JP2023526495A - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン - Google Patents
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Abstract
本明細書は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質を含むワクチン組成物を開示する。ワクチンとしてのそれらの使用を含む、組成物に関連するヌクレオチド、細胞、及び方法も開示する。【選択図】図２０Ｂ
Description
関連出願との相互参照
本出願は、あらゆる目的でその全容を参照によって本明細書にそれぞれ援用する２０２０年５月１９日出願の米国特許仮出願第６３／０２７，２８３号、２０２０年７月２日出願の同第６３／０４７，７８９及び２０２１年１月１９日出願の同第６３／１３９，２９２号の利益を主張するものである。
本出願は、あらゆる目的でその全容を参照によって本明細書にそれぞれ援用する２０２０年５月１９日出願の米国特許仮出願第６３／０２７，２８３号、２０２０年７月２日出願の同第６３／０４７，７８９及び２０２１年１月１９日出願の同第６３／１３９，２９２号の利益を主張するものである。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年５月１９日に作成され、ＧＳＯ－０９１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔの名前が付けられており、そのサイズは１０，１４２，３９８バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年５月１９日に作成され、ＧＳＯ－０９１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔの名前が付けられており、そのサイズは１０，１４２，３９８バイトである。
背景
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、コロナウイルス感染症２０１９（Ｃｏｖｉｄ－１９）パンデミックの原因となったウイルス株である。２０２０年４月１５日現在、このウイルスは全世界で２百万人を超える人に感染し、約１４万人の死亡を引き起こしている。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＯＶＩＤ－１９において、コロナウイルスとの関連で２つの理由で重要であると考えられる。１つ目は、抗体応答のみを刺激するＳＡＲＳワクチンは、ウイルスのクリアランスとは関係なく、しばしば肺の炎症を伴う、という前臨床モデルにおける反復的な観察である。これはげっ歯類及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の両方で観察されており、アンバランスな免疫応答によって引き起こされ、バランスの取れた抗体とＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔｈ１）応答を誘導するワクチンを使用することで解決される可能性が高いというのが現在のコンセンサスとなっている（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａ Ｃｏａｌｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（ＣＥＰＩ）／Ｂｒｉｇｈｔｏｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ（ＢＣ） ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ１２－１３，２０２０（非特許文献１））。２つ目は、コロナウイルスは、明らかに頻繁に変異し、動物レゼルボアからヒトに感染し、過去１８年間で３回のエピデミック／パンデミックを引き起こしている（２００２年のＳＡＲＳ、２０１２年のＭＥＲＳ、現在のＣＯＶＩＤ－１９）ことである。抗体応答が、株及びアイソレート間で大きく変化する高度に変異性のタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質）に対するものであるのに対して、Ｔ細胞エピトープはより進化的に保存されたタンパク質にしばしば由来する。一般的にＴ細胞記憶はＢ細胞記憶よりも持続性が高く、そのためＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＣＤ８＋Ｔ記憶は将来的なＳＡＲＳバリアントに対してより長期で良好な防御を与えると考えられる。多くのワクチンがＮＨＰ及びヒトに抗体応答を誘導できることが示されているが、タンパク質／ペプチド及びｍＲＮＡワクチンなどの広く用いられているモダリティは、これらの種で有効なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激しない。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、コロナウイルス感染症２０１９（Ｃｏｖｉｄ－１９）パンデミックの原因となったウイルス株である。２０２０年４月１５日現在、このウイルスは全世界で２百万人を超える人に感染し、約１４万人の死亡を引き起こしている。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＯＶＩＤ－１９において、コロナウイルスとの関連で２つの理由で重要であると考えられる。１つ目は、抗体応答のみを刺激するＳＡＲＳワクチンは、ウイルスのクリアランスとは関係なく、しばしば肺の炎症を伴う、という前臨床モデルにおける反復的な観察である。これはげっ歯類及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の両方で観察されており、アンバランスな免疫応答によって引き起こされ、バランスの取れた抗体とＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔｈ１）応答を誘導するワクチンを使用することで解決される可能性が高いというのが現在のコンセンサスとなっている（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａ Ｃｏａｌｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（ＣＥＰＩ）／Ｂｒｉｇｈｔｏｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ（ＢＣ） ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ１２－１３，２０２０（非特許文献１））。２つ目は、コロナウイルスは、明らかに頻繁に変異し、動物レゼルボアからヒトに感染し、過去１８年間で３回のエピデミック／パンデミックを引き起こしている（２００２年のＳＡＲＳ、２０１２年のＭＥＲＳ、現在のＣＯＶＩＤ－１９）ことである。抗体応答が、株及びアイソレート間で大きく変化する高度に変異性のタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質）に対するものであるのに対して、Ｔ細胞エピトープはより進化的に保存されたタンパク質にしばしば由来する。一般的にＴ細胞記憶はＢ細胞記憶よりも持続性が高く、そのためＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＣＤ８＋Ｔ記憶は将来的なＳＡＲＳバリアントに対してより長期で良好な防御を与えると考えられる。多くのワクチンがＮＨＰ及びヒトに抗体応答を誘導できることが示されているが、タンパク質／ペプチド及びｍＲＮＡワクチンなどの広く用いられているモダリティは、これらの種で有効なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激しない。
感染症の抗原ワクチン設計におけるさらなる疑問の１つは、存在する多くのタンパク質のうちのどれが、「最良の」治療抗原、例えば、免疫を刺激することができる抗原を生じるかというものである。
現行の抗原予測法の課題に加えて、その多くがヒト由来のものである、ヒトにおける抗原送達に使用することができる既存のベクター系にもやはり特定の課題が存在する。例えば、多くのヒトは、過去の自然曝露の結果としてヒトウイルスに対する既存の免疫を有しており、この免疫ががん治療または感染症に対するワクチンなどのワクチン接種戦略における抗原を送達するための組換えヒトウイルスの使用にとって大きな障害となりうる。上記の課題に対処したワクチン接種戦略では一定の進歩があったものの、高齢者を含むヒトにおけるバランスの取れたＢ及びＴ細胞免疫を刺激するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンのニーズといった、ワクチン効力及び有効性の向上など、特に臨床用途において依然、改善の余地がある。
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａ Ｃｏａｌｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（ＣＥＰＩ）／Ｂｒｉｇｈｔｏｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ（ＢＣ） ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ１２－１３，２０２０
概要
本明細書では、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、（ａ）場合により、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、ベクター骨格を含み、前記ベクター骨格が、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、を含む、前記１つ以上のベクターと、（ｂ）存在する場合に前記ベクター骨格に場合により挿入される、抗原カセットであって、（ｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と、を含む、前記抗原カセットと、を含む、組成物を提供する。
本明細書では、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、（ａ）場合により、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、ベクター骨格を含み、前記ベクター骨格が、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、を含む、前記１つ以上のベクターと、（ｂ）存在する場合に前記ベクター骨格に場合により挿入される、抗原カセットであって、（ｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と、を含む、前記抗原カセットと、を含む、組成物を提供する。
本明細書ではまた、抗原ベースワクチンであって、（ｉ）少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドであって、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドと、（ｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）と、を含む、前記抗原ベースワクチンも提供される。
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドと、（ｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）と、を含む、前記抗原ベースワクチンも提供される。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、（ａ）場合により、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、ベクター骨格を含み、前記ベクター骨格が、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、を含む、前記１つ以上のベクターと、（ｂ）存在する場合に前記ベクター骨格に場合により挿入される、抗原カセットであって、（ｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個、またはそれ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、前記免疫原性ポリペプチドが、（Ａ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号６６または配列番号６７に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、（Ｂ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び表Ｃに記載のポリペプチド配列番号を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープが、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在し、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が配列番号６８に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、（Ｃ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が配列番号６９、配列番号７９、配列番号８３，配列番号８５、または配列番号８７に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、（Ｄ）表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープが、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在し、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号６４または配列番号６５に記載の配列を含む、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、（Ｅ）配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異、スパイクＲ６８２Ｖ変異、スパイクＲ８１５Ｎ変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により前記改変スパイクタンパク質が、配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含み、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７０または配列番号８９に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、（Ｆ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７１に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、（Ｇ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７２に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、（Ｈ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７３に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、（Ｉ）表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７４に記載の配列を含む、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、（Ｊ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異、スパイクＲ６８２Ｖ変異、スパイクＲ８１５Ｎ変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、（Ｋ）配列番号９０に記載の改変スパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、（Ｌ）表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、（Ｍ）表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたは前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、または（Ｎ）１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有し、場合により前記スパイクタンパク質が配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、を含み、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のそれぞれが、（Ａ）場合により、５’リンカー配列と、（Ｂ）場合により、３’リンカー配列と、を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と、を含む、前記抗原カセットと、を含む、組成物も提供される。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、（ａ）場合により、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、ベクター骨格を含み、前記ベクター骨格が、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、を含む、前記１つ以上のベクターと、（ｂ）存在する場合に前記ベクター骨格に場合により挿入される、抗原カセットであって、（ｉ）表Ｃに記載の免疫原性ポリペプチド配列をそれぞれがコードする少なくとも１８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、場合により前記免疫原性ポリペプチド配列が、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に連結されている、前記少なくとも１８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と、を含む、前記抗原カセットと、を含む、組成物も提供される。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、（ａ）場合により、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、ベクター骨格を含み、前記ベクター骨格が、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、を含む、前記１つ以上のベクターと、（ｂ）存在する場合に前記ベクター骨格に場合により挿入される、抗原カセットであって、（ｉ）表１０に記載の免疫原性ポリペプチド配列をそれぞれがコードする少なくとも１５個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、場合により前記免疫原性ポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に連結されている、前記少なくとも１５個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と、を含む、前記抗原カセットと、を含む、組成物も提供される。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、（ａ）場合により、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、ベクター骨格であって、場合によりＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または場合によりベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含む、前記ベクター骨格を含み、前記ベクター骨格が、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、を含む、前記１つ以上のベクターと、（ｂ）前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されるように前記ベクター骨格内に挿入された抗原カセットであって、（ｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と、を含む、前記抗原カセットと、を含む、組成物も提供される。
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と、を含む、前記抗原カセットと、を含む、組成物も提供される。
本明細書ではまた、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、配列番号１１４に記載のヌクレオチド配列を含む、組成物も提供される。
本明細書ではまた、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、配列番号９３に記載のヌクレオチド配列を含む、組成物も提供される。
本明細書ではまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクがあるかまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を評価する方法であって、（ａ）１）前記対象が、抗原ベースワクチンに含まれる抗原を提示することが予測されているかまたは知られているＨＬＡアレルを有するか否かを判定するかまたは既にそれが判定されている工程と、（ｂ）前記（ａ）の結果から、前記対象が前記ＨＬＡアレルを発現している場合に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補となることを判定するかまたは既にそれが判定されている工程と、（ｃ）場合により、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既にそれが投与されている工程と、を含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチド、または２）前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含み、場合により前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ場合により前記免疫原性ポリペプチドが、Ｎ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、方法も提供される。
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ場合により前記免疫原性ポリペプチドが、Ｎ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、方法も提供される。
いくつかの態様では、工程（ａ）及び／または（ｂ）は、前記対象からの試料を処理したサードパーティーからデータセットを得ることを含む。いくつかの態様では、工程（ａ）は、前記対象から試料を得ることと、前記試料を、エクソームシークエンシング、標的化エクソームシークエンシング、トランスクリプトームシークエンシング、サンガーシークエンシング、ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイ、質量分析に基づく方法、マイクロアレイ、ナノストリング、ＩＳＨ、及びＩＨＣからなる群から選択される方法を用いてアッセイすることと、を含む。いくつかの態様では、前記試料は、感染試料、正常組織試料、または感染試料と正常組織試料を含む。いくつかの態様では、前記試料は、組織、体液、血液、脊髄液、及び穿刺吸引液から選択される。いくつかの態様では、前記ＨＬＡアレルは、少なくとも５％のＨＬＡ頻度を有する。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドまたは前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされた前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドは、対象の細胞上のＨＬＡアレルによって提示されるＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、抗原発現系を含む。いくつかの態様では、抗原発現系は、本明細書で提供される抗原発現系のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、本明細書で提供される医薬組成物のいずれか１つを含む。
本明細書ではまた、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチド、または２）前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含み、前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ、場合により前記免疫原性ポリペプチドが、Ｎ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、方法も提供される。
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ、場合により前記免疫原性ポリペプチドが、Ｎ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、方法も提供される。
本明細書ではまた、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、（１）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個、またはそれ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチド、または（２）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個、またはそれ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含み、前記免疫原性ポリペプチドが、（Ａ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号６６または配列番号６７に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、（Ｂ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び表Ｃに記載のポリペプチド配列番号を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープが、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在し、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が配列番号６８に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、（Ｃ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が配列番号６９、配列番号７９、配列番号８３，配列番号８５、または配列番号８７に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、（Ｄ）表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープが、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在し、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号６４または配列番号６５に記載の配列を含む、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、（Ｅ）配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異、スパイクＲ６８２Ｖ変異、スパイクＲ８１５Ｎ変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により前記改変スパイクタンパク質が、配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含み、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７０に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、（Ｆ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７１に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、（Ｇ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７２に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、（Ｈ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７３に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、（Ｉ）表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７４に記載の配列を含む、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、または（Ｊ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異、スパイクＲ６８２Ｖ変異、スパイクＲ８１５Ｎ変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により前記改変スパイクタンパク質が配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、を含む、方法も提供される。
本明細書ではまた、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、（ａ）場合により、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、ベクター骨格であって、場合によりＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または場合によりベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含む、前記ベクター骨格を含み、前記ベクター骨格が、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、を含む、前記１つ以上のベクターと、（ｂ）前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されるように前記ベクター骨格内に挿入された抗原カセットであって、（ｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と、を含む、前記抗原カセットと、を含む、方法も提供される。
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせを含み、かつ前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と、を含む、前記抗原カセットと、を含む、方法も提供される。
本明細書ではまた、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチド、または２）前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含み、前記免疫原性ポリペプチドが、表Ｃに記載の免疫原性ポリペプチド配列をそれぞれがコードする少なくとも１８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含み、場合により前記免疫原性ポリペプチド配列が、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に連結されている、方法も提供される。
いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、抗原発現系を含む。いくつかの態様では、抗原発現系は、本明細書で提供される抗原発現系のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、本明細書で提供される医薬組成物のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、対象は、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する。いくつかの態様では、対象は、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、ＭＨＣクラスＩエピトープは、表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープを含む。いくつかの態様では、対象は、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。いくつかの態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は、対象が感染した、または感染のリスクがあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプによってコードされたポリペプチドに対応する少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、前記免疫原性ポリペプチドをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの１つ以上の順序付けられた配列は、５’から３’方向に、
Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
を含む式で記述され、
式中、Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここでａ＝０または１であり、Ｎは、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの１つを含み、ここでｃ＝１であり、場合により各Ｎは、表Ａ、表Ｂ、及び／または表Ｃに記載されるポリペプチド配列をコードし、Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であり、Ｙ＝０、１、または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、ユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、場合により少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方、またはＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列を含む。
Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
を含む式で記述され、
式中、Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここでａ＝０または１であり、Ｎは、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの１つを含み、ここでｃ＝１であり、場合により各Ｎは、表Ａ、表Ｂ、及び／または表Ｃに記載されるポリペプチド配列をコードし、Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であり、Ｙ＝０、１、または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、ユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、場合により少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方、またはＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列を含む。
いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮｃは、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵｆは、異なるＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列である。いくつかの態様では、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝１８、Ｙ＝２であり、かつ、（ｉ）ベクター骨格はＣｈＡｄＶ６８ベクターを含み、ａ＝１であり、ＰはＣＭＶプロモーターであり、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が存在し、第２のポリ（Ａ）配列はベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列であり、場合により外因性のポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列を含み、または（ｉｉ）ベクター骨格はベネズエラ馬脳炎ウイルスベクターを含み、ａ＝０であり、前記抗原カセットは内因性２６Ｓプロモーターに機能的に連結され、少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列は、前記骨格によって与えられる少なくとも８０個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列（配列番号２７９４０）であり、各Ｎは、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激することができるエピトープ、またはこれらの組み合わせをコードし、Ｌ５は、エピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、５’リンカー配列は、少なくともアミノ酸３個の長さのペプチドをコードし、Ｌ３は、エピトープの天然のＣ末端アミノ酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、３’リンカー配列は、少なくともアミノ酸３個の長さのペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれである。
いくつかの態様において、組成物は、ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む。いくつかの態様において、ナノ粒子状の送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの態様では、イオン化可能なアミノ脂質は、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート）分子を含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは抗原発現系を封入する。
いくつかの態様では、抗原カセットは、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と少なくとも１つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれる。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と機能的に連結される。
いくつかの態様において、１つ以上のベクターは、１つ以上の＋鎖ＲＮＡを含む。いくつかの態様において、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、５’ ７－メチルグアノシン（ｍ７ｇ）キャップを含む。いくつかの態様において、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、インビトロ転写によって生成される。いくつかの態様において、１つ以上のベクターは、哺乳動物細胞内で自己複製する。
いくつかの態様において、骨格は、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、骨格は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む。いくつかの態様において、骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様において、非構造タンパク質媒介増幅のための配列は、アルファウイルス５’ ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、２４ｎｔのＣＳＥ、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス３’ ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様において、骨格は、構造ビリオンタンパク質カプシドＥ２及びＥ１をコードしていない。いくつかの態様において、抗原カセットは、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入される。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、さらに塩基対７５４４～１１１７５の間の欠失を有する配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様において、骨格は、配列番号６または配列番号７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、抗原カセットは、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４～１１１７５の間の欠失を置換するように７５４４位に挿入されている。いくつかの態様では、抗原の挿入は、ｎｓＰ１～４遺伝子及び少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、ｎｓＰ１～４遺伝子と少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列とが別々のオープンリーディングフレーム内にある。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、骨格によってコードされた天然の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。
いくつかの態様では、骨格は、チンパンジーアデノウイルスベクターの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、場合によりチンパンジーアデノウイルスベクターはＣｈＡｄＶ６８ベクターである。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が配列から完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている点を除いて、配列番号１に記載の配列を含み、場合により、配列は、配列番号１に記載の配列の（１）Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、（２）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、及びＥ３、または（３）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３、及びＥ４が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号１の配列から得られる遺伝子または調節配列を含み、場合により、前記遺伝子は、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、欠失または部分欠失Ｅ４ｏｒｆ２領域及び欠失または部分欠失Ｅ４ｏｒｆ３領域、及び場合により、欠失または部分欠失Ｅ４ｏｒｆ４領域を含む部分欠失Ｅ４遺伝子を含む。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含み、さらに、（１）配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド５７７～３４０３のＥ１欠失、（２）配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５のＥ３欠失、及び（３）配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２のＥ４欠失を含み、場合により抗原カセットは、Ｅ１欠失内に挿入されている。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号７５に記載の配列を含み、場合により、抗原カセットは、Ｅ１欠失内に挿入されている。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号１に記載の配列の塩基対番号５７７～３４０３の間、または塩基対４５６～３０１４の間に１つ以上の欠失を含み、場合により、ベクターは、塩基対２７，１２５～３１，８２５の間、または塩基対２７，８１６～３１，３３３の間に１つ以上の欠失をさらに含む。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号１に記載の配列の塩基対番号３９５７～１０３４６、塩基対番号２１７８７～２３３７０、及び塩基対番号３３４８６～３６１９３の間に１つ以上の欠失を含む。いくつかの態様では、カセットは、Ｅ１領域、Ｅ３領域、及び／または、カセットの組み込みが可能な任意の欠失されたＡｄＶ領域においてＣｈＡｄＶ骨格に挿入される。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ骨格は、第１世代、第２世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターの１つから生成される。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＲＳＶ、ＰＧＫ、ＨＳＡ、ＭＣＫ、及びＥＢＶプロモーター配列からなる群から選択される。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーター配列である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、外因性のＲＮＡプロモーターである。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列またはＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列または複数のＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列またはＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列は、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写をもたらす。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、それぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、それぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、それぞれ２ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、それぞれ５ｋｂ未満のサイズである。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つは、ＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つは、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つは、Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部をコードし、場合により、Ｂ細胞応答を刺激することができる前記ポリペプチド配列またはその一部は、完全長タンパク質、タンパク質ドメイン、タンパク質サブユニット、または抗体と結合できることが予測されているかまたは知られている抗原性フラグメントを含む。
いくつかの態様において、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は互いに直接連結される。いくつかの態様において、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つは、リンカーをコードする核酸配列によって異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と連結されている。いくつかの態様では、リンカーは、（１）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したグリシン残基（配列番号２７９４１）、（２）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したアラニン残基（配列番号２７９４２）、（３）２個のアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さのコンセンサス配列、（６）起源の同族タンパク質に由来する抗原に隣接しており、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２～２０個の長さの１つ以上の天然配列、及び（７）フーリンまたはＴＥＶ切断配列からなる群から選択される。いくつかの態様において、リンカーは、２個のＭＨＣクラスＩＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩ配列と連結する。いくつかの態様では、リンカーは、配列ＧＰＧＰＧ（配列番号５６）を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つの配列は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、及び／または免疫原性を高める、分離した、または連続した配列に機能的または直接的に連結されている。いくつかの態様では、分離した、または連続した配列は、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列（例えば、７６位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含有するユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも１つを含み、場合によりプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示が可能であることが予測または検証されている２つ以上の異なるポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のそれぞれは、翻訳後の対応する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の５０％未満、４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４５％未満、４３％未満、４２％未満、４１％未満、４０％未満、３９％未満、３８％未満、３７％未満、３６％未満、３５％未満、３４％未満、または３３％未満であるポリペプチド配列またはその一部をコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のそれぞれは、翻訳後の対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の機能性タンパク質、機能性タンパク質ドメイン、機能性タンパク質サブユニット、または機能性タンパク質フラグメントをコードしていないポリペプチド配列またはその一部をコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの２つ以上が、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子に由来する。いくつかの態様では、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子に由来する２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は、対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子内で第１の核酸配列に第２の核酸配列が続く場合に、第１の核酸配列に第２の核酸配列が直接続くことも、連結されることもできないように順序付けられる。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は少なくとも２～４００個の核酸配列を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも２個は、（１）ＭＨＣクラスＩによって提示される、（２）ＭＨＣクラスＩＩによって提示される、及び／または（３）Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも２個は、（１）ＭＨＣクラスＩによって提示される、（２）ＭＨＣクラスＩＩによって提示される、及び／または（３）Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部をコードする。
いくつかの態様では、対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされた抗原のうちの少なくとも１つは抗原提示細胞上に提示され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上の抗原の少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらす。いくつかの態様では、対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされた抗原のうちの少なくとも１つは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス上の抗原の少なくとも１つを標的とする抗体応答をもたらす。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、対象に投与されて翻訳された場合、前記ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ抗原のうちの少なくとも１つは抗原提示細胞上に提示され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上の抗原の少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらし、場合により、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のそれぞれの発現は、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって誘導される。
いくつかの態様では、各ＭＨＣクラスＩエピトープコードＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は、アミノ酸８～３５個の長さ、場合により、アミノ酸９～１７個、９～２５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個のポリペプチド配列をコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列は存在する。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列は存在し、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列は、アミノ酸１２～２０個、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０～４０個の長さである。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在して少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、場合により、前記少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方、及び／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、非誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、前記骨格に天然に存在するポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、前記骨格に外因性のポリ（Ａ）配列を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つと機能的に連結される。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、または少なくとも９０個の連続したＡヌクレオチド（配列番号２７９４３）である。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも８０個の連続したＡヌクレオチド（配列番号２７９４０）である。いくつかの態様では、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列は、存在する。いくつかの態様では、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列、または２つ以上のＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の組み合わせを含む。いくつかの態様では、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列は、２つ以上の第２のポリ（Ａ）配列を含み、場合により前記２つ以上の第２のポリ（Ａ）配列は、２つ以上のＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、２つ以上のＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列、またはＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列とＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列との組み合わせを含む。
いくつかの態様では、抗原カセットは、イントロン配列、外因性イントロン配列、恒常的輸送エレメント（ＣＴＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フーリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された、ｍＲＮＡの核輸送、安定性、もしくは翻訳効率を向上させることが知られている５’もしくは３’末端の非コード領域内の配列、のうちの少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの態様では、抗原カセットは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む。いくつかの態様では、検出可能なペプチドまたはエピトープは、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む。いくつかの態様では、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性抗体もしくは互いに連結された多重特異性抗体としての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、柔軟なリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である。いくつかの態様では、抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とは、２ＡまたはＩＲＥＳなどの自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または抗体の重鎖配列と軽鎖配列とは、連続したグリシン残基などの柔軟なリンカーによって連結される。いくつかの態様では、免疫調節物質はサイトカインである。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１、またはそれぞれのそのバリアントである。
いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープコードＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程と、（ｂ）各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力することにより、前記抗原のそれぞれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記数値的尤度のセットを生成する工程と、（ｃ）前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択することにより、前記ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープコードＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成する工程と、を行うことによって選択される。
いくつかの態様では、各ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープコードＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程と、（ｂ）各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力することにより、前記抗原のそれぞれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記数値的尤度のセットを生成する工程と、（ｃ）前記抗原のセットのサブセットを前記数値的尤度のセットに基づいて選択することにより、前記少なくとも１８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成する工程と、を行うことによって選択される。いくつかの態様において、選択された抗原のセットの数は、２～２０である。いくつかの態様において、提示モデルは、（ａ）ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、（ｂ）ペアのＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上の提示の尤度との間の依存性を表す。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上に提示される尤度が増大している抗原を選択することを含み、場合により、前記選択された抗原は、１つ以上の特異的ＨＬＡアレルによって提示されているものとして検証されている。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している抗原を選択することを含み、場合により、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、対象における正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、エクソームまたはトランスクリプトームのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染組織もしくは細胞でシークエンシングを行うことによって取得される。いくつかの態様では、シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の超並列シークエンシングアプローチである。
いくつかの態様では、抗原カセットは、抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの、または各ジャンクションエピトープ配列は、ＭＨＣに対して５００ｎＭよりも高い親和性を有する。いくつかの態様では、各ジャンクションエピトープ配列は、非自己である。
いくつかの態様では、前記ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩエピトープのそれぞれは、集団の少なくとも５％に存在する少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示が可能であることが予測または検証されている。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩエピトープのそれぞれは、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアは、集団において少なくとも０．０１％の抗原／ＨＬＡ頻度を有する。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩエピトープのそれぞれは、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアが、集団において少なくとも０．１％の抗原／ＨＬＡ頻度を有する。
いくつかの態様では、抗原カセットは、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、非治療的エピトープが対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される。いくつかの態様では、非治療的な予測されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列は、抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列である。
いくつかの態様では、予測は、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである。いくつかの態様では、抗原カセット内における前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列の順序は、（ａ）前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列の異なる順序に対応した候補抗原カセット配列のセットを生成する工程と、（ｂ）前記各候補抗原カセット配列について、前記候補抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程と、（ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補抗原カセット配列を、抗原ワクチン用の抗原カセット配列として選択する工程と、を含む一連の工程によって決定される。
また、本明細書では、本明細書で提供される組成物のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供される。いくつかの態様において、組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの態様では、組成物は、免疫調節物質をさらに含む。いくつかの態様では、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。
本明細書ではまた、本明細書に記載される組成物のいずれかの抗原カセットと、配列番号３または配列番号５の配列から得られる１つ以上の因子と、を含む単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、場合により、前記１つ以上の因子が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列、ポリ（Ａ）配列、及び配列番号３または配列番号５に記載の配列のｎｓＰ１～４遺伝子からなる群から選択され、場合により、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットも提供される。いくつかの態様において、前記単離ヌクレオチド配列または配列のセットは、配列番号６または配列番号７に記載の配列の７５４４位に挿入された先行の組成物の請求項のいずれかに記載の抗原カセットを含む。いくつかの態様では、前記単離配列は、さらに、配列番号３または配列番号５の配列から得られた前記１つ以上の因子の５’側に位置するＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、場合により、前記ポリ（Ａ）配列の３’側に位置する１つ以上の制限部位と、を含む。いくつかの態様では、本明細書で提供される組成物のいずれかの抗原カセットは、配列番号８または配列番号９の７５６３位に挿入される。
本明細書ではまた、本明細書で提供される組成物のいずれかの抗原カセットと、配列番号１または配列番号７５の配列から得られる１つ以上の因子と、を含む単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、場合により、前記１つ以上の因子が、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択され、場合により、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットも提供される。いくつかの態様では、前記配列または単離ヌクレオチド配列のセットは、配列番号７５に記載の配列のＥ１欠失内に挿入された、本明細書で提供される組成物の抗原カセットを含む。いくつかの態様では、単離配列は、配列番号１または配列番号７５の配列から得られた前記１つ以上の因子の５’側に位置するＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、場合により、前記ポリ（Ａ）配列の３’側に位置する１つ以上の制限部位と、をさらに含む。
本明細書ではまた、本明細書で提供される単離されたヌクレオチド配列または単離されたヌクレオチド配列のセットのいずれかを含むベクターまたはベクターのセットも提供される。
本明細書ではまた、本明細書で提供される単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞であって、場合により、前記細胞が、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａ細胞である、単離細胞も提供される。
本明細書ではまた、本明細書で提供される組成物のいずれかと、使用説明書と、を含むキットも提供される。
本明細書ではまた、対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するかまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するための方法であって、対象に、本明細書で提供される組成物または医薬組成物のいずれかを投与することを含む、方法も提供される。いくつかの態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は、対象が感染した、または感染のリスクがあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプによってコードされたポリペプチドに対応する少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、同種プライミング／ブースター戦略を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、異種プライミング／ブースター戦略を含む。いくつかの態様では、異種プライミング／ブースター戦略は、異なるワクチンプラットフォームによってコードされた同一の抗原カセットを含む。いくつかの態様では、異種プライミング／ブースター戦略は、同じワクチンプラットフォームによってコードされた異なる抗原カセットを含む。いくつかの態様では、異種プライミング／ブースター戦略は、異なるワクチンプラットフォームによってコードされた異なる抗原カセットを含む。いくつかの態様では、異なる抗原カセットは、スパイクコードカセット及び別のＴ細胞エピトープコードカセットを含む。いくつかの態様では、異なる抗原カセットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なるアイソレートに由来する異なるエピトープ及び／または抗原をコードするカセットを含む。
本明細書ではまた、対象における免疫応答を誘導するための方法であって、対象に本明細書で提供される組成物または医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法も提供される。いくつかの態様では、対象は、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する。いくつかの態様では、対象は、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、ＭＨＣクラスＩエピトープは、表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープを含む。いくつかの態様では、対象は、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。いくつかの態様では、組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与される。いくつかの態様では、組成物は筋肉内投与される。
いくつかの態様では、方法は、１つ以上の免疫調節物質を投与することをさらに含み、場合により、免疫調節物質は、組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される。いくつかの態様では、１つ以上の免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。いくつかの態様では、免疫調節物質は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）投与される。いくつかの態様では、皮下投与は、組成物または医薬組成物の投与部位の近くに、または１つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる。
いくつかの態様では、方法は、対象に第２のワクチン組成物を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、第１の組成物または医薬組成物の投与の前に投与される。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、本明細書で提供される組成物または医薬組成物のいずれかの投与の後に投与される。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、投与された第１の組成物または医薬組成物と同じである。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、投与された第１の組成物または医薬組成物と異なる。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む。いくつかの態様では、チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列は、本明細書で提供される組成物のいずれかの少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と同じである。
本明細書ではまた、先行の組成物の請求項のいずれかに記載の１つ以上のベクターを製造する方法であって、（ａ）骨格及び抗原カセットを含む直鎖化ＤＮＡ配列を得ることと、（ｂ）直鎖化ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写するために必要なすべての成分を含んだインビトロ転写反応に、直鎖化ＤＮＡ配列を加えることにより、直鎖化ＤＮＡ配列をインビトロ転写することであって、場合により、得られたＲＮＡにｍ７ｇキャップをインビトロで付加することをさらに含む、インビトロ転写することと、（ｃ）インビトロ転写反応から１つ以上のベクターを単離することと、を含む、方法も提供される。いくつかの態様では、直線化ＤＮＡ配列は、ＤＮＡプラスミド配列を直線化することにより、またはＰＣＲを用いた増幅により生成される。いくつかの態様では、プラスミド配列は、細菌組換えまたは全ゲノムＤＮＡ合成または細菌細胞内での合成されたＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成のうちの１つを用いて生成される。いくつかの態様では、前記インビトロ転写反応から１つ以上のベクターを単離することは、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムベースの精製、または同様のＲＮＡ精製法のうちの１つ以上を含む。
本明細書ではまた、前記抗原発現系を送達するための先行の組成物の請求項のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、（ａ）ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を与えることと、（ｂ）抗原発現系を与えることと、（ｃ）ナノ粒子状の送達ビヒクル及び抗原発現系が、抗原発現系を送達するための組成物を生成するのに十分な条件を与えることと、を含む方法も提供される。いくつかの態様では、かかる条件は、マイクロ流体混合によって与えられる。
本明細書ではまた、本明細書に開示されるアデノウイルスベクターを製造する方法であって、前記少なくとも１つのプロモーター配列と前記抗原カセットとを含むプラスミド配列を得ることと、前記プラスミド配列を１つ以上の宿主細胞にトランスフェクトすることと、前記１つ以上の宿主細胞から前記アデノウイルスベクターを単離することと、を含む方法も開示される。
いくつかの態様では、単離することは、宿主細胞を溶解してアデノウイルスベクターを含む細胞ライセートを得ることと、細胞ライセートからアデノウイルスベクターを精製することと、を含む。
いくつかの態様では、プラスミド配列は、細菌組換えまたは全ゲノムＤＮＡ合成または細菌細胞内での合成されたＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成のうちの１つを用いて生成される。いくつかの態様では、前記１つ以上の宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、及びＡＥ１－２ａ細胞のうちの少なくとも１つである。いくつかの態様では、細胞ライセートからアデノウイルスベクターを精製することは、クロマトグラフィー分離、遠心分離、ウイルス沈殿、及び濾過のうちの１つ以上を行う。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であってよい。いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの態様では、イオン化可能なアミノ脂質は、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート）分子を含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは抗原発現系を封入する。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、抗原発現系、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質を含み、前記複数のＬＮＰのうち、少なくとも約９５％のＬＮＰは、非層状の形態を有するか、または高電子密度であるかのいずれかである。
いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、（１）リン脂質、及び（２）コレステロールまたはコレステロール誘導体の混合物である。
いくつかの態様では、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体である。いくつかの態様では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ－リン脂質複合体、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成員である。
いくつかの態様では、抗原発現系は、ＬＮＰ中に完全に封入される。
いくつかの態様では、ＬＮＰの非層状の形態は、逆六方晶（ＨＩＩ）または立方晶相構造を含む。
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１．５ｍｏｌ％～約１８ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、非層状の形態を有する。いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、高電子密度である。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、非カチオン性脂質であって、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の４ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成する、前記混合物、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、リン脂質がＬＮＰ中に存在する全脂質の３ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％を構成し、コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成する、混合物、または、ＬＮＰ中に存在する全脂質の４９．５ｍｏｌ％以下であり、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％から４０ｍｏｌ％を構成する前記混合物、のいずれかを含む、前記非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％～８５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１３ｍｏｌ％～４９．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはこれらの混合物を含む。
いくつかの態様では、複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＭＡ）複合体、ＰＥＧ－ジステアロイルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＳＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、複合体のＰＥＧ部分は、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式Ｉの構造：
［式中、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－０（Ｃ＝０）－、－（Ｃ＝０）０－、－Ｃ（＝０）－、－０－、－Ｓ（０）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝０）Ｓ－、－ＳＣ（＝０）－、－ＲａＣ（＝０）－、－Ｃ（＝０）Ｒａ－、－ＲａＣ（＝０）Ｒａ－、－ＯＣ（＝０）Ｒａ－、－ＲａＣ（＝０）０－、または直接的結合であり、Ｇ１は、Ｃｉ～Ｃ２アルキレン、－（Ｃ＝０）－、－０（Ｃ＝０）－、－ＳＣ（＝０）－、－ＲａＣ（＝０）－、または直接的結合であり、－Ｃ（＝０）－、－（Ｃ＝０）０－、－Ｃ（＝０）Ｓ－、－Ｃ（＝０）Ｒａ－、または直接的結合であり、Ｇは、Ｃｉ～Ｃ６アルキレンであり、Ｒａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの場合で、独立して（ａ）ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり、Ｒ７は、Ｃ４～Ｃ２０アルキルであり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８とＲ９とは、それらが結合した窒素原子とともに、５、６、または７員の複素環を形成し、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、それぞれ独立して１～２４の整数であり、ｘは０、１、または２である］を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式ＩＩの構造：
［式中、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して－０（Ｃ＝０）－、－（Ｃ＝０）０－、または炭素－炭素二重結合であり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ３ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの場合で、（ａ）ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり、Ｒ７は、それぞれの場合で、独立してＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、非置換のＣ１～Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８とＲ９とは、それらが結合した窒素原子とともに、１個の窒素原子を含む５、６、または７員の複素環を形成し、ａ及びｄは、それぞれ独立して０～２４の整数であり、ｂ及びｃはそれぞれ独立して１～２４の整数であり、ｅは１または２であり、ただし、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、またはＲ４ａのうちの少なくとも１つが、Ｃ１～Ｃ１２アルキルであるか、またはＬ１またはＬ２の少なくとも一方が、－０（Ｃ＝０）－または－（Ｃ＝０）０－であり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルでなく、ａが８である場合にはｎ－ブチルでない］を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、中性脂質、ステロイド、及びポリマー結合脂質を含む１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの態様では、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、中性脂質はＤＳＰＣである。
いくつかの態様では、化合物と中性脂質とのモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。
いくつかの態様では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの態様では、化合物とコレステロールとのモル比は、約２：１～１：１の範囲である。
いくつかの態様では、ポリマー結合脂質はＰＥＧ化脂質である。いくつかの態様では、化合物とＰＥＧ化脂質とのモル比は、約１００：１～約２５：１の範囲である。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧポリエチレン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧ－スクシノイル－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ｃｅｒ、またはＰＥＧジアルキルオキシプロピルカルバメートである。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、下記構造式ＩＩＩ：
［式中、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は場合により１つ以上のエステル結合によって中断され、ｚは、３０～６０の範囲の平均値を有する］を有するか、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、もしくは立体異性体である。いくつかの態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの態様では、ｚの平均は、約４５である。
ここから開始
ここから開始
いくつかの態様では、ＬＮＰは、ポリアニオン性の核酸と混合される際に非二重層構造に自己組織化する。いくつかの態様では、非二重層構造は、６０ｎｍ～１２０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、非二重層構造は、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、または約１００ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは、約１００ｎｍの直径を有する。
本明細書ではまた、上記に記載のヌクレオチド配列のいずれかを含むベクターまたはベクターのセットも提供される。本明細書ではまた、本明細書に開示される単離ヌクレオチド配列を含むベクターも開示される。
本明細書ではまた、本明細書に記載のヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞であって、場合により、前記細胞が、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａ細胞である、単離細胞も提供される。
本明細書ではまた、本明細書に記載の組成物のいずれかと、使用説明書と、を含むキットも提供される。本明細書ではまた、本明細書に開示されるベクターまたは組成物と、使用説明書と、を含むキットも開示される。
本明細書では、Ｃｏｖｉｄ－１９に罹患した対象を治療するための方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のいずれか、または本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを投与することを含む、方法も提供される。
本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているかまたは感染のリスクのある対象を治療するための方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のいずれか、または本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを投与することを含む、方法も提供される。
本明細書ではまた、対象の免疫応答を刺激するための方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のいずれかまたは医薬組成物のいずれかを投与することを含む、方法も提供される。
本明細書ではまた、対象を治療するための方法であって、対象に、本明細書に開示されるベクター、または本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む方法も開示される。
本明細書では、上記の組成物のいずれかの１つ以上のベクターを製造する方法も提供される。
本明細書ではまた、本明細書に開示される組成物のいずれかを製造する方法も提供される。
本発明のこれらの、ならびに他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明文、及び添付図面を参照することでより深い理解がなされるであろう。
詳細な説明
Ｉ．定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
Ｉ．定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書で使用するところの「抗原」という用語は、免疫反応を刺激する物質のことである。抗原は、特定の集団、例えば、感染症を有する、または感染のリスクのあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者の特定の集団間にみられる抗原である「共有抗原」であってよい。
本明細書において使用するところの「抗原ベースワクチン」という用語は、１つ以上の抗原、例えば複数の抗原に基づいたワクチン組成物のことである。ワクチンは、ヌクレオチドベース（例えば、ウイルスベース、ＲＮＡベース、またはＤＮＡベース）、タンパク質ベース（例えば、ペプチドベース）、またはこれらの組み合わせであってよい。
本明細書において使用するところの「候補抗原」という用語は、抗原を表しうる配列を生じる変異または他の異常のことである。
本明細書において使用するところの「コード領域」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の部分（複数可）のことである。
本明細書において使用するところの「コード変異」という用語は、コード領域で生じる変異のことである。
本明細書において使用するところの「ＯＲＦ」という用語は、オープンリーディングフレームを意味する。
本明細書において使用するところの「ミスセンス変異」という用語は、１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」という用語は、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすか、またはカノニカル開始コドンの除去を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」という用語は、タンパク質のフレームに変更を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「インデル」という用語は、１つ以上の核酸の挿入または欠失である。
本明細書において使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列との関連での「同一率」（％）という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査により測定される、最大の一致について比較し、整列させた場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の比率（％）が同じである２つ以上の配列または部分配列のことを指す。用途に応じて、「同一率」（％）は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在するか、あるいは、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
配列比較では、一般的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一率（％）を算出する。あるいは、配列の類似性または相違性は、選択された配列位置（例えば、配列モチーフ）における特定のヌクレオチドの、または翻訳後の配列ではアミノ酸の有無の組み合わせによって確立することもできる。
比較を行うための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性の探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施することができる（一般的には、下記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照）。
配列同一率（％）及び配列類似率（％）を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公に入手可能である。
本明細書において使用される場合、「ノンストップまたはリードスルー」という用語は、天然の終止コドンの除去を引き起こす変異のことである。
本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体が一般的に結合する、抗原の特異的な部分のことである。
本明細書において使用される場合、「免疫原性」という用語は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはその両方を介して免疫応答を刺激する能力のことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ結合親和性」、「ＭＨＣ結合親和性」という用語は、特異的な抗原と特異的なＭＨＣアレルとの結合の親和性を意味する。
本明細書において使用される場合、「ベイト」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの特定の配列を試料から濃縮するために使用される核酸プローブのことである。
本明細書において使用される場合、「変異」という用語は、対象の核酸と、対照として使用される参照ヒトゲノムとの差である。
本明細書において使用される場合、「変異コール」という用語は、典型的にはシークエンシングからの、変異の存在のアルゴリズム的決定である。
本明細書において使用される場合、「多型」という用語は、生殖細胞系列変異、すなわち、個体のすべてのＤＮＡ保有細胞において見出される変異である。
本明細書において使用される場合、「体細胞変異」という用語は、個体の非生殖系列細胞において生じる変異である。
本明細書において使用される場合、「アレル」という用語は、遺伝子の１つのバージョンまたは遺伝子配列の１つのバージョンまたはタンパク質の１つのバージョンのことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ型」という用語は、ＨＬＡ遺伝子アレルの相補体のことである。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異依存分解機構」または「ＮＭＤ」という用語は、未成熟な終止コドンに起因する細胞によるｍＲＮＡの分解のことである。
本明細書において使用される場合、「エクソーム」という用語は、タンパク質をコードするゲノムのサブセットである。エクソームは、ゲノムの集合的なエクソンでありうる。
本明細書において使用される場合、「ロジスティック回帰」という用語は、従属変数が１に等しい確率のロジットが従属変数の線形関数としてモデル化される、統計からのバイナリデータ用の回帰モデルである。
本明細書において使用される場合、「ニューラルネットワーク」という用語は、多層の線形変換に続いて一般的に確率的勾配降下法及び逆伝搬により訓練された要素ごとの非線形変換を行うことからなる分類または回帰のための機械学習モデルである。
本明細書において使用される場合、「プロテオーム」という用語は、細胞、細胞の群、または個体によって発現される、及び／または翻訳されるすべてのタンパク質のセットのことである。
本明細書において使用される場合、「ペプチドーム」という用語は、細胞表面上のＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩによって提示されるすべてのペプチドのセットのことである。ペプチドームは、細胞または細胞の集合の性質を指す場合もある（例えば、感染症ペプチドームは、感染症に感染したすべての細胞のペプチドームの集合を意味する）。
本明細書において使用される場合、「ＥＬＩＳＰＯＴ」という用語は、ヒト及び動物において免疫応答を観察するための一般的な方法である、酵素結合免疫吸着スポットアッセイを意味する。
本明細書において使用される場合、「デキサトラマー」という用語は、フローサイトメトリーにおいて抗原特異的Ｔ細胞染色に使用される、デキストランベースのペプチド－ＭＨＣマルチマーである。
本明細書において使用される場合、「寛容または免疫寛容」という用語は、１つ以上の抗原、例えば、自己抗原に対する免疫不応答の状態のことである。
本明細書において使用される場合、「中枢性寛容」という用語は、自己反応性Ｔ細胞クローンを欠失させること、または自己反応性Ｔ細胞クローンの免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を促進することのいずれかにより、胸腺において与えられる寛容である。
本明細書において使用される場合、「末梢性寛容」という用語は、中枢性寛容を生き延びた自己反応性Ｔ細胞を下方制御もしくはアネルギー化すること、またはこれらのＴ細胞のＴｒｅｇへの分化を促進することにより、末梢系において与えられる寛容である。
「試料」という用語は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、もしくは介入、または当技術分野において公知の他の手段を含む手段によって対象から採取された、単一細胞、または複数の細胞、または細胞の断片、または体液のアリコートを含むことができる。
「対象」という用語は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ、雄または雌のいずれかの、細胞、組織、または生物体、ヒトまたは非ヒトを包含する。対象という用語は、ヒトを含む哺乳動物を含める。
「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、それらに限定されない。
「臨床的因子」という用語は、対象の状態、例えば、疾患の活性または重症度の測定を指す。「臨床的因子」は、非試料マーカーを含む、対象の健康状態のすべてのマーカー、ならびに／または、非限定的に年齢及び性別などの、対象の他の特徴を包含する。臨床的因子は、対象または所定の条件下の対象由来の試料（または試料の集団）の評定から取得され得るスコア、値、または値のセットであることができる。臨床的因子はまた、マーカー、及び／または遺伝子発現代替物などの他のパラメータによっても予測することができる。臨床的因子は、感染のタイプ（例えば、コロナウイルス種）、感染のサブタイプ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント）、及び病歴を含むことができる。
「感染由来の抗原コード核酸配列」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲによって感染細胞または感染症生物から得られた核酸配列、または、感染細胞または感染症生物をシークエンシングした後、例えば当該技術分野では周知の様々な合成法もしくはＰＣＲに基づく方法によりシークエンシングデータを利用して核酸配列を合成することによって得られた配列データのことを指す。得られる配列は、対応する天然の感染症生物の核酸配列と同じポリペプチド配列をコードする、配列最適化された核酸配列バリアント（例えば、コドン最適化及び／または他の形で発現が最適化された）などの核酸配列バリアントを含み得る。得られる配列は、天然の感染症生物のポリペプチド配列に対して１つ以上の（例えば、１、２、３、４、または５個の）変異を有する、改変された感染症生物のペプチド配列をコードする核酸配列バリアントを含み得る。例えば、改変されたポリペプチド配列は、感染症生物のタンパク質の天然ポリペプチド配列に対して１つ以上のミスセンス変異を有することができる。
「免疫原性ポリペプチドをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスから得られた核酸配列、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染細胞をシークエンシングした後、例えば当該技術分野では周知の様々な合成法もしくはＰＣＲに基づく方法によりシークエンシングデータを利用して核酸配列を合成することによって得られた配列データのことを指す。得られる配列は、対応する天然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸配列と同じポリペプチド配列をコードする、配列最適化された核酸配列バリアント（例えば、コドン最適化及び／または他の形で発現が最適化された）などの核酸配列バリアントを含み得る。得られる配列は、天然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチド配列に対して１つ以上の（例えば、１、２、３、４、または５個の）変異を有する、改変されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド配列をコードする核酸配列バリアントを含み得る。例えば、改変スパイクポリペプチド配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の天然のスパイクポリペプチド配列に対するＲ６８２、Ｒ８１５、Ｋ９８６Ｐ、またはＶ９８７Ｐの１つ以上のミスセンス変異などの１つ以上の変異を有することができる。
「アルファウイルス」という用語は、トガウイルス科のメンバーのことを指し、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。アルファウイルスは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモーガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ－８３などの新世界型に分類される。アルファウイルスは一般的には自己複製ＲＮＡウイルスである。
「アルファウイルス骨格」という用語は、ウイルスゲノムの自己複製を可能とするアルファウイルスの最小配列（複数可）のことを指す。最小配列としては、非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及びポリＡ配列、ならびに、サブゲノムプロモーター（例えば、２６Ｓプロモーター因子）をはじめとするサブゲノミックウイルスＲＮＡの発現用の配列を挙げることができる。
「非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列」という用語には、当該技術分野では周知のアルファウイルス保存配列因子（ＣＳＥ）が含まれる。ＣＳＥとしては、これらに限定されるものではないが、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１－ｎｔ ＣＳＥ、２４－ｎｔ ＣＳＥ、サブゲノムプロモーター配列（例えば２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列）、１９－ｎｔ ＣＳＥ、及びアルファウイルス３’ＵＴＲが挙げられる。
「ＲＮＡポリメラーゼ」という用語には、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡポリヌクレオチドの生成を触媒するポリメラーゼが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６を含むバクテリオファージ由来ポリメラーゼが挙げられる。
「脂質」という用語には、疎水性及び／または両親媒性分子が含まれる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。脂質は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、脂肪、及び脂溶性ビタミンを含みうる。脂質には、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）及びＭＣ３様分子も含まれうる。
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語には、リポソームとも呼ばれる、水性の内部を包囲する脂質含有膜を用いて形成された小胞様構造が含まれる。脂質ナノ粒子は、界面活性剤により安定化された固体脂質コアを有する脂質ベースの組成物を含む。コア脂質は、脂肪酸、アシルグリセロール、ワックス、及びこれらの界面活性剤の混合物であってよい。リン脂質、スフィンゴミエリン、胆汁酸（タウロコール酸）、及びステロール類（コレステロール）のような生体膜脂質を安定化剤として用いることができる。脂質ナノ粒子は、１種類以上のカチオン性、アニオン性、または中性脂質の規定の比率を含む（ただし、これに限定されない）、規定の比率の異なる脂質分子を用いて形成することができる。脂質ナノ粒子は、外膜シェル内に分子を封入することができ、その後、標的細胞と接触させて封入分子を宿主細胞のサイトゾルに送達することができる。脂質ナノ粒子は、それらの表面などを非脂質分子で修飾または官能化することができる。脂質ナノ粒子は、単一層（単層）または多層（複層）とすることができる。脂質ナノ粒子は、核酸と複合体化することができる。単層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となる。複層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となるか、またはその間を形成するかまたはその間に挟まれる。
略語：ＭＨＣ：主要組織適合性複合体；ＨＬＡ：ヒト白血球抗原、またはヒトＭＨＣ遺伝子座；ＮＧＳ：次世代シークエンシング；ＰＰＶ：陽性適中率；ＴＳＮＡ：腫瘍特異的新生抗原；ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋；ＮＭＤ：ナンセンス変異依存分解機構；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺がん；ＤＣ：樹状細胞。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈によってそうでない旨が明示されない限り、複数の指示物を含む点に留意されたい。
特に断らない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される「約」という用語は、例えば、平均から標準偏差２つ分以内など、当該技術分野における公称公差の範囲内にあるものとして理解される。「約」は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書に示される全ての数値は「約」という語によって修飾されている。
本明細書において直接定義されていない用語は、本発明の技術分野の範囲内で理解されるような、一般的にそれらに付随する意味を有するものとして理解されるべきである。本発明の態様の組成物、装置、方法など、ならびにそれらの製造または使用法を説明するうえで実施者にさらなる手引きを与える目的で特定の用語が本明細書で検討される。同じものについて複数の言い方がなされうる点は認識されるであろう。したがって、代替的な語及び同義語が、本明細書で検討される用語の任意の１つ以上について用いられる場合がある。本明細書においてある用語が詳述または検討されているか否かに重きが置かれるべきではない。いくつかの同義語または代用可能な方法、材料などが提供される。１つまたは数個の同義語または均等物の記載は、明確に述べられない限り、他の同義語または均等物の使用を除外しない。用語の例を含む例の使用は、あくまで説明を目的としたものにすぎず、本明細書における発明の態様の範囲及び意味を限定しない。
本明細書の本文において引用されるすべての参照文献、発行特許、及び特許出願は、あらゆる目的でそれらの全容を参照により本明細書に援用するものである。
ＩＩ．抗原の特定
腫瘍の及び正常なエクソーム及びトランスクリプトームのＮＧＳ解析の研究モデルについては、これまでに記載されており、抗原特定空間で適用される。６，１４，１５臨床状況における抗原特定の感度及び特異性を高めるための特定の最適化を考慮することができる。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するものと、ＮＧＳデータ解析に関連するものの２つの領域に分類することができる。記載される研究法は、感染症生物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、対象の感染症、または対象の感染細胞からの特定など、他の状況での抗原の特定にも適用することができる。最適化の例は当業者には周知のものであり、例えば、そのような方法が、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号、米国特許出願第１６／６０６，５７７号、ならびに国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２１５０８号により詳細に記載されている。
腫瘍の及び正常なエクソーム及びトランスクリプトームのＮＧＳ解析の研究モデルについては、これまでに記載されており、抗原特定空間で適用される。６，１４，１５臨床状況における抗原特定の感度及び特異性を高めるための特定の最適化を考慮することができる。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するものと、ＮＧＳデータ解析に関連するものの２つの領域に分類することができる。記載される研究法は、感染症生物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、対象の感染症、または対象の感染細胞からの特定など、他の状況での抗原の特定にも適用することができる。最適化の例は当業者には周知のものであり、例えば、そのような方法が、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号、米国特許出願第１６／６０６，５７７号、ならびに国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２１５０８号により詳細に記載されている。
抗原（例えば、感染症生物に由来する抗原）を特定するための方法は、細胞表面上に提示される（例えば、感染細胞、または、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む免疫細胞上のＭＨＣにより提示される）可能性が高い、及び／または免疫原性を有する可能性が高い抗原を特定することを含む。例として、かかる方法の１つは、感染細胞または感染症生物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データを用いて抗原（例えば、感染症生物に由来する抗原）のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータが得られる、前記エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程と、各抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力して抗原のそれぞれが、対象の感染細胞などの細胞表面の１つ以上のＭＨＣアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記数値的尤度のセットを生成する工程と、前記数値的尤度のセットに基づいて抗原のセットのサブセットを選択して、選択された抗原のセットを生成する工程と、を含む。
ＩＶ．抗原
抗原は、ヌクレオチドまたはポリペプチドを含みうる。例えば、抗原は、ポリペプチド配列をコードするＲＮＡ配列であってよい。したがって、ワクチンにおいて有用な抗原には、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が含まれる。
抗原は、ヌクレオチドまたはポリペプチドを含みうる。例えば、抗原は、ポリペプチド配列をコードするＲＮＡ配列であってよい。したがって、ワクチンにおいて有用な抗原には、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が含まれる。
本明細書では、対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、または対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞に関連した任意のポリペプチドに由来するペプチド及びペプチドをコードした核酸を開示する。抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に由来するものであってよい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のポリペプチド配列としては、これらに限定されるものではないが、表Ａに示される予測されたＭＨＣクラスＩエピトープ、表Ｂに示される予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープ、表Ｃに示される予測されたＭＨＣクラスＩエピトープ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクペプチド（配列番号５９に由来するペプチド）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ペプチド（配列番号６１に由来するペプチド）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドペプチド（配列番号６２に由来するペプチド）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープペプチド（配列番号６３に由来するペプチド）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２レプリカーゼｏｒｆ１ａ及びｏｒｆ１ｂペプチド［非構造タンパク質（ｎｓｐ）１～１６のうちの１つ以上のものなど］、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによってコードされる他の任意のペプチド配列が挙げられる。ペプチド及びペプチドをコードする核酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照配列（配列番号７６、あらゆる目的で本明細書に参照により援用するＮＣ＿０４５５１２．２）と呼ばれる場合もある、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに由来するものとすることができる。ペプチド及びペプチドをコードする核酸配列は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１アイソレートを基準としてタンパク質に１つ以上の変異を有するアイソレート（タンパク質バリアントとも呼ばれる）のような、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートとは異なるアイソレートに由来するものとすることができる。ワクチン接種戦略は、異なるアイソレートに由来するペプチド及びペプチドをコードした核酸配列を含む複数のワクチンを含むことができる。例えば、例示的な非限定例として、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレート由来のスパイクタンパク質をコードしたワクチンを投与し、その後、Ｂ．１．３５１（「南アフリカ」）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレート（例えば、配列番号１１２）由来またはＢ．１．１．７（「南アフリカ」） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレート（例えば、配列番号１１０）由来のスパイクタンパク質をコードしたワクチンを投与することができる。１つ以上のバリアントとしては、これらに限定されるものではないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２レプリカーゼｏｒｆ１ａ及びｏｒｆ１ｂタンパク質［非構造タンパク質（ｎｓｐ）１～１６のうちの１つ以上のものなど］、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによってコードされる他の任意のタンパク質における変異が挙げられる。バリアントは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプ／アイソレートの１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上に存在する変異／バリアントなど、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプ／アイソレート間の変異の頻度に基づいて選択することができる。アイソレートの１％よりも多くにみられる変異の例を表１に示す。バリアントは、特定の人口統計学的または地理的集団のような、特定の集団に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプ／アイソレート間の変異の頻度に基づいて選択することができる。高頻度のバリアント／変異の例示的な非限定例としては、全世界でシークエンシングされているゲノムの６０．０５％に、また、ヨーロッパ及び北米ではそれぞれ７０．４６％及び５８．４９％にみられるスパイクＤ６１４Ｇミスセンス変異がある。したがって、ワクチンは、例えば、特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプ／アイソレートによる感染のリスクのある特定の人口統計学的または地理的集団用の予防的ワクチンで使用するため、対象が感染している、または感染のリスクのあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプによりコードされたポリペプチドに対応した少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードするように設計することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされたポリペプチドに対応する少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドと、例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）２００２に関連した種（あらゆる目的で本明細書に参照により援用するＮＣ＿００４７１８．３）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）２０１２に関連した種（あらゆる目的で本明細書に参照により援用するＮＣ＿０１９８４３．３）など、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種によってコードされたポリペプチドに対応する少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドと、をコードするように設計することができる。ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）種などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存された（例えば、エピトープ間のアミノ酸配列保存率が１００％）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされるポリペプチドに対応する少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードするように設計することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープとしては、コロナウイルススパイクタンパク質、コロナウイルス膜タンパク質、コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質、コロナウイルスエンベロープタンパク質、コロナウイルスレプリカーゼｏｒｆ１ａ及びｏｒｆ１ｂタンパク質［非構造タンパク質（ｎｓｐ）１～１６のうちの１つ以上のものなど］、または例えば、図２７に示されるような、コロナウイルスによってコードされる他の任意のタンパク質配列を挙げることができる。
感染細胞または樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む免疫細胞などの細胞の細胞表面状に提示されることが予測される抗原を選択することができる。免疫原性を有することが予測される抗原を選択することができる。本明細書に記載される方法を用いてＭＨＣによって細胞表面に提示されると予測される例示的な抗原としては、表Ａに示される予測されたＭＨＣクラスＩエピトープ、表Ｂに示される予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープ、及び表Ｃに示される予測されたＭＨＣクラスＩエピトープが挙げられる。
文献（例えば、Ｎｅｌｄｅ ｅｔ ａｌ．［Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ２２，ｐａｇｅｓ７４－８５ ２０２１］，Ｔａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．２０２１，またはＳｃｈｅｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．［ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０８．１３．２４９４３３］）で以前に報告／検証されているものなど、特定のＨＬＡによって提示され、及び／または免疫応答を刺激することが検証されている抗原を選択することができる。免疫応答の刺激の大きさを用いて、カセットがサイズ制約を有する場合を含め、できるだけ強い免疫応答を刺激するエピトープを選択する目的などで、エピトープ／抗原の選択を導くことができる。免疫応答の刺激の大きさに基づいた選択の例示的な非限定例として、以下を用いることができる：（１）個人の応答の大きさは、それぞれのディプロタイプアレルにわたったすべてのエピトープの応答の大きさの合計であり、（２）各エピトープの応答の大きさ＝（応答の大きさ）×（正の応答の頻度／１００）［例えば、あらゆる目的で本明細書に参照により援用する、Ｔａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．にみられる値を使用する（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ ｃａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ Ｍｅｄ． ２０２１ Ｆｅｂ １６；２（２）：１００２０４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｘｃｒｍ．２０２１．１００２０４．Ｅｐｕｂ ２０２１ Ｊａｎ ２６．）］、（３）頻度が５％よりも高い変異にわたった出発タンパク質からのエピトープ以外のエピトープの除外（場合によりフランキング領域内の変異は許容される）、及び／または（４）本明細書に記載されるように、カセットの順序は、隣接フレームにまたがる意図しないジャンクションエピトープが最小となるよう、また、機能性タンパク質フラグメントが生じる可能性を低減するため、同じタンパク質内の連続したフレームが最小となるように決定される。
カセットは、１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有しているものをコードするように構成することができる。カセットは、１つ以上の検証済みエピトープ及び少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有しているものをコードするように構成することができる。
抗原ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドは、以下のうちの少なくとも１つを含むことができる：１０００ｎＭ未満のＩＣ５０値でのＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩペプチドについてはアミノ酸８～１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、プロテアソーム切断を促進するペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドについてはアミノ酸６～３０個、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、細胞外もしくはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン）によるペプチド促進切断部位またはＨＬＡ－ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合部位内またはその近くの配列モチーフの存在。
１つ以上の抗原は、感染細胞の表面上に存在することができる（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞）。
１つ以上の抗原が、感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を有するか有することが疑われる対象で免疫原性でありうる（例えば、対象のＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を刺激することができる）。１つ以上の抗原が、感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のリスクがある対象で免疫原性でありうる（例えば、感染症に特異的なメモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、または抗体の産生を刺激するなど、感染症に対する免疫学的防御（すなわち、免疫）を与える対象のＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を刺激することができる）。
１つ以上の抗原が、１つ以上の抗原を認識する抗体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原及び／またはウイルスを認識する抗体）の産生などのＢ細胞応答を刺激することが可能な場合がある。抗体は、直鎖状ポリペプチド配列を認識するか、または二次及び三次構造を認識することができる。したがって、Ｂ細胞の抗原としては、これらに限定されるものではないが、完全長タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質ドメイン、または二次及び三次構造を有することが知られているかもしくは予測される任意のポリペプチドを含む直鎖状ポリペプチド配列または二次及び三次構造を有するポリペプチドを挙げることができる。感染に対するＢ細胞応答を刺激することができる抗原は、感染症生物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の表面に見出すことができる。感染に対するＢ細胞応答を刺激することができる抗原は、感染症生物で発現される細胞内抗原であり得る。感染に対するＢ細胞応答を刺激することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原としては、これらに限定されるものではないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドペプチド、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープペプチドが挙げられる。
１つ以上の抗原は、Ｔ細胞応答を刺激することができる抗原（例えば、予測されるＴ細胞エピトープ配列を含むペプチド）と、Ｂ細胞応答を刺激することができる異なる抗原（例えば、完全長タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質ドメイン）との組み合わせを含むことができる。
対象において自己免疫応答を刺激する１つ以上の抗原は、対象のためのワクチン生成との関連において考察から除外することができる。
少なくとも１つの抗原性ペプチド分子（例えば、エピトープ配列）のサイズは、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、またはそれよりも多いアミノ分子残基、及びこれらの範囲から導出される任意の範囲を含むことができるが、それらに限定されない。具体的な実施形態において、抗原性ペプチド分子は、アミノ酸５０個以下である。
抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩについては長さが１５残基以下で、通常約８～約１１残基の間からなり、特に９または１０残基であることができ；ＭＨＣクラスＩＩについては、６～３０残基であることができる。
望ましい場合、より長いペプチドを、いくつかのやり方において設計することができる。１つの例において、ＨＬＡアレル上のペプチドの提示尤度が予測されるかまたは公知である場合、より長いペプチドは、（１）各々の対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に向かって２～５アミノ酸の伸長を有する個々の提示されるペプチド；（２）各々について伸長した配列を有する、提示されるペプチドのいくつかまたはすべての連鎖のいずれかからなることができる。別の場合では、シークエンシングによって長い（１０個よりも多い残基）エピトープ配列の存在が判明した場合、より長いペプチドは、（３）新規な感染症特異的アミノ酸のストレッチ全体からなる（これにより、最も強くＨＬＡ提示されるより短いペプチドを計算またはインビトロ試験選択に基づいて選択する必要がない）。いずれの場合も、より長いペプチドは、患者細胞による内因性プロセシングを可能とし、より効果的な抗原提示をもたらし、Ｔ細胞応答の増加をもたらし得る。より長いペプチドは、感染症生物で発現されるものなど、完全長タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質ドメイン、及びそれらのペプチドの組み合わせも含み得る。Ｂ細胞応答を刺激するためにより長いペプチド（例えば、完全長タンパク質、タンパク質サブユニット、またはタンパク質ドメイン）及びそれらの組み合わせを含めることができる。
抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質上に提示されることができる。いくつかの態様において、抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、野生型ペプチドよりも高い親和性でＨＬＡタンパク質上に提示される。いくつかの態様において、抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも１０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれよりも小さいＩＣ５０を有することができる。
いくつかの態様において、抗原性ペプチド及びポリペプチドは、対象に投与された場合に、自己免疫応答を刺激せず、及び／または免疫寛容を引き起こさない。
少なくとも２つ以上の抗原性ペプチドを含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも２つの異なるペプチドを含む。少なくとも２つの異なるペプチドは同じポリペプチドに由来するものであってよい。異なるペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方において異なることを意味する。ペプチドは、感染症生物に関連することが知られているかもしくは疑われる任意のポリペプチドに由来するものとするか、またはペプチドは、正常細胞または組織と比較して感染細胞で発現が変化していることが知られているかもしくは見出されている任意のポリペプチド（例えば、宿主細胞に発現が制限されている感染症ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む感染症ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）に由来するものとすることができる。
望ましい活性または性質を有する抗原性ペプチド及びポリペプチドは、望ましいＭＨＣ分子に結合して適切なＴ細胞を活性化する非改変ペプチドの生物学的活性を増大させるかまたは実質的にそのすべてを少なくとも保持しつつ、特定の望ましい属性、例えば、改善された薬理学的特徴を与えるように改変することができる。例として、抗原性ペプチド及びポリペプチドを、保存的または非保存的のいずれかの置換などの、種々の改変にさらに供することができ、そのような改変は、改善されたＭＨＣ結合、安定性、または提示などの、それらの使用におけるある特定の利点を提供し得る。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似している別のもので、例えば、１つの疎水性残基を別の疎水性残基、または１つの極性残基を別の極性残基で置き換えることを意味する。置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ－アミノ酸を用いて探査してもよい。そのような改変は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１－２８４（１９７９）；及びＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載されているように、周知のペプチド合成手順を用いて行うことができる。
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチド及びポリペプチドの改変は、インビボでのペプチド及びポリペプチドの安定性の増大に特に有用である場合がある。安定性は多くの方法でアッセイすることができる。例として、ペプチダーゼ、ならびに、ヒト血漿及び血清などの種々の生物学的媒質が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１－３０２（１９８６）を参照されたい。ペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて好都合に決定することができる。プロトコールは、概して以下のようなものである。プールしたヒト血清（タイプＡＢ、非熱不活性化）を、使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清を、ＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用する。あらかじめ決定された時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、６％水性トリクロロ酢酸またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却（４℃）し、次いで、スピンして沈降血清タンパク質を沈殿させる。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いた逆相ＨＰＬＣによって決定する。
ペプチド及びポリペプチドを、改善された血清半減期以外の望ましい属性を提供するために修飾することができる。例として、ＣＴＬ活性を刺激するペプチドの能力を、Ｔヘルパー細胞応答を刺激することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列への連結によって増強することができる。免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結することができる。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下で実質的に無電荷である、アミノ酸またはアミノ酸模倣物などの相対的に小さな中性分子から構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または、非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基から構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが、理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１または２残基、より通常は、３～６残基であろう。あるいは、ペプチドを、スペーサーなしでＴヘルパーペプチドに連結することができる。
ポリペプチドコード抗原は、プロテアーゼ切断及び／または他の翻訳後プロセシングのようなポリペプチドのプロセシングを変化させるように改変することができる。ポリペプチドコード抗原は、抗原が特定のコンフォメーションをとりやすくなるように改変することができる。ポリペプチドコード抗原は、例えば二次及び三次構造（例えばα螺旋またはβシートの形成）を妨げるプロリンの導入などにより、変異（例えば、１つ以上のミスセンス変異）が抗原の特定のコンフォメーションを妨げるように改変することができる。プロセシングまたはコンフォメーション変化を変化させる、減少させる、または消失させることで、一部の場合では、中和抗体産生に有利な状態をとるように抗原がバイアスされる。一連の例示的な例では、アミノ酸６８２、８１５、９８７、及び９８８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク変異を操作することで、スパイクタンパク質を、抗体媒介中和にとって潜在的に好ましい状態である前融合状態に主として維持されるようにバイアスさせる。具体的には、理論によって束縛されることを望むものではないが、Ｒ６８２の変異（例えばＲ６８２Ｖ）は、スパイクのＳ１とＳ２へのプロセシングに関与するフーリン切断部位を破壊し、Ｒ８１５の変異（例えばＲ８１５Ｎ）は、Ｓ２内の切断部位を破壊し、Ｋ９８６及びＶ９８７の変異（例えば２個のプロリンを導入するＫ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ）はスパイクの二次構造を妨げ、スパイクが前融合状態から後融合状態にプロセシングされにくくする。したがって、抗原カセットは、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１アイソレートを基準としてスパイクＲ６８２Ｖ変異、スパイクＲ８１５Ｎ変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びそれらの組み合わせを有する改変スパイクタンパク質をコードすることができる（配列番号５９の参照配列及び変異を有する配列番号６０／配列番号９０を参照）。改変ポリペプチド配列は、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチド配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％同一であってよい。改変ポリペプチド配列は、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチド配列と少なくとも９１％、９２％、９３％または９４％同一であってよい。改変ポリペプチド配列は、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。改変ポリペプチド配列は、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチド配列と少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％同一であってよい。
抗原性ペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接またはスペーサーを介してのいずれかでＴヘルパーペプチドに連結することができる。抗原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端を、アシル化することができる。例示的なＴヘルパーペプチドは、破傷風トキソイドの８３０～８４３、インフルエンザの３０７～３１９、マラリアスポロゾイトの周囲３８２～３９８及び３７８～３８９を含む。
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技法を通したタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然由来源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。種々の遺伝子に対応する、ヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ処理されたデータベースで見出すことができる。１つのそのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのウェブサイトに位置する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示する技法を用いて、または当業者に公知であるように、増幅及び／または発現させることができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの種々の商業的調製物が、当業者に公知である。
さらなる態様において、抗原は、抗原性ペプチドまたはその一部をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、例えば、ホスホロチオアートバックボーンを有するポリヌクレオチドなどの、ポリヌクレオチドの一本鎖及び／もしくは二本鎖、または天然形態もしくは安定化形態のいずれか、または、それらの組み合わせであることができ、イントロンを含有してもよく、または含有しなくてもよい。抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、転写、翻訳、転写後プロセシング、及び／またはＲＮＡ安定性を改善することなどにより、発現を改善するために配列最適化することができる。例えば、抗原をコードするポリヌクレオチド配列はコドン最適化することができる。本明細書では「コドン最適化」とは、特定の生物のコドンバイアスに関して、低頻度で用いられるコドンを高頻度で用いられる同義コドンに置換することを指す。ポリヌクレオチド配列は、転写後プロセシングを改善するために最適化することができ、例えば、好ましいスプライシング事象にバイアスするように、スプライシングモチーフ（例えば、カノニカル及び／またはクリプティック／非カノニカルスプライスドナー、ブランチ、及び／またはアクセプター配列）の除去、及び／または外因性スプライシングモチーフ（スプライスドナー、ブランチ、及び／またはアクセプター配列）の導入などにより、意図しないスプライシングを減少させるように最適化することができる。外因性イントロン配列としては、これらに限定されるものではないが、ＳＶ４０に由来するもの（例えば、ＳＶ４０ミニイントロン［配列番号８８］）及び／または免疫グロブリンに由来するもの（例えば、ヒトβ－グロブリン遺伝子）が挙げられる。外因性イントロン配列は、プロモーター／エンハンサー配列と抗原（複数可）配列との間に組み込むことができる。発現ベクターで使用するための外因性イントロン配列は、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用するＣａｌｌｅｎｄｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７ Ｊｕｌ ５；３６３（２）： ２８８－３０２）により詳細に記載されている。ポリヌクレオチド配列は、例えば、ＲＮＡ安定性モチーフ（例えば、ＡＵリッチエレメント及び／または３’ＵＴＲモチーフ）及び／または反復ヌクレオチド配列の除去により転写物安定性を改善するように最適化することができる。ポリヌクレオチド配列は、例えば、クリプティックな転写イニシエーター及び／またはターミネーターの除去によって正確な転写を改善するように最適化することができる。ポリヌクレオチド配列は、例えば、クリプティックなＡＵＧ開始コドン、未成熟ポリＡ配列、及び／または二次構造モチーフの除去によって翻訳及び翻訳精度を改善するように最適化することができる。ポリヌクレオチド配列は、恒常的輸送エレメント（ＣＴＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）の付加などによって、転写物の核外輸送を改善するように最適化することができる。発現ベクターで使用するための核外輸送シグナルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用するＣａｌｌｅｎｄｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７ Ｊｕｌ ５；３６３（２）： ２８８－３０２）により詳細に記載されている。ポリヌクレオチド配列は、例えば、特定の生物の平均ＧＣ含量を反映するように、ＧＣ含量に関して最適化することができる。配列最適化によって、転写、翻訳、転写後プロセシング、及び／またはＲＮＡ安定性などの１つ以上の配列特性のバランスをとることができる。配列最適化によって、転写、翻訳、転写後プロセシング、及びＲＮＡ安定性のそれぞれのバランスをとる最適配列を生成することができる。配列最適化アルゴリズムは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（ＩＤＴ）、Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ、ＳＧＩ－ＤＮＡ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの当業者には周知のものである。抗原コードタンパク質の１つ以上の領域を別々に配列最適化することができる。非限定的な例示的な例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、タンパク質のＳ１領域において配列最適化（または非最適化）することができ、Ｓ２領域は別に最適化される（例えば、異なるアルゴリズムを使用して最適化されるか、かつ／またはＳ２領域に固有の１つ以上の配列特性について最適化される）。
本明細書に開示される方法はまた、サブセットの中の抗原のうちの少なくとも１つに対して抗原特異的な１つ以上のＴ細胞を特定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、特定は、１つ以上の抗原特異的Ｔ細胞を増殖させる条件下で１つ以上のＴ細胞をサブセットの中の抗原のうちの１つ以上と共培養することを含む。さらなる実施形態では、特定は、１つ以上のＴ細胞を、サブセットの中の抗原のうちの１つ以上を含むテトラマーと、Ｔ細胞とテトラマーとの結合が可能な条件下で接触させることを含む。いっそうさらなる実施形態では、本明細書に開示される方法はまた、前記１つ以上の同定されたＴ細胞の１つ以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定することをさらに含むことができる。特定の実施形態では、１つ以上のＴ細胞受容体を同定することは、前記１つ以上の同定されたＴ細胞のＴ細胞受容体配列をシークエンシングすることを含む。本明細書に開示される方法は、１つ以上の特定されたＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することと、複数のＴ細胞が増殖する条件下で複数のＴ細胞を培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することと、をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の特定されたＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することは、１つ以上の特定されたＴ細胞のＴ細胞受容体配列を発現ベクターにクローニングすることと、複数のＴ細胞のそれぞれに発現ベクターをトランスフェクトすることと、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される本方法は、１つ以上の特定されたＴ細胞を、１つ以上の特定されたＴ細胞が増殖する条件下で培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することと、をさらに含む。
本明細書ではまた、サブセットの中の少なくとも１つの選択された抗原に対して抗原特異的である単離Ｔ細胞も開示される。
またさらなる態様は、ポリペプチドまたはその一部を発現することができる発現ベクターを提供する。様々な細胞タイプ用の発現ベクターが、当技術分野において周知であり、過度の実験なしで選択することができる。概して、ＤＮＡを、プラスミドなどの発現ベクター中に、発現のための適正な方向及び正確なリーディングフレームで挿入する。必要な場合は、ＤＮＡを、望ましい宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節性制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、そのような制御は、概して発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、ベクターを、標準的な技法を通して宿主中に導入する。手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において見出すことができる。
Ｖ．ワクチン組成物
また、特異的な免疫応答、例えば、感染症生物特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば本明細書に記載される方法を用いて選択された１つまたは複数の抗原を含む。ワクチン組成物はワクチンと呼ぶこともできる。
また、特異的な免疫応答、例えば、感染症生物特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば本明細書に記載される方法を用いて選択された１つまたは複数の抗原を含む。ワクチン組成物はワクチンと呼ぶこともできる。
ワクチンは、１～３０個のペプチド、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の異なるペプチド、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の異なるペプチド、または１２、１３、もしくは１４個の異なるペプチドを含むことができる。ペプチドは、翻訳後修飾を有してもよい。ワクチンは、１～１００個またはそれ以上のヌクレオチド配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４，９５、９６、９７、９８、９９、１００個、もしくはそれよりも多くの異なるヌクレオチド配列、６、７、８、９、１０ １１、１２、１３、もしくは１４個の異なる抗原コード核酸配列、または１２、１３もしくは１４個の異なる抗原コード核酸配列を含むことができる。ワクチンは、１～３０個の抗原配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４，９５、９６、９７、９８、９９、１００個、もしくはそれよりも多くの異なる抗原配列、６、７、８、９、１０ １１、１２、１３、もしくは１４個の異なる抗原配列、または１２、１３もしくは１４個の異なる抗原配列を含むことができる。
ワクチンは、１～３０個の抗原コード核酸配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４，９５、９６、９７、９８、９９、１００個、もしくはそれよりも多くの異なる抗原コード核酸配列、６、７、８、９、１０ １１、１２、１３、もしくは１４個の異なる抗原コード核酸配列、または１２、１３もしくは１４個の異なる抗原コード核酸配列を含むことができる。抗原コード核酸配列は、「抗原カセット」の抗原コード部分を指す場合もある。抗原カセットの特性について下記により詳細に説明する。抗原コード核酸配列は、１つ以上のエピトープコード核酸配列（例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードした抗原コード核酸配列）を含むことができる。
ワクチンは、１～３０個の異なるエピトープコード核酸配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４，９５、９６、９７、９８、９９、１００個、もしくはそれよりも多くの異なるエピトープコード核酸配列、６、７、８、９、１０ １１、１２、１３、もしくは１４個の異なるエピトープコード核酸配列、または１２、１３もしくは１４個の異なるエピトープコード核酸配列を含むことができる。エピトープコード核酸配列とは、連結されたＴ細胞エピトープコード核酸配列をコードする抗原コード核酸配列中のＴ細胞エピトープのそれぞれなど、個別のエピトープ配列の配列を指す場合もある。
ワクチンは、エピトープコード核酸配列の少なくとも２個の反復配列を含むことができる。本明細書で使用される「反復配列」とは、抗原コード核酸配列内の同じ核酸エピトープコード核酸配列（本明細書に記載される任意の５’リンカー配列及び／または任意の３’リンカー配列を含む）の２個以上の繰り返しを指す。１つの例では、カセットの抗原コード核酸配列部分は、エピトープコード核酸配列の少なくとも２個の反復配列をコードする。さらなる非限定的な例では、カセットの抗原コード核酸配列部分は複数の異なるエピトープをコードし、異なるエピトープのうちの少なくとも１つは、異なるエピトープをコードした核酸配列の少なくとも２個の反復（すなわち、少なくとも２個の異なるエピトープコード核酸配列）によってコードされる。例示的な非限定例では、抗原コード核酸配列は、エピトープコード核酸配列Ａ（ＥＡ）、エピトープコード配列Ｂ（ＥＢ）、及びエピトープコード配列Ｃ （ＥＣ）によってコードされるエピトープＡ、Ｂ、及びＣをコードし、異なるエピトープのうちの少なくとも１つの反復配列を有する例示的な抗原コード核酸配列は、これらに限定されるものではないが、下式によって示される。
－１つの異なるエピトープの反復配列（エピトープＡの反復配列）：
ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＡ、または
ＥＡ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ
－複数の異なるエピトープの反復配列（エピトープＡ、Ｂ、及びＣの反復配列）：
ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ、または
ＥＡ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＣ
－複数の異なるエピトープの複数の反復配列（エピトープＡ、Ｂ、及びＣの反復配列）：
ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ、または
ＥＡ－ＥＡ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＢ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＣ－ＥＣ
－１つの異なるエピトープの反復配列（エピトープＡの反復配列）：
ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＡ、または
ＥＡ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ
－複数の異なるエピトープの反復配列（エピトープＡ、Ｂ、及びＣの反復配列）：
ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ、または
ＥＡ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＣ
－複数の異なるエピトープの複数の反復配列（エピトープＡ、Ｂ、及びＣの反復配列）：
ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ、または
ＥＡ－ＥＡ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＢ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＣ－ＥＣ
上記の例は限定的なものではなく、異なるエピトープのうちの少なくとも１つの反復配列を有する抗原コード核酸配列は、異なるエピトープのそれぞれを任意の順序または頻度でコードすることができる。例えば、順序及び頻度は、例えば式ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＣ－ＥＡ－ＥＢ－ＥＡ－ＥＣ－ＥＡ－ＥＣ－ＥＣ－ＥＢによるエピトープＡ、Ｂ、及びＣを有する例におけるように、異なるエピトープのランダムな配置とすることができる。
本明細書では、５’から３’方向に下式によって記述される少なくとも１つの抗原コード核酸配列を有する抗原コードカセットが提供される。
（Ｅｘ－（ＥＮ ｎ）ｙ）ｚ
式中、Ｅは、少なくとも１つの異なるエピトープコード核酸配列を含むヌクレオチド配列を表し、
ｎは、別個の異なるエピトープコード核酸配列の数を表し、０を含む任意の整数であり、
ＥＮは、それぞれの対応するｎについて別個の異なるエピトープコード核酸配列を含むヌクレオチド配列を表し、
ｚのそれぞれの繰り返しについて、各ｎにおいてｘ＝０または１、ｙ＝０または１であり、ｘまたはｙの少なくとも一方は１であり、
ｚ＝２以上であり、抗原コード核酸配列は、Ｅ、特定のＥＮ、またはこれらの組み合わせの少なくとも１つの２回の繰り返しを含む。
（Ｅｘ－（ＥＮ ｎ）ｙ）ｚ
式中、Ｅは、少なくとも１つの異なるエピトープコード核酸配列を含むヌクレオチド配列を表し、
ｎは、別個の異なるエピトープコード核酸配列の数を表し、０を含む任意の整数であり、
ＥＮは、それぞれの対応するｎについて別個の異なるエピトープコード核酸配列を含むヌクレオチド配列を表し、
ｚのそれぞれの繰り返しについて、各ｎにおいてｘ＝０または１、ｙ＝０または１であり、ｘまたはｙの少なくとも一方は１であり、
ｚ＝２以上であり、抗原コード核酸配列は、Ｅ、特定のＥＮ、またはこれらの組み合わせの少なくとも１つの２回の繰り返しを含む。
各ＥまたはＥＮは、本明細書に記載されるエピトープコード核酸配列（例えば、表Ａ、表Ｂ、及び／または表Ｃに記載されるポリヌクレオチド配列をコードしたヌクレオチド配列）を独立して含むことができる。例えば、各ＥまたはＥＮは、５’から３’方向に、式（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）によって記述されるヌクレオチド配列を独立して含むことができ、式中、Ｎは、各ＥまたはＥＮに関連付けられた異なるエピトープコード核酸配列を含み、ここでｃ＝１であり、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１である。使用することができるエピトープ及びリンカーについては本明細書でさらに述べる。
エピトープコード核酸配列（任意の５’リンカー配列及び／または任意の３’リンカー配列を含む）の反復配列は互いに直接連結されてもよい（例えば、上記に示したように、ＥＡ－ＥＡ－…）。エピトープコード核酸配列の反復配列は、１つ以上のさらなるヌクレオチド配列によって分離されてもよい。一般的に、エピトープコード核酸配列の反復配列は、本明細書に記載される組成物に適用可能な任意のサイズのヌクレオチド配列によって分離されうる。１つの例では、エピトープコード核酸配列の反復配列は、別個の異なるエピトープコード核酸配列によって分離されうる（例えば、上記に示したように、ＥＡ－ＥＢ－ＥＣ－ＥＡ…）。反復配列が単一の別個の異なるエピトープコード核酸配列によって分離されており、各エピトープコード核酸配列（任意の５’リンカー配列及び／または任意の３’リンカー配列を含む）がアミノ酸２５個の長さのペプチドをコードする例では、反復配列は、例えばＥＡ－ＥＢ－ＥＡ…（ＥＡは７５個のヌクレオチドによって分離されている）により表される抗原コード核酸におけるように７５個のヌクレオチドによって分離されうる。例示的な１つの例では、２５マーの抗原Ｔｒｐ１（ＶＴＮＴＥＭＦＶＴＡＰＤＮＬＧＹＭＹＥＶＱＷＰＧＱ：配列番号１１６）及びＴｒｐ２（ＴＱＰＱＩＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴ：配列番号１１７）の反復配列をコードした配列ＶＴＮＴＥＭＦＶＴＡＰＤＮＬＧＹＭＹＥＶＱＷＰＧＱＴＱＰＱＩＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴＶＴＮＴＥＭＦＶＴＡＰＤＮＬＧＹＭＹＥＶＱＷＰＧＱＴＱＰＱＩＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴ（配列番号１１５）を有する抗原コード核酸であり、Ｔｒｐ１の反復配列が２５マーのＴｒｐ２によって分離されており、したがって、Ｔｒｐ１エピトープコード核酸配列の反復配列は、ヌクレオチド７５個のＴｒｐ２エピトープコード核酸配列によって分離される。反復配列が２、３、４、５、６、７、８、または９個の別個の異なるエピトープコード核酸配列によって分離されており、各エピトープコード核酸配列（任意の５’リンカー配列及び／または任意の３’リンカー配列を含む）がアミノ酸２５個の長さのペプチドをコードする例では、反復配列は、それぞれ、１５０、２２５、３００、３７５、４５０、５２５、６００、または６７５個のヌクレオチドによって分離されうる。
一実施形態では、異なるペプチド及び／もしくはポリペプチド、またはそれらをコードするヌクレオチド配列は、ペプチド及び／またはポリペプチドが、異なるＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子などの異なるＭＨＣ分子と結合することができるように選択される。いくつかの態様において、１つのワクチン組成物は、最も頻繁に存在するＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができるペプチド及び／またはポリペプチドのコード配列を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも２種類の好ましい、少なくとも３種類の好ましい、または少なくとも４種類の好ましいＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができる異なる断片を含むことができる。
ワクチン組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答及び特異的なヘルパーＴ細胞応答を刺激することができる。
ワクチン組成物は、特異的Ｂ細胞応答（例えば、抗体応答）を刺激することができる。
ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び／または特異的Ｂ細胞応答を刺激することができる。ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答及び特異的Ｂ細胞応答を刺激することができる。ワクチン組成物は、特異的ヘルパーＴ細胞応答及び特異的Ｂ細胞応答を刺激することができる。ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び特異的Ｂ細胞応答を刺激することができる。
ワクチン組成物の組み合わせは、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び／または特異的Ｂ細胞応答を刺激することができる。ワクチン組成物は、同種であってよく、特異的細胞毒性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び／または特異的Ｂ細胞応答の組み合わせを刺激することができる。ワクチン組成物は、同種であってよく、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び特異的Ｂ細胞応答の組み合わせを刺激することができる。ワクチン組成物は、異種であってよく、特異的細胞毒性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び／または特異的Ｂ細胞応答の組み合わせを刺激することができる。ワクチン組成物は、異種であってよく、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び特異的Ｂ細胞応答の組み合わせを刺激することができる。異種ワクチンは、例えばウイルスワクチン（例えばＣｈＡｄＶベースのプラットフォーム）及びｍＲＮＡワクチン（例えばＳＡＭベースのプラットフォーム）などの異なるワクチンプラットフォームによってコードされた同じ抗原カセットを含む。異種ワクチンは、例えばウイルスワクチン（例えばＣｈＡｄＶベースのプラットフォーム）またはｍＲＮＡワクチン（例えばＳＡＭベースのプラットフォーム）のいずれかなど、同じワクチンプラットフォームによってコードされた異なる抗原カセット（例えば、スパイクカセットと別のＴ細胞エピトープコードカセット、または、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１アイソレート及びＢ．１．３５１アイソレート由来のスパイクタンパク質バリアントなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なるアイソレートに由来するエピトープ／抗原）を含む。異種ワクチンは、例えばウイルスワクチン（例えばＣｈＡｄＶベースのプラットフォーム）及びｍＲＮＡワクチン（例えばＳＡＭベースのプラットフォーム）など、異なるワクチンプラットフォームによってコードされた異なる抗原カセット（例えば、スパイクカセットと別のＴ細胞エピトープコードカセット、または、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１アイソレート及びＢ．１．３５１アイソレート由来のスパイクタンパク質バリアントなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なるアイソレートに由来するエピトープ／抗原）を含む。例えば、例示的な非限定的例として、ウイルスワクチン（例えばＣｈＡｄＶベースのプラットフォーム）は、強い細胞傷害性Ｔ細胞応答を特に刺激することができ、ｍＲＮＡワクチン（例えばＳＡＭベースのプラットフォーム）は強いＢ細胞応答を特に刺激することができる。
ワクチン組成物は、アジュバント及び／または担体をさらに含むことができる。有用なアジュバント及び担体の例を本明細書で以下に示す。組成物は、例えば、タンパク質、またはペプチドをＴ細胞に提示することができる樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞などの担体を伴ってもよい。
アジュバントは、ワクチン組成物に混合することで抗原に対する免疫応答を増大または他の形で改変する任意の物質である。担体は、抗原が会合することができる、例えばポリペプチドまたは多糖類などのスカフォールド構造であってよい。場合により、アジュバントは共有結合または非共有結合により結合される。
アジュバントが抗原に対する免疫応答を増大させる能力は、免疫介在反応の有意なもしくは大幅な増大、または疾患症状の低減として一般的に現れる。例えば、体液性免疫の増大は、抗原に対して生成された抗体の力価の有意な増大として一般的に現れ、Ｔ細胞活性の増大は細胞増殖、または細胞毒性、またはサイトカイン分泌の増大として一般的に現れる。アジュバントはまた、例えば、主として体液性またはＴｈ応答を主として細胞性またはＴｈ応答に変化させることにより、免疫応答も変化させることができる。
適当なアジュバントとしては、これらに限定されるものではないが、１０１８ ＩＳＳ、ミョウバン、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクターシステム、ＰＬＧ微小粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンから誘導されるＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１スティミュロン（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）、マイコバクテリウム抽出物及び合成細菌壁模倣体、ならびにＲｉｂｉ’ｓ Ｄｅｔｏｘ． ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどの他の特許取得アジュバントが挙げられる。不完全フロイントまたはＧＭ－ＣＳＦなどのアジュバントが有用である。樹状細胞に対して特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの製剤がこれまでに記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８－２７；Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３－１１）。サイトカインを用いることもできる。いくつかのサイトカインが、リンパ組織への樹状細胞の遊走に影響を及ぼし（例えば、ＴＮＦ－α）、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速させ（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１及びＩＬ－４）（参照によって本明細書にその全容を具体的に援用する米国特許第５，８４９，５８９号）、免疫アジュバントとして作用する（例えば、ＩＬ－１２）（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６（６）：４１４－４１８）ことに直接的な関連が示されている。
ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドも、ワクチン環境におけるアジュバントの効果を高めることが報告されている。ＲＮＡ結合ＴＬＲ ７、ＴＬＲ ８及び／またはＴＬＲ ９のような他のＴＬＲ結合分子を使用することもできる。
有用なアジュバントの他の例としては、これらに限定されるものではないが、化学修飾ＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ｐｏｌｙｉ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌性ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに、治療作用を有するか、かつ／またはアジュバントとして作用しうる、シクロフォスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５などの免疫活性小分子及び抗体が挙げられる。アジュバント及び添加剤の量ならびに濃度は、当業者によれば不要な実験を行うことなく容易に決定することが可能である。さらなるアジュバントとしては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスティム）などのコロニー刺激因子が挙げられる。
ワクチン組成物は、複数の異なるアジュバントを含むことができる。さらに、治療組成物は、上記のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む、任意のアジュバント物質を含むことができる。ワクチンとアジュバントは、一緒に投与してもよく、または任意の適当な順序で別々に投与することもできる。
担体（または賦形剤）がアジュバントとは独立して存在してもよい。担体の機能は、例えば特定の変異体の分子量を増やすことによって、活性もしくは免疫原性を高める、安定性を付与する、生物活性を高める、または血清半減期を延ばすことであってよい。さらに、担体は、Ｔ細胞へのペプチドの提示を助けることができる。担体は、例えば、タンパク質または抗原提示細胞などの当業者には周知の任意の適当な担体であってよい。担体タンパク質は、これらに限定されるものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン；トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、チログロブリンまたはオボアルブミンなどの血清タンパク質、免疫グロブリン；インスリンまたはパルミチン酸などのホルモンであってよい。ヒトの免疫化においては、担体は一般的に、ヒトに許容される、安全な生理学的に許容される担体である。しかしながら、破傷風トキソイド及び／またはジフテリアトキソイドは適当な担体である。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであってもよい。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、インタクトな外来抗原自体ではなく、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形の抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置している。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子及びＡＰＣの三量体複合体が存在する場合に可能となる。これに対応して、ＣＴＬは、ペプチドのみがＣＴＬの活性化に用いられる場合でなく、対応するＭＨＣ分子を有するＡＰＣがさらに加えられる場合に免疫応答を増強することができる。したがって、特定の実施形態では、ワクチン組成物は少なくとも１つの抗原提示細胞をさらに含む。
抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照されたい）、または、第２、第３、もしくはハイブリッド第２／第３世代のレンチウイルス、及び特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つ以上の抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする１つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（ １３）：３４０１－１０を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を刺激する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
Ｖ．Ａ．抗原カセット
１つ以上の抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「抗原カセット」または「カセット」とは、選択された抗原または複数の抗原（例えば、抗原コード核酸配列）と、この抗原（複数可）を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。選択された抗原または複数の抗原とは、異なるエピトープ配列を指す場合がある（例えば、カセット内の抗原コード核酸配列は、エピトープが転写されて発現されるようにエピトープコード核酸配列（または複数のエピトープコード核酸配列）をコードすることができる）。抗原または複数の抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で抗原（複数可）の発現を誘導することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、抗原カセットは、抗原（複数可）に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントとともに配置された選択されたプロモーターも含むことができる。カセットは、それぞれが独立して別個のプロモーターに機能的に連結されるか、かつ／または、２Ａリボソームスキッピング配列エレメント（例えば、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａ配列）または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列エレメントなどの他のマルチシストロニックシステムを用いて互いに連結された複数の抗原コード核酸配列を含むカセットなどの１つ以上の抗原コード核酸配列を有することができる。リンカーは、ＴＥＶまたはフーリン切断部位のような切断部位を有することもできる。切断部位を有するリンカーを、マルチシストロニックシステム内のエレメントなど、他のエレメントと組み合わせることもできる。非限定的な例示的な例では、フリンプロテアーゼ切断部位を２Ａリボソームスキッピング配列エレメントと組み合わせて使用して、翻訳後の２Ａ配列の除去を促進するようにフリンプロテアーゼ切断部位を構成することができる。複数の抗原コード核酸配列を含むカセットにおいて、各抗原コード核酸配列は、１つ以上のエピトープコード核酸配列（例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードした抗原コード核酸配列）を含むことができる。マルチシストロンフォーマットの例示的な例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするカセットは、以下のように構成される：（１）内因性２６Ｓプロモーター－スパイクタンパク質－Ｔ２Ａ－膜タンパク質、または（２）内因性２６Ｓプロモーター－スパイクタンパク質－２６Ｓプロモーター－連結されたＴ細胞エピトープ。
１つ以上の抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「抗原カセット」または「カセット」とは、選択された抗原または複数の抗原（例えば、抗原コード核酸配列）と、この抗原（複数可）を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。選択された抗原または複数の抗原とは、異なるエピトープ配列を指す場合がある（例えば、カセット内の抗原コード核酸配列は、エピトープが転写されて発現されるようにエピトープコード核酸配列（または複数のエピトープコード核酸配列）をコードすることができる）。抗原または複数の抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で抗原（複数可）の発現を誘導することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、抗原カセットは、抗原（複数可）に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントとともに配置された選択されたプロモーターも含むことができる。カセットは、それぞれが独立して別個のプロモーターに機能的に連結されるか、かつ／または、２Ａリボソームスキッピング配列エレメント（例えば、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａ配列）または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列エレメントなどの他のマルチシストロニックシステムを用いて互いに連結された複数の抗原コード核酸配列を含むカセットなどの１つ以上の抗原コード核酸配列を有することができる。リンカーは、ＴＥＶまたはフーリン切断部位のような切断部位を有することもできる。切断部位を有するリンカーを、マルチシストロニックシステム内のエレメントなど、他のエレメントと組み合わせることもできる。非限定的な例示的な例では、フリンプロテアーゼ切断部位を２Ａリボソームスキッピング配列エレメントと組み合わせて使用して、翻訳後の２Ａ配列の除去を促進するようにフリンプロテアーゼ切断部位を構成することができる。複数の抗原コード核酸配列を含むカセットにおいて、各抗原コード核酸配列は、１つ以上のエピトープコード核酸配列（例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードした抗原コード核酸配列）を含むことができる。マルチシストロンフォーマットの例示的な例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードするカセットは、以下のように構成される：（１）内因性２６Ｓプロモーター－スパイクタンパク質－Ｔ２Ａ－膜タンパク質、または（２）内因性２６Ｓプロモーター－スパイクタンパク質－２６Ｓプロモーター－連結されたＴ細胞エピトープ。
有用なプロモーターは、構成性プロモーター、または発現させる抗原（複数可）の量を制御することが可能な調節された（誘導性）プロモーターであってよい。例えば、望ましいプロモーターとして、サイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサーのものがある［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照］。別の望ましいプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハンサーが挙げられる。さらに別のプロモーター／エンハンサー配列は、ニワトリβアクチンプロモーターである［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３）］。当業者であれば、他の適当な、または望ましいプロモーターも選択することができる。
抗原カセットは、転写産物の効率的なポリアデニル化（ポリ（Ａ）、ポリＡまたはｐＡ）のためのシグナルを与える配列ならびに機能的スプライスドナー及びアクセプター部位を含むイントロンを含む、ウイルスベクター配列に対して異種の核酸配列も含みうる。本明細書の例示的なベクターに用いられる一般的なポリＡ配列は、パポバウイルスＳＶ－４０由来のものである。ポリＡ配列は、抗原ベースの配列の後で、ウイルスベクター配列の前にカセットに挿入することができる。一般的なイントロン配列もまたＳＶ－４０由来のものでよく、ＳＶ－４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。抗原カセットは、プロモーター／エンハンサー配列と抗原（複数可）との間に位置するイントロンを含んでもよい。これら及び他の一般的なベクターエレメントの選択は従来のものであり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及び本明細書に引用される参照文献を参照］、多くのかかる配列が商業的及び産業的供給元、ならびにＧｅｎｂａｎｋより入手可能である。
抗原カセットは１つ以上の抗原を有することができる。例えば個、特定のカセットは、１～１０個、１～２０個、１～３０個、１０～２０個、１５～２５個、１５～２０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多くの抗原を含むことができる。抗原は互いに直接連結されてもよい。抗原はリンカーによって互いに連結されてもよい。抗原は、Ｎ～ＣまたはＣ～Ｎを含む、互いに対して任意の方向とすることができる。
他の箇所で述べたように、抗原カセットは、選択することができるものの中でもとりわけ、例えば、ＣｈＡｄ－ベースベクターのＥ１遺伝子領域の欠失またはＥ３遺伝子領域の欠失の部位またはＶＥＥ骨格の欠失した構造タンパク質などのウイルスベクター骨格内の任意の選択された欠失部位内に配置することができる。
抗原コードカセット（例えば、カセット内に免疫原性ポリペプチドをコードしたカセットまたは１つ以上の核酸配列）は、５’から３’方向に各因子の順序付けられた配列を記述する下式を用いて記述することができる。すなわち、
Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
［式中、Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝０または１であり、ｃ＝１であり、Ｎは、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの１つを含み、場合により各Ｎは、表Ａ、表Ｂ、及び／または表Ｃに記載されるポリペプチド配列をコードし、Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であり、Ｙ＝０、１、または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、（１）ユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、場合により少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方、または（２）ＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列を含む］。いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮｃは、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵｆは、異なるユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列または異なるＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列である。上記の抗原コード配列の式は、特定の場合では、連結されたＴ細胞エピトープなどの連結されたエピトープ配列をコードした抗原カセットの一部のみを記述する。例えば、連結されたＴ細胞エピトープ配列と１つ以上の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質とをコードしたカセットでは、上記の抗原コードカセットの式は連結されたエピトープ配列を記述し、カセットは別に、場合により２Ａリボソームスキッピング配列エレメント（例えば、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａ配列）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列エレメントなどのマルチシストロニックシステムを用いて連結され、かつ／または別のプロモーターに独立して機能的に連結された１つ以上の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードする。
Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
［式中、Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝０または１であり、ｃ＝１であり、Ｎは、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの１つを含み、場合により各Ｎは、表Ａ、表Ｂ、及び／または表Ｃに記載されるポリペプチド配列をコードし、Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であり、Ｙ＝０、１、または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、（１）ユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、場合により少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方、または（２）ＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列を含む］。いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮｃは、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵｆは、異なるユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列または異なるＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列である。上記の抗原コード配列の式は、特定の場合では、連結されたＴ細胞エピトープなどの連結されたエピトープ配列をコードした抗原カセットの一部のみを記述する。例えば、連結されたＴ細胞エピトープ配列と１つ以上の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質とをコードしたカセットでは、上記の抗原コードカセットの式は連結されたエピトープ配列を記述し、カセットは別に、場合により２Ａリボソームスキッピング配列エレメント（例えば、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａ配列）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列エレメントなどのマルチシストロニックシステムを用いて連結され、かつ／または別のプロモーターに独立して機能的に連結された１つ以上の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードする。
１つの例では、存在する因子は、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝１８、Ｙ＝２であるものを含み、かつ、ベクター骨格はＣｈＡｄＶ６８ベクターを含み、ａ＝１であり、ＰはＣＭＶプロモーターであり、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が存在し、第２のポリ（Ａ）配列はベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列であり、場合により外因性のポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列を含み、各Ｎは、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激することができるエピトープ、またはこれらの組み合わせをコードし、Ｌ５は、前記エピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、前記５’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さのペプチドをコードし、Ｌ３は、前記エピトープの天然のＣ末端アミノ酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、前記３’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さのペプチドをコードし、及びＵは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれである。上記の抗原コード配列の式は、特定の場合では、連結されたＴ細胞エピトープなどの連結されたエピトープ配列をコードした抗原カセットの一部のみを記述する。
１つの例では、存在する因子は、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝１８、Ｙ＝２であるものを含み、ベクター骨格はベネズエラ馬脳炎ウイルスベクターを含み、ａ＝０であり、抗原カセットは内因性２６Ｓプロモーターに機能的に連結され、少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列は、骨格によって与えられる少なくとも８０個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列（配列番号２７９４０）であり、各Ｎは、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激することができるエピトープ、またはこれらの組み合わせをコードし、Ｌ５は、エピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、５’リンカー配列は、少なくともアミノ酸３個の長さのペプチドをコードし、Ｌ３は、エピトープの天然のＣ末端アミノ酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、３’リンカー配列は、少なくともアミノ酸３個の長さのペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれである。
抗原コード配列は、５’から３’方向に各因子の順序付けられた配列を記述する下式を用いて記述することができる。すなわち、
（Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ）Ｚ－（Ｐ２ｈ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ）Ｗ－Ｇ３ｇ
［式中、Ｐ及びＰ２は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、Ｎは、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸のうちの１つを含み（例えば、Ｎは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、及び／または表１０に記載のポリペプチド配列をコードする）、Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、Ｇ５は、アミノ酸リンカーをコードした核酸配列を含み、Ｇ３は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、Ｕは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、各Ｘについて、対応するＮｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であり、各Ｙについて、対応するＵｆは、（１）ユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、場合により少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方、または（２）ＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列を含む］。組成物及び順序付けられた配列は、存在する因子の数を選択することによってさらに定義することができ、例えば、ａ＝０または１である場合、ｂ＝０または１である場合、ｃ＝１である場合、ｄ＝０または１である場合、ｅ＝０または１である場合、ｆ＝１である場合、ｇ＝０または１である場合、ｈ＝０または１である場合、Ｘ＝１～４００であり、Ｙ＝０、１、２、３、４または５であり、Ｚ＝１～４００であり、かつＷ＝０、１、２、３、４または５である。
（Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ）Ｚ－（Ｐ２ｈ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ）Ｗ－Ｇ３ｇ
［式中、Ｐ及びＰ２は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、Ｎは、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸のうちの１つを含み（例えば、Ｎは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、及び／または表１０に記載のポリペプチド配列をコードする）、Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、Ｇ５は、アミノ酸リンカーをコードした核酸配列を含み、Ｇ３は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、Ｕは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、各Ｘについて、対応するＮｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であり、各Ｙについて、対応するＵｆは、（１）ユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、場合により少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方、または（２）ＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列を含む］。組成物及び順序付けられた配列は、存在する因子の数を選択することによってさらに定義することができ、例えば、ａ＝０または１である場合、ｂ＝０または１である場合、ｃ＝１である場合、ｄ＝０または１である場合、ｅ＝０または１である場合、ｆ＝１である場合、ｇ＝０または１である場合、ｈ＝０または１である場合、Ｘ＝１～４００であり、Ｙ＝０、１、２、３、４または５であり、Ｚ＝１～４００であり、かつＷ＝０、１、２、３、４または５である。
１つの例では、存在する因子は、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝０、Ｘ＝１０、Ｙ＝２、Ｚ＝１、かつＷ＝１であり、さらなるプロモーターが存在しない場合が記述される場合（例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格などのベクター骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列のみが存在する）、１０個のエピトープが存在し、各Ｎについて５’リンカーが存在し、各Ｎについて３’リンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープを連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの５’末端を最後のＭＨＣクラスＩエピトープの３’リンカーに連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの３’末端をベクター骨格に連結するリンカーが存在する。抗原カセットの３’末端の、ベクター骨格との連結の例としては、３’の１９ｎｔのＣＳＥのような、ベクター骨格によって与えられる３’ＵＴＲ因子に直接連結することが挙げられる。抗原カセットの５’末端の、ベクター骨格との連結の例としては、２６Ｓプロモーター配列、アルファウイルスの５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、またはアルファウイルス骨格の２４ｎｔのＣＳＥなどのベクター骨格のプロモーターまたは５’ＵＴＲエレメントに直接連結することが挙げられる。
他の例としては、ａ＝１であり、ベクター骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外のプロモーターが存在する場合が記述される場合；ａ＝１かつＺが１よりも大きく、それぞれが１つ以上の異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列の発現をもたらす、ベクター骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外の複数のプロモーターが存在する場合；ｈ＝１であり、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列の発現をもたらす別のプロモーターが存在することが記述される場合；及び、ｇ＝０であり、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列（存在する場合）がベクター骨格に直接連結される場合などが挙げられる。
他の例としては、存在する各ＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーを有する、３’リンカーを有する、どちらも有さない、または両方を有する場合が挙げられる。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
他の例としては、存在する各抗原が、５’リンカーを有する、３’リンカーを有する、どちらも有さない、または両方を有する場合が挙げられる。複数の抗原が同じ抗原カセット内に存在する例では、一部の抗原が５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他の抗原が、５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数の抗原が同じ抗原カセット内に存在するその他の例では、一部の抗原が５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他の抗原が５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ＲＮＡアルファウイルス骨格などのベクター骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と同じであってよい。例えば、ベクター骨格によって与えられるプロモーター配列であるＰｎ及びＰ２が、それぞれ２６ＳのサブゲノミックプロモーターまたはＣＭＶプロモーターを含むことができる。プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ベクター骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と異なっていてもよく、また、互いと異なっていてもよい。
５’リンカーＬ５は、天然配列または非天然配列であってよい。非天然配列としては、これらに限定されるものではないが、ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰが挙げられる。３’リンカーＬ３もまた、天然配列または非天然配列であってよい。さらに、Ｌ５及びＬ３は、いずれも天然配列であってよく、いずれも非天然配列であってよく、または一方が天然で他方が非天然であってもよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーは、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｙについて、アミノ酸リンカーＧ５は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｙについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
アミノ酸リンカーＧ３は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。Ｇ３はまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激することができるエピトープ、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、及びＢ細胞応答を刺激することができるエピトープの組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープとＭＨＣクラスＩＩエピトープとの組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープとＢ細胞応答を刺激することができるエピトープとの組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、Ｎは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープとＢ細胞応答を刺激することができるエピトープとの組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。各Ｘについて、各Ｎはまた、アミノ酸が少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、Ｂ細胞応答を刺激することができるエピトープをコードすることができる。
１つ以上の抗原をコードするカセットは、７００ヌクレオチド以下であってよい。１つ以上の抗原をコードするカセットは、７００ヌクレオチド以下であってよく、２個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる（例えば、免疫原性ポリペプチドをコードする２個の異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列をコードする）。１つ以上の抗原をコードするカセットは、７００ヌクレオチド以下であってよく、少なくとも２個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、７００ヌクレオチド以下であってよく、３個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、７００ヌクレオチド以下であってよく、少なくとも３個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、７００ヌクレオチド以下であってよく、１～１０個、１～５個、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多い抗原を含むことができる。
１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～７００ヌクレオチドの長さであってよい。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～７００ヌクレオチドの長さであってよく、２個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～７００ヌクレオチドの長さであってよく、少なくとも２個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～７００ヌクレオチドの長さであってよく、３個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～７００ヌクレオチドの長さであってよく、少なくとも３個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～７００ヌクレオチドの長さであってよく、１～１０個、１～５個、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多い抗原を含むことができる。
１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、または１００ヌクレオチド以下の長さであってよい。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、または１００ヌクレオチド以下の長さであってよく、２個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、または１００ヌクレオチド以下の長さであってよく、少なくとも２個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、または１００ヌクレオチド以下の長さであってよく、３個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、または１００ヌクレオチド以下の長さであってよく、少なくとも３個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、または１００ヌクレオチド以下の長さであってよく、１～１０個、１～５個、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多い抗原を含むことができる。
１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチドの長さであってよい。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチドの長さであってよく、２個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチドの長さであってよく、少なくとも２個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチドの長さであってよく、３個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチドの長さであってよく、少なくとも３個の異なるエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチドの長さであってよく、１～１０個、１～５個、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多い抗原を含むことができる。
Ｖ．Ｂ．ワクチン設計及び製造のさらなる考慮事項
上記の抗原フィルターのすべてが適用された後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補抗原が、ワクチン包含になおも利用可能である可能性がある。追加的に、抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
１． 自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい）
２． シークエンシングアーチファクトの確率（より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい）
３． 免疫原性の確率（より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい）
４． 提示の確率（より高い提示の確率が、典型的に好ましい）
５． 遺伝子発現（より高い発現が、典型的に好ましい）
６． ＨＬＡ遺伝子のカバレッジ（抗原のセットの提示に関与する、より多い数のＨＬＡ分子は、感染細胞が、ＨＬＡ分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある）
７．ＨＬＡクラスのカバレッジ（ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、感染症の回避の確率が低くなる可能性がある）
上記の抗原フィルターのすべてが適用された後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補抗原が、ワクチン包含になおも利用可能である可能性がある。追加的に、抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
１． 自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい）
２． シークエンシングアーチファクトの確率（より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい）
３． 免疫原性の確率（より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい）
４． 提示の確率（より高い提示の確率が、典型的に好ましい）
５． 遺伝子発現（より高い発現が、典型的に好ましい）
６． ＨＬＡ遺伝子のカバレッジ（抗原のセットの提示に関与する、より多い数のＨＬＡ分子は、感染細胞が、ＨＬＡ分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある）
７．ＨＬＡクラスのカバレッジ（ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、感染症の回避の確率が低くなる可能性がある）
さらに、場合によっては、抗原が、患者の感染細胞のすべてまたは一部において喪失するかまたは不活性化されたＨＬＡアレルによって提示されることが予想される場合には、抗原のワクチン接種における優先順位を下げる（例えば除外）することができる。ＨＬＡアレルの喪失は、体細胞変異、ヘテロ接合性の喪失、または遺伝子座のホモ接合欠失のいずれかによって生じうる。ＨＬＡアレルの体細胞変異の検出方法は当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。体細胞ＬＯＨ及びホモ接合欠失（ＨＬＡ遺伝子座を含む）の検出方法についても同様に述べられている（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；ＭｃＧｒａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｖａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。抗原は、質量分析データが、予測された抗原が予測されたＨＬＡアレルによって提示されないことを示す場合には優先順位付けを外してもよい。
Ｖ．Ｃ．自己複製ＲＮＡベクター
一般的に、すべての自己複製（ＳＡＭ）ＲＮＡベクターは、自己複製ウイルスに由来する自己複製骨格を含む。「自己増幅骨格」という用語は、ウイルスゲノムの自己複製を可能とする自己複製ウイルスの最小配列（複数可）のことを指す。例えば、アルファウイルスの自己複製を可能とする最小配列は、非構造タンパク質媒介増幅のための保存された配列（例えば、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及び／またはポリＡ配列）を含むことができる。自己複製骨格は、サブゲノミックウイルスＲＮＡの発現のための配列（例えば、アルファウイルスでは２６Ｓプロモーターエレメント）を含むこともできる。ＳＡＭベクターは、（＋）センスまたは（－）センス自己複製ウイルスに由来する骨格を有するベクターのような（＋）センスＲＮＡポリヌクレオチドまたは（－）センスＲＮＡポリヌクレオチドであってよい。自己複製ウイルスとしては、これらに限定されるものではないが、アルファウイルス、フラビウイルス（例えば、クンジンウイルス）、麻疹ウイルス、及びラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス）が挙げられる。自己複製ウイルス由来のＳＡＭベクターシステムの例は、あらゆる目的で本明細書に参照により援用する、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１８ Ｄｅｃ １３；２３（１２）．ｐｉｉ：Ｅ３３１０．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２３１２３３１０）により詳細に記載されている。
一般的に、すべての自己複製（ＳＡＭ）ＲＮＡベクターは、自己複製ウイルスに由来する自己複製骨格を含む。「自己増幅骨格」という用語は、ウイルスゲノムの自己複製を可能とする自己複製ウイルスの最小配列（複数可）のことを指す。例えば、アルファウイルスの自己複製を可能とする最小配列は、非構造タンパク質媒介増幅のための保存された配列（例えば、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及び／またはポリＡ配列）を含むことができる。自己複製骨格は、サブゲノミックウイルスＲＮＡの発現のための配列（例えば、アルファウイルスでは２６Ｓプロモーターエレメント）を含むこともできる。ＳＡＭベクターは、（＋）センスまたは（－）センス自己複製ウイルスに由来する骨格を有するベクターのような（＋）センスＲＮＡポリヌクレオチドまたは（－）センスＲＮＡポリヌクレオチドであってよい。自己複製ウイルスとしては、これらに限定されるものではないが、アルファウイルス、フラビウイルス（例えば、クンジンウイルス）、麻疹ウイルス、及びラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス）が挙げられる。自己複製ウイルス由来のＳＡＭベクターシステムの例は、あらゆる目的で本明細書に参照により援用する、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１８ Ｄｅｃ １３；２３（１２）．ｐｉｉ：Ｅ３３１０．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２３１２３３１０）により詳細に記載されている。
Ｖ．Ｃ．１．アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモーガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ－８３などの新世界型に分類される（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４）。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約１２ｋｂであり、その最初の２／３は、ウイルスゲノムを自己複製するためのＲＮＡ複製複合体を形成する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードする遺伝子を含んでおり、最後の１／３は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる（Ｆｒｏｌｏｖ ＲＮＡ ２００１）。
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモーガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ－８３などの新世界型に分類される（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４）。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約１２ｋｂであり、その最初の２／３は、ウイルスゲノムを自己複製するためのＲＮＡ複製複合体を形成する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードする遺伝子を含んでおり、最後の１／３は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる（Ｆｒｏｌｏｖ ＲＮＡ ２００１）。
アルファウイルスのモデル生活環は、複数の異なるステップを含む（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４，Ｊｏｓｅ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００９）。宿主細胞にウイルスが吸着した後、ビリオンが細胞内区画内の膜と融合し、最終的にゲノムＲＮＡをサイトゾル中に放出する。プラス鎖の向きを有し、５’末端のメチルグアニル酸キャップ及び３’末端のポリＡテールを有するゲノムＲＮＡは、翻訳されて非構造タンパク質ｎｓＰ１－４を生成し、これが複製複合体を形成する。感染初期には、プラス鎖はこの複合体によってマイナス鎖の鋳型に複製される。現在のモデルでは、複製複合体は感染が進行するにつれてさらにプロセシングされ、生じたプロセス後の複合体はマイナス鎖の完全長プラス鎖ゲノムＲＮＡ及び構造遺伝子を含む２６Ｓのサブゲノムプラス鎖ＲＮＡへの転写に切り替わる。アルファウイルスのいくつかの保存配列エレメント（ＣＳＥ）が、マイナス鎖鋳型からのプラス鎖ＲＮＡの複製における５’ＵＴＲの相補体、ゲノム鋳型からのマイナス鎖合成の複製における５１ｎｔのＣＳＥ、マイナス鎖からのサブゲノムＲＮＡの転写におけるｎｓＰと２６Ｓ ＲＮＡとのジャンクション領域内の２４ｎｔのＣＳＥ、及び、プラス鎖鋳型からのマイナス鎖合成における３’末端の１９ｎｔのＣＳＥを含む様々なＲＮＡ合成ステップにおいて潜在的に一定の役割を担っているものとして同定されている。
ウイルスの自然の生活環では、異なるＲＮＡ種の複製後、ウイルス粒子が通常、アセンブルされる。２６Ｓ ＲＮＡは翻訳され、生じたタンパク質はさらにプロセシングされて、カプシドタンパク質、糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、ならびに２種類の小ポリペプチドＥ３及び６Ｋを含む構造タンパク質を生成する（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。ウイルス粒子のカプシド形成が生じ、通常はゲノムＲＮＡのみに特異的なカプシドタンパク質がパッケージングされた後、ビリオンがアセンブルされ、膜表面に出芽する。
Ｖ．Ｃ．２．送達ベクターとしてのアルファウイルス
アルファウイルス（アルファウイルス配列、特徴、及び、他の要素）を使用してアルファウイルスベースの送達ベクター（アルファウイルスベクター、アルファウイルスウイルスベクター、アルファウイルスワクチンベクター、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクター、または自己増幅ＲＮＡ（ｓａｍＲＮＡ）ベクターとも称される）を作製することができる。アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７，Ｒｈｅｍｅ ２００４）。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有しうる。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、ＶＥＥのＴＣ－８３株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの抗原発現を可能とし、抗原に対する強い免疫応答を刺激し、ベクター自体に対する免疫応答は刺激せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、抗原発現カセットは、ベクターが、ＶＥＥまたはその弱毒化誘導株ＴＣ－８３に由来する配列を含む（ただしこれらに限定されない）どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を刺激するように設計することができる。
アルファウイルス（アルファウイルス配列、特徴、及び、他の要素）を使用してアルファウイルスベースの送達ベクター（アルファウイルスベクター、アルファウイルスウイルスベクター、アルファウイルスワクチンベクター、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクター、または自己増幅ＲＮＡ（ｓａｍＲＮＡ）ベクターとも称される）を作製することができる。アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７，Ｒｈｅｍｅ ２００４）。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有しうる。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、ＶＥＥのＴＣ－８３株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの抗原発現を可能とし、抗原に対する強い免疫応答を刺激し、ベクター自体に対する免疫応答は刺激せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、抗原発現カセットは、ベクターが、ＶＥＥまたはその弱毒化誘導株ＴＣ－８３に由来する配列を含む（ただしこれらに限定されない）どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を刺激するように設計することができる。
アルファウイルス配列を用いたいくつかの発現ベクターの設計戦略が開発されている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。１つの戦略では、アルファウイルスベクターの設計は、構造タンパク質遺伝子の下流に２６Ｓプロモーター配列因子の第２のコピーを挿入した後、異種遺伝子を挿入することを含む（Ｆｒｏｌｏｖ １９９３）。これにより、天然の非構造及び構造タンパク質以外に、さらなる異種タンパク質を発現するサブゲノムＲＮＡが産生される。このシステムでは、感染性ビリオンを産生するためのすべての因子が存在し、したがって、非感染細胞において発現ベクターの繰り返しの感染のラウンドが行われうる。
別の発現ベクターの設計では、ヘルパーウイルスシステムを利用する（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。この戦略では、構造タンパク質は異種遺伝子によって置換される。したがって、依然としてインタクトな非構造遺伝子によって媒介されるウイルスＲＮＡの自己複製の後、２６ＳサブゲノムＲＮＡが異種タンパク質の発現をもたらす。従来、構造タンパク質を発現するさらなるベクターが、例えば、細胞株の同時トランスフェクションなどによってイン・トランスで与えられることで感染性ウイルスを生じる。１つのシステムが米国特許第８，０９３，０２１号に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。ヘルパーベクターシステムは、感染性粒子を形成する可能性を制限するという長所をもたらし、したがってバイオセーフティーを改善する。さらに、ヘルパーベクターシステムは、全ベクター長を短縮し、複製及び発現の効率を改善する可能性がある。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、構造タンパク質が抗原カセットで置換されたアルファウイルス骨格を用いることができ、得られるベクターはバイオセーフティーの問題が低減されるのと同時に全体的な発現ベクターのサイズの減少により、効率的な発現を促進する。
Ｖ．Ｃ．３．インビトロでの自己増幅ウイルスの生成
ＲＮＡ生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳（ＩＶＴ）がある。この方法では、所望のベクターのＤＮＡ鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。
ＲＮＡ生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳（ＩＶＴ）がある。この方法では、所望のベクターのＤＮＡ鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。
このＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡに転写されることが望ましい配列（例えば、ＳＡＭ）の５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、Ｋ１１、またはＳＰ６などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。選択された特異的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に応じて、さらなる５’ヌクレオチドが所望の配列に加えて転写され得る。例えば、カノニカルＴ７プロモーターは、配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ（配列番号１１８）により参照することができ、所望の配列Ｎの生成にＤＮＡ鋳型ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＮ（配列番号１１９）を用いたＩＶＴ反応によってｍＲＮＡ配列ＧＧ－Ｎが得られる。一般的に、また、理論によって束縛されることを望まずに言えば、Ｔ７ポリメラーゼは、グアノシンで始まるＲＮＡ転写物をより効率的に転写することができる。さらなる５’ヌクレオチドが望ましくない（例えば、さらなるＧＧが望ましくない）場合、ＤＮＡ鋳型に含まれるＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、所望の配列の５’ヌクレオチドのみを含む転写物を生じる配列（例えば、ＳＡＭベクターが由来する自己複製ウイルスの天然の５’配列を有するＳＡＭ）とすることができる。例えば、最小Ｔ７プロモーターは、配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡにより参照することができ、所望の配列Ｎの生成にＤＮＡ鋳型ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＮを用いたＩＶＴ反応によってｍＲＮＡ配列Ｎが得られる。同様に、ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡにより参照することができる最小ＳＰ６プロモーターを使用してさらなる５’ヌクレオチドを含まない転写物を生成することができる。一般的なＩＶＴ反応では、ＤＮＡ鋳型は、適当なＲＮＡポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド（ＮＴＰ）とインキュベートされる。
得られたＲＮＡポリヌクレオチドは、７－メチルグアノシンまたは関連する構造などの５’キャップ構造の付加、及び場合によりポリアデニル化（ポリＡ）テールを有するように３’末端を改変することを含む（ただしこれらに限定されない）方法によって、場合によりさらに改変することができる。改変ＩＶＴ反応では、ＲＮＡは、ＩＶＴにおいてキャップアナログの付加によって同時転写により５’キャップ構造でキャッピングされる。キャップアナログとしては、ジヌクレオチド（（ｍ７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ）キャップアナログまたはトリヌクレオチド（ｍ７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ－Ｎ）キャップアナログ（Ｎは、ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド（例えば、これらに限定されるものではないが、アデノシン、グアノシン、シチジン、及びウリジンを含むリボヌクレオシド）を表す）。例示的キャップアナログ及びＩＶＴ反応におけるそれらの使用については、あらゆる目的で本明細書に参照により援用する米国特許第１０，５１９，１８９号にもより詳細に記載されている。上記に述べたように、Ｔ７ポリメラーゼはグアノシンで始まるＲＮＡ転写物をより効率的に転写することができる。グアノシンで始まらない鋳型の転写効率を高めるために、トリヌクレオチドキャップアナログ（ｍ７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ－Ｎ）を使用することができる。トリヌクレオチドキャップアナログは、ジヌクレオチドキャップアナログ（ｍ７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ）を使用したＩＶＴ反応に対して転写効率を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、またはそれ以上、高めることができる。
例えば、ｍＲＮＡ ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ及びＳ－アデノシルメチオニンを含むワクシニアキャッピングシステム（例えば、ＮＥＢカタログ番号Ｍ２０８０）を用いることなどにより、５’キャップ構造を転写後に付加することもできる。
得られたＲＮＡポリヌクレオチドは、場合により、ポリアデニレート（ポリＡ）テールを含むように３’末端を修飾することを含むがこれに限定されない、記載されるキャッピング法とは別に、またはそれに加えてさらに修飾することができる。
次に、ＲＮＡをフェノールクロロホルム抽出などの当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
Ｖ．Ｃ．４．脂質ナノ粒子による送達
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の１つとして、ベクター自体に対する免疫がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の１つとして、ベクター自体に対する免疫がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
アルファウイルスベクターの場合では、標準的な送達方法は、カプシド、Ｅ１、及びＥ２タンパク質をイン・トランスで与えることによって感染性のウイルス粒子を生じる上記に述べたヘルパーウイルスシステムである。しかしながら、Ｅ１及びＥ２タンパク質は、しばしば中和抗体の主要な標的である点に留意することが重要である（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。したがって、対象とする抗原を標的細胞に送達するためにアルファウイルスベクターを使用することの有効性は、感染性粒子が中和抗体の標的とされる場合に低下する可能性がある。
ウイルス粒子を媒介とした遺伝子送達の代替的手法として、ナノ粒子を用いた発現ベクターの送達がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。重要な点として、ナノ材料担体は、非免疫原性材料で形成することができ、送達ベクター自体に対する免疫の刺激を一般的に回避することができる。これらの材料としては、これらに限定されるものではないが、脂質、無機ナノ材料、及び他のポリマー材料を挙げることができる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。かかる材料は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、脂肪、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、及び脂溶性ビタミンを含みうる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、膜及び小胞状構造の形成を可能とする脂質の両親媒性の性質のために魅力的な送達システムである（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。一般的にこれらの小胞は、標的細胞の膜内に吸収され、サイトゾル中に核酸を放出することによって発現ベクターを送達する。さらに、ＬＮＰは特定の細胞種のターゲティングを促すようにさらに改変または官能化することができる。ＬＮＰの設計における別の考慮事項は、ターゲティングの効率と細胞毒性との間のバランスである。脂質の組成は一般的に、カチオン性、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質の規定の混合物を含む。いくつかの例では、ＬＮＰの凝集を防止するか、脂質の酸化を防止するか、またはさらなる部分の付着を促す化学官能基を与えるために特定の脂質が含まれる。脂質の組成は、全体のＬＮＰのサイズ及び安定性に影響しうる。１つの例では、脂質の組成は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）またはＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３及びＭＣ３様脂質の組成物は、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ複合化脂質、ステロール、または中性脂質などの１種類以上の他の脂質を含むように製剤化することができる。
血清に直接曝露された発現ベクターなどの核酸ベクターは、血清中のヌクレアーゼによる核酸の分解、または遊離核酸による免疫系のオフターゲットの刺激を含むいくつかの望ましくない影響を有しうる。したがって、アルファウイルスベクターの封入を利用して分解を防止する一方で、潜在的なオフターゲット効果も防止することができる。特定の例では、アルファウイルスベクターは、ＬＮＰの水性の内部など、送達担体内に完全に封入される。ＬＮＰ内へのアルファウイルスベクターの封入は、微小流体液滴生成装置で行われる微小流体混合及び液滴生成などの当該技術分野では周知の方法によって実施することができる。かかる装置としては、これらに限定されるものではないが、標準的なＴジャンクション装置またはフローフォーカシング装置が挙げられる。１つの例では、ＭＣ３またはＭＣ３様分子含有組成物などの所望の脂質製剤を、アルファウイルス送達ベクター及び他の所望の物質と並行して液滴生成装置に供給することで、送達ベクター及び所望の物質がＭＣ３またはＭＣ３様分子ベースのＬＮＰの内部に完全に封入される。１つの例では、液滴生成装置は、生成されたＬＮＰの粒径範囲及び粒度分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、直径１～１０００ｎｍの範囲の粒径、例えば、１、１０、５０、１００、５００、または１０００ｎｍの粒径を有することができる。液滴生成の後、発現ベクターを封入した送達ベクターを、投与に備えてさらに処理または改変することができる。
Ｖ．Ｄ．チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）
Ｖ．Ｄ．１．チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
１つ以上の抗原を送達する（例えば、抗原カセットにより）ためのワクチン組成物は、チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることにより作出することができる。チンパンジーＣ６８アデノウイルス（本明細書ではＣｈＡｄＶ６８とも呼ぶ）のヌクレオチド配列を、抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる（配列番号１を参照）。Ｃ６８アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第６，０８３，７１６号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
Ｖ．Ｄ．１．チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
１つ以上の抗原を送達する（例えば、抗原カセットにより）ためのワクチン組成物は、チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることにより作出することができる。チンパンジーＣ６８アデノウイルス（本明細書ではＣｈＡｄＶ６８とも呼ぶ）のヌクレオチド配列を、抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる（配列番号１を参照）。Ｃ６８アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第６，０８３，７１６号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
さらなる態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列と、発現を誘導する調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む組換えアデノウイルスが提供される。この組換えウイルスは、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞に感染させることが可能であり、細胞内で新生抗原カセットの産物を発現することが可能である。このベクターでは、天然のチンパンジーＥ１遺伝子、及び／またはＥ３遺伝子、及び／またはＥ４遺伝子を欠失させることができる。抗原カセットを、これらの遺伝子欠失部位のいずれに挿入することもできる。抗原カセットは、それに対するプライミングされた免疫応答が望ましい抗原を含むことができる。
別の態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスを感染させた哺乳動物細胞が提供される。
さらなる別の態様では、チンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＣ６８由来の）またはその機能的フラグメントを発現する新規な哺乳動物細胞株が提供される。
いっそうさらなる態様において、本明細書では、哺乳動物細胞内に抗原カセットを送達するための方法であって、細胞内に、抗原カセットを発現するように操作された、有効量のＣ６８などのチンパンジーアデノウイルスを導入する工程を含む方法が提供される。
さらなる別の態様は、哺乳動物宿主に免疫応答を刺激する方法を提供する。この方法は、免疫応答が標的とする感染に由来する１種類以上の抗原をコードする抗原カセットを含む、有効量のＣ６８などの組換えチンパンジーアデノウイルスを宿主に投与する工程を含むことができる。
さらなる別の態様は、哺乳動物宿主に免疫応答を刺激して、感染症などの対象の疾患を治療または予防するための方法を提供する。この方法は、免疫応答が標的とする感染症に由来する抗原などの１つ以上の抗原をコードする抗原カセットを含む、有効量のＣ６８などの組換えチンパンジーアデノウイルスを宿主に投与する工程を含むことができる。
さらに、配列番号１の配列から得られるチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する非サル哺乳動物細胞も開示される。この遺伝子は、配列番号１のアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群から選択することができる。
さらに、配列番号１の配列から得られる遺伝子を含むチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列を含む核酸分子も開示される。この遺伝子は、配列番号１の前記チンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択することができる。いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１を含む。いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失した、配列番号１の配列を含む。
さらに、配列番号１から得られるチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、異種宿主細胞内でカセットの発現を誘導する１つ以上の調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含むベクターであって、場合により、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列が、複製及びカプシド形成に必要とされる少なくともシスエレメントを含み、シスエレメントが抗原カセット及び調節配列に隣接している、ベクターも開示される。いくつかの態様において、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子配列から選択される遺伝子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、Ｅ１Ａ及び／またはＥ１Ｂ遺伝子を欠失していてもよい。
本明細書では、欠失または部分欠失Ｅ４ｏｒｆ２領域及び欠失または部分欠失Ｅ４ｏｒｆ３領域、及び場合により、欠失または部分欠失Ｅ４ｏｒｆ４領域を含む部分欠失Ｅ４遺伝子を含むアデノウイルスベクターも開示される。部分欠失Ｅ４は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２のＥ４欠失を含むことができ、ベクターは、配列番号１に記載される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分欠失Ｅ４は、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３４，９４２の少なくとも部分欠失、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９５２～３５，３０５の少なくとも部分欠失、及び配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，３０２～３５，６４２の少なくとも部分欠失のＥ４欠失を含むことができ、ベクターは、配列番号１に記載される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分欠失Ｅ４は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９８０～３６，５１６のＥ４欠失を含むことができ、ベクターは、配列番号１に記載される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分欠失Ｅ４は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９７９～３５，６４２のＥ４欠失を含むことができ、ベクターは、配列番号１に記載される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分欠失Ｅ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、完全欠失したＥ４Ｏｒｆ３、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失のＥ４欠失を含むことができる。部分欠失Ｅ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、Ｅ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失のＥ４欠失を含むことができる。部分欠失Ｅ４は、Ｅ４Ｏｒｆ１の少なくとも部分欠失、完全欠失したＥ４Ｏｒｆ２、及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失のＥ４欠失を含むことができる。部分欠失Ｅ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失のＥ４欠失を含むことができる。部分欠失Ｅ４は、Ｅ４Ｏｒｆ１の開始部位からＥ４Ｏｒｆ５の開始部位までのＥ４欠失を含むことができる。部分欠失Ｅ４は、Ｅ４Ｏｒｆ１の開始部位に隣接したＥ４欠失であってよい。部分欠失Ｅ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の開始部位に隣接したＥ４欠失であってよい。部分欠失Ｅ４は、Ｅ４Ｏｒｆ３の開始部位に隣接したＥ４欠失であってよい。部分欠失Ｅ４は、Ｅ４Ｏｒｆ４の開始部位に隣接したＥ４欠失であってよい。Ｅ４欠失は、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、少なくとも１５００、少なくとも１６００、少なくとも１７００、少なくとも１８００、少なくとも１９００、ｏｒ 少なくとも２０００ヌクレオチドであってよい。Ｅ４欠失は、少なくとも７００ヌクレオチドであってよい。Ｅ４欠失は、少なくとも１５００ヌクレオチドであってよい。Ｅ４欠失は、５０以下、１００以下、２００以下、３００以下、４００以下、５００以下、６００以下、７００以下、８００以下、９００以下、１０００以下、１１００以下、１２００以下、１３００以下、１４００以下、１５００以下、１６００以下、１７００以下、１８００以下、１９００以下、または２０００ヌクレオチド以下であってよい。Ｅ４欠失は、７５０ヌクレオチド以下であってよい。Ｅ４欠失は、少なくとも１５５０ヌクレオチドまたはそれ以下であってよい。
さらに、抗原カセットを発現するように操作されたＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターをトランスフェクトした宿主細胞も開示される。さらに、細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することによって細胞内に導入された選択された遺伝子を発現するヒト細胞も開示される。
さらに、哺乳動物細胞に抗原カセットを送達するための方法であって、前記細胞内に、抗原カセットを発現するように操作された有効量のＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターを導入することを含む方法も提供される。
さらに、哺乳動物細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することと、適当な条件下で細胞を培養することと、抗原を産生することと、を含む、抗原を産生するための方法も開示される。
Ｖ．Ｄ．２．Ｅ１を発現する相補性細胞株
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス（Ａｄ）を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能（ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合）をヘルパーウイルスまたは細胞株（すなわち、相補性またはパッケージング細胞株）によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはＨＥＫ２９３またはそのバリアントが含まれうる。チンパンジーＥ１遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール（米国特許第６，０８３，７１６号の実施例３及び４）にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス（Ａｄ）を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能（ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合）をヘルパーウイルスまたは細胞株（すなわち、相補性またはパッケージング細胞株）によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはＨＥＫ２９３またはそのバリアントが含まれうる。チンパンジーＥ１遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール（米国特許第６，０８３，７１６号の実施例３及び４）にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
ＡＡＶ強化アッセイを用いてチンパンジーアデノウイルスＥ１発現細胞株を同定することができる。このアッセイは、他の特性評価されていないアデノウイルス（例えば他の種由来）のＥ１遺伝子を使用して作製された細胞株においてＥ１の機能を同定するうえで有用である。このアッセイは米国特許第６，０８３，７１６号の実施例４Ｂに記載されている。
選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＥ１）は、選択された親細胞株で発現するためのプロモーターの転写制御下にある可能性がある。この目的で誘導性または構成性プロモーターを用いることができる。誘導性プロモーターには、亜鉛によって誘導されるヒツジメタロチオニンプロモーター、または糖質コルチコイド、特にデキサメタゾンによって誘導されるマウス哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）がある。本明細書に参照により援用するところの国際出願第ＷＯ９５／１３３９２号において特定されるものなどの他の誘導性プロモーターもパッケージング細胞株の作製に使用することができる。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の発現を制御する構成性プロモーターも用いることができる。
任意の所望のＣ６８遺伝子を発現する新規な細胞株を作製するために親細胞を選択することができる。限定されることなく、かかる親細胞株は、ＨｅＬａ［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１８５］、ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２］、及びＷＩ－３８［ＣＣＬ７５］細胞であってよい。他の適当な親細胞株を他の供給元から入手することができる。親細胞株としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａを挙げることができる。
Ｅ１発現細胞株は、組換えチンパンジーアデノウイルスＥ１欠失ベクターの作製において有用となりうる。１つ以上の他のチンパンジーアデノウイルス遺伝子産物を発現する基本的に同じ手順を用いて構築された細胞株は、これらの産物をコードする遺伝子に欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルスベクターの作製において有用である。さらに、他のヒトＡｄＥ１遺伝子産物を発現する細胞株も、チンパンジー組換えＡｄを作製するうえで有用である。
Ｖ．Ｄ．３．ベクターとしての組換えウイルス粒子
本明細書に開示される組成物は、少なくとも１種類の抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、Ｃ６８のようなチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む。Ｃ６８ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。Ｃ６８ベクターは１つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。抗原カセットは、プロモーターなどの１つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも１つの抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
本明細書に開示される組成物は、少なくとも１種類の抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、Ｃ６８のようなチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む。Ｃ６８ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。Ｃ６８ベクターは１つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。抗原カセットは、プロモーターなどの１つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも１つの抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
「機能的に欠失された」という用語は、その遺伝子領域の十分な量が除去または例えば変異もしくは改変により他の形で変化させられていることにより、その遺伝子領域が遺伝子発現の１つ以上の機能的産物を産生できなくなっていることを意味する。機能的欠失につながりうる変異または改変としては、これらに限定されるものではないが、未成熟終止コドンの導入及び基準及び非基準開始コドンの除去のようなナンセンス変異、ｍＲＮＡスプライシングまたは他の転写プロセシングを変化させる変異、またはこれらの組み合わせが挙げられる。必要な場合、遺伝子領域全体を除去することができる。
配列の欠失、挿入、及び他の変異を含む、本明細書に開示されるベクターを形成する核酸配列の改変は、標準的な分子生物学的手法を用いて生成することができるものであり、本明細書の範囲内である。
Ｖ．Ｄ．４．ウイルスプラスミドベクターの構築
本発明で有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、Ｅ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子に機能的欠失を有し、場合により例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている［例えば、上記に引用のＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びＩＩ、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第５，２４０，８４６号を参照］。
本発明で有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、Ｅ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子に機能的欠失を有し、場合により例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている［例えば、上記に引用のＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びＩＩ、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第５，２４０，８４６号を参照］。
抗原カセットをヒト（または他の哺乳動物）細胞に送達するための有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターの構築において、広範囲のアデノウイルス核酸配列をベクターに用いることができる。最小のチンパンジーＣ６８アデノウイルス配列を含むベクターをヘルパーウイルスとともに使用して感染性の組換えウイルス粒子を作製することができる。ヘルパーウイルスは、最小のチンパンジーアデノウイルスベクターのウイルス感染性及び増殖に必要な基本的な遺伝子産物を提供する。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の１つ以上の選択された欠失のみが、欠失がなければ機能性のウイルスベクターに導入される場合、欠失された遺伝子産物は、欠失された遺伝子機能をイン・トランスで与えるウイルスを選択されたパッケージング細胞株内で増殖させることによるウイルスベクター作製プロセスで供給することができる。
Ｖ．Ｄ．５．組換え最小アデノウイルス
最小チンパンジーＡｄ Ｃ６８ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の５’及び３’の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（複製起点として機能する）と、天然の５’パッケージング／エンハンサードメイン（直鎖状のＡｄのゲノム及びＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む）とを含む。例えば、国際出願第ＷＯ９６／１３５９７号において「最小」ヒトＡｄベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
最小チンパンジーＡｄ Ｃ６８ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の５’及び３’の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（複製起点として機能する）と、天然の５’パッケージング／エンハンサードメイン（直鎖状のＡｄのゲノム及びＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む）とを含む。例えば、国際出願第ＷＯ９６／１３５９７号において「最小」ヒトＡｄベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
Ｖ．Ｄ．６．他の欠損アデノウイルス
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のＡｄベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のＡｄベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
１つの例として、適当なベクターは、Ｃ６８アデノウイルスの最初期遺伝子Ｅ１ａ及び後初期遺伝子Ｅ１ｂの全体または十分な部分を欠失させることにより、それらの正常な生物学的機能を失わせることによって形成することができる。複製不全Ｅ１欠失ウイルスは、対応する遺伝子産物をイン・トランスで与える機能的アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を含むチンパンジーのアデノウイルス形質転換相補性細胞株で増殖させた場合に感染性のウイルスを複製及び生成することが可能である。既知のアデノウイルス配列に対する相同性に基づけば、得られる組換えチンパンジーアデノウイルスは、当該技術分野のヒト組換えＥ１欠失アデノウイルスでそうであるように多くの細胞種に感染することが可能であり、抗原（複数可）を発現することができるが、チンパンジーＥ１領域ＤＮＡを有していない多くの細胞では、細胞が極めて高い感染多重度で感染していないかぎりは複製できないものと予想される。
別の例として、Ｃ６８アデノウイルス後初期遺伝子Ｅ３の全体または一部を、組換えウイルスの一部を形成するチンパンジーアデノウイルス配列から除去することができる。
チンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターは、Ｅ４遺伝子の欠失を有するように構築することもできる。さらに別のベクターは、後初期遺伝子Ｅ２ａに欠失を有することができる。
欠失は、チンパンジーＣ６８アデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１～Ｌ５のいずれに導入することもできる。同様に、中期遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２内の欠失も特定の目的では有用となりうる。他の欠失を他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子に導入することもできる。
上記に述べた欠失は、個々に用いることもできる。すなわち、アデノウイルス配列はＥ１のみの欠失を有してもよい。また、それらの生物学的活性を破壊または低減するうえで効果的な遺伝子全体またはその一部を任意の組み合わせで用いることもできる。例えば、１つの例示的なベクターでは、アデノウイルスＣ６８配列は、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子、またはＥ１、Ｅ２ａ、及びＥ３遺伝子、またはＥ１及びＥ３遺伝子、または、Ｅ３の欠失をともなうかまたはともなわない、Ｅ１、Ｅ２ａ、及びＥ４遺伝子の欠失を有することができる。上記に述べたように、かかる欠失は、所望の結果を得るために温度感受性変異などの他の変異と組み合わせて用いることができる。
抗原（複数可）を含むカセットを場合によりチンパンジーＣ６８Ａｄウイルスの任意の欠失領域に挿入する。また、必要に応じて既存の遺伝子領域内にカセットを挿入することでその領域の機能を破壊することもできる。
Ｖ．Ｄ．７．ヘルパーウイルス
抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに十分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに十分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターコンストラクト中に存在しない、及び／またはベクターをトランスフェクトしたパッケージング細胞株によって発現されない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。ヘルパーウイルスは複製不全であってよく、上記に述べた配列以外の様々なアデノウイルス遺伝子を含むことができる。ヘルパーウイルスは、本明細書に記載されるＥ１発現細胞株と組み合わせて用いることができる。
Ｃ６８では、「ヘルパー」ウイルスは、Ｃ６８ゲノムのＣ末端を、ウイルスの左端から約１３００ｂｐを除去するＳｓｐＩによって短縮することによって形成されるフラグメントとすることができる。次に、この短縮されたウイルスをプラスミドＤＮＡとともにＥ１発現細胞株内に同時トランスフェクトすることにより、プラスミド内のＣ６８配列との相同組み換えによって組換えウイルスを形成する。
ヘルパーウイルスは、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５－１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（Ａｐｒ．１，１９９４）に記載されるようなポリカチオン複合体として形成することもできる。ヘルパーウイルスは、場合によりレポーター遺伝子を含んでもよい。多くのかかるレポーター遺伝子が当該技術分野で知られている。アデノウイルスベクター上の抗原カセットとは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在によって、Ａｄベクターとヘルパーウイルスを独立して観察することが可能となる。この第２のレポーター遺伝子を用いることで、精製時に得られた組換えウイルスとヘルパーウイルスとを分離することが可能である。
Ｖ．Ｄ．８．ウイルス粒子のアセンブリと細胞株の感染
アデノウイルス、抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたＤＮＡ配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のｃＤＮＡのクローニング法、インビトロ組換え法（例えば、ギブソンアセンブリ）、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組み換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
アデノウイルス、抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたＤＮＡ配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のｃＤＮＡのクローニング法、インビトロ組換え法（例えば、ギブソンアセンブリ）、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組み換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
例えば、所望の抗原を含むウイルスベクターの構築及びアセンブリの後、ベクターをインビトロでヘルパーウイルスの存在下でパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができる。ヘルパーとベクター配列との間で相同組み換えが起こり、これによりベクター内のアデノウイルス－抗原配列が複製されてビリオンカプシド内にパッケージングされ、組換えウイルスベクター粒子が得られる。
得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルスは、抗原カセットを選択された細胞に導入するうえで有用である。パッケージング細胞株内で増殖させた組換えウイルスを用いたインビボ実験において、Ｅ１欠失組換えチンパンジーアデノウイルスが、カセットを非チンパンジー細胞、好ましくはヒト細胞に導入するうえで実用性を有することが実証されている。
Ｖ．Ｄ．９．組換えウイルスベクターの使用
したがって、抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルス（上記に述べたようなアデノウイルスベクターとヘルパーウイルス、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株の組み込みにより作製される）は、抗原（複数可）をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
したがって、抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルス（上記に述べたようなアデノウイルスベクターとヘルパーウイルス、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株の組み込みにより作製される）は、抗原（複数可）をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
上記に述べた組換えベクターは、遺伝子治療について公開されている方法にしたがってヒトに投与される。抗原カセットを有するチンパンジーウイルスベクターは、好ましくは生体適合性溶液または薬学的に許容される送達溶媒中に懸濁させて患者に投与することができる。適当な溶媒としては滅菌生理食塩水が挙げられる。薬学的に許容される担体として知られ、当業者には周知のものである他の水性及び非水性等張滅菌注射溶液、ならびに水性及び非水性滅菌懸濁液をこの目的で使用することもできる。
チンパンジーアデノウイルスベクターは、ヒト細胞を形質転換し、医療分野の当業者によって判定することが可能な有害作用をともなわずに、または医学的に許容される生理学的作用をともなって、治療効果を与えるうえで十分なレベルの抗原の導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、肝臓、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせることができる。
ウイルスベクターの用量は、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの因子に主として依存し、したがって患者間で異なりうる。用量は、あらゆる副作用に対して治療効果のバランスが取れるように調節され、かかる用量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて異なりうる。抗原（複数可）の発現レベルを観察することにより、投与頻度を決定することができる。
組換え複製不全アデノウイルスは、「薬学的有効量」、すなわち、所望の細胞をトランスフェクトし、ワクチン効果、すなわち一定の測定可能なレベルの防御免疫をもたらすような選択された遺伝子の十分な発現レベルを与えるのにある投与経路で有効な組換えアデノウイルスの量で投与することができる。抗原を含むＣ６８ベクターは、アジュバントと同時投与することができる。アジュバントは、ベクターとは別のモノマーの出会ってもよく（例えばミョウバン）または特にアジュバントがタンパク質である場合にはベクター内にコードされてもよい。アジュバントは当該技術分野では周知のものである。
従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせるか、または免疫原もしくは疾患に応じて調節することができる。例えば、狂犬病の予防では、皮下、気管内、及び鼻腔内経路が好ましい。投与経路は、主として治療される疾患の性質によって決められる。
抗原（複数可）の発現レベルを観察することにより、ブースターの必要性（ある場合）を決定することができる。例えば、血清中の抗体力価の評価の後、必要に応じてブースター免疫が望ましい場合がある。
ＶＩ．治療及び製造方法
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の抗原などの１つ以上の抗原を対象に投与することにより、対象における感染症生物特異的（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的）な免疫応答を誘導し、感染症生物に対するワクチン接種を行い、対象の感染症生物に関連した感染症の症状を治療及びまたは緩和する方法も提供される。
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の抗原などの１つ以上の抗原を対象に投与することにより、対象における感染症生物特異的（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的）な免疫応答を誘導し、感染症生物に対するワクチン接種を行い、対象の感染症生物に関連した感染症の症状を治療及びまたは緩和する方法も提供される。
いくつかの態様では、対象は、年齢、地理的／移動、及び／または仕事に関連した感染症の高いリスクまたは素因など、感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によるＣｏｖｉｄ－１９）を診断されているかまたは感染症のリスクを有する、または季節性及び／または新規の疾患感染のリスクを有する。
抗原は、ＣＴＬ応答を刺激するのに十分な量で投与することができる。抗原は、Ｔ細胞応答を刺激するのに十分な量で投与することができる。抗原は、Ｂ細胞応答を刺激するのに十分な量で投与することができる。
抗原は、単独で、または他の治療薬と併用して投与することができる。治療薬は、抗ウイルス剤または抗生剤などの感染症生物を標的とするものを含みうる。
ワクチン組成物中に含まれる各抗原の最適量及び最適な投与レジメンを決定することができる。例えば、抗原またはそのバリアントは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射用に製剤化することができる。注射の方法としては、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、及び静脈内（ｉ．ｖ．）が挙げられる。ＤＮＡまたはＲＮＡの注射方法としては、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）及び静脈内（ｉ．ｖ．）が挙げられる。ワクチン組成物の他の投与方法は、当業者には周知のものである。
ワクチンは、組成物中に存在する抗原の選択、数、及び／または量が、組織、感染症、及び／または患者に特異的であるように適合することができる。例えば、ペプチドの正確な選択は、特定の親タンパク質の発現パターンによって導くか、または患者の変異もしくは疾患状態によって導くことができる。この選択は、特定の感染症（例えば、対象が感染している、または感染のリスクのある特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離物）、疾患の状態、ワクチン接種の目的（例えば、予防的かまたは進行中の疾患を標的としているか）、初期の治療レジメン、患者の免疫状態、及び、言うまでもなく、患者のＨＬＡハロタイプに依存しうる。さらに、ワクチンは、特定の患者の個人的ニーズにしたがって、個別化された成分を含むことができる。例としては、特定の患者における抗原の発現にしたがって抗原の選択を変えること、または治療の第１ラウンドもしくはスキーム後の二次的治療を調整することが挙げられる。
抗原ワクチンの投与を行うための患者は、様々な診断方法、例えば、下記でさらに述べる患者選択方法の使用により特定することができる。患者選択では、１つ以上の遺伝子の変異または発現パターンを特定することを行うことができる。患者選択では、進行中の感染の感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及び／または特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離物の存在）を特定することを行うことができる。患者選択では、感染症による感染のリスクを特定することを行うことができる。場合により、患者選択では、患者のハプロタイプを特定することを行う。様々な患者選択方法を並行して行うことができ、例えば、シークエンシング診断によって患者の変異及びハプロタイプの両方を特定することができる。様々な患者選択方法を順次行うこともでき、例えば、１つの診断検査で変異を特定し、別の診断検査で患者のハプロタイプを特定し、その場合、各検査は、同じ（例えば、両方ともハイスループットシークエンシング）か、または異なる（例えば、一方がハイスループットシークエンシングで他方がサンガーシークエンシング）診断方法であってよい。
組成物が感染症のワクチンとして使用されるためには、正常組織で高量で発現される類似の正常な自己ペプチドを含む抗原が、本明細書に記載される組成物中で避けられるかまたは低量で存在してもよい。これに対して、患者の感染細胞が特定の抗原を高量で発現していることが分かっている場合、この感染の治療用のそれぞれの医薬組成物を高量で存在させることができ、及び／またはこの特定の抗原またはこの抗原の経路に対して特異的な複数の抗原が含まれてもよい。
抗原を含む組成物を、既に感染症に罹患している個人に投与することができる。治療用途では、組成物は、感染症生物抗原に対する効果的なＣＴＬを刺激し、症状及び／または合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するうえで十分な量で患者に投与される。これを実現するのに適した量は、「治療有効用量」として定義される。この目的で有効な量は、例えば、組成物、投与形態、治療される疾患のステージ及び重症度、患者の体重及び一般的状態、ならびに処方医師の判断によって決められる。組成物は、特に、感染症生物が誘導された臓器障害及び／または他の免疫病態を有する場合に、重篤な病状、すなわち命に関わる、または潜在的に命に関わる状況で一般的に用いることができる。そのような場合、外来物質及び抗原の相対的非毒性特性の最小化を考慮すると、治療にあたる医師によってこれらの組成物の大幅な過剰量を投与することが可能であり、望ましいと感じられるものと考えられる。
治療用途では、感染の検出または治療時に投与を開始することができる。これに続いて、少なくとも症状が実質的に消失するまで、その後の所定の期間、ブースター用量を投与することができる。
治療処置用の医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経鼻、経口、局所（ｌｏｃａｌ）投与を意図している。医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内投与することができる。組成物は、対象の特定の感染組織及び／または細胞を標的として投与することができる。本明細書では、抗原の溶液を含む非経口投与用の組成物を開示し、ワクチン組成物は許容される担体、例えば水性担体中に溶解または懸濁される。例えば、水、緩衝された水、０．９％生理食潜水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などの様々な水性担体を使用することができる。これらの組成物は従来の周知の滅菌法によって滅菌するか、または滅菌濾過することができる。得られた水溶液はそのまま使用されるようにパッケージングされてもよく、または凍結乾燥し、凍結乾燥した製剤を投与に先立って滅菌溶液と加え合わせることができる。組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどのｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤など、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含むことができる。
抗原は、リンパ系組織などの特定の細胞組織に抗原をターゲティングするリポソームによって投与することもできる。リポソームは、半減期を増大させるうえでも有用である。リポソームとしては、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などが挙げられる。これらの製剤中では、送達させようとする抗原を、単独で、または例えばＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などのリンパ系細胞に多くみられる受容体に結合する分子、または他の治療用もしくは免疫原性組成物と共にリポソームの一部として取り込ませる。したがって、所望の抗原で充填されたリポソームをリンパ系細胞の部位に誘導することができ、そこでリポソームは選択された治療用／免疫原性組成物を送達する。リポソームは、一般的に中性及び負に帯電したリン脂質とコレステロールのようなステロールとを含む標準的な小胞形成脂質から形成することができる。脂質の選択は、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性、及び血流中でのリポソームの安定性を考慮して一般的に導かれる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、及び同第５，０１９，３６９号に記載されるようなリポソームを調製するための様々な方法がある。
免疫細胞にターゲティングするため、リポソームに組み込むリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体またはそのフラグメントを含むことができる。リポソーム懸濁液を、とりわけ、投与方法、送達されるペプチド、及び治療される疾患のステージに応じて異なる用量で静脈内、局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）といった要領で投与することができる。
治療または免疫化の目的では、ペプチド及び場合により本明細書に記載されるペプチドの１つ以上をコードする核酸患者に投与してもよい。核酸を患者に投与するための多くの方法が便宜よく用いられる。例えば、核酸は「ネイキッドＤＮＡ」として直接投与することができる。このアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５－１４６８（１９９０）、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるような弾道送達を用いて投与することもできる。ＤＮＡのみで構成された粒子を投与することもできる。あるいは、ＤＮＡを金粒子のような粒子に付着させてもよい。核酸配列を送達するためのアプローチとしては、エレクトロポレーションを伴う、または伴わないウイルスベクター、ｍＲＮＡベクター、及びＤＮＡベクターが挙げられる。
核酸は、カチオン性脂質などのカチオン性化合物と複合体化して送達させることもできる。脂質により媒介される遺伝子送達法は、例えば、９６１８３７２ＷＯＡＷＯ９６／１８３７２、９３２４６４０ＷＯＡＷＯ９３／２４６４０、Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２－６９１（１９８８）、米国特許第５，２７９，８３３号Ｒｏｓｅ米国特許第５，２７９，８３３号、９１０６３０９ＷＯＡＷＯ９１／０６３０９、及びＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３－７４１４（１９８７）に記載されている。
抗原は、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照）、または、第２、第３、またはハイブリッド第２／第３世代レンチウイルス及び特定の細胞タイプまたは受容体をターゲティングするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１，Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８，Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０，Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照）などのウイルスベクターに基づいたワクチンプラットフォームに含まれるようにしてもよい。上記に述べたウイルスベクターに基づくワクチンプラットフォームのパッケージングキャパシティーに応じて、この手法は１つ以上の抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、変異が導入されていない配列を隣接させてもよく、リンカーによって分離されてもよく、または細胞内区画をターゲティングする１つ以上の配列がその前に配置されてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８，Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１，Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（１３）：３４０１－１０を参照）。宿主に導入されると、感染細胞は抗原を発現し、それによりペプチド（複数可）に対する宿主の免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を刺激する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターとしてＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ、カルメット・ゲラン桿菌）がある。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクターなどの治療薬の投与または抗原の免疫化において有用な広範な他のワクチンベクターが、本明細書の記載から当業者には明らかとなろう。
核酸を投与する手段の１つは、１つまたは複数のエピトープコード核酸配列をコードしたミニジーンコンストラクトを使用することである。ヒト細胞で発現させるための選択されたＣＴＬエピトープをコードしたＤＮＡ配列（ミニジーン）を作製するには、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。ヒトのコドン使用表を用いて各アミノ酸のコドン選択の手引きとする。これらのエピトープコードＤＮＡ配列を直接連結して、連続したポリペプチド配列を作製する。発現及び／または免疫原性を最適化するため、さらなるエレメントをミニジーンの設計に組み込むことができる。逆翻訳してミニジーン配列に組み込むことができるアミノ酸配列の例としては、ヘルパーＴリンパ球、エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保留シグナルが挙げられる。さらに、ＣＴＬエピトープのＭＨＣによる提示は、合成（例えば、ポリアラニン）または天然のフランキング配列をＣＴＬエピトープに隣接して組み込むことによって向上させることができる。ミニジーン配列は、ミニジーンの＋鎖と－鎖をコードしたオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによりＤＮＡに変換される。重複するオリゴヌクレオチド（３０～１００塩基の長さ）を周知の方法を用いて合成、リン酸化、精製し、適当な条件下でアニールする。オリゴヌクレオチドの末端同士を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてつなげる。次いで、ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードしたこの合成ミニジーンを所望の発現ベクターにクローニングする。
精製したプラスミドＤＮＡは、様々な製剤を用いて注射用に調製することができる。これらのうちで最も簡単なものは、凍結乾燥したＤＮＡを無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で戻すことである。様々な方法がこれまでに記載されており、新たな技術も利用可能となる可能性がある。上記に述べたように、核酸はカチオン性脂質と便宜よく配合される。さらに、糖脂質、膜融合性リポソーム、ペプチド及びＰＩＮＣ（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ，ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ，ｎｏｎ－ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ、保護的、相互作用性、非凝縮性）と総称される化合物を、精製したプラスミドＤＮＡと複合体化することで安定性、筋肉内の分散性、または特定の臓器もしくは細胞タイプへのトラフィッキングなどの変数に影響を及ぼすこともできる。
本明細書に開示される方法の各工程を実行することと、複数の抗原または複数の抗原のサブセットを含むワクチンを生産することとを含む、ワクチンを製造する方法も開示される。
本明細書に開示される抗原は、当該技術分野における周知の方法を用いて製造することができる。例えば、本明細書に開示される抗原またはベクター（例えば、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つの配列を含むベクター）の製造方法は、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、抗原またはベクターを発現するのに適した条件下で培養することと、抗原またはベクターを精製することと、を含むことができる。標準的な精製方法としては、クロマトグラフィー法、電気泳動法、免疫学的方法、沈殿、透析、濾過、濃縮、及びクロマト分画法が挙げられる。
宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、酵母、またはＨＥＫ２９３細胞を含みうる。宿主細胞は、本明細書に開示される抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換することができ、場合により、単離されたポリヌクレオチドは、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含む。特定の実施形態では、単離されたポリペプチドはｃＤＮＡであってよい。
ＶＩＩ．抗原の使用及び投与
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に１つ以上の抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に１つ以上の抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。
免疫モニタリングを、ワクチン投与の前、その間、及び／またはその後に行うことができる。かかるモニタリングは、他のパラメータの中でもとりわけ、安全性及び有効性についての情報を与えることができる。
免疫モニタリングを行うには、ＰＢＭＣが一般的に用いられる。ＰＢＭＣは、プライミングワクチン接種の前、及びプライミングワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に単離することができる。ＰＢＭＣは、ブースターワクチン接種の直前、及び各ブースターワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に採取することができる。
Ｔ細胞応答を免疫モニタリングプロトコールの一環として評価することができる。例えば、本明細書に記載されるワクチン組成物が免疫応答を刺激する能力を監視及び／または評価することができる。本明細書で使用する「免疫応答を刺激する」とは、免疫応答を開始させること（例えば、ナイーブな対象において免疫応答の開始を刺激するプライミングワクチン）、または免疫応答の増強（例えば、プライミングワクチンにより開始された既存の免疫応答などの抗原に対する既存の免疫応答を有する対象における免疫応答の増強を刺激するブースターワクチン）などの免疫応答のあらゆる増加を指す。Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、サイトカイン分泌、及び細胞表面捕捉、Ｔ細胞増殖、ＭＨＣマルチマー染色、または細胞毒性アッセイなどの当業者には周知の１つ以上の方法を用いて測定することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対するＴ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＩＦＮ－γなどのサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーを用いて、ＩＦＮ－γなどの細胞内または細胞外で捕捉されたサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、ＭＨＣマルチマー染色を用い、エピトープ／ＭＨＣクラスＩ複合体に対して特異的なＴ細胞受容体を発現するＴ細胞集団を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、３Ｈチミジン、ブロモデオキシウリジン、及びカルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）の取り込み後に、Ｔ細胞集団のエクスビボ増殖を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに特異的なＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の抗原認識能及び溶解活性は、クロム放出アッセイまたは代替的な比色細胞毒性アッセイにより機能的に評価することができる。
Ｂ細胞応答は、Ｂ細胞の分化（例えば、形質細胞への分化）、Ｂ細胞または形質細胞の増殖、Ｂ細胞または形質細胞の活性化（例えば、ＣＤ８０またはＣＤ８６などの共刺激マーカーの増加）、抗体のクラススイッチ、及び／または抗体産生（例えば、ＥＬＩＳＡ）を判定するために用いられるアッセイなど、当該技術分野では周知の１つ以上の方法を用いて測定することができる。
ＶＩＩＩ．ＨＬＡペプチドの単離及び検出
ＨＬＡペプチド分子の単離を、組織試料の溶解及び可溶化後に古典的な免疫沈降（ＩＰ）法を用いて行った（５５～５８）。実施例及び方法は、あらゆる目的で本明細書にその全容を援用するところの国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／２０８８５６により詳細に記載されている。
ＨＬＡペプチド分子の単離を、組織試料の溶解及び可溶化後に古典的な免疫沈降（ＩＰ）法を用いて行った（５５～５８）。実施例及び方法は、あらゆる目的で本明細書にその全容を援用するところの国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／２０８８５６により詳細に記載されている。
ＩＸ．提示モデル
提示モデルを用いて、患者におけるペプチド提示の尤度を特定することができる。異なる提示モデルは当業者には周知のものであり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号及び同第ＵＳ２０１１０２９３６３７、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号、及び同第ＷＯ２０１６１８７５０８号により詳細に記載されている。
提示モデルを用いて、患者におけるペプチド提示の尤度を特定することができる。異なる提示モデルは当業者には周知のものであり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号及び同第ＵＳ２０１１０２９３６３７、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号、及び同第ＷＯ２０１６１８７５０８号により詳細に記載されている。
Ｘ．訓練モジュール
訓練モジュールを用いて、ペプチド配列がそのペプチド配列に関連したＭＨＣアレルによって提示される尤度を生成する１つ以上の提示モデルを訓練データセットに基づいて構築することができる。様々な訓練モジュールが当業者には周知であり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。訓練モジュールは、アレル毎ベースでペプチドの提示尤度を予測するための予測モデルを構築することができる。訓練モジュールは、２つ以上のＭＨＣアレルが存在する複数アレル場面においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルも構築することができる。
訓練モジュールを用いて、ペプチド配列がそのペプチド配列に関連したＭＨＣアレルによって提示される尤度を生成する１つ以上の提示モデルを訓練データセットに基づいて構築することができる。様々な訓練モジュールが当業者には周知であり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。訓練モジュールは、アレル毎ベースでペプチドの提示尤度を予測するための予測モデルを構築することができる。訓練モジュールは、２つ以上のＭＨＣアレルが存在する複数アレル場面においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルも構築することができる。
ＸＩ．予測モジュール
予測モジュールを用いて配列データを受け取り、提示モデルを用いて配列データ中の候補抗原を選択することができる。具体的には、配列データは、患者の感染細胞または感染症生物それ自体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）から抽出されたＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び／またはタンパク質配列であってよい。予測モジュールは、患者の正常組織の細胞から抽出された配列データを、患者の感染細胞から抽出された配列データと比較して１つ以上の感染症生物関連抗原を含む部分を特定することなどにより、病原体由来ペプチド（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）である候補抗原を特定することができる。予測モジュールは、患者の正常組織の細胞から抽出された配列データをその患者の感染組織の細胞から抽出された配列データと比較して、発現される候補抗原を特定する（例えば、感染症で特異的に発現されるポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを特定する）ことにより、正常細胞または組織と比較して感染細胞または感染組織で発現している候補抗原を特定することができる。
予測モジュールを用いて配列データを受け取り、提示モデルを用いて配列データ中の候補抗原を選択することができる。具体的には、配列データは、患者の感染細胞または感染症生物それ自体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）から抽出されたＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び／またはタンパク質配列であってよい。予測モジュールは、患者の正常組織の細胞から抽出された配列データを、患者の感染細胞から抽出された配列データと比較して１つ以上の感染症生物関連抗原を含む部分を特定することなどにより、病原体由来ペプチド（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来）である候補抗原を特定することができる。予測モジュールは、患者の正常組織の細胞から抽出された配列データをその患者の感染組織の細胞から抽出された配列データと比較して、発現される候補抗原を特定する（例えば、感染症で特異的に発現されるポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを特定する）ことにより、正常細胞または組織と比較して感染細胞または感染組織で発現している候補抗原を特定することができる。
提示モジュールは、１つ以上の提示モデルを処理されたペプチド配列に適用してペプチド配列の提示尤度を推定することができる。具体的には、予測モジュールは、提示モデルを候補抗原に適用することによって、感染細胞のＨＬＡ分子上に提示される可能性が高い１つ以上の候補抗原ペプチド配列を選択することができる。一実現形態では、提示モジュールは、あらかじめ決定された閾値を上回る推定提示尤度を有する候補抗原配列を選択する。別の実現形態では、提示モデルは、最も高い推定提示尤度を有するＮ個の候補抗原配列を選択する（Ｎは、一般的に、ワクチン中で送達することができるエピトープの最大数である）。所定の患者について選択された候補抗原を含むワクチンを患者に注射して免疫応答を刺激することができる。
ＸＩ．Ｂ．カセット設計モジュール
ＸＩ．Ｂ．１ 概要
カセット設計モジュールを用いて、患者に注射するために選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成することができる。例えば、カセット設計モジュールを用いて、連結されたＴ細胞エピトープなどの連結されたエピトープ配列をコードする配列を生成することができる。様々なカセット設計モジュールが当業者には周知であり、例えば、そのようなカセット設計訓練モジュールが、あらゆる目的で本明細書に参照によりそれらの全容をそれぞれ援用する米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
ＸＩ．Ｂ．１ 概要
カセット設計モジュールを用いて、患者に注射するために選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成することができる。例えば、カセット設計モジュールを用いて、連結されたＴ細胞エピトープなどの連結されたエピトープ配列をコードする配列を生成することができる。様々なカセット設計モジュールが当業者には周知であり、例えば、そのようなカセット設計訓練モジュールが、あらゆる目的で本明細書に参照によりそれらの全容をそれぞれ援用する米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
治療エピトープのセットは、所定の閾値を上回る提示尤度（提示尤度は、提示モデルにより決定される）に関連付けられた予測モジュールによって決定された選択されたペプチドに基づいて生成することができる。しかしながら、他の実施形態では、治療エピトープのセットは、多くの方法の任意の１つ以上（単独または組み合わせ）に基づいて、例えば、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合親和性もしくは予測される結合親和性、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合安定性もしくは予測される結合安定性、ランダムサンプリングなどに基づいて、生成することができる。
治療エピトープはそれ自体が選択されたペプチドに相当してもよい。治療エピトープは、選択されたペプチド以外にＣ及び／またはＮ末端フランキング配列を含むこともできる。Ｎ及びＣ末端フランキング配列は、その由来源タンパク質との関連において治療ワクチンエピトープの天然のＮ及びＣ末端フランキング配列であってよい。治療エピトープは固定長のエピトープを表してもよい。治療エピトープは、可変長のエピトープを表してもよく、エピトープの長さは例えばＣまたはＮ末端フランキング配列の長さによって異なりうる。例えば、Ｃ末端フランキング配列及びＮ末端フランキング配列は、それぞれ２～５残基の異なる長さを有してよく、これによりエピトープの１６種類の可能な選択肢が与えられる。
カセット設計モジュールは、カセット内の２個の治療エピトープ間の連結部にまたがるジャンクションエピトープの提示を考慮することによってカセット配列を生成することもできる。ジャンクションエピトープは、カセット内で治療エピトープ及びリンカー配列を連結するプロセスによってカセット内に生じる新規な非自己であるが無関係なエピトープ配列である。ジャンクションエピトープの新規な配列は、カセットの治療エピトープ自体とは異なる。
カセット設計モジュールは、ジャンクションエピトープがその患者において提示される尤度を低下させるカセット配列を生成することができる。具体的には、カセットが患者に注射される際、ジャンクションエピトープは、患者のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩアレルによって提示される可能性を有し、それぞれＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激する。かかる応答は、ジャンクションエピトープに対する反応性を有するＴ細胞は治療効果を有さないことから望ましくなく、抗原競合によりカセット内の選択された治療エピトープに対する免疫応答を消失させる可能性がある７６。
カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセットについて繰り返し処理を行って、そのカセット配列に関連付けられたジャンクションエピトープの提示スコアが数値閾値を下回るカセット配列を決定することができる。ジャンクションエピトープ提示スコアは、カセット内のジャンクションエピトープの提示尤度に関連付けられた量であり、ジャンクションエピトープ提示スコアの値が高いほど、カセットのジャンクションエピトープがＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩまたはその両方によって提示されやすいことを示す。
一実施形態では、カセット設計モジュールは、候補カセット配列間で最も低いジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられたカセット配列を決定することができる。
カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセット配列について繰り返し処理を行い、各候補カセットのジャンクションエピトープ提示スコアを決定し、閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた最適なカセット配列を特定することができる。
カセット設計モジュールは、候補カセット配列内のジャンクションエピトープのいずれかが、ワクチンを設計しようとする特定の患者の自己エピトープであるかどうかを識別するために１つ以上の候補カセット配列をさらに確認することができる。これを行うには、カセット設計モジュールは、ＢＬＡＳＴなどの既知のデータベースに対してジャンクションエピトープを確認する。一実施形態では、カセット設計モジュールは、ジャンクション自己エピトープを防止するカセットを設計するように構成することができる。
カセット設計モジュールは、ブルートフォースアプローチを実行して、すべての、または大部分の可能な候補カセット配列について繰り返し処理を行うことで最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する配列を選択することができる。しかしながら、かかる候補カセットの数は、ワクチンの容量が大きくなるにしたがって途方もなく大きくなりうる。例えば、２０個のエピトープのワクチン容量では、カセット設計モジュールは、最小のエピトープ提示スコアを有するカセットを決定するために約１０１８個の可能な候補カセットについて繰り返し処理を行わなければならない。この決定は、カセット設計モジュールが妥当な長さの時間内で患者に対するワクチンを生成するには計算の負荷（必要とされる計算処理リソースの点で）が大きくなり、時として処理不能となりうる。さらに、各候補カセットについて可能なジャンクションエピトープを処理することはよりいっそうの負荷となりうる。したがって、カセット設計モジュールは、ブルートフォースアプローチにおける候補カセット配列の数よりも大幅に小さい候補カセット配列の数について繰り返し処理を行う方法に基づいてカセット配列を選択することができる。
カセット設計モジュールは、ランダムに、または少なくとも疑似ランダムに生成された候補カセットを生成し、所定の閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた候補カセットをカセット配列として選択することができる。さらに、カセット設計モジュールは、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有するサブセットからの候補カセットをカセット配列として選択することができる。例えば、カセット設計モジュールは、２０個の選択されたエピトープのセットについて約１００万の候補カセットのサブセットを生成し、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する候補カセットを選択することができる。ランダムカセット配列のサブセットを生成し、このサブセットからジャンクションエピトープ提示スコアの低いカセット配列を選択することはブルートフォースアプローチと比べて最適とはいえないが、これは、必要な計算リソースが大幅に少なく、そのため、その実施が技術的に可能である。さらに、このより効率的な手法に対してブルートフォース法を行うことは、ジャンクションエピトープ提示スコアのわずかな、またはさらには無視される程度の改善しかもたらされない可能性があるため、リソースの配分の観点からはあまり価値がない。カセット設計モジュールは、カセットのエピトープ配列を非対称巡回セールスマン問題（ＴＳＰ）として定式化することにより、改善されたカセット構成を決定することができる。ノードのリスト、及び各ノードのペア間の距離が与えられた場合、ＴＳＰは、各ノードをちょうど１回ずつ訪問して元のノードに戻るための最小の総距離に関連付けられたノードの配列を決定する。例えば、互いの間の距離が既知である都市Ａ、Ｂ、及びＣが与えられた場合、ＴＳＰの解は、可能な巡回路のうちで各都市をちょうど１回ずつ訪問するのに移動する総距離が最小となるような都市の閉じた配列を生成する。ＴＳＰの非対称バージョンは、ノードのペア間の距離が非対象である場合の最適なノードの配列を決定する。例えば、ノードＡからノードＢに移動するための「距離」は、ノードＢからノードＡに移動するための「距離」と異なる場合がある。非対称ＴＳＰを用いて改善された最適カセットについて解くことにより、カセット設計モジュールは、カセットの各エピトープ間のジャンクションにわたって低い提示スコアを与えるカセット配列を見つけることができる。非対称ＴＳＰの解は、カセットの各ジャンクションにわたったジャンクションエピトープ提示スコアを最小とするために各エピトープが連結されなければならない順序に対応した治療エピトープの配列を示す。このアプローチによって決定されたカセット配列は、ジャンクションエピトープの提示が大幅に低い配列を与える一方で、特に生成される候補カセット配列の数が大きい場合に、必要とされる計算リソースがランダムサンプリングアプローチよりも大幅に少なくなる可能性がある。異なる計算手法及び最適化カセット設計の比較の例示的な例が、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
カセット設計モジュールは、ワクチンにコードされたさらなるタンパク質配列を考慮に入れることによってカセット配列を生成することもできる。例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードした配列を生成するために使用されるカセット設計モジュールは、候補配列のリストからさらなるタンパク質配列によって既にコードされているＴ細胞エピトープを除去することなどにより、ワクチン（例えば、完全長のタンパク質配列）内に存在するさらなるタンパク質配列によって既にコードされているＴ細胞エピトープを考慮することができる。
カセット設計モジュールは、配列のサイズを考慮に入れることによってカセット配列を生成することもできる。理論によって束縛されることを望むものではないが、一般的に、大きなカセットサイズは、ワクチン生産及び／またはワクチン有効性などのワクチン性状に悪影響を及ぼし得る。一例では、カセット設計モジュールは、重複する細胞エピトープ配列などの重複配列を考慮に入れることができる。一般的に、重複するＴ細胞エピトープ配列を含む単一の配列（「フレーム」とも呼ばれる）は、複数のペプチドをコードするために必要とされる配列サイズが小さくなることから、個々のＴ細胞エピトープ配列を別々に連結するよりも効率的である。したがって、例示的な一例では、連結されたＴ細胞エピトープをコードする配列を生成するために使用されるカセット設計モジュールは、配列のサイズを大きくすることのコストに対するさらなるＴ細胞エピトープを提示するＭＨＣのさらなる集団カバレッジで得られるベネフィットを決定するなど、１つ以上のさらなるＴ細胞エピトープをコードする候補Ｔ細胞エピトープを延長するコスト／ベネフィットを考慮に入れることができる。
カセット設計モジュールは、検証済みエピトープによってもたらされる免疫応答の刺激の大きさを考慮に入れることによってカセット配列を生成することもできる。
カセット設計モジュールは、集団全体におけるコードされたエピトープの提示、例えば、少なくとも１つの免疫原性エピトープが、集団の一定の割合、例えば集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％で少なくとも１つのＨＬＡによって提示される（例えば、４つの主要な民族、すなわち、ヨーロッパ人（ＥＵＲ）、アフリカ系アメリカ人（ＡＦＡ）、アジア人または太平洋諸島住民（ＡＰＡ）、及びヒスパニック（ＨＩＳ）にわたったＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）ことを考慮に入れることによってカセット配列を生成することもできる。例示的な非限定例として、カセット設計モジュールは、少なくとも１つのＨＬＡが、少なくとも１つの検証済みエピトープを提示するかまたは少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープを提示する集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％にわたって存在するようにカセット配列を生成することもできる。
カセット設計モジュールは、潜在的に安全性リスクをもたらす機能的タンパク質、機能的タンパク質ドメイン、機能的タンパク質サブユニット、または機能的タンパク質フラグメントをコードする、またはコードする可能性を制限するなど、潜在的な安全性を向上させる他の性状を考慮に入れることによってカセット配列を生成することもできる。場合により、カセット設計モジュールは、コードされるペプチドの配列サイズを、翻訳後の対応する完全長タンパク質の５０％未満、４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４５％未満、４３％未満、４２％未満、４１％未満、４０％未満、３９％未満、３８％未満、３７％未満、３６％未満、３５％未満、３４％未満、または３３％未満となるように制限することができる。場合により、カセット設計モジュールは、単一の連続配列が、翻訳後の対応する完全長タンパク質の５０％未満となるように、コードされるペプチドの配列サイズを制限することができるが、複数の配列が同じ翻訳後の対応する完全長タンパク質に由来してよく、それらが共に５０％超をコードしてよい。例示的な一例では、重複するＴ細胞エピトープ配列を含む単一の配列（「フレーム」）が、翻訳後の対応する完全長タンパク質の５０％よりも大きい場合、各フレームが翻訳後の対応する完全長タンパク質の５０％未満となるような複数のフレーム（他、ｆ１、ｆ２など）にフレームを分割することができる。カセット設計モジュールは、単一の連続配列が、翻訳後の対応する完全長タンパク質の４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４５％未満、４３％未満、４２％未満、４１％未満、４０％未満、３９％未満、３８％未満、３７％未満、３６％未満、３５％未満、３４％未満、または３３％未満となるように制限することができる。同じ遺伝子からの複数のフレームがコードされる場合、複数のフレームは、互いに重複する、すなわち、それぞれが同じ配列を別々にコードした配列を有することができる。同じ遺伝子からの複数のフレームがコードされる場合、同じ遺伝子に由来する２つ以上の核酸配列を、対応する遺伝子内の第１の核酸配列の後に第２の核酸配列が直接または間接的に続く場合、第１の核酸配列に第２の核酸配列が直接続かない、または連結され得ないような順序で配置することができる。例えば、同じ遺伝子内に３つのフレームが存在する（アミノ酸位置が大きくなる順にｆ１、ｆ２、ｆ３）場合、
－以下のカセットの順序は許容されない。すなわち、
・ｆ１の直後にｆ２が続く
・ｆ２の直後にｆ３が続く
・ｆ１の直後にｆ３が続く。
－以下のカセットの順序は許容される。すなわち、
・ｆ３の直後にｆ２が続く
・ｆ２の直後にｆ１が続く。
－以下のカセットの順序は許容されない。すなわち、
・ｆ１の直後にｆ２が続く
・ｆ２の直後にｆ３が続く
・ｆ１の直後にｆ３が続く。
－以下のカセットの順序は許容される。すなわち、
・ｆ３の直後にｆ２が続く
・ｆ２の直後にｆ１が続く。
ＸＩＩＩ．例示的なコンピュータ
本明細書に記載される計算方法のいずれにおいてもコンピュータを使用することができる。当業者には、コンピュータは異なるアーキテクチャを有し得る点が認識されよう。当業者には周知のコンピュータの例は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
本明細書に記載される計算方法のいずれにおいてもコンピュータを使用することができる。当業者には、コンピュータは異なるアーキテクチャを有し得る点が認識されよう。当業者には周知のコンピュータの例は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
ＸＩＶ．実施例
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと、許容されなければならない。
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと、許容されなければならない。
本発明の実施では、特に断らない限りは、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を用いている。かかる技術は文献に完全に説明されている（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい）。
ＸＩＶ．Ａ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープの予測及びワクチンカセットの構築
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はコロナウイルス科に属し、その参照ゲノムは２９９０３塩基対の一本鎖ＲＮＡ配列である。そのゲノムは、図１に示されるような少なくとも１４個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有している。コードされた遺伝子のうち、不可欠な遺伝子は、レプリカーゼＯＲＦ１ａｂ、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、及びヌクレオカプシド（Ｎ）である。レプリカーゼＯＲＦ１ａｂ（２６６～２１５５５位）は、２個のタンパク質、すなわちｏｒｆ１ａとｏｒｆ１ｂをコードし、後者は１３４６８位における－１のリボソームフレームシフトによって翻訳される。２個のタンパク質は、図２に示されるように合わせて１６個の非構造タンパク質（ｎｓｐ１～ｎｓｐ１６）を含み、すなわち、ＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ｂは１６個のｎｓｐに切断される。スパイクタンパク質は、ヒト細胞のＡＣＥ２受容体に結合し、ウイルスがヒト細胞に入り込んでその複製マシナリーを用いてさらなるウイルスのコピーを生成して拡散することを可能とするものと考えられる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はコロナウイルス科に属し、その参照ゲノムは２９９０３塩基対の一本鎖ＲＮＡ配列である。そのゲノムは、図１に示されるような少なくとも１４個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有している。コードされた遺伝子のうち、不可欠な遺伝子は、レプリカーゼＯＲＦ１ａｂ、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、及びヌクレオカプシド（Ｎ）である。レプリカーゼＯＲＦ１ａｂ（２６６～２１５５５位）は、２個のタンパク質、すなわちｏｒｆ１ａとｏｒｆ１ｂをコードし、後者は１３４６８位における－１のリボソームフレームシフトによって翻訳される。２個のタンパク質は、図２に示されるように合わせて１６個の非構造タンパク質（ｎｓｐ１～ｎｓｐ１６）を含み、すなわち、ＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ｂは１６個のｎｓｐに切断される。スパイクタンパク質は、ヒト細胞のＡＣＥ２受容体に結合し、ウイルスがヒト細胞に入り込んでその複製マシナリーを用いてさらなるウイルスのコピーを生成して拡散することを可能とするものと考えられる。
ＲＮＡウイルスは、高い変異率を有することが知られていることから、多数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムを分析してそのプロテオームにおける可変の領域を特定した。２０２０年４月１９日現在でＧＩＳＡＩＤデータベース［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｉｓａｉｄ．ｏｒｇ］に蓄積された８０００を超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全なゲノムを取得した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の参照ゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０４５５１２、配列番号７６）に対してゲノムのそれぞれのペアワイズでのグローバルアラインメントを行った。参照ゲノムのコード領域に対してアラインされたこれらのゲノム上の配列の位置を詳細に特定した。次いで、これらの配列を翻訳してこれらのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質配列を得た。次いで、これらのタンパク質配列をそれぞれの参照タンパク質配列とアラインしてバリアントを特定した。
この分析によって、バリアント率が１％よりも高いタンパク質配列上の２０個の部位が特定された。これらの部位を表１に示す。Ｔ細胞エピトープの選択に当たり、これらの可変部位と交差する候補エピトープは除外した。
クラス最高であることが示されている［あらゆる目的で本明細書に参照により援用する、Ｂｕｌｉｋ－Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｄｅｅｐ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＨＬＡ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａｓｅｔｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１８，３７（１）］、本発明者らの機械学習ＥＤＧＥプラットフォーム（あらゆる目的で本明細書に参照により援用する米国特許第１０，０５５，５４０号を参照）を使用してＣＤ８＋エピトープを予測した。このクラスＩエピトープを予測するためのモデルは、３９８個の試料にわたった質量分析で提示された５０７，５０２種のペプチドで最近訓練されたものであり、１１６個の特定されたアレルを含み、そのうち１１２個のアレル（表２、図７）を後述するハプロタイプ分布データセットに示す。
候補ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのリストを作成するため、ｏｒｆ１ａｂタンパク質を図２に示される切断部位で分割した。スパイクタンパク質は６８１～６８４位にフーリン様切断モチーフを有し、切断事象は６８４位の後で生じることが研究によって示されている［Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ２０１９－ｎＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６７（６４８３），１２６０－１２６３，Ｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｎ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｍｕｎｅ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１１（１），１６２０］。スパイクタンパク質のＳ１及びＳ２への切断は細胞への侵入を促進し、ウイルスの感染力に寄与するものと考えられる。そこで、候補ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを生成するためにスパイクタンパク質をフーリン切断部位で分割した。８～１１マーペプチドのすべてが、切断後のタンパク質及びそれらの天然のＮ末端及び／またはＣ末端の５マーに挟まれた他のタンパク質から生成された。
ＥＤＧＥ機械学習モデルを、各ＨＬＡクラスＩアレルについてこれらの候補エピトープで実行した。すなわち、候補エピトープの提示スコアに、各ＨＬＡアレルのＥＤＧＥスコアが与えられる。一般的に、あるペプチドが提示される確率は、そのペプチドを含むタンパク質のファミリー、及びタンパク質の発現レベルによって影響される。ＥＤＧＥモデルをヒトペプチドームデータセットでも訓練した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の同等のタンパク質ファミリーがないものと仮定して、特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドの提示を予測するため、ランダムなタンパク質ファミリーをすべてのペプチドに割り当てた。ランダムではあるが同じタンパク質ファミリーを割り当てることで、すべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドに対して同じ効果を有することになる。高い発現レベルも用いた（ｔｐｍ＝１０）。ＨＬＡアレルに対するＥＤＧＥスコアが０．００１以上である候補エピトープの一覧、及び予測されたＥＤＧＥスコアが０．００１よりも高い同種ＨＬＡアレルを、各同種ペアリングをＨ（ＥＤＧＥスコア＞０．１）、Ｍ（ＥＤＧＥ＝０．０１～０．１）、及びＬ（ＥＤＧＥスコア＜０．０１）とランク付けして表Ａに示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子の異なるレベルの発現を説明するため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムからの遺伝子間の報告されているＴ細胞応答の比［Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｗｈｏｌｅ ＳＡＲＳ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８１（８），５４９０－５５００］を、遺伝子発現レベルの比の代用として用いた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子からの全エピトープのスコアを、選択された遺伝子内のエピトープの９９パーセンタイルとスパイク遺伝子内のエピトープの９９パーセンタイルとの比が［Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｗｈｏｌｅ ＳＡＲＳ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８１（８），５４９０－５５００］に報告されている比に従うようにスケーリングした。
次いで、スケーリング後のＥＤＧＥスコアがｔ＝０．０１の閾値以上であるものを選ぶことにより、候補ＣＤ８＋エピトープを選択した。閾値は、Ｔ細胞エピトープのＰＰＶが０．２と推定され、再現率が０．５となるようにＨＩＶ ＬＡＮＬデータセット（データは示さず）の分析から選択した。Ｇｒｉｆｏｎｉ ｅｔ ａｌ．［（２０２０）．Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｃａｎ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２７（４），６７１－６８０．ｅ２］に記載されるアプローチと同様、ＩＥＤＢ［Ｖｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ）：２０１８ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７（Ｄ１），Ｄ３３９－Ｄ３４３．］に報告されている既知のＳＡＲｓ－ＣｏＶ Ｔ細胞エピトープと９０％以上相同であるセット配列も含めた。
上記に述べ、表１に示されるように可変率が０．０１よりも高い部位のうちの少なくとも１つを含む配列は候補エピトープのセットから除外した。
世界人口全体におけるワクチンのカバー率を最大化するため、ヨーロッパ人（ＥＵＲ）、アフリカ系アメリカ人（ＡＦＡ）、アジア人及び太平洋諸島住民（ＡＰＡ）、ならびにヒスパニック（ＨＩＳ）の４つの主要な民族におけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子のアレル頻度を、一般公開されているＮａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｒｏｗ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍデータセット［ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇ／ｈｌａ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｈａｐｌｏｔｙｐｅ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ／ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｈｌａ－ａｌｌｅｌｅｓ－ａｎｄ－ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ－ｉｎ－ｔｈｅ－ｕｓ－ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ］より取得した。次いで、シミュレーションを行ってこれらのＨＬＡアレルの組み合わせで構成されたハプロタイプの頻度を推定した。
カセット最適化は以下に従って進めた。
エピトープ選択の定義
－候補エピトープセットＥ：スケーリング後のＥＤＧＥスコアがｔ＝０．０１の閾値以上である候補ＣＤ８＋エピトープのセット
－集団カバー率基準Ｐ：上記に述べた４つの民族（ＥＵＲ／ＡＦＡ／ＡＰＡ／ＨＩＳ）のそれぞれについて、その民族でシミュレートした人の９５％で、少なくとも３０個の候補エピトープがそれらのディプロタイプで提示されること。
－解フレームセットＦ－加えられた候補エピトープを包含する現在解におけるすべてのアミノ酸範囲
・解に加えられた各エピトープについて、エピトープと各末端の５隣接天然アミノ酸はＦのフレーム内に完全に含まれていなければならない。
・各フレームは、タンパク質領域（ｏｒｆ１ａｂ内の個々のＮＳＰを含む）のみにわたる。
エピトープの選択方法
－集団カバー率基準Ｐは、全遺伝子（複数可）内のすべてのエピトープが最初に加えられた状態で計算されたものとして開始する。
－集団カバー率基準Ｐが満たされない場合、Ｐへの進行を最も効率的に最大化するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のプロテオーム全体にわたったアミノ酸フレームｆを引き続き選択する。
・さらなる集団カバー率Ｃ／さらなる追加アミノ酸塩基ＡＡの最も高い比（Ｃ／ＡＡ）として定義される。
・すべての候補フレームは新たな２５ａａのフレーム（ＡＡ＝２５）であるか、または既存の解Ｆ内のフレームと重複してよく、その場合、２５ａａよりも小さい任意の量（ＡＡ＜２５）を加えることができる。
・さらなる集団カバー率Ｃは、４つすべての民族にわたって合計したハプロタイプの集団頻度で重み付けされた（乗じた）、カバーされるエピトープが２０個未満であるハプロタイプにおける、エピトープカウントのＥからの増加である。
・ハプロタイプ当たり２０個のエピトープが、ディプロタイプ当たり３０個の候補エピトープの全体のカバー率基準に達するのに効率的なプロキシであると判定される（実験的に選択される）。
・解フレームセットＦにｆを加える。ｆ内の候補エピトープをＥから除去する。
－フレームが選択された後、最終セットＦを生成する。
・最初に、重複するフレーム同士を融合して連続した配列（すなわち、エピトープの「ホットスポット」）を生成する。
・次に、すべてのフレームがそのフレームの全体の遺伝子サイズの５０％よりも小さくなるようにする。フレームがこのサイズよりも大きい場合、フレームをこの要件よりもそれぞれが小さい（場合により重複した）フレームに分割する。さらなるより厳密なサイズ制限を試験することができる。
－より大きなカセットサイズの限界値を示すため、Ｐが満たされた時点を超えてフレーム選択を継続することができるが、基準Ｐについて選択されたカセットの組成には影響しない。
エピトープ選択の定義
－候補エピトープセットＥ：スケーリング後のＥＤＧＥスコアがｔ＝０．０１の閾値以上である候補ＣＤ８＋エピトープのセット
－集団カバー率基準Ｐ：上記に述べた４つの民族（ＥＵＲ／ＡＦＡ／ＡＰＡ／ＨＩＳ）のそれぞれについて、その民族でシミュレートした人の９５％で、少なくとも３０個の候補エピトープがそれらのディプロタイプで提示されること。
－解フレームセットＦ－加えられた候補エピトープを包含する現在解におけるすべてのアミノ酸範囲
・解に加えられた各エピトープについて、エピトープと各末端の５隣接天然アミノ酸はＦのフレーム内に完全に含まれていなければならない。
・各フレームは、タンパク質領域（ｏｒｆ１ａｂ内の個々のＮＳＰを含む）のみにわたる。
エピトープの選択方法
－集団カバー率基準Ｐは、全遺伝子（複数可）内のすべてのエピトープが最初に加えられた状態で計算されたものとして開始する。
－集団カバー率基準Ｐが満たされない場合、Ｐへの進行を最も効率的に最大化するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のプロテオーム全体にわたったアミノ酸フレームｆを引き続き選択する。
・さらなる集団カバー率Ｃ／さらなる追加アミノ酸塩基ＡＡの最も高い比（Ｃ／ＡＡ）として定義される。
・すべての候補フレームは新たな２５ａａのフレーム（ＡＡ＝２５）であるか、または既存の解Ｆ内のフレームと重複してよく、その場合、２５ａａよりも小さい任意の量（ＡＡ＜２５）を加えることができる。
・さらなる集団カバー率Ｃは、４つすべての民族にわたって合計したハプロタイプの集団頻度で重み付けされた（乗じた）、カバーされるエピトープが２０個未満であるハプロタイプにおける、エピトープカウントのＥからの増加である。
・ハプロタイプ当たり２０個のエピトープが、ディプロタイプ当たり３０個の候補エピトープの全体のカバー率基準に達するのに効率的なプロキシであると判定される（実験的に選択される）。
・解フレームセットＦにｆを加える。ｆ内の候補エピトープをＥから除去する。
－フレームが選択された後、最終セットＦを生成する。
・最初に、重複するフレーム同士を融合して連続した配列（すなわち、エピトープの「ホットスポット」）を生成する。
・次に、すべてのフレームがそのフレームの全体の遺伝子サイズの５０％よりも小さくなるようにする。フレームがこのサイズよりも大きい場合、フレームをこの要件よりもそれぞれが小さい（場合により重複した）フレームに分割する。さらなるより厳密なサイズ制限を試験することができる。
－より大きなカセットサイズの限界値を示すため、Ｐが満たされた時点を超えてフレーム選択を継続することができるが、基準Ｐについて選択されたカセットの組成には影響しない。
カセットの順序付け
解フレームセットＦ内の各フレームを、ジャンクションエピトープ（隣接するフレームによって生成される、解の一部ではない意図されないエピトープ）のＥＤＧＥスコアが最小となるように順序付けする。１つの遺伝子内の連続したフレームが、カセット内で互いに直接続くことも禁止される（遺伝子内制限）。換言すれば、遺伝子内制限は、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子に由来するエピトープをコードした２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列がある場合、２つの配列が、対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子内で第１の核酸配列に第２の核酸配列が続く場合に、第１の核酸配列に第２の核酸配列が直接続くことも、連結されることもできないように順序付けられることを必要とする。例えば、同じ遺伝子内に３つのフレームが存在する（アミノ酸位置が大きくなる順にｆ１、ｆ２、ｆ３）場合、
－以下のカセットの順序は不可能である。すなわち、
・ｆ１の直後にｆ２が続く
・ｆ２の直後にｆ３が続く
・ｆ１の直後にｆ３が続く。
－以下のカセットの順序は可能である。すなわち、
・ｆ３の直後にｆ２が続く
・ｆ２の直後にｆ１が続く。
解フレームセットＦ内の各フレームを、ジャンクションエピトープ（隣接するフレームによって生成される、解の一部ではない意図されないエピトープ）のＥＤＧＥスコアが最小となるように順序付けする。１つの遺伝子内の連続したフレームが、カセット内で互いに直接続くことも禁止される（遺伝子内制限）。換言すれば、遺伝子内制限は、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子に由来するエピトープをコードした２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列がある場合、２つの配列が、対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子内で第１の核酸配列に第２の核酸配列が続く場合に、第１の核酸配列に第２の核酸配列が直接続くことも、連結されることもできないように順序付けられることを必要とする。例えば、同じ遺伝子内に３つのフレームが存在する（アミノ酸位置が大きくなる順にｆ１、ｆ２、ｆ３）場合、
－以下のカセットの順序は不可能である。すなわち、
・ｆ１の直後にｆ２が続く
・ｆ２の直後にｆ３が続く
・ｆ１の直後にｆ３が続く。
－以下のカセットの順序は可能である。すなわち、
・ｆ３の直後にｆ２が続く
・ｆ２の直後にｆ１が続く。
カセットの順序付けの方法
Ｇｏｏｇｌｅ最適化ルーティングツール［ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅｖｅｌｏｐｅｒｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ／ｒｏｕｔｉｎｇ］を使用して、巡回セールスマン最適化経路を実施した。ただし、Ｆ内のフレームの各ペア間の距離は、
－上記の遺伝子内制限に従って、フレームがこの順序で互いに続くことが許容されない場合、無限である。
－そうでない場合、集団内のアレル頻度により重み付けされた、すべてのアレルにわたったジャンクションエピトープのＥＤＧＥスコアの合計である。
Ｇｏｏｇｌｅ最適化ルーティングツール［ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅｖｅｌｏｐｅｒｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ／ｒｏｕｔｉｎｇ］を使用して、巡回セールスマン最適化経路を実施した。ただし、Ｆ内のフレームの各ペア間の距離は、
－上記の遺伝子内制限に従って、フレームがこの順序で互いに続くことが許容されない場合、無限である。
－そうでない場合、集団内のアレル頻度により重み付けされた、すべてのアレルにわたったジャンクションエピトープのＥＤＧＥスコアの合計である。
最短経路距離のルート探索によって、ジャンクションエピトープが最小化され、遺伝子内で連続したフレームが回避されるようなカセット内の各フレームの最適な順序付けが得られる。
結果
集団カバー率基準Ｐを、Ｓ１とＳ２に分割されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号５９）によって与えられるすべての初期エピトープを用いて計算した。上記の最適化アルゴリズムを適用することで、表３Ａに示されるような、１８個のエピトープコードフレームを有する５９４個のアミノ酸カセット配列が得られた。表Ｃは、カセットに含まれるさらなるエピトープのそれぞれを示す（スパイクタンパク質に由来するタンパク質は含まない）。経験的に、最適なフレームセットＦは、すべてのフレームのサイズ閾値をそのフレームの全体の遺伝子サイズの４２％未満に設定した場合に得られた。４つの集団にわたって設計されたカセットのカバー率を図５に示し、１列目に提示されると予測されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープの数を示し、２列目に０．２ＰＰＶに基づいた、提示されるエピトープの予想数を示す。各行は、特定の数のエピトープを用いた場合の各集団の防御カバー率を示す。
集団カバー率基準Ｐを、Ｓ１とＳ２に分割されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号５９）によって与えられるすべての初期エピトープを用いて計算した。上記の最適化アルゴリズムを適用することで、表３Ａに示されるような、１８個のエピトープコードフレームを有する５９４個のアミノ酸カセット配列が得られた。表Ｃは、カセットに含まれるさらなるエピトープのそれぞれを示す（スパイクタンパク質に由来するタンパク質は含まない）。経験的に、最適なフレームセットＦは、すべてのフレームのサイズ閾値をそのフレームの全体の遺伝子サイズの４２％未満に設定した場合に得られた。４つの集団にわたって設計されたカセットのカバー率を図５に示し、１列目に提示されると予測されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープの数を示し、２列目に０．２ＰＰＶに基づいた、提示されるエピトープの予想数を示す。各行は、特定の数のエピトープを用いた場合の各集団の防御カバー率を示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテオームからの潜在的なＨＬＡ－ＤＲＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＰ ＭＨＣクラスＩＩエピトープも予測した。候補ＣＤ８／ＭＨＣクラスＩエピトープの生成について述べた方法を用いて、９～２０アミノ酸のサイズのペプチドを生成した。クラスＩＩについてＥＤＧＥモデルを実行してそれぞれの特定可能なアレルに対するこれらのペプチドのそれぞれのＥＤＧＥスコアを計算した（例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する米国特許出願第１６／６０６，５７７号及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２１５０８を参照）。ＥＤＧＥスコアが０．００１よりも高いＣＤ４エピトープの一覧、及び予測されたＥＤＧＥスコアが０．００１よりも高い同種ＨＬＡアレルを、各同種ペアリングをＨ（ＥＤＧＥスコア＞０．１）、Ｍ（ＥＤＧＥ＝０．０１～０．１）、及びＬ（ＥＤＧＥスコア＜０．０１）とランク付けして表Ｂに示す。ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰは分析に用いたそれらのα及びβ鎖で参照されるのに対して、α鎖はヒト集団では一般に不変であり、ＨＬＡ－ＤＲのペプチド接触領域は特に不変であることから、ＨＬＡ－ＤＲはそのβ鎖で参照される。
次いで、上記で決定された最適化されたＭＨＣ Ｉカセットフレーム内に含まれる０．０２よりも高いスコアが付けられたペプチドを特定した。モデル予測が、有病比陽性：陰性が１：１００である質量分析データを予測する際にＰＰＶ０．２を有することから、閾値として０．０２を選択した。図６Ａは、調べた各ＭＨＣクラスＩＩアレルによって提示される予測されるエピトープの数を示す。図６Ｂは、ディプロイドレベルでのＭＨＣクラスＩＩの集団カバー率を示す。
上記に述べたエピトープ予測及びフレーム順序付けアルゴリズムを用いてさらなるカセットを設計し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜（配列番号６１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（配列番号６２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ（配列番号６３）、またはそれらの組み合わせ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクとの組み合わせを含む）もしくは配列バリアントにより与えられるすべての初期エピトープを用いて初期集団カバー率基準Ｐを計算した。
ＸＩＶ．Ｂ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン設計
最大の有効性を得るために中和抗体（Ｂ細胞からの）とエフェクター及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方を誘導するバランスの取れた免疫応答を生じるようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する一連のワクチンを設計した。一般的に、ウイルス表面タンパク質に対する中和抗体は細胞内へのウイルスの侵入を防止し、ウイルスエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はウイルス感染細胞を殺滅する。さらに、世界人口にわたったワクチンのカバー率を最大化するような（すなわち、本発明者のカセット配列のフットプリントは最小に抑えながら、標的とする大部分の個人（例えば、＞９５％）にすべての主要な祖先群にわたった多数（例えば、≧３０）の候補ＣＤ８＋エピトープを投与する）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを設計した。
最大の有効性を得るために中和抗体（Ｂ細胞からの）とエフェクター及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方を誘導するバランスの取れた免疫応答を生じるようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する一連のワクチンを設計した。一般的に、ウイルス表面タンパク質に対する中和抗体は細胞内へのウイルスの侵入を防止し、ウイルスエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はウイルス感染細胞を殺滅する。さらに、世界人口にわたったワクチンのカバー率を最大化するような（すなわち、本発明者のカセット配列のフットプリントは最小に抑えながら、標的とする大部分の個人（例えば、＞９５％）にすべての主要な祖先群にわたった多数（例えば、≧３０）の候補ＣＤ８＋エピトープを投与する）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを設計した。
抗原及びカセット
上記に述べたエピトープ予測及びフレーム順序付けアルゴリズムを用いて設計されたＭＨＣエピトープコードカセットをコードしたワクチンを構築する。例示的なカセット（本明細書では、連結されたＥＤＧＥ予測ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣクラスＩエピトープカセットまたはＥＤＧＥ予測エピトープ（ＥＰＥ）と呼ぶ）を作製し、上記に述べたように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクによって与えられるすべての初期エピトープを用いて初期集団カバー率基準Ｐを計算した。
上記に述べたエピトープ予測及びフレーム順序付けアルゴリズムを用いて設計されたＭＨＣエピトープコードカセットをコードしたワクチンを構築する。例示的なカセット（本明細書では、連結されたＥＤＧＥ予測ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣクラスＩエピトープカセットまたはＥＤＧＥ予測エピトープ（ＥＰＥ）と呼ぶ）を作製し、上記に述べたように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクによって与えられるすべての初期エピトープを用いて初期集団カバー率基準Ｐを計算した。
主としてＢ細胞応答を刺激することを目的として、さまざまな完全長タンパク質を単独または組合せでコードしたワクチンも設計する。完全長タンパク質には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（配列番号５９）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜（配列番号６１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（配列番号６２）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープ（配列番号６３）が含まれ、これらの配列を表３Ｂに示す。
スパイクタンパク質に関し、流行中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの初期の分析（上記に記載、表１を参照）により、ゲノムのおよそ４４％に存在するスパイクタンパク質バリアントが特定されている。８０００を超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全なゲノムのその後の解析により、６１４位の野生型のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に変異した主要なバリアントが特定された。Ｄ６１４Ｇとして示されるこの変異は、全世界でシークエンシングされたゲノムの６０．０５％、ヨーロッパ及び北米ではそれぞれ、配列の７０．４６％及び５８．４９％で見出されている（図４）。したがって、参照スパイクタンパク質（配列番号５９）を基準として主要なＤ６１４Ｇスパイクバリアントを含むスパイクタンパク質を用いる。さらに、前融合状態のスパイクは抗体によるウイルスの中和のより効果的な標的となりうることから、スパイクタンパク質が主として前融合状態に維持されるようにバイアスされた改変スパイクタンパク質を遺伝子操作により作製した。以下の変異を選択した。すなわち、フーリン切断部位を破壊するＲ６８２Ｖ、Ｓ２内の切断部位を破壊するＲ８１５Ｎ、及びスパイクの二次構造を妨げるＫ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ。したがって、参照スパイクタンパク質（配列番号５９）を基準として以下の変異、すなわち、Ｄ６１４Ｇ変異、Ｒ６８２Ｖ変異、Ｒ８１５Ｎ変異、Ｋ９８６Ｐ変異、またはＶ９８７Ｐ変異のうちの１つ以上を含む「改変」スパイクタンパク質を用いる。参考として、スパイク変異のすべてを有する改変スパイクを配列番号６０に示す。
さまざまなワクチン設計及びそれらのそれぞれのカセットヌクレオチド配列を表４により詳細に示す。ＳＡＭベースのワクチンでは、一般的にカセットはベクター骨格によって与えられる内因性の２６Ｓプロモーター及び／またはポリ（Ａ）配列と機能的に連結されていると仮定されるため、プロモーター及び／またはポリ（Ａ）シグナル配列を除去することができる。カセットの機構及び構成に応じて、翻訳されたタンパク質（例えば、表３Ｂに示されるもの）も、例えば、２Ａリボソームスキッピング配列エレメント（または翻訳後のそのフラグメント）及び／またはさらなる２６Ｓプロモーター配列などの特定の発現戦略に関連したさらなる配列（複数可）を含み得る。
ＳＡＭベクター
自己複製型のベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス（Ｋｉｎｎｅｙ，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：４００－４１３）から、２６Ｓサブゲノムプロモーターの３’側に位置するＶＥＥの構造タンパク質を欠失させることによって、抗原発現系のＲＮＡアルファウイルス骨格を作製した（７５４４～１１，１７５を欠失させたＶＥＥ；番号付けはＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ １９８６に基づく。配列番号６）。自己複製型ｍＲＮＡ（「ＳＡＭ」）ベクターを作製するには、欠失させた配列を抗原配列に置き換える。２０個のモデル抗原を含む代表的なＳＡＭベクターは、「ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー」（配列番号４）である。ＭＡＧ２５マーカセットを有する記載される抗原カセットを有するベクターを、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カセット及び／または完全長タンパク質に置き換えることができる。
自己複製型のベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス（Ｋｉｎｎｅｙ，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：４００－４１３）から、２６Ｓサブゲノムプロモーターの３’側に位置するＶＥＥの構造タンパク質を欠失させることによって、抗原発現系のＲＮＡアルファウイルス骨格を作製した（７５４４～１１，１７５を欠失させたＶＥＥ；番号付けはＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ １９８６に基づく。配列番号６）。自己複製型ｍＲＮＡ（「ＳＡＭ」）ベクターを作製するには、欠失させた配列を抗原配列に置き換える。２０個のモデル抗原を含む代表的なＳＡＭベクターは、「ＶＥＥ－ＭＡＧ２５マー」（配列番号４）である。ＭＡＧ２５マーカセットを有する記載される抗原カセットを有するベクターを、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カセット及び／または完全長タンパク質に置き換えることができる。
ＳＡＭを作製するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うには： ＳＡＭベクターを「ＡＵ－ＳＡＭ」ベクターとして作製する。カノニカルな３’末端のジヌクレオチドＧＧを欠いた改変Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ：配列番号１２０）をＳＡＭベクターの５’末端に付加してインビトロ転写用の鋳型ＤＮＡ（配列番号７７、挿入された抗原カセットを有さない、７５４４～１１，１７５を欠失させたもの）を作製した。反応条件を以下に記載する。
－１ｘＴ７ ＲＮＡポリメラーゼミックス（Ｅ２０４０Ｓ）、０．０２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ転写用鋳型（制限酵素による消化によって直鎖化したもの）、８ｍＭのＣｌｅａｎＣａｐ試薬ＡＵ（カタログ番号Ｎ－７１１４）及び各１０ｍＭのＡＴＰ、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ＧＴＰ、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の最終濃度を用いた、１ｘ転写バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭスペルミジン、０．００２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び２７ｍＭ塩化マグネシウム）
－転写反応を３７℃で２時間インキュベートし、ＤＮａｓｅＩバッファー中、０．００１ｍｇのＤＮＡ転写鋳型当たり最終濃度２ＵのＤＮａｓｅＩ（ＡＭ２２３９）で１時間、３７℃で処理した。
－ＳＡＭをＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ（ＱＩＡＧＥＮ，７５１６２）により精製した。
インビトロ試験を行うには： ＳＡＭベクターを「ＡＵ－ＳＡＭ」ベクターとして作製する。カノニカルな３’末端のジヌクレオチドＧＧを欠いた改変Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ：配列番号１２０）をＳＡＭベクターの５’末端に付加してインビトロ転写用の鋳型ＤＮＡ（配列番号７７、挿入された抗原カセットを有さない、７５４４～１１，１７５を欠失させたもの）を作製した。反応条件を以下に記載する。
－１ｘＴ７ ＲＮＡポリメラーゼミックス（Ｅ２０４０Ｓ）、０．０２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ転写用鋳型（制限酵素による消化によって直鎖化したもの）、８ｍＭのＣｌｅａｎＣａｐ試薬ＡＵ（カタログ番号Ｎ－７１１４）及び各１０ｍＭのＡＴＰ、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ＧＴＰ、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の最終濃度を用いた、１ｘ転写バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭスペルミジン、０．００２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び２７ｍＭ塩化マグネシウム）
－転写反応を３７℃で２時間インキュベートし、ＤＮａｓｅＩバッファー中、０．００１ｍｇのＤＮＡ転写鋳型当たり最終濃度２ＵのＤＮａｓｅＩ（ＡＭ２２３９）で１時間、３７℃で処理した。
－ＳＡＭをＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ（ＱＩＡＧＥＮ，７５１６２）により精製した。
５’キャップ構造の同時転写による付加の代わりに、７－メチルグアノシンまたは関連する５’キャップ構造を、ｍＲＮＡ ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ及びＳ－アデノシルメチオニンを含むワクシニアキャッピングシステム（ＮＥＢカタログ番号Ｍ２０８０）を用いて転写後に酵素的に付加することもできる。
アデノウイルスベクター
抗原発現系用の改変ＣｈＡｄＶ６８ベクター（「ｃｈＡｄ６８－空－Ｅ４欠失－配列番号７５）を、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）、Ｅ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）、及びＥ４領域（ｎｔ３４，９１６～３５，６４２）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４（独立してシークエンシングした完全長のＶＲ－５９４ Ｃ６８、配列番号１０）ヌクレオチドを５つの位置で置換したＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製した。対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４が５つの位置で置換された完全長のＣｈＡｄＶ６８ ＡＣ＿００００１１．１配列は、「ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ」（配列番号１）と呼ばれる。ＣＭＶプロモーター／エンハンサー配列の制御下にある抗原カセットを欠失させたＥ１配列の代わりに挿入する。
抗原発現系用の改変ＣｈＡｄＶ６８ベクター（「ｃｈＡｄ６８－空－Ｅ４欠失－配列番号７５）を、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）、Ｅ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）、及びＥ４領域（ｎｔ３４，９１６～３５，６４２）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４（独立してシークエンシングした完全長のＶＲ－５９４ Ｃ６８、配列番号１０）ヌクレオチドを５つの位置で置換したＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製した。対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４が５つの位置で置換された完全長のＣｈＡｄＶ６８ ＡＣ＿００００１１．１配列は、「ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ」（配列番号１）と呼ばれる。ＣＭＶプロモーター／エンハンサー配列の制御下にある抗原カセットを欠失させたＥ１配列の代わりに挿入する。
２９３Ｆ細胞でのアデノウイルス生産
ＣｈＡｄＶ６８ウイルス生産を、８％ＣＯ２のインキュベーター内で２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）培地中で増殖させた２９３Ｆ細胞で行う。感染させた日に細胞を生存率９８％で１０６細胞／ｍＬに希釈し、１Ｌの振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の生産ラン１回当たり４００ｍＬを使用する。感染１回当たり、４ｍＬの目標ＭＯＩが３．３よりも高い３次ウイルスストックを用いる。トリパンブルーにより測定される生存率が７０％を下回るまで４８～７２時間、細胞をインキュベートする。次いで、感染細胞を最大速度のベンチトップ遠心分離器による遠心分離により回収し、１×ＰＢＳ中で洗浄し、再遠心した後、２０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中に再懸濁する。細胞ペレットを、凍結融解を３回繰り返して溶解し、４３００×ｇで５分間遠心して清澄化する。
ＣｈＡｄＶ６８ウイルス生産を、８％ＣＯ２のインキュベーター内で２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）培地中で増殖させた２９３Ｆ細胞で行う。感染させた日に細胞を生存率９８％で１０６細胞／ｍＬに希釈し、１Ｌの振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の生産ラン１回当たり４００ｍＬを使用する。感染１回当たり、４ｍＬの目標ＭＯＩが３．３よりも高い３次ウイルスストックを用いる。トリパンブルーにより測定される生存率が７０％を下回るまで４８～７２時間、細胞をインキュベートする。次いで、感染細胞を最大速度のベンチトップ遠心分離器による遠心分離により回収し、１×ＰＢＳ中で洗浄し、再遠心した後、２０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中に再懸濁する。細胞ペレットを、凍結融解を３回繰り返して溶解し、４３００×ｇで５分間遠心して清澄化する。
ＣｓＣｌ遠心分離によるアデノウイルスの精製
ＣｓＣｌ遠心分離によってウイルスＤＮＡを精製する。２回の不連続の勾配ランを行う。１回目は、細胞成分からウイルスを精製するためのものであり、２回目は、細胞成分からの分離物をさらに精製して感染性粒子から欠陥粒子を分離するためのものである。
ＣｓＣｌ遠心分離によってウイルスＤＮＡを精製する。２回の不連続の勾配ランを行う。１回目は、細胞成分からウイルスを精製するためのものであり、２回目は、細胞成分からの分離物をさらに精製して感染性粒子から欠陥粒子を分離するためのものである。
１０ｍＬの１．２（９２ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に２６．８ｇのＣｓＣｌを溶解したもの）ＣｓＣｌをポリアロマーチューブに加える。次いで、８ｍＬの１．４ＣｓＣｌ（８７ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に５３ｇのＣｓＣｌを溶解したもの）を、ピペットを使用してチューブの底に入れることで慎重に加える。清澄化したウイルスを１．２の層の上に層をなすように静かに入れる。必要に応じてさらなる１０ｍＭ Ｔｒｉｓを加えてチューブのバランスを取る。次いで、各チューブをＳＷ－３２Ｔｉローターに入れ、１０℃で２時間３０分、遠心する。次いで、チューブを取り出して層流キャビネットに移し、１８ゲージの針と１０ｍＬシリンジを用いてウイルスバンドを吸引する。混入する宿主細胞のＤＮＡ及びタンパク質を除去しないように注意を払う。次いで、バンドを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で少なくとも２倍に希釈し、上記に述べた不連続勾配上に上記のように層をなすように置く。今回のランは終夜行った点以外は、上記と同様にしてランを行う。翌日、欠陥粒子のバンドを吸引しないように注意しながらバンドを吸引する。次いで、ＡＲＭバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％グリセロール）に対してＳｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してウイルスを透析する。これをバッファーを１回交換する毎に１時間、３回行う。次いで、ウイルスを等分量に分けて－８０℃で保存する。
アデノウイルスアッセイ
ＯＤ２６０ｎｍでの吸光度値１に相当する１．１×１０１２個のウイルス粒子（ＶＰ）の消光係数に基づいてＯＤ２６０アッセイを用いてＶＰ濃縮化を行う。アデノウイルスの２つの希釈液（１：５と１：１０）を、ウイルス溶解バッファー（０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で調製する。両方の希釈液でＯＤを２重に測定し、ＯＤ２６０値×希釈倍率×１．１×１０１２ＶＰを乗じることにより、ＶＰ濃度／ｍＬを測定する。
ＯＤ２６０ｎｍでの吸光度値１に相当する１．１×１０１２個のウイルス粒子（ＶＰ）の消光係数に基づいてＯＤ２６０アッセイを用いてＶＰ濃縮化を行う。アデノウイルスの２つの希釈液（１：５と１：１０）を、ウイルス溶解バッファー（０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で調製する。両方の希釈液でＯＤを２重に測定し、ＯＤ２６０値×希釈倍率×１．１×１０１２ＶＰを乗じることにより、ＶＰ濃度／ｍＬを測定する。
ウイルスストックの限界希釈アッセイによって感染単位（ＩＵ）力価を計算する。最初にウイルスをＤＭＥＭ／５％ＮＳ／１×ＰＳ中で１００倍に希釈した後、１０倍希釈率を用いて１×１０－７にまで希釈する。次いで、１００μＬのこれらの希釈液を、少なくとも１時間前に２４ウェルプレートに３ｅ５細胞／ウェルで播種した２９３Ａ細胞に加える。これを二重で行う。各プレートを、３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーターで４８時間、インキュベートする。次いで、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した後、１００％冷メタノール（－２０℃）で固定する。次いで、各プレートを－２０℃で最低２０分間インキュベートする。ウェルを１×ＰＢＳで洗浄した後、１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中、室温で１時間ブロッキングする。ウサギ抗Ａｄ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）をブロッキングバッファー中、１：８，０００の希釈率で加え（ウェル当たり０．２５ｍｌ）、室温で１時間インキュベートする。ウェルをウェル当たり０．５ｍＬのＰＢＳで４回洗浄する。１０００倍に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｔｅｘａｓ）をウェルごとに加え、１時間インキュベートした後、最終ラウンドの洗浄を行う。５回のＰＢＳ洗浄を行い、各プレートを、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水に加えたＤＡＢ（ジアミノベンジジン四塩酸塩）基質（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中、０．６７ｍｇ／ｍＬのＤＡＢ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を０．０１％Ｈ２Ｏ２とともに使用して発色させる。各ウェルを、カウントに先立って５分間、発色させる。細胞を、視野当たり４～４０個の染色細胞となるような希釈率を用いて１０倍対物レンズ下でカウントする。使用する視野は、２４ウェルプレート上の視野当たり６２５個に相当する０．３２ｍｍ２の格子とする。１ｍＬ当たりの感染性ウイルスの数は、格子１個当たりの染色細胞の数に、視野１つ当たりの格子の数を掛け、希釈倍率１０を掛けることによって求めることができる。同様に、ＧＦＰ発現細胞を扱う場合、カプシド染色の代わりに蛍光を用いて１ｍＬ当たりのＧＦＰ発現ビリオンの数を求めることができる。
ＸＩＶ．Ｃ．ＣｈＡｄＶ６８ベクターを用いたマウスにおけるワクチン有効性の評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをコードしたカセットを含むワクチンの有効性を、高用量と低用量で評価した。Ｔ細胞応答をモニタリングすることにより有効性を評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをコードしたカセットを含むワクチンの有効性を、高用量と低用量で評価した。Ｔ細胞応答をモニタリングすることにより有効性を評価した。
免疫化
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣｈＡｄＶ６８ワクチンでは、１００ｕＬ体積中、５×１０８個または１×１０１０個のウイルス粒子（ＶＰ）を両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）として投与した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣｈＡｄＶ６８ワクチンでは、１００ｕＬ体積中、５×１０８個または１×１０１０個のウイルス粒子（ＶＰ）を両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）として投与した。
脾細胞の解離
脾細胞を免疫１４日後に単離した。各マウスの脾臓を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者のプロトコールに従って使用して機械的解離を行った。解離した細胞を、４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を用いてＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でカウントした。次いで、後の分析用に細胞を適当な生細胞濃度に調整した。
脾細胞を免疫１４日後に単離した。各マウスの脾臓を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者のプロトコールに従って使用して機械的解離を行った。解離した細胞を、４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を用いてＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でカウントした。次いで、後の分析用に細胞を適当な生細胞濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を用い、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝に従ってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コートプレート中で１６時間、スパイク抗原にわたった１０ｕＭの重複ペプチドプール（１５ａａの長さ、１１ａａの重複）でエクスビボで刺激した。アルカリホスファターゼを用いてスポットを発色させた。反応時間を１０分計り、水道水をプレートに流して反応を停止させた。ＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてスポットをカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析では、飽和度が５０％よりも高いウェルを「測定不能多数」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いで、スポットのカウントを式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェルのカウントを抗原刺激ウェルから差し引くことによりネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、測定不能多数として標識されたウェルを、最高の観察補正値に設定し、１０の位で四捨五入して１００の位までの概数とした。
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を用い、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝に従ってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コートプレート中で１６時間、スパイク抗原にわたった１０ｕＭの重複ペプチドプール（１５ａａの長さ、１１ａａの重複）でエクスビボで刺激した。アルカリホスファターゼを用いてスポットを発色させた。反応時間を１０分計り、水道水をプレートに流して反応を停止させた。ＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてスポットをカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析では、飽和度が５０％よりも高いウェルを「測定不能多数」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いで、スポットのカウントを式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェルのカウントを抗原刺激ウェルから差し引くことによりネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、測定不能多数として標識されたウェルを、最高の観察補正値に設定し、１０の位で四捨五入して１００の位までの概数とした。
結果
マウスを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたカセット（「ＣＭＶ－スパイク－ＳＶ４０」配列番号６９；ＩＤＴアルゴリズムを用いてスパイクタンパク質配列最適化したもの；ｎｂ、初期実験用カセットは１個のＤ１１５３Ｇミスセンス変異を含んでいた）を含む改変ＣｈＡｄＶ６８ベクター（ベクター骨格はｃｈＡｄ６８－空－Ｅ４欠失（配列番号７５）に基づく）で免疫した。スパイクタンパク質にわたる２つのペプチドプールに対するＴ細胞応答についてのＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔにより有効性を評価した。図８Ａに示されるように、ナイーブマウスから得た脾細胞と比較して、スパイクをコードしたＣｈＡｄＶ６８ベクターによる免疫は、スパイクペプチドに対して用量依存的に増加するＴ細胞応答を示した（左パネル－各別個のペプチドプールに対する脾細胞１０６個当たりのＳＦＣ；右パネル－両方のペプチドプールの合計の応答における脾細胞１０６個当たりのＳＦＣ）。
マウスを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたカセット（「ＣＭＶ－スパイク－ＳＶ４０」配列番号６９；ＩＤＴアルゴリズムを用いてスパイクタンパク質配列最適化したもの；ｎｂ、初期実験用カセットは１個のＤ１１５３Ｇミスセンス変異を含んでいた）を含む改変ＣｈＡｄＶ６８ベクター（ベクター骨格はｃｈＡｄ６８－空－Ｅ４欠失（配列番号７５）に基づく）で免疫した。スパイクタンパク質にわたる２つのペプチドプールに対するＴ細胞応答についてのＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔにより有効性を評価した。図８Ａに示されるように、ナイーブマウスから得た脾細胞と比較して、スパイクをコードしたＣｈＡｄＶ６８ベクターによる免疫は、スパイクペプチドに対して用量依存的に増加するＴ細胞応答を示した（左パネル－各別個のペプチドプールに対する脾細胞１０６個当たりのＳＦＣ；右パネル－両方のペプチドプールの合計の応答における脾細胞１０６個当たりのＳＦＣ）。
ＸＩＶ．Ｄ．ＳＡＭベクターを用いたマウスにおけるワクチン有効性の評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチン（例えば、表４を参照）の有効性を評価した。Ｔ細胞及び／またはＢ細胞応答をモニタリングすることにより有効性を評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチン（例えば、表４を参照）の有効性を評価した。Ｔ細胞及び／またはＢ細胞応答をモニタリングすることにより有効性を評価した。
免疫化
ＳＡＭワクチンでは、１００ｕＬ体積中、１または１０ｕｇのＲＮＡ－ＬＮＰ複合体を両側性筋肉内注射（片脚当たり５０ｕＬ）として投与した。
ＳＡＭワクチンでは、１００ｕＬ体積中、１または１０ｕｇのＲＮＡ－ＬＮＰ複合体を両側性筋肉内注射（片脚当たり５０ｕＬ）として投与した。
各試験群を下記表５Ａに記載する。
脾細胞の解離
脾細胞を免疫２週後及び１０週後に単離した。各マウスの脾臓を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールする。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者のプロトコールに従って使用して機械的解離を行った。解離した細胞を、４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（約１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を用いてＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でカウントした。次いで、後の分析用に細胞を適当な生細胞濃度に調整した。
脾細胞を免疫２週後及び１０週後に単離した。各マウスの脾臓を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールする。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者のプロトコールに従って使用して機械的解離を行った。解離した細胞を、４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（約１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を用いてＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でカウントした。次いで、後の分析用に細胞を適当な生細胞濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を用い、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝に従ってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コートプレート中で１６時間、目的の抗原全体にわたった１０ｕＭの重複ペプチドプール（「ＯＬＰ」、１５マー、１１ａａの重複）とインキュベートした。アルカリホスファターゼを用いてスポットを発色させた。反応時間を１０分計り、水道水をプレートに流して反応を停止させた。ＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてスポットをカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析では、飽和度が５０％よりも高いウェルを「測定不能多数」として記録する。複製ウェルの偏差が１０％よりも高い試料を分析から除外した。次いで、スポットのカウントを式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェルのカウントを抗原刺激ウェルから差し引くことによりネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、測定不能多数として標識されたウェルを、最高の観察補正値に設定し、１０の位で四捨五入して１００の位までの概数とした。
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を用い、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝に従ってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コートプレート中で１６時間、目的の抗原全体にわたった１０ｕＭの重複ペプチドプール（「ＯＬＰ」、１５マー、１１ａａの重複）とインキュベートした。アルカリホスファターゼを用いてスポットを発色させた。反応時間を１０分計り、水道水をプレートに流して反応を停止させた。ＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてスポットをカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析では、飽和度が５０％よりも高いウェルを「測定不能多数」として記録する。複製ウェルの偏差が１０％よりも高い試料を分析から除外した。次いで、スポットのカウントを式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェルのカウントを抗原刺激ウェルから差し引くことによりネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、測定不能多数として標識されたウェルを、最高の観察補正値に設定し、１０の位で四捨五入して１００の位までの概数とした。
エクスビボ細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリー分析
２～５×１０６細胞／ｍＬの密度の新しく単離したリンパ球を、目的の抗原全体にわたる１０ｕＭの重複ペプチドプール（１５マー、１１ａａの重複）と２時間インキュベートした。２時間後、ブレフェルジンＡを５ｕｇ／ｍｌの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに４時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ７８０で標識し、抗ＣＤ８ ＡＰＣ（クローン５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）により１：４００の希釈率で染色した。細胞内染色には抗ＩＦＮｇ ＰＥ（クローンＸＭＧ１．２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を１：１００で使用した。細胞をＣＤ４、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びグランザイムＢについても染色した。試料をＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で採取した。フローサイトメトリーのデータをプロットし、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。抗原特異的応答の大きさを評価するため、染色細胞の割合を各ペプチドプールに応じて計算した。
２～５×１０６細胞／ｍＬの密度の新しく単離したリンパ球を、目的の抗原全体にわたる１０ｕＭの重複ペプチドプール（１５マー、１１ａａの重複）と２時間インキュベートした。２時間後、ブレフェルジンＡを５ｕｇ／ｍｌの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに４時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ７８０で標識し、抗ＣＤ８ ＡＰＣ（クローン５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）により１：４００の希釈率で染色した。細胞内染色には抗ＩＦＮｇ ＰＥ（クローンＸＭＧ１．２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を１：１００で使用した。細胞をＣＤ４、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びグランザイムＢについても染色した。試料をＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で採取した。フローサイトメトリーのデータをプロットし、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。抗原特異的応答の大きさを評価するため、染色細胞の割合を各ペプチドプールに応じて計算した。
抗体力価
抗体応答をモニタリングするため、血液を２週毎に採取した。血清中の抗体力価を、あらゆる目的で本明細書に参照により援用するところのＪ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｂｃ６２８４（２０２０）に記載されるようにして決定した。
抗体応答をモニタリングするため、血液を２週毎に採取した。血清中の抗体力価を、あらゆる目的で本明細書に参照により援用するところのＪ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｂｃ６２８４（２０２０）に記載されるようにして決定した。
結果
マウスを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号５９、ＩＤＴ最適化配列）、膜タンパク質（配列番号６１）、及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット（配列番号５８）をコードしたカセットを含むＳＡＭベクターで免疫した。スパイクタンパク質にわたる２つのペプチドプールに対するＴ細胞応答についてのＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔにより有効性を評価した。図８Ｂ及び図８Ｃに示される（表７に定量化される）ように、ナイーブマウスから得た脾細胞と比較して、スパイクをコードしたＳＡＭベクターによる免疫は、スパイクペプチドに対して用量依存的に増加するＴ細胞応答を示した（図８Ａ－各別個のペプチドプールに対する脾細胞１０６個当たりのＳＦＣ；図８Ｂ－両方のペプチドプールの合計の応答における脾細胞１０６個当たりのＳＦＣ）。さらに、下記表８に示されるように、ＳＡＭスパイクによる免疫は、抗体力価、具体的には中和抗体（「Ｎａｂ」）の増加を示した。注目すべき点として、Ｎａｂ力価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から回復した２７人の回復期のヒトのコホートにおけるＮａｂ力価と大きさが同等であった（力価中央値９３）［Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｂｃ６２８４（２０２０）］。したがって、これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来抗原、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをコードしたＳＡＭベクターによるワクチン接種が、Ｔ細胞及びＢ細胞免疫応答を示したことを示すものである。
マウスを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号５９、ＩＤＴ最適化配列）、膜タンパク質（配列番号６１）、及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット（配列番号５８）をコードしたカセットを含むＳＡＭベクターで免疫した。スパイクタンパク質にわたる２つのペプチドプールに対するＴ細胞応答についてのＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔにより有効性を評価した。図８Ｂ及び図８Ｃに示される（表７に定量化される）ように、ナイーブマウスから得た脾細胞と比較して、スパイクをコードしたＳＡＭベクターによる免疫は、スパイクペプチドに対して用量依存的に増加するＴ細胞応答を示した（図８Ａ－各別個のペプチドプールに対する脾細胞１０６個当たりのＳＦＣ；図８Ｂ－両方のペプチドプールの合計の応答における脾細胞１０６個当たりのＳＦＣ）。さらに、下記表８に示されるように、ＳＡＭスパイクによる免疫は、抗体力価、具体的には中和抗体（「Ｎａｂ」）の増加を示した。注目すべき点として、Ｎａｂ力価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から回復した２７人の回復期のヒトのコホートにおけるＮａｂ力価と大きさが同等であった（力価中央値９３）［Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｂｃ６２８４（２０２０）］。したがって、これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来抗原、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをコードしたＳＡＭベクターによるワクチン接種が、Ｔ細胞及びＢ細胞免疫応答を示したことを示すものである。
ＸＩＶ．Ｅ．１ マウスにおけるワクチン有効性の評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチン（例えば、表４を参照）の有効性を評価する。Ｔ細胞及び／またはＢ細胞応答をモニタリングすることにより有効性を評価する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチン（例えば、表４を参照）の有効性を評価する。Ｔ細胞及び／またはＢ細胞応答をモニタリングすることにより有効性を評価する。
免疫化
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＳＡＭワクチンでは、１または１０ｕｇのＲＮＡ－ＬＮＰ複合体を１００ｕＬ体積で両側性筋肉内注射（片脚当たり５０ｕＬ）により注入する。
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＳＡＭワクチンでは、１または１０ｕｇのＲＮＡ－ＬＮＰ複合体を１００ｕＬ体積で両側性筋肉内注射（片脚当たり５０ｕＬ）により注入する。
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣｈＡｄＶ６８ワクチンでは、１００ｕＬ体積中、５×１０８個または１×１０１０個のウイルス粒子（ＶＰ）を両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）として投与する。
マウスに最初のプライミング用量と６週目にその後のブースター用量を投与した。マウスを、同種ＳＡＭワクチン接種戦略、同種ＣｈＡｄＶ６８ワクチン接種戦略、または異種ＣｈＡｄＶ６８／ＳＡＭワクチン接種戦略（ＣｈＡｄＶ６８によるプライミング／ＳＡＭによるブースター）のいずれかで免疫した。
代表的な試験群を下記表５Ｂに記載する。
脾細胞の解離
脾細胞を免疫２週後及び８週後に単離する。各マウスの脾臓を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールする。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行う。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解する。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁する。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を用いてＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でカウントする。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整する。
脾細胞を免疫２週後及び８週後に単離する。各マウスの脾臓を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールする。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行う。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解する。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁する。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を用いてＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でカウントする。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整する。
エクスビボ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行う。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コートプレート中で１６時間、目的の抗原全体にわたった１０ｕＭの重複ペプチドプール（１５マー、１１ａａの重複）とインキュベートする。スポットをアルカリホスファターゼを用いて発色させる。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させる。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントする。ＥＬＩＳＰＯＴ分析では、飽和度が５０％よりも高いウェルを「測定不能多数」として記録する。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外する。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正する。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正する。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入する。
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行う。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コートプレート中で１６時間、目的の抗原全体にわたった１０ｕＭの重複ペプチドプール（１５マー、１１ａａの重複）とインキュベートする。スポットをアルカリホスファターゼを用いて発色させる。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させる。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントする。ＥＬＩＳＰＯＴ分析では、飽和度が５０％よりも高いウェルを「測定不能多数」として記録する。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外する。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正する。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正する。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入する。
エクスビボ細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリー分析
２～５×１０６細胞／ｍＬの密度の新しく単離したリンパ球を、目的の抗原全体にわたる１０ｕＭの重複ペプチドプール（１５マー、１１ａａの重複）と２時間インキュベートする。２時間後、ブレフェルジンＡを５ｕｇ／ｍｌの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに４時間インキュベートする。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ７８０で標識し、抗ＣＤ８ ＡＰＣ（クローン５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）により１：４００の希釈率で染色する。抗ＩＦＮｇ ＰＥ（クローンＸＭＧ１．２， ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１：１００で使用して細胞染色を行った。細胞をＣＤ４、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びグランザイムＢについても染色する。試料をＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で採取する。フローサイトメトリーのデータをプロットし、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析する。抗原特異的応答の大きさを評価するため、染色細胞の割合を各ペプチドプールに応じて計算する。
２～５×１０６細胞／ｍＬの密度の新しく単離したリンパ球を、目的の抗原全体にわたる１０ｕＭの重複ペプチドプール（１５マー、１１ａａの重複）と２時間インキュベートする。２時間後、ブレフェルジンＡを５ｕｇ／ｍｌの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに４時間インキュベートする。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ７８０で標識し、抗ＣＤ８ ＡＰＣ（クローン５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）により１：４００の希釈率で染色する。抗ＩＦＮｇ ＰＥ（クローンＸＭＧ１．２， ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１：１００で使用して細胞染色を行った。細胞をＣＤ４、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びグランザイムＢについても染色する。試料をＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で採取する。フローサイトメトリーのデータをプロットし、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析する。抗原特異的応答の大きさを評価するため、染色細胞の割合を各ペプチドプールに応じて計算する。
抗体力価
抗体応答をモニタリングするため、血液を２週毎に採取する。血清中の抗体力価（ＩｇＧ、ＩＧＭ）をスパイク及び膜タンパク質について測定する。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２アイソタイプを決定してＴｈ１分極化を評価する。抗体媒介中和も評価する。
抗体応答をモニタリングするため、血液を２週毎に採取する。血清中の抗体力価（ＩｇＧ、ＩＧＭ）をスパイク及び膜タンパク質について測定する。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２アイソタイプを決定してＴｈ１分極化を評価する。抗体媒介中和も評価する。
高齢マウスモデル
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１評価に用いられた高齢マウスモデル（Ｂｏｌｌｅｓ ２０１１）を用いてＴ細胞の免疫原性、Ｂ細胞応答、及び抗体媒介中和を評価する。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣｈＡｄＶ６８ワクチンでは、１００ｕＬ体積中、１×１０１０個のウイルス粒子（ＶＰ）を両側性筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）として投与する。高齢ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳＡＭワクチンでは、１００ｕＬ体積中、１０ｕｇのＳＡＭ－ＬＮＰを両側性筋肉内注射（片脚当たり５０ｕＬ）として投与する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１評価に用いられた高齢マウスモデル（Ｂｏｌｌｅｓ ２０１１）を用いてＴ細胞の免疫原性、Ｂ細胞応答、及び抗体媒介中和を評価する。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣｈＡｄＶ６８ワクチンでは、１００ｕＬ体積中、１×１０１０個のウイルス粒子（ＶＰ）を両側性筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）として投与する。高齢ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳＡＭワクチンでは、１００ｕＬ体積中、１０ｕｇのＳＡＭ－ＬＮＰを両側性筋肉内注射（片脚当たり５０ｕＬ）として投与する。
結果
上記に述べたようにマウスを免疫する。マウスにおける有効性試験を図９に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチンは、ワクチン設計に従ってＴ細胞及びＢ細胞応答の両方を示す。ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔｈ１、及びＴｈ２の分極化も測定する。
上記に述べたようにマウスを免疫する。マウスにおける有効性試験を図９に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチンは、ワクチン設計に従ってＴ細胞及びＢ細胞応答の両方を示す。ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔｈ１、及びＴｈ２の分極化も測定する。
ＸＩＶ．Ｅ．２ 非ヒト霊長類におけるワクチン有効性の評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチン（例えば、表４を参照）の有効性及び安全性を評価する。Ｔ細胞及び／またはＢ細胞応答をモニタリングすることにより有効性を評価する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチン（例えば、表４を参照）の有効性及び安全性を評価する。Ｔ細胞及び／またはＢ細胞応答をモニタリングすることにより有効性を評価する。
免疫化
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルにおけるＳＡＭワクチンでは、ＳＡＭを、大腿四頭筋に片脚当たり１ｍＬ、動物当たり合計１ｍｇの用量で両側性筋肉内注射として投与する。
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルにおけるＳＡＭワクチンでは、ＳＡＭを、大腿四頭筋に片脚当たり１ｍＬ、動物当たり合計１ｍｇの用量で両側性筋肉内注射として投与する。
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルにおけるＣｈＡｄＶ６８ワクチンでは、ＣｈＡｄＶ６８を、１×１０１２個のウイルス粒子（注射当たり５×１０１１個のウイルス粒子）で両側性に投与する。
アカゲザルにおける免疫モニタリング
免疫モニタリングを行うため、１０～２０ｍＬの血液をヘパリンが入ったバキュテイナチューブに採取し、単離まで室温で維持する。ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）及びＬｅｕｃｏｓｅｐ分離チューブを使用して、密度勾配遠心分離によって単離する。ＰＢＭＣをヨー化プロピジウムで染色し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して生細胞をカウントした。次いで、試料を、ＲＰＭＩ完全培地（１０％ＦＢＳ）中に４×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。
免疫モニタリングを行うため、１０～２０ｍＬの血液をヘパリンが入ったバキュテイナチューブに採取し、単離まで室温で維持する。ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）及びＬｅｕｃｏｓｅｐ分離チューブを使用して、密度勾配遠心分離によって単離する。ＰＢＭＣをヨー化プロピジウムで染色し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して生細胞をカウントした。次いで、試料を、ＲＰＭＩ完全培地（１０％ＦＢＳ）中に４×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。
プレコートされた９６ウェルプレート（ＭＡｂｔｅｃｈ，サルＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ ＰＬＵＳ，ＡＬＰ（キットロット番号３６、プレートロット番号１９））を製造者のプロトコールに従って使用してＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行う。各試料及び刺激について、ウェル当たり個及び１×１０５個のＰＢＭＣを、１０ｕｇ／ｍＬのペプチド刺激（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）とともに３重に播種し、完全ＲＰＭＩ中で一晩インキュベートする。試料を、スパイク、膜またはＴ細胞エピトープに対する重複ペプチドプール、またはＤＭＳＯのみと一晩インキュベートする。重複プール（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）は、各タンパク質（スパイク、膜、ヌクレオカプシド）またはＥＤＧＥにより決定されたエピトープのストレッチにわたるアミノ酸１１個の重複を有する、アミノ酸１５個の長さのペプチドからなる。各プールをそれぞれ最大６０ペプチドのミニプールに分割する。各試料のネガティブコントロールとして、ＤＭＳＯのみを用いる。プレートをＰＢＳで洗浄し、抗サルＩＦＮγ ＭＡｂビオチン（ＭＡｂｔｅｃｈ）と２時間インキュベートし、その後、さらに洗浄してストレプトアビジン－ＡＬＰ（ＭＡｂｔｅｃｈ）と１時間インキュベートする。最後の洗浄後、プレートをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＭＡｂｔｅｃｈ）と１０分間インキュベートして免疫スポットを発色させ、３７℃で一晩乾燥させる。スポットを撮影し、ＡＩＤリーダー（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）を使用してカウントする。
複製ウェル変動性（変動性＝分散／［中央値＋１］）が１０よりも大きく、かつ中央値が１０よりも大きい試料は除外する。スポット値を、下式に従ってウェル飽和度に基づいて調整する。調整後スポット＝非処理スポット＋２×（非処理スポット×飽和度／［１００－飽和度］）。ウェル飽和度が３３％よりも大きいウェルは、「測定不能多数」（ＴＮＴＣ）とみなし、除外する。ネガティブコントロールペプチドのウェルの平均値を差し引くことにより各試料のバックグラウンド補正を行う。補正後のスポット数に１×１０６／播種細胞数を掛けることにより、データを１×１０６個のＰＢＭＣ当たりのスポット形成コロニー（ＳＦＣ）に対して正規化する。全体のサマリー分析を行うため、試料がＴＮＴＣであった場合以外は、１×１０５細胞／ウェルで細胞を播種することにより得られた計算値を用い、ＴＮＴＣの場合には２．５×１０４細胞／ウェルで細胞を播種して得られた計算値をその特定の試料／刺激／時点で用いる。データ処理は、Ｒプログラミング言語を用いて行った。
細胞内サイトカインアッセイも行う。ＰＢＭＣをＶ底９６ウェルプレート内にウェル当たり１×１０６細胞で分配する。細胞をペレット化し、スパイク、膜、またはＥＤＧＥで予測されたＴ細胞エピトープのいずれかに対する上記に述べた重複ペプチドプールを含む１００μｌの完全ＲＰＭＩ中に再懸濁する。各試料のネガティブコントロールとして、ＤＭＳＯを用いる。１時間後にブレフェルジンＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を最終濃度５μｇ／ｍＬまで加え、細胞を一晩インキュベートする。生死判別染色後、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で細胞外染色を行う。細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて洗浄、固定、及び透過処理する。細胞内染色を行う。試料を、生存率、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＦＮγ、ＴＮＦａ、ＩＬ－２、パーフォリン、ＣＤ１０７ａ、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡについて評価する。
血清サイトカインアッセイマーカーもモニタリングする。血清サイトカイン及びケモカインレベルを標準的なマルチプレックスアッセイにより測定する。血清を採取し、ワクチン接種の０時間（ベースライン）、２時間、８時間、及び４８時間後にマーカー分析を行う。評価したサイトカインは、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン－１（ＩＬ－１０）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロンγ誘導タンパク質１０（ＩＰ－１０）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ－１β）、及びＩＦＮ－α（ＩＦＮ－α２ａ）である。
血清抗体力価及び中和抗体力価を測定する。
結果
上記に述べたようにＮＨＰを免疫する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチンは、ワクチン設計に従ってＴ細胞及びＢ細胞応答の両方を示す。このワクチン戦略により、中和抗体の産生ももたらされる。
上記に述べたようにＮＨＰを免疫する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣエピトープコードカセット及び／または完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードしたカセットを含むワクチンは、ワクチン設計に従ってＴ細胞及びＢ細胞応答の両方を示す。このワクチン戦略により、中和抗体の産生ももたらされる。
ＸＩＶ．Ｆ．スパイクタンパク質の配列最適化
スパイクタンパク質をコードするさまざまな配列最適化されたヌクレオチド配列をＣｈＡｄＶ６８ワクチンベクターで評価した。
スパイクタンパク質をコードするさまざまな配列最適化されたヌクレオチド配列をＣｈＡｄＶ６８ワクチンベクターで評価した。
スパイクタンパク質の配列最適化
Ｗｕｈａｎ Ｈｕ／１からのスパイクヌクレオチド配列（配列番号７８）を、アミノ酸配列が影響されないように同義コドンで置換することにより配列最適化した。ＩＤＴアルゴリズムをヒトでの発現を増強し、合成を助けるために複雑さを低減するために用いた（例えば、配列番号６６～７４を参照）。２つのさらなるアルゴリズム、すなわち、（１）ＳＧＩ ＤＮＡ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて生成された単一の配列（配列番号８７）、（２）ＣＯＯＬ（ＣＯＯＬアルゴリズムは複数の配列を生成し、６つを選択した）を用いて生成されたＣＴ１、ＣＴ２０、ＣＴ５６、ＣＴ８３、ＣＴ１３１、及びＣＴ１９９（配列番号７９～８４）として示される６つの配列を用いてスパイクタンパク質をさらに配列最適化した。それぞれの配列を表６に示す。
Ｗｕｈａｎ Ｈｕ／１からのスパイクヌクレオチド配列（配列番号７８）を、アミノ酸配列が影響されないように同義コドンで置換することにより配列最適化した。ＩＤＴアルゴリズムをヒトでの発現を増強し、合成を助けるために複雑さを低減するために用いた（例えば、配列番号６６～７４を参照）。２つのさらなるアルゴリズム、すなわち、（１）ＳＧＩ ＤＮＡ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて生成された単一の配列（配列番号８７）、（２）ＣＯＯＬ（ＣＯＯＬアルゴリズムは複数の配列を生成し、６つを選択した）を用いて生成されたＣＴ１、ＣＴ２０、ＣＴ５６、ＣＴ８３、ＣＴ１３１、及びＣＴ１９９（配列番号７９～８４）として示される６つの配列を用いてスパイクタンパク質をさらに配列最適化した。それぞれの配列を表６に示す。
ＣｈＡｄＶ６８ウイルスに感染させるかまたはＣｈＡｄＶ６８ゲノムＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ａ細胞からのｃＤＮＡでスプライシング事象を特定した。具体的には、１０ｅ５～１０ｅ６細胞からの全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙカラムを使用して精製した。ＤＮＡアーゼ処理により残留ＤＮＡを除去し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてｃＤＮＡを生成した。その後、ＧｒｉｔｓｔｏｎｅＣｈＡｄＶ６８カセットの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに特異的なプライマーを使用してＰＣＲ産物を生成し、アガロースゲル電気泳動により分析し、ゲル精製し、サンガー法によりシークエンシングしてスプライシングによって欠失された領域を特定した。
部位特異的変異導入によりスプライスドナー部位を除去して、アミノ酸配列に影響しないようにヌクレオチド配列モチーフを破壊した。変異導入は、上記の変異をＰＣＲプライマーに導入し、複数のフラグメントを並行して増幅し、各フラグメント（３０～６０ｎｔの重複を有する）にギブソンアセンブリを用いて行った。最適化されたクローンＣＴ１－２Ｃ（配列番号８５）は、ＮＴ３８５及びＮＴ５３９が変異したサンガー法で配列特定されたスプライスドナーモチーフを有し、クローンＩＤＴ－４Ｃ（配列番号８６）は、ＮＴ３８５、ＮＴ５３９が変異したサンガー法で配列特定されたスプライスドナーモチーフと、ＮＴ２００３及びＮＴ２４７３が変異した予測されたドナーモチーフを有していた。さらに、ｎｔ４４５の可能なポリアデニル化部位ＡＡＴＡＡＡが、ＩＤＴ－４ＣクローンではＡＡｃＡＡＡに変異していた。
上記に述べた配列を表６に示す。
配列最適化されたスパイク配列のクローニング
配列最適化されたスパイク配列のそれぞれを、それぞれのｇＢｌｏｃｋが１３００～１５００ｂｐであり、互いに約１００ヌクレオチドが重複した３つのｇＢｌｏｃｋのセットとしてＩＤＴから注文した。スパイク配列の５’及び３’末端を含むｇＢｌｏｃｋは、プラスミド骨格と１００ヌクレオチド重複していた。これらのｇＢｌｏｃｋをＰＣＲとギブソンアセンブリの組み合わせによって直鎖化ｐＡ６８－Ｅ４ｄ ＡｓｉｓＩ／ＰｍｅＩ骨格にアセンブルしてｐＡ６８－Ｅ４－配列最適化スパイククローンを作製した。クローンをＰＣＲによりスクリーニングし、適正なサイズのクローンをプラスミド産生用に増殖させ、ＮＧＳまたはサンガーシークエンシングによりシークエンシングした。適正なクローンの配列を確認した後、トランスフェクション用に大規模プラスミド産生及び精製を行った。
配列最適化されたスパイク配列のそれぞれを、それぞれのｇＢｌｏｃｋが１３００～１５００ｂｐであり、互いに約１００ヌクレオチドが重複した３つのｇＢｌｏｃｋのセットとしてＩＤＴから注文した。スパイク配列の５’及び３’末端を含むｇＢｌｏｃｋは、プラスミド骨格と１００ヌクレオチド重複していた。これらのｇＢｌｏｃｋをＰＣＲとギブソンアセンブリの組み合わせによって直鎖化ｐＡ６８－Ｅ４ｄ ＡｓｉｓＩ／ＰｍｅＩ骨格にアセンブルしてｐＡ６８－Ｅ４－配列最適化スパイククローンを作製した。クローンをＰＣＲによりスクリーニングし、適正なサイズのクローンをプラスミド産生用に増殖させ、ＮＧＳまたはサンガーシークエンシングによりシークエンシングした。適正なクローンの配列を確認した後、トランスフェクション用に大規模プラスミド産生及び精製を行った。
ベクター産生
ｐＡ６８－Ｅ４－スパイクプラスミドＤＮＡをＰａｃＩで消化し、２ｕｇのＤＮＡをＴｒａｎｓＩｔ Ｌｅｎｔｉトランスフェクション試薬を使用して２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの５日後、細胞及び培地を回収し、－８０Ｃ及び３７Ｃで凍結解凍することによりライセートを生成した。このライセートの画分を用いて３０ｍＬの２９３Ｆ細胞に再感染させ、４８～７２時間インキュベートした後、回収した。－８０Ｃ及び３７Ｃで凍結解凍することによりライセートを生成し、このライセートの画分を用いて１ｅ６細胞／ｍＬで播種した４００ｍＬの２９３Ｆ細胞に感染させた。次に、４８～７２時間後に細胞を回収し、１０ｍＭのｔｒｉｓ ｐＨ ８．０／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中で溶解し、３７及び－８０Ｃで１回凍結解凍した。次いでこのライセートを４３００×ｇで１０分間遠心して清澄化した後、１．２／１．４ＣｓＣｌ勾配にかけた。最低２時間勾配にかけた後、各バンドを回収し、Ｔｒｉｓ中で２～４倍に希釈し、再び１．３５ＣｓＣｌ勾配に少なくとも２時間かけた。ウイルスバンドを回収し、次いで１×ＡＲＭバッファー中で３回透析した。ウイルス感染性力価を免疫染色力価アッセイにより決定し、ウイルス粒子をＡ２６０ｎｍの吸光度により測定した。
ｐＡ６８－Ｅ４－スパイクプラスミドＤＮＡをＰａｃＩで消化し、２ｕｇのＤＮＡをＴｒａｎｓＩｔ Ｌｅｎｔｉトランスフェクション試薬を使用して２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの５日後、細胞及び培地を回収し、－８０Ｃ及び３７Ｃで凍結解凍することによりライセートを生成した。このライセートの画分を用いて３０ｍＬの２９３Ｆ細胞に再感染させ、４８～７２時間インキュベートした後、回収した。－８０Ｃ及び３７Ｃで凍結解凍することによりライセートを生成し、このライセートの画分を用いて１ｅ６細胞／ｍＬで播種した４００ｍＬの２９３Ｆ細胞に感染させた。次に、４８～７２時間後に細胞を回収し、１０ｍＭのｔｒｉｓ ｐＨ ８．０／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中で溶解し、３７及び－８０Ｃで１回凍結解凍した。次いでこのライセートを４３００×ｇで１０分間遠心して清澄化した後、１．２／１．４ＣｓＣｌ勾配にかけた。最低２時間勾配にかけた後、各バンドを回収し、Ｔｒｉｓ中で２～４倍に希釈し、再び１．３５ＣｓＣｌ勾配に少なくとも２時間かけた。ウイルスバンドを回収し、次いで１×ＡＲＭバッファー中で３回透析した。ウイルス感染性力価を免疫染色力価アッセイにより決定し、ウイルス粒子をＡ２６０ｎｍの吸光度により測定した。
ウエスタン分析
スパイク発現分析用の試料を、トランスフェクション後の指定の時間に回収するか、または精製ウイルスの場合には、既知のウイルスＭＯＩでの制御された感染実験を計画し、感染の特定の時間後、通常２４～４８時間後に回収した。一般的には、１ｅ６細胞を、１０％β－メルカプトエタノールを含む０．５ｍＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー中に回収した。試料を煮沸し、変性及び還元条件下で４～２０％ポリアクリルアミドゲルに流した。次いで、ゲルをＢｉｏＲａｄ Ｒａｐｉｄ転写装置を使用してＰＶＤＦ膜上にブロッティングした。この膜をＴＢＳＴ中の５％スキムミルク中、室温で２時間ブロッキングした。次いで、膜を抗スパイクＳ１ポリクローナル（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）または抗スパイクモノクローナル抗体１Ａ９（ＧｅｎｅＴｅｘ、カタログ番号ＧＴＸ６３２６０４）でプローブし、２時間インキュベートした。次いで、膜をＰＢＳＴ中で５回洗浄し、ＨＲＰ結合抗マウス抗体（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｓ）で１時間プローブした。膜を上記に述べたように洗浄した後、化学発光基質ＥＣＬｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とインキュベートした。次いで、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（ＢｉｏＲａｄ ｄｅｖｉｃｅ）を使用して画像を撮影した。
スパイク発現分析用の試料を、トランスフェクション後の指定の時間に回収するか、または精製ウイルスの場合には、既知のウイルスＭＯＩでの制御された感染実験を計画し、感染の特定の時間後、通常２４～４８時間後に回収した。一般的には、１ｅ６細胞を、１０％β－メルカプトエタノールを含む０．５ｍＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー中に回収した。試料を煮沸し、変性及び還元条件下で４～２０％ポリアクリルアミドゲルに流した。次いで、ゲルをＢｉｏＲａｄ Ｒａｐｉｄ転写装置を使用してＰＶＤＦ膜上にブロッティングした。この膜をＴＢＳＴ中の５％スキムミルク中、室温で２時間ブロッキングした。次いで、膜を抗スパイクＳ１ポリクローナル（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）または抗スパイクモノクローナル抗体１Ａ９（ＧｅｎｅＴｅｘ、カタログ番号ＧＴＸ６３２６０４）でプローブし、２時間インキュベートした。次いで、膜をＰＢＳＴ中で５回洗浄し、ＨＲＰ結合抗マウス抗体（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｓ）で１時間プローブした。膜を上記に述べたように洗浄した後、化学発光基質ＥＣＬｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とインキュベートした。次いで、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（ＢｉｏＲａｄ ｄｅｖｉｃｅ）を使用して画像を撮影した。
結果
スパイクＳ２タンパク質の発現を、異なるスパイクコードベクターを用いた２９３Ｆ細胞中でのウイルス産生において評価した。図１０Ａに示されるように、ＩＤＴの配列最適化スパイクカセットをコードしたベクターを使用し、ＳＡＭベクター中で発現させた場合（図１０Ａ、最後のレーン）には、抗スパイクＳ２抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）を使用したウエスタンブロットによりスパイクＳ２タンパク質が検出されたが、ＣｈＡｄＶ６８ベクター（「ＣＭＶ－スパイク（ＩＤＴ）」、配列番号６９）で発現させた場合には２つの異なるＭＯＩ及び時点（図１０Ａ、レーン１及び７）で検出されなかった。スパイクバリアントＤ６１４Ｇを発現するように操作した２つのクローン（「ＣＭＶ－スパイク（ＩＤＴ）－Ｄ６１４Ｇ」、配列番号７０）も、Ｓ２抗体を使用したウエスタンブロットにより検出可能なレベルのスパイクタンパク質を発現しなかった（図１０Ａ、レーン２及び３）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質とスパイクを同時発現するように操作したクローン（「ＣＭＶ－スパイク（ＩＤＴ）－Ｄ６１４Ｇ－膜」、配列番号６６）、またはフーリン切断部位を破壊するためのＲ６８２Ｖ変異を含むクローンは発現表現型を維持しなかった（図１０Ａ、レーン４及び５）。これに対して、図１０Ｂに示されるように、スパイクＳ１タンパク質は、スパイクＳ１タンパク質が検出されなかったフーリンＲ６８２Ｖ変異を除き、低い濃度ではあるが、すべてのＩＤＴコンストラクトで検出された。
スパイクＳ２タンパク質の発現を、異なるスパイクコードベクターを用いた２９３Ｆ細胞中でのウイルス産生において評価した。図１０Ａに示されるように、ＩＤＴの配列最適化スパイクカセットをコードしたベクターを使用し、ＳＡＭベクター中で発現させた場合（図１０Ａ、最後のレーン）には、抗スパイクＳ２抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）を使用したウエスタンブロットによりスパイクＳ２タンパク質が検出されたが、ＣｈＡｄＶ６８ベクター（「ＣＭＶ－スパイク（ＩＤＴ）」、配列番号６９）で発現させた場合には２つの異なるＭＯＩ及び時点（図１０Ａ、レーン１及び７）で検出されなかった。スパイクバリアントＤ６１４Ｇを発現するように操作した２つのクローン（「ＣＭＶ－スパイク（ＩＤＴ）－Ｄ６１４Ｇ」、配列番号７０）も、Ｓ２抗体を使用したウエスタンブロットにより検出可能なレベルのスパイクタンパク質を発現しなかった（図１０Ａ、レーン２及び３）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質とスパイクを同時発現するように操作したクローン（「ＣＭＶ－スパイク（ＩＤＴ）－Ｄ６１４Ｇ－膜」、配列番号６６）、またはフーリン切断部位を破壊するためのＲ６８２Ｖ変異を含むクローンは発現表現型を維持しなかった（図１０Ａ、レーン４及び５）。これに対して、図１０Ｂに示されるように、スパイクＳ１タンパク質は、スパイクＳ１タンパク質が検出されなかったフーリンＲ６８２Ｖ変異を除き、低い濃度ではあるが、すべてのＩＤＴコンストラクトで検出された。
ＩＤＴ配列最適化クローンによる発現の問題がＳ１またはＳ２ドメインのいずれに固有であるかを解明するため、Ｓ１またはＳ２ドメインのみを発現するベクターも評価した。図１０Ｃに示されるように、ＩＤＴ配列最適化スパイクＳ１タンパク質のみをコードしたＣｈＡｄＶ６８ベクターは、完全長スパイクベクターで観察された低い発現に対して、強いタンパク質発現を示した（図１０Ｃ、レーン１と２）。予想されるように、Ｓ２ドメインのみをコードしたベクターではＳ１のシグナルは観察されなかった。これに対して、図１０Ｄに示されるように、ＩＤＴ配列最適化スパイクＳ２タンパク質のみをコードしたＣｈＡｄＶ６８ベクターは観察可能なタンパク質発現は示さず、シグナルが認められなかった完全長スパイクベクターと同等であった（図１０Ｄ、レーン１及び３）。したがって、これらのデータは、ＩＤＴ配列最適化スパイクＳ２が、完全長スパイク配列の発現への影響を含め、低い発現を示したことを示している。
タンパク質発現の問題に対処するため、さらなるアルゴリズム、すなわち、（１）ＳＧＩ ＤＮＡ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて生成された単一の配列（配列番号８７）、（２）ＣＯＯＬ（ＣＯＯＬアルゴリズムは複数の配列を生成し、６つを選択した。）を用いて生成されたＣＴ１、ＣＴ２０、ＣＴ５６、ＣＴ８３、ＣＴ１３１、及びＣＴ１９９（配列番号７９～８４）として示される６つの配列を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクコードヌクレオチド配列を配列最適化した。図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるように、ＣＯＯＬアルゴリズムによる配列最適化により、抗Ｓ２抗体及び抗Ｓ１抗体の両方を用いたウエスタンブロットにより評価した場合にＣｈＡｄＶ６８ベクターを用いた検出可能な発現を示す配列（ＣＴ１（配列番号７９））が生成された（図１０Ａ及び図１０Ｂ、それぞれ対応するレーン６「ＣｈＡｄ－スパイクＣＴ１－Ｄ６１４Ｇ」）。ＣＯＯＬアルゴリズム及びＳＧＩアルゴリズムを使用して生成されたさらなる配列もウエスタンブロットにより評価した。図１１に示されるように、ＳＧＩクローン及びＣＯＯＬ配列ＣＴ１３１もまた、抗Ｓ２抗体を用いたウエスタンブロットにより検出可能なレベルのスパイクタンパク質を示した（図１１、レーン３及び６）のに対して、他のＣＯＯＬで生成された配列は、コントロールのＣＴ１由来配列（レーン２）以外は、検出可能なシグナルを生じなかった。したがって、これらのデータは、特定の配列最適化が、ＣｈＡｄＶ６８ベクター中の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の発現を改善したことを示している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、それ自身の複製マシナリーをコードした、細胞質で複製する＋鎖ＲＮＡウイルスであり、そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はスプライシング及び核外搬出マシナリーによる天然のプロセシングを受けない。図１２Ａに示されるように、ＣｈＡｄＶ６８ベクターから発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクコードｍＲＮＡにおけるスプライシングの役割を評価するため、スパイクのコード領域を増幅するプライマーを設計した。ｍＲＮＡスプライシングの存在下では、アンプリコンのサイズは予想される完全長コード領域よりも小さくなると考えられる。図１２Ｂに示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクカセットをコードしたプラスミドのＰＣＲが予想されたアンプリコンのサイズを示した（「スパイクプラスミド」、左パネル、右の列）のに対して、感染２９３細胞からのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は２つのより小さいアンプリコンを示し、ｍＲＮＡ転写産物のスプライシングを示した（「ＣｈＡｄ－スパイク（ＩＤＴ）ｃＤＮＡ」、左パネル、左の列）。さらに、スパイクコード配列をＳ１及びＳ２コード配列に分割した。やはり図１２Ｂに示されるように、感染２９３細胞からのＳ１のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は予想されたアンプリコンのサイズを示し（「スパイクＳ１」、右パネル、左の列）、Ｓ１が望ましくないスプライシングを受けない可能性が高いのに対してＳ２領域内の配列はスプライシングに影響しうることを示している。
より小さいアンプリコン配列を分析したところ、２つのスプライスドナー部位がサンガーシークエンシングにより特定された。３つのさらなる潜在的ドナー部位がさらなる配列分析によって予測された。スプライスモチーフ配列の位置及び種類を以下に示す（ヌクレオチドトリプレットはコドンに対応し、番号付けはスパイクＡＴＧを基準として始まる）：
ＮＴ３８５－：ＡＡＧ ＧＴＧ ＴＧＴ －＞ ＡＡａ ＧＴｃ ＴＧｃ（シークエンシングにより特定されたもの）
ＮＴ５３９－： ＡＡ ＧＧＴ ＡＡＧ Ｃ －＞ Ａｇ ＧＧｃ ＡＡａ Ｃ（シークエンシングにより特定されたもの）
ＮＴ２００３－：ＣＡ ＧＧＴ ＡＴＣ Ｔ －＞ Ｃｔ ＧＧａ ＡＴＣ Ｔ（予測されたもの）
ＮＴ２４７３－：ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＣＣ －＞ ＡＡａ ＧＴｃ ＡＣＣ（予測されたもの）
ＮＴ３４１７－： Ｃ ＣＣＣ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＴＣＣ（配列番号１２３） －＞ Ｔ ＣＣａ ＣＴｇ ＣＡａ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ａｇｔ（配列番号１２４）
ＮＴ３８５－：ＡＡＧ ＧＴＧ ＴＧＴ －＞ ＡＡａ ＧＴｃ ＴＧｃ（シークエンシングにより特定されたもの）
ＮＴ５３９－： ＡＡ ＧＧＴ ＡＡＧ Ｃ －＞ Ａｇ ＧＧｃ ＡＡａ Ｃ（シークエンシングにより特定されたもの）
ＮＴ２００３－：ＣＡ ＧＧＴ ＡＴＣ Ｔ －＞ Ｃｔ ＧＧａ ＡＴＣ Ｔ（予測されたもの）
ＮＴ２４７３－：ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＣＣ －＞ ＡＡａ ＧＴｃ ＡＣＣ（予測されたもの）
ＮＴ３４１７－： Ｃ ＣＣＣ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＴＣＣ（配列番号１２３） －＞ Ｔ ＣＣａ ＣＴｇ ＣＡａ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ａｇｔ（配列番号１２４）
部位特異的変異導入により選択されたスプライスドナー部位を除去して、アミノ酸配列に影響しないようにヌクレオチド配列モチーフを破壊した。ＣＯＯＬ配列最適化クローンＣＴ１を、配列特定されたスプライスドナーモチーフのＮＴ３８５及びＮＴ５３９が変異したクローンＣＴ１－２Ｃ（配列番号８５）の参照配列として用いた。ＩＤＴ配列最適化クローンをクローンＩＤＴ－４Ｃ（配列番号８６）の参照配列として用い、これは、配列特定されたスプライスドナーモチーフ及び予測されたスプライスドナーモチーフの両方のＮＴ３８５、ＮＴ５３９、ＮＴ２００３、及びＮＴ２４７３が変異しており、さらに可能性のあるＮＴ４４５のポリアデニル化部位ＡＡＴＡＡＡがＡＡｃＡＡＡに変異している。図１１に示されるように、配列特定されたスプライスドナーモチーフを含むクローンで、ウエスタンブロットによりスパイクタンパク質発現が検出された（「ＣＴ１－２Ｃ」、レーン２）。各コンストラクトでスプライシングをＰＣＲ分析によりさらに評価した。図１３に示されるように、スプライスドナーモチーフ及び／または潜在的なポリ（Ａ）部位のみを変異させた場合、スプライシングは妨げられず、スプライシングがサブドミナントなスプライス部位から生じる可能性を示した。
ＣｈＡｄＶ６８ベクターから発現された完全長スパイクｍＲＮＡでスプライシング事象が特定されたことから、さらなるコンストラクトを作製してタンパク質発現の改善について評価する。さらなる最適化には、外因性の核外搬送シグナル（例えば、恒常的輸送エレメント（ＣＴＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、または、例えば、スパイク遺伝子の直ぐ上流のＣＭＶプロモーターとコザック配列との間にＳＶ４０ミニイントロン（配列番号８８）を導入するなど、スプライシングをバイアスさせるための外因性のスプライスドナー／ブランチ／アクセプターモチーフ配列の導入による人工イントロンの付加を有するコンストラクトが含まれる。特定されたスプライスドナーモチーフ及び／または予測されたスプライスドナーモチーフを、さらなる配列最適化と組み合わせてさらに評価する。
ＸＩＶ．Ｇ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの有効性評価
さまざまなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン設計、コンストラクト、及び投与レジメンを評価した。ワクチンは、スパイクタンパク質のさまざまな最適化バージョン、選択された予測Ｔ細胞エピトープ（ＴＣＥ）、またはスパイクとＴＣＥカセットとの組み合わせをコードするものであった。
さまざまなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン設計、コンストラクト、及び投与レジメンを評価した。ワクチンは、スパイクタンパク質のさまざまな最適化バージョン、選択された予測Ｔ細胞エピトープ（ＴＣＥ）、またはスパイクとＴＣＥカセットとの組み合わせをコードするものであった。
マウスの免疫化
すべてのマウス試験は、ＩＡＣＵＣにより承認されたプロトコールに従ってＭｕｒｉｇｅｎｉｃｓにおいて実施された。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｅｎｖｉｇｏ）をすべての試験で用いた。ワクチンは－８０℃で保存し、免疫の当日に室温で解凍した後、ＰＢＳで０．１μｇ／ｍＬに希釈し、０．２ミクロンのフィルターに通して濾過した。濾過した製剤を４℃で保存し、調製の４時間以内に注射した。すべての免疫化は、各５０μＬの２回の注射、合計１００μＬを前脛骨筋に両側性筋肉内注射して行った。
すべてのマウス試験は、ＩＡＣＵＣにより承認されたプロトコールに従ってＭｕｒｉｇｅｎｉｃｓにおいて実施された。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｅｎｖｉｇｏ）をすべての試験で用いた。ワクチンは－８０℃で保存し、免疫の当日に室温で解凍した後、ＰＢＳで０．１μｇ／ｍＬに希釈し、０．２ミクロンのフィルターに通して濾過した。濾過した製剤を４℃で保存し、調製の４時間以内に注射した。すべての免疫化は、各５０μＬの２回の注射、合計１００μＬを前脛骨筋に両側性筋肉内注射して行った。
非ヒト霊長類の免疫化
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルにおけるＳＡＭワクチンでは、ＳＡＭを大腿四頭筋に示された用量で両側性筋肉内注射として投与した。
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルにおけるＳＡＭワクチンでは、ＳＡＭを大腿四頭筋に示された用量で両側性筋肉内注射として投与した。
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルにおけるＣｈＡｄＶ６８ワクチンでは、ＣｈＡｄＶ６８を、示された用量（注射当たり５×１０１１個のウイルス粒子）で両側性に投与した。
アカゲザルにおける免疫モニタリング
免疫モニタリングを行うため、１０～２０ｍＬの血液をヘパリンが入ったバキュテイナチューブに採取し、単離まで室温で維持した。ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）及びＬｅｕｃｏｓｅｐ分離チューブを使用して、密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣをヨー化プロピジウムで染色し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して生細胞をカウントした。次いで、試料を、ＲＰＭＩ完全培地（１０％ＦＢＳ）中に４×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。
免疫モニタリングを行うため、１０～２０ｍＬの血液をヘパリンが入ったバキュテイナチューブに採取し、単離まで室温で維持した。ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）及びＬｅｕｃｏｓｅｐ分離チューブを使用して、密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣをヨー化プロピジウムで染色し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して生細胞をカウントした。次いで、試料を、ＲＰＭＩ完全培地（１０％ＦＢＳ）中に４×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。
脾細胞の単離
Ｔ細胞応答の評価を行うため、マウスの脾臓を免疫後のさまざまな時点で摘出した。留意すべき点として、一部の試験では、脾臓を同じ時間に採取して比較できるように免疫を時間差で行った。脾臓を採取し、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ及びＩＣＳにより分析した。脾臓をＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）中に懸濁し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して解離させた。解離した細胞を、４０μｍのストレーナーを使用して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（約１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解した。溶解後、細胞を３０μｍのストレーナーにより濾過してＲＰＭＩ完全培地中に再懸濁した。
Ｔ細胞応答の評価を行うため、マウスの脾臓を免疫後のさまざまな時点で摘出した。留意すべき点として、一部の試験では、脾臓を同じ時間に採取して比較できるように免疫を時間差で行った。脾臓を採取し、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ及びＩＣＳにより分析した。脾臓をＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）中に懸濁し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して解離させた。解離した細胞を、４０μｍのストレーナーを使用して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（約１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解した。溶解後、細胞を３０μｍのストレーナーにより濾過してＲＰＭＩ完全培地中に再懸濁した。
マウスにおける血清採取
免疫後の異なる時点で２００μＬの血液を抜き取った。血液を室温で１０分間、１０００ｇで遠心した。血清を採取して－８０℃で凍結した。
免疫後の異なる時点で２００μＬの血液を抜き取った。血液を室温で１０分間、１０００ｇで遠心した。血清を採取して－８０℃で凍結した。
Ｓ１ ＩｇＧ ＭＳＤ／ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＱｕｉｃｋＰｌｅｘプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で希釈した５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを２５０μＬのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を使用して揺動により３回洗浄し、プレートを１５０μＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、オービタルシェーカー上で室温で１時間、ブロックした。試験血清を１０％の種適合（ｓｐｅｃｉｅｓ－ｍａｔｃｈｅｄ）血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｖｉ，ＭＩ）中、適当な連続希釈で希釈し、各プレート上のシングルウェルで試験した。開始希釈率１：１００とし、希釈率３倍で試料当たり１１回希釈した。各ウェルを洗浄し、５０ｕＬの希釈試料を各ウェルに加え、オービタルシェーカー上で室温で１時間インキュベートした。各ウェルを洗浄し、ＤＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で希釈した２５μＬの１μｇ／ｍＬ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識抗マウス抗体（ＭＳＤ）と、オービタルシェーカー上で室温で１時間インキュベートした。各ウェルを洗浄し、読取りバッファー（ＭＳＤ）を含む１５０μＬのトリプロピルアミンを加えた。ＱＰｌｅｘ ＳＱ １２０（ＭＳＤ）ＥＣＬプレートリーダーを使用して直ちにプレートの読取りを行った。エンドポイント力価は、シグナルがバックグラウンド値の２倍となる各試料の希釈率の逆数として定義され、バックグラウンド値の２倍よりも大きい最後の２つの値の間の直線を当てはめることにより内挿される。バックグラウンド値は、１０％種適合血清のみが入ったコントロールウェルの平均値（各プレートについて計算したもの）である。
９６ウェルＱｕｉｃｋＰｌｅｘプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で希釈した５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを２５０μＬのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を使用して揺動により３回洗浄し、プレートを１５０μＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、オービタルシェーカー上で室温で１時間、ブロックした。試験血清を１０％の種適合（ｓｐｅｃｉｅｓ－ｍａｔｃｈｅｄ）血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｖｉ，ＭＩ）中、適当な連続希釈で希釈し、各プレート上のシングルウェルで試験した。開始希釈率１：１００とし、希釈率３倍で試料当たり１１回希釈した。各ウェルを洗浄し、５０ｕＬの希釈試料を各ウェルに加え、オービタルシェーカー上で室温で１時間インキュベートした。各ウェルを洗浄し、ＤＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で希釈した２５μＬの１μｇ／ｍＬ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識抗マウス抗体（ＭＳＤ）と、オービタルシェーカー上で室温で１時間インキュベートした。各ウェルを洗浄し、読取りバッファー（ＭＳＤ）を含む１５０μＬのトリプロピルアミンを加えた。ＱＰｌｅｘ ＳＱ １２０（ＭＳＤ）ＥＣＬプレートリーダーを使用して直ちにプレートの読取りを行った。エンドポイント力価は、シグナルがバックグラウンド値の２倍となる各試料の希釈率の逆数として定義され、バックグラウンド値の２倍よりも大きい最後の２つの値の間の直線を当てはめることにより内挿される。バックグラウンド値は、１０％種適合血清のみが入ったコントロールウェルの平均値（各プレートについて計算したもの）である。
抗体力価
抗体応答のモニタリングを行うため、中和抗体力価を含む抗体力価を、あらゆる目的で本明細書に参照により援用するところのＪ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｂｃ６２８４（２０２０）に記載されるようにして決定した。
抗体応答のモニタリングを行うため、中和抗体力価を含む抗体力価を、あらゆる目的で本明細書に参照により援用するところのＪ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｂｃ６２８４（２０２０）に記載されるようにして決定した。
ＩＦＮγのＥＬＩＳｐｏｔ分析
プレコートされた９６ウェルプレート（ＭＡｂｔｅｃｈ，サルＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳ，ＡＬＰを製造者のプロトコールに従って使用してＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。試料を、異なる重複ペプチドプール（アミノ酸１５個の長さ、アミノ酸１１個の重複）により、ペプチド当たり１μｇ／ｍＬの最終濃度で一晩刺激した。スパイクでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，プール当たり３６～４０種のペプチド）８つの異なる重複ペプチドプール。脾細胞を各スパイクプールではウェル当たり１×１０５細胞、スパイクプール２、４、及び７ではウェル当たり２．５×１０４細胞（７．５×１０４個のナイーブ細胞）となるように二重に播種した。ＴＣＥカセットに対する応答を測定するため、１つのプールはカセットにコードされたヌクレオカプシドタンパク質にわたるものとし（ＪＰＴ、ＮＣａｐ－１、１０２種のペプチド）、１つのプールは膜タンパク質にわたるものとし（ＪＰＴ、ＶＭＥ－１、５３種のペプチド）、及び１つのプールはＯｒｆ３ａ領域（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、３８種のペプチド）にわたるものとした。ＴＣＥペプチドプールでは、脾細胞を各プールについてウェル当たり２×１０５細胞となるように二重に播種した。ペプチドプールの各配列を表Ｄ（配列番号２７１８０～２７４９５）、表Ｅ（配列番号２７４９６～２７６０３）、及び表Ｆ（配列番号２７６０４～２７９３９）に示す。各試料及び細胞数についてＤＭＳＯのみのコントロールを播種した。３７℃で一晩のインキュベーションの後、各プレートをＰＢＳで洗浄し、抗サルＩＦＮγｍＡｂビオチン（ＭＡｂｔｅｃｈ）と２時間インキュベートし、その後、さらに洗浄し、ストレプトアビジン－ＡＬＰ（ＭＡｂｔｅｃｈ）と１時間、インキュベートした。最後の洗浄後、各プレートをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＭＡｂｔｅｃｈ）と１０分間インキュベートして免疫スポットを発色させた。スポットを撮影し、ＡＩＤリーダー（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）を使用して計数した。データ処理及び分析を行うため、複製ウェル変動性（変動性＝分散／（中央値＋１））が１０よりも大きく、かつ中央値が１０よりも大きい試料は除外した。スポット値を、下式に従ってウェル飽和度に基づいて調整した。
調整後スポット＝非処理スポット＋２×（非処理スポット×飽和度／［１００－飽和度］）。
ネガティブコントロールペプチドのウェルの平均値を差し引くことにより各試料のバックグラウンド補正を行った。データを、脾細胞１×１０６個当たりのスポット形成コロニー（ＳＦＣ）として示す。ウェル飽和度の値が３５％よりも大きいウェルは、「測定不能多数」（ＴＮＴＣ）とみなし、除外した。ＴＮＴＣであった試料及びペプチドについては２．５×１０４細胞／ウェルで測定された値を用いた。
プレコートされた９６ウェルプレート（ＭＡｂｔｅｃｈ，サルＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳ，ＡＬＰを製造者のプロトコールに従って使用してＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。試料を、異なる重複ペプチドプール（アミノ酸１５個の長さ、アミノ酸１１個の重複）により、ペプチド当たり１μｇ／ｍＬの最終濃度で一晩刺激した。スパイクでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，プール当たり３６～４０種のペプチド）８つの異なる重複ペプチドプール。脾細胞を各スパイクプールではウェル当たり１×１０５細胞、スパイクプール２、４、及び７ではウェル当たり２．５×１０４細胞（７．５×１０４個のナイーブ細胞）となるように二重に播種した。ＴＣＥカセットに対する応答を測定するため、１つのプールはカセットにコードされたヌクレオカプシドタンパク質にわたるものとし（ＪＰＴ、ＮＣａｐ－１、１０２種のペプチド）、１つのプールは膜タンパク質にわたるものとし（ＪＰＴ、ＶＭＥ－１、５３種のペプチド）、及び１つのプールはＯｒｆ３ａ領域（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、３８種のペプチド）にわたるものとした。ＴＣＥペプチドプールでは、脾細胞を各プールについてウェル当たり２×１０５細胞となるように二重に播種した。ペプチドプールの各配列を表Ｄ（配列番号２７１８０～２７４９５）、表Ｅ（配列番号２７４９６～２７６０３）、及び表Ｆ（配列番号２７６０４～２７９３９）に示す。各試料及び細胞数についてＤＭＳＯのみのコントロールを播種した。３７℃で一晩のインキュベーションの後、各プレートをＰＢＳで洗浄し、抗サルＩＦＮγｍＡｂビオチン（ＭＡｂｔｅｃｈ）と２時間インキュベートし、その後、さらに洗浄し、ストレプトアビジン－ＡＬＰ（ＭＡｂｔｅｃｈ）と１時間、インキュベートした。最後の洗浄後、各プレートをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＭＡｂｔｅｃｈ）と１０分間インキュベートして免疫スポットを発色させた。スポットを撮影し、ＡＩＤリーダー（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）を使用して計数した。データ処理及び分析を行うため、複製ウェル変動性（変動性＝分散／（中央値＋１））が１０よりも大きく、かつ中央値が１０よりも大きい試料は除外した。スポット値を、下式に従ってウェル飽和度に基づいて調整した。
調整後スポット＝非処理スポット＋２×（非処理スポット×飽和度／［１００－飽和度］）。
ネガティブコントロールペプチドのウェルの平均値を差し引くことにより各試料のバックグラウンド補正を行った。データを、脾細胞１×１０６個当たりのスポット形成コロニー（ＳＦＣ）として示す。ウェル飽和度の値が３５％よりも大きいウェルは、「測定不能多数」（ＴＮＴＣ）とみなし、除外した。ＴＮＴＣであった試料及びペプチドについては２．５×１０４細胞／ウェルで測定された値を用いた。
ワクチンコンストラクト
評価した異なる配列は以下の通りである。
－「ＩＤＴスパイクｇ」：ＩＤＴ最適化配列（配列番号６９を参照）によってコードされ、配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含む（配列番号７０の対応するヌクレオチド変異を参照）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、「スパイクＶ１」とも呼ばれる。
－「ＣＴスパイクｇ」：配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含む（配列番号７０の対応するヌクレオチド変異を参照）、Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ最適化配列バージョン１（配列番号７９を参照）によってコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、「スパイクＶ２」とも呼ばれる。「ＣＴスパイクＤ」と呼ばれるバージョンでは、Ｄ６１４は変化していない。
－「ＣＴスパイクＦ２Ｐｇ」：フーリン切断部位を破壊するためのＲ６８２Ｖ（６８２～６８５のＲＲＡＲ［配列番号１２５］がＧＳＡＳ［配列番号１２６］に）と、参照スパイクタンパク質（配列番号５９）を基準としてスパイクの二次構造を妨げるＫ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐとを含む、Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ最適化配列バージョン１（配列番号７９を参照）によってコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質。ヌクレオチド配列を配列番号８９に示し、タンパク質配列を配列番号９０に示す。
－「ＴＣＥ５」：ＥＤＧＥプラットフォームによって、スパイク以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質でＭＨＣ分子上に提示されるものとして予測された選択されたＣＤ８＋エピトープ。これら１５種の選択されたエピトープを、カセット内におけるそれらの順序とともに表１０に示す。ヌクレオチド配列を配列番号９１に示し、タンパク質配列を配列番号９２に示す。図１４は、ＴＣＥ５について４つの示された集団にわたった推定される防御を示す。すべての集団が、少なくとも７つのエピトープの閾値まで９５％を上回るカバー率を有するものと推定される（最後のカラム）。
－ＳＡＭベクター ＳＡＭ－ＳＧＰ１－ＴＣＥ５－ＳＧＰ２－ＣＴスパイクＧＦ２Ｐを配列番号９３に示す。
－ＣｈＡｄベクター ＣｈＡｄ－ＣＭＶ－ＣＴスパイクＧＦ２Ｐ－ＣＭＶ－ＴＣＥ５（ＥＰＥ）を配列番号１１４に示す。
－配列番号１０９～１１３に示されるさらなるベクター及びスパイクバリアントを設計して評価を行った。
評価した異なる配列は以下の通りである。
－「ＩＤＴスパイクｇ」：ＩＤＴ最適化配列（配列番号６９を参照）によってコードされ、配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含む（配列番号７０の対応するヌクレオチド変異を参照）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、「スパイクＶ１」とも呼ばれる。
－「ＣＴスパイクｇ」：配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含む（配列番号７０の対応するヌクレオチド変異を参照）、Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ最適化配列バージョン１（配列番号７９を参照）によってコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、「スパイクＶ２」とも呼ばれる。「ＣＴスパイクＤ」と呼ばれるバージョンでは、Ｄ６１４は変化していない。
－「ＣＴスパイクＦ２Ｐｇ」：フーリン切断部位を破壊するためのＲ６８２Ｖ（６８２～６８５のＲＲＡＲ［配列番号１２５］がＧＳＡＳ［配列番号１２６］に）と、参照スパイクタンパク質（配列番号５９）を基準としてスパイクの二次構造を妨げるＫ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐとを含む、Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ最適化配列バージョン１（配列番号７９を参照）によってコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質。ヌクレオチド配列を配列番号８９に示し、タンパク質配列を配列番号９０に示す。
－「ＴＣＥ５」：ＥＤＧＥプラットフォームによって、スパイク以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質でＭＨＣ分子上に提示されるものとして予測された選択されたＣＤ８＋エピトープ。これら１５種の選択されたエピトープを、カセット内におけるそれらの順序とともに表１０に示す。ヌクレオチド配列を配列番号９１に示し、タンパク質配列を配列番号９２に示す。図１４は、ＴＣＥ５について４つの示された集団にわたった推定される防御を示す。すべての集団が、少なくとも７つのエピトープの閾値まで９５％を上回るカバー率を有するものと推定される（最後のカラム）。
－ＳＡＭベクター ＳＡＭ－ＳＧＰ１－ＴＣＥ５－ＳＧＰ２－ＣＴスパイクＧＦ２Ｐを配列番号９３に示す。
－ＣｈＡｄベクター ＣｈＡｄ－ＣＭＶ－ＣＴスパイクＧＦ２Ｐ－ＣＭＶ－ＴＣＥ５（ＥＰＥ）を配列番号１１４に示す。
－配列番号１０９～１１３に示されるさらなるベクター及びスパイクバリアントを設計して評価を行った。
ＴＣＥ５ ヌクレオチド配列（配列番号９１）：
ＴＣＥ５ アミノ酸配列（配列番号９２）：
ＳＡＭ－ＳＧＰ１－ＴＣＥ５－ＳＧＰ２－ＣＴスパイクＧＦ２Ｐヌクレオチド配列（配列番号９３）：（ＮＴ１－１７：Ｔ７プロモーター；ＮＴ６２－７５４３：ＶＥＥＶ非構造タンパク質コード領域；ＮＴ７５１８－７５６０：ＳＧＰ１；ＮＴ７５８２－７５８７及び９５４１－９５４６：コザック配列；ＮＴ７５８８－９４７４：ＴＣＥ５カセット；ＮＴ９４８０－９５４０：ＳＧＰ２；ＮＴ９５４７－１３３６８：ＣＴスパイクフーリン－２Ｐ）；配列表を参照。
ＣｈＡｄ－ＣＭＶ－ＣＴスパイクＧＦ２Ｐ－ＣＭＶ－ＴＣＥ５（ＥＰＥ）ヌクレオチド配列（配列番号１１４）；配列表を参照。
ＸＩＶ．Ｇ．Ｉ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンはさまざまなスパイクコンストラクトに対して応答を生じる
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のさまざまなバージョンをコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のさまざまなバージョンをコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを評価した。
異なる配列最適化を有するスパイクコードカセットのバージョン「ＩＤＴスパイクｇ」（配列番号６９、「スパイクＶ１」または「ｖ１」とも呼ばれる）、「ＣＴスパイクｇ」：（配列番号７９、「スパイクＶ２」または「ｖ２」とも呼ばれる）を評価した。図１５に示されるように、ＣｈＡｄ（図１５Ａ）及びＳＡＭ（図１５Ｂ）ワクチンは、検出可能なＴ細胞応答（左パネル）、スパイク特異的ＩｇＧ抗体（中央のパネル）、及び中和抗体（右パネル）を生じた。注目すべき点として、ＣＴスパイクｇ配列のバージョンをコードしたＣｈＡｄワクチンは、Ｔ細胞応答の３倍の増加、ＩｇＧ産生の１００倍の増加、及び中和抗体力価の６０倍の増加をもたらした。同様に、ＣＴスパイクｇ配列のバージョンをコードしたＳＡＭワクチンは、Ｔ細胞応答の増加、ＩｇＧ産生の７倍の増加、及び中和抗体力価の４倍の増加をもたらした。したがって、これらのデータは、スパイクカセットの配列最適化が、調べられた各ワクチンプラットフォームについて評価した複数のパラメータにわたって免疫応答の増加をもたらしたことを示している。
Ｓ２ドメイン内のフーリン部位の除去及びプロリンの付加を含む改変スパイクを有するスパイクコードペプチドのバージョン「ＣＴスパイクＦ２Ｐｇ」（配列番号８９及び配列番号９０）を評価した。図１６に示されるように、Ｆ２Ｐ改変スパイクをコードしたＣｈＡｄ（左パネル）ワクチン及びＳＡＭ（右パネル）ワクチンはいずれも、参照される改変を有さない対応する「ＣＴスパイクｇ」カセットと比較して、それぞれ５倍及び２０倍のスパイク特異的ＩｇＧ抗体を生じた。したがって、これらのデータは、スパイクカセットの改変が、検討した各ワクチンプラットフォームにおいて抗体応答の増加をもたらしたことを示している。
ＸＩＶ．Ｇ．ＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、Ｔ細胞エピトープに対する応答をもたらす
さまざまな改変ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質とＥＤＧＥ予測エピトープ（ＥＰＥ）をコードしたＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ）カセットとをコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭプラットフォームを評価した。
さまざまな改変ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質とＥＤＧＥ予測エピトープ（ＥＰＥ）をコードしたＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ）カセットとをコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭプラットフォームを評価した。
改変スパイクのみをコードしたカセット（「ＣＴＳｐｉｋｅＦ２Ｐｇ」（配列番号８９）及び改変スパイクとさらなる非スパイクＴ細胞エピトープをコードしたもの（ＣｈＡｄ 配列番号１１４、ＳＡＭ 配列番号９３、表１０の「ＴＣＥ５」を参照）、上記に述べたように免疫応答を評価した。図１７に示されるように、ＣｈＡｄ（図１７Ａ）及びＳＡＭ（図１７Ｂ）の評価したそれぞれのワクチンがスパイクに対する検出可能なＴ細胞応答をもたらした（左パネル）のに対して、ＴＣＥ５カセットを含むワクチンはコードされたＴ細胞エピトープに対する検出可能なＴ細胞応答も一般的にもたらした（右パネル）。したがって、これらのデータは、Ｔ細胞エピトープを追加することで、検討したそれぞれのワクチンプラットフォームにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム全体にわたった幅広いＴ細胞応答がもたらされたことを示すものである。
ＸＩＶ．Ｇ．ＩＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン内のカセットの順序は免疫応答に影響する
改変ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質とＥＤＧＥ予測エピトープ（ＥＰＥ）をコードしたＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ）カセットとを異なる順序でコードしたＳＡＭプラットフォームを評価した。
改変ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質とＥＤＧＥ予測エピトープ（ＥＰＥ）をコードしたＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ）カセットとを異なる順序でコードしたＳＡＭプラットフォームを評価した。
図１８に示されるように、異なるコンストラクトを用いてワクチン接種した場合に、スパイクに対するＴ細胞応答（上のパネル）、コードされたＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答（中央のパネル）、及びスパイク特異的ＩｇＧ抗体（下のパネル）がもたらされた。図１８Ａにおいて、各ＳＡＭコンストラクトは、「ＩＤＴＳｐｉｋｅｇ」（配列番号６９）のみ（左の柱）、第１のサブゲノムプロモーターから発現されるＩＤＴＳｐｉｋｅｇに続く、第２のサブゲノムプロモーターから発現されるＴＣＥ５（中央の柱）、または第１のサブゲノムプロモーターから発現されるＴＣＥ５に続く、第２のサブゲノムプロモーターから発現されるＩＤＴＳｐｉｋｅｇ（右の柱）を含み、上記に述べたようにして免疫応答を評価した。図１８Ｂにおいて、各ＳＡＭコンストラクトは、「ＩＤＴＳｐｉｋｅｇ」（配列番号６９）のみ（柱１）、第１のサブゲノムプロモーターから発現されるＩＤＴＳｐｉｋｅｇに続く、第２のサブゲノムプロモーターから発現されるＴＣＥ６またはＴＣＥ７（それぞれ、柱２及び４）、または第１のサブゲノムプロモーターから発現されるＴＣＥ６またはＴＣＥ７に続く、第２のサブゲノムプロモーターから発現されるＩＤＴＳｐｉｋｅｇ（それぞれ、柱３及び５）を含み、上記に述べたようにして免疫応答を評価した。図１８Ｃにおいて、各ＳＡＭコンストラクトは、「ＣＴＳｐｉｋｅｇ」（配列番号７９）のみ（柱１）、第１のサブゲノムプロモーターから発現されるＣＴＳｐｉｋｅｇに続く、第２のサブゲノムプロモーターから発現されるＴＣＥ５またはＴＣＥ８（それぞれ、柱２及び４）、または第１のサブゲノムプロモーターから発現されるＴＣＥ５またはＴＣＥ８に続く、第２のサブゲノムプロモーターから発現されるＣＳｐｉｋｅｇ（それぞれ、柱３及び５）を含み、上記に述べたようにして免疫応答を評価した。一般的に、また特にスパイクでは、スパイクのみと比較してスパイクに対するＴ細胞応答の増加を含め、各エピトープを第２のサブゲノムプロモーターから発現させた場合にＴ細胞応答が増加した。同様の傾向が、潜在的にＣＴスパイクｇコンストラクトを例外として、スパイク抗原を第２のサブゲノムプロモーターから発現させた場合にスパイク特異的ＩｇＧ力価の増加でも一般的に認められた。したがって、これらのデータは、ワクチンプラットフォーム内の抗原カセットの配列順序が免疫応答に影響することを示している。
ＸＩＶ．Ｇ．ＩＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンプライミング用量はマウスにスパイクに対する応答をもたらす
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを、単一／プライミングワクチンとしてマウスで評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを、単一／プライミングワクチンとしてマウスで評価した。
上記に述べたように、マウスを「ＣＴスパイクｇ」（配列番号７９）を有するスパイクコードカセットを含むＳＡＭコードカセットで免疫し、経時的にモニタリングした。図１９に示されるように、ＣｈＡｄ（図１９Ａ）及びＳＡＭ（図１９Ｂ）ワクチンはいずれも、単一のプライミング用量の後、複数のスパイクＴ細胞エピトーププールにわたった検出可能なＴ細胞応答（左のパネル）、プライミングの少なくとも１６週後までのスパイク特異的ＩｇＧ抗体（右のパネル）、及びプライミングの少なくとも６週後までの中和抗体（右下のパネル）をもたらした。したがって、これらのデータはスパイクカセットを含むワクチンによるプライミング免疫が、検討したそれぞれのワクチンプラットフォームで幅広い強力なスパイク特異的Ｔ細胞ならびに持続的なＩｇＧ及び中和抗体の力価をもたらしたことを示している。
ＸＩＶ．Ｇ．Ｖ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２異種プライミング／ブースターレジメンはマウスにスパイクに対する応答をもたらす
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを、図２０Ａ（上のパネル）に示されるように、異種プライミング／ブースターレジメンの一環としてマウスで評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを、図２０Ａ（上のパネル）に示されるように、異種プライミング／ブースターレジメンの一環としてマウスで評価した。
上記に述べたように、マウスを「ＣＴスパイクｇ」（配列番号７９）を有するスパイクコードカセットを含むＣｈＡｄプラットフォームのプライミング用量で免疫し、その後、「ＩＤＴスパイクｇ」（配列番号６９）を有するスパイクコードカセットを含むＳＡＭプラットフォームのブースター用量で免疫し、経時的にモニタリングした。図２０に示されるように、複数のスパイクＴ細胞エピトーププールにわたった検出可能なＴ細胞応答（図２０Ａ、下のパネル）、プライミングの少なくとも１４週後までのスパイク特異的ＩｇＧ抗体（図２０Ｂ、左のパネル）、及びプライミングの少なくとも１０週後までの中和抗体（図２０Ｂ、右のパネル）が、ＣｈＡｄの投与によってもたらされ、ＳＡＭの投与によってその後ブーストされた。注目すべき点として、ＳＡＭブースターワクチンは、ブースター投与の２週後にＴ細胞応答の９倍の増加（ＩＣＳにより評価したＴｈ１バイアスを含む。ＩＣＳデータは示さず）、ＩｇＧ産生の１００倍の増加、中和抗体力価の４０倍の増加をもたらした。したがって、これらのデータはスパイクカセットを含むワクチンによる免疫が、異種プライミング／ブースターワクチンレジメンがブースター用量の投与後に応答の増加をもたらしたことを含め、マウスに幅広い強力なスパイク特異的Ｔ細胞ならびに持続的なＩｇＧ及び中和抗体の力価をもたらしたことを示している。
ＸＩＶ．Ｇ．ＶＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２異種プライミング／ブースターレジメンは非ヒト霊長類にスパイクに対する応答をもたらす
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを、図２１Ａ（上のパネル）に示されるように、異種プライミング／ブースターレジメンの一環としてインドアカゲザルで評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを、図２１Ａ（上のパネル）に示されるように、異種プライミング／ブースターレジメンの一環としてインドアカゲザルで評価した。
上記に述べたように、ＮＨＰを「ＣＴスパイクｇ」（配列番号７９）を有するスパイクコードカセットを含むＣｈＡｄプラットフォームのプライミング用量で免疫し、その後、「ＩＤＴスパイクｇ」（配列番号６９）を有するスパイクコードカセットを含むＳＡＭプラットフォームのブースター用量で免疫し、経時的にモニタリングした。図２１に示されるように、ＣｈＡｄ／ＳＡＭプライミング／ブースターワクチンレジメンは評価した５匹のＮＨＰ動物全てにおいて、複数のスパイクＴ細胞エピトーププールにわたった検出可能なＴ細胞応答（図２１Ａ、中央及び下のパネル）、プライミングの少なくとも１２週後までのスパイク特異的ＩｇＧ抗体（図２１Ｂ、左上のパネル）、及びプライミングの少なくとも１２週後までの中和抗体（図２１Ｂ、左下のパネル）をもたらした。注目すべき点として、ピークスパイクＴ細胞応答は、ＳＩＶ及びインフルエンザのそれぞれのスパイクタンパク質に対して防御的であると考えられるレベルよりも高かった（図２１Ａ、それぞれ、下のパネルの上下の破線）。さらに、中和抗体の力価は、回復期のヒト血清中でみられる力価よりも少なくとも１０倍高く（図２１Ｂ、右のパネル）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して防御的であると考えられるレベルよりも高かった（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０２０）。したがって、これらのデータはスパイクカセットを含むワクチンによる免疫が、防御的であると一般的に考えられる抗体応答を含め、異種プライミング／ブースターワクチンレジメンの一環としてＮＨＰに幅広い強力なスパイク特異的Ｔ細胞ならびに持続的なＩｇＧ及び中和抗体の力価をもたらしたことを示している。
ＸＩＶ．Ｇ．ＶＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２同種プライミング／ブースターレジメンはマウスにスパイクに対する応答をもたらす
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＳＡＭワクチンプラットフォームを、図２２Ａ（上のパネル）に示されるように、同種プライミング／ブースターレジメンの一環としてマウスで評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＳＡＭワクチンプラットフォームを、図２２Ａ（上のパネル）に示されるように、同種プライミング／ブースターレジメンの一環としてマウスで評価した。
上記に述べたように、マウスを「ＩＤＴスパイクＤ」（Ｄ６１４が変異していない点を除き、配列番号６９）を有するスパイクコードカセットを含むＳＡＭプラットフォームで免疫し、経時的にモニタリングした。図２２に示されるように、複数のスパイクＴ細胞エピトーププールにわたった検出可能なＴ細胞応答（図２２Ａ、下のパネル）、プライミングの少なくとも１５週後までのスパイク特異的ＩｇＧ抗体（図２２Ｂ、左のパネル）、及びプライミングの少なくとも１５週後までの中和抗体（図２２Ｂ、右のパネル）が、ＳＡＭの投与によって最初にどちらももたらされ、再投与によってその後ブーストされた。注目すべき点として、ＳＡＭブースターワクチンは、ブースター投与の２週後にＴ細胞応答の少なくとも４倍の増加、ブースター投与の７週後にＩｇＧ産生の８０倍の増加、及びブースター投与後の７週後に中和抗体の２５倍の増加をもたらした。したがって、これらのデータはスパイクカセットを含むワクチンによる免疫が、同種プライミング／ブースターワクチンレジメンがブースター用量の投与後に応答の増加をもたらしたことを含め、マウスに幅広い強力なスパイク特異的Ｔ細胞ならびに持続的なＩｇＧ及び中和抗体の力価をもたらしたことを示している。
ＸＩＶ．Ｇ．ＶＩＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２同種プライミング／ブースターレジメンは非ヒト霊長類にスパイクに対する応答をもたらす
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＳＡＭワクチンプラットフォームを、図２３（上のパネル）に示されるように、同種プライミング／ブースターレジメンの一環としてマウスで評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードしたＳＡＭワクチンプラットフォームを、図２３（上のパネル）に示されるように、同種プライミング／ブースターレジメンの一環としてマウスで評価した。
上記に述べたように、ＮＨＰを「ＩＤＴスパイクｇ」（配列番号６９）を有するスパイクコードカセットを含むＳＡＭプラットフォームで免疫し、経時的にモニタリングした。図２３に示されるように、プライミングの少なくとも１２週後までのスパイク特異的ＩｇＧ抗体（図２３、中央のパネル）、及びプライミングの少なくとも１０週後までの中和抗体（図２３、下のパネル）が、ＳＡＭの投与によって最初にどちらももたらされ、再投与によってその後ブーストされた。注目すべき点として、中和抗体の力価は、回復期のヒト血清中でみられる力価よりも少なくとも１０倍高く（図２３、右下のパネル）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して防御的であると考えられるレベルよりも高かった（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０２０）。さらに、低用量（３０μｇ）のＳＡＭ投与により、より高用量（３００μｇ）ＳＡＭ投与よりも強い応答がもたらされた。したがって、これらのデータは、スパイクカセットを含むワクチンが、同種プライミング／ブースターワクチンレジメンが、特に「低い」用量との関連で、ブースター用量の投与後に応答の増加をもたらしたばかりでなく、防御的であると一般的に考えられる抗体応答をもたらしたことを含め、ＮＨＰにおいてより持続的なＩｇＧ及び中和抗体の力価をもたらしたことを示している。
ＸＩＶ．Ｈ． さらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの構築
検証済みエピトープから１０００を超える全体の応答の大きさを得ることが予測される人の割合が最大となるようなワクチンを構築した。要約すると、出発タンパク質（例えば、スパイク）中のすべての検証済みエピトープ及びＴＣＥカセットに加えられたすべてのエピトープにわたって、以下に従って応答の大きさを計算したところ、予想されるおよそのサイズ上限はスパイクをアミノ酸６００個上回った。（１）個人の応答の大きさは、それぞれのディプロタイプアレルにわたったすべてのエピトープの応答の大きさの合計であり、（２）各エピトープの応答の大きさ＝（応答の大きさ）×（正の応答の頻度／１００）（値は、あらゆる目的で本明細書に参照により援用する、Ｔａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ ｃａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ Ｍｅｄ． ２０２１ Ｆｅｂ １６；２（２）：１００２０４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｘｃｒｍ．２０２１．１００２０４．Ｅｐｕｂ ２０２１ Ｊａｎ ２６．）に見られる）、（３）頻度が５％よりも高い変異にわたった出発タンパク質からのエピトープ以外のエピトープは除外した（全体または特定の株で頻度が１％よりも高いすべての変異について表１１を参照）、ただし、隣接領域内の変異は許容される、及び（４）上記に述べたように、カセットの順序は、隣接フレームにまたがる意図しないジャンクションエピトープが最小となるよう、また、機能性タンパク質フラグメントが生じる可能性を低減するため、同じタンパク質内の連続したフレームが最小となるように選択した。
検証済みエピトープから１０００を超える全体の応答の大きさを得ることが予測される人の割合が最大となるようなワクチンを構築した。要約すると、出発タンパク質（例えば、スパイク）中のすべての検証済みエピトープ及びＴＣＥカセットに加えられたすべてのエピトープにわたって、以下に従って応答の大きさを計算したところ、予想されるおよそのサイズ上限はスパイクをアミノ酸６００個上回った。（１）個人の応答の大きさは、それぞれのディプロタイプアレルにわたったすべてのエピトープの応答の大きさの合計であり、（２）各エピトープの応答の大きさ＝（応答の大きさ）×（正の応答の頻度／１００）（値は、あらゆる目的で本明細書に参照により援用する、Ｔａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ ｃａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ Ｍｅｄ． ２０２１ Ｆｅｂ １６；２（２）：１００２０４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｘｃｒｍ．２０２１．１００２０４．Ｅｐｕｂ ２０２１ Ｊａｎ ２６．）に見られる）、（３）頻度が５％よりも高い変異にわたった出発タンパク質からのエピトープ以外のエピトープは除外した（全体または特定の株で頻度が１％よりも高いすべての変異について表１１を参照）、ただし、隣接領域内の変異は許容される、及び（４）上記に述べたように、カセットの順序は、隣接フレームにまたがる意図しないジャンクションエピトープが最小となるよう、また、機能性タンパク質フラグメントが生じる可能性を低減するため、同じタンパク質内の連続したフレームが最小となるように選択した。
以下のコンストラクトを作製した。（Ａ）「ＴＣＥ１０」、完全スパイクタンパク質を開始点として始まり、上記に従って検証済みエピトープを追加してスパイクに加えてアミノ酸３７８個の全体のサイズとなるようにしたもの（表１２Ａ、各エピトープのマップは図２４Ａ～２４Ｆに網羅される）；（Ｂ）「ＴＣＥ９」、ＴＣＥ１０を延長し、ＳＡＲＳとＳＡＲＳ－２の間で完全に保存されている場合にのみ上記に従って検証済みエピトープを追加し（例えば、パン－コロナウイルスワクチンとして）、各アレルについてさらなる予測されたエピトープ（すなわち、検証済みエピトープでない）を含むように特定のフレームを延長して（すべてのフレームにわたって２１個のさらなるアミノ酸）、スパイクに加えてアミノ酸５５６個の全体のサイズとなるようにしたもの（表１２Ｂ、各エピトープのマップは図２５Ａ～２５Ｇに網羅される）；（Ｃ）「ＴＣＥ１１」、完全なスパイク及びヌクレオカプシドタンパク質を開始点として始まり、上記に従って検証済みエピトープを追加してスパイクに加えてアミノ酸６１６個の全体のサイズ（１９７ａａ＋完全なＮ）としたもの（表１２Ｃ、各エピトープのマップは図２６Ａ～２６Ｄに網羅される）。表１３Ａ及び表１３Ｂは、それぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で保存されたエピトープにおいてＴＣＥ５、ＴＣＥ９、ＴＣＥ１０、及びＴＣＥ１１のそれぞれについてさまざまな集団にわたった応答の大きさのカバー率を示す。注目すべき点として、ワクチンコンストラクトのそれぞれが、示された集団のそれぞれの８９％超を、ＳＡＲＳとＳＡＲＳ－２の間で保存されたエピトープに対して１０００を上回る検証済みの応答の大きさでカバーし、９５％超を１００を上回る検証済みの応答の大きさでカバーしたのに対して、ＴＣＥ９は、示された集団のそれぞれの７４％超を１０００を上回る検証済みの応答の大きさでカバーしている。図２７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ（左のパネル）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＭＥＲＳ（右のパネル）の間の共有候補９マーエピトープ分布の割合を示し、相当な数のスパイクタンパク質の外側の保存された配列がハイライトで示されているが、これは、特にパン－コロナウイルスワクチンを構築するという目的では、単純にスパイクによってコードされたものを超えたエピトープを評価し、含めることの価値を実証するものである。
ＸＩＶ．Ｉ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回復期のヒトＰＢＭＣは、ワクチンコンストラクトにコードされたＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答を示す
自然の感染症では、Ｔ細胞はプライミングされ、最初の曝露後の２～３週間以内に増殖するため、感染細胞の除去を効果的に開始するまでに数週間を要する。これに対して、ワクチンによって誘導されるＴ細胞応答は、曝露時に急速に増加することができるため、ワクチンによって誘導される抗体力価が感染を予防するうえで十分でなくなった場合に（重篤な）感染を予防できる可能性が高い。したがって、回復期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２対象から得られたＰＢＭＣ試料を、スパイク及びＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ５）領域に対する機能性及び細胞傷害性メモリーＴ細胞応答の存在について分析して、ワクチンカセットコンストラクトに含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性部分が、自然の感染によって刺激されるものと同様にＴ細胞応答を刺激し、したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御免疫を誘導することに関係している可能性が高いかどうかを評価した。
自然の感染症では、Ｔ細胞はプライミングされ、最初の曝露後の２～３週間以内に増殖するため、感染細胞の除去を効果的に開始するまでに数週間を要する。これに対して、ワクチンによって誘導されるＴ細胞応答は、曝露時に急速に増加することができるため、ワクチンによって誘導される抗体力価が感染を予防するうえで十分でなくなった場合に（重篤な）感染を予防できる可能性が高い。したがって、回復期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２対象から得られたＰＢＭＣ試料を、スパイク及びＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ５）領域に対する機能性及び細胞傷害性メモリーＴ細胞応答の存在について分析して、ワクチンカセットコンストラクトに含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性部分が、自然の感染によって刺激されるものと同様にＴ細胞応答を刺激し、したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御免疫を誘導することに関係している可能性が高いかどうかを評価した。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出はＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより行った［Ｓ．Ｊａｎｅｔｚｋｉ，Ｊ．Ｈ．Ｃｏｘ，Ｎ．Ｏｄｅｎ，Ｇ．Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０２，５１－８６（２００５）］。要約すると、細胞を採取し、カウントして培地中に４×１０６細胞／ｍｌ（エクスビボのＰＢＭＣ）または２×１０６細胞／ｍｌ（ＩＶＳ増殖させた細胞）で再懸濁し、抗ヒトＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）でコーティングしたＥＬＩＳｐｏｔ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ プレート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中、ＤＭＳＯ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、フィトヘマグルチニン－Ｌ（ＰＨＡ－Ｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの各重複ペプチドプール（表Ｄ）、ＴＣＥ５にコードされた各重複ペプチドプール（表Ｅ）、またはＴＣＥ５にコードされた各最小エピトープペプチドプール（表Ｆ）の存在下で培養した。ペプチドプールを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のソース、ＥＤＧＥで予測された、及び／または文献（例えば、Ｎｅｌｄｅ ｅｔ ａｌ．［Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ２２，ｐａｇｅｓ７４－８５ ２０２１］，Ｔａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．２０２１，またはＳｃｈｅｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．［ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０８．１３．２４９４３３］）で以前に報告／検証されているか（「検証済み」）によって分類されたより小さいプールにより細かく分割した。５％ＣＯ２、３７℃の加湿したインキュベーター内で１８時間インキュベートした後、上清を回収し、細胞をプレートから除去し、膜に結合したＩＦＮγを抗ヒトＩＦＮγ検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ａｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＡＥＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて検出した。プレートを撮影し、ＡＩＤ ｉＳｐｏｔリーダー（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）で計数した。データは細胞１００万個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示される。ＰＢＭＣは、購入したか（Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、「コホート１」）または第２のソースから得たものとした（「コホート２」）。
ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出はＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより行った［Ｓ．Ｊａｎｅｔｚｋｉ，Ｊ．Ｈ．Ｃｏｘ，Ｎ．Ｏｄｅｎ，Ｇ．Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０２，５１－８６（２００５）］。要約すると、細胞を採取し、カウントして培地中に４×１０６細胞／ｍｌ（エクスビボのＰＢＭＣ）または２×１０６細胞／ｍｌ（ＩＶＳ増殖させた細胞）で再懸濁し、抗ヒトＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）でコーティングしたＥＬＩＳｐｏｔ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ プレート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中、ＤＭＳＯ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、フィトヘマグルチニン－Ｌ（ＰＨＡ－Ｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの各重複ペプチドプール（表Ｄ）、ＴＣＥ５にコードされた各重複ペプチドプール（表Ｅ）、またはＴＣＥ５にコードされた各最小エピトープペプチドプール（表Ｆ）の存在下で培養した。ペプチドプールを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のソース、ＥＤＧＥで予測された、及び／または文献（例えば、Ｎｅｌｄｅ ｅｔ ａｌ．［Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ２２，ｐａｇｅｓ７４－８５ ２０２１］，Ｔａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．２０２１，またはＳｃｈｅｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．［ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０８．１３．２４９４３３］）で以前に報告／検証されているか（「検証済み」）によって分類されたより小さいプールにより細かく分割した。５％ＣＯ２、３７℃の加湿したインキュベーター内で１８時間インキュベートした後、上清を回収し、細胞をプレートから除去し、膜に結合したＩＦＮγを抗ヒトＩＦＮγ検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ａｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＡＥＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて検出した。プレートを撮影し、ＡＩＤ ｉＳｐｏｔリーダー（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）で計数した。データは細胞１００万個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示される。ＰＢＭＣは、購入したか（Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、「コホート１」）または第２のソースから得たものとした（「コホート２」）。
インビトロ刺激（ＩＶＳ）培養
回復期の患者ＰＢＭＣ試料から得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性Ｔ細胞を、以前に記載されているように（Ｂ．Ｂｕｌｉｋ－Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｅｐ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＨＬＡ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａｓｅｔｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，（２０１８））、スパイク（表Ｄ）及びＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ）領域（表Ｅ）をカバーする重複ペプチドプールと低用量のＩＬ－２の存在下で増殖させた。要約すると、解凍したＰＢＭＣを一晩休ませ、１０ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含むＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＸＦ Ｔ細胞増殖培地（ＩＣ培地；ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、スパイクと全ＴＣＥ＿ＯＬＰ重複ペプチドプール（４～５μｇ／ｍｌ／ペプチド）の組み合わせの存在下で刺激した。細胞を１～２×１０６細胞／ウェルで播種し、ｒｈＩＬ－２を含む培地の２／３を２～３日ごとに交換することによって栄養供給した。ＩＶＳ刺激の後、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行う前に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）より販売されるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞細胞単離キットを製造者の指示に従って使用してＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞除去を行った。
回復期の患者ＰＢＭＣ試料から得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性Ｔ細胞を、以前に記載されているように（Ｂ．Ｂｕｌｉｋ－Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｅｐ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＨＬＡ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａｓｅｔｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，（２０１８））、スパイク（表Ｄ）及びＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ）領域（表Ｅ）をカバーする重複ペプチドプールと低用量のＩＬ－２の存在下で増殖させた。要約すると、解凍したＰＢＭＣを一晩休ませ、１０ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含むＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＸＦ Ｔ細胞増殖培地（ＩＣ培地；ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、スパイクと全ＴＣＥ＿ＯＬＰ重複ペプチドプール（４～５μｇ／ｍｌ／ペプチド）の組み合わせの存在下で刺激した。細胞を１～２×１０６細胞／ウェルで播種し、ｒｈＩＬ－２を含む培地の２／３を２～３日ごとに交換することによって栄養供給した。ＩＶＳ刺激の後、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行う前に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）より販売されるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞細胞単離キットを製造者の指示に従って使用してＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞除去を行った。
ＩｎｃｕＣｙｔｅ殺滅アッセイ
Ｒｅｄレンチウイルスで形質導入したＨＬＡを発現するＡ３７５細胞（Ａ＊０１：０１、Ａ＊０２：０１、Ａ＊０３：０１、Ａ＊１１：０１及びＡ＊３０：０１）を、１０％熱失活ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中、ウェル当たり２．５×１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに、またはウェル当たり３．５×１０４細胞の濃度で４８ウェルプレートに播種した。各プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内に置き、播種の２４時間後に、エフェクター細胞を２．５×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに、または３．５×１０５細胞／ウェルの濃度で４８ウェルプレートにエフェクター：標的比が１０：１となるように播種した。処理したウェルに最小エピトープペプチドプールを４μｇ／ｍＬの最終濃度で加え、コントロールウェルにはＤＭＳＯを使用した。各プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）で合計２～４日間撮影し、データをＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ ２０１８分析ソフトウェアを使用して分析した。Ａ３７５の生存率を赤血球数により評価し、ＤＭＳＯ共培養コントロールウェルに対する相対標的数をエフェクター添加時間（０ｈ）から計算した。
Ｒｅｄレンチウイルスで形質導入したＨＬＡを発現するＡ３７５細胞（Ａ＊０１：０１、Ａ＊０２：０１、Ａ＊０３：０１、Ａ＊１１：０１及びＡ＊３０：０１）を、１０％熱失活ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中、ウェル当たり２．５×１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに、またはウェル当たり３．５×１０４細胞の濃度で４８ウェルプレートに播種した。各プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内に置き、播種の２４時間後に、エフェクター細胞を２．５×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに、または３．５×１０５細胞／ウェルの濃度で４８ウェルプレートにエフェクター：標的比が１０：１となるように播種した。処理したウェルに最小エピトープペプチドプールを４μｇ／ｍＬの最終濃度で加え、コントロールウェルにはＤＭＳＯを使用した。各プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）で合計２～４日間撮影し、データをＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ ２０１８分析ソフトウェアを使用して分析した。Ａ３７５の生存率を赤血球数により評価し、ＤＭＳＯ共培養コントロールウェルに対する相対標的数をエフェクター添加時間（０ｈ）から計算した。
結果
スパイク及びＴＣＥ５コードエピトープに対するＴ細胞応答をＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した。図２８に示され、また表１４に定量化されるように、わずかであるが検出可能なエピトープ特異的応答が、エクスビボで直接試験した（すなわち、ＩＶＳ増殖を行わずに）ＰＢＭＣにおいてさまざまな示されるスパイクペプチドプール及びＴＣＥ５コードペプチドプールにわたって観察された。図２９に示され、また表１５に定量化されるように、ＩＶＳ増殖させたＰＢＭＣ（コホート１）は、検討したさまざまな示されるスパイクペプチドプール及びＴＣＥ５コードペプチドプールにわたって強いエピトープ特異的応答を示した。図３０に示され、また表１６に定量化されるように、ＩＶＳ増殖させたＰＢＭＣ（コホート２）は、定量上限値（ＵＬＯＱ）を上回る応答を含め、検討したさまざまな示されるスパイクペプチドプール及びＴＣＥ５コードペプチドプールにわたって強いエピトープ特異的応答を示した。図３１は、定量上限値（ＵＬＯＱ）を上回る応答を含め、検証済みの、及びＥＤＧＥ予測された、検討したさまざまな示される最小ＴＣＥ５コードペプチドプールにわたって強いエピトープ特異的応答を示すＩＶＳ増殖させたＰＢＭＣから得られた試料のセレクションを示す（コホート１及びコホート２、図２９及び図３０を参照）。これらの結果は、ＴＣＥ５に含めるためのスパイク及び選択されたＴ細胞エピトープはいずれも、自然感染によって刺激されるものと同様の幅広く強いＴ細胞応答を刺激し、ワクチンとして投与した場合にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御免疫を与える可能性を示している。
スパイク及びＴＣＥ５コードエピトープに対するＴ細胞応答をＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した。図２８に示され、また表１４に定量化されるように、わずかであるが検出可能なエピトープ特異的応答が、エクスビボで直接試験した（すなわち、ＩＶＳ増殖を行わずに）ＰＢＭＣにおいてさまざまな示されるスパイクペプチドプール及びＴＣＥ５コードペプチドプールにわたって観察された。図２９に示され、また表１５に定量化されるように、ＩＶＳ増殖させたＰＢＭＣ（コホート１）は、検討したさまざまな示されるスパイクペプチドプール及びＴＣＥ５コードペプチドプールにわたって強いエピトープ特異的応答を示した。図３０に示され、また表１６に定量化されるように、ＩＶＳ増殖させたＰＢＭＣ（コホート２）は、定量上限値（ＵＬＯＱ）を上回る応答を含め、検討したさまざまな示されるスパイクペプチドプール及びＴＣＥ５コードペプチドプールにわたって強いエピトープ特異的応答を示した。図３１は、定量上限値（ＵＬＯＱ）を上回る応答を含め、検証済みの、及びＥＤＧＥ予測された、検討したさまざまな示される最小ＴＣＥ５コードペプチドプールにわたって強いエピトープ特異的応答を示すＩＶＳ増殖させたＰＢＭＣから得られた試料のセレクションを示す（コホート１及びコホート２、図２９及び図３０を参照）。これらの結果は、ＴＣＥ５に含めるためのスパイク及び選択されたＴ細胞エピトープはいずれも、自然感染によって刺激されるものと同様の幅広く強いＴ細胞応答を刺激し、ワクチンとして投与した場合にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御免疫を与える可能性を示している。
Ｔ細胞応答を特徴付けるためにＴＣＥ５コードエピトープに対するＴ細胞応答をさらに調べた。図３２に示され、また表１７に定量化されるように、ＩＶＳ増殖させたＰＢＭＣ（コホート１）は、検討したさまざまな示されるＴＣＥ５コードペプチドプールにわたって強いエピトープ特異的応答を示した（柱１）。ＰＢＭＣのＣＤ８除去が、低下してはいるが依然として検出可能なＴ細胞応答（下のパネル、柱３）を一般的にもたらしたのに対して、ＰＢＭＣのＣＤ４除去はさまざまなプール及びドナーソースにわたって異なる効果をもたらした（柱２）。これらの結果は、ＴＣＥ５に含めるための選択されたＴ細胞エピトープが、混ざり合ったＣＤ４／ＣＤ８細胞応答を刺激したことを示している。
標的細胞の機能的殺滅を評価するためにＴＣＥ５コードエピトープに対するＴ細胞応答をさらに調べた。図３３Ａ～Ｌに示され、また表１８Ａ～Ｌに定量化されるように、標的細胞の殺滅が、検討したさまざまな示されるＴＣＥ５コードペプチドプールにわたってＨＬＡアレル発現標的細胞のそれぞれについて、ペプチド及びエフェクターＴ細胞特異的な形で観察された（白四角）。これらの結果は、ＴＣＥ５に含めるための選択されたＴ細胞エピトープが、自然感染においてもたらされるＴ細胞によるＴ細胞媒介殺滅を促進し、ワクチンとして投与した場合にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御免疫を促進する可能性を示している。
ＸＩＶ．Ｊ． 異なるアイソレートからのスパイクタンパク質を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライミング／ブースターレジメンは非ヒト霊長類にスパイクに対する応答をもたらす
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の異なるアイソレートをコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを、図３４に示され、表１９に示されるように、同種または異種プライミング／ブースターレジメンの一環としてインドアカゲザルで評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の異なるアイソレートをコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンプラットフォームを、図３４に示され、表１９に示されるように、同種または異種プライミング／ブースターレジメンの一環としてインドアカゲザルで評価した。
ＮＨＰを、示される用量の「ＣｈＡｄ－ＳＤ６１４Ｇ；ＣＴ」（配列番号７９）を有するスパイクコードカセットを含むＣｈＡｄプラットフォームまたは「ＳＡＭ－ＳＤ６１４Ｇ；ＩＤＴ」（配列番号６９）を有するスパイクコードカセットを含むＳＡＭプラットフォームのプライミング用量で最初に免疫した。その後、ＮＨＰに、６または８週目に、示される用量の「ＳＡＭ－ＳＤ６１４Ｇ；ＩＤＴ」を有するスパイクコードカセットを含むＳＡＭプラットフォームによる１回目のブースターを投与した。その後、ＮＨＰに、３０週目に、Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ配列最適化（「ＣＴ」）及び本明細書に記載のＦ２Ｐ改変（「Ｆ２Ｐ」）（配列番号１１２）を有するＢ．１．３５１スパイクバリアントコードカセットを含むＣｈＡｄプラットフォーム、または同じＢ．１．３５１スパイクバリアントを含むＳＡＭプラットフォームによる２回目のブースターを投与した（各プラットフォームは、表１０を参照して示される方向でＴＣＥ５ Ｔ細胞エピトープも含んでいる）。ＣｈＡｄＶ抗原カセットを配列番号１１３に示す。ＮＨＰを本明細書に記載されるように経時的にモニタリングした。
図３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、及び３５Ｄに示されるように、異なるワクチンレジメン（それぞれ、グループ１、２、５、及び６）が、複数のスパイクＴ細胞エピトーププールにわたったＴ細胞応答をもたらした（上の各パネル）。単一の大きなスパイクＴ細胞エピトーププールに対する個々のＮＨＰのＴ細胞応答は不均一であり（中央の各パネル、及び図３６の上のパネルに要約される）、各ブースターは、一部における強い応答の発生（例えば、ブースター２の後のグループ１の２匹のＮＨＰ）を含め、Ｔ細胞応答の増加を一般的にもたらした。評価した５匹のＮＨＰ動物のすべてにおいて、各ブースター後にスパイク特異的なＩｇＧ抗体力価が検出され、増加した（下の各パネル、及び図３６の下のパネルに要約される）。ＴＣＥ５コードエピトープに対するＴ細胞応答は、一般的にわずかであったが、ブースター２（ＴＣＥ５を含むワクチンの初回の投与）の後に増加の傾向を示し、ＣｈＡｄＶプラットフォームワクチンの投与により一般的により強い応答を生じた（図３６、中央のパネル）。したがって、これらのデータは、スパイクバリアントをコードしたワクチンによるブースターを含むワクチンレジメンは、Ｔ細胞及び抗体応答をもたらしたことを示している。
抗体応答を、Ｄ６１４Ｇシュードウイルス及びＢ．１．３５１シュードウイルスに対する中和抗体産生についてさらに評価した。図３７に示されるように、Ｄ６１４Ｇシュードウイルスに対する中和抗体（Ｎａｂ）が、４つのグループでブースター１の後に検出され、ブースター２の後でＮａｂ力価は概ね同じであった（左の各パネル）。ブースター１の後、Ｂ．１．３５１シュードウイルスに対する交差中和抗体の力価は、検出されたものの、Ｄ６１４Ｇシュードウイルスに対するＮａｂ力価と比較して顕著に低かった（右のパネル、柱１）。しかしながら、Ｂ．１．３５１スパイクバリアントをコードしたブースター２の投与の後では、Ｂ．１．３５１シュードウイルスに対するＮａｂ力価は顕著に増加し（右の各パネル、柱２）、注目すべき点として、Ｎａｂ力価のレベルは、ブースター１後のＤ６１４Ｇシュードウイルスに対するものと同等であった。これらの結果は、シュードウイルスのそれぞれに対する相対的Ｎａｂ力価を比較した図３８にさらに示されており、評価したワクチンレジメンのそれぞれで、ブースター１の後のＢ．１．３５１シュードウイルスに対する交差中和能の低下（上の各パネル）及びブースター２の後の交差中和能の回復（下の各パネル）を示している。
これらのデータは、異なるワクチンレジメンがＮＨＰにおいてコードされた抗原に対してＴ細胞応答及び抗体応答の両方をもたらし、注目すべき点として、スパイクバリアントをコードしたワクチンによるその後の免疫によってそれぞれのバリアントシュードウイルスに対するＮａｂ力価の顕著な改善が示された。
ＸＩＶ．Ｋ．ヒト被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの臨床評価
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクのみ、またはスパイクと表Ａ～Ｆに示されるエピトープ、または表１０、１２Ａ、１２Ｂ、または１２Ｃに記載のＴ細胞エピトープカセットのようなさらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープ（ＴＣＥ）のいずれかを発現する研究対象のチンパンジーアデノウイルスベクター血清型６８（ＣｈＡｄ）及び自己増幅型ｍＲＮＡ（ＳＡＭ）ベクターの安全性、忍容性、及び免疫原性を調べるための同種及び異種プライミング／ブースターワクチン接種スケジュールの第１相、非盲検、用量漸増、非無作為化試験を健康な成人被験者で実施した。ステージ１では、センチネル及び用量漸増のための時差組み入れを含む異種ＣｈＡｄプライミング／ＳＡＭブースター及び同種ＳＡＭプライミング／ＳＡＭブースターレジメンに重点を置いて、スパイクタンパク質のみをコードしたＣｈＡｄワクチンとＳＡＭワクチンを、１８～６０歳の被験者では２群の用量漸増試験、６０歳以上の被験者では３群の用量漸増試験で比較する。ステージ２では、スパイク及びＴＣＥの両方をコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンの最適用量（ステージ１で決定される）を、同種ＳＡＭプライミング／ＳＡＭブースター、同種ＣｈＡｄプライミング／ＣｈＡｄブースター、及び異種ＣｈＡｄプライミング／ＳＡＭブースターの組み合わせを投与するために最大６群に同時に組み入れた１８歳以上の被験者で比較する。最大７０人（ステージ１）及び最大７０人（ステージ２）の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症または重症コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）に対する疾患進行の高いリスクがなく、かつすべての適格性基準を満たす、健康状態が良好な１８歳以上の男性及び非妊娠女性を組み入れる。被験者は、少なくとも４箇所の米国拠点の感染症臨床研究コンソーシアム（ＩＤＣＲＣ）の治験実施施設のうちの１つにおいて、年齢別（１８～６０歳及び６０歳以上）に異なる群に組み入れる。この試験の主要目的は、高齢の成人被験者を含む健康な成人被験者にプライミング及び／またはブースターとして投与した場合の異なる用量のＣｈＡｄ－Ｓ（またはＣｈＡｄ－Ｓ－ＴＣＥ）及びＳＡＭ－Ｓ（またはＳＡＭ－Ｓ－ＴＣＥ）の安全性及び忍容性を評価することにある。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクのみ、またはスパイクと表Ａ～Ｆに示されるエピトープ、または表１０、１２Ａ、１２Ｂ、または１２Ｃに記載のＴ細胞エピトープカセットのようなさらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープ（ＴＣＥ）のいずれかを発現する研究対象のチンパンジーアデノウイルスベクター血清型６８（ＣｈＡｄ）及び自己増幅型ｍＲＮＡ（ＳＡＭ）ベクターの安全性、忍容性、及び免疫原性を調べるための同種及び異種プライミング／ブースターワクチン接種スケジュールの第１相、非盲検、用量漸増、非無作為化試験を健康な成人被験者で実施した。ステージ１では、センチネル及び用量漸増のための時差組み入れを含む異種ＣｈＡｄプライミング／ＳＡＭブースター及び同種ＳＡＭプライミング／ＳＡＭブースターレジメンに重点を置いて、スパイクタンパク質のみをコードしたＣｈＡｄワクチンとＳＡＭワクチンを、１８～６０歳の被験者では２群の用量漸増試験、６０歳以上の被験者では３群の用量漸増試験で比較する。ステージ２では、スパイク及びＴＣＥの両方をコードしたＣｈＡｄ及びＳＡＭワクチンの最適用量（ステージ１で決定される）を、同種ＳＡＭプライミング／ＳＡＭブースター、同種ＣｈＡｄプライミング／ＣｈＡｄブースター、及び異種ＣｈＡｄプライミング／ＳＡＭブースターの組み合わせを投与するために最大６群に同時に組み入れた１８歳以上の被験者で比較する。最大７０人（ステージ１）及び最大７０人（ステージ２）の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症または重症コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）に対する疾患進行の高いリスクがなく、かつすべての適格性基準を満たす、健康状態が良好な１８歳以上の男性及び非妊娠女性を組み入れる。被験者は、少なくとも４箇所の米国拠点の感染症臨床研究コンソーシアム（ＩＤＣＲＣ）の治験実施施設のうちの１つにおいて、年齢別（１８～６０歳及び６０歳以上）に異なる群に組み入れる。この試験の主要目的は、高齢の成人被験者を含む健康な成人被験者にプライミング及び／またはブースターとして投与した場合の異なる用量のＣｈＡｄ－Ｓ（またはＣｈＡｄ－Ｓ－ＴＣＥ）及びＳＡＭ－Ｓ（またはＳＡＭ－Ｓ－ＴＣＥ）の安全性及び忍容性を評価することにある。
ＣｈＡｄＶ６８－Ｓ：チンパンジーアデノウイルス血清型６８－スパイク（ＣｈＡｄＶ６８－Ｓ）は、サブグループＥのアデノウイルス科に属する、チンパンジーアデノウイルス６８（最初にＰａｎ９と指定されていたＣ６８、６８／ＳＡｄＶ－２５）に基づいた複製不能な、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４Ｏｒｆ２～４を欠失させたアデノウイルスベクターである。１回の０．５ｍＬまたは１．０ｍＬ筋肉内注射（用量レベルによる）を三角筋に投与する。可能な場合、プライミングワクチンとブースターワクチンは違う腕に投与する。
ＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ：自己複製型ｍＲＮＡ－脂質ナノ粒子－スパイク（ＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ）は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に基づいたＳＡＭベクターである。１回の０．５ｍＬ筋肉内注射（用量レベルによる）を三角筋に投与する。可能な場合、プライミングワクチンとブースターワクチンは違う腕に投与する。
ＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥ：チンパンジーアデノウイルス血清型６８－スパイク＋さらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープ（ＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥ）は、サブグループＥのアデノウイルス科に属する、チンパンジーアデノウイルス６８（最初にＰａｎ９と指定されていたＣ６８、６８／ＳＡｄＶ－２５）に基づいた複製不能な、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４Ｏｒｆ２～４を欠失させたアデノウイルスベクターである。１回の０．５ｍＬまたは１．０ｍＬ筋肉内注射を三角筋に投与する。可能な場合、プライミングワクチンとブースターワクチンは違う腕に投与するべきである。
ＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥ：自己複製型ｍＲＮＡ－脂質ナノ粒子－スパイク＋さらなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープ（ＳＡＭ－Ｓ－ＴＣＥ）は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に基づいたＳＡＭベクターである。１回の０．５ｍＬ筋肉内注射を三角筋に投与する。可能な場合、プライミングワクチンとブースターワクチンは違う腕に投与するべきである。
この試験で使用した希釈剤は０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰであり、塩化ナトリウムと注射用水の滅菌、非発熱性の等張溶液である。１ミリリットル（ｍＬ）には塩化ナトリウム９ｍｇが含まれている。静菌剤、抗微生物剤、または添加バッファーは含んでおらず、注射用の薬剤を希釈または溶解するための１回用量容器中でのみ供給される。０．３０８ｍＯｓｍｏｌ／ｍＬ（計算値）。０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰは防腐剤は含まない。
以下のグループを評価した。
－ステージ１ グループ１：１８～６０歳の参加者に１日目に５×１０１０個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ２：１８～６０歳の参加者に１日目に１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ３：１８～６０歳の参加者に１日目及び２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ４：１８～６０歳の参加者に１日目及び２９日目に１００ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ５：６０歳を超える参加者に１日目に５×１０１０個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ６：６０歳を超える参加者に１日目に１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ７：６０歳を超える参加者に１日目に５×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を１．０ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ８：１８～６０歳の参加者に１日目に５×１０１０個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子または１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、５７日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ９：６０歳を超える参加者に１日目に５×１０１０個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子または１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子または５×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を０．５ｍＬまたは１．０ｍＬ（５×１０１１個のウイルス粒子について）の筋肉内注射により三角筋に投与し、５７日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ１０：１８～６０歳の参加者に１日目及び１１３日目に１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ１１：６０歳を超える参加者に１日目及び１１３日目に１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与するか、または１日目及び１１３日目に５×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を１．０ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ１２：１８歳以上の参加者に１日目及び５７日目に１０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０。
－ステージ２ グループ１３：１８歳以上の参加者に１日目及び５７日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ１４：１８歳以上の参加者に１日目及び５７日目に１００ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ１：１８～６０歳の参加者に１日目に５×１０１０個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ２：１８～６０歳の参加者に１日目に１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ３：１８～６０歳の参加者に１日目及び２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ４：１８～６０歳の参加者に１日目及び２９日目に１００ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ５：６０歳を超える参加者に１日目に５×１０１０個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ６：６０歳を超える参加者に１日目に１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ１ グループ７：６０歳を超える参加者に１日目に５×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓのウイルス粒子を１．０ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、２９日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ８：１８～６０歳の参加者に１日目に５×１０１０個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子または１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与し、５７日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ９：６０歳を超える参加者に１日目に５×１０１０個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子または１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子または５×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を０．５ｍＬまたは１．０ｍＬ（５×１０１１個のウイルス粒子について）の筋肉内注射により三角筋に投与し、５７日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ１０：１８～６０歳の参加者に１日目及び１１３日目に１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ１１：６０歳を超える参加者に１日目及び１１３日目に１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与するか、または１日目及び１１３日目に５×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８－Ｓ－ＴＣＥのウイルス粒子を１．０ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ１２：１８歳以上の参加者に１日目及び５７日目に１０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０。
－ステージ２ グループ１３：１８歳以上の参加者に１日目及び５７日目に３０ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
－ステージ２ グループ１４：１８歳以上の参加者に１日目及び５７日目に１００ｍｃｇのＳＡＭ－ＬＮＰ－Ｓ－ＴＣＥを０．５ｍＬの筋肉内注射により三角筋に投与する。Ｎ＝１０
以下の主要アウトカムを評価した。
－非自発報告による局所的反応原性有害事象［ＡＥ］のグレード別の頻度［時間枠：各ワクチン接種の７日後まで］
－非自発報告による全身性反応原性有害事象［ＡＥ］のグレード別の頻度［時間枠：各ワクチン接種の７日後まで］
－自発報告による有害事象［ＡＥ］のグレード別の頻度［時間枠：各ワクチン接種の２８日後まで］
－特に注目すべき有害事象（ＡＥＳＩ）の頻度［時間枠：１日目から４７８日目］。免疫の関与が疑われる医学的事象（ＰＩＭＭＣ）、診療を要した有害事象（ＭＡＡＥ）、及び新たに認められた慢性的な医学的事象（ＮＯＣＭＣ）を含む。
－重症度別の臨床的安全性検査施設有害事象の頻度［時間枠：各ワクチン接種の７日後まで］。評価されるパラメータには以下が含まれる：白血球数（ＷＢＣ）、ヘモグロビン（ＨｇＢ）、血小板（ＰＬＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビン（Ｔ Ｂｉｌｉ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、及びクレアチニン（Ｃｒ）。
－重篤な有害事象（ＳＡＥ）の頻度［時間枠：１日目から４７８日目］
－非自発報告による局所的反応原性有害事象［ＡＥ］のグレード別の頻度［時間枠：各ワクチン接種の７日後まで］
－非自発報告による全身性反応原性有害事象［ＡＥ］のグレード別の頻度［時間枠：各ワクチン接種の７日後まで］
－自発報告による有害事象［ＡＥ］のグレード別の頻度［時間枠：各ワクチン接種の２８日後まで］
－特に注目すべき有害事象（ＡＥＳＩ）の頻度［時間枠：１日目から４７８日目］。免疫の関与が疑われる医学的事象（ＰＩＭＭＣ）、診療を要した有害事象（ＭＡＡＥ）、及び新たに認められた慢性的な医学的事象（ＮＯＣＭＣ）を含む。
－重症度別の臨床的安全性検査施設有害事象の頻度［時間枠：各ワクチン接種の７日後まで］。評価されるパラメータには以下が含まれる：白血球数（ＷＢＣ）、ヘモグロビン（ＨｇＢ）、血小板（ＰＬＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビン（Ｔ Ｂｉｌｉ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、及びクレアチニン（Ｃｒ）。
－重篤な有害事象（ＳＡＥ）の頻度［時間枠：１日目から４７８日目］
以下の副次アウトカムを評価した。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株についてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイにより測定された力価のベースラインからの増加倍率の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。
－受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価のベースラインからの増加倍率の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのＲＢＤについて酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定。
－スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価のベースラインからの増加倍率の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのスパイクについて抗疎結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株についてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイにより測定された力価の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。
－受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのＲＢＤについて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定。
－スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのスパイクについて酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定。
－細胞タイプ別のサイトカイン（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）、サイトカインのセット（ＣＤ４＋ではＴｈ１またはＴｈ２サイトカイン、及びＣＤ８＋ではＣＤ８＋サイトカイン、または他の目的の組み合わせ）、及びペプチドプール（スパイク及びＴ細胞エピトープ領域をカバーした）を発現する細胞の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。ＩＣＳにより測定。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのＲＢＤについてセロコンバージョンした被験者の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。セロコンバージョンは、ＥＬＩＳＡにより測定された受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）特異的ＩｇＧのベースラインからの４倍の変化として定義される。血清中の総スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づく）及び機能（中和、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ））を測定するさまざまなアッセイにより評価される例えばＢ．１．１．７．のような出現ウイルス株に対するものを含む。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのスパイクタンパク質についてセロコンバージョンした被験者の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。セロコンバージョンは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定されたスパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のベースラインからの４倍の変化として定義される。血清中の総スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づく）及び機能（中和、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ））を測定するさまざまなアッセイにより評価される例えばＢ．１．１．７．のような出現ウイルス株に対するものを含む。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株についてセロコンバージョンした被験者の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。セロコンバージョンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイにより測定された力価のベースラインからの４倍の変化として定義される。血清中の総スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づく）及び機能（中和、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ））を測定するさまざまなアッセイにより評価される例えばＢ．１．１．７．のような出現ウイルス株に対するものを含む。
－ペプチドプール（スパイク及びＴ細胞エピトープ領域をカバーした）別の細胞１００万個当たりのスポット形成細胞の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。インターフェロン（ＩＦＮ）ガンマ酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）により測定。
－適用可能なサイトカインの各セット及び各ペプチドプールについて細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）から導かれる応答者ステータス［時間枠：１日目から４７８日目］。スパイク及びＴ細胞エピトープ領域をカバーしているもの。
－各ペプチドプールについてインターフェロン（ＩＦＮ）ガンマ酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）により判定される応答者ステータス［時間枠：１日目から４７８日目］。スパイク及びＴ細胞エピトープ領域をカバーしているもの。
－Ｔ細胞応答のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインのバランス［時間枠：ブースターワクチン接種の２８日後まで］。被験者のサブセットにおいて酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）上清を用いたマルチプレックスサイトカインアッセイを使用してインターロイキン（ＩＬ）２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３を測定することによる。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株についてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイにより測定された力価のベースラインからの増加倍率の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。
－受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価のベースラインからの増加倍率の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのＲＢＤについて酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定。
－スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価のベースラインからの増加倍率の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのスパイクについて抗疎結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株についてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイにより測定された力価の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。
－受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのＲＢＤについて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定。
－スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価の幾何平均値［時間枠：１日目から４７８日目］。野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのスパイクについて酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定。
－細胞タイプ別のサイトカイン（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）、サイトカインのセット（ＣＤ４＋ではＴｈ１またはＴｈ２サイトカイン、及びＣＤ８＋ではＣＤ８＋サイトカイン、または他の目的の組み合わせ）、及びペプチドプール（スパイク及びＴ細胞エピトープ領域をカバーした）を発現する細胞の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。ＩＣＳにより測定。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのＲＢＤについてセロコンバージョンした被験者の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。セロコンバージョンは、ＥＬＩＳＡにより測定された受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）特異的ＩｇＧのベースラインからの４倍の変化として定義される。血清中の総スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づく）及び機能（中和、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ））を測定するさまざまなアッセイにより評価される例えばＢ．１．１．７．のような出現ウイルス株に対するものを含む。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株からのスパイクタンパク質についてセロコンバージョンした被験者の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。セロコンバージョンは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定されたスパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のベースラインからの４倍の変化として定義される。血清中の総スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づく）及び機能（中和、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ））を測定するさまざまなアッセイにより評価される例えばＢ．１．１．７．のような出現ウイルス株に対するものを含む。
－野生型ウイルス及び出現ウイルス株についてセロコンバージョンした被験者の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。セロコンバージョンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイにより測定された力価のベースラインからの４倍の変化として定義される。血清中の総スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づく）及び機能（中和、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ））を測定するさまざまなアッセイにより評価される例えばＢ．１．１．７．のような出現ウイルス株に対するものを含む。
－ペプチドプール（スパイク及びＴ細胞エピトープ領域をカバーした）別の細胞１００万個当たりのスポット形成細胞の割合［時間枠：１日目から４７８日目］。インターフェロン（ＩＦＮ）ガンマ酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）により測定。
－適用可能なサイトカインの各セット及び各ペプチドプールについて細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）から導かれる応答者ステータス［時間枠：１日目から４７８日目］。スパイク及びＴ細胞エピトープ領域をカバーしているもの。
－各ペプチドプールについてインターフェロン（ＩＦＮ）ガンマ酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）により判定される応答者ステータス［時間枠：１日目から４７８日目］。スパイク及びＴ細胞エピトープ領域をカバーしているもの。
－Ｔ細胞応答のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインのバランス［時間枠：ブースターワクチン接種の２８日後まで］。被験者のサブセットにおいて酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）上清を用いたマルチプレックスサイトカインアッセイを使用してインターロイキン（ＩＬ）２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３を測定することによる。
さらなる配列
表Ａ
配列表の配列番号１３０～８１９５を参照されたい。ＥＤＧＥスコア＞０．００１で特定のＨＬＡアレルと関連付けられることが予測されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされた各候補ＭＨＣクラスＩエピトープが示されている。各エントリーは、予測されたＥＤＧＥスコアが０．００１よりも高い候補エピトープ配列と同種ＨＬＡを含み、各同種ペアリングをＨ（ＥＤＧＥスコア＞０．１）、Ｍ（ＥＤＧＥ＝０．０１～０．１）、及びＬ（ＥＤＧＥスコア＜０．０１）としてランク付けしている。例えば、候補エピトープＭＥＳＬＶＰＧＦ（配列番号１２７）は、それぞれＥＤＧＥスコア．０１９、．０３２、及び．００８でＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０５とペアになると予測される。したがって、配列番号１３０のエントリーは、「ＭＥＳＬＶＰＧＦ：Ｂ１８：０１Ｍ；Ｂ３７：０１Ｍ；Ｂ０７：０５Ｌ」となっている。
表Ａ
配列表の配列番号１３０～８１９５を参照されたい。ＥＤＧＥスコア＞０．００１で特定のＨＬＡアレルと関連付けられることが予測されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされた各候補ＭＨＣクラスＩエピトープが示されている。各エントリーは、予測されたＥＤＧＥスコアが０．００１よりも高い候補エピトープ配列と同種ＨＬＡを含み、各同種ペアリングをＨ（ＥＤＧＥスコア＞０．１）、Ｍ（ＥＤＧＥ＝０．０１～０．１）、及びＬ（ＥＤＧＥスコア＜０．０１）としてランク付けしている。例えば、候補エピトープＭＥＳＬＶＰＧＦ（配列番号１２７）は、それぞれＥＤＧＥスコア．０１９、．０３２、及び．００８でＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０５とペアになると予測される。したがって、配列番号１３０のエントリーは、「ＭＥＳＬＶＰＧＦ：Ｂ１８：０１Ｍ；Ｂ３７：０１Ｍ；Ｂ０７：０５Ｌ」となっている。
表Ｂ
配列表の配列番号８１９６～２６７４０を参照されたい。ＥＤＧＥスコア＞０．００１で特定のＨＬＡアレルと関連付けられることが予測されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされた各候補ＭＨＣクラスＩＩエピトープが示されている。各エントリーは、予測されたＥＤＧＥスコアが０．００１よりも高い候補エピトープ配列と同種ＨＬＡを含み、各同種ペアリングをＨ（ＥＤＧＥスコア＞０．１）、Ｍ（ＥＤＧＥ＝０．０１～０．１）、及びＬ（ＥＤＧＥスコア＜０．０１）としてランク付けしている。例えば、候補エピトープＶＥＬＶＡＥＬＥＧＩ（配列番号１２８）は、それぞれＥＤＧＥスコア０．００３１４５、０．００３２８、０．０４１０９７、及び０．０１１６１３でＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０３：０２－Ｂ１＊０３：０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０２、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０５：０５－Ｂ１＊０３：１９、及び ＨＬＡ－ＤＰＡ１＊０１：０３－Ｂ１＊１０４：０１とペアになると予測される。したがって、配列番号８２１９のエントリーは、「ＶＥＬＶＡＥＬＥＧＩ：ＤＱＡ１＊０３：０２－Ｂ１＊０３：０３Ｌ；ＤＲＢ１＊１１：０２Ｌ；ＤＱＡ１＊０５：０５－Ｂ１＊０３：１９Ｍ；ＤＰＡ１＊０１：０３－Ｂ１＊１０４：０１Ｍ」となっている。ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰのみがそれらのα及びβ鎖で参照されている。ＨＬＡ－ＤＲは、α鎖はヒト集団では一般的に不変であり、特にＨＬＡ－ＤＲペプチドの接触領域は不変であることから、β鎖のみによって参照されている。
配列表の配列番号８１９６～２６７４０を参照されたい。ＥＤＧＥスコア＞０．００１で特定のＨＬＡアレルと関連付けられることが予測されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされた各候補ＭＨＣクラスＩＩエピトープが示されている。各エントリーは、予測されたＥＤＧＥスコアが０．００１よりも高い候補エピトープ配列と同種ＨＬＡを含み、各同種ペアリングをＨ（ＥＤＧＥスコア＞０．１）、Ｍ（ＥＤＧＥ＝０．０１～０．１）、及びＬ（ＥＤＧＥスコア＜０．０１）としてランク付けしている。例えば、候補エピトープＶＥＬＶＡＥＬＥＧＩ（配列番号１２８）は、それぞれＥＤＧＥスコア０．００３１４５、０．００３２８、０．０４１０９７、及び０．０１１６１３でＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０３：０２－Ｂ１＊０３：０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０２、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０５：０５－Ｂ１＊０３：１９、及び ＨＬＡ－ＤＰＡ１＊０１：０３－Ｂ１＊１０４：０１とペアになると予測される。したがって、配列番号８２１９のエントリーは、「ＶＥＬＶＡＥＬＥＧＩ：ＤＱＡ１＊０３：０２－Ｂ１＊０３：０３Ｌ；ＤＲＢ１＊１１：０２Ｌ；ＤＱＡ１＊０５：０５－Ｂ１＊０３：１９Ｍ；ＤＰＡ１＊０１：０３－Ｂ１＊１０４：０１Ｍ」となっている。ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰのみがそれらのα及びβ鎖で参照されている。ＨＬＡ－ＤＲは、α鎖はヒト集団では一般的に不変であり、特にＨＬＡ－ＤＲペプチドの接触領域は不変であることから、β鎖のみによって参照されている。
表Ｃ
配列表の配列番号２６７４１～２７１７９を参照されたい。ＥＤＧＥスコア＞０．００１で特定のＨＬＡアレルと関連付けられることが予測された、最適化されたカセット内にコードされた、スパイクタンパク質からのもの以外のさらなるＭＨＣクラスＩエピトープが示されている。これらのさらなるエピトープは、すべての初期エピトープがＳ１とＳ２に分割されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号５９）によって与えられるものとして集団カバー率基準Ｐを計算し、本明細書に記載される最適化アルゴリズムを適用することによって決定される。
配列表の配列番号２６７４１～２７１７９を参照されたい。ＥＤＧＥスコア＞０．００１で特定のＨＬＡアレルと関連付けられることが予測された、最適化されたカセット内にコードされた、スパイクタンパク質からのもの以外のさらなるＭＨＣクラスＩエピトープが示されている。これらのさらなるエピトープは、すべての初期エピトープがＳ１とＳ２に分割されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号５９）によって与えられるものとして集団カバー率基準Ｐを計算し、本明細書に記載される最適化アルゴリズムを適用することによって決定される。
表Ｄ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク重複ペプチドプールについて、配列番号２７１８０～２７４９５を参照されたい。各エントリーは、刺激ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のソース、ペプチドサブプール情報、及び表を含む。例えば、刺激ペプチドＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣ（配列番号２７１８０）は、サブプールＳ＿Ｗｕ＿１＿２に含まれ、表Ｄに見出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｗｕｈａｎ Ｄ６１４Ｇバリアント）に由来する。したがって、配列番号２７１８０のエントリーは、「ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣ：スパイクＷｕｈａｎ Ｄ６１４Ｇ；Ｓ＿Ｗｕ＿１＿２；表Ｄ」となっている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク重複ペプチドプールについて、配列番号２７１８０～２７４９５を参照されたい。各エントリーは、刺激ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のソース、ペプチドサブプール情報、及び表を含む。例えば、刺激ペプチドＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣ（配列番号２７１８０）は、サブプールＳ＿Ｗｕ＿１＿２に含まれ、表Ｄに見出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｗｕｈａｎ Ｄ６１４Ｇバリアント）に由来する。したがって、配列番号２７１８０のエントリーは、「ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣ：スパイクＷｕｈａｎ Ｄ６１４Ｇ；Ｓ＿Ｗｕ＿１＿２；表Ｄ」となっている。
表Ｅ
ＴＣＥ５にコードされた重複ペプチドプールについて、配列番号２７４９６～２７６０３を参照されたい。各エントリーは、刺激ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のソース、ペプチドサブプール情報、及び表を含む。例えば、刺激ペプチドＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶ（配列番号２７４９６）は、サブプールＯＬＰ＿Ｍｅｍに含まれ、表Ｅに見出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質に由来する。したがって、配列番号２７４９６のエントリーは、「ＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶ：膜；ＯＬＰ＿Ｍｅｍ；表Ｅ」となっている。
ＴＣＥ５にコードされた重複ペプチドプールについて、配列番号２７４９６～２７６０３を参照されたい。各エントリーは、刺激ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のソース、ペプチドサブプール情報、及び表を含む。例えば、刺激ペプチドＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶ（配列番号２７４９６）は、サブプールＯＬＰ＿Ｍｅｍに含まれ、表Ｅに見出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質に由来する。したがって、配列番号２７４９６のエントリーは、「ＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶ：膜；ＯＬＰ＿Ｍｅｍ；表Ｅ」となっている。
表Ｆ
ＴＣＥ５にコードされた最小エピトープペプチドプールについて、配列番号２７６０４～２７９３９を参照されたい。各エントリーは、刺激ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のソース、ペプチドサブプール情報、及び表を含む。例えば、刺激ペプチドＡＬＳＫＧＶＨＦＶ（配列番号２７６０４）は、サブプールＭｉｎ＿検証済みに含まれ、表Ｆに見出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３ａタンパク質（フレーム５２～８５）に由来する。したがって、配列番号２７６０４のエントリーは、「ＡＬＳＫＧＶＨＦＶ：ＯＲＦ３ａ ５２～８５；Ｍｉｎ＿検証済み；表Ｆ」となっている。
ＴＣＥ５にコードされた最小エピトープペプチドプールについて、配列番号２７６０４～２７９３９を参照されたい。各エントリーは、刺激ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のソース、ペプチドサブプール情報、及び表を含む。例えば、刺激ペプチドＡＬＳＫＧＶＨＦＶ（配列番号２７６０４）は、サブプールＭｉｎ＿検証済みに含まれ、表Ｆに見出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３ａタンパク質（フレーム５２～８５）に由来する。したがって、配列番号２７６０４のエントリーは、「ＡＬＳＫＧＶＨＦＶ：ＯＲＦ３ａ ５２～８５；Ｍｉｎ＿検証済み；表Ｆ」となっている。
本明細書で参照されるベクター、カセット、及び抗体の特定のさらなる配列を以下に記載し、配列番号で参照する。
参考文献
Claims (192)
- 抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記抗原発現系が、以下：
（ａ）場合により、１つ以上のベクターであって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、ベクター骨格
を含む、前記１つ以上のベクターと、
（ｂ）存在する場合に前記ベクター骨格に場合により挿入される、抗原カセットであって、以下：
（ｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、
前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたは前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含み、及び／または場合により、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含む、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせ
を含み、かつ
前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、
前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、
（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、
（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセットと
を含む、
前記組成物。 - 抗原ベースワクチンであって、以下：
（ｉ）少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドであって、以下：
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含み、及び／または場合により、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含む、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせ
を含み、かつ場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドと、
（ｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原と、
（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）と
を含む、前記抗原ベースワクチン。 - 抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記抗原発現系が、以下：
（ａ）場合により、１つ以上のベクターであって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、ベクター骨格
を含む、前記１つ以上のベクターと、
（ｂ）存在する場合に前記ベクター骨格に場合により挿入される、抗原カセットであって、以下：
（ｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個、またはそれ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、
前記免疫原性ポリペプチドが、
（Ａ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号６６または配列番号６７に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
（Ｂ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び表Ｃに記載のポリペプチド配列番号を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープが、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在し、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が配列番号６８に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
（Ｃ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が配列番号６９、配列番号７９、配列番号８３，配列番号８５、または配列番号８７に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
（Ｄ）表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープが、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在し、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号６４または配列番号６５に記載の配列を含む、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
（Ｅ）配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異、スパイクＲ６８２Ｖ変異、スパイクＲ８１５Ｎ変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により前記改変スパイクタンパク質が、配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含み、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７０または配列番号８９に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
（Ｆ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７１に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
（Ｇ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７２に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
（Ｈ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７３に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
（Ｉ）表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７４に記載の配列を含む、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
（Ｊ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異、スパイクＲ６８２Ｖ変異、スパイクＲ８１５Ｎ変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により前記改変スパイクタンパク質が配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
（Ｋ）配列番号９０に記載の改変スパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
（Ｌ）表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
（Ｍ）表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたは前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、または
（Ｎ）１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ
を含み、
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のそれぞれが、
（Ａ）場合により、５’リンカー配列と、
（Ｂ）場合により、３’リンカー配列と
を含む、
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、
（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、
（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセットと
を含む、
前記組成物。 - 抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記抗原発現系が、以下：
（ａ）場合により、１つ以上のベクターであって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、ベクター骨格
を含む、前記１つ以上のベクターと、
（ｂ）存在する場合に前記ベクター骨格に場合により挿入される、抗原カセットであって、以下：
（ｉ）表Ｃに記載の免疫原性ポリペプチド配列をそれぞれがコードする少なくとも１８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、場合により前記免疫原性ポリペプチド配列が、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に連結されている、前記少なくとも１８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、
（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、
（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセットと
を含む、
前記組成物。 - 抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記抗原発現系が、以下：
（ａ）場合により、１つ以上のベクターであって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、ベクター骨格
を含む、前記１つ以上のベクターと、
（ｂ）存在する場合に前記ベクター骨格に場合により挿入される、抗原カセットであって、以下：
（ｉ）表１０に記載の免疫原性ポリペプチド配列をそれぞれがコードする少なくとも１５個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、場合により前記免疫原性ポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に連結されている、前記少なくとも１５個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、
（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、
（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセットと
を含む、
前記組成物。 - 抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、配列番号１１４に記載のヌクレオチド配列を含む、前記組成物。
- 抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が、配列番号９３に記載のヌクレオチド配列を含む、前記組成物。
- 抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記抗原発現系が、以下：
（ａ）１つ以上のベクターであって、
場合によりＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または場合によりベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含む、ベクター骨格であって、以下：
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格
を含む、前記１つ以上のベクターと、
（ｂ）前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されるように前記ベクター骨格内に挿入された抗原カセットであって、以下：
（ｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせ
を含み、かつ
前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、
前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、
（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、
（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセットと
を含む、
前記組成物。 - 前記免疫原性ポリペプチドをコードする前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの１つ以上の順序付けられた配列が、５’から３’方向に、
Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
を含む式で記述され、
式中、Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝０または１であり、
Ｎは、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｃ＝１であり、場合により各Ｎは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、及び／または表１０に記載のポリペプチド配列をコードし、
Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、
Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、
Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、
Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、
Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｆ＝１であり、
Ｘ＝１～４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であり、かつ
Ｙ＝０、１、または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、ユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、場合により前記少なくとも１つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方、またはＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列を含む、
請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。 - 各Ｘについて、対応するＮｃが、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列である、請求項９に記載の組成物。
- 各Ｙについて、対応するＵｆが、異なるＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列である、請求項９または１０に記載の組成物。
- ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝１８、Ｙ＝２であり、
（ｉ）前記ベクター骨格がＣｈＡｄＶ６８ベクターを含み、ａ＝１であり、ＰはＣＭＶプロモーターであり、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が存在し、前記第２のポリ（Ａ）配列は前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列であり、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列を含むか、または（ｉｉ）前記ベクター骨格がベネズエラ馬脳炎ウイルスベクターを含み、ａ＝０であり、前記抗原カセットが内因性２６Ｓプロモーターに機能的に連結され、前記少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列が、前記骨格によって与えられる少なくとも８０個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列（配列番号２７９４０）であり、
各Ｎが、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激することができるエピトープ、またはこれらの組み合わせをコードし、
Ｌ５が、前記エピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、前記５’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さのペプチドをコードし、
Ｌ３が、前記エピトープの天然のＣ末端アミノ酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、前記３’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さのペプチドをコードし、かつ
Ｕが、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれである、
請求項９～１１のいずれか１項に記載の組成物。 - ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１３に記載の組成物。
- 前記ＬＮＰが、イオン化可能なアミノ脂質を含む、請求項１４に記載の組成物。
- 前記イオン化可能なアミノ脂質が、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート）分子を含む、請求項１５に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、前記抗原発現系を封入している、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記抗原カセットが、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれている、請求項１～４、９～１１、または１３～１７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と機能的に連結されている、請求項１～４、９～１１、または１３～１８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記１つ以上のベクターが、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む、請求項１～４、９～１１、または１３～１９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、５’末端の７－メチルグアノシン（ｍ７ｇ）キャップを含む、請求項２０に記載の組成物。
- 前記１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、インビトロ転写によって生成される、請求項２０または２１に記載の組成物。
- 前記１つ以上のベクターが、哺乳動物細胞内で自己複製する、請求項１～４、９～１１、または１３～２２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記骨格が、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～４、９～１１、または１３～２３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～４、９～１１、または１３～２３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む、請求項２４または２５に記載の組成物。
- 前記骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む、請求項２４または２５に記載の組成物。
- 非構造タンパク質媒介増幅のための配列が、アルファウイルス５’ ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、２４ｎｔのＣＳＥ、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス３’ ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６または２７に記載の組成物。
- 前記骨格が構造ビリオンタンパク質カプシドＥ２及びＥ１をコードしていない、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記抗原カセットが、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入されている、請求項２９に記載の組成物。
- 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、配列番号３または配列番号５の配列を含む、請求項２４または２５に記載の組成物。
- 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対７５４４～１１１７５の間の欠失をさらに含む配列番号３または配列番号５の配列を含む、請求項２４または２５に記載の組成物。
- 前記骨格が、配列番号６または配列番号７に記載の配列を含む、請求項３２に記載の組成物。
- 前記抗原カセットが、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４～１１１７５の間の前記欠失を置換するように７５４４位に挿入されている、請求項３２または３３に記載の組成物。
- 前記抗原カセットの挿入が、前記ｎｓＰ１～４遺伝子及び前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、前記ｎｓＰ１～４遺伝子と前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列とが別々のオープンリーディングフレーム内にある、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記骨格によってコードされた天然の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、請求項１～４、９～１１、または１３～３５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記骨格が、チンパンジーアデノウイルスベクターの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、場合により前記チンパンジーアデノウイルスベクターがＣｈＡｄＶ６８ベクターである、請求項１～４、９～１１、または１３～２３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１に記載の配列を含む、請求項３７に記載の組成物。
- 前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が配列から完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている点を除いて、配列番号１に記載の配列を含み、場合により、前記配列は、配列番号１に記載の配列の（１）Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、（２）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、及びＥ３、または（３）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３、及びＥ４が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている、請求項３７に記載の組成物。
- 前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１の配列から得られる遺伝子または調節配列を含み、場合により、前記遺伝子が、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される、請求項３７に記載の組成物。
- 前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、欠失または部分欠失Ｅ４ｏｒｆ２領域及び欠失または部分欠失Ｅ４ｏｒｆ３領域、及び場合により、欠失または部分欠失Ｅ４ｏｒｆ４領域を含む部分欠失Ｅ４遺伝子を含む、請求項３７に記載の組成物。
- 前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含み、かつ（１）配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド５７７～３４０３のＥ１欠失、（２）配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５のＥ３欠失、及び（３）配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２のＥ４欠失をさらに含み、場合により前記抗原カセットが、前記Ｅ１欠失内に挿入されている、請求項３７に記載の組成物。
- 前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号７５に記載の配列を含み、場合により、前記抗原カセットがＥ１欠失内に挿入されている、請求項３７に記載の組成物。
- 前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１に記載の配列の塩基対番号５７７～３４０３の間、または塩基対４５６～３０１４の間に１つ以上の欠失を含み、場合により、前記ベクターが、塩基対２７，１２５～３１，８２５の間、または塩基対２７，８１６～３１，３３３の間に１つ以上の欠失をさらに含む、請求項３７に記載の組成物。
- 前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１に記載の配列の塩基対番号３９５７～１０３４６、塩基対番号２１７８７～２３３７０、及び塩基対番号３３４８６～３６１９３の間に１つ以上の欠失を含む、請求項３７に記載の組成物。
- 前記カセットが、Ｅ１領域、Ｅ３領域、及び／または、前記カセットの組み込みが可能な任意の欠失されたＡｄＶ領域において前記ＣｈＡｄＶ骨格に挿入されている、請求項３７～４５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＣｈＡｄＶ骨格が、第１世代、第２世代、またはヘルパー依存アデノウイルスベクターの１つから生成される、請求項３７～４６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＲＳＶ、ＰＧＫ、ＨＳＡ、ＭＣＫ、及びＥＢＶプロモーター配列からなる群から選択される、請求項３７～４７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、ＣＭＶプロモーター配列である、請求項３７～４７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、外因性のＲＮＡプロモーターである、請求項１～４、９～１１、または１３～４９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列またはＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列である、請求項１～４、９～１１、または１３～５０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列または複数のＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列またはＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列が、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写をもたらす、請求項１～４、９～１１、または１３～５０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記１つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記１つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記１つ以上のベクターが、それぞれ２ｋｂのサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記１つ以上のベクターが、それぞれ５ｋｂ未満のサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つが、ＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つが、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つが、Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部をコードし、場合により、Ｂ細胞応答を刺激することができる前記ポリペプチド配列またはその一部が、完全長タンパク質、タンパク質ドメイン、タンパク質サブユニット、または抗体と結合できることが予測されているかまたは知られている抗原性フラグメントを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が互いに直接連結されている、請求項１～４、９～１１、または１３～５９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つが、リンカーをコードする核酸配列によって異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と連結されている、請求項１～４、９～１１、または１３～６０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記リンカーが、２個のＭＨＣクラスＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩＩ配列と連結する、請求項６１に記載の組成物。
- 前記リンカーが、（１）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したグリシン残基（配列番号２７９４１）、（２）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したアラニン残基（配列番号２７９４２）、（３）２個のアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さのコンセンサス配列、及び（６）起源の同族タンパク質に由来する抗原に隣接しており、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２～２０個の長さの１つ以上の天然配列からなる群から選択される、請求項６２に記載の組成物。
- 前記リンカーが、２個のＭＨＣクラスＩＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩ配列と連結する、請求項６１に記載の組成物。
- 前記リンカーが、配列ＧＰＧＰＧ（配列番号５６）を含む、請求項６４に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つの配列が、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、及び／または免疫原性を高める、分離した、または連続した配列に機能的または直接的に連結されている、請求項１～４、９～１１、または１３～６５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記分離した、または連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列（例えば、７６位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含有するユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも１つを含み、場合によりプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である、請求項６６に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示が可能であることが予測または検証されている２つ以上の異なるポリペプチドをコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のそれぞれが、翻訳後の対応する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の５０％未満、４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４５％未満、４３％未満、４２％未満、４１％未満、４０％未満、３９％未満、３８％未満、３７％未満、３６％未満、３５％未満、３４％未満、または３３％未満であるポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のそれぞれが、翻訳後の対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の機能性タンパク質、機能性タンパク質ドメイン、機能性タンパク質サブユニット、または機能性タンパク質フラグメントをコードしていないポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの２つ以上が、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子に由来する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子に由来する２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子内で第１の核酸配列に第２の核酸配列が続く場合に第１の核酸配列に第２の核酸配列が直接続くことも、連結されることもできないように順序付けられる、請求項７１に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の核酸配列を含む、請求項１～４、９～１１、または１３～７２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の核酸配列を含む、請求項１～４、９～１１、または１３～７２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が少なくとも２～４００個の核酸配列を含み、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも２個が、（１）ＭＨＣクラスＩによって提示される、（２）ＭＨＣクラスＩＩによって提示される、及び／または（３）Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項１～４、９～１１、または１３～７２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも２個が、（１）ＭＨＣクラスＩによって提示される、（２）ＭＨＣクラスＩＩによって提示される、及び／または（３）Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項５または１２に記載の組成物。
- 前記対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされた抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上の前記抗原の少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらす、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされた抗原のうちの少なくとも１つが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス上の前記抗原の少なくとも１つを標的とする抗体応答をもたらす、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上の前記抗原の少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらし、場合により、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって誘導される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 各ＭＨＣクラスＩエピトープコードＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、アミノ酸８～３５個の長さ、場合により、アミノ酸９～１７、９～２５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個の長さのポリペプチド配列をコードする、請求項１～４、９～１１、または１３～７９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在している、請求項１～４、９～１１、または１３～８０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、存在し、かつ少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含む、請求項１～４、９～１１、または１３～８０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、アミノ酸１２～２０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０～４０個の長さである、請求項１～４、９～１１、または１３～８２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、存在し、かつ少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、場合により、前記少なくとも１つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方、及び／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来エピトープコード核酸配列を含む、請求項１～４、９～１１、または１３～８３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、請求項１～４、９～１１、または１３～８４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、請求項１～４、９～１１、または１３～８４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記骨格に天然に存在するポリ（Ａ）配列を含む、請求項１～４、９～１１、または１３～８６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記骨格に外因性のポリ（Ａ）配列を含む、請求項１～４、９～１１、または１３～８６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つと機能的に連結されている、請求項１～４、９～１１、または１３～８８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、または少なくとも９０個の連続したＡヌクレオチド（配列番号２７９４３）である、請求項１～４、９～１１、または１３～８９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも８０個の連続したＡヌクレオチド（配列番号２７９４０）である、請求項１～４、９～１１、または１３～８９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が存在する、請求項１～４、９～１１、または１３～９１のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列、または２つ以上のＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の組み合わせを含む、請求項９２に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が、２つ以上の第２のポリ（Ａ）配列を含み、場合により前記２つ以上の第２のポリ（Ａ）配列が、２つ以上のＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、２つ以上のＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列、またはＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列とＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列との組み合わせを含む、請求項９２に記載の組成物。
- 前記抗原カセットが、イントロン配列、外因性イントロン配列、恒常的輸送エレメント（ＣＴＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フーリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された、ｍＲＮＡの核輸送、安定性、もしくは翻訳効率を向上させることが知られている５’もしくは３’末端の非コード領域内の配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される、請求項９６に記載の組成物。
- 前記１つ以上のベクターが、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項９８に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性抗体もしくは互いに連結された多重特異性抗体としての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、柔軟なリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である、請求項９９に記載の組成物。
- 前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが、２ＡまたはＩＲＥＳなどの自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが、連続したグリシン残基などの柔軟なリンカーによって連結されている、請求項９９または１００に記載の組成物。
- 前記免疫調節物質がサイトカインである、請求項９８に記載の組成物。
- 前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１、またはそれぞれのそのバリアントのうちの少なくとも１つである、請求項１０２に記載の組成物。
- ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープコードＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、
（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程と、
（ｂ）各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力することにより、前記抗原のそれぞれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記数値的尤度のセットを生成する工程と、
（ｃ）前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択することにより、前記ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープコードＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成する工程と
を行うことによって選択される、請求項１～４、９～１１、または１３～１０３のいずれか１項に記載の組成物。 - 各ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープコードＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、
（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程と、
（ｂ）各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力することにより、前記抗原のそれぞれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記数値的尤度のセットを生成する工程と、
（ｃ）前記抗原のセットのサブセットを前記数値的尤度のセットに基づいて選択することにより、前記少なくとも１８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成する工程と
を行うことによって選択される、請求項５または１２に記載の組成物。 - 前記選択された抗原のセットの数が、２～２０である、請求項１０４に記載の組成物。
- 前記提示モデルが、
（ａ）前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
（ｂ）前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの前記特定の１つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上での提示の尤度と
の間の依存性を表す、請求項１０４～１０６のいずれか１項に記載の組成物。 - 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞表面上に提示される尤度が増大している抗原を選択することを含み、場合により、前記選択された抗原が、１つ以上の特異的ＭＨＣアレルによって提示されているものとして検証されている、請求項１０４～１０７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している抗原を選択することを含む、請求項１０４～１０８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している抗原を選択することを含み、場合により、前記ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である、請求項１０４～１０９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している抗原を選択することを含む、請求項１０４～１１０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原に比べて、前記対象における正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している抗原を選択することを含む、請求項１０４～１１１のいずれか１項に記載の組成物。
- エクソームまたはトランスクリプトームのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチドシークエンシングデータが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染組織もしくは細胞でシークエンシングを行うことによって取得される、請求項１０４～１１２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記シークエンシングが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の超並列シークエンシングアプローチである、請求項１１３に記載の組成物。
- 前記抗原カセットが、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 少なくとも１つの、または各ジャンクションエピトープ配列が、ＭＨＣに対して５００ｎＭよりも高い親和性を有する、請求項１１５に記載の組成物。
- 各ジャンクションエピトープ配列が、非自己である、請求項１１５または１１６に記載の組成物。
- 前記抗原カセットが、１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープを含み、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩエピトープのそれぞれが、集団の少なくとも５％に存在する少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示が可能であることが予測または検証されている、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩエピトープのそれぞれが、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアが、集団において少なくとも０．０１％の抗原／ＨＬＡ頻度を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩエピトープのそれぞれが、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアが、集団において少なくとも０．１％の抗原／ＨＬＡ頻度を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記非治療的な予測されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列が、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列である、請求項１２２に記載の組成物。
- 前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである、請求項１１５～１２３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記抗原カセット内における前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列の順序が、
（ａ）前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列の異なる順序に対応した候補抗原カセット配列のセットを生成する工程と、
（ｂ）前記各候補抗原カセット配列について、前記候補抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程と、
（ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、抗原ワクチン用の抗原カセット配列として選択する工程と
を含む一連の工程によって決定される、請求項１１５～１２４のいずれか１項に記載の組成物。 - 先行請求項のいずれか１項に記載の前記組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項１２６に記載の組成物。
- 免疫調節物質をさらに含む、請求項１２６または１２７に記載の医薬組成物。
- 前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項１２８に記載の医薬組成物。
- 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の抗原カセットと、配列番号３または配列番号５の配列から得られる１つ以上の因子とを含む、単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、場合により、前記１つ以上の因子が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列、ポリ（Ａ）配列、及び配列番号３または配列番号５に記載の配列のｎｓＰ１～４遺伝子からなる群から選択され、場合により、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセット。
- 前記配列または単離ヌクレオチド配列のセットが、配列番号６または配列番号７に記載の配列の７５４４位に挿入された先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の抗原カセットを含む、請求項１３０に記載の単離ヌクレオチド配列。
- 配列番号３または配列番号５の配列から得られた前記１つ以上の因子の５’側に位置するＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、
場合により、前記ポリ（Ａ）配列の３’側に位置する１つ以上の制限部位と
をさらに含む、請求項１３０または１３１に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の抗原カセットが、配列番号８または配列番号９の７５６３位に挿入されている、請求項１３０に記載の単離ヌクレオチド配列。
- 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の抗原カセットと、配列番号１または配列番号７５の配列から得られる１つ以上の因子とを含む、単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、場合により、前記１つ以上の因子が、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択され、場合により、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセット。
- 前記配列または単離ヌクレオチド配列のセットが、配列番号７５に記載の配列の前記Ｅ１欠失内に挿入された先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の抗原カセットを含む、請求項１３４に記載の単離ヌクレオチド配列。
- 配列番号１または配列番号７５の配列から得られた前記１つ以上の因子の５’側に位置するＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、
場合により、前記ポリ（Ａ）配列の３’側に位置する１つ以上の制限部位と
をさらに含む、請求項１３４または１３５に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 請求項１３０～１３６に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクターまたはベクターのセット。
- 請求項１３０～１３７に記載のヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットを含む、単離細胞であって、場合により、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａ細胞である、前記単離細胞。
- 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
- 対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するかまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１２６～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、対象が感染した、または感染のリスクがあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプによってコードされたポリペプチドに対応する少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする、請求項１４０に記載の方法。
- 対象における免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１２６～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記対象が、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、請求項１４０～１４２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記ＭＨＣクラスＩエピトープが、表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープを含む、請求項１４０～１４２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープが、表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項１４０～１４２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組成物が、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与される、請求項１４０～１４５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組成物が筋肉内投与される、請求項１４０～１４５のいずれか１項に記載の方法。
- １つ以上の免疫調節物質を投与することをさらに含み、場合により、前記免疫調節物質が前記組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、請求項１４０～１４７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上の免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１４８に記載の方法。
- 前記免疫調節物質が、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）投与される、請求項１４８または１４９に記載の方法。
- 前記皮下投与が、前記組成物もしくは医薬組成物の投与部位の近くに、または１つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、請求項１５０に記載の方法。
- 前記対象に第２のワクチン組成物を投与することをさらに含む、請求項１４０～１５１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第２のワクチン組成物が、請求項１４０～１５１のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物の投与の前に投与される、請求項１５２に記載の方法。
- 前記第２のワクチン組成物が、請求項１４０～１５１のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物の投与の後に投与される、請求項１５２に記載の方法。
- 前記第２のワクチン組成物が、請求項１４０～１５１のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物と同じである、請求項１５３または１５４に記載の方法。
- 前記第２のワクチン組成物が、請求項１４０～１５１のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物と異なる、請求項１５３または１５４に記載の方法。
- 前記第２のワクチン組成物が、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む、請求項１５６に記載の方法。
- 前記チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と同じである、請求項１５７に記載の方法。
- 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の１つ以上のベクターを製造する方法であって、
（ａ）前記骨格及び前記抗原カセットを含む直線化ＤＮＡ配列を得る工程と、
（ｂ）前記直線化ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写するために必要なすべての成分を含んだインビトロ転写反応に、前記直線化ＤＮＡ配列を加えることにより、前記直線化ＤＮＡ配列をインビトロ転写する工程であって、場合により、得られたＲＮＡに前記ｍ７ｇキャップをインビトロで付加することをさらに含む、インビトロ転写する工程と、
（ｃ）前記インビトロ転写反応から前記１つ以上のベクターを単離する工程と
を含む、前記方法。 - 前記直線化ＤＮＡ配列が、ＤＮＡプラスミド配列を直線化することにより、またはＰＣＲを用いた増幅により生成される、請求項１５９に記載の製造方法。
- 前記プラスミド配列が、細菌組換えまたは全ゲノムＤＮＡ合成または細菌細胞内での合成されたＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成のうちの１つを用いて生成される、請求項１６０に記載の製造方法。
- 前記インビトロ転写反応から前記１つ以上のベクターを単離する工程が、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムベースの精製、または同様のＲＮＡ精製法のうちの１つ以上を含む、請求項１５９に記載の製造方法。
- 前記抗原発現系を送達するための先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法であって、
（ａ）ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を与える工程と、
（ｂ）前記抗原発現系を与える工程と、
（ｃ）前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記抗原発現系が前記抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに十分な条件を与える工程と
を含む、前記方法。 - 前記条件がマイクロ流体混合によって与えられる、請求項１６３に記載の製造方法。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクがあるかまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を評価する方法であって、
（ａ）以下：
１）前記対象が、抗原ベースワクチンに含まれる抗原を提示することが予測されているかまたは知られているＨＬＡアレルを有するか否か
を判定するかまたは既にそれが判定されている工程と、
（ｂ）前記（ａ）の結果から、以下：
前記対象が前記ＨＬＡアレルを発現している場合に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補となること
を判定するかまたは既にそれが判定されている工程と、
（ｃ）場合により、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既にそれが投与されている工程と
を含み、
前記抗原ベースワクチンが、
１）少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチド、または
２）前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列
を含み、
場合により前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示される配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせ
を含み、かつ
前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、
前記方法。 - 前記工程（ａ）及び／または（ｂ）が、前記対象からの試料の処理を行ったサードパーティーからデータセットを得ることを含む、請求項１６５に記載の方法。
- 前記工程（ａ）が、前記対象から試料を得ることと、前記試料を、エクソームシークエンシング、標的化エクソームシークエンシング、トランスクリプトームシークエンシング、サンガーシークエンシング、ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイ、質量分析に基づく方法、マイクロアレイ、ナノストリング、ＩＳＨ、及びＩＨＣからなる群から選択される方法を用いてアッセイすることとを含む、請求項１６５に記載の方法。
- 前記試料が、感染試料、正常組織試料、または前記感染試料と前記正常組織試料を含む、請求項１６６または１６７に記載の方法。
- 前記試料が、組織、体液、血液、脊髄液、及び穿刺吸引液から選択される、請求項１６８に記載の方法。
- 前記ＨＬＡアレルが、少なくとも５％のＨＬＡ頻度を有する、請求項１６５～１６９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドまたは前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされた前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドが、前記対象の細胞上のＨＬＡアレルによって提示されるＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項１６５～１７０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記抗原ベースワクチンが、抗原発現系を含む、請求項１６５～１７１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記抗原発現系が、請求項１～１２５のいずれか１項に記載の前記抗原発現系のいずれか１つを含む、請求項１７２に記載の方法。
- 前記抗原ベースワクチンが、請求項１２６～１２９のいずれか１項に記載の前記医薬組成物のいずれか１つを含む、請求項１６５～１７１のいずれか１項に記載の方法。
- 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、
前記抗原ベースワクチンが、
１）少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチド、または
２）前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列
を含み、
前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせ
を含み、かつ
前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、
前記方法。 - 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、
前記抗原ベースワクチンが、
（１）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個、またはそれ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチド、または
（２）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個、またはそれ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列
を含み、
前記免疫原性ポリペプチドが、
（Ａ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号６６または配列番号６７に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
（Ｂ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び表Ｃに記載のポリペプチド配列番号を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープが、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在し、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が配列番号６８に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
（Ｃ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が配列番号６９、配列番号７９、配列番号８３，配列番号８５、または配列番号８７に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
（Ｄ）表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープが、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在し、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号６４または配列番号６５に記載の配列を含む、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
（Ｅ）配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異、スパイクＲ６８２Ｖ変異、スパイクＲ８１５Ｎ変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により前記改変スパイクタンパク質が、配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含み、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７０または配列番号８９に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
（Ｆ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７１に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
（Ｇ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７２に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
（Ｈ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７３に記載の配列を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
（Ｉ）表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質であって、場合により前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、配列番号７４に記載の配列を含む、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
（Ｊ）配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異、スパイクＲ６８２Ｖ変異、スパイクＲ８１５Ｎ変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により前記改変スパイクタンパク質が配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
（Ｋ）配列番号９０に記載の改変スパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質及び前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
（Ｌ）表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
（Ｍ）表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたは前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、または
（Ｎ）１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ
を含む、
前記方法。 - 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、
前記抗原ベースワクチンが、以下：
（ａ）１つ以上のベクターであって、
場合によりＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または場合によりベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含む、ベクター骨格であって、以下：
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格
を含む、前記１つ以上のベクターと、
（ｂ）前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されるように前記ベクター骨格内に挿入された抗原カセットであって、以下：
（ｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列であって、前記免疫原性ポリペプチドが、
－表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープであって、場合により、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、
－表１０に記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に存在する、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメントであって、場合により前記少なくとも１つのポリペプチド配列が、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列のそれぞれを含む連結されたポリペプチド内に存在し、場合により前記連結されたポリペプチドが、表１２Ａ、表１２Ｂ、または表１２Ｃに記載の配列の順序を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド配列、またはそのエピトープ含有フラグメント、
－表Ａ及び／または表Ｃに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または表Ｂに記載のポリペプチド配列を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープであって、前記コードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫原性ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種との間で保存され、場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス種及び／または亜種が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び／または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープ、
－１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープであって、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％が、前記１つ以上の検証済みエピトープのうちの少なくとも１つを提示することが検証されている少なくとも１つのＨＬＡ及び／または前記少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープのそれぞれを提示することが予測されている少なくとも１つのＨＬＡを保有している、前記１つ以上の検証済みエピトープ及び／または少なくとも４、５、６、または７個の予測されたエピトープ、
－配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であって、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号５９を基準としてＤ６１４Ｇ変異を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示される配列によりコードされる、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、
－配列番号５９に記載の前記スパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＲ６８２変異、スパイクＲ８１５変異、スパイクＫ９８６Ｐ変異、スパイクＶ９８７Ｐ変異、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質であって、場合により配列番号６０または配列番号９０に記載のポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２改変スパイクタンパク質、
－配列番号６１に記載の膜ポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質、
－配列番号６２に記載のヌクレオカプシドポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、
－配列番号６３に記載のエンベロープポリペプチド配列またはそのエピトープ含有フラグメントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプの１％以上にみられる変異を含む上記のいずれかのバリアントであって、場合により、前記バリアントは、表１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含み、及び／または場合により、前記バリアントは、配列番号５９に記載のスパイクポリペプチド配列を基準としてスパイクＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、場合により配列番号１１２に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質、または場合により配列番号１１０に記載のスパイクポリペプチド配列を含むＢ．１．１．７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アイソレートに相当するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントスパイクタンパク質を含み、場合により前記スパイクポリペプチドが、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、または配列番号８７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、前記バリアント、
－または、これらの組み合わせ
を含み、かつ
前記免疫原性ポリペプチドが、場合によりＮ末端リンカー及び／またはＣ末端リンカーを含む、
前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列と、
（ｉｉ）場合により、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列と、
（ｉｖ）場合により、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）場合により、天然のポリ（Ａ）配列または前記ベクター骨格に外因性のポリ（Ａ）配列である少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、場合により前記外因性のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセットと
を含む、
前記方法。 - 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、
前記抗原ベースワクチンが、
１）少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチド、または
２）前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列
を含み、
前記免疫原性ポリペプチドが、表１０に記載の免疫原性ポリペプチド配列をそれぞれがコードする少なくとも１５個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含み、場合により前記免疫原性ポリペプチド配列が、配列番号９２に記載の連結されたポリペプチド配列内に連結されている、
前記方法。 - 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、
前記抗原ベースワクチンが配列番号１１４に記載のヌクレオチド配列を含む、
前記方法。 - 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、
前記抗原ベースワクチンが配列番号９３に記載のヌクレオチド配列を含む、
前記方法。 - 対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するか、及び／または免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に抗原ベースワクチンを投与することを含み、
前記抗原ベースワクチンが、
１）少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチド、または
２）前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来免疫原性ポリペプチドをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列
を含み、
前記免疫原性ポリペプチドが、表Ｃに記載の免疫原性ポリペプチド配列をそれぞれがコードする少なくとも１８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列を含み、場合により前記免疫原性ポリペプチド配列が、配列番号５７または配列番号５８に記載の連結されたポリペプチド配列内に連結されている、
前記方法。 - 前記抗原ベースワクチンが、抗原発現系を含む、請求項１７５～１８１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記抗原発現系が、請求項１～１２５のいずれか１項に記載の前記抗原発現系のいずれか１つを含む、請求項１８２に記載の方法。
- 前記抗原ベースワクチンが、請求項１２６～１２９のいずれか１項に記載の前記医薬組成物のいずれか１つを含む、請求項１７５～１８１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、請求項１７５～１８４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記ＭＨＣクラスＩエピトープが、表Ａに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープを含む、請求項１７５～１８４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、前記少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列によってコードされたＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されているかまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープが、表Ｂに記載のポリペプチド配列を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項１７５～１８４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来核酸配列が、前記対象が感染した、または感染のリスクがあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブタイプによってコードされたポリペプチドに対応する少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする、請求項１７５～１８７のいずれか１項に記載の方法。
- 同種プライミング／ブースター戦略を含む、請求項１７５～１８８のいずれか１項に記載の方法。
- 異種プライミング／ブースター戦略を含み、
場合により前記異種プライミング／ブースター戦略が、（ａ）異なるワクチンプラットフォームによってコードされた同一の抗原カセット、（ｂ）同じワクチンプラットフォームによってコードされた異なる抗原カセット、及び／または（ｃ）異なるワクチンプラットフォームによってコードされた異なる抗原カセットを含む、
請求項１７５～１８８のいずれか１項に記載の方法。 - 前記異なる抗原カセットが、スパイクコードカセット及び別のＴ細胞エピトープコードカセットを含む、請求項１９０に記載の方法。
- 前記異なる抗原カセットが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なるアイソレートに由来する異なるエピトープ及び／または抗原をコードするカセットを含む、請求項１９０に記載の方法。
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