 반려동물에 대한 최종 용량은 약 1 ㎖이다. 공중합체 기반의 보조제인 Polygen™(MVP Technologies)는 바람직하게는 약 5-15%(v/v) 사용될 수 있다.
일반적으로 말하면, 대형 가축(양, 소, 돼지 등)에 대한 항원 및 보조제의 용량(및 최종 용량)은 본 명세서에서 말에 대해 적용한 것과 마찬가지로, 50-100 마이크로그램 항원 및 일반적으로 약 250 마이크로그램 ISC를, 예컨대, 최종 부피 1-3 ㎖로 사용할 수 있다. 돼지에 관해서는, 대안 및 효과적인 보조제 배합은 1-3 ㎖ 최종 용량(Quil A:포스파티딜콜린:콜레스테롤이 5:1:1, WO 2000/41720) 내 ISC의 블렌드 및 이온성 다당류, 특히 100 ㎎ DEAE 덱스트란 및 800 마이크로그램 ISC를 포함한다.
백신 접종된 동물의 구별
본 발명은 HeV 및/또는 NiV에 노출 또는 감염된 동물로부터 백신 접종된 건강한 동물의 구별 방법을 포함한다. 바이러스 감염 동안, HeV 및 NiV는 G 당단백질(G) 외에 융합 단백질(F), 매트릭스 단백질(M), 인단백질(P), 거대 단백질(L) 및 뉴클레오캡시드 단백질(N)과 같은 추가적인 단백질을 나타낸다. 이러한 추가적인 단백질은 동물 내에서 상기 단백질에 결합하는 항체를 형성하거나 T 세포 면역의 형태로 면역반응을 유도할 가능성을 갖는다. 상기 다른 단백질에 대한 항체 반응의 정도는 보통 EIA(Enzyme-linked immune assay)와 같은 분석법으로 측정할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 면역원성 및 백신 제조는 HeV 및 /또는 NiV 항원으로서 G 당단백질만을 포함하고, 이는 HeV 및/또는 NiV의 G 당단백질에 대한 항체를 포함하는 면역 반응을 유도할 것이다. 본 명세서에 서술한 면역원성 조성물이 접종된 동물은 HeV 또는 NiV에 감염된 후에 G 당단백질에 대한 면역 반응이 증폭되고 G 당단백질 외에 다른 HeV 및 NiV 단백질에 대한 항체의 변화가 나타날 것이다. 그러므로, 융합 단백질(F), 매트릭스 단백질(M), 인단백질(P), 거대 단백질(L) 및 뉴클레오캡시드 단백질(N)에 대한 항체의 존재는 혈청 시료 내 상기 단백질에 특이적인 항체의 존재 유무를 결정하기 위한 EIA로 측정될 수 있다. 상기 다른 단백질(예컨대, G 당단백질 외)에 대한 항원이 검출되면, 동물은 HeV 및/또는 NiV에 노출된 것이다. 그렇지 않고, 상기 다른 단백질에 대한 항체가 발견되지 않고, G 단백질에 대한 항체만 검출되었다면 상기 동물은 백신 접종된 것이다.
본 발명의 EIA는 HeV 및/또는 NiV에 감염된 동물 및 본 명세서에서 서술한 면역원성 조성물로 백신 접종된 건강한 동물을 검출 및 진단하는데 있어서 매우 특이적이고 매우 선택적이다. 본 발명은 동종 및 이종 환경에서 ELISA를 포함하는 다양한 분석 방법에 활용할 수 있다. 상기 분석 방법은 혈액, 혈청, 유액 또는 항체를 함유하는 다른 체액과 같은 시료로 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, EIA에 사용되는 항체는 G 당단백질의 백신 접종에 의해 유도된 항체와 특이적으로 경쟁하지만 동물에서 HeV 및/또는 NiV로 감염에 의해 유도된 항체를 그렇지 않을 것이다. 이는 HeV 및 NiV 감염의 혈청학적 진단 뿐 아니라 단독 진단에서 감염에 대하여 백신 접종의 진단할 수 있게 한다. 상기 EIA 방법은 표준 혈청 시료 또는 체액 또는 항체를 포함하는 분비물에 대하여 실시될 수 있다. 상기 EIA 방법은 G 당단백질 및 다른 HeV 및/또는 NiV 바이러스 단백질(예컨대, 융합 단백질(F), 매트릭스 단백질(M), 인단백질(P), 거대 단백질(L) 및 뉴클레오캡시드 단백질(N)과 같은 단백질은 HeV 및/또는 NiV에 노출된 적이 없는 예방 접종된 건강한 동물에서 나타나지 않음)에 대한 단일 클론 및/또는 다클론 항체를 이용할 수 있다. 상기 EIA는 컴퓨터 지원 데이터 분석 절감 소프트웨어 및 하드웨어를 사용하거나 사용하지 않고 상업적으로 이용 가능한 고정형, 휴대용-수동형, 반자동화형 또는 자동 기계형 ELISA 장치로 실시될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, HeV 및/또는 NiV에 노출되거나 감염된 동물들로부터 백신 접종된 건강한 동물을 구별하는 방법은 말, 소, 양, 돼지, 염소, 개 또는 고양이를 포함하나 이에 한정되지 않는 길들여진 동물로부터 분리한 생물학적 시료로 실시될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 대상은 치킨을 포함하는 가금류이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 대상은 인간이다.
도 1은 생(live) 헨드라 바이러스 노출(0 일) 후, 250 pg 면역자극 복합체로 보조된 50 또는 100 pg/용량 재조합 헨드라 바이러스 가용성 당 단백질(sG)이 투여된 말의 직장 온도를 나타낸다.
도 2는 생(live) 헨드라 바이러스 노출(0 일) 후, 250 pg 면역자극 복합체로 보조된 50 또는 100 pg/용량 재조합 헨드라 바이러스 가용성 당 단백질(sG)이 투여된 말의 심박동수를 나타낸다.
도 3은 면역자극 복합체의 제조를 도식으로 나타낸다.
도 4는 sGHeV 백신 접종 및 Ni 챌린지 일정을 계통도를 나타낸다. sGHeV 백신 접중, NiV 챌린지 및 안락사 실시일을 화살표로 나타내었다. '*' 표시된 포스트-챌린지 -42, -7, 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 및 28에 혈액 및 면봉 채취물 표본을 수집하였다. 회색 글자는 챌린지 시각표(윗줄); 검정 글자는 백신 접종 시각표를 의미한다(아랫줄). 각 백신 접종 용량군 및 대조군의 대상이 되는 AGM(african green monkey) 번호를 나타내었다.
도 5는 NiV-감염 대상의 생존 곡선을 나타낸다. 대조군(n=2) 및 sGHeV 백신 접종된 대상(n=9)으로 Kaplan-Meier 생존 곡선을 그렸다. 대조군은 추가적인 조직학적 대조 대상의 데이터를 포함한다. 백신 접종된 대상은 10 pg, 50 pg 또는 100 pg sGHeV를 2회 피하 주사하였다. 대조군에서 질환 말기까지의 평균 시간은 11일인 반면, 모든 백신 접종된 대상은 안락사하는 연구의 종결시점까지 생존하였다.
도 6은 백신 접종된 대상의 NiV- 및 HeV- 특이적 면역글로불린(Ig) 항체를 나타낸다. 백신 접종된 대상으로부터 혈청 및 비강 면봉 채취물을 수집하고, sGHeV 및 sGNiV 복합 분석을 이용하여 IgG, IgA 및 IgM 반응을 평가하였다. 동일한 백신 도즈 군(n=3) 내 대상의 혈청 또는 비강 면봉 채취물을 각각 분석하였고, 배지의 형광 세기의 평균을 계산하여 Y-축에 나타내었다. 오류 막대는 평균의 표준편차를 나타낸다. 혈청 sG-특이적 Ig를 검정색으로 나타내고(sGHeV(열린 삼각형), sGNiV(닫힌 삼각형)), 점막의 sG-특이적 IgA을 회색 상징으로 나타내었다(sGHeV(열린 삼각형), sGNiV(닫힌 삼각형)).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 벡터 제조
막 단백질/세포질 미부(transmembrane/cytoplasmic tail)이 결실된 HeV(헨드라 바이러스) G 또는 NiV(니파 바이러스) G를 발현하는 벡터를 제조하였다. 전장 HeV 또는 NiV G 단백질이 클로닝된 cDNA를 PCR로 증폭하여 막 단백질 도메인/세포질 미부-결실된 HeV 또는 NiV G 단백질을 코딩하는 약 2600 뉴클레오타이드의 분획을 제조하였다.
HeV G를 증폭하기 위해 다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였다:
sHGS: 5'-GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3'(서열목록 제5서열). sHGAS: 5'-GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTGGGCAGGTATC-3'(서열목록 제6서열).
NiV G를 증폭하기 위해 다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였다:
sNGS: 5'-CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3'(서열목록 제7서열), sNGAS: 5'-CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATTGCTCTGGTATC-3'(서열목록 제8서열).
모든 PCR 반응은 Accupol DNA 폴리머라아제(PGS Scientifics Corp)를 이용하여 다음의 세팅으로 실시하였다: 초기 반응 94℃ 5분, 94℃ 1분, 56℃ 2분 및 72℃ 4분 25 사이클. 프라이머는 Sal1에 의해 잘린 sHeV G ORF 및 Xho1에 의해 잘린 sNiV G ORF를 제조하였다. PCR 산물을 젤 정제하였다(Qiagen). 젤 정제 후, sHeV G 및 sNiV G를 TOPO 벡터(Invitrogen)에 서브클로닝하였다.
PSectag2B(Invitrogen)을 구매하여 S-펩타이드 태그 또는 myc-에피토프 태그를 갖도록 수정하였다. S-펩타이드 및 서열은 코딩하고 Kpn1 및 EcoR1 오버행(overhangs)을 갖는 오버랩핑(overlapping) 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
SPEPS: 5'-CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATTCT-3'(서열목록 제9서열), SPEPAS: 5'AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTTAGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3'(서열목록 제10서열).
myc-에피토프 태그를 코딩하고 Kpn1 및 EcoR1 오버행을 갖는 오버랩핑 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
MTS: 5'-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3'(서열목록 제11서열), MTAS: 5'-AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3'(서열목록 제12서열).
64 mol SPEPS 및 64 mol SPEPAS를 혼합하고 85℃에서 5분 동안 가열한 다음 50℃까지 천천히 식혔다. 64 mol MTS 및 64 mol MTAS를 혼합하고 65℃에서 5분 동안 가열한 다음 50℃까지 천천히 식혔다. 두 혼합물을 희석하고 Kpn1-EcoR1 절단된 pSecTag2B에 클로닝하여 S-펩타이드 변형 pSecTag2B 또는 myc-에피토프 변형 pSecTag2B를 제조하였다. 모든 컨스트럭트는 한정 효소 처리 및 시퀀싱하여 확인하였다.
TOPO sG 컨스트럭트를 Sal1 한정효소 처리하고 젤 정제하여 S-펩타이드 변형 pSecTag2B 또는 myc-에피토프 변형 pSecTag2B의 Xho1 부위에 서브클로닝 하였다. 모든 컨스트럭트는 한정 효소 처리 및 시퀀싱하여 확인하였다.
Ig 리더-S-펩타이드-s HeVG(sGS-tag) 및 Ig 리더-myc tag-sHeVG(sGmyc-tag) 컨스트럭트를 백시니아(vaccinia) 셔틀 벡터인 pMCO2에 서브클로닝하였다. 올리고뉴클레오타이드(5'-TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3'; 서열목록 제13서열)를 합성하고 올리고뉴클레오타이드 sHGAS와 결합하여 PCR, sGs-tag 및 sGmyc-tag로 증폭하였다. 모든 PCR 반응은 Accupol DNA 폴리머라아제(PGS Scientifics Corp.)를 이용하여 다음의 세팅으로 실시하였다:
초기 반응 94℃ 5분, 94℃ 1분, 56℃ 2분 및 72℃ 4분 25 사이클.
프라이머는 Sal1 부위가 잘린 PCR 산물을 제조하였다. PCR 산물을 젤 정제하였다(Qiagen). 젤 정제 후, sGs-tag 및 sGmyc-tag를 TOPO 벡터(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. sG S-태그 및 sG myc-태그를 Sal1으로 한정 효소 처리하고 pMCO2의 Sal1 부위에 서브클로닝하였다. 모든 컨스트럭트는 한정 효소 처리 및 시퀀싱하여 확인하였다. 진핵 세포주에서 생산이 가능하도록 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열(서열목록 제16서열)을 제조하였다.
실시예 2: 백시니아를 이용한 수용성 G 단백질의 단백질 제조
단백질 생성을 위해, 코돈 최적화된 서열포함하는 유전적 컨스트럭트를 이용하여 재조합 폭스바이러스 벡터(vaccinia virus, WR 주)를 제조하였다. tk-선별 및 GUS 염색을 적용한 표준 기술을 이용하여 재조합 폭스바이러스를 수득하였다. 간단하게, pMCO2 sHeV G 융합 또는 pMCO2 sNiV G 융합을 인산칼슘 트랜스펙션 키트(Promega)를 이용하여 CV-1 세포에 트랜스펙션하였다. 백시니아 바이러스의 Western Reserve(WR) 야생형 주를 0.05 PFU/cell의 MOI(multiplicity of infection)로 단일층에 감염시켰다. 2일 후에 재조합 바이러스인 세포 펠렛(pellets)을 수집하였다. 25 g/ml BrdU(5'-Bromo-2'-deoxyuridine, Calbiochem)의 존재 하에 재조합 바이러스로 TK 세포를 감염시켰다. 2시간 후에 바이러스를 LMP(low melting point) 아가로즈(Life Technologies) 및 25 g/ml BrdU를 포함하는 EMEM-10 오버레이로 교체하였다. 반응 2일 후, 1% LMP 아가로즈, 25 g/㎖ BrdU 및 0.2 ㎎/㎖ X-GLUC(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid; Clontech)를 포함하는 추가적인 EMEM-10 오버레이를 첨가하였다. 24-48시간 이내에 파란색 플라크(plaque)가 명확해지면, 픽킹하고 이중 선별 플라크 정제의 2개 이상 라운드 하였다. 재조합 백시니아 바이러스 vkB16(sHeV G 융합) 및 vkB22(sNiV G 융합)을 증폭하고 표준 방법으로 정제하였다. 간단하게, 재조합 백시니아 바이러스를 플라크 정제, 세포-배양 증폭, 초원심분리기 내 수크로즈 쿠션 펠레팅 및 플라크 분석을 통한 타이트레이션(titration). sHeV G의 발현을 세포 용해물 및 배양 상층액에서 확인하였다.
실시예 3: 293F 세포를 이용한 수용성 G 단백질의 단백질 생산
HeV 수용성 G 당단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 제조하기 위해 코돈 최적화된 서열을 포함하는 유전적 컨스트럭트를 293F 세포(Invitrogen)에 형질전환 하였다. 또한, HeV 수용성 G 당단백질의 형질전환 및 발현을 위해 CHO-S 세포(Invitrogen)를 사용하였다. 형질전환 세포를 35 ㎖ DMEM-10을 갖는 162 ㎠ 조직 배양 플라스크에 플레이팅하였다. 수일 동안 5-8% CO2 및 37℃ 하에 세포를 부착하고 성장하도록 하였다. 세포가 밀집되었을 때, 150 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B(hygromycin B, 30 ㎖/플라스크)를 포함하는 DMEM-10가 채워진 다수의 플라스크로 계대하였다. 세포가 70-80% 밀집하면, 30 ㎖ PBS로 2회 세척하고, 20 ㎖ 293 SFM Ⅱ(Invitrogen)을 첨가하여 5-8% CO2 및 37℃ 하에 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 200 ㎖ SFM Ⅱ 배지를 갖는 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크로 옮겼다. 세포가 죽기 시작할 때까지, 5-6 일 동안 37℃ 및 5-8% CO2 조건 하에 125 rpm으로 성장하도록 하였다. 세포가 죽기 시작하는 시점에, 상층액을 수집하였다.
각 에를렌마이어로부터 수집한 배지를 3,500 rpm으로 30분 동안 원심분리를 실시하였다. 상층액을 250 ㎖ 원심분리용 병에 옮기고 1시간 동안 10,000 rpm으로 회젼시켰다. 결과물의 상층액을 수집하고 프로테아제(protease) 억제제를 최종 농도 0.1%의 Triton X-100과 함께 제조업자의 권고에 따라 첨가하였다. 상층액을 0.2 ㎛ 저단백 결합 여과막으로 여과하였다.
S-단백질 아가로즈 친화 컬럼을 이용하여 HeVsG를 정제하였다. S-단백질 아가로즈(Novagen)의 20 ㎖ 충진 부피를 XK 26 컬럼(GE Healthcare)으로 로딩하였다. 10×충진 부피의 결합/세척 완충액(0.15 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 및 0.1% Triton X-100)으로 컬럼을 세척하였다. 제조된 HeV sG의 상층액을 컬럼에 적용하여 3 ㎖/분의 유속으로 유지하였다. 10×충진 부피(200 ㎖)의 결합/세척 완충액 Ⅰ(0.15 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 및 0.1% Triton X-100)으로 컬럼을 세척하고 6×충진 부피(120 ㎖)의 세척 완충액 1× 세척 완충액(0.15 M NaCl 및 20 mM Tris-HCl, pH 7.5).
펌프를 정지시키고 세척 완충액을 비드의 표면에 도달할 때까지 물을 빼내고 30 ㎖ 용출 완충액(0.2 M 구연산, pH 2)을 첨가하였다. 흐름의 (아직 세척 완충액일) 최초 10 ㎖을 수집하고 용출 완충액과 비드를 10분 동안 반응시켰다. 다음, 용출물의 15 ㎖을 25 ㎖ 중화 완충액(1 M Tris, pH 8)이 담긴 50 ㎖ 살균 원뿔형 원심분리용 튜브에 수집하였다. pH를 중성으로 조절하고 용출 및 반응을 3회 반복하였다. 모든 중화된 용출물을 합하여 약 4 ㎖로 농축하였다. 수득한 HeV sG(4 ㎖)을 0.2 ㎛ 저단백 결합 여과막(0.2 ㎛ HT Tuffryn 막을 갖는 Acrodisc 13 ㎜ 주사 여과기)으로 정제하였다.
HeV sG를 추가 정제하는데 젤 여과를 이용할 수 있다. 품질 관리 분석 및 순도 및 올리고머 상태의 확인 후, 4량체(tetramer)+2량체(dimer), 2량체 및 단량체의 수집한 분획을 분주하여 -80℃에 보관하였다.
실시예 4: 백신 배합의 제조
ISC의 제조를 요약한 도식은 도 3에 나타나 있으며, 추가적으로 하기 설명한다:
단계 1: 90 g/L 데카노일-n-메틸글루카마이드(Mega-10 디터전트) 용액을 주사용 증류수(water for injection; WFI)으로 제조한다. 상기 용액을 Mega 10이 완전히 용해하도록 가열하고 단계 2에 즉시 사용하거나 살균 여과한다.
단계 2: 25 g/L 콜레스테롤 및 25 g/L DPPC(dipalmitoyl phosphatidyl choline)으로 구성된 용액을 Mega 10 디터전트의 스톡 용액에 용해하여 제조한다. 상기 용액을 모든 구성이 용해하도록 가열하고 즉시 사용하거나 살균 여과한다.
단계　3：BIS(buffered isotonic saline, 10 mM 인산염 완충액, pH 6.2±1)을 제조하고 즉시 사용하지 않는 경우에 살균 여과한다.
단계 4: 최종 농도가 100 g/L가 되도록 Quil A를 BIS로 제조하고, 즉시 사용하지 않는 경우에 살균 여과한다.
단계 5: 교반 온도 조절 용기(22-37℃)에서 미리 가열된 BIS, Mega-10 용액(160 ㎖/L)에 용해된 콜레스테롤/DPPC 및 Quil A(200 ㎖/L) 용액을 차례로 첨가하여 ISC를 배합한다. 이 반응은 BIS를 첨가하여 표적 부피가 되게 한다.
단계 6: 전체 배합은 필요 온도(22-37℃ 가용 작동 범위를 갖는 표적 27℃)에서 평형하게 되고 ISC 형성을 위해 15분 동안 교반하여 반응시킨다. ISC 용액은 단계 7로 진행되거나 적정 보관을 위해 살균 여과한다.
단계 7: ISC 반응 혼합물을 온도 조절(22-37℃ 가용 작동 범위를 갖는 표적 27℃) 하에 비결합 요소를 제거하기 위해 BIS에 대하여 최소 20 부피 교환의 투석(막: hydrosart 30 kDa(Sartoriun AG Goettingen))으로 세척하였다.
단계 8: 투석한 ISC를 투석에 사용된 동일한 막을 사용한 한외거르기로 대략 2-폴드로 농축하였다. ISC를 원래 부피로 회복시키기 위해 여과 시스템을 BIS로 세척하였다.
단계 9: ISC를 0.22 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 살균 여과하여 살균 저장용기로 옮겼다.
단계 10: ISC 보조제(adjuvant)를 백신 제조에 사용할 때까지 2-8℃에서 보관하였다.
면역 자극 조성물(250 ㎍/㎖) 가용성 HeV G 당단백질(예컨대, 5, 50, 100 ㎍/㎖)의 적절한 양과 결합시키고 BIS로 부피를 조절하였다.
실시예 5: 1차 임상 실험(말)
시험 백신 1: 250 ㎍ 면역 자극 복합체가 보조된 100 ㎍/용량 재조합 헨드라 바이러스 가용성 당단백질(sG): 부피는 살린 용액으로 1 ㎖/용량으로 조절하였다.
시험 백신 2: 250 ㎍ 면역 자극 복합체가 보조된 50 ㎍/용량 재조합 헨드라 바이러스 가용성 당단백질(sG): 부피는 살린 용액으로 1 ㎖/용량으로 조절하였다.
시험 백신 3: 250 ㎍ 면역 자극 복합체가 보조된 5 ㎍/용량 재조합 헨드라 바이러스 가용성 당단백질(sG): 부피는 살린 용액으로 1 ㎖/용량으로 조절하였다.
고농도의 항원(50 ㎍/용량 및 100 ㎍/용량)을 포함하는 백신을 투여한 2 롯트의 말로부터 말의 혈청학 및 공격/방어 데이터를 수집하였다.
혈청학: 두 말을 각각 두 백신 용량(100 ㎍ sG with ISC)로 면역하여 21일 격리하였다. 포스트-프라이밍 및 프리-챌린지 혈청 테스트는 HeV에 대한 백신-유도성 혈청변환을 확인하였다(표 1). 프리-챌린지 바이러스 중화 항체 정도는 밀접하게 관련된 니파 바이러스의 치사량 외에 노출된 고양이에서 보호되는 것으로 밝혀진 것과 유사한 정도이다. 보조제를 투여한 말(음성 대조군)은 바이러스 챌린지 전에 HeV의 항체가 생성되지 않았다.
말 번호 기저 역가 포스트-프라임 역가 프리-챌린지 역가
V1 <2 32 1024
V2 <2 32 512
V3 (대조군l) <2 <2 <2
따라서, 각 말에 BSL4 보호격리시설에서 생(live) HeV를 노출시키고 27일 후에 추가 투여하였다. 바이러스는 비강내 투여(1×106 TCID50) 및 구강 투여(1×106 TCID50)하였다. 챌린지 및 그 후 관찰기간 동안, 본 업무에 관련된 직원은 대조군 말의 정체를 공지하지 않았다.
V1에 대한 임상 관찰: 말은 포스트-챌린지 8일에 기록한 내재 경정맥 카테커의 입구의 국부 감염 외에 HeV 노출 후 관찰 기간 동안 임상적으로 건강하였다. 이는 질환의 어떠한 체질적 징후와 관련이 없다. 바이러스 챌린지 9일 후에 말을 전기적으로 안락사 시켰다. 사후 분석에서 기형은 10 ㎝ 장간막 지방종(부수적 발견) 및 바르비투르로 인한 왼쪽 심성폐 엽의 복부 끝의 림프관의 가벼운 팽창에 국한하였다. 조직의 초기 스크리닝은 말에서 병소 또는 HeV 항원의 어떠한 증거도 발견되지 않았다.
V2에 대한 임상 관찰: 말은 3일 째에 가벼운 일시적인 비루(nasal discharge)가 발견되었으나, 6일 째 경정맥 카테터의 부위의 국부적인 염증 반응과 관련된 체온 상승 전까지 건강하였다. 카테터를 제거하여도 병소가 계속 확장되어 말이 점점 민감해져 다음날인 7일에 지효성 페니실린을 처리하였다. 8일 째에 온도 및 기질은 정상으로 돌아왔고, 전기적으로 안락사 시켰다. 사후 분석에서 기형은 바르비투르로 인한 오른쪽 심성폐 엽의 복부 끝의 림프관의 가벼운 팽창에 국한하였다. 조직의 초기 스크리닝은 말에서 병소 또는 HeV 항원의 어떠한 증거도 발견되지 않았다; 상세한 분석은 현재 완료중이다.
V3에 대한 임상 관찰: 말은 4일 째에 가벼운 일시적인 비루(nasal discharge)가 발견되었으나, 국부 징후 외에 6일 째 체온 상승 까지 건강하였다. 심박동수가 증가하였고 가벼운 탈수와 일관된 피부의 약한 텐팅(tenting) 및 턱업(tucked-up) 외관이 나타났다. 이러한 징후들은 실험실 조건에서 급성 HeV 감염의 전형적인 징후이다. 체온 및 심박동수는 12시간 이후에도 계속 증가하였다(도 1 및 2). 말은 조금 활기가 없어졌고 7일 째에 인도적 처우로 안락사 시켰다. 사후 분석에서 늑막 비후 및 부종과 함께 복부 8-10 ㎝와 함께 폐의 심장성 엽 림프관의 중간 정도로 심한 확장이 있었다.
조직학적 분석에서, 혈관벽의 유섬유소변성괴사(fibrinoid necrosis)를 갖는 폐의 맥관염, 소엽 사이의 중격의 부종 및 소상괴사성 폐포염이 있었다. 내피 및 폐; 뇌막; 뇌 유연조직; 삼차신경절; 하악; 기관지; 사타구니 및 신장의 림프노드; 비장; 간; 심장; 연구개; 부신; 신장 사구체; 소장 및 대장; 인두 및 비개골뿐만 아니라 비장의 배중심 및 가끔 심근세포의 혈관의 메디아에서 HeV 항원의 광범위한 침적이 있었다. 척수, 후낭, 방광 및 뇌의 후두극은 음성이였다. 조직 테스트 및 면역조직 테스트는 과급성 HeV 감염과 일관되었다.
임상 시료의 분자 분석. 임상 관찰 기간 동안, 면역된 말 V1 및 V2로부터 수집한 생물학적 시료에서 HeV의 쉐딩에 대한 증거는 발견되지 않았다. 특히, 노출 후 비강 내부 면봉 채취물 및 혈액으로부터 게놈이 회복되지 않았다.
반면에, 비-면역 말 V3에서는, 챌린지 3일 후 비강 내 면봉 채취물에서 바이러스의 게놈이 검출되었다. 연이은 시료 채취 일의 Ct 값 감소는 기도 상부에서 바이러스의 복제를 시사하고, HeV Redlands 2008에 노출된 정상말의 실험실 초기 관찰과 일관된다. 우울증과 같은 다른 임상적 징후의 최초 인식을 동반하는 발열 시작에 직전의 혈중 바이러스 게놈의 발견 및 이후의 분비는 초기 관찰과 일관된다.
Figure pct00001
사후 시료. 다수의 조직에 감염이 전염된 V3(대조군) 내 챌린지 바이러스의 복제를 TaqMan PCR(HeV N-유전자)로 확인하였다(표 3). 이전에 보고되었듯이, 호기도의 상부 및 하부와 관련된 폐, 비장, 신장, 심근 및 림프양조직에서 가장 높은 복제 정도가 나타났다(V1 및 V2).
Figure pct00002
포스트-챌린지 혈청 테스트. HeV 챌린지 후 면역된 말 V1 및 V2는 역가가 증가하지 않았다(표 4). 이는 동물들에서 챌린지 바이러스의 유의한 복제가 없음과 일관된다. 포스트-챌린지 7일 째에 안락사 시점에서 대조군 말 V3은 항체가 검출되지 않았다. 이는 검출할 수 있는 항체의 생성에 바이러스 노출 및 동물의 죽음 사이의 시간이 불충분한 것으로 생각되고, 이는 이전의 말의 HeV Redlands의 관찰과 일관된다.
말 번호 기저 역가 포스트-프라임 역가 프리-챌린지 역가 최종 역가
V1 <2 32 1024 128, 128 (day 9)
V2 <2 32 512 128, 256 (day 8)
V3 (대조군) <2 <2 <2 <2, <2 (day 7)
1차 접종에서 100 ㎍ sG+ISC 보조제를 접종한 두 말(V1 및 V2)는 HeV 노출 이전에 HeV에 대한 항체를 생산하였다. ISC만 접종된 말(V3)은 챌린지 바이러스에 대하여 혈청 반응 음성이였다.
HeV의 치사량 외로 챌린지한 다음, 면역된 말은 관찰 기간 동안 임상적으로 건강하였고, 이는 HeV가 실험적으로 유도된 말의 경우의 발병시기를 능가하였다. 혈청학적 증상을 갖지 않는 말(V3)을 급성 HeV와 일관된 임상 징후가 발생한 후 안락사 시켰다. 말들에서 챌린지 바이러스의 복제가 나타나지 않음과 일관되게, 면역된 말에서 챌린지 후에 항체 역가의 증가가 검출되지 않았다.
모든 일일 임상 시료에 대한 PCR 음성 결과에서 면역된 말에서 바이러스의 쉐딩이 나타나지 않았다. 비-면역된 대조군에서는, 바이러스 노출 후 3일부터 비강 내 면봉 채취물에서, 발열 직전의 혈중에서, 및 발열 후의 임상 시료에서 바이러스의 게놈이 검출되었다. 쉐딩의 경향은 이전의 연구에서의 HeV에 노출된 정상말에서와 일치하였다.
급성 감염 기간으로 예상되는 때에 안락사 시킨 후, 사후 검사에서 수집한 면역된 말의 조직에서 HeV 바이러스의 복제는 없었다. 반면에, HeV 게놈 및 항원은 급성 HeV 감염과 일관되게 대조군 말의 조직 전반에 분포하였고, HeV 감염의 전형전인 맥관병도 확인되었다.
실시예 6: 2차 임상 실험(말)
3 마리 말을 각각 2가지 백신 용량(50 ㎍ sG with ISC)으로 21일 차이로 면역하였다. 포스트-프라이밍 및 프리-챌린지 혈청 테스트로 HeV에 대한 백신-유도성 혈청전환(seroconversion)을 확인하였다(표 5). 프리-챌린지 바이러스 중화 항체 정도는 밀접하게 관련된 니파 바이러스의 치사량 외로 노출된 고양이 및 본 명세서에 기재된 1차 임상 실험에서 HeV에 노출된 말에서 방어하는 것에 필적한다. 보조제가 접종된 말은 면역된 말의 바이러스 챌린지 이전에 HeV에 대한 항체를 생성하지 않았다(데이터 나타내지 않음).
말 번호 기저 역가 포스트-프라임 역가 프리-챌린지 역가
V4 <2 4 256/128
V5 <2 32 2048/>8192
V6 <2 4 512/1024
따라서, 각 면역된 말을BSL4 보호격리시설에서 생(live) HeV를 노출시키고 27일 후에 추가 투여하였다. 바이러스는 비강내 투여(1×106 TCID50) 및 구강 투여(1×106 TCID50)하였다. 본 발명에서 병원성 대조군으로 HeV 질환에 4마리 기니피그를 이중 중 최소 1마리가 굴복하는 것을 이용하였다. 기니피그는 복강내 경로로 50,000 TCID50 HeV를 노출시켰다.
V4에 대한 임상 관찰: 말은 HeV 노출 후 관찰 기간 동안 임상적으로 건강하였고, 체온 및 심박동수는 정상 한계 내였다. 바이러스 챌린지 8일 후, 말을 전기적으로 안락사 시켰다. 사후 검사에서 기형이 나타나지 않았다. 말 내 조직의 초기 스크리닝에서 병소 또는 HeV 항원의 흔적이 없었다. 상세한 검사는 현재 완료중이다.
V5에 대한 임상 관찰: HeV 노출 후 관찰 기간 동안 임상적으로 건강하였고, 체온 및 심박동수는 정상 한계 내였다(도 2). 바이러스 챌린지 7일 후, 말을 전기적으로 안락사 시켰다. 사후 검사에서 기형이 나타나지 않았다. 말 내 조직의 초기 스크리닝에서 병소 또는 HeV 항원의 흔적이 없었다. 상세한 검사는 현재 완료중이다.
V6에 대한 임상 관찰: HeV 노출 후 관찰 기간 동안 임상적으로 건강하였고, 체온 및 심박동수는 정상 한계 내였다(도 2). 바이러스 챌린지 9일 후, 말을 전기적으로 안락사 시켰다. 사후 검사에서 기형이 나타나지 않았다. 말 내 조직의 초기 스크리닝에서 병소 또는 HeV 항원의 흔적이 없었다. 상세한 검사는 현재 완료중이다.
기니피그: 4마리 기니피그 중 한마리(No. 3)가 HeV 챌린지 후 3일째에 체중이 감소하기 시작했다. 체중감소는 신경증상(사경, 떨림)나타난 5일까지 진행되었고, 안락사 시켰다. 사후 분석에서 기형은 복막후 결합조직의 부종에 한정되었다.
조직학적 검사에서, HeV 항원의 축적과 관련된 폐혈관염, 신장 주변부의 맥관염, 난소염 및 비-화농성 뇌염이 있었다. 조직학적 검사 및 면역 조직학적 검사는 급성 HeV 감염과 일관되었고, 챌린지 바이러스의 병원성을 확인하였다.
임상 관찰의 기간 동안 3일째 V6의 직장 면봉 채취물의 2 웰 중 하나에서 TaqMan PCR에 의해 36.2의 G 값(HeV N 유전자)이 확인된 것을 제외하고 V4, V5 또는 V6로부터 수집한 생물학적 시료에서 HeV의 쉐딩에 대한 증거는 없었다(표 6). 특히, 노출 후 비강 내부 면봉 채취물 및 혈액으로부터 게놈이 회복되지 않았다.
Figure pct00003
사후 시료. 면역된 말 V4, V5 또는 V6의 조직 내 바이러스 복제의 증거는 없었다. 챌린지 후 5일 째에 한마리 기니피그(No. 3)에서 급성 HeV 감염의 임상학적, 조직학적 및 면역조직학적 발견을 뒷받침하는 바이러스 게놈이 혈액(Ct 34.2), 뇌, 폐 및 비장에서 검출되었다(표 7).
Figure pct00004
포스트-챌린지 혈청 테스트. 면역된 말 V4, V5 및 V6는 HeV 챌린지후 역가가 증가하지 않았다(표 8). 이는 동물들 내 챌린지 바이러스의 유의한 복제가 없는 것과 일관된다.
말 번호 기저 역가 포스트-프라임 역가 프리-챌린지 역가 최종 역가
V4 <2 4 256/128 256/32 (day 8)
V5 <2 32 2048/>8192 1024/512 (day 7)
V6 <2 4 512/1024 128/256 (day 9)
1차 접종에서 50 ㎍ sG+ISC 보조제로 접종된 3마리 말(V4, V5 및 V6)는 HeV 노출 전에 HeV에 대한 항체를 생산하였다. ISC만 접종된 말(V3)은 챌린지 바이러스에 대하여 혈청 반응 음성이였다.
HeV의 치사량 외 챌린지 후에, 면역된 말들은 관찰 기간 동안 임상학적으로 건강하였고, 이는 말에서 HeV이 실험적으로 유도된 경우의 발병시기를 능가하였다. 한마리 기니피그를 병원성 대조군으로 사용하였고, 급성 HeV에 일치하는 임상적 징후가 발생한 후에 안락사 시켰다. 면역된 말 내에서 챌린지 후 항체 역가의 증가는 검출되지 않았고, 이는 이 동물들에서 챌린지 바이러스의 복제가 검출되지 않은 것과 일관된다.
3일째 V6의 직장 면봉 채취물의 단 하나의 복제물 외에 임상 관찰의 기간 동안 모든 일일 임상 시료에 대한 PCR 음성 시험 결과에 의하면, 면역된 말에서 HeV의 쉐딩에 대한 증거는 없었다. 이 테스트는 반복중이다; 잔여 접종물이 저농도로 관찰되는 유사한 결과일 것이다. 바이러스 노출 후 5일 째에 비-면역 기니피그의 주요 장기 및 혈액에서 바이러스의 게놈이 검출되었다.
급성 감염 기간으로 예상되는 때에 안락사 시킨 후 사후 검사에서 수집한 면역된 말의 조직에서 HeV 바이러스의 복제의 증거는 없었다. 반면에, HeV 게놈 및 항원은 급성 HeV 감염과 일관되게 감수성의 기니피그의 조직 전반에 분포하였고, HeV 감염의 전형전인 맥관병도 또한 확인되었다.
실시예 7: 니파 바이러스에 대한 영장류 임상 실험
통계처리. 특정 비-인간 영장류 연구에서 동물 연구를 진행하기 위해, 생물안전도 4에서 동물 대상의 수, 얻을 수 있는 시료의 양 및 독립적인 반복 분석을 엄격하게 한정하였고, 통계적 분석을 한정하였다. 결과적으로, 데이터는 반복 시료에서 산출된 평균 또는 중간값으로 나타내어지고, 반복 실험이 아닌 경우 오류 막대로 표준편차를 나타냈다.
바이러스. NiV-Malaysia(GenBank Accession No. Af212302)는 조지아, 애틀란타, 질병관리본부의 특수병원체과로부터 얻었다. Rockx et al. (2010) J. Virol. 84, 9831.에 설명된대로, NiV는 Vero 세포에서 생식하고 역가를 측정하였다.
백신 배합. sGHeV의 3종류 백신 제조를 이용하였다(10 ㎍, 50 ㎍ 또는 100 ㎍). sGHeV의 제조 및 정제는 Pallister (2011) Vaccine 29, 5623에 설명된대로 실시하였다. 각 백신 배합은 또한 Allhydrogel™(Accurate Chemical & Scientific Corporation) 및 전체 포스포로티어에이트 백본을 갖는 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN) 2006(Invivogen)을 함유하였다. ODN 2006의 고정양, sGHeV의 변수량 및 알루미늄 이온(중량비 1:25)을 포함하는 백신 용량을 다음과 같이 제조하였다: 100 ㎍ 용량: 100 ㎍ sGHeV, 1.25 ㎎ 알루미늄 이온 및 150 ㎍ ODN 2006; 50 ㎍ 용량: 50 ㎍ sGHeV, 1.25 ㎎ 알루미늄 이온 및 150 ㎍ ODN 2006; 및 10 ㎍ 용량: 5 ㎍ sGHeV, 250 ㎍ 알루미늄 이온 및 150 ㎍ ODN 2006. 모든 용량에 대하여, Alhydrogel™ 및 sGHeV을 ODN 2006이 첨가되기 전에 혼합하였다. 각 백신 용량은 주입 전에 PBS로 1 ㎖로 조절하고 혼합물을 실온 조건의 회전 휠에서 최소 2-3시간 동안 반응시켰다. 프라임 및 부스트에 대하여 동일한 1 ㎖ 용량으로 각 대상에게 투여하였고, 모든 백신 용량은 근육내 투여로 하였다.
동물. 4-6 ㎏ 체중의 10 살 청소년 아프리카 사바나원숭이(african green monkeys; AGM, Chlorocebus aethiops)를 각각 우리에 가두었다. 대상을 케타민(10-15 ㎎/㎏) 근육내 투여로 마취하고 sGHeV를 -42일(프라임) 및 -21일(부스트)에접종하였다. 3마리 대상(AGM 16, AGM 17, AGM 18)에 10 ㎍ 용량을 투여하였고, 3마리 대상(AGM 13, AGM 14, AGM 15)에 50 ㎍ 용량을 투여하였으며, 3마리 대상(AGM 10, AGM 11, AGM 12)에 2번 100 ㎍ 용량을, 1마리 대상(AGM 9)에 보조제-단독을 투여하였다. 0일, 대상을 마취하고 4 ㎖ DMEM(Sigma-Aldrich)의 1×105 TCID50 NiV(조직 배양 감염 용량의 중간값)를 기관내 주입으로 접종하였다. 감염 후(post-infection; p.i.) 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 및 28일에 체온, 호흡률, 흉부 방사선, 출혈 및, 비강, 구강 및 직장 점막의 면봉 채취물의 임상학적 검사를 위해 대상을 마취하였다. 감염 후 10일에 인도적 종료시점에 따라 대조군 대상(AGM 9)을 안락사 시켰다. 다른 모든 대상은 연구 종결 시까지 생존하였고, 감염 후 28일에 안락사 시켰다. 부검 시, 바이러스 및 조직학적 분석을 위해 다양한 조직을 수집하였다. 결막, 편도선, 중앙인두/비인두, 비강 점막, 기관, 오른쪽 기관지, 왼쪽 기관지, 오른쪽 폐 위엽, 오른쪽 폐 중엽, 오른쪽 폐 아래엽, 가벼운 폐 상엽, 가벼운 폐 중엽. 가벼운 폐 아래엽, 기관지 림프노드, 심장, 간, 비장, 신장, 부신, 췌장, 공장, 횡행결장, 뇌(전두부), 뇌(소뇌), 뇌간, 경부척수, 뇌하수체, 하악 림프노드, 타액 림프노드, 서혜부 림프노드, 겨드랑이 림프노드, 장간막 림프노드, 방광, 고환 또는 난소, 대퇴부 골수를 포함하는 조직의 시료를 조사하였다. 백신 접종은 BSL-2 격리하에 실시하였다. 백신 접종 일정, 챌린지 및 생물학적 시료 수집일의 타임라인을 도 4에 나타내었다.
백신 접종 및 NiV 챌린지. 이전에, AGM의 105 TCID50(조직 배양 감염 용량의 중간값) NiV의 기관내 접종이 치사를 야기함을 보여주었다(Rockx et al. (2010) J. Virol. 84, 9831). 본 연의 급속히 진행되는 임상적 질환을 기록하였다. 임상학적 징후는 심각한 우울증, 급성 호흡장애로 이어지는 호흡기 질환, 심각한 신경질환 및 심각하게 감소된 이동성, 및 7-12일에 안락사에 대하여 승인된 인도적 종료시점이 되는 시간을 포함한다. 본 발명자들은 sGHeV의 백신 접종이 AGMs에서 NiV 감염 및 질환을 억제하는지 결정하고자 하였다. 방법에 기재한 것과 같이, 10, 50 또는 100 ㎍ sGHeV의 용량을 알럼(alum) 및 CpG 모이어티와 혼합하였다. 각 백신을 3마리 대상에 0일(프라임) 및 21일(부스트)에 피하로 투여하고 보조제 단독을 한마리 대조군 대상(AGM 9)에 동일한 날 투여하였다. 42일에, 모든 대상에 105 TCID50 NiV를 기관내 접종하였다. 대조군 대상(AGM 9)은 말기 질환의 식욕 감퇴, 심한 행동 변화(우울증, 활동성 감소, 구부린 자세), 혈소판 수의 감소 및 호흡률의 극적 증가를 나타내었다. 다음, AGM 9은 급성 호흡 장애로 발전하였고 감염 후 10일에 인도적 종결시점에 따라 안락사 시켰다. 반면에, 백신 접종된 대상은 임상적 질환을 나타내지 않았고, 실험 종결시까지 생존하였다. Kaplan-Meier 생존곡선을 도 5에 나타내었다.
대조군 대상 내 NiV-매개 질환. 대조군 대상 내 총 병리학적 변화는 NiV-감염된 AGMs의 이전 연구와 일치하였다(Geisbert et al. (2010) PLoS One 5, e10690). 뇌 표면에서 비장 비대증 및 혈관의 충혈이 존재하였고 모든 폐 엽은 습하고 폐기종이 있었다. AGM 9 혈액 시료에서 NiV RNA 및 감염성 바이러스가 생식하지 않았고, 바이러스 감염에 대한 증거도 없었다. AGM 9는 NiV-특이 IgM의 유의한 정도를 나타냈고, NiV-특이 IgG 및 IgA를 검출되었다. 조직 시료의 추가적인 분석은 이전에 확인한 광범위한 NiV 감염과 유사하게 광범위한 NiV 조직 바이러스친화성을 나타내었다(Geisbert et al. (2010) PLoS One 5, e10690). 지적한 바와 같이 AGM 9는 다수의 조직에서 NiV RNA를 나타내었고, 감염성 바이러스는 많은 조직에서 생식하였다. 유의한 병소는 조직 사이의 폐렴, 아급성 뇌염 및 괴사, 및 백색수의 출혈을 포함한다. 폐포 공간은 부종 유체, 피브린, 핵붕괴 및 세포 잔해, 및 폐포성 대식세포로 채워져 있었다. 다소성 뇌염은 중간 수의 림프구 및 적은 호중성 백혈구에 의한 Virchow-Robins 공간의 팽창이 특징이다. 소수의 염증 세포는 주변 조직으로 확장된다. 수많은 뉴런은 부어오르고 공포가 되거나 핵융해와 함께 분절화된다(괴사). 백색수 내 모낭의 다소성 배중심은 출혈 및 피브린 및 소수의 호중성 백혈구, 및 세포성 및 핵붕괴성 잔해에 의해 없어진다. 이러한 발견은 비장 내 괴사 및 배중심의 손실과 일치한다. 뇌간에 존재하는 대량의 바이러스 항원은 NiV에 의해 중추신경계가 광범위하게 손상됨을 의미한다.
sGHeV-백신 접종 대상의 예방. 챌린지 후 수집된 모든 혈액 샘플 및 부검 시 수집한 모든 조직을 포함하는 모든 생물학적 시료는 NiV RNA에 대하여 음성이였고 감염성 바이러스가 분리되지 않았다. 예방 접종된 대상의 조직 일부의 세밀한 검사에서, 조직 아키텍쳐는 정상을 나타냈고, 면역조직학적 검사 시 NiV 항원은 조직에서 검출되지 않았다. 예방의 백신-유도성 기작을 추가적으로 분석하기 위해, 백신 접종된 대상에서 혈청 및 점막성 sGNiV- 및 sGHeV-특이 IgM, IgG 및 IgA 뿐만 아니라 NiV 및 HeV 혈청 중화 역가를 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 챌린지 7일 후, 최소 sGHeV 용량이 접종된 대상은 항원-특이 혈청 IgM 및 고수준의 sGHeV-특이 혈청 IgG가 검출되었다. 챌린지 7일 후, 50 ㎍ sGHeV가 접종된 대상 또한 혈청 IgM 및 고수준의 혈청 IgG가 검출되었다. -7일에 고용량을 접종한 대상은 다른 두 군과 비교하여 혈청 IgM 및 혈청 IgG 정도가 유의하게 낮아 검출되지 않았다. NiV 챌린지까지, 고용량을 접종한 대상의 혈청 IgG 정도는 증가하였고, 모든 백신 접종된 대상은 유사한 IgG 정도를 나타내었다. NiV 챌린지 후에 혈청 IgM 정도는 변함없었다. 중간 용량 접종한 대상에서 NiV 챌린지 날에 혈청 IgG 정도는 감소하였고, 저용량 접종한 대상에서는 NiV 챌린지 후에 IgG 정도가 감소하였다. 흥미롭게도, 두 군에서 감염 후 3일 및 5일까지 IgG 정도는 증가하였으나, 그러나, IgG 정도는 챌린지 7일 전까지 초과하지 않았고, 감염 후 28일까지 양 군의 역가는 유의하게 감소하였다.
정반대로, 고용량 군에서 혈청 IgG 정도는 높은 수준으로 남아있었고, 감염 28일 후 최고치를 나타냈다. 백신 접종 후 모든 대상에서 항원-특이 혈청 IgA가 검출되었다; 그러나, 정도는 매우 낮았고, 프리- 및 포스트-챌린지에서 유의한 변화 정도를 나타내지 않았다(도 6). 감염 14일 후 저용량 대상의 비강 면봉 채취물에서 점막성 항원-특이 IgA 내 최소 증가가 검출되었으나, 그 정도가 너무 낮아 챌린지 후 NiV의 확산을 막는 역할을 했을 것으로 보이지 않았다. 혈청 중화 시험(serum neutralization tests; SNTs) 결과를 표 9에 나타내었다. 모든 백신-접종된 대상에서, 감염 28일 후까지 HeV-특이 중화 역가가 동일하거나 감소되는 것으로 확인되었고, 챌린지 후 저용량 대상에서 조차, 감염 7일 후까지 NiV-특이 중화 역가는 유의하게 변화하지 않았다. 한마리 저용량 대상 및 한마리 고용량 대상은 감염 14일 후 까지 NiV SNT 역가가 로그 증가하였고, 한마리 중간용량 대상은 감염 21일 후까지 NiV SNT 역가가 로그 증가하였다. 모든 백신 접종된 대상에서, SNT 역가의 변화는 일관(역가가 증가하다가 감소)되거나, 유의하지 않았다(로그 보다 낮은 3-4 폴드까지 증가). 마침내, NiV 챌린지 후 예방 접종한 대상에서 NiV 융합(F) 외막 당단백질로의 혈청변환이 측정되었다. 감염 10일 및 21일 후 저용량 및 중간용량 대상에서 각각 혈청 항-NiV F IgM의 최소량이 검출되었고, 이러한 낮은 M.F.I 값은 NiV 챌린지 후 약한 1차 항체 반응을 의미한다. 고용량 대상에서 혈청 항-NiV IgM은 검출되지 않았으며, 이는 챌린지 후 순환하는 바이러스가 거의 없음을 의미한다.
Day2 -42 -7 7 14 28 -42 -7 7 14 28
sGHeV doses AGM HeV NiV
0 3 9 <20 <20 24 * * <20 <20 <20 * *

10
 16 <20 >2560 >2560 >2560 1074 <20 379 226 >2560 2147
17 <20 >2560 >2560 905 537 <20 134 134 537 453
18 <20 >2560 >2560 453 537 <20 189 134 189 453

50
13 <20 >2560 >2560 >2560 757 <20 379 189 189 453
14 <20 1514 >2560 >2560 537 <20 28 47 226 134
15 <20 2147 757 >2560 905 <20 67 95 757 1074

100 g		 10 <20 >2560 2147 1810 453 <20 67 113 268 453
11 <20 >2560 >2560 >2560 1514 <20 134 189 905 1514
12 <20 >2560 >2560 >2560 757 <20 189 226 >2560 1514
실시예 8: 헨드라 바이러스에 대한 영장류 임상 실험
헨드라 바이러스에 대한 백신 접종 및 챌린지를 평가하기 위해 2차 임상 실험을 AGM에서 진행하였다. 실시예 7과 동일한 배합을 백신으로 이용하였고, 보조제(no ODN 2006으로 나타냄)로 Alhydrogel™을 sGHeV와 같이 투여한 다른 군과 비교하였다. 동물들을 -21일에 접종하고, 0일에 추가접종하고, 21일에 챌?니 접종하였다. 별도의 표시가 없으면, 모든 조건은 실시예 7과 동일하였다. 다음은 실험 요약이다:
처방 A를 투여한 처리군 100 ㎍/용량 헨드라 sG 백신+보조제(150 ㎍ CpG ODN 2006+119 ㎕ Alhydrogel) 3주 간격의 4 프라임+1 부스트 처방 B 100 ㎍/용량 헨드라 sG 백신+보조제(250 ㎕ Alhydrogel) 3주 간격의 4 프라임+1 부스트 처방 C 보조제 단독(150 ㎍ CpG ODN 2006) 3주 간격의 1 프라임+1 부스트 처방 D 보조제 단독(250 ㎕ Alhydrogel) 1 A-B 군과 동일한 일정 총 10
결과: 두 군(A 및 B)의 모든 동물(n=4)은 105 TCID50 헨드라 바이러스를 기관내 접종한 후 헨드라 바이러스 챌린지에 생존하였다. 대조군 대상은 8일에 죽었다. 백신 접종된 대상은 임상적 질환이 관찰되지 않았고 연구 종료점까지 건강하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예인 것이 명백하다. 본 명세서에 기재된 모든 발행물 , 미국 및 외국 특허 및 특허출원을 포함하는 모든 참고 문헌은 참고문헌으로써 구체적 및 전적으로 인용된다. 명세서 및 실시예는 다음의 청구범위에 의해 기재된 본 발명의 정확한 영역 및 의미를 예시로 간주되도록 한다.
<110> THE HENRY M. JACKSON FOUNDATION FOR THE ADVANCEMENT OF MILITARY MEDICINE. INC. ZOETIS LLC <120> HENDRA AND NIPAH VIRUS G GLYCOPROTEIN IMMUNOGENIC COMPOSITIONS <130> 013306-5006 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1815 <212> DNA <213> Hendra virus <400> 1 atgatggctg attccaaatt ggtaagcctg aacaataatc tatctggtaa aatcaaggat 60 caaggtaaag ttatcaagaa ttattacggc acaatggaca tcaagaaaat taacgatggg 120 ttattagata gtaagatact tggggcgttt aacacagtga tagctttgtt gggatcaatc 180 atcatcattg tgatgaatat catgataatt caaaattaca ccagaacgac tgataatcag 240 gcactaatca aagagtcact ccagagtgta cagcaacaaa tcaaagcttt aacagacaaa 300 atcgggacag agataggccc caaagtctca ctaattgaca catccagcac catcacaatt 360 cctgctaaca tagggttact gggatccaag ataagtcagt ctaccagcag tattaatgag 420 aatgttaacg ataaatgcaa atttactctt cctcctttaa agattcatga gtgtaatatc 480 tcttgtccga atcctttgcc tttcagagaa taccgaccaa tctcacaagg ggtgagtgat 540 cttgtaggac tgccgaacca gatctgtcta cagaagacaa catcaacaat cttaaagccc 600 aggctgatat cctatactct accaattaat accagagaag gggtttgcat cactgaccca 660 cttttggctg ttgataatgg cttcttcgcc 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Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly 340 345 350 Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly 355 360 365 Phe Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile 370 375 380 Ile His Cys Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly 385 390 395 400 Val Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr 405 410 415 Asn Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala 420 425 430 Asp Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu 435 440 445 Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile 450 455 460 Lys Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg 465 470 475 480 Asn Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe 485 490 495 Asn Val Cys Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe 500 505 510 Leu Ile Asp Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser 515 520 525 Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu 530 535 540 Ile Leu Tyr Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys 545 550 555 560 Thr Ile Thr Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser 565 570 575 Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu 580 585 590 Phe Ala Val Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser 595 600 <210> 3 <211> 1809 <212> DNA <213> Nipah virus <400> 3 atgccggcag aaaacaagaa agttagattc gaaaatacta cttcagacaa agggaaaatt 60 cctagtaaag ttattaagag ctactacgga accatggaca ttaagaaaat aaatgaagga 120 ttattggaca gcaaaatatt aagtgctttc aacacagtaa tagcattgct tggatctatc 180 gtgatcatag tgatgaatat aatgatcatc caaaattaca caagatcaac agacaatcag 240 gccgtgatca aagatgcgtt gcagggtatc caacagcaga tcaaagggct tgctgacaaa 300 atcggcacag agatagggcc caaagtatca ctgattgaca catccagtac cattactatc 360 ccagctaaca ttgggctgtt aggttcaaag atcagccagt cgactgcaag tataaatgag 420 aatgtgaatg aaaaatgcaa attcacactg cctcccttga aaatccacga atgtaacatt 480 tcttgtccta acccactccc ttttagagag tataggccac agacagaagg ggtgagcaat 540 ctagtaggat tacctaataa tatttgcctg caaaagacat ctaatcagat attgaagcca 600 aagctgattt catacacttt acccgtagtc ggtcaaagtg gtacctgtat cacagaccca 660 ttgctggcta tggacgaggg ctattttgca tatagccacc tggaaagaat cggatcatgt 720 tcaagagggg tctccaaaca aagaataata ggagttggag aggtactaga cagaggtgat 780 gaagttcctt ctttatttat gaccaatgtc tggaccccac caaatccaaa caccgtttac 840 cactgtagtg ctgtatacaa caatgaattc tattatgtac tttgtgcagt gtcaactgtt 900 ggagacccta ttctgaatag cacctactgg tccggatctc taatgatgac ccgtctagct 960 gtgaaaccca agagtaatgg tgggggttac aatcaacatc aacttgccct acgaagtatc 1020 gagaaaggga ggtatgataa agttatgccg tatggacctt caggcatcaa acagggtgac 1080 accctgtatt ttcctgctgt aggatttttg gtcaggacag agtttaaata caatgattca 1140 aattgtccca tcacgaagtg tcaatacagt aaacctgaaa attgcaggct atctatgggg 1200 attagaccaa acagccatta tatccttcga tctggactat taaaatacaa tctatcagat 1260 ggggagaacc ccaaagttgt attcattgaa atatctgatc aaagattatc tattggatct 1320 cctagcaaaa tctatgattc tttgggtcaa cctgttttct accaagcgtc attttcatgg 1380 gatactatga ttaaatttgg agatgttcta acagtcaacc ctctggttgt caattggcgt 1440 aataacacgg taatatcaag acccgggcaa tcacaatgcc ctagattcaa tacatgtcca 1500 gagatctgct gggaaggagt ttataatgat gcattcctaa ttgacagaat caattggata 1560 agcgcgggtg tattccttga cagcaatcag accgcagaaa atcctgtttt tactgtattc 1620 aaagataatg aaatacttta tagggcacaa ctggcttctg aggacaccaa tgcacaaaaa 1680 acaataacta attgttttct cttgaagaat aagatttggt gcatatcatt ggttgagata 1740 tatgacacag gagacaatgt cataagaccc aaactattcg cggttaagat accagagcaa 1800 tgtacataa 1809 <210> 4 <211> 602 <212> PRT <213> Nipah virus <400> 4 Met Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser Asp 1 5 10 15 Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr Met 20 25 30 Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser 35 40 45 Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val 50 55 60 Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln 65 70 75 80 Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly 85 90 95 Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile 100 105 110 Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly 115 120 125 Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu 130 135 140 Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile 145 150 155 160 Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu 165 170 175 Gly Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys 180 185 190 Thr Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro 195 200 205 Val Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met 210 215 220 Asp Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys 225 230 235 240 Ser Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu 245 250 255 Asp Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr 260 265 270 Pro Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn 275 280 285 Glu Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile 290 295 300 Leu Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala 305 310 315 320 Val Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala 325 330 335 Leu Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly 340 345 350 Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly 355 360 365 Phe Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile 370 375 380 Thr Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly 385 390 395 400 Ile Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr 405 410 415 Asn Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser 420 425 430 Asp Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu 435 440 445 Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile 450 455 460 Lys Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg 465 470 475 480 Asn Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe 485 490 495 Asn Thr Cys Pro Glu Ile Cys Trp Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe 500 505 510 Leu Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser 515 520 525 Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu 530 535 540 Ile Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys 545 550 555 560 Thr Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser 565 570 575 Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu 580 585 590 Phe Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr 595 600 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gtcgaccacc atgcaaaatt acaccagaac gactgataat 40 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gtttaaacgt cgaccaatca actctctgaa cattgggcag gtatc 45 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ctcgagcacc atgcaaaatt acacaagatc aacagacaa 39 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ctcgagtagc agccggatca agcttatgta cattgctctg gtatc 45 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 caaggagacc gctgctgcta agttcgaacg ccagcacatg gattct 46 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 aattagaatc catgtgctgg cgttcgaact tagcagcagc ggtctccttg gtac 54 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 cgaacaaaag ctcatctcag aagaggatct g 31 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 aattcagatc ctcttctgag atgagctttt gttcggtac 39 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 tcgacccacc atggagacag acacactcct gcta 34 <210> 14 <211> 1662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HeV sG viral sequence <400> 14 atggaaaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctcctgt gggtccccgg cagcacaggc 60 gactacacca gaacgactga taatcaggca ctaatcaaag agtcactcca gagtgtacag 120 caacaaatca aagctttaac agacaaaatc gggacagaga taggccccaa agtctcacta 180 attgacacat ccagcaccat cacaattcct gctaacatag ggttactggg atccaagata 240 agtcagtcta ccagcagtat taatgagaat gttaacgata aatgcaaatt tactcttcct 300 cctttaaaga ttcatgagtg taatatctct tgtccgaatc ctttgccttt cagagaatac 360 cgaccaatct cacaaggggt gagtgatctt gtaggactgc cgaaccagat ctgtctacag 420 aagacaacat caacaatctt aaagcccagg ctgatatcct atactctacc aattaatacc 480 agagaagggg tttgcatcac tgacccactt ttggctgttg ataatggctt cttcgcctat 540 agccatcttg aaaagatcgg atcatgtact agaggaattg caaaacaaag gataataggg 600 gtgggtgagg tattggatag gggtgataag gtgccatcaa tgtttatgac caatgtttgg 660 acaccaccca atccaagcac catccatcat tgcagctcaa cttaccatga agatttttat 720 tacacattgt gcgcagtgtc ccatgtggga gatcctatcc ttaacagtac ttcctggaca 780 gagtcactgt ctctgattcg tcttgctgta agaccaaaaa gtgatagtgg agactacaat 840 cagaaataca tcgctataac taaagttgaa agagggaagt acgataaggt gatgccttac 900 ggtccatcag gtatcaagca aggggataca ttgtactttc cggccgtcgg ttttttgcca 960 aggaccgaat ttcaatataa tgactctaat tgtcccataa ttcattgcaa gtacagcaaa 1020 gcagaaaact gtaggctttc aatgggtgtc aactccaaaa gtcattatat tttgagatca 1080 ggactattga agtataatct atctcttgga ggagacatca tactccaatt tatcgagatt 1140 gctgacaata gattgaccat cggttctcct agtaagatat acaattccct aggtcaaccc 1200 gttttctacc aggcatcata ttcttgggat acgatgatta aattaggcga tgttgatacc 1260 gttgaccctc taagagtaca gtggagaaat aacagtgtga tttctagacc tggacagtca 1320 cagtgtcctc gatttaatgt ctgtcccgag gtatgctggg aagggacata taatgatgct 1380 tttctaatag accggctaaa ctgggttagt gctggtgttt atttaaacag taaccaaact 1440 gcagagaacc ctgtgtttgc cgtattcaag gataacgaga tcctttacca agttccactg 1500 gctgaagatg acacaaatgc acaaaaaacc atcacagatt gcttcttgct ggagaatgtc 1560 atatggtgta tatcactagt agaaatatac gatacaggag acagtgtgat aaggccaaaa 1620 ctatttgcag tcaagatacc tgcccaatgt tcagagagtt ga 1662 <210> 15 <211> 553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile 20 25 30 Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp 35 40 45 Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser 50 55 60 Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile 65 70 75 80 Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys 85 90 95 Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro 100 105 110 Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser 115 120 125 Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser 130 135 140 Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr 145 150 155 160 Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly 165 170 175 Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly 180 185 190 Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly 195 200 205 Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn 210 215 220 Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser 245 250 255 Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro 260 265 270 Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys 275 280 285 Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly 290 295 300 Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro 305 310 315 320 Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys 325 330 335 Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser 340 345 350 Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser 355 360 365 Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg 370 375 380 Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro 385 390 395 400 Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly 405 410 415 Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser 420 425 430 Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys 435 440 445 Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp 450 455 460 Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr 465 470 475 480 Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr 485 490 495 Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr 500 505 510 Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu 515 520 525 Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val 530 535 540 Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser 545 550 <210> 16 <211> 1662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mammalian - Codon optimized Hendra virus sG <400> 16 atggaaaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctcctgt gggtccccgg cagcacaggc 60 gactacaccc ggaccaccga caaccaggcc ctgatcaaag agtccctgca gagcgtccag 120 cagcagatca aggccctgac cgacaagatc ggcaccgaga tcggccccaa agtgtccctg 180 atcgacacca gcagcaccat caccatcccc gccaacatcg ggctgctggg ctccaagatc 240 agccagagca ccagctccat caacgagaac gtgaacgaca agtgcaagtt caccctgccc 300 cccctgaaga tccacgagtg caacatcagc tgccccaacc ccctgccctt ccgggagtac 360 cggcccatca gccagggcgt gagcgacctg gtgggcctgc ccaaccagat ctgcctgcag 420 aaaaccacct ccaccatcct gaagccccgg ctgatcagct acaccctgcc catcaacacc 480 cgggagggcg tgtgcatcac cgaccctctg ctggccgtgg acaacggctt cttcgcctac 540 agccacctgg aaaagatcgg cagctgcacc cggggcattg ccaagcagcg gatcatcggc 600 gtgggcgagg tgctggaccg gggcgacaag gtgcccagca tgttcatgac caacgtgtgg 660 acccccccca accccagcac aatccaccac tgcagcagca cctaccacga ggacttctac 720 tacaccctgt gcgccgtgag ccacgtgggc gaccccatcc tgaacagcac cagctggacc 780 gagagcctga gcctgatccg gctggccgtg cggcccaaga gcgacagcgg cgactacaac 840 cagaagtata tcgccatcac caaggtggag cggggcaagt acgacaaagt gatgccctac 900 ggccccagcg gcatcaagca gggcgacaca ctgtacttcc ccgccgtggg cttcctgccc 960 cggaccgagt tccagtacaa cgacagcaac tgccccatca tccactgcaa gtacagcaag 1020 gccgagaact gcagactgag catgggcgtg aacagcaaga gccactacat cctgcggagc 1080 ggcctgctga agtacaacct gtccctgggc ggcgacatca tcctgcagtt catcgagatc 1140 gccgacaacc ggctgaccat cggcagcccc agcaagatct acaacagcct gggccagccc 1200 gtgttctacc aggccagcta cagctgggac accatgatca agctggggga cgtggacacc 1260 gtggaccccc tgcgggtgca gtggcggaac aacagcgtga tcagcagacc cggccagagc 1320 cagtgccccc ggttcaacgt gtgccccgaa gtgtgctggg agggcaccta caacgacgcc 1380 tttctgatcg accggctgaa ctgggtgtcc gccggagtgt acctgaactc caaccagacc 1440 gccgagaacc ccgtgttcgc cgtgttcaag gacaacgaga tcctgtacca ggtgcccctg 1500 gccgaggacg acaccaacgc ccagaaaacc atcaccgact gctttctgct ggaaaacgtg 1560 atctggtgca tcagcctggt ggagatctac gacaccggcg actccgtgat ccggcccaag 1620 ctgtttgccg tgaagatccc cgcccagtgc agcgagagct ga 1662 <210> 17 <211> 553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile 20 25 30 Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp 35 40 45 Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser 50 55 60 Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile 65 70 75 80 Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys 85 90 95 Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro 100 105 110 Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser 115 120 125 Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser 130 135 140 Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr 145 150 155 160 Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly 165 170 175 Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly 180 185 190 Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly 195 200 205 Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn 210 215 220 Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser 245 250 255 Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro 260 265 270 Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys 275 280 285 Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly 290 295 300 Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro 305 310 315 320 Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys 325 330 335 Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser 340 345 350 Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser 355 360 365 Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg 370 375 380 Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro 385 390 395 400 Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly 405 410 415 Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser 420 425 430 Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys 435 440 445 Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp 450 455 460 Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr 465 470 475 480 Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr 485 490 495 Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr 500 505 510 Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu 515 520 525 Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val 530 535 540 Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser 545 550

Claims (30)

  1. 대상에 투여하여 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스에 대한 중화 항체를 생성하기 위한 유효량의 헨드라 바이러스 G 당단백질 및/또는 니파 바이러스 G 당단백질, 면역자극 복합체(immunostimulatory complex; ISC) 및 하나 이상의 첨가물을 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역자극 복합체는 사포닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 면역자극 복합체는 인지질 및 스테로이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 서열목록 제2서열의 야생 헨드라 바이러스 G 당단백질의 73번째 내지 604번째 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 서열목록 제16서열의 64 번째 내지 1662번째 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 이형체로 존재하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 이량체는 하나 이상의 이황화물 결합(disulfide bonds)에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 4량체로 존재하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 5 내지 100 /ml의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 사포닌은 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)로부터 분리한 사포닌인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 사포닌은 QH-A, QH-B, QH-C 또는 QS21인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 인지질은 PC(phosphatidyl choline), DPPC(dipalmitoyl phosphatidyl choline), PA(phosphatidic acid, phosphaidate), PE(phosphatidylethanolamine), PS(phosphatidylserine), PI(phosphatidylinositol), PIP(phosphatidylinositol phosphate), PIP2(phosphatidylinositol bisphosphate), PIP3(phosphatidyl triphosphate), SPH(phosphorylcholine), Cer-PE(ceramide phosphorylethanolamine) 및 세라마이드 포스포릴글리세롤로 구성된 군으로부터 선택되는 인지질인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  13. 제 3 항에 있어서, 상기 사포닌은 Quil A이고, 상기 인지질은 DPPC이며, 상기 스테로이드는 콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 Quil A, DPPC 및 콜레스테롤의 중량비는 5:1:1(Quil A:DPPC:콜레스테롤)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 인간, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 닭, 개 또는 고양이인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  16. 상기 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 중화 항체 반응을 생성하는데 유효한 양 및 기간으로 대상에 투여하는 단계를 포함하는 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스에 대한 중화 항체를 제조하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 중화 항체 반응은 대상 내 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 중화 항체 반응은 대상 내 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스의 쉐딩(shedding)을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 대상은 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스에 노출된 적이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 대상은 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스 감염상태인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 근육 내(intramuscularly) 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 16 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 복수 도즈로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 초기 도즈는 초기 도즈 후 최소 21일 내지 28일 후에 2차 도즈가 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 각 도즈는 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질을 50 또는 100 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 대상으로부터 분리된 생물학적 시료 내 융합 단백질(fusion protein), 매트릭스 단백질(matrix protein), 인단백질(phosphoprotein), 거대 단백질(large protein) 및 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스의 단백질에 대한 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 상기 면역원성 조성물이 접종된 대상을 구별하는 방법.
  26. 제 16 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 인간, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 닭, 개 또는 고양이인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 16 항 내지 제 25 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 헨드라 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 16 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 니파 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 중화 항체 반응을 나타내는데 유효한 양 및 기간의 헨드라 바이러스 가용성 G 당단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 인간 대상 내 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 제조 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 보조제(adjuvant)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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