KR20220030208A - T 세포 조성물의 제조를 위한 조성물 및 방법, 및 그의 용도 - Google Patents

T 세포 조성물의 제조를 위한 조성물 및 방법, 및 그의 용도 Download PDF

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KR20220030208A
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로버트 안
비크람 주네자
리처드 게이노르
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바이오엔테크 유에스 인크.
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Abstract

본원에는, 에피토프 서열의 라이브러리로부터 에피토프 서열을 포함하는 펩티드로 유도된 T 세포를 투여함으로써 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 라이브러리의 각각의 에피토프 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 매칭되며 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하며, 면역원성 검정에 따라 면역원성이며, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시되며, T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극하는 것인, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 포함하여, T 세포 조성물의 제조를 위한 조성물 및 방법, 및 그의 용도가 제공된다.

Description

T 세포 조성물의 제조를 위한 조성물 및 방법, 및 그의 용도
상호 참조
본 출원은 2019년 3월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/827,018의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
입양 면역요법 또는 림프구를 사용한 입양 세포 요법 (ACT)은 유전자 변형된 T 림프구를 질환의 요법을 위해 대상체에게 전달하는 것이다. 입양 면역 요법은 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환, 및 면역결핍증을 포함한 다종다양한 질환을 치료하기 위한 그의 가능성을 아직 실현하지 못하였다. 그러나, 전부는 아니지만 대부분의 입양 면역요법 전략은 임상적으로 효과적인 치료 용량의 T 세포를 생성하기 위해 T 세포 활성화 및 확장 단계를 필요로 한다. 환자 세포를 수득하는 기존 전략, 및 ACT를 위한 유효 세포 수의 생체외 활성화, 확장 및 회수는 장기간이며 다루기 힘들고 본질적으로 복잡한 공정이며 - 심각한 도전과제를 제기한다. 따라서, 유리한 표현형 및 기능을 갖고 더 짧은 시간 범위 내에서 항원 특이적 T 세포의 확장 및 유도를 위한 조성물 및 방법을 개발할 필요가 남아 있다.
요약
본원에는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 에피토프 서열의 라이브러리로부터 적어도 하나의 에피토프 서열을 선택하는 단계로서, 여기서 라이브러리의 각각의 에피토프 서열은 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 매칭되는 것인 단계; 및 대상체로부터의 T 세포 또는 동종이계 T 세포를 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 각각은 하기 기준: 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다, 면역원성 검정에 따라 면역원성이다, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시된다, 그리고 T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극한다 중 적어도 세 가지를 충족하기 위해 사전 검정되는 것인 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열은 돌연변이를 포함하고 방법은 돌연변이를 가진 에피토프를 코딩하도록 대상체의 암 세포를 확인하는 단계를 포함하거나; 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열은 대상체의 암 세포에 의해 과발현되는 단백질 내에 있고 방법은 에피토프를 함유하는 단백질을 과발현하도록 대상체의 암 세포를 확인하는 단계를 포함하거나; 또는 적어도 하나의 에피토프 서열은 종양 미세환경에서 세포에 의해 발현되는 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 대상체의 암 세포에 의해 발현되지 않는 에피토프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 암 세포에 의해 발현되지 않는 에피토프는 대상체의 종양 미세환경에서 세포에 의해 발현된다.
일부 실시양태에서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 에피토프는 결합 검정에 따라 500 nM 이하의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC 분자에 결합한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 에피토프는 컴퓨터 상에 구현되는 MHC 에피토프 예측 프로그램을 사용하여 500 nM 이하의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC 분자에 결합하는 것으로 예측된다.
일부 실시양태에서, 컴퓨터 상에 구현되는 MHC 에피토프 예측 프로그램은 NetMHCpan이다 일부 실시예에서, 컴퓨터 상에 구현되는 MHC 에피토프 예측 프로그램은 NetMHCpan 버전 4.0이다.
일부 실시양태에서, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시되는 에피토프는 15 Da, 10 Da 또는 5 Da 미만, 또는 10,000 또는 5,000 백만분율 (ppm) 미만일 검출된 펩티드의 질량 정확도로 APC로부터 용리 후 질량 분석법에 의해 검출된다.
일부 실시양태에서, 면역원성 검정에 따라 면역원성인 에피토프는 다량체 검정 또는 기능적 검정에 따라 면역원성이다.
일부 실시양태에서, 다량체 검정은 유세포 분석법 분석을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다량체 검정은 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 및 매칭된 HLA 대립유전자를 포함하는 펩티드-MHC 다량체에 결합된 T 세포를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극되었다.
일부 실시양태에서, 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 세포의 적어도 0.1% 또는 0.01% 또는 0.005%를 구성하고, (iii) CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성이다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6개 자극 중 적어도 하나에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성이다.
일부 실시양태에서, 대조군 샘플은 (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하지 않거나, (ii) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열과 상이한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하거나, 또는 (iii) 무작위 서열을 가진 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 T 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 7, 18, 19, 20 또는 그 초과의 일 동안 자극되었다.
일부 실시양태에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC의 존재 하에 적어도 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 500배 또는 1,000배 또는 그 초과로 확장되었다.
일부 실시양태에서, 기능적 검정은 면역검정을 포함한다.
일부 실시양태에서, 기능적 검정은 IFNγ 또는 TNFα의 세포내 염색 또는 CD107a 및/또는 CD107b의 세포 표면 발현으로 T 세포를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극되었다
일부 실시양태에서, 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 또는 CD4+ 세포의 적어도 0.1% 또는 0.01% 또는 0.005%를 구성하고, (iii) CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 기능적 검정에 따라 면역원성이다.
일부 실시양태에서, 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극된 T 세포는 에피토프를 제시하는 세포를 사멸시키는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하는 세포의 수는 T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하지 않는 세포의 수보다 적어도 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500, 또는 1,000배 더 높다.
일부 실시양태에서, T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하는 세포의 수는 (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하지 않거나, (ii) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열과 상이한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하거나, 또는 (iii) 무작위 서열을 가진 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하는 세포의 수보다 적어도 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500, 또는 1,000배 더 높다.
일부 실시양태에서, T 세포에 의해 사멸되는 돌연변이체 에피토프를 제시하는 세포의 수는 T 세포에 의해 사멸되는 상응하는 야생형 에피토프를 제시하는 세포의 수보다 적어도 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500, 또는 1,000배 더 높다.
일부 실시양태에서, 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극된 T 세포는 세포독성 검정에 따라 특이적으로 세포독성이 되도록 자극된 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 방법은 순환 종양 DNA 검정을 사용하여 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 유전자 패널을 사용하여 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체로부터의 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 동종이계 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 각각은 하기 기준: 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다, 면역원성 검정에 따라 면역원성이다, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시된다, 그리고 T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극한다 중 각각을 충족하기 위해 사전 검정된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드 중 적어도 하나는 합성된 펩티드 또는 핵산 서열로부터 발현된 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하거나 대상체의 게놈에서 HLA 대립유전자를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열은 표 1A 내지 표 1F, 표 2A 내지 표 2C, 표 3, 표 4A-4M, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 11, 표 12, 표 13 및 표 14의 하나 이상의 에피토프 서열로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체외에서 하나 이상의 펩티드와 접촉된 T 세포를 확장시켜 MHC 단백질과 복합체를 형성하는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열에 특이적인 T 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 T 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질은 대상체의 암 세포에 의해 발현된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질은 대상체의 종양 미세환경에서 세포에 의해 발현된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 종양 특이적 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 대상체의 암 세포에 의해 과발현되는 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 드라이버 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 약물 내성 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 조직 특이적 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 암 고환 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 바이러스 에피토프이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 부(minor) 조직적합성 에피토프이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 RAS 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 GATA3 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 EGFR 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 BTK 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 p53 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 TMPRSS2::ERG 융합 폴리펩티드로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 Myc 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 하나는 ANKRD30A, COL10A1, CTCFL, PPIAL4G, POTEE, DLL3, MMP13, SSX1, DCAF4L2, MAGEA4, MAGEA11, MAGEC2, MAGEA12, PRAME, CLDN6, EPYC, KLK3, KLK2, KLK4, TGM4, POTEG, RLN1, POTEH, SLC45A2, TSPAN10, PAGE5, CSAG1, PRDM7, TG, TSHR, RSPH6A, SCXB, HIST1H4K, ALPPL2, PRM2, PRM1, TNP1, LELP1, HMGB4, AKAP4, CETN1, UBQLN3, ACTL7A, ACTL9, ACTRT2, PGK2, C2orf53, KIF2B, ADAD1, SPATA8, CCDC70, TPD52L3, ACTL7B, DMRTB1, SYCN, CELA2A, CELA2B, PNLIPRP1, CTRC, AMY2A, SERPINI2, RBPJL, AQP12A, IAPP, KIRREL2, G6PC2, AQP12B, CYP11B1, CYP11B2, STAR, CYP11A1, 및 MC2R로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의해 코딩되는 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 하나는 표적 조직과 상이한 복수의 비표적 조직의 각각의 조직에서 조직 특이적 단백질의 발현 수준보다 적어도 2배 더 초과인 대상체의 표적 조직에서의 발현 수준을 갖는 조직 특이적 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포 또는 동종이계 T 세포를 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계는 T 세포를 에피토프를 제시하는 APC와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 에피토프를 제시하는 APC는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드 또는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 코딩하는 다중핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 항원 제시 세포 (APC) 및 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD14+ 세포 및 CD25+ 세포를 고갈시켜, APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 형성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 세포의 집단은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 방법은 (b) APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드 (FLT3L), 및 (A) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (B) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재 하에 제1 기간 동안 인큐베이션하여; 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (c) 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 확장시켜, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 종양 항원 특이적 T 세포는 (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 및 (ii) 대상체의 암 세포 또는 APC에 의해 발현되는 MHC 단백질을 포함하는 복합체에 특이적인 T 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 28일 미만 내에 확장된다.
일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD8+ T 세포의 총 수의 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율은 생물학적 샘플에서 CD8+ T 세포의 총 수의 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율보다 적어도 2배 더 높다.
일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD4+ T 세포의 총 수의 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율은 생물학적 샘플에서 CD4+ T 세포의 총 수의 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율보다 적어도 2배 더 높다.
일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD8+ T 세포의 적어도 0.1%는 나이브 CD8+ T 세포로부터 유래된 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD4+ T 세포의 적어도 0.1%는 나이브 CD4+ T 세포로부터 유래된 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 확장시키는 단계는 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 성숙한 APC의 제2 집단과 접촉시키는 단계로서, 여기서 성숙한 APC의 제2 집단은 FLT3L과 함께 인큐베이션되었고 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 제시하는 것인 단계; 및 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 제2 기간 동안 확장시켜, T 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 성숙한 APC의 제2 집단은 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 성숙한 APC의 제2 집단과 접촉시키기 전에 적어도 1일 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션되었다.
일부 실시양태에서, 확장시키는 단계는 (C) T 세포의 확장된 집단을 성숙한 APC의 제3 집단과 접촉시키는 단계로서, 여기서 성숙한 APC의 제3 집단은 (i) FLT3L과 함께 인큐베이션되었고 (ii) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 제시하는 것인 단계; 및 (D) T 세포의 확장된 집단을 제3 기간 동안 확장시켜, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 성숙한 APC의 제3 집단은 T 세포의 확장된 집단을 성숙한 APC의 제3 집단과 접촉시키기 전에 적어도 1일 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션되었다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 백혈구성분채집술 샘플 또는 성분채집술 샘플이다.
일부 실시양태에서, 방법은 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 수확하는 단계, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 냉동보존하는 단계 또는 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 함유하는 약학 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 인큐베이션하는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 FLT3L 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 존재 하에 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 포함하는 약학 조성물을 암을 가진 인간 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 암을 가진 인간 대상체는 그로부터 생물학적 샘플을 수득한 인간 대상체이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 길이가 8 내지 50개의 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개를 포함하고, 각각은 암을 가진 인간 대상체의 암 세포에 의해 발현된다.
일부 실시양태에서, APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD14+ 세포 및 CD25+ 세포를 고갈시키는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단을 CD14 결합제 및 CD25 결합제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 고갈시키는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD19+ 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 고갈시키는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD11b+ 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 수득된 암 세포를 포함하는 제1 생물학적 샘플로부터 암 세포 핵산을 생성하는 단계 및 동일한 대상체로부터 수득된 비암(non-cancer) 세포를 포함하는 제2 생물학적 샘플로부터 비암 세포 핵산을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질은 HLA-A01:01, HLA-A02:01, HLA-A03:01, HLA-A11:01, HLA-A24:01, HLA-A30:01, HLA-A31:01, HLA-A32:01, HLA-A33:01, HLA-A68:01, HLA-B07:02, HLA-B08:01, HLA-B15:01, HLA-B44:03, HLA-C07:01 및 HLA-C07:02로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질이다.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하고 대상체의 암 세포에 의해 발현되는 하나 또는 둘 이상의 상이한 단백질을 확인하는 단계를 포함한다
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하고 암 세포에서 하나 또는 둘 이상의 상이한 단백질을 코딩하는 RNA의 수준을 측정함으로써 대상체의 암 세포에 의해 발현되는 하나 또는 둘 이상의 상이한 단백질을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 8 내지 12개의 아미노산의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 13 내지 25개의 아미노산의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 암 세포 및 비암 세포로부터 게놈 DNA 또는 RNA를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 점 돌연변이 또는 점 돌연변이에 의해 코딩되는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 neoORF 돌연변이에 의해 코딩되는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 유전자 융합 돌연변이에 의해 코딩되는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상 indel 돌연변이에 의해 코딩되는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 스플라이스 부위 돌연변이에 의해 코딩되는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개는 동일한 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개는 중첩 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개는 상이한 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 초과의 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 고형암의 암 세포이다.
일부 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 백혈병 또는 림프종의 암 세포이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이는 복수의 암 환자에서 발생하는 돌연변이이다.
일부 실시양태에서, MHC는 클래스 I MHC이다.
일부 실시양태에서, MHC는 클래스 II MHC이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD8 T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD4 T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 세포독성 T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 기억 T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 투여하기 전에 T 세포의 확장된 집단으로부터 세포의 하나 이상의 하위집단을 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 배양물에서 면역 반응을 도출하는 단계는 펩티드와 접촉 직후 T 세포 배양물로부터 IL2 생산을 유도하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 배양물에서 면역 반응을 도출하는 단계는 펩티드와 접촉 직후 T 세포 배양물로부터 사이토카인 생성을 유도하는 단계를 포함하고, 여기서 사이토카인은 인터페론 감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자 (TNF) 알파 (α) 및/ 또는 베타 (β) 또는 그의 조합이다.
일부 실시양태에서, T 세포 배양물에서 면역 반응을 유도하는 단계는 T 세포 배양물을 유도하여 펩티드를 발현하는 세포를 사멸시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 배양물에서 면역 반응을 도출하는 단계는 T 세포 배양물에서 Fas 리간드, 그랜자임, 퍼포린, IFN, TNF, 또는 그의 조합의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드는 정제된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드는 동결건조된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드는 용액이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드는 펩티드의 무결성이 ≥99%가 되도록 하는 저장 조건에 존재한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포독성 검정에 따라 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열이 로딩된 세포에 대해 세포독성이 되도록 T 세포를 자극하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포독성 검정에 따라 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질을 발현하는 암 세포에 대해 세포독성이 되도록 T 세포를 자극하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포독성 검정에 따라 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질을 발현하는 암 연관 세포에 대해 세포독성이 되도록 T 세포를 자극하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프는 암 세포에 의해 발현되고, 추가 선택된 에피토프는 암 연관 세포에 의해 발현된다.
일부 실시양태에서, 추가 선택된 에피토프는 암 연관 섬유모세포 상에서 발현된다.
일부 실시양태에서, 추가 선택된 에피토프는 표 8로부터 선택된다.
또한, 본원에는 본원에 제공된 방법에 의해 제조된 T 세포를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또한, 본원에는 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리가 제공되며, 여기서 라이브러리의 각각의 에피토프 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 매칭되며; 여기서 라이브러리의 각각의 에피토프 서열은 하기 기준: 치료될 암을 가진 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다, 면역원성 검정에 따라 면역원성이다, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시된다, 및/또는 T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극한다 중 적어도 세 가지를 충족하기 위해 사전 검정된다.
또한, 본원에는 대상체에게 (i) G12R RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드, 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서: (a) G12R RAS 에피토프는 vvgaRgvgk이고 대상체는 HLA-A03:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하거나; (b) G12R RAS 에피토프는 eyklvvvgaR이고 대상체는 HLA- A33:03 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하거나; (c) G12R RAS 에피토프는 vvvgaRgvgk이고 대상체는 HLA-A11:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하거나; (d) G12R RAS 에피토프는 aRgvgksal이고 대상체는 HLA- C07:02, HLA- B39:01 및 HLA- C07:01로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 것인, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
도 1a는 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법의 개략도이다.
도 1b는 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법의 개략도이다.
도 2는 공유된 에피토프의 오프라인 특성화를 위한 예시적인 방법의 개략도이다.
도 3a는 인실리코 에피토프 예측이 질량 분석법에 따라 제시되는 RAS G12D 돌연변이로부터 유래된 다수의 신생항원을 확인하였음을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 3b는 인실리코 에피토프 예측이 질량 분석법에 따라 제시되는 RAS G12V 돌연변이로부터 유래된 다수의 신생항원을 확인하였음을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 3c는 인실리코 에피토프 예측이 질량 분석법에 따라 제시되는 RAS G12C 돌연변이로부터 유래된 다수의 신생항원을 확인하였음을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 3d는 인실리코 에피토프 예측이 질량 분석법에 따라 제시되는 RAS G12R 돌연변이로부터 유래된 다수의 신생항원을 확인하였음을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 4a는 공유된 신생항원 에피토프의 제시(presentation)가 질량 분석법에 의해 직접 확인될 수 있고 RAS 신생항원이 정의된 환자 집단에서 표적화될 수 있음을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 4b는 내인성으로 처리된 돌연변이체 RAS 펩티드 에피토프 VVVGAVGVGK (상단) 및 그의 상응하는 중(heavy) 펩티드 (하단)에 대한 MS/MS 스펙트럼의 헤드-투-토우(head-to-toe) 플롯을 나타낸다. 293T 세포는 RASG12V 돌연변이체 펩티드를 함유하는 폴리펩티드 및 HLA-A*03:01 유전자 둘 다로 렌티바이러스로 형질도입되었다.
도 4c는 내인성으로 처리된 돌연변이체 RAS 펩티드 에피토프 VVVGAVGVGK (상단) 및 그의 상응하는 중 펩티드 (하단)에 대한 MS/MS 스펙트럼의 헤드-투-토우 플롯을 나타낸다. RASG12V 돌연변이체를 자연적으로 발현하는 SW620 세포는 HLA-A*03:01 유전자를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다.
도 4d는 내인성으로 처리된 돌연변이체 RAS 펩티드 에피토프 VVVGAVGVGK (상단) 및 그의 상응하는 중 펩티드 (하단)에 대한 MS/MS 스펙트럼의 헤드-투-토우 플롯을 나타낸다. RASG12V 돌연변이 및 HLA-A*03:01 유전자 둘 다를 자연적으로 발현하는 NCI-H441 세포를 본 실험에 사용하였다.
도 4e는 내인성으로 처리된 GATA3 neoORF 펩티드 에피토프 SMLTGPPARV에 대한 MS/MS 스펙트럼의 헤드-투-토우 플롯을 나타낸다. 내인성 펩티드 스펙트럼은 상단 패널에 나타내고 상응하는 광 합성 스펙트럼은 하단 패널에 나타냈다.
도 5는 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-A11:01 및 HLA-A03:01 상의 RAS G12 신생항원에 대한 드 노보(de novo) CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 6은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-A11:01 상의 RAS G12V 신생항원에 대한 다수의 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다. 파이(pie) 차트에 표시된 바와 같이, 3명의 독립적인 건강한 공여자에서 HLA-A11:01 상의 RAS G12V 신생항원에 대해 유도된 개별 T 세포 클론의 빈도가 도시된다.
도 7은 생체외에서 생성된 RASG12V 활성화된 T 세포가 표적 세포를 사멸할 수 있음을 예시하는 데이터를 도시한다. GFP를 발현하는 A375 표적 세포는 2 μM RASG12V 항원, 야생형 RAS 항원이 로딩되거나, 대조군 GFP+ 세포로서 어떤 펩티드도 로딩되지 않았다. RASG12V 특이적 CD8 T 세포 (이펙터 세포)를 대조군 세포 또는 표적 세포와 함께 0.05:1 비로 인큐베이션하였다. 이펙터 세포의 존재 하에, 표적 세포는 RASWT 항원을 제시하거나 무항원인 대조군 세포보다 더 쉽게 용해되고 고갈되었다. 펩티드가 없는 표적 세포 성장에 의해 정규화된 바와 같이 특이적 세포 사멸의 그래프를 좌측 도표에 나타냈다. 대표적 이미지는 우측에 나타냈다.
도 8은 상응하는 야생형 항원이 아닌, HLA-11:01 상의 RAS G12V 신생항원으로 RAS G12V 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이, 표시된 이펙터:표적 세포 비 및 증가하는 펩티드 농도를 사용하여 T 세포가 세포독성이 되도록 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 9는 RASG12V 돌연변이를 가진 에피토프를 제시하는 FLT3L 처리된 PBMC의 1회 (1x 자극) 또는 2회 (2x 자극)로 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이, HLA-A*11:01 유전자를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 SW620 세포 (자연적으로 RASG12V 돌연변이체를 발현함)와 함께 이들 T 세포를 공동배양한 후에 시간 경과에 따른 아넥신V 양성 세포에 의해 측정된 바와 같이 T 세포가 세포독성이 되도록 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 10은 RASG12V 돌연변이 및 HLA-A*03:01 유전자 둘 다를 자연적으로 발현하는 NCI-H441 세포를 표시된 이펙터:표적 세포 비에서 RASG12V 돌연변이를 가진 에피토프를 함유하는 펩티드로 프라이밍되고 활성화되고 확장된 T 세포와 함께 공동배양한 후에 시간 경과에 따른 아넥신V 양성 세포의 그래프를 도시한다.
도 11a는 HLA-A11:01 대립유전자에 의해 코딩된 MHC에 결합된 RAS-G12V 에피토프에 결합하는 TCR로 형질도입된 저캇(Jurkat) 세포의 존재 하에 인큐베이션한 후에 RAS-G12V 야생형 또는 돌연변이체 펩티드가 로딩된 표적 세포 (A375-A11:01)에 대한 IL-2 농도 (pg/mL)의 그래프를 도시한다.
도 11b는 TCR 형질도입된 PBMC를 다양한 이펙터:표적 세포 비에 걸쳐 천연 G12V 및 HLA-A11:01을 가진 5,000개의 SNGM 세포와 공동배양한 후에 시간 경과에 따른 아넥신V 양성 세포의 그래프를 도시한다.
도 11c는 HLA-A03:01 대립유전자에 의해 코딩된 MHC에 결합된 RAS-G12V에 결합하는 TCR로 형질도입된 저캇 세포의 존재 하에 인큐베이션한 후에 RAS-G12V 야생형 또는 돌연변이체 펩티드가 로딩된 표적 세포 (A375-A03:01)에 대한 IL-2 농도 (pg/mL)의 그래프를 도시한다.
도 11d는 TCR 형질도입된 PBMC를 0.75:1의 이펙터:표적 세포 비를 사용하여 천연 G12V 및 HLA-A03:01을 가진 세포와 공동배양한 후에 시간 경과에 따른 아넥신V 양성 세포의 그래프 (상단) 및 TCR 형질도입된 PBMC를 0.75:1의 이펙터:표적 세포 비를 사용하여 천연 G12V 및 HLA-A03:01을 가진 세포와의 공동배양 후 24시간 후의 IFNγ 농도 (pg/mL)의 그래프를 도시한다.
도 12a는 HLA-A11:01 대립유전자에 의해 코딩된 MHC에 결합된 밑줄 친 RAS-G12V 에피토프에 결합하는 TCR로 형질도입된 저캇 세포와 공동배양된 후 증가하는 양의 표시된 RAS-G12V 돌연변이체 펩티드와 접촉된 FLT3L 처리된 PBMC에 대한 IL-2 농도 (pg/mL)의 그래프를 도시한다.
도 12b는 건강한 공여자로부터의 PBMC를 사용한 시험관내 (상부) 및 펩티드로 면역화된 HLA-A11:01 트랜스제닉 마우스를 사용한 생체내 (하부) 둘 다에서 도 12로부터 표시된 RAS-G12V 돌연변이체 펩티드의 면역원성을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 13은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-02:01 상의 RAS G12V 신생항원에 대한 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 14는 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-A68:01 상의 RAS G12 신생항원에 대한 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 15는 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-B07:02 상의 RAS G12 신생항원에 대한 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다
도 16은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-B08:01 상의 RAS G12 신생항원에 대한 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 17은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-C08:02 상의 RAS G12D 신생항원에 대한 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 18은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 RAS 신생항원에 대한 드 노보 CD4 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 19a는 풍부화 절차가 항원 특이적 T 세포의 추가 확장 전에 사용될 수 있음을 입증하는 유세포 분석법 데이터를 예시하는 데이터를 도시한다. 4-1BB를 상향조절하는 세포는 자기-보조 세포 분리(Magnetic-Assisted Cell Separation) (MACS; 밀테니(Miltenyi))를 사용하여 풍부화되었다. 다량체에 의해 염색된 T 세포는 자극 14일차에 MACS에 의해 풍부화되었다. 이 접근법은 다수의 항원 특이적 T 세포 집단을 풍부화할 수 있었다.
도 19b는 도 19a의 결과를 정량화하는 예시적인 막대 그래프를 도시한다.
도 20은 예측된 GATA3 neoORF 에피토프가 강한 친화도 (<500 nM), 긴 안정성 (>0.5hr)을 갖고/갖거나 GATA3 neoORF를 발현하는 세포로부터의 HLA 분자로부터 용리된 에피토프의 질량 분석법 분석에 의해 검출될 수 있음을 예시하는 실험의 요약을 예시한다.
도 21은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-A02:01, HLA-A03:01, HLA-A11:01, HLA-B07:02 및 HLA-B08:01 상의 GATA3 neoORF 신생항원에 대한 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 22는 생체외에서 생성된 GATA3 neoORF 에피토프 활성화된 T 세포가 표적 세포를 사멸할 수 있음을 예시하는 데이터를 도시한다. GFP를 발현하는 293T 표적 세포는 2 μM GATA3 neoORF 항원으로 로딩되거나 대조군 GFP+ 세포로서 로딩되지 않은 채로 두었다. GATA3-neoORF 특이적 CD8 T 세포 (이펙터 세포)를 1:10 비로 대조군 세포 또는 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이펙터 세포의 존재 하에, 표적 세포는 GATA3 신생항원을 제시하는 대조군 세포보다 더 쉽게 용해되고 고갈되었다. 100시간에 걸쳐 GFP+ 세포의 그래프를 상단 도표에 나타냈다. GATA3 신생항원 활성화된 CD8 세포의 존재 하에 대조군 (좌측 하단 이미지) 및 표적 GFP+ 세포 (우측 하단 이미지)의 이미지를 나타냈다.
도 23은 형질도입되지 않은 HEK 293T 세포에 대한 GATA3 신생항원 형질도입된 HEK 293T 세포에서 생존 표적 세포의 카스파제-3 양성 분획의 비교 그래프를 도시한다. 2개의 상이한 GATA3 유도된 건강한 공여자 PBMC를 음성 대조군으로서 GATA3 신생항원 형질도입된 HEK 293T 세포 또는 형질도입되지 않은 HEK 293T 세포와 공동배양하였다.
도 24는 2회의 자극을 포함한, 배양 20일 후 GATA3 neoORF 특이적 펩티드를 사용한 항원 특이적 CD4+ T 세포의 유도를 예시하는 유세포 분석법 데이터를 도시한다. 항원 특이적 T 세포는 펩티드가 없는 것 (좌측)에 비해 GATA3 neoORF 펩티드 (우측)와 함께 인큐베이션한 후 IFNγ 및/또는 TNFα의 증가에 의해 검출된다
도 25a는 인간 공여자로부터 전립선암 세포주 또는 전립선 조직에 제시된 펩티드의 발견 및 검증 단계를 거쳐, 큐레이트된(curated) 검증된 펩티드 라이브러리에 대한 검증된 펩티드를 생성하는 단계의 개략도를 도시한다.
도 25b는 시험관내 에피토프 특이적 CD8T 세포의 생성을 예시하는 데이터를 도시한다. 펩티드는 전립선암에 특이적인 단백질에서 T 세포 에피토프 예측 소프트웨어를 사용하여 예측되었다.
도 25c는 생체외에서 생성된 KLK4 에피토프 활성화된 T 세포가 면역원성이며 표적 세포를 사멸함을 예시하는 데이터를 도시한다. GFP를 발현하는 293T 표적 세포는 2 μM KLK4 항원 (LLANGRMPTV)으로 로딩되거나 대조군 GFP+ 세포로서 로딩되지 않은 채로 두었다. KLK4 특이적 CD8 T 세포 (이펙터 세포)를 1:10 비로 대조군 세포 또는 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이펙터 세포의 존재 하에, 표적 세포 성장은 KLK4를 발현하지 않는 대조군 세포보다 더 쉽게 제어되었다. 또한, 100시간에 걸친 GFP+ 세포의 그래프를 나타냈다 (하단). KLK4 활성화된 CD8 세포의 존재 하에 대조군 (좌측 하단 이미지) 및 표적 GFP+ 세포 (우측 하단 이미지)의 이미지를 나타냈다.
도 26은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-02:01 상의 BTK C481S 신생항원에 대한 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 27은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 HLA-02:01 상의 EGFR T790M 신생항원에 대한 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 28a는 T 세포 요법의 적용을 위해 본원에 제공된 예시적인 방법의 개략도를 도시한다.
도 28b는 T 세포 요법의 적용을 위해 본원에 제공된 예시적인 방법의 개략도를 도시한다.
도 29는 인실리코 T 세포 에피토프 예측을 위한 예시적인 방법의 개략도를 도시한다. PPV는 주어진 n개의 히트(hit) 수 및 5,000개의 디코이(decoy)에 대해 결정되었으며, n개의 최상위 펩티드 중 히트가 몇 분율인지를 결정하였다.
도 30은 인실리코 에피토프 예측을 사용한 MHC 리간돔(ligandome)의 대립유전자 커버리지의 개략도를 도시한다.
도 31은 인실리코 T 세포 에피토프 예측 모델을 비교하는 개략도를 도시한다.
도 32는 인실리코 T 세포 에피토프 예측 및 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법을 사용한 면역원성 펩티드의 확인 및 검증을 예시하는 개략도를 도시한다.
도 33은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 다수의 신생항원 CD8+ T 세포 집단을 유도 및 확장할 수 있음을 예시하는 데이터를 도시한다. 나타낸 데이터는 흑색종 환자로부터의 샘플로부터의 대표적 데이터이다.
도 34는 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 동일한 환자에서 3개의 CD4+ 집단을 생성하였음을 예시하는 데이터를 도시한다. 나타낸 데이터는 흑색종 환자로부터의 샘플로부터의 대표적 데이터이다.
도 35는 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 흑색종 환자 샘플에 걸쳐 T 세포 유도를 반복적으로 입증함을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 36은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 돌연변이체 에피토프에 대해 고도로 특이적인 T 세포를 유도함을 예시하는 흑색종 환자 샘플로부터의 대표적인 데이터를 도시한다.
도 37은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 고기능성인 T 세포를 유도함을 예시하는 흑색종 환자 샘플로부터의 대표적인 데이터를 도시한다.
도 38은 항원 특이적 T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장하는 본원에 제공된 예시적인 방법이 CD8+ T 세포가 종양 세포를 사멸할 수 있도록 유도함을 예시하는 데이터를 도시한다.
비록 많은 에피토프가 MHC 분자에 결합할 가능성을 갖긴 하지만, 실험적으로 시험할 때 MHC 분자에 결합할 수 있는 에피토프는 거의 없다. 비록 많은 에피토프가, 또한 예를 들어, 질량 분석법에 의해 검출될 수 있는 MHC 분자에 의해 제시될 가능성에 대한 가능성을 갖긴 하지만, 이들 에피토프의 단지 선택된 수가 질량 분석법에 의해 제시 및 검출될 수 있다. 비록 많은 에피토프가 또한 면역원성의 가능성을 갖긴 있지만, 실험적으로 시험했을 때 이들 에피토프 중 다수는 항원 제시 세포에 의해 제시되는 것으로 입증되었음에도 불구하고, 면역원성이 아니다. 많은 에피토프는 또한 T 세포를 활성화시켜 세포독성이 될 가능성을 가지나; 항원 제시 세포에 의해 제시되고/되거나 면역원성인 것으로 입증된 많은 에피토프는 여전히 T 세포를 활성화시켜 세포독성이 되도록 할 수 없다.
본원에는 하나 이상의 MHC 분자에 결합하고, 하나 이상의 MHC 분자에 의해 제시되며, 면역원성이고 T 세포를 활성화시켜 세포독성이 될 수 있는 것으로 확인 및 검증된 T 세포 에피토프를 함유하는 항원이 제공된다. 검증된 항원 및 이들 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 치료 용도를 위한 항원 특이적 T 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검증된 항원 및 이들 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 치료 용도를 위한 T 세포 제조 방법에 사용하기 위해 사전 제조 및 저장될 수 있다. 예를 들어, 검증된 항원 및 이들 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 환자를 위한 치료 T 세포 조성물을 신속하게 준비하기 위해 신속하게 사전 제조되거나 제조될 수 있다. T 세포 에피토프를 가진 검증된 항원을 사용하여, HLA 결합 활성을 갖는 펩티드 또는 이러한 펩티드를 코딩하는 RNA와 같은 면역원을 제조할 수 있다. 라이브러리에서 다수의 면역원을 확인, 검증 및 사전 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적합한 시간에 적합한 환자에 대한 약리학상 개입을 위해 저장, 보관 및 사용에 적합한 규모로 제조될 수 있다.
모든 암은 아니지만 일부 암은 면역요법의 잠재적 표적인 항원을 갖는다. 각각의 펩티드 항원은 특이적 HLA 코딩된 MHC 분자와 연관되어 항원 제시 세포에 대한 T 세포 활성화를 위해 제시될 수 있다. 다른 한편으로, 본원에는 특정한 에피토프가 특정한 HLA에 대해 사전 확인 및 사전 검증되고, 이들 에피토프가 세포 요법 제조 공정을 위해 사전 제조될 수 있는 잠재적으로 보편적인 접근법이 제공된다. 예를 들어, G12, G13 및 Q61 돌연변이를 가진 다수의 KRAS 에피토프는 신뢰할 수 있는 T 세포 에피토프 제시 예측 모델 (예를 들어, 2018년 2월 12일에 출원된 PCT/US2018/017849, 및 2019년 12월 20일에 출원된 PCT/US2019/068084를 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다)을 사용하여, 이들 에피토프의 면역원성 검증, 이들 에피토프의 질량 분석법을 사용한 처리 및 제시, 및 상이한 HLA에 의해 코팅된 이들 에피토프 및 MHC에 대해 TCR을 가진 세포독성 T 세포를 제조하는 능력과 함께, 확인될 수 있다. 각각의 에피토프는 그의 특이적 아미노산 서열 및 관련 HLA로 검증된다. 일단 이들 에피토프가 검증되면, 에피토프를 함유하는 펩티드 또는 이들 에피토프를 함유하는 펩티드를 코딩하는 RNA와 같이 사전 제조된 면역원을 포함하는 라이브러리를 생성시킬 수 있다.
항원은 돌연변이되지 않은 항원 또는 돌연변이된 항원일 수 있다. 예를 들어, 항원은 종양 연관 항원, 돌연변이된 항원, 조직 특이적 항원 또는 신생항원일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 돌연변이된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 조직 특이적 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 신생항원이다. 신생항원은 대상체의 암 또는 종양에서 발견되며 생식선에서 분명하지 않거나 대상체의 건강한 조직에서 발현되지 않는다. 따라서, 암의 유전자 돌연변이가 신생항원 생성 기준을 충족하기 위해, 암의 유전자 돌연변이가 변경된 단백질 생성물로 번역되는 비침묵 돌연변이여야 한다. 변경된 단백질 생성물은 T 세포에 대한 돌연변이된 에피토프가 될 수 있는 돌연변이를 가진 아미노산 서열을 함유한다. 돌연변이된 에피토프는 MHC 분자에 결합할 가능성을 갖는다. 돌연변이된 에피토프는 또한, 예를 들어, 질량 분석법에 의해 검출될 수 있는 MHC 분자에 의해 제시될 가능성을 갖는다. 더욱이, 돌연변이된 에피토프는 면역원성일 가능성을 갖는다. 게다가, 돌연변이된 에피토프는 T 세포를 활성화시켜 세포독성이 될 가능성을 갖는다.
본원에는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 에피토프 서열의 라이브러리로부터 적어도 하나의 에피토프 서열을 선택하는 단계로서, 여기서 라이브러리의 각각의 에피토프 서열은 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 매칭되는 것인 단계; 및 대상체로부터의 T 세포 또는 동종이계 T 세포를 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 각각은 하기 기준, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다, 면역원성 검정에 따라 면역원성이다, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시된다, 그리고 T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극한다 중 적어도 둘 또는 셋 또는 네 가지를 충족하기 위해 사전 검정되는 것인 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 T 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열은 돌연변이를 포함하고 방법은 돌연변이를 가진 에피토프를 코딩하도록 대상체의 암 세포를 확인하는 단계; 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열은 대상체의 암 세포에 의해 과발현되는 단백질 내에 있고 방법은 에피토프를 함유하는 단백질을 과발현하도록 대상체의 암 세포를 확인하는 단계를 포함하거나; 또는 적어도 하나의 에피토프 서열은 종양 미세환경에서 세포에 의해 발현되는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 대상체의 암 세포에 의해 발현되지 않는 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체의 암 세포에 의해 발현되지 않는 에피토프는 대상체의 종양 미세환경에서 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 방법은 순환 종양 DNA 검정을 사용하여 대상체를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 유전자 패널을 사용하여 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 대상체로부터의 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 동종이계 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 각각은 하기 기준: 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다, 면역원성 검정에 따라 면역원성이다, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시된다, 그리고 T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극한다 중 하나 이상 또는 각각을 충족하기 위해 사전 검정된다.
일부 실시양태에서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 에피토프는 결합 검정에 따라 500 nM 이하의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC 분자에 결합한다. 예를 들어,대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 에피토프는 결합 검정에 따라 400 nM, 300 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 또는 25 nM 이하의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 에피토프는 컴퓨터 상에 구현되는 MHC 에피토프 예측 프로그램을 사용하여 500 nM 이하의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC 분자에 결합하는 것으로 예측된다. 예를 들어, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 에피토프는 컴퓨터 상에 구현되는 MHC 에피토프 예측 프로그램을 사용하여 400 nM, 300 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 또는 25 nM 이하의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC 분자에 결합하는 것으로 예측될 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 상에 구현되는 MHC 에피토프 예측 프로그램은 NetMHCpan이다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 상에 구현되는 MHC 에피토프 예측 프로그램은 NetMHCpan 버전 4.0이다.
일부 실시양태에서, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시되는 에피토프는 15 Da 미만일 검출된 펩티드의 질량 정확도로 APC로부터 용리 후 질량 분석법에 의해 검출된다. 예를 들어, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시되는 에피토프는 14 Da, 13 Da, 12 Da, 11 Da, 10 Da, 9 Da, 8 Da, 7 Da, 6 Da, 5 Da, 4 Da, 3 Da, 2 Da, 또는 1 Da 미만일 검출된 펩티드의 질량 정확도로 APC로부터 용리 후 질량 분석법에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시되는 에피토프는 10,000 백만분율 (ppm) 미만일 검출된 펩티드의 질량 정확도로 APC로부터 용리 후 질량 분석법에 의해 검출된다. 예를 들어, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시되는 에피토프는 7,500 ppm; 5,000 ppm; 2,500 ppm; 1,000 ppm; 900 ppm; 800 ppm; 700 ppm; 600 ppm; 500 ppm; 400 ppm; 300 ppm; 200 ppm 또는 100 ppm 미만일 검출된 펩티드의 질량 정확도로 APC로부터 용리 후 질량 분석법에 의해 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역원성 검정에 따라 면역원성인 에피토프는 다량체 검정에 따라 면역원성이다. 일부 실시양태에서, 다량체 검정은 유세포 분석법 분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체 검정은 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 및 매칭된 HLA 대립유전자를 포함하는 펩티드-MHC 다량체에 결합된 T 세포를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극되었다. 일부 실시양태에서, 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 세포의 적어도 0.005%를 구성하고, (iii) CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성이다. 예를 들어, 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900개 또는 그 초과의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 세포의 적어도 0.005%를 구성하고, (iii) CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 세포의 적어도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%를 구성하고, (iii) CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900개 또는 그 초과의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 세포의 적어도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%를 구성하고, (iii) CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6개 자극 중 적어도 하나에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성이다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900개 또는 그 초과의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6개 자극 중 적어도 하나에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 자극 중 적어도 2개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6개 자극 중 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 7개 자극 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 8개 자극 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 9개 자극 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 10개 자극 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 11개 자극 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 12개 자극 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 자극 중 적어도 3개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 자극 중 적어도 4개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900개 또는 그 초과의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6개 자극 중 적어도 하나에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900개 또는 그 초과의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 자극 중 적어도 2개에서 또는 동일한 출발 샘플로부터 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 자극 중 적어도 3개에서 또는 동일한 출발 샘플로부터 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 자극 중 적어도 4개에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조군 샘플은 (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하지 않거나, (ii) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열과 상이한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하거나, 또는 (iii) 무작위 서열을 가진 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 7, 18, 19, 20 또는 그 초과의 일 동안 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극되었다. 일부 실시양태에서, 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC의 존재 하에 적어도 5배, 10배, 20, 배, 50배, 100배, 500배 또는 1,000배 또는 그 초과로 확장되었다.
일부 실시양태에서, 면역원성 검정에 따라 면역원성인 에피토프는 기능적 검정에 따라 면역원성이다. 일부 실시양태에서, 기능적 검정은 면역검정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 검정은 IFNγ 또는 TNFα의 세포내 염색 또는 CD107a 및/또는 CD107b의 세포 표면 발현으로 T 세포를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극되었다 일부 실시양태에서, 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 또는 CD4+ 세포의 적어도 0.005%를 구성하고, (iii) CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 기능적 검정에 따라 면역원성이다. 예를 들어 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900개 또는 그 초과의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 또는 CD4+ 세포의 적어도 0.005%를 구성하고, (iii) CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 기능적 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 또는 CD4+ 세포의 적어도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%를 구성하고, (iii) CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 기능적 검정에 따라 면역원성일 수 있다. 예를 들어 에피토프는, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900개 또는 그 초과의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 또는 CD4+ 세포의 적어도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%를 구성하고, (iii) CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 기능적 검정에 따라 면역원성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극된 T 세포는 에피토프를 제시하는 세포를 사멸시키는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하는 세포의 수는 T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하지 않는 세포의 수보다 적어도 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500, 또는 1,000배 더 높다. 일부 실시양태에서, T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하는 세포의 수는 (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하지 않거나, (ii) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열과 상이한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하거나, 또는 (iii) 무작위 서열을 가진 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하는 세포의 수보다 적어도 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500, 또는 1,000배 더 높다 일부 실시양태에서, T 세포에 의해 사멸되는 돌연변이체 에피토프를 제시하는 세포의 수는 T 세포에 의해 사멸되는 상응하는 야생형 에피토프를 제시하는 세포의 수보다 적어도 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500, 또는 1,000배 더 높다. 일부 실시양태에서, 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극된 T 세포는 세포독성 검정에 따라 특이적으로 세포독성이 되도록 자극된 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드 중 적어도 하나는 합성된 펩티드 또는 핵산 서열로부터 발현된 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하거나 대상체의 게놈에서 HLA 대립유전자를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열은 표 1 내지 표 8 및 표 11 내지 표 14의 하나 이상의 에피토프 서열로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체외에서 하나 이상의 펩티드와 접촉된 T 세포를 확장시켜 MHC 단백질과 복합체를 형성하는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열에 특이적인 T 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질은 대상체의 암 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질은 대상체의 종양 미세환경에서 세포에 의해 발현된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 종양 특이적 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 대상체의 암 세포에 의해 과발현되는 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 드라이버 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 약물 내성 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 조직 특이적 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 암 고환 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 바이러스 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 부 조직적합성 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 RAS 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 GATA3 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 EGFR 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 BTK 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 p53 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 TMPRSS2::ERG 융합 폴리펩티드로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 Myc 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 하나는 ANKRD30A, COL10A1, CTCFL, PPIAL4G, POTEE, DLL3, MMP13, SSX1, DCAF4L2, MAGEA4, MAGEA11, MAGEC2, MAGEA12, PRAME, CLDN6, EPYC, KLK3, KLK2, KLK4, TGM4, POTEG, RLN1, POTEH, SLC45A2, TSPAN10, PAGE5, CSAG1, PRDM7, TG, TSHR, RSPH6A, SCXB, HIST1H4K, ALPPL2, PRM2, PRM1, TNP1, LELP1, HMGB4, AKAP4, CETN1, UBQLN3, ACTL7A, ACTL9, ACTRT2, PGK2, C2orf53, KIF2B, ADAD1, SPATA8, CCDC70, TPD52L3, ACTL7B, DMRTB1, SYCN, CELA2A, CELA2B, PNLIPRP1, CTRC, AMY2A, SERPINI2, RBPJL, AQP12A, IAPP, KIRREL2, G6PC2, AQP12B, CYP11B1, CYP11B2, STAR, CYP11A1, 및 MC2R로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의해 코딩되는 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 하나는 표적 조직과 상이한 복수의 비표적 조직의 각각의 조직에서 조직 특이적 단백질의 발현 수준보다 적어도 2배 더 초과인 대상체의 표적 조직에서의 발현 수준을 갖는 조직 특이적 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포 또는 동종이계 T 세포를 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계는 T 세포를 에피토프를 제시하는 APC와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 에피토프를 제시하는 APC는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드 또는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 코딩하는 다중핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개를 포함하고, 각각은 암을 가진 인간 대상체의 암 세포에 의해 발현된다.
일부 실시양태에서, 방법은 항원 제시 세포 (APC) 및 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD14+ 세포 및 CD25+ 세포를 고갈시켜, APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포의 집단은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드 (FLT3L), 및 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재 하에 제1 기간 동안 인큐베이션하여, 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 확장시켜, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 종양 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 및 대상체의 암 세포 또는 APC에 의해 발현되는 MHC 단백질을 포함하는 복합체에 특이적인 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 확장시키는 단계는 28일 미만 내에 수행된다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션하는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 FLT3L 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 존재 하에 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD14+ 세포 및 CD25+ 세포를 고갈시키는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단을 CD14 결합제 및 CD25 결합제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고갈시키는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD19+ 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 고갈시키는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD11b+ 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 포함하는 약학 조성물을 암을 가진 인간 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 암을 가진 인간 대상체는 그로부터 생물학적 샘플을 수득한 인간 대상체이다.
일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD8+ T 세포의 총 수의 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율은 생물학적 샘플에서 CD8+ T 세포의 총 수의 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율보다 적어도 2배 더 높다. 일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD4+ T 세포의 총 수의 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율은 생물학적 샘플에서 CD4+ T 세포의 총 수의 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율보다 적어도 2배 더 높다. 일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD8+ T 세포의 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%는 나이브 CD8+ T 세포로부터 유래된 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD8+ T 세포의 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%는 기억 CD8+ T 세포로부터 유래된 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD4+ T 세포의 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%는 나이브 CD4+ T 세포로부터 유래된 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD4+ T 세포의 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%는 기억 CD4+ T 세포로부터 유래된 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 확장시키는 단계는 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 성숙한 APC의 제2 집단과 접촉시키는 단계로서, 여기서 성숙한 APC의 제2 집단은 FLT3L과 함께 인큐베이션되었고 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 제시하는 것인 단계; 및 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 제2 기간 동안 확장시켜, T 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 성숙한 APC의 제2 집단은 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 성숙한 APC의 제2 집단과 접촉시키기 전에 적어도 1일 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션되었다. 일부 실시양태에서, 확장시키는 단계는 T 세포의 확장된 집단을 성숙한 APC의 제3 집단과 접촉시키는 단계로서, 여기서 성숙한 APC의 제3 집단은 FLT3L과 함께 인큐베이션되었고 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 제시하는 것인 단계; 및 T 세포의 확장된 집단을 제3 기간 동안 확장시켜, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 성숙한 APC의 제3 집단은 T 세포의 확장된 집단을 성숙한 APC의 제3 집단과 접촉시키기 전에 적어도 1일 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션되었다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플, 백혈구성분채집술 샘플 또는 성분채집술 샘플이다.
일부 실시양태에서, 방법은 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 수확하는 단계, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 냉동보존하는 단계 또는 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 함유하는 약학 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 수득된 암 세포를 포함하는 제1 생물학적 샘플로부터 암 세포 핵산을 생성하는 단계 및 동일한 대상체로부터 수득된 비암 세포를 포함하는 제2 생물학적 샘플로부터 비암 세포 핵산을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질은 HLA-A01:01, HLA-A02:01, HLA-A03:01, HLA-A11:01, HLA-A24:01, HLA-A30:01, HLA-A31:01, HLA-A32:01, HLA-A33:01, HLA-A68:01, HLA-B07:02, HLA-B08:01, HLA-B15:01, HLA-B44:03, HLA-C07:01 및 HLA-C07:02로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질이다.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하고 대상체의 암 세포에 의해 발현되는 하나 또는 둘 이상의 상이한 단백질을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하고 암 세포에서 하나 또는 둘 이상의 상이한 단백질을 코딩하는 RNA의 수준을 측정함으로써 대상체의 암 세포에 의해 발현되는 하나 또는 둘 이상의 상이한 단백질을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 암 세포 및 비암 세포로부터 게놈 DNA 또는 RNA를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 점 돌연변이 또는 점 돌연변이에 의해 코딩되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 neoORF 돌연변이에 의해 코딩되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 유전자 융합 돌연변이에 의해 코딩되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 indel 돌연변이에 의해 코딩된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상은 스플라이스 부위 돌연변이에 의해 코딩되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개는 동일한 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개는 중첩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개는 상이한 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 초과의 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 고형암의 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 백혈병 또는 림프종의 암 세포이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이는 복수의 암 환자에서 발생하는 돌연변이이다
일부 실시양태에서, MHC는 클래스 I MHC이다. 일부 실시양태에서, MHC는 클래스 II MHC이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD8 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포 t는 기억 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 나이브 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 투여하기 전에 T 세포의 확장된 집단으로부터 세포의 하나 이상의 하위집단을 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 배양물에서 면역 반응을 도출하는 단계는 펩티드와 접촉 직후 T 세포 배양물로부터 IL2 생산을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 배양물에서 면역 반응을 도출하는 단계는 펩티드와 접촉 직후 T 세포 배양물로부터 사이토카인 생성을 유도하는 단계를 포함하고, 여기서 사이토카인은 인터페론 감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자 (TNF) 알파 (α) 및/ 또는 베타 (β) 또는 그의 조합이다. 일부 실시양태에서, T 세포 배양물에서 면역 반응을 도출하는 단계는 T 세포 배양물을 유도하여 펩티드를 발현하는 세포를 사멸시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 배양물에서 면역 반응을 도출하는 단계는 T 세포 배양물에서 Fas 리간드, 그랜자임, 퍼포린, IFN, TNF, 또는 그의 조합의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드가 정제된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드는 동결건조된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드는 용액이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드는 펩티드의 무결성이 ≥99%가 되도록 하는 저장 조건에 존재한다.
일부 실시양태에서, 세포독성 검정에 따라 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열이 로딩된 세포에 대해 세포독성이 되도록 T 세포를 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포독성 검정에 따라 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질을 발현하는 암 세포에 대해 세포독성이 되도록 T 세포를 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포독성 검정에 따라 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질을 발현하는 암 연관 세포에 대해 세포독성이 되도록 T 세포를 자극하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 선택된 에피토프는 암 세포에 의해 발현되고, 추가 선택된 에피토프는 암 연관 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 추가 선택된 에피토프는 암 연관 섬유모세포 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 추가 선택된 에피토는 표 8로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 에피토프 서열의 라이브러리로부터 적어도 하나의 에피토프 서열을 선택하는 단계로서, 여기서 라이브러리의 각각의 에피토프 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 매칭되는 것인 단계; 및 대상체로부터의 T 세포 또는 동종이계 T 세포를 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열이; 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하며, 면역원성 검정에 따라 면역원성이며, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시되며, T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극하는 것인 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 방법은 순환 종양 DNA 검정을 사용하여 대상체를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 유전자 패널을 사용하여 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 대상체로부터의 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드 중 적어도 하나는 합성된 펩티드 또는 핵산 서열로부터 발현된 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하거나 대상체의 게놈에서 HLA 대립유전자를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에 의해 발현되는 대상체의 HLA 대립유전자의 코딩되는 단백질을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터의 T 세포를 본원에 제공된 표의 하나 이상의 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터의 T 세포를 본원에 제공된 표의 에피토프로부터 선택된 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체외에서 하나 이상의 펩티드와 접촉된 T 세포를 확장시켜 T 세포의 집단을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 암이 감소되거나 제거되도록 하는 용량 및 시간 간격으로 T 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 암이 감소되거나 제거되도록 하는 용량 및 시간 간격으로 대상체에게 T 세포 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드 중 적어도 하나는 대상체의 암 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 종양 특이적 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 대상체의 암 세포에 의해 과발현되는 단백질로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 ANKRD30A, COL10A1, CTCFL, PPIAL4G, POTEE, DLL3, MMP13, SSX1, DCAF4L2, MAGEA4, MAGEA11, MAGEC2, MAGEA12, PRAME, CLDN6, EPYC, KLK3, KLK2, KLK4, TGM4, POTEG, RLN1, POTEH, SLC45A2, TSPAN10, PAGE5, CSAG1, PRDM7, TG, TSHR, RSPH6A, SCXB, HIST1H4K, ALPPL2, PRM2, PRM1, TNP1, LELP1, HMGB4, AKAP4, CETN1, UBQLN3, ACTL7A, ACTL9, ACTRT2, PGK2, C2orf53, KIF2B, ADAD1, SPATA8, CCDC70, TPD52L3, ACTL7B, DMRTB1, SYCN, CELA2A, CELA2B, PNLIPRP1, CTRC, AMY2A, SERPINI2, RBPJL, AQP12A, IAPP, KIRREL2, G6PC2, AQP12B, CYP11B1, CYP11B2, STAR, CYP11A1, 및 MC2R로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의해 코딩되는 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩티드 중 적어도 하나는 표적 조직과 상이한 복수의 비표적 조직의 각각의 조직에서 조직 특이적 단백질의 발현 수준보다 적어도 2배 더 초과인 대상체의 표적 조직에서의 발현 수준을 갖는 조직 특이적 항원 에피토프 유전자에 의해 코딩되는 단백질로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 방법은, 하나 이상의 항원 제시 세포 (APC) 제제를, CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 하나 이상의 별개의 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 하나 이상의 APC 제제를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 하나 이상의 별개의 기간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 APC는 하나 이상의 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드 (FLT3L)로 자극된 APC를 포함하는 것인 단계; 또는 FLT3L 및 적어도 하나의 펩티드를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 FLT3L을 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하고 여기서 적어도 하나의 펩티드를 면역 세포의 집단과 함께 제1 펩티드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하며, 여기서 면역 세포의 집단은 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 APC를 포함하는 것인 단계를 포함하며; 여기서 적어도 하나의 항원 특이적 기억 T 세포가 확장되거나, 적어도 하나의 항원 특이적 나이브 T 세포가 유도된다.
일부 실시양태에서, 방법은 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제 중 제1 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 것으로부터 28일 미만의 하나 이상의 별개의 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 3개 이하의 APC 제제와 함께 3개 이하의 별개의 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 2개 이하의 APC 제제와 함께 2개 이하의 별개의 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제 중 제1 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 것으로부터 28일 미만의 하나 이상의 별개의 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 별개의 기간 동안 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 하나 이상의 APC 제제와 함께 인큐베이션함으로써 항원으로 자극된 T 세포 제조의 총 기간은 28일 미만이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 2개는 FLT3L로 자극된 APC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 3개는 FLT3L로 자극된 APC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션하는 단계는 APC 제제 중 제1 APC 제제를 T 세포와 함께 7일 초과 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, APC 제제의 APC는 적어도 하나의 항원 펩티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 항원 펩티드가 로딩된 APC를 포함한다. 일부 실시양태에서, APC 제제의 APC는 자가 APC 또는 동종이계 APC이다. 일부 실시양태에서, APC 제제의 APC는 수지상 세포 (DC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, DC는 CD141+ DC이다. 일부 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 CD19를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 CD11b를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계는 CD14 또는 CD25 결합제를 하나 이상의 APC 제제의 APC에 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 항원 특이적 T 세포 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 인큐베이션하는 단계는 하나 이상의 APC 제제 중 제1 APC 제제를 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 초과 동안 T 세포에 대해 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 하나를 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제1 배지와 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 하나를 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 포함하는 제2 배지와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 성숙 APC를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제3 기간 후에 제2 배지의 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, APC 제제의 APC는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로 자극된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 폴리 I:C, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원은 신생항원, 종양 연관 항원, 바이러스 항원, 부 조직적합성 항원 또는 그의 조합이다.
일부 실시양태에서, 방법은 생체외에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 방법은 CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단을 FLT3L과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 펩티드를 CD14 및 CD25를 발현하는 세포가 고갈된 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역 세포의 집단으로부터 CD14를 발현하는 세포, CD19를 발현하는 세포 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역 세포의 집단으로부터 CD14를 발현하는 세포, CD11b를 발현하는 세포 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 CD14를 발현하는 세포, CD11b를 발현하는 세포, CD19를 발현하는 세포 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 CD14, CD11b, CD19 및 CD25를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 CD14, CD11b, CD19 및 CD25 중 적어도 하나를 발현하는 세포, 및 제5 세포 표면 마커를 발현하는 적어도 제5 세포 유형을 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 인큐베이션 기간, 제2 인큐베이션 기간, 및/또는 제3 인큐베이션 기간에, 면역 세포 집단으로부터 CD14 및 CD25 발현 세포, 및 면역 세포 집단으로부터 CD19, CD11b 발현 세포 중 임의의 하나 이상을 선택적으로 고갈시키는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포 또는 동종이계 T 세포를 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계는 T 세포를 에피토프를 제시하는 APC와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 에피토프를 제시하는 APC는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드 또는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 코딩하는 다중핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 항원 제시 세포 (APC) 및 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD14+ 세포 및 CD25+ 세포를 고갈시켜, APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포의 집단은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 것이다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드 (FLT3L), 및 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재 하에 제1 기간 동안 인큐베이션하여, 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 확장시켜, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 종양 항원 특이적 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 및 대상체의 암 세포 또는 APC에 의해 발현되는 MHC 단백질을 포함하는 복합체에 특이적인 T 세포를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 확장시키는 단계는 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 성숙한 APC의 제2 집단과 접촉시키는 단계로서, 여기서 성숙한 APC의 제2 집단은 FLT3L과 함께 인큐베이션되었고 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 제시하는 것인 단계 및 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 제2 기간 동안 확장시켜, T 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 성숙한 APC의 제2 집단은 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 성숙한 APC의 제2 집단과 접촉시키기 전에 적어도 1일 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션되었다. 일부 실시양태에서, 확장시키는 단계는 T 세포의 확장된 집단을 성숙한 APC의 제3 집단과 접촉시키는 단계로서, 여기서 성숙한 APC의 제3 집단은 FLT3L과 함께 인큐베이션되었고 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 제시하는 것인 단계; 및 T 세포의 확장된 집단을 제3 기간 동안 확장시켜, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 성숙한 APC의 제3 집단은 T 세포의 확장된 집단을 성숙한 APC의 제3 집단과 접촉시키기 전에 적어도 1일 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션되었다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 수확하는 단계, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 냉동보존하는 단계 또는 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 함유하는 약학 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션하는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 FLT3L 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 존재 하에 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 포함하는 약학 조성물을 암을 가진 인간 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 암을 가진 인간 대상체는 그로부터 생물학적 샘플을 수득한 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 길이가 8 내지 50개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개를 포함하고, 각각은 암을 가진 인간 대상체의 암 세포에 의해 발현된다.
일부 실시양태에서, APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD14+ 세포 및 CD25+ 세포를 고갈시키는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단을 CD14 결합제 및 CD25 결합제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고갈시키는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD19+ 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역 세포의 집단을 CD19 결합제과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 고갈시키는 단계는 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD11b+ 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역 세포의 집단을 CD11b 결합제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 적어도 하나의 T 세포와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 자극된 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC, 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제2 APC 펩티드 로딩된 샘플, 또는 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC, 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩티드 로딩된 샘플, 또는 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩티드 로딩된 샘플과 함께 인큐베이션하여, 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 별개의 기간, 3개 이하의 별개의 기간, 제1 기간, 제2 기간, 제3 기간, 제4 기간, 또는 제5 기간은 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 13시간, 적어도 14시간, 적어도 15시간, 적어도 16시간, 적어도 17시간, 적어도 18시간, 적어도 19시간, 적어도 20시간, 적어도 21시간, 적어도 22시간, 적어도 23시간, 적어도 24시간, 적어도 25시간, 적어도 26시간, 적어도 27시간, 적어도 28시간, 적어도 29시간, 적어도 30시간, 적어도 31시간, 적어도 32시간, 적어도 33시간, 적어도 34시간, 적어도 35시간, 적어도 36시간, 적어도 37시간, 적어도 38시간, 적어도 39시간, 또는 적어도 40시간이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 별개의 기간, 3개 이하의 별개의 기간, 제1 기간, 제2 기간, 제3 기간, 제4기간, 또는 제5 기간은 1 내지 4시간, 1 내지 3시간, 1 내지 2시간, 4 내지 40시간, 7 내지 40시간, 4 내지 35시간, 4 내지 32시간, 7 내지 35시간 또는 7 내지 32시간이다.
일부 실시양태에서, 면역 세포의 집단은 APC 또는 하나 이상의 APC 제제 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포의 집단은 APC를 포함하지 않고/거나 면역 세포의 집단은 하나 이상의 APC 제제 중 하나를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 방법은 FLT3L 및 적어도 하나의 펩티드를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 여기서 FLT3L을 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하고 여기서 적어도 하나의 펩티드를 면역 세포의 집단과 함께 제1 펩티드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하며, 여기서 면역 세포의 집단은 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 APC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 FLT3L 및 적어도 하나의 펩티드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 FLT3L을 적어도 하나의 APC와 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하고 여기서 적어도 하나의 펩티드를 적어도 하나의 APC와 함께 제2 펩티드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계; 및 제1 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 제1 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 FLT3L 및 적어도 하나의 펩티드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 FLT3L을 적어도 하나의 APC와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하고 여기서 적어도 하나의 펩티드를 적어도 하나의 APC와 함께 제3 펩티드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계; 및 제2 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 제2 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 자극된 T 세포 샘플로부터 제1 자극 T 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선행 문장에 기재된 바와 같이 단리하는 단계는 적어도 하나의 펩티드와 함께 인큐베이션된 적어도 하나의 APC와 접촉된 면역 세포의 집단으로부터 자극 T 세포를 풍부화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 풍부화 단계는 적어도 하나의 자극 T 세포의 하나 이상의 세포 마커의 발현을 결정하고 하나 이상의 세포 마커를 발현하는 자극 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서 세포 표면 마커는 TNF-α, IFN-γ, LAMP-1, 4-1BB, IL-2, IL-17A, 그랜자임 B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포 마커는 사이토카인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터 적어도 하나의 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14를 발현하는 세포를 풍부화하여, CD14+ 세포 풍부 샘플을 수득하는 단계; CD14+ 세포 풍부 샘플을 적어도 하나의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩티드를 CD14+ 세포 풍부 샘플과 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하여, APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계; APC 펩티드 로딩된 샘플을 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하여, 성숙 APC 샘플을 수득하는 단계; 성숙 APC 샘플의 APC를 T 세포를 포함하는 CD14 및 CD25 고갈된 샘플과 함께 제4 기간 동안 인큐베이션하는 단계; T 세포를 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 제5 기간 동안 인큐베이션하는 단계; T 세포를 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 제6 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 T 세포 중 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플을 수득하는 단계; CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩티드를 제2 기간 동안 CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계; APC 펩티드 로딩된 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 임의로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플을 수득하는 단계; CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩티드를 제2 기간 동안 CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플과 함께 인큐베이션하여, APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계; APC 펩티드 로딩된 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 임의로, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 성숙 APC 샘플의 APC와 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 임의로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플을 수득하는 단계; CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩티드를 제2 기간 동안 CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제1 APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계; 제1 APC 펩티드 로딩된 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 임의로, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제2 APC 펩티드 로딩된 샘플과 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 임의로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 제3 APC 펩티드 로딩된 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 적어도 하나의 APC 및 적어도 하나의 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 CD14 및 CD25를 발현하는 세포를 고갈시켜, CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플을 수득하는 단계; CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플을 제1 기간 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계; 적어도 하나의 펩티드를 제2 기간 동안 CD14 및 CD25 세포 고갈된 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제1 APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계; 제1 APC 펩티드 로딩된 샘플을 제3 기간 동안 적어도 하나의 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 임의로, 제1 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제4 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC와 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 임의로, 제2 자극 T 세포 샘플의 T 세포를 제5 기간 동안 FLT3L 및 성숙 APC 샘플의 FLT3L로 자극된 APC과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계; 제1, 제2 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 FLT3L 및 적어도 하나의 펩티드를 생물학적 샘플로부터의 면역 세포의 집단과 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 FLT3L을 면역 세포의 집단과 함께 제1 기간 동안 인큐베이션하고 여기서 적어도 하나의 펩티드를 면역 세포의 집단과 함께 제1 펩티드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 자극 T 세포 샘플을 수득하며, 여기서 면역 세포의 집단은 적어도 하나의 T 세포 및 적어도 하나의 APC를 포함하는 것인 단계; 임의로, FLT3L 및 적어도 하나의 펩티드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 FLT3L을 적어도 하나의 APC와 함께 제2 기간 동안 인큐베이션하고 여기서 적어도 하나의 펩티드를 적어도 하나의 APC와 함께 제2 펩티드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제1 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계; 및 제1 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 제1 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제2 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계: 임의로, FLT3L 및 적어도 하나의 펩티드를 적어도 하나의 APC와 함께 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 FLT3L을 적어도 하나의 APC와 함께 제3 기간 동안 인큐베이션하고 여기서 적어도 하나의 펩티드를 적어도 하나의 APC와 함께 제3 펩티드 자극 기간 동안 인큐베이션하여, 제2 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 수득하는 단계; 및 제2 성숙 APC 펩티드 로딩된 샘플을 제2 자극 T 세포 샘플과 함께 인큐베이션하여, 제3 자극 T 세포 샘플을 수득하는 단계: 및 제1 자극 T 세포, 제2 자극 T 세포 또는 제3 자극 T 세포 샘플의 적어도 하나의 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 수득된 암 세포를 포함하는 제1 생물학적 샘플로부터 암 세포 핵산을 생성하는 단계 및 동일한 대상체로부터 수득된 비암 세포를 포함하는 제2 생물학적 샘플로부터 비암 세포 핵산을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 전체 게놈 시퀀싱 또는 전체 엑솜 시퀀싱에 의해 암 세포 핵산을 시퀀싱하여, 암 세포 핵산 서열을 포함하는 제1 복수의 핵산 서열을 수득하는 단계; 및 전체 게놈 시퀀싱 또는 전체 엑솜 시퀀싱에 의해 비암 세포 핵산을 시퀀싱하여 비암 세포 핵산 서열을 포함하는 제2 복수의 핵산 서열을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 암 세포에 특유하고 대상체의 비암 세포로부터 제2 복수의 핵산 서열로부터의 핵산 서열을 포함하지 않는 제1 복수의 핵산 서열로부터 복수의 암 특이적 핵산 서열을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 투여하기 전에 T 세포의 확장된 집단으로부터 세포의 하나 이상의 하위집단을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 하위집단을 선택하는 단계는 본원에 제공된 하나 이상의 세포 표면 마커의 발현에 기반한 세포 분류에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포는 하기: CD27, CD274, CD276, CD8A, CMKLR1, CXCL9, CXCR6, HLA-DQA1, HLA-DRB1, HLA-E, IDO1, LAG3, NKG7, PDCD1LG2, PSMB10, STAT1, CD45RO, CCR7, FLT3LG, IL-6 등 중 어느 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포 표면 마커에 기초하여 분류될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 T 세포의 집단을 투여하기 전에 대상체에서 하나 이상의 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포 표면 마커를 발현하는 세포의 하나 이상의 하위집단.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩티드의 아미노산 서열은 펩티드 시퀀싱에 의해 검증된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩티드의 아미노산 서열은 질량 분석법에 의해 검증된다.
또한, 본원에는 표 1 내지 표 8 및 표 11 내지 표 14 중 어느 하나의 하나 이상의 에피토프 서열을 제시하는 항원 제시 세포의 존재 하에 T 세포를 확장함으로써 제조된 T 세포를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또한, 본원에는 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리가 제공되며, 여기서 라이브러리의 각각의 에피토프 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 매칭되며; 여기서 라이브러리의 각각의 에피토프 서열은 하기 기준: 치료될 암을 가진 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다, 면역원성 검정에 따라 면역원성이다, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시된다, 및/또는 T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극한다 중 적어도 둘 또는 셋 또는 네 가지를 충족하기 위해 사전 검정된다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 표 1 내지 표 8 및 표 11 내지 표 14 중 어느 하나의 에피토프 서열을 포함하는 하나 또는 둘 이상의 펩티드 서열을 포함한다.
본원에 제공된 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 항원 특이적 T 세포를 제조하기 위한 것일 수 있고, 하나 이상의 MHC 분자에 결합하고, 하나 이상의 MHC 분자에 의해 제시되며, 면역원성이고/거나 T 세포를 활성화시켜 세포독성이 될 수 있는 것으로 확인 및 검증된, 종양 특이적 신생에피토프(neoepitope)와 같은 에피토프를 포함하는 재조합 펩티드 및 폴리뉴클레오티드 및 합성 펩티드를 포함한다. 펩티드는 생체외에서 T 세포를 프라이밍하는 방법에서 사용하기 위해 제조될 수 있다. 펩티드는 생체외에서 T 세포를 활성화하는 방법에서 사용하기 위해 제조될 수 있다. 펩티드는 항원 특이적 T 세포를 확장시키는 방법에서 사용하기 위해 제조될 수 있다. 펩티드는 생체외에서 드 노보 CD8 T 세포 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위해 제조될 수 있다. 펩티드는 생체외에서 드 노보 CD4 T 세포 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위해 제조될 수 있다. 펩티드는 생체외에서 기억 CD8 T 세포 반응을 자극하는 방법에서 사용하기 위해 제조될 수 있다. 펩티드는 생체외에서 기억 CD4 T 세포 반응을 자극하는 방법에서 사용하기 위해 제조될 수 있다. T 세포는 인간 대상체로부터 수득할 수 있다. T 세포는 동종이계 T 세포일 수 있다. T 세포는 T 세포주일 수 있다.
에피토프는 암 세포의 게놈에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 적어도 8개의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 암 세포의 게놈에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 8-12개의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 암 세포의 게놈에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 13-25개의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 암 세포의 게놈에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 8-50개의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 길이가 약 8 내지 약 30개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 길이가 약 8 내지 약 25개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 길이가 약 15 내지 약 24개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 길이가 약 9 내지 약 15개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 길이가 8개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 길이가 9개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 길이가 10개 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 최대 500개, 최대 250개, 최대 150개, 최대 125개, 또는 최대 100개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 적어도 8개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개, 또는 적어도 300개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 8 내지 약 500개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 8 내지 약 100개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 8 내지 약 50개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 15 내지 약 35개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 8 내지 약 15개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 8개 내지 약 11개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 9개 또는 10개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 8개 내지 약 30개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 8 내지 약 25개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 15 내지 약 24개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 길이가 약 9 내지 약 15개의 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 또는 적어도 500개의 아미노산의 총 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 13, 최대 14, 최대 15, 최대 16, 최대 17, 최대 18, 최대 19, 최대 20, 최대 21, 최대 22, 최대 23, 최대 24, 최대 25, 최대 26, 최대 27, 최대 28, 최대 29, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 최대 60, 최대 70, 최대 80, 최대 90, 최대 100, 최대 150, 최대 200, 최대 250, 최대 300, 최대 350, 최대 400, 최대 450, 또는 최대 500개의 아미노산의 총 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 함유하는 펩티드는 적어도 제2 신생에피토프에 연결된 제1 신생에피토프 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 다음 중 하나 이상으로부터 검증된 에피토프를 함유한다: ABL1, AC011997, ACVR2A, AFP, AKT1, ALK, ALPPL2, ANAPC1, APC, ARID1A, AR, AR-v7, ASCL2, β2M, BRAF, BTK, C15ORF40, CDH1, CLDN6, CNOT1, CT45A5, CTAG1B, DCT, DKK4, EEF1B2, EEF1DP3, EGFR, EIF2B3, env, EPHB2, ERBB3, ESR1, ESRP1, FAM111B, FGFR3, FRG1B, GAGE1, GAGE10, GATA3, GBP3, HER2, IDH1, JAK1, KIT, KRAS, LMAN1, MABEB16, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA4, MAGEA8, MAGEB17, MAGEB4, MAGEC1, MEK, MLANA, MLL2, MMP13, MSH3, MSH6, MYC, NDUFC2, NRAS, PAGE2, PAGE5, PDGFRa, PIK3CA, PMEL, pol 단백질, POLE, PTEN, RAC1, RBM27, RNF43, RPL22, RUNX1, SEC31A, SEC63, SF3B1, SLC35F5, SLC45A2, SMAP1, SMAP1, SPOP, TFAM, TGFBR2, THAP5, TP53, TTK, TYR, UBR5, VHL, XPOT EEF1DP3:FRY 융합 폴리펩티드, EGFR:SEPT14 융합 폴리펩티드, EGFRVIII 결실 폴리펩티드, EML4:ALK 융합 폴리펩티드, NDRG1:ERG 융합 폴리펩티드, AC011997.1:LRRC69 융합 폴리펩티드, RUNX1(ex5)-RUNX1T1융합 폴리펩티드, TMPRSS2:ERG 융합 폴리펩티드, NAB:STAT6 융합 폴리펩티드, NDRG1:ERG 융합 폴리펩티드, PML:RARA 융합 폴리펩티드, PPP1R1B:STARD3 융합 폴리펩티드, MAD1L1:MAFK 융합 폴리펩티드, FGFR3:TAC 융합 폴리펩티드, FGFR3:TACC3 융합 폴리펩티드, BCR:ABL 융합 폴리펩티드, C11orf95:RELA 융합 폴리펩티드, CBFB:MYH11 융합 폴리펩티드, CBFB:MYH11 융합 폴리펩티드, CD74:ROS1 융합 폴리펩티드, CD74:ROS1 융합 폴리펩티드, ERVE-4: 프로테아제, ERVE-4: 역전사효소, ERVE-4: 역전사효소, ERVE-4: 공지되지 않은, ERVH-2 매트릭스 단백질, ERVH-2: gag, ERVH-2: 레트로바이러스 매트릭스, ERVH48-1: 코트 단백질, ERVH48-1: 신시틴, ERVI-1 외피 단백질, ERVK-5 gag, ERVK-5 env, ERVK-5 pol, EBV A73, EBV BALF3, EBV BALF4, EBV BALF5, EBV BARF0, EBV LF2, EBV RPMS1, HPV-16, HPV-16 E7, 및 HPV-16 E6. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 β2M, BTK, EGFR, GATA3, KRAS, MLL2, TMPRSS2:ERG 융합 폴리펩티드, 또는 TP53 또는 Myc에서 돌연변이 사례로 인한 돌연변이를 함유한다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 약 500 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 약 250 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 약 150 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 약 50 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 I 분자에 결합한다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 MHC 클래스 I 분자에 결합하고 클래스 I 에피토프를 함유하는 펩티드는 MHC 클래스 II 분자에 결합한다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 MHC 클래스 II 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 인간 백혈구 항원 (HLA) -A, -B, -C, -DP, -DQ, 또는 -DR에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 1000 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 II 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 500 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 II 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서 에피토프는 약 250 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 II 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 약 150 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 II 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 약 50 nM 이하의 결합 친화도로 MHC 클래스 II 분자에 결합한다.
일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 에피토프의 C-말단에 플랭킹하는 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 에피토프의 N-말단에 플랭킹하는 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 에피토프의 C-말단에 플랭킹하는 하나 이상의 아미노산 및 에피토프의 N-말단에 플랭킹하는 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 플랭킹하는 아미노산은 나이브 플랭킹하는 아미노산이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 제1 에피토프는 MHC 클래스 I 분자에 결합하고 제2 에피토프는 MHC 클래스 II 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 펩티드의 생체내 반감기를 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 펩티드에 의한 세포 표적화를 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 펩티드의 세포 흡수를 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 펩티드 처리를 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 에피토프의 MHC 친화도를 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 에피토프의 MHC 안정성을 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 MHC 클래스 I 분자, 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 의한 에피토프의 제시를 증가시키는 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 시퀀싱 방법이 면역원성 항원을 확인하는 데 사용된다. 임의의 적합한 시퀀싱 방법, 예를 들어, 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 3세대 시퀀싱 방법은 방법의 시퀀싱 단계의 속도를 높이기 위해 미래에 NGS 기술을 대체할 수 있다. 명확성 목적을 위해: 본 발명의 맥락에서 용어 "차세대 시퀀싱" 또는 "NGS"는 생거(Sanger) 화학으로 공지된 "종래의" 시퀀싱 방법과 달리. 전체 게놈을 작은 조각으로 분해하여 전체 게놈을 따라 핵산 템플릿을 무작위로 병렬로 읽는 모든 새로운 고처리량 시퀀싱 기술을 의미한다. 이러한 NGS 기술 (대규모 병렬 시퀀싱 기술로도 공지됨)은 매우 짧은 기간에, 예를 들어 1-2주 내에, 예를 들어, 1-7일 내에 또는 24시간 미만 내에, 전체 게놈, 엑솜, 전사체 (게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬(methylome) (게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 전달할 수 있고, 원칙적으로 단일 세포 시퀀싱 접근법을 허용할 수 있다. 상업적으로 이용가능하거나 문헌에 언급된 다수의 NGS 플랫폼, 예를 들어 WO 2012/159643에 상세히 기재된 것들이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 예컨대 폴리-글리신 또는 폴리-세린 링커에 의해 적어도 제2 펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 변형은 담체 단백질에 대한 접합, 리간드에 대한 접합, 항체에 대한 접합, PEG화, 폴리시알릴화 HES화(HESylation), 재조합 PEG 모방체, Fc 융합, 알부민 융합, 나노입자 부착, 나노입자 캡슐화, 콜레스테롤 융합, 철 융합, 아실화, 아미드화, 글리코실화, 측쇄 산화, 인산화, 비오틴화, 표면 활성 물질의 첨가, 아미노산 모방체의 첨가, 또는 비천연 아미노산의 첨가이다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에 대한 세포 표적화를 증가시키는 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검증된 에피토프를 함유하는 펩티드는 항원 제시 세포 표적화 모이어티 또는 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포는 DEC205, XCR1, CD197, CD80, CD86, CD123, CD209, CD273, CD283, CD289, CD184, CD85h, CD85j, CD85k, CD85d, CD85g, CD85a, CD141, CD11c, CD83, TSLP 수용체, Clec9a 또는 CD1a 마커를 사용하여 표적화된다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포는 CD141, DEC205, Clec9a, 또는 XCR1 마커를 사용하여 표적화된다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포는 자가 세포이다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포 중 하나 이상은 T 세포에 결합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 암 또는 종양의 치료를 위한 공유된 항원에 상응하는 HLA 매칭된 펩티드의 대규모 제조 및 저장을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 표 1 내지 표 8 및 표 11 내지 표 14 중 어느 하나에 제시된 HLA 매칭된 펩티드 레퍼토리로부터 선택된 검증된 에피토프에 특이적인 암 항원 특이적 T 세포를 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프 특이적 T 세포는 주입에 의해 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 직접 정맥내 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 동종이계 T 세포이다.
본 개시내용의 방법은 관련 기술분야에 공지된 임의의 유형의 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암, 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 중피종, 신장 세포 암종, 위암, 위의 암(gastric cancer), 난소암, NHL, 백혈병, 자궁암, 결장암, 방광암, 신장암 또는 자궁내막암을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병, 편평 세포 암, 폐암 (소 세포 폐암, 비소 세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평 암종 포함), 복막암, 간세포암, 위의 또는 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 흑색종, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 두경부암, 결장직장암, 직장암, 연조직 육종, 카포시 육종, B-세포 림프종 (저 등급/여포성 비호지킨 림프종 (NHL), 소림프구성 (SL) NHL, 중간 등급/여포성 NHL, 중간 등급 확산성 NHL, 고 등급 면역모세포성 NHL, 고 등급 림프모세포성 NHL, 고 등급 작은 비절단된 세포 NHL, 거대 질환(bulky disease) NHL, 맨틀 세포 림프종, AIDS 관련 림프종, 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 골수종, 모양 세포 백혈병, 만성 골수모세포 백혈병, 및 이식후 림프구증식성 장애 (PTLD), 모반증과 연관된 비정상적인 혈관 증식, 부종, 메이그 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암의 비제한적 예는 흑색종 (예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 신장암 (예를 들어, 투명 세포 암종(clear cell carcinoma)), 전립선암 (예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 췌장 선암종, 유방암, 결장암, 폐암 (예를 들어, 비소 세포 폐암), 식도암, 두경부의 편평 세포 암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 교모세포종, 신경교종, 백혈병, 림프종, 및 다른 신생물 악성종양을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 암종, 편평 암종, 선암종, 육종, 자궁내막암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 나팔관암, 원발성 복막암, 결장암, 결장직장암, 항문생식기 부위의 편평 세포 암종, 흑색종, 신장 세포 암종, 폐암, 비소 세포 폐암, 폐의 편평 세포 암종, 위암, 방광암, 담낭암, 간암, 갑상선암, 후두암, 타액선암, 식도암, 두경부암, 교모세포종, 신경교종, 두경부의 편평 세포 암종, 전립선암, 췌장암, 중피종, 육종, 혈액암, 백혈병, 림프종, 신경종, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암은, 예를 들어, 암종, 편평 암종 (예를 들어, 자궁경관, 눈꺼풀, 결막(tunica conjunctiva), 질, 폐, 구강, 피부, 방광, 혀, 후두, 및 식도), 및 선암종 (예를 들어, 전립선, 소장, 자궁내막, 자궁경관, 대장, 폐, 췌장, 식도, 직장, 자궁, 위, 유선, 및 난소)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암은 육종 (예를 들어, 근육성 육종), 백혈증, 신경종, 흑색종, 및 림프종을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 삼중 음성 유방암 (TNBC)이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 결장직장암이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약학 조성물로 치료될 환자 또는 환자의 집단은 고형 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 흑색종, 신장 세포 암종, 폐암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 담낭암, 후두암, 간암, 갑상선암, 위암, 타액선암, 전립선암, 췌장암, 또는 메르켈 세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약학 조성물로 치료될 환자 또는 환자의 집단은 혈액암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 혈액암, 예컨대 확산성 거대 B 세포 림프종 ("DLBCL"), 호지킨 림프종 ("HL"), 비호지킨 림프종 ("NHL"), 여포성 림프종 ("FL"), 급성 골수성 백혈병 ("AML"), 또는 다발성 골수종 ("MM")을 갖는다. 일부 실시양태에서, 치료될 환자 또는 환자의 집단은 난소암, 폐암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 갖는다.
본원에 제공된 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식 (자가, 동계, 동종이계 또는 비관련)과 같은 종래의 치료 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 요법을 포함하는 조성물 이외에 적어도 하나 이상의 면역요법제가 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 화학요법제는 상이한 부류의 화학요법제에 속할 수 있다. 본원에 제공된 치료 또는 사용 방법의 실시에서, 치료 유효량의 약학 조성물이 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 치료 유효량은 질환의 중증도, 대상체의 연령 및 상대적인 건강, 사용된 화합물의 효능, 및 다른 인자에 따라 광범위하게 달라질 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 방법은 T 세포 이식 전에 1회 이상의 백혈구성분채집술을 포함한다. 백혈구성분채집술은 말초 혈액 단핵구 (PBMC)의 수집을 포함할 수 있다. 백혈구성분채집술은 수집 전에 PBMC를 동원하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 고정되지 않은 PBMC를 수집할 수 있다. 많은 양의 PBMC를 1회에서 대상체로부터 수집할 수 있다. 대안적으로, 대상체는 2회 이상의 백혈구성분채집술을 겪을 수 있다. 성분채집량은 이식에 필요한 세포 수에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 12-15리터의 고정되지 않은 PBMC가 1회에서 대상체로부터 수집될 수 있다. 대상체로부터 수집될 PBMC의 수는 1x108 내지 5x1010개의 세포일 수 있다. 대상체로부터 수집될 PBMC의 수는 1x108 , 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010 또는 5x1010개의 세포일 수 있다. 대상체로부터 수집될 PBMC의 최소 수는 1x106개/kg의 대상체의 체중일 수 있다. 대상체로부터 수집될 PBMC의 최소 수는 1x106/kg, 5x106/kg, 1x107/kg, 5x107/kg, 1x108/kg, 5x108개/대상체의 체중 kg일 수 있다.
단일 주입은 대상체의 체표면 제곱미터당 1x106개 세포 (세포/m2) 내지 5x109개 세포/m2의 용량을 포함할 수 있다. 단일 주입은 약 2.5x106 내지 약 5x109개 세포/m2를 포함할 수 있다. 단일 주입은 적어도 약 2.5x106개 세포/m2를 포함할 수 있다. 단일 주입은 최대 5x109개 세포/m2를 포함할 수 있다. 단일 주입은 1x106 내지 2.5x106, 1x106 내지 5x106, 1x106 내지 7.5x106, 1x106 내지 1x107, 1x106 내지 5x107, 1x106 내지 7.5x107, 1x106 내지 1x108, 1x106 내지 2.5x108, 1x106 내지 5x108, 1x106 내지 1x109, 1x106 내지 5x109, 2.5x106 내지 5x106, 2.5x106 내지 7.5x106, 2.5x106 내지 1x107, 2.5x106 내지 5x107, 2.5x106 내지 7.5x107, 2.5x106 내지 1x108, 2.5x106 내지 2.5x108, 2.5x106 내지 5x108, 2.5x106 내지 1x109, 2.5x106 내지 5x109, 5x106 내지 7.5x106, 5x106 내지 1x107, 5x106 내지 5x107, 5x106 내지 7.5x107, 5x106 내지 1x108, 5x106 내지 2.5x108, 5x106 내지 5x108, 5x106 내지 1x109, 5x106 내지 5x109, 7.5x106 내지 1x107, 7.5x106 내지 5x107, 7.5x106 내지 7.5x107, 7.5x106 내지 1x108, 7.5x106 내지 2.5x108, 7.5x106 내지 5x108, 7.5x106 내지 1x109, 7.5x106 내지 5x109, 1x107 내지 5x107, 1x107 내지 7.5x107, 1x107 내지 1x108, 1x107 내지 2.5x108, 1x107 내지 5x108, 1x107 내지 1x109, 1x107 내지 5x109, 5x107 내지 7.5x107, 5x107 내지 1x108, 5x107 내지 2.5x108, 5x107 내지 5x108, 5x107 내지 1x109, 5x107 내지 5x109, 7.5x107 내지 1x108, 7.5x107 내지 2.5x108, 7.5x107 내지 5x108, 7.5x107 내지 1x109, 7.5x107 내지 5x109, 1x108 내지 2.5x108, 1x108 내지 5x108, 1x108 내지 1x109, 1x108 내지 5x109, 2.5x108 내지 5x108, 2.5x108 내지 1x109, 2.5x108 내지 5x109, 5x108 내지 1x109, 5x108 내지 5x109, 또는 1x109 내지 5x109개 세포/m2를 포함할 수 있다. 단일 주입은 1x106개 세포/m2, 2.5x106개 세포/m2, 5x106개 세포/m2, 7.5x106개 세포/m2, 1x107개 세포/m2, 5x107개 세포/m2, 7.5x107개 세포/m2, 1x108개 세포/m2, 2.5x108개 세포/m2, 5x108개 세포/m2, 1x109개 세포/m2, 또는 5x109개 세포/m2를 포함할 수 있다.
방법은 고용량의 골수제거제를 사용하는 림프구고갈 화학요법을 포함한 대상체에게 화학요법을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 사전컨디셔닝제(preconditioning agent), 예컨대 림프구고갈제, 예컨대 시클로포스파미드, 플루다라빈, 또는 그의 조합을, 제1 또는 후속 용량 전에 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 대상체는 제1 또는 후속 용량에 대해, 적어도 2일 전, 예를 들어 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 전에 사전컨디셔닝제를 투여받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 제1 또는 후속 용량에 대해, 10일 이하 전에, 예컨대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2일 이하 전에 사전컨디셔닝제를 투여받는다.
일부 실시양태에서, 림프구고갈제가 시클로포스파미드를 포함하는 경우, 대상체는 대상체의 체표면 제곱미터당 0.3 그램 (g/m2) 내지 5 g/m2의 시클로포스파미드를 투여받는다. 일부 경우에, 대상체에게 투여되는 시클로포스파미드의 양은 약 적어도 0.3 g/m2이다. 일부 경우에, 대상체에게 투여되는 시클로포스파미드의 양은 약 최대 5 g/m2이다. 일부 경우에, 대상체에게 투여되는 시클로포스파미드의 양은 약 0.3 g/m2 내지 0.4 g/m2, 0.3 g/m2 내지 0.5 g/m2, 0.3 g/m2 내지 0.6 g/m2, 0.3 g/m2 내지 0.7 g/m2, 0.3 g/m2 내지 0.8 g/m2, 0.3 g/m2 내지 0.9 g/m2, 0.3 g/m2 내지 1 g/m2, 0.3 g/m2 내지 2 g/m2, 0.3 g/m2 내지 3 g/m2, 0.3 g/m2 내지 4 g/m2, 0.3 g/m2 내지 5 g/m2, 0.4 g/m2 내지 0.5 g/m2, 0.4 g/m2 내지 0.6 g/m2, 0.4 g/m2 내지 0.7 g/m2, 0.4 g/m2 내지 0.8 g/m2, 0.4 g/m2 내지 0.9 g/m2, 0.4 g/m2 내지 1 g/m2, 0.4 g/m2 내지 2 g/m2, 0.4 g/m2 내지 3 g/m2, 0.4 g/m2 내지 4 g/m2, 0.4 g/m2 내지 5 g/m2, 0.5 g/m2 내지 0.6 g/m2, 0.5 g/m2 내지 0.7 g/m2, 0.5 g/m2 내지 0.8 g/m2, 0.5 g/m2 내지 0.9 g/m2, 0.5 g/m2 내지 1 g/m2, 0.5 g/m2 내지 2 g/m2, 0.5 g/m2 내지 3 g/m2, 0.5 g/m2 내지 4 g/m2, 0.5 g/m2 내지 5 g/m2, 0.6 g/m2 내지 0.7 g/m2, 0.6 g/m2 내지 0.8 g/m2, 0.6 g/m2 내지 0.9 g/m2, 0.6 g/m2 내지 1 g/m2, 0.6 g/m2 내지 2 g/m2, 0.6 g/m2 내지 3 g/m2, 0.6 g/m2 내지 4 g/m2, 0.6 g/m2 내지 5 g/m2, 0.7 g/m2 내지 0.8 g/m2, 0.7 g/m2 내지 0.9 g/m2, 0.7 g/m2 내지 1 g/m2, 0.7 g/m2 내지 2 g/m2, 0.7 g/m2 내지 3 g/m2, 0.7 g/m2 내지 4 g/m2, 0.7 g/m2 내지 5 g/m2, 0.8 g/m2 내지 0.9 g/m2, 0.8 g/m2 내지 1 g/m2, 0.8 g/m2 내지 2 g/m2, 0.8 g/m2 내지 3 g/m2, 0.8 g/m2 내지 4 g/m2, 0.8 g/m2 내지 5 g/m2, 0.9 g/m2 내지 1 g/m2, 0.9 g/m2 내지 2 g/m2, 0.9 g/m2 내지 3 g/m2, 0.9 g/m2 내지 4 g/m2, 0.9 g/m2 내지 5 g/m2, 1 g/m2 내지 2 g/m2, 1 g/m2 내지 3 g/m2, 1 g/m2 내지 4 g/m2, 1 g/m2 내지 5 g/m2, 2 g/m2 내지 3 g/m2, 2 g/m2 내지 4 g/m2, 2 g/m2 내지 5 g/m2, 3 g/m2 내지 4 g/m2, 3 g/m2 내지 5 g/m2, 또는 4 g/m2 내지 5 g/m2이다. 일부 경우에, 대상체에게 투여되는 시클로포스파미드의 양은 약 0.3 g/m2, 0.4 g/m2, 0.5 g/m2, 0.6 g/m2, 0.7 g/m2, 0.8 g/m2, 0.9 g/m2, 1 g/m2, 2 g/m2, 3 g/m2, 4 g/m2, 또는 5 g/m2이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 약 20 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 사이, 예컨대 약 40 mg/kg 내지 80 mg/kg 또는 그 사이의 용량으로 시클로포스파미드로 사전 컨디셔닝된다. 일부 측면에서, 대상체는 약 60 mg/kg의 시클로포스파미드로 사전 컨디셔닝된다.
일부 실시양태에서, 림프구고갈제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체는 대상체의 체표면 제곱미터당 약 1 밀리그램 (g/m2) 내지 100 mg/m2 또는 그 사이의 용량의 플루다라빈을 투여받는다. 일부 경우에, 대상체에게 투여되는 플루다라빈의 양은 약 적어도 1 mg/m2이다. 일부 경우에, 대상체에게 투여되는 플루다라빈의 양은 약 최대 100 mg/m2이다. 일부 경우에, 대상체에게 투여되는 플루다라빈의 양은 약 1 mg/m2 내지 5 mg/m2, 1 mg/m2 내지 10 mg/m2, 1 mg/m2 내지 15 mg/m2, 1 mg/m2 내지 20 mg/m2, 1 mg/m2 내지 30 mg/m2, 1 mg/m2 내지 40 mg/m2, 1 mg/m2 내지 50 mg/m2, 1 mg/m2 내지 70 mg/m2, 1 mg/m2 내지 90 mg/m2, 1 mg/m2 내지 100 mg/m2, 5 mg/m2 내지 10 mg/m2, 5 mg/m2 내지 15 mg/m2, 5 mg/m2 내지 20 mg/m2, 5 mg/m2 내지 30 mg/m2, 5 mg/m2 내지 40 mg/m2, 5 mg/m2 내지 50 mg/m2, 5 mg/m2 내지 70 mg/m2, 5 mg/m2 내지 90 mg/m2, 5 mg/m2 내지 100 mg/m2, 10 mg/m2 내지 15 mg/m2, 10 mg/m2 내지 20 mg/m2, 10 mg/m2 내지 30 mg/m2, 10 mg/m2 내지 40 mg/m2, 10 mg/m2 내지 50 mg/m2, 10 mg/m2 내지 70 mg/m2, 10 mg/m2 내지 90 mg/m2, 10 mg/m2 내지 100 mg/m2, 15 mg/m2 내지 20 mg/m2, 15 mg/m2 내지 30 mg/m2, 15 mg/m2 내지 40 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 15 mg/m2 내지 70 mg/m2, 15 mg/m2 내지 90 mg/m2, 15 mg/m2 내지 100 mg/m2, 20 mg/m2 내지 30 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 20 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 70 mg/m2, 20 mg/m2 내지 90 mg/m2, 20 mg/m2 내지 100 mg/m2, 30 mg/m2 내지 40 mg/m2, 30 mg/m2 내지 50 mg/m2, 30 mg/m2 내지 70 mg/m2, 30 mg/m2 내지 90 mg/m2, 30 mg/m2 내지 100 mg/m2, 40 mg/m2 내지 50 mg/m2, 40 mg/m2 내지 70 mg/m2, 40 mg/m2 내지 90 mg/m2, 40 mg/m2 내지 100 mg/m2, 50 mg/m2 내지 70 mg/m2, 50 mg/m2 내지 90 mg/m2, 50 mg/m2 내지 100 mg/m2, 70 mg/m2 내지 90 mg/m2, 70 mg/m2 내지 100 mg/m2, 또는 90 mg/m2 내지 100 mg/m2이다. 일부 경우에, 대상체에게 투여되는 플루다라빈의 양은 약 1 mg/m2, 5 mg/m2, 10 mg/m2, 15 mg/m2, 20 mg/m2, 30 mg/m2, 40 mg/m2, 50 mg/m2, 70 mg/m2, 90 mg/m2, 또는 100 mg/m2이다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3일마다 제공되는 바와 같이 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 작용제, 예를 들어 플루다라빈은 약 1 내지 5회 또는 그 사이, 예컨대 약 3 내지 5회 또는 그 사이에 투여된다. 일부 실시양태에서, 이러한 복수의 용량은 1일 1 내지 5회 또는 3 내지 5회와 같이 동일한 날에 투여된다.
일부 실시양태에서, 림프구고갈제는 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 조합과 같이, 작용제의 조합을 포함한다. 따라서, 작용제의 조합은 상기 기재된 것들과 같은 임의의 용량 또는 투여 일정으로 시클로포스파미드, 및 상기 기재된 것들과 같은 임의의 용량 또는 투여 일정으로 플루다라빈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체는 T 세포의 제1 또는 후속 용량 전에 400 mg/m2의 시클로포스파미드 및 1회 이상의 용량의 20 mg/m2의 플루다라빈을 투여받는다. 일부 예에서. 대상체는 T 세포의 제1 또는 후속 용량 전에 500 mg/m2의 시클로포스파미드 및 1회 이상의 용량의 25 mg/m2의 플루다라빈을 투여받는다. 일부 예에서. 대상체는 T 세포의 제1 또는 후속 용량 전에 600 mg/m2의 시클로포스파미드 및 1회 이상의 용량의 30 mg/m2의 플루다라빈을 투여받는다. 일부 예에서. 대상체는 T 세포의 제1 또는 후속 용량 전에 700 mg/m2의 시클로포스파미드 및 1회 이상의 용량의 35 mg/m2의 플루다라빈을 투여받는다. 일부 예에서. 대상체는 T 세포의 제1 또는 후속 용량 전에 700 mg/m2의 시클로포스파미드 및 1회 이상의 용량의 40 mg/m2 플루다라빈을 투여받는다. 일부 예에서. 대상체는 T 세포의 제1 또는 후속 용량 전에 800 mg/m2의 시클로포스파미드 및 1회 이상의 용량의 45 mg/m2 플루다라빈을 투여받는다.
플루다라빈 및 시클로포스파미드는 다른 날에 투여될 수 있다. 일부 경우에, 플루다라빈 및 시클로포스파미드를 공동으로 투여할 수 있다. 일부 경우에, 플루다라빈의 초기 용량에 이어서 시클로포스파미드의 용량이 뒤따른다. 일부 경우에, 시클로포스파미드의 초기 용량에 이어서 플루다라빈의 초기 용량이 뒤따를 수 있다. 일부 예에서, 치료 요법은 이식 10일 전에 초기 용량의 플루다라빈으로 대상체를 치료한 후, 제2 용량의 플루다라빈과 공동으로, 세포 이식 9일 전에 투여된 초기 용량의 시클로포스파미드로 치료하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 치료 요법은 이식 8일 전에 초기 용량의 플루다라빈으로 대상체를 치료한 후, 제2 용량의 플루다라빈과 공동으로, 세포 이식 7일 전에 투여된 초기 용량의 시클로포스파미드로 치료하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 표 1 내지 표 8 및 표 11 내지 표 14 중 어느 하나에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 1에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 2에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 3에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4A에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4B에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4C에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4D에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4E에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4F에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4G에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4H에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4I에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4J에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4K에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4L에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 4M에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 5에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 6에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 7에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 8에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 11에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 12에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 13에 따른 에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 표 14에 따른 에피토프 서열을 포함한다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
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[표 2]
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표 1 (n=562)로부터 펩티드의 서브세트를 합성하고 그의 주어진 HLA 클래스 I 분자에 대한 그의 친화도를 기재된 바와 같이 측정하였다. 값은 표 3에 나타냈다. 이들 데이터는 예측과 측정 사이의 강한 상관관계를 나타내며 (점선은 가장 적합함을 나타냄, R2 = 0.45), 이는 예측 값을 입증한다. 그러나, 이상치는 이들 측정의 중요성을 입증한다. 두꺼운 수직선과 수평선은 각각 예측된 친화도 및 관찰된 친화도에 대해 500 nM에서 나타내진다. 500 nM은 HLA 클래스 I에 대한 "약한 결합제"인 에피토프에 대한 최대 친화도로 관련 분야에서 통상적으로 허용된다. 따라서, 우측 하단 사분면 (500 nM 초과 예측, 500 nM 미만 측정)의 지점이 에피토프이며 이는 매우 약한 결합제로 간주되었으나 허용되는 범위 내에서 결합하는 것으로 관찰되었다. 이 사분면 (n=75)의 에피토프는 예측에 의해 결합제로 간주되지 않는 에피토프의 30.5%를 나타낸다 (우측 하단 및 우측 상단 사분면의 조합, n=246).
[표 3]
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[표 4A]
Figure pct00054
표 4B 내지 표 4M은 RAS 돌연변이를 포함하는 펩티드 서열, 이것이 결합하는 상응하는 HLA 대립유전자, 및 가장 높은 친화도를 갖는 가장 낮은 수 (예를 들어, 1)를 가진 상응하는 예측된 결합 친화도 점수를 나타내며, 그 반대도 마찬가지이다.
[표 4B]
RAS Q61H 돌연변이
Figure pct00055
Figure pct00056
[표 4C]
RAS Q61R 돌연변이
Figure pct00057
Figure pct00058
[표 4D]
RAS Q61K 돌연변이
Figure pct00059
Figure pct00060
[표 4E]
RAS Q61L 돌연변이
Figure pct00061
Figure pct00062
[표 4F]
RAS G12A 돌연변이
Figure pct00063
Figure pct00064
[표 4G]
RAS G12C 돌연변이
Figure pct00065
[표 4H]
RAS G12D 돌연변이
Figure pct00066
[표 4I]
RAS G12R 돌연변이
Figure pct00067
[표 4J]
RAS G12S 돌연변이
Figure pct00068
Figure pct00069
[표 4K]
RAS G12V 돌연변이
Figure pct00070
Figure pct00071
[표 4L]
RAS G13C 돌연변이
Figure pct00072
[표 4M]
RAS G13D 돌연변이
Figure pct00073
또한, 본원에는 대상체에게 (i) G12R RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드, 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서: (a) G12R RAS 에피토프는 vvgaRgvgk이고 대상체는 HLA-A03:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하거나; (b) G12R RAS 에피토프는 eyklvvvgaR이고 대상체는 HLA- A33:03 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하거나; (c) G12R RAS 에피토프는 vvvgaRgvgk이고 대상체는 HLA-A11:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하거나; (d) G12R RAS 에피토프는 aRgvgksal이고 대상체는 HLA- C07:02, HLA- B39:01 및 HLA- C07:01로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 것인, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
표 5는 GATA 펩티드 및 그의 HLA 결합 파트너를 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00074
표 6은 선택된 BTK 펩티드의 HLA 친화도 및 안정성을 나타낸다:
[표 6]
Figure pct00075
표 7은 선택된 EGFR 펩티드의 HLA 친화도 및 안정성을 나타낸다:
[표 7]
Figure pct00076
종양 미세환경과 연관된 종양 항원
많은 경우에, 우세한 항원은 질환에 대한 우수한 바이오마커로서 작용할 뿐만 아니라, 면역요법을 위한 중요한 백신 후보도 될 수 있는 종양 미세환경의 세포에 의해 발현된다. 이러한 종양 연관 항원 (TAA)은 반드시 종양 세포의 표면에 제시되는 것이 아니라 기질 세포, 결합 조직 세포, 섬유모세포 등이 될 수 있는, 종양에 병치된 세포에 제시된다. 이들은 종종 종양의 구조적 무결성에 기여하며, 종양에 영양을 공급하고 종양의 성장을 지원하는 세포이다. 대부분의 경우에 TAA는 종양 미세환경에서 과발현된 항원이나, 종양 미세환경에서의 일부 항원은 종양 연관 세포에서 또한 특유할 수 있다. 예를 들어, 텔로머라제 역전사효소 (TERT)는 대부분의 정상 조직에는 존재하지 않으나 대부분의 인간 종양에서 활성화되는 TAA이다. 다른 한편으로, 조직 칼리크레인 관련 펩티다제, 또는 칼리크레인 (KLK)은 다양한 암에서 과발현되며 분비된 트립신 또는 키모트립신 유사 세린 프로테아제의 ㄱ광범위한 패밀리를 포함한다. 칼리크레인은 전립선암 난소암 및 유방암에서 상향조절된다. 일부 TAA는 특정 암에 특이적이며, 일부는 광범위한 다양한 암에서 발현된다. 암배아항원 (CEA)은 유방 암종, 결장 암종, 폐 암종 및 췌장 암종에서 과발현되며, 한편 MUC-1은 유방암, 폐암, 전립선암, 결장암이다. 일부 TAA는 분화 또는 조직 특이적이며, 예를 들어 MART-1 / 멜란-A 및 gp100은 정상 멜라닌세포 및 흑색종에서 발현되고, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 및 전립선 특이적 항원 (PSA)은 전립선 상피 세포뿐만 아니라 전립선 암종에 의해서도 발현된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 과발현된 조직 특이적 또는 종양 연관 항원, 예컨대 전립선 암 요법의 경우에 전립선 특이적 칼리크레인 단백질 KLK2, KLK3, KLK4, 또는 선암종의 경우 트랜스글루타마제 단백질 4, TGM4에 대한 입양 요법을 위해 개발된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 입양 요법을 위해 표적화되는 항원성 펩티드는 종양 미세환경을 조정하는 데 효과적이다. T 세포는 TME에서 세포에 의해 발현되는 항원으로 프라이밍되므로, 요법은 T 세포 매개 용해를 위해 종양 세포를 직접 표적화하는 것 외에도, 종종 TME를 촉진하는 종양의 약화 및/또는 분해를 지향한다.
종양 미세환경은 종양 성장을 유도하거나 영향을 미치는 세포의 많은 부분을 구성하는 섬유모세포, 기질 세포, 내피 세포 및 결합 조직 세포를 포함한다. T 세포가 면역억제성 종양 환경에서 종양 세포를 자극하고 공격할 수 있는 것과 같이, 특정 펩티드와 항원을 활용하여 T 세포를 종양 전파를 돕는 종양 주변의 세포에 대항하게 할 수 있으며 CD8+ 및 CD4+ T 세포는 생체외에서 생성되어 종양 유지 및 전파를 촉진하는 종양 미세환경의 비종양 세포 표면의 항원에 대항할 수 있다. 암/종양 연관 섬유모세포 (CAF)는 췌장 선암종 (PDAC)과 같은 췌장암의 특징이 되는 특색이다. CAF는 Col10a1 항원을 발현한다. CAF는 종양을 영속화하는 데 도움이 될 수 있는 세포이다. Col10A1은 종종 종양에 부정적인 예후를 부여한다. 일부 실시양태에서 Col10A1은 종양 지속 및 진행에 대한 바이오마커로 간주될 수 있다. 이는 유방암 및 결장직장암에서 불량한 예후와 연관된 680개 아미노산 길이의 이종이량체 단백질이다.
Col10a1 특이적 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 활성화는 Col10A1 특이적 섬유모세포의 공격 및 파괴를 돕고 고형 종양의 조직 매트릭스를 분해하는 것을 도울 수 있다.
T 세포는 본원에 기재된 방법을 사용하여 생체외에서 생성되어, T 세포가 암 연관 섬유모세포 (CAF)에 대해 활성화될 수 있다. 이를 위해, T 세포를 특이적으로 활성화할 수 있는 에피토프를 포함하는 Col10a1 펩티드가 생성되었으며, 표 8에 기재된 바와 같이 이전에 기재된 사내 생성된 기계 학습 에피토프 제시 소프트웨어로부터 생성된 고도로 신뢰할 수 있는 데이터를 사용하여 HLA 결합 파트너를 결정하였다.
[표 8]
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Figure pct00079
본원에 제공된 신생항원성 펩티드는 HLA 결합 면역원성에 대해 사전 검증되었다 (표 1 내지 표 8 및 표 11 내지 표 14). 일부 실시양태에서, 이전에 제조 및 저장된 신생항원성 펩티드를 사용하여 항원 제시 세포 (APC)를 접촉시킨 다음에 신생항원 특이적 활성화된 T 세포의 제조를 위해 시험관내에서 T 세포에 제시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2-80개 이상의 신생항원성 펩티드를 사용하여 한 번에 환자로부터 T 세포를 자극한다.
일부 실시양태에서 APC는 자가 APC이다. 일부 실시양태에서 APC는 비자가 APC이다. 일부 실시양태에서 APC는 APC로서 기능하도록 설계된 합성 세포이다. 일부 실시양태에서 T 세포는 자가 세포이다. 일부 실시양태에서, 항원 제시 세포는 항원을 발현하는 세포이다. 예를 들어, 항원 제시 세포는 세포 흡수 후 항원을 처리하고 T 세포 활성화를 위해 MHC와 회합하여 항원을 제시하는, 수지상 세포 또는 골수 세포와 같은 포식세포일 수 있다. 특정 목적을 위해, 본원에 사용된 바와 같은 APC는 정상적으로 그의 표면에 항원을 제시하는 세포이다. 본원에 기재된 바와 같은 특정 세포독성 검정과 관련된 비결합 또는 비제한적 예에서, 종양 세포는 T 세포가 항원 제시 세포 (종양 세포)를 인식할 수 있는, 항원 제시 세포이다. 유사하게, 항원을 발현하는 세포 또는 세포주는 본원에 사용된 바와 같은 특정 목적을 위해, 항원 제시 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 신생항원성 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 시험관내 활성화를 위해 T 세포에 제시하기 위해 세포에서 발현시킬 수 있다. 신생항원성 펩티드 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 벡터에 코딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 2 내지 약 80개의 신생항원성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 실시양태에서, 추가의 신생항원성 펩티드 중 적어도 하나는 개별 대상체의 종양에 특이적이다. 실시양태에서, 대상체 특이적 신생항원성 펩티드는 대상체의 종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 전사체와 비종양 샘플의 게놈, 엑솜, 및/또는 전사체 사이의 서열 차이를 확인함으로써 선택된다. 실시양태에서, 샘플은 새로운 또는 포르말린 고정된 파라핀 포매된 종양 조직, 새로 단리된 세포, 또는 순환하는 종양 세포이다. 실시양태에서, 서열 차이는 차세대 시퀀싱에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서 본원에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여 본원에 기재된 하나 이상의 신생항원성 펩티드 또는 본원에 기재된 하나 이상의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T 세포 수용체 (TCR)를 확인하거나 단리할 수 있다. 실시양태에서, MHC-펩티드의 MHC는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II이다. 실시양태에서, TCR은 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 도메인을 추가로 포함하는 이중특이적 TCR이다. 실시양태에서, 항원은 T 세포 특이적 항원이다. 실시양태에서, 항원은 CD3이다. 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 항-CD3 scFv이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 (i) T 세포 활성화 분자; (ii) 막횡단 영역; 및 (iii) 본원에 기재된 하나 이상의 신생항원성 펩티드 또는 본원에 기재된 하나 이상의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 항원 인식 모이어티를 포함하는 키메라 항원 수용체를 제조하는데사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD3-제타는 T 세포 활성화 분자이다. 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 적어도 하나의 공동자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, ITAM, 또는 Fc 입실론 RI-감마이다. 실시양태에서, 항원 인식 모이어티는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II의 맥락에서 단리된 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다. 실시양태에서, CD3-제타, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR, 또는 PD-1 막횡단 영역. 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 종양 연관 폴리펩티드의 세포외 도메인에 위치한다. 실시양태에서, MHC-펩티드의 MHC는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II이다.
본원에는 본원에 기재된 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포가 제공되며, 임의로 여기서 T 세포는 헬퍼 또는 세포독성 T 세포이다. 실시양태에서, T 세포는 대상체의 T 세포이다.
본원에는 본원에 기재된 하나 이상의 신생항원성 펩티드 또는 본원에 기재된 하나 이상의 신생항원성 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하는 T 세포가 제공되며, 여기서 T 세포는 T 세포를 활성화시키기에 충분한 시간 동안 본원에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 중 하나 이상 및 항원 제시 세포와 함께 인큐베이션된 대상체로부터의 T 세포 집단으로부터 단리된 T 세포이다. 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포, 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포이다. 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포의 집단은 대상체로부터의 CD8+ T 세포의 집단이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 중 하나 이상은 대상체 특이적 신생항원성 펩티드이다. 실시양태에서, 대상체 특이적 신생항원성 펩티드는 대상체의 종양에 특이적인 에피토프인 상이한 종양 신생에피토프를 갖는다. 실시양태에서, 대상체 특이적 신생항원성 펩티드는 대상체의 비종양 샘플에 존재하지 않는 종양 특이적 비침묵 돌연변이의 발현 생성물이다. 실시양태에서, 대상체 특이적 신생항원성 펩티드는 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 대상체 특이적 신생항원성 펩티드는 500 nM 미만의 IC50으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 활성화된 CD8+ T 세포는 항원 제시 세포로부터 분리된다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포 또는 CD40 확장된 B 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 형질전환되지 않은 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 감염되지 않은 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 자가이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 그의 표면에서 내인성 MHC 연관 펩티드를 스트립핑하도록 처리되었다. 실시양태에서, 내인성 MHC 연관 펩티드를 스트립핑하기 위한 처리는 약 26℃에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 내인성 MHC 연관 펩티드를 스트립핑하기 위한 처리는 세포를 약산성 용액으로 처리하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 본원에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드로 펄스화되었다. 실시양태에서, 펄스화하는 단계는 본원에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 각각의 적어도 약 2 μg/mL의 존재 하에 항원 제시 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 항원 제시 세포에 대한 단리된 T 세포의 비는 약 30:1 내지 300:1이다. 실시양태에서, T 세포의 단리된 집단을 인큐베이션하는 단계는 IL-2 및 IL-7의 존재 하에서이다. 실시양태에서, MHC-펩티드의 MHC는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II이다.
본원에는 대상체로부터 T 세포 집단을 단리하는 단계; 및 T 세포를 활성화시키기에 충분한 시간 동안 T 세포의 단리된 집단을 항원 제시 세포 및 본원에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 종양 특이적 T 세포를 활성화하는 방법이 제공된다. 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포, 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포이다. 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포의 집단은 대상체로부터의 CD8+ T 세포의 집단이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 중 하나 이상은 대상체 특이적 신생항원성 펩티드이다. 실시양태에서, 대상체 특이적 신생항원성 펩티드는 대상체의 종양에 특이적인 에피토프인 상이한 종양 신생에피토프를 갖는다. 실시양태에서, 대상체 특이적 신생항원성 펩티드는 대상체의 비종양 샘플에 존재하지 않는 종양 특이적 비침묵 돌연변이의 발현 생성물이다. 실시양태에서, 대상체 특이적 신생항원성 펩티드는 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 대상체 특이적 신생항원성 펩티드는 500 nM 미만의 IC50으로 대상체의 HLA 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 방법은 항원 제시 세포로부터 활성화된 T 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 신생항원성 펩티드 중 적어도 하나에 대한 반응성의 증거에 대해 활성화된 T 세포를 시험하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포 또는 CD40 확장된 B 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 형질전환되지 않은 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 감염되지 않은 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 자가이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 그의 표면에서 내인성 MHC 연관 펩티드를 스트립핑하도록 처리되었다. 실시양태에서, 내인성 MHC 연관 펩티드를 스트립핑하기 위한 처리는 약 26℃에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 내인성 MHC 연관 펩티드를 스트립핑하기 위한 처리는 세포를 약산성 용액으로 처리하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 본원에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드로 펄스화되었다. 실시양태에서, 펄스화하는 단계는 본원에 기재된 적어도 하나의 신생항원성 펩티드 각각의 적어도 약 2 μg/mL의 존재 하에 항원 제시 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 항원 제시 세포에 대한 단리된 T 세포의 비는 약 30:1 내지 300:1이다. 실시양태에서, T 세포의 단리된 집단을 인큐베이션하는 단계는 IL-2 및 IL-7의 존재 하에서이다. 실시양태에서, MHC-펩티드의 MHC는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II이다.
본원에는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 활성화된 종양 특이적 T 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
본원에는 본원에 기재된, 또는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 활성화된 종양 특이적 T 세포의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 실시양태에서, 투여하는 단계는 활성화된 종양 특이적 T 세포의 약 10^6 내지 10^12, 약 10^8 내지 10^11, 또는 약 10^9 내지 10^10을 투여하는 단계를 포함한다.
본원에는 본원에 기재된 T 세포 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산이 제공된다. 실시양태에서, TCR은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 또는 클래스 II의 맥락에서 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다.
본원에는 본원에 기재된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산이 제공된다. 실시양태에서, 항원 인식 모이어티는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 또는 클래스 II의 맥락에서 적어도 하나의 신생항원성 펩티드에 결합할 수 있다. 실시양태에서, 신생항원성 펩티드는 종양 연관 폴리펩티드의 세포외 도메인에 위치한다. 실시양태에서, 핵산은 CD3-제타, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR, 또는 PD-1 막횡단 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 환자의 말초 혈액으로부터의 자가 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 구성한다. 일부 실시양태에서, 환자의 말초 혈액으로부터의 자가 면역 세포는 성분채집술 절차를 통해 수집된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 1회 초과의 성분채집술 절차, 또는 1회 초과의 말초 혈액 채취로부터 수집된다.
일부 실시양태에서, CD25+ 세포 및 CD14+ 세포 둘 다는 펩티드의 첨가 전에 고갈된다. 일부 실시양태에서, CD25+ 세포 또는 CD14+ 세포 중 어느 하나는 펩티드의 첨가 전에 고갈된다. 일부 실시양태에서, CD14+ 세포가 아닌 CD25+ 세포는 펩티드의 첨가 전에 고갈된다.
일부 실시양태에서, 고갈 절차에 뒤이어 FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드 (FLT3L)를 첨가하여, 펩티드를 첨가하기 전에 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포 (DC)로 구성된, 항원 제시 세포 (APC)를 자극한다. 일부 실시양태에서, 고갈 절차에 뒤이어 T 세포에 대한 펩티드 제시에 적합한 PAC로서 DC를 선택하고, 성숙한 대식세포 및 다른 항원 제시 세포를 환자로부터의 자가 면역 세포로부터 제거한다. 일부 실시양태에서, 고갈 절차에 뒤이어 T 세포에 대한 펩티드 제시에 적합한 PAC로서 미성숙 DC를 선택한다.
일부 실시양태에서, 'n'개의 신생항원성 펩티드의 선택은 T 세포에 대한 항원 제시를 위한 APC의 자극을 위해 APC와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 'n'개의 신생항원성 펩티드의 제1 수준 선택은 수령자 환자에게 존재하도록 미리 결정된 적어도 HLA 일배체형에 대한 펩티드 각각의 결합 능력에 기반한다. 수령자 환자에게 존재하도록 미리 결정된 HLA 일배체형을 결정하기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 환자는 치료 절차의 시작 전에 혈액 샘플로부터 HLA 일배체형 검정에 적용된다. 일부 실시양태에서, 'n'개의 신생항원성 펩티드의 제1 수준 선택은 신생항원성 펩티드(들)에 존재하는 돌연변이가 암에 걸린 것으로 알려진 환자의 적어도 5%에서 발견되는 것으로 알려진 신생항원 (또는 이를 야기하는 돌연변이)과 매칭되는지 여부의 결정에 기반한 두 번째 수준 선택이 뒤따른다. 일부 실시양태에서, 선택의 제2 수준은 돌연변이가 환자에서 명백한지 여부를 추가로 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, APC와 접촉하기 위한 'n'개의 신생항원성 펩티드의 제1 및 제2 수준 선택은, 결합 친화도가 높을수록 펩티드 선택이 더 양호하다는 결정과 함께, 펩티드가 결합할 수 있고 적어도 500 nM 미만인 HLA와 펩티드의 결합 친화도를 기반으로 하는, 선택의 제3 수준이 뒤따른다. 일부 실시양태에서, 최종 선택된 'n'개의 펩티드는 APC를 배양 배지 내의 펩티드에 노출시키고 APC와 접촉시키기 위한, 혼합물에 있는 1-200개 펩티드의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 10-190개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 20-180개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 30-170개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 40-160개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 50-150개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 60-140개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 'n'개의 펩티드는 70-130개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 80-120개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 50-100개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 50-90개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 50-80개의 신생항원성 펩티드의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 적어도 60개의 신생항원성 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서 일부 실시양태에서 'n'개의 펩티드는 (a) 화학식 AxByCz를 따르는, 이전에 기재된 바와 같은 돌연변이된 아미노산을 포함하는 짧은, 8-15개 아미노산 길이인 신생항원성 펩티드; 이들 펩티드는 본 출원의 목적을 위해 상호교환적으로 쇼트머(shortmer) 또는 짧은 펩티드로 지칭됨; 및 (b) 더 양호한 항원 제시를 위해 수지상 세포에 의해 내인성 처리에 적용되는, 15, 30, 50, 60, 80, 100-300개의 아미노산 길이와 그 사이의 임의의 길이인 긴 펩티드; 이들 펩티드는 본 출원의 목적을 위해 상호교환적으로 롱머(longmer) 또는 긴 펩티드로 지칭됨;의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 60개의 신생항원성 펩티드는 적어도 30개의 쇼트머 및 적어도 30개의 롱머 또는 이들의 변이체를 포함한다. 이들의 예시적인 변형은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 일부 실시양태에서, 적어도 60개의 신생항원성 펩티드는 적어도 32개의 쇼트머 및 적어도 32개의 롱머 또는 그의 변형체를 포함한다. 일부 실시양태에서 적어도 60개의 신생항원성 펩티드는 적어도 34개의 쇼트머 및 적어도 30개의 롱머 또는 그의 변형체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 60개의 신생항원성 펩티드는 적어도 28개의 쇼트머 및 적어도 34개의 롱머 또는 이들의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 'n'개의 펩티드가 배양물 중 APC를 포함하는 배지에서 인큐베이션되고, 여기서 APC (DC)는 PBMC로부터 단리되었고, FLT3L로 이전에 자극되었다. 일부 실시양태에서, 'n'개의 펩티드가 FLT3L의 존재 하에 APC와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, APC를 FLT3L과 함께 인큐베이션하는 단계 후에, 세포는 펩티드와 함께 인큐베이션하기 위해 FL3TL을 함유하는 새로운 배지와 함께 첨가된다. 일부 실시양태에서, 성숙 펩티드 로딩된 DC로의 APC의 성숙은 성숙을 향해 DC를 배양하는 단계, 배양 배지에서 하나 이상의 방출된 물질 (예를 들어, 사이토카인, 케모카인)의 분석에 의해 성숙 상태를 조사하는 단계 또는 때때로 배양물 형태의 DC의 분취액을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, DC의 성숙은 배양 개시로부터 배양에서 적어도 5일 걸린다. 일부 실시양태에서, DC의 성숙은 배양 개시로부터 배양에서 적어도 7일 걸린다. 일부 실시양태에서, DC의 성숙은 배양 개시로부터 배양에서 적어도 11일, 또는 그 사이의 임의의 일수가 걸린다.
일부 실시양태에서, DC는 제시된 항원의 레퍼토리를 확인하기 위한 성숙 인자 및 펩티드 사량체 검정의 존재 또는 부재에 대해 확인된 후 T 세포와 접촉된다.
일부 실시양태에서, DC는 1차 유도를 위해 약 2일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 1차 유도를 위해 약 3일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 1차 유도를 위해 약 4일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 2차 유도를 위해 적어도 약 2일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 2차 유도를 위해 적어도 약 3일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 2차 유도를 위해 적어도 약 4일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 2차 유도를 위해 5일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 2차 유도를 위해 약 6일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 2차 유도를 위해 약 7, 8, 9 또는 10일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 3차 유도를 위해 약 1일 미만 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 3차 유도를 위해 적어도 약 2 또는 3일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 3차 유도를 위해 적어도 약 4일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 3차 유도를 위해 5일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 3차 유도를 위해 약 6일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다. 일부 실시양태에서, DC는 2차 유도를 위해 약 7, 8, 9 또는 10일 동안 T 세포 배지에서 T 세포와 접촉된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 1차 유도 단계, 2차 유도 단계 또는 3차 유도 단계에서 DC (및 DC에 더하여)와의 인큐베이션 동안 하나 이상의 쇼트머 펩티드와 추가로 접촉된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 1차 유도 단계 및 2차 유도 단계에서 DC와의 인큐베이션 동안 하나 이상의 쇼트머 펩티드와 추가로 접촉된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 2차 유도 단계 및 3차 유도 단계에서 DC와의 인큐베이션 동안 하나 이상의 쇼트머 펩티드와 추가로 접촉된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 3개의 유도 단계 모두에서 하나 이상의 쇼트머 펩티드와 추가로 접촉된다.
일부 실시양태에서, APC 및 T 세포는 환자로부터 제1 단계에서 채취한 환자의 말초 혈액으로부터의 동일한 자가 면역 세포에 포함된다. T 세포는 DC 성숙 단계의 말미에서 DC와의 활성화 시간 동안 단리되고 보존된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 DC 성숙 단계의 말미에 DC와의 활성화 시간 동안 활성화에 적합한 배지의 존재 하에 공배양된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 DC 성숙 단계의 말미에 DC와의 활성화 시점에 유도를 위해 적어도 4시간 내지 최대 약 48시간 동안 해동되고 배양되는, 환자로부터의 사전 냉동보존된 세포이다.
일부 실시양태에서, APC 및 T 세포는 환자, 예를 들어, 상이한 성분채집술 절차에서, 환자로부터 상이한 기간에 채취된 환자의 말초 혈액으로부터의 동일한 자가 면역 세포에 포함된다. 일부 실시양태에서, 환자의 성분채집술로부터 수확 시간까지의 시간은 약 20일 내지 약 26일 미만이 걸린다. 일부 실시양태에서, 환자의 성분채집술로부터 수확 시간까지의 시간은 약 21일 내지 약 25일 미만이 걸린다. 일부 실시양태에서, 환자의 성분채집술로부터 수확 시간까지의 시간은 약 21일 내지 약 24일 미만이 걸린다. 일부 실시양태에서, 환자의 성분채집술로부터 수확 시간까지의 시간은 약 21일 내지 약 23일 미만이 걸린다. 일부 실시양태에서, 환자의 성분채집술로부터 수확 시간까지의 시간은 약 21일이 걸린다. 일부 실시양태에서, 환자의 성분채집술로부터 수확 시간까지의 시간은 약 21일 미만이 걸린다.
일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포 (약물 물질)에 대한 방출 기준은 무균, 내독소, 세포 표현형, TNC 계수, 생존율, 세포 농도, 효능 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포 (약물 물질)에 대한 방출 기준은 무균, 내독소, 세포 표현형, TNC 카운트, 생존력, 세포 농도, 효능 중 각각의 것을 포함한다.
일부 실시양태에서 세포의 총 수는 2 x 10^10이다. 일부 실시양태에서 세포의 총 수는 2x10^9이다. 일부 실시양태에서 세포의 총 수는 5 x 10^8이다. 일부 실시양태에서, 세포의 총 수는 2 x 10^8이다. 일부 실시양태에서 재현탁된 T 세포의 최종 농도는 2 x 10^5 세포/ml 이상이다. 일부 실시양태에서 재현탁된 T 세포의 최종 농도는 1 x 10^6 세포/ml 이상이다. 일부 실시양태에서 재현탁된 T 세포의 최종 농도는 2 x 10^6 세포/ml 이상이다.
방출된 세포의 하기 기준은 예시적인 비제한적 조건으로서 기재되는데, 특히 약물 물질 (DS)의 세포 집단 및 하위집단에 대한 기준이 암, 암의 상태, 환자의 상태, 매칭되는 HLA 일배체형의 이용가능성 및 펩티드 존재 하에 APC 및 T 세포의 성장 가능성에 따라 달라질 수 있기 때문이다. 일부 실시양태에서 활성화된 T 세포 (약물 물질)는 사량체 검정에 의해 특정한 신생항원에 반응성인 CD8+ T 세포의 적어도 2% 또는 적어도 3% 또는 적어도 4% 또는 적어도 5%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포 (약물 물질)는 사량체 검정에 의해 특정한 신생항원에 반응성인 CD4+ T 세포의 적어도 2% 또는 적어도 3% 또는 적어도 4% 또는 적어도 5%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포 (약물 물질)는 기억 T 세포 표현형에 대해 양성인 세포의 적어도 5% 또는 적어도 6% 또는 적어도 7% 또는 적어도 8% 또는 적어도 9% 또는 적어도 10%를 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포 (약물 물질)는 하나 이상의 마커에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포 (약물 물질)는 하나 이상의 마커에 기초하여 선택되지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포 (약물 물질)의 분취액을 하기 마커 중 하나 이상의 존재 또는 부재, 시험된 마커 각각을 나타내는 그의 세포의 비율에 대해 시험하고, 하나 이상의 마커는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD27, CD38, CD40, CD72, CD3, CD79a, CD79b, IGKC, IGHD, MZB1, TNFRSF17, MS4A1, CD138, TNFRSR13B, GUSPB11, BAFFR, AID, IGHM, IGHE, IGHA1, IGHA2, IGHA3, IGHA4, BCL6, FCRLA CCR7, CD27, CD45RO, FLT3LG, GRAP2, IL16, IL7R, LTB, S1PR1, SELL, TCF7, CD62L, PLAC8, SORL1, MGAT4A, FAM65B, PXN, A2M, ATM, C20orf112, GPR183, EPB41, ADD3, GRAP2, KLRG1, GIMAP5, TC2N, TXNIP, GIMAP2, TNFAIP8, LMNA, NR4A3, CDKN1A, KDM6B, ELL2, TIPARP, SC5D, PLK3, CD55, NR4A1, REL, PBX4, RGCC, FOSL2, SIK1, CSRNP1, GPR132, GLUL, KIAA1683, RALGAPA1, PRNP, PRMT10, FAM177A1, CHMP1B, ZC3H12A, TSC22D2, P2RY8, NEU1, ZNF683, MYADM, ATP2B1, CREM, OAT, NFE2L2, DNAJB9, SKIL, DENND4A, SERTAD1, YPEL5, BCL6, EGR1, PDE4B, ANXA1, SOD2, RNF125, GADD45B, SELK, RORA, MXD1, IFRD1, PIK3R1, TUBB4B, HECA, MPZL3, USP36, INSIG1, NR4A2, SLC2A3, PER1, S100A10, AIM1, CDC42EP3, NDEL1, IDI1, EIF4A3, BIRC3, TSPYL2, DCTN6, HSPH1, CDK17, DDX21, PPP1R15B, ZNF331, BTG2, AMD1, SLC7A5 POLR3E, JMJD6, CHD1, TAF13, VPS37B, GTF2B, PAF1, BCAS2, RGPD6, TUBA4A, TUBA1A, RASA3, GPCPD1, RASGEF1B, DNAJA1, FAM46C, PTP4A1, KPNA2, ZFAND5, SLC38A2, PLIN2, HEXIM1, TMEM123, JUND, MTRNR2L1, GABARAPL1, STAT4, ALG13, FOSB, GPR65, SDCBP, HBP1, MAP3K8, RANBP2, FAM129A, FOS, DDIT3, CCNH, RGPD5, TUBA1C, ATP1B3, GLIPR1, PRDM2, EMD, HSPD1, MORF4L2, IL21R, NFKBIA, LYAR, DNAJB6, TMBIM1, PFKFB3, MED29, B4GALT1, NXF1, BIRC2, ARHGAP26, SYAP1, DNTTIP2, ETF1, BTG1, PBXIP1, MKNK2, DEDD2, AKIRIN1, HLA-DMA, HLA-DNB, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, CCL18, CCL19, CCL21, CXCL13, LAMP3, LTB, IL7R, MS4A1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CXCL10, CXCL11, CXCL9, CD3, LTA, IL17, IL23, IL21, IL7, CCL5, CD27, CD274, CD276, CD8A, CMKLR1, CXCL9, CXCR6, HLA-DQA1, HLA-DRB1, HLA-E, IDO1, LAG3, NKG7, PDCD1LG2, PSMB10, STAT1, TIGIT, CD56, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL8, IFN, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, NCR1, XCL1, XCL2, IL21R, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NCAM1, HLA-DMA, HLA-DNB, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, 및 HLA-DRB5.
일부 실시양태에서, 환자의 말초 혈액으로부터 자가 면역 세포의 수득으로부터 수득된 나이브 T 세포의 적어도 0.01%가 신생항원에 대한 반응으로 자극되었고, 절차의 말미에 증폭되고 수확되었다. 일부 실시양태에서, 환자의 말초 혈액으로부터 자가 면역 세포의 수득으로부터 수득된 나이브 T 세포의 0.01% 초과가 신생항원에 대한 반응으로 자극되었고, 절차의 말미에 증폭되고 수확되었다. 일부 실시양태에서, 환자의 말초 혈액으로부터 자가 면역 세포의 수득으로부터 수득된 나이브 T 세포의 0.1% 초과가 신생항원에 대한 반응으로 자극되었고, 절차의 말미에 증폭되고 수확되었다. 일부 실시양태에서, 환자의 말초 혈액으로부터 자가 면역 세포의 수득으로부터 수득된 나이브 T 세포의 1% 초과가 신생항원에 대한 반응으로 자극되었고, 절차의 말미에 증폭되고 수확되었다.
일부 실시양태에서, 세포의 총 수는 DC 성숙 및 T 세포 활성화 공정 1, 2, 또는 3 주기로부터 수확된다.
일부 실시양태에서, 수확된 세포는 백(bag)에서 액체 질소의 증기 상에서 냉동보존된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 환자의 말초 혈액으로부터 자가 면역 세포의 수득으로부터 세포의 수확에 이르기까지 이 섹션의 이전 단락에 기재된 모든 적용은 무균 폐쇄 시스템에서 수행되되, 단, 유세포 분석법, 질량 분광학, 세포 계수, 세포 분류 또는 임의의 기능적 검정에 의한 검사를 위해 배지 또는 세포의 분취액을 취하는 단계는 제외되며, 이는 분취액으로서 취한 세포 또는 물질의 종점(terminal)이다. 일부 실시양태에서 수확할 때까지의 무균 배양을 위한 폐쇄 시스템은 출원인의 공정에 독점적이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 환자의 말초 혈액으로부터 자가 면역 세포의 수득으로부터 시작하여 수확에 이르기까지, 무균 절차에서 확장가능한, 상기 기재된 단계를 포함하는 활성화된 T 세포의 배양 및 확장 방법이다. 일부 실시양태에서, 한 번에 적어도 1리터의 DC 세포 배양이 수행된다. 일부 실시양태에서, 한 번에 적어도 1-2리터의 T 세포 배양이 수행된다. 일부 실시양태에서, 한 번에 적어도 5리터의 DC 세포 배양이 수행된다. 일부 실시양태에서, 한 번에 적어도 5-10리터의 T 세포 배양이 수행된다. 일부 실시양태에서, 한 번에 적어도 10리터의 DC 세포 배양이 수행된다. 일부 실시양태에서, 한 번에 적어도 10-40리터의 T 세포 배양이 수행된다. 일부 실시양태에서, 한 번에 적어도 10리터의 DC 세포 배양이 수행된다. 일부 실시양태에서, 한 번에 적어도 10-50리터의 T 세포 배양이 수행된다. 일부 실시양태에서, 동시 배치 배양은 폐쇄된 시스템인 시스템에서 수행되고 시험되며, 이는 비무균 수단을 도입하지 않고 외부로부터 조작 및 개입될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기재된 폐쇄 시스템은 완전히 자동화된다.
투여가 주사에 의한 경우, 활성제는 수용액, 구체적으로 행크스 용액, 링거 용액, 또는 생리 식염수 완충제와 같은 생리학상 적합한 완충제에서 제제화될 수 있다. 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 화합물은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열원이 없는 물과 함께 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 약물 제품은 숙주의 면역 반응의 성분을 추가로 활성화 또는 억제하는 물질, 예를 들어, 펩티드에 대한 숙주의 면역 반응을 감소 또는 제거하는 물질을 포함한다.
본원에 제공된 개시내용은 공유된 신생항원이 환자의 즉시 치료적 투여에 사용될 수 있고, 이에 의해 벤치-투-베드사이드(bench-to-bedside) 시간 지연을 상당히 감소시킬 수 있음을 입증한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 암 치료제 분야에서 혁신적인 발전을 제공한다.
실시예
실시예 1. 정밀 NEOSTIM 임상 과정
본원에는 대상체의 암에 대해 특이적인 큐레이트된 사전 검증되고, 보류된(shelved) 항원성 펩티드에 대해 프라이밍되고 반응성인 T 세포가 대상체에게 투여되는 입양 T 세포 요법이 제공된다. 이 실시예에는 대상체 특이적 신생항원 펩티드의 긴 시퀀싱, 확인 및 제조를 우회한 후에, 적어도 대상체가 이러한 평가 및 개인맞춤형 요법을 위한 준비 과정을 겪는 동안 암 면역요법을 위한 대상체 특이적 TCR을 갖는 T 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 이 과정의 이점은 그것이 빠르고, 표적화되며, 강력하다는 점이다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 암 또는 종양으로 확인된 환자는 확인된 암에 대해 공지된 공유된 항원의 라이브러리로부터 생성된 에피토프의 선택된, 사전 검증된 수집을 갖는 웨어하우스 큐레이트된 펩티드로 생체외에서 활성화된 T 세포를 투여받을 수 있다. 환자 선택으로부터 T 세포 요법까지의 과정은 6주 미만을 필요로 할 수 있다. 도 1b는 T 세포를 추정 T 세포 에피토프를 발현하는 항원 제시 세포 (APC)로 프라이밍하고 활성화된 T 세포를 확장시켜 기억 표현형을 나타내는 이들 세포의 집단을 포함한 에피토프 특이적 CD8+ 및 CD4+를 수득함으로써 암 표적 특이적 T 세포를 생체외에서 생성하는 방법을 도시한다 (예를 들어, WO2019094642 참조, 그 전문이 참조로 포함됨). 사전 검증된 에피토프 라이브러리가 미리 생성된다. 이러한 에피토프는 해당 분야의 사전 지식, 통상의 드라이버 돌연변이, 통상의 약물 내성 돌연변이, 조직 특이적 항원 및 종양 연관 항원으로부터 수집된다. 에피토프 예측, HLA 결합 및 제시 특성을 위한 효율적인 컴퓨터 기반 프로그램의 도움으로, 사전 검증된 펩티드는 도 2의 다이어그램에 나타낸 바와 같이 저장 및 비축을 위해 생성된다. 통상의 RAS G12 돌연변이에 대한 예시적인 예측이 도 3a 내지 도 3d에 도시되어 있다. 검증은 실시예 2 내지 5에 요약된 바와 같이 체계적인 공정을 사용하여 수행된다. 표적 종양 세포 항원 반응성 T 세포는 생체외에서 생성되고 면역원성은 시험관내 항원 특이적 T 세포 검정을 사용하여 검증된다 (실시예 2). 관심 항원을 발현하는 세포가 관련 HLA 분자에 대한 펩티드를 처리하고 제시할 수 있는지 검증하기 위해 질량 분석법이 사용된다 (실시예 3). 게다가, 펩티드를 제시하는 세포를 사멸시키는 이들 T 세포의 능력은 세포독성 검정을 사용하여 확인된다 (실시예 4). 본원에 제공된 예시적인 데이터는 RAS 및 GATA3 신생항원에 대한 이러한 검증 공정을 입증하고, 다른 항원에 쉽게 적용될 수 있다.
실시예 2. 생체외 표적 종양 세포 항원 반응성 T 세포의 생성
재료:
AIM V 배지 (인비트로겐(Invitrogen))
인간 FLT3L, 전임상 셀게닉스(CellGenix) #1415-050 스톡 50 ng/μL
TNF-α, 전임상 셀게닉스 #1406-050 스톡 10 ng/μL
IL-1β, 전임상 셀게닉스 #1411-050 스톡 10 ng/μL
PGE1 또는 알프로스타딜(Alprostadil) - 체코 공화국으로부터의 캐이맨(Cayman) 스톡 0.5 μg/μL
R10 배지- RPMI 1640 글루타맥스 + 10% 인간 혈청+ 1% PenStrep
20/80 배지- 18% AIM V + 72% RPMI 1640 글루타맥스 + 10% 인간 혈청 + 1% PenStrep
IL7 스톡 5 ng/μL
IL15 스톡 5 ng/μL
절차:
단계 1: 2 mL AIM V 배지에서 FLT3L을 가진 24웰 플레이트의 각각의 웰에 5백만 개의 PBMC (또는 관심 세포)를 플레이트한다.
단계 2: AIMV에서 - 펩티드 로딩 및 성숙
1. 관심 펩티드 풀 (펩티드가 없는 상태 제외)을 각각 웰에서 PBMC (또는 관심 세포)와 혼합한다.
2. 1시간 동안 인큐베이션한다.
3. 인큐베이션 후 각각의 웰에 성숙 칵테일 (TNF-α, IL-1β, PGE1, 및 IL-7 포함)을 혼합한다.
단계 3: 최종 농도가 10 중량%가 되도록 각각의 웰에 인간 혈청을 첨가하고 혼합한다.
단계 4: 배지를 IL7 + IL15가 보충된 새로운 RPMI+ 10% HS 배지로 교체한다.
단계 5: 배지를 인큐베이션 기간 동안 1-6일마다 IL7 + IL15가 보충된 새로운 20/80 배지로 교체한다.
단계 6: 2 mL AIM V 배지에서 FLT3L을 가진 새로운 6웰 플레이트의 각각의 웰에 5백만 개의 PBMC (또는 관심 세포)를 플레이트한다.
단계 7: 재자극- (새로운 플레이트)을 위한 펩티드 로딩 및 성숙
1. 관심 펩티드 풀 (펩티드가 없는 상태 제외)을 각각 웰에서 PBMC (또는 관심 세포)와 혼합한다.
2. 1시간 동안 인큐베이션한다.
3. 인큐베이션 후 각각의 웰에 성숙 칵테일을 혼합한다.
단계 8: 재자극:
1. 1차 자극 FLT3L 배양의 수를 세고 새로운 재자극 플레이트에 5백만 개의 배양된 세포를 첨가한다.
2. 배양 부피를 5 mL (AIM V)가 되게 하고 500 μL의 인간 혈청을 첨가한다 (10 중량%).
단계 9: 배지 3 ml를 제거하고 IL7 + IL15가 보충된 RPMI+ 10% HS 배지 6 ml를 첨가한다.
단계 10: 배지의 75%를 IL7 + IL15가 보충된 새로운 20/80 배지로 교체한다.
단계 11: 필요한 경우 재자극을 반복한다.
항원 특이적 유도의 분석
MHC 사량체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 현장에서 구입하거나 제조하고, 면역원성 검정에서 펩티드 특이적 T 세포 확장을 측정하는 데 사용된다. 평가를 위해, 사량체를 제조업체의 지침에 따라 1% FCS 및 0.1% 아지드화나트륨 (FACS 완충제)을 함유하는 PBS 중 1 x 105개 세포에 첨가한다. 세포를 실온에서 20분 동안 암실에서 인큐베이션한다. 이어서 CD8과 같은 T 세포 마커에 특이적인 항체를 제조업체가 제안한 최종 농도로 첨가하고, 세포를 4℃의 암실에서 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 차가운 FACS 완충제로 세척하고 1% 포름알데히드를 함유하는 완충제에 재현탁한다. 세포를 LSR 포르테사(Fortessa) (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 기기에서 획득하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석한다. 사량체 양성 세포의 분석을 위해, 림프구 게이트는 전방 및 측면 산란 플롯에서 취한다. 데이터는 CD8+/사량체+였던 세포의 백분율로 보고된다.
HLA-A03:01 및 HLA-A11:01에 대한 RAS 신생항원에 대한 예시적인 데이터를 도 5에 나타냈다. HLA-A11:01에 대한 RAS G12V 신생항원에 대한 다수의 건강한 공여자에 걸친 예시적인 데이터를 도 6에 나타냈다. HLA-A02:01 상의 RAS G12V 신생항원에 대한 예시적인 데이터를 도 13에 나타냈다. HLA-A68:01 상의 RAS 신생항원에 대한 예시적인 데이터를 도 14에 나타냈다. HLA-B07:02 상의 RAS 신생항원에 대한 예시적인 데이터를 도 15에 나타냈다. HLA-B08:01 상의 RAS 신생항원에 대한 예시적인 데이터를 도 16에 나타냈다. HLA-C08:02 상의 RAS G12D 신생항원에 대한 예시적인 데이터를 도 17에 나타냈다. HLA-A02:01, HLA-A03:01, HLA-A11:01, HLA-B07:02, 및 HLA-B08:01 상의 GATA3 신생항원에 대한 예시적인 데이터를 도 21에 나타냈다. HLA-A02:01 상의 BTK C481S 신생항원에 대한 예시적인 데이터를 도 26에 나타냈다. HLA-A02:01 상의 EGFR T790M 신생항원에 대한 예시적인 데이터를 도 27에 나타냈다.
신생항원에 대한 CD44+ T 세포 반응은 생체외 유도 프로토콜을 사용하여 유도될 수 있다. 이 예에서, CD44+ T 세포 반응은 항원 특이적 방식으로 IFNγ 및/또는 TNFα 생산을 모니터링함으로써 확인되었다. 도 18은 RAS G12D 신생항원에 반응성인 CD4+ T 세포에 대한 이러한 유세포 분석법 분석의 대표적인 예를 나타낸다. 도 24는 GATA3 신생항원에 반응성인 CD4+ T 세포에 대한 이러한 유세포 분석법 분석의 대표적인 예를 나타낸다.
실시예 3. 항원 제시의 평가
예측된 항원의 서브세트에 대해, 표시된 HLA 대립유전자에 대한 신생에피토프의 친화도 및 HLA 대립유전자에 대한 신생에피토프의 안정성을 결정하였다. RAS 신생항원 및 GATA3 신생항원의 서브세트에 대한 예시적인 데이터를 각각 도 4a 및 도 20에 나타냈다.
클래스 I MHC에 대한 펩티드의 결합 친화도를 측정하기 위해 활용된 프로토콜의 예시적인 상세한 설명이 공개되었다 (Sette et al, Mol. Immunol. 31(11):813-22, 1994). 간단히 말해서, MHCI 복합체를 준비하고 방사성표지된 참조 펩티드에 결합시켰다. 펩티드를 이들 복합체와 함께 다양한 농도에서 2일 동안 인큐베이션하고, MHCI에 결합된 방사성표지된 펩티드의 잔류량을 크기 배제 겔 여과를 사용하여 측정하였다. 참조 방사성표지된 펩티드를 대체하는 데 필요한 시험 펩티드의 농도가 낮을수록 MHCI에 대한 시험 펩티드의 더 강한 친화도를 입증한다. MHCI에 대한 친화도가 <50 nM인 펩티드는 일반적으로 강한 결합제로 간주되며 한편 친화도가 <150 nM인 펩티드는 중간 결합제로 간주되고 <500 nM인 펩티드는 약한 결합제로 간주된다 (Fritsch et al, 2014).
클래스 I MHC에 대한 펩티드의 결합 안정성을 측정하는 데 활용되는 프로토콜의 예시적인 상세한 설명이 공개되었다 (Sette et al, Mol. Immunol. 31(11):813-22, 1994). 간단히 말해서, 비오틴화된 MHC-1 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 합성 유전자는 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되고 표준 방법을 사용하여 봉입체로부터 정제된다. 경쇄 (β2m)는 아이오딘 (125I)으로 방사성표지되고 18℃에서 정제된 MHC-I 중쇄 및 관심 펩티드와 조합되어 pMHC-I 복합체 형성을 개시한다. 이들 반응은 스트렙타비딘 코팅된 마이크로플레이트에서 수행되어 비오틴화된 MHC-I 중쇄를 표면에 결합하고 방사성표지된 경쇄를 측정하여 복합체 형성을 모니터링할 수 있게 한다. 해리는 더 높은 농도의 표지되지 않은 경쇄를 첨가하고 37℃에서 인큐베이션함으로써 개시된다. 안정성은 신틸레이션 카운트에 의해 측정된 바, 복합체의 절반이 해리되는 데 걸리는 시간 (시간)으로 정의된다.
항원이 더 큰 폴리펩티드 맥락으로부터 처리되고 제시될 수 있는지를 평가하기 위해, 관심 유전자를 발현하는 세포로부터 단리된 HLA 분자로부터 용리된 펩티드를 탠덤 질량 분석법 (MS/MS)에 의해 분석하였다.
RAS 신생항원의 제시 분석을 위해, 자연적으로 RAS 돌연변이를 갖거나 돌연변이된 RAS 유전자를 발현하도록 렌티바이러스로 형질도입된 세포주를 활용하였다. HLA 분자는 세포주의 자연 발현에 기초하여 단리되거나 세포주가 렌티바이러스로 형질도입되거나 일시적으로 형질감염되어 관심 HLA를 발현하였다. 293T 세포는 돌연변이 RAS 펩티드의 다양한 영역을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 돌연변이 RAS 펩티드에 의해 코딩된 펩티드를 발현하는 5천만 개 초과의 세포를 배양하고 산 세척제를 사용하여 HLA-펩티드 복합체로부터 펩티드를 용리시켰다. 이어서, 용리된 펩티드를 병렬 반응 모니터링 (PRM)으로 표적화된 MS/MS에 의해 분석하였다. RASG12V 돌연변이 및 HLA-A*03:01 유전자 둘 다로 렌티바이러스로 형질도입된 293T 세포의 경우, 아미노산 서열 vvvgaVgvgk를 가진 펩티드가 질량 분석법에 의해 검출되었다. 그의 상응하는 안정한 무거운 동위원소 표지된 합성 펩티드에 대한 스펙트럼 비교 (도 4b)는 검출된 펩티드의 질량 정확도가 5백만분율 (ppm) 미만임을 나타냈다. 내인성 펩티드 스펙트럼은 상단 패널에 나타내고 상응하는 안정한 무거운 동위원소 표지된 스펙트럼은 하단 패널에 나타냈다. RASG12V 돌연변이를 자연적으로 발현하고 HLA-A*03:01 유전자로 렌티바이러스로 형질도입된 SW620 세포의 경우, 아미노 서열 vvvgaVgvgk를 가진 펩티드가 질량 분석법에 의해 검출되었다. 그의 상응하는 안정한 무거운 동위원소 표지된 합성 펩티드에 대한 스펙트럼 비교는 검출된 펩티드의 질량 정확도가 5 ppm 미만임을 나타냈다 (도 4c). 내인성 펩티드 스펙트럼은 상단 패널에 나타내고 상응하는 안정한 무거운 동위원소 표지된 스펙트럼은 하단 패널에 나타냈다. RASG12V 돌연변이 및 HLA-A*03:01 유전자 둘 다를 자연적으로 발현하는 NCI-H441 세포의 경우, 아미노산 서열 vvvgaVgvgk를 가진 펩티드가 질량 분석법에 의해 검출되었다. 그의 상응하는 안정한 무거운 동위원소 표지된 합성 펩티드에 대한 스펙트럼 비교는 검출된 펩티드의 질량 정확도가 5 ppm 미만임을 나타냈다 (도 4d). 내인성 펩티드 스펙트럼은 상단 패널에 나타내고 상응하는 안정한 무거운 동위원소 표지된 스펙트럼은 하단 패널에 나타냈다. HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*30:01, HLA-A*68:01 및 HLA-B*07:02에 대한 다수의 RASG12 돌연변이로부터 유래된 펩티드를 분석하기 위해 유사한 절차를 수행하고 표 13은 질량 분석법에 의해 검출된 그러한 펩티드를 열거한다.
[표 13]
Figure pct00080
GATA3 신생항원의 제시 분석을 위해, GATA3 neoORF에 의해 코딩된 펩티드의 다양한 영역을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 293T 세포를 형질도입하였다. GATA3 neoORF 서열에 의해 코딩된 펩티드를 발현하는 형질도입된 세포 중 5천만 내지 7억 개를 배양하고 산 세척제를 사용하여 HLA-펩티드 복합체로부터 펩티드를 용리시켰다. 이어서 용리된 펩티드를 PRM을 사용하여 표적화된 MS/MS에 의해 분석하였다. 각각의 검출을 확인하기 위해 GATA3 neoORF로부터 유래된 펩티드와 상응하는 합성 펩티드 간의 스펙트럼 비교를 수행하였다. HLA-A*02:01 단백질을 발현하는 293T 세포의 경우, 펩티드 VLPEPHLAL, SMLTGPPARV 및 MLTGPPARV를 질량 분석법에 의해 검출하였다 (표 14 및 도 20). 상응하는 합성 펩티드에 대한 스펙트럼 비교는 검출된 펩티드 (SMLTGPPARV)의 질량 정확도가 5 ppm 미만임을 나타냈다 (도 4e). HLA-A*03:01 또는 HLA-A*11:01 단백질을 발현하는 293T 세포의 경우, 펩티드 KIMFATLQ가 질량 분석법에 의해 검출되었다 (도 20). HLA-A*30:02 단백질을 발현하는 293T 세포의 경우, 펩티드 IMKPKRDGY 및 SIMKPKRDGY가 질량 분석법에 의해 검출되었다 (표 14). HLA-B*07:02 단백질을 발현하는 293T 세포의 경우, 펩티드 KPKRDGYMF 및 KPKRDGYMFL이 질량 분석법에 의해 검출되었다 (표 14 및 도 20). HLA-B*08:01 단백질을 발현하는 293T 세포의 경우, 펩티드 ESKIMFATL이 질량 분석법에 의해 검출되었다 (표 14 및 도 20). HLA-B*40:02 단백질을 발현하는 293T 세포의 경우, 펩티드 AESKIMFATL 및 AESKIMFAT가 질량 분석법에 의해 검출되었다 (표 14). HLA-C*03:03 단백질을 발현하는 293T 세포의 경우, 펩티드 FATLQRSSL이 질량 분석법에 의해 검출되었다 (표 14).
[표 14]
Figure pct00081
HLA 클래스 I 결합 및 안정성
친화도 측정에 사용된 펩티드의 서브세트는 또한 기재된 검정을 사용하여 안정성 측정에 사용되었다 (n=275). 이들 데이터는 표 3에 나타냈다. 50 nM 미만은 당해 분야에 의해 강한 결합제로 간주되고, 50-150 nM은 중간 결합제로 간주되고, 150-500 nM을 약한 결합제로 간주되고, 500 nM 초과는 매우 약한 결합제로 간주되었다. 관찰된 안정성과 관찰된 친화도 사이의 연결은 이들 결합된 안정성 간격에 걸쳐 감소하는 중앙값 안정성에 의해 명백하였다. 그러나, 빈(bin) 사이에는 상당한 중첩이 있으며, 중요하게는 매우 약한 결합제를 포함하여 여러 시간 범위에서 관찰된 안정성을 가진 모든 빈에 에피토프가 있다.
면역원성 검정을 사용하여 T 세포를 확장하는 각각의 시험 펩티드의 능력을 시험한다. 성숙한 전문 APC를 하기 방식으로 이들 검정을 위해 준비한다. 단핵구를 비드-기반 키트 (밀테니)를 사용하여 건강한 인간 공여자 PBMC로부터 풍부화한다. 풍부화된 세포는 미성숙 DC를 유도하기 위해 GM-CSF 및 IL-4에 플레이팅한다. 5일 후, 미성숙 DC를 사이토카인 성숙 칵테일 (GM-CSF, IL-1β, IL-4, IL-6, TNFα, PGE1β)을 첨가하기 전에 1시간 동안 각각 펩티드와 함께 37℃에서 인큐베이션한다. 세포를 37℃에서 인큐베이션하여 DC를 성숙시킨다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 환자에게 투여될 때 면역 반응을 도출하는 데 필요하다.
표 4A는 RAS 돌연변이를 포함하는 펩티드 서열, 이것이 결합하는 상응하는 HLA 대립유전자, 및 측정된 안정성 및 친화도를 나타낸다.
실시예 4. 시험관내 항원 특이적 T 세포의 세포독성 능력 평가
세포독성 활성은 유세포 분석법에 의해 표적 세포에서 절단된 카스파제 3의 검출로 측정될 수 있다. 표적 암 세포는 돌연변이체 펩티드 함께 그리고 적절한 MHC-I 대립 유전자를 발현하도록 조작된다. 모의 형질도입된 표적 세포 (즉, 돌연변이체 펩티드를 발현하지 않음)는 음성 대조군으로 사용한다. 세포는 이펙터 세포로 사용되는 자극된 PBMC와 구별하기 위해 CFSE로 표지한다. 표적 세포 및 이펙터 세포는 수확되기 전에 6시간 동안 공동배양한다. 세포내 염색은 CFSE 양성 표적 암 세포에서 절단된 형태의 카스파제 3을 검출하기 위해 수행한다. 특이적 용해의 백분율은 다음과 같이 계산된다: 카스파제 3의 실험적 절단/카스파제 3의 자발적 절단 (돌연변이체 펩티드 발현의 부재 하에 측정됨) x 100. GATA3 신생항원에 대해 유도된 T 세포가 GATA3 neoORF를 발현하는 표적 세포를 사멸시킬 수 있음을 나타내는 예시적인 데이터를 도 23에 나타냈다.
일부 예에서, 세포독성 활성은 유도된 T 세포를 항원 특이적 T 세포의 집단과 상응하는 HLA를 발현하는 표적 세포와 공동배양하고, 특이적으로 표적 암 세포에서 아폽토시스성 마커 아넥신 V를 측정하면서, 표적 세포의 상대 성장을 결정함으로써 평가한다. 표적 암 세포는 돌연변이체 펩티드를 발현하도록 조작되거나 펩티드가 외인성으로 로딩된다. 모의 형질도입된 표적 세포 (즉, 돌연변이체 펩티드를 발현하지 않음), 야생형 펩티드가 로딩된 표적 세포, 또는 펩티드가 로딩되지 않은 표적 세포는 음성 대조군으로 사용된다. 세포는 또한 GFP를 안정적으로 발현하도록 형질도입되어 표적 세포 성장을 추적할 수 있다. GFP 신호 또는 아넥신-V 신호는 IncuCyte S3 장치로 시간 경과에 따라 측정된다. 이펙터 세포로부터 기원한 아넥신 V 신호는 크기 배제에 의해 필터링된다. 표적 세포 성장 및 사멸은 각각 시간 경과에 따른 GFP 및 아넥신-V 면적 (mm2)으로 표시된다.
HLA-A11:01 상에서 RASG12V 신생항원을 인식하도록 자극된 T 세포가 돌연변이체 펩티드가 로딩되나 야생형 펩티드는 로딩되지 않은 표적 세포를 특이적으로 인식하고 사멸시킨다는 것을 입증하는 예시적인 데이터를 도 7에 나타냈다. HLA-A11:01 상에서 RASG12V 신생항원을 인식하도록 자극된 T 세포가 E:T 비 <0.2:1에서 나노몰량의 펩티드로 로딩된 표적 세포를 사멸시킨다는 것을 입증하는 예시적인 데이터를 도 8에 나타냈다. HLA-A11:01 상에서 RASG12V 신생항원을 인식하도록 자극된 T 세포가 RASG12V 돌연변이를 자연적으로 갖고 HLA-A11:01로 형질도입된 SW620 세포를 사멸시킨다는 것을 입증하는 예시적인 데이터를 도 9에 나타냈다. HLA-A03:01 상에서 RASG12V 신생항원을 인식하도록 자극된 T 세포가 RASG12V 돌연변이 및 HLA-A03:01을 자연적으로 갖는 NCI-H441 세포를 사멸시킨다는 것을 입증하는 예시적인 데이터를 도 10에 나타냈다. HLA-A02:01 상에서 GATA3 신생항원을 인식하도록 자극된 T 세포가 자연적으로 HLA-A02:01을 갖고 GATA3 neoORF로 형질도입된 293T 세포를 사멸시킨다는 것을 입증하는 예시적인 데이터를 도 22 및 도 23에 나타냈다.
실시예 5. 조직 특이적 항원에 적용된 정밀 NEO-STIM 공정
비필수 조직에서 특이적으로 발현되는 항원은 이러한 조직에서 종양이 발생하는 경우 표적화될 수 있다. 예를 들어, 전립선 조직에서 특이적으로 발현된 항원은 원발성 종양이 절제된 전이성 전립선암의 맥락에서 표적화될 수 있는데, 그 이유는 이들 항원을 발현하는 유일한 세포가 전이성 암 세포이기 때문이다. 이러한 비필수 조직이 여러 개 있다. 예를 들어, 잠재적인 전립선 특이적 항원을 발견하기 위해 두 가지 방법론을 사용하여 전립선 세포를 평가하였다. 한 접근법에서, 전립선 조직 또는 전립선암 세포주는 실시예 3에 요약된 바와 같이 HLA-MS를 사용하여 평가되었다. 이 접근법은 처리되고 제시되는 것으로 검증된 항원의 확인을 야기할 수 있다. 이 접근법으로부터의 예시적인 데이터를 도 25a에 나타냈다. 또 다른 접근법에서, 전립선 세포에서 특이적으로 발현되는 것으로 공지된 유전자는 하나 이상의 MHC 결합 및 제시 예측 소프트웨어를 통해 평가될 수 있다. 펩티드-MHC 예측 알고리즘이 생성되었고 이들 연구에 사용되었다. 실시예 2, 3 및 4에서와 같이, 질량 분석법, 세포 및 면역학적 분석은 예측된 펩티드 - HLA 쌍을 검증하는 데 추가로 도움이 된다. 전립선에서 특이적으로 발현되는 것으로 공지된 4가지 유전자 (KLK2, KLK3, KLK4, TGM4)에 대한 본 분석으로부터의 예시적인 결과는 하기 표에 나타냈다. 이들 에피토프는 실시예 2에서와 같이 면역원성 연구에 추가로 적용되었다. '*'가 접두사로 붙은 에피토프는 공여자 중 하나 또는 둘 다에서 양성 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 것으로 나타났으며 (각각 열 6에서 1 또는 2로 표시됨) 또한 도 25b에서 입증되었다.
[표 12]
Figure pct00082
추가 검정에서, 상기 표에 표시된 펩티드에 대해 특이적인 T 세포를 실시예 4에 기재된 바와 같이 표적 세포를 사멸시키는 능력에 대해 시험하였다. 예시적 데이터를 도 25c에 제시하였으며, 여기서 KLK4 전립선 특이적 에피토프는 2 uM의 펩티드가 로딩되거나 로딩되지 않은 293T-GFP 세포와 공동배양되었다. 펩티드가 로딩된 표적 세포는 펩티드가 없는 대조군 (좌측 이미지)과 비교하여 훨씬 더 많이 사멸되었다 (우측 이미지).
실시예 6. 표적 항원 활성화된 T 세포의 풍부화
종양 항원 반응성 T 세포는 추가로 풍부화될 수 있다. 이 예에서는, 항원 반응성 T 세포의 풍부화를 위한 여러 가지 방법을 탐색하고 결과를 제시한다. 항원 특이적 T 세포의 초기 자극 (실시예 2, 단계 1 내지 5) 후에, 이들 세포의 추가 확장 전에 풍부화 절차를 사용할 수 있다. 예를 들어, 자극 배양 및 13일차에 초기 자극에 사용된 동일한 펩티드로 펄스화하고, 4-1BB를 상향조절하는 세포를 자기 보조 세포 분리 (MACS; 밀테니)를 사용하여 풍부화한다. 이어서 이들 세포는, 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 마이크로비드 및 저용량 IL-2를 사용하여 추가로 확장될 수 있다. 도 19a (가운데 행) 및 도 19b (가운데 열)에 나타낸 바와 같이, 이 접근법은 다수의 항원 특이적 T 세포 집단을 풍부하게 할 수 있다. 또 다른 예로서, 다량체에 의해 염색된 T 세포는 자극 14일차에 MACS에 의해 풍부화될 수 있고, 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 마이크로비드 및 저용량 IL-2를 사용하여 추가로 확장될 수 있다. 도 19a (하단 행) 및 도 19b (우측 열)에 나타낸 바와 같이, 이 접근법은 다수의 항원 특이적 T 세포 집단을 풍부하게 할 수 있다.
실시예 7. 선택된 펩티드에 대한 면역원성 검정
DC의 성숙 후, PBMC (벌크 또는 T 세포에 대해 풍부화)를 증식 사이토카인을 갖는 성숙한 수지상 세포에 첨가한다. 기능적 검정 및/또는 사량체 염색의 조합을 사용하여 펩티드 특이적 T 세포에 대해 배양물을 모니터링한다. 변형된 펩티드와 모 펩티드를 사용한 병렬 면역원성 검정은 펩티드가 펩티드 특이적 T 세포를 확장하는 상대적 효율성의 비교를 가능하게 하였다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 T 세포 배양물에서 면역 반응을 도출하며 T 세포 배양물에서 FAS 리간드, 그랜자임, 퍼포린, IFN, TNF, 또는 그의 조합의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
면역원성은 사량체 검정에 의해 측정될 수 있다. MHC 사량체는 현장에서 구입하거나 제조하고, 면역원성 검정에서 펩티드 특이적 T 세포 확장을 측정하는 데 사용된다. 평가를 위해, 사량체를 제조업체의 지침에 따라 1% FCS 및 0.1% 아지드화나트륨 (FACS 완충제)을 함유하는 PBS 중 1x10^5개 세포에 첨가한다. 세포를 실온에서 20분 동안 암실에서 인큐베이션한다. 이어서 CD8과 같은 T 세포 마커에 특이적인 항체를 제조업체가 제안한 최종 농도로 첨가하고, 세포를 4℃의 암실에서 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 차가운 FACS 완충제로 세척하고 1% 포름알데히드를 함유하는 완충제에 재현탁한다. 세포를 FACS 칼리버(Calibur) (벡톤 디킨슨) 기기에서 획득하고, 셀퀘스트(Cellquest) 소프트웨어 (벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석한다. 사량체 양성 세포의 분석을 위해 림프구 게이트는 전방 및 측면 산란 플롯으로부터 취한다. 데이터는 CD8+/사량체+였던 세포의 백분율로 보고된다.
면역원성은 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정될 수 있다. 항원 특이적 T 세포 집단을 확인하기 위한 잘 확립된 사량체 염색의 부재 하에, 항원 특이성은 잘 확립된 유세포 분석법 검정을 사용하여 사이토카인 생성 평가를 사용하여 추정할 수 있다. 간단히 말해서, T 세포는 관심 펩티드로 자극되고 대조군과 비교된다. 자극 후, CD4+ T 세포 (예를 들어, IFNγ 및 TNFα)에 의한 사이토카인 생성을 세포내 염색에 의해 평가한다. 이들 사이토카인, 특히 IFNγ는 자극된 세포를 확인하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 면역원성은 ELISpot 검정을 사용하여, T 세포에 의해 발현되는 단백질 또는 펩티드를 측정함으로써 측정된다. 펩티드 특이적 T 세포는 단일 세포 기준으로 T 세포로부터 IFNγ의 방출을 측정하는 ELISpot 검정 (BD 바이오사이언시즈(Biosciences))을 사용하여 기능적으로 열거된다. 표적 세포 (T2 또는 HLA-A0201 형질감염된 C1R)를 37℃에서 1시간 동안 10 μM 펩티드로 펄스하고 3회 세척하였다. 1x10^5 펩티드 펄스 표적은 면역원성 배양으로부터 취한 다양한 농도의 T 세포 (5x10^2 내지 2x10^3)와 함께 ELISPOT 플레이트 웰에서 공동배양된다. 플레이트는 제조업체의 프로토콜에 따라 개발되고, 동반 소프트웨어와 함께 ELISPOT 판독기 (셀룰라 테크놀로지 리미티드(Cellular Technology Ltd.))에서 분석된다. IFN 감마 생성 T 세포의 수에 상응하는 반점은 플레이팅된 T 세포의 수당 반점의 절대 수로 보고된다. 변형된 펩티드에서 확장된 T 세포는 변형된 펩티드로 펄스된 표적을 인식하는 그의 능력뿐만 아니라, 모 펩티드로 펄스된 표적을 인식하는 능력에 대해서도 시험된다.
CD107a 및 b는 동족 펩티드로 활성화한 후 CD8+ T 세포의 세포 표면에서 발현된다. T 세포의 용해 과립은 CD107a 및 b 분자를 포함하는 리소좀 연관 막 당단백질 ("LAMP")을 함유하는 지질 이중층을 갖는다. 세포독성 T 세포가 T 세포 수용체를 통해 활성화되는 경우, 이들 용해 과립의 막이 이동하여 T 세포의 원형질막과 융합된다. 과립 내용물이 방출되어, 이것이 표적 세포의 사멸을 야기한다. 과립 막이 원형질막과 융합됨에 따라, C107a와 b가 세포 표면에 노출되므로, 탈과립의 마커이다. CD107a 및 b 염색에 의해 측정된 바와 같은 탈과립은 단일 세포 기준으로 보고되기 때문에, 검정은 펩티드 특이적 T 세포를 기능적으로 열거하는 데 사용된다. 검정을 수행하기 위해, HLA-A0201이 형질감염된 세포 C1R에 펩티드를 최종 농도가 20 μM이 되도록 첨가하고, 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 3회 세척하였다. 1x10^5의 펩티드 펄스된 C1R 세포를 튜브에 분주하고, CD107a 및 b에 특이적인 항체를 제조업체 (벡톤 디킨슨)가 제안한 최종 농도로 첨가한다. 항체는 검정 과정 동안 표면에 일시적으로 나타나는 바와 같은 CD107 분자를 "포획"하기 위해 T 세포를 첨가하기 전에 첨가된다. 다음으로, 면역원성 배양물로부터의 1x10^5 T 세포를 첨가하고, 샘플을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. T 세포는 CD8과 같은 추가 세포 표면 분자에 대해 추가로 염색되고 FACS 칼리버 기기 (벡톤 디킨슨) 상에서 획득하였다. 데이터는 동반되는 셀퀘스트 소프트웨어를 사용하여 분석되고, 결과는 CD8+ CD107 a 및 b+ 세포의 백분율로 보고되었다.
세포독성 활성은 크롬 방출 검정을 사용하여 측정된다. 표적 T2 세포를 Na51Cr로 37℃에서 1시간 동안 표지하고 세척한 다음에 5x10^3 표적 T2 세포를 면역원성 배양물로부터 다양한 수의 T 세포에 첨가하였다. 크롬 방출은 37℃에서 4시간 인큐베이션 후 수확된 상청액에서 측정된다. 특정 용해의 백분율은 다음과 같이 계산된다:
실험 방출-자발적 방출/총 방출-자발적 방출 x 100
면역원성 검정을 수행하여 각각의 펩티드가 항원 특이적 확장에 의해 T 세포 반응을 도출할 수 있는지 여부를 평가하였다. 비록 현재의 방법이 불완전하고, 따라서 음성 결과가 펩티드가 반응을 유도할 수 없다는 것을 의미하지는 않지만, 양성 결과는 펩티드가 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증한다. 표 3으로부터의 여러 펩티드를 기재된 바와 같이 다량체 판독으로 CD8+ T 세포 반응을 도출하는 능력에 대해 시험하였다. 각각의 양성 결과는 임의의 제제 편향을 피하기 위해 제2 다량체 제제로 측정되었다. 예시적인 검정에서, HLA-A02:01+ T 세포를 10일 동안 TMPRSS2::ERG 융합 신생에피토프 (ALNSEALSV; HLA-A02:01)가 로딩된 단핵구 유래 수지상 세포와 공동배양하였다. CD8+ T 세포는 다량체를 사용하여 TMPRSS2::ERG 융합 신생에피토프에 대한 항원 특이성에 대해 분석하였다 (초기: BV421 및 PE; 검증: APC 및 BUV396).
항원 특이적 CD8+ T 세포 반응은 잘 확립된 HLA 클래스 I 다량체 기술을 사용하여 쉽게 평가되지만, HLA 클래스 II 다량체 기술이 확립되지 않았기 때문에 CD4+ T 세포 반응은 평가하기 위해 별도의 검정을 필요로 한다. CD4+ T 세포 반응을 평가하기 위해, T 세포를 관심 펩티드로 재자극하고 대조군과 비교하였다. 완전히 새로운 서열 (예를 들어, 프레임 이동 또는 융합으로부터 생김)의 경우에, 대조군은 펩티드가 없었다. 점 돌연변이의 경우에, 대조군은 WT 펩티드였다. 자극 후, CD4+ T 세포 (예를 들어, IFNγ 및 TNFα)에 의한 사이토카인 생성을 세포내 염색에 의해 평가하였다. 이들한 사이토카인, 특히 IFNγ는 자극된 세포를 확인하는 데 사용된다. 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응은 대조군에 비해 증가된 사이토카인 생성을 나타냈다
실시예 8. 세포 확장 및 제조
APC를 제조하기 위해, 하기 방법을 사용하여 (a) 환자의 말초 혈액으로부터 자가 면역 세포를 수득하고; 배양에서 단핵구 및 수지상 세포를 풍부하게 하고; 펩티드 및 성숙한 DC를 로딩하였다.
T 세포 유도 (프로토콜 1)
1차 유도: (a) 성분채집술 백에서 자가 T 세포를 수득하는 단계; (b) CD25+ 세포 및 CD14+ 세포를 고갈시키거나, 대안적으로, CD25+ 세포만 고갈시키는 단계; (c) 펩티드가 로딩되고 성숙한 DC 세포를 세척하고, T 세포 배양 배지에 재현탁시키는 단계; (d) 성숙 DC와 함께 T 세포를 배양하는 단계.
2차 유도: (a) T 세포를 세척하고, T 세포 배지에 재현탁시키고, 임의로 세포 배양물로부터 소량의 분취액을 평가하여 세포 성장, T 세포 하위유형의 비교 성장 및 유도 및 항원 특이성을 결정하고 세포 집단의 손실을 모니터링하는 단계; (b) 성숙한 DC와 함께 T 세포를 배양하는 단계.
3차 유도: (a) T 세포를 세척하고, T 세포 배지에 재현탁시키고, 임의로 세포 배양물로부터 소량의 분취액을 평가하여 세포 성장, T 세포 하위유형의 비교 성장 및 유도 및 항원 특이성을 결정하고 세포 집단의 손실을 모니터링하는 단계; (b) 성숙한 DC와 함께 T 세포를 배양하는 단계.
펩티드 활성화된 t 세포를 수확하고 T 세포를 냉동보존하기 위해, 하기 방법을 사용하여, (a) 약물 물질 (DS)의 원하는 특성을 구성하는 세포 유형의 최적 세포 수 및 비율에 있는 활성화된 T 세포를 포함하는 최종 제제를 세척 및 재현탁시켰다. 방출 기준 시험은 특히 멸균, 내독소, 세포 표현형, TNC 수, 생존력, 세포 농도, 효능을 포함한다; (b) 적합한 밀폐 주입 백에 약물 물질을 충전; (c) 사용시까지 보존.
실시예 9. CD4+ 및 CD8+ 신생항원 특이적 T 세포의 기능적 특성화 방법.
단백질 코딩 유전자 서열을 변경하는 체세포 돌연변이로부터 암세포에서 발생하는 신생항원은 면역요법을 위한 매력적인 표적으로 부상하고 있다. 이들은 건강한 조직과 달리 종양 세포에서 독특하게 발현되며 면역 체계에 의해 외래 항원으로 인식되어, 면역원성을 증가시킬 수 있다. T 세포 제조 공정은 다수회의 생체외 T 세포 자극을 통해 환자 특이적 신생항원에 대한 기억 및 드 노보 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 향상시키고 입양 세포 요법에서 사용하기 위한 신생항원 반응성 T 세포 생성물을 생성하기 위해 개발되었다. 자극된 T 세포 생성물의 상세한 특성화는 이들 공정이 활용하는 많은 잠재적 변수를 시험하는 데 사용할 수 있다.
T 세포 기능 및/또는 특이성을 조사하기 위해, 항원 특이적 T 세포 반응을 동시에 검출하고 그 크기 및 기능을 특성화하기 위한 검정이 개발되었다. 이 분석은 하기 단계를 사용한다. 첫 번째 T 세포-APC 공동배양을 사용하여 항원 특이적 T 세포에서 반응성을 유도하였다. 임의로, 형광 세포 바코드를 사용하는 샘플 멀티플렉싱이 사용된다. 항원 특이적 CD8+ T 세포를 확인하고 T 세포 기능을 검사하기 위해, 펩티드-MHC 다량체의 염색과 멀티파라미터 세포내 및/또는 세포 표면 세포 마커 염색을 FACS 분석을 사용하여 동시에 조사하였다. 이 간소화된 검정 결과는 건강한 공여자로부터 유도된 T 세포 반응을 연구하는 데 그의 적용을 입증하였다. 펩티드에 대해 유도된 신생항원 특이적 T 세포 반응은 건강한 공여자에서 확인되었다. 유도된 T 세포 반응의 크기, 특이성 및 기능도 비교되었다. 간단히 말해서, 상이한 T 세포 샘플을 상이한 농도에서 상이한 형광 염료로 바코딩하였다 (예를 들어, 실시예 19 참조). 각각의 샘플은 상이한 농도의 형광 염료 또는 상이한 농도의 여러 염료의 조합을 받았다. 샘플을 인산염 완충 식염수 (PBS)에 재현탁시킨 다음에 DMSO (전형적으로 1:50 희석으로)에 용해된 형광단을 최대 최종 농도 5 μM까지 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 표지한 후, 단백질 함유 배지 (예를 들어 10% 풀링된 인간 AB형 혈청을 포함하는 RPMI 배지)를 첨가하여 과잉 형광 염료를 켄칭하였다. 독특하게 바코드가 붙은 T 세포 배양물은 상기에 기재된 항원 펩티드로 펄스된 자가 APC로 시험감염되었다.
차등적으로 표지된 샘플을 하나의 FACS 튜브 또는 웰에 합하고, 생성된 부피가 100 μL보다 큰 경우 다시 펠렛화하였다. 합해진, 바코딩드가 붙은 샘플 (전형적으로 100 μL)을 형광색소 접합 펩티드-MHC 다량체를 포함한 표면 마커 항체로 염색하였다. 고정 및 투과화 후, 샘플을 TNF-α 및 IFN-γ를 표적으로 하는 항체로 추가로 세포내 염색하였다.
이어서, 합해진, 바코드가 붙은 T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색을 유세포 분석기 상에서 유세포 분석법에 의해 동시에 분석하였다. T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색을 개별적으로 분석하는 다른 방법과 달리, 본 실시예에 기재된 T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색의 동시 분석은 항원 특이적이고 증가된 세포 마커 염색을 또한 갖는 T 세포의 백분율에 관한 정보를 제공한다. T 세포의 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색을 분석하는 다른 방법은 항원 특이적인 샘플의 T 세포의 백분율을 개별적으로 결정하고, 증가된 세포 마커 염색을 갖는 T 세포의 백분율을 개별적으로 결정하여, 이들 빈도의 상관관계만을 허용한다.
본 실시예에 기재된 T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색의 동시 분석은 항원 특이적 T 세포의 빈도 및 증가된 세포 마커 염색을 갖는 T 세포의 빈도의 상관관계에 의존하지 않고; 오히려, 항원 특이적이고 증가된 세포 마커 염색을 또한 갖는 T 세포의 빈도를 제공한다. 본 실시예에 기재된 T 세포 샘플의 세포 마커 프로파일 및 MHC 사량체 염색의 동시 분석은 단일 세포 수준에서 항원 특이적이고 증가된 세포 마커 염색을 또한 갖는 그러한 세포를 결정할 수 있게 해 준다.
주어진 유도 공정의 성공을 평가하기 위해, 리콜 반응 검정을 사용한 후 멀티플렉스된 다중파라미터 유세포 분석 패널 분석을 사용하였다. 유도 배양물로부터 채취한 샘플을 독특한 2색 형광 세포 바코드로 표지하였다. 표지된 세포를 항원 로딩된 DC 또는 로딩되지 않은 DC 상에서 밤새 인큐베이션하여 항원 특이적 세포에서 기능적 반응을 자극하였다. 다음날, 독특하게 표지된 세포를 하기 표 9에 따라 항체 및 다량체 염색 전에 조합하였다.
[표 9]
Figure pct00083
생물정보학 엔진을 사용하여 환자 특이적 신생항원을 예측하였다. 예측된 신생항원을 커버하는 합성된 긴 펩티드를 자극 프로토콜에서 면역원으로 사용하여 면역원성 능력을 평가하였다. 자극 프로토콜은 이들 신생항원 코딩 펩티드를 환자 유래 APC에 공급한 다음에, 환자 유래 T 세포와 함께 공동배양하여 신생항원 특이적 T 세포를 프라이밍하는 것을 포함한다.
기억 및 드 노보 T 세포 반응을 프라이밍, 활성화 및 확장하기 위해 자극 프로토콜에 다수회의 자극이 포함된다. 이들 반응을 하기 검정로 특성화하여 이들 신생항원 특이적 T 세포의 특이성, 표현형 및 기능을 분석하였다: pMHC 다량체를 사용한 조합 코딩 분석을 사용하여 다수의 신생항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 검출하였다. 멀티플렉스된 다중파라미터 유세포 분석법을 사용한 리콜 반응 검정을 이용하여 CD4+ T 세포 반응을 확인하고 검증하였다. IFN-γ 및 TNFα를 포함한 항염증성 사이토카인의 생성, 및 탈과립 마커로서 CD107a의 상향조절을 측정함으로써 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응의 기능을 평가하였다. 자연적으로 처리되고 제시된 항원에 대한 반응으로 표적 세포를 인식하고 사멸시키는 CD8+ T 세포 반응의 능력을 이해하기 위해 신생항원-발현 종양주를 사용한 세포독성 검정을 사용하였다. T 세포 상의 CD107a의 세포 표면 상향조절 및 신생항원 발현 종양 세포 상의 활성 카스파제3의 상향조절에 의해 세포독성을 측정하였다. 자극 프로토콜은 기존 CD8+ T 세포 반응의 확장뿐만 아니라 드 노보 CD8+ T 세포 반응 (표 10)의 유도에 성공적이었다
[표 10]
Figure pct00084
흑색종 환자로부터의 PBMC를 사용하여 출원인의 군에 의해 수행된 임상 연구에서, 기존 CD8+ T 세포 반응의 확장이 CD8+ T 세포의 4.5%에서 CD8+ T 세포의 72.1%로 관찰되었다 (SRSF1E>K). 더욱이, 자극 프로토콜은 환자 특이적 신생항원에 대한 두 가지 추정된 드 노보 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 데 효과적이었다 (예시적인 드 노보 CD8+ T 세포 반응: ARAP1Y>H: CD8+ T 세포의 6.5% 및 PKDREJG>R: CD8+ T세포의 13.4%: 자극 과정 전에 세포가 검출되지 않음). 자극 프로토콜은 또 다른 흑색종 환자 NV6으로부터의 PBMC를 사용하여 이전에 기재된 모델 및 신규 모델 신생항원 둘 다에 대해 7개의 드 노보 CD8+ T 세포 반응을 다양한 크기까지 성공적으로 유도하였다 (ACTN4K>N CSNK1A1S>L DHX40neoORF 7, GLI3P>L, QARSR>W, FAM178BP>L 및 RPS26P>L, 범위: CD8+ T 세포의 0.2%에서 CD8+ T 세포의 최대 52%). 게다가, 환자 특이적 신생항원에 대한 CD8+ 기억 T 세포 반응이 확장되었다 (AASDHneoORF, 자극 후 CD8+ T 세포의 최대 13%).
환자로부터 유도된 CD8+ T 세포를 보다 상세하게 특성화하였다. 돌연변이체 펩티드가 로딩된 DC로 재시험감염 직후, 신생항원 특이적 CD8+ T 세포는 1개, 2개 및/또는 3개 기능 모두를 나타냈다 (SRSF1E>K 및 ARAP1Y>H에 대해 각각 16.9% 및 65.5% 기능적 CD8+ pMHC+ T 세포. 상이한 농도의 신생항원 펩티드로 재시험감염시, 유도된 CD8+ T 세포는 돌연변이체 신생항원 펩티드에 유의하게 반응하였으나 야생형 펩티드에는 반응하지 않았다. 상기 환자에서, CD4+ T 세포 반응은 돌연변이체 신생항원이 로딩된 DC를 사용한 리콜 반응 분석을 사용하여 확인되었다. 돌연변이체 신생항원 펩티드가 로딩된 DC에 대한 반응성을 기반으로 세가지 CD4+ T 세포 반응이 확인되었다 (MKRN1S>L, CREBBPS>L 및 TPCN1K>E). 이들 CD4+ T 세포 반응은 돌연변이체 신생항원 펩티드로 재시험감염시 또한 다기능적 프로파일을 나타냈다. CD4+ T 세포의 31.3%, 34.5% 및 41.9%가 각각 MKRN1S>L, CREBBPS>L 및 TPCN1K>E 반응의 1개, 2개 및/또는 3개 기능을 나타냈다.
상기 환자로부터 유도된 CD8+ 반응의 세포독성 능력을 또한 평가하였다. SRSF1E>K 및 ARAP1Y>H 반응 둘 다 공동배양 후 돌연변이체 구축물로 형질도입된 종양 세포에 대한 활성 카스파제3 및 CD8+ T 세포에 대한 CD107a의 유의한 상향조절을 나타냈다.
자극 프로토콜을 사용하여, 예측된 환자 특이적 신생항원, 뿐만 아니라 모델 신생항원은, 환자 물질에서 다수의 신생항원 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응의 유도에 의해 면역원성인 것으로 확인되었다. 다기능적 및 돌연변이 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 유도하는 능력은 고품질 신생항원을 예측하고 강력한 T 세포 반응을 생성하는 능력을 입증한다. 자극 과정의 말미에 다중 풍부화된 신생항원 특이적 T 세포 집단 (기억 및 드 노보)의 존재는 새로운 T 세포 반응을 향상시키고 암 환자를 치료하기 위한 효과적인 암 면역 요법을 생성하는 능력을 입증한다.
T 세포 배양의 예시적인 재료를 하기에 제공한다:
재료: AIM V 배지 (인비트로겐)인간 FLT3L; 전임상 셀게닉스 #1415-050 스톡 50 ng/μL TNFα; 전임상 셀게닉스 #1406-050 스톡 10 ng/μL; IL-1β, 전임상 셀게닉스 #1411-050 스톡 10 ng/μL; PGE1 또는 알프로스타딜 - 체코 공화국으로부터의 캐이맨 스톡 0.5 μg/μL; R10 배지- RPMI 1640 글루타맥스 + 10% 인간 혈청+ 1% PenStrep; 20/80 배지- 18% AIM V + 72% RPMI 1640 글루타맥스 + 10% 인간 혈청 + 1% PenStrep; IL7 스톡 5 ng/μL; IL15 스톡 5 ng/μL; DC 배지 (셀게닉스); CD14 마이크로비드, 인간, 밀테니 #130-050-201, 사이토카인 및/또는 성장 인자, T 세포 배지 (AIM V + RPMI 1640 글루타맥스 + 혈청 + PenStrep), 펩티드 스톡 - 펩티드당 1 mM (HIV A02 - 5-10 펩티드, HIV B07- 5-10 펩티드, DOM - 4-8 펩티드, PIN - 6-12 펩티드).
SEQUENCE LISTING <110> NEON THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREPARING T CELL COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> 50401-744.601 <140> PCT/US2020/025796 <141> 2020-03-30 <150> 62/827,018 <151> 2019-03-30 <160> 1428 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Met Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg Val 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Leu Ala Asn Gly Arg Met Pro Thr Val 1 5 10 <210> 8 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu 50 55 60 <210> 9 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu 50 55 60 <210> 10 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu 50 55 60 <210> 11 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn 1 5 10 15 His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys 20 25 30 Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr 35 40 45 Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr 50 55 60 Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe 65 70 75 80 Glu Asp Ile His His Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser 85 90 95 Glu Asp Val Pro Met 100 <210> 12 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn 1 5 10 15 His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys 20 25 30 Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr 35 40 45 Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr 50 55 60 Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe 65 70 75 80 Glu Asp Ile His His Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser 85 90 95 Glu Asp Val Pro Met 100 <210> 13 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn 1 5 10 15 His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys 20 25 30 Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr 35 40 45 Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr 50 55 60 Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe 65 70 75 80 Ala Asp Ile Asn Leu Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser 85 90 95 Asp Asp Val Pro Met 100 <210> 14 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn 1 5 10 15 His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys 20 25 30 Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr 35 40 45 Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr 50 55 60 Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe 65 70 75 80 Ala Asp Ile Asn Leu Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser 85 90 95 Asp Asp Val Pro Met 100 <210> 15 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Ile Lys Glu Gly Ser Met Ser Glu Asp Glu Phe Ile Glu Glu Ala 1 5 10 15 Lys Val Met Met Asn Leu Ser His Glu Lys Leu Val Gln Leu Tyr Gly 20 25 30 Val Cys Thr Lys Gln Arg Pro Ile Phe Ile Ile Thr Glu Tyr Met Ala 35 40 45 Asn Gly Ser Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met Arg His Arg Phe Gln 50 55 60 Thr Gln Gln Leu Leu Glu Met Cys Lys Asp Val Cys Glu Ala Met Glu 65 70 75 80 Tyr Leu Glu Ser Lys Gln Phe Leu His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn 85 90 95 Cys Leu Val Asn Asp 100 <210> 16 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser 1 5 10 15 Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn 20 25 30 Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys 35 40 45 Ile Ile Arg Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val 50 55 60 Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg 65 70 75 80 Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp 85 90 95 Lys Cys Asn Leu Leu 100 <210> 17 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala 1 5 10 15 Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn 20 25 30 Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln 35 40 45 Leu Ile Met Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg 50 55 60 Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val 65 70 75 80 Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His 85 90 95 Arg Asp Leu Ala Ala 100 <210> 18 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Ala Asp Gly Leu Ile Thr Thr Leu His Tyr Pro Ala Pro Lys Arg 1 5 10 15 Asn Lys Pro Thr Val Tyr Gly Val Ser Pro Asn Tyr Asp Lys Trp Glu 20 25 30 Met Glu Arg Thr Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln 35 40 45 Tyr Gly Lys Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val 50 55 60 Ala Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu 65 70 75 80 Lys Glu Ala Ala Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln 85 90 95 Leu Leu Gly Val Cys 100 <210> 19 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Val Ala Asp Gly Leu Ile Thr Thr Leu His Tyr Pro Ala Pro Lys Arg 1 5 10 15 Asn Lys Pro Thr Val Tyr Gly Val Ser Pro Asn Tyr Asp Lys Trp Glu 20 25 30 Met Glu Arg Thr Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln 35 40 45 Tyr Gly Val Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val 50 55 60 Ala Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu 65 70 75 80 Lys Glu Ala Ala Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln 85 90 95 Leu Leu Gly Val Cys 100 <210> 20 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Leu Leu Gly Val Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr Glu 1 5 10 15 Phe Met Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg 20 25 30 Gln Glu Val Asn Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser 35 40 45 Ser Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asp Leu 50 55 60 Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val Ala 65 70 75 80 Asp Phe Gly Leu Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His 85 90 95 Ala Gly Ala Lys Phe 100 <210> 21 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Leu Thr Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val 1 5 10 15 Glu Glu Phe Leu Lys Glu Ala Ala Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro 20 25 30 Asn Leu Val Gln Leu Leu Gly Val Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr 35 40 45 Ile Ile Ile Glu Phe Met Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg 50 55 60 Glu Cys Asn Arg Gln Glu Val Asn Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala 65 70 75 80 Thr Gln Ile Ser Ser Ala Met Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile 85 90 95 His Arg Asp Leu Ala 100 <210> 22 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ser Thr Val Ala Asp Gly Leu Ile Thr Thr Leu His Tyr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Lys Arg Asn Lys Pro Thr Val Tyr Gly Val Ser Pro Asn Tyr Asp Lys 20 25 30 Trp Glu Met Glu Arg Thr Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly 35 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Ile Gly Val Ser Leu Gln Ser Leu Pro Arg Phe 35 40 45 Ile Leu Met Glu Leu Met Ala Gly Gly Asp Leu Lys Ser Phe Leu Arg 50 55 60 Glu Thr Arg Pro Arg Pro Ser Gln Pro Ser Ser Leu Ala Met Leu Asp 65 70 75 80 Leu Leu His Val Ala Arg Asp Ile Ala Cys Gly Cys Gln Tyr Leu Glu 85 90 95 Glu Asn His Phe Ile 100 <210> 25 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Ile Lys Leu Ile Asp Ile Ala Arg Gln Thr Ala Gln Gly Met Asp 1 5 10 15 Tyr Leu His Ala Lys Ser Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Ser Asn Asn 20 25 30 Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu 35 40 45 Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu Gln Leu 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala Pro Glu Val Ile Arg Met Gln Asp 65 70 75 80 Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asp Val Tyr Ala Phe Gly Ile Val 85 90 95 Leu Tyr Glu Leu Met 100 <210> 26 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Gly Phe Gly Asp Leu Lys Ser Pro Ala Gly Leu Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Asp Tyr Leu Ala Asp Lys Ser Tyr Ile Glu Gly Tyr Val Pro Ser Gln 20 25 30 Ala Asp Val Ala Val Phe Glu Ala Val Ser Gly Pro Pro Pro Ala Asp 35 40 45 Leu Cys His Ala Leu Arg Trp Tyr Asn His Ile Lys Ser Tyr Glu Lys 50 55 60 Glu Lys Ala Ser Leu Pro Gly Val Lys Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Pro Ala Asp Val Glu Asp Thr Thr Gly Ser Gly Ala Thr 85 90 <210> 27 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu Thr Gly 1 5 10 15 His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val Thr Gly 20 25 30 Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu Pro Asn 35 40 45 Leu Arg Met Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe Ala Ile 50 55 60 Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu Arg Gln 65 70 75 80 Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val Tyr Ile 85 90 95 Glu Lys Asn Asp Lys 100 <210> 28 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu Gln Gln Gln His Gln Arg 1 5 10 15 Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His 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Ala Asn Asp Leu Met Leu Ile 1 5 <210> 1407 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1407 Phe Gln Asn Ser Tyr Thr Ile Gly Leu 1 5 <210> 1408 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1408 Met Leu Ile Lys Leu Asp Glu Ser Val 1 5 <210> 1409 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1409 Val Leu Gln Cys Val Asn Val Ser Val 1 5 <210> 1410 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1410 Ile Leu Asn Asp Thr Gly Cys His Tyr Val 1 5 10 <210> 1411 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1411 Phe Gln Tyr Pro Glu Phe Ser Ile Glu Leu 1 5 10 <210> 1412 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1412 Ile Leu Gly Lys Tyr Gln Leu Asn Val 1 5 <210> 1413 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1413 Leu Leu Gly Asn Ser Val Asn Phe Thr Val 1 5 10 <210> 1414 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1414 Val Leu Asp Cys Cys Ile Ser Leu Leu 1 5 <210> 1415 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1415 Ile Leu Gly Ser Phe Glu Leu Gln Leu 1 5 <210> 1416 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 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1423 Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu 1 5 10 <210> 1424 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <400> 1424 Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys 1 5 10 <210> 1425 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <400> 1425 Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys 1 5 10 <210> 1426 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <400> 1426 Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu 1 5 <210> 1427 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1427 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 <210> 1428 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1428 Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser 1 5 10 15 Ala Leu Thr Ile 20

Claims (76)

  1. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 에피토프 서열의 라이브러리로부터 적어도 하나의 에피토프 서열을 선택하는 단계로서, 여기서 라이브러리의 각각의 에피토프 서열은 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 매칭되는 것인 단계; 및
    (b) 대상체로부터의 T 세포 또는 동종이계 T 세포를 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 항원 제시 세포 (APC)와 접촉시키는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 각각은 하기 기준:
    (i) 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다,
    (ii) 면역원성 검정에 따라 면역원성이다,
    (iii) 질량 분석법 검정에 따라 APC에 의해 제시된다, 그리고
    (iv) T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극한다
    중 적어도 2개 또는 3개를 충족하는 것인 단계
    를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열은 돌연변이를 포함하고 방법은 돌연변이를 가진 에피토프를 코딩하도록 대상체의 암 세포를 확인하는 단계를 포함하거나;
    (b) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열은 대상체의 암 세포에 의해 과발현되는 단백질 내에 있고 방법은 에피토프를 함유하는 단백질을 과발현하도록 대상체의 암 세포를 확인하는 단계를 포함하거나; 또는
    (c) 적어도 하나의 에피토프 서열은 종양 미세환경에서 세포에 의해 발현되는 단백질을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상이 대상체의 암 세포에 의해 발현되지 않는 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 대상체의 암 세포에 의해 발현되지 않는 에피토프가 대상체의 종양 미세환경에서 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 에피토프가 결합 검정에 따라 500 nM 이하의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC 분자에 결합하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 에피토프가 컴퓨터 상에 구현되는 MHC 에피토프 예측 프로그램을 사용하여 500 nM 이하의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC 분자에 결합하는 것으로 예측되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시되는 에피토프가 15 Da, 10 Da 또는 5 Da 미만, 또는 10,000 또는 5,000 백만분율 (ppm) 미만일 검출된 펩티드의 질량 정확도로 APC로부터 용리 후 질량 분석법에 의해 검출되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 검정에 따라 면역원성인 에피토프가 다량체 검정 또는 기능적 검정에 따라 면역원성인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 다량체 검정이 유세포 분석법 분석을 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 다량체 검정이 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 및 매칭된 HLA 대립유전자를 포함하는 펩티드-MHC 다량체에 결합된 T 세포를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 에피토프가, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 세포의 적어도 0.1% 또는 0.01% 또는 0.005%를 구성하고, (iii) CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 에피토프가, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 동일한 출발 샘플로부터 6개 자극 중 적어도 하나에서 검출되는 경우, 다량체 검정에 따라 면역원성인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 대조군 샘플이 (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하지 않거나, (ii) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열과 상이한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하거나, 또는 (iii) 무작위 서열을 가진 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 7, 18, 19, 20 또는 그 초과의 일 동안 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 것인 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 특이적 T 세포가 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC의 존재 하에 적어도 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 500배 또는 1,000배 또는 그 초과로 확장된 것인 방법.
  16. 제8항에 있어서, 기능적 검정이 면역검정을 포함하는 것인 방법.
  17. 제8항 또는 제16항에 있어서, 기능적 검정이 IFNγ 또는 TNFα의 세포내 염색 또는 CD107a 및/또는 CD107b의 세포 표면 발현으로 T 세포를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 T 세포는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 에피토프가, (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 적어도 10개의 T 세포가 검출되고, (ii) 검출된 T 세포가 분석된 CD8+ 또는 CD4+ 세포의 적어도 0.1% 또는 0.01% 또는 0.005%를 구성하고, (iii) CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율이 대조군 샘플에서 검출된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 검출된 T 세포의 백분율보다 더 높은 경우, 기능적 검정에 따라 면역원성인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극된 T 세포가 에피토프를 제시하는 세포를 사멸시키는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 T 세포인 방법.
  20. 제19항에 있어서, T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하는 세포의 수가 T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하지 않는 세포의 수보다 적어도 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500, 또는 1,000배 더 높은 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하는 세포의 수가 (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 함유하는 펩티드를 포함하지 않거나, (ii) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열과 상이한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하거나, 또는 (iii) 무작위 서열을 가진 펩티드를 포함하는 APC로 자극된 T 세포에 의해 사멸되는 에피토프를 제시하는 세포의 수보다 적어도 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500, 또는 1,000배 더 높은 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, T 세포에 의해 사멸되는 돌연변이체 에피토프를 제시하는 세포의 수가 T 세포에 의해 사멸되는 상응하는 야생형 에피토프를 제시하는 세포의 수보다 적어도 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500, 또는 1,000배 더 높은 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극된 T 세포가 세포독성 검정에 따라 특이적으로 세포독성이 되도록 자극된 T 세포인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 순환 종양 DNA 검정 또는 유전자 패널을 사용하여 대상체를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, T 세포가 대상체로부터의 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플 또는 대상체로부터의 성분채집술 샘플 또는 대상체로부터의 백혈구성분채집술 샘플로부터의 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 동종이계 T 세포인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 각각이 하기 기준:
    (i) 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다,
    (ii) 면역원성 검정에 따라 면역원성이다,
    (iii) 질량 분석법 검정에 따라 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시된다, 그리고
    (iv) T 세포를 세포독성 검정에 따라 세포독성이 되도록 자극한다
    각각을 충족하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 펩티드 중 적어도 하나가, 합성된 펩티드 또는 핵산 서열로부터 발현된 펩티드인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하거나 대상체의 게놈에서 HLA 대립유전자를 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열이 표 1A 내지 표 1F, 표 2A 내지 표 2C, 표 3, 표 4A-4M, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 11, 표 12, 표 13 및 표 14의 하나 이상의 에피토프 서열로부터 선택된 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 또는 생체외에서 하나 이상의 펩티드와 접촉된 T 세포를 확장시켜 MHC 단백질과 복합체를 형성하는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열에 특이적인 T 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질이 대상체의 암 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질이 대상체의 종양 미세환경에서 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상이 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상이 대상체의 암 세포에 의해 과발현되는 단백질로부터의 것, 조직 특이적 단백질로부터의 것, 암 고환 단백질로부터의 것, 드라이버 돌연변이를 포함하는 것, 약물 내성 돌연변이를 포함하는 것, 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 것, 바이러스 에피토프인 것, 부 조직적합성 에피토프인 것, RAS 단백질로부터의 것, GATA3 단백질로부터의 것, EGFR 단백질로부터의 것, BTK 단백질로부터의 것, p53 단백질로부터의 것, TMPRSS2::ERG 융합 폴리펩티드로부터의 것 또는 Myc 단백질로부터의 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 하나가 ANKRD30A, COL10A1, CTCFL, PPIAL4G, POTEE, DLL3, MMP13, SSX1, DCAF4L2, MAGEA4, MAGEA11, MAGEC2, MAGEA12, PRAME, CLDN6, EPYC, KLK3, KLK2, KLK4, TGM4, POTEG, RLN1, POTEH, SLC45A2, TSPAN10, PAGE5, CSAG1, PRDM7, TG, TSHR, RSPH6A, SCXB, HIST1H4K, ALPPL2, PRM2, PRM1, TNP1, LELP1, HMGB4, AKAP4, CETN1, UBQLN3, ACTL7A, ACTL9, ACTRT2, PGK2, C2orf53, KIF2B, ADAD1, SPATA8, CCDC70, TPD52L3, ACTL7B, DMRTB1, SYCN, CELA2A, CELA2B, PNLIPRP1, CTRC, AMY2A, SERPINI2, RBPJL, AQP12A, IAPP, KIRREL2, G6PC2, AQP12B, CYP11B1, CYP11B2, STAR, CYP11A1, 및 MC2R로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의해 코딩되는 단백질로부터의 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 적어도 하나가 표적 조직과 상이한 복수의 비표적 조직의 각각의 조직에서 조직 특이적 단백질의 발현 수준보다 적어도 2배 더 초과인 대상체의 표적 조직에서의 발현 수준을 갖는 조직 특이적 단백질로부터의 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 T 세포 또는 동종이계 T 세포를 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드와 접촉시키는 단계가 T 세포를 에피토프를 제시하는 APC와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 에피토프를 제시하는 APC가 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드 또는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 코딩하는 다중핵산을 포함하는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포 (APC) 및 T 세포를 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD14+ 세포 및 CD25+ 세포를 고갈시켜, APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서,면역 세포의 집단이 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 것인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, (b) APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을
    (i) FMS 유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드 (FLT3L), 및
    (ii) (A) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (B) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
    의 존재 하에 제1 기간 동안 인큐베이션하여, 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, (c) 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 확장시켜, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 종양 항원 특이적 T 세포는 (i) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 및 (ii) 대상체의 암 세포 또는 APC에 의해 발현되는 MHC 단백질을 포함하는 복합체에 특이적인 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)가 28일 미만 내에 수행되는 것인 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD8+ T 세포의 총 수의 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율이 생물학적 샘플에서 CD8+ T 세포의 총 수의 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율보다 적어도 2배 더 높은 것인 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD4+ T 세포의 총 수의 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율이 생물학적 샘플에서 CD4+ T 세포의 총 수의 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포의 분율보다 적어도 2배 더 높은 것인 방법.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD8+ T 세포의 적어도 0.1%가 나이브 CD8+ T 세포로부터 유래된 CD8+ 종양 항원 특이적 T 세포인 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단에서 CD4+ T 세포의 적어도 0.1%가 나이브 CD4+ T 세포로부터 유래된 CD4+ 종양 항원 특이적 T 세포인 방법.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 확장시키는 단계가,
    (A) 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 성숙한 APC의 제2 집단과 접촉시키는 단계로서, 여기서 성숙한 APC의 제2 집단은
    (i) FLT3L과 함께 인큐베이션되었고
    (ii) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 제시하는 것인 단계; 및
    (B) 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 제2 기간 동안 확장시켜, T 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 성숙한 APC의 제2 집단이, 자극된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 성숙한 APC의 제2 집단과 접촉시키기 전에 적어도 1일 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션된 것인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 확장시키는 단계가 (C) T 세포의 확장된 집단을 성숙한 APC의 제3 집단과 접촉시키는 단계로서, 여기서 성숙한 APC의 제3 집단은 (i) FLT3L과 함께 인큐베이션되었고 (ii) 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 제시하는 것인 단계; 및 (D) T 세포의 확장된 집단을 제3 기간 동안 확장시켜, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 성숙한 APC의 제3 집단이 T 세포의 확장된 집단을 성숙한 APC의 제3 집단과 접촉시키기 전에 적어도 1일 동안 FLT3L과 함께 인큐베이션된 것인 방법.
  55. 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 말초 혈액 샘플, 백혈구성분채집술 샘플 또는 성분채집술 샘플인 방법.
  56. 제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 수확하는 단계, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 냉동보존하는 단계 또는 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 함유하는 약학 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  57. 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션하는 단계가 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 CD14/CD25 고갈된 집단을 FLT3L 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 존재 하에 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  58. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원 특이적 T 세포를 포함하는 세포의 확장된 집단을 포함하는 약학 조성물을 암을 가진 인간 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 암을 가진 인간 대상체가 그로부터 생물학적 샘플을 수득한 인간 대상체인 방법.
  60. 제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 길이가 8 내지 50개의 아미노산인 방법.
  61. 제42항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 선택된 에피토프 서열 중 적어도 2개를 포함하고, 각각은 암을 가진 인간 대상체의 암 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  62. 제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 고갈시키는 단계가 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD19+ 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  63. 제42항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 고갈시키는 단계가 APC 및 T 세포의 제1 집단을 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 CD11b+ 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 수득된 암 세포를 포함하는 제1 생물학적 샘플로부터 암 세포 핵산을 생성하는 단계 및 동일한 대상체로부터 수득된 비암 세포를 포함하는 제2 생물학적 샘플로부터 비암 세포 핵산을 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질이 HLA-A01:01, HLA-A02:01, HLA-A03:01, HLA-A11:01, HLA-A24:01, HLA-A30:01, HLA-A31:01, HLA-A32:01, HLA-A33:01, HLA-A68:01, HLA-B07:02, HLA-B08:01, HLA-B15:01, HLA-B44:03, HLA-C07:01 및 HLA-C07:02로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질인 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하고 대상체의 암 세포에 의해 발현되는 하나 또는 둘 이상의 상이한 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하고 암 세포에서 하나 또는 둘 이상의 상이한 단백질을 코딩하는 RNA의 수준을 측정함으로써 대상체의 암 세포에 의해 발현되는 하나 또는 둘 이상의 상이한 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상이 8 내지 12개의 아미노산의 길이를 갖는 것인 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열 중 하나 이상이 13 내지 25개의 아미노산의 길이를 갖는 것인 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여하기 전에 T 세포의 확장된 집단으로부터 세포의 하나 이상의 하위집단을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 배양물에서 면역 반응을 도출하는 단계가 펩티드와의 접촉시 T 세포 배양물로부터 사이토카인 또는 IL2 생산을 유도하는 것을 포함하고, 여기서 사이토카인은 인터페론 감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자 (TNF) 알파 (α) 및/ 또는 베타 (β) 또는 그의 조합인 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 검정에 따라 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열이 로딩된 세포 또는 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질을 발현하는 암 세포에 대해 세포독성이 되도록 T 세포를 자극하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 검정에 따라 적어도 하나의 선택된 에피토프 서열을 포함하는 단백질을 발현하는 암 연관 세포에 대해 세포독성이 되도록 T 세포를 자극하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 선택된 에피토프가 암 세포에 의해 발현되고, 추가 선택된 에피토프가 암 연관 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 추가 선택된 에피토프가 암 연관 섬유모세포 상에서 발현되는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 추가 선택된 에피토프가 표 8로부터 선택된 것인 방법.
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