CN111727262A - 胞啃介导的表位发现 - Google Patents

Abstract

本文公开了基于胞啃(trogocytosis)的TCR配体发现平台及其使用方法、基于胞啃的TCR发现平台及其使用方法、以及基于胞啃的配体发现平台及其使用方法。本文还公开了使用基于胞啃的发现平台产生的分离的细胞、核苷酸、序列和序列数据库。

Description

胞啃介导的表位发现

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年7月25日提交的美国临时申请第62/536,828号的权益，在此通过引用将该申请以其整体并入用于所有目的。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明根据国立卫生研究院(the National Institute of Health)授予的批准第CA199090号在政府支持下完成。政府在本发明中拥有某些权利。

序列表

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背景

T细胞通过与靶细胞的直接、抗原特异性接触来介导适应性免疫。每种T细胞的抗原特异性由其独特的T细胞受体(TCR)决定¹，所述T细胞受体(TCR)结合呈递在靶细胞或抗原呈递细胞(APC)表面的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白分子上的关联(cognate)肽配体(表位)。通常，识别自身MHC上的自身配体的初生(nascent)T细胞在胸腺阴性选择期间被消除，从而产生成熟T细胞库(repertoire)，所述成熟T细胞具有结合被呈递在受感染的细胞上的外来配体、被呈递在癌细胞上的突变的自身配体(新表位)、或被呈递在APC上的多种来源的配体的能力。以此方式，TCR抗原特异性指导T细胞帮助B细胞产生抗体并使抗体成熟，以活化固有效应物、维持对自身的免疫耐受性以及直接杀死受感染的细胞和癌细胞，它们全都以准确靶向的方式进行。TCR配体发现可用于表征对病原体和肿瘤的适应性免疫应答以及对自身和饮食抗原的不适当应答^2,3。该知识还使得能够进行临床上有益的免疫疗法(例如TCR基因转移和疫苗)，其启动、增强或减弱对靶抗原的免疫应答^4,5。例如，呈递外来或突变的自身肽配体的受感染的或癌性靶细胞可以被表达识别所呈递的表位的TCR的细胞毒性T细胞杀死。因此，TCR配体发现是用于阐明抗肿瘤免疫的靶点和设计靶向免疫疗法的有价值的步骤。

对稳健、高通量、无偏倚的TCR配体发现技术存在尚未满足的需求。肽-MHC(pMHC)多聚体技术使得能够监测T细胞介导的对所选择的抗原组的应答⁶，但通常局限于用于针对与免疫应答相关的先前表征过的抗原靶的偏倚筛选。目前，使用pMHC多聚体的筛选不具无偏倚抗体配体发现平台的规模⁷。在癌症的情况下，由肿瘤特异性突变引起的肿瘤新抗原(neoantigen)可以通过外显子组测序来发现，并且然后用于使用肽-MHC多聚体或新抗原转导的抗原呈递细胞来询问T细胞^8,9。然而，肿瘤外显子组测序未解决其他较少聚焦于突变表位的免疫应答(例如病原体特异性免疫、自身免疫)。

用预选抗原询问T细胞应答的一种替代选择是鉴定介导该应答的TCR，并且然后使用这些TCR来询问抗原文库。介导感兴趣的免疫应答的TCR可以通过对T细胞进行深度测序来鉴定，所述T细胞在表型上牵连在该应答中^10,11或在该应答部位处的克隆T细胞中富集(例如肿瘤反应性TCR在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中处于高频率)^12,13。例如，最近的一项研究描述了一种无偏倚的TCR-配体发现方法，该方法使用源自孤儿(orphan)TCR胞外域的可溶性荧光标记试剂来筛选酵母细胞表面展示的pMHC文库¹⁴。然而，该方法需要针对待测试的每种MHC等位基因和每种配体长度构建、验证和筛选单独的酵母文库(通常没有待测试的TCR的MHC限制的知识)，以及产生可溶性TCR胞外域。

胞啃(trogocytosis)(来自希腊语：trogo-，啃咬)是一种生物学现象，通过这种现象，细胞在接合时共享膜和膜相关蛋白¹⁵。尚未报道通过与T细胞结合的靶细胞来提取T细胞膜蛋白。因此，在本领域中，使用胞啃进行抗原发现或配对的抗原与TCR发现未被描述。

将T细胞的抗原特异性与TCR基因配对提供了信息且是有用的。例如，T细胞亚群识别的抗原的知识可以指导疗法的设计。同样，TCR基因的知识可以指导基于工程化细胞的疗法的设计。因此，在单细胞水平上筛选分析TCR抗原特异性的能力仍然是本领域中的重要需求。然而，本领域中缺乏较为类似于无偏倚筛选方法(诸如抗体配体筛选中使用的方法)的用于抗原特异性T细胞配对的方法。因此，本领域中需要用于TCR抗原鉴定和用于抗原特异性T细胞配对的改进的筛选平台和方法。

概述

本发明人已经发现了基于胞啃的系统，该系统可以鉴定结合分子的配体，诸如被TCR识别的抗原肽。基于胞啃的系统也可以鉴定抗原特异性结合分子，诸如抗原特异性TCR。基于胞啃的系统是可扩展且可定制的，以用于不同的筛选应用。因此，本文描述的基于胞啃的系统解决了抗原发现领域，特别是抗原特异性T细胞配对领域中的若干突出问题。

相应地，本文公开了抗原鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供一种或更多种表达抗原特异性T细胞受体(TCR)的细胞群体；b)提供一种或更多种靶细胞群体，其中靶细胞群体将一种或更多种抗原肽呈递在一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上；c)使一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体与一种或更多种靶细胞群体接触，其中接触包括提供足以用于一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体中的至少一种特异性结合一种或更多种靶细胞群体中的至少一种的条件，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在至少一种表达抗原特异性TCR的细胞与至少一种靶细胞之间转移；d)分离或已经分离i)感兴趣的靶细胞，其中感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从至少一种表达抗原特异性TCR的细胞转移的一种或更多种膜组分，以及任选地ii)感兴趣的表达TCR的细胞，其中感兴趣的表达TCR的细胞包含在接触步骤(c)之后从至少一种靶细胞转移的一种或更多种膜组分；并且e)确定或已经确定i)与感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列，ii)与感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分，或iii)与感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列以及与感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分。

本文还公开了抗原鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供表达抗原特异性TCR的抗原特异性T细胞群体；b)提供多于一种靶细胞群体，其中靶细胞群体将抗原肽呈递在主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上；c)使抗原特异性T细胞群体与多于一种靶细胞群体接触，其中接触包括提供足以用于抗原特异性T细胞群体特异性结合多于一种靶细胞群体中的至少一种的条件，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在抗原特异性T细胞与至少一种靶细胞之间转移；d)分离或已经分离i)感兴趣的靶细胞，其中感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从表达抗原特异性TCR的细胞转移的一种或更多种膜组分；以及e)确定或已经确定与感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列，其中确定步骤(e)包括从感兴趣的靶细胞纯化一种或更多种多核苷酸或已经从感兴趣的靶细胞纯化一种或更多种多核苷酸，并且对纯化的多核苷酸或使用纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸进行测序或已经对纯化的多核苷酸或使用纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸进行测序。

本文还公开了抗原特异性TCR鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体；b)提供一种或更多种靶细胞群体，其中靶细胞群体将一种或更多种抗原肽呈递在一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上；c)使一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体与一种或更多种靶细胞群体接触，其中一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体中的至少一种特异性结合一种或更多种靶细胞群体中的至少一种，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在至少一种表达抗原特异性TCR的细胞与至少一种靶细胞之间转移；d)分离或已经分离i)感兴趣的表达TCR的细胞，其中感兴趣的表达TCR的细胞包含在接触步骤(c)之后从至少一种靶细胞转移的一种或更多种膜组分，或者其中感兴趣的表达TCR的细胞显示出在接触步骤(c)之后从至少一种表达抗原特异性TCR的细胞转移的一种或更多种膜组分的丢失，以及任选地ii)感兴趣的靶细胞，其中感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从至少一种表达抗原特异性TCR的细胞转移的一种或更多种膜组分；并且e)确定或已经确定i)与感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列，ii)编码与感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分，或iii)与感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列以及编码与感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分。

在一些方面，一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体包括永生化细胞系。在一些方面，一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体包括一种或更多种抗原特异性T细胞群体。在一些方面，一种或更多种抗原特异性T细胞群体选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞(CTL)群体、CD8+T细胞群体、CD4+T细胞群体、原代T细胞群体、离体培养的T细胞群体、肿瘤浸润性T细胞群体、自身免疫性T细胞群体、病原体特异性T细胞群体、调节性T细胞群体、耗竭性T细胞(exhausted T cell)、记忆T细胞群体，自然杀伤T细胞群体、γ-δ(γδ)T细胞群体、工程化T细胞群体、永生化T细胞系及其组合。在一些方面，一种或更多种抗原特异性T细胞群体中的至少一种从受试者分离。在一些方面，受试者已知患有癌症或被怀疑患有癌症。

在一些方面，一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体中的至少一种是人类细胞。

在一些方面，一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体中的至少一种包含一种或更多种外源性TCR，任选地其中一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体不表达内源性TCR。在一些方面，一种或更多种外源性TCR由一种或更多种TCR多核苷酸序列编码，其中一种或更多种TCR多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。在一些方面，一种或更多种外源性TCR包括TCRα链和TCRβ链。在一些方面，一种或更多种外源性TCR包括TCRγ链和TCRδ链。在一些方面，外源性TCR的链在同一TCR多核苷酸序列上编码。在一些方面，一种或更多种TCR多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。在一些方面，病毒载体被整合到一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体的基因组中。在一些方面，一种或更多种外源性TCR在肿瘤样品中被鉴定或已经在肿瘤样品中被鉴定出。在一些方面，一种或更多种外源性TCR基于在肿瘤样品中的频率来选择。在一些方面，一种或更多种外源性TCR基于表达一种或更多种外源性TCR的细胞的表型来选择。在一些方面，表型选自由以下组成的组：PD-1阳性、CD39阳性、CD137阳性及其组合。

在一些方面，一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体包含TCR共受体。在一些方面，TCR共受体选自由以下组成的组：CD3、CD4、CD8或其组合。在一些方面，TCR共受体是CD3。在一些方面，TCR共受体是外源性TCR共受体，任选地，其中一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体不表达内源性TCR共受体。在一些方面，外源性TCR共受体由TCR共受体多核苷酸序列编码，其中共受体多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。在一些方面，TCR共受体多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。在一些方面，病毒载体被整合到一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体的基因组中。

在一些方面，一种或更多种靶细胞群体包括永生化细胞系。在一些方面，永生化细胞系是K562细胞系。在一些方面，一种或更多种靶细胞群体包括专职性(professional)抗原呈递细胞(APC)群体。在一些方面，专职性APC群体选自由以下组成的组：树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。

在一些方面，一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括外源性MHC等位基因，任选地，其中一种或更多种靶细胞群体不表达内源性MHC等位基因。在一些方面，外源性MHC等位基因由一种或更多种MHC多核苷酸序列编码，其中一种或更多种MHC多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。在一些方面，一种或更多种MHC多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。在一些方面，病毒载体被整合到一种或更多种靶细胞群体的基因组中。

在一些方面，一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括哺乳动物MHC等位基因。在一些方面，哺乳动物MHC等位基因包括人类MHC等位基因。

在一些方面，一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括MHC I类分子。在一些方面，MHC I类分子选自由以下组成的组：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些方面，一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括MHC II类分子。在一些方面，MHC II类分子包括并且MHC分子选自由以下组成的组：HLA-DQ和HLA-DR。

在一些方面，一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括单链三聚体(singlechain trimer；SCT)。

在一些方面，一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括受试者的MHC等位基因。在一些方面，受试者已知患有癌症或被怀疑患有癌症。

在一些方面，一种或更多种抗原肽中的至少一种选自由以下组成的组：肿瘤相关表位、新表位(neoepitope)、肿瘤新表位、病毒表位、磷酸化表位(phospho-epitope)、细菌表位、微生物表位、组织特异性自身表位、自身表位及其组合。在一些方面，一种或更多种抗原肽包括新表位。在一些方面，新表位通过分析来自受试者的肿瘤、病毒或细菌测序数据以鉴定一种或更多种体细胞突变来选择。在一些方面，受试者已知患有癌症或怀疑患有癌症。在一些方面，分析使用计算机(in silico)预测算法来进行。在一些方面，预测算法包括预测新抗原与受试者的MHC等位基因之间的结合的MHC结合算法。在一些方面，一种或更多种MHC等位基因中的至少一种是受试者的MHC等位基因。

在一些方面，一种或更多种抗原肽中的每一种包括源自健康样品的抗原肽。

在一些方面，一种或更多种抗原肽中的至少一种被呈递在MHC I类分子上。在一些方面，被呈递在MHC I类分子上的一种或更多种抗原肽中的至少一种的长度为7-15个、7-10个、8-9个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。在一些方面，被呈递在MHCI类分子上的一种或更多种抗原肽中的至少一种的长度为8-10个之间的氨基酸。

在一些方面，一种或更多种抗原肽中的至少一种被呈递在MHC II类分子上。在一些方面，被呈递在MHC II类分子上的一种或更多种抗原肽中的至少一种的长度为11-30个、14-20个、15-18个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸。在一些方面，被呈递在MHC II类分子上的一种或更多种抗原肽中的至少一种的长度为10与35个之间、10与30个之间、10与25个之间、或10与20个之间的氨基酸。

在一些方面，一种或更多种抗原肽中的至少一种包括外源性抗原肽。在一些方面，外源性抗原肽由抗原多核苷酸序列编码，其中抗原多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。在一些方面，抗原多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。在一些方面，病毒载体被整合到一种或更多种靶细胞群体的基因组中。

在一些方面，一种或更多种抗原肽中的至少一种源自未加工的肽序列，其中未加工的肽序列包含一种或更多种抗原肽中的至少一种。在一些方面，未加工的肽序列被靶细胞加工，以产生一种或更多种抗原肽中的至少一种。在一些方面，未加工的肽序列被靶向至蛋白酶体。在一些方面，靶细胞被工程化以增强加工或被刺激以增强加工。在一些方面，未加工的肽序列由未加工的抗原多核苷酸序列编码，其中未加工的抗原多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。在一些方面，未加工的抗原多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。在一些方面，病毒载体被整合到一种或更多种靶细胞群体的基因组中。

在一些方面，接触包括旋转、颠倒、涡旋、振荡、孵育、吸移、混合或其组合。在一些方面，接触在容器中进行。在一些方面，容器选自由以下组成的组：多孔板、组织培养处理的板、组织培养处理的多孔板、细颈瓶、组织培养处理的细颈瓶、微量离心管、培养管、试管、圆底管和锥形管。

在一些方面，一种或更多种膜组分中的至少一种包括表达抗原特异性TCR的细胞膜组分。在一些方面，表达抗原特异性TCR的细胞膜组分选自由以下组成的组：TCR；TCR共受体(co-receptor)、CD3 TCR共受体、CD4 TCR共受体和CD8 TCR共受体。在一些方面，一种或更多种膜组分中的至少一种包括靶细胞膜组分。在一些方面，靶细胞膜组分包括MHC等位基因。

在一些方面，一种或更多种膜组分中的至少一种包括外源性膜组分。在一些方面，外源性膜组分选自由以下组成的组：跨膜蛋白、膜相关蛋白、表面受体、荧光分子、细胞表面蛋白、糖和脂质。

在一些方面，一种或更多种膜组分中的至少一种包括标记的膜组分。在一些方面，标记的膜组分包含生物素标记物、荧光标记物或反应性基团。

在一些方面，分离包括将包含一种或更多种转移的膜组分的感兴趣的靶细胞或感兴趣的表达TCR的细胞与不包含一种或更多种转移的膜组分的靶细胞或表达TCR的细胞分离。

在一些方面，分离包括磁性分离。在一些方面，磁性分离包括用磁体将感兴趣的靶细胞或感兴趣的表达TCR的细胞捕获到壁上，并且去除未被捕获到壁上的成分(element)。

在一些方面，分离步骤包括使用微流体装置。在一些方面，微流体装置包括流式细胞仪。在一些方面，分离步骤包括荧光激活细胞分选(FACS)。

在一些方面，分离包括鉴定一种或更多种膜组分。在一些方面，鉴定包括使感兴趣的靶细胞或感兴趣的表达TCR的细胞与标记试剂接触。在一些方面，标记试剂选自由以下组成的组：抗体、包含反应性基团的试剂和脂质反应性试剂。在一些方面，标记试剂与可检测标志物缀合。在一些方面，可检测标志物是荧光团。

在一些方面，确定步骤(e)包括从感兴趣的靶细胞或感兴趣的表达TCR的细胞纯化一种或更多种多核苷酸或已经从感兴趣的靶细胞或感兴趣的表达TCR的细胞纯化一种或更多种多核苷酸。在一些方面，纯化的多核苷酸选自由以下组成的组：基因组DNA、载体DNA、质粒DNA、mRNA、通过PCR扩增的DNA和通过逆转录产生的cDNA。在一些方面，纯化或已经纯化一种或更多种多核苷酸包括从单细胞纯化一种或更多种多核苷酸或已经从单细胞纯化一种或更多种多核苷酸。

在一些方面，确定步骤(e)包括测序。在一些方面，测序包括对多核苷酸进行测序。在一些方面，测序包括对本文描述的任何纯化的多核苷酸进行测序或已经对本文描述的任何纯化的多核苷酸进行测序，或对使用本文描述的任何纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸进行测序或已经对使用本文描述的任何纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸进行测序。在一些方面，测序包括下一代测序。在一些方面，测序包括单细胞测序。

在一些方面，确定步骤还包括鉴定新抗原或新抗原特异性TCR。

在一些方面，一种或更多种膜组分包含一种或更多种寡核苷酸条形码。在一些方面，一种或更多种寡核苷酸条形码被直接地缀合至一种或更多种膜组分。在一些方面，一种或更多种寡核苷酸条形码被间接地缀合至一种或更多种膜组分。在一些方面，一种或更多种寡核苷酸条形码被缀合至标记试剂。在一些方面，标记试剂选自由以下组成的组：抗体、包含反应性基团的试剂和脂质反应性试剂。在一些方面，确定步骤(e)还包括确定或已经确定一种或更多种寡核苷酸条形码中的至少一种的序列。在一些方面，至少一种寡核苷酸条形码的序列对于一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体的特定TCR是独特的。在一些方面，一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体包括两种或更多种不同的表达抗原特异性TCR的细胞群体，每种不同的表达抗原特异性TCR的细胞群体包含独特的TCR和与每种独特的TCR的身份可操作地关联的独特的、确定的条形码序列。在一些方面，至少一种寡核苷酸条形码的序列对于一种或更多种靶细胞群体中的特定靶细胞群体是独特的。在一些方面，特定靶细胞群体表达独特的抗原肽、独特的MHC等位基因或独特的抗原肽和MHC等位基因对。在一些方面，一种或更多种靶细胞群体包括两种或更多种不同的靶细胞群体，每种不同的靶细胞包含与每种独特的抗原肽、每种独特的MHC等位基因或每种独特的抗原肽和MHC等位基因对的身份可操作地关联的独特的、确定的条形码序列。

本文还公开了分离的感兴趣的靶细胞或感兴趣的表达TCR的细胞，所述分离的感兴趣的靶细胞或感兴趣的表达TCR的细胞通过以上方法中的任一种产生。

本文还公开了纯化的多核苷酸或使用纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸，所述纯化的多核苷酸或使用纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸通过以上方法中的任一种产生。

本文还公开了数据库，所述数据库包含通过以上方法中的任一种产生的一种或更多种序列。在一些方面，一种或更多种序列包括通过以上方法中的任一种产生的一种或更多种经测序的多核苷酸。

本文还公开了分离的感兴趣的靶细胞，其中靶细胞包含：i)一种或更多种T细胞膜相关组分，其中靶细胞不包含编码一种或更多种T细胞膜组分的内源性多核苷酸序列；以及ii)一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因，其中一种或更多种抗原肽被呈递在一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上。在一些方面，一种或更多种抗原肽由一种或更多种抗原多核苷酸序列编码。

本文还公开了配体鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供一种或更多种表达配体特异性结合分子的细胞群体；b)提供一种或更多种靶细胞群体，其中靶细胞群体呈递能够被一种或更多种配体特异性结合分子结合的一种或更多种配体；c)使一种或更多种表达配体特异性结合分子的细胞群体与一种或更多种靶细胞群体接触，其中接触包括提供足以用于至少一种表达配体特异性结合分子的细胞特异性结合至少一种靶细胞的条件，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在表达配体特异性结合分子的细胞与靶细胞之间转移；d)分离或已经分离i)感兴趣的靶细胞，其中感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从表达配体特异性结合分子的细胞转移的一种或更多种膜组分；以及任选地ii)感兴趣的表达配体特异性结合分子的细胞，其中感兴趣的表达配体特异性结合分子的细胞包含在接触步骤(c)之后从靶细胞转移的一种或更多种膜组分；并且e)确定或已经确定i)编码与感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种配体的序列的至少一部分，或ii)编码与感兴趣的表达配体特异性结合分子的细胞相关的结合分子肽的结合分子序列的至少一部分。在一些方面，配体特异性结合分子选自由以下组成的组：免疫受体、免疫球蛋白、抗体或其片段、受体、嵌合受体、嵌合抗原受体(CAR)、信号传导受体、细胞表面受体和跨膜受体。在一些方面，一种或更多种配体选自由以下组成的组：抗原、表面抗原、表位、非经典MHC呈递的抗原和受体配体。

附图的若干视图的简要描述

对照以下描述和附图，本发明的这些及其他特征、方面和优点将变得更好理解，其中：

图1A-图1E.靶细胞胞啃是抗原特异性的。(图1A)Jurkat细胞和K562细胞通过流式细胞术的分辨(resolution)。通过分别对LNGFR⁺群体和ZsGreen⁺群体设门来分辨(resolve)Jurkat T细胞和K562细胞。(图1B)与表达HLA-A2/MART1_26-35(A27L)单链三聚体(SCT)的关联MART1-K562靶细胞(ZsGreen⁺)或表达HLA-A2/NYESO1_{157-165(C165V)}的非关联NYEOS1-K562靶细胞共孵育的生物素化的F5-Jurkat T细胞上的NHS-生物素的水平。F5-Jurkat T细胞上的表面蛋白用1mg/mL NHS-生物素来标记，并且生物素化的蛋白的水平使用荧光标记的链霉亲和素来评估。(图1C)在将Jurkat细胞与K562细胞以5:1的比例共孵育后，使用荧光标记的链霉亲和素评估生物素化的膜蛋白从Jurkat T细胞(LNGFR⁺)向K562靶细胞(ZsGreen⁺)的转移。(图1D)细胞膜蛋白LNGFR和TCR从F5-Jurkat T细胞向关联MART1-K562靶细胞(ZsGreen⁺)而不是向非关联NYESO1-K562靶细胞(ZsGreen⁺)(5:1J:K)的抗原特异性转移。使用抗LNGFR和抗人类TCR(huTCR)抗体评估了胞啃。(图1E)NYESO1-K562细胞或MART1-K562细胞在与1G4-Jurkat细胞或F5-Jurkat T细胞(5:1J:K)共孵育之后的代表性流式细胞术图叠加。K562细胞(ZsGreen⁺HLA-A2⁺)显示出T细胞膜蛋白LNGFR和huTCR的抗原特异性获取，而Jurkat细胞(ZsGreen^-HLA-A2^-)显示出膜蛋白LNGFR和huTCR的抗原特异性丢失。指示了相关群体。

图2A-图2C.胞啃是可滴定的，并通过CD8的存在而增强。(图2A)鼠源化的(murinized)F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞与装载有从0uM至10uM范围的不同剂量的MART1(ELAGIGILTV；上图)或NYESO1(SLLMWITQV；下图)变态(heteroclitic)肽的表达HLA-A2的K562(A2-K562)细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较。使用抗muTCR抗体评估SCT-K562细胞(eGFP⁺)的TCR获取。对于每种条件，左柱代表F5-Jurkat细胞，且右柱代表1G4-Jurkat细胞。(图2B)鼠源化的F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞与装载有不同的MART1变体(上图)或NYESO1变体(下图)的A2-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较。通过TCR⁺eGFP⁺A2-K562细胞的百分比评估胞啃能力。对于每种条件，左柱代表F5-Jurkat细胞，且右柱代表1G4-Jurkat细胞。(图2C)CD8⁺或CD8^-F5-Jurkat细胞或者CD8⁺或CD8^-1G4-Jurkat细胞与MART1-K562或NYESO1-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，如通过TCR⁺eGFP⁺SCT-K562的百分比示出的。对于每种条件，从左至右的柱代表F5-Jurkat细胞、F5-CD8-Jurkat细胞、1G4-Jurkat细胞和1G4-CD8-Jurkat细胞。

图3A-图3B.靶细胞胞啃足够灵敏，鉴定出在10,000个非抗原表达细胞中的1个表达关联抗原的靶细胞。(图3A)与F5-Jurkat细胞(上图)或1G4-Jurkat细胞(下图)共孵育的1:10,000的关联NYESO1-K562(CD80^-ZsGreen⁺)靶细胞与非关联A2-K562细胞(CD80⁺ZsGreen^-)(20,000:10,000:1Jurkat:K562:SCT-K562)的示意图和代表性流式图。对NYESO1-K562细胞(HLA-A2⁺ZsGreen⁺)和非关联A2-K562细胞(HLA-A2⁺ZsGreen^-)单独设门，以使用抗LNGFR和抗muTCR抗体来分析膜转移标志物LNGFR和TCR的获取。非关联A2-K562细胞的叠加(灰色)提供了关联和非关联K562细胞中胞啃的清晰比较。(图3B)与1G4-Jurkat细胞(上图)或F5-Jurkat细胞(下图)共孵育的1:10,000的关联MART1-K562(CD80^-ZsGreen⁺)靶细胞与非关联A2-K562细胞(CD80⁺ZsGreen^-)的示意图和流式细胞术图。本实验的流式细胞术数据以类似于(a)中的数据分析方式进行分析。

图4A-图4D.靶细胞胞啃验证了公共F5 TCR和1G4 TCR的配体。(图4a)用于包含12,055种表位的A2限制性文库的背景中的胞啃的示意图概述。首先产生包含来自免疫表位数据库(Immune Epitope Database)(IEDB)的多种已知T细胞表位的A2限制性SCT DNA文库。然后，用A2限制性SCT文库以低MOI转导K562细胞，以确保每个细胞包含仅一个或两个拷贝的DNA。然后将F5-Jurkat细胞或1G4 Jurkat细胞(E2-Crimson⁺CD8⁺)与K562文库细胞(2:1J:K)共孵育，并且使用FACS来分选胞啃⁺(E2-Crimson^-eGFP⁺TCR⁺)A2-SCT-K562细胞，以用于通过dextramer染色、共孵育和下一代测序(NGS)进行抗原验证。(图4B)直方图(histogram)代表与F5-Jurkat或1G4-Jurkat一起孵育的从F5-Jurkat培养物分选的K562细胞(左图)或从1G4-Jurkat培养物分选的K562细胞(左图)(2:1J:K)的验证性共孵育之后的分选的胞啃⁺SCT-K562细胞的平均荧光。(图4C)分选的胞啃⁺SCT-K562细胞与1G4 TCR或F5 TCRdextramer结合的代表性流式细胞术图。与F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞共孵育一轮或两轮并通过FACS选择之后的胞啃⁺SCT-K562通过荧光标记的F5 TCR(上图)和1G4 TCR(下图)dextramer染色来验证。(图4D)通过深度测序分析进行两轮胞啃选择之后富集的肽的验证。排序平均值代表富集的肽的排序，其基于来自一式三份的实验的所有肽中每种肽的丰度来计算。

图5A-图5D.靶细胞胞啃鉴定新抗原特异性、患者来源的TCR的关联配体。(图5A)用于源自肿瘤样品的包含5,000种表位的A2限制性新表位文库的背景中的胞啃的示意图概述。首先使用预测的由HLA-A*02:01呈递的新表位产生A2限制性新抗原SCT文库，所述新表位来自突变的序列，所述突变的序列经由对来自患者的黑素瘤进行外显子组测序鉴定出。然后，用来自同一患者的新表位特异性TCR(neoTCR)转导CD8⁺Jurkat细胞(E2-Crimson⁺)，并且用A2限制性新表位文库以低MOI转导K562细胞，以确保每个细胞包含仅一个或两个拷贝的DNA。然后将这些细胞共孵育(2:1J:K)，并且使用FACS来分选胞啃⁺(eGFP⁺TCR⁺)A2限制性SCT-K562细胞，以用于通过NGS进行表位鉴定以及通过共孵育和细胞毒性测定进行验证。(图5B)通过深度测序分析鉴定两轮胞啃选择之后富集的肽。排序平均值代表富集的肽的排序，其基于来自一式三份的实验的所有肽中每种肽的丰度来计算。(图5C)直方图示出了对经由胞啃测试的TCR-新抗原配对的验证通过评估新表位特异性TCR从neoTCR-Jurkat细胞转移至USP7mut-K562细胞(2:1J:K)来进行(左图)。直方图被定量为TCR阳性细胞的百分比(右图)。对于每种条件，左柱代表F5-Jurkat细胞，且右柱代表neo12-Jurkat细胞。(图5D)在体外neoTCR-T细胞对USP7mut-K562细胞的细胞毒性。将neoTCR-T细胞或F5TCR-T细胞与USP7mut-K562细胞或MART1-K562细胞以不同的效应物-比-靶的比例共孵育4小时，并且测量对USP7mut-K562细胞或MART1-K562细胞的细胞毒性，并将所述细胞毒性呈现为特异性裂解％。

图6A-图6B.表达F5 TCR或1G4 TCR的Jurkat细胞和表达HLA-A2/MART1_26-35(A27L)或HLA-A2/NYESO1_{157-165(C165V)}的单链三聚体(SCT)的K562细胞的建立。(图6A)逆转录病毒载体将F5 TCR或1G4 TCR基因以及LNGFRΔ共递送至Jurkat细胞，所述F5 TCR或1G4 TCR基因携带人类或鼠TCR恒定区，所述LNGFRΔ是包含具有细胞内结构域被截短的低亲和力神经生长因子受体的转导标志物。慢病毒载体将包含MART1或NYESO1肽的SCT与作为转导标志物的ZsGreen共递送至K562细胞。SCT包含单个多肽链，该多肽链具有通过柔性GS接头连接的抗原肽、β2-微球蛋白和HLA-A2结构域的线性组成。(图6B)红色/蓝色着色指示关联TCR抗原对。F5 TCR(红色)与表达MART1肽的SCT配对，且1G4TCR(蓝色)与表达NYESO1肽的SCT配对。

图7A-图7D.胞啃可以通过多种蛋白转移来跟踪。(图7A)T细胞膜蛋白CD3和CD8从表达CD8的F5-Jurkat和1G4-Jurkat细胞向K562细胞(ZsGreen⁺)(5:1J:K)的抗原特异性转移，如通过抗CD3抗体和抗CD8抗体评估的。(图7B)K562细胞膜蛋白HLA-A2从K562细胞向Jurkat细胞(ZsGreen-)(5:1J:K)的抗原特异性转移，如通过抗HLA-A2抗体评估的。(图7C和图7D)膜蛋白从供体细胞的伴随减少。K562细胞(ZsGreen⁺)显示出抗原特异性的HLA-A2丢失，而Jurkat细胞(ZsGreen-)显示出抗原特异性的LNGFR和鼠源化TCR丢失，如通过抗HLA-A2抗体、抗LNGFR抗体和抗小鼠TCR(muTCR)抗体评估的。

图8.发生从供体细胞向受体细胞的抗原特异性TCR转移，与细胞身份无关。(图8A)在F5或1G4 TCR-K562细胞与MART1或NYESO1SCT-Jurkat细胞(ZsGreen⁺)以5:1的比例共孵育后的抗原特异性TCR转移，如通过抗muTCR抗体评估的，直方图(左图)。直方图被定量为TCR阳性细胞的百分比(右图)。对于每种条件，左柱代表F5-K562细胞，而右柱代表1G4-K562细胞。(图8B)在F5或1G4 TCR-K562与MART1或NYESO1SCT-K562(ZsGreen⁺)以5:1的比例的相同细胞类型的共孵育后的抗原特异性TCR转移，如通过抗muTCR抗体评估的，直方图(左图)。直方图被定量为TCR阳性细胞的百分比(右图)。对于每种条件，左柱代表F5-K562细胞，且右柱代表1G4-K562细胞。(图8C)在F5或1G4 TCR-Jurkat与MART1或NYESO1 SCT-Jurkat(ZsGreen⁺)以1:1的比例共孵育后的抗原特异性TCR转移，如通过抗muTCR抗体评估的，直方图(左图)。直方图被定量为TCR阳性细胞的百分比(右图)。对于每种条件，左柱代表F5-Jurkat细胞，且右柱代表1G4-Jurkat细胞。

图9A-图9J.基于肽剂量和变体的胞啃能力的直方图可视化。(图9A)鼠源化F5-Jurkat细胞与装载有从0uM至10uM范围的不同剂量的关联MART1变态肽的A2-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较。胞啃通过eGFP⁺TCR⁺A2-K562细胞的百分比来确定。(图9B)鼠源化F5-Jurkat细胞与装载有从0uM至10uM范围的不同剂量的非关联NYESO1的A2-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，如通过eGFP⁺TCR⁺A2-K562细胞的百分比评估的。(图9C)鼠源化1G4-Jurkat细胞与装载有从0uM至10uM范围的不同剂量的关联NYESO1的A2-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，如通过eGFP⁺TCR⁺K562细胞的百分比评估的。(图9D)鼠源化1G4-Jurkat细胞与装载有从0uM至10uM范围的不同剂量的MART1的A2-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，如通过eGFP⁺TCR⁺K562细胞的百分比评估的。(图9E)鼠源化F5-Jurkat细胞与装载有不同MART1变体的A2-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，所述胞啃能力通过eGFP⁺TCR⁺A2-K562细胞的百分比确定。(图9F)鼠源化1G4-Jurkat细胞与装载有不同MART1变体的A2-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，所述胞啃能力通过eGFP⁺TCR⁺A2-K562细胞的百分比确定。(图9G)鼠源化1G4-Jurkat细胞与装载有不同NYESO1变体的A2-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，所述胞啃能力通过eGFP⁺TCR⁺A2-K562细胞的百分比确定。(图9H)鼠源化F5-Jurkat细胞与装载有不同NYESO1变体的A2-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，所述胞啃能力通过eGFP⁺TCR⁺A2-K562细胞的百分比确定。(图9I)CD8⁺或CD8^-鼠源化F5-Jurkat细胞与MART1-K562细胞或NYESO1-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，所述胞啃能力通过eGFP⁺TCR⁺SCT-K562细胞的百分比确定。(图9J)CD8⁺或CD8^-鼠源化1G4-Jurkat细胞与MART1-K562细胞或NYESO1-K562细胞(5:1J:K)的胞啃能力的比较，所述胞啃能力通过eGFP⁺TCR⁺SCT-K562细胞的百分比确定。

图10A-图10C.靶细胞胞啃分辨表达关联抗原的靶细胞与表达非关联抗原的细胞。(图10A)实验示意图。将NYESO1-K562和MART1-K562的1:1混合物用于与F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞(10:1:1Jurkat:NYESO1-K562:MART1-K562)的共孵育实验。通过dextramer染色进一步分析胞啃⁺SCT-K562细胞(HLA-A2⁺ZsGreen⁺LNGFR^高TCR^高细胞)以验证抗原特异性胞啃。(图10B)NYESO1-K562和MART1-K562细胞的1:1混合物与1G4-Jurkat细胞(上图)或F5-Jurkat细胞(下图)(10:1:1Jurkat:NYESO1-K562:MART1-K562)共孵育的代表性流式图。对混合的NYESO1-K562细胞和MART1-K562细胞(HLA-A2⁺ZsGreen⁺)单独进行针对胞啃⁺(TCR⁺LNGFR⁺)和胞啃^-(TCR^-LNGFR^-)群体的设门。然后通过使用F5 TCR或1G4 TCR dextramer染色来验证胞啃⁺群体和胞啃^-群体的抗原特异性。(图10C)一式三份的1:1K562混合物实验的定量证实胞啃可以特异性地分辨出表达关联抗原的靶细胞。胞啃⁺NYESO1-K562细胞针对关联1G4 TCR dextramer染色呈阳性。对于每种设门条件，左柱代表1G4-Jurkat细胞，且右柱代表F5-Jurkat细胞。

详细描述

在下文描述中阐述了本发明的多种实施方案的细节。根据说明书和附图以及根据权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将是明显的。

定义

除非另外指明，否则在权利要求书和说明书中使用的术语如下文阐述的被定义。

如本文使用的，“抗原特异性T细胞”或“表达抗原特异性TCR的”细胞是指彼此通过它们的T细胞受体(TCR)区分的细胞，所述T细胞受体(TCR)赋予它们对MHC呈递的关联抗原肽(也被称为“表位”)的抗原特异性。

本发明的实施方案包括能够与关联T细胞配对的重组抗原-MHC复合体。如本文使用的，“抗原-MHC”、“抗原-MHC复合体”、“重组抗原-MHC复合体”、“肽MHC”和“p/MHC”可互换使用，是指具有在MHC的抗原结合沟(groove)中的肽的主要组织相容性复合体。

如本文使用的，“抗原”包括任何抗原，包括患者特异性新抗原。“抗原肽”是指能够结合MHC分子并且被呈递至表达TCR的细胞的肽片段。“新抗原”是指这样的抗原，所述抗原具有至少一个使新抗原或新抗原的呈递与其对应的野生型抗原不同的改变(例如，多肽序列中的突变、翻译后修饰的差异或表达水平的差异)。“肿瘤新抗原”是指源自肿瘤或癌症，例如，来自患者的肿瘤的新抗原。

如本文使用的，“T细胞配对的抗原MHC复合体”是指具有与MHC分子呈递的抗原肽结合的T细胞受体的T细胞复合体。

术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。

如本文使用的术语“哺乳动物”包括人类和非人类两者，并且包括但不限于人类、非人类灵长类动物、犬科动物(canine)、猫科动物(feline)、鼠科动物(murine)、牛科动物(bovine)、马科动物(equine)和猪类(porcine)。

术语“足够量”是指足以产生期望的效果的量，例如足以调节细胞中蛋白聚集的量。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。

必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。

除非特别说明或另外从上下文明显的，否则如本文使用的术语“约”应被理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以被理解为在陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非另外从上下文明确，否则本文提供的所有数值均由术语约修饰。

引言

T细胞介导的免疫可以通过抗原特异性细胞毒性T细胞的活化来表征，所述抗原特异性细胞毒性T细胞能够诱导将抗原展示在其表面的主要组织相容性复合体(MHC)中的细胞的死亡。这些展示出装载有抗原的MHC复合体的细胞包括病毒感染的细胞、具有细胞内细菌的细胞、具有已经被内化或吞噬的细胞外来源的蛋白的细胞、以及展示出肿瘤抗原的癌细胞。

为了利用T细胞介导的免疫过程，例如，用于患者特异性癌症免疫疗法，初始步骤之一可以包括鉴定患者的肿瘤特异性抗原(例如，新抗原)。与已公布的文献相反，抗原呈递靶细胞可以通过在本文中被称为靶细胞胞啃的过程从相互作用的T细胞提取膜和膜相关蛋白。抗原特异性靶细胞胞啃可以通过多种蛋白转移以及通过供体细胞的蛋白丢失来跟踪。这种靶细胞胞啃是肽MHC密度依赖性的，并且能够基于TCR对各种变体的相应识别能力来区分不同的肽变体。

本文描述了TCR配体发现平台，其利用靶细胞胞啃现象来选择性地标记靶细胞，诸如呈递与孤儿TCR转导的细胞诸如T细胞关联的表位的表达MHC等位基因的细胞，使得能够从靶细胞文库分离所识别的表位。本文还描述了TCR发现平台，其利用靶细胞胞啃现象来选择性地标记识别靶细胞上的关联表位的孤儿TCR转导的细胞诸如T细胞，使得能够从表达TCR的细胞文库分离TCR。

本文还描述了配体发现平台，其利用靶细胞胞啃现象来选择性地标记和鉴定配体及其关联结合分子。

抗原鉴定的方法

本文提供了一种抗原鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供一种或更多种表达抗原特异性T细胞受体(TCR)的细胞群体；b)提供一种或更多种靶细胞群体，其中靶细胞群体将一种或更多种抗原肽呈递在一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上；c)使一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体与一种或更多种靶细胞群体接触，其中接触包括提供足以用于一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体中的至少一种特异性结合一种或更多种靶细胞群体中的至少一种的条件，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在至少一种表达抗原特异性TCR的细胞与至少一种靶细胞之间转移；d)分离或已经分离i)感兴趣的靶细胞，其中感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从至少一种表达抗原特异性TCR的细胞转移的一种或更多种膜组分，以及任选地ii)感兴趣的表达TCR的细胞，其中感兴趣的表达TCR的细胞包含在接触步骤(c)之后从至少一种靶细胞转移的一种或更多种膜组分；并且e)确定或已经确定i)与感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列，ii)编码与感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分，或iii)与感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列以及编码与感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分。

表达抗原特异性TCR的细胞

表达抗原特异性TCR的细胞是指表达一种或更多种TCR的任何细胞。

如本文使用的，“群体”是指一组克隆上相同或基本相同的细胞。群体可以指任何数目的克隆上相同的细胞。例如，群体可以指一个细胞、多于一个细胞、2个细胞、3个细胞、4个细胞、5个细胞、6个细胞、7个细胞、8个细胞、9个细胞、10个细胞、多于10个细胞、多于20个细胞、多于30个细胞、多于40个细胞、多于50个细胞、多于10²个细胞、多于10³个细胞、多于10⁴个细胞、多于10⁵个细胞、多于10⁶个细胞、多于10⁷个细胞或多于10⁸个细胞。一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体可以是2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体。一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体可以是多于10种、多于20种、多于30种、多于40种、多于50种、多于10²种、多于10³种、多于10⁴种、多于10⁵种、多于10⁶种、多于10⁷种或多于10⁸种表达抗原特异性TCR的细胞群体。一种或更多种靶细胞群体可以是2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种靶细胞群体。一种或更多种靶细胞群体可以是多于10种、多于20种、多于30种、多于40种、多于50种、多于10²种、多于10³种、多于10⁴种、多于10⁵种、多于10⁶种、多于10⁷种或多于10⁸种靶细胞群体。

表达抗原特异性TCR的细胞可以是T细胞。T细胞的实例包括但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞、离体培养的T细胞、肿瘤浸润性T细胞、自身免疫性T细胞、病原体特异性T细胞、调节性T细胞、耗竭性T细胞、记忆T细胞群体、自然杀伤T细胞(NKT)群体、γ-δ(γδ)T细胞群体、工程化T细胞和永生化T细胞系。可用于本文方法的T细胞的具体实例包括Jurkat永生化T细胞系(也被称为“Jurkat”或“Jurkat细胞”)。Jurkat细胞能够被工程化，诸如以表达外源性蛋白(例如，外源性TCR)和/或以使特定感兴趣的基因缺失，并且能够被传代以产生可用于本文方法的克隆或文库。具有不同期望特性的多种Jurkat细胞系已经被工程化并且公开可得，例如在美国典型培养物保藏中心(theAmerican Type Culture Collection)公开可得。T细胞可以被工程化以具有有助于本文描述的方法的特性。例如，T细胞可以被工程化以不表达特定基因，诸如内源性TCR分子，或者T细胞可以被工程化以表达外源性分子，诸如TCR或多种T细胞共受体。细胞工程化的方法包括但不限于瞬时转染、稳定转染、病毒转导(例如，逆转录病毒或慢病毒转导)、基于核酸酶的工程化方法、电穿孔、以及产生工程化细胞诸如T细胞的其他工程化方法(例如，可以用于产生工程化T细胞的动物或干细胞的工程化)。基于核酸酶的方法包括使用核酸酶，所述核酸酶包括但不限于成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats)(CRISPR)家族核酸酶(例如，Cas9)、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物以及归巢内切核酸酶(homing endonuclease)(HE)或其衍生物。T细胞可以只表达其由天然TCR基因座表达的内源性TCR。

可以从受试者诸如已知或怀疑患有癌症的受试者分离T细胞。受试者来源的(也被称为“患者来源的”)T细胞可以从患者的外周血单核细胞(PBMC)或肿瘤浸性润淋巴细胞(TIL)分离。例如，CD4+和CD8+T细胞两者都可以使用抗CD4和抗CD8荧光抗体标记PBMC细胞或TIL细胞并且使用荧光激活细胞分选(FACS)分选从PBMC细胞或TIL细胞分选活的CD4+和CD8+单阳性细胞群体，以只分离CD4+细胞或CD8+细胞。可以使用其他分选方法，诸如磁性分选。也可以从患者间接地分离受试者来源的T细胞，诸如在离体培养从患者分离的T细胞或T细胞前体之后分离T细胞。可以使用多种标志物来鉴定和分离T细胞。可以较广泛地使用标志物来分离T细胞，诸如使用抗CD3荧光抗体，随后通常用FACS来分离所有T细胞。可以使用其他标志物来分离特定类型或亚型的T细胞。例如，可以使用表型标志物来区分和分离T细胞的类型或亚型，表型标志物诸如活化标志物，包括但不限于PD-1、CD39和CD137。可以使用单一标志物，或者可以使用不同标志物的组合(例如，CD4/PD-1双阳性T细胞)。本领域技术人员能够确定可用于询问感兴趣的一种类型或更多种类型抗原肽的待分离的T细胞类型或亚型。

表达抗原特异性TCR的细胞也可以是不源自T细胞的细胞。例如，不源自T细胞的细胞包括被工程化以表达外源性TCR的永生化细胞系。可用于本文描述的方法的永生化细胞系包括但不限于K562细胞、HEK293细胞及其衍生物、3T3细胞及其衍生物、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞及其衍生物、HeLa细胞及其衍生物。可以如上文描述的将永生化细胞工程化。

表达抗原特异性TCR的细胞可以是人类细胞或人类来源的细胞、哺乳动物细胞或哺乳动物来源的细胞、鼠细胞或鼠来源的细胞、或脊椎动物细胞或脊椎动物来源的细胞。可以使用其他细胞和细胞表达系统，诸如噬菌体、酵母和大肠杆菌(E.coli)表达系统。表达抗原特异性TCR的细胞可以表达源自与该细胞的物种不同的物种的蛋白，诸如人类细胞被工程化以表达鼠来源的TCR，或者反之亦然。

表达抗原特异性TCR的细胞可以被工程化以表达外源性TCR。表达抗原特异性TCR的细胞可以表达除内源性TCR之外的外源性TCR或替代内源性TCR的外源性TCR，例如，表达内源性TCR的T细胞可以被工程化以还表达外源性TCR。外源性TCR可以由TCR多核苷酸序列编码，其中一种或更多种TCR多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。可以编码TCR的多核苷酸包括但不限于病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。启动子核苷酸序列的实例包括但不限于哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动子、来自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)来源的启动子、两种或更多种启动子的融合体(fusions)、启动子的两个或更多个部分的融合体、MMLV LTR启动子、HIVLTR启动子、MCMV LTR启动子、EF1α启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统以及他莫昔芬条件性启动子系统。可以编码外源性TCR的多核苷酸可以具有可用于PCR介导的外源性TCR扩增和/或附接可用于NGS的测序衔接子的通用引物序列，例如通用引物序列可以在编码TCR的多核苷酸的侧翼。

TCR可以由TCR多核苷酸序列瞬时表达，其中TCR多核苷酸序列不被整合到工程化细胞的基因组中。TCR可以由被整合到工程化细胞的基因组中的TCR多核苷酸序列表达。被整合的TCR多核苷酸序列可以被整合到特定基因座中。可以被整合到的特定基因组基因座的实例包括但不限于编码区、内含子、T细胞受体(TCR)-α基因座、TCR-β基因座、免疫检查点基因座(例如，PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3和VISTA)。被整合到特定基因座中的TCR多核苷酸序列可以被可操作地连接至特定基因座的内源性启动子核苷酸序列并由其表达，或者它可以被可操作地连接至诸如上文描述的那些的外源性启动子并由其表达。

表达抗原特异性TCR的细胞可以表达单一TCR。表达抗原特异性TCR的细胞可以表达多于一种TCR，例如表达抗原特异性TCR的细胞可以表达多种TCR，其中每种TCR对不同的独特抗原是特异性的。表达抗原特异性TCR的细胞可以表达2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种TCR。多种TCR可以是随机的，诸如来自TCR表达文库的多种TCR，或者可以合理选择多种TCR，例如已知存在于受试者或患者中的TCR。

表达抗原特异性TCR的细胞可以存在于表达抗原特异性TCR的细胞群体中，群体的成员表达不同的TCR或TCR的组合。在一个实例中，从受试者或患者分离的T细胞通常将包括表达抗原特异性TCR的细胞群体，群体的成员表达不同的TCR。群体中不同的TCR可以是随机的，诸如来自TCR表达文库的多种TCR。可以合理选择群体中不同的TCR。用于合理选择的标准包括但不限于，选择已知存在于受试者或患者中的TCR，选择已知以特定频率存在于受试者或患者中的TCR，以及选择已知由特定T细胞群体(例如，本文先前描述的任何T细胞群体)或通过特定表型表征的T细胞，例如活化的T细胞(例如，特征为PD-1+、CD39+和/或CD137+)或耗竭性T细胞表达的TCR。鉴定群体中潜在感兴趣的TCR序列的方法是本领域已知的，例如已发布的美国专利8,507,205、已发布的美国专利9,347,099、已发布的美国专利9,506,119、国际申请WO2018075693、Han等人2014、Briggs等人2017、Gros等人2014、Pricket等人2016、Linneman等人2014、Pasetto等人2014以及国际申请PCT/US18/21611，其中每一个都通过引用并入用于所有目的。

通常，TCR是异二聚体蛋白，由两种被称为“链”的组分相互作用形成。通常认为经典的T细胞是表达α(α)链和β(β)链的α-β(αβ)T细胞。在其天然背景下，TCRα链和TCRβ链由不同的基因表达。当外源性TCR被表达时，它可以由单独编码TCRα链和TCRβ链的两种TCR多核苷酸序列编码，或者它可以由编码TCRα链和TCRβ链两者的单个TCR多核苷酸序列编码。由单个TCR多核苷酸序列编码的TCRα链和TCRβ链可以由接头序列分开，例如以TCR-α:接头:TCR-β取向或TCR-β:接头:TCR-α取向。在一系列实例中，接头序列编码可裂解肽，诸如弗林蛋白酶(furin)裂解位点，使得所表达的连接的TCRα和TCRβ多肽可以被加工以形成单独的TCRα和TCRβ多肽。在另一系列实例中，接头序列编码允许多顺反子表达的核苷酸序列，即TCRα开放阅读框和TCRβ开放阅读框的单独翻译，产生单独的TCRα和TCRβ多肽，诸如IRES元件或核糖体跳跃元件(例如，T2A、E2A、P2A、F2A或其他“自裂解”肽)。

其他TCR包括来自表达γ(γ)链和δ(δ)链的γ-δ(γδ)T细胞的TCR。仍其他的TCR包括来自自然杀伤T细胞(NKT)的TCR。

表达抗原特异性TCR的细胞可以被工程化以表达标志物，以鉴定和/或分离被正确工程化的表达抗原特异性TCR的细胞，所述标志物诸如荧光标志物(例如，eGFP、E2-Crimson)、药物选择标志物(例如，潮霉素、新霉素)或表面表达的标志物(例如，LNGFR)。用于对TCR的表达和标志物的表达进行工程化的方法和系统可以相同或不同。标志物多核苷酸序列可以是与TCR多核苷酸序列，诸如上文描述的可裂解肽或多顺反子系统相同的多核苷酸。标志物多核苷酸序列可以是与TCR多核苷酸序列独立的多核苷酸。

TCR共受体

表达抗原特异性TCR的细胞可以表达T细胞共受体，诸如T细胞共受体CD3、CD4、CD8或其组合。可以使用本领域技术人员已知的任何共受体。

CD3可以与TCR缔合以形成TCR复合体。CD3总体上是指包含CD3δ、CD3ε、CD3γ亚基的蛋白复合体，并且在一些情况下，诸如在活性信号传导TCR复合体的情况下，是指CD3δ亚基。

像CD3一样，CD4和CD8可以与TCR缔合以形成TCR复合体。在天然T细胞的背景下，T细胞通常将表达CD4或CD8。不希望受理论束缚，CD4或CD8的表达促进表达抗原特异性TCR的细胞通过CD4与MHC II类之间的或CD8与MHC I类之间的特异性相互作用区分分别表达MHCII类或MHC I类的细胞。表达CD4的T细胞(也被称为“CD4+T细胞”、“辅助性T细胞”、“T辅助细胞”或“T_H细胞”)通常与表达MHC II类的专职性抗原呈递细胞相互作用。表达CD8的T细胞(也被称为“CD8+T细胞”、“细胞毒性T细胞”、“杀伤性T细胞”、“T_C细胞”或“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)”)通常与任何表达MHC I类的有核细胞相互作用。

在一些实例中，本文描述的方法可以用于区分需要T细胞共受体表达的MHC呈递的抗原肽的TCR识别与不需要T细胞共受体表达的MHC呈递的抗原肽的TCR识别。

表达抗原特异性TCR的细胞诸如T细胞可以表达内源性T细胞共受体。表达抗原特异性TCR的细胞可以被工程化以表达外源性T细胞共受体。表达抗原特异性TCR的细胞可以表达除内源性T细胞共受体之外的外源性T细胞共受体或替代内源性T细胞共受体的外源性T细胞共受体，例如，表达内源性T细胞共受体的T细胞可以被工程化以还表达外源性T细胞共受体。外源性T细胞共受体可以由T细胞共受体多核苷酸序列编码，其中一种或更多种T细胞共受体多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。可以编码T细胞共受体的多核苷酸包括但不限于病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。启动子核苷酸序列的实例包括但不限于哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动子、源自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)启动子、两种或更多种启动子的融合体、启动子的两个或更多个部分的融合体、MMLV LTR启动子、HIV LTR启动子、MCMV LTR启动子、EF1α启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统以及他莫昔芬条件性启动子系统。可以编码T细胞共受体的多核苷酸可以具有可用于PCR介导的外源性T细胞共受体扩增和/或附接可用于NGS的测序衔接子的通用引物序列，例如通用引物序列可以在编码T细胞共受体的多核苷酸的侧翼。

T细胞共受体可以由T细胞共受体多核苷酸序列瞬时表达，其中T细胞共受体多核苷酸序列不被整合到工程化细胞的基因组中。T细胞共受体可以由被整合到工程化细胞的基因组中的T细胞共受体多核苷酸序列表达。被整合的T细胞共受体多核苷酸序列可以被整合在特定基因座中。被整合到特定基因座中的T细胞共受体多核苷酸序列可以被可操作地连接至特定基因座的内源性启动子核苷酸序列并由其表达，或者它可以被可操作地连接至诸如上文描述的那些的外源性启动子并由其表达。

被工程化以表达T细胞共受体的表达抗原特异性TCR的细胞可以是能够被工程化的任何细胞。被工程化以表达T细胞共受体的表达抗原特异性TCR的细胞还可以被工程化以表达外源性TCR。用于对TCR的表达和T细胞共受体的表达进行工程化的方法和系统可以相同或不同。T细胞共受体多核苷酸序列可以是与TCR多核苷酸序列，诸如上文描述的可裂解肽或多顺反子系统相同的多核苷酸。T细胞共受体多核苷酸序列可以是与TCR多核苷酸序列独立的多核苷酸。

靶细胞

如本文使用的，“靶细胞”是指能够被表达抗原特异性TCR的细胞或表达结合分子的细胞识别的任何细胞。靶细胞可以是原代细胞、离体培养的细胞、肿瘤浸润性细胞、自身免疫性细胞、病原体感染的细胞、癌症或肿瘤来源的细胞以及永生化细胞系。可用于本文描述的方法的永生化细胞系包括但不限于K562细胞、HEK293细胞及其衍生物(例如HEK293T细胞)、3T3细胞及其衍生物、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞及其衍生物、HeLa细胞及其衍生物。可以如上文描述的将永生化细胞工程化。

靶细胞可以是人类细胞或人类来源的细胞、哺乳动物细胞或哺乳动物来源的细胞、鼠细胞或鼠来源的细胞、或脊椎动物细胞或脊椎动物来源的细胞。可以使用其他细胞和细胞表达系统，诸如噬菌体、酵母和大肠杆菌表达系统。靶细胞可以表达源自与该细胞的物种不同的物种的蛋白，诸如人类细胞被工程化以表达鼠来源的蛋白，或者反之亦然。

MHC等位基因

在旨在鉴定TCR表位的实例中，靶细胞可以是表达表位和能够呈递表位的MHC分子(即，MHC等位基因)的任何细胞。被工程化以表达MHC的靶细胞可以是能够被工程化的任何细胞。

靶细胞可以是将内源性或外源性表位呈递在靶细胞的内源性MHC分子(即，由靶细胞天然表达)上的细胞。表达内源性MHC I类分子的细胞通常包括所有有核细胞。表达内源性MHC II类分子的细胞包括专职性抗原呈递细胞(APC)，诸如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。

通常，MHC I类分子是异二聚体复合体，包含β2-微球蛋白(也被称为β2M、β-2微球蛋白或B2M)和包含α1、α2和α3结构域的MHC I类重链(也被称为α链)。在其天然背景下，β2M和MHC I类重链由不同的基因编码并且被表达为单独的多肽。

通常，MHC II类分子是异二聚体复合体，包含α-链(α链)和β-链(β链)。α-链包含α1结构域和α2结构域，而β-链包含β1结构域和β2结构域。在其天然背景下，α-链和β-链由不同的基因编码并且被表达为单独的多肽。

MHC分子可以是哺乳动物MHC等位基因，包括但不限于人类MHC等位基因(也被称为HLA)。人类群体中常见的I类HLA包括但不限于HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因。人类群体中常见的I类HLA的具体亚类包括但不限于高加索人中的HLA-A*02、HLA-A*24、HLA-A*01，HLA-B*35、HLA-B*44、HLA-B*51，DRB1*11、DRB1*13、DRB1*07；非洲裔巴西人(afro-brazilians)中的HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*30，HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*44，DRB1*13、DRB1*11、DRB1*03；以及亚洲人中的HLA-A*24、HLA-A*02、HLA-A*26，HLA-B*40、HLA-B*51、HLA-B*52，DRB1*04、DRB1*15、DRB1*09。人类群体中常见的II类HLA包括但不限于HLA-DQ和HLA-DR。Bardi等人(Rev Bras Hematol Hemoter.2012；34(1):25-30)中进一步描述了在人类群体中存在的常见等位基因。

靶细胞可以被工程化以表达外源性MHC分子。靶细胞可以表达除内源性MHC分子之外的MHC分子或替代内源性MHC分子的MHC分子，例如，表达内源性MHC II类分子的APC可以被工程化以还表达外源性MHC II类分子。外源性MHC分子可以由一种或更多种MHC多核苷酸序列编码，其中一种或更多种MHC多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。可以编码MHC分子的多核苷酸包括但不限于病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。启动子核苷酸序列的实例包括但不限于哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动子、源自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)启动子、两种或更多种启动子的融合体、启动子的两个或更多个部分的融合体、MMLV LTR启动子、HIV LTR启动子、MCMV LTR启动子、EF1α启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统以及他莫昔芬条件性启动子系统。可以编码外源性MHC分子的多核苷酸可以具有可用于PCR介导的外源性MHC分子扩增和/或附接可用于NGS的测序衔接子的通用引物序列，例如通用引物序列可以在编码MHC分子的多核苷酸的侧翼。

MHC分子可以由MHC多核苷酸序列瞬时表达，其中MHC多核苷酸序列不被整合到工程化细胞的基因组中。MHC分子可以由被整合到工程化细胞的基因组中的MHC多核苷酸序列表达。被整合的MHC多核苷酸序列可以被整合到特定基因座中。被整合到特定基因座中的MHC多核苷酸序列可以被可操作地连接至特定基因座的内源性启动子核苷酸序列并由其表达，或者它可以被可操作地连接至诸如上文描述的那些的外源性启动子并由其表达。

靶细胞可以表达单一MHC分子。靶细胞可以表达多于一种MHC分子，例如，靶细胞可以表达多种MHC分子，其中每种MHC分子呈递不同的表位。靶细胞可以表达2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种MHC分子。多种MHC分子可以是随机的，诸如来自MHC表达文库的多种MHC分子，或者可以合理选择多种MHC分子。例如，合理选择的MHC分子可以是那些已知由受试者或患者表达的等位基因，并且可以通过HLA分型来确定。受试者可以已知患有癌症或被怀疑患有癌症，并且受试者也可以是T细胞或TCR从其分离或源自其的同一受试者。作为特定实例，表达抗原特异性TCR的细胞可以被工程化以表达一种或更多种被鉴定为在患者中表达的TCR，并且靶细胞可以被工程化以表达一种或更多种对患者特异性的MHC等位基因。从患者分离的细胞也可以被用于替代表达抗原特异性TCR的细胞和/或靶细胞的工程化细胞。

靶细胞可以存在于靶细胞群体中，群体的成员表达不同的MHC分子或MHC分子的组合。在一种实例中，哺乳动物(包括人类)对于不同的MHC分子是杂合的。因此，通常，从受试者分离的细胞在它们的MHC库中天然地是多样的。例如，对于HLA-A、HLA-B和HLA-C的每一种，人类通常将具有两种不同的MHC I类重链等位基因，在天然背景下其的每一种都在细胞中表达，使得细胞表面上通常存在6种不同的MHC I类分子。群体中不同的MHC分子可以是随机的，诸如来自MHC表达文库的多种MHC分子。可以合理选择群体中不同的MHC分子。如上文讨论的，用于合理选择的标准包括但不限于选择已知存在于受试者或患者中的MHC分子。

MHC分子可以是与条件性配体一起表达的MHC I类分子。由于MHC I类分子在没有肽(即抗原肽)的情况下不稳定，因此将重组MHC I类分子与可裂解肽一起表达，可裂解肽在UV光辐照后从复合体解离并分解。然而，如果可裂解肽的UV分解是在“挽救肽”的存在下进行的，则挽救肽将容易地替代被UV辐照的结合沟中的肽，如Toebes等人，2006,Nat.Med.12:246-251和Bakker等人，PNAS,2008,105:3825-3830中描述的，将这两篇文献的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。使用该技术，若干经组装的MHC I类分子可以被装载有候选抗原包括新抗原，以形成用于筛选TCR的MHC I类抗原文库。

MHC分子可以是单链三聚体。单链三聚体在美国公布第2003/0003535号、美国公布第2009/0117153号和美国公布第2008/0219947号中有更详细的描述，这些文献的每一个通过引用以其整体并入本文用于所有目的。简而言之，如本文使用的，“单链三聚体”是指以抗原肽、β2-微球蛋白和包含α1、α2和α3结构域的MHC I类重链的单个多肽融合体表达的重组MHC分子。在某些实施方案中，单链三聚体可以包含二硫化物陷阱(disulfide trap)，如美国公布第2009/0117153号和美国公布第2008/0219947号中描述的。MHC II类分子和以单个肽表达的表位的表达还在Ignatowicz等人(J Immunol.1995Apr 15；154(8):3852-62)中描述，其通过引用以其整体并入本文用于所有目的。

可以使用的MHC分子类型的另外描述可以见于美国公布第2017/0003288号中。表达并且装载有候选抗原肽的重组MHC II类分子在Novak等人1999,J.Clin.Invest.104:R63-R67中描述，该文献的全部内容通过引用并入本文。

抗原肽

在旨在鉴定TCR表位的实例中，抗原肽(也被称为表位)可以是能够被MHC分子呈递的任何肽片段。抗原肽可以是肿瘤相关表位、新表位、肿瘤新表位、病毒表位、磷酸化表位、细菌表位、微生物表位、组织特异性自身表位和自身表位。

新表位和/或新抗原可以来自已知或怀疑患有癌症的受试者。为了鉴定患者的推定新表位或新抗原(肿瘤或病原体)，可以利用计算机预测算法程序分析肿瘤、病毒或细菌测序数据，包括全基因组、全外显子组或转录物组测序数据，以鉴定对应于推定表达的新抗原的一种或更多种突变。另外，可以从患者的肿瘤或血液样品来确定人类白细胞抗原(HLA)分型，并且该HLA信息可以与所鉴定的推定新抗原肽序列一起用于MHC结合的预测算法，如Fritsch等人，2014,Cancer Immunol Res.,2:522-529验证的，该文献的全部内容通过引用并入本文。人类群体中常见的HLA也可以被包括在新抗原预测算法中，诸如高加索人中的HLA-A*02、HLA-A*24、HLA-A*01，HLA-B*35、HLA-B*44、HLA-B*51，DRB1*11、DRB1*13、DRB1*07；非洲裔巴西人中的HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*30，HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*44，DRB1*13、DRB1*11、DRB1*03；以及亚洲人中的HLA-A*24、HLA-A*02、HLA-A*26，HLA-B*40、HLA-B*51、HLA-B*52，DRB1*04、DRB1*15、DRB1*09。还可以使用HLA等位基因的特异性配对。Bardi等人(Rev Bras Hematol Hemoter.2012；34(1):25-30)中进一步描述了在人类群体中存在的常见等位基因。

鉴定新抗原的方法的另外实例包括将测序与质谱术和MHC呈递预测组合(例如，美国公布第2017/0199961号)，以及将测序与MHC结合亲和力预测组合(例如，已发布的美国专利9,115,402)。另外，可用于鉴定患者样品中是否存在新抗原特异性T细胞的方法(例如，如美国公布第2017/0003288号和PCT/US17/59598中描述的方法，通过引用以其整体并入本文)可以与本文描述的方法组合使用。这些分析产生了患者的候选新抗原肽的排序列表，患者的候选新抗原肽可以使用常规方法容易地合成，用于筛选关联抗原特异性T细胞。

抗原肽可以源自通常被认为健康的样品或特征为不呈现特定疾病、状况或表型的样品。来自健康样品的抗原肽的使用可用于受益于对照样品的方法，诸如受益于鉴定TCR的背景结合或脱靶/交叉反应结合的方法。

抗原肽可以是能够被MHC I类分子呈递的任何肽。被MHC I类分子呈递的肽的长度可以为7-15个、7-10、8-9个、7个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸，并且长度通常为8-10个氨基酸(即，8个、9个或10个)。抗原肽可以是能够被MHC II类分子呈递的任何肽。被MHCII类分子呈递的肽的长度可以为11-30个、14-20个、15-18个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸。被MHC II类分子呈递的肽的长度可以为10与35个之间、10与30个之间、10与25个之间、或10与20个之间的氨基酸。

抗原肽可以是外源性抗原肽，即，被提供至靶细胞的外源性肽。可以使用上文描述的UV可裂解肽系统将外源性抗原肽提供至靶细胞上的MHC分子。可以以足以替代与MHC分子结合的其他肽的量来提供外源性抗原肽，这也被称为肽脉冲。外源性抗原肽也可以被编码为与MHC分子相同的多肽诸如本文先前描述的单链三聚体的一部分。

靶细胞可以被工程化以表达外源性抗原肽。靶细胞可以表达除内源性抗原肽之外的抗原肽或替代内源性抗原肽的抗原肽，例如，表达内源性天然抗原肽的靶细胞可以被工程化以还表达突变形式的抗原肽(例如，新表位)。外源性抗原肽可以由一种或更多种抗原多核苷酸序列编码，其中一种或更多种抗原多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。可以编码抗原肽的多核苷酸包括但不限于病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。启动子核苷酸序列的实例包括但不限于哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动子、源自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)启动子、两种或更多种启动子的融合体、启动子的两个或更多个部分的融合体、MMLV LTR启动子、HIV LTR启动子、MCMV LTR启动子、EF1α启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统以及他莫昔芬条件性启动子系统。可以编码抗原肽的多核苷酸可以具有可用于PCR介导的抗原肽扩增和/或附接可用于NGS的测序衔接子的通用引物序列，例如通用引物序列可以在编码抗原肽的多核苷酸的侧翼。

外源性抗原肽可以由抗原多核苷酸序列瞬时表达，其中抗原序列不被整合到工程化细胞的基因组中。抗原肽可以由被整合到工程化细胞的基因组中的抗原序列表达。被整合的抗原多核苷酸序列可以被整合到特定基因座中。被整合到特定基因座中的抗原多核苷酸序列可以被可操作地连接至特定基因座的内源性启动子核苷酸序列并由其表达，或者它可以被可操作地连接至诸如上文描述的那些的外源性启动子并由其表达。

靶细胞可以表达单一抗原肽。靶细胞可以表达多于一种抗原肽，例如，靶细胞可以表达多种抗原肽，其中每种抗原肽与不同的MHC分子结合。靶细胞可以表达2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种抗原肽。靶细胞可以表达多于10种、多于20种、多于30种、多于40种、多于50种、多于10²种、多于10³种、多于10⁴种、多于10⁵种、多于10⁶种、多于10⁷种或多于10⁸种抗原肽。多种抗原肽可以是随机的，诸如来自抗原文库的多种抗原肽，或者可以合理选择多种抗原肽。例如，合理选择的抗原肽可以是已知由受试者或患者表达的那些表位或抗原，或者是已知与受试者已知或被怀疑具有的特定疾病、状况或表型相关的那些表位或抗原。例如，受试者可以已知患有癌症或被怀疑患有癌症。上文描述了用于预测受试者和/或癌症特异性表位的方法。受试者也可以是T细胞、TCR和/或MHC分子从其分离或源自其的同一受试者。作为特定实例，表达抗原特异性TCR的细胞可以被工程化以表达一种或更多种被鉴定为在患者中表达的TCR，并且靶细胞可以被工程化以表达对患者特异性的一种或更多种抗原肽和潜在的一种或更多种MHC等位基因。从患者分离的细胞也可以被用于替代表达抗原特异性TCR的细胞和/或靶细胞的工程化细胞。

靶细胞可以存在于靶细胞群体中，群体的成员表达不同的抗原肽或抗原肽的组合。例如，靶细胞文库可以被工程化，使得各种靶细胞群体表达不同的抗原肽。群体中不同的抗原肽可以是随机的，诸如来自抗原表达文库的多种抗原肽。可以合理选择群体中不同的抗原肽。如上文讨论的，用于合理选择的标准包括但不限于选择已知存在于受试者或患者中的抗原肽。

抗原肽可以源自肿瘤抗原、新抗原、肿瘤新抗原、病毒抗原、磷酸化抗原、细菌抗原、微生物抗原、组织特异性自身抗原和自身抗原。从其获得抗原肽的抗原，即未加工的抗原，可以被提供至靶细胞，并依赖于靶细胞的内源性加工途径。用于提供未加工的抗原的方法可以取决于期望的加工途径和/或待靶向的MHC分子来选择。例如，可以取决于是否期望在MHC I类、MHC II类上呈递或交叉呈递来选择不同的方法。可以将未加工的抗原以多肽的形式提供至(即，递送至)靶细胞。多种递送未加工的抗原的方法是本领域已知的，诸如电穿孔、细胞穿透肽融合、蛋白转染、纳米颗粒递送以及囊泡介导的递送。其他非常适于递送至MHC II类呈递途径的方法包括，但不限于，靶向未加工的抗原或表达未加工的抗原的细胞以进行APC吞噬，诸如抗体靶向和其他形式的调理作用。靶向至吞噬途径也可以被用于将未加工的抗原靶向至交叉呈递途径。也可以通过递送编码未加工的抗原的多核苷酸序列而将未加工的抗原提供至靶细胞。编码未加工的抗原的多核苷酸序列可以采用本文先前描述的任何编码抗原的多核苷酸序列的形式。当未加工的抗原在细胞内被表达时，通过递送多核苷酸序列来递送未加工的抗原可以在将未加工的抗原靶向至MHC I类呈递途径方面具有特定用途。

未加工的抗原也可以被修饰以靶向至蛋白酶体途径，特别是在一些情况下靶向至免疫蛋白酶体，诸如通过未加工的抗原的泛素化。也可以刺激靶细胞以增加蛋白酶体活性，特别是在一些情况下增加免疫蛋白酶体活性，诸如通过干扰素-γ(IFNγ)刺激。

接触

如本文使用的，“接触”是指将表达抗原特异性TCR的细胞或表达结合分子的细胞带到靶细胞附近并处于足以与靶细胞相互作用的条件下的任何方法。通常，接触包括将细胞在足以胞啃发生的条件下，诸如在细胞培养环境中(例如，在培养箱中)一起孵育。接触可以包括将细胞在容器中一起孵育，所述容器诸如多孔板的孔、组织培养处理的板的孔、组织培养处理的多孔板的孔、细颈瓶、组织培养处理的细颈瓶、微量离心管、培养管、试管、圆底管或锥形管。接触可以包括将细胞混合在一起，诸如通过机械扰动细胞，使得允许它们一起相互作用，机械扰动诸如通过旋转、吸移、颠倒、涡旋或振荡。可以将细胞连续混合，或者可以混合一定时间段，并且然后允许保持不扰动，直至进一步处理。

膜组分

如本文使用的，“膜组分”是指与细胞膜相关的任何分子。通常，膜组分还指允许区分细胞的任何分子，诸如通常与表达抗原特异性TCR的细胞或表达结合分子的细胞相关但与靶细胞不相关的膜组分，或者反之亦然。

膜组分可以是与表达抗原特异性TCR的细胞或表达结合分子的细胞相关的膜组分，即，在胞啃期间从表达抗原特异性TCR的细胞或表达结合分子的细胞转移至靶细胞的膜组分。表达抗原特异性TCR的细胞的膜组分可以是通常与T细胞相关的膜组分，诸如TCR；TCR共受体、CD3 TCR共受体、CD4 TCR共受体、CD8 TCR共受体或通常存在于T细胞上的任何其他组分。

膜组分可以是与靶细胞相关的膜组分，即，在胞啃期间从靶细胞转移至表达抗原特异性TCR的细胞或表达结合分子的细胞的膜组分。在旨在鉴定TCR表位的实例中，与靶细胞相关的膜组分可以是MHC分子。

细胞可以被工程化以具有外源性膜组分，诸如跨膜蛋白、膜相关蛋白、表面受体、荧光分子、细胞表面蛋白、糖或脂质。例如，细胞可以被工程化以表达包含细胞外结构域的多肽，所述细胞外结构域诸如通常被用作转导或转染标志物的那些蛋白(例如LNGFRΔ)。用于使细胞工程化的方法可以是本文先前描述的任何方法，诸如使用编码本文先前描述的多肽的任何多核苷酸系统。外源性膜组分可以包含可检测标志物，诸如荧光团(例如，加GFP加标签的膜组分)。外源性膜组分可以包含胞内酶(例如，β-内酰胺酶)，并且可以用于这样的系统中，其中接收膜组分的细胞还将包含酶底物，使得在胞啃之后，转移的胞内酶可以将底物转化为可检测分子。外源性膜组分可以包含转录因子，并且可以用于这样的系统中，其中接受膜组分的细胞还将包含释放转录因子的手段(例如，TEV蛋白酶系统)，使得在胞啃之后，转移的转录因子将被释放并启动可检测分子的表达(即，活化报道物基因)。外源性膜组分可以通过与细胞膜的相互作用而缔合，即不具有跨膜基序。

膜组分也可以被标记。例如，在胞啃反应的孵育之前，可以用可检测分子或反应性基团来标记膜组分。可以用反应性基团进行标记，使得在胞啃之后，可以用可检测标志物(例如荧光团)来进一步标记膜组分。反应性基团对包括但不限于链霉亲和素/生物素系统、巯基基团(例如，半胱氨酸)和马来酰亚胺、金刚烷和环糊精、氨基基团和羧基基团、以及叠氮基基团和炔基基团。标记可以是特异性的，诸如用反应性基团或荧光团缀合的抗体进行染色。抗体可以包括本领域技术人员已知的抗体片段或抗体形式。标记可以是非特异性或半特异性的，诸如用缀合至反应性基团或荧光团的蛋白反应性分子进行标记。标记可以包括直接标记细胞膜，诸如用脂质反应性染料(例如，DiOC₁₈(3)[Thermo Fisher])进行标记。

膜组分在胞啃期间可以从膜组分通常与之相关的另一细胞转移至感兴趣的细胞，在此期间膜组分必然从膜组分通常与之相关的另一细胞丢失。多于一种膜组分可以转移至感兴趣的细胞。多于2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、30种、40种或50种或更多种膜组分可以转移至感兴趣的细胞。

分离

如本文使用的，“分离”是指将感兴趣的细胞、细胞类型或细胞群体与其他细胞群体分离，并且通常包括感兴趣的细胞相对于其他细胞的富集。可以分离本文描述的任何细胞，诸如靶细胞或表达TCR的细胞。分离可以包括基于感兴趣的细胞的特性，诸如具有从另一细胞转移(即，接收)的膜组分，将感兴趣的细胞与其他细胞分离。例如，分离可以包括鉴定(即，检测)转移的膜组分，并且可以是转移的膜组分的获得或转移的膜组分的丢失。可以使用多种标记试剂来鉴定转移的膜组分，诸如抗体、包含反应性基团的标志物和脂质反应性标志物。例如，对膜组分特异性的抗体可以被用于鉴定转移的膜组分，该抗体与可检测标志物(例如，荧光团)直接地缀合或者可被另一种标记试剂(例如，缀合至荧光团的二抗)识别。在另一个实例中，包含对官能化膜组分特异性的反应性基团的标志物可以被用于鉴定转移的膜组分，诸如使用荧光链霉亲和素来鉴定生物素化的膜组分。分离还可以包括鉴定转移的膜组分，同时鉴定感兴趣的细胞的其他特性，诸如细胞类型(例如鉴定T细胞)或活化/信号传导状态(例如鉴定PD-1、CD39、CD137或细胞因子产生)。

可以分离感兴趣的细胞，使得分离的细胞群体仅包含或基本上包含感兴趣的细胞。可以分离感兴趣的细胞，使得分离的细胞群体的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少90％是感兴趣的细胞。可以分离感兴趣的细胞，使得分离的细胞群体的至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％是感兴趣的细胞。可以分离感兴趣的细胞，使得分离的细胞群体的约100％是感兴趣的细胞。可以分离感兴趣的细胞，使得分离的细胞群体的约25％、约37％、约86％或约95％是感兴趣的细胞。

分离可以包括使用微流体装置。例如，分离可以包括荧光激活细胞分选(FACS)，其中基于与感兴趣的细胞相关的荧光来分离或“分选”细胞。可以使用缀合至荧光分子的抗体对细胞进行染色(即，接触或混合)。也可以使用一组缀合至不同荧光分子的抗体对细胞进行染色。可用于分离的抗体可以基于它们区分感兴趣的细胞与其他细胞的能力来选择，诸如识别先前膜组分的抗体或识别特定细胞类型的抗体。细胞也可以表达荧光分子或被工程化以表达荧光分子。可以通过FACS将细胞分离到大批量收集容器中(例如，将每一种分离的感兴趣的细胞收集在同一容器中)。也可以通过FACS将细胞分离到单独的收集容器诸如多孔板中。单独的收集容器可以是单细胞反应容器，诸如在单细胞DropSeq应用中形成的那些。

分离可以包括使用磁体(即，磁性分离步骤)。例如，磁珠或磁性纳米颗粒(诸如将抗体缀合至珠或纳米颗粒)可以被官能化以捕获感兴趣的细胞。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒包括磁性氧化铁。磁性颗粒的实例包括但不限于Dynabeads^TM(Thermo Fisher)。磁性分离可以包括以下步骤：用磁体将感兴趣的细胞捕获到壁上，并且去除未被捕获到壁上的其他细胞或其他成分。磁性分离可以包括使用可以基于磁性特性分离细胞的柱，诸如磁激活细胞分选(MACS)方法。磁性分离可以包括使用可以基于磁性特性分离细胞的微流体装置。磁性纳米颗粒可以是荧光性的或者被直接地或间接地附接至荧光团，并且磁分离方法可以与FACS结合使用(例如，在FACS之前、在FACS之后、或在FACS之前和之后)。

分离可以包括使用珠捕获。例如，珠或纳米颗粒可以被官能化以捕获感兴趣的细胞，诸如将抗体缀合至珠或纳米颗粒。纳米颗粒可以是聚苯乙烯颗粒、表面、珠或聚合物。珠的实例包括但不限于琼脂糖珠和琼脂糖凝胶珠。珠捕获可以包括施加的力，诸如离心或重力，以分离细胞。在特定实施方案中，颗粒或纳米颗粒可以是荧光性的或者被直接地或间接地附接至荧光团，并且重力分离方法可以与FACS结合使用(例如，在FACS之前、在FACS之后、或在FACS之前和之后)。如果是磁性的，则纳米颗粒使用结合FACS的磁性方法来分离(例如，在FACS之前、在FACS之后、或在FACS之前和之后)。

测序

可以使用多种测序方法来确定本文描述的任何感兴趣的多肽序列(例如抗原肽或TCR肽)，诸如对编码感兴趣多肽的多核苷酸进行测序。多核苷酸测序方法包括但不限于桑格测序和下一代测序(NGS)。NGS方法包括但不限于合成测序平台、Illumina/Solexa平台(例如，HiSeq和MiSeq)、454焦磷酸测序平台(Roche)和SOLiD平台(Applied BioSystems)。

也可以确定序列的部分，诸如确定TCR的一个或更多个可变结构域或互补决定区。

在多核苷酸测序之前，可以对本文描述的任何感兴趣的多核苷酸序列(例如从感兴趣的细胞提取的多核苷酸序列)进行纯化。感兴趣的特定多核苷酸序列可以是基因组DNA、载体DNA、质粒DNA、mRNA、通过PCR扩增的DNA和通过逆转录产生的cDNA。可以使用本领域熟知的技术来纯化多核苷酸，诸如酚-氯仿提取(phenol-chloroform extraction)、琼脂糖凝胶分离、基于硅胶柱的纯化、氯化铯、类似的纯化方法或其组合。可以基于待纯化的感兴趣的特定多核苷酸来选择特定纯化方法。还可以在测序前纯化和进一步加工感兴趣的多核苷酸序列，诸如通过PCR方法扩增、加条形码、用测序衔接子修饰、逆转录、或制备用于测序的任何其他过程。被进一步加工的多核苷酸序列还可以经受另外轮次的纯化。

测序之后，可以分析测序结果以鉴定感兴趣的特定多核苷酸序列。

可用于确定感兴趣的多肽序列的其他方法包括但不限于肽测序和质谱术。例如，可以将抗原肽从分离的靶细胞上的MHC分子洗脱，并且可以通过质谱术来确定肽序列。

条形码

DNA条形码可以被直接地或间接地缀合至膜组分。例如，条形码可以被缀合至对膜组分特异性的抗体。用于将DNA寡核苷酸缀合至抗体的方法和试剂是本领域技术人员已知的，诸如商业试剂盒(例如，Solulink All-in-One抗体-寡核苷酸缀合试剂盒)。条形码可以是对特定细胞群体，诸如表达特定TCR的细胞特异性的；或者条形码可以是对特定细胞混合物，诸如表达特定TCR的细胞与表达特定抗原肽的另一种细胞混合物特异性的。

条形码通常包含随机核苷酸序列。随机核苷酸序列的长度可以是6-20个之间、6-15个之间、6-12个之间、6-10个之间、或6-8个之间的核苷酸。随机核苷酸序列可以位于通用序列之间，诸如可用于PCR介导的条形码扩增和/或附接可用于NGS的测序衔接子的通用引物序列，例如通用引物序列可以在DNA条形码的侧翼。寡核苷酸(即，条形码)可以采用以下形式：UPS1-NAANGGNAANGGNAAN-UPS2，其中N表示随机核苷酸。通用引物序列UPS1和UPS2可以不包含相邻的AA或GG二核苷酸。

抗体可以是针对细胞表面上的蛋白(例如，内源性蛋白，诸如CD8a、CD3e、TCR-β、CD2，或外源性蛋白，诸如LNGFR、表面表达的表位标签)的商业抗体。

加条形码的细胞，例如，用加条形码的抗体标记的细胞，可以被汇集。例如，可以用对每种特定TCR独特的DNA寡核苷酸对各自表达特定TCR的多于一种细胞加条形码，并且然后汇集以形成表达抗原特异性TCR的细胞群体的文库。可以产生表达抗原肽的细胞(例如，靶细胞)，诸如用DNA寡核苷酸加条形码的细胞的文库，所述DNA寡核苷酸对独特抗原肽(例如针对抗原肽文库)、独特MHC等位基因(例如针对MHC等位基因文库)、或独特抗原肽和MHC等位基因对(例如针对MHC:表位对文库)是独特的。可以将加条形码的细胞，包括汇集的加条形码的细胞，与其他细胞混合，并且在胞啃反应中一起孵育。例如，可以将表达加条形码的TCR的细胞的文库与表达抗原肽的细胞的文库混合(即接触)。

胞啃之后，可以分离包含加条形码的膜蛋白的感兴趣的细胞。可以使用本文描述的任何分离方法。可以对分离的加条形码的细胞测序以确定条形码序列和信息，以用于确定转移的膜组分来源的细胞(例如，表达特定TCR的细胞)的身份，以及随后确定已知由转移的膜组分来源的细胞表达的任何感兴趣的蛋白或多核苷酸(例如，由TCR文库表达的特定TCR)的身份。可以使用本文描述的任何测序方法。除了确定条形码序列，可以确定其他感兴趣的序列，诸如抗原肽序列。在一个实例中，分析所有独特的条形码以确定群体中存在的所有独特的条形码。在旨在鉴定TCR表位的实例中，分析可以用于确定群体内TCR和/或抗原肽的总体频率。在另一个实例中，以单细胞形式(例如，通过Drop-Seq)分析独特的条形码，以确定对单细胞独特的所有独特的条形码，并且独特的条形码可以包括一个独特的条形码或多于一个独特的条形码(例如，多于一个细胞可能已经与分离的细胞相互作用)。在旨在鉴定TCR表位的实例中，分析可以用于确定TCR与特定抗原肽的特异性配对。

配体鉴定的方法

胞啃方法可以被应用于TCR表位鉴定之外的多种基于细胞的结合相互作用。相应地，本文还提供了配体鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供一种或更多种表达配体特异性结合分子的细胞群体；b)提供一种或更多种靶细胞群体，其中靶细胞群体呈递能够被一种或更多种配体特异性结合分子结合的一种或更多种配体；c)使一种或更多种表达配体特异性结合分子的细胞群体与一种或更多种靶细胞群体接触，其中接触包括提供足以用于至少一种表达配体特异性结合分子的细胞特异性结合至少一种靶细胞的条件，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在表达配体特异性结合分子的细胞与靶细胞之间转移；以及d)分离或已经分离i)感兴趣的靶细胞，其中感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从表达配体特异性结合分子的细胞转移的一种或更多种膜组分；以及任选地ii)感兴趣的表达配体特异性结合分子的细胞，其中感兴趣的表达配体特异性结合分子的细胞包含在接触步骤(c)之后从靶细胞转移的一种或更多种膜组分；e)确定或已经确定i)编码与感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种配体的序列的至少一部分，或ii)编码与感兴趣的表达配体特异性结合分子的细胞相关的结合分子肽的结合分子序列的至少一部分。

例如，其他结合相互作用包括但不限于与结合分子的配体特异性相互作用，所述结合分子诸如免疫受体、免疫球蛋白、抗体或其片段、受体、嵌合受体、嵌合抗原受体(CAR)、信号传导受体、细胞表面受体、跨膜受体或适体。抗体片段或抗体形式包括但不限于Fab片段和Fab融合形式、Fv片段和Fv融合形式、单链抗体形式、scFv、串联scFv、单可变结构域形式(例如，骆驼科(camelid)VHH)，以及本领域技术人员已知的其他抗体片段或形式。示例性抗体和抗体片段形式在Brinkmann等人(MABS,2017,第9卷,第2期,182-212)中详细描述，关于该文献教导的全部内容通过引用并入本文。相应地，可以确定结合分子的配体的身份，诸如抗原、表面抗原、表位、非经典MHC呈递的抗原和受体配体的身份。可以使用表达感兴趣的结合分子的任何细胞，诸如表达膜相关抗体的B细胞。可以使用表达感兴趣的配体(诸如抗体识别的抗原)的任何细胞。

本文先前描述的多种方法、技术和方面中的任一种都可以被应用于配体和结合分子的鉴定，诸如描述了可用于细胞的工程化、感兴趣的细胞的分离、多核苷酸的纯化、多核苷酸的测序和肽序列的确定的系统和组分的那些方法、技术和方面。

本发明的组合物

本文还提供了分离的感兴趣的靶细胞，其中靶细胞包含：i)一种或更多种T细胞膜相关组分，其中靶细胞不包含编码一种或更多种T细胞膜组分的内源性多核苷酸序列；以及ii)一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因，其中一种或更多种抗原肽被呈递在一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上。一种或更多种抗原肽可以由一种或更多种抗原多核苷酸序列编码。抗原肽可以是本文先前描述的任何抗原肽。靶细胞可以是本文先前描述的任何细胞，诸如本文先前描述的任何工程化细胞。T细胞膜相关组分可以是本文先前描述的任何膜组分，诸如本文先前描述的通常与T细胞相关的任何膜组分或任何外源性膜组分。MHC等位基因可以是本文先前描述的任何MHC分子。

可以应用本文先前描述的多种方法、技术和方面中的任何一种，诸如描述了可用于细胞的工程化和感兴趣的细胞的分离的系统和组分的那些方法、技术和方面。

本文还提供了从任何分离的感兴趣的靶细胞纯化的多核苷酸序列。

实施例1：方法

细胞系和原代细胞

HEK-293T、Jurkat E6-1和K562细胞从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得。原代人类PBMC购自UCLA艾滋病研究所(AIDS Institute)的CFAR Virology Core实验室。HEK-293T细胞在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS；Corning,NY)和100U/ml青霉素/链霉素(Mediatech Inc.,Manassas,VA)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；MediatechInc.,Manassas,VA)中培养。Jurkat和K562细胞在补充有10％(v/v)FBS、10mM HEPES(Thermo Fisher,Waltham,MA)、50μMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、1x MEMNEAA(Thermo Fisher,Waltham,MA)和1mM丙酮酸钠(Mediatech Inc.,Manassas,VA)的RPMI1640培养基(Mediatech Inc.,Manassas,VA)中培养。所有细胞在37℃在5％大气CO₂的情况下培养。

根据呈HLA-A*02:01阳性、具有足够的基线活组织检查物以及在治疗过程中的(on-treatment)活组织检查物并且在参加pembrolizumab的I期试验时表现出客观肿瘤反应来选择患有转移性黑素瘤的患者以进行本发明的分析。患者#1和患者#2每3周接受静脉内10mg/kg单剂pembrolizumab(10Q3W)。从12周开始评估肿瘤反应，在首次反应后4周进行确认，并且此后每12周进行成像。反应通过实体肿瘤反应评估标准(the ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST)和免疫相关反应标准(irRC)两者来表征。肿瘤活组织检查物和外周血细胞收集及分析由UCLA IRB11-001918和11-003066批准。在基线和治疗过程中获得来自所分析患者的肿瘤活组织检查物，并且将一份等分试样立即于福尔马林中固定，随后进行石蜡包埋用于病理分析，将第二份等分试样通过立即浸入液氮中速冻用于遗传分析，以及将第三份新鲜等分试样在无菌条件下切碎，随后进行DNA酶/胶原酶消化以产生单细胞悬浮液(s.c.s)，然后冷冻保存在液氮中。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从新鲜全血制备外周血单核细胞(PBMC)并冷冻保存。使用抗CD3抗体(OKT3，50ng/mL，暴露48小时)和IL-2(300IU/mL)从冷冻保存的s.c.s扩增肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，并在2-4周后以5×10⁶个细胞/mL再冷冻保存。在使用的早上，将TIL解冻并用DNA酶处理45min，并用CD4抗体(BV510，BioLegend,San Diego,CA)和CD8+抗体(BV605，BioLegend,SanDiego,CA)染色。将CD4和CD8+单阳性细胞的活的(7AAD阴性)群体使用FACS细胞分选仪(BDBiosciences,San Jose,CA)进行分选。

DNA构建体

编码携带人类或鼠TCR恒定区的F5 TCR、1G4 TCR或neoTCR基因的基于MSGV的逆转录病毒载体(编码TERT的MSCV载体是来自Eugene Barsov实验室的友好惠赠，其限制性序列被修饰以促进TCR基因克隆)具有LNGFRΔ-P2A-TCRα-F2A-TCRβ的形式。LNGFRΔ是一种转导标志物，其包含细胞内结构域被截短的低亲和力神经生长因子受体，并且通过表面染色可检测。MSGV逆转录病毒载体也被用于CD8转导。如描述的³²，用二硫化物诱捕(disulfidetrap)修饰来制备慢病毒载体(修饰的pHAGE6骨架是来自Richard Mulligan实验室的友好惠赠，其限制性序列被修饰以促进SCT和MHC基因克隆)，所述慢病毒载体编码ZsGreen/eGFP和肽-MHC单链三聚体(SCT)，包含通过柔性GS接头连接的抗原肽(NY-ESO-1，SLLMWITQV；MART1，ELAGIGILTV；USP7mut，YLTHRVDVI)、β2-微球蛋白和HLA-A2结构域。pHAGE6慢病毒载体也被用于转导呈非SCT形式的HLA-A2基因，例如，用于A2-K562细胞。将E2-Crimson亚克隆到慢病毒载体中。将编码CD3δ、CD3ε、CD3γ和CD3δ的CD3融合基因亚克隆到共表达E2-Crimson的慢病毒载体中。

细胞系构建

编码F5 TCR、1G4 TCR、neoTCR或CD8的逆转录病毒根据制造商的方案，通过使用TransIT-293(Mirus Bio，Madison，WI)瞬时转染基于逆转录病毒的质粒及其包装载体(pRD114和pHIT60)在HEK-293T细胞中产生。编码E2-Crimson、SCT、HLA-A2或CD3/E2-Crimson的慢病毒通过瞬时转染基于慢病毒的载体及其包装载体(psPAX2和pMD2.G)在HEK-293T细胞中产生。转染后48小时，收集病毒，通过0.45μm注射器过滤器过滤，并且用于感染。在2,500rpm和30℃，用补充有10μg/mL聚凝胺(polybrene)的病毒上清液旋转感染(spin-infect)Jurkat细胞或K562细胞90min。感染后第3天，通过流式细胞术来分选TCR^高、TCR^高E2-Crimson+、TCR^高CD8^高、A2^高eGFP^高、或A2^高Zsgreen^高K562(CD3-或CD3+)细胞或Jurkat细胞，以建立如指示的衍生细胞系。对于SCT-K562文库细胞，对eGFP+K562细胞进行分选。

T细胞活化和转导

如先前描述的刺激、转导和培养T细胞³²。为了转导原代人类T细胞，在涂覆有1μg/mL抗CD3(克隆OKT3，eBioscience,San Diego,CA)的24孔板中，在1μg/mL可溶性抗CD28(克隆CD28.2，eBioscience,San Diego,CA)和300U/mL IL-2(Fisher Scientific,Tustin,CA)的存在下，在T细胞培养基(补充有5％(v/v)人类AB血清和抗生素(青霉素/链霉素)的AIM-V培养基)中活化PBMC(2×10⁶个细胞/mL)。活化48小时后，在2,500rpm和30℃用补充有10μg/mL聚凝胺的病毒上清液旋转感染细胞90min。旋转感染后，用含有300U/mL IL-2和1μg/mL抗CD28的新鲜T细胞培养基替换逆转录病毒上清液。将转导的原代T细胞培养48小时，并且然后用于细胞毒性测定。

表面生物素标记

将F5-Jurkat细胞以1000万个细胞/mL重悬于新鲜制备的生物素溶液(1mg/mL，在无菌PBS中，Thermo/Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 100mg[21335]或8×1mg No-Weight[21327]形式)中，并在室温孵育10min。细胞用1等量的FBS猝灭，并且在4℃孵育10min，然后用10mL补充有FBS的RPMI 1640培养基洗涤3次。然后将标记的细胞用于共孵育实验。

A2-K562细胞的肽装载

将冻干肽(Thermo Fisher,Waltham,MA)在DMSO中重构为10mM，并且然后在水中进一步稀释为2mM工作储存液。使用50μM起始溶液(5μL2mM工作储存液在195μL无血清培养基(SFM)中)对肽进行5倍系列稀释，直至达到80nM。将靶A2-K562细胞(总计50K个，0.5×10⁶个细胞/mL)在96孔的U形底板中用25μL的5×系列肽稀释液脉冲，并在37℃孵育2小时。孵育之后，向每个孔添加100μL培养基，并且然后以1500rpm离心5min。将细胞沉淀物用200μL培养基洗涤一次，并且然后重悬于100μL培养基中用于共孵育实验。

共孵育测定和细胞染色/分选

对于使用F5-Jurkat、1G4-Jurkat、MART1-K562和NYESO-K562的实验，共孵育在96孔U形底板中以5:1Jurkat-比-K562的比例设置(每孔300K个细胞)，并在37℃共孵育45min。涉及SCT-Jurkat细胞和TCR-K562细胞的共孵育实验的比例在文本和附图描述中示出。然后将共培养物以1500rpm离心5min，并通过真空抽吸培养基。将细胞沉淀物用含有2mM EDTA的冷PBS溶液重悬，然后离心。将细胞在4℃用不同的抗体染色20min，洗涤两次，并且然后使用MACSQuant分析仪10(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)通过流式细胞术进行分析。使用以下抗体检测表面标志物的表达：抗CD3-PE(克隆UHCT1)、抗CD8-BV510(克隆HIT8a)、抗TCRαβ-PacificBlue(克隆IP26)、抗TCRαβ-PE/Cy7(克隆IP26)、抗LNGFR-PE(克隆ME20.4)、抗LNGFR-APC(克隆ME20.4)、抗HLA-A2-PacificBlue(克隆BB7.2)、抗HLA-A2-BV510(克隆BB7.2)和抗muTCRαβ-PE/Cy7(克隆H57-597)(全部来自Biolegend,San Diego,CA)。

与A2限制性SCT和新抗原SCT文库的共孵育实验

对于F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞(E2-Crimson+)与A2限制性SCT文库细胞(eGFP+)的共孵育，将480万F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞与240万表达A2限制性SCT文库的K562细胞在37℃共孵育45min。如先前描述的对细胞进行染色，并且通过对TCR^高染色设门的FACS来分选胞啃⁺靶K562细胞(还将K562-SCT细胞对eGFP+设门，并将Jurkat-TCR对E2-Crimson+设门)。对于A2限制性新抗原SCT文库共孵育，将200万供体细胞与100万受体细胞在37℃共孵育45min。与A2限制性SCT文库共孵育类似地制备细胞用于通过FACS分选。

SCT-K562细胞上的dextramer结合

如先前描述的，通过使用荧光标记的链霉亲和素(Life Technologies,Carlsbad,CA)来制备F5 TCR或1G4 TCR dextramer³²。在室温用TCR dextramer和7AAD(eBioscience,San Diego,CA)对SCT转导的K562细胞染色20min。使用MACSQuant分析仪10(MiltenyiBiotec,Bergisch Gladbach,Germany)通过流式细胞术来分析经染色的细胞。

使用钙黄绿素AM对原代人类T细胞进行细胞毒性测定

为了测量效应T细胞对靶细胞的细胞毒性反应，如先前描述的进行了基于钙黄绿素AM释放的细胞毒性测定³⁴。简而言之，将1×10⁶个SCT-K562靶细胞重悬于1mL的含有(5μL/mL)钙黄绿素AM(Thermo Fisher，Waltham，MA)的细胞培养基中，在37℃孵育1小时，同时偶尔摇动，然后用细胞培养基洗涤两次以去除残留染料。将用F5 TCR或neoTCR转导的效应T细胞和靶SCT细胞以多个的效应物比靶的比例(16:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0.5:1、0:1)铺在96孔的U形底板上，并在37℃共孵育4小时。共孵育之后，将无细胞上清液仔细取出，并使用荧光板读取器分析(激发滤光片485nm，发射滤光片530nm)。基于测量的光密度，使用公式[(测试释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100来计算特异性裂解的百分比。自发释放孔中的靶细胞与单独的培养基一起孵育(被认为是0％裂解)，而最大释放孔中的靶细胞与2％Triton X-100一起孵育(被认为是100％裂解)。

表位选择

A2限制性SCT cDNA文库包含来自免疫表位数据库(IEDB)的约12,055种公共T细胞A2限制性表位。

新抗原SCT cDNA文库包含约3,000种独特的新抗原，这些新抗原通过对来自黑素瘤患者的肿瘤材料的外显子组/RNA测序及预测通过HLA-A*02:01的新抗原呈递而被独立鉴定出。从速冻肿瘤活组织检查物同时提取了DNA和RNA两者(Qiagen AllPrep试剂盒)。在UCLA临床微阵列核心(the UCLA Clinical Microarray Core)对来自肿瘤和匹配的正常血液样品的DNA进行测序。使用Nimblegen SeqCap EZ人类外显子组文库v3.0(Roche)进行外显子捕获后，在HiSeq 2000平台(Illumina,San Diego,CA)上进行了双端(paired-end)2×100bp测序，所述文库靶向65Mb的基因组。测序产生60亿-100亿个读段/样品，每个靶向的碱基由平均90-150个读段覆盖。使用BWA-mem算法(v0.7.9)将序列与UCSC hg19人类基因组参考进行比对。预处理遵循GATK Best Practices Workflow v3，包括重复删除(duplicateremoval)(Picard Tools)、插入/缺失(indel)重比对、和碱基质量评分重校准。用由³⁵修改的方法，使用MuTect(v1.1.7)³⁶、Varscan2 Somatic(v2.3.6)³⁷和GATK-HaplotypeCaller(HC,v3.3)来调用体细胞突变。仅高置信度突变被保留，被定义为三个程序中至少两个鉴定出的突变。对于GATK-HC，使用肿瘤/正常对之间的单侧Fisher精确检验来确定体细胞变异(P值截止值≤0.01)。变体由Oncotator注释³⁸，非同义突变是被分类为以下的突变：无义突变、错义突变、剪接位点(Splice_site)突变、或终止密码子突变(Nonstop Mutation)，以及移码(Frame_Shift)、阅读框内(In_Frame)或改变起始密码子(Start_Codon)的插入/缺失。通过ATHLATES从全外显子组测序数据进行HLA分型。根据制造商的说明书，使用IlluminaHiSeq2500平台，对使用IlluminaTruSeq RNA样品制备试剂盒制备的100-bp双端文库进行RNA测序。使用TopHat2 v2.0将读段映射至hg19³⁹，并且使用Cufflinks v2.2.1⁴⁰程序和CuffNorm进行定量和归一化，以使用几何归一化方法按文库大小(每百万个映射的片段中映射到外显子的每千碱基的片段数(fragments per kilobase of exon per millionfragments mapped)，FPKM)产生归一化的表达表。利用Biopython和pysam包通过定制的Python(v2.7.3)脚本来鉴定包含突变的RNA读段，并且通过在Integrated GenomicsViewer(IGV)中目视检查进行验证。在每个非同义氨基酸改变突变周围的滑动窗中，通过netMHC3.4⁴¹针对9-mer肽和10-mer肽产生对HLA-A02:01的肽结合预测。(肽序列源自Ensembl GRCh37 release 74.)按以下将候选肽分箱(bin)：1)具有通过RNA测序(RNA-seq)鉴定的包含突变的读段的肽，2)具有RNA表达(FPKM>0)但没有鉴定的突变读段的肽，和3)所有其他没有可检测的RNA测序表达的肽。在每个箱内将肽按HLA结合亲和力进行排序和分选。

文库产生

合成了编码A2限制性公共表位和新表位的寡核苷酸汇集物(Twist Bioscience,San Francisco,CA)并且用作模板，使用引物5'-CAGGAGGGCTCGGCA-3'和5'-GATGAGCGGCCGCCGGACCCTCCGC ATCC-3'用以下程序进行PCR扩增：初始变性步骤在95℃持续2min，随后是95℃持续20秒、61℃持续10秒和70℃持续15秒的6个循环，然后是在70℃持续1min的最终延伸，随后4℃保持。在寡核苷酸文库的PCR扩增之后，将PCR扩增子用NotI消化，然后通过In-Fusion克隆插入BsmBI线性化的慢病毒载体(pCCLc骨架是来自Don Kohn实验室的友好惠赠，限制性序列被修饰以促进SCT和MHC基因克隆)中，该慢病毒载体具有IRES介导GFP基因的共表达。

PCR扩增和深度测序

使用PureLink Genomic DNA Mini试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取经分选的SCT-K562细胞的基因组DNA并且用作模板，在Mastercycler Pro S PCR System(Eppendorf,Hamburg,Germany)中用以下程序进行加条形码的PCR扩增：初始变性步骤在95℃持续2min，随后是95℃持续20秒、66℃持续10秒和70℃持续15秒的35个循环，然后是在70℃持续2min的最终延伸，随后4℃保持。用于PCR扩增的引物如下：TruSeq-Univ-SCTfixed-Forward：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGCCTGCTTTGT TTGCC-3'，TruSeq-Read2-SCTfixed-Reverse：5'-GTGACTGGAGTTCAGAC GTGTGCTCTTCCGATCTCCTCCACCACCGCTACCTC-3'和Truseq-Adapter-Index反向引物。遵循制造商的方案，使用DNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA)来纯化扩增的PCR。扩增的加条形码的DNA通过Bioanalyzer(Agilent Genomics,Santa Clara,CA)进行定量，并通过Iliumina Genome Analyzer IIx System(Illumina,San Diego,CA)进行测序。

实施例2：抗原特异性靶细胞胞啃从T细胞至APC靶细胞发生，并且可以通过多种蛋白转移进行跟踪

描述了基于胞啃的细胞平台，其能够稳健地鉴定对感兴趣的孤儿TCR具有反应性的配体。建立了表达关联TCR抗原对的细胞系。将Jurkat T细胞用逆转录病毒载体转导，所述逆转录病毒载体共递送HLA-A2/MART1_26-35特异性F5 TCR基因和转导标志物(细胞内截短的低亲和力神经生长因子受体(LNGFRΔ))(图6a、图6b)。并行地，将K562细胞用慢病毒载体转导，所述慢病毒载体共递送HLA-A2/MART1_26-35(A27L)的单链三聚体(SCT)和作为转导标志物的ZsGreen(图6a、图6b)。将Jurkat T细胞用A2/NYESO1_157-165特异性1G4 TCR转导，并将K562细胞用A2/NYESO1_{157-165(C165V)}SCT转导，以建立第二对关联T细胞/靶细胞系。为了测试在抗原特异性相互作用后，T细胞膜组分是否被转移至靶细胞，我们修改了用于胞啃的测定¹⁸。标准测定包括用NHS-生物素标记靶细胞上的表面蛋白，并且然后使用荧光链霉亲和素监测生物素化的膜蛋白(即，膜组分)从靶细胞向反应性T细胞的转移。与此相反，本文监测膜组分以从反应性T细胞向靶细胞的相反方向的转移。用NHS-生物素标记T细胞表面蛋白(即，膜组分)，并且监测它们在共孵育期间向靶细胞的转移。共孵育后，对LNGFR⁺Jurkat T细胞和ZsGreen⁺K562细胞分别设门(图1a)，并且用荧光链霉亲和素评估表面生物素化。如预期的，用NHS-生物素处理的Jurkat T细胞被链霉亲和素强烈染色(图1b)，而未与生物素化的Jurkat细胞共孵育的K562是链霉亲和素阴性的(图1c，左侧两个峰)。生物素化的F5-Jurkat细胞与非关联NYESO1-K562细胞的共孵育导致链霉亲和素染色偏移>30倍，表明非特异性生物素转移至靶细胞(图1c，从右侧起第二个峰)。然而，生物素化的F5-Jurkat细胞与关联MART1-K562细胞的共孵育导致该非特异性转移的进一步3.5倍的转移，证明了抗原特异性靶细胞胞啃(图1c，右侧峰)。有趣的是，当将MART1-K562细胞与F5-Jurkat细胞共孵育时，代表非生物素化的膜组分的LNGFR和TCR两者也表现出相似的2-3倍偏移，而当与非关联NYESO1-K562细胞共孵育时，LNGFR和TCR均没有可检测到的非特异性偏移(图1a、图1d)。使用单独的抗体(即不使Jurkat T细胞生物素化)进行了单独的实验，以监测T细胞蛋白向靶细胞的转移。NYESO1-K562细胞和MART1-K562细胞两者当与表达其各自关联TCR的Jurkat T细胞而不是表达非关联TCR的Jurkat T细胞一起孵育时，显示出LNGFR和TCR染色的偏移，确认了靶细胞胞啃的抗原特异性(图1e)。除了LNGFR和TCR之外，还观察到其他膜蛋白以抗原依赖性方式的转移，包括CD3和CD8从Jurkat细胞转移至K562细胞，以及HLA-A2从K562细胞转移至Jurkat细胞(图7a、图7b)。此外，观察到蛋白从供体细胞的伴随减少，包括HLA-A2从K562细胞的伴随减少以及TCR和LNGFR从Jurkat细胞的伴随减少(图7c、图7d)。因此，胞啃是双向的，并且观察到质量平衡。

为了确定胞啃是否依赖于供体细胞/受体细胞身份，产生了表达TCR或SCT的K562细胞系和Jurkat细胞系，并且使用所有配对组合进行了共孵育实验(TCR-K562与SCT-Jurkat，TCR-K562与SCT-K562，TCR-Jurkat与SCT-Jurkat)。观察到所有细胞对的抗原特异性TCR转移(图8a-图8c)，表明靶细胞胞啃独立于供体和受体细胞身份发生。

实施例3：胞啃是可滴定的，并通过CD8共表达而增强

被呈递在靶细胞上的pMHC复合物的密度对于TCR识别是重要的²¹。为了测试胞啃是否是定量地可滴定的，将F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞与用从0.016μM-10μM的范围的不同剂量的MART1变态肽(ELAGIGILTV)脉冲的表达HLA-A2的K562细胞(A2-K562)共孵育。如通过染色以确定TCR阳性百分比所定量的，胞啃⁺靶细胞的数目随着脉冲到A2-K562细胞上的MART1肽的剂量而增加(图2a上图和图9a)。当将F5-Jurkat细胞与用非关联NYESO1变态肽(SLLMWITQV)脉冲的A2-K562靶细胞共孵育时，胞啃⁺靶细胞的数目没有显著增加(图2a下图和图9b)。类似地，在与1G4-Jurkat细胞共孵育后，只有用递增剂量的关联NYESO1变态肽脉冲的A2-K562靶细胞的胞啃⁺靶细胞的数目增加(图2a和图9c、图9d)。这些数据表明靶细胞胞啃是pMHC密度依赖性的。

表达F5 TCR的T细胞对不同的MART1肽序列变体作出不同程度的反应²²。例如，F5TCR对变态ELA肽比对天然MART1 EAA肽更具反应性。检查了不同MART1肽变体引发胞啃的程度。将F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞与用相同剂量的不同MART1肽变体脉冲的A2-K562细胞共孵育。相比于与用天然EAA肽或其他肽变体脉冲的A2-K562细胞共孵育的F5-Jurkat细胞，在F5-Jurkat细胞与ELA肽脉冲的A2-K562细胞的混合物中观察到胞啃⁺靶细胞的百分比增加(图2b上图和图9e、图9f)。类似地，相比于用天然肽或其他肽变体脉冲的A2-K562细胞，当将1G4-Jurkat细胞与用变态NYESO1肽脉冲的A2-K562细胞共孵育时存在胞啃⁺靶细胞的百分比增加(图2b下图和图9g、图9h)。

CD8的共表达通过直接与MHC-I结合增加了TCR-pMHC相互作用的亲合力(avidity)，使亲和力较低的TCR能够接合²³。为了检查CD8是否增强胞啃，将用CD8转导的F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞与NYESO1-K562细胞和MART1-K562细胞一起孵育，并且测量了TCR向靶K562细胞的转移。通过对CD8a直接染色评估了CD8逆转录病毒转导。相对于仅表达TCR的Jurkat细胞，被工程化以共表达CD8的Jurkat细胞使胞啃增加了～3倍(图2c和图9i、图9j)。因此，结果表明靶细胞胞啃与TCR对所呈递的肽的反应性相关，并且还通过CD8的共表达而增强。

实施例4：靶细胞胞啃使得能够分离呈递关联表位的靶细胞

在先前描述的实施例中，靶细胞胞啃测定是在使得仅存在单一的T细胞-靶细胞对的条件下进行的，即，将一种表达TCR的T细胞衍生物与一种呈递表位的K562衍生物共孵育。然而，可能的是单独的相互作用/活化是抗原特异性的，而在相互作用/活化后，T细胞将膜转移至它们随后接触的任何细胞。活化的T细胞与非关联靶细胞之间潜在的相互作用将使文库应用复杂化，其中稀有的呈递关联表位的靶细胞将从多得多的呈递非关联表位的细胞中选择出。为了确定靶细胞胞啃是否能够分离呈递关联表位的靶细胞与呈递非关联表位的细胞，将1G4-Jurkat T细胞或F5-Jurkat T细胞与NYESO1-K562和MART1-K562靶细胞的1:1混合物共孵育。然后将细胞混合物用可溶性1G4或F5 TCR dextramer标记，允许确定经历胞啃的靶细胞的抗原组成(图10a)。当将NYESO1-K562和MART1-K562靶细胞的混合物与1G4-Jurkat细胞共孵育时，关联NYESO1-K562细胞的胞啃⁺靶细胞(HLA-A2⁺ZsGreen⁺LNGFR^高TCR^高)被高度富集(95.1％)(图10b、图10c)。在进行针对低染色的LNGFR和TCR的设门的胞啃^-靶细胞中，观察到非关联MART1-K562细胞的伴随富集(70.8％)超过关联NYESO1-K562细胞(23.7％)。类似地，靶细胞混合物与F5-Jurkat细胞的共孵育在胞啃⁺靶细胞中富集了MART1-K562(94.9％)，而在胞啃^-靶细胞中富集了NYESO1-K562(76.3％对比18.8％MART1-K562)。因此，靶细胞胞啃本身是抗原特异性的，并且能够分辨表达抗原的靶细胞与不表达抗原的细胞。

进行了概念验证文库模拟，以证明胞啃监测用于文库筛选应用的适用性。将NYESO1-K562细胞(表达ZsGreen)以1:10,000稀释到CD80⁺HLA-A2⁺K562细胞(不表达ZsGreen)(CD80⁺HLA-A2⁺K562细胞是来自Owen Witte实验室的友好惠赠)中。将稀释的混合物与1G4-Jurkat细胞或F5-Jurkat细胞共孵育，并且监测CD80^-ZsGreen⁺(NYESO1-K562)和CD80⁺ZsGreen^-(对照，HLA-A2⁺K562)靶细胞中的胞啃(图3a)。如预期的，在两种共孵育中，NYESO1-K562细胞占所有靶细胞的～0.01％。进行胞啃分析，并且观察到胞啃⁺NYESO1-K562靶细胞(HLA-A2⁺ZsGreen⁺LNGFR^高TCR^高)的百分比在与非关联对照F5-Jurkat细胞共孵育的NYESO1-K562(0.0％)和与关联1G4-Jurkat细胞共孵育的NYESO1-K562(70.8％)之间存在显著差异。相比之下，对照CD80⁺HLA-A2⁺K562细胞与任一种Jurkat细胞类型共孵育后，只观察到最小程度的胞啃，潜在地反映了背景水平(0.35％对比0.33％)。使用每10,000个对照细胞1个MART1-K562细胞进行了另外的实验，相应的K562-Jurkat细胞对产生了类似的结果：相对于1G4-Jurkat细胞，与关联F5-Jurkat一起孵育导致了胞啃⁺MART1-K562细胞的百分比增加(1.6％对比73.4％)，但是对于对照细胞，只有最小程度的胞啃(0.46％对比0.41％)(图3b)。因此，靶细胞胞啃可以用于检测至少低至1:10,000的比例的表达关联抗原的靶细胞。

在广泛配体文库的背景下进一步检查了靶细胞胞啃用于配体发现的应用。产生了A2限制性SCT cDNA文库，所述文库包含来自免疫表位数据库(IEDB)的12,055种公共T细胞表位，长度范围为从8-12个氨基酸，该文库包括对F5 TCR和1G4 TCR特异性的表位(分别为MART1和NYESO1)。将K562细胞用A2限制性SCT文库转导，并将转导的靶细胞文库与F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞共孵育。通过对TCR^高染色设门的荧光激活细胞分选(FACS)来分选胞啃⁺靶K562细胞(还将K562-SCT细胞对eGFP+设门，并将Jurkat-TCR对E2-Crimson+设门)(图4a)。对胞啃⁺细胞进行两轮分选后，其中每轮包括进行胞啃共孵育、随后进行FACS分选，进行胞啃实验以验证分选的K562细胞的特异性。随后将从F5-Jurkat共孵育培养物两次分选的K562细胞与F5-Jurkat细胞或1G4-Jurkat细胞再次共孵育。如通过TCR染色测量的，与1G4-Jurkat细胞相比，当与F5-Jurkat细胞一起孵育时，分选的靶细胞显示出增加的胞啃，表明分选富集了优先与F5-Jurkat细胞相互作用的细胞。(图4b，左图)。同样，如通过TCR染色测量的，与F5-Jurkat细胞相比，当与1G4-Jurkat细胞一起孵育时，从1G4-Jurkat共孵育培养物进行两次分选的K562细胞显示出增加的胞啃，表明分选富集了优先与1G4-Jurkat细胞相互作用的细胞。(图4b，右图)。此外，与F5-Jurkat细胞共孵育后分选的靶K562细胞的95％为F5 TCR dextramer染色阳性的(从一轮分选后的37％增加)(图4c，上图)，而与1G4-Jurkat细胞共孵育后分选的靶K562细胞的86％为1G4 TCR dextramer染色阳性的(从一轮分选后的25％增加)(图4c，下图)。相比之下，在两轮分选的非关联对中，分选的细胞的dextramer染色为阴性(图4c)。这些结果强烈表明选择是TCR依赖性的，并且表明被呈递在富集的靶细胞上的配体分别与F5和1G4的关联配体相关。为了确定由分选的群体呈递的配体的身份，使用Illumina平台对来自第二轮各胞啃选择的靶细胞进行下一代测序(NGS)，以鉴定富集的表位。在从F5-Jurkat共培养物分选的胞啃⁺细胞呈递的前9种富集的配体中，8种是F5 TCR的关联天然配体和变态配体(EAAGIGILTV和ELAGIGILTV)或密切相关的配体(与关联配体≤3个位置不同)。从1G4-Jurkat共培养物分选的胞啃⁺细胞呈递的前2种配体同样是1G4 TCR的关联天然配体和变态配体(SLLMWITQC和SLLMWITQV)(图4d)。这些数据证明靶细胞胞啃提供了用于鉴定孤儿TCR的关联配体和序列相似的交叉反应配体的平台。

实施例5：靶细胞胞啃鉴定患者来源的新抗原特异性TCR的配体

基因组学和蛋白组学的最新进展，以及支持性生物信息学和计算机预测工具，已经使得能够快速鉴定来自患者来源的肿瘤的突变的新表位^24,25。已经验证了靶细胞胞啃从公共表位文库正确鉴定出关联TCR配体，进一步检查了靶细胞胞啃在以下情况中的应用：从定制的患者特异性新表位文库发现肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)来源的孤儿TCR的新表位配体(图5a)。通过对来自患有转移性黑素瘤的患者的肿瘤材料进行外显子组/RNA测序来鉴定私有突变(private mutation)，并且通过算法预测由HLA*02:01呈递的通过突变产生的潜在新表位配体。先前的工作使用pMHC多聚体组来筛选取自同一患者的TIL，以分离新表位反应性TCR(未示出)。产生了新表位SCT cDNA文库，包含3,251种长度范围为从8-12个氨基酸的独特新表位，并且将其转导到K562细胞中以产生靶向新表位靶细胞文库。将K562新表位靶细胞文库与neoTCR转导的Jurkat细胞(neoTCR-Jurkat)共孵育，并对胞啃⁺靶细胞进行两轮分选。通过NGS对分选的靶细胞进行分析，以鉴定富集的新表位。两轮选择后富集的前五种配体是源自泛素特异性肽酶7(USP7)的重叠的突变肽(图5b)。为了验证neoTCR识别富集的新表位，将K562细胞用编码所有富集命中中包含的核心9-mer突变体肽YLYHRVDVI的SCT转导(mutUSP7-K562)。如预期的，与非关联F5-Jurkat细胞相比，mutUSP7-K562和neoTCR-Jurkat细胞共孵育之后观察到胞啃⁺靶细胞的百分比增加(图5c)，证明USP7突变表位YLYHRVDVI被neoTCR识别。通过测量neoTCR在识别呈递新表位的靶细胞后诱导细胞毒性的能力，进一步验证了neoTCR对USP7突变体表位的识别。用neoTCR转导的原代T细胞以抗原特异性和效应物:靶细胞比例依赖性的方式杀伤mutUSP7-K562靶细胞(图5d)，证实了neoTCR功能性地靶向通过靶细胞胞啃鉴定的USP7mut表位。表A中呈现了裂解百分比的定量。

实施例6：并行筛选以鉴定新表位和关联TCR

使用上文描述的方法鉴定了患者特异性新表位和关联TCR。

为了鉴定患者的推定新抗原(肿瘤或病原体)，利用计算机预测算法程序分析肿瘤、病毒或细菌测序数据，包括全基因组、全外显子组或转录组测序数据，以鉴定对应于推定表达的新抗原的体细胞突变。另外，可以从患者的肿瘤或血液样品确定人类白细胞抗原(HLA)分型，并且该HLA信息可以与所鉴定的推定新抗原肽序列一起用于MHC结合的预测算法，如Fritsch等人，2014,Cancer Immunol Res.,2:522-529验证的，该文献的全部内容通过引用并入本文。鉴定新抗原的方法的另外实例包括将测序与质谱术和MHC呈递预测组合(例如，美国公布第2017/0199961号)，以及将测序与MHC结合亲和力预测组合(例如，已发布的美国专利9,115,402)。另外，可用于鉴定患者样品中是否存在新抗原特异性T细胞的方法可以与本文描述的方法组合使用，例如，如美国公布第2017/0003288号和PCT/US17/59598中描述的方法，它们通过引用以其整体并入本文。这些分析产生了患者的候选新抗原肽的排序列表，患者的候选新抗原肽可以使用常规方法容易地合成，用于筛选关联抗原特异性T细胞。

将潜在的新表位克隆到表达载体，诸如先前描述的SCT逆转录病毒表达载体中。用新表位表达载体转导或转染表达MHC的细胞，诸如被工程化以表达单一MHC的k562细胞或可选择地被工程化以表达多于一种MHC(例如，患者的每种MHC等位基因)的k562细胞，以形成表达新表位的靶细胞文库。

将靶细胞文库与表达源自患者的TCR的细胞，例如直接从患者样品分离的原代T细胞或被工程化以表达确定存在于患者中的TCR的细胞共孵育。选择待筛选的患者特异性TCR的标准可以包括：已知存在于受试者或患者中的TCR，选择已知以特定频率存在于受试者或患者中的TCR，已知由特定T细胞或通过特定表型表征的T细胞，例如活化的T细胞(例如，特征为PD-1+、CD39+和/或CD137+)或耗竭性T细胞表达的TCR。鉴定群体中潜在的感兴趣的TCR序列的方法是本领域已知的，例如已发布的美国专利8,507,205、已发布的美国专利9,347,099、已发布的美国专利9,506,119、国际申请WO2018075693、Han等人2014、Briggs等人2017、Gros等人2014、Pricket等人2016、Linneman等人2014、Pasetto等人2014以及国际申请PCT/US18/21611，其中每一个都通过引用并入用于所有目的。

将靶细胞和表达TCR的细胞共孵育后，基于膜标志物的转移对细胞进行分选。基于源自T细胞或表达TCR的细胞的膜标志物的存在，对表达被TCR识别的新表位的靶细胞进行分选。另外或可选择地，基于源自靶细胞的膜标志物的存在，对表达识别潜在新表位的TCR的细胞进行分选。可选择地，将感兴趣的靶细胞或T细胞/表达TCR的细胞基于它们相应的膜组分的丢失进行分选。

分离来自分选的靶细胞和/或T细胞/表达TCR的细胞的DNA或mRNA，并且通过下一代测序来测序，以及鉴定新表位和/或TCR。

实施例7：对膜组分并行加条形码

遵循制造商的说明书，使用商业试剂盒(Solulink All-in-One抗体-寡核苷酸缀合试剂盒)将DNA条形码缀合至抗体。简而言之，将氨基修饰的DNA寡核苷酸(由侧翼为两个通用引物位点的条形码组成)缀合至磺基-S-4FB，从而用4-FB修饰寡核苷酸。并行地，将抗体缀合至双功能HyNic-NHS酯，从而用HyNic基团修饰抗体表面Lys残基。然后，在多孔板的每个孔中，使HyNic修饰的抗体与独特的4-FB修饰的寡核苷酸(或与4-FB修饰的寡核苷酸的独特组合的组)反应，独特的4-FB修饰的寡核苷酸对每个孔是特异性的。

寡核苷酸(即，条形码)采用以下形式：UPS1-NAANGGNAANGGNAAN-UPS2，其中N表示随机核苷酸。通用引物位点UPS1和UPS2不包含相邻的AA或GG二核苷酸。

抗体是针对T细胞表面的蛋白(例如，内源性蛋白，诸如CD8a、CD3e、TCR-β、CD2，或外源性蛋白，诸如LNGFR、表面表达的表位标签)的商业抗体。

在一系列实验中，将HyNic-抗CD8a(克隆HIT8a)分配至96孔板的96个孔，并且然后将96种独特的4-FB寡核苷酸条形码(或4-FB寡核苷酸条形码的96种独特组合)添加至96个孔，在抗体和每个寡核苷酸之间产生稳定的双芳基腙键，产生一组加条形码的抗CD8抗体。

然后用加条形码的抗体标记孤儿TCR，所述孤儿TCR来自一组感兴趣的孤儿TCR(例如，来自TIL的前100种最常见的TCR，或源自在肿瘤部位的表达CD39和/或CD103和/或PD-1的T细胞的TCR)。将表达96种不同孤儿TCR的Jurkat T细胞分离至96个孔，每个孔包含表达仅一种孤儿TCR的细胞。将以上产生的96种加独特条形码的抗CD8a抗体添加至96个独特的表达孤儿TCR的Jurkat细胞孔，进行孵育以允许结合，并且然后进行洗涤以去除未结合的加条形码的抗体。

洗涤步骤之后，将加独特条形码的表达孤儿TCR的T细胞合并呈单一汇集物，并且然后在胞啃反应中与靶细胞文库一起孵育。膜蛋白从T细胞转移至靶细胞文库的表达关联表位的成员，使得能够鉴定和分离那些与一种或若干种被询问的孤儿TCR相互作用的靶细胞。具体地，通过FACS来分选显示出TCR^高表型的胞啃⁺靶细胞。CD8在转移至胞啃⁺靶细胞的膜蛋白中。因此，分选的胞啃⁺靶细胞具有加条形码的抗CD8抗体。通过NGS来分析胞啃⁺靶细胞，以鉴定靶细胞编码的表位和与抗CD8抗体缔合的加条形码的寡核苷酸两者。因此，在单个实验中鉴定出所有对肿瘤作出反应的新表位反应性TCR和驱动该免疫应答的表位。

在另一系列实验中，将胞啃⁺细胞分选作为单细胞(或大批量分选，并且然后通过单细胞Drop-seq来分析)，通过NGS进行分析，使得介导抗肿瘤免疫的所有TCR、驱动免疫应答的所有表位以及另外的TCR:表位关联对被鉴定出(即，来自单细胞的条形码和表位测序结果鉴定一种或更多种关联TCR-表位对)。

实施例8：讨论

如在此发现和呈现的，抗原呈递靶细胞以抗原特异性和pMHC密度依赖性的方式从相互作用的T细胞提取膜相关蛋白。该现象被称为胞啃，其在此已经被证明提供用于用从关联T细胞提取的TCR(和其他膜蛋白)标记配体呈递靶细胞的平台，使得能够发现配体。已经通过使用公共的和新表位特异性TCR两者验证了该平台。可以通过参与T细胞突触(TCR、CD3和CD8)或不是LNGFRΔ的多种蛋白中的任一种的转移来鉴定呈递关联pMHC的靶细胞。因此，使用多种独立的商业上可获得的试剂(即抗体)验证了该平台。使用胞啃平台鉴定出的最靠前的表位可靠地返回了被测试的TCR的生物靶配体。胞啃平台还展示了容易地可检测的和分辨的Jurkat T细胞群体，该群体以抗原特异性的方式从其表面丢失TCR，允许与鉴定表位并行地鉴定T细胞及其相应的TCR。

总之，基于胞啃的方法能够快速鉴定由T细胞介导的免疫所靶向的表位，这是传染病、肿瘤免疫学、自身免疫和免疫疗法领域的基础和转化研究中的关键目标。

实施例9：其他实施方案

虽然已经参考优选实施方案和多种可选实施方案具体示出及描述了本发明，但相关领域技术人员将理解，可以对其进行形式和细节的多种改变而不偏离本发明的精神和范围。

本说明书的正文中引用的所有参考文献、发布的专利及专利申请均在此通过引用以其整体并入用于所有目的。

参考文献

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Claims (120)

1.一种抗原鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供一种或更多种表达抗原特异性T细胞受体(TCR)的细胞群体；

b)提供一种或更多种靶细胞群体，其中所述靶细胞群体将一种或更多种抗原肽呈递在一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上；

c)使所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体与所述一种或更多种靶细胞群体接触，其中所述接触包括提供足以用于所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体中的至少一种特异性结合所述一种或更多种靶细胞群体中的至少一种的条件，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在至少一种表达抗原特异性TCR的细胞与至少一种靶细胞之间转移；

d)分离或已经分离

i)感兴趣的靶细胞，其中所述感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从所述至少一种表达抗原特异性TCR的细胞转移的所述一种或更多种膜组分，以及任选地

ii)感兴趣的表达TCR的细胞，其中所述感兴趣的表达TCR的细胞包含在接触步骤(c)之后从所述至少一种靶细胞转移的所述一种或更多种膜组分；并且

e)确定或已经确定

i)与所述感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列，

ii)与所述感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分，或

iii)与所述感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列以及与所述感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分。

2.一种抗原鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供表达抗原特异性TCR的抗原特异性T细胞群体；

b)提供多于一种靶细胞群体，其中所述靶细胞群体将抗原肽呈递在主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上；

c)使所述抗原特异性T细胞群体与所述多于一种靶细胞群体接触，其中所述接触包括提供足以用于所述抗原特异性T细胞群体特异性结合所述多于一种靶细胞群体中的至少一种的条件，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在抗原特异性T细胞与至少一种靶细胞之间转移；

d)分离或已经分离

i)感兴趣的靶细胞，其中所述感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从表达抗原特异性TCR的所述细胞转移的所述一种或更多种膜组分；以及

e)确定或已经确定与所述感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列，

其中确定步骤(e)包括从所述感兴趣的靶细胞纯化一种或更多种多核苷酸或已经从所述感兴趣的靶细胞纯化一种或更多种多核苷酸，并且对纯化的多核苷酸或使用纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸进行测序或已经对纯化的多核苷酸或使用纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸进行测序。

3.一种抗原特异性TCR鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体；

b)提供一种或更多种靶细胞群体，其中所述靶细胞群体将一种或更多种抗原肽呈递在一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上；

c)使所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体与所述一种或更多种靶细胞群体接触，其中所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体中的至少一种特异性结合所述一种或更多种靶细胞群体中的至少一种，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在至少一种表达抗原特异性TCR的细胞与至少一种靶细胞之间转移；

d)分离或已经分离

i)感兴趣的表达TCR的细胞，其中所述感兴趣的表达TCR的细胞包含在接触步骤(c)之后从所述至少一种靶细胞转移的所述一种或更多种膜组分，或者其中所述感兴趣的表达TCR的细胞显示出在接触步骤(c)之后从所述至少一种表达抗原特异性TCR的细胞转移的所述一种或更多种膜组分的丢失，以及任选地

ii)感兴趣的靶细胞，其中所述感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从所述至少一种表达抗原特异性TCR的细胞转移的所述一种或更多种膜组分；并且

e)确定或已经确定

i)与所述感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列，

ii)编码与所述感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分，或

iii)与所述感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种抗原肽的序列以及编码与所述感兴趣的表达TCR的细胞相关的TCR肽的TCR序列的至少一部分。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体包括永生化细胞系。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体包括一种或更多种抗原特异性T细胞群体。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述一种或更多种抗原特异性T细胞群体选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞(CTL)群体、CD8+T细胞群体、CD4+T细胞群体、原代T细胞群体、离体培养的T细胞群体、肿瘤浸润性T细胞群体、自身免疫性T细胞群体、病原体特异性T细胞群体、调节性T细胞群体、耗竭性T细胞、记忆T细胞群体，自然杀伤T细胞群体、γ-δ(γδ)T细胞群体、工程化T细胞群体、永生化T细胞系及其组合。

7.如权利要求5-6中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种抗原特异性T细胞群体中的至少一种从受试者分离。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述受试者已知患有癌症或被怀疑患有癌症。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体中的至少一种是人类细胞。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体中的至少一种包含一种或更多种外源性TCR，任选地其中所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体不表达内源性TCR。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或更多种外源性TCR由一种或更多种TCR多核苷酸序列编码，其中所述一种或更多种TCR多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述一种或更多种外源性TCR包括TCRα链和TCRβ链。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述一种或更多种外源性TCR包括TCRγ链和TCRδ链。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述外源性TCR的链在同一TCR多核苷酸序列上编码。

15.如权利要求11-14所述的方法，其中所述一种或更多种TCR多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述病毒载体被整合到所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体的基因组中。

17.如权利要求10-16中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种外源性TCR在肿瘤样品中被鉴定出或已经在肿瘤样品中被鉴定出。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述一种或更多种外源性TCR基于在所述肿瘤样品中的频率来选择。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述一种或更多种外源性TCR基于表达所述一种或更多种外源性TCR的细胞的表型来选择。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述表型选自由以下组成的组：PD-1阳性、CD39阳性、CD137阳性及其组合。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体包含TCR共受体。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述TCR共受体选自由以下组成的组：CD3、CD4、CD8或其组合。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述TCR共受体是CD3。

24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述TCR共受体是外源性TCR共受体，任选地，其中所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体不表达内源性TCR共受体。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述外源性TCR共受体由TCR共受体多核苷酸序列编码，其中所述共受体多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述TCR共受体多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述病毒载体被整合到所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体的基因组中。

28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种靶细胞群体包括永生化细胞系。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述永生化细胞系是K562细胞系。

30.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种靶细胞群体包括专职性抗原呈递细胞(APC)群体。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述专职性APC群体选自由以下组成的组：树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。

32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括外源性MHC等位基因，任选地，其中所述一种或更多种靶细胞群体不表达内源性MHC等位基因。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述外源性MHC等位基因由一种或更多种MHC多核苷酸序列编码，其中所述一种或更多种MHC多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述一种或更多种MHC多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述病毒载体被整合到所述一种或更多种靶细胞群体的基因组中。

36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括哺乳动物MHC等位基因。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述哺乳动物MHC等位基因包括人类MHC等位基因。

38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括MHC I类分子。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述MHC I类分子选自由以下组成的组：HLA-A、HLA-B和HLA-C。

40.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括MHC II类分子。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述MHC II类分子包括并且MHC分子选自由以下组成的组：HLA-DQ和HLA-DR。

42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括单链三聚体(SCT)。

43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种MHC等位基因中的至少一种包括受试者的MHC等位基因。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述受试者已知患有癌症或被怀疑患有癌症。

45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种抗原肽中的至少一种选自由以下组成的组：肿瘤相关表位、新表位、肿瘤新表位、病毒表位、磷酸化表位、细菌表位、微生物表位、组织特异性自身表位、自身表位及其组合。

46.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种抗原肽包括新表位。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述新表位通过分析来自受试者的肿瘤、病毒或细菌测序数据以鉴定一种或更多种体细胞突变来选择。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述受试者已知患有癌症或被怀疑患有癌症。

49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述分析使用计算机预测算法来进行。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述预测算法包括预测新抗原与所述受试者的MHC等位基因之间的结合的MHC结合算法。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述一种或更多种MHC等位基因中的至少一种是所述受试者的MHC等位基因。

52.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种抗原肽中的每一种包括源自健康样品的抗原肽。

53.如权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种抗原肽中的至少一种被呈递在MHC I类分子上。

54.如权利要求53所述的方法，其中被呈递在MHC I类分子上的一种或更多种抗原肽中的至少一种的长度为7-15个、7-10个、8-9个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。

55.如权利要求53所述的方法，其中被呈递在MHC I类分子上的一种或更多种抗原肽中的至少一种的长度为8-10个之间的氨基酸。

56.如权利要求1-55中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种抗原肽中的至少一种被呈递在MHC II类分子上。

57.如权利要求56所述的方法，其中被呈递在MHC II类分子上的一种或更多种抗原肽中的至少一种的长度为11-30个、14-20个、15-18个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸。

58.如权利要求56所述的方法，其中被呈递在MHC II类分子上的一种或更多种抗原肽中的至少一种的长度为10与35个之间、10与30个之间、10与25个之间或10与20个之间的氨基酸。

59.如权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种抗原肽中的至少一种包括外源性抗原肽。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述外源性抗原肽由抗原多核苷酸序列编码，其中所述抗原多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。

61.如权利要求60所述的方法，其中所述抗原多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述病毒载体被整合到所述一种或更多种靶细胞群体的基因组中。

63.如权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种抗原肽中的至少一种源自未加工的肽序列，其中所述未加工的肽序列包含所述一种或更多种抗原肽中的至少一种。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述未加工的肽序列被所述靶细胞加工，以产生所述一种或更多种抗原肽中的至少一种。

65.如权利要求64所述的方法，其中所述未加工的肽序列被靶向至蛋白酶体。

66.如权利要求64或65所述的方法，其中所述靶细胞被工程化以增强加工或被刺激以增强加工。

67.如权利要求63-66中任一项所述的方法，其中所述未加工的肽序列由未加工的抗原多核苷酸序列编码，其中所述未加工的抗原多核苷酸序列被可操作地连接至启动子核苷酸序列。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述未加工的抗原多核苷酸序列选自由以下组成的组：病毒载体、cDNA、质粒、线性双链DNA载体、线性单链DNA载体和线性单链RNA载体。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述病毒载体被整合到所述一种或更多种靶细胞群体的基因组中。

70.如权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述接触包括旋转、颠倒、涡旋、振荡、孵育、吸移、混合或其组合。

71.如权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述接触在容器中进行。

72.如权利要求71所述的方法，其中所述容器选自由以下组成的组：多孔板、组织培养处理的板、组织培养处理的多孔板、细颈瓶、组织培养处理的细颈瓶、微量离心管、培养管、试管、圆底管和锥形管。

73.如权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种膜组分中的至少一种包括表达抗原特异性TCR的细胞膜组分。

74.如权利要求73所述的方法，其中所述表达抗原特异性TCR的细胞膜组分选自由以下组成的组：TCR；TCR共受体、CD3 TCR共受体、CD4 TCR共受体和CD8 TCR共受体。

75.如权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种膜组分中的至少一种包括靶细胞膜组分。

76.如权利要求75所述的方法，其中所述靶细胞膜组分包括MHC等位基因。

77.如权利要求1-76中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种膜组分中的至少一种包括外源性膜组分。

78.如权利要求77所述的方法，其中所述外源性膜组分选自由以下组成的组：跨膜蛋白、膜相关蛋白、表面受体、荧光分子、细胞表面蛋白、糖和脂质。

79.如权利要求1-78中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种膜组分中的至少一种包括标记的膜组分。

80.如权利要求79所述的方法，其中所述标记的膜组分包含生物素标记物、荧光标记物或反应性基团。

81.如权利要求1-80中任一项所述的方法，其中所述分离包括将包含一种或更多种转移的膜组分的所述感兴趣的靶细胞或所述感兴趣的表达TCR的细胞与不包含所述一种或更多种转移的膜组分的靶细胞或表达TCR的细胞分离。

82.如权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述分离包括磁性分离。

83.如权利要求82所述的方法，其中所述磁性分离包括用磁体将所述感兴趣的靶细胞或所述感兴趣的表达TCR的细胞捕获到壁上，并且去除未被捕获到所述壁上的成分。

84.如权利要求1-83中任一项所述的方法，其中分离步骤包括使用微流体装置。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述微流体装置包括流式细胞仪。

86.如权利要求85所述的方法，其中分离步骤包括荧光激活细胞分选(FACS)。

87.如权利要求1-86中任一项所述的方法，其中所述分离包括鉴定所述一种或更多种膜组分。

88.如权利要求87所述的方法，其中所述鉴定包括使所述感兴趣的靶细胞或所述感兴趣的表达TCR的细胞与标记试剂接触。

89.如权利要求88所述的方法，其中所述标记试剂选自由以下组成的组：抗体、包含反应性基团的试剂和脂质反应性试剂。

90.如权利要求88或89所述的方法，其中所述标记试剂与可检测标志物缀合。

91.如权利要求90所述的方法，其中所述可检测标志物是荧光团。

92.如权利要求1-91中任一项所述的方法，其中确定步骤(e)包括从所述感兴趣的靶细胞或所述感兴趣的表达TCR的细胞纯化一种或更多种多核苷酸或已经从所述感兴趣的靶细胞或所述感兴趣的表达TCR的细胞纯化一种或更多种多核苷酸。

93.如权利要求92所述的方法，其中纯化的多核苷酸选自由以下组成的组：基因组DNA、载体DNA、质粒DNA、mRNA、通过PCR扩增的DNA和通过逆转录产生的cDNA。

94.如权利要求92-93中任一项所述的方法，其中纯化或已经纯化所述一种或更多种多核苷酸包括从单细胞纯化一种或更多种多核苷酸或已经从单细胞纯化一种或更多种多核苷酸。

95.如权利要求1-94中任一项所述的方法，其中确定步骤(e)包括测序。

96.如权利要求95所述的方法，其中所述测序包括对多核苷酸进行测序。

97.如权利要求96所述的方法，其中所述测序包括对权利要求92-93的任一项中的纯化的多核苷酸进行测序或已经对权利要求92-93的任一项中的纯化的多核苷酸进行测序，或对使用权利要求92-93的任一项中的纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸进行测序或已经对使用权利要求92-93的任一项中的纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸进行测序。

98.如权利要求96-97中任一项所述的方法，其中所述测序包括下一代测序。

99.如权利要求96-98中任一项所述的方法，其中所述测序包括单细胞测序。

100.如权利要求1-99中任一项所述的方法，其中确定步骤还包括鉴定新抗原或新抗原特异性TCR。

101.如权利要求1-100中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种膜组分包含一种或更多种寡核苷酸条形码。

102.如权利要求101所述的方法，其中所述一种或更多种寡核苷酸条形码被直接地缀合至所述一种或更多种膜组分。

103.如权利要求101所述的方法，其中所述一种或更多种寡核苷酸条形码被间接地缀合至所述一种或更多种膜组分。

104.如权利要求103所述的方法，其中所述一种或更多种寡核苷酸条形码被缀合至标记试剂。

105.如权利要求104所述的方法，其中所述标记试剂选自由以下组成的组：抗体、包含反应性基团的试剂和脂质反应性试剂。

106.如权利要求101-105中任一项所述的方法，其中确定步骤(e)还包括确定或已经确定所述一种或更多种寡核苷酸条形码中的至少一种的序列。

107.如权利要求106所述的方法，其中至少一种寡核苷酸条形码的序列对于所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体的特定TCR是独特的。

108.如权利要求107所述的组合物，其中所述一种或更多种表达抗原特异性TCR的细胞群体包括两种或更多种不同的表达抗原特异性TCR的细胞群体，每种不同的表达抗原特异性TCR的细胞群体包含独特的TCR和与每种独特的TCR的身份可操作地关联的独特的、确定的条形码序列。

109.如权利要求106所述的方法，其中至少一种寡核苷酸条形码的序列对于所述一种或更多种靶细胞群体中的特定靶细胞群体是独特的。

110.如权利要求109所述的组合物，其中所述特定靶细胞群体表达独特的抗原肽、独特的MHC等位基因或独特的抗原肽和MHC等位基因对。

111.如权利要求110所述的组合物，其中所述一种或更多种靶细胞群体包括两种或更多种不同的靶细胞群体，每种不同的靶细胞包含与每种独特的抗原肽、每种独特的MHC等位基因或每种独特的抗原肽和MHC等位基因对的身份可操作地关联的独特的、确定的条形码序列。

112.一种分离的感兴趣的靶细胞或感兴趣的表达TCR的细胞，所述分离的感兴趣的靶细胞或感兴趣的表达TCR的细胞通过以上方法中的任一种产生。

113.一种纯化的多核苷酸或使用所述纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸，所述纯化的多核苷酸或使用所述纯化的多核苷酸作为模板产生的任何多核苷酸通过以上方法中的任一种产生。

114.一种数据库，所述数据库包含通过以上方法中的任一种产生的一种或更多种序列。

115.如权利要求114所述的数据库，其中所述一种或更多种序列包括通过以上方法中的任一种产生的一种或更多种经测序的多核苷酸。

116.一种分离的感兴趣的靶细胞，其中所述靶细胞包含：

i)一种或更多种T细胞膜相关组分，其中所述靶细胞不包含编码一种或更多种T细胞膜组分的内源性多核苷酸序列；以及

ii)一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因，其中一种或更多种抗原肽被呈递在所述一种或更多种主要组织相容性复合体(MHC)等位基因上。

117.如权利要求116所述的分离的靶细胞，其中所述一种或更多种抗原肽由一种或更多种抗原多核苷酸序列编码。

118.一种配体鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供一种或更多种表达配体特异性结合分子的细胞群体；

b)提供一种或更多种靶细胞群体，其中所述靶细胞群体呈递能够被一种或更多种所述配体特异性结合分子结合的一种或更多种配体；

c)使所述一种或更多种表达配体特异性结合分子的细胞群体与所述一种或更多种靶细胞群体接触，其中所述接触包括提供足以用于至少一种表达配体特异性结合分子的细胞特异性结合至少一种靶细胞的条件，并且其中在结合之后，一种或更多种膜组分在表达配体特异性结合分子的细胞与靶细胞之间转移；

d)分离或已经分离

i)感兴趣的靶细胞，其中所述感兴趣的靶细胞包含在接触步骤(c)之后从所述表达配体特异性结合分子的细胞转移的所述一种或更多种膜组分；以及任选地

ii)感兴趣的表达配体特异性结合分子的细胞，其中所述感兴趣的表达配体特异性结合分子的细胞包含在接触步骤(c)之后从所述靶细胞转移的所述一种或更多种膜组分；并且

e)确定或已经确定，

i)编码与所述感兴趣的靶细胞相关的一种或更多种配体的序列的至少一部分，或

ii)编码与所述感兴趣的表达配体特异性结合分子的细胞相关的结合分子肽的结合分子序列的至少一部分。

119.如权利要求118所述的方法，其中所述配体特异性结合分子选自由以下组成的组：免疫受体、免疫球蛋白、抗体或其片段、受体、嵌合受体、嵌合抗原受体(CAR)、信号传导受体、细胞表面受体和跨膜受体。

120.如权利要求118或119所述的方法，其中所述一种或更多种配体选自由以下组成的组：抗原、表面抗原、表位、非经典MHC呈递的抗原和受体配体。

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