KR20180037792A

KR20180037792A - 구제역 바이러스 백신 조성물

Info

Publication number: KR20180037792A
Application number: KR1020160128413A
Authority: KR
Inventors: 탁동섭; 이향심; 고영준; 박선영; 김충수; 이명현; 우샤라니
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2016-10-05
Filing date: 2016-10-05
Publication date: 2018-04-13
Also published as: KR101919314B1

Abstract

본 발명은 양 유래 인터페론 타우-4 단백질, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물 및 구제역 바이러스 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 구제역 바이러스 7개 혈청형에 대한 우수한 항 바이러스 효과가 있고, 구제역 바이러스 감염 전 또는 후에도 방어능이 뛰어나 구제역 바이러스 백신 조성물으로서 이용 가능하다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 생체 물질인 인터페론 타우-4 단백질을 유효 성분으로 이용 하는 것으로, 특정 구제역 바이러스 종(strain)의 유전자를 포함하지 않아, 광범위한 구제역 바이러스 균주에 적용 가능하며, 안전성이 높아 다양한 우제류 가축에 적용 가능한 장점이 있다. 또한, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 인터페론 알파 또는 감마와는 달리 고농도에서도 독성이 없으므로, 구제역 바이러스 백신으로서 효과적으로 활용 가능하다.

Description

구제역 바이러스 백신 조성물{A vaccine composition for Foot-and-Mouth Disease virus}

본 발명은 양 유래 인터페론 타우-4 단백질, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물 및 구제역 바이러스 백신 조성물에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-mouth disease, FMD)은 우제류에 감염되는 가축 전염병이다. 구제역에 감염되면 발열, 발과 입의 물집, 물집으로 인한 파행 증상이 나타나며, 입, 혀, 코, 발 및 유두에 수포성 병변이 발생한다. 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)는 숙주의 인두에서 12시간 내에 복제되어 48시간 내에 폐에 도달하고 이어서 혈류로 진입함으로써 입과 발에 병변을 유발하며, 직접 접촉, 오염된 축산물을 통하여 전파된다. 경우에 따라서는 공기전파도 가능한데 일반적으로 농장에 바이러스가 유입된 후에 14일 이내에 축사 내에 공기 감염이 일어나며 이어서 주위 농장으로 공기 전파가 가능한 것으로 알려져 있다.

구제역 바이러스는 항원 변이성이 가장 높은 바이러스 중의 하나이며, 이는 복제 과정에서 3D 폴리머라제가 유전자 교정(3D pol gene proofreading) 및 복제 후 수리 활성이 결여되어 있기 때문이다. 또한 구제역바이러스는 서로 다른 혈청형 간에는 교차방어가 일어나지 않는 특성이 있다.

구제역 백신으로 생독 백신은 잘 사용되고 있지 않으며, 현재 사독백신이 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. 국내에서도 2010년 11월 28일 구제역이 발생한 이후 독점적으로 공급되는 외국계 제약회사의 사독백신을 사용하고 있으나, 상기 백신은 단가가 높아 축산업자들에게 적지 않은 부담이 되고 있다. 최근에는 항바이러스제로서 인터페론을 이용하고 있고, 상기 인터페론은 바이러스가 생체내로 침입하면 1차 방어체계로서 분비되는 생체물질이다. 대표적으로 인터페론 알파 또는 베타를 이용하고 있으나, 고농도에 독성이 보이는 단점이 있고, 인터페론 타우의 경우 인터페론 알파 또는 베타와 비교하여 고농도에서 독성이 나타나지 않는 장점이 있다[(Nakajima, A, 2002, J. Interferon Cytokine Res. 22, 397-402), (Ott, T.L, 1997, Biol. Reprod. 57, 621-629), (Soos, J.M, J. Immunol. 155, 2747-2753)]. 따라서 상기 인터페론 알파 또는 베타의 단점을 개선한 구제역 백신의 개발이 절실한 실정이다.

이에 본 발명자들은 구제역 바이러스에 대한 항 바이러스 효과가 있는 물질을 탐색하던 중, 양 유래 인터페론 타우-4 유전자가 도입된 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 대장균이 발현하는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 수득하였으며, 상기 단백질을 이용 시, 구제역 바이러스 7개 혈청형에 대한 세포 변성 방어 효과가 우수하고, 구제역 바이러스 감염 전 또는 후에도 항 바이러스 효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양(Ovis aries) 유래 인터페론 타우-4(interferon tau-4) 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 재조합 벡터로 형질전환된 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 형질전환 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 백신 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양(Ovis aries) 유래 인터페론 타우-4(interferon tau-4) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 재조합 벡터로 형질전환된 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 형질전환 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 유효성분으로 포함하는 구제역 바이러스 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 유효성분으로 포함하는 구제역 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 구제역 바이러스 7개 혈청형에 대한 우수한 항 바이러스 효과가 있고, 구제역 바이러스 감염 전 또는 후에도 방어능이 뛰어나 구제역 바이러스 백신 조성물으로서 이용 가능하다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 생체 물질인 인터페론 타우-4 단백질을 유효 성분으로 이용 하는 것으로, 특정 구제역 바이러스 종(strain)의 유전자를 포함하지 않아, 광범위한 구제역 바이러스 균주에 적용 가능하며, 안전성이 높아 다양한 우제류 가축에 적용 가능한 장점이 있다. 또한, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 고농도에서도 독성이 없으므로, 구제역 바이러스 백신으로서 효과적으로 활용 가능하다.

도 1은 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 유전자 발현을 위한 제조합 벡터의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 2는 발현된 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 단백질 전기영동 결과(가) 및 히스티딘 단클론항체를 이용한 웨스턴 블롯(나) 결과를 확인한 도이다.
도 3은 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 농도별 처리에 따른 세포 변성방어 효과(가) 및 구제역바이러스 RNA 감소 효과(나)를 나타낸 도이다.
도 4는 구제역 바이러스 감염 후 접종된 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 접종 시간에 따른 세포 변성 방어 효과(가) 및 구제역바이러스 RNA 감소 효과(나)를 나타낸 도이다.
도 5는 구제역 바이러스의 혈청형에 따른 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 세포 변성방어 효과(가) 및 구제역바이러스 각 혈청형 RNA 감소 효과(나)를 나타낸 도이다.
도 6은 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 처리에 따른 MX1 mRNA 발현(가) 및 ISG15, OAS 및 PKR mRNA 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 마우스에 처리 시 마우스의 생존률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양(Ovis aries) 유래 인터페론 타우-4(interferon tau-4) 단백질을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "인터페론 타우-4(interferon tau-4)"는 반추류의 프로포블라스트와 엔도메트리얼 등의 생식세포에서 지속적으로 분비되는 호르몬으로서, 바이러스가 생체내로 침입하면 1차 방어체계로서 분비되는 생체물질이다.

본 발명에 있어서, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 변이체란 재조합 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

본 발명에 있어서, 상기 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 통상의 단백질 분리 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 따라 배양물로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 크로마토그래피 (예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용 해도(예, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해서 정제될 수 있다.

상기 인터페론 타우-4 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 코딩되고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열 또는 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 구제역 바이러스 게놈 DNA 또는 각 유전자를 주형으로 목적한 염기서열 또는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 염기서열을 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 염기서열 또는 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 염기서열 또는 유전자의 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 구체적으로, 본 발명의 염기서열 또는 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 염기서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "벡터"는 유전자 또는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 상기 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 염기서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 염기서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

상기 재조합 벡터는 하기의 개열 지도를 갖으며, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 발현 증진 목적을 달성할 수 있는 구조라면, 이에 제한되지 않는다.

[도]

상기 미생물은 대장균, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 대장균이나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적인 제제로서, 구제역 또는 구제역 바이러스의 예방을 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다.

상기 구제역 바이러스는 O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1 구제역 바이러스의 혈청형으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형이고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 "구제역 바이러스(foot and mouth disease virus) 혈청형"은 구제역 바이러스는 항원 변이성이 가장 높은 바이러스 중 하나이며, 이는 복제 과정에서 3D 폴리머라제가 유전자 교정(3D pol gene proofreading) 및 복제 후 수리 활성이 결여되어 있기 때문에, 다양한 혈청형이 존재한다. 상기 구제역 바이러스에는 7개의 혈청형이 존재하고, 혈청형이 동일하다 하더라도 바이러스 종(strain)별로 방어효과가 상이하여, 각 종별로 별도의 항원 및 백신을 개발해야 하는 문제점이 제기된다. 본 발명의 목적 상, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 이용 시, 7개 혈청형에 대한 우수한 항 바이러스 효과가 있고, 특정 구제역 바이러스 종(strain)의 유전자를 포함하지 않아, 광범위한 구제역 바이러스 균주에 적용 가능하며, 안전성이 높다.

본 발명의 백신 조성물에는 재조합 단백질 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물과 약학적 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 재조합 단백질의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000 ㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.

상기 사료로는 돼지고기, 소고기 및 닭고기 등의 부산물을 비롯하여 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다. 이러한 사료에 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 동물은 우제류(Artiodactyla)이고, 상기 우제류는 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 및 낙타로 이루어진 군에서 선택된 1종이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 양 유래 인터페론 타우-4 유전자가 도입된 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 대장균이 발현하는 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 수득하였다. 상기 단백질을 이용 시, 인터페론 유도 관련 유전자(MX1, OAS, PKR 및 ISG15)가 발현됨을 확인하여 구제역 바이러스에 대한 항바이러스 효과가 나타남을 확인하였다. 구체적으로, 구제역 바이러스 7개 혈청형에 대한 세포 변성 방어 효과가 우수하고, 구제역 바이러스 감염 전 또는 후에도 항 바이러스 효과가 우수하다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 생체 물질인 인터페론 타우-4 단백질을 유효 성분으로 이용 하는 것으로, 특정 구제역 바이러스 종(strain)의 유전자를 포함하지 않아, 광범위한 구제역 바이러스 균주에 적용 가능하며, 안전성이 높아 다양한 우제류 가축에 적용 가능한 효과가 있음을 확인하였다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 양 유래 인터페론 타우 -4 유전자 발현벡터 제작 및 인터페론 타우 -4 단백질 발현

양 유래 인터페론 타우-4 유전자를 대장균 발현벡터에 클로닝한 후 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 발현하였다.

구체적으로, 도 1의 개열 지도를 갖는 재조합 벡터를 제작하기 위하여, 양 유래 인터페론 타우-4 유전자(Gene accession No.X56341.1)를 합성(Bioneer Corp, Daejeon, Republic of Korea)한 후, 이 중 서열번호 2의 염기서열에 해당하는 상기 유전자를 프라이머(5'-CGCGAACAGATTGGAGGTTGTTACCTATCTCAGAGACT-3'(서열번호 3) 및 5'-GTGGCGGCCGCTCTATTATCAAGGTGAGTTCAGATCTC-3'(서열번호 4))를 사용하여 대장균 발현벡터 시스템인 Expresso® Rhamnose SUMO vector (Lucigen Corporation, USA)에 클로닝하였다. 상기 클로닝한 유전자를 0.15% L-rhamnose 와 0.15% glucose 넣어서 30에서 24시간동안 발현하였다. 수용성 분획의 단백질을 Ni-NTA 컬럼으로 정제하였다. 정제단백질은 PBS(10mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH₂PO₄, 140mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4)로 투석하였고 Bicinchonic acid법(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)으로 정량하였다. 발현 단백질의 면역원성은 폴리히스티딘 단클론항체 (Sigma)를 사용하여 웨스턴블롯법으로 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 33kDa의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 확인하였고, 총 1000 μg/ml 단백질을 수득하였으며, 상기 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 아미노산은 서열번호 1로 나타내었다.

실시예 2. 양 유래 인터페론 타우 -4 단백질의 농도에 따른 구제역 바이러스의 항바이러스 효과 확인

양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 농도에 따른 구제역 바이러스의 항바이러스 효과를 세포 수준에서 확인하였다.

구체적으로, LFBK(Fetal bovine kidney cell line, ARS, USDA) 세포 (3× 10⁴ cells/well)를 DMEM(2% FBS, 1% Antibiotics)에 배양하여 96-웰 플레이트에 분주한 다음에 37에서 4시간동안 고정하였다. 그 후, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 1500 ng/ml부터 10진 희석하여 1500, 150, 15, 1.5, 0.15, 0.015 ng/ml 및 비처리(음성 대조군) 농도 조건으로 24시간동안 반응시킨 후, 구제역 바이러스(O1 Manisa 혈청형)를 감염시켰다. 음성 대조군에서 세포변성을 나타내는 시기에 LFBK 세포변성여부 결과를 측정하였고 총 RNA는 MagNa Pure 96 LC system (Roche, Basel, Switzerland)로 추출하여 실시간 RT-PCR법으로 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 도 3의 가에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 농도가 최저 0.15 ng/ml에도 구제역 바이러스에 대한 항바이러스 효과가 나타남을 확인하였다. 또한, 도 3의 나에 나타낸 바와 같이, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 농도가 0.15 ng/ml일 때, 음성 대조군과 비교하여 구제역 바이러스의 RNA 발현양이 100배 감소됨을 확인하였다.

실시예 3. 접종 경과 후 시간에 따른 양 유래 인터페론 타우 -4 단백질의 항바이러스 효과 확인

접종 경과 후 시간에 따른 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 항바이러스 효과를 확인하였다.

구체적으로, LFBK 세포 (3×10⁴ cells/well)를 DMEM (2% FBS, 1% Antibiotics)에 배양하여 96-웰 플레이트에 분주한 다음에 37에서 4시간동안 고정하였다. 구제역바이러스 (O1 Manisa 혈청형)를 100TCID₅₀으로 접종한 다음 접종 경과 후(0, 2, 4, 8, 16 및 24시간) 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 0.15ng/ml 농도로 처리하였다. 음성 대조군에서 세포변성을 나타내는 시기에 LFBK 세포변성여부 결과를 측정하였고 총 RNA는 MagNa Pure 96 LC system (Roche, Basel, Switzerland)로 추출 후 실시간 RT-PCR법으로 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 가에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 접종 경과 후 8시간까지 100% 세포변성을 방어함을 확인하였다. 또한, 도 4의 나에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 접종 경과 후 0 내지 4시간 처리한 실험군은 음성 대조군과 비교하여, 구제역바이러스 RNA 발현양을 100배-1000배까지 감소시킴을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 구제역 바이러스 감염 후 시간이 경과한 후 접종하여도 이에 대한 항 바이러스 효과가 나타남을 확인하였다

실시예 4. 각 혈청형의 구제역 바이러스에 따른 양 유래 인터페론 타우 -4 단백질의 항바이러스 효과 확인

각 혈청형의 구제역 바이러스에 따른 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 항바이러스 효과를 확인하였다.

구체적으로, LFBK 세포에 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 0.3 ng/ml을 처리하고 나서 각 혈청형의 구제역바이러스(O1 Manisa, O SKR2000, O Andong, A Malaysia 97, A Pocheon, A22 IRQ24/6, Asia Shamir 및 Asia 1 Mongolia)를 100TCID₅₀으로 접종한 다음에 음성 대조군에서 세포변성을 나타내는 시기에 LFBK 세포변성여부 결과를 측정하였다. 또한, 총 RNA는 MagNa Pure 96 LC system (Roche, Basel, Switzerland)로 추출하여 실시간 RT-PCR법으로 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 가에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 각 혈청형의 구제역 바이러스에 대한 세포 변성을 억제함을 확인하였다. 또한, 도 5의 나에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군에 비교하여 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 각 혈청형의 구제역 바이러스 RNA 발현양을 약 3배 이상 감소시킴을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 구제역바이러스의 각 혈청형에도 효과적인 항 바이러스 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5. 양 유래 인터페론 타우 -4 단백질의 처리에 따른 인터페론 유도 관련 유전자 발현 정도 확인

양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 처리에 따른 인터페론 유도 관련 유전자(MX1, OAS, PKR 및 ISG15) 발현 정도를 확인하였다.

구체적으로, LFBK 세포 (3×10⁵cells/well)를 12-웰 플레이트에 분주한 다음에 37에 24시간 반응시킨 후, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 각 농도 (2.5 ng/ml, 25 ng/ml, 250 ng/ml)로 처리하고 24시간 후에 세포를 수확하였다. 이 세포들에서 RNA를 RNeasy Plus mini kit (Qiagen, USA)로 추출하고 DNase I (NEB) 처리군 1μg을 iScript c-DNA synthesis kit (Bio-rad Laboratories, USA) 이용하여 cDNA 합성하였다. 이후에 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 250, 25 및 2.5 ng/ml 농도에 따른 인터페론 유도 관련 유전자 (MX1 gene) 발현 정도를 측정하고 GAPDH를 대조군으로 사용하였다. 또한, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 2.5 ng/ml 농도에 대해서 인터페론 유도관련 유전자들 (MX1, OAS, PKR 및 ISG15)에 대한 발현 정도를 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.

PCR 혼합액 (20 μl)은 TaqMan universal PCR master mix(Applied Biosystems, Foster City, CA), Primer-probe mixture(표 1), 1 μl cDNA으로 구성으로 이용하였으며, 1단계(45도 10분, 95도 10분) 및 2단계(95도 15초와 60도 60초 45회 순환) 반응은 RT-PCR 장비(C1000 TouchTM thermal cycler, Bio-rad laboratories, USA)를 사용하여 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

유유전자	정방향	역방향	Taqman probe
GGAPDH	GCATCGTGGAGGGACTTATGA	GGGCCATCCACAGTCTTCTG	CACTGTCCACGCCATCACTGCCA
MMx1	AACACCTGACCGCGTACCA	GCACGAAGAACTGGATGATCAA	CAGGAAGCTAGCACCCGCATCTCC
OOAS	AAAGAGGAAGCGGCGTGC	CTCCTCAGGTT CTCGCACTCT	TCAGCTTCGTGCTCAGGTC
IISG15	GCGTGTACAAGCGGACCAGT	AGCGGGTGCTCATCATCC	CTGGCTGTCTTTTGAAGGGAGGCCC
PPKR	TGCCAAACTGGCTTATGAAAAG	TCACCACACGCAGCACTGA	CAGAAACAATGAAGATGG

도 6의 가에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 농도 의존적으로 MX1 mRNA 발현이 증가함을 확인하였다. 또한, 도 6의 나에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 처리 시, MX1 mRNA 발현이 음성 대조군과 비교하여 약 300배 증가였고, ISG15, OAS 및 PKR mRNA 발현 또한 각 872배, 544배 및 200배 증가함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질은 인터페론 유도양상과 유사한 기전으로 구제역 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 6. 마우스에서 양 유래 인터페론 타우 -4 단백질의 농도에 따른 구제역 바이러스의 항바이러스 효과 확인

상기 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 세포 수준에서 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 항 바이러스 효과를 확인하였으므로, 마우스에서 양 유래 인터페론 타우-4 단백질의 농도에 따른 구제역 바이러스의 항바이러스 효과를 확인하였다.

구체적으로, 40마리의 마우스(6주령)를 4개 군으로 구분하여 그룹별 10마리씩 실험하였다. 음성 대조군은 PBS 처리하였고, 실험군으로서, 실시예 1에서 제조된 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 500 ng 처리군 및 250 ng 처리군을 두었다. 각 대조군 및 실험군의 조건으로 마우스의 복강에 50 μl 부피로 접종하였다. 이후 24시간 경과한 후에 구제역바이러스(O형 안동주) 100LD₅₀를 접종하였다. 이 후, 마우스의 생존률을 접종 후 10일째까지 관찰하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 250 ng 접종한 실험군에서는 구제역 바이러스 감염 후 3일, 4일 및 5일째에 각 100%, 80% 및 70%의 생존률이 나타남을 확인하였다. 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 500 ng 접종한 실험군에서는 접종 후 4일째까지 100% 생존률을 나타내었고 5일째는 90%를 보였다. 접종 10일째에는 250 ng 접종군 및 500 ng 접종군에서 생존률이 각 70% 및 90%이 나타남을 확인하여, 고농도에서도 독성이 없으므로, 구제역 백신으로서 활용 가능함을 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> A vaccine composition for Foot-and-Mouth Disease virus <130> 1-77 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 172 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> amino acid of interferon tau-4 <400> 1 Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp 20 25 30 Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu 35 40 45 Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu 85 90 95 Asp Thr Cys Arg Asp Gln Val Met Gly Glu Lys Asp Ser Glu Leu Gly 100 105 110 Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile His 115 120 125 Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val 130 135 140 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 165 170 <210> 2 <211> 516 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> nucleotide of interferon tau-4 <400> 2 tgttacctat ctcagagact catgctggat gccagggaga acctcaagct cctggaccga 60 atgaacagac tctcccctca ttcctgtctg caggacagaa aagactttgg tcttccccag 120 gagatggtgg agggcgacca gctccagaag gaccaggcct tccctgtgct ctacgagatg 180 ctccagcaga gcttcaacct cttctacaca gagcactcct ctgctgcctg ggacaccacc 240 ctcctggacc agctctgcac tggactccaa cagcagctgg accacctgga cacctgcagg 300 gatcaagtga tgggagagaa agactctgaa ctgggtaaca tggaccccat tgtgaccgtg 360 aagaagtact tccagggcat ccatgactac ctgcaagaga agggatacag cgactgcgcc 420 tgggaaatcg tcagagtcga gatgatgaga gccctcactg tatcaaccac cttgcaaaaa 480 aggttaacaa agatgggtgg agatctgaac tcacct 516 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of interferon tau-4 <400> 3 cgcgaacaga ttggaggttg ttacctatct cagagact 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of interferon tau-4 <400> 4 gtggcggccg ctctattatc aaggtgagtt cagatctc 38 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GAPDH <400> 5 gcatcgtgga gggacttatg a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GAPDH <400> 6 gggccatcca cagtcttctg 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe of GAPDH <400> 7 cactgtccac gccatcactg cca 23 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Mx1 <400> 8 aacacctgac cgcgtacca 19 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Mx1 <400> 9 gcacgaagaa ctggatgatc aa 22 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe of Mx1 <400> 10 caggaagcta gcacccgcat ctcc 24 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of OAS <400> 11 aaagaggaag cggcgtgc 18 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of OAS <400> 12 ctcctcaggt tctcgcactc t 21 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe of OAS <400> 13 tcagcttcgt gctcaggtc 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of ISG15 <400> 14 gcgtgtacaa gcggaccagt 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of ISG15 <400> 15 agcgggtgct catcatcc 18 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe of ISG15 <400> 16 ctggctgtct tttgaaggga ggccc 25 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of PKR <400> 17 tgccaaactg gcttatgaaa ag 22 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of PKR <400> 18 tcaccacacg cagcactga 19 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Taqman probe of PKR <400> 19 cagaaacaat gaagatgg 18

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양(Ovis aries) 유래 인터페론 타우-4(interferon tau-4) 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인터페론 타우-4 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 코딩되는 것을 특징으로 하는, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질.
서열번호 2의 염기서열을 포함하는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 재조합 벡터.
제3항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 하기의 개열 지도를 갖는 것을 특징으로 하는, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 재조합 벡터.
[도]
양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 재조합 벡터로 형질전환된 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 형질전환 미생물.
제5항에 있어서,
상기 미생물은 대장균, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 양 유래 인터페론 타우-4 단백질 생산용 형질전환 미생물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 백신 조성물.
제7항에 있어서,
상기 구제역 바이러스는 O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1의 구제역 바이러스 혈청형으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 백신 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 예방 또는 개선용 사료 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 양 유래 인터페론 타우-4 단백질을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역 예방 또는 치료 방법.
제11항에 있어서,
상기 동물은 우제류(Artiodactyla)인 것을 특징으로 하는, 구제역 예방 또는 치료 방법.
제12항에 있어서,
상기 우제류(Artiodactyla)는 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 및 낙타로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 구제역 예방 또는 치료 방법.