JP6898024B2 - ヘンドラ及びニパウイルスg糖タンパク質免疫原性組成物 - Google Patents
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Description
[0020]本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、組成物を投与された対象において、いくつかの液性及び細胞性免疫のうちの少なくとも1つを誘導するか、あるいは、HeV及び/又はNiV株の少なくとも1つに対する少なくとも1つの免疫応答を増強するのに有効である。そのため、本発明のワクチン及び免疫原性組成物の投与は、HeV及び/又はNiVの少なくとも1種の株によるHeV及び/又はNiV感染に対するワクチン接種用途及び/又は予防に好適である。本発明の組成物は、必要とする対象に、HeV及び/又はNiV由来の可溶性G糖タンパク質を含むG糖タンパク質と、アジュバントとして作用する免疫刺激複合体(ISC)と、を送達する。いくつかの実施形態において、G糖タンパク質の量としては、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200又は250μg/mlが挙げられる。また、ISCの含有量としては、100、125、150、175、200、225、250、275又は300μg/mlが挙げられる。いくつかの実施形態において、G糖タンパク質の量は、5、50又は100μg/mlであり、ISCの量は250μg/mlである。
[0021]いくつかの実施形態において、ワクチン及び免疫原性組成物は、本明細書に記載の少なくとも1種のHeV及び/又はNiV G糖タンパク質を含む。本明細書において、タンパク質という語は、ポリペプチド又はその断片を包含するものとして広く使用される。例えば、HeV G糖タンパク質は可溶性形態であり得、Wang(2000)、J.Virol.、74、9972−9979(Yu(1998)、Virology、251、227−233も参照)におけるHeV G糖タンパク質のアミノ酸配列の73〜604位のアミノ酸を含み得る。また、例えば、NiV G糖タンパク質は可溶性形態であり得、Harcourt(2000)、Virology、271:334−349、2000(Chua(2000)、Science、288、1432−1も参照)におけるNiV G糖タンパク質のアミノ酸配列の71〜602位のアミノ酸を含み得る。
[0035]概して、本発明は、可溶性形態のHeV及び/又はNiV G糖タンパク質エンベロープタンパク質を免疫刺激複合体(ISC)と組み合わせて含む免疫原性組成物(ワクチン組成物を含む)、並びにこれらの組成物を用いて対象におけるHeV及び/又はNiV感染を予防及び治療するための方法を提供するものである。本発明において、ワクチン及び/又は免疫原性組成物はアジュバントとして作用する免疫刺激複合体を含む。本明細書において、「アジュバント」とは、それ自体は何ら特別な抗原的効果を有しないが、免疫系を刺激して抗原に対する反応を増強させ得る物質を指す。
例えば、Wee(2008)、Mucosal Immunol.、1、489−496に記載されているように、抗原の入手可能性が制限されている又は抗原が高額である状況において、ISCにより10〜100倍の抗原節約が可能となることが示されている。この特徴は、組み合わせによる効果の増強又は他のアジュバントと比較してより適切な作用機構に基づいている可能性が高い。
例えば、Schnurr(2009)、J.Immunol.、182、1253−1259で記載されているように、抗原提示細胞(APC)による抗原提示は、通常、2つの経路の1つに従う。外来抗原は、通常、APCによって貪食された後、主要組織適合抗原複合体(MHC)クラスII分子によってAPCの表面でプロセシングされ、再び発現する。その後、リンパ球で見られるようになり、正しい共刺激因子/シグナルが存在する場合には適切に応答する。自己及び癌抗原並びにウイルス抗原は、APCの細胞質に存在しているため、通常、クラスI分子においてプロセシングされ、発現する。癌及びウイルス抗原に対する免疫を有効にするためにはクラスI経路を利用する必要がある。このクラスI経路の利用は、ウイルス感染又は細胞ホメオスタシス(内部抗原の細胞代謝回転)において自然に起こる。ワクチンとして導入される抗原(ウイルス抗原又は自己抗原)は、細胞の外側から細胞の抗原プロセシング機構へ入り、クラスII経路からクラスI経路へ入る方法を見出すことが必要となる。これは、樹状細胞(DC、スペシャリストAPC)で自然に起こり得、あるいは、抗原とアジュバントであるISCとを混合してワクチン接種することによって達成され得る。外来性の抗原が、抗原を提示するクラスI経路に自身の経路を見出していくプロセスは、交差提示と称される。ISCが抗原の交差提示を達成するメカニズムは完全には明らかとなっていないが、ISC成分による膜摂動に依拠している可能性がある。
例えば、Maraskovsky(2009)、Immunol.Cell Biol.、87、371−376)に記載されているように、ISCの作用機構は獲得免疫系の液性及び細胞性応答の両方に関与する。いくつかの種では、この特徴は、このアジュバントを用いたワクチン接種により刺激されるサイトカインのプロファイルと並行する。1型免疫応答は、インターロイキン−2及びIFN−γの出現と細胞内毒素(細菌、原生動物及びウイルス)に対する防御によって特徴づけられ、2型免疫応答は、インターロイキン−4の出現並びに抗毒素及び抗病原体関連免疫に対する中和抗体の生成によって特徴づけられる。ISCは、これらの2つの経路の間でバランスのとれたサイトカインプロファイルをもたらし、より広範な免疫応答を可能にする。さらにいくつかの研究により、ワクチンを鼻腔内送達した場合にISCの効果が高くなり得ることが示されている。これにより粘膜表面の増感が可能になり、その結果、病原菌侵入部位での重要な免疫(本ケースでは特に重要な免疫)(粘膜免疫)がもたらされる(Sjolander(2001)、Vaccine、19、4072−4080も参照されたい。)
ISC粒子径は通常、直径40nmであり、後に製剤化される調製物の滅菌に使用するフィルターに通過させることが可能になる。さらに、Quil Aで見出されるようなトリテルペノイドサポニンがコレステロール及びリン脂質と関わろうとする本来的傾向がISCの作製方法の開発のために利用されてきた。ISC粒子を形成しないQuil A種は最終生成物から透析により除去される。構成成分の比率を調整することによって、不均一な連続体のQuil Aサポニンから均一な生成物が生じる。偏差によっては構造が40nm粒子を特徴としない構造(例えば、へリックス、シート)になるため、上記比率は重要である。ISCコロイドの自由流動性並びに透過電子顕微鏡法、HPLC及び他の技術での測定可能性により、このアジュバントは放出アッセイ及び他の精度のある測定法で展開させ易い。
[0049]本発明の免疫原性及びワクチン組成物は、さらに、薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び/又は安定化剤(例えば、Remington:The Science and practice of Pharmacy(2005)、Lippincott Williams)を凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で含み得る。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、特定の投与量及び濃度でレシピエントに非毒性のものである。例えば、緩衝剤(例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸);酸化防止剤(例えば、アスコルビン酸、及びメチオニン);保存剤(例えば、[(o−カルボキシフェニル)チオ]エチル水銀ナトリウム塩(チメロサール)、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、アルキルパラベン(例えば、メチル又はプロピルパラベン)、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3−ペンタノール、及びm−クレゾール);タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン);親水性ポリマー(例えばポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン);単糖類、二糖類、及び他の炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、又はデキストラン);キレート剤(例えばEDTA);糖類(例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール);塩形成対イオン(例えばナトリウム);金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又は非イオン界面活性剤(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、TWEEN、又はPLURONICS)が挙げられる。
[0051]本発明は、ヘンドラ及び/又はニパウイルス感染を予防及び/又は治療する方法であって、本発明の免疫原性及びワクチン組成物を任意の哺乳類対象に投与するステップを含む方法を包含する。HeV及び/又はNiV G糖タンパク質と本明細書に記載のアジュバントとをワクチン接種することにより誘発される活性な免疫により、細胞性又は液性免疫応答をプライム又はブーストすることができる。有効量のHeV及び/又はNiV G糖タンパク質又はその抗原性断片をアジュバントと混合して調製し、ワクチンを調製することができる。
[0065]本発明は、健康なワクチン接種動物と、HeV及び/又はNiVに曝露された又は感染している動物と、を識別する方法を包含する。ウイルス感染の間に、HeV及びNiVは、G糖タンパク質(G)以外のさらなるタンパク質、例えば、融合タンパク質(F)、マトリックスタンパク質(M)、リンタンパク質(P)、巨大タンパク質(L)及びヌクレオカプシドタンパク質(N)を発現する。これらのさらなるタンパク質は、これらのタンパク質に結合する抗体又はT細胞免疫の形態で動物において免疫反応を誘発する可能性がある。これらの他のタンパク質に対する抗体反応のレベルは、通常、酵素結合免疫アッセイ(EIA)等のアッセイ法により測定し得る。本発明の免疫原性及びワクチン製剤は、いくつかの実施形態において、HeV及び/又はNiV抗原としてG糖タンパク質のみを含有し、したがって、HeV及び/又はNiVのG糖タンパク質のみに対する抗体により免疫反応を誘発する。本明細書に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物がその後HeV又はNiVに感染した場合、G糖タンパク質に対する追加免疫応答が起こるが、G糖タンパク質以外のいくつかのHeV及びNiVタンパク質に対する抗体の存在にも変化が示されるであろう。したがって、融合タンパク質(F)、マトリックスタンパク質(M)、リンタンパク質(P)、巨大タンパク質(L)及びヌクレオカプシドタンパク質(N)のいずれかに対する抗体の存在は、EIAにより血清試料中のこれらのタンパク質に特異的な抗体の存在又は不在を決定して測定することができる。これらの他のタンパク質(すなわち、G糖タンパク質以外のタンパク質)のいずれかに対する抗体が検出される場合、該動物はHeV及び/又はNiVに曝露された動物である。あるいは、これらの他のタンパク質に対する抗体が検出されず、Gタンパク質に結合する抗体のみが検出される場合には、該動物はワクチン接種を受けたにすぎない動物である。
[0069]ベクターは、膜貫通/細胞質テール欠失HeV G又はNiV Gを発現するように構築した。完全長HeV又はNiV Gタンパク質のクローンcDNAをPCRにより増幅して、膜貫通ドメイン/細胞質テール欠失HeV又はNiV Gタンパク質をコードする約2600のヌクレオチド断片を生成させた。
sHGS: 5’−GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT−3’(配列番号5)
sHGAS: 5’−GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTGGGCAGGTATC−3’(配列番号6)
sNGS: 5’−CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA−3’(配列番号7)
sNGAS: 5’−CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATTGCTCTGGTATC−3’(配列番号8)
SPEPS: 5’−CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATTCT−3’(配列番号9)
SPEPAS: 5’AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTTAGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC−3’(配列番号10)
MTS: 5’−CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG−3’(配列番号11)
MTAS: 5’−AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC−3’(配列番号12)
[0077]タンパク質産生のために、コドン最適化配列を含有する遺伝子構築物を使用して、組換えpoxウイルスベクターを生成した(ワクシニアウイルス、WR株)。次いで、tk選択及びGUS染色を利用した標準的な技術を用いて組換えpoxウイルスを得た。簡単に言うと、CV−1細胞に、カルシウムリン酸トランスフェクションキット(Promega)を用いて、pMCO2 sHeV G融合体又はpMCO2 sNiV G融合体のいずれかを遺伝子導入した。次いで、これらの単層にワクシニアウイルスのWestern Reserve(WR)野生株を多重感染度(MOI)0.05PFU/細胞で感染させた。2日後、細胞ペレットを未精製の組換えウイルスのストックとして回収した。TK細胞に、25μg/mlの5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)(Calbiochem)の存在下、未精製の組換え体ストックを感染させた。2時間後、ウイルスを、1%低融点(LMP)アガロース(Life Technologies)及び25μg/mlのBrdUを含有するEMEM−10オーバーレイを用いて置き換えた。インキュベーションの2日後、1%のLMPアガロース、25μg/mlのBrdU、及び0.2mg/mlの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロン酸(X−GLUC)(Clontech)を含有するEMEM−10オーバーレイを追加的に加えた。24〜48時間後、青色のプラークを確認し、これを採集し、二重選択プラーク精製にさらに2回かけた。次いで、組換えワクシニアウイルスvKB16(sHeV G融合体)及びvKB22(sNiV G融合体)の増幅を行い、標準的方法で精製した。簡単に言うと、組換えワクシニアウイルスを、プラーク精製、細胞培養増殖、超遠心分離でのショ糖クッションペレット化、及びプラークアッセイによる滴定によって精製する。sHeV Gの発現を細胞溶解物及び培養上清で確認した。
[0078]コドン最適化配列を含有する遺伝子構築物を使用して、293F細胞(Invitrogen)を形質転換し、HeV可溶性G糖タンパク質を発現する安定な細胞株を作製した。CHO−S細胞(Invitrogen)を使用して、形質転換及びHeV可溶性G糖タンパク質の発現を行ってもよい。形質転換された細胞を、162cm2組織培養フラスコに、35mlのDMEM−10と共に、播種する。細胞を接着させ、37℃、5〜8%CO2下で数日間増殖させた。細胞がコンフルエントになったとき、150μg/mlのHygromycin Bを含むDMEM−10を入れた複数のフラスコ(フラスコ当たり30ml)に分割した。細胞が70〜80%コンフルエントになったとき、30mlのPBSで2回洗浄し、次いで、20mlの293 SFM II(Invitrogen)を加え、細胞を37℃、5〜8%CO2下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、200mlのSFM II培地を入れた三角フラスコに移した。細胞を37℃、5〜8%CO2下、125rpmで5〜6日間、細胞が死滅し始めるまで増殖させた。その際、上清を回収する。
[0083]ISCの調製の概略を図3に示し、以下でさらに説明する。
90g/Lのデカノイル−n−メチルグルカミド(Mega10洗剤)溶液を、注射用水(WFI)で調製する。溶液を加熱して、Mega10を確実にすべて溶解させた後、すぐにステップ2で使用するか、又は滅菌濾過する。
25g/Lのコレステロール及び25g/Lのジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)を含む溶液を、これらの成分をMega10洗剤の保存溶液に溶解することによって調製する。溶液を加熱して、すべての成分を確実に溶解させた後、すぐにステップ3で使用するか、又は滅菌濾過する。
等張緩衝生理食塩水(10mMのリン酸緩衝液、pH6.2±1)(BIS)をWFIで調製し、すぐに使用しない場合には滅菌濾過する。
Quil AをBIS中で最終濃度100g/Lに調製し、すぐに使用しない場合には滅菌濾過する。
ISCを、撹拌された温度調節容器(22〜37℃)に、予熱したBIS、コレステロール/DPPCのMega10溶液(160ml/L)、及びQuil A溶液(200ml/L)を順次追加することによって製剤化する。反応物にBISを加えることによって目的の体積とする。
製剤全体を、必要とされる温度(目標温度:27℃;許容可能な操作温度範囲:22〜37℃)に平衡化し、次いで撹拌しながら15分間インキュベートして、ISC製剤の反応性を高める。ISC溶液をステップ7でさらに処理するか、又は中間貯蔵のために滅菌濾過する。
複合体化していない成分を除去するために、ISC反応混合物を、温度制御(目標温度:27℃;許容可能な操作温度範囲:21〜37℃)下で透析(膜:ハイドロザルト(Hydrosart)30kDa(Sartorius AG Goettingen))により洗浄して、BISに対し少なくとも20回の体積交換を行う。
透析されたISCを、透析に使用した膜と同じ膜を使用する限外濾過によっておよそ2倍に濃縮する。濾過系をBISで濯いでISCを元の体積に戻す。
ISCを、0.22μmの酢酸セルロースフィルターに通す滅菌濾過を行って滅菌保存容器に移す。
ISCアジュバントを、ワクチン製剤で使用するために放出するまで2〜8℃で保存する。
[0095]試験ワクチン1:
250μgの免疫刺激複合体でアジュバントされた100μg/用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質(sG)。体積を生理食塩水で1ml/用量に調整。
250μgの免疫刺激複合体でアジュバントされた50μg/用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質(sG)。体積を生理食塩水で1ml/用量に調整。
250μgの免疫刺激複合体でアジュバントされた5μg/用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質(sG)。体積を生理食塩水で1ml/用量に調整。
2頭のウマを各々、21日間の間隔を空けて2回のワクチン投与(100μgのsGとISCを併用)により免疫化した。プライミング後及びチャレンジ前の血清学的検査により、HeVに対するワクチン誘導の血清転換が確認された(表1)。チャレンジ前のウイルス中和抗体レベルは、致死量の近縁のニパウイルスに曝露されたネコで防御効果があることが見出された抗体レベルに匹敵するものであった。アジュバントのみを適用されたウマ(ネガティブコントロール)では、ウイルスチャレンジ前にHeVに対する抗体は生じなかった。
このウマは、HeVの曝露後の観察期間を通じて臨床的に良好な状態を維持していた。但し、チャレンジ後8日目に、頸静脈カテーテルの入口で局所的な感染が示された。これは、何ら疾患を構成することを示すものではなかった。ウイルスチャレンジ後9日目に、ウマを選択的に安楽死させた。総体的な死後の検査での異常は、10cmの腸間膜脂肪腫(偶発的所見)と、バルビツール酸系薬剤に起因する左肺心葉の腹面の先端におけるリンパ管の軽度の拡張に限定されていた。組織の初回スクリーニングにおいて、このウマに、病変又はHeV抗原の痕跡となるものは見当たらなかった。
このウマは、3日目に一時的な軽度の鼻汁があった後、良好な状態を維持していたが、6日目に頸静脈カテーテル部位の局所的な炎症反応を伴って体温が上昇した。カテーテルを除去したが、病変は拡大し続け、ウマはかなりの興奮状態になったため、翌日(7日目)に、その雌ウマを長時間作用型ペニシリンで処置した。8日目に、体温も気質も通常に戻り、そしてその雌ウマを選択的に安楽死させた。総体的な死後の検査での異常は、バルビツール酸系薬剤に起因する右肺心葉の腹面先端におけるリンパ管の軽度の拡張に限定された。組織の初回スクリーニングにおいて、このウマに病変又はHeV抗原の痕跡となるものは見当たらなかった。詳細な検査は現在、完了しつつある。
このウマは、4日目に、一時的な軽度の鼻汁があった後、良好な状態を維持していたが、6日目に局所的な徴候を有しない体温の上昇が現れた。この雌ウマは心拍数も高くなり、また皮膚にわずかなテンティングがあり、これは軽度の脱水症状及び縫上げたような(tucked−up)外観に通じるものであった。これらの一群の徴候は、本発明者らの実験条件下での急性HeV感染に典型的な徴候であった。雌ウマの体温及び心拍数は、その後も12時間にわたって増加し続け(図1及び2)、雌ウマは軽い抑鬱となり、7日目に人道的基準に基づいて雌ウマを安楽死させた。死後の検査で、肺の心葉におけるリンパ管の中等度の拡大と、胸膜肥厚及び浮腫が付随する8〜10cm腹部の関与があった。
臨床観察期間を通じて、免疫化したウマV1及びV2から回収した生物学的試料のいずれからもHeVの排出の痕跡は見当たらなかった。具体的には、曝露後のすべての日において、鼻奥の鼻腔スワブ又は血液のいずれからもゲノムは回収されなかった。
TaqMan PCR(HeV N遺伝子)により、V3(コントロール)において、チャレンジウイルスの複製物が複数の組織に伝播して感染していることが確認された(表3)。最高レベルの複製は、先に報告されているように、肺、脾臓、腎臓、心筋、並びに上部及び下部気道に関わるリンパ組織に現れるようであった。免疫化したウマ(V1及びV2)の組織では、ウイルス複製の痕跡は見られなかった。
免疫化したウマV1及びV2では、HeVチャレンジ後、力価の上昇が見られなかった(表4)。このことは、これらの動物でチャレンジウイルスの顕著な複製がなかったことと一致する。チャレンジ後7日目の安楽死の時点で、コントロールウマV3に抗体は検出されなかった。これは、検出可能な抗体の生成に十分な時間がウイルス曝露と動物の死との間に存在しなかったと考えられ、RedlandsのウマのHeVについて本発明者らの実験室で得られた先の所見と一致する。
[00113]3頭のウマを、それぞれ、21日間の間隔を空けて2回のワクチン投与(50μgのsGとISCを併用)により免疫化した。プライミング後及びチャレンジ前の血清学的検査により、HeVに対するワクチン誘導血清転換が確認された(表5)。チャレンジ前のウイルス中和抗体レベルは、致死量の近縁ニパウイルスに曝露されたネコで防御効果があると見出されたレベルに匹敵するものであり、また、本明細書に記載の第1臨床試験でHeVに曝露されたウマでのレベルに匹敵するものであった。アジュバントのみを適用されたウマでは、免疫化したウマのウイルスチャレンジ前に、HeVに対する抗体は生じなかった(データは示していない)。
このウマは、HeVへの曝露後の観察期間において臨床的に良好な状態を維持しており、体温及び心拍数も正常な範囲に留まっていた。このウマを、ウイルスチャレンジ後8日目に選択的に安楽死させた。死後の検査において全体的に異常は見られなかった。組織の初回スクリーニングにおいて、病変又はHeV抗原の痕跡となるものはこのウマでは見当たらなかった。詳細な検査は現在、完了しつつある。
このウマは、HeVへの曝露後の観察期間において臨床的に良好な状態を維持しており、体温及び心拍数も正常な範囲内に留まっていた(図2)。このウマを、ウイルスチャレンジ後7日目に選択的に安楽死させた。死後の検査において全体的に異常は見られなかった。組織の初回スクリーニングにおいて、病変又はHeV抗原の痕跡となるものはこのウマでは見当たらなかった。詳細な検査は現在、完了しつつある。
このウマは、HeVへの曝露後の観察期間において、臨床的に良好な状態を維持しており、体温及び心拍数も正常な範囲内に留まっていた(図2)。このウマを、ウイルスチャレンジ後9日目に選択的に安楽死させた。死後の検査において全体的に異常は見られなかった。組織の初回スクリーニングにおいて、病変又はHeV抗原の痕跡となるものはこのウマでは見当たらなかった。詳細な検査は現在、完了しつつある。
4匹のモルモットのうち1匹(番号3)は、HeVチャレンジ後3日目に体重が減少し始めた。体重の減少は、神経学的徴候(頭部後屈、振戦)が現れた5日目まで続き、その後、モルモットを安楽死させた。死後の検査での異常は後腹膜結合組織での浮腫に限定された。
免疫化したウマV4、V5及びV6では、HeVチャレンジ後、力価の上昇が見られなかった(表8)。このことは、これらの動物でチャレンジウイルスの顕著な複製がないことと一致する。
[00127]統計:バイオセーフティレベル4(BSL−4)の動物試験、特に非ヒト霊長類の試験の実施では、動物対象の数、得られ得る生物学的試料の体積、分析の独立した再試可能性が著しく制限され、従って、統計学的分析も限定される。結果として、データは、複製アッセイではなく複製試料から計算した平均値又は中央値で表され、エラーバーは複数の複製物にわたる標準偏差を表す。
NiV−マレーシア(GenBank受託番号:AF212302)は、米国疾病管理予防センターの特殊病原菌部門(Special Pathogens Branch of the Centers for Disease Control and Prevention)(ジョージア州、アトランタ)から入手した。NiVを、Rockxら、(2010)、J.Virol.、84、9831でHeVに対して記載されているように、ベロ細胞で増殖させ、力価を測定した。
3種のsGHeVワクチン製剤を用いた(10μg、50μg、又は100μg)。sGHeVの生産及び精製は、従前に、Pallister (2011)、Vaccine、29、5623に記載されているように行った。各ワクチン製剤には、アルハイドロゲル(商標)(Accurate Chemical&Scientific Corporation)と、完全なホスホロチオエート骨格を有するCpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)2006(Invivogen)も含有させた。一定量のODN2006と、異なる量のsGHeV及びアルミニウムイオン(重量比1:25)を含むワクチン用量を次のように処方した。100μg用量:sGHeV 100μg,アルミニウムイオン 2.5mg,及びODN2006 150μg;50μg用量:sGHeV 50μg,アルミニウムイオン 1.25mg,及びODN2006 150μg;10μg用量:sGHeV 5μg,アルミニウムイオン 250μg,及びODN2006 150μg。すべての用量において、アルハイドロゲル(商標)とsGHeVとを、ODN2006を添加する前に最初に混合した。各ワクチン用量を、PBSで1mlに調節し、混合物を室温で少なくとも2〜3時間、回転輪上でインキュベートした後で注射した。各対象は同じ1ml用量でプライミング及びブースティングを受け、すべてのワクチン用量は筋肉内注射により投与された。
体重が4〜6kgの若齢成体アフリカミドリザル(AGM)(クロロセブス・アエチオプス(Chlorocebus aethiops))(Three Springs Scientific Inc.)10匹を別個に檻に入れた。対象にケタミン(10〜15mg/kg)の筋肉内注射で麻酔をかけ、sGHeVのワクチン接種を−42日目(プライム)及び−21日目(ブースト)に行った。3匹の対象は10μg用量を2回(AGM16、AGM17、AGM18)、3匹の対象は50μgの用量を2回(AGM13、AGM14、AGM15)、3匹の動物は100μgの用量を2回(AGM10、AGM11、AGM12)、1匹の対象(AGM9)はアジュバントのみを投与した。0日目に、対象に麻酔をかけ、1×105TCID50(組織培養感染量中央値)のNiVを含有する4mlのダルベッコ最小必須培地(DMEM)(Sigma−Aldrich)を気管内接種した。対象に臨床検査のために麻酔をかけた。臨床検査には、体温、呼吸数、胸部X線写真、採血、鼻腔、口腔及び直腸粘膜のスワブが含まれ、感染後(p.i.)0、3、5、7、10、14、21及び28日目に行った。コントロール対象(AGM9)は、感染後10日目に、承認された人道的エンドポイントに従って安楽死させなければならなかった。他のすべての対象は、試験終了まで生存し、感染後28日目に安楽死させた。剖検に際し、様々な組織を、ウイルス学的及び組織病理学的な目的で回収した。組織試料には、結膜、扁桃、中/鼻咽頭、鼻腔粘膜、気管、右気管支、左気管支、右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉、左肺上葉、左肺中葉、左肺下葉、気管支リンパ節(LN)、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、副腎、膵臓、空腸、横行結腸、脳(前頭葉)、脳(小脳)、脳幹、頸部脊髄、脳下垂体、下顎骨LN、唾液LN、鼠径部LN、腋下LN、腸間膜LN、膀胱、精巣又は卵巣、大腿骨骨髄が挙げられる。ワクチン接種はBSL−2封じ込め条件で行った。接種スケジュール、チャレンジ及び生物学的試料回収日のタイムラインを図4に示す。
先に、本発明者らは、105TCID50(組織培養感染量中央値)のNiVでAGMを気管内接種すると、一様に死に至ることを実証した(Rockxら、(2010)、J.Virol.、84、9831)。急速に進行する臨床的疾患がこれらの研究で示された。臨床的徴候としては、重度抑鬱、急性呼吸窮迫を導く呼吸器疾患、重症の神経疾患、及び機動性の著しい低下が挙げられ、安楽死に対して承認された人道的エンドポイントの基準に至るまでの時間は、7〜12日であった。ここで、本発明者らは、sGHeVを用いたワクチン接種により、AGMにおけるNiV感染及び疾患が予防できるかを判定することを試みた。上記方法で記載されるように、10、50又は100μgの用量のsGHeVを、ミョウバン及びCpG部分と混合した。各ワクチン製剤を3匹の対象に0日目(プライム)及び再度21日目(ブースト)に皮下投与し、1匹のコントロール対象(AGM9)には、アジュバントのみで上記と同じ日程でプライミング及びブースティングを行った。42日目に、すべての対象に、105TCID50のNiVを気管内接種した。コントロール対象(AGM9)は、食欲の喪失、重症の持続性行動の変化(抑鬱、活動性の低下、丸まった姿勢)、血小板数の減少、及び末期疾患での呼吸数の段階的増加を示した。続いて、AGM9は、急性呼吸窮迫を発症し、感染後10日目に、承認された人道的エンドポイントに従って安楽死させなければならなかった。対照的に、ワクチン接種対象のいずれも臨床的な疾患を有さず、すべてのワクチン接種対象が試験終了まで生存した。カプラン−マイヤー生存曲線を図5に示す。
コントロール対象の総体的な病理学的変化は、以前、NiV感染AGMで見られたものと一致していた(Geisbertら、(2010)、PLoS One 5、e10690)。脳の表面に巨脾及び血管の鬱血が現れ、肺の全葉が湿り、重かった。NiV RNA及び感染ウイルスはAGM9血液試料からは回収されず、ウイルス血症の痕跡もなかった。AGM9では、NiV特異的IgM並びに検出可能なNiV特異的IgG及びIgAのレベルが顕著であった。組織試料のさらなる分析により、従前にAGMで見られた広範なNiV感染と類似する過度のNiV組織屈性が明示された(Geisbertら、(2010)、PLoS One 5、e10690)。AGM9は組織の大半にNiV RNAを有しており、多数の組織から感染性ウイルスが回収された。顕著な病変としては、間質性肺炎、亜急性脳炎及び壊死及び白脾髄の出血があった。肺胞空間には、浮腫液、フィブリン、核崩壊及び細胞性破片、及び肺胞マクロファージが充満していた。多病巣性脳炎は、ウイルヒョウ・ロバン腔の拡大、適度な数のリンパ球、及び少ない好中球によって特徴づけられた。少数のこれらの炎症細胞が、隣接する柔組織内に延びていた。複数のニューロンが膨張し、空胞化し(変性)、又は核崩壊(壊死)により細片化していた。白脾髄の小胞の多病巣性胚中心は、出血及びフィブリン、並びに少数の好中球及び細胞性及び核崩壊性破片により失われていた。これらの所見は、脾臓での壊死及び胚中心の喪失と一致していた。過剰量のウイルス抗原が脳幹に存在しており、NiVが中枢神経系に著しい損傷を引き起こしていることを強調していた。
すべての生物学的試料(チャレンジ後に回収した全血液試料及び剖検の際に回収したすべての組織を含む。)がNiV RNA陰性であり、いずれの試料からも感染性ウイルスは単離されなかった。ワクチン接種対象に由来する組織切片をより詳細に試験した結果、組織構築は正常のようであり、NiV抗原はいずれの組織からも免疫組織化学的技術手段で検出されなかった。ワクチンが誘発する防御メカニズムをさらに分析するために、血清及び粘膜sGNiV−及びsGHeV−特異的IgM、IgG及びIgA、並びにNiV及びHeV血清中和力価をワクチン接種動物で測定した。図6に示されるように、チャレンジ前の7日間、最低用量のsGHeVを投与した対象は、検出可能な抗原特異的血清IgMと最高レベルのsGHeV特異的血清IgGを示した。50μgのsGHeVを投与した対象も、チャレンジ前の7日間に、検出可能レベルの血清IgMと最高レベルの血清IgGを示した。高用量の対象は検出可能な血清IgMを有さず、血清IgGレベルは、−7日目において他の2つのグループに対して著しく低かった。NiVチャレンジの日までに、高用量対象の血清IgGレベルが増加し、すべてのワクチン接種対象が同様のIgGレベルを有していた。血清IgMレベルは、NiVチャレンジ後、いずれの対象においても変化しなかった。血清IgGレベルはNiVチャレンジの日に中用量対象で減少し、IgGレベルはNiVチャレンジ後すぐに低用量対象で減少した。興味深いことに、IgGレベルは、これらのグループのいずれにおいても感染後3日目及び5日目までに増加したが、チャレンジ前の7日間に提示されたIgGレベルを超えることはなく、両方のグループの力価が感染後28日までに顕著に減少した。
[00135]ヘンドラウイルスを用いたワクチン接種及びチャレンジを評価するために、第2の臨床試験をAGMで行った。実施例7と同じ製剤をワクチンとして利用したが、sGHeVと、アジュバントとしてアルハイドロゲル(商標)のみ(ODN2006は含めなかった)と、を投与した別のグループとも比較した。動物に、−21日目にワクチン接種を行い、0日目にブースティングを行い、21日目にチャレンジを行った。特に断わらない限り、すべての条件は実施例7と同じとした。実験概要を下記に示す。
両方のグループ(A及びB)のすべての動物(n=4)が、105TCID50ヘンドラウイルスを気管内に接種後、ヘンドラウイルスチャレンジを生き延びた。コントロール対象は8日目に死亡した。ワクチン接種対象のいずれにおいても臨床的疾患は観察されず、健康で良好な状態が試験の終了時点まで維持された。
本発明の実施形態は例えば下記実施形態1〜33を含む。
実施形態1:
ヘンドラ及び/又はニパウイルスG糖タンパク質と免疫刺激複合体(ISC)と少なくとも1種の賦形剤とを、ヘンドラ及び/又はニパウイルスに感受性のある対象への投与後に該ヘンドラ及び/又はニパウイルスに対する免疫防御を誘発するのに有効な量で含むワクチンであって、
(a)ヘンドラ及び/又はニパウイルスG糖タンパク質は1用量当たり5〜100μgの量で存在し、
(b)ISCはサポニン及びステロイドを含む、
ワクチン。
実施形態2:
サポニンはQuil Aである、実施形態1に記載のワクチン。
実施形態3:
ISCはリン脂質をさらに含む、実施形態1に記載のワクチン。
実施形態4:
可溶性ヘンドラウイルスG糖タンパク質は、天然のヘンドラG糖タンパク質(配列番号2)の73〜604位のアミノ酸からなる、実施形態1に記載のワクチン。
実施形態5:
可溶性ヘンドラウイルスG糖タンパク質は、配列番号16の64〜1662位のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によってコードされている、実施形態4に記載のワクチン。
実施形態6:
可溶性ヘンドラウイルスG糖タンパク質は二量体形態で存在している、実施形態1に記載のワクチン。
実施形態7:
可溶性ヘンドラウイルスG糖タンパク質二量体の各サブユニットは少なくとも1つのジスルフィド結合によって連結されている、実施形態6に記載のワクチン。
実施形態8:
可溶性ヘンドラウイルスG糖タンパク質は四量体形態で存在している、実施形態1に記載のワクチン。
実施形態9:
可溶性ヘンドラウイルスG糖タンパク質の量は約50〜約100μgであり、前記対象はウマである、実施形態1に記載のワクチン。
実施形態10:
サポニンは、キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)から単離されたものである、実施形態1に記載のワクチン。
実施形態11:
サポニンは、QH−A、QH−B、QH−C、又はQS21である、実施形態10に記載のワクチン。
実施形態12:
リン脂質は、ホスファチジルコリン(PC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ホスファチジン酸(ホスファチデート)(PA)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルイノシトールリン酸(PIP)、ホスファチジルイノシトール二リン酸(PIP2)、ホスファチジルイノシトール三リン酸(PIP3)、ホスホリルコリン(SPH)、セラミドホスホリルエタノールアミン(Cer−PE)、及びセラミドホスホリルグリセロールからなる群から選択される、実施形態3に記載のワクチン。
実施形態13:
サポニンはQuil Aであり、リン脂質はDPPCであり、ステロイドはコレステロールである、実施形態3に記載のワクチン。
実施形態14:
組成物におけるQuil A:DPPC:コレステロールの重量比は5:1:1である、実施形態13に記載のワクチン。
実施形態15:
前記対象は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、又はネコである、実施形態1〜8及び10〜14のいずれかに記載のワクチン。
実施形態16:
前記対象における前記ヘンドラ及び/又はニパウイルスに対する中和抗体応答を生成することができる、実施形態1〜15のいずれかに記載のワクチン。
実施形態17:
中和抗体応答は前記対象におけるヘンドラ及び/又はニパウイルスの複製を減少させる、実施形態16に記載のワクチン。
実施形態18:
中和抗体応答は前記対象におけるヘンドラ及び/又はニパウイルスの排出を減少させる、実施形態16に記載のワクチン。
実施形態19:
前記対象は、ヘンドラ及び/又はニパウイルスに曝露された対象である、実施形態16に記載のワクチン。
実施形態20:
前記対象は、ヘンドラ及び/又はニパウイルス感染に罹患している対象である、実施形態19に記載のワクチン。
実施形態21:
筋肉内投与された場合に中和抗体応答を生成することができる、実施形態16に記載のワクチン。
実施形態22:
複数回投与で投与された場合に中和抗体応答を生成することができる、実施形態16に記載のワクチン。
実施形態23:
第2回目の投与が第1回目の投与から少なくとも約21〜約28日後に行われる、実施形態22に記載のワクチン。
実施形態24:
各用量は約50又は約100μgの可溶性ヘンドラウイルスG糖タンパク質を含む、実施形態22に記載のワクチン。
実施形態25:
前記対象はウマであり、各用量は約50又は約100μgの可溶性ヘンドラウイルスG糖タンパク質を含み、ISCはQuil A、DPPC、及びコレステロールを含む、実施形態16〜24のいずれかに記載のワクチン。
実施形態26:
前記ウイルスはヘンドラウイルスである、実施形態16〜25のいずれかに記載のワクチン。
実施形態27:
前記ウイルスはニパウイルスである、実施形態16〜25のいずれかに記載のワクチン。
実施形態28:
実施形態1〜27のいずれかに記載のワクチンをワクチン接種された対象から単離された生物学的試料と、ヘンドラ及び/又はニパウイルスに曝露された対象から単離された生物学的試料と、を識別する方法であって、生物学的試料において、融合タンパク質(F)、マトリックスタンパク質(M)、リンタンパク質(P)、巨大タンパク質(L)、及びヌクレオカプシドタンパク質(N)からなる群から選択されるHeV及び/又はNiVウイルスタンパク質の少なくとも1つに対する抗体の存在を検出するステップを含む方法。
実施形態29:
前記対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、又はネコである、実施形態28に記載の方法。
実施形態30:
前記ウイルスはヘンドラウイルスである、実施形態28に記載の方法。
実施形態31:
前記ウイルスはニパウイルスである、実施形態28に記載の方法。
実施形態32:
ヘンドラウイルス感染に対してウマにワクチン接種するための方法であって、実施形態9に記載のワクチンを前記ウマに2回投与することを含む方法。
実施形態33:
第2回目の投与が第1回目の投与から少なくとも約21〜約28日後に行われる、実施形態32に記載の方法。
Claims (12)
- ウマ又はブタにおいてヘンドラ及び/又はニパウイルスにより引き起こされる感染を予防するためのワクチンであって、
(a)ヘンドラG糖タンパク質の可溶性断片、
(b)サポニン、リン脂質及びコレステロールを含む免疫刺激複合体(ISC)、及び
(c)少なくとも1種の賦形剤
を含み、
前記可溶性断片は、配列番号2の73〜604位のアミノ酸又はそれと少なくとも95%同一である配列からなり、
リン脂質は、ホスファチジルコリン(PC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ホスファチジン酸(ホスファチデート)(PA)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルイノシトールリン酸(PIP)、ホスファチジルイノシトール二リン酸(PIP2)、ホスファチジルイノシトール三リン酸(PIP3)、ホスホリルコリン(SPH)、セラミドホスホリルエタノールアミン(Cer−PE)、及びセラミドホスホリルグリセロールからなる群から選択され、
該ワクチンは前記ウマ又はブタに2回投与されるように用いられ、
各回投与の用量は50〜100μgの前記可溶性断片を含む、
ワクチン。 - 各回投与の用量は100μgの前記可溶性断片を含む、請求項1に記載のワクチン。
- ヘンドラG糖タンパク質の可溶性断片は、配列番号16の64〜1662位のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によってコードされている、請求項1又は2に記載のワクチン。
- ヘンドラG糖タンパク質の可溶性断片は二量体形態で存在している、請求項1〜3のいずれか一項に記載のワクチン。
- ヘンドラG糖タンパク質の可溶性断片は四量体形態で存在している、請求項1〜3のいずれか一項に記載のワクチン。
- 各回投与の用量は250μgのISCを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン。
- サポニンはQuil Aであり、リン脂質はDPPCである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のワクチン。
- 組成物におけるQuil A:DPPC:コレステロールの重量比は5:1:1である、請求項7に記載のワクチン。
- 第2回目の投与が第1回目の投与から約21〜約28日後に行われる、請求項1〜8のいずれか一項に記載のワクチン。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のワクチンをワクチン接種された対象と、ヘンドラ及び/又はニパウイルスに曝露された対象と、を識別する方法であって、
対象から単離された生物学的試料において、融合タンパク質(F)、マトリックスタンパク質(M)、リンタンパク質(P)、巨大タンパク質(L)、及びヌクレオカプシドタンパク質(N)からなる群から選択されるHeV及び/又はNiVウイルスタンパク質の少なくとも1つに対する抗体の存在を検出するステップを含み、
前記対象はウマ又はブタである、
方法。 - 前記ウイルスはヘンドラウイルスであり、前記対象はウマである、請求項10に記載の方法。
- 前記ウイルスはニパウイルスであり、前記対象はブタである、請求項10に記載の方法。
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