JP2018515588A - 個別化送達ベクターに基づく免疫療法とその使用 - Google Patents
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本発明は治療用免疫療法送達ベクターをはじめとする疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法組成物を提供および作成する系、および1つ以上のネオエピトープと関連するペプチド、または対象の癌もしくは非健常に特異的な突然変異を含むペプチドを発現する遺伝子発現コンストラクトを含む同組成物の作製方法を提供する。本発明の送達ベクターにはリステリア細菌ベクターをはじめとする細菌ベクター、またはウイルスベクター、ペプチド免疫療法ベクター、またはDNA免疫療法ベクターが含まれ、そのベクターは対象より獲得された疾患担持生体試料に存在する1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含む1つ以上の融合タンパク質を備える。本発明は、腫瘍もしくは癌、または感染症、または自己免疫疾患もしくは臓器移植拒絶反応をはじめとする前記対象における疾患または症状に対する免疫応答を誘導するための同組成物の使用方法も提供する。【選択図】図1
Description
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本出願は、2015年5月26日に出願された米国特許出願番号第62/166591号、2015年6月12日に出願された米国特許出願番号第62/174692号、および2015年9月15日に出願された米国特許出願番号第62/218936号の利益を請求し、それらの特許出願のそれぞれの全体が全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
本出願は、2015年5月26日に出願された米国特許出願番号第62/166591号、2015年6月12日に出願された米国特許出願番号第62/174692号、および2015年9月15日に出願された米国特許出願番号第62/218936号の利益を請求し、それらの特許出願のそれぞれの全体が全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
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本発明は治療用免疫療法送達ベクターをはじめとする疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法組成物、および1つ以上のネオエピトープと関連するペプチド、または対象の癌もしくは非健常に特異的な突然変異を含むペプチドを発現する遺伝子発現コンストラクトを含む同組成物の作製方法を提供する。本発明の送達ベクターには細菌ベクター、またはウイルスベクター、ペプチド免疫療法ベクター、またはDNA免疫療法ベクターが含まれ、対象より獲得された疾患担持生体試料に存在する1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含む1つ以上の融合タンパク質を備えるリステリア細菌ベクターが含まれる。本発明は、腫瘍もしくは癌、または感染症、または自己免疫疾患もしくは臓器移植拒絶反応をはじめとする前記対象における疾患または症状に対する免疫応答を誘導するための同組成物の使用方法も提供する。
個別化医療の前には特定のタイプおよびステージの癌を有する大半の患者が同じ治療を受けた。しかしながら、ある特定の患者にはよく効くが、他の患者には同様には効かない治療があることが医師と患者に明らかになってきた。したがって、特定の腫瘍に効果がある有効な個別免疫治療を開発する必要が存在する。個別化治療戦略は、標準的な治療で予期されるものよりも個体にとって有効であり、且つ、副作用を起こすことが少ないものであり得る。
腫瘍は人のDNAの突然変異に起因して発生し、その突然変異は、宿主によって産生される対応する正常タンパク質には存在しない潜在的なネオエピトープを含む変異型タンパク質または異常型タンパク質を産生する原因となり得る。これらのネオエピトープの中にはT細胞応答を刺激し、且つ、免疫系による初期の癌細胞の破壊を仲介して癌の臨床エビデンスを発生させないことができるものもある。しかしながら定着癌の場合ではその免疫応答は不充分である。癌における天然配列腫瘍関連バイオマーカー、過剰発現バイオマーカー、または不適切発現バイオマーカーを標的とする治療的免疫療法の開発に関する大量のデータが生成されている。しかしながら、これらの治療法に関連する明らかな臨床上の利益を実証することは極めて難しいことが示されており、本出願を作文している時点ではFDAによって認可された治療的免疫療法はたった1件である。このことの主な理由は、全ての個体に生じる中枢性トレランスの一部として、天然配列ペプチドに対して高い結合親和性を有するあらゆるT細胞が自己抗原として認識され、自己免疫を防ぐためにこれらの自己反応性クローンが幼児期に胸腺によって除去されるか、または他には寛容機構を介して不活化されることである。
ネオエピトープは、晩年に生じるDNAの変異、例えば、獲得突然変異、またはある特定の細胞のDNA内の変異によって起こるゲノム変異により生じる疾患に関連するタンパク質内に存在する潜在的に免疫原性のエピトープである。例えば癌では特定の「ネオエピトープ」が獲得DNA異常を保持しない(同じ個体の)細胞に関連する対応する正常タンパク質内には存在せず、そのDNA異常によりそのネオエピトープが病気になっていない、または中に疾患担持組織を含んでいない対象細胞において発現される。ネオエピトープを特定することは困難であり得るが、しかしながらネオエピトープを特定し、それらを標的とする治療法を開発することは個別化治療戦略内で使用するために有利になる。特定の獲得DNA異常は患者の特定の疾患細胞ならびにそれらの免疫系が認識する可能性がある特定のエピトープの両方にとって非常に個別的である。これらの因子は人毎に異なるので、前癌状態のような疾患を持つ人に生じる数千になり得る複数のネオエピトープを標的とするために個別化アプローチを用いることが必要である。
リステリア・モノサイトゲネス(Lm)は、リステリア症の原因となるグラム陽性の通性細胞内病原体である。その細胞内生活環においてLmは食作用によって、または非食細胞の能動的侵入によって宿主細胞に侵入する。内在化に続いてLmは膜結合ファゴソーム/液胞からのその脱出を幾つかの細菌病原性因子、主に宿主細胞の細胞質へのその細菌の侵入を可能にする孔形成性タンパク質であるリステリオリジンO(LLO)の分泌によって媒介することができる。細胞質中でLmは複製し、細菌性アクチン重合タンパク質(ActA)と他の病原性因子によって促進される移動性に基づいて隣接する細胞に広がる。細胞質内でLm分泌タンパク質、および最終的にはLm構造タンパク質はプロテアソームによって分解され、そして小胞体内のMHCクラスI分子結合し得るペプチドへとプロセッシングを受ける。これらのMHCペプチド複合体は細胞表面に輸送され、そして標的特異的T細胞に提示され、且つ、標的特異的T細胞によって認識され得る。この特有の特徴により、腫瘍抗原がMHCクラスI分子によって提示されて腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を活性化することができるという点でLmは大変魅力的なT細胞生成ベクターとされる。CTLは、癌細胞または細胞内感染を有する細胞のような体内の他の細胞を殺す主標的特異的エフェクター細胞である。
加えて、Lmは一度内在化されるとファゴリソソーム区画においてもプロセッシングを受け、MHCクラスII上のそのペプチドによって癌細胞または感染細胞の標的指向型殺滅についてCTLを支援し得る抗原特異的CD4−T細胞応答が生成され得る。
加えて、そのベクターは生きた細菌であるのでその組成物は、PAMP、DAMPS、およびTLRをはじめとする幾つかの細胞外分子パターン受容体、細胞内分子パターン受容体、および細胞質分子パターン受容体を含む、自然免疫の多数のトリガーを刺激し得る。例えば、核オリゴマー化ドメイン様受容体によるペプチドグリカンの認識、およびDNAであるAIM2およびSTINGによるLm DNAの認識により炎症カスケードおよび免疫調節カスケードが活性化される。この炎症性応答とMHC IおよびMHC II経路への抗原の効率的な送達との組合せがLmを腫瘍の治療、腫瘍に対する保護、および腫瘍に対する免疫応答の誘導における強力な免疫療法的ベクターとしている。
T細胞応答を追加的に刺激し、そして他の治療法と併用されてもよいリステリアベースの免疫療法ベクターの一構成要素として対象の癌に特異的なネオエピトープをターゲティングすることにより、対象の癌に対して個別化されており、且つ、その癌の治療に有効でもある免疫療法が提供され得る。免疫原性の高いペプチド抗原の標的ペプチドへの融合によりその標的抗原の免疫原性、または寛容機構を逃れていたT細胞を刺激する免疫療法の能力を著しく高めることができ、それは免疫療法として特定の可能性を有し得る。
本発明は個別免疫療法組成物、および対象の異常または非健常組織内の潜在的なネオエピトープをターゲティングするためのその使用法を提供し、その免疫療法は、これらのネオエピトープを標的とする免疫応答を増強するために前記ネオエピトープを含むペプチドおよび/または融合ポリペプチドを発現するための送達および免疫療法ベクターとしての組換え型リステリア免疫療法の使用を含む。作成されるそれらの個別免疫療法は対象における疾患、例えば癌を効果的に治療し、予防し、寿命を延ばし、またはその疾患の発生率を低下させることができる。さらに、本発明の組換え型リステリアは他の抗疾患療法または抗癌療法と効果的に併用され得る。
1つの態様では本発明は、疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
a. 弱毒化リステリア株送達ベクター、および
b. 前記リステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープまたは潜在的なネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含み、
前記ベクターで前記リステリア株を形質転換することにより前記対象の疾患または症状を標的とした個別免疫療法系が作成される前記系に関する。
a. 弱毒化リステリア株送達ベクター、および
b. 前記リステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープまたは潜在的なネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含み、
前記ベクターで前記リステリア株を形質転換することにより前記対象の疾患または症状を標的とした個別免疫療法系が作成される前記系に関する。
1つの態様では本発明は、疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
a. 送達ベクター、および所望により
b. 前記送達ベクターを形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含む前記系に関する。
a. 送達ベクター、および所望により
b. 前記送達ベクターを形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含む前記系に関する。
関連の態様では前記送達ベクターは細菌性送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはウイルスベクター送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはペプチド免疫療法送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはDNAプラスミド免疫療法送達ベクターを含む。
関連の態様では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、または腫瘍、または癌、または異型細胞もしくは組織を含む。別の態様では治療としての生きた弱毒化免疫療法薬品の人への投与により惹起される自然免疫応答によって適応免疫応答が促進および増強される。別の関連の態様ではその免疫応答は適応免疫応答である。さらに別の関連の 態様ではその 免疫応答 はT細胞 免疫応答である。別の関連の態様では弱毒化組換え型リステリアが培養され、凍結保存され、所望により凍結乾燥およびスプレー乾燥され、そして前記対象に対する治療形態として単独で投与されるか、またはそれらの疾患に対して有益な可能性がある他の治療法と併用投与される。その治療には反復投与が含まれ得る。
別の態様では本発明は、疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
a. 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを前記比較により特定するステップ、
b. 免疫原性応答向けの前記1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをスクリーニングするステップ、
c. 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、
d. および二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を前記対象に投与し、免疫原性組成物の一部として前記弱毒化組換え型リステリア株を投与するステップを含む前記方法に関する。
a. 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを前記比較により特定するステップ、
b. 免疫原性応答向けの前記1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをスクリーニングするステップ、
c. 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、
d. および二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を前記対象に投与し、免疫原性組成物の一部として前記弱毒化組換え型リステリア株を投与するステップを含む前記方法に関する。
関連の態様では本発明は次のもの、すなわち、
a. 本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドに融合された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子、または
b. キメラタンパク質をコードする第1オープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質が
i. 細菌分泌シグナル配列、
ii. ユビキチン(Ub)タンパク質、
iii. 本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含み、且つ、
(i)〜(iii)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドが機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている前記核酸コンストラクトを含む組換え弱毒化リステリア株に関する。
a. 本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドに融合された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子、または
b. キメラタンパク質をコードする第1オープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質が
i. 細菌分泌シグナル配列、
ii. ユビキチン(Ub)タンパク質、
iii. 本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含み、且つ、
(i)〜(iii)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドが機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている前記核酸コンストラクトを含む組換え弱毒化リステリア株に関する。
関連の態様では前記細菌性配列はリステリア配列であり、幾つかの実施形態では前記リステリア配列はhlyシグナル配列またはactAシグナル配列である。
別の関連の態様では本発明は、本明細書において提供される弱毒化組換え型リステリア株、および薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物に関する。
別の関連の態様では前記組成物は1つ以上の弱毒化リステリア株を含み、各弱毒化リステリア株が1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上の異なるペプチドを発現する。別の態様では各弱毒化リステリアは一連のネオエピトープを発現する。
関連の態様では本明細書において提供される前記方法により疾患または症状を有する前記対象における個別化増強抗疾患免疫応答、すなわち、抗感染症免疫応答、抗自己免疫疾患免疫応答、抗臓器移植拒絶反応免疫応答、または抗腫瘍もしくは抗癌免疫応答の生成が可能になる。
別の関連の態様では本明細書において提供される前記方法により対象における前記疾患、すなわち、前記感染症、前記自己免疫疾患、前記臓器移植拒絶反応、または前記腫瘍もしくは癌の個別化治療または予防が可能になる。
別の関連の態様では本明細書において提供される前記方法により前記疾患または症状、すなわち、前記感染症、または前記自己免疫疾患、または前記臓器移植拒絶反応、または前記腫瘍もしくは癌を有する前記対象の生存時間が増加する。
1つの態様では本発明は、1つ以上の個別化ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列を備える組換え型弱毒化リステリア株であって、前記ネオエピトープが疾患または症状を有する対象の前記疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記リステリア株に関する。
1つの態様では本発明は、疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって (a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、(b)(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、所望により、(c)前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である前記1つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、(d)(c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および(e)前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法に関する。
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、(a)疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、(b) (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、または(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、(c)前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、(d)(c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および(e)前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または(c)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法。
1つの態様では本発明は、(a)本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドに融合された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子、または(b)キメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質が (i)細菌分泌シグナル配列、(ii)ユビキチン(Ub)タンパク質、(iii)本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含み、且つ、(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチンおよび1つ以上のペプチドが機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている前記コンストラクトを含む組換え型弱毒化リステリア株であって、
前記ネオエピトープが疾患または症状を有する対象の前記疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記リステリア株に関する。
前記ネオエピトープが疾患または症状を有する対象の前記疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記リステリア株に関する。
関連の態様では前記疾患または症状を有する対象への前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした免疫応答が生じる。
関連の態様では前記株は前記対象の疾患または症状を標的とした前記対象向けの個別免疫療法ベクターである。
関連の態様では前記ネオエピトープ配列は腫瘍特異的、転移癌特異的、細菌感染症特異的、ウイルス感染症特異的、およびそれらのあらゆる組合せである。
関連の態様では1つ以上のネオエピトープが約5個から50個の間のアミノ酸を含む。
関連の態様では前記疾患担持組織または細胞のエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて前記ネオエピトープが決定される。
関連の態様では免疫抑制性エピトープについて1つ以上のネオエピトープがスクリーニングされ、免疫抑制性エピトープが前記核酸分子から除外される。
関連の態様では1つ以上のネオエピトープが前記リステリア株に応じて発現および分泌に関してコドンを最適化される。
関連の態様では1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している。
関連の態様では前記免疫原性ポリペプチドは変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、ActA−PEST2(LA−242)融合体、またはPESTアミノ酸配列である。
関連の態様では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、または、腫瘍もしくは癌、または異形成症である。
関連の態様では前記感染症はウイルス感染症または細菌感染症を含む。
関連の態様では1つ以上のネオエピトープは感染症関連特異的エピトープを含む。
関連の態様では前記弱毒化リステリアは1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む。
関連の態様では前記リステリア株は1つ以上の免疫調節性分子をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトをさらに備える。
関連の態様では個別免疫療法組成物は上記のいずれかにおいて開示される1つ以上のリステリア株を含む。
関連の態様では個別免疫療法組成物により1つ以上のネオエピトープを標的とする免疫応答が誘発される。
関連の態様では前記組成物は前記リステリア株の混合物を含み、その混合物は同日に投与される複数の前記ネオエピトープを含む。
関連の態様では前記混合物は異なる日に投与される、または交互の順序で投与される複数の前記リステリア株を含み、異なる日に投与される前記混合物は複数の前記ネオエピトープを含む。
関連の態様では前記組成物は前記リステリア株の混合物を含み、その混合物は同日に投与される複数の前記ネオエピトープを含む。
関連の態様では前記混合物は本系において発現し得る前記患者において特定された全ての前記ネオエピトープを含む。
関連の態様では前記混合物はクローン性と記載される全て、または複数の前記ネオエピトープを含む。
関連の態様では前記混合物はRNAシーケンシングに基づくトランスクリプトームにおいても示される全て、または複数の前記ネオエピトープを含む。
関連の態様では前記組成物は、各株が少なくとも1つの特有の前記ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む前記核酸コンストラクトを備える複数の前記リステリア株の混合物を含む。
関連の態様では前記組成物は前記リステリア株の混合物を含み、前記混合物は複数の前記ネオエピトープを含む。
関連の態様では前記混合物は最大で約500個のネオエピトープを含む。
関連の態様では前記混合物は、1つ以上のエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備える1つ以上の組換え型弱毒化リステリア株送達ベクターをさらに含み、前記エピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含み、前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした免疫療法が発生する。
関連の態様では上記のいずれかにおいて開示される組成物はアジュバントをさらに含む。
関連の態様では前記対象への前記組成物の投与により前記対象における個別化増強抗疾患または抗症状免疫応答が生じる。
本発明の関連の態様ではDNA免疫療法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物を含む。
本発明の関連の態様ではペプチド免疫療法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物を含む。
本発明の関連の態様では本発明の医薬組成物は上記のいずれかにおいて開示される免疫療法または個別免疫療法組成物と医薬担体を含む。
本発明の関連の態様では前記疾患または症状を有する対象の疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する少なくとも1つのネオエピトープに対する免疫応答の誘導方法は、上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
本発明の関連の態様では疾患または症状を有する対象における標的とされる免疫応答の誘導方法は上記のいずれかにおいて記載される免疫原性組成物または免疫療法を前記対象に投与することを含み、前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした個別免疫療法が発生する。
本発明の関連の態様では対象において疾患または症状を治療、抑止、または抑制する方法は、前記疾患または症状を標的とするために上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を投与するステップを含む。
さらに別の実施形態では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、腫瘍、または癌である。
本発明の関連の態様では対象のリンパ組織または体循環、および腫瘍、または疾患もしくは異型組織内の制御性T細胞(Treg)に対するTエフェクター細胞の比率であって、対象の疾患または症状を担持する組織内に存在するネオエピトープを標的としている前記Tエフェクター細胞の比率を上げる方法は、上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
本発明の関連の態様では、抗原またはそのペプチド断片が1つ以上のネオエピトープを含む、その抗原に特異的なT細胞を対象において増加させるための方法は、上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
本発明の関連の態様では腫瘍を有するか、または癌を患う対象、または感染症を患う対象の生存時間の増加方法は、上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
本発明の関連の態様では対象の癌からの予防方法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
本発明の関連の態様では対象における癌発症の抑制または遅延化方法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
本発明の関連の態様では対象における腫瘍または転位の減少化方法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
本発明の関連の態様では対象の感染症からの予防方法は上記のいずれかにおいて記載される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
本発明の別の実施形態によると、上記の方法であって、前記個別免疫療法組成物を作製するステップを追加として含み、前記作製が、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答の生成を生じさせるステップ、所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である1つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) 1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するためにその第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいはその第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が開示される。
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答の生成を生じさせるステップ、所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である1つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) 1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するためにその第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいはその第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が開示される。
1つの実施形態では本発明は、本明細書において開示される方法により作製された1つ以上の組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物に関する。別の実施形態では前記混合物中の前記リステリアの各々が1つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む。別の実施形態では前記混合物中の各リステリアは1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを発現する。別の実施形態では各混合物は1〜5株、5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の組換え型リステリア株を含む。
1つの実施形態では本発明は、対象における抗腫瘍応答の誘発方法であって、本明細書において開示される免疫原性混合物組成物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法に関する。別の実施形態では対象において腫瘍を予防または治療する方法であって、本明細書において開示される組成物の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法が本明細書において開示される。1つの実施形態では本発明は次の要素、すなわち、N末端短縮型LLO(tLLO)が融合している第1ネオエピトープアミノ酸配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第1ネオエピトープAA配列に連結されている第2ネオエピトープAA配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第2ネオエピトープAA配列に連結されている少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列、およびリンカー配列を介して機能的であるようにC末端ヒスチジンタグに連結している最後のネオエピトープを含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクトに関する。
別の実施形態では本発明は、対象向けの個別免疫療法を作成するための系であって、少なくとも1つの処理装置、および前記処理装置により実行されるプログラム命令を含む少なくとも1つの記憶媒体を含み、前記プログラム命令によって前記処理装置が次のこと、すなわち、
a. 全ての新抗原および前記対象のヒト白血球抗原(HLA)タイプを含む出力データを受信すること、
b. 各エピトープの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるエピトープを除外すること、
c. 対象HLAに結合する残りの新抗原の能力、およびそれらの新抗原の予想MHC結合スコアに基づいてそれらの新抗原を数値により評価すること、
d. 各エピトープのアミノ酸配列をプラスミドに挿入すること、
e. 各コンストラクトの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるあらゆるコンストラクトを除外すること、
f. 最も高いスコアになったコンストラクトから開始して、各コンストラクトのアミノ酸配列を対応するDNA配列に翻訳すること、
g. 所定の上限に達するまでランク順に前記プラスミドコンストラクトに追加のエピトープを挿入すること、
h. 対象における免疫治療応答を測定するために前記コンストラクトの末端にDNA配列タグを付加すること、および
i. リステリア・モノサイトゲネスにおける発現および分泌のために前記エピトープおよびDNA配列タグを最適化すること、を含むステップを実行することになる前記系に関する。
a. 全ての新抗原および前記対象のヒト白血球抗原(HLA)タイプを含む出力データを受信すること、
b. 各エピトープの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるエピトープを除外すること、
c. 対象HLAに結合する残りの新抗原の能力、およびそれらの新抗原の予想MHC結合スコアに基づいてそれらの新抗原を数値により評価すること、
d. 各エピトープのアミノ酸配列をプラスミドに挿入すること、
e. 各コンストラクトの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるあらゆるコンストラクトを除外すること、
f. 最も高いスコアになったコンストラクトから開始して、各コンストラクトのアミノ酸配列を対応するDNA配列に翻訳すること、
g. 所定の上限に達するまでランク順に前記プラスミドコンストラクトに追加のエピトープを挿入すること、
h. 対象における免疫治療応答を測定するために前記コンストラクトの末端にDNA配列タグを付加すること、および
i. リステリア・モノサイトゲネスにおける発現および分泌のために前記エピトープおよびDNA配列タグを最適化すること、を含むステップを実行することになる前記系に関する。
以下の発明を実施するための形態、実施例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、この発明を実施するための形態より本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が当業者に明らかとなるので、この発明を実施するための形態および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示として提示されていることを理解するべきである。
本発明に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本発明の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点と共に、添付図面と共に読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解され得る。
図46CはLmddA274、Lm−Neo−12、またはLm−Neo−20での処置後のB16F10腫瘍を含むマウスの生存を陰性対照として使用されるPBSでの処置後のものと比較する図である。
例示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも正確な縮尺率で描かれているわけではないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、対応する要素または類似の要素を示すために図の間で参照番号が繰り返される場合がある。
以下の発明を実施するための形態では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示されている。しかしながら、本発明は本明細書において実際に示されるこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者によって理解される。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
1つの実施形態では、疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
a. 弱毒化リステリア株送達ベクター、および
b. 前記リステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを備える前記プラスミドベクター、
を含み、前記プラスミドで前記リステリア株を形質転換することにより前記被検者の疾患または症状を対象とする個別免疫療法系が作成作製される前記系が提供される。
a. 弱毒化リステリア株送達ベクター、および
b. 前記リステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを備える前記プラスミドベクター、
を含み、前記プラスミドで前記リステリア株を形質転換することにより前記被検者の疾患または症状を対象とする個別免疫療法系が作成作製される前記系が提供される。
1つの実施形態では本発明は、疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
a. 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを前記比較により特定するステップ、
b. 免疫原性応答向けの前記1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをスクリーニングするステップ、
c. 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、および
d. 二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を前記対象に投与し、免疫原性組成物の一部として前記弱毒化組換え型リステリア株を投与するステップを含む前記方法を提供する。
a. 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを前記比較により特定するステップ、
b. 免疫原性応答向けの前記1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをスクリーニングするステップ、
c. 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、および
d. 二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を前記対象に投与し、免疫原性組成物の一部として前記弱毒化組換え型リステリア株を投与するステップを含む前記方法を提供する。
別の実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を提供するための系であって、次の構成要素、すなわち、
a. 前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される疾患担持生体試料、
b. 前記疾患または症状を有する前記対象、または別の健常ヒト対象より獲得される健常生体試料、
c. 前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記核酸配列によりコードされる前記ORF中の突然変異であって、1つ以上のネオエピトープを構成する前記突然変異を特定するためのスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールと関連のデジタルソフトウェアであって、
i. T細胞エピトープまたは免疫原性またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前記ORF中の前記突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む関連デジタルソフトウェア、
d. 前記疾患担持試料に由来する前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸をクローニングし、且つ、発現させるための核酸クローニングおよび発現キット、
e. 1つ以上のネオエピトープを含む候補ペプチドのT細胞免疫原性を検査するための免疫原性アッセイ、
f. ステップ(e)の1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記特定済み免疫原性ペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターで形質転換するための弱毒化リステリア送達ベクターを含み、
一度形質転換されると前記リステリアが保存されるか、または免疫原性組成物の一部として(a)の前記ヒト対象に投与される、前記系が提供される。
a. 前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される疾患担持生体試料、
b. 前記疾患または症状を有する前記対象、または別の健常ヒト対象より獲得される健常生体試料、
c. 前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記核酸配列によりコードされる前記ORF中の突然変異であって、1つ以上のネオエピトープを構成する前記突然変異を特定するためのスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールと関連のデジタルソフトウェアであって、
i. T細胞エピトープまたは免疫原性またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前記ORF中の前記突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む関連デジタルソフトウェア、
d. 前記疾患担持試料に由来する前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸をクローニングし、且つ、発現させるための核酸クローニングおよび発現キット、
e. 1つ以上のネオエピトープを含む候補ペプチドのT細胞免疫原性を検査するための免疫原性アッセイ、
f. ステップ(e)の1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記特定済み免疫原性ペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターで形質転換するための弱毒化リステリア送達ベクターを含み、
一度形質転換されると前記リステリアが保存されるか、または免疫原性組成物の一部として(a)の前記ヒト対象に投与される、前記系が提供される。
別の実施形態では感染症、臓器移植拒絶反応、または腫瘍もしくは癌。
1つの実施形態では本発明は、疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
c. 送達ベクター、および所望により
d. 前記送達ベクターを形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含む前記系に関する。
c. 送達ベクター、および所望により
d. 前記送達ベクターを形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含む前記系に関する。
1つの実施形態では、1つ以上の個別化ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列を備える組換え型弱毒化リステリア株であって、前記ネオエピトープが疾患または症状を有する対象の前記疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記リステリア株が提供される。
1つの実施形態では、(a)本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドに融合された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子、または(b)キメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質が (i)細菌分泌シグナル配列、(ii)ユビキチン(Ub)タンパク質、および(iii)本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含み、(i)〜(iii)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドが機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている前記核酸コンストラクトを含む組換え型弱毒化リステリア株であって、前記ネオエピトープが疾患または症状を有する対象の前記疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記リステリア株が提供される。
別の実施形態では前記疾患または症状を有する対象への前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした免疫応答が生じる。
別の実施形態では前記株は前記対象の疾患または症状を標的とした前記対象向けの個別免疫療法ベクターである。
別の実施形態では前記ペプチドは少なくとも2つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では前記ペプチドは同じアミノ酸配列の1回以上のネオエピトープの繰返しを含む。
別の実施形態では前記リステリア株は1つのネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記リステリア株は約1〜100個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、5〜15個、5〜20個、5〜25個、15〜20個、15〜25個、15〜30個、15〜35個、20〜25個、20〜35個、20〜45個、30〜45個、30〜55個、40〜55個、40〜65個、50〜65個、50〜75個、60〜75個、60〜85個、70〜85個、70〜95個、80〜95個、80〜105個、または95〜105個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約50〜100個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は最大で約100個のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約1〜100個、5〜100個、5〜75個、5〜50個、5〜40個、5〜30個、5〜20個、5〜15個、または5〜10個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約1〜100個、1〜75個、1〜50個、1〜40個、1〜30個、1〜20個、1〜15個、または1〜10個の範囲のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記リステリア株は約100個を超えるネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で10個のネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で20個のネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で30個のネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で40個のネオエピトープを含む。別の実施形態では前記リステリア株は最大で50個のネオエピトープを含む。あるいは、前記リステリア株は約2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、または100個のネオエピトープを含む。
本明細書に記載される1つの実施形態ではネオエピトープ内の検出される突然変異の両側に約5〜30アミノ酸の範囲のアミノ酸が組み込まれる。加えて、または代わりに約8〜27アミノ酸長の範囲の様々なサイズのネオエピトープ挿入断片が挿入される。加えて、または代わりに約5〜50アミノ酸長の範囲の様々なサイズのネオエピトープ挿入断片が挿入される。加えて、または代わりに10〜30アミノ酸長、10〜40アミノ酸長、15〜30アミノ酸長、15〜40アミノ酸長、または15〜25アミノ酸長の範囲の様々なサイズのネオエピトープ挿入断片(すなわち、ネオエピトープをコードするペプチド)が挿入される。別の実施形態では各ネオエピトープ挿入断片は1〜10アミノ酸長、10〜20アミノ酸長、20〜30アミノ酸長、または30〜40アミノ酸長である。別の実施形態では前記ネオエピトープ挿入断片は1〜100アミノ酸長、5〜100アミノ酸長、5〜75アミノ酸長、5〜50アミノ酸長、5〜40アミノ酸長、5〜30アミノ酸長、5〜20アミノ酸長、5〜15アミノ酸長、または5〜10アミノ酸長である。さらに別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸配列は1〜100、1〜75、1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜15または1〜10である。別の実施形態では各ネオエピトープ挿入断片は21アミノ酸長であるか、または「21−mer」ネオエピトープ配列である。さらに別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸挿入断片は約8〜11アミノ酸長または11〜16アミノ酸長である。
別の実施形態では前記ネオエピトープ配列は腫瘍特異的、転移癌特異的、細菌感染症特異的、ウイルス感染症特異的、およびそれらのあらゆる組合せである。加えて、または代わりに前記ネオエピトープ配列は炎症特異的、免疫調節分子エピトープ特異的、T細胞特異的、自己免疫疾患特異的、移植片対宿主病(GvHD)特異的、およびそれらのあらゆる組合せである。
別の実施形態では1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む。加えて、または代わりに1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む。別の実施形態では1つ以上のネオエピトープが立体構造ネオエピトープを含む。
別の実施形態では1つ以上のネオエピトープがT細胞エピトープを含む。
1つの実施形態では、次の要素、すなわち、免疫原性ポリペプチドが融合している第1ネオエピトープアミノ酸(AA)配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第1ネオエピトープAA配列に連結されている第2ネオエピトープAA配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第2ネオエピトープAA配列に連結されている少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクトが本明細書において開示される。所望により、前記免疫原性ポリペプチドはN末端短縮型LLO(tLLO)であってよい。所望により、前記最後のネオエピトープはリンカー配列を介して機能的であるようにC末端のヒスチジンタグなどのタグに連結されていてよい。所望により、前記核酸コンストラクトは前記タグをコードする配列の後に少なくとも1つの終止コドン(例えば2つの終止コドン)を含んでよい。1つの実施形態では、次の要素、すなわち、N末端短縮型LLO(tLLO)が融合している第1ネオエピトープアミノ酸(AA)配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第1ネオエピトープAA配列に連結されている第2ネオエピトープAA配列、リンカー配列を介して機能的であるように前記第2ネオエピトープAA配列に連結されている少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列、およびリンカー配列を介して機能的であるようにC末端ヒスチジンタグに連結している最後のネオエピトープを含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクトが本明細書において開示される。所望により、前記ヒスチジンタグは6×ヒスチジンタグであってよい。別の実施形態では前記要素はN末端からC末端へと配置されているか、または機能的であるように連結されている。別の実施形態では各核酸コンストラクトは前記6×ヒスチジン(HIS)タグをコードする配列の後に少なくとも1つの終止コドンを含む。別の実施形態では各核酸コンストラクトは前記6×ヒスチジン(HIS)タグをコードする配列の後に2つの終止コドンを含む。別の実施形態では前記6×ヒスチジンタグは機能的であるようにN末端でSIINFEKLペプチドに連結されている。別の実施形態では前記リンカーは4×グリシンリンカーである。
別の実施形態では前記核酸コンストラクトは少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含む。別の実施形態では前記核酸コンストラクトは2〜10個の追加ネオエピトープ、10〜15個の追加ネオエピトープ、10〜25個の追加ネオエピトープ、25〜40個の追加ネオエピトープ、または40〜60個の追加ネオエピトープを含む。別の実施形態では前記核酸コンストラクトは約1〜10個、約10〜30個、約30〜50個、約50〜70個、約70〜90個、または最大で約100個のネオエピトープを含む。例えば、前記核酸コンストラクトは約5〜100個のネオエピトープ、または約15〜35個のネオエピトープを含み得る。
別の実施形態では各ネオエピトープアミノ酸配列は1〜10アミノ酸長、10〜20アミノ酸長、20〜30アミノ酸長、または30〜40アミノ酸長である。別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸配列は1〜100アミノ酸長、5〜100アミノ酸長、5〜75アミノ酸長、5〜50アミノ酸長、5〜40アミノ酸長、5〜30アミノ酸長、5〜20アミノ酸長、5〜15アミノ酸長、または5〜10アミノ酸長である。さらに別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸配列は1〜100、1〜75、1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜15または1〜10である。別の実施形態では各ネオエピトープアミノ酸配列は21アミノ酸長であるか、または「21−mer」ネオエピトープ配列である。さらに別の実施形態では前記ネオエピトープアミノ酸配列は約8〜11アミノ酸長または11〜16アミノ酸長である。
別の実施形態では前記核酸コンストラクトは、N末端短縮型LLOが融合している21アミノ酸配列のネオエピトープとそれに隣接するリンカー配列およびその後に続く少なくとも1つの第2ネオエピトープとそれに隣接する別のリンカーを含み、且つ、そのオープン・リーディング・フレームを終えるSIINFEKL−6xHisタグ−2×終止コドンによって終わる組換えポリペプチド、キメラタンパク質、または融合ポリペプチド、すなわち、pHly−tLLO−第一21mer−4×グリシンリンカーG1−第二21mer−4×グリシンリンカーG2−…−SIINFEKL−6xHistag−2×終止コドンをコードする。別の実施形態では上記のコンストラクトの発現はhlyプロモーターによって引き起こされる。
別の実施形態では前記核酸配列は少なくとも1つの第1ネオエピトープと少なくとも1つの第2ネオエピトープとの間に組み込まれている1つ以上のリンカー配列を含む。別の実施形態では前記核酸配列は少なくとも1つの第1ネオエピトープと少なくとも1つの第2ネオエピトープと少なくとも1つの第3エピトープとの間に組み込まれている少なくとも2つの異なるリンカー配列を含む。別の実施形態では1つ以上のリンカーは配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、および配列番号86で表されるヌクレオチド配列を含む群より選択される4×グリシンリンカーである。
別の実施形態では前記核酸配列は前記のコードされるペプチドに融合しているタグをコードする少なくとも1つの配列を含む。別の実施形態ではそのタグは配列番号87で表されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では前記1つ以上のネオエピトープはそれぞれ約8個〜27個の間のアミノ酸を含む。あるいは、前記1つ以上のネオエピトープはそれぞれ約5個〜50個の間のアミノ酸を含む。別の実施形態では前記1つ以上のネオエピトープはそれぞれ約21個のアミノ酸を含む。
別の実施形態では前記疾患担持組織または細胞のエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて前記ネオエピトープが決定される。
別の実施形態では前記ネオエピトープはマッチする生体試料アミノ酸配列と比較して選択されたアミノ酸突然変異をコードする核酸配列とそのN末端側に隣接する約10アミノ酸とそのC末端側の約10アミノ酸を含む。
別の実施形態では1つ以上のネオエピトープ、前記免疫原性エピトープを含むペプチド、またはそれらの両方が親水性である。
別の実施形態では1つ以上のネオエピトープ、前記免疫原性エピトープを含むペプチド、またはそれらの両方がカイト・ドゥーリトル・プロット上で最大でも1.6である。
別の実施形態では免疫抑制性エピトープについて1つ以上のネオエピトープがスクリーニングされ、免疫抑制性エピトープが前記核酸分子から除外される。
別の実施形態では1つ以上のネオエピトープが前記リステリア株に応じて発現および分泌に関してコドンを最適化される。
1つの実施形態ではネオエピトープ、治療用ポリペプチド、または治療用核酸をコードする前記核酸配列は1つ以上のネオエピトープまたは核酸の発現レベル上昇のために最適化され、別の実施形態では1つ以上のネオエピトープを含む治療用ポリペプチドまたは核酸の発現期間の増加のために最適化され、別の実施形態ではそれらの組合せのために最適化される。加えて、または代わりに、ネオエピトープ、治療用ポリペプチド、または治療用核酸をコードする前記核酸配列は翻訳、分泌、転写、およびそれらのあらゆる組合せのレベル上昇のために最適化される。
加えて、または代わりに、ネオエピトープ、治療用ポリペプチド、または治療用核酸をコードする前記核酸配列はそのオリゴヌクレオチド配列において形成される可能性がある二次構造の可能性のレベルを低下させるために最適化され、あるいはその配列を修飾し得るあらゆる酵素の結合を防止するために最適化される。
1つの実施形態では「最適化される」という用語は所望の変化を指し、1つの実施形態ではそれは本発明において記載される1つ以上のネオエピトープを含む人工的遺伝子発現の変化であり、別の実施形態ではそれはタンパク質発現の変化である。1つの実施形態では最適化された遺伝子発現は遺伝子発現の最適化された調節である。別の実施形態では最適化された遺伝子発現は遺伝子発現の増加である。本態様によると、および1つの実施形態では野生型と比較した遺伝子発現の2倍から1000倍の増加が企図されている。別の実施形態では遺伝子発現の2倍から500倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の2倍から100倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の2倍から50倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の2倍から20倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の2倍から10倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の3倍から5倍の増加が企図されている。
別の実施形態では最適化された遺伝子発現は特定の環境条件下での遺伝子発現の増加であり得る。別の実施形態では最適化された遺伝子発現は遺伝子発現の減少を含んでよく、1つの実施形態ではそれは特定の環境条件下だけでのことであってよい。
別の実施形態では最適化された人工的遺伝子発現は遺伝子発現期間の増加である。本態様によると、および1つの実施形態では野生型と比較した遺伝子発現期間の2倍から1000倍の増加が企図されている。別の実施形態では遺伝子発現期間の2倍から500倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の2倍から100倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の2倍から50倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の2倍から20倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の2倍から10倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現期間の3倍から5倍の増加が企図されている。別の実施形態ではその遺伝子発現期間の増加は非ベクター発現対照における遺伝子発現に対して比較されるか、あるいは野生型ベクター発現対照における遺伝子発現に対して比較される。
1つの実施形態では細菌細胞における発現は転写サイレンシング、短いmRNA半減期、二次構造形成、抑制因子または阻害因子などのオリゴヌクレオチド結合分子の結合部位、および希少tRNAプールの利用可能性によって妨げられる。細菌における 発現の多くの問題の原因は大元の配列内に見出される。RNAの最適化にはcis作用性要素の改変、そのGC含量の適合、その細菌細胞の非限定性tRNAプールに関するコドンバイアスの改変、および内部相同性領域の無効化が含まれ得る。
したがって、1つの実施形態では注意深く設計された合成配列によると半減期が延長した安定的なメッセージ、つまり、宿主細胞内での高レベルのタンパク質産生を期待することができる。
したがって、1つの実施形態では配列の最適化は宿主遺伝子のコドンバイアス、1つの実施形態ではリステリア・モノサイトゲネス遺伝子のコドンバイアスへのコドン使用頻度の適合、非常に高い(80%超)または非常に低い(30%未満)GC含量を有する領域の調節、次のcis作用性配列モチーフ、すなわち内部TATAボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位のうちの1つ以上の回避、ATリッチ配列ストレッチまたはGCリッチ配列ストレッチの回避、反復配列およびRNA二次構造の回避、(潜在的な)スプライシングのドナー部位およびアクセプター部位、分岐部位の回避、またはそれらの組合せを伴う。1つの実施形態では遺伝子がヒト細胞での発現のために最適化される。さらに別の実施形態では発現の最適かは遺伝子の隣接領域および/または発現ベクター内の他の部分への配列要素の付加を伴う。
1つの実施形態では本発明の製剤および方法は、前記核酸によりコードされる1つ以上のネオエピトープを含む治療用ポリペプチドの発現レベルの上昇、発現期間の増加、またはそれらの組合せのために最適化された核酸を提供する。
別の実施形態では1つ以上のネオエピトープによりMHCクラスIIのエピトープ提示が可能になる。
別の実施形態では前記リステリア株は1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを発現および分泌する。
別の実施形態では前記リステリア株は前記対象の感染時に1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを発現および分泌する。
別の実施形態では前記リステリア株は複数の前記核酸配列分子を含む。
1つの実施形態では本明細書において開示される融合ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトはプラスミド挿入断片である。別の実施形態ではその挿入断片は前記融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む。別の実施形態では前記融合ポリペプチドは本明細書において開示される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドに融合した免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む。一実施形態ではこの挿入断片はプラスミド上にあってよく、またはゲノム中に少なくとも部分的に組み込まれてよい。別の実施形態ではその挿入断片はキメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトとして設計されてよく、そのキメラタンパク質は細菌分泌シグナル配列、ユビキチン(Ub)タンパク質、および本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含む。別の実施形態ではそのシグナル配列、ユビキチン、および1つ以上のペプチドは機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている。
別の実施形態では前記リステリア株はキメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクト中の核酸配列を含み、前記キメラタンパク質は (a)細菌分泌シグナル配列、(b)ユビキチン(Ub)タンパク質、(c)本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含み、(a)〜(c)のシグナル配列、ユビキチン、および1つ以上のペプチドが機能的であるように連結されているか、またはアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されている。
別の実施形態では前記核酸分子は前記組換え型リステリア株内の細菌人工染色体中に存在する。
別の実施形態では前記核酸分子は前記組換え型リステリアワクチン株内のプラスミドの中に存在する。
別の実施形態ではそのプラスミドは組込み型プラスミドである。
別の実施形態ではそのプラスミドは染色体外マルチコピープラスミドである。
別の実施形態ではそのプラスミドは抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において安定的に維持される。
別の実施形態ではそのプラスミドは前記リステリア株に対して抗生物質耐性を付与しない。
別の実施形態では前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している。例えば、それらの1つ以上のペプチドの各々が異なる免疫原性ポリペプチドまたはそれらの断片に融合していてよく、またはそれらの1つ以上のペプチドの組合せが免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合していてよい(例えば、免疫原性ポリペプチドが第1ネオエピトープに連結されており、それが第2ネオエピトープに連結されており、それが第3ネオエピトープに連結されている等々)。
別の実施形態では1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含むそれらの1つ以上のペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片に同時に融合している。
別の実施形態ではその免疫原性ポリペプチドは変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、ActA−PEST2融合体、またはPESTアミノ酸配列である。
別の実施形態ではそのActA−PEST2融合タンパク質は配列番号16で表される。
別の実施形態ではそのtLLOタンパク質は配列番号3で表される。
別の実施形態ではそのactAは配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される。
別の実施形態ではそのPESTアミノ酸配列は配列番号5〜10で表される配列から選択される。
別の実施形態ではその変異型LLOはコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む。
別の実施形態ではその突然変異は配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
別の実施形態ではその突然変異は配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、その非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む。
別の実施形態ではその突然変異は配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む。
別の実施形態では前記1つ以上のペプチドは前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む。別の実施形態ではその異種抗原または自己抗原は腫瘍関連抗原またはその断片である。
別の実施形態では前記ネオエピトープまたはその断片はヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む。
別の実施形態ではその腫瘍または癌は乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺性腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む。
別の実施形態ではその腫瘍または癌はその腫瘍または癌の転移癌を含む。
別の実施形態では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、または、腫瘍もしくは癌である。
別の実施形態では前記感染症はウイルス感染症または細菌感染症を含む。
別の実施形態では1つ以上のネオエピトープは感染症関連特異的エピトープを含む。
別の実施形態ではその感染症は感染性ウイルス病である。
別の実施形態ではその感染症は感染性細菌病である。
別の実施形態ではその感染症は以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる。
別の実施形態では前記弱毒化リステリアは1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む。
別の実施形態ではその内在性遺伝子突然変異はactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、またはdal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される。
別の実施形態ではその突然変異は前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む。
別の実施形態では前記ベクターは代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレーム、または代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第2核酸配列をさらに備える。
別の実施形態ではそのオープン・リーディング・フレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
別の実施形態では前記リステリアはリステリア・モノサイトゲネスである。
別の実施形態では前記リステリア株は1つ以上の免疫調節性分子をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトをさらに備える。
別の実施形態ではその免疫調節性分子はインターフェロンγ、サイトカイン、ケモカイン、T細胞刺激因子、およびそれらのあらゆる組合せを含む群より選択され、前記分子が前記リステリア株から発現および分泌される。
1つの実施形態では本明細書において開示される個別免疫療法組成物は本明細書において開示される1つ以上の送達ベクターを含む。1つの実施形態では本明細書において開示される個別免疫療法組成物は上記のいずれかにおいて開示される1つ以上のリステリア株を含む。別の実施形態では個別免疫療法組成物は1つ以上のネオエピトープをそれぞれ発現する1〜2種類、1〜5種類、1〜10種類、1〜20種類、または1〜40種類の組換え送達ベクターの混合物を含む。別の実施形態ではその混合物は1〜5種類、5〜10種類、10〜15種類、15〜20種類、10〜20種類、20〜30種類、30〜40種類、または40〜50種類の送達ベクターを含む。別の実施形態では個別免疫療法組成物は短縮型LLOタンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列との融合タンパク質という背景の中で1つ以上のネオエピトープをそれぞれ発現する1〜2種類、1〜5種類、1〜10種類、1〜20種類、または1〜40種類の組換え送達ベクターの混合物を含む。1つの実施形態ではその送達ベクター混合物中に存在する個々の送達ベクターが治療の一部として対象に同時投与される。別の実施形態ではその送達ベクター混合物中に存在する個々の送達ベクターが治療の一部として対象に順次投与される。
1つの実施形態では、本明細書において開示される方法によって作製される1つ以上の組換え送達ベクターを含む組成物の免疫原性混合物が本明細書において開示される。別の実施形態では前記混合物中の前記送達ベクターの各々が1つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む。別の実施形態では前記混合物中の各送達ベクターは1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを発現する。別の実施形態では各混合物は1〜5種類、5〜10種類、10〜15種類、15〜20種類、10〜20種類、20〜30種類、30〜40種類、または40〜50種類の送達ベクターを含む。別の実施形態ではその混合物は異なるセットの1つ以上のネオエピトープをそれぞれ含む複数の送達ベクターを含む。ネオエピトープの第1セットは第2セットが含んでいない1つのネオエピトープを含む場合にその第2セットとは異なり得る。同様に、ネオエピトープの第1セットは第2セットが含んでいるネオエピトープを含んでいない場合にその第2セットとは異なり得る。例えば、ネオエピトープの第1セットと第2セットは同じネオエピトープのうちの1つ以上を含むことができ、それでいてなお異なるセットであり得、または第1セットは同じネオエピトープのうちのいずれかを含んでいないことでネオエピトープの第2セットと異なり得る。
1つの実施形態では、本明細書において開示される方法により作製された1つ以上の組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物が本明細書において開示される。別の実施形態では前記混合物中の前記リステリアの各々が1つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む。別の実施形態では前記混合物中の各リステリアは1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを発現する。別の実施形態では各混合物は1〜5株、5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の組換え型リステリア株を含む。別の実施形態ではその混合物は異なるセットの1つ以上のネオエピトープをそれぞれ含む複数の組換え型リステリア株を含む。ネオエピトープの第1セットは第2セットが含んでいない1つのネオエピトープを含む場合にその第2セットとは異なり得る。同様に、ネオエピトープの第1セットは第2セットが含んでいるネオエピトープを含んでいない場合にその第2セットとは異なり得る。例えば、ネオエピトープの第1セットと第2セットは同じネオエピトープのうちの1つ以上を含むことができ、それでいてなお異なるセットであり得、または第1セットは同じネオエピトープのうちのいずれかを含んでいないことでネオエピトープの第2セットと異なり得る。
1つの実施形態では、対象における抗腫瘍応答の誘発方法であって、本明細書において開示される免疫原性混合物組成物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法が本明細書において開示される。別の実施形態では対象において腫瘍を予防または治療する方法であって、本明細書において開示される組成物の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法が本明細書において開示される。1つの実施形態では前記組成物混合物から選択される少なくとも1つの組換え型リステリア株を含む組成物は前記組成物混合物から選択される少なくとも別の組換え型リステリア株と同時に(すなわち、同じ医薬として)投与されてよく、並行して(すなわち、あらゆる順序で次々に投与される別個の医薬として)投与されてよく、またはあらゆる順序で順次投与されてよい。順次投与は本明細書において開示される組換え型リステリア株を含む原薬が異なる剤形である(1つの薬剤が錠剤またはカプセル剤であり、別の薬剤が滅菌液剤である)とき、および/または異なる投与スケジュールで投与されるとき、例えば、1つのリステリア株を含む前記組成物混合物の1つの組成物が少なくとも毎日投与され、別の組成物が週に一回、2週に一回、または3週に一回など、より低い頻度で投与されるときに特に有用である。
別の実施形態ではその個別免疫療法組成物により1つ以上のネオエピトープを標的とする免疫応答が誘発される。
別の実施形態では前記組成物は、各株が少なくとも1つの特有の前記ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む前記核酸コンストラクトを備える複数の前記リステリア株の混合物を含む。
別の実施形態では前記組成物は前記リステリア株の混合物を含み、前記混合物は複数の前記ネオエピトープを含む。
当業者は「複数」という用語は1より上の整数を包含し得ることを理解する。1つの実施形態ではその用語は1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、60〜70、70〜80、80〜90、または90〜100の範囲を指す。
別の実施形態では前記混合物は最大で約300個のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は約1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個の範囲のネオエピトープを含む。
1つの実施形態では前記混合物はベクター当たり約8〜27個の範囲のエピトープを含む。別の実施形態では前記混合物はベクター当たり約21個のエピトープの範囲を含む。別の実施形態では前記混合物はベクター当たり約1〜5個、1〜10個、1〜20個、1〜30個、1〜50個、1〜60個、1〜70個、1〜80個、1〜90個、1〜100個、1〜110個、1〜150個、1〜200個、1〜250個、1〜300個、または1〜500個の範囲エピトープを含む。
1つの実施形態では全てのエピトープがネオエピトープである。別の実施形態ではベクター当たり少なくとも1つのエピトープがネオエピトープである。
1つの実施形態ではネオエピトープの発現と分泌の効率を決定するために送達ベクター内の突然変異数に対するコンストラクトの数が決定される。別の実施形態ではベクター当たり約50個のエピトープから開始して一連の直鎖状ネオエピトープが検査される。別の実施形態ではベクター当たり約1〜5個、5〜10個、10〜20個、20〜50個、50〜70個、70〜90個、90〜110個、110〜150個、150〜200個、200〜250個、300〜350個、または400〜500個のエピトープから開始して一連の直鎖状ネオエピトープが検査される。1つの実施形態ではベクター当たり少なくとも1つのネオエピトープがコンストラクトに含まれる。
1つの実施形態では使用されるベクターの数は単一のベクターに由来する複数のエピトープの翻訳と分泌の効率および特定のネオエピトープを保持する各Lmベクターに必要とされる感染多重度(MOI)を考慮して、またはネオエピトープ数を参照して決定される。
1つの実施形態では使用されるベクター(例えばリステリアベクター)の数は、循環腫瘍細胞に見出される公知の腫瘍関連突然変異、公知の癌「ドライバー」突然変異、および/または公知の化学療法耐性突然変異からなる所定の群を考慮に入れ、21アミノ酸配列ペプチドの選択においてこれらを優先することにより決定される(実施例30参照)。別の実施形態ではこの決定は、特定された変異遺伝子をCOSMIC(癌体細胞突然変異カタログ、cancer.Sanger.ac.uk)またはキャンサーゲノムアナリシスまたは他の類似の癌関連遺伝子データベースに対してスクリーニングすることにより行われ得る。さらに、および別の実施形態では免疫抑制性エピトープ(Tregエピトープ、IL−10誘導性Tヘルパーエピトープ、等)のスクリーニングを利用して脱選択する、またはベクターに対する免疫抑制的影響を回避する。別の実施形態では選択されるコドンは特定の送達ベクター(例えばリステリア株)に応じて効率的な翻訳および分泌について最適化されたコドンである。当技術分野において知られているL.モノサイトゲネスについて最適化されたコドンの例は本明細書中の表8に提示されている。
別の実施形態では前記混合物は少なくとも2つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では前記混合物は約1〜5個、5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、または90〜100個の範囲のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は約50〜100個の範囲のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は最大で約100個のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は約100個より多くのネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は最大で約10個のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は最大で約20個のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は最大で約50個のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は約2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、または50個のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は約5〜15個、5〜20個、5〜25個、15〜20個、15〜25個、15〜30個、15〜35個、20〜25個、20〜35個、20〜45個、30〜45個、30〜55個、40〜55個、40〜65個、50〜65個、50〜75個、60〜75個、60〜85個、70〜85個、70〜95個、80〜95個、80〜105個、または95〜105個の範囲のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は約51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、または100個のネオエピトープを含む。
別の実施形態では前記混合物は1つ以上の1つ以上の免疫調節性分子をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備える1つ以上の組換え型弱毒化リステリア株送達ベクターをさらに含む。
別の実施形態ではその免疫調節性分子はインターフェロンγ、サイトカイン、ケモカイン、T細胞刺激因子、およびそれらのあらゆる組合せを含む群より選択され、前記分子が前記リステリア株から発現および分泌される。
別の実施形態では前記混合物は、1つ以上のエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備える1つ以上の組換え型弱毒化リステリア株送達ベクターをさらに含み、前記エピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含み、前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした免疫療法が発生する。
別の実施形態では上記のいずれかにおいて開示される組成物はアジュバントをさらに含む。
別の実施形態ではそのアジュバントは顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む。
別の実施形態では前記対象への前記組成物の投与により前記対象における個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる。
別の実施形態ではその免疫応答は抗癌応答または抗腫瘍応答を含む。
別の実施形態ではその免疫応答は抗感染症応答を含む。
別の実施形態では前記感染症はウイルス感染症を含む。
別の実施形態では前記感染症は細菌感染症を含む。
別の実施形態ではその個別免疫療法により前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が増加する。
別の実施形態ではその個別免疫療法は前記疾患または症状を有する前記対象における腫瘍サイズまたは転移癌サイズを減少させる。
別の実施形態ではその個別免疫療法は前記疾患または症状を有する前記対象において転移癌を予防する。
本発明の別の実施形態ではDNA免疫療法は上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物を含む。
本発明の別の実施形態ではペプチド免疫療法は上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物を含む。
別の実施形態ではその免疫療法はアジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組合せをさらに含む。
本発明の別の実施形態では本発明の医薬組成物は上記のいずれかにおいて開示される免疫療法または個別免疫療法組成物と医薬担体を含む。
本発明の別の実施形態では前記疾患または症状を有する対象の疾患または症状を担持する組織または細胞に存在する少なくとも1つのネオエピトープに対する免疫応答の誘導方法は、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む。
本発明の関連の態様では疾患または症状を有する対象における標的とされる免疫応答の誘導方法は上記のいずれかにおいて開示される免疫原性組成物または免疫療法を前記対象に投与することを含み、前記リステリア株の投与により前記対象の疾患または症状を標的とした個別免疫療法が発生する。
本発明の別の実施形態では対象において疾患または症状を治療、抑止、または抑制する方法は、前記疾患または症状を標的とするために上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を投与するステップを含む。
本発明の別の実施形態によると前記組成物または免疫療法を経口投与または非経口投与するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
別の実施形態では非経口投与は静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む。
さらに別の実施形態では前記疾患または症状は感染症、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、腫瘍、または癌である。
別の実施形態ではその腫瘍または癌は乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺性腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む。
別の実施形態では前記感染症はウイルス感染症または細菌感染症を含む。
別の実施形態ではその感染症は以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる。
本発明の別の実施形態では、対象の脾臓および腫瘍内の制御性T細胞(Treg)に対するTエフェクター細胞の比率であって、対象の疾患または症状を担持する組織内に存在するネオエピトープを標的としている前記Tエフェクター細胞の比率を上げる方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、抗原またはそのペプチド断片が1つ以上のネオエピトープを含む、その抗原に特異的なT細胞を対象において増加させるための方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、腫瘍を有するか、または癌を患う対象、または感染症を患う対象の生存時間の増加方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、対象の癌からの予防方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、対象における癌発症の抑制または遅延化方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、対象における腫瘍サイズまたは転移癌サイズの減少方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
本発明の別の実施形態によるとその腫瘍または癌は乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺性腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む。
本発明の別の実施形態では、対象の感染症からの予防方法であって、上記のいずれかにおいて開示される個別免疫療法組成物または免疫療法を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
本発明の別の実施形態では前記感染症はウイルス感染症または細菌感染症を含む。
本発明の別の実施形態ではその感染症は以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる。
別の実施形態では前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答が生じる。
本発明の別の実施形態によると、上記の方法であって、前記個別免疫療法組成物を作製するステップを追加として含み、前記作製が、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答の生成を生じさせるステップ、所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である1つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) 1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するためにその第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいはその第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が開示される。
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答の生成を生じさせるステップ、所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である1つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) 1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するためにその第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいはその第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が開示される。
1つの実施形態では前記1つ以上のネオエピトープは複数のネオエピトープを含む。所望により、ステップ(b)はステップ(b)の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドの順序のランダム化を1回以上繰り返すことをさらに含んでもよい。そのようなランダム化は、例えば、複数のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドのセット全体の順序のランダム化を含むことができ、または複数のネオエピトープの部分セットを含む1つ以上のペプチドの部分セットの順序のランダム化を含むことができる。例えば、前記核酸配列が20個のネオエピトープを含む(1番〜20番まで番号を付けられた)20個のペプチドを含む場合、ランダム化は20個全てのペプチドの順序のランダム化を含むことができ、またはそれらのペプチドの部分セット(例えば、ペプチド1〜5またはペプチド6〜10)だけの順序のランダム化を含むことができる。そのような順序のランダム化はそれらのネオエピトープの分泌および提示、ならびにそれぞれ個々の領域の分泌および提示を容易にし得る。
別の実施形態では疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較するステップは、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFを前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用をさらに含み、前記関連デジタルソフトウェアは、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列内の前記ORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む。
本発明の別の実施形態では上記のいずれかにおいて開示される方法は、1つ以上のネオエピトープ、1つ以上のネオエピトープを含むペプチド、またはそれらの両方を疎水性および親水性についてスクリーニングするステップを追加的に含む。
本発明の別の実施形態によると親水性である1つ以上のネオエピトープ、1つ以上のネオエピトープを含むペプチド、またはそれらの両方を選択するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
本発明の別の実施形態によるとカイト・ドゥーリトル・プロットにおいて最大で1.6である1つ以上のネオエピトープ、1つ以上のネオエピトープを含むペプチド、またはそれらの両方を選択するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
本発明の別の実施形態によると特定のリステリア株に応じて発現および分泌について1つ以上のネオエピトープまたは1つ以上のネオエピトープを含むペプチドのコドンを最適化するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
本発明の別の実施形態によると免疫抑制性エピトープ向けの1つ以上のネオエピトープをスクリーニングするステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
本発明の別の実施形態によると前記生体試料は組織、細胞、血液、または血清である。
本発明の別の実施形態によると前記疾患または症状を有する前記対象より疾患担持生体試料を獲得するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
別の実施形態によると本明細書において開示される本発明は、前記疾患または症状を有する前記対象より健常生体試料を獲得するステップを追加的に含む。
別の実施形態によると前記対象から第2生体試料を獲得するステップは、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む生体試料を獲得することを含む。
本発明の別の実施形態によると (a)前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および(b)前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
別の実施形態では前記スクリーニングおよび特定ステップはT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む。
別の実施形態ではそのシーケンシングは関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む。
本発明の別の実施形態によるとエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて前記核酸配列のシーケンシングを決定するステップを追加的に含む上記の方法が開示される。
1つの実施形態では本明細書において開示される融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質は本明細書において開示される組換え型リステリアによって発現および分泌される。別の実施形態では本明細書において開示されるその融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質はC末端SIINFEKL−S−6×HISタグを含む。別の実施形態では本明細書において開示されるその融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質は本明細書において開示される組換え型リステリアによって発現および分泌される。別の実施形態ではポリヒスチジン(His)タグに特異的に結合するタンパク質、分子、または抗体(またはその断片)を使用して本明細書において開示される抗原またはポリペプチド(融合またはキメラ)の分泌が検出される。別の実施形態では本明細書において開示されるその融合ポリペプチド、またはキメラタンパク質は本明細書において開示される組換え型リステリアによって発現および分泌される。別の実施形態ではSIINFEKL−S−6×HISタグに結合する抗体、タンパク質、または分子を使用して本明細書において開示される抗原またはポリペプチド(融合またはキメラ)の分泌が検出される。別の実施形態では本明細書において開示されるキメラタンパク質の融合ポリペプチドは、限定されないが、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン(TRX)およびポリ(NANP)をはじめとする当技術分野において知られている他のあらゆるタグを含む。
1つの実施形態では各ネオエピトープはリンカー配列によって同じベクター上にコードされる後続のネオエピトープに接続される。1つの実施形態ではそのリンカーは4×グリシンDNA配列である。当業者は、本明細書において開示される方法および組成物に当技術分野において知られている他のリンカー配列を使用することができることを理解する(例えば、全体が参照により本明細書に援用されるReddy Chichili, V. P., Kumar, V. and Sivaraman, J. (2013), Linkers in the structural biology of protein−protein interactions. Protein Science, 22: 153−167を参照されたい)。さらに別の実施形態では前記リンカーは配列番号 1〜11、それに応じて配列番号76〜86、およびそれらのあらゆる組合せを含む群より選択される。
1つの実施形態では挿入断片中の最後のネオエピトープはタグ配列とそれに続く終止コドンに融合している。当業者は、例えばLmベクターからの分泌時に、または特定のT細胞への親和性、または抗原提示細胞による提示についてコンストラクトを検査するときにタグによって融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質の簡単な検出が可能なり得ることを理解する。
1つの実施形態では様々なHLA T細胞受容体(TCR)リーディングフレームのうちの少なくとも幾つかを提供するために検出された突然変異の両側に約10個の隣接アミノ酸を組み込んでクラス1MHC−1提示を提供する。
本明細書中の表7は、各突然変異がアミノ酸を表す太字の文字によって表示されており、各突然変異の両側に10アミノ酸が隣接して21アミノ酸ペプチドネオエピトープを提供している50個のネオエピトープペプチドの試料リストを示している。1つの実施形態では、単一のプラスミド中に適合し得るものよりも使用しやすい21アミノ酸ペプチドが存在する場合、異なる21アミノ酸ペプチドを必要に応じて/要望に応じて優先順位によって第1コンストラクト、第2コンストラクト等と呼ぶ。別の実施形態では所望のネオエピトープのセット全体を含む複数のベクターのうちの1つに対する優先度の割り当てが、相対的サイズ、転写優先度、および/または翻訳されたポリペプチドの全体的疎水性のような因子に基づいて決定される。
1つの実施形態では反復度を最小限にするためにネオエピトープ間に異なるリンカー配列が配置される。別の実施形態ではネオエピトープ間に異なるリンカー配列を配置することにより二次構造が低減され、それによりLm組換えベクター株集団内の挿入断片を含むプラスミドの効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化が可能になる。
1つの実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
a. 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
b. (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、所望により、
c. 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である前記1つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
d. (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
e. 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が本明細書において開示される。
a. 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
b. (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、所望により、
c. 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である前記1つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
d. (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
e. 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が本明細書において開示される。
1つの実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、または(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) (c)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が本明細書において開示される。
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、または(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) (c)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が本明細書において開示される。
1つの実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
a. 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
b. (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換し、または(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のORFを含む前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、
c. T細胞クローンまたはT浸潤細胞または血液または組織標本を含む前記対象の第2生体試料であって、潜在的なネオエピトープペプチドに対する応答の特定および選択をT細胞免疫応答の増加または変化に基づいて可能にする前記第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドとの反応により、またはT細胞受容体特異性についてのPCRベースのディープシーケンシングおよびネオエピトープと関連する増加したT細胞応答の評価により特徴分析するステップ、
d. (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
e. (c)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が本明細書において開示される。
a. 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
b. (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換し、または(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のORFを含む前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、
c. T細胞クローンまたはT浸潤細胞または血液または組織標本を含む前記対象の第2生体試料であって、潜在的なネオエピトープペプチドに対する応答の特定および選択をT細胞免疫応答の増加または変化に基づいて可能にする前記第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドとの反応により、またはT細胞受容体特異性についてのPCRベースのディープシーケンシングおよびネオエピトープと関連する増加したT細胞応答の評価により特徴分析するステップ、
d. (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
e. (c)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法が本明細書において開示される。
別の実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を提供するための系であって、次の構成要素、すなわち、
g. 前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される疾患担持生体試料、
h. 前記疾患または症状を有する前記対象、または別の健常ヒト対象より獲得される健常生体試料、
i. 前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記核酸配列によりコードされる前記ORF中の突然変異であって、1つ以上のネオエピトープを構成する前記突然変異を特定するためのスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールと関連のデジタルソフトウェアであって、
i. T細胞エピトープまたは免疫原性またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前記ORF中の前記突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む関連デジタルソフトウェア、
j. 前記疾患担持試料に由来する前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸をクローニングし、且つ、発現させるための核酸クローニングおよび発現キット、
k. T細胞の免疫原性および/または1つ以上のネオエピトープを含む候補ペプチドの結合を検査するための免疫原性アッセイ、
l. 核酸配列、ペプチド アミノ酸配列、および T細胞 受容体 アミノ酸配列をシーケンシングし、分析するための分析装置および関連のソフトウェア、
m. ステップ(e)の1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記特定済み免疫原性ペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターで形質転換するための弱毒化リステリア送達ベクターであって、
i. 一度形質転換されると前記リステリアが保存されるか、または免疫原性組成物の一部として(a)の前記ヒト対象に投与される前記弱毒化リステリア送達ベクター、または
n. 送達ベクター、および所望により
o. 前記送達ベクターを形質転換するためのベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記ベクターを含む前記系が提供される。
g. 前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される疾患担持生体試料、
h. 前記疾患または症状を有する前記対象、または別の健常ヒト対象より獲得される健常生体試料、
i. 前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記核酸配列によりコードされる前記ORF中の突然変異であって、1つ以上のネオエピトープを構成する前記突然変異を特定するためのスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールと関連のデジタルソフトウェアであって、
i. T細胞エピトープまたは免疫原性またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前記ORF中の前記突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む関連デジタルソフトウェア、
j. 前記疾患担持試料に由来する前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸をクローニングし、且つ、発現させるための核酸クローニングおよび発現キット、
k. T細胞の免疫原性および/または1つ以上のネオエピトープを含む候補ペプチドの結合を検査するための免疫原性アッセイ、
l. 核酸配列、ペプチド アミノ酸配列、および T細胞 受容体 アミノ酸配列をシーケンシングし、分析するための分析装置および関連のソフトウェア、
m. ステップ(e)の1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記特定済み免疫原性ペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターで形質転換するための弱毒化リステリア送達ベクターであって、
i. 一度形質転換されると前記リステリアが保存されるか、または免疫原性組成物の一部として(a)の前記ヒト対象に投与される前記弱毒化リステリア送達ベクター、または
n. 送達ベクター、および所望により
o. 前記送達ベクターを形質転換するためのベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前記ベクターを含む前記系が提供される。
別の実施形態では前記1つ以上のペプチドは前記核酸配列中の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)によってコードされる。
別の実施形態では疾患は感染症、または腫瘍もしくは癌である。
別の実施形態では前記送達ベクターは細菌性送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはウイルスベクター送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはペプチド免疫療法送達ベクターを含む。別の関連の態様では前記送達ベクターはDNA免疫療法送達ベクターを含む。
1つの実施形態では個別免疫療法を作成するための方法であって、
a. 前記疾患または症状を有する対象より疾患担持生体試料を獲得するステップ、
b. 前記疾患担持試料より核酸を抽出するステップ、
c. ステップ(a)の前記対象または同じ種の異なる個体より健常生体試料を獲得するステップ、
d. 前記健常試料より核酸を抽出するステップ、
e. ステップ(b)とステップ(d)の抽出された核酸をシーケンシングするステップ、
f. 前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記ORFであって、1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードする前記ORF内の変異核酸配列を特定するステップ、
g. 前記疾患担持試料の前記ORFであって、1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードする前記ORF内の変異配列を特定するステップであって、
a. 限定されないが、T細胞受容体(TCR)シーケンシング、またはホールエクソームシーケンシングを含む当技術分野においてよく知られている方法を用いて前記ネオエピトープが特定される前記ステップ、
h. 前記特定済み変異核酸配列を含む前記1つ以上のペプチドを発現させるステップ、
i. 免疫原性T細胞応答の存在がT細胞エピトープを含む1つ以上のネオエピトープの存在と相関する、その免疫原性T細胞応答について前記1つ以上のネオエピトープを含む各ペプチドをスクリーニングするステップ、
j. T細胞エピトープである1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上の免疫原性ペプチドをコードする核酸配列を特定および選択し、前記配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、
k. 前記1つ以上の免疫原性ペプチドの発現と分泌を確認するために前記弱毒化リステリア株を培養し、その特徴を分析するステップ、および
l. 所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化リステリアを保存するか、または免疫原性組成物の一部として投与される前記弱毒化リステリア株を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
a. 前記疾患または症状を有する対象より疾患担持生体試料を獲得するステップ、
b. 前記疾患担持試料より核酸を抽出するステップ、
c. ステップ(a)の前記対象または同じ種の異なる個体より健常生体試料を獲得するステップ、
d. 前記健常試料より核酸を抽出するステップ、
e. ステップ(b)とステップ(d)の抽出された核酸をシーケンシングするステップ、
f. 前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記ORFであって、1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードする前記ORF内の変異核酸配列を特定するステップ、
g. 前記疾患担持試料の前記ORFであって、1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードする前記ORF内の変異配列を特定するステップであって、
a. 限定されないが、T細胞受容体(TCR)シーケンシング、またはホールエクソームシーケンシングを含む当技術分野においてよく知られている方法を用いて前記ネオエピトープが特定される前記ステップ、
h. 前記特定済み変異核酸配列を含む前記1つ以上のペプチドを発現させるステップ、
i. 免疫原性T細胞応答の存在がT細胞エピトープを含む1つ以上のネオエピトープの存在と相関する、その免疫原性T細胞応答について前記1つ以上のネオエピトープを含む各ペプチドをスクリーニングするステップ、
j. T細胞エピトープである1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上の免疫原性ペプチドをコードする核酸配列を特定および選択し、前記配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、
k. 前記1つ以上の免疫原性ペプチドの発現と分泌を確認するために前記弱毒化リステリア株を培養し、その特徴を分析するステップ、および
l. 所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化リステリアを保存するか、または免疫原性組成物の一部として投与される前記弱毒化リステリア株を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
別の実施形態では前記対象より第2生体試料を獲得する工程は、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記第2組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む生体試料を獲得することを含む。
別の実施形態では前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析する工程は、
a. 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、
b. 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む。
a. 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、
b. 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む。
別の実施形態では特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップは、前記T細胞を前記1つ以上のペプチドと接触させることを含む。別の実施形態では前記スクリーニングおよび特定ステップは、T細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを実施してペプチド特異性を決定することを含む。当業者は、T細胞受容体に結合するペプチドを決定する方法が当技術分野においてよく知られていることを充分に理解する。
1つの実施形態では本明細書において提供される個別免疫療法を作成する系または方法における比較ステップは、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、且つ、前記疾患担持試料の前記ORFであって、1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードする、またはそれらのペプチド内に構成される前記ORF内の変異核酸配列を特定するための関連デジタルソフトウェアの使用を含む。別の実施形態ではその関連デジタルソフトウェアは、T細胞エピトープまたは免疫原性またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前記ORF内の前記疾患担持核酸配列のスクリーニング、または1つ以上のネオエピトープを含む前記ペプチドをコードするデジタル式で翻訳された対応するアミノ酸配列のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む。
1つの実施形態では、提供される個別免疫療法を作成するための前記系または方法における免疫原性T細胞応答のスクリーニングステップは、例えばT細胞増殖アッセイ、前記ネオエピトープで活性化されたT細胞を使用し、且つ、腫瘍細胞と共培養され、51Cr放出アッセイまたは3Hチミジンアッセイを用いる腫瘍退行アッセイ、ELISAアッセイ、ELIspotアッセイ、およびFACS分析をはじめとする当技術分野においてよく知られている免疫応答アッセイの使用を含む。(例えば、全体が本明細書に援用される米国特許第8771702号明細書を参照されたい)。
別の実施形態では前記細菌性配列はリステリア配列であり、幾つかの実施形態では前記リステリア配列はhlyシグナル配列またはactAシグナル配列である。
別の実施形態では前記疾患は局所性疾患である。別の実施形態では前記疾患は腫瘍または癌である。別の実施形態ではその腫瘍または癌は固形腫瘍または固形癌である。別の実施形態ではその腫瘍または癌は液性腫瘍または液性癌である。別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は腫瘍、または癌、またはそれらの一部分を含む。
1つの実施形態では前記疾患は感染症である。別の実施形態ではその感染症は感染性ウイルス病または感染性細菌病である。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により特定されるネオエピトープは感染症関連特異的エピトープである。
別の実施形態ではネオエピトープは特有の腫瘍または癌ネオエピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは免疫原性である。別の実施形態ではネオエピトープはT細胞によって認識される。別の実施形態では1つ以上のネオエピトープを含むペプチドは、腫瘍または癌に対するT細胞応答であって、前記対象に対して個別化されている前記応答を活性化する。
別の実施形態ではネオエピトープは特有の腫瘍または癌ネオエピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは感染症に関連する特有のエピトープを含む。1つの実施形態ではその感染症エピトープは前記疾患と直接的に相関する。交互の実施形態ではその感染症エピトープは前記感染症と関連する。
別の実施形態では本明細書において提供される前記方法によりが疾患を有する前記対象における個別化増強抗疾患免疫応答、すなわち、抗感染症免疫応答、または抗感染症免疫応答、または抗腫瘍免疫応答の生成可能になる。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により対象における前記疾患、すなわち、前記感染または感染症、または前記腫瘍もしくは癌の個別化治療または予防が可能になる。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により前記疾患、すなわち、前記感染または感染症、または前記腫瘍もしくは癌を有する前記対象の生存時間が増加する。
1つの実施形態では本発明は本明細書において提供される組換え型リステリア株と薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では1つ以上の異なるネオエピトープを含む1つ以上の異なるペプチドをそれぞれ発現する1つ以上の組換え型リステリア株を含む1つ以上の免疫原性組成物が本明細書において提供される。別の実施形態では各リステリアは一連のネオエピトープを発現する。別の実施形態では各ペプチドはT細胞エピトープである1つ以上のネオエピトープを含む。1つの実施形態では対象において標的とされる個別化抗腫瘍T細胞応答を誘発する方法であって、本明細書において提供される組換え型リステリア株であって、1つ以上のネオエピトープを含む前記リステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。別の実施形態ではリステリア株は次のもののうちの1つ、すなわち、癌疾患に関連する1つ以上のネオエピトープを含むペプチドに融合している免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子、またはキメラタンパク質をコードする第1オープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質がリステリア分泌シグナル配列、ユビキチン(Ub)タンパク質、および腫瘍または癌に関連する1つ以上のネオエピトープをそれぞれ含む1つ以上のペプチドを含み、前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配置されているか、または機能的であるように連結されている前記核酸コンストラクトを含む。
別の実施形態では前記融合ペプチドはHISタグまたはSIINFEKLタグにさらに連結されている。別の実施形態ではそのタグ配列はC末端SIINFEKLおよび6Hisアミノ酸を含む。別の実施形態ではそのタグ配列はネオエピトープの簡単な検出を可能にするアミノ酸配列または核酸配列である。別の実施形態ではそのタグ配列は本明細書において開示されるネオエピトープの分泌を確認するためのアミノ酸配列または核酸配列である。当業者は、それらのタグの配列が前記プラスミドベクターまたはファージベクター上の融合ペプチド配列に組み込まれる場合があることを理解する。これらのタグが発現し、臨床医がこれらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することにより、分泌されたペプチドの免疫原性を追跡することを可能にする抗原性エピトープが提示される場合がある。そのような免疫応答は、限定されないが、これらのタグに対して特異的なモノクローナル抗体およびDNAプローブまたはRNAプローブをはじめとする多数の試薬を使用してモニターされ得る。
別の実施形態では本発明の方法は、対象の脾臓および腫瘍内の制御性T細胞(Treg)に対するTエフェクター細胞の比率であって、対象の異常組織または非健常組織、例えば腫瘍組織または癌の内部に存在するネオエピトープを標的とする前記Tエフェクター細胞の比率を上げることであり、本明細書において提供される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法である。
別の実施形態では本発明の方法は、対象において抗原特異的T細胞を増加させるためのものであって、前記抗原またはそのペプチド断片が1つ以上のネオエピトープを含み、本明細書において提供される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法である。
別の実施形態では本発明の方法は、腫瘍を有するか、または癌を患う対象、または感染症を患う対象の生存時間を増加させるためのものであって、本明細書において提供される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法である。
別の実施形態では本発明の方法は、対象における腫瘍または癌または感染症または感染症を治療することであって、本明細書において提供される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法である。
I.免疫療法の個別化
I.免疫療法の個別化
1つの実施形態では本発明の方法により個別免疫療法が作成される。別の実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法の作成方法は、前記患者の疾患に特異的である変異および異型抗原(新抗原)内のネオエピトープを特定および選択することを含む。別の実施形態では対象向けの個別免疫療法の作成方法は前記対象への治療を提供するためにある。別の実施形態では個別免疫療法は、癌、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、細菌感染症、ウイルス感染症、およびHIVなどの慢性ウイルス病のような疾患を治療するために用いられ得る。
1つの実施形態では個別免疫療法の作成方法の一ステップは疾患または症状を有する対象より異常生体試料または非健常生体試料を獲得することである。本明細書において使用される場合、「異常生体試料または非健常生体試料」という用語は「疾患担持生体試料」または「疾患担持試料」と互換的に使用され、全て同じ意味と質を有する。1つの実施形態では生体試料は組織、細胞、血液、リンパ球を含む対象から得られるあらゆる試料、疾患担持細胞を含む対象から得られるあらゆる試料、または対象から得られる健常であるが、同じ対象もしくは類似の個体から得られる疾患担持試料にも匹敵するあらゆる試料である。
1つの実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は腫瘍組織または癌組織またはそれらの一部分を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は固形腫瘍であり得る。別の実施形態では腫瘍または癌は固形腫瘍または固形癌、例えば血液癌または腫瘍が生じない乳癌ではない。
別の実施形態では腫瘍試料は、腫瘍細胞または癌細胞を含有する患者、または腫瘍細胞または癌細胞を含有することが疑われる患者に由来する生体試料などのあらゆる試料に関する。その生体試料は血液、原発腫瘍から得られる組織試料、または腫瘍転移癌、もしくは腫瘍細胞もしくは癌細胞を含有する他のあらゆる試料から得られる組織試料などのあらゆる組織試料であり得る。さらに別の実施形態では生体試料は血液、唾液に由来する細胞、または脳脊髄液に由来する細胞である。別の実施形態では腫瘍試料は、循環腫瘍細胞(CTC)などの1つ以上の単離腫瘍細胞または癌細胞、または循環腫瘍細胞(CTC)などの1つ以上の単離腫瘍細胞もしくは癌細胞を含む試料に関する。別の実施形態では腫瘍または癌は乳癌または乳房腫瘍を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍を含む。別の実施形態では腫瘍または癌はHer2含有腫瘍またはHer2含有癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は黒色腫の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は膵臓腫瘍または膵臓癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は卵巣腫瘍または卵巣癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は胃腫瘍または胃癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は膵臓の癌病巣を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺性腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は多形神経膠芽腫の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は大腸腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺扁平腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は胃腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は卵巣表面上皮性新生物(例えばその良性、増殖性、または悪性の変種)の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は口腔扁平上皮癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺非小細胞癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は子宮内膜癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は膀胱腫瘍または膀胱癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は頭頚部腫瘍または頭頚部癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は前立腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は胃腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は口腔咽頭腫瘍または口腔咽頭癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺腫瘍または肺癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肛門腫瘍または肛門癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は大腸腫瘍または大腸癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は食道腫瘍または食道癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は中皮腫の腫瘍または癌を含む。
別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は非腫瘍組織または癌組織を含む。別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は血液試料から単離された細胞、唾液に由来する細胞、または脳脊髄液に由来する細胞を含む。別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は異常または非健常であると考えられるあらゆる組織またはその部分の試料を含む。
1つの実施形態では、本明細書において提供される前記方法に従って分析のために疾患担持生体試料を獲得することができる感染症をはじめとする他の非腫瘍疾患または非癌疾患が本発明によって包含される。別の実施形態では感染症はウイルス感染症を含む。別の実施形態では感染症は慢性ウイルス感染症を含む。別の実施形態では感染症はHIVなどの慢性ウイルス病を含む。別の実施形態では感染症は細菌感染症を含む。別の実施形態では前記感染症は寄生虫感染症である。
1つの実施形態ではその感染症は、限定されないが、以下の病原体のうちのいずれか1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、膣トリコモナス、または本明細書において挙げられていない当技術分野において知られている他のいずれかの感染症によって引き起こされる感染症である。
1つの実施形態では病原性原生動物および蠕虫による感染症にアメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、ニューモシスティス・カリニ、バベシア症、ランブル鞭毛虫症、旋毛虫病、フィラリア症、住血吸虫症、線虫症、吸虫症、または肝蛭症、および条虫(サナダムシ)症が挙げられる。
別の実施形態では前記感染症は家畜の感染症である。別の実施形態では家畜の疾患は、人間に伝染する可能性があり、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態ではこれらの疾患に口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ウシ感染性鼻気管炎(IBR)、仮性狂犬病、ブタコレラ(CSF)、牛の1型ウシヘルペスウイルス(BHV−1)感染によって生じるIBR、および豚の仮性狂犬病(オーエスキー病)、トキソプラズマ症、炭疽病、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト(エルシニア・ペスチス)、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。
1つの実施形態では、本明細書において提供される前記方法に従って分析のために疾患担持生体試料を獲得することができる自己免疫疾患をはじめとする他の非腫瘍疾患または非癌疾患が本発明によって包含される。当業者は、「自己免疫疾患」という用語が個体自身の組織、器官に対する免疫反応、またはその出現より生じる疾患または症状、またはその結果の状態を指すことを理解する。本明細書において使用される場合、「自己免疫疾患」という用語には診断学において自己組織を指向する抗体が必ずしも癌および他の疾患の状態に関与していないが、それでもなお重要であるその疾患の状態が含まれる。さらに、1つの実施形態ではその用語は、正常身体組織および正常な抗原と反応する抗体に関わるB細胞による自己抗体の産生により生じる、またはその自己抗体の産生により悪化する症状を指す。他の実施形態では自己免疫疾患は、自己抗原(例えば核抗原)に由来するエピトープに特異的である自己抗体の分泌を伴う疾患である。
1つの実施形態では、自己免疫疾患を有する対象を治療しようとする努力の中で本発明は、自己反応性ネオエピトープを特定する系および方法であって、抗体または免疫抑制細胞、例えばTregまたはMDSCが介在する寛容を誘導するためにこれらの自己反応性ネオエピトープに対して自己免疫疾患を有する対象を免疫する方法を含む前記系または方法を含む。
1つの実施形態では自己免疫疾患は全身性自己免疫疾患を含む。「全身性自己免疫疾患」という用語は1つより多くの器官に影響する自己免疫反応が原因の疾患、障害、または一群の症状を指す。別の実施形態では全身性自己免疫疾患には抗GBM腎炎(グッドパスチャー病)、多発性血管炎性肉芽腫症(GPA)、顕微鏡的多発性血管炎(MPA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性筋炎(PM)またはセリアック病が含まれるがこれらに限定されない。
1つの実施形態では自己免疫疾患は結合組織疾患を含む。「結合組織疾患」という用語は身体の結合組織に影響する自己免疫反応が原因の疾患、病気、または一群の症状を指す。別の実施形態では結合組織疾患には全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性筋炎(PM)、全身性硬化症または混合性結合組織病(MCTD)が含まれるがこれらに限定されない。
1つの実施形態では、本明細書において提供される前記方法に従って分析のために疾患担持生体試料を獲得することができる臓器移植拒絶反応をはじめとする他の非腫瘍疾患または非癌疾患が本発明によって包含される。別の実施形態では拒絶される器官は、限定されないが、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、腸、胃、精巣、角膜、皮膚、心臓弁、血管、または骨をはじめとする固形器官である。別の実施形態では拒絶される器官には血液組織、骨髄、またはランゲルハンス島細胞が含まれるがこれらに限定されない。
1つの実施形態では、移植された器官の拒絶を有する移植対象、または移植片宿主病(GVhD)を経験している移植対象を治療しようとする努力の中で本発明は、自己反応性ネオエピトープを特定する系および方法であって、抗体または免疫抑制細胞、例えばTregまたはMDSCが介在する寛容を誘導するためにこれらの自己反応性ネオエピトープに対して自己免疫疾患を有する対象を免疫する方法を含む前記系または方法を含む。
試料は当技術分野においてよく知られている日常的な生検技法を用いて獲得され得る。生検は医療専門家、例えば病理医による対象からの細胞または組織の摘出を含み得る。多種多様なタイプの生検技法がある。最も一般的なタイプには (1)組織試料だけが摘出される切開生検、(2)一塊の領域または疑わしい領域が摘出される切除生検、および(3)組織試料または液体試料が針で摘出される針生検が含まれる。太い針を使用するとき、その技法はコア生検と呼ばれる。細い針を使用するとき、その技法は細針生検と呼ばれる。
1つの実施形態では本発明の試料は切開生検によって獲得される。別の実施形態では試料は切除生検によって獲得される。別の実施形態では試料は針生検を用いて獲得される。別の実施形態では針生検はコア生検である。別の実施形態では生検は細針吸引生検である。別の実施形態では試料は血液試料の一部から獲得される。別の実施形態では試料は頬スワブの一部として獲得される。別の実施形態では試料は唾液試料採取の一部として獲得される。別の実施形態では生体試料は組織生検材料の全部または一部を含む。別の実施形態では組織生検材料が採取され、その組織試料に由来する細胞であって、本発明の生体試料を含む前記細胞が収集される。別の実施形態では本発明の試料は細胞生検材料の一部として獲得される。別の実施形態では同じ対象から複数の生検材料が採取され得る。別の実施形態では同じ組織または細胞から同じ対象に由来する複数の生検材料が収集され得る。別の実施形態では前記対象内の異なる組織の細胞源から同じ対象に由来する複数の生検材料が収集され得る。
1つの実施形態では生検材料は骨髄組織を含む。別の実施形態では生検材料は血液試料を含む。別の実施形態では生検材料は胃腸組織、例えば食道、胃、十二指腸、直腸、結腸、および末端回腸の生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は肺組織を含む。別の実施形態では生検材料は前立腺組織を含む。別の実施形態では生検材料は肝臓組織を含む。別の実施形態では生検材料は神経系組織、例えば脳生検材料、神経生検材料、または髄膜生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は泌尿生殖器組織、例えば腎臓生検材料、子宮内膜生検材料、または子宮頸部錐体生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は乳房生検材料を含む。別の実施形態では生検材料はリンパ節生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は筋肉生検材料を含む。さらに別の実施形態では生検材料は皮膚生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は骨生検材料を含む。別の実施形態では疾患組織の診断を確認するために各試料についての疾患担持試料病理検査が行われる。別の実施形態では健常組織の診断を確認するために健常試料が検査される。
1つの実施形態では正常生体試料または健常生体試料が前記対象から獲得される。別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は、対象に由来する生体試料などのあらゆる試料に関連する非腫瘍試料である。その試料は本明細書において提供される生体試料から獲得される健常細胞などのあらゆる組織試料であり得る。別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は、1つの実施形態では関連の個体である別の個体から獲得される。別の実施形態では別の個体は前記対象と同じ種の個体である。別の実施形態では別の個体は、疾患担持生体試料を含有していない、または疾患担持生体試料を含有することが疑われていない健康な個体である。別の実施形態では別の個体は、腫瘍細胞または癌細胞を含有しない、または腫瘍細胞もしくは癌細胞を含有することが疑われていない健康な個体である。当業者は、その個体が健康であることを判定するために疾患の存在についての当技術分野において知られている方法を用いてその健康な個体がスクリーニングされ得ることを理解する。疾患担持生体試料と健常生体試料は両方とも同じ組織(例えば、腫瘍組織とその周りの正常組織の両方を含む組織部分)から獲得することができる。好ましくは、健常生体試料は基本的に、または完全に正常健常細胞から構成され、疾患担持生体試料(例えば、癌細胞または特定の種類の癌細胞を含むと考えられる試料)との比較に使用することができる。それらの試料は同じタイプのもの(例えば、両方とも血液、または両方とも血清)であることが好ましい。例えば、疾患担持生体試料が細胞を含む場合、健常生体試料中の細胞がその疾患担持生体試料中の疾患担持細胞と同じ組織起源(例えば、肺または脳)を持ち、且つ、同じ細胞種(例えば、神経性、上皮性、間質性、造血性)から生じることが好ましい。
別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は同時に獲得される。「正常生体試料または健常生体試料」および「基準試料」または「基準組織」という用語は全体を通して互換的に使用され、全て同じ意味と質を有する。別の実施形態では「基準」は、腫瘍標本より得られた結果との相互関係を示し、且つ、腫瘍標本より得られた結果を比較するために使用され得る。別の実施形態では「基準」は、同じ種の充分に多数の正常標本を検査することにより経験的に決定され得る。別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は、異常試料または健常試料を獲得する前、またはその後にその正常試料または健常試料が獲得されるような時間であり得る異なる時点で獲得される。獲得方法は生検または採血について当技術分野において日常的に用いられている方法を含む。別の実施形態では試料は凍結試料である。別の実施形態では試料は組織パラフィン包埋(FFPE)組織ブロックとして構成される。
1つの実施形態では前記正常生体試料または健常生体試料の獲得の後に前記試料は、当技術分野においてよく知られている技術および方法を用いて核酸抽出のために加工される。別の実施形態では抽出された核酸はDNAを含む。別の実施形態では抽出された核酸はRNAを含む。別の実施形態ではRNAはmRNAである。別の実施形態では次世代シーケンシング(NGS)ライブラリーが調製される。次世代シーケンシングライブラリーが構築されてよく、次世代シーケンシングライブラリーがエクソームキャプチャまたは標的遺伝子キャプチャを行ってよい。別の実施形態では当技術分野において知られている技術を用いてcDNA発現ライブラリーが作製される。例えば、ここに完全に援用される米国特許出願公開第20140141992号明細書を参照されたい。
個別免疫療法を作成するための本発明の方法は、正常または健常試料と比べて異常試料または非健常試料に存在する体細胞突然変異または配列差異であって、発現されるアミノ酸をコードするこれらの配列にある前記体細胞突然変異または前記差異を特定するためにその異常試料または非健常試料に由来する抽出核酸とその正常試料または健常基準試料に由来する抽出核酸の使用を含み得る。1つの実施形態では前記体細胞突然変異または配列差異を発現するペプチドは、ある特定の実施形態では全体を通して「ネオエピトープ」と呼ばれ得る。
当業者は、「ネオエピトープ」という用語が基準試料、例えば正常非癌性細胞もしくは組織または生殖系列細胞もしくは組織などには存在しないが疾患担持組織、例えば癌細胞には見つかるエピトープも意味し得ることを理解する。別の実施形態では、これには正常非癌細胞または生殖系列細胞において対応するエピトープが見つかるが、しかしながら癌細胞では1つ以上の突然変異に起因してそのエピトープの配列がネオエピトープになるように変化している状況が含まれる。別の実施形態ではネオエピトープは変異型エピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープはそのエピトープの両側に非変異配列を有する。1つの実施形態ではネオエピトープは直鎖状エピトープである。別の実施形態ではネオエピトープは溶媒曝露されると考えられており、したがってT細胞抗原受容体にアクセス可能であると考えらえる。
別の実施形態では本明細書において提供される1つ以上のペプチドは1つ以上の免疫抑制性T調節性ネオエピトープを含まない。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により特定され、且つ、使用されるネオエピトープは免疫抑制性エピトープを含まない。別の実施形態では本明細書において提供される前記方法により特定され、且つ、使用されるネオエピトープはT調節性(Treg)細胞を活性化しない。
別の実施形態ではネオエピトープは免疫原性である。別の実施形態ではネオエピトープはT細胞エピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは適応免疫応答エピトープを含む。
別の実施形態ではネオエピトープは単一の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも2か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも2か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも3か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも4か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも5か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも6か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも7か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも8か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも9か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも10か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも20か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは1〜10か所、11〜20か所、20〜30か所、および31〜40か所の突然変異を含む。
別の実施形態ではネオエピトープは前記対象の前記疾患または症状と関連する。別の実施形態ではネオエピトープは前記対象の前記疾患または症状を引き起こす。別の実施形態ではネオエピトープは前記疾患担持生体試料内に存在する。別の実施形態ではネオエピトープは前記疾患担持生体組織内に存在するが、前記疾患または症状を引き起こさず、または前記疾患もしくは症状と関係ない。
別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは1個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは2個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは3個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは4個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは5個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは6個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは7個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは8個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは9個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは10個またはそれより多くのネオエピトープを含む。
1つの実施形態ではネオエピトープの特定ステップは、異常生体試料または非健常生体試料より得られた抽出核酸をシーケンシングすること、および正常生体基準試料または健常生体基準試料より得られた抽出核酸をシーケンシングすることを含む。別の実施形態では全ゲノムがシーケンシングされる。別の実施形態ではエクソームがシーケンシングされる。さらに別の実施形態ではトランスクリプトームがシーケンシングされる。別の実施形態ではT細胞受容体シーケンシングを用いてネオエピトープが特定される。
別の実施形態ではネオエピトープは以下、すなわち、Pavlenko M, Leder C, Roos AK, Levitsky V, Pisa P. (2005) Identification of an immunodominant H−2D(b)−restricted CTL epitope of human PSA. Prostate. 15;64(1):50−9 (PSAネオエピトープ)、Maciag PC, Seavey MM, Pan ZK, Ferrone S, Paterson Y. (2008) Cancer immunotherapy targeting the high molecular weight melanoma−associated antigen protein results in a broad antitumor response and reduction of pericytes in the tumor vasculature. Cancer Res. 1;68(19):8066−75 (HLA−A2マウスのHMW−MAAエピトープ)、Zhang KQ, Yang F, Ye J, Jiang M, Liu Y, Jin FS, Wu YZ. (2012) A novel DNA/peptide combined immunotherapy induces PSCA−specific cytotoxic T−lymphocyte responses and suppresses tumor growth in experimental prostate cancer. Urology.;79(6):1410.e7−13. doi: 10.1016/j.urology.2012.02.011. Epub 2012 Apr 17 (HLA−A2エピトープPSCA)、Kouiavskaia DV, Berard CA, Datena E, Hussain A, Dawson N, Klyushnenkova EN, Alexander RB. (2009)Vaccination with agonist peptide PSA: 154−163 (155L) derived from prostate specific antigen induced CD8 T−cell response to the native peptide PSA: 154−163 but failed to induce the reactivity against tumor targets expressing PSA: a phase 2 study in patients with recurrent prostate cancer.J Immunother.;32(6):655−66 (HLA−A2エピトープPSA)において開示される、当技術分野において知られているネオエピトープを含む。
「ゲノム」という用語は生物の染色体中の遺伝情報の総量を指す。「エクソーム」という用語はゲノムのコード領域を指す。「トランスクリプトーム」という用語は全てのRNA分子からなるセットを指す。
1つの実施形態によると核酸はデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)であり、より好ましくはRNAであり、最も好ましくはインビトロ転写されたRNA(ΓνRNA)または合成RNAである。本発明によると核酸にはゲノムDNA、cDNA、mRNA、組換え技術により生産された分子、および化学合成された分子が含まれる。別の実施形態では核酸は一本鎖または二本鎖の直鎖状または共有結合により閉環した分子として存在し得る。別の実施形態では核酸は単離されたものでよい。本発明によると「単離核酸」という用語は、その核酸が(i)インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して増幅され、(ii)クローニングにより組換え技術で生産され、(iii)例えば、切断とゲル電気泳動による分離により精製され、または(iv)例えば、化学合成により合成されたことを意味する。核酸は、特に鋳型DNAからのインビトロ 転写により調製することができるRNAの形態で 細胞への導入、すなわち、細胞の形質移入に使用され得る。また、RNAは使用前に配列の安定化、キャッピング、およびポリアデニル化により修飾され得る。
当業者は、「突然変異」という用語は基準配列と比較した前記核酸配列の変化または差異(ヌクレオチド置換、付加、または欠失、早期終止または停止)を包含し得ることを理解することになる。例えば、異常試料中に存在する変化または差異は正常試料には見られない。「体細胞突然変異」は生殖細胞(精子および卵)を除く体の細胞のいずれにおいても起こる可能性があり、したがって子供には受け渡されない。これらの変化は(常にというわけではないが)癌または他の疾患の原因となり得る。1つの実施形態では突然変異は非同義突然変異である。「非同義突然変異」という用語は翻訳産物中のアミノ酸置換などのアミノ酸変化を引き起こす突然変異、好ましくはヌクレオチド置換を指す。
異常試料が腫瘍または癌組織である場合、1つの実施形態では突然変異は「癌突然変異シグネチャ」を含むことがあり得る。「癌突然変異シグネチャ」という用語は、非癌性基準細胞と比較すると癌細胞中に存在する突然変異のセットを指す。前癌組織または異型組織、および同組織の体細胞突然変異が含まれる。
デジタル核型分析は遺伝病の原因となり得るあらゆる大きな染色体異常を見つけるために染色体分析に用いられる技術である。1つの実施形態ではデジタル核型分析を用いてシーケンシングおよび比較分析される染色体領域に焦点を合わせることができる。別の実施形態ではデジタル核型分析は、ゲノム全体の特定の座位に由来する、単離され、且つ、列挙されている短いDNA配列を分析して仮想的に実施される。
あらゆる適切なシーケンシング法を本発明に従って用いることができる。1つの実施形態では次世代シーケンシング(NGS)テクノロジーが用いられる。本方法のシーケンシングステップにかかる時間を短くするために将来的に第三世代のシーケンシング法がNGSテクノロジーの代わりになる可能性がある。明確化を目的として説明すると、本発明の背景における「次世代シーケンシング」または「NGS」という用語は、サンガー化学として知られる「コンベンショナル」シーケンシング法と対照的に、ゲノム全ゲノムを小断片に切断することにより全ゲノムに沿ってランダムに鋳型核酸を並行して読む全ての新規ハイスループットシーケンシング技術を意味する。そのようなNGS技術(大規模並行シーケンシング技術としても知られる)はゲノム全体、エクソーム、トランスクリプトーム(ゲノムの全転写配列)またはメチローム(ゲノムの全メチル化配列)の核酸配列情報を非常に短い時間で、例えば、1〜2週間以内、好ましくは1〜7日以内、または最も好ましくは24時間未満以内に配信することができ、且つ、原理的には一細胞シーケンシングアプローチを可能にする。商業的に利用可能である、または文献中で言及されている複数のNGSプラットフォーム、例えば、Zhang et al. 2011: The impact of next− generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95−109、またはVoelkerding et al. 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641−658に詳しく記載されているプラットフォームを本発明の背景で使用することができる。そのようなNGSテクノロジー/プラットフォームの非限定的な例には以下のものが含まれる。
1)例えば最初にRonaghi et al. 1998: A sequencing method based on real−time pyrophosphate''. Science 281 (5375), 363−365において記載されたRocheの関連会社である454 Life Sciences(コネチカット州ブランフォード)のGS−FLX 454ゲノムシーケンサー(商標)において実施されたパイロシーケンシングとして知られるシーケンシング・バイ・シンセシステクノロジー。この技術は、一本鎖DNA結合ビーズが激しいボルテックス混合により油によって周囲を覆われたPCR反応物を含有するエマルジョンPCR増幅用の水性ミセルに封入されているエマルジョンPCRを用いる。パイロシーケンシング工程の時、ポリメラーゼがDNA鎖を合成するときのヌクレオチドの取り込み時にリン酸分子から発せられる光が記録される。
2)可逆的ダイターミネーターに基づき、例えばIllumina Solexa Genome Analyzer(商標)およびIllumina HiSeq 2000 Genome Analyzer(商標)において実施されるSolexa(現在ではカリフォルニア州サンディエゴのIllumina Inc.の一部)により開発されたシーケンシング・バイ・シンセシスアプローチ。この技術では4種類全てのヌクレオチドがDNAポリメラーゼと共にフローセルチャネル中のオリゴプライマーがアニールされたクラスター断片に同時に加えられる。ブリッジ増幅によりシーケンシング用の4種類全ての蛍光標識ヌクレオチドでクラスター鎖が伸長する。
3)例えばApplied Biosystems(現在ではLife Technologies Corporation、カリフォルニア州カールスバッド)のSOLid(商標)プラットフォームにおいて実施されるシーケンシング・バイ・ライゲーションアプローチ。この技術では固定された長さの一群の全ての可能なオリゴヌクレオチドがシーケンシングされる位置に応じて標識される。オリゴヌクレオチドがアニールされ、且つ、ライゲーションされる。マッチする配列に対してのDNAリガーゼによる優先的なライゲーションによりその位置のヌクレオチド情報を知らせるシグナルが生じる。シーケンシングの前にDNAはエマルジョンPCRにより増幅される。同一のDNA分子のコピーだけをそれぞれ含有するそれにより生じたビーズがスライドグラス上に配置される。二つ目の例として、Dover Systems(ニューハンプシャー州セイラム)のPolonator(商標)G.007プラットフォームも、並行シーケンシング用にDNA断片を増幅するためにランダムアレイ化ビーズベースエマルジョンPCRを用いることによるシーケンシング・バイ・ライゲーションアプローチを用いている。
4)例えばPacific Biosciences(カリフォルニア州メンロパーク)のPacBio RSシステムまたは Helicos Biosciences(マサチューセッツ州ケンブリッジ)のHeliScope(商標)プラットフォームにおいて実施されるものなどの一分子シーケンシング技術。この技術のはっきりとした特徴は、一分子リアルタイム(SMRT)DNAシーケンシングとして定義される、増幅することなく単一のDNA分子またはRNA分子をシーケンシングするその能力である。例えば、HeliScopeは合成するときに各ヌクレオチドを直接的に検出するために非常に高感度の蛍光検出システムを使用している。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づく類似アプローチがVisigen Biotechnology(テキサス州ヒューストン)により開発されている。他の蛍光ベースの一分子技術はU.S.Genomicsの技術(GeneEngine(商標))とGenovoxxの技術(AnyGene(商標))である。
5)複製時の一本鎖上のポリメラーゼ分子の移動をモニターするためにチップ上に配置されている様々なナノ構造体を使用する一分子シーケンシング用ナノテクノロジー。ナノテクノロジーに基づくアプローチの非限定的な例はOxford Nanopore Technologies(英国オックスフォード)のGridON(商標)プラットフォーム、Nabsys(ロードアイランド州プロビデンス)により開発されたハイブリダイゼーション支援ナノポアシーケンシングプラットフォーム(HANS(商標))、およびコンビナトリアル・プローブアンカーライゲーション(cPAL(商標))と呼ばれる特許権で保護されたDNAナノボール(DNB)テクノロジーを使用するリガーゼベースDNAシーケンシングプラットフォームである。
6)一分子シーケンシング向け電子顕微鏡法ベースの技術、例えばLightSpeed Genomics(カリフォルニア州サニーベール)およびHalcyon Molecular(カリフォルニア州レッドウッドシティ)により開発された一分子シーケンシング向け電子顕微鏡法ベースの技術。
7)DNAの重合時に放出される水素イオンの検出に基づくイオンセミコンダクターシーケンシング。例えば、Ion Torrent Systems(カリフォルニア州サンフランシスコ)は.大規模並行的にこの生化学過程を実施するために微細加工ウェルの高密度アレイを使用する。各ウェルは異なる鋳型DNAを保持する。それらのウェルの下にイオン感受性層があり、その下に特許権で保護されたイオンセンサーがある。
幾つかの実施形態ではDNA調製物とRNA調製物がNGSの出発物質として働く。そのような核酸は生体材料などの試料から、例えば新鮮な瞬時凍結腫瘍組織またはホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織(FFPE)から、または新たに単離された細胞から、または患者の末梢血液に存在するCTCから容易に入手され得る。正常非変異型ゲノムDNAまたはRNAを正常、体細胞組織から抽出することができるが、しかしながら本発明の背景では生殖系列細胞が好ましい。生殖細胞系列DNAまたはRNAは非血液系悪性腫瘍を有している患者の末梢血単核細胞(PBMC)から抽出される。FFPE組織または新規単離単一細胞より抽出された核酸は非常によく断片化されているが、それらはNGS用途には適切である。
エクソームシーケンシング向けの幾つかの標的化NGS方法が文献中に記載されており(レビューには、例えばTeer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145−51参照)、それらの全てを本発明と併用することができる。これらの方法(例えばゲノムキャプチャ、ゲノムパーティショニング、ゲノムエンリッチメント等として記載される)の多くがハイブリダイゼーション技術を使用し、それらにはアレイベースハイブリダイゼーションアプローチ(例えばHodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522−1527)およびリキッドベースハイブリダイゼーションアプローチ(例えばChoi et al. 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096−19101)が含まれる。DNA試料調製とその後のエクソームキャプチャ用の市販のキットも利用可能であり、例えば、Illumina Inc.(カリフォルニア州サンディエゴ)はTruSeq(商標)DNA試料調製キットとExome濃縮キットTruSeq(商標)Exome Enrichment Kitを提供している。
本発明の背景では、「RNA」という用語は、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全または実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子を指す。「リボヌクレオチド」はβ−D−リボフラノシル基の2’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「RNA」という用語は二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的または完全に精製されたRNAなどの単離RNA、基本的に純粋なRNA、合成RNA、および1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および/または変化により天然RNAとは異なる改変型RNAなどの組換え技術により生成されたRNAを含む。そのような変化はRNAの末端または内部への非ヌクレオチド材料の付加など、非ヌクレオチド材料の付加、例えば、RNAの1つ以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。RNA分子中のヌクレオチドは非天然ヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドなどの非標準的ヌクレオチドを含むこともできる。これらの改変型RNAを類似体または天然RNA類似体と呼ぶことができる。
本発明によると、「RNA」という用語は「mRNA」を含み、且つ、好ましくは「mRNA」に関する。「mRNA」という用語は「メッセンジャーRNA」を意味し、そして鋳型DNAを使用して生成され、且つ、ペプチドまたはポリペプチドをコードする「転写物」に関する。典型的には、mRNAは5’−UTR、タンパク質コード領域、および3’−UTRを含む。細胞中およびインビトロではmRNAは限られた半減期しか持たない。本発明の背景ではmRNAは鋳型DNAからのインビトロ転写によって生成されてもよい。そのインビトロ転写法は当業者に知られている。例えば、市販されている様々なインビトロ転写キットがある。
1つの実施形態ではヒト組織(またはあらゆる非ヒト動物)より得られる生体試料(疾患および/または正常)に由来するDNAおよびRNAは三組抽出される。別の実施形態では疾患試料は腫瘍試料であり、前記試料新抗原/ネオエピトープの供給源を提供する。別の実施形態では新抗原の供給源は順次生じる転移癌または循環腫瘍細胞に由来する。当業者は、これらが、最初の生検材料には存在しないが、細胞傷害性T細胞(CTC)を特異的に標的とするベクター、またはシーケンシングされた最初の生検材料とは異なるように変異形成した転移癌には含まれ得る追加の突然変異を含む場合があり得ることを理解する。
1つの実施形態では本明細書の開示に従って得られた三組の各試料がDNAエクソームシーケンシングによってシーケンシングされる。ホールエクソームシーケンシングの後にVCFファイル出力データまたは他の適切なファイルが得られ、FASTA形式または当技術分野において知られている他のあらゆる適切な形式で表示される。1つの実施形態では「VCF」またはバリアントコール形式という用語はSNPおよび他の構造的遺伝子変異をコードするための1000ゲノムプロジェクトにより使用されるファイル形式である。その形式は1000ゲノムプロジェクトのウェッブサイト(www.1000genomes.org/wiki/Analysis/Variant%20Call%20Format/VCF%20%28Variant%20Call%20Format%29%20version%204.0/encoding−structural−variants)でさらに説明されている。VCFコールはEBI/NCBIにおいて利用可能である。1つの実施形態ではその表示は非同義突然変異を中央に置き、その突然変異がコードするアミノ酸の両側の10〜15アミノ酸を示している。フレームシフト突然変異は終止コドンまでコードされる変異型ペプチドの全配列を周囲の10〜15アミノ酸と共に示す。1つの実施形態ではVCFファイルまたは他の適切なファイルから関係する情報を抽出し、それをFASTA形式または他の適切な形式にすることによりハイドロパシー検査スクリプトとMHC結合親和性スクリプトの両方にそれらの21merネオエピトープ配列を直接的に入力することが可能になる。
1つの実施形態では疎水性は、カイト・ドゥーリトル(Kyte J, Doolittle RF (May 1982). “A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”. J. Mol. Biol. 157 (1): 105−32)、または他の適切なハイドロパシープロット、または、限定されないが、全ての文献の全体が参照により本明細書に援用されるRoseら(Rose, G.D. and Wolfenden, R. (1993) Annu. Rev. Biomol. Struct., 22, 381−415.)、Kallol M. Biswas, Daniel R. DeVido, John G. Dorsey(2003) Journal of Chromatography A,1000, 637−655、Eisenberg D (July 1984). Ann. Rev. Biochem. 53: 595−623.)、Abraham D.J., Leo A.J. Proteins: Structure, Function and Genetics 2:130−152(1987)、Sweet R.M., Eisenberg D. J. Mol. Biol. 171:479−488(1983)、Bull H.B., Breese K. Arch. Biochem. Biophys. 161:665−670(1974)、Guy H.R. Biophys J. 47:61−70(1985)、Miyazawa S., et al., Macromolecules 18:534−552(1985)、Roseman M.A. J. Mol. Biol. 200:513−522(1988)、Wolfenden R.V., et al. Biochemistry 20:849−855(1981)、Wilson K.J、Biochem. J. 199:31−41(1981)、Cowan R., Whittaker R.G. Peptide Research 3:75−80(1990)、Aboderin A.A. Int. J. Biochem. 2:537−544(1971)、Eisenberg D. et al., J. Mol. Biol. 179:125−142(1984)、Hopp T.P., Woods K.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824−3828(1981)、Manavalan P., Ponnuswamy P.K. Nature 275:673−674(1978)、Black S.D., Mould D.R. Anal. Biochem. 193:72−82(1991)、Fauchere J.−L., Pliska V.E. Eur. J. Med. Chem. 18:369−375(1983)、Janin J. Nature 277:491−492(1979)、Rao M.J.K., Argos P. Biochim. Biophys. Acta 869:197−214(1986)、Tanford C. J. Am. Chem. Soc. 84:4240−4274(1962)、Welling G.W., et al., FEBS Lett. 188:215−218(1985)、Parker J.M.R. et al., Biochemistry 25:5425−5431(1986)、Cowan R., Whittaker R.G. Peptide Research 3:75−80(1990)により開示される定量法をはじめとする他の適切な定量法を用いて定量される。別の実施形態では効率的な分泌には不満足なほど高レベルの疎水性を持つスコアがその定量関連の尺度で付いた全てのエピトープがリストから除かれるか、または選択から除かれる。別の実施形態では効率的な分泌には不満足なほど高レベルの疎水性を持つ1.6以上などのスコアがカイト・ドゥーリトル・プロットで付いた全てのエピトープがリストから除かれるか、または選択から除かれる。別の実施形態では対象HLAに結合する各新抗原の能力が、netMHCpan、ANN、SMMPMBEC、SMM、CombLib_Sidney2008、PickPocket、netMHCconsをはじめとする免疫エピトープデータベース(IEDB)分析資源を用いて評価される。他の情報源にはTEpredict(tepredict.sourceforge.net/help.html)または当技術分野において利用可能な代替的MHC結合測定スケールが含まれる。
別の実施形態では、対象向けの個別免疫療法を作成するための系であって、少なくとも1つの処理装置、および前記処理装置により実行されるプログラム命令を含む少なくとも1つの記憶媒体、前記プログラム命令によって前記処理装置が次のこと、すなわち、
a. 全ての新抗原/ネオエピトープおよび対象のヒト白血球抗原(HLA)タイプを含む出力データを受信すること、
b. 各エピトープの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるエピトープを除外すること、
c. 対象HLAに結合する残りの新抗原の能力、およびそれらの新抗原の予想MHC結合スコアに基づいてそれらの新抗原を数値により評価すること、
d. 各エピトープのアミノ酸配列をプラスミドに挿入すること、
e. 各コンストラクトの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるあらゆるコンストラクトを除外すること、
f. 最も高いスコアになったコンストラクトから開始して、各コンストラクトのアミノ酸配列を対応するDNA配列に翻訳すること、
g. 所定の上限に達するまでランク順に前記プラスミドコンストラクトに追加のエピトープを挿入すること、
h. 対象における免疫治療応答を測定するために前記コンストラクトの末端にDNA配列タグを付加すること、および
i. リステリア・モノサイトゲネスにおける発現および分泌のために前記エピトープおよびDNA配列タグを最適化すること、を含むステップを実行することになる前記系が本明細書において開示される。
a. 全ての新抗原/ネオエピトープおよび対象のヒト白血球抗原(HLA)タイプを含む出力データを受信すること、
b. 各エピトープの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるエピトープを除外すること、
c. 対象HLAに結合する残りの新抗原の能力、およびそれらの新抗原の予想MHC結合スコアに基づいてそれらの新抗原を数値により評価すること、
d. 各エピトープのアミノ酸配列をプラスミドに挿入すること、
e. 各コンストラクトの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるあらゆるコンストラクトを除外すること、
f. 最も高いスコアになったコンストラクトから開始して、各コンストラクトのアミノ酸配列を対応するDNA配列に翻訳すること、
g. 所定の上限に達するまでランク順に前記プラスミドコンストラクトに追加のエピトープを挿入すること、
h. 対象における免疫治療応答を測定するために前記コンストラクトの末端にDNA配列タグを付加すること、および
i. リステリア・モノサイトゲネスにおける発現および分泌のために前記エピトープおよびDNA配列タグを最適化すること、を含むステップを実行することになる前記系が本明細書において開示される。
1つの実施形態では一度ネオエピトープが特定されるとカイト・ドゥーリトル・ハイドロパシーインデックス21アミノ酸ウィンドウによってそのネオエピトープにスコアが付けられ、別の実施形態では特定のカットオフ値(約1.6)より上のスコアになるネオエピトープはリステリア・モノサイトゲネスによって分泌されない可能性があるので除外される。別の実施形態ではそのカットオフ値は次の範囲、1.2〜1.4、1.4〜1.6、1.6〜1.8、1.8〜2.0、2.0〜2.2 2.2〜2.5、2.5〜3.0、3.0〜3.5、3.5〜4.0、または4.0〜4.5から選択される。1つの実施形態では実施形態エピトープをリストから除外する、または選択除外するために使用されるカットオフ値スコアは1.6である。別の実施形態ではそのカットオフ値は1.4、1.5、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.3、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、または4.5である。別の実施形態ではそのカットオフ値は使用されている送達ベクターの属に応じて変化する。別の実施形態ではそのカットオフ値は使用されている送達ベクターの種に応じて変化する。
1つの実施形態ではカイト・ドゥーリトル・ハイドロパシーインデックス21アミノ酸スライディングウィンドウによってネオエピトープにスコアがつけられる。別の実施形態ではそのスライディングウィンドウサイズは9アミノ酸、11アミノ酸、13アミノ酸、15アミノ酸、17アミノ酸、19アミノ酸、および21アミノ酸を含む群より選択される。別の実施形態ではそのスライディングウィンドウサイズは9〜11アミノ酸、11〜13アミノ酸、13〜15アミノ酸、15〜17アミノ酸、17〜19アミノ酸、または19〜21アミノ酸である。
別の実施形態ではステップ(h)のDNA配列タグはSIINFEKL−6×Hisまたは当技術分野において利用可能な代用タグ配列である。別の実施形態では免疫抑制特性を有することが知られている新抗原が上のステップ(a)の前に考慮対象外とされる。1つの実施形態ではこれらの免疫抑制性エピトープは配列中に提示されるとおりであるか、またはエピトープ配列およびリンカーのスプライシングの結果として人工的に作製される。
1つの実施形態では本明細書において開示される方法によって得られる出力FASTAファイル(例えば、本明細書の実施例30参照)を使用して患者特異的コンストラクトが手作業かプログラムされたスクリプトのどちらかにより設計される。別の実施形態ではそのプログラムされたスクリプトは一連のプロトコルを使用して各対象向けの1つ以上のネオエピトープを含有する個別化血漿コンストラクトの作製を自動化する(図44)。その出力FASTAファイルを入力し、それらのプロトコルが実行された後に1つ以上のネオエピトープを含むLMベクターのDNA配列が出力される。そのソフトウェアプログラムは各対象向けの個別免疫療法の作成に有用である。
1つの実施形態ではネオエピトープを特定するために疾患担持試料と健常試料に由来する核酸配列が比較される。ネオエピトープはORF配列内にアミノ酸変化を含む。本明細書において使用される場合、ペプチドまたはタンパク質に関しての「配列変化」という用語はアミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体、およびアミノ酸置換変異体を指し、好ましくはアミノ酸置換変異体を指す。本発明によるとこれらの全ての配列変化が新しいエピトープを作製する可能性がある。
1つの実施形態ではアミノ酸挿入変異体は特定のアミノ酸配列中に単一の、または2個、またはそれより多くのアミノ酸の挿入を含む。別の実施形態ではアミノ酸付加変異体は1個以上のアミノ酸、例えば1個、2個、3個、4個、または5個、またはそれより多くのアミノ酸のアミノ末端融合および/またはカルボキシ末端融合を含む。別の実施形態ではアミノ酸欠失変異体は配列からの1個以上のアミノ酸の除去、例えば1個、2個、3個、4個、または5個、またはそれより多くのアミノ酸の除去を特徴とする。別の実施形態ではアミノ酸置換変異体は配列中の少なくとも1つの残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されることを特徴とする。
全ての試料がORF内の新規遺伝子シーケンシングについて分析される。前記疾患担持生体試料と健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を比較するための方法は、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールおよび関連のデジタルソフトウェアの使用を含む。バイオインフォマティクス分析を実施するための方法が当技術分野において知られており、例えば、各々が完全に本出願に援用される米国特許出願公開第2013/0210645号明細書、同第2014/0045881号明細書、および国際公開WO2014/052707号パンフレットを参照されたい。
ヒト腫瘍は顕著な数の体細胞突然変異を保持することが典型的である。しかしそれでも腫瘍を通してどの特定の遺伝子でも同一の突然変異が見つかることはまれである(最も一般的なドライバー突然変異についても低い頻度である)。したがって、1つの実施形態では患者特異的腫瘍突然変異を包括的に特定する本発明の方法により個別免疫療法の標的が提供される。
1つの実施形態では疾患担持試料から特定される突然変異が主要組織適合複合体クラスI分子(MHCI)上に提示される場合があり得る。1つの実施形態ではネオエピトープ突然変異を含有するペプチドは免疫原性であり、適応免疫系により「非自己」新抗原として認識される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では前記疾患または症状に対するT細胞免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では疾患または症状に対する適応免疫応答を治療的に活性化し得る。
別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗腫瘍または抗癌T細胞免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では抗腫瘍適応免疫応答または抗癌適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗自己免疫疾患T細胞免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では抗自己免疫疾患適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗感染症T細胞免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では抗感染症適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗臓器移植拒絶反応T細胞免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる1つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では疾患または症状に対する抗臓器移植拒絶反応適応免疫応答を治療的に活性化し得る。
別の実施形態では免疫原性応答の存在が1つ以上の免疫原性ネオエピトープの存在と相関する。別の実施形態では組換えリステリアがT細胞エピトープ、または適応免疫応答エピトープ、またはそれらのあらゆる組合せを含むネオエピトープをコードする核酸を含む。
1つの実施形態では本方法は1つ以上のネオエピトープを含む各アミノ酸配列を免疫原性応答についてスクリーニングすることを含み、免疫原性応答の存在が免疫原性エピトープを含む1つ以上のネオエピトープと相関する。別の実施形態では1つ以上の免疫原性ネオエピトープがペプチドに含まれる。別の実施形態では1つ以上の免疫原性ネオエピトープがポリペプチドに含まれる。別の実施形態では1つ以上の免疫原性ネオエピトープが融合ポリペプチドに含まれる。別の実施形態では1つ以上の免疫原性ネオエピトープがユビキチンポリペプチドに融合して含まれる。
別の実施形態では本方法は1つ以上のネオエピトープを含む各アミノ酸配列を免疫原性T細胞応答についてスクリーニングすることを含み、免疫原性T細胞応答の存在がT細胞エピトープを含む1つ以上のネオエピトープと相関する。別の実施形態では本方法は1つ以上のネオエピトープを含む各アミノ酸配列を適応免疫応答についてスクリーニングすることを含み、適応免疫応答の存在が適応免疫応答エピトープを含む1つ以上のネオエピトープと相関する。
1つの実施形態では、提供される個別免疫療法を作成するための前記系または方法における免疫原性T細胞応答のスクリーニングステップは、例えばT細胞増殖アッセイ、前記ネオエピトープで活性化されたT細胞を使用し、且つ、腫瘍細胞と共培養され、51Cr放出アッセイまたは3Hチミジンアッセイを用いる腫瘍退行アッセイ、ELISAアッセイ、ELIspotアッセイ、およびFACS分析をはじめとする当技術分野においてよく知られている免疫応答アッセイの使用を含む。(例えば、全体が本明細書に援用される米国特許第8771702号明細書、および欧州特許第1774332(B1)号明細書を参照されたい)。別の実施形態では免疫原性応答についてのスクリーニングステップは非T細胞応答を調査する。別の実施形態では提供される個別免疫療法の作成系または作成方法における非T細胞応答についてのスクリーニングステップは、サイトカイン産生の調査が異なる部分集合のサイトカイン、すなわち、IL−10およびIL−1βに焦点を当てていることを除いて上記のT細胞についてのアッセイと類似のアッセイをはじめとする当技術分野においてよく知られている免疫応答アッセイの使用を含む。(例えば、両方とも全体が本明細書に援用される米国特許第8962319号明細書および欧州特許第177432号明細書を参照されたい。例えば、51Cr放出アッセイによってT細胞免疫応答をアッセイしてよく、そのアッセイは1つ以上のネオエピトープを含む免疫療法でマウスを免疫するステップを含み、免疫後約10日に脾臓の採取が続き、その後でフィーダー細胞としての放射線照射したTC−1細胞(100:1、脾細胞:TC−1)と培養して脾細胞を確立し、インビトロで5日間にわたって刺激し、その後で標的として1つ以上のネオエピトープを含むペプチド/ポリペプチドを使用して標準的な51Cr放出アッセイにおいて使用することができる。
別の実施形態では免疫応答についてのスクリーニングステップは、例えば全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第2011/0129499号明細書に開示されるようにHLA−A2トランスジェニックマウスの使用を含む。
1つの実施形態では本方法は、特定されたT細胞ネオエピトープをコードする核酸配列、または前記特定されたT細胞ネオエピトープを含むペプチドを選択し、前記配列で組換え弱毒化リステリア株を形質転換することを含む。1つの実施形態では本方法は、特定された適応免疫応答ネオエピトープをコードする核酸配列、または前記特定された適応免疫応答ネオエピトープを含むペプチドを選択し、前記配列で組換え弱毒化リステリア株を形質転換することを含む。
1つの実施形態では本明細書に記載される系または方法は前記T細胞ネオエピトープの発現と分泌を確認するために前記リステリア株を培養し、その特徴を分析することを含む。1つの実施形態では本明細書に記載される系または方法は前記適応免疫応答ネオエピトープの発現と分泌を確認するために前記リステリア株を培養し、その特徴を分析することを含む。1つの実施形態では本明細書に記載される系または方法は前記1つ以上のペプチドの発現と分泌を確認するために前記リステリア株を培養し、その特徴を分析することを含む。
1つの実施形態では本発明の系または方法は所定の時点で前記対象に投与するために前記リステリアを保存すること、または前記リステリアを前記対象に投与し、前記リステリア株を免疫原性組成物の一部として投与することを含む。
II 組換え型リステリア株
II 組換え型リステリア株
1つの実施形態では本発明の組換え型リステリア株は核酸分子を含み、その核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含み、その融合ポリペプチドは1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドに融合している短縮型リステリオリジンO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列を含む。当業者は、1つ以上のエピトープを含む本明細書において提供される1つ以上のペプチドがまず免疫原性であってよく、それらの免疫原性がtLLO、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列などの免疫原性ポリペプチドと融合されるか、または混合されることにより増強されてよいことを理解する。別の実施形態では本発明の組換え型リステリア株は核酸分子を含み、その核酸分子は短縮型リステリオリシンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列をコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む。1つの実施形態ではその組換え型リステリア株は弱毒化されている。
1つの実施形態では1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む本明細書において提供される1つ以上のペプチドはそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している。
別の実施形態では短縮型リステリオリシンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列は異種抗原またはその断片に融合していない。別の実施形態では短縮型リステリオリシンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列は本明細書において提供される1つ以上のペプチドに融合していない。
別の実施形態では1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む本明細書において提供される1つ以上のペプチドは免疫原性組成物の一部として免疫原性ポリペプチドまたはその断片と混合される。
1つの実施形態では短縮型リステリオリシンO(LLO)タンパク質は推定上のPEST配列を含む。1つの実施形態では短縮型actAタンパク質はPEST含有アミノ酸配列を含む。別の実施形態では短縮型actAタンパク質は推定上のPEST含有アミノ酸配列を含む。
1つの実施形態ではPESTアミノ酸(AA)配列は短縮型LLO配列を含む。別の実施形態ではPESTアミノ酸配列はKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(配列番号1)である。別の実施形態ではリステリアに由来する他のLM PEST AA配列への抗原の融合によってもその抗原の免疫原性が増強される。
別の実施形態では本発明の方法および組成物のN末端LLOタンパク質断片は配列番号3を含む。別の実施形態ではその断片はLLOシグナルペプチドを含む。別の実施形態ではその断片は配列番号4を含む。別の実施形態ではその断片はほぼ配列番号4から構成される。別の実施形態ではその断片は配列番号4から本質的に構成される。別の実施形態ではその断片は配列番号4に対応する。別の実施形態ではその断片は配列番号4と相同である。別の実施形態ではその断片は配列番号4の断片と相同である。1つの実施形態では使用される短縮型LLOは前記シグナル配列を含まない。別の実施形態ではその短縮型LLOはシグナル配列を含む。活性化ドメインを有さず、且つ、特にシステイン484を有しないあらゆる短縮型LLOが本発明の方法および組成物に適切であることが当業者に明らかになる。別の実施形態では配列番号1のPEST AA配列を含むあらゆる短縮型LLOへの異種抗原の融合によりその抗原の細胞介在性免疫および抗腫瘍免疫が増強される。
本発明の免疫治療を構築するために利用されるLLOタンパク質は別の実施形態では以下の配列を有する:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(GenBank受託番号P13128;配列番号2;核酸配列はGenBank受託番号X15127で表される)。この配列に対応するプロタンパク質の最初の25個のAAはシグナル配列であり、それらは細菌によってLLOが分泌されるときにそれから切断される。したがって、この実施形態では全長活性型LLOタンパク質は504残基長である。別の実施形態では上記のLLO断片は本発明の免疫療法に組み込まれるLLO断片の供給源として使用される。
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(GenBank受託番号P13128;配列番号2;核酸配列はGenBank受託番号X15127で表される)。この配列に対応するプロタンパク質の最初の25個のAAはシグナル配列であり、それらは細菌によってLLOが分泌されるときにそれから切断される。したがって、この実施形態では全長活性型LLOタンパク質は504残基長である。別の実施形態では上記のLLO断片は本発明の免疫療法に組み込まれるLLO断片の供給源として使用される。
別の実施形態では本発明の組成物および方法において利用されるLLOタンパク質のN末端断片は、以下の配列を有する:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD (配列番号3)。
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD (配列番号3)。
別の実施形態ではそのLLO断片は本明細書において利用されるLLOタンパク質のおよそAA20〜442に対応する。
別の実施形態ではそのLLO断片は以下の配列を有する:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD (配列番号4)。
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD (配列番号4)。
別の実施形態では「N末端短縮型LLOタンパク質」、「N末端LLO断片」、「短縮型LLOタンパク質」、「ΔLLO」という用語、またはそれらの文法的に同等の用語は本明細書において互換的に使用され、非溶血性であるLLO断片を指す。別の実施形態ではこれらの用語は推定上のPEST配列を含むLLO断片を指す。
別の実施形態ではそのLLO断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態ではそのLLO断片は、システイン484を含む領域の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態ではLLOは、参照により本明細書に援用される米国特許第8771702号明細書に詳細に述べられるように、コレステロール結合ドメイン(CBD)の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
1つの実施形態では本発明はリステリオシンO(LLO)タンパク質を含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供し、前記LLOタンパク質は前記LLOタンパク質のコレステロール結合ドメイン(CBD)の残基C484、W491、W492、またはこれらの組み合わせの突然変異を含む。1つの実施形態では前記C484、W491、およびW492の残基は配列番号2の残基C484、W491、およびW492であるが、別の実施形態ではそれらの残基は、当業者に知られているように配列アラインメント使用して推測することができるような対応する残基である。1つの実施形態では残基C484、W491、およびW492に突然変異が形成されている。1つの実施形態では突然変異は置換であり、別の実施形態では欠失である。1つの実施形態ではCBD全体に突然変異が形成されており、一方で別の実施形態ではCBDの部分に突然変異が形成されており、一方で別の実施形態ではCBD内の特定の残基だけに突然変異が形成されている。
1つの実施形態では本発明は変異型LLOタンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供し、その変異型LLOタンパク質またはその断片は変異型LLOタンパク質またはその断片の突然変異領域に対する非LLOペプチドの置換を含み、突然変異領域はC484、W491、およびW492から選択される残基を含む。別の実施形態ではそのLLO断片はN末端LLO断片である。別の実施形態ではそのLLO断片は少なくとも492アミノ酸(AA)長である。別の実施形態ではそのLLO断片は492〜528AA長である。別の実施形態では前記非LLOペプチドは1〜50アミノ酸長である。別の実施形態では前記突然変異領域は1〜50アミノ酸長である。別の実施形態ではその非LLOペプチドはその突然変異領域と同一の長さである。別の実施形態ではその非LLOペプチドはその突然変異領域と異なる長さを有する。別の実施形態では前記置換は溶血活性に関する不活化突然変異である。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型LLOと比べた溶血活性の低下を呈する。別の実施形態ではその組換え型のタンパク質またはポリペプチドは非溶血性である。
本明細書において提示されるように、LLOの残基C484、W491、およびW492がアラニン残基で置換された突然変異型LLOタンパク質を作製した(実施例25)。その変異型LLOタンパク質、すなわち、mutLLOは大腸菌発現系で発現および精製され(実施例27)、野生型LLOと比べて実質的に低下した溶血活性を呈する(実施例28)ことができた。
別の実施形態では本発明は、(a)変異型LLOタンパク質であって、その変異型LLOタンパク質のコレステロール結合ドメインに含まれる内部欠失を含有する前記変異型LLOタンパク質、および(b)目的の異種ペプチドを含む組換え型のタンパク質またはポリペプチドを提供する。別の実施形態ではそのコレステロール結合ドメインの配列は配列番号101で表される。別の実施形態ではその内部欠失は11〜50アミノ酸内部欠失である。別の実施形態ではその内部欠失はその組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血活性を不活性化する。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型LLOに比べた溶血活性の低下を呈する。
別の実施形態では本発明は、(a)変異型LLOタンパク質であって、その変異型LLOタンパク質のコレステロール結合ドメインの断片に含まれる内部欠失を含有する前記変異型LLOタンパク質、および(b)目的の異種ペプチドを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供する。別の実施形態ではその内部欠失は1〜11アミノ酸内部欠失である。別の実施形態ではそのコレステロール結合ドメインの配列は配列番号101で表される。別の実施形態ではその内部欠失はその組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血活性を不活性化する。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型LLOに比べた溶血活性の低下を呈する。
別の実施形態では本発明の方法および組成物の突然変異領域は配列番号2の残基C484を含む 別の実施形態ではその突然変異領域は相同LLOタンパク質の対応するシステイン残基を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は配列番号2の残基W491を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は相同LLOタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は配列番号2の残基W492を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は相同LLOタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。相同タンパク質の対応する残基を特定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば配列アライメントがその方法に挙げられる。
別の実施形態ではその突然変異領域は残基C484およびW491を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は残基C484およびW492を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は残基W491およびW492を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は残基C484、W491およびW492を含む。
別の実施形態では本発明の方法および組成物の突然変異領域は変異型LLOタンパク質またはその断片のコレステロール結合ドメインを含む。例えば、配列番号2の残基470〜500、470〜510、または480〜500から構成される突然変異領域がそのCBD(残基483〜493)を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は変異型LLOタンパク質のCBD断片、またはその断片である。例えば、本明細書において提示されるように、それぞれがCBD断片である残基C484、W491、およびW492がアラニン残基に変更された(実施例25)。さらに、本明細書において提示されるように、残基484〜492のCBD断片がNY−ESO−1に由来する異種配列で置き換えられた(実施例26)。別の実施形態ではその突然変異領域は変異型LLOタンパク質のCBDまたはその断片と重なる。例えば、配列番号2の残基470〜490、480〜488、490〜500、または486〜510から構成される突然変異領域がそのCBDを含む。別の実施形態では単一のペプチドがシグナル配列に欠失を、CBDに突然変異または置換を有してよい。本発明の別個の実施形態により各可能性が表される。
別の実施形態ではその突然変異領域の長さは1〜50AAである。別の実施形態ではその長さは1〜11AAである。別の実施形態ではその長さは2〜11AAである。別の実施形態ではその長さは3〜11AAである。別の実施形態ではその長さは4〜11AAである。別の実施形態ではその長さは5〜11AAである。別の実施形態ではその長さは6〜11AAである。別の実施形態ではその長さは7〜11AAである。別の実施形態ではその長さは8〜11AAである。別の実施形態ではその長さは9〜11AAである。別の実施形態ではその長さは10〜11AAである。別の実施形態ではその長さは1〜2AAである。別の実施形態ではその長さは1〜3AAである。別の実施形態ではその長さは1〜4AAである。別の実施形態ではその長さは1〜5AAである。別の実施形態ではその長さは1〜6AAである。別の実施形態ではその長さは1〜7AAである。別の実施形態ではその長さは1〜8AAである。別の実施形態ではその長さは1〜9AAである。別の実施形態ではその長さは1〜10AAである。別の実施形態ではその長さは2〜3AAである。別の実施形態ではその長さは2〜4AAである。別の実施形態ではその長さは2〜5AAである。別の実施形態ではその長さは2〜6AAである。別の実施形態ではその長さは2〜7AAである。別の実施形態ではその長さは2〜8AAである。別の実施形態ではその長さは2〜9AAである。別の実施形態ではその長さは2〜10AAである。別の実施形態ではその長さは3〜4AAである。別の実施形態ではその長さは3〜5AAである。別の実施形態ではその長さは3〜6AAである。別の実施形態ではその長さは3〜7AAである。別の実施形態ではその長さは3〜8AAである。別の実施形態ではその長さは3〜9AAである。別の実施形態ではその長さは3〜10AAである。別の実施形態ではその長さは11〜50AAである。別の実施形態ではその長さは12〜50AAである。別の実施形態ではその長さは11〜15AAである。別の実施形態ではその長さは11〜20AAである。別の実施形態ではその長さは11〜25AAである。別の実施形態ではその長さは11〜30AAである。別の実施形態ではその長さは11〜35AAである。別の実施形態ではその長さは11〜40AAである。別の実施形態ではその長さは11〜60AAである。別の実施形態ではその長さは11〜70AAである。別の実施形態ではその長さは11〜80AAである。別の実施形態ではその長さは11〜90AAである。別の実施形態ではその長さは11〜100AAである。別の実施形態ではその長さは11〜150AAである。別の実施形態ではその長さは15〜20AAである。別の実施形態ではその長さは15〜25AAである。別の実施形態ではその長さは15〜30AAである。別の実施形態ではその長さは15〜35AAである。別の実施形態ではその長さは15〜40AAである。別の実施形態ではその長さは15〜60AAである。別の実施形態ではその長さは15〜70AAである。別の実施形態ではその長さは15〜80AAである。別の実施形態ではその長さは15〜90AAである。別の実施形態ではその長さは15〜100AAである。別の実施形態ではその長さは15〜150AAである。別の実施形態ではその長さは20〜25AAである。別の実施形態ではその長さは20〜30AAである。別の実施形態ではその長さは20〜35AAである。別の実施形態ではその長さは20〜40AAである。別の実施形態ではその長さは20〜60AAである。別の実施形態ではその長さは20〜70AAである。別の実施形態ではその長さは20〜80AAである。別の実施形態ではその長さは20〜90AAである。別の実施形態ではその長さは20〜100AAである。別の実施形態ではその長さは20〜150AAである。別の実施形態ではその長さは30〜35AAである。別の実施形態ではその長さは30〜40AAである。別の実施形態ではその長さは30〜60AAである。別の実施形態ではその長さは30〜70AAである。別の実施形態ではその長さは30〜80AAである。別の実施形態ではその長さは30〜90AAである。別の実施形態ではその長さは30〜100AAである。別の実施形態ではその長さは30〜150AAである。本発明の別の実施形態により各可能性が表される。
別の実施形態では本発明の方法および組成物の置換突然変異はLLOタンパク質またはその断片の突然変異領域が同数の異種AAで置き換えられている突然変異である。別の実施形態ではその突然変異領域のサイズよりも大きい数の異種AAが導入される。別の実施形態ではその突然変異領域のサイズよりも小さい数の異種AAが導入される。本発明の別の実施形態により各可能性が表される。
別の実施形態ではその置換突然変異は単一の残基の点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は2残基の点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は3残基の点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は3残基より多くの点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は数残基の点突然変異である。別の実施形態では点突然変異に含まれる複数の残基が連続している。別の実施形態ではそれらの複数の残基は連続していない。
別の実施形態では本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドの突然変異領域を置き換える非LLOペプチドの長さは1〜50AAである。別の実施形態ではその長さは1〜11AAである。別の実施形態ではその長さは2〜11AAである。別の実施形態ではその長さは3〜11AAである。別の実施形態ではその長さは4〜11AAである。別の実施形態ではその長さは5〜11AAである。別の実施形態ではその長さは6〜11AAである。別の実施形態ではその長さは7〜11AAである。別の実施形態ではその長さは8〜11AAである。別の実施形態ではその長さは9〜11AAである。別の実施形態ではその長さは10〜11AAである。別の実施形態ではその長さは1〜2AAである。別の実施形態ではその長さは1〜3AAである。別の実施形態ではその長さは1〜4AAである。別の実施形態ではその長さは1〜5AAである。別の実施形態ではその長さは1〜6AAである。別の実施形態ではその長さは1〜7AAである。別の実施形態ではその長さは1〜8AAである。別の実施形態ではその長さは1〜9AAである。別の実施形態ではその長さは1〜10AAである。別の実施形態ではその長さは2〜3AAである。別の実施形態ではその長さは2〜4AAである。別の実施形態ではその長さは2〜5AAである。別の実施形態ではその長さは2〜6AAである。別の実施形態ではその長さは2〜7AAである。別の実施形態ではその長さは2〜8AAである。別の実施形態ではその長さは2〜9AAである。別の実施形態ではその長さは2〜10AAである。別の実施形態ではその長さは3〜4AAである。別の実施形態ではその長さは3〜5AAである。別の実施形態ではその長さは3〜6AAである。別の実施形態ではその長さは3〜7AAである。別の実施形態ではその長さは3〜8AAである。別の実施形態ではその長さは3〜9AAである。別の実施形態ではその長さは3〜10AAである。別の実施形態ではその長さは11〜50AAである。別の実施形態ではその長さは12〜50AAである。別の実施形態ではその長さは11〜15AAである。別の実施形態ではその長さは11〜20AAである。別の実施形態ではその長さは11〜25AAである。別の実施形態ではその長さは11〜30AAである。別の実施形態ではその長さは11〜35AAである。別の実施形態ではその長さは11〜40AAである。別の実施形態ではその長さは11〜60AAである。別の実施形態ではその長さは11〜70AAである。別の実施形態ではその長さは11〜80AAである。別の実施形態ではその長さは11〜90AAである。別の実施形態ではその長さは11〜100AAである。別の実施形態ではその長さは11〜150AAである。別の実施形態ではその長さは15〜20AAである。別の実施形態ではその長さは15〜25AAである。別の実施形態ではその長さは15〜30AAである。別の実施形態ではその長さは15〜35AAである。別の実施形態ではその長さは15〜40AAである。別の実施形態ではその長さは15〜60AAである。別の実施形態ではその長さは15〜70AAである。別の実施形態ではその長さは15〜80AAである。別の実施形態ではその長さは15〜90AAである。別の実施形態ではその長さは15〜100AAである。別の実施形態ではその長さは15〜150AAである。別の実施形態ではその長さは20〜25AAである。別の実施形態ではその長さは20〜30AAである。別の実施形態ではその長さは20〜35AAである。別の実施形態ではその長さは20〜40AAである。別の実施形態ではその長さは20〜60AAである。別の実施形態ではその長さは20〜70AAである。別の実施形態ではその長さは20〜80AAである。別の実施形態ではその長さは20〜90AAである。別の実施形態ではその長さは20〜100AAである。別の実施形態ではその長さは20〜150AAである。別の実施形態ではその長さは30〜35AAである。別の実施形態ではその長さは30〜40AAである。別の実施形態ではその長さは30〜60AAである。別の実施形態ではその長さは30〜70AAである。別の実施形態ではその長さは30〜80AAである。別の実施形態ではその長さは30〜90AAである。別の実施形態ではその長さは30〜100AAである。別の実施形態ではその長さは30〜150AAである。
別の実施形態では本発明の方法および組成物のLLO断片の長さは少なくとも484AAである。別の実施形態ではその長さは484AAを超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも489AAである。別の実施形態ではその長さは489を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも493AAである。別の実施形態ではその長さは493を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも500AAである。別の実施形態ではその長さは500を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも505AAである。別の実施形態ではその長さは505を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも510AAである。別の実施形態ではその長さは510を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも515AAである。別の実施形態ではその長さは515を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも520AAである。別の実施形態ではその長さは520を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも525AAである。別の実施形態ではその長さは520を超える。本明細書においてLLO断片の長さに言及するとき、シグナル配列が含まれる。したがって、CBD内の第1システインの番号は484であり、AA残基の総数は529である。
別の実施形態では本発明は、(a)変異型LLOタンパク質であって、その変異型LLOタンパク質のコレステロール結合ドメインに含まれる内部欠失を含有する前記変異型LLOタンパク質、および(b)本明細書において提供される1つ以上のエピトープを含むペプチドを含む組換えタンパク質またはポリペプチド、または同タンパク質もしくはポリペプチドを備える本明細書において提供される弱毒化リステリア株を提供する。別の実施形態ではそのコレステロール結合ドメインの配列は配列番号101で表される。別の実施形態ではその内部欠失は1〜11アミノ酸内部欠失、1〜50アミノ酸内部欠失、または11〜50アミノ酸内部欠失である。別の実施形態ではその内部欠失はその組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血活性を不活性化する。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型LLOに比べた溶血活性の低下を呈する。
別の実施形態では本発明のペプチドは融合ペプチドである。別の実施形態では「融合ペプチド」はペプチド結合または他の化学結合によって互いに連結した2つ以上のタンパク質を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。別の実施形態では前記タンパク質はペプチド結合または他の化学結合によって直接的に互いに連結されている。別の実施形態では前記タンパク質はそれらの2つ以上のタンパク質の間の1個以上のAA(例えば、「スペーサー」)によって互いに連結されている。
本明細書において提示されるように、LLOの残基C484、W491、およびW492が抗原NY−ESO−1由来のCTLエピトープで置換された突然変異型LLOタンパク質を作製した(実施例26)。その変異型LLOタンパク質、すなわち、mutLLOは大腸菌発現系で発現および精製され(実施例27)、野生型LLOと比べて実質的に低下した溶血活性を呈する(実施例28)ことができた。当業者は、本明細書において提供される方法または過程により特定されるあらゆるネオエピトープをLLOのCBDの置換または置き換えに使用することができることを理解する。
別の実施形態では本発明の方法および組成物の内部欠失の長さは1〜50AAである。別の実施形態ではその長さは1〜11AAである。別の実施形態ではその長さは2〜11AAである。別の実施形態ではその長さは3〜11AAである。別の実施形態ではその長さは4〜11AAである。別の実施形態ではその長さは5〜11AAである。別の実施形態ではその長さは6〜11AAである。別の実施形態ではその長さは7〜11AAである。別の実施形態ではその長さは8〜11AAである。別の実施形態ではその長さは9〜11AAである。別の実施形態ではその長さは10〜11AAである。別の実施形態ではその長さは1〜2AAである。別の実施形態ではその長さは1〜3AAである。別の実施形態ではその長さは1〜4AAである。別の実施形態ではその長さは1〜5AAである。別の実施形態ではその長さは1〜6AAである。別の実施形態ではその長さは1〜7AAである。別の実施形態ではその長さは1〜8AAである。別の実施形態ではその長さは1〜9AAである。別の実施形態ではその長さは1〜10AAである。別の実施形態ではその長さは2〜3AAである。別の実施形態ではその長さは2〜4AAである。別の実施形態ではその長さは2〜5AAである。別の実施形態ではその長さは2〜6AAである。別の実施形態ではその長さは2〜7AAである。別の実施形態ではその長さは2〜8AAである。別の実施形態ではその長さは2〜9AAである。別の実施形態ではその長さは2〜10AAである。別の実施形態ではその長さは3〜4AAである。別の実施形態ではその長さは3〜5AAである。別の実施形態ではその長さは3〜6AAである。別の実施形態ではその長さは3〜7AAである。別の実施形態ではその長さは3〜8AAである。別の実施形態ではその長さは3〜9AAである。別の実施形態ではその長さは3〜10AAである。別の実施形態ではその長さは11〜50AAである。別の実施形態ではその長さは12〜50AAである。別の実施形態ではその長さは11〜15AAである。別の実施形態ではその長さは11〜20AAである。別の実施形態ではその長さは11〜25AAである。別の実施形態ではその長さは11〜30AAである。別の実施形態ではその長さは11〜35AAである。別の実施形態ではその長さは11〜40AAである。別の実施形態ではその長さは11〜60AAである。別の実施形態ではその長さは11〜70AAである。別の実施形態ではその長さは11〜80AAである。別の実施形態ではその長さは11〜90AAである。別の実施形態ではその長さは11〜100AAである。別の実施形態ではその長さは11〜150AAである。別の実施形態ではその長さは15〜20AAである。別の実施形態ではその長さは15〜25AAである。別の実施形態ではその長さは15〜30AAである。別の実施形態ではその長さは15〜35AAである。別の実施形態ではその長さは15〜40AAである。別の実施形態ではその長さは15〜60AAである。別の実施形態ではその長さは15〜70AAである。別の実施形態ではその長さは15〜80AAである。別の実施形態ではその長さは15〜90AAである。別の実施形態ではその長さは15〜100AAである。別の実施形態ではその長さは15〜150AAである。別の実施形態ではその長さは20〜25AAである。別の実施形態ではその長さは20〜30AAである。別の実施形態ではその長さは20〜35AAである。別の実施形態ではその長さは20〜40AAである。別の実施形態ではその長さは20〜60AAである。別の実施形態ではその長さは20〜70AAである。別の実施形態ではその長さは20〜80AAである。別の実施形態ではその長さは20〜90AAである。別の実施形態ではその長さは20〜100AAである。別の実施形態ではその長さは20〜150AAである。別の実施形態ではその長さは30〜35AAである。別の実施形態ではその長さは30〜40AAである。別の実施形態ではその長さは30〜60AAである。別の実施形態ではその長さは30〜70AAである。別の実施形態ではその長さは30〜80AAである。別の実施形態ではその長さは30〜90AAである。別の実施形態ではその長さは30〜100AAである。別の実施形態ではその長さは30〜150AAである。
別の実施形態では内部欠失を含む本発明の変異型LLOタンパク質はその内部欠失を除いて完全長である。別の実施形態ではその変異型LLOタンパク質は追加的な内部欠失を含む。別の実施形態ではその変異型LLOタンパク質は1つより多くの追加的な内部欠失を含む。別の実施形態ではその変異型LLOタンパク質はC末端から短縮されている。
別の実施形態では本発明の方法および組成物の内部欠失は変異型LLOタンパク質またはその断片のCBDを含む。例えば、配列番号2の残基470〜500、470〜510、または480〜500から構成される内部欠失はそのCBD(残基483〜493)を含む。別の実施形態ではその内部欠失は変異型LLOタンパク質またはその断片のCBD断片である。例えば、残基484〜492、485〜490、および486〜488は全て配列番号2のCBDの断片である。別の実施形態ではその内部欠失は変異型LLOタンパク質またはその断片のCBDと重なる。例えば、配列番号2の残基470〜490、480〜488、490〜500、または486〜510から構成される内部欠失はそのCBDを含む。
別の実施形態では短縮型LLO断片はLLOタンパク質の最初の441AAを含む。別の実施形態ではそのLLO断片はLLOの最初の420AAを含む。別の実施形態ではそのLLO断片は野生型LLOタンパク質の非溶血性形態である。
別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜25から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜50から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜75から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜100から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜125から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜150から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜175から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜200から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜225から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜250から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜275から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜300から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜325から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜350から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜375から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜400から構成される。別の実施形態ではそのLLO断片はおよそ残基1〜425から構成される。
別の実施形態ではそのLLO断片は上記のAA範囲のうちの1つに対応する相同LLOタンパク質の残基を含有する。別の実施形態ではそれらの残基番号は上に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同LLOタンパク質が本明細書において利用されるLLOタンパク質と比べて挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態ではそのLLO断片は当技術分野において知られている他のあらゆるLLO断片である。
相同タンパク質の対応する残基を特定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば配列アライメントがその方法に挙げられる。1つの実施形態では相同LLOは、LLO配列(例えば、配列番号2〜4のうちの1つ)に対する70%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同LLOは配列番号 2〜4のうちの1つに対する72%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する75%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する78%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する80%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する82%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する83%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する85%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する87%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する88%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する90%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する92%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する93%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する95%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する96%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する97%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する98%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する99%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 2〜4のうちの1つに対する100%の同一性を指す。
「PESTアミノ酸配列」、「PEST配列」、「PEST配列ペプチド」、「PESTペプチド」、または「PEST配列含有タンパク質またはペプチド」という用語は本明細書において互換的に使用される。当業者は、これらの用語に短縮型LLOタンパク質が包含される場合があり、それは1つの実施形態ではN末端LLOであり、または別の実施形態では短縮型ActAタンパク質であることを理解する。PEST配列ペプチドは当技術分野において知られており、米国特許第7635479号明細書、および米国特許出願公開第2014/0186387号明細書に記載されており、これらの両方の全体が本明細書に援用される。
別の実施形態では、L.モノサイトゲネスについてRechsteiner and Roberts(TBS 21:267−271, 1996)によって記載されるものなどの方法に従って原核生物のPEST配列を日常的に特定することができる。あるいは、この方法に基づいて他の原核生物由来のPESTアミノ酸配列を特定することもできる。PESTアミノ酸配列が期待される他の原核生物には他のリステリア属の種が含まれるが、これらに限定されない。例えば、L.モノサイトゲネスのタンパク質ActAは4つのそのような配列を含有する。これらは、KTEEQPSEVNTGPR(配列番号5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(配列番号6)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(配列番号7)、およびRGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(配列番号8)である。また、ストレプトコッカス属の種に由来するストレプトリジンOもPEST配列を含有する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスのストレプトリジンOはアミノ酸35〜51にPEST配列KQNTASTETTTTNEQPK(配列番号9)を含み、ストレプトコッカス・エクイシミリスのストレプトリジンOはアミノ酸38〜54にPEST様配列KQNTANTETTTTNEQPK(配列番号10)を含む。さらに、PEST配列を抗原タンパク質の中に埋め込むことができると考えられる。したがって、本発明の目的のため、PEST配列融合に関するときは「融合」という言葉によって、抗原タンパク質が抗原と、その抗原の一端に連結されているか、またはその抗原の中に埋め込まれるかのいずれかのPESTアミノ酸配列の両方を含むことを意味する。他の実施形態ではPEST配列またはPEST含有ポリペプチドは融合タンパク質の一部でもなく、そのポリペプチドが異種抗原を含むこともない。
「核酸配列」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸コンストラクト」という用語は本明細書において互換的に使用され、それらの用語はDNA分子またはRNA分子を指してよく、それらの分子には原核生物配列、真核生物mRNA、真核生物mRNA由来のcDNA、真核生物(例えば、哺乳類)DNA由来のゲノムDNA配列、および甚だしくは合成DNA配列も含まれるがこれらに限定されない。この用語はDNAおよびRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。この用語は少なくとも2つの塩基/糖/リン酸化合物からなる鎖を指す場合もある。この用語は一量体単位の核酸重合体を指す場合もある。1つの実施形態ではRNAは、tRNA(転移RNA)、snRNA(核内低分子RNA)、rRNA(リボソームRNA)、mRNA(メッセンジャーRNA)、アンチセンスRNA、阻害的低分子RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、およびリボザイムの形態であってよい。siRNAおよびmiRNAの使用が記述されている(Caudy AA et al, Genes & Devel 16:2491−96およびそれに引用された参照文献)。DNAはプラスミドDNA、ウイルスDNA、直鎖状DNA、もしくは染色体DNAの形態であってよく、またはこれらの群の誘導体であってよい。加えて、これらの形態のDNAおよびRNAは一本鎖、二本鎖、三重鎖、または四重鎖であってもよい。別の実施形態ではこれらの用語は他の種類の骨格を含むが、同じ塩基を含む人工核酸も含み得る。1つの実施形態ではこの人工核酸はPNA(ペプチド核酸)である。PNAはペプチド骨格およびヌクレオチド塩基を含有し、1つの実施形態ではDNA分子とRNA分子の両方に結合することができる。別の実施形態ではヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態ではヌクレオチドは、1つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では人工核酸は当技術分野において知られている天然核酸のリン酸骨格の他のあらゆる変異形を含有する。ホスホロチオエート核酸およびPNAの使用は当業者に知られており、例えばNeilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353−57、およびRaz NK et al Biochem Biophys Res Commun.297:1075−84に記載される。核酸の生産および使用が当業者に知られており、例えばMolecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell編、およびMethods in Enzymology:Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio and G. C. Fareedに記載される。
別の実施形態では本明細書において提供される核酸分子はエピソームベクターまたはプラスミドベクターから発現する。別の実施形態ではそのプラスミドは抗生物質選択が無い状態で組換え型リステリア株において安定的に維持される。別の実施形態ではそのプラスミドは組換え型リステリアに対して抗生物質耐性を付与しない。
1つの実施形態では本明細書において提供される免疫原性ポリペプチドまたはその断片はActAタンパク質またはその断片である。1つの実施形態ではActAタンパク質は配列番号11で表される配列を含む:
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPLIPTEEELNGRGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDRLADLRDRGTGKHSRNAGFLPLNPFISSPVPSLTPKVPKISAPALISDITKKAPFKNPSQPLNVFNKKTTTKTVTKKPTPVKTAPKLAELPATKPQETVLRENKTPFIEKQAETNKQSINMPSLPVIQKEATESDKEEMKPQTEEKMVEESESANNANGKNRSAGIEEGKLIAKSAEDEKAKEEPGNHTTLILAMLAIGVFSLGAFIKIIQLRKNN (配列番号11)。
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPLIPTEEELNGRGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDRLADLRDRGTGKHSRNAGFLPLNPFISSPVPSLTPKVPKISAPALISDITKKAPFKNPSQPLNVFNKKTTTKTVTKKPTPVKTAPKLAELPATKPQETVLRENKTPFIEKQAETNKQSINMPSLPVIQKEATESDKEEMKPQTEEKMVEESESANNANGKNRSAGIEEGKLIAKSAEDEKAKEEPGNHTTLILAMLAIGVFSLGAFIKIIQLRKNN (配列番号11)。
この配列に対応するプロタンパク質の最初の29個のAAはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにActAタンパク質から切断される。1つの実施形態ではActAポリペプチドまたはペプチドは上記配列番号11のAA1〜29のシグナル配列を含む。別の実施形態ではActAポリペプチドまたはペプチドは上記配列番号11のAA1〜29のシグナル配列を含まない。
1つの実施形態では短縮型ActAタンパク質はActAタンパク質のN末端断片を含む。別の実施形態では短縮型ActAタンパク質はActAタンパク質のN末端断片である。1つの実施形態では短縮型ActAタンパク質は配列番号12で表される配列を含む:
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP (配列番号12)。
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP (配列番号12)。
別の実施形態ではそのActA断片は配列番号12で表される配列を含む。
別の実施形態では短縮型ActAタンパク質は配列番号13で表される配列を含む:
MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKG (配列番号13)。
MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKG (配列番号13)。
別の実施形態ではそのActA断片は当技術分野において知られている他のあらゆるActA断片である。別の実施形態ではそのActA断片は免疫原性断片である。
別の実施形態ではActAタンパク質は配列番号14で表される配列を含む:
M G L N R F M R A M M V V F I T A N C I T I N P D I I F A A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K I D E N P E V K K A I V D K S A G L I D Q L L T K K K S E E V N A S D F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P T P S E P S S F E F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P A T S E P S S F E F P P P P T E D E L E I M R E T A P S L D S S F T S G D L A S L R S A I N R H S E N F S D F P L I P T E E E L N G R G G R P T S E E F S S L N S G D F T D D E N S E T T E E E I D R L A D L R D R G T G K H S R N A G F L P L N P F I S S P V P S L T P K V P K I S A P A L I S D I T K K A P F K N P S Q P L N V F N K K T T T K T V T K K P T P V K T A P K L A E L P A T K P Q E T V L R E N K T P F I E K Q A E T N K Q S I N M P S L P V I Q K E A T E S D K E E M K P Q T E E K M V E E S E S A N N A N G K N R S A G I E E G K L I A K S A E D E K A K E E P G N H T T L I L A M L A I G V F S L G A F I K I I Q L R K N N(配列番号14)。この配列に対応するプロタンパク質の最初の29個のAAはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにActAタンパク質から切断される。1つの実施形態ではActAポリペプチドまたはペプチドは配列番号154のAA1〜29のシグナル配列を含む。別の実施形態ではActAポリペプチドまたはペプチドは配列番号14のAA1〜29のシグナル配列を含まない。
M G L N R F M R A M M V V F I T A N C I T I N P D I I F A A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K I D E N P E V K K A I V D K S A G L I D Q L L T K K K S E E V N A S D F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P T P S E P S S F E F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P A T S E P S S F E F P P P P T E D E L E I M R E T A P S L D S S F T S G D L A S L R S A I N R H S E N F S D F P L I P T E E E L N G R G G R P T S E E F S S L N S G D F T D D E N S E T T E E E I D R L A D L R D R G T G K H S R N A G F L P L N P F I S S P V P S L T P K V P K I S A P A L I S D I T K K A P F K N P S Q P L N V F N K K T T T K T V T K K P T P V K T A P K L A E L P A T K P Q E T V L R E N K T P F I E K Q A E T N K Q S I N M P S L P V I Q K E A T E S D K E E M K P Q T E E K M V E E S E S A N N A N G K N R S A G I E E G K L I A K S A E D E K A K E E P G N H T T L I L A M L A I G V F S L G A F I K I I Q L R K N N(配列番号14)。この配列に対応するプロタンパク質の最初の29個のAAはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにActAタンパク質から切断される。1つの実施形態ではActAポリペプチドまたはペプチドは配列番号154のAA1〜29のシグナル配列を含む。別の実施形態ではActAポリペプチドまたはペプチドは配列番号14のAA1〜29のシグナル配列を含まない。
別の実施形態では短縮型ActAタンパク質は配列番号15で表される配列を含む:
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G(配列番号15)。別の実施形態では配列番号15で表される短縮型ActAタンパク質はActA/PEST1と呼ばれる。別の実施形態では短縮型ActAは全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸122までを含む。別の実施形態では配列番号15は全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸122までを含む。別の実施形態では短縮型ActAは配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸122までを含む。別の実施形態では配列番号15は配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸122までを含む。
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G(配列番号15)。別の実施形態では配列番号15で表される短縮型ActAタンパク質はActA/PEST1と呼ばれる。別の実施形態では短縮型ActAは全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸122までを含む。別の実施形態では配列番号15は全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸122までを含む。別の実施形態では短縮型ActAは配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸122までを含む。別の実施形態では配列番号15は配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸122までを含む。
別の実施形態では短縮型ActAタンパク質は配列番号16で表される配列を含む:
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K(配列番号16)。別の実施形態では配列番号16で表される短縮型ActAはActA/PEST2と呼ばれる。別の実施形態では配列番号16で表される短縮型ActAはLA229と呼ばれる。別の実施形態では短縮型ActAは完全長ActA配列のアミノ酸30からアミノ酸229までを含む。別の実施形態では配列番号16は完全長ActA配列の約アミノ酸30から約アミノ酸229までを含む。別の実施形態では短縮型ActAは配列番号14の約アミノ酸30からアミノ酸229までを含む。別の実施形態では配列番号16は配列番号14のアミノ酸30からアミノ酸229までを含む。
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K(配列番号16)。別の実施形態では配列番号16で表される短縮型ActAはActA/PEST2と呼ばれる。別の実施形態では配列番号16で表される短縮型ActAはLA229と呼ばれる。別の実施形態では短縮型ActAは完全長ActA配列のアミノ酸30からアミノ酸229までを含む。別の実施形態では配列番号16は完全長ActA配列の約アミノ酸30から約アミノ酸229までを含む。別の実施形態では短縮型ActAは配列番号14の約アミノ酸30からアミノ酸229までを含む。別の実施形態では配列番号16は配列番号14のアミノ酸30からアミノ酸229までを含む。
別の実施形態では本明細書に開示される短縮型ActA配列はN末端においてhlyシグナルペプチドにさらに融合している。別の実施形態ではhlyシグナルペプチドに融合しているその短縮型ActAは配列番号138を含む:
M K K I M L V F I T L I L V S L P I A Q Q T E A S R A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K.
M K K I M L V F I T L I L V S L P I A Q Q T E A S R A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K.
別の実施形態ではhlyシグナルペプチドに融合している短縮型ActAは、配列番号139を含む配列によってコードされる:
(配列番号139)。別の実施形態では配列番号139は、XbaI用の特有の制限酵素部位を作製するために使用されるリンカー領域(太字、斜字体のテキストを参照のこと)をコードし、それにより様々なポリペプチド、異種抗原等をシグナル配列の後にクローニングすることができる配列を含む。よって、当業者は、シグナルペプチダーゼがそのリンカー領域の前にある配列に作用してシグナルペプチドを切断することを理解する。
別の実施形態では、短縮型ActAタンパク質は配列番号17で表される配列を含む:
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K I D E N P E V K K A I V D K S A G L I D Q L L T K K K S E E V N A S D F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P T P S E P S S F E F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P A T S E P S S(配列番号17)。別の実施形態では配列番号17で表される短縮型ActAはActA/PEST3と呼ばれる。別の実施形態ではこの短縮型ActAは全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸332までを含む。別の実施形態では配列番号17は全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸332までを含む。別の実施形態では短縮型ActAは配列番号14の最初の約30個目のアミノ酸からアミノ酸332までを含む。別の実施形態では配列番号17は配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸332までを含む。
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K I D E N P E V K K A I V D K S A G L I D Q L L T K K K S E E V N A S D F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P T P S E P S S F E F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P A T S E P S S(配列番号17)。別の実施形態では配列番号17で表される短縮型ActAはActA/PEST3と呼ばれる。別の実施形態ではこの短縮型ActAは全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸332までを含む。別の実施形態では配列番号17は全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸332までを含む。別の実施形態では短縮型ActAは配列番号14の最初の約30個目のアミノ酸からアミノ酸332までを含む。別の実施形態では配列番号17は配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸332までを含む。
別の実施形態では短縮型ActAタンパク質は配列番号18で表される配列を含む:
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K I D E N P E V K K A I V D K S A G L I D Q L L T K K K S E E V N A S D F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P T P S E P S S F E F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P A T S E P S S F E F P P P P T E D E L E I M R E T A P S L D S S F T S G D L A S L R S A I N R H S E N F S D F P L I P T E E E L N G R G G R P T S E(配列番号18)。別の実施形態では配列番号18で表される短縮型ActAはActA/PEST4と呼ばれる。別の実施形態ではこの短縮型ActAは全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸399までを含む。別の実施形態では配列番号18は全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸399までを含む。別の実施形態では短縮型ActAは配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸399までを含む。別の実施形態では配列番号18は配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸399までを含む。
A T D S E D S S L N T D E W E E E K T E E Q P S E V N T G P R Y E T A R E V S S R D I E E L E K S N K V K N T N K A D L I A M L K A K A E K G P N N N N N N G E Q T G N V A I N E E A S G V D R P T L Q V E R R H P G L S S D S A A E I K K R R K A I A S S D S E L E S L T Y P D K P T K A N K R K V A K E S V V D A S E S D L D S S M Q S A D E S T P Q P L K A N Q K P F F P K V F K K I K D A G K W V R D K I D E N P E V K K A I V D K S A G L I D Q L L T K K K S E E V N A S D F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P T P S E P S S F E F P P P P T D E E L R L A L P E T P M L L G F N A P A T S E P S S F E F P P P P T E D E L E I M R E T A P S L D S S F T S G D L A S L R S A I N R H S E N F S D F P L I P T E E E L N G R G G R P T S E(配列番号18)。別の実施形態では配列番号18で表される短縮型ActAはActA/PEST4と呼ばれる。別の実施形態ではこの短縮型ActAは全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸399までを含む。別の実施形態では配列番号18は全長ActA配列の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸399までを含む。別の実施形態では短縮型ActAは配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸399までを含む。別の実施形態では配列番号18は配列番号14の最初の30個目のアミノ酸からアミノ酸399までを含む。
別の実施形態では「短縮型ActA」または「ΔActA」はPESTドメインを含むActA断片を指す。別の実施形態ではこれらの用語はPEST配列を含むActA断片を指す。
別の実施形態では短縮型ActAタンパク質をコードする組換え型ヌクレオチドは配列番号19で表される配列を含む:
atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca.
別の実施形態では短縮型ActAタンパク質をコードする組換え型ヌクレオチドは配列番号19で表される配列を含む:
atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca.
別の実施形態ではその組換え型ヌクレオチドは配列番号19で表される配列を有する。別の実施形態ではその組換え型ヌクレオチドはActAタンパク質の断片をコードする他のあらゆる配列を含む。
別の実施形態ではそのActA断片はActAタンパク質の最初の約100AAから構成される。
別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜25から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜50から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜75から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜100から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜125から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜150から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜175から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜200から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜225から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜250から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜275から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜300から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜325から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜338から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜350から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜375から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜400から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜450から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜500から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜550から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜600から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜639から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜100から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜125から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜150から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜175から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜200から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜225から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜250から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜275から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜300から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜325から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜338から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜350から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜375から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜400から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜450から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜500から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜550から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基1〜600から構成される。別の実施形態ではそのActA断片はおよそ残基30〜604から構成される。
別の実施形態ではそのActA断片は上記のAA範囲のうちの1つに対応する相同ActAタンパク質の残基を含有する。別の実施形態ではそれらの残基番号は上に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ActAタンパク質が本明細書において利用されるActAタンパク質と比べて挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態ではそのActA断片は当技術分野において知られている他のあらゆるActA断片である。
別の実施形態では相同ActAは、ActA配列(例えば、配列番号11〜18のうちの1つ)に対する70%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する72%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する75%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する78%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する80%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する82%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する83%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する85%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する87%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する88%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する90%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する92%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する93%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する95%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する96%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する97%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する98%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する99%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では相同は配列番号 11〜18のうちの1つに対する100%の同一性を指す。
当業者は、本明細書において提供されるあらゆる核酸配列に対して参照されるときの「相同性」という用語は、対応する天然核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチドのパーセンテージを包含し得ることを理解する。
1つの実施形態では相同性は当技術分野において充分に記述される方法によって、配列アライメントについてのコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム分析は、例えば、BLASTパッケージ、DOMAINパッケージ、BEAUTY(BLAST増強アラインメントユーティリティ)パッケージ、GENPEPTパッケージ、およびTREMBLパッケージなどの利用可能なあらゆる数のソフトウェアパッケージの利用を含み得る。
別の実施形態では「相同性」は、本明細書において提供される配列から選択される配列に対する68%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では「相同性」は、本明細書において提供される配列から選択される配列に対する70%よりも高い同一性を指す。別の実施形態では「相同性」は、本明細書において提供される配列から選択される配列に対する72%よりも高い同一性を指す。別の実施形態ではその同一性は75%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は78%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は80%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は82%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は83%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は85%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は87%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は88%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は90%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は92%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は93%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は95%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は96%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は97%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は98%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は99%よりも高い。別の実施形態ではその同一性は100%である。
別の実施形態では相同性は候補配列のハイブリダイゼーションの測定を介して決定され、そのハイブリダイゼーションの方法は当技術分野において充分に記述されている(例えば、“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J.編、(1985)、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.、およびAusubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Yを参照されたい)。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、天然カスパーゼペプチドをコードするDNAの相補物に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行され得る。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、10〜20%のホルムアミド、5×SSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト液、10%の硫酸デキストラン、および20μg/mLの断片化変性サケ精子DNAを含む溶液中における42℃で一晩のインキュベーションである。
1つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は抗生物質耐性遺伝子を持っていない。
1つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリアはファゴリソソームを回避する能力を有する。
1つの実施形態ではリステリアゲノムは内因性actA遺伝子の欠失を含み、この遺伝子は1つの実施形態では病原性因子である。1つの実施形態では異種抗原または抗原性ポリペプチドがリステリア染色体中にLLOとインフレームで組み込まれる。別の実施形態ではその組み込まれた核酸分子は、ActAとインフレームでactA座位に組み込まれている。別の実施形態ではActAをコードする染色体核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置き換えられる。
1つの実施形態では本明細書において提供されるペプチドは1つ以上のネオエピトープを含む。1つの実施形態では本明細書において提供されるペプチドは抗原によって構成される。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは抗原断片である。1つの実施形態では本明細書において提供される抗原は1つ以上のネオエピトープを含む。別の実施形態ではその抗原は異種抗原または自己抗原である。1つの実施形態では本明細書において提供される異種抗原または自己抗原は腫瘍関連抗原である。当業者は、「異種」という用語が、細菌が天然または通常では発現しない抗原またはその一部を指すことを理解する。1つの実施形態では異種抗原は、リステリア株が天然または通常では発現しない抗原を含む。別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は天然の腫瘍関連抗原である。別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は合成腫瘍関連抗原である。別の実施形態ではその腫瘍関連抗原はキメラ腫瘍関連抗原である。さらに別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は1つ以上のネオエピトープを含む。さらに別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は新抗原である。
1つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリアは1つ以上のペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含み、前記1つ以上のペプチドが1つ以上のネオエピトープを含む。別の実施形態ではその組換えポリペプチドは、本明細書において提供されるペプチドに融合した短縮型LLOタンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPEST配列をさらに含む。
別の実施形態では本明細書において提供される核酸分子は短縮型LLOタンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPEST配列を含む組換えポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含み、その短縮型LLOタンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPEST配列ペプチドは異種抗原に融合していない。別の実施形態ではその第1オープン・リーディング・フレームは短縮型LLOタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第1オープン・リーディング・フレームは短縮型ActAタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第1オープン・リーディング・フレームは短縮型LLOタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第1オープン・リーディング・フレームは短縮型ActAタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第1オープン・リーディング・フレームは短縮型LLOタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第1オープン・リーディング・フレームは、N末端ActAタンパク質またはその断片からなる短縮型ActAタンパク質をコードする。
当業者は、「抗原」、「抗原断片」、「抗原部分」、「異種タンパク質」、「異種抗原」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」、「抗原性ポリペプチド」という用語、またはそれらの文法的に同等の用語が本明細書において互換的に使用され、その用語は、宿主内に存在すると、または別の実施形態では宿主によって検出されるとプロセッシングを受け、且つ、対象の細胞内に存在するMHCクラスI分子および/またはクラスII分子上に提示され、その提示が免疫応答の開始につながる本明細書に記載されるポリペプチド、ペプチドまたは組換えペプチドを指すことを理解する。1つの実施形態ではその抗原は宿主に対して外来のものであり得る。別の実施形態ではその抗原は宿主内に存在してもよいが、免疫寛容のために宿主によってこの抗原に対する免疫応答が誘発されない。別の実施形態ではその抗原は1つ以上の ネオエピトープを含む新抗原であり、1つ以上のネオエピトープがT細胞エピトープである。別の実施形態ではその抗原またはそのペプチド断片はT細胞エピトープである1つ以上のネオエピトープを含む。
別の実施形態では抗原は少なくとも1つのネオエピトープを含む。1つの実施形態では抗原は少なくとも1つのネオエピトープを含む新抗原である。1つの実施形態ではネオエピトープは免疫系によって以前に認識されていないエピトープである。新抗原は腫瘍抗原と関連することが多く、癌原細胞中に見出される。新抗原および、拡大すると、新抗原決定基(ネオエピトープ)は、タンパク質がグリコシル化、リン酸化、またはタンパク質分解などの生化学経路内でさらに修飾されると形成される場合がある。これはそのタンパク質の構造変化により新または「ネオ」エピトープを産生することができる。
1つの実施形態では本明細書において提供されるリステリアは、キメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前記キメラタンパク質が
a. 細菌分泌シグナル配列、
b. ユビキチン(Ub)タンパク質、
c. 前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含み、且つ、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されているか、または機能的であるように連結されている前記コンストラクトを含む。
a. 細菌分泌シグナル配列、
b. ユビキチン(Ub)タンパク質、
c. 前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含み、且つ、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されているか、または機能的であるように連結されている前記コンストラクトを含む。
別の実施形態では本明細書において提供される細菌性シグナル配列はリステリアのシグナル配列であり、それは別の実施形態ではhlyシグナル配列またはactAシグナル配列である。別の実施形態ではその細菌性シグナル 配列は当技術分野において知られている他のあらゆるシグナル配列である。別の実施形態ではミニ遺伝子核酸コンストラクトを含む組換え型リステリアは、各オープン・リーディング・フレーム間のシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された2つ以上のオープン・リーディング・フレームをさらに含む。別の実施形態ではミニ遺伝子核酸コンストラクトを含む組換え型リステリアは、各オープン・リーディング・フレーム間のシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された1〜4つのオープン・リーディング・フレームをさらに含む。別の実施形態では各オープン・リーディング・フレームが異なるペプチドをコードする。
別の実施形態では細菌分泌シグナル配列(SS)、ユビキチン(Ub)タンパク質、およびペプチド配列をコードするオープン・リーディング・フレームを含む組換え型核酸コンストラクトを含む組換え型弱毒化リステリア株が本明細書において提供される。別の実施形態ではその核酸コンストラクトは、細菌分泌シグナル配列、ユビキチンタンパク質、およびペプチド配列を含むキメラタンパク質をコードする。1つの実施形態ではそのキメラタンパク質は次(SS−Ub−ペプチド)のように配置される。
1つの実施形態ではその核酸コンストラクトは2つの終止コドンが続くペプチド部分のカルボキシ末端に対応するコドンを含んでタンパク質合成の終了を確実にする。
1つの実施形態では本明細書に記載される組成物および方法において提供されるミニ遺伝子核酸コンストラクトは、カルボキシ末端に別個のペプチド部分を含有する多数の組換えタンパク質を促進するように設計されている発現系を含む。これは、1つの実施形態では、それらの細菌分泌シグナル配列-ユビキチン-ペプチド(SS−Ub−ペプチド)コンストラクトのうちの1つをコードする配列をテンプレートとして利用するPCR反応により達成される。1つの実施形態では、Ub配列のカルボキシ末端領域にまで延びるプライマーを使用し、且つ、そのプライマーの3’端に所望のペプチド配列のためのコドンを導入すると、一度のPCR反応で新しいSS−Ub−ペプチド配列を生成することができる(本明細書の実施例を参照のこと)。細菌プロモーターと細菌分泌シグナル配列の最初の数ヌクレオチドをコードする5’プライマーは、全てのコンストラクトに対して同一であってもよい。このコンストラクトの概略図が本明細書の図26A〜Cに提示されている。
1つの実施形態では、本明細書において提供される組換えポリペプチドをコードする核酸はシグナルペプチドまたは配列も含む。1つの実施形態では、本明細書において提供される核酸コンストラクトまたは核酸分子によってコードされる細菌分泌シグナル配列はリステリア分泌シグナル配列である。別の実施形態では本発明の方法および組成物の融合タンパク質はリステリオリシンO(LLO)由来のLLOシグナル配列を含む。当業者は、本明細書において提供される1つ以上のネオエピトープを含む抗原またはペプチドが例えばヘモリジン(hly)シグナル配列またはactAシグナル配列のようなシグナル配列の使用により発現し得ることを理解する。あるいは、外来遺伝子は、例えば、融合タンパク質を作製することなくL.モノサイトゲネスプロモーターの下流で発現可能である。別の実施形態ではそのシグナルペプチドは細菌性(リステリア性または非リステリア性)である。1つの実施形態ではそのシグナルペプチドはその細菌に固有のものである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはその細菌にとって外来のものである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはリステリア・モノサイトゲネス由来のシグナルペプチド、例えばsecA1シグナルペプチドである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはラクトコッカス・ラクティス由来のUsp45シグナルペプチド、またはバチルス・アントラシス由来の保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはリステリア・モノサイトゲネス由来のsecA2シグナルペプチド、例えばp60シグナルペプチドである。加えて、その組換え型核酸分子はp60をコードする第3のポリヌクレオチド配列またはその断片を所望により含む。別の実施形態ではそのシグナルペプチドは、バチルス・サブチリスTatシグナルペプチドなどのTatシグナルペプチド(例えば、PhoD)である。1つの実施形態ではそのシグナルペプチドは前記組換えポリペプチドをコードする同じ翻訳リーディングフレーム内にある。
別の実施形態では前記分泌シグナル配列はリステリアタンパク質由来である。別の実施形態ではその分泌シグナルはActA300分泌シグナルである。別の実施形態ではその分泌シグナルはActA100分泌シグナルである。
1つの実施形態では前記核酸コンストラクトはユビキチンタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む。1つの実施形態ではそのユビキチンは全長タンパク質である。当業者は、本明細書において提供される発現コンストラクト内のユビキチン(本明細書において提供される核酸コンストラクトより発現されたユビキチン)は宿主細胞の細胞質に侵入すると加水分解酵素の作用によりカルボキシ末端でその核酸コンストラクトより発現されたその組換えキメラタンパク質の残りの部分から切断されることを理解する。これによりそのペプチド部分のアミノ末端が遊離し、宿主細胞の細胞質中にペプチド(長さはその特定のペプチドに依存する)を産生する。
1つの実施形態では本明細書において提供される核酸コンストラクトによってコードされるペプチドは、長さが8〜10アミノ酸(AA)である。別の実施形態ではそのペプチドは10〜20AA長である。別の実施形態ではそのペプチドは21〜30AA長である。別の実施形態ではそのペプチドは31〜50AA長である。別の実施形態ではそのペプチドは51〜100AA長である。
1つの実施形態では本明細書において提供される核酸分子は代謝酵素をコードする第2オープン・リーディング・フレームをさらに含む。別の実施形態ではその代謝酵素は、前記組換え型リステリア株の染色体の中で失われている内在性遺伝子を相補する。別の実施形態ではその代謝酵素は、前記組換え型リステリア株の染色体内で突然変異が形成されている内在性遺伝子を相補する。別の実施形態ではその第2オープン・リーディング・フレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素(dal)である。別の実施形態ではその第2オープン・リーディング・フレームによってコードされる代謝酵素はD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素(dat)である。別の実施形態では本明細書において提供されるリステリア株は内在性dal/dat遺伝子内に突然変異を含む。別の実施形態ではそのリステリアはdal/dat遺伝子を欠いている。
別の実施形態では本発明の方法および組成物の核酸分子は機能可能であるようにプロモーター/調節性配列に連結されている。別の実施形態では本発明の方法および組成物の第1オープン・リーディング・フレームは機能可能であるようにプロモーター/調節性配列に連結されている。別の実施形態では本発明の方法および組成物の第2オープン・リーディング・フレームは機能可能であるようにプロモーター/調節性配列に連結されている。別の実施形態ではそれらのオープン・リーディング・フレームの各々が機能可能であるようにプロモーター/調節性配列に連結されている。
別の実施形態では「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌の持続的増殖のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの酵素は栄養素の合成に要求される。
別の実施形態では前記組換え型リステリアは弱毒化栄養要求性株である。別の実施形態ではその組換え型リステリアは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第8114414号明細書に記載されるLm−LLO−E7株である。
1つの実施形態では前記弱毒化株はLm dal(−)dat(−)(Lmdd)である。別の実施形態ではその弱毒化株はLm dal(−)dat(−)ΔactA(LmddA)である。LmddAは、リステリア免疫療法ベクターに基づき、病原性遺伝子であるactAの欠失に起因して弱毒化されており、且つ、dal遺伝子の相補によってインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または短縮型LLO発現のためのプラスミドを保持する。
別の実施形態では前記弱毒化株はLmddAである。別の実施形態ではその弱毒化株はLmΔactAである。別の実施形態ではその弱毒化株はLmΔPrfAである。別の実施形態ではその弱毒化株はLmΔPrfA*である。別の実施形態ではその弱毒化株はLmΔPlcBである。別の実施形態ではその弱毒化株はLmΔPlcAである。別の実施形態ではその株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態ではこの株は、リステリアベースの免疫療法の固有の特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態ではこの株はEGDリステリアバックボーンから作られる。別の実施形態では本発明で使用される株は非溶血性LLOを発現するリステリア株である。
別の実施形態では前記リステリア株は栄養要求性突然変異体である。別の実施形態ではそのリステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
1つの実施形態ではD−アラニン欠損AA株を、例えば、当業者に周知の多数の方法で作製することができ、それらの方法には欠失突然変異形成、挿入突然変異形成、およびフレームシフト突然変異、タンパク質の早期終止を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響する調節性配列の突然変異を生成することになる突然変異形成が含まれる。別の実施形態では、組換えDNA技術を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射線照射を用い、その後で突然変異体を選択する伝統的な突然変異形成技術を使用して突然変異形成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰に伴われる低い可能性のため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるD−アラニンについての変異体は、単純な実験室培養アッセイにおいてD−アラニンの非存在下で増殖する能力について試験される場合がある。別の実施形態では、この化合物の非存在下で増殖することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
別の実施形態では、本明細書において提示されるように、前述のD−アラニン関連遺伝子に加えて代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子がリステリアの突然変異形成の標的として使用されてもよい。
別の実施形態ではその代謝酵素は、前記組換え型細菌株の染色体の残りの部分に欠けている内在性代謝遺伝子を相補する。1つの実施形態ではその内在性代謝遺伝子は染色体内で突然変異が形成される。別の実施形態ではその内在性代謝遺伝子は染色体から欠失している。別の実施形態ではその代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態ではその代謝酵素はその組換え型リステリア株内で細胞壁合成に使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態ではその代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態ではその代謝酵素はD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。本明細書において提供される方法および組成物の別々の実施形態により各可能性が表される。
1つの実施形態では前記栄養要求性リステリア株は、その栄養要求性リステリア株の栄養要求性を相補する代謝酵素を含むエピソーム性発現ベクターを含む。別の実施形態では、そのコンストラクトはエピソーム様式でそのリステリア株内に含有される。別の実施形態ではその外来抗原はその組換え型リステリア株が保持するプラスミドベクターから発現される。別の実施形態ではそのエピソーム性発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。1つの実施形態では本明細書において提供される方法および組成物の抗原はPEST配列を含むポリペプチドに融合している。
別の実施形態では前記リステリア株はアミノ酸(AA)代謝酵素が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はDグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はdat遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はdal遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はdga遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はジアミノピメリン酸合成に関与する遺伝子が欠損している。CysK。別の実施形態ではその遺伝子はビタミンB12非依存的メチオニンシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はtrpAである。別の実施形態ではその遺伝子はtrpBである。別の実施形態ではその遺伝子はtrpEである。別の実施形態ではその遺伝子はasnBである。別の実施形態ではその遺伝子はgltDである。別の実施形態ではその遺伝子はgltBである。別の実施形態ではその遺伝子はleuAである。別の実施形態ではその遺伝子はargGである。別の実施形態ではその遺伝子はthrCである。別の実施形態ではそのリステリア株は上述の遺伝子のうちの1つ以上が欠損している。
別の実施形態ではそのリステリア株はシンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではその遺伝子はAA合成遺伝子である。別の実施形態ではその遺伝子はfolPである。別の実施形態ではその遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はispDである。別の実施形態ではその遺伝子はispFである。別の実施形態ではその遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はhisFである。別の実施形態ではその遺伝子はhisHである。別の実施形態ではその遺伝子はfliIである。別の実施形態ではその遺伝子はリボソームラージサブユニット・シュードウリジンシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はispDである。別の実施形態ではその遺伝子は二機能性GMPシンターゼ/グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はcobSである。別の実施形態ではその遺伝子はcobBである。別の実施形態ではその遺伝子はcbiDである。別の実施形態ではその遺伝子はウロポルフィリン−III C−メチルトランスフェラーゼ/ウロポルフィリノゲン−IIIシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はcobQである。別の実施形態ではその遺伝子はuppSである。別の実施形態ではその遺伝子はtruBである。別の実施形態ではその遺伝子はdxsである。別の実施形態ではその遺伝子はmvaSである。別の実施形態ではその遺伝子はdapAである。別の実施形態ではその遺伝子はispGである。別の実施形態ではその遺伝子はfolCである。別の実施形態ではその遺伝子はクエン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はargJである。別の実施形態ではその遺伝子は3−デオキシ−7−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はインドール−3−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はアントラニル酸シンターゼ/グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成要素である。別の実施形態ではその遺伝子はmenBである。別の実施形態ではその遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼIまたはIIである。別の実施形態ではその遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はcarBである。別の実施形態ではその遺伝子はcarAである。別の実施形態ではその遺伝子はthyAである。別の実施形態ではその遺伝子はmgsAである。別の実施形態ではその遺伝子はaroBである。別の実施形態ではその遺伝子はhepBである。別の実施形態ではその遺伝子はrluBである。別の実施形態ではその遺伝子はilvBである。別の実施形態ではその遺伝子はilvNである。別の実施形態ではその遺伝子はalsSである。別の実施形態ではその遺伝子はfabFである。別の実施形態ではその遺伝子はfabHである。別の実施形態ではその遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はpyrGである。別の実施形態ではその遺伝子はtruAである。別の実施形態ではその遺伝子はpabBである。別の実施形態ではその遺伝子はatpシンターゼ遺伝子(例えば、atpC、atpD−2、aptG、atpA−2、等々)である。
別の実施形態ではその遺伝子はphoPである。別の実施形態ではその遺伝子はaroAである。別の実施形態ではその遺伝子はaroCである。別の実施形態ではその遺伝子はaroDである。別の実施形態ではその遺伝子はplcBである。
別の実施形態ではそのリステリア株はペプチドトランスポーターが欠損している。別の実施形態ではその遺伝子はABCトランスポーター/ATP結合/パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はオリゴペプチドABCトランスポーター/オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はオリゴペプチドABCトランスポーター/パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子は亜鉛ABCトランスポーター/亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子は糖ABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はリン酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はZIP亜鉛トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はEmrB/QacAファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は硫酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチドトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はマグネシウムトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は蟻酸/亜硝酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はスペルミジン/プトレシンABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はNa/Piコトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は糖リン酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はグルタミンABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はメジャーファシリテイターファミリートランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はグリシンベタイン/L−プロリンABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はモリブデンABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はテイコ酸ABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はコバルトABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はアンモニウムトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はアミノ酸ABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は細胞分裂ABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はマンガンABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は鉄化合物ABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はマルトース/マルトデキストリンABCトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はBcr/CflAファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は上記のタンパク質のうちの1つのサブユニットである。
1つの実施形態では、組換え型リステリアを得るため、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書において提供される。別の実施形態ではリステリアを形質転換するために使用される本明細書において提供されるその核酸は、病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその核酸分子はリステリアゲノムの中に組み込まれ、非機能性病原性遺伝子を担持する。別の実施形態ではその病原性遺伝子はその組換え型リステリア内で突然変異が形成される。さらに別の実施形態ではその核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内在性遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態ではその病原性遺伝子はactA遺伝子、inlA遺伝子、ならびにinlB遺伝子、inlC遺伝子、inlJ遺伝子、plbC遺伝子、bsh遺伝子、またはprfA遺伝子である。当業者は、病原性遺伝子は組換え型リステリア内の病原性と関連付けられる当技術分野において知られているあらゆる遺伝子であり得ることを理解すべきである。
さらに別の実施形態ではそのリステリア株はinlA突然変異体、inlB突然変異体、inlC突然変異体、inlJ突然変異体、prfA突然変異体、actA突然変異体、dal/dat突然変異体、prfA突然変異体、plcB欠失突然変異体、またはplcAとplcBの両方を欠いている二重変異体、またはactAとinlBの両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態ではそのリステリアはこれらの遺伝子の欠失または突然変異を個別に、または組み合わせて含む。別の実施形態では本明細書において提供されるリステリアは遺伝子のそれぞれ1つずつを欠いている。別の実施形態では本明細書において提供されるリステリアは、actA、prfA、およびdal/dat遺伝子を含む本明細書において提供されるいずれかの遺伝子のうちの少なくとも1遺伝子、最高で10遺伝子を欠いている。別の実施形態ではprfA突然変異体はD133V PrfA突然変異体である。
1つの実施形態では前記弱毒化生リステリアは組換え型リステリアである。別の実施形態ではその組換え型リステリアは、ゲノムインターナリンC(inlC)遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態ではその組換え型リステリアは、ゲノムactA遺伝子およびゲノムインターナリンC遺伝子の突然変異または欠失を含む。1つの実施形態では隣接する細胞へのリステリアの移行はその過程に関与するactA遺伝子および/またはinlC遺伝子の欠失によって阻害され、それにより免疫療法のバックボーンとしての高い免疫原性と有用性を伴う予想外に高レベルの弱毒化が生じる。
1つの実施形態ではその代謝遺伝子、病原性遺伝子などはそのリステリア株の染色体内で欠けている。別の実施形態ではその代謝遺伝子、病原性遺伝子などはそのリステリア株の染色体内および何らかのエピソーム性遺伝要素内で欠けている。別の実施形態ではその代謝遺伝子、病原性遺伝子などはその病原性株のゲノム内で欠けている。1つの実施形態ではその病原性遺伝子は染色体内で突然変異が形成される。別の実施形態ではその病原性遺伝子は染色体から欠失している。
1つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は弱毒化されている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはactA病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはprfA病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはinlB遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはactA遺伝子とinlB遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性actA遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性inlB遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性inlC遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性actA遺伝子とinlB遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性actA遺伝子とinlC遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性actA遺伝子、inlB遺伝子、およびinlC遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性actA遺伝子、inlB遺伝子、およびinlC遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は内在性actA遺伝子、inlB遺伝子、およびinlC遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は以下の遺伝子、すなわち、actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、plcBのうちのいずれか一遺伝子または遺伝子の組合せの不活性化突然変異を含む。
当業者は、「突然変異」という用語およびその文法的に同等の用語が配列(核酸配列またはアミノ酸配列)に対するあらゆるタイプの突然変異または修飾を含み、これには欠失突然変異、短縮化、不活性化、分断、または転座が含まれることを理解する。これらのタイプの突然変異は当技術分野においてよく知られている。
1つの実施形態では、本明細書において提供される代謝酵素または相補性遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するため、形質転換された栄養要求性細菌はそのアミノ酸代謝遺伝子またはその相補性遺伝子の発現について選別を行う培地上で培養される。別の実施形態ではD−グルタミン酸合成について栄養要求性の細菌がD−グルタミン酸合成遺伝子を含むプラスミドで形質転換され、D−グルタミン酸が無い状態でその栄養要求性細菌が増殖し、一方でそのプラスミドで形質転換されなかった栄養要求性細菌、またはD−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は増殖しない。別の実施形態ではD−グルタミン酸合成について栄養要求性の細菌が形質転換され、本発明のプラスミドを発現すると、そのプラスミドがD−アラニン合成のアミノ酸代謝酵素をコードする核酸を含む場合、D−アラニンが無い状態でその細菌が増殖する。必要な増殖因子、添加物、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含んでいる、または欠いている適切な培地を作製するためのそのような方法は当技術分野においてよく知られており、また市販されている(Becton−Dickinson、ニュージャージー州フランクリン・レイクス)。本発明の別個の実施形態によって各方法が表される。
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一度適切な培地上で選択されると、この細菌は選択圧の存在下で繁殖する。そのような繁殖は栄養要求性因子を有しない培地でのその細菌の増殖を含む。その栄養要求性細菌内にアミノ酸代謝酵素を発現するそのプラスミドが存在することにより、そのプラスミドがその細菌と共に複製し、そうしてそのプラスミドを保持する細菌が継続的に選択されることが確実になる。当業者は本開示および本明細書の方法を教授されると、そのプラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによってそのリステリア免疫療法ベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
当業者は、別の実施形態では他の栄養要求性株および相補系を本発明に関して使用するためにそれらが適合されることを理解する。
1つの実施形態ではN末端LLOタンパク質断片および異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態ではN末端LLOタンパク質断片をコードする遺伝子および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態ではN末端LLOタンパク質断片および異種抗原は機能可能であるようにリンカーペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではN末端LLOタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではN末端LLOタンパク質断片は異種抗原に対してN末端側にある。別の実施形態ではN末端LLOタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態ではN末端LLOタンパク質断片は融合タンパク質の最N末端部分である。別の実施形態では短縮型LLOは、N末端LLOを得るためにC末端側において切断される。別の実施形態では短縮型LLOは非溶血性LLOである。
1つの実施形態ではN末端ActAタンパク質断片および異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態ではN末端ActAタンパク質断片をコードする遺伝子および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態ではN末端ActAタンパク質断片および異種抗原は機能可能であるようにリンカーペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではN末端ActAタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではN末端ActAタンパク質断片は異種抗原に対してN末端側にある。別の実施形態ではN末端ActAタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態ではN末端ActAタンパク質断片は融合タンパク質の最N末端部分である。別の実施形態では短縮型ActAは、N末端ActAを得るためにC末端側において切断される。
1つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は組換えポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型核酸は、本明細書において提供される組換え型リステリア株のプラスミド中にある。別の実施形態ではそのプラスミドはその組換え型リステリア株の染色体中に組み込まれないエピソーム性プラスミドである。別の実施形態ではそのプラスミドはそのリステリア株の染色体中に組み込まれる組み込みプラスミドである。別の実施形態ではそのプラスミドはマルチコピープラスミドである。
1つの実施形態では前記異種抗原は腫瘍関連抗原である。1つの実施形態では本明細書において提供される組成物および方法の組換え型リステリア株は、腫瘍細胞が発現する異種抗原性ポリペプチドを発現する。1つの実施形態では腫瘍関連抗原は前立腺特異抗原(PSA)である。別の実施形態では腫瘍関連抗原はヒトパピローマウイルス(HPV)抗原である。さらに別の実施形態では腫瘍関連抗原は、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2011/014279号明細書に記載されるHer2/neuキメラ抗原である。さらに別の実施形態では腫瘍関連抗原は血管新生抗原である。
1つの実施形態では本明細書において提供されるペプチドは抗原性ペプチドである。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは腫瘍抗原に由来する。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは感染症抗原に由来する。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは自己抗原に由来する。別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドは血管新生抗原に由来する。
1つの実施形態では本明細書において提供されるペプチドが由来する抗原は、真菌病原体、細菌、寄生生物、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では本明細書のペプチドが由来する抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン分子、ジフテリアトキソイド、HIV gp120、HIV gagタンパク質、IgAプロテアーゼ、インスリンペプチドB、ばれいしょ粉状そうか病菌抗原、ビブリオース抗原、サルモネラ抗原、ニューモコッカス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、黒色腫関連抗原(TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、gp−100、チロシナーゼ、MART−1、HSP−70、β−HCG)、タイプHPV−16、−18、−31、−33、−35または−45ヒトパピローマウイルス由来のヒトパピローマウイルス抗原E1およびE2、腫瘍抗原CEA、変異型かそうではないrasタンパク質、変異型かそうではないp53タンパク質、Muc1、メソテリン、EGFR VIIIまたはpSAから選択される。
他の実施形態ではそのペプチドは、以下の疾患、すなわち、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、A型肝炎、B型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来の免疫原および抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形腫瘍および血液担持腫瘍を含む癌、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、1型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓移植、心臓移植、膵臓移植、肺移植、骨移植、および肝臓移植などの移植拒絶反応、グレーブス病、多腺性自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性関節炎、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ウェゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、尋常性白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ぶどう膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じん麻疹、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、X連鎖高IgM症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、アミロイドーシス、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアスポロゾイト周囲タンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症のうちの1つに関連する抗原に由来する。
別の実施形態では本明細書において提供されるペプチドが由来する抗原は腫瘍関連抗原であり、これは1つの実施形態では以下の腫瘍抗原のうちの1つ、すなわち、MAGE(黒色腫関連抗原E)タンパク質、例えばMAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4、チロシナーゼ、変異型rasタンパク質、変異型p53タンパク質、p97黒色腫抗原、進行性癌に関連するrasペプチドまたはp53ペプチド、子宮頚部癌に関連するHPV16/18抗原、乳癌に関連するKLH抗原、大腸癌に関連するCEA(癌胎児性抗原)、gp100、黒色腫に関連するMART1抗原、または前立腺癌に関連するPSA抗原である。別の実施形態では本明細書において提供される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これらは1つの実施形態ではTRP−2、MAGE−1、MAGE−3、gp−100、チロシナーゼ、HSP−70、β−HCG、またはこれらの組み合せである。当技術分野において知られている他の腫瘍関連抗原も本発明において考慮されている。
1つの実施形態では前記ペプチドは、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願番号12/945386号明細書に記載されるキメラHer2抗原に由来する。
別の実施形態ではそのペプチドは、HPV−E7(HPV16株またはHPV18株のどちらかに由来)、HPV−E6(HPV16株またはHPV18株のどちらかに由来)、Her−2/neu、NY−ESO−1、テロメラーゼ(TERT、SCCE、CEA、LMP−1、p53、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、PSMA、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、HMW−MAA、WT−1、HIV−1 Gag、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2、PSA(前立腺特異的抗原)、EGFR−III、サバイビン、バキュロウイルスアポトーシス阻害性反復配列含有タンパク質5(BIRC5)、LMP−1、p53、PSMA、PSCA、Muc1、PSA(前立腺特異的抗原)、またはこれらの組み合せから選択される抗原に由来する。
1つの実施形態では本発明のリステリアによって発現されるポリペプチドは神経ペプチド成長因子アンタゴニストでもよく、1つの実施形態ではこれは[D−Arg1、D−Phe5、D−Trp7,9、Leu11]サブスタンスP、[Arg6、D−Trp7,9、NmePhe8]サブスタンスP(6−11)である。これらの実施形態および関連する実施形態は当業者に理解される。
1つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含み、その抗原はHPV−E7タンパク質を含む。1つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株はHPV−E7タンパク質をコードする核酸分子を含む。
1つの実施形態ではE7タンパク質全体またはその断片のどちらかがLLOタンパク質またはその短縮化物またはそのペプチド、ActAタンパク質またはその短縮化物またはそのペプチド、またはPEST様配列含有ペプチドに融合されて本発明の組成物および方法の組換えポリペプチドまたはペプチドを生成する。別の実施形態では、(全体で、または断片の供与源としてのどちらかで)利用されるE7タンパク質は、次の配列
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(配列番号20)を有する。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の相同体である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の変異体である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の異性体である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の断片である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の相同体の断片である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の変異体の断片である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の異性体の断片である。
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(配列番号20)を有する。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の相同体である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の変異体である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の異性体である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の断片である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の相同体の断片である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の変異体の断片である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は配列番号20の異性体の断片である。
別の実施形態ではそのE7タンパク質の配列は、
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(配列番号21)である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の相同体である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の変異体である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の異性体である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の断片である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の相同体の断片である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の変異体の断片である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の異性体の断片である。
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(配列番号21)である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の相同体である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の変異体である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の異性体である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の断片である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の相同体の断片である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の変異体の断片である。別の実施形態ではそのE6タンパク質は配列番号21の異性体の断片である。
別の実施形態ではそのE7タンパク質は以下のGenBankエントリのうちの1つ、すなわち、M24215、NC_004500、V01116、X62843、またはM14119で表される配列を有する。別の実施形態ではそのE7タンパク質は上記のGenBankエントリのうちの1つの配列の相同体である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は上記のGenBankエントリのうちの1つの配列の変異体である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は上記のGenBankエントリのうちの1つの配列の異性体である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は上記のGenBankエントリのうちの1つの配列の断片である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は上記のGenBankエントリのうちの1つの配列の相同体の断片である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は上記のGenBankエントリのうちの1つの配列の変異体の断片である。別の実施形態ではそのE7タンパク質は上記のGenBankエントリのうちの1つの配列の異性体の断片である。
1つの実施形態ではHPV抗原はHPV16である。別の実施形態ではHPVはHPV−18である。別の実施形態ではHPVはHPV−16およびHPV−18から選択される。別の実施形態ではHPVはHPV−31である。別の実施形態ではHPVはHPV−35である。別の実施形態ではHPVはHPV−39である。別の実施形態ではHPVはHPV−45である。別の実施形態ではHPVはHPV−51である。別の実施形態ではHPVはHPV−52である。別の実施形態ではHPVはHPV−58である。別の実施形態ではHPVは高リスクHPVタイプである。別の実施形態ではHPVは粘膜HPVタイプである。
1つの実施形態ではHPV E6はHPV−16由来である。別の実施形態では、HPV E7はHPV−16由来である。別の実施形態では、HPV−E6はHPV−18由来である。別の実施形態では、HPV−E7はHPV−18由来である。別の実施形態ではHPV E6抗原は、本発明の組成物または方法においてE7抗原の代わりに、またはE7抗原に加えて、HPV媒介性の疾患、障害、または症状を治療もしくは改善するために利用される。別の実施形態ではHPV−16 E6およびE7は、HPV−18 E6およびE7の代わりに、またはこれと組み合せて利用される。そのような実施形態ではその組換え型リステリアはHPV−16 E6およびE7を染色体から発現し、且つ、HPV−18 E6およびE7をプラスミドから発現してよく、またはその逆で発現してもよい。別の実施形態ではHPV−16 E6抗原およびE7抗原ならびにHPV−18 E6抗原およびE7抗原は、本明細書において提供される組換え型リステリア内に存在するプラスミドから発現する。別の実施形態ではHPV−16 E6抗原およびE7抗原ならびにHPV−18 E6抗原およびE7抗原は、本明細書において提供される組換え型リステリアの染色体から発現する。別の実施形態ではHPV−16 E6抗原およびE7抗原ならびにHPV−18 E6抗原およびE7抗原は、各HPV株のE6抗原とE7抗原のそれぞれがプラスミドまたは染色体のどちらかより発現される実施形態をはじめとする上記の実施形態のあらゆる組合せで発現する。
1つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含み、その腫瘍関連抗原はHer−2/neuペプチドを含む。1つの実施形態では腫瘍関連抗原はHer−2/neu抗原を含む。1つの実施形態ではHer−2/neuペプチドはキメラHer−2/neu抗原(cHer-2)を含む。
1つの実施形態では弱毒化栄養要求性リステリア免疫療法株はリステリア免疫療法ベクターに基づき、病原性遺伝子ActAの欠失に起因して弱毒化されており、且つ、dal遺伝子の相補によってインビボおよびインビトロでのHer2/neu発現のためのプラスミドを保持する。1つの実施形態ではそのリステリア株はリステリオリシンO(LLO)の最初の441アミノ酸に融合しているキメラ型Her2/neuタンパク質を発現および分泌する。別の実施形態ではそのリステリアは、dal、datおよびactAの内在性遺伝子内に突然変異を有するdal/dat/actAリステリアである。別の実施形態ではその突然変異はそれらの変異形成された遺伝子の欠失、短縮化、または不活性化である。別の実施形態ではそのリステリア株は、トランスジェニック動物内のHER2/neuに対する寛容を破壊する能力を有する強力で抗原特異的な抗腫瘍応答を発揮する。別の実施形態では、dal/dat/actA株は免疫されたマウスの脾臓からより迅速に除去されるので、それは高度に弱毒化されており、且つ、以前のリステリア免疫治療世代よりも良好な安全性プロファイルを有する。別の実施形態では、このリステリア株により、抗生物質耐性でより病原性のバージョンのこの免疫療法であるLm−LLO−ChHer2よりも長い腫瘍発症の遅延がトランスジェニック動物において生じる。全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願番号12/945386号明細書、米国特許出願公開第2011/0142791号明細書を参照されたい。別の実施形態ではそのリステリア株は腫瘍内の制御性T細胞(Treg)の著しい減少を生じる。別の実施形態では、LmddA免疫療法で処理した腫瘍内のTregの頻度がより低くなることで腫瘍内のCD8/Treg比率が上昇し、LmddA免疫療法を用いた免疫後により好ましい腫瘍微小環境を得ることができることが示唆される。1つの実施形態では本発明は、Her−2キメラタンパク質またはその断片に融合しているLLOタンパク質のN末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。1つの実施形態では本発明は、Her−2キメラタンパク質またはその断片に融合しているLLOタンパク質のN末端断片から構成される組換えポリペプチドを提供する。その実施形態では前記異種抗原はHer−2キメラタンパク質またはその断片である。
別の実施形態では本発明の方法および組成物のHer−2キメラタンパク質はヒトHer−2キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのHer−2タンパク質はマウスHer−2キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのHer−2タンパク質はラットHer−2キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのHer−2タンパク質は霊長類Her−2キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのHer−2タンパク質はヒトまたは他のあらゆる動物種のHer−2キメラタンパク質または当技術分野において知られているその組合せである。
別の実施形態ではそのHer−2タンパク質は「HER−2/neu」、「Erbb2」、「v−erb−b2」、「c−erb−b2」、「neu」、または「cNeu」と称されるタンパク質である。
1つの実施形態では前記Her2−neuキメラタンパク質は、癌遺伝子のMHCクラスIエピトープのクラスターを示すHer2/neu抗原の2つの細胞外断片と1つの細胞内断片を保持し、別の実施形態ではそのキメラタンパク質は、Her2/neu抗原の3つのH2DqおよびマッピングされたヒトMHCクラスIエピトープのうちの少なくとも17エピトープ(断片EC1、EC2、およびIC1)を保持する(図20A)。別の実施形態ではそのキメラタンパク質はマッピングされたヒトMHCクラスIエピトープのうちの少なくとも13エピトープ(断片EC2およびIC1)を保持する。別の実施形態ではそのキメラタンパク質はマッピングされたヒトMHCクラスIエピトープのうちの少なくとも14エピトープ(断片EC1およびIC1)を保持する。別の実施形態ではそのキメラタンパク質はマッピングされたヒトMHCクラスIエピトープのうちの少なくとも9エピトープ(断片EC1およびIC2)を保持する。別の実施形態ではそのHer2−neuキメラタンパク質は非溶血性リステリオリシンO(LLO)に融合している。別の実施形態ではそのHer2−neuキメラタンパク質はリステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシンO(LLO)タンパク質の最初の441アミノ酸に融合しており、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化栄養要求性株LmddAによって発現および分泌される。別の実施形態ではキメラ型Her2/neu抗原/LLO融合タンパク質を発現する本明細書において提供される弱毒化栄養要求性株からのその融合タンパク質tLLO−ChHer2の発現と分泌は、インビトロで8時間培養した後のTCA沈殿した細胞培養上清内のLm−LLO−ChHer2のものと同等である(図20B参照)。
1つの実施形態ではCTL活性が無感作の動物または関連のリステリア免疫療法を注射されたマウスにおいて検出されなかった(図21A)。一方で別の実施形態では本明細書において提供される弱毒化栄養要求性株は、野生型FVB/Nマウスに由来する脾細胞によるIFN−γの分泌を刺激することができる(図21Bおよび21C)。
別の実施形態ではそのHer−2キメラタンパク質は配列番号22に示される以下の核酸配列によってコードされる:
gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaa (配列番号22)。
gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaa (配列番号22)。
別の実施形態ではそのHer−2キメラタンパク質は以下の配列を持つ:
E T H L D M L R H L Y Q G C Q V V Q G N L E L T Y L P T N A S L S F L Q D I Q E V Q G Y V L I A H N Q V R Q V P L Q R L R I V R G T Q L F E D N Y A L A V L D N G D P L N N T T P V T G A S P G G L R E L Q L R S L T E I L K G G V L I Q R N P Q L C Y Q D T I L W K N I Q E F A G C K K I F G S L A F L P E S F D G D P A S N T A P L Q P E Q L Q V F E T L E E I T G Y L Y I S A W P D S L P D L S V F Q N L Q V I R G R I L H N G A Y S L T L Q G L G I S W L G L R S L R E L G S G L A L I H H N T H L C F V H T V P W D Q L F R N P H Q A L L H T A N R P E D E C V G E G L A C H Q L C A R G Q Q K I R K Y T M R R L L Q E T E L V E P L T P S G A M P N Q A Q M R I L K E T E L R K V K V L G S G A F G T V Y K G I W I P D G E N V K I P V A I K V L R E N T S P K A N K E I L D E A Y V M A G V G S P Y V S R L L G I C L T S T V Q L V T Q L M P Y G C L L D (配列番号23)。
E T H L D M L R H L Y Q G C Q V V Q G N L E L T Y L P T N A S L S F L Q D I Q E V Q G Y V L I A H N Q V R Q V P L Q R L R I V R G T Q L F E D N Y A L A V L D N G D P L N N T T P V T G A S P G G L R E L Q L R S L T E I L K G G V L I Q R N P Q L C Y Q D T I L W K N I Q E F A G C K K I F G S L A F L P E S F D G D P A S N T A P L Q P E Q L Q V F E T L E E I T G Y L Y I S A W P D S L P D L S V F Q N L Q V I R G R I L H N G A Y S L T L Q G L G I S W L G L R S L R E L G S G L A L I H H N T H L C F V H T V P W D Q L F R N P H Q A L L H T A N R P E D E C V G E G L A C H Q L C A R G Q Q K I R K Y T M R R L L Q E T E L V E P L T P S G A M P N Q A Q M R I L K E T E L R K V K V L G S G A F G T V Y K G I W I P D G E N V K I P V A I K V L R E N T S P K A N K E I L D E A Y V M A G V G S P Y V S R L L G I C L T S T V Q L V T Q L M P Y G C L L D (配列番号23)。
1つの実施形態では本明細書において提供される方法および組成物のHer2キメラタンパク質またはその断片はそのシグナル配列を含まない。別の実施形態では、そのシグナル配列の疎水性が高いため、そのシグナル配列の削除によりそのHer2断片がリステリア内で順調に発現できるようになる。
別の実施形態では本発明の方法および組成物のHer2キメラタンパク質の断片はその膜貫通ドメイン(TM)を含まない。1つの実施形態では、そのTMの疎水性が高いため、そのTMの削除によりそのHer−2断片がリステリア内で順調に発現できるようになる。
耐性腫瘍が小断片性リステリアベース免疫治療またはトランスツズマブ(Her2/neu抗原の細胞外領域に位置するエピトープに対するモノクローナル抗体)の標的とされているとき、癌原性タンパク質であるHer2/neu内の点突然変異またはアミノ酸欠失が耐性腫瘍細胞の治療に介在することが報告されている。その癌遺伝子のMHCクラスIエピトープのクラスターを示すHer2/neu抗原の2つの細胞外断片と1つの細胞内断片を保持するキメラ型Her2/neuベースの組成物が本明細書に記載される。Her2/neu抗原の3つのH2DqおよびマッピングされたヒトMHCクラスIエピトープのうちの少なくとも17エピトープを保持するこのキメラタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシンOタンパク質の最初の441アミノ酸に融合され、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化株LmddAによって発現および分泌された。
別の実施形態では前記腫瘍関連抗原は血管新生抗原である。別の実施形態ではその血管新生抗原は活性化周皮細胞と腫瘍新生血管内の周皮細胞との両方の上に発現し、別の実施形態ではその抗原はインビボでの新血管形成と関連する。別の実施形態ではその血管新生抗原はHMW−MAAである。別の実施形態ではその血管新生抗原は当技術分野において知られているものであり、参照により本明細書に援用される国際公開WO2010/102140号パンフレット内において提供される。
1つの実施形態では本明細書において列挙されるあらゆるアミノ酸配列に対するタンパク質および/またはペプチドの相同性は、免疫ブロット分析を含む当技術分野において充分に記述される方法によって、または確立された方法を介する利用可能な多数のソフトウェアパッケージのうちのどれかを利用するアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム分析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかにはFASTAパッケージ、BLASTパッケージ、MPsrchパッケージ、またはScanpsパッケージが含まれてよく、それらは例えばスミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および/または分析のための広範囲/局所的もしくはBLOCKSアラインメントを採用してもよい。
1つの実施形態では本明細書において提供されるミニ遺伝子核酸コンストラクトまたは本明細書において提供される1つ以上のペプチドに融合している免疫原性ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を備えるプラスミドが、相同組換えを用いてリステリア染色体に組み込まれる。相同組換えの技術は当技術分野において周知であり、例えばBaloglu S、Boyle SMらの著作 (Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein.Vet Microbiol 2005, 109(1−2):11−7)、およびJiang LL, Song HH, et al., (Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing green fluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 2005, 37(1):19−24)に記載されている。別の実施形態では相同組換えは米国特許第6855320号に記載されるように実施される。この場合、E7を発現する組換え型Lm株は、hlyプロモーターの制御下にあり、且つ、遺伝子産物の分泌を確実にするためにhlyシグナル配列を含むE7遺伝子の染色体への組み込みによって作製され、Lm−AZ/E7と称される組換え体を得た。別の実施形態では温度感受性プラスミドが組換え体を選択するために使用される。本発明の別個の実施形態により各技術が表される。
別の実施形態では前記コンストラクトまたは核酸分子は、トランスポゾン挿入を用いてリステリア染色体に組み込まれる。トランスポゾン挿入の技術は当技術分野において周知であり、とりわけDP−L967の構築についてのSunらの著作 (Infection and Immunity 1990, 58: 3770−3778)に記載される。別の実施形態ではトランスポゾン突然変異形成は安定なゲノム挿入変異体を形成することができるという利点を有するが、外来遺伝子が挿入されるゲノム内の位置がわからないという欠点を有する。
1つの実施形態では本明細書において提供されるベクターは、プラスミドベクターまたはファージベクターを含む当技術分野において知られているベクターである。別の実施形態では前記コンストラクトまたは核酸分子は、ファージ組込み部位を含むファージベクターを用いてリステリア染色体に組み込まれる(Lauer P,Chow MY et al,Construction,characterization,and use of two Listeria monocytogenes site−specific phage integration vectors.J Bacteriol 2002;184(15):4177−86)。この方法のある特定の実施形態ではバクテリオファージ(例えば、U153またはPSAリステリオファージ)のインテグレース遺伝子と付着部位を使用してゲノム内のあらゆる適切な部位(例えば、comKまたはarg tRNA遺伝子の3’端)であり得るその対応する付着部位にその異種遺伝子が挿入される。別の実施形態ではそのコンストラクトまたは異種遺伝子の組込みの前に利用される付着部位から内在性プロファージが除去される。別の実施形態ではこの方法により一コピー組込み体が生じる。別の実施形態では本発明は、d−アラニンラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素について栄養要求性である宿主株、例えば、Lmdal(−)dat(−)を使用することができる臨床用途向けのファージベースの染色体組込み系をさらに含む。別の実施形態では「ファージ除去工程」を避けるためにPSAに基づくファージ組込み系を使用する。別の実施形態ではこれは組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では本発明は、抗生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組込み系の確立を可能にする。代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。
別の実施形態では本明細書において提供されるベクターは、細菌性送達ベクター、ウイルスベクター送達ベクター、ペプチド免疫療法送達ベクター、およびDNA免疫療法送達ベクターを含む当技術分野において知られている送達ベクターである。当業者は、「送達ベクター」という用語が1つ以上のネオエピトープまたは1つ以上のネオエピトープを含むペプチドを宿主細胞内に送達することができ、ある特定の実施形態ではそれを宿主細胞内で発現することができるコンストラクトを指すことを理解する。そのようなベクターの代表例にはウイルスベクター、核酸発現ベクター、裸DNA、およびある特定の真核細胞(例えば、プロデューサー細胞)が含まれる。1つの実施形態では送達ベクターはプラスミドベクターまたはファージベクターと異なる。別の実施形態では本発明の送達ベクターと本発明のプラスミドベクターまたはファージベクターは同じである。別の実施形態では本明細書において開示される方法および組成物において使用される送達ベクターはリステリア・モノサイトゲネス株である。
本明細書において提供される方法および組成物の1つの実施形態では、「組換え部位」または「部位特異的組換え部位」という用語は、その組換え部位に隣接する核酸部分の交換または切除を媒介するリコンビナーゼによって(いくつかの事例では、関連タンパク質と共に)認識される核酸分子内の塩基配列を指す。それらのリコンビナーゼと関連タンパク質は「組換えタンパク質」と総称される(例えば、Landy,A.,(Current Opinion in Genetics & Development)3:699−707;1993)を参照のこと)。
「ファージ発現ベクター」、「ファージベクター」、または「ファージミド」は、本明細書において提供される方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞を含むあらゆる細胞の中で構成的または誘導的に発現することを目的としたあらゆるファージベースの組換え発現系を指す。典型的にはファージ発現ベクターは細菌細胞内で複製することも適切な条件下でファージ粒子を生成することも可能である。この用語は直鎖状または環状の発現系を含み、且つ、エピソームのままであるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれる両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
1つの実施形態では本明細書において使用される「機能可能であるように連結される」という用語は、転写が開始されるように転写および翻訳の調節性核酸があらゆるコード配列に対して配置されることを意味する。一般的に、これはプロモーターおよび転写開始または始動配列がコ−ド領域の5’側に配置されることを意味する。
1つの実施形態では「オープン・リーディング・フレーム」または「ORF」は、タンパク質をコードする可能性がある塩基配列を含有する生物のゲノムの部分である。別の実施形態ではORFの開始末端および終止末端はmRNAの末端と同等ではなく、それらの末端は通常mRNA内に含まれる。1つの実施形態ではORFは遺伝子の開始コード配列(開始コドン)と停止コドン配列(終止コドン)との間に位置する。したがって、1つの実施形態では内在性ポリペプチドとのオープン・リーディング・フレームとして機能可能であるようにゲノムに組み込まれた核酸分子は、内在性ポリペプチドと同一のオープン・リーディング・フレームとしてゲノムに組み込まれた核酸分子である。
1つの実施形態では本発明はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。1つの実施形態では「リンカー配列」は2つの異種ポリペプチドまたはそれらの断片もしくはドメインを接続するアミノ酸配列を指す。一般的に、本明細書において使用される場合、リンカーはポリペプチドを共有結合で連結して融合ポリペプチドを形成するアミノ酸配列である。典型的には、リンカーは、オープン・リーディング・フレームがコードするアミノ酸配列およびディスプレイタンパク質を含む融合タンパク質を作製するためのディスプレイプラスミドベクターからレポーター遺伝子を除去した後に残る組換えシグナルから翻訳されるアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、そのリンカーはグリシンおよび他の小さい中性アミノ酸などの追加的なアミノ酸を含むことができる。
1つの実施形態では、本明細書において使用される場合、「内在性」は基準生物内で発生もしくは創出された、または基準生物内の原因により生じたものを説明する。別の実施形態では内在性は天然であることを指す。
別の実施形態では「安定的に維持される」は、選択(例えば、抗生物質選択)が無い状態での検出可能な損失を伴わない核酸分子またはプラスミドの10世代にわたる維持を指す。別の実施形態ではその期間は15世代である。別の実施形態ではその期間は20世代である。別の実施形態ではその期間は25世代である。別の実施形態ではその期間は30世代である。別の実施形態ではその期間は40世代である。別の実施形態ではその期間は50世代である。別の実施形態ではその期間は60世代である。別の実施形態ではその期間は80世代である。別の実施形態ではその期間は100世代である。別の実施形態ではその期間は150世代である。別の実施形態ではその期間は200世代である。別の実施形態ではその期間は300世代である。別の実施形態ではその期間は500世代である。別の実施形態ではその期間はより多くの世代である。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビトロで(例えば、培養されて)安定的に維持される。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定的に維持される。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定的に維持される。
別の実施形態では内在性ActA配列とのオープン・リーディング・フレームとして機能可能であるようにリステリアゲノムに組み込まれた核酸分子を含む組換え型リステリア株が本明細書において提供される。別の実施形態では本明細書において提供される方法および組成物の組換え型リステリア株は、ActAまたは短縮型ActAに融合された抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性発現プラスミドベクターを含む。1つの実施形態ではその抗原の発現と分泌は、actAプロモーターおよびactAシグナル配列の制御下にあり、その抗原はActAの1〜233アミノ酸(短縮型ActAまたはtActA)への融合として発現される。別の実施形態ではその短縮型ActAは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第7655238号明細書に記載されるように、野生型ActAタンパク質の最初の390のアミノ酸から成る。別の実施形態ではその短縮型ActAは、米国特許出願公開第2014/0186387号明細書に記載されるように、PESTモチーフが欠失しており、非保存的QDNKR置換を含有するActA−N100またはその修正版(ActA−N100*と称される)である。
1つの実施形態では本明細書において提供される断片は機能的断片である。別の実施形態では「機能的断片」は、単独で、または本明細書において提供される免疫療法組成物として対象に投与されると免疫応答を誘発することができる免疫原性断片である。別の実施形態では機能的断片は、当業者によって理解され、且つ、本明細書においてさらに提示されるように、生物活性を有する。
1つの実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は弱毒化株である。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は組換え株である。別の実施形態では本明細書において提供される組換え型リステリア株は生きた弱毒化組換え型リステリア株である。
別の実施形態では本発明の方法および組成物の組換え型リステリア株は、組換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・シーリゲリ}株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は、当技術分野において知られている他のあらゆるリステリア種の組換え株である。
別の実施形態では本発明の組換え型リステリア株は動物宿主を通して継代されている。別の実施形態ではその継代はその株の免疫療法ベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の病原性を増加する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の不安定な亜系の普及を低下させる。別の実施形態ではそのリステリア株は抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入物を含む。別の実施形態ではそのリステリア株は抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態ではその継代は本明細書に記載されるように実施される。別の実施形態では当技術分野において知られている他のあらゆる方法によってその継代が実施される。
別の実施形態では本発明の組換え型核酸は、前記リステリア株内のそのコードされたペプチドの発現を引き起こすプロモーター/調節性配列に機能可能であるように連結されている。遺伝子の構成的発現を引き起こすために有用なプロモーター/調節性配列は当技術分野において周知であり、これらには、例えば、リステリアのPhlyAプロモーター、PActAプロモーター、およびp60プロモーター、ストレプトコッカスbacプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスsgiAプロモーター、およびバチルス・チューリンゲンシスphaZプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では本発明のペプチドをコードする核酸の誘導性で組織特異的な発現が、そのペプチドをコードする核酸を誘導性または組織特異的プロモーター/調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘導性プロモーター/調節性配列の例としてはMMTV LTR誘導性プロモーター、およびSV40後期エンハンサー/プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では金属、グルココルチコイドなどのような誘導剤に応答して誘導されるプロモーターが利用される。したがって、本発明は、既知または未知のどちらかであるプロモーター/調節性配列であって、その配列に機能可能であるように連結されている所望のタンパク質の発現を引き起こすことができるあらゆるプロモーター/調節性配列の使用を含むことが理解される。当業者は、「異種」という用語が基準種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することを理解する。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は1つの実施形態ではそのリステリア株にとって固有または内在性のものではないペプチドを発現することになり、または別の実施形態ではそのリステリア株によって通常発現されないポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態ではそのリステリア株以外の供給源に由来するポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では異種という用語は同一の種の中の異なる生物に由来するものを説明するために使用される。別の実施形態では前記異種抗原は、リステリアの組換え株によって発現され、その組換え株が哺乳類細胞に感染するとプロセッシングを受け、且つ、細胞傷害性T細胞に提示される。別の実施形態ではリステリア種によって発現されるその異種抗原は、その哺乳類内で自然に発現する対応する未修飾の抗原またはタンパク質を認識するT細胞応答が生じる限り、腫瘍細胞または感染性因子の中のその未修飾の抗原またはタンパク質と厳密に一致する必要がない。「異種抗原」という用語は本明細書において「抗原性ポリペプチド」、「異種タンパク質」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」などと呼ばれる場合がある。
当業者は、「エピソーム性発現ベクター」という用語が、直鎖状または環状であり得、且つ、通常二本鎖の形態であり、細菌または細胞のゲノムに組み込まれるのと反対に宿主細菌または宿主細胞の細胞質内に存在するという点で染色体外にある核酸プラスミドベクターを包含することを理解する。1つの実施形態ではエピソーム性発現ベクターは目的の遺伝子を含む。別の実施形態ではエピソーム性ベクターは細菌の細胞質中において複数コピーで存続し、それにより目的の遺伝子の増幅をもたらし、別の実施形態では必要なときにウイルス性トランス作用因子が供給される。別の実施形態ではそのエピソーム性発現ベクターは本明細書においてプラスミドと称される場合がある。別の実施形態では「組込み型プラスミド」は宿主ゲノムへのそのプラスミドの挿入または担持される目的の遺伝子の挿入を目的とする配列を含む。別の実施形態では目的の挿入遺伝子は分断されず、または細胞DNAへの組込みによりしばしば生じる調節上の制約を受けない。別の実施形態ではその挿入異種遺伝子の存在は、その細胞自身の重要な領域の再構成または分断につながらない。別の実施形態において、安定な形質移入法ではエピソーム性ベクターを使用することで染色体組込み型プラスミドを使用するよりも高い形質移入効率が生じることが多い(Belt,P.B.G.M.,et al(1991)Efficient cDNA cloning by direct phenotypic correction of a mutant human cell line(HPRT2)using an Epstein−Barr virus−derived cDNA expression vector.Nucleic Acids Res.19,4861−4866;Mazda,O.,et al.(1997)Extremely efficient gene transfection into lympho−hematopoietic cell lines by Epstein−Barr virus−based vectors.J.Immunol.Methods 204, 143−151)。1つの実施形態では本明細書において提供される方法および組成物のエピソーム性発現ベクターは、DNA分子を細胞に送達するために用いられる様々な方法のいずれかによってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達され得る。また、それらのベクターは単独でも対象の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態でも送達され得る。
1つの実施形態では「融合される」という用語は共有結合による機能可能な連結を指す。1つの実施形態ではこの用語は(核酸配列またはそのオープン・リーディング・フレームの)組換え技術による融合を含む。別の実施形態ではこの用語は化学的結合を含む。
1つの実施形態では「形質転換」という用語は、プラスミドまたは他の異種DNA分子を取り込むように細菌細胞を操作することを指す。別の実施形態では「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種DNA分子の遺伝子を発現させるために細菌細胞を操作することを指す。本明細書において提供される方法および組成物の別個の実施形態により各可能性が表される。
別の実施形態では遺伝物質および/またはプラスミドを細菌の中へ導入するために接合が用いられる。接合の方法は当技術分野において周知であり、例えば、Nikodinovic J.ら(A second generation snp−derived Escherichia coli−Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation.Plasmid.2006 Nov;56(3):223−7)およびAuchtung JMら(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005 Aug 30;102(35):12554−9)に記載されている。本明細書において提供される方法および組成物の別個の実施形態により各方法が表される。
1つの実施形態では「弱毒化」という用語は細菌が動物において疾患の原因となる能力の減退を意味する。つまり、その弱毒化リステリアは培養状態で増殖し、且つ、維持され得るが、その弱毒化リステリア株の病原特性は野生型リステリアと比較すると減少している。例として弱毒化リステリアを用いるBalb/cマウスの静脈内接種を用いると、接種された動物の50%が生存する致死量(LD50)が野生型リステリアのLD50より少なくとも約10倍増加するのが好ましく、少なくとも約100倍増加するのがより好ましく、少なくとも約1,000倍増加するのがより好ましく、少なくとも約10,000倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約100,000倍増加するのが最も好ましい。したがって、リステリアの弱毒化株は、それが投与された動物を殺さない株であるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺す株である。弱毒化細菌は、一般的な環境中ではその細菌の成長のために必要な栄養素が中に存在しないために複製する能力を有しない細菌を意味するとも解釈されるべきである。したがって、その細菌の複製は必要な栄養素が提供される制御環境中での複製に限定される。したがって、本発明の弱毒化株は非制御的複製の能力がないという点で環境的に安全である。
組成物
組成物
1つの実施形態では本発明の組成物は免疫原性組成物である。1つの実施形態では本発明の組成物はインターフェロンガンマの強い特異的刺激を誘導し、1つの実施形態ではこれは抗血管新生特性を有する。1つの実施形態では本発明のリステリアはインターフェロンガンマの強い特異的刺激を誘導し、1つの実施形態ではこれは抗血管新生特性を有する(全体が参照により本明細書に援用されるDominiecki et al.,Cancer Immunol Immunother.2005 May;54(5):477−88.Epub 2004 Oct 6、全体が参照により本明細書に援用されるBeatty and Paterson,J Immunol.2001 Feb 15;166(4):2276−82)。1つの実施形態ではリステリアの抗血管新生特性はCD4+T細胞によって媒介される(Beatty and Paterson, 2001)。別の実施形態ではリステリアの抗血管新生特性はCD8+T細胞によって媒介される。別の実施形態ではリステリアワクチン接種の結果としてのIFN−ガンマ分泌は、NK細胞、NKT細胞、Th1 CD4+T細胞、TC1 CD8+T細胞、またはこれらの組み合せによって媒介される。
別の実施形態では本発明の組成物の投与は1つ以上の抗血管新生タンパク質または因子の生産を誘導する。1つの実施形態ではその抗血管新生タンパク質はIFN−γである。別の実施形態ではその抗血管新生タンパク質は色素上皮由来因子(PEDF)、アンジオスタチン、エンドスタチン、fms様チロシンキナーゼ(sFlt)−1、または可溶性エンドグリン(sEng)である。1つの実施形態では本発明のリステリアは抗血管新生因子の放出に関与し、したがって1つの実施形態では抗原を対象に導入するためのプラスミドベクターとしての役割に加えて治療的な役割を有する。本発明の別個の実施形態により各リステリア株およびその株のタイプが表される。
別の実施形態では本明細書において提供される方法および組成物によって誘導される免疫応答はT細胞応答である。別の実施形態ではその免疫応答はT細胞応答を含む。別の実施形態ではその応答はCD8+ T細胞応答である。別の実施形態ではその応答はCD8+T細胞応答を含む。本明細書において提供される別個の実施形態により各可能性が表される。
別の実施形態では本発明の組成物の投与により抗原特異的T細胞の数が増加する。別の実施形態では組成物の投与によりT細胞上の共刺激受容体が活性化される。別の実施形態では組成物の投与によりメモリーT細胞および/またはエフェクターT細胞の増殖が誘導される。別の実施形態では組成物の投与によりT細胞の増殖が増加する。本明細書において提供される別個の実施形態により各可能性が表される。
全体を通して使用される場合、「組成物」および「免疫原性組成物」という用語は交換可能であり、すべて同一の意味と質を有する。1つの実施形態では組換え型リステリア株を含み、且つ、各構成要素の同時投与または順次投与のために抗体をさらに含む本明細書において提供される免疫原性組成物は、「併用療法」とも呼ばれる。当業者は、併用療法が追加的な構成要素、抗体、療法などを含んでもよいことを理解する。幾つかの実施形態では「医薬組成物」という用語は医療用途に適切な組成物、例えば、必要な対象に投与するための組成物を指す。1つの実施形態では本発明は本明細書において提供される弱毒化リステリア株と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では本発明は本明細書において提供されるDNA免疫療法と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では本発明は本明細書において提供されるワクシニアウイルス株またはウイルス様粒子と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では本発明は本明細書において提供されるペプチド免疫療法と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
別の実施形態では本発明は本発明のヌクレオチド分子を含む組換え免疫療法ベクターを提供する。別の実施形態ではそのベクターは発現ベクターである。別の実施形態ではその発現ベクターはプラスミドである。別の実施形態では本発明は本発明のヌクレオチド分子を細胞に導入するための方法を提供する。組換えベクターを構築および利用するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrookらの著作 (2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)およびBrentらの著作 (2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、New York)に記載されている。別の実施形態ではそのベクターは細菌ベクターである。別の実施形態ではそのベクターはサルモネラ属の種、シゲラ属の種、BCG、L.モノサイトゲネス、大腸菌、およびS.ゴルドニから選択される。別の実施形態ではファゴリソソーム融合を回避し、且つ、細胞の細胞質内で生きるように改変された組換え細菌ベクターによって1つ以上のペプチドが送達される。別の実施形態ではそのベクターはウイルスベクターである。他の実施形態ではそのベクターはワクシニア、アビポックス、アデノウイルス、AAV、ワクシニアウイルスNYVAC、変異ワクシニア株アンカラ(MVA)、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスから選択される。別の実施形態ではそのベクターは裸DNAベクターである。別の実施形態ではそのベクターは当技術分野において知られている他のあらゆるベクターである。本発明の別個の実施形態により各可能性が表される。
対象において増強抗腫瘍T細胞応答を誘発するため、対象において腫瘍介在性免疫抑制を阻害するため、または対象の脾臓および腫瘍におけるTエフェクター細胞の制御性T細胞(Treg)に対する比率を増加させるため、またはこれらのあらゆる組合せの目的で本発明の組成物が本発明の方法で使用され得る。
別の実施形態では本発明のリステリア株を含む組成物はアジュバントをさらに含む。1つの実施形態では本発明の組成物はアジュバントをさらに含む。別の実施形態では本発明の方法および組成物において使用されるアジュバントは顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質である。別の実施形態ではそのアジュバントはGM−CSFタンパク質を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはGM−CSFをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態ではそのアジュバントはGM−CSFをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはサポニンQS21である。別の実施形態ではそのアジュバントはサポニンQS21を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはモノホスホリルリピドAである。別の実施形態ではそのアジュバントはモノホスホリルリピドAを含む。別の実施形態ではそのアジュバントはSBAS2である。別の実施形態ではそのアジュバントはSBAS2を含む。別の実施形態ではそのアジュバントは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態ではそのアジュバントは非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは当技術分野において知られている他のあらゆるアジュバントであるか、またはこれを含む。
1つの実施形態では本発明の免疫原性組成物は、核酸分子を含む組換え型リステリア株であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含み、前記融合ポリペプチドが異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリシンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列を含む前記組換え型リステリア株を含む。別の実施形態では本発明の免疫原性組成物は、核酸分子を含む組換え型リステリア株であって、前記核酸分子が短縮型リステリオリシンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列コードする第1オープン・リーディング・フレームを含む前記組換え型リステリア株を含む。
1つの実施形態では本発明の免疫原性組成物は、核酸分子を含む組換え型リステリア株であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含み、前記融合ポリペプチドが異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列を含む前記組換え型リステリア株を含み、前記組成物は抗体またはその断片をさらに含む。別の実施形態では前記抗体またはその断片はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、Fv断片、単鎖抗体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
1つの実施形態では本発明の免疫原性組成物は本明細書において提供される組換え型リステリア株を含み、前記組成物は抗体またはその断片をさらに含む。別の実施形態では前記抗体またはその断片はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、Fv断片、単鎖抗体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
別の実施形態では本発明の免疫原性組成物は組換え型リステリア株を含み、前記組成物は抗体またはその断片をさらに含む。別の実施形態では前記抗体またはその断片はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、Fv断片、単鎖抗体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
幾つかの実施形態では「抗体」という用語は、所望の標的と特異的に相互作用可能であり、例えば、チェックポイント阻害薬の結合を妨害することができる完全な分子ならびに「抗原結合断片」とも呼ばれるFab、F(ab’)2、およびFvなどのその機能性断片を指す。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストを含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗PD−L1/PD−L2抗体またはその断片を含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗PD−1抗体またはその断片を含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗CTLA−4抗体またはその断片を含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗B7−H4抗体またはその断片を含む。
幾つかの実施形態ではそれらの抗体断片は (1)抗体分子の一価抗原結合断片を含有し、一つの完全な軽鎖と一本の重鎖の一部を得るためにパパイン酵素で抗体全体を消化することで作製され得る断片であるFab、(2)一つの完全な軽鎖と重鎖の一部を得るためにペプシンで抗体全体を処理し、続いて還元することにより得ることができる抗体分子の断片であって、抗体当たり2本の断片が得られるFab’、(3)ペプシンで抗体全体を処理し、後続の還元を行わないことにより得ることができる抗体の断片であって、2本のFab’断片が2本のジスルフィド結合によって結合した二量体である(Fab’)2、(4)2本の鎖として発現した軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝的に改変された断片であるFv、または(5)遺伝的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝的に改変された断片である単鎖抗体(「SCA」)を含む。本発明の別個の実施形態により各可能性が表される。
これらの断片の作製方法は当技術分野において知られている。(例えば、参照により本明細書に援用されるHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照されたい)。
幾つかの実施形態では前記抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解、またはその断片をコードするDNAの大腸菌もしくは哺乳類細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系)内での発現によって調製され得る。
幾つかの実施形態では抗体断片は従来の方法による抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化によって獲得され得る。例えば、F(ab’)2で表される5S断片を提供するためにペプシンを用いる抗体の酵素的切断によって抗体断片を作製することができる。チオール還元剤を使用し、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の保護基を所望により使用してこの断片をさらに切断して3.5SのFab’一価断片を作製することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断により2本の一価Fab’断片と1本のFc断片が直接的に作製される。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許 第4036945号明細書および同第4331647号明細書、およびその中に含有される参照文献によって説明されており、それらの特許の全体を参照により本明細書に援用する。Porter, R. R., Biochem. J., 73:119〜126, 1959も参照されたい。一価軽鎖重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝的技術などの抗体を切断する他の方法は、完全抗体によって認識される抗原にそれらの断片が結合する限り、用いられてもよい。
Fv断片はVH鎖およびVL鎖の結合を含む。この結合は、Inbar et al., Proc. Nat.’l Acad. Sci. USA 69:2659〜62, 1972に記載されるように非共有結合性である場合がある。あるいは、それらの可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結する、またはグルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋することができる。Fv断片はペプチドリンカーによって接続されたVH鎖およびVL鎖を含むことが好ましい。これらの単鎖抗原結合タンパク質(sFv)は、オリゴヌクレオチドによって接続されるVHドメインとVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。その構造的遺伝子は発現ベクターに挿入され、これはその後大腸菌などの宿主細胞の中に導入される。その組換え型宿主細胞はそれらの2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。sFvを作製するための方法は、例えば、Whitlow and Filpula, Methods, 2: 97−105, 1991、Bird et al., Science 242: 423−426, 1988、Pack et al., Bio/Technology 11: 1271−77, 1993、および全体が参照により本明細書に援用されるLadnerらの米国特許 第4946778号明細書によって説明されている。
抗体断片の別の形態は単一相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。目的の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって、CDRペプチド(「最小認識単位」)を得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して抗体生成細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Larrick and Fry, Methods, 2: 106−10, 1991を参照のこと。
幾つかの実施形態では本明細書に記載される抗体または断片は「ヒト化形態」の抗体を含む場合がある。幾つかの実施形態では「ヒト化形態の抗体」という用語は、非ヒト(例えば、マウスの)抗体であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、または抗体の他の抗原結合部分配列など)のキメラ分子である前記非ヒト抗体を指す。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域(CDR)を形成する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRに由来する残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)が含まれる。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも移入したCDRまたはフレームワーク配列でも見られない残基を含む場合もある。一般的に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである少なくとも1つの、そして典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。最適にはヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分も含むことになる[Jones et al., Nature, 321:522−525 (1986)、Riechmann et al., Nature, 332:323−329 (1988)、およびPresta, Curr. Op. Struct.Biol., 2:593−596 (1992)]。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源からその中に導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は移入残基と呼ばれることが多く、これらは典型的には移入可変ドメインから取られる。ヒト化は、ウィンターおよびその協力者の方法[Jones et al., Nature, 321:522−525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323−327 (1988)、Verhoeyen et al., Science, 239:1534−1536 (1988)]に従って、齧歯類のCDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応配列に置き換えることによって基本的実施可能である。したがって、こうしたヒト化抗体はキメラ抗体(米国特許第4816567号)であり、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種の対応する配列によって置き換えられている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのCDR残基および場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類の抗体の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野において知られている様々な技法を使用しても生産され得る[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)、Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]。Coleらの技法およびBoernerらの技法もヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)、およびBoerner et al.、J. Immunol., 147(1):86−95(1991)]。同様に、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えば、マウスの中にヒト免疫グロブリン座位を導入することによってヒトを作製することができる。それを挑戦すると、遺伝子再構成、組立、および抗体レパートリーを含む全ての点に関してヒトの中で見られるものと非常に似ているヒト抗体の生産が観察される。この取り組みは、例えば、米国特許 第5545807号明細書、同第5545806号明細書、同第5569825号明細書、同第5625126号明細書、同第5633425号明細書、同第5661016号明細書、および以下の科学出版物、すなわち、Marks et al., Bio/Technology 10, 779−783(1992)、Lonberg et al., Nature 368 856−859(1994)、Morrison, Nature 368 812−13(1994)、Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845−51(1996)、Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826(1996)、Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65−93(1995)に記載されている。
1つの実施形態では本明細書において提供される疾患は癌または腫瘍である。1つの実施形態では本発明の方法で治療される癌は乳癌である。別の実施形態ではこの癌は子宮頚部癌である。別の実施形態ではこの癌はHer2含有性癌である。別の実施形態ではこの癌は黒色腫である。別の実施形態ではこの癌は膵臓癌である。別の実施形態ではこの癌は卵巣癌である。別の実施形態ではこの癌は胃癌である。別の実施形態ではこの癌は膵臓の癌病巣である。別の実施形態ではこの癌は肺腺癌である。別の実施形態ではこの癌は肺腺癌である。別の実施形態では、これは多形神経膠芽腫である。別の実施形態ではこの癌は大腸腺癌である。別の実施形態ではこの癌は肺扁平腺癌である。別の実施形態ではこの癌は胃腺癌である。別の実施形態ではこの癌は卵巣表面上皮性新生物(例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種)である。別の実施形態ではこの癌は口腔扁平上皮癌である。別の実施形態ではこの癌は肺非小細胞癌である。別の実施形態ではこの癌は子宮内膜癌である。別の実施形態ではこの癌は膀胱癌である。別の実施形態ではこの癌は頭頸部癌である。別の実施形態ではこの癌は前立腺癌である。別の実施形態ではこの癌は口腔咽頭癌である。別の実施形態ではこの癌は肺癌である。別の実施形態ではこの癌は肛門癌である。別の実施形態ではこの癌は大腸癌である。別の実施形態ではこの癌は食道癌である。別の実施形態ではこの癌は中皮腫である。
1つの実施形態では本明細書において提供される異種抗原はHPV−E7である。別の実施形態ではその抗原はHPV−E6である。別の実施形態ではそのHPV-E7はHPV株16由来である。別の実施形態ではそのHPV-E7はHPV株18由来である。別の実施形態ではそのHPV-E6はHPV株16由来である。別の実施形態ではそのHPV-E7はHPV株18由来である。別の実施形態では本明細書において提供される異種抗原の断片も本発明に包含される。
別の実施形態ではその抗原はHer−2/neuである。別の実施形態ではその抗原はNY−ESO−1である。別の実施形態ではその抗原はテロメラーゼ(TERT)である。別の実施形態ではその抗原はSCCEである。別の実施形態ではその抗原はCEAである。別の実施形態ではその抗原はLMP−1である。別の実施形態ではその抗原はp53である。別の実施形態ではその抗原は炭酸脱水酵素IX(CAIX)である。別の実施形態ではその抗原はPSMAである。別の実施形態ではその抗原は前立腺幹細胞抗原(PSCA)である。別の実施形態ではその抗原はHMW−MAAである。別の実施形態ではその抗原はWT−1である。別の実施形態ではその抗原はHIV−1 Gagである。別の実施形態ではその抗原はプロテイナーゼ3である。別の実施形態ではその抗原はチロシナーゼ関連タンパク質2である。別の実施形態ではその抗原はPSA(前立腺特異抗原)である。別の実施形態ではその抗原は二価PSAである。別の実施形態ではその抗原はERGである。別の実施形態ではその抗原はERGコンストラクトIII型である。別の実施形態ではその抗原はERGコンストラクトVI型である。別の実施形態ではその抗原はアンドロゲン受容体(AR)である。別の実施形態ではその抗原はPAK6である。別の実施形態ではその抗原はPAK6の高エピトープ領域を含む。別の実施形態ではその抗原は、HPV−E7、HPV−E6、Her−2、NY−ESO−1、テロメラーゼ(TERT)、SCCE、HMW−MAA、EGFR−III、サバイビン、バキュロウイルスアポトーシス阻害性反復配列含有タンパク質5(BIRC5)、WT−1、HIV−1 Gag、CEA、LMP−1、p53、PSMA、PSCA、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2、Muc1、PSA(前立腺特異的抗原)、またはこれらの組合せから選択される。別の実施形態では抗原はその抗原の野生型を含む。別の実施形態では抗原はその抗原の突然変異型を含む。
1つの実施形態ではPAK6の核酸配列は配列番号102で示される。別の実施形態ではPAK6のアミノ酸配列は配列番号103で示される。(全体が本明細書に援用される、2012年9月5日にオンライン出版されたKwek et al. (2012) J Immunolを参照されたい。)
別の実施形態では「免疫原性断片」は、単独で、または本明細書において提供される免疫療法組成物として対象に投与されると免疫応答を誘発する断片である。別の実施形態ではそのような断片は、液性免疫応答および/または適応免疫応答のどちらかを誘発するために必要なエピトープを含有する。
1つの実施形態では本発明の組成物は抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物は少なくとも1つの抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では組成物は2つの抗体、3つの抗体、4つの抗体、または4つを超える抗体を含みうる。別の実施形態では本発明の組成物はLm株および抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物はLm株および少なくとも1つの抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本明細書の組成物はLm株および2つの抗体、3つの抗体、4つの抗体、または4つを超える抗体を含む。別の実施形態では本発明の組成物は抗体またはその機能性断片を含み、その組成物は本明細書において提供されるリステリア株を含まない。同じ組成物または異なる組成物に存在する様々な抗体は同一の形態を有する必要はなく、例えば、1つの抗体はモノクローナル抗体であってよく、別の抗体はFAb断片であってよい。本発明の異なる実施形態により各可能性が表される。
1つの実施形態では本発明の組成物は、特異的にGITRまたはその部分に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物は、特異的にOX40またはその部分に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では組成物は、GITRまたはその部分に特異的に結合する抗体とOX40に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では本発明の組成物はLm株、およびGITRに特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物はLm株、およびOX40に特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物はLm株、およびGITRまたはその部分に特異的に結合する抗体、およびOX40またはその部分に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では本発明の組成物はGITRに特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含み、その組成物は本明細書において提供されるリステリア株を含まない。別の実施形態では本発明の組成物はOX40に特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含み、その組成物は本明細書において提供されるリステリア株を含まない。別の実施形態では本発明の組成物はGITRに特異的に結合する抗体またはその機能性断片とGITRに特異的に結合する抗体を含み、その組成物は本明細書において提供されるリステリア株を含まない。同じ組成物または異なる組成物に存在する様々な抗体は同一の形態を有する必要はなく、例えば、1つの抗体はモノクローナル抗体であってよく、別の抗体はFAb断片であってよい。本発明の異なる実施形態により各可能性が表される。
「抗体機能性断片」という用語は、特異的に抗原に結合して本発明で意図されている生物学的効果を引き起こすことが可能である完全抗体の部分を指す。抗体断片の例としてはFab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、およびFv断片、直鎖状抗体、scFv抗体、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるがこれに限定されない。
本明細書において使用される場合、「抗体重鎖」は全ての抗体分子の天然の立体構造でそれらの分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち長い方を指す。
本明細書において使用される場合、「抗体軽鎖」は全ての抗体分子の天然の立体構造でそれらの分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち短い方を指し、κ軽鎖およびλ軽鎖は2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
本明細書において使用される「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書において記載されるバクテリオファージによる抗体発現など、組換えDNA技術を使用して作製された抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子を合成し、そのDNA分子が抗体タンパク質を発現することにより生成されたその抗体、またはその抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、そのDNAまたはアミノ酸配列は当技術分野において利用可能であり、且つ、よく知られている合成DNA技術またはアミノ酸配列技術用いて獲得されている。
1つの実施形態では抗体またはその機能性断片は抗原結合領域を含む。1つの実施形態では抗原結合領域は抗体またはその抗原結合ドメインである。1つの実施形態ではその抗原結合ドメインはFabまたはscFvである。
当業者は、抗体に関する「結合する」または「特異的に結合する」という用語が特異的な抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合することがない抗体またはその機能性断片を包含することを理解する。例えば、1つの種の抗原に特異的に結合する抗体は、1つ以上の種のその抗原にも結合する場合があるが、そのような種間交差反応性はそれ自体で特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。別の実施例では抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原の異なるアレル型に結合する場合もある。しかしながら、そのような交差反応はそれ自体で特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。幾つかの事例では、第2化学種と抗体、タンパク質、またはペプチドの相互作用に関連して、その相互作用がその化学種上での特定の構造(例えば抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存すること、例えば、抗体は特定のアミノ酸配列というよりも特定のタンパク質構造を認識して結合することを意味するために「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を使用することができる。
1つの実施形態では本発明の組成物は、組換え型リステリア・モノサイトゲネス(Lm)株を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるように、本発明の組成物は抗体またはその機能性断片を含む。
1つの実施形態では免疫原性組成物は、本明細書において提供される抗体またはその機能性断片、および本明細書において提供される組換え型弱毒化リステリアを含む。別の実施形態では本明細書において提供される免疫原性組成物の各構成成分は、本明細書において提供されるその免疫原性組成物の別の構成成分の前に、別の構成成分と同時に、または別の構成成分の後に投与される。1つの実施形態では、同時に投与されるときでさえも、Lm組成物と抗体またはその機能性断片は2つの別個の組成物として投与されてよい。あるいは、別の実施形態ではLm組成物は抗体またはその機能性断片を含んでよい。
別の実施形態では本発明の組成物は、非経口的に、癌近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内に投与されるなど、当業者に知られているあらゆる方法によって対象に投与される。
別の実施形態では前記組成物は経口投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物として製剤される。好適な固形経口製剤としては錠剤、カプセル、丸薬、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。好適な液状経口製剤としては液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、オイルなどが挙げられる。本発明の別の実施形態では前記活性成分はカプセルに製剤される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて硬質ゼラチンカプセルを含む。
別の実施形態では組成物は液状調製物の静脈内注射、動脈内注射、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体製剤としては液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、オイルなどが挙げられる。1つの実施形態ではそれらの医薬組成物は静脈内投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で製剤される。別の実施形態ではそれらの医薬組成物は動脈内投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で製剤される。別の実施形態ではそれらの医薬組成物は筋肉内投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で製剤される。
幾つかの実施形態では、抗体またはその機能性断片が組換え型Lm株を含む組成物と別個に投与されるとき、その抗体は静脈内に、皮下に、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてよい。1つの実施形態では抗体を含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
1つの実施形態では「免疫原性組成物」という用語は本明細書において提供される組換え型リステリア、およびアジュバントおよび抗体もしくはその機能性断片、またはこれらのあらゆる組合せを包含する場合がある。別の実施形態では免疫原性組成物は本明細書において提供される組換え型リステリアを含む。別の実施形態では免疫原性組成物は当技術分野において知られている、または本明細書において提供されるアジュバントを含む。本明細書にさらに提供されるように、そのような組成物の投与が免疫応答を強化する、または制御性T細胞に対するTエフェクター細胞の比率を増加する、または抗腫瘍免疫応答を誘発することも理解されるべきである。
1つの実施形態では本発明は、前記リステリア株を含み、且つ、抗体またはその機能性断片をさらに含む組成物の投与を含む使用方法を提供する。別の実施形態では、同じ組成物または異なる組成物に存在し得る、且つ、そのリステリアと同じ組成物内か、または別個の組成物内に存在し得る本明細書において提供される1つより多くの抗体の投与が使用方法に含まれる。本発明の異なる実施形態により各可能性が表される。
1つの実施形態では「医薬組成物」という用語は、前記リステリア株および少なくとも1つの抗体またはその機能性断片をはじめとする活性成分または複数の活性成分の治療的有効量を医薬的に許容される担体または希釈剤と共に包含する。「治療的有効量」という用語が所与の病状および投与レジメンに対して治療効果をもたらす量を指すことが理解されるべきである。
当業者は、「投与する」という用語が対象を本発明の組成物と接触させることを包含することを理解する。1つの実施形態ではインビトロで、すなわち試験管内で、またはインビボで、すなわち生物、例えば、ヒトの細胞または組織の中で投与を行うことができる。1つの実施形態では本発明は、本発明のリステリア株およびその組成物を対象に投与することを包含する。
本明細書において使用される「約」という用語は数量的にプラスマイナス5%を意味し、または別の実施形態ではプラスマイナス10%を意味し、または別の実施形態ではプラスマイナス15%を意味し、または別の実施形態ではプラスマイナス20%を意味する。当業者は、「対象」という用語が、病気またはその後遺症に対する治療を必要とする、またはその病気もしくはその後遺症になりやすい成人または子供のヒト、ティーンエージャーまたは青年のヒトを含む哺乳類を包含することができ、その用語がイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類も含み得ることを理解するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解される。「対象」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
本明細書において提供される免疫原性組成物の投与に続き、腫瘍部位におけるTエフェクター細胞の存在を増大することになる末梢リンパ器官内でのTエフェクター細胞の増殖が本明細書において提供される方法によって誘導される。別の実施形態では、末梢におけるTエフェクター細胞の存在を増大することになる末梢リンパ器官におけるTエフェクター細胞の増殖が本明細書において提供される方法によって誘導される。Tエフェクター細胞のそのような増殖は、Treg数に影響を与えずに末梢内および腫瘍部位における制御性T細胞に対するTエフェクター細胞の比率の増加をもたらす。当業者は、末梢リンパ器官には脾臓、パイエル板、リンパ節、アデノイド等が挙げられるがこれに限定されないことを理解する。1つの実施形態では制御性T細胞に対するTエフェクター細胞の比率の増加がTregの数に影響を与えずに末梢で起こる。別の実施形態では、制御性T細胞に対するTエフェクター細胞の比率の増加が末梢内、リンパ器官内、および腫瘍部位においてこれらの部位でのTreg数に影響を与えずに起こる。別の実施形態ではTエフェクター細胞の比率の増加によりTregの頻度が低下するが、これらの部位におけるTregの総数は減少しない。
併用療法およびその使用方法
併用療法およびその使用方法
1つの実施形態では本発明は、対象において増強抗腫瘍T細胞応答を誘発する方法であって、異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含む組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む方法であり、免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストを含む組成物の有効量を投与するステップをさらに含む前記方法を提供する。
1つの実施形態では免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストは抗PD−L1/PD−L2抗体またはその断片、抗PD−1抗体またはその断片、抗CTLA−4抗体またはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である。
別の実施形態では本発明は、対象において増強抗腫瘍T細胞応答を誘発する方法であって、短縮型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列をコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含む組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む方法であり、抗体またはその断片を含む組成物の有効量を前記対象に投与するステップをさらに含む前記方法を提供する。別の実施形態ではその抗体はアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態ではその抗体は抗TNF受容体抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態ではその抗体は抗OX40抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態ではその抗体は抗GITR抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態では前記方法は、前記組換え型リステリア株を含む組成物内に含まれ得るか、または別個の組成物内に含まれ得る追加的な抗体の投与をさらに含む。
1つの実施形態では本明細書において記載されるリステリア株を含むあらゆる組成物が本発明の方法の中で使用され得る。1つの実施形態では、本明細書に記載されるように、リステリア株と抗体またはその断片を含むあらゆる組成物、例えばTNF受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗体、またはT細胞受容体共刺激分子に結合する抗体、または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体に結合する抗体を含む組成物が本発明の方法の中で使用され得る。1つの実施形態では本明細書に記載される抗体またはその機能性断片を含むあらゆる組成物が本発明の方法の中で使用され得る。リステリア株を含む組成物であって、抗体を含むものと含まないものをこれまでに詳細に説明してきた。抗体を含む組成物についてもこれまでに詳細に説明してきた。一部の実施形態では本発明の方法において、抗体またはその断片、例えばTNF受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗体、またはT細胞受容体共刺激分子に結合する抗体、または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体に結合する抗体を含む組成物が、リステリア株を含む組成物の投与の前に、その投与と同時に、またはその投与の後に投与され得る。
1つの実施形態では腫瘍の退行を達成するため、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、もしくは数か月の間隔の後、本発明の組成物の反復投与(投薬)を行ってよい。別の実施形態では腫瘍増殖の抑制を達成するため、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、反復投薬を行ってよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの分析、生検、または腫瘍に伴う症状の存在、その不在、またはその寛解などの診断方法を含む当技術分野において知られているあらゆる技法のいずれかによって評価を決定してよい。
1つの実施形態では、異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療、およびそれに対するワクチン接種のための、およびその異種抗原の準優占エピトープに対する免疫応答を誘導しつつ、その腫瘍のエスケープ変異を防止するための方法および組成物が本明細書において提供される。
1つの実施形態では異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療、およびそれに対するワクチン接種のための方法および組成物は、短縮型リステリオリシン(tLLO)タンパク質の使用を含む。別の実施形態では本明細書において提供される方法および組成物は、tLLOを過剰発現する組換え型リステリアを含む。別の実施形態ではそのtLLOはリステリア内のプラスミドから発現する。
別の実施形態では、対象において腫瘍増殖または癌を予防または治療するための方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。別の実施形態では、対象において腫瘍増殖または癌を予防または治療するための方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および短縮型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列をコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
1つの実施形態では「治療する」という用語は疾患を治癒することを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患を防止することを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の発生率を減少させることを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の症状を改善することを指す。別の実施形態では「治療する」とは患者の無成績生存率または全体的生存率を増加させることを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の進行を安定させることを指す。別の実施形態では「治療する」とは寛解を誘導することを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の進行を減速させることを指す。別の実施形態では「減少させる」、「抑制する」、および「阻害する」という用語はより少なくすること、または減らすことを指す。
1つの実施形態では、対象の脾臓および腫瘍微小環境内で制御性T細胞(Treg)に対するTエフェクター細胞の比率を増加させる方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物を投与することを含む前記方法が本明細書において提供される。別の実施形態では対象内の脾臓および腫瘍微小環境内で調節性T細胞(Treg)に対するTエフェクター細胞の比率を増加させることにより、対象内でのより顕著な抗腫瘍応答が可能になる。
別の実施形態ではTエフェクター細胞はCD4+FoxP3− T細胞を含む。別の実施形態ではTエフェクター細胞はCD4+FoxP3− T細胞である。別の実施形態ではTエフェクター細胞はCD4+FoxP3− T細胞およびCD8+ T細胞を含む。別の実施形態ではTエフェクター細胞はCD4+FoxP3− T細胞およびCD8+ T細胞である。別の実施形態では制御性T細胞はCD4+FoxP3+ T細胞である。
1つの実施形態では本発明は、腫瘍または癌を治療する、腫瘍または癌から保護する、および腫瘍または癌に対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。
1つの実施形態では本発明は、ヒト対象において腫瘍または癌を予防または治療する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物株であるLLOタンパク質のN末端断片と腫瘍関連抗原を含む組換えポリペプチドを含む前記組換え型リステリア株を前記対象に投与するステップを含み、それによりその腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって前記組換え型リステリア株がヒト対象における腫瘍または癌を治療する前記方法を提供する。別の実施形態ではその免疫応答はT細胞応答である。別の実施形態ではそのT細胞応答はCD4+FoxP3− T細胞応答である。別の実施形態ではそのT細胞応答はCD8+ T細胞応答である。別の実施形態ではそのT細胞応答はCD4+FoxP3−およびCD8+ T細胞応答である。別の実施形態では本発明は、腫瘍または癌から対象を保護する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。別の実施形態では本発明は、対象において腫瘍退行を誘導する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。別の実施形態では本発明は、腫瘍または癌の発生または再発を減少させる方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。別の実施形態では本発明は、対象において腫瘍の形成を抑制する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。別の実施形態では本発明は、対象において癌の寛解を誘導する方法であって、本明細書において提供される免疫原性組成物をその対象に投与するステップを含む前記方法を提供する。1つの実施形態では融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子がリステリアゲノムに組み込まれる。別の実施形態ではその核酸分子はその組換え型リステリア免疫療法株内のプラスミドの中にある。別の実施形態ではその核酸分子はその組換え型リステリア免疫療法株内の細菌人工染色体の中にある。
1つの実施形態では本方法は組換え型リステリアを追加的な療法と共に同時投与するステップを含む。別の実施形態ではその追加的な療法は外科手術、化学療法、免疫療法、放射線療法、抗体ベースの免疫療法、またはこれらの組合せである。別の実施形態ではその追加的な療法はその組換え型リステリアの投与に先行する。別の実施形態ではその追加的な療法はその組換え型リステリアの投与の後に続く。別の実施形態ではその追加的療法は抗体療法である。別の実施形態では、Tエフェクター細胞に対する制御性T細胞の比率を増加させ、且つ、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するため、その組換え型リステリアが漸増用量で投与される。当業者は、細胞の免疫応答を強化するために腫瘍を有する対象に、限定されないが、IFN−γ、TNF−α、および当技術分野において知られている他のサイトカインをはじめとするサイトカインであって、それらのうちの幾つかが参照により本明細書に援用される米国特許第6991785号明細書に記載されているサイトカインを提供することによって抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることを理解する。
1つの実施形態では本明細書において提供される方法は、前記対象内で抗腫瘍免疫応答を強化する抗体またはその機能性断片と本明細書において提供される免疫原性組成物を同時投与するステップをさらに含む。
1つの実施形態では本明細書において提供される方法は、インドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(IDO)経路阻害剤と本明細書において提供される免疫原性組成物を同時投与するステップをさらに含む。本発明で使用されるIDO経路阻害剤としては、限定されないが、1−メチルトリプトファン(1MT)、1−メチルトリプトファン(1MT)、ネクロスタチン−1、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、5−メチルインドール−3−カルボキシアルデヒド、CAY10581、抗IDO抗体、または小分子IDO阻害剤をはじめとする当技術分野において知られているあらゆるIDO経路阻害剤が含まれる。別の実施形態では本明細書において提供される組成物および方法は、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンとも併せて、その前に、またはそれに続いて使用される。別の実施形態ではIDO阻害は化学療法剤の効率を強化する。
別の実施形態では、癌を患うか、または腫瘍を有する対象の生存率を増加させる方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
別の実施形態では、癌を患うか、または腫瘍を有する対象において抗原特異的T細胞を増加させる方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。別の実施形態では、癌を患うか、または腫瘍を有する対象においてT細胞を増加させる方法であって、本明細書に記載されるような抗体またはその機能性断片、および短縮型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列をコードする第1オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含む組換え型リステリア免疫療法株を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む前記方法が提供される。
別の実施形態では本発明の方法は、本明細書において提供されるような組換え型リステリア株または抗体もしくはその機能性断片を用いて対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態では追加免疫接種で使用されるその組換え型リステリア株は、最初の「準備刺激」接種で使用される株と同一である。別の実施形態ではその追加免疫株は準備刺激株と異なる。別の実施形態ではその追加免疫接種で使用される抗体は、最初の「準備刺激」接種で使用される抗体と同じ抗原に結合する。別の実施形態ではその追加免疫抗体は準備刺激抗体と異なる。別の実施形態では準備刺激接種と追加免疫接種において同一の用量が使用される。別の実施形態ではより大きい用量が追加免疫に使用される。別の実施形態ではより小さい用量が追加免疫に使用される。別の実施形態では本発明の方法は対象に追加免疫ワクチン接種を実施するステップをさらに含む。1つの実施形態ではその追加免疫ワクチン接種は一回の準備刺激ワクチン接種に続いて行われる。別の実施形態では準備刺激ワクチン接種の後に一回の追加免疫ワクチン接種が実施される。別の実施形態では準備刺激ワクチン接種の後に2回の追加免疫ワクチン接種が実施される。別の実施形態では準備刺激ワクチン接種の後に3回の追加免疫ワクチン接種が実施される。1つの実施形態では準備刺激株と追加免疫株との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では準備刺激株と追加免疫株との間の期間は1週間であり、別の実施形態ではそれは2週間であり、別の実施形態ではそれは3週間であり、別の実施形態ではそれは4週間であり、別の実施形態ではそれは5週間であり、別の実施形態ではそれは6〜8週間であり、さらに別の実施形態では追加免疫株は準備刺激株の8〜10週間後に投与される。
別の実施形態では本発明の方法は、本明細書において提供される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物で対象を追加免疫することをさらに含む。別の実施形態では本発明の方法は、本明細書において提供される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物の追加免疫用量を投与するステップを含む。別の実施形態ではその追加免疫用量は前記免疫原性組成物の代替的形態である。別の実施形態では本発明の方法は対象に追加免疫用免疫原性組成物を投与するステップをさらに含む。1つの実施形態ではその追加免疫用量は前記免疫原性組成物の単回準備刺激用量の後に続く。別の実施形態では準備刺激用量の後に単回追加免疫用量が投与される。別の実施形態では準備刺激用量の後に2回の追加免疫用量が投与される。別の実施形態では準備刺激用量の後に3回の追加免疫用量が投与される。1つの実施形態では、本明細書において提供される弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物の準備刺激用量と追加免疫用量との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態ではこの用量は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では準備刺激用量と追加免疫用量との間の期間は1週間であり、別の実施形態ではそれは2週間であり、別の実施形態ではそれは3週間であり、別の実施形態ではそれは4週間であり、別の実施形態ではそれは5週間であり、別の実施形態ではそれは6〜8週間であり、さらに別の実施形態ではその追加免疫用量は免疫原性組成物の準備刺激用量の8〜10週間後に投与される。
多数の病原体に対する免疫応答とそれらに対する保護の強化にとって非相同的「準備刺激追加免疫」戦略が有効であった。Schneider et al.,Immunol. Rev. 170:29−38(1999)、Robinson, H.L., Nat. Rev. Immunol. 2:239−50(2002)、Gonzalo, R.M. et al., Strain 20:1226−31(2002)、Tanghe, A., Infect. Immun. 69:3041−7(2001)。準備刺激注射と追加免疫注射において異なる形態の抗原を提供することがその抗原に対する免疫応答を最大化するようである。DNA株での準備刺激とそれに続くアジュバント中のタンパク質を用いた追加免疫、または抗原をコードするDNAのウイルスベクター送達による追加免疫が、抗原特異的抗体およびCD4+ T細胞応答またはCD8+ T細胞応答をそれぞれ改善する最も効果的な方法のようである。Shiver J.W. et al., Nature 415:331−5(2002)、Gilbert, S.C. et al., Strain 20:1039−45(2002)、Billaut−Mulot, O. et al., Strain 19:95−102(2000)、Sin, J.I. et al., DNA Cell Biol. 18:771−9(1999)。サルのワクチン接種研究の最近のデータより、サルがHIV gag DNAで準備刺激ワクチン接種され、続いてHIV gagを発現するアデノウイルスベクター(Ad5−gag)で追加免疫ワクチン接種されるときにHIV gag抗原をコードするDNAにCRL1005ポロキサマー(12kDa、5%POE)を添加することでT細胞応答が増強されることが示唆されている。DNA/ポロキサマーでの準備刺激とそれに続くAd5−gag追加免疫についての細胞免疫応答は、(ポロキサマーを含まない)DNA準備刺激とそれに続くAd5−gag追加免疫についての細胞免疫応答、またはAd5−gagのみについての細胞免疫応答よりも大きかった。Shiver, J.W. et al. Nature 415:331−5(2002)。米国特許出願公開第2002/0165172(A1)号明細書は、免疫応答が生成されるように抗原の免疫原性部分をコードするベクターコンストラクトと抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質を同時投与することについて記載している。その文書はB型肝炎抗原およびHIV抗原に限られている。さらに、米国特許第6500432号明細書は、目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は同一の免疫応答時の、好ましくは互いに0〜10日以内、または3〜7日間以内のそのポリヌクレオチドとそのポリペプチドの投与を意味する。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎(全ての形態)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫(例えば、プラスモジウム属のもの)、および病原性細菌(結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられるがこれに限定されない)が挙げられる。上記の参照文献の全ては全体が参照により本明細書に援用される。
1つの実施形態では本発明の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態ではそのプロトコルは予防的である。別の実施形態では本発明の組成物は、家族性遺伝学、または当業者によって理解されるようなこれらの種類の病気にかかりやすくする他の環境のために乳癌または他の種類の腫瘍などの癌のリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では本免疫療法は、外科手術、従来の化学療法、または放射線治療による腫瘍増殖の縮小術の後の癌免疫療法として使用される。そのような処置に続いて本発明の免疫療法が投与され、これによってその免疫療法の腫瘍抗原に対するCTL応答により残っている転移癌が破壊され、癌からの寛解が長期化される。別の実施形態では本発明の免疫療法は、以前に定着した腫瘍の成長に作用し、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。
幾つかの実施形態では「含む」という用語またはその文法的な形態は、表示された活性薬剤、例えば、本発明のLm菌株を含むと共に他の活性薬剤、例えば、抗体またはその機能性断片、および製薬業界で知られているような医薬的に許容される担体、賦形剤、軟化薬、安定剤などを含むことを指す。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、唯一の活性成分が示された活性成分である組成物を意味するが、製剤の安定、保存などのためであって、指示された活性成分の治療効果には直接的に関与しないその他の化合物も含まれることがある。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、指示された活性成分の機序とは別個の機序によって治療効果を発揮する構成要素を意味することがある。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、治療効果を発揮し、且つ、表示された活性成分のクラスとは別個の化合物クラスに属する構成要素に関連し得る。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、例えば、異なる作用機序により作用することにより治療効果を発揮し、表示された活性成分の治療効果とは異なり得る構成要素に関連し得る。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は活性成分の放出を促進する構成要素に関連し得る。幾つかの実施形態では「から成る」という用語は、活性成分および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物に関連する。
本明細書において使用される時、「a」、「an」、および「the」で表される単数形は、文脈から明確に別段の指示が無い限り、複数の参照物を含む。例えば、「1つの化合物」または「少なくとも1つの化合物」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
本出願全体を通して本発明の様々な実施形態が範囲形式で提示される場合がある。範囲形式の記載は単に利便性および簡潔性のためにすぎず、本発明の範囲の一定不動の限定として解釈されるべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記載はその範囲内の全ての可能な部分的範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、1〜6までなどのような範囲の記載は、1〜3まで、1〜4まで、1〜5まで、2〜4まで、2〜6まで、3〜6まで、等々などの部分的範囲、ならびにこの範囲内の個々の数、例えば、1、2、3、4、5、および6を具体的に開示したと考えられるべきである。これは範囲の程度と無関係に適用される。
本明細書において数値的範囲が示されるときはいつも、表示された範囲内のあらゆる引用される数値(分数または整数)を含むことを意味する。第1表示数と第2表示数と「の間にわたる/の間の範囲」という句、および第1表示数「から」第2表示数「までにわたる/までの範囲」という句は本明細書において互換的に使用され、第1表示数および第2表示数ならびにそれらの間の全ての分数および整数を含むことを意味する。
本明細書において使用される場合、「方法」という用語は、限定されないが、化学技術分野、薬理学技術分野、生物学技術分野、生化学技術分野、および医学技術分野などの専門家によって知られているか、またはそれらの専門家によって既知の方式、手段、技術、および手法から容易に開発される方式、手段、技術、および手法をはじめとする、所与の課題を実線するための方式、手段、技術、および手法を指す。
1つの実施形態では「約」という用語は表示された数、または数値範囲からの0.0001〜5%の間の逸脱を指す。1つの実施形態では「約」という用語は表示された数、または数値範囲からの1〜10%の間の逸脱を指す。1つの実施形態では「約」という用語は表示された数、または数値範囲からの最大で25%の逸脱を指す。
本明細書において開示される対象には次の実施形態が含まれるがこれらに限定されない。
実施形態1 疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系であって、
(a) 弱毒化リステリア株送達ベクター、および
(b) 前記リステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを備える前記プラスミドベクター、
を含み、前記プラスミドで前記リステリア株を形質転換することにより前記被検者の疾患または症状を対象とする個別免疫療法系が作成作製される、前記系。
実施形態2 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌を含む、実施形態1に記載の系。
実施形態3 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態2に記載の系。
実施形態4 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態2に記載の系。
実施形態5 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープ、または立体構造ネオエピトープ、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の系。
実施形態6 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露ネオエピトープを含む、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の系。
実施形態7 T細胞を前記1つ以上のペプチドと接触させてCD25、CD44、またはCD69、またはそれらのあらゆる組合せのうちの少なくとも1つの分泌増加、またはIFN−γ、TNF−α、IL−1、およびIL−2を含む群より選択されるサイトカインの分泌増加を分析し、前記増加により前記ペプチドが1つ以上のT細胞ネオエピトープを含むと特定される免疫原性アッセイを用いて前記ネオエピトープの免疫原性が決定された、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の系。
実施形態8 前記プラスミドで形質転換された前記弱毒化リステリアが前記1つ以上の免疫原性のペプチドを分泌する、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の系。
実施形態9 前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合した1つ以上のネオエピトープを含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の系。
実施形態10 前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がミニ遺伝子核酸コンストラクトを含み、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを備え、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、
(c) 1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の系。
実施形態11 前記プラスミドベクターが組込み型プラスミドである、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の系。
実施形態12 前記プラスミドベクターが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の系。
実施形態13 形質転換の後に抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、実施形態12に記載の系。
実施形態14 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態9に記載の系。
実施形態15 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態14に記載の系。
実施形態16 前記ActAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態14に記載の系。
実施形態17 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態14に記載の系。
実施形態18 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態14に記載の系。
実施形態19 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態18に記載の系。
実施形態20 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態18に記載の系。
実施形態21 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態18に記載の系。
実施形態22 前記免疫原性の1つ以上のネオエピトープが前記疾患または症状と関連する、実施形態1〜21のいずれか1つに記載の系。
実施形態23 1つ以上のネオエピトープを含む前記免疫原性のペプチドが異種抗原または自己抗原、またはそれらの断片から構成される、実施形態1〜22のいずれか1つに記載の系。
実施形態24 前記異種抗原または自己抗原が腫瘍関連抗原である、実施形態23に記載の系。
実施形態25 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態1〜24のいずれか1つに記載の系。
実施形態26 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態25に記載の系。
実施形態27 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態2または25のいずれかに記載の系。
実施形態28 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態1〜24のいずれか1つに記載の系。
実施形態29 前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態28に記載の系。
実施形態30 前記感染症が感染性細菌病である、実施形態28に記載の系。
実施形態31 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態28に記載の系。
実施形態32 前記弱毒化リステリアが1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、実施形態1〜31のいずれか1つに記載の系。
実施形態33 前記内在性遺伝子突然変異がactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、またはdal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、実施形態32に記載の系。
実施形態34 D133V突然変異を含むPrfAをコードする核酸配列を備えるプラスミドで前記リステリアを形質転換することにより前記prfA突然変異が相補される、実施形態33に記載の系。
実施形態35 前記突然変異が前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、実施形態32〜34のいずれか1つに記載の系。
実施形態36 前記プラスミドが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第2核酸配列をさらに備える、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の系。
実施形態37 前記オープン・リーディング・フレームによってコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態36に記載の系。
実施形態38 前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、実施形態1〜37のいずれか1つに記載の系。
実施形態39 前記組換え型リステリアが培養または凍結保存されるか、またはそれらのあらゆる組合せで処理され、且つ、前記対象に対してある形態の治療法として単独で、または前記疾患にとって有益な可能性がある他の治療法と併用して投与される、実施形態1〜38のいずれか1つに記載の系。
実施形態40 前記対象に対する前記弱毒化組換え型リステリアとアジュバントを含む免疫原性組成物の一部として前記プラスミドで形質転換された前記弱毒化リステリアが投与される、実施形態1〜39のいずれか1つに記載の系。
実施形態41 前記免疫原性組成物の投与が、1つ以上のネオエピトープを含む異なるペプチドを発現する弱毒化リステリアとアジュバントを含む1つ以上の免疫原性組成物を同時または順次投与するステップをさらに含む、実施形態40に記載の系。
実施形態42 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態40〜41のいずれか1つに記載の系。
実施形態43 疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを前記比較により特定するステップ、
(b) 免疫原性応答向けの前記1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをスクリーニングするステップ、
(c) 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を前記対象に投与し、免疫原性組成物の一部として前記弱毒化組換え型リステリア株を投与するステップを含む前記方法。
実施形態44 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌である、実施形態43に記載の方法。
実施形態45 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態44に記載の方法。
実施形態46 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態44に記載の方法。
実施形態47 前記疾患担持生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態43〜46のいずれか1つに記載の方法。
実施形態48 前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象、または同じ種の異なる個体より獲得される、実施形態43〜47のいずれか1つに記載の方法。
実施形態49 前記疾患担持生体試料または健常生体試料が組織、血液から単離された細胞、痰から単離された細胞、唾液から単離された細胞、または脳脊髄液から単離された細胞を含む、実施形態43〜48のいずれか1つに記載の方法。
実施形態50 前記核酸配列がエクソームシーケンシングを用いて決定される、実施形態43〜49のいずれか1つに記載の方法。
実施形態51 前記核酸配列がトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、実施形態43〜50のいずれか1つに記載の方法。
実施形態52 前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
(i) 前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記ORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態43〜51のいずれか1つに記載の方法。
実施形態53 免疫原性応答についての前記スクリーニングが次のステップ、すなわち、
(a) 1つ以上のネオエピトープを含む前記ペプチドとT細胞または複数のT細胞を接触させるステップ、
(b) 前記細胞において免疫原性T細胞応答について分析し、免疫原性T細胞応答の存在により前記ペプチドを免疫原性ペプチドとして特定するステップを含む、実施形態43〜51のいずれか1つに記載の方法。
実施形態54 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープまたは立体構造ネオエピトープを含む、実施形態43〜53のいずれか1つに記載の方法。
実施形態55 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、実施形態43〜54のいずれか1つに記載の方法。
実施形態56 前記弱毒化組換え型リステリアがT細胞エピトープを含む1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上の免疫原性のペプチドを分泌する、実施形態43〜55のいずれか1つに記載の方法。
実施形態57 それぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合した1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上の免疫原性のペプチドをコードする核酸配列を備えるプラスミドベクターを使用して前記形質転換が行われる、実施形態43〜56のいずれか1つに記載の方法。
実施形態58 ミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、キメラタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む前記コンストラクトを備えるプラスミドベクターを用いて前記形質転換が行われ、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、
(c) 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上の免疫原性のペプチドを含み、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態43〜56のいずれか1つに記載の系。
実施形態59 前記1つ以上の免疫原性のペプチドの発現を確認するために前記弱毒化組換え型リステリア株を培養し、その特徴を分析することをさらに含む実施形態43〜58のいずれか1つに記載の方法。
実施形態60 前記プラスミドが組込み型プラスミドである、実施形態43〜59のいずれか1つに記載の方法。
実施形態61 前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態43〜59のいずれか1つに記載の方法。
実施形態62 抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、実施形態61に記載の方法。
実施形態63 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態57に記載の方法。
実施形態64 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態63に記載の方法。
実施形態65 前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態63に記載の方法。
実施形態66 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態63に記載の方法。
実施形態67 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態63に記載の方法。
実施形態68 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態67に記載の方法。
実施形態69 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態67に記載の方法。
実施形態70 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態67に記載の方法。
実施形態71 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原から構成される、実施形態43〜70のいずれか1つに記載の方法。
実施形態72 前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、実施形態71に記載の方法。
実施形態73 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態43〜72のいずれか1つに記載の方法。
実施形態74 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態73に記載の方法。
実施形態75 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態44および73のいずれか1つに記載の方法。
実施形態76 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態43〜75のいずれか1つに記載の方法。
実施形態77 前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態76に記載の方法。
実施形態78 前記感染症が感染性細菌病である、実施形態76に記載の方法。
実施形態79 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態76に記載の方法。
実施形態80 前記弱毒化リステリアが1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、実施形態43〜79のいずれか1つに記載の方法。
実施形態81 前記内在性遺伝子突然変異がactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、またはdal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、実施形態80に記載の方法。
実施形態82 D133V突然変異を含むPrfAをコードする核酸配列を備えるプラスミドで前記リステリアを形質転換することにより前記prfA突然変異が相補される、実施形態81に記載の方法。
実施形態83 前記突然変異が前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、実施形態80〜82のいずれか1つに記載の方法。
実施形態84 前記プラスミドが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第2核酸配列をさらに備える、実施形態43〜83のいずれか1つに記載の方法。
実施形態85 前記オープン・リーディング・フレームによってコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態84に記載の方法。
実施形態86 前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、実施形態43〜85のいずれか1つに記載の方法。
実施形態87 1つ以上の異なるネオエピトープを含む異なるペプチドを発現する組換え型リステリアとアジュバントを含む1つ以上の免疫原性組成物を前記対象に投与することをさらに含む実施形態43〜86のいずれか1つに記載の方法。
実施形態88 同時投与または順次投与が投与に含まれる、実施形態87に記載の方法。
実施形態89 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態87〜88のいずれか1つに記載の方法。
実施形態90 免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む実施形態43〜89のいずれか1つに記載の方法。
実施形態91 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、実施形態90に記載の方法。
実施形態92 前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、実施形態43〜91のいずれか1つに記載の方法。
実施形態93 前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、実施形態92に記載の方法。
実施形態94 前記免疫応答が抗感染症応答を含む、実施形態92に記載の方法。
実施形態95 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態94に記載の方法。
実施形態96 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態94に記載の方法。
実施形態97 前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、実施形態43〜96のいずれか1つに記載の方法。
実施形態98 前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が前記投与により増加する、実施形態43〜97のいずれか1つに記載の方法。
実施形態99 実施形態43〜86のいずれか1つに記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
実施形態100 疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
(a) 送達ベクターまたは他のベクター、および所望により
(b) 前記送達ベクターを形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含む前記系。
実施形態101 前記送達ベクターが細菌送達ベクターを含む、実施形態100に記載の系。
実施形態102 前記送達ベクターがウイルスベクター送達ベクターを含む、実施形態100に記載の系。
実施形態103 前記送達ベクターがペプチド免疫療法送達ベクターを含む、実施形態100に記載の系。
実施形態104 前記ペプチド免疫療法送達ベクターが1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む、実施形態103に記載の系。
実施形態105 前記送達ベクターがDNAプラスミド免疫療法ベクターを含む、実施形態100に記載の系。
実施形態106 前記DNAプラスミド免疫療法ベクター送達ベクターが1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む、実施形態105に記載の系。
実施形態107 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌を含む、実施形態100に記載の系。
実施形態108 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態107に記載の系。
実施形態109 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態107に記載の系。
実施形態110 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープ、または立体構造ネオエピトープ、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態100〜109のいずれか1つに記載の系。
実施形態111 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露ネオエピトープを含む、実施形態100〜110のいずれか1つに記載の系。
実施形態112 T細胞を前記1つ以上のペプチドと接触させてCD25、CD44、またはCD69、またはそれらのあらゆる組合せのうちの少なくとも1つの分泌増加、またはIFN−γ、TNF−α、IL−1、およびIL−2を含む群より選択されるサイトカインの分泌増加を分析し、前記増加により前記ペプチドが1つ以上のT細胞ネオエピトープを含むと特定される免疫原性アッセイを用いて前記ネオエピトープの免疫原性が決定された、実施形態100〜111のいずれか1つに記載の系。
実施形態113 前記プラスミドで形質転換された前記送達ベクターが前記1つ以上の免疫原性のペプチドを分泌する、実施形態100〜112のいずれか1つに記載の系。
実施形態114 前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合した1つ以上のネオエピトープを含む、実施形態100〜113のいずれか1つに記載の系。
実施形態115 前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がミニ遺伝子核酸コンストラクトを含み、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを備え、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、
(c) 1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態100〜113のいずれか1つに記載の系。
実施形態116 前記プラスミドベクターが組込み型プラスミドである、実施形態100〜115のいずれか1つに記載の系。
実施形態117 前記プラスミドベクターが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態100〜115のいずれか1つに記載の系。
実施形態118 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態114に記載の系。
実施形態119 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態118に記載の系。
実施形態120 前記ActAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態118に記載の系。
実施形態121 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態118に記載の系。
実施形態122 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態118に記載の系。
実施形態123 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態118に記載の系。
実施形態124 前記突然変異が配列番号68で表さる前記CBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態118に記載の系。
実施形態125 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態118に記載の系。
実施形態126 前記免疫原性の1つ以上のネオエピトープが前記疾患または症状と関連する、実施形態100〜125のいずれか1つに記載の系。
実施形態127 1つ以上のネオエピトープを含む前記免疫原性のペプチドが異種抗原または自己抗原、またはそれらの断片から構成される、実施形態100〜125のいずれか1つに記載の系。
実施形態128 前記異種抗原または自己抗原が腫瘍関連抗原である、実施形態127に記載の系。
実施形態129 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態100〜128のいずれか1つに記載の系。
実施形態130 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態128に記載の系。
実施形態131 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態107または128のいずれかに記載の系。
実施形態132 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態100〜131のいずれか1つに記載の系。
実施形態133 前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態132に記載の系。
実施形態134 前記感染症が感染性細菌病である、実施形態132に記載の系。
実施形態135 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態132に記載の系。
実施形態136 前記送達ベクターが培養または凍結保存されるか、またはそれらのあらゆる組合せで処理され、且つ、前記対象に対してある形態の治療法として単独で、または前記疾患にとって有益な可能性がある他の治療法と併用して投与される、実施形態100〜135のいずれか1つに記載の系。
実施形態137 前記対象に対する前記組換え送達ベクターとアジュバントを含む免疫原性組成物の一部として前記プラスミドで形質転換されてもよい前記送達ベクターの投与が行われる、実施形態100〜136のいずれか1つに記載の系。
実施形態138 前記免疫原性組成物の投与が1つ以上のネオエピトープを含む異なるペプチドを発現する送達ベクターとアジュバントを含む1つ以上の免疫原性組成物の投与をさらに含む、実施形態137に記載の系。
実施形態139 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態137〜138のいずれか1つに記載の系。
実施形態140 疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である前記1つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法。
実施形態141 前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFを前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
(i) 前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列内のORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態140に記載の方法。
実施形態142 前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記第2組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む生体試料の獲得を含む、実施形態140〜141のいずれか1つに記載の方法。
実施形態143 前記生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、実施形態140〜142のいずれか1つに記載の方法。
実施形態144 前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、実施形態140〜143のいずれか1つに記載の方法。
実施形態145 前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、実施形態144に記載の方法。
実施形態146 前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、実施形態145に記載の方法。
実施形態147 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌である、実施形態140〜146のいずれか1つに記載の方法。
実施形態148 前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、実施形態147に記載の方法。
実施形態149 前記疾患担持生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態140〜148のいずれか1つに記載の方法。
実施形態150 前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態140〜149のいずれか1つに記載の方法。
実施形態151 前記核酸配列の前記シーケンシングがエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、実施形態140〜150のいずれか1つに記載の方法。
実施形態152 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、実施形態140〜151のいずれか1つに記載の方法。
実施形態153 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、実施形態140〜152のいずれか1つに記載の方法。
実施形態154 前記弱毒化組換え型リステリアが1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを分泌する、実施形態140〜153のいずれか1つに記載の方法。
実施形態155 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープがT細胞エピトープを含む、請求項140〜154のいずれか一項に記載の方法。
実施形態156 プラスミドベクターまたはファージベクターを使用して前記形質転換が行われる、実施形態140〜155のいずれか1つに記載の方法。
実施形態157 1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、実施形態140〜156のいずれか1つに記載の方法。
実施形態158 ミニ遺伝子核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターを使用して前記形質転換が行われ、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含み、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、
(c) 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態140〜157のいずれか1つに記載の系。
実施形態159 前記1つ以上のペプチドの発現と分泌を確認するために前記弱毒化組換え型リステリア株を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む実施形態140〜158のいずれか1つに記載の方法。
実施形態160 前記プラスミドが組込み型プラスミドである、実施形態156〜158のいずれか1つに記載の方法。
実施形態161 前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態156〜158のいずれか1つに記載の方法。
実施形態162 抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、実施形態156〜158に記載の方法。
実施形態163 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態157に記載の方法。
実施形態164 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態163に記載の方法。
実施形態165 前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態163に記載の方法。
実施形態166 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態163に記載の方法。
実施形態167 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態163に記載の方法。
実施形態168 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態167に記載の方法。
実施形態169 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態167に記載の方法。
実施形態170 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態167に記載の方法。
実施形態171 前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原から構成される、実施形態140〜170のいずれか1つに記載の方法。
実施形態172 前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、実施形態171に記載の方法。
実施形態173 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態140〜172のいずれか1つに記載の方法。
実施形態174 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態171〜173のいずれか1つに記載の方法。
実施形態175 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態147および173のいずれか1つに記載の方法。
実施形態176 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態140〜175のいずれか1つに記載の方法。
実施形態177 前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態176に記載の方法。
実施形態178 前記感染症が感染性細菌病である、実施形態176に記載の方法。
実施形態179 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態176に記載の方法。
実施形態180 前記弱毒化リステリアが1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、実施形態140〜179のいずれか1つに記載の方法。
実施形態181 前記内在性遺伝子突然変異がactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、またはdal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、実施形態180に記載の方法。
実施形態182 前記突然変異が前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、実施形態180〜181のいずれか1つに記載の方法。
実施形態183 前記ベクターが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレーム、または代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第2核酸配列をさらに備える、実施形態140〜182のいずれか1つに記載の方法。
実施形態184 前記オープン・リーディング・フレームによってコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態183に記載の方法。
実施形態185 前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、実施形態140〜184のいずれか1つに記載の方法。
実施形態186 前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む実施形態140〜185のいずれか1つに記載の方法。
実施形態187 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態176に記載の方法。
実施形態188 免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む実施形態140〜187のいずれか1つに記載の方法。
実施形態189 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、実施形態188に記載の方法。
実施形態190 前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、実施形態140〜189のいずれか1つに記載の方法。
実施形態191 前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、実施形態190に記載の方法。
実施形態192 前記免疫応答が抗感染症応答を含む、実施形態190に記載の方法。
実施形態193 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態192に記載の方法。
実施形態194 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態192に記載の方法。
実施形態195 前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、実施形態140〜194のいずれか1つに記載の方法。
実施形態196 前記個別免疫療法により前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が増加する、実施形態140〜191のいずれか1つに記載の方法。
実施形態197 実施形態140〜185のいずれか1つに記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
実施形態198 疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、または(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) (c)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法。
実施形態199 前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFを前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
(ii) 前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列内のORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態198に記載の方法。
実施形態200 前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む前記第2組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む第2生体試料の獲得を含む、実施形態198〜199のいずれか1つに記載の方法。
実施形態201 前記生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、実施形態198〜200のいずれか1つに記載の方法。
実施形態202 前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、実施形態198〜201のいずれか1つに記載の方法。
実施形態203 前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、実施形態202に記載の方法。
実施形態204 前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、実施形態203に記載の方法。
実施形態205 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌である、実施形態198〜204のいずれか1つに記載の方法。
実施形態206 前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、実施形態205に記載の方法。
実施形態207 前記疾患担持生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態198〜206のいずれか1つに記載の方法。
実施形態208 前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態198〜207のいずれか1つに記載の方法。
実施形態209 前記核酸配列の前記シーケンシングがエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、実施形態198〜208のいずれか1つに記載の方法。
実施形態210 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、実施形態198〜209のいずれか1つに記載の方法。
実施形態211 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、実施形態198〜210のいずれか1つに記載の方法。
実施形態212 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープがT細胞エピトープを含む、実施形態198〜211のいずれか1つに記載の方法。
実施形態213 前記ベクターがワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子である、実施形態198〜212のいずれか1つに記載の方法。
実施形態214 前記1つ以上のペプチドの発現を確認するために前記ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む実施形態198〜213のいずれか1つに記載の方法。
実施形態215 前記DNA免疫療法が1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のORFを含む核酸配列を含む、実施形態198〜212のいずれか1つに記載の方法。
実施形態216 前記核酸配列がプラスミドの形態である、実施形態215に記載の方法。
実施形態217 前記プラスミドが組込み型プラスミドまたは染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態216のいずれか1つに記載の方法。
実施形態218 1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、実施形態59〜78のいずれか1つに記載の方法。
実施形態219 前記ペプチド免疫療法が1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含み、各ペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片と融合しているか、または混合されている、実施形態198〜212のいずれか1つに記載の方法。
実施形態220 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態218〜219のいずれか1つに記載の方法。
実施形態221 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態220に記載の方法。
実施形態222 前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態220に記載の方法。
実施形態223 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態220に記載の方法。
実施形態224 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態220に記載の方法。
実施形態225 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態224に記載の方法。
実施形態226 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態224に記載の方法。
実施形態227 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態224に記載の方法。
実施形態228 前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原から構成される、実施形態198〜227のいずれか1つに記載の方法。
実施形態229 前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、実施形態228に記載の方法。
実施形態230 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態198〜229のいずれか1つに記載の方法。
実施形態231 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態229〜230のいずれか1つに記載の方法。
実施形態232 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態205および230のいずれか1つに記載の方法。
実施形態233 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態198〜232のいずれか1つに記載の方法。
実施形態234 前記感染症が感染性ウイルス病または感染性細菌病である、実施形態233に記載の方法。
実施形態235 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態234に記載の方法。
実施形態236 前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む実施形態198〜235のいずれか1つに記載の方法。
実施形態237 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態236に記載の方法。
実施形態238 免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む実施形態198〜237のいずれか1つに記載の方法。
実施形態239 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、実施形態238に記載の方法。
実施形態240 前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、実施形態198〜239のいずれか1つに記載の方法。
実施形態241 前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、実施形態240に記載の方法。
実施形態242 前記免疫応答が抗感染症応答を含む、実施形態240に記載の方法。
実施形態243 前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、実施形態242に記載の方法。
実施形態244 前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、実施形態198〜243のいずれか1つに記載の方法。
実施形態245 前記個別免疫療法により前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が増加する、実施形態198〜244のいずれか1つに記載の方法。
実施形態246 実施形態198〜214、218、および220〜235のいずれか1つに記載の方法により作製されるウイルス様粒子。
実施形態247 実施形態198〜214、218、および220〜235のいずれか1つに記載の方法により作製されるワクシニアウイルス株。
実施形態248 実施形態198〜212、215〜218、および220〜235のいずれか1つに記載の方法により作製されるDNA免疫療法。
実施形態249 実施形態198〜212、219、および220〜235のいずれか1つに記載の方法により作製されるペプチド免疫療法。
実施形態250 実施形態197に記載のリステリアを含む医薬組成物。
実施形態251 実施形態246に記載のウイルス様粒子を含む医薬組成物。
実施形態252 実施形態247に記載のワクシニアウイルス株を含む医薬組成物。
実施形態253 実施形態248に記載のDNA免疫療法を含む医薬組成物。
実施形態254 実施形態249に記載のペプチド免疫療法を含む医薬組成物。
実施形態255 対象向けの個別免疫療法を作成するための系であって、少なくとも1つの処理装置および前記処理装置により実行されるプログラム命令を含む少なくとも1つの記憶媒体を含み、前記プログラム命令によって前記処理装置が次のこと、すなわち、
(a) 全てのネオエピトープおよび前記対象のヒト白血球抗原(HLA)タイプを含む出力データを受信すること、
(b) 各ネオエピトープの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるエピトープを除外すること、
(c) 対象HLAに結合する残りのネオエピトープの能力、およびそれらのネオエピトープの予想MHC結合スコアに基づいてそれらのネオエピトープを数値により評価すること、
(d) 各ネオエピトープのアミノ酸配列をプラスミドに挿入すること、
(e) 各コンストラクトの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるあらゆるコンストラクトを除外すること、
(f) 最も高いスコアになったコンストラクトから開始して、各コンストラクトのアミノ酸配列を対応するDNA配列に逆翻訳すること、
(g) 所定の上限に達するまでランク順に前記プラスミドコンストラクトに追加のネオエピトープを挿入すること、
(h) 前記対象における免疫治療応答を測定するために前記コンストラクトの末端にDNA配列タグを付加すること、および
(i) リステリア・モノサイトゲネスにおける発現および分泌のために前記ネオエピトープをコードする前記DNA配列および前記DNA配列タグを最適化すること、を含むステップを実行することになる前記系。
実施形態256 好ましい出力データがFASTA形式のものである、実施形態255に記載の系。
実施形態257 カイト・ドゥーリトル・ハイドロパシープロットを用いて疎水性が測定される、実施形態255〜256のいずれかに記載の系。
実施形態258 カイト・ドゥーリトル・プロット上で1.6より上のスコアになる全てのネオエピトープが除外または選択除外される、実施形態255〜257のいずれかに記載の系。
実施形態259 免疫エピトープデータベース(IED)を用いて対象HLAに結合する各ネオエピトープの能力が評価される、実施形態255〜258のいずれかに記載の系。
実施形態260 各ネオエピトープのサイズが21アミノ酸(21mer)である、実施形態255〜259のいずれかに記載の系。
実施形態261 前記DNAタグがリンカーを介して前記ネオエピトープに連結される、実施形態255〜260のいずれかに記載の系。
実施形態262 前記リンカーが4×グリシンリンカーである、実施形態255〜261のいずれかに記載の系。
実施形態263 ステップ(h)の前記DNA配列タグがSIINFEKL−6×Hisである、実施形態255〜262のいずれかに記載の系。
実施形態264 免疫抑制特性を有することが知られているネオエピトープがステップ(a)の前に考慮から除外される、実施形態255〜263のいずれかに記載の系。
実施形態1 疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系であって、
(a) 弱毒化リステリア株送達ベクター、および
(b) 前記リステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを備える前記プラスミドベクター、
を含み、前記プラスミドで前記リステリア株を形質転換することにより前記被検者の疾患または症状を対象とする個別免疫療法系が作成作製される、前記系。
実施形態2 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌を含む、実施形態1に記載の系。
実施形態3 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態2に記載の系。
実施形態4 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態2に記載の系。
実施形態5 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープ、または立体構造ネオエピトープ、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の系。
実施形態6 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露ネオエピトープを含む、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の系。
実施形態7 T細胞を前記1つ以上のペプチドと接触させてCD25、CD44、またはCD69、またはそれらのあらゆる組合せのうちの少なくとも1つの分泌増加、またはIFN−γ、TNF−α、IL−1、およびIL−2を含む群より選択されるサイトカインの分泌増加を分析し、前記増加により前記ペプチドが1つ以上のT細胞ネオエピトープを含むと特定される免疫原性アッセイを用いて前記ネオエピトープの免疫原性が決定された、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の系。
実施形態8 前記プラスミドで形質転換された前記弱毒化リステリアが前記1つ以上の免疫原性のペプチドを分泌する、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の系。
実施形態9 前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合した1つ以上のネオエピトープを含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の系。
実施形態10 前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がミニ遺伝子核酸コンストラクトを含み、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを備え、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、
(c) 1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の系。
実施形態11 前記プラスミドベクターが組込み型プラスミドである、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の系。
実施形態12 前記プラスミドベクターが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の系。
実施形態13 形質転換の後に抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、実施形態12に記載の系。
実施形態14 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態9に記載の系。
実施形態15 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態14に記載の系。
実施形態16 前記ActAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態14に記載の系。
実施形態17 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態14に記載の系。
実施形態18 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態14に記載の系。
実施形態19 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態18に記載の系。
実施形態20 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態18に記載の系。
実施形態21 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態18に記載の系。
実施形態22 前記免疫原性の1つ以上のネオエピトープが前記疾患または症状と関連する、実施形態1〜21のいずれか1つに記載の系。
実施形態23 1つ以上のネオエピトープを含む前記免疫原性のペプチドが異種抗原または自己抗原、またはそれらの断片から構成される、実施形態1〜22のいずれか1つに記載の系。
実施形態24 前記異種抗原または自己抗原が腫瘍関連抗原である、実施形態23に記載の系。
実施形態25 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態1〜24のいずれか1つに記載の系。
実施形態26 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態25に記載の系。
実施形態27 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態2または25のいずれかに記載の系。
実施形態28 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態1〜24のいずれか1つに記載の系。
実施形態29 前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態28に記載の系。
実施形態30 前記感染症が感染性細菌病である、実施形態28に記載の系。
実施形態31 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態28に記載の系。
実施形態32 前記弱毒化リステリアが1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、実施形態1〜31のいずれか1つに記載の系。
実施形態33 前記内在性遺伝子突然変異がactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、またはdal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、実施形態32に記載の系。
実施形態34 D133V突然変異を含むPrfAをコードする核酸配列を備えるプラスミドで前記リステリアを形質転換することにより前記prfA突然変異が相補される、実施形態33に記載の系。
実施形態35 前記突然変異が前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、実施形態32〜34のいずれか1つに記載の系。
実施形態36 前記プラスミドが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第2核酸配列をさらに備える、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の系。
実施形態37 前記オープン・リーディング・フレームによってコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態36に記載の系。
実施形態38 前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、実施形態1〜37のいずれか1つに記載の系。
実施形態39 前記組換え型リステリアが培養または凍結保存されるか、またはそれらのあらゆる組合せで処理され、且つ、前記対象に対してある形態の治療法として単独で、または前記疾患にとって有益な可能性がある他の治療法と併用して投与される、実施形態1〜38のいずれか1つに記載の系。
実施形態40 前記対象に対する前記弱毒化組換え型リステリアとアジュバントを含む免疫原性組成物の一部として前記プラスミドで形質転換された前記弱毒化リステリアが投与される、実施形態1〜39のいずれか1つに記載の系。
実施形態41 前記免疫原性組成物の投与が、1つ以上のネオエピトープを含む異なるペプチドを発現する弱毒化リステリアとアジュバントを含む1つ以上の免疫原性組成物を同時または順次投与するステップをさらに含む、実施形態40に記載の系。
実施形態42 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態40〜41のいずれか1つに記載の系。
実施形態43 疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを前記比較により特定するステップ、
(b) 免疫原性応答向けの前記1つ以上のネオエピトープを含むペプチドをスクリーニングするステップ、
(c) 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化組換え型リステリア株を前記対象に投与し、免疫原性組成物の一部として前記弱毒化組換え型リステリア株を投与するステップを含む前記方法。
実施形態44 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌である、実施形態43に記載の方法。
実施形態45 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態44に記載の方法。
実施形態46 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態44に記載の方法。
実施形態47 前記疾患担持生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態43〜46のいずれか1つに記載の方法。
実施形態48 前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象、または同じ種の異なる個体より獲得される、実施形態43〜47のいずれか1つに記載の方法。
実施形態49 前記疾患担持生体試料または健常生体試料が組織、血液から単離された細胞、痰から単離された細胞、唾液から単離された細胞、または脳脊髄液から単離された細胞を含む、実施形態43〜48のいずれか1つに記載の方法。
実施形態50 前記核酸配列がエクソームシーケンシングを用いて決定される、実施形態43〜49のいずれか1つに記載の方法。
実施形態51 前記核酸配列がトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、実施形態43〜50のいずれか1つに記載の方法。
実施形態52 前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
(i) 前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記ORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態43〜51のいずれか1つに記載の方法。
実施形態53 免疫原性応答についての前記スクリーニングが次のステップ、すなわち、
(a) 1つ以上のネオエピトープを含む前記ペプチドとT細胞または複数のT細胞を接触させるステップ、
(b) 前記細胞において免疫原性T細胞応答について分析し、免疫原性T細胞応答の存在により前記ペプチドを免疫原性ペプチドとして特定するステップを含む、実施形態43〜51のいずれか1つに記載の方法。
実施形態54 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープまたは立体構造ネオエピトープを含む、実施形態43〜53のいずれか1つに記載の方法。
実施形態55 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、実施形態43〜54のいずれか1つに記載の方法。
実施形態56 前記弱毒化組換え型リステリアがT細胞エピトープを含む1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上の免疫原性のペプチドを分泌する、実施形態43〜55のいずれか1つに記載の方法。
実施形態57 それぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合した1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上の免疫原性のペプチドをコードする核酸配列を備えるプラスミドベクターを使用して前記形質転換が行われる、実施形態43〜56のいずれか1つに記載の方法。
実施形態58 ミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、キメラタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む前記コンストラクトを備えるプラスミドベクターを用いて前記形質転換が行われ、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、
(c) 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上の免疫原性のペプチドを含み、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記ペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態43〜56のいずれか1つに記載の系。
実施形態59 前記1つ以上の免疫原性のペプチドの発現を確認するために前記弱毒化組換え型リステリア株を培養し、その特徴を分析することをさらに含む実施形態43〜58のいずれか1つに記載の方法。
実施形態60 前記プラスミドが組込み型プラスミドである、実施形態43〜59のいずれか1つに記載の方法。
実施形態61 前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態43〜59のいずれか1つに記載の方法。
実施形態62 抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、実施形態61に記載の方法。
実施形態63 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態57に記載の方法。
実施形態64 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態63に記載の方法。
実施形態65 前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態63に記載の方法。
実施形態66 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態63に記載の方法。
実施形態67 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態63に記載の方法。
実施形態68 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態67に記載の方法。
実施形態69 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態67に記載の方法。
実施形態70 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態67に記載の方法。
実施形態71 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原から構成される、実施形態43〜70のいずれか1つに記載の方法。
実施形態72 前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、実施形態71に記載の方法。
実施形態73 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態43〜72のいずれか1つに記載の方法。
実施形態74 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態73に記載の方法。
実施形態75 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態44および73のいずれか1つに記載の方法。
実施形態76 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態43〜75のいずれか1つに記載の方法。
実施形態77 前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態76に記載の方法。
実施形態78 前記感染症が感染性細菌病である、実施形態76に記載の方法。
実施形態79 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態76に記載の方法。
実施形態80 前記弱毒化リステリアが1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、実施形態43〜79のいずれか1つに記載の方法。
実施形態81 前記内在性遺伝子突然変異がactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、またはdal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、実施形態80に記載の方法。
実施形態82 D133V突然変異を含むPrfAをコードする核酸配列を備えるプラスミドで前記リステリアを形質転換することにより前記prfA突然変異が相補される、実施形態81に記載の方法。
実施形態83 前記突然変異が前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、実施形態80〜82のいずれか1つに記載の方法。
実施形態84 前記プラスミドが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第2核酸配列をさらに備える、実施形態43〜83のいずれか1つに記載の方法。
実施形態85 前記オープン・リーディング・フレームによってコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態84に記載の方法。
実施形態86 前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、実施形態43〜85のいずれか1つに記載の方法。
実施形態87 1つ以上の異なるネオエピトープを含む異なるペプチドを発現する組換え型リステリアとアジュバントを含む1つ以上の免疫原性組成物を前記対象に投与することをさらに含む実施形態43〜86のいずれか1つに記載の方法。
実施形態88 同時投与または順次投与が投与に含まれる、実施形態87に記載の方法。
実施形態89 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態87〜88のいずれか1つに記載の方法。
実施形態90 免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む実施形態43〜89のいずれか1つに記載の方法。
実施形態91 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、実施形態90に記載の方法。
実施形態92 前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、実施形態43〜91のいずれか1つに記載の方法。
実施形態93 前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、実施形態92に記載の方法。
実施形態94 前記免疫応答が抗感染症応答を含む、実施形態92に記載の方法。
実施形態95 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態94に記載の方法。
実施形態96 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態94に記載の方法。
実施形態97 前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、実施形態43〜96のいずれか1つに記載の方法。
実施形態98 前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が前記投与により増加する、実施形態43〜97のいずれか1つに記載の方法。
実施形態99 実施形態43〜86のいずれか1つに記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
実施形態100 疾患または症状を有する対象のために作成された個別免疫療法系を提供するための系であって、
(a) 送達ベクターまたは他のベクター、および所望により
(b) 前記送達ベクターを形質転換するためのプラスミドベクターであって、1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む前記プラスミドベクターを含む前記系。
実施形態101 前記送達ベクターが細菌送達ベクターを含む、実施形態100に記載の系。
実施形態102 前記送達ベクターがウイルスベクター送達ベクターを含む、実施形態100に記載の系。
実施形態103 前記送達ベクターがペプチド免疫療法送達ベクターを含む、実施形態100に記載の系。
実施形態104 前記ペプチド免疫療法送達ベクターが1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む、実施形態103に記載の系。
実施形態105 前記送達ベクターがDNAプラスミド免疫療法ベクターを含む、実施形態100に記載の系。
実施形態106 前記DNAプラスミド免疫療法ベクター送達ベクターが1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前記ネオエピトープが前記疾患または症状を有する前記対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを含む、実施形態105に記載の系。
実施形態107 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌を含む、実施形態100に記載の系。
実施形態108 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態107に記載の系。
実施形態109 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態107に記載の系。
実施形態110 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープ、または立体構造ネオエピトープ、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態100〜109のいずれか1つに記載の系。
実施形態111 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露ネオエピトープを含む、実施形態100〜110のいずれか1つに記載の系。
実施形態112 T細胞を前記1つ以上のペプチドと接触させてCD25、CD44、またはCD69、またはそれらのあらゆる組合せのうちの少なくとも1つの分泌増加、またはIFN−γ、TNF−α、IL−1、およびIL−2を含む群より選択されるサイトカインの分泌増加を分析し、前記増加により前記ペプチドが1つ以上のT細胞ネオエピトープを含むと特定される免疫原性アッセイを用いて前記ネオエピトープの免疫原性が決定された、実施形態100〜111のいずれか1つに記載の系。
実施形態113 前記プラスミドで形質転換された前記送達ベクターが前記1つ以上の免疫原性のペプチドを分泌する、実施形態100〜112のいずれか1つに記載の系。
実施形態114 前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合した1つ以上のネオエピトープを含む、実施形態100〜113のいずれか1つに記載の系。
実施形態115 前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列がミニ遺伝子核酸コンストラクトを含み、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを備え、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、
(c) 1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態100〜113のいずれか1つに記載の系。
実施形態116 前記プラスミドベクターが組込み型プラスミドである、実施形態100〜115のいずれか1つに記載の系。
実施形態117 前記プラスミドベクターが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態100〜115のいずれか1つに記載の系。
実施形態118 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態114に記載の系。
実施形態119 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態118に記載の系。
実施形態120 前記ActAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態118に記載の系。
実施形態121 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態118に記載の系。
実施形態122 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態118に記載の系。
実施形態123 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態118に記載の系。
実施形態124 前記突然変異が配列番号68で表さる前記CBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態118に記載の系。
実施形態125 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態118に記載の系。
実施形態126 前記免疫原性の1つ以上のネオエピトープが前記疾患または症状と関連する、実施形態100〜125のいずれか1つに記載の系。
実施形態127 1つ以上のネオエピトープを含む前記免疫原性のペプチドが異種抗原または自己抗原、またはそれらの断片から構成される、実施形態100〜125のいずれか1つに記載の系。
実施形態128 前記異種抗原または自己抗原が腫瘍関連抗原である、実施形態127に記載の系。
実施形態129 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態100〜128のいずれか1つに記載の系。
実施形態130 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態128に記載の系。
実施形態131 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態107または128のいずれかに記載の系。
実施形態132 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態100〜131のいずれか1つに記載の系。
実施形態133 前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態132に記載の系。
実施形態134 前記感染症が感染性細菌病である、実施形態132に記載の系。
実施形態135 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態132に記載の系。
実施形態136 前記送達ベクターが培養または凍結保存されるか、またはそれらのあらゆる組合せで処理され、且つ、前記対象に対してある形態の治療法として単独で、または前記疾患にとって有益な可能性がある他の治療法と併用して投与される、実施形態100〜135のいずれか1つに記載の系。
実施形態137 前記対象に対する前記組換え送達ベクターとアジュバントを含む免疫原性組成物の一部として前記プラスミドで形質転換されてもよい前記送達ベクターの投与が行われる、実施形態100〜136のいずれか1つに記載の系。
実施形態138 前記免疫原性組成物の投与が1つ以上のネオエピトープを含む異なるペプチドを発現する送達ベクターとアジュバントを含む1つ以上の免疫原性組成物の投与をさらに含む、実施形態137に記載の系。
実施形態139 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態137〜138のいずれか1つに記載の系。
実施形態140 疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記弱毒化リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上のネオエピトープであって、免疫原性である前記1つ以上のネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前記第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法。
実施形態141 前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFを前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
(i) 前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列内のORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態140に記載の方法。
実施形態142 前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記第2組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む生体試料の獲得を含む、実施形態140〜141のいずれか1つに記載の方法。
実施形態143 前記生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、実施形態140〜142のいずれか1つに記載の方法。
実施形態144 前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、実施形態140〜143のいずれか1つに記載の方法。
実施形態145 前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、実施形態144に記載の方法。
実施形態146 前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、実施形態145に記載の方法。
実施形態147 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌である、実施形態140〜146のいずれか1つに記載の方法。
実施形態148 前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、実施形態147に記載の方法。
実施形態149 前記疾患担持生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態140〜148のいずれか1つに記載の方法。
実施形態150 前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態140〜149のいずれか1つに記載の方法。
実施形態151 前記核酸配列の前記シーケンシングがエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、実施形態140〜150のいずれか1つに記載の方法。
実施形態152 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、実施形態140〜151のいずれか1つに記載の方法。
実施形態153 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、実施形態140〜152のいずれか1つに記載の方法。
実施形態154 前記弱毒化組換え型リステリアが1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを分泌する、実施形態140〜153のいずれか1つに記載の方法。
実施形態155 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープがT細胞エピトープを含む、請求項140〜154のいずれか一項に記載の方法。
実施形態156 プラスミドベクターまたはファージベクターを使用して前記形質転換が行われる、実施形態140〜155のいずれか1つに記載の方法。
実施形態157 1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、実施形態140〜156のいずれか1つに記載の方法。
実施形態158 ミニ遺伝子核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターを使用して前記形質転換が行われ、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含み、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、
(c) 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、
(a)〜(c)の前記シグナル配列、前記ユビキチン、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、実施形態140〜157のいずれか1つに記載の系。
実施形態159 前記1つ以上のペプチドの発現と分泌を確認するために前記弱毒化組換え型リステリア株を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む実施形態140〜158のいずれか1つに記載の方法。
実施形態160 前記プラスミドが組込み型プラスミドである、実施形態156〜158のいずれか1つに記載の方法。
実施形態161 前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態156〜158のいずれか1つに記載の方法。
実施形態162 抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、実施形態156〜158に記載の方法。
実施形態163 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態157に記載の方法。
実施形態164 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態163に記載の方法。
実施形態165 前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態163に記載の方法。
実施形態166 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態163に記載の方法。
実施形態167 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態163に記載の方法。
実施形態168 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態167に記載の方法。
実施形態169 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態167に記載の方法。
実施形態170 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態167に記載の方法。
実施形態171 前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原から構成される、実施形態140〜170のいずれか1つに記載の方法。
実施形態172 前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、実施形態171に記載の方法。
実施形態173 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態140〜172のいずれか1つに記載の方法。
実施形態174 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態171〜173のいずれか1つに記載の方法。
実施形態175 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態147および173のいずれか1つに記載の方法。
実施形態176 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態140〜175のいずれか1つに記載の方法。
実施形態177 前記感染症が感染性ウイルス病である、実施形態176に記載の方法。
実施形態178 前記感染症が感染性細菌病である、実施形態176に記載の方法。
実施形態179 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態176に記載の方法。
実施形態180 前記弱毒化リステリアが1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、実施形態140〜179のいずれか1つに記載の方法。
実施形態181 前記内在性遺伝子突然変異がactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、またはdal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、実施形態180に記載の方法。
実施形態182 前記突然変異が前記遺伝子または前記複数の遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、実施形態180〜181のいずれか1つに記載の方法。
実施形態183 前記ベクターが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレーム、または代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む第2核酸配列をさらに備える、実施形態140〜182のいずれか1つに記載の方法。
実施形態184 前記オープン・リーディング・フレームによってコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態183に記載の方法。
実施形態185 前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、実施形態140〜184のいずれか1つに記載の方法。
実施形態186 前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む実施形態140〜185のいずれか1つに記載の方法。
実施形態187 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態176に記載の方法。
実施形態188 免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む実施形態140〜187のいずれか1つに記載の方法。
実施形態189 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、実施形態188に記載の方法。
実施形態190 前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、実施形態140〜189のいずれか1つに記載の方法。
実施形態191 前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、実施形態190に記載の方法。
実施形態192 前記免疫応答が抗感染症応答を含む、実施形態190に記載の方法。
実施形態193 前記感染症がウイルス感染症を含む、実施形態192に記載の方法。
実施形態194 前記感染症が細菌感染症を含む、実施形態192に記載の方法。
実施形態195 前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、実施形態140〜194のいずれか1つに記載の方法。
実施形態196 前記個別免疫療法により前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が増加する、実施形態140〜191のいずれか1つに記載の方法。
実施形態197 実施形態140〜185のいずれか1つに記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
実施形態198 疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の前記1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) (a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、または(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与により前記疾患または前記症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップ、および所望により、
(c) 前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析するステップ、
(d) (c)において特定された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択するステップ、および
(e) (c)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製し、二者択一的に、所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、
それにより前記対象向けの個別免疫療法を作成する前記方法。
実施形態199 前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFを前記健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
(ii) 前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列内のORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態198に記載の方法。
実施形態200 前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む前記第2組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む第2生体試料の獲得を含む、実施形態198〜199のいずれか1つに記載の方法。
実施形態201 前記生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、実施形態198〜200のいずれか1つに記載の方法。
実施形態202 前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、実施形態198〜201のいずれか1つに記載の方法。
実施形態203 前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、実施形態202に記載の方法。
実施形態204 前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、実施形態203に記載の方法。
実施形態205 前記疾患または症状が感染症、または腫瘍もしくは癌である、実施形態198〜204のいずれか1つに記載の方法。
実施形態206 前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、実施形態205に記載の方法。
実施形態207 前記疾患担持生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態198〜206のいずれか1つに記載の方法。
実施形態208 前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、実施形態198〜207のいずれか1つに記載の方法。
実施形態209 前記核酸配列の前記シーケンシングがエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、実施形態198〜208のいずれか1つに記載の方法。
実施形態210 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、実施形態198〜209のいずれか1つに記載の方法。
実施形態211 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、実施形態198〜210のいずれか1つに記載の方法。
実施形態212 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープがT細胞エピトープを含む、実施形態198〜211のいずれか1つに記載の方法。
実施形態213 前記ベクターがワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子である、実施形態198〜212のいずれか1つに記載の方法。
実施形態214 前記1つ以上のペプチドの発現を確認するために前記ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む実施形態198〜213のいずれか1つに記載の方法。
実施形態215 前記DNA免疫療法が1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上のORFを含む核酸配列を含む、実施形態198〜212のいずれか1つに記載の方法。
実施形態216 前記核酸配列がプラスミドの形態である、実施形態215に記載の方法。
実施形態217 前記プラスミドが組込み型プラスミドまたは染色体外マルチコピープラスミドである、実施形態216のいずれか1つに記載の方法。
実施形態218 1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、実施形態59〜78のいずれか1つに記載の方法。
実施形態219 前記ペプチド免疫療法が1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドを含み、各ペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片と融合しているか、または混合されている、実施形態198〜212のいずれか1つに記載の方法。
実施形態220 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、実施形態218〜219のいずれか1つに記載の方法。
実施形態221 前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、実施形態220に記載の方法。
実施形態222 前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、実施形態220に記載の方法。
実施形態223 前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、実施形態220に記載の方法。
実施形態224 前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、実施形態220に記載の方法。
実施形態225 前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、実施形態224に記載の方法。
実施形態226 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、実施形態224に記載の方法。
実施形態227 前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、実施形態224に記載の方法。
実施形態228 前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原から構成される、実施形態198〜227のいずれか1つに記載の方法。
実施形態229 前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、実施形態228に記載の方法。
実施形態230 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、実施形態198〜229のいずれか1つに記載の方法。
実施形態231 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、実施形態229〜230のいずれか1つに記載の方法。
実施形態232 前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、実施形態205および230のいずれか1つに記載の方法。
実施形態233 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連特異的エピトープを含む、実施形態198〜232のいずれか1つに記載の方法。
実施形態234 前記感染症が感染性ウイルス病または感染性細菌病である、実施形態233に記載の方法。
実施形態235 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、実施形態234に記載の方法。
実施形態236 前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む実施形態198〜235のいずれか1つに記載の方法。
実施形態237 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態236に記載の方法。
実施形態238 免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む実施形態198〜237のいずれか1つに記載の方法。
実施形態239 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、実施形態238に記載の方法。
実施形態240 前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、実施形態198〜239のいずれか1つに記載の方法。
実施形態241 前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、実施形態240に記載の方法。
実施形態242 前記免疫応答が抗感染症応答を含む、実施形態240に記載の方法。
実施形態243 前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、実施形態242に記載の方法。
実施形態244 前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、実施形態198〜243のいずれか1つに記載の方法。
実施形態245 前記個別免疫療法により前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が増加する、実施形態198〜244のいずれか1つに記載の方法。
実施形態246 実施形態198〜214、218、および220〜235のいずれか1つに記載の方法により作製されるウイルス様粒子。
実施形態247 実施形態198〜214、218、および220〜235のいずれか1つに記載の方法により作製されるワクシニアウイルス株。
実施形態248 実施形態198〜212、215〜218、および220〜235のいずれか1つに記載の方法により作製されるDNA免疫療法。
実施形態249 実施形態198〜212、219、および220〜235のいずれか1つに記載の方法により作製されるペプチド免疫療法。
実施形態250 実施形態197に記載のリステリアを含む医薬組成物。
実施形態251 実施形態246に記載のウイルス様粒子を含む医薬組成物。
実施形態252 実施形態247に記載のワクシニアウイルス株を含む医薬組成物。
実施形態253 実施形態248に記載のDNA免疫療法を含む医薬組成物。
実施形態254 実施形態249に記載のペプチド免疫療法を含む医薬組成物。
実施形態255 対象向けの個別免疫療法を作成するための系であって、少なくとも1つの処理装置および前記処理装置により実行されるプログラム命令を含む少なくとも1つの記憶媒体を含み、前記プログラム命令によって前記処理装置が次のこと、すなわち、
(a) 全てのネオエピトープおよび前記対象のヒト白血球抗原(HLA)タイプを含む出力データを受信すること、
(b) 各ネオエピトープの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるエピトープを除外すること、
(c) 対象HLAに結合する残りのネオエピトープの能力、およびそれらのネオエピトープの予想MHC結合スコアに基づいてそれらのネオエピトープを数値により評価すること、
(d) 各ネオエピトープのアミノ酸配列をプラスミドに挿入すること、
(e) 各コンストラクトの疎水性スコアを求め、ある特定の閾値より上のスコアになるあらゆるコンストラクトを除外すること、
(f) 最も高いスコアになったコンストラクトから開始して、各コンストラクトのアミノ酸配列を対応するDNA配列に逆翻訳すること、
(g) 所定の上限に達するまでランク順に前記プラスミドコンストラクトに追加のネオエピトープを挿入すること、
(h) 前記対象における免疫治療応答を測定するために前記コンストラクトの末端にDNA配列タグを付加すること、および
(i) リステリア・モノサイトゲネスにおける発現および分泌のために前記ネオエピトープをコードする前記DNA配列および前記DNA配列タグを最適化すること、を含むステップを実行することになる前記系。
実施形態256 好ましい出力データがFASTA形式のものである、実施形態255に記載の系。
実施形態257 カイト・ドゥーリトル・ハイドロパシープロットを用いて疎水性が測定される、実施形態255〜256のいずれかに記載の系。
実施形態258 カイト・ドゥーリトル・プロット上で1.6より上のスコアになる全てのネオエピトープが除外または選択除外される、実施形態255〜257のいずれかに記載の系。
実施形態259 免疫エピトープデータベース(IED)を用いて対象HLAに結合する各ネオエピトープの能力が評価される、実施形態255〜258のいずれかに記載の系。
実施形態260 各ネオエピトープのサイズが21アミノ酸(21mer)である、実施形態255〜259のいずれかに記載の系。
実施形態261 前記DNAタグがリンカーを介して前記ネオエピトープに連結される、実施形態255〜260のいずれかに記載の系。
実施形態262 前記リンカーが4×グリシンリンカーである、実施形態255〜261のいずれかに記載の系。
実施形態263 ステップ(h)の前記DNA配列タグがSIINFEKL−6×Hisである、実施形態255〜262のいずれかに記載の系。
実施形態264 免疫抑制特性を有することが知られているネオエピトープがステップ(a)の前に考慮から除外される、実施形態255〜263のいずれかに記載の系。
以下の実施例では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本発明はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者によって理解される。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記載されていない。
材料および実験方法(実施例1〜2)
細胞株
C57BL/6同系TC−1腫瘍をHPV−16 E6およびE7で不死化し、c−Ha−ras癌遺伝子で形質転換した。T.C.Wu(ジョンズ・ホプキンズ大学医学部、米国メリーランド州ボルチモア)によって提供されたTC−1は、低レベルのHPV−16 E6およびE7を発現し、且つ、c−Ha−ras癌遺伝子で形質転換された腫瘍形成性の高い肺上皮細胞である。TC−1を、RPMI 1640、10%のFCS、2mMのL−グルタミン、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、100μMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、50マイクロモル(mcM)の2−ME、400マイクログラム(mcg)/mLのG418、および10%のナショナルコレクションタイプカルチャー−109培地中、37°で10%のCO2を用いて培養した。C3は、HPV 16の完全ゲノムで不死化され、且つ、pEJ−rasで形質転換されたC57BL/6マウス由来のマウス胚細胞である。EL−4/E7は、レトロウイルスによってE7を形質導入された胸腺腫EL−4である。
L.モノサイトゲネス株および増殖
細胞株
C57BL/6同系TC−1腫瘍をHPV−16 E6およびE7で不死化し、c−Ha−ras癌遺伝子で形質転換した。T.C.Wu(ジョンズ・ホプキンズ大学医学部、米国メリーランド州ボルチモア)によって提供されたTC−1は、低レベルのHPV−16 E6およびE7を発現し、且つ、c−Ha−ras癌遺伝子で形質転換された腫瘍形成性の高い肺上皮細胞である。TC−1を、RPMI 1640、10%のFCS、2mMのL−グルタミン、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、100μMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、50マイクロモル(mcM)の2−ME、400マイクログラム(mcg)/mLのG418、および10%のナショナルコレクションタイプカルチャー−109培地中、37°で10%のCO2を用いて培養した。C3は、HPV 16の完全ゲノムで不死化され、且つ、pEJ−rasで形質転換されたC57BL/6マウス由来のマウス胚細胞である。EL−4/E7は、レトロウイルスによってE7を形質導入された胸腺腫EL−4である。
L.モノサイトゲネス株および増殖
使用されたリステリア株は、Lm−LLO−E7(エピソーム発現系内のhly−E7融合遺伝子、図1A)、Lm−E7(ADXS11−001とも呼ばれる)(リステリアゲノムへと組み込まれる単一コピーE7遺伝子カセット)、Lm−LLO−NP(「DP−L2028」、エピソーム発現系内のhly−NP融合遺伝子)、およびLm−Gag(「ZY−18」、染色体へと組み込まれる単一コピーHIV−1Gag遺伝子カセット)であった。プライマー5’−GGCTCGAGCATGGAGATACACC−3’(配列番号24、XhoI部位は下線付き)および5’−GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA−3’(配列番号25、SpeI部位は下線付き)を使用してPCRによってE7を増幅し、pCR2.1(Invitrogenカリフォルニア州サンディエゴ)にライゲーションした。XhoI/SpeI消化によってE7をpCR2.1から切り出し、pGG−55にライゲーションした。このhly−E7融合遺伝子および多能性転写因子prfAをマルチコピーシャトルプラスミド(Wirth R et al、 J Bacteriol、 165:831, 1986)であるpAM401にクローニングし、pGG−55を作製した。hlyプロモーターはhly遺伝子産物の最初の441個のAAの発現を引き起こし(溶血性C末端を欠いており、以下では「ΔLLO」と呼ばれ、配列番号3に示す配列を有する)、これはXhoI部位によってE7遺伝子に結合されてhly−E7融合遺伝子を生じ、それはLLO−E7として転写され、分泌される。リステリアのprfA陰性株であるXFL−7(ペンシルバニア大学のDr.Hao Shenによって提供された)のpGG−55を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された(図1A〜図1B)。プライマー5’−GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC−3’(配列番号26、NheI部位は下線付き)、および5’−CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC−3’(配列番号27、XhoI部位は下線付き)を用いてhlyプロモーターおよび遺伝子断片を作成した。プライマー5’−GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT−3’(配列番号28、XbaI部位は下線付き)、および5’−CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG−3’(配列番号29、SalI部位は下線付き)を用いてprfA遺伝子をPCR増幅した。hlyプロモーターとE7の発現と分泌を引き起こすシグナル配列とを含有する発現カセットをLMゲノムのorfZドメインへと導入することによってLm−E7を作製した。プライマー5’−GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC−3’(配列番号30、BamHI部位は下線付き)および5’−GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG−3’(配列番号31、XbaI部位は下線付き)を使用してE7をPCR増幅した。次いでE7をpZY−21シャトルベクターにライゲーションした。結果として得られるプラスミドpZY−21−E7でLM株10403Sを形質転換したが、このプラスミドはLMゲノムのorfX、Y、Zドメインに対応する1.6kb配列の中央に挿入された発現カセットを含む。その相同性ドメインが相同組換えによるE7遺伝子カセットのorfZドメインへの挿入を可能にする。E7遺伝子カセットのorfZドメインへの組込みについてクローンをスクリーニングした。クロラムフェニコール(20μg/mL)を含むブレインハートインフュージョン培地中で細菌を培養し(Lm−LLO−E7およびLm−LLO−NP)、またはクロラムフェニコールを含まない同培地中で細菌を培養した(Lm−E7およびZY−18)。細菌をアリコットにして−80℃で凍結した。ウエスタンブロット法によって発現を検証した(図2)。
ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット法
リステリア株をルリア−ベルターニ培地中に37℃で培養し、600nmで測定された同一の光学密度で採取した。上清をTCA沈殿し、0.1NのNaOHを補充した1×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一量の各細胞ペレットまたは各TCA沈殿上清を4〜20%のトリスグリシンSDS−PAGEゲル(NOVEX、カリフォルニア州サンディエゴ)上に負荷した。それらのゲルを二フッ化ポリビニリデンに転写し、抗E7モノクローナル抗体(mAb)(Zymed Laboratories、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ)で調査し、次いでHRP−結合抗マウス二次Ab(Amersham Pharmacia Biotech、英国リトル・チャルフォント)とインキュベートし、Amersham ECL検出試薬で発色させ、Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)に露光させた。
腫瘍増殖の測定
腫瘍増殖の測定
1日おきに表面の最短径及び最長径にキャリパーをわたして腫瘍を測定した。これら2つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートルの単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が20mmに達したとき、マウスを殺処理した。各時点に対する腫瘍の測定値は生きているマウスに対してのみ示されている。
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組換え体の効果
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組換え体の効果
6〜8週齢のC57BL/6マウス(Charles River)が左脇腹の皮下に2×105TC−1細胞を受容した。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径4〜5mmの触知可能なサイズに達した。次いで8匹のマウスからなる群を7日目および14日目に0.1LD50の Lm−LLO−E7(107CFU)、Lm−E7(106CFU)、Lm−LLO−NP(107CFU)、またはLm−Gag(5×105CFU)で腹腔内処置した。
51Crリリースアッセイ
51Crリリースアッセイ
6〜8週齢のC57BL/6マウスを0.1LD50のLm−LLO−E7、Lm−E7、Lm−LLO−NP、またはLm−Gagで腹腔内免疫した。免疫の10日後に脾臓を採取した。脾細胞をフィーダー細胞としての放射線照射TC−1細胞と培養して(100:1、脾細胞:TC−1)確立し、インビトロで5日間刺激し、次いで以下の標的を使用して標準的51Crリリースアッセイに使用した。EL−4、EL−4/E7、またはE7 H−2bペプチド(RAHYNIVTF)でパルスしたEL−4。E:T細胞比は、3回繰り返して、80:1、40:1、20:1、10:1、5:1、および2.5:1であった。37℃で4時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、50μlの上清を各ウェルから取り出した。Wallac 1450シンチレーションカウンター(米国メリーランド州ゲイザースバーグ)を用いてサンプルをアッセイした。特異的溶解率は、[(実験による一分当たりのカウント(cpm)−自然発生cpm)/(総cpm−自然発生cpm)]×100として決定された。
TC−1特異的増殖
TC−1特異的増殖
Lm−LLO−E7、Lm−E7、Lm−LLO−NP、またはLm−Gagを用いてC57BL/6マウスを0.1LD50で免疫し、20日後に1LD50で腹腔内注射により追加免疫した。追加免疫の6日後、免疫したマウスおよび未感作マウスから脾臓を採取した。E7 Ag源としてのウェル当たり2.5×104細胞、1.25×104細胞、6×103細胞、または3×103細胞の放射線照射TC−1細胞と共に、またはTC−1細胞を含まずに、または10μg/mlのCon Aと共に平底96ウェルプレート中に5×105細胞/ウェルの密度で培養して脾細胞を確立した。45時間後に0.5μCi[3H]チミジン/ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはTomtecハーベスター96(米国コネチカット州オレンジ)を使用して18時間後に回収され、Wallac 1450シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。cpmの変化は、実験的cpm−Agを含まないcpmとして計算された。
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析
C57BL/6マウスを、0.1 LD50のLm−LLO−E7またはLm−E7を用いて静脈内(i.v.)免疫し、30日後に追加免疫した。CD8(53−6.7、PE結合)、CD62リ癌ド(CD62L、MEL−14、APC結合)、およびE7 H−2Db四量体に対する3色フローサイトメトリーを、FACSCalibur(登録商標)フローサイトメーターとCellQuest(登録商標)ソフトウェア(Becton Dickinson、カリフォルニア州マウンテンビュー)を使用して実施した。追加免疫の5日後に採取した脾細胞を、E7ペプチド(RAHYNIVTF)または対照(HIV−Gag)ペプチドを負荷したH−2Db四量体を用いて、室温(rt)で染色した。四量体を1/200に希釈して使用した。これらの四量体は、Dr.Larry R. Pease(Mayo Clinic、米国ミネソタ州ロチェスター)およびNIAID Tetramer Core FacilityおよびNIH AIDS Researchならびに標準試薬プログラムによって提供された。四量体+、CD8+、CD62Llow細胞を分析した。
B16F0−Ova実験
B16F0−Ova実験
24匹のC57BL/6マウスに5×105細胞のB16F0−Ova細胞を接種した。3日目、10日目、および17日目に0.1LD50のLm−OVA(106cfu)、Lm−LLO−OVA(108cfu)を用いて8匹のマウスの群を免疫し、8匹のマウスを処置しないままにした。
統計
統計
腫瘍径の比較のため、各群の腫瘍サイズの平均値とSDを決定し、スチューデントのt−検定によって統計的有意性を決定した。p≦0.05を有意と見なした。
実施例1:LLO−抗原融合体は抗腫瘍免疫性を誘導する
結果
実施例1:LLO−抗原融合体は抗腫瘍免疫性を誘導する
結果
Lm−E7およびLm−LLO−E7をTC−1の増殖に影響を与える能力に関して比較した。皮下腫瘍をC57BL/6マウスの左の脇腹に確立した。7日後、腫瘍は触診可能なサイズ(4〜5mm)に達した。7日目および14日目に0.1LD50のLm−E7、Lm−LLO−E7、または対照としてのLm−GagおよびLm−LLO−NPをマウスにワクチン接種した。Lm−LLO−E7は定着したTC−1腫瘍のうちの75%の完全な退行を誘導し、一方でこの群の中の他の2匹のマウスでは腫瘍増殖が抑制された(図3)。対照的に、Lm−E7およびLm−Gagを用いた免疫は腫瘍退行を誘導しなかった。この実験は複数回繰返され、常に非常に類似した結果であった。加えて、Lm−LLO−E7については異なる免疫プロトコル下でも類似の結果が達成された。別の実験では、定着した5mmのTC−1腫瘍を有するマウスを単回の免疫で治癒することができた。
他の実験では2つの他のE7発現腫瘍細胞株であるC3とEL−4/E7を使用して類似の結果が得られた。Lm−LLO−E7を用いたワクチン接種の有効性を確認するため、腫瘍を除去した動物にTC−1腫瘍細胞またはEL−4/E7腫瘍細胞をそれぞれ60日目または40日目に再負荷した。Lm−LLO−E7で免疫された動物は実験終了まで腫瘍が無いままであった(TC−1の場合124日目、EL−4/E7については54日目)。
したがってΔLLOとの融合タンパク質としての抗原の発現によりその抗原の免疫原性が強化される。
実施例2:LM−LLO−E7処理によりTC−1特異的脾細胞増殖が誘発される
実施例2:LM−LLO−E7処理によりTC−1特異的脾細胞増殖が誘発される
Lm−LLO−E7を有するLm−E7によるT細胞の誘導を測定するため、抗原特異的免疫能の尺度であるTC−1特異的増殖性応答を免疫されたマウスにおいて測定した。20:1、40:1、80:1、および160:1の脾細胞:TC−1比でE7の供給源としての放射線照射TC−1細胞に曝露されるとLm−LLO−E7で免疫されたマウス由来の脾細胞が増殖した(図4)。反対に、Lm−E7およびrLm対照で免疫されたマウスに由来する脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖を示しただけであった。
実施例3:ActA−E7融合およびPEST−E7融合体は抗腫瘍免疫性を付与する
材料および方法
Lm−ActA−E7の構築
実施例3:ActA−E7融合およびPEST−E7融合体は抗腫瘍免疫性を付与する
材料および方法
Lm−ActA−E7の構築
Lm−ActA−E7は、短縮型のactAタンパク質に融合されたE7タンパク質を発現するプラスミドを含むLMの組換え株である。Lm−actA−E7は、pDP−2028を修飾することにより構成されたプラスミドベクターpDD−1をリステリアに導入することにより作製された。pDD−1は、ActA−E7の発現と分泌を引き起こす1コピーの310bpのhlyプロモーターとhlyシグナル配列(ss)を発現する発現カセット、4つのPEST配列(配列番号19)を含む1170bpのactA遺伝子(短縮型ActAポリペプチドはその分子の最初の390個のAAから成る。配列番号11)、300bpのHPVE7遺伝子、1019bpのprfA遺伝子(病原性遺伝子の発現を制御)、および形質転換細菌クローンの選択のためのCAT遺伝子(クロラムフェニコール耐性遺伝子)を含む(Sewell et al.(2004)、Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 130:92−97)。
hlyプロモーター(pHly)および遺伝子断片は、pGG55(実施例1)からプライマー5’−GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC−3’(Xba I部位は下線付き;配列番号32)およびプライマー5’−ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC−’3(Not I部位は下線付き。最初の18ヌクレオチドはActA遺伝子と重複;配列番号33)を使用してPCR増幅された。actA遺伝子は、Lm 10403S野生型ゲノムからプライマー5’−GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT−3’(NotI部位は下線付き;配列番号34)およびプライマー5’−TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC−3’(XhoI部位は下線付き;配列番号35)を使用してPCR増幅された。E7遺伝子は、pGG55(pLLO−E7)からプライマー5’−GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA−3’(XhoI部位は下線付き;配列番号36)およびプライマー5’−AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA−3’(XmaI部位は下線付き;配列番号37)を使用してPCR増幅された。prfA遺伝子は、Lm 10403S野生型ゲノムからプライマー5’−TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT−3’(XmaI部位は下線付き;配列番号38)およびプライマー5’−GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG−3’(SalI部位は下線付き;配列番号39)を使用してPCR増幅された。hlyプロモーター−actA遺伝子融合(pHly−actA)は、精製したpHly DNAおよび精製したactA DNAから、上流pHlyプライマー(配列番号32)および下流actAプライマー(配列番号35)を使用してPCR生成および増幅された。
prfA遺伝子(E7−prfA)に融合されたE7遺伝子は、精製したE7 DNAおよび精製したprfA DNAから、上流E7プライマー(配列番号36)および下流prfA遺伝子プライマー(配列番号39)を使用してPCR生成および増幅された。
E7−prfA融合生成物に融合されたpHly−actA融合生成物は、精製した融合pHly−actA DNA生成物および精製した融合E7−prfA DNA生成物から、上流pHlyプライマー(配列番号32)および下流prfA遺伝子プライマー(配列番号39)を使用してPCRで生成および増幅され、pCRII(Invitrogen、カリフォルニア州ラホヤ)にライゲーションされた。コンピテント大腸菌(TOP10’F、Invitrogen、カリフォルニア州ラホヤ)をpCRII-ActAE7で形質転換した。溶解および分離の後、BamHIを使用する制限分析(770bpと6400bpの期待断片サイズ(または挿入断片をベクターに転じると:2500bpと4100bp))およびBstXIを使用する制限分析(2800bpと3900bpの期待断片サイズ)によりプラスミドをスクリーニングし、上流pHlyプライマー(配列番号32)および下流prfA遺伝子プライマー(配列番号39)を使用するPCR分析でもプラスミドをスクリーニングした。
XbaIとSalIを使用する二重消化によりpCRIIからpHly−actA−E7−prfA DNA挿入断片を切り出し、同様にXbaIおよびSalIで消化されたpDP−2028にライゲーションした。pActAE7発現系でTOP10’Fコンピテント大腸菌(Invitrogen、カリフォルニア州ラホヤ)を形質転換した後に上流pHlyプライマー(配列番号32)および下流PrfA遺伝子プライマー(配列番号39)を使用するPCR分析によりクロラムフェニコール耐性クローンをスクリーニングした。pActAE7を含むクローンをブレインハートインフュージョン培地(クロラムフェニコール(20mcg(マイクログラム)/ml(ミリリットル)、Difco、ミシガン州デトロイトを含む)中に培養し、ミディプレップDNA精製システムキット(Promega、ウィスコンシン州マディソン)を使用してpActAE7を細菌細胞から単離した。Ikonomidis et al.(1994, J. Exp. Med. 180: 2209−2218)に記載されるようにペニシリン処理したリステリア(XFL−7株)のprfA陰性株をpActAE7発現系で形質転換し、インビボでのそのプラスミドの保持についてクローンを選抜した。クローンをクロラムフェニコール(20mcg/mL)入りのブレインハートインフュージョン中に37℃で培養した。細菌をアリコットにして−80℃で凍結した。
抗原発現のイムノブロット検証
抗原発現のイムノブロット検証
Lm−ActA−E7がActA−E7(約64kD)を分泌することを検証するため、リステリア株をルリア−ベルターニ(LB)培地中に37℃で培養した。トリクロロ酢酸(TCA)を用いて培養上清からタンパク質を沈殿させ、0.1Nの水酸化ナトリウムを含む1×サンプルバッファー中にそれを再懸濁した。同一の量の各TCA沈殿上清を4%〜20%のトリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル(NOVEX、カリフォルニア州サンディエゴ)に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に転写し、1:2500の抗E7モノクローナル抗体(Zymed Laboratories、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ)で調査し、次いで1:5000のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG(Amersham Pharmacia Biotech、英国、リトル・チャルフォント)で調査した。Amersham増強化学発光検出試薬を用いてブロットを発色させ、オートラジオグラフィーフィルム(Amersham)に対して露光させた(図5A)。
Lm−PEST−E7、Lm−ΔPEST−E7、およびLm−E7epiの構築(図6A)
Lm−PEST−E7、Lm−ΔPEST−E7、およびLm−E7epiの構築(図6A)
Lm−PEST−E7は、それがプロモーターおよびhly遺伝子のPEST配列のみ、特にLLOの最初の50個のAAを含有すること以外はLm−LLO−E7と同一である。Lm−PEST−E7を構築するため、SOE(ジーンスプライシング・バイ・オーバーラップエクステンション)PCR技法を使用して、hlyプロモーターおよびPEST領域を全長のE7遺伝子に融合した。従来のPCR技法によってE7遺伝子およびhly−PEST遺伝子断片をLLOの最初の441個のAAを含有するプラスミドpGG−55から増幅し、まとめてスプライシングした。最終的なプラスミドpVS16.5を作製するため、インビトロ選択用のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドpAM401にhly−PEST−E7断片およびprfA遺伝子をサブクローニングし、得られたプラスミドを使用してXFL−7を形質転換した。
Lm−ΔPEST−E7は、それがPEST配列を欠いていること以外は、Lm−LLO−E7と同一である組換え型リステリア株である。これは、PEST含有領域(333〜387bp)をhly−E7融合遺伝子から除去するために設計されたプライマーを使用してエピソーム発現系を構築したこと以外は、基本的にLm−PEST−E7について記載されたように作製された。Lm−E7epiは、PEST領域またはLLOを含まないE7を分泌する組換え株である。この株を形質転換するのに用いるプラスミドはE7遺伝子に融合したhlyプロモーターの遺伝子断片およびシグナル配列を含有する。このコンストラクトは、染色体の中へと組み込まれた単一コピーのE7遺伝子を発現した大元のLm−E7とは異なる。Lm−E7epiは、発現されるE7抗原の形態を除いて、Lm−LLO−E7、Lm−PEST−E7、およびLm−ΔPEST−E7と完全に同系である。
結果
結果
Lm−ActA−E7によって誘導される抗腫瘍免疫をLm−LLO−E7によって誘導される抗腫瘍免疫性に対して比較するため、2×105細胞のTC−1腫瘍細胞をマウスに皮下移植し、触知可能サイズ(およそ5ミリメートル[mm])まで増殖させた。7日目および14日目に1LD50のLm−ActA−E7(5×108CFU)(十字)、Lm−LLO−E7(108CFU)(四角)、またはLm−E7(106CFU)(丸)のいずれかでマウスを腹腔内免疫した。26日目までに、Lm−LLO−E7およびLm−ActA−E7の全ての動物は腫瘍が無いままであったが、一方で未感作動物(三角)およびLm−E7で免疫された動物の全てが大きい腫瘍を成長させた(図5B)。したがって、ActA−E7融合体でのワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
加えて、E7発現腫瘍の退行を生じさせるLm−LLO−E7、Lm−PEST−E7、Lm−ΔPEST−E7、およびLm−E7epiの能力についてそれらを比較した。40匹のC57BL/6マウスの左脇腹に皮下TC−1腫瘍を確立した。腫瘍が4〜5mmに達した後、8匹のマウスからなる5つの群にマウスを分けた。各群を4つの組換え型LM免疫療法のうちの1つで処置し、1つの群は未処置のままにした。Lm−LLO−E7およびLm−PEST−E7はそれぞれ5/8事例および3/8の事例で定着した腫瘍の退行を誘導した。いずれの時点においてもLm−PEST−E7またはLm−LLO−E7で処置されたマウスの平均腫瘍サイズの間に統計的な差はなかった。しかしながら、PEST配列を含まないE7であるLm−ΔPEST−E7およびLm−E7epiを発現する免疫療法は、1匹を除いて全てのマウスで腫瘍退行を引き起こすことができなかった(図6B、上のパネル)。これは2回の実験を表したものであり、28日目における平均腫瘍サイズの統計的に有意な差がLm−LLO−E7またはLm−PEST−E7で処置した腫瘍とLm−E7epiまたはLm−ΔPEST−E7で処置した腫瘍との間で観察された(P<0.001、スチューデントのt検定;図6B、下のパネル)。加えて、PEST含有免疫療法をワクチン接種されたマウスの脾臓における3回の実験にわたって四量体陽性脾細胞のパーセンテージの増加に再現性が見られた(図6C)。したがって、PEST−E7融合体を用いたワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
実施例4:LLO、ActA、またはPEST様配列へのE7の融合がE7特異的免疫を強化し、腫瘍浸潤性E7特異的CD8+細胞を発生させる
材料および実験方法
実施例4:LLO、ActA、またはPEST様配列へのE7の融合がE7特異的免疫を強化し、腫瘍浸潤性E7特異的CD8+細胞を発生させる
材料および実験方法
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の100mcl(マイクロリットル)の2×105細胞のTC−1腫瘍細胞に加えて400mclのMATRIGEL(登録商標)(BD Biosciences、ニュージャージー州フランクリン・レイクス)を含む500mclのMATRIGEL(登録商標)を12匹のC57BL/6マウスの左脇腹に皮下移植した(n=3)。マウスを7日目、14日目、および21日目に腹腔内免疫し、脾臓および腫瘍を28日目に採取した。腫瘍MATRIGELをマウスから取り出し、氷上で、2ミリリットル(mL)のRP 10培地を含有する試験管内において4℃で一晩インキュベートした。鉗子を用いて腫瘍を細かく切り刻み、2mmのブロックに切断し、3mlの酵素混合物(PBS中の0.2mg/mlのコラゲナーゼP、1mg/mlのDNAse−1)と共に37℃で1時間インキュベートした。四量体およびIFN−γ染色のため、組織懸濁液をナイロンメッシュに通して濾過し、PBS中の5%胎児ウシ血清+0.05%NaN3で洗浄した。
ブレフェルジンAの存在下で107細胞/mLの脾細胞および腫瘍細胞を1マイクロモル(mcm)のE7ペプチドと共に5時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、50mclの抗マウスFc受容体上清(2.4 G2)中、4℃で1時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子CD8およびCD62Lについて染色し、透過処理し、透過処理キットGolgi−stop(登録商標)またはGolgi−Plug(登録商標)(Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して固定し、IFN−γについて染色した。2レーザーフローサイトメーター、FACSCaliburを使用して500,000イベントを取得し、Cellquest Software(Becton Dickinson、ニュージャージー州フランクリン・レイクス)を使用して分析した。活性化(CD62Llow)CD8+T細胞内のIFN−γ分泌細胞のパーセンテージを計算した。
四量体染色のため、H−2Db四量体にフィコエリスリン(PE)結合E7ペプチド(RAHYNIVTF、配列番号40)を負荷し、室温で1時間染色し、アロフィコシアニン(APC)結合抗MEL−14(CD62L)およびFITC−結合抗CD8+で4℃において30分間染色した。脾臓および腫瘍内の四量体+CD8+CD62Llow細胞を比較して細胞を分析した。
結果
結果
抗原特異的免疫を強化するLm−ActA−E7の能力を分析するため、マウスにTC−1腫瘍細胞を移植し、Lm−LLO−E7(1×107CFU)、Lm−E7(1×106CFU)、またはLm−ActA−E7(2×108CFU)のいずれかで免疫するか、または無処置(未感作)とした。Lm−LLO−E7群およびLm−ActA−E7群のマウスの腫瘍は、Lm−E7または未感作マウスにおけるものよりも高いパーセンテージのIFN−γ分泌CD8+T細胞(図7A)および四量体特異的CD8+細胞(図7B)を含有した。
別の実験では、腫瘍担持マウスにLm−LLO−E7、Lm−PEST−E7、Lm−ΔPEST−E7、またはLm−E7epiを投与し、腫瘍中のE7特異的リンパ球のレベルを測定した。0.1LD50の4つの免疫療法を用いて7日目および14日目にマウスを処置した。腫瘍を21日目に採取し、CD62L、CD8に対する抗体を用いて、およびE7/Db四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセンテージの増加が、Lm−LLO−E7およびLm−PEST−E7を用いてワクチン接種されたマウスで見られた(図8A)。この結果は3つの実験にわたって再現性があった(図8B)。
したがって、Lm−LLO−E7、Lm−ActA−E7、およびLm−PEST−E7は、腫瘍浸潤CD8+T細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。
実施例5:LLOおよびActAの融合体はE6/E7トランスジェニックマウスにおいて自発性(自然発生)腫瘍を減少させる
実施例5:LLOおよびActAの融合体はE6/E7トランスジェニックマウスにおいて自発性(自然発生)腫瘍を減少させる
E6/E7トランスジェニックマウスにおける自発性腫瘍に対するLm−LLO−E7免疫療法およびLm−ActA−E7免疫療法の影響を判断するため、6〜8週齢のマウスを1×108 単位のLm−LLO−E7または2.5×108単位の Lm−ActA−E7で毎月一回8か月にわたり免疫した。最後の免疫から20日後にマウスを殺処理し、甲状腺を摘出し、重量測定した。この実験を二回実施した(表1)。
表1. 8か月齢のワクチン未接種のトランスジェニックマウスとワクチン接種済みのトランスジェニックマウスにおける甲状腺重量(mg)*。
Lm−LLO−E7処置マウスと無処置マウスの間の甲状腺重量の差、およびLm−LLO−ActA処置マウスと無処置マウスの間の甲状腺重量の差は両方の実験において有意(それぞれp<0.001およびp<0.05)であったが、Lm−LLO−NP処置マウス(無関係の抗原対照)と無処置マウスの間の差は有意ではなく(スチューデントのt−検定)、このことはLm−LLO−E7およびLm−ActA−E7が自然発生腫瘍増殖を抑制したことを示している。よって、本発明の免疫療法は新しいE7発現腫瘍の形成を防止する。
上記実施例における所見を要約すると、LLO抗原およびActA抗原の融合体は、(a)腫瘍浸潤性抗原特異的T細胞を含み、且つ、腫瘍退行を誘導して通常の腫瘍および特に侵襲性の強い腫瘍の両方の腫瘍増殖を抑制することが可能である腫瘍特異的免疫応答を誘導し、(b)自己抗原に対する寛容を克服し、そして(c)自然発生腫瘍増殖を防止する。これらの所見は、多種多様な抗原、PEST様配列、および腫瘍タイプについて首尾よく実施されたことによって証明されるように、大多数の抗原、PEST様配列、および腫瘍タイプに一般化される。
実施例6:Lm−LLO−E7免疫療法は安全であり子宮頚部癌患者の臨床指標を改善する
材料および実験方法
実施例6:Lm−LLO−E7免疫療法は安全であり子宮頚部癌患者の臨床指標を改善する
材料および実験方法
選択基準。治験の全ての患者は「進展子宮頸部癌、進行性子宮頸部癌、または再発性子宮頚部癌」と診断されており、登録時の評価で全員がステージIVBの疾患を有する段階であることが示された。全ての患者がカンジジン、おたふく風邪、破傷風、またはツベルクリン精製タンパク質誘導体(PPD)から選択される3つのメモリー抗原を含むアネルギーパネルに対して陽性の免疫応答を示し、妊娠中でもHIV陽性でもなく、4週間以内に治験薬を服用しておらず、ステロイドを受容していなかった。
プロトコル:患者は、入院患者への250mlの通常生理食塩水の30分間にわたる静脈内(IV)注入として3週間の間隔で2回のワクチン接種を実施された。5日後、患者は単回のIVアンピシリンコースを受け、さらに10日間の経口アンピシリンを受けた上で解放された。食欲、日常的作業を完了する能力、安らかな睡眠など、全般的な生命力および生活の質の尺度であるカルノフスキーパフォーマンス指標を使用して全般的な健康状態を判断した。さらに、安全性および全体的な健康状態についての以下の指標、すなわち、アルカリホスファターゼ、直接ビリルビンと総ビリルビンの両方、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ(ggt)、コレステロール、収縮期、拡張期、および心拍数、カルノフスキー様の生活の質の指標である疾患進行評価用の米国東海岸がん臨床試験グループ(ECOG)基準、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板レベル、リンパ球レベル、AST(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ)、ALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)、およびLDH(乳酸脱水素酵素)が決定された。患者は2回目の投与後の3週間目および3か月目に追跡調査を受け、その時点でそれらの患者の固形腫瘍治療効果判定基準(RECIST)スコアを決定し、スキャンを実施して腫瘍サイズを決定し、治験終了時に免疫学的分析用に血液標本を採取し、その免疫学的分析にはIFN−γ、IL−4、CD4+細胞集団、およびCD8+細胞母集団の評価が含まれた。
リステリア株:Lm−LLO−E7の作製は実施例1に説明されている。
結果
結果
治験の前に、Lm−LLO−E7の静脈内(i.v.)投与と腹腔内(i.p.)投与の間で抗腫瘍有効性を判断するために前臨床実験を実施した。1×104細胞のTC−1細胞を含む腫瘍を皮下に確立した。7日目および14日目に108単位のLm−LLO−E7の腹腔内投与か、または108単位、107単位、106単位、もしくは105単位の用量でのLm−LLO−E7の静脈内投与のいずれかでマウスを免疫した。35日目に両方の経路で108単位のLm−LLO−E7を受けたか、または107単位のLm−LLO−E7の静脈内投与を受けたマウスの5/8、および106単位のLm−LLO−E7の静脈内投与を受けたマウスの4/8が治癒した。それに対して、107単位未満の用量、または幾つかの事例では腹腔内投与された108単位のLm−LLO−E7は腫瘍増殖の抑制に効果的ではなかった。よって、Lm−LLO−E7の静脈内投与は腹腔内投与よりも効果的である。
治験
治験
進展子宮頸部癌、進行性子宮頸部癌、または再発性子宮頚部癌の患者におけるLm−LLO−E7免疫療法の安全性と有効性を評価するために第I相/第II相の治験を実施した。それぞれ5人の患者をコホート1〜2に割り当て、それぞれ1×109CFUまたは3.3×109CFUを受けた。さらに5人の患者をそれぞれコホート3〜4に割り当て、それぞれ1×1010CFUまたは3.31×1010CFUを受ける。
安全性データ
第1コホート
安全性データ
第1コホート
第1コホートの患者全員が注入の開始後1〜2時間以内に軽度から中程度の発熱および悪寒の発症を報告した。一部の患者には吐き気を伴う嘔吐、または伴わない嘔吐があった。1例を除いて(後述)パラセタモールなどの非ステロイド系薬剤の単回投与がこれらの症状の解消に充分であった。発熱と呼応して、その時間経過に合わせて幾分かの一時的な心血管系の効果が観察された。その他の有害効果は報告されなかった。
子宮頚部癌のこの後期段階では1年生存率は患者の10〜15%であることが典型的であり、有効であった腫瘍療法はこれまでに無い。実際に、患者2は非常に侵襲性の強い疾患を有する若年の患者であり、治験完了後まもなくに亡くなった。
投与後2日目、3日目、および5日目に定量的血液培養物を評価した。このコホートで評価可能な5人の患者のうち、4人はどの時点でも血清中リステリアを示さず、1人は2日目に非常に少量(35CFU)の循環リステリアを有したが、3日目または5日目には検出可能なリステリアはなかった。
患者5は最初のワクチン接種に反応し、投与後48時間にわたって軽度の発熱があり、抗炎症剤で治療を受けた。1例で発熱が中程度の重篤度になる(どの時点でも38.4℃を超えない)まで上昇したが、その後その患者にはアンピシリンコースが提供され、これによって発熱が解消した。抗生物質投与中、この患者は軽度のじんましんを発症し、これは抗生物質投与後に解消した。血液培養物は全て無菌であり、心血管データはその他の患者で観察された範囲内にあり、血清化学値は正常で、この患者にはリステリア症がないことが示された。さらに、アネルギーパネルは、1/3のメモリー抗原に対する強い反応を示し、(他の患者と類似する)機能性免疫の存在を示した。患者5はその後、追加免疫を受けると他の全員の患者と類似した反応を示した。
第2コホートおよび全般的安全性の観察
第2コホートおよび全般的安全性の観察
両方のコホートで注入後に肝臓機能試験において軽度で一時的な変化が観察された。これらの変化は治験をモニタリングする主治医によって臨床的有意性を持たないと判断され、体循環から肝臓および脾臓まで急速に除去される細菌の短命の感染であると予期された。概して、上記の方法の節に記載された全ての安全性指標が正味の変化をほとんど、または全く示さず、優れた安全性プロフィールを示した。このコホートにおける副作用プロファイルは最初のコホートで見られたプロファイルと実質的に同一であり、それは医原性感染の誘導の結果として発生するサイトカインおよび類似の因子の結果に関連する用量依存的シリーズの症状のようであった。どの時点でも血清中リステリアが観察されず、どちらのコホートでも用量制限毒性が観察されなかった。
有効性−第1コホート
有効性−第1コホート
治験を終了した第1コホートの3人の患者で以下の有効性指標を観察した:(図9)。
患者1はそれぞれ20mmの2個の腫瘍がある状態で治験に登録し、これらの腫瘍は治験期間にわたり18mmおよび14mmに縮小し、免疫療法の治療有効性を示した。さらに、患者1はカルノフスキーパフォーマンス指標が70で治験登録し、その指標は投与後には90に上昇した。安全性審査パネルの会合で、セルビア国ベオグラード市の腫瘍学および放射線学研究所腫瘍学部門の部門長であるSinisa Radulovicが、それらの治験の実施機関の代表者、その機関のコンサルタントとして働く独立癌医であるMichael Kurman、Merck社のためにガーダシルの第III相治験を実施し、Glaxo Smithkline社のためにサーバリックスの治験を実施したエモリー大学の婦人科腫瘍学者であるKevin Ault、およびNCIの婦人科腫瘍学グループの創設者であり、ミシシッピ大学の婦人科腫瘍学の教授であるTate Thigpenに結果を発表した。Radulovic博士の意見では、患者1は免疫療法の治療による臨床的利益を示した。
亡くなる前の患者2は混在した反応を示しており、1/2の腫瘍が縮小した。
患者3は腫瘍随伴性疾患(患者の全体的な衰弱状態によって癌にとって二次的な他の続発症が生じるその癌の付帯現象)がある状態で登録したが、それには血小板数の936×109/mlまでの上昇が含まれた。最初の投与の後、この数値はほぼ正常なレベルである405×109/mlに減少した。
患者4はそれぞれ20mmの2個の腫瘍がある状態で治験に登録し、これらの腫瘍は治験期間にわたり18mmおよび14 mmに縮小し、免疫療法の治療有効性を示した。患者4は1.6Kgの体重増加を示し、1回目と2回目の投与の間でおよそ10%のヘモグロビン数増加を示した。
有効性 - 第2コホートおよび一般的観察
有効性 - 第2コホートおよび一般的観察
最低用量のコホートでは2人の患者で腫瘍の縮小が見られた。この効果のタイミングは、その効果が免疫応答の経時的発生に従っていたという点で免疫学的応答に関して観察された内容と一致した。これまでに腫瘍細胞量が評価された第2コホートの2人の患者のうち1人がワクチン接種後の時点で劇的な腫瘍細胞量の減少を示した。治験開始時、この患者には13mm、13mm、および14mmの3個の腫瘍があった。2回の免疫療法投与後、2個の腫瘍が9.4mmおよび12mmに縮小し、3個目の腫瘍はもはや検出できなかった。
2つのコホートの腫瘍細胞量を図13Bに示す。要約すると、準備刺激注入と単回の追加免疫を含む治療レジメンで投与された比較的に低用量のLm−LLO−E7によっても、データが収集された6人の患者のうち3人で客観的奏功が達成された。
考察
考察
子宮頚部癌のこの後期段階では1年生存率は患者の10〜15%であることが典型的であり、有効であった腫瘍療法はこれまでに無い。ステージIVBの子宮頚部癌を回復に向かわせることに有効であることを示した治療は無かった。この段階での子宮頚部癌の治療の困難さにもかかわらず、2/6の患者において抗腫瘍効果が観察された。さらに、本明細書において上述したようにその他の有効性指標が治験を終了した患者で観察された。
よって、Lm−LLO−E7はヒト対象において安全であり、比較的低い用量で投与されても子宮頚部癌患者の臨床的指標を向上させる。追加免疫ワクチン接種の用量と回数を増やすと、および/または抗生物質を少量の用量で、もしくは注入後の後期の時点で投与すると、追加の肯定的な結果が観察される可能性がある。前臨床研究により、一桁台の倍率での用量の増加が奏効率に劇的な変化(例えば、0%の奏効率から50〜100%の完全寛解率)を起こし得ることが示された。また、追加的な追加免疫投与によって得られる免疫応答がさらに増強される高い可能性がある。さらに、観察された治療的免疫応答の肯定的効果は、免疫系が引き続き癌を攻撃することから、追加の時間経過にわたり継続する可能性がある。
実施例7:弱毒化リステリア株LmddΔactAの構築、およびLmdd株およびLmdda株内のhly遺伝子へのフレーム内でのヒトklk3遺伝子の挿入。
材料および方法
実施例7:弱毒化リステリア株LmddΔactAの構築、およびLmdd株およびLmdda株内のhly遺伝子へのフレーム内でのヒトklk3遺伝子の挿入。
材料および方法
前立腺癌のマウスモデルにおいて腫瘍の退行に関連する強力なPSA特異的免疫応答を誘発するtLLOに融合されたPSAを分泌する組換え型Lmであって、tLLO−PSAの発現がそのベクターに抗生物質耐性を付与するpGG55ベースのプラスミド(表2)に由来する前記組換え型Lm(Lm−LLO−PSA)を開発した。最近、我々はpADV142プラスミドに基づくPSA免疫療法用の新株であって、抗生物質耐性マーカーを持たず、LmddA−142(表3)と呼ばれる株を開発した。この新株は、Lm−LLO−PSAよりも10倍弱毒化されている。加えて、LmddA−142はLm−LLO−PSAよりも免疫原性がわずかに高く、且つ、PSAを発現する腫瘍の退行に関して著しく有効であった。
表2. プラスミドおよび株
プラスミドpAdv142(6523bp)の配列は次のとおりであった:cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgttatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaaccccTAAcccgggccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaagccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggacattagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaaccaggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcatta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このプラスミドは2008年2月20日にGenewiz試験施設にて大腸株から配列決定された。
Lm dal dat(Lmdd)株を病毒性因子ActAの不可逆的な欠失によって弱毒化した。下流遺伝子の発現に対するあらゆる極性効果を避けるようにactAのフレーム内欠失をLmdaldat(Lmdd)バックグラウンドで構築した。そのLm dal dat ΔactAはActAの591アミノ酸の欠失によってN末端の最初の19アミノ酸とC末端の28アミノ酸残基を含有する。
そのactA欠失突然変異体は、PCRによってactAの上流部分(657bp、オリゴAdv271/272)および下流部分(625bp、オリゴAdv273/274)に対応する染色体領域を増幅し、且つ、結合することにより作製された。この増幅に使用されたプライマーの配列が表3に提示されている。actAの上流DNA領域と下流DNA領域をEcoRI/PstI制限部位においてpNEB193内にクローニングし、このプラスミドからEcoRI/PstIを温度感受性プラスミドpKSV7内にさらにクローニングしてΔactA/pKSV7(pAdv120)を得た。
表3:actAの上流および下流のDNA配列の増幅に使用されたプライマーの配列
その遺伝子の染色体上の位置からの欠失を、そのactA欠失領域の外側に結合するプライマーであって、プライマー3(Adv305−tgggatggccaagaaattc、配列番号:46)およびプライマー4(Adv304−ctaccatgtcttccgttgcttg、配列番号47)として図10Aおよび図10Bに示されているプライマーを使用して確認した。LmddおよびLmddΔactAから単離された染色体DNAに対してPCR分析を実施した。Lmddの染色体DNA内でのプライマー対1/2および3/4の2つの異なるセットによる増幅後のDNA断片のサイズは3.0Kbおよび3.4Kbであると予期された。一方で、LmddΔactA用のプライマー対1/2および3/4を使用するPCRの期待サイズは1.2Kbおよび1.6Kbであった。したがって、図10Aおよび図10B中のPCR分析によりactAの1.8kb領域がLmddΔactA株内で欠失していることが確認される。LmddΔactA株内のactA含有領域の欠失を確認するためにPCR産物に対してDNAシーケンシングも実施した。
実施例8:Lmベクターによる抗原送達のための抗生物質非依存的エピソーム発現系の構築。
実施例8:Lmベクターによる抗原送達のための抗生物質非依存的エピソーム発現系の構築。
Lmベクター(pAdv142)による抗原送達のための抗生物質非依存的なエピソーム発現系は、次世代の抗生物質を含まないプラスミドpTV3である(Verch et al., Infect Immun、2004. 72(11):6418−25、参照により本明細書に援用される)。リステリア株Lmddは染色体中に病原性遺伝子転写活性化因子の遺伝子である1コピーのprfA遺伝子を含むため、prfAをpTV3から欠失した。さらに、NheI/PacI制限部位でのp60−リステリアdalのカセットをp60−枯草菌dalにより置換してプラスミドpAdv134を得た(図11A)。リステリアとバチルスのdal遺伝子の類似性は約30%であり、Lmdd染色体内のdal遺伝子の残りの断片とそのプラスミドとの間で組換えが起こる可能性が実質的に排除される。プラスミドpAdv134は抗原発現カセットtLLO−E7を含んだ。LmddA株をpAdv134プラスミドで形質転換し、選択したクローンからのLLO−E7タンパク質の発現をウエスタンブロットによって確認した(図11B)。10403S野生型株に由来するLmdd系は、Lmddストレプトマイシン耐性を除き、抗生物質耐性マーカーを持っていない。
さらに、pAdv134をXhoI/XmaIで制限処理してヒトPSAであるklk3をクローニングしてプラスミドpAdv142を得た。新しいプラスミドであるpAdv142(図11C、表2)はリステリアp60プロモーターの制御下にあるバチルスdal(B−Dal)を含む。そのシャトルプラスミドpAdv142は外因性D−アラニンの非存在下で大腸菌ala drx MB2159ならびにリステリア・モノサイトゲネス株Lmddの両方の増殖を相補した。プラスミドpAdv142内の抗原発現カセットはhlyプロモータープロモーターおよびLLO−PSA融合タンパク質から構成される(図11C)。
プラスミドpAdv142でリステリアのバックグラウンド株であるLmddactA株を形質転換してLm−ddA−LLO−PSAを得た。そのLm−ddA−LLO−PSA株によるLLO−PSA融合タンパク質の発現と分泌を、抗LLO抗体および抗PSA抗体を使用するウエスタンブロットにより確認した(図11D)。インビボでの2継代後にLm−ddA−LLO−PSA株によるLLO−PSA融合タンパク質の安定した発現および分泌が存在した。
実施例9:LmddA−LLO−PSA株のインビトロおよびインビボでの安定性
実施例9:LmddA−LLO−PSA株のインビトロおよびインビボでの安定性
LmddA−LLO−PSAリステリア株を選択圧の存在下または非存在下で8日間にわたり培養することによりプラスミドのインビトロでの安定性を検査した。LmddA−LLO−PSA株用の選択圧はD−アラニンである。したがって、ブレインハートインフュージョン(BHI)培地およびBHI+100μg/ml D−アラニン培地中でLmddA−LLO−PSA株を継代培養した。選択培地(BHI)および非選択培地(BHI+D−アラニン)培地上にプレーティングした後に毎日CFUを決定した。プラスミドの喪失が非選択培地(BHI+D−アラニン)上へのプレーティング後のより高いCFUにつながることが予期された。図12Aに示されるとおり、選択培地と非選択培地の間でCFU数に差が無かった。このことは、実験が終了するときである少なくとも50世代にわたってプラスミドpAdv142が安定であったことを示唆する。
5×107CFUのLmddA−LLO−PSAをC57BL/6マウスに静脈内注入することによりインビボでのプラスミド維持を測定した。24時間および48時間の時点でPBS中に均質化した脾臓から生存可能な細菌を分離した。BHIプレートおよびBHI+100mg/ml D−アラニン上で各時点について各試料のCFUを決定した。選択培地および非選択培地への脾細胞のプレーティングの後、24時間後にコロニーを回収した。この株は非常に弱毒化されているため、インビボにおいて24時間で細菌負荷量が除去された。選択的プレートおよび非選択的プレートで有意なCFUの差は検出されず、単離された全ての細菌内での前記組換えプラスミドの安定した存在を示した(図12B)。
実施例10:LmddA−142(LmddA−LLO−PSA)株のインビボでの継代、病毒性およびクリアランス
実施例10:LmddA−142(LmddA−LLO−PSA)株のインビボでの継代、病毒性およびクリアランス
LmddA−142は、エピソーム的に発現されたtLLO−PSA融合タンパク質を分泌する組換え型リステリア株である。安全な用量を決定するために様々な用量のLmddA−LLO−PSAでマウスを免疫化し、毒性効果を決定した。LmddA−LLO−PSAは、最小限の毒性効果しか引き起こさなかった(データ非表示)。それらの結果より、108CFUの用量のLmddA−LLO−PSAはマウスによって充分に忍容されることが示唆された。病毒性研究によりLmddA−LLO−PSA株が非常に弱毒化されたことが示されている。
C57BL/6マウスに安全な用量108CFUを腹腔内投与した後での、LmddA−LLO−PSAのインビボクリアランスを決定した。2日後、LmddA−LLO−PSAで免疫されたマウスの肝臓および脾臓内には検出可能なコロニーが存在しなかった。この株は高度に弱毒化されているため、インビボで48時間の時点で完全に除去された(図13A)。
マクロファージに感染して細胞内で成長するLmddA−LLO−PSA株の能力がLmddA−LLO−PSAの弱毒化により低下するか決定するため、細胞感染アッセイを実施した。J774A.1などのマウスのマクロファージ様細胞株にリステリア構成体をインビトロで感染させ、細胞内増殖を定量した。陽性対照株である野生型リステリア株10403Sは細胞内で増殖し、prfA変異体である陰性対照XFL7は、ファゴリソソームを回避することができず、したがってJ774細胞内で増殖しない。LmddA−LLO−PSAの細胞質内増殖は、細胞から細胞へと伝播するこの株の能力が失われているため、10403Sよりも遅かった(図13B)。それらの結果は、LmddA−LLO−PSAがマクロファージに感染し、細胞質内で増殖する能力を持っていることを示す。
実施例11:C57BL/6 マウスにおけるLmddA−LLO−PSA株の免疫原性
実施例11:C57BL/6 マウスにおけるLmddA−LLO−PSA株の免疫原性
C57BL/6 マウス内でLmddA−LLO−PSAコンストラクトにより誘発されたPSA特異的免疫応答を、PSA四量体染色を用いて決定した。1週間の間隔でマウスをLmddA−LLO−PSAで2回免疫し、追加免疫から6日後にPSA四量体について脾細胞を染色した。PSA特異的四量体についての脾細胞の染色により、LmddA−LLO−PSAがPSA四量体+CD8+CD62Llow細胞の23%を誘発することが示された(図14A)。PSAペプチドでの5時間にわたる刺激後にIFN−γを分泌するPSA特異的T細胞の機能的能力を、細胞内サイトカイン染色を使用して検査した。LmddA−LLO−PSA群ではPSAペプチドで刺激されたCD8+CD62LlowIFN−γ分泌細胞のパーセンテージの、未感作マウスと比較して200倍の増加があり(図14B)、これはLmddA−LLO−PSA株が非常に免疫原性であり、且つ、脾臓内でPSAに対して高レベルの機能的に活性的なPSA CD8+T細胞応答を引き起こすことを示している。
LmddA−LLO−PSAでマウスを免疫した後でPSAに対して生成された細胞傷害性T細胞の機能的活性を決定するため、我々は瞬間的にH−2Dbペプチドで処理されたEL4細胞を溶解するPSA特異的CTLの能力をインビトロアッセイで試験した。FACSベースのカスパーゼアッセイ(図14C)およびユーロピウム放出(図14D)を用いて細胞溶解を測定した。LmddA−LLO−PSAで免疫されたマウスの脾細胞は、PSAペプチドを標的抗原として提示する細胞に対して高い細胞溶解活性を持つCTLを含んだ。
抗原で24時間にわたって刺激した後、IFN−γを分泌するエフェクターT細胞の機能的能力を決定するためにELISpotを実施した。ELISpotを用いると、特異的ペプチドで刺激されたLmddA−LLO−PSAで免疫されたマウスに由来する脾細胞におけるIFN−γのスポット数の20倍の増加が、未感作マウスの脾細胞と比較すると観察された(図14E)。
実施例12:LmddA−142株での免疫によりPSAを発現する腫瘍の退行およびPSA特異的CTLによる腫瘍の浸潤が誘導される。
実施例12:LmddA−142株での免疫によりPSAを発現する腫瘍の退行およびPSA特異的CTLによる腫瘍の浸潤が誘導される。
PSAを発現するように改変された前立腺腺癌細胞株(Tramp−C1−PSA(TPSA);Shahabi et al., 2008)を使用してLmddA−142(LmddA−LLO−PSA)コンストラクトの治療効力を決定した。マウスに2×106のTPSA細胞を皮下移植した。腫瘍接種後6日目に腫瘍が4〜6mmの触知可能なサイズに達したとき、1週間の間隔でマウスを3回にわたって108CFUのLmddA−142で免疫するか、107CFUのLm−LLO−PSA(陽性対照)で免疫するか、または未処置のままとした。未感作マウスは腫瘍を徐々に増殖させた(図15A)。LmddA−142で免疫されたマウスでは全てに35日目まで腫瘍が無く、8匹のうち3匹のマウスが腫瘍を徐々に増殖させたが、それらの腫瘍は未感作マウスと比較してずっと遅い速度で増殖した(図15B)。8匹のうち5匹のマウスが70日目まで腫瘍が無いままであった。予期されたとおり、Lm−LLO−PSAワクチン接種マウスには未感作対照よりも腫瘍が少なく、対照におけるものよりも遅く腫瘍が増殖した(図15C)。したがって、LmddA−LLO−PSAコンストラクトは、TPSA細胞株によって確立された腫瘍の60%を退行させ、且つ、他のマウスでは腫瘍の増殖を遅らせることができた。腫瘍が無いまま治癒したマウスは68日目にTPSA腫瘍に再曝露された。
無処置群(図15A)で起こらなかったことと比べると、LmddA−142によるマウスの免疫により実験動物の60%超(図15B)において、PSAを発現するよう改変されて7日間で確立されたTramp−C1腫瘍の増殖を抑制し、それらの腫瘍の退行を誘導することができる。非常に弱毒化されたベクター(LmddA)およびpADV142プラスミド(表2)を使用してLmddA−142を構築した。
さらに、LmddA−LLO−PSAコンストラクトによって生成されたPSA特異的CD8リンパ球の腫瘍浸潤能力を調査した。マウスに腫瘍およびマトリゲルの混合物を皮下移植した後、7日間の間隔でマウスを未感作にするか、または対照(Lm−LLO−E7)リステリアもしくはLmddA−LLO−PSAで2回免疫した。21日目に腫瘍を切除し、それらの腫瘍に浸潤しているCD8+CD62LlowPSA四量体+とCD4+CD25+FoxP3+の制御性T細胞集団についてそれらの腫瘍を分析した。
未感作マウスおよびLm−LLO−E7対照で免疫されたマウスの両方に存在する非常に少数のPSA特異的CD8+CD62LlowPSA四量体+腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)が観察された。ところが、LmddA−LLO−PSAで免疫されたマウスではPSA特異的CD8+CD62LlowPSA四量体+TILのパーセンテージに10〜30倍の増加があった(図7A)。興味深いことに、脾臓内のCD8+CD62LlowPSA四量体+細胞集団は腫瘍内よりも7.5倍少なかった(図16A)。
加えて、無処置マウスおよびリステリアで免疫されたマウスの腫瘍内でのCD4+/CD25+/FoxP3+制御性T細胞(Treg)の存在が決定された。興味深いことに、リステリアでの免疫によって脾臓内ではなく腫瘍内のCD4+CD25+FoxP3+Tregの数にかなりの減少が生じた(図16B)。ところが、LmddA−LLO−PSAコンストラクトは、未感作群およびLm−LLO−E7免疫群と比較されると腫瘍内でのCD4+CD25+FoxP3+Tregの頻度の減少に強力な影響を有した(図16B)。
よって、LmddA−142免疫療法は、腫瘍部位を浸潤することができるPSA特異的CD8+T細胞を誘導できる(図16A)。興味深いことに、LmddA−142での免疫は、腫瘍内での制御性T細胞数の減少に関連し(図16B)、おそらく、効率的な抗腫瘍CTL活性にとってより好ましい環境がその免疫により創出される。
実施例13:Lmdd−143およびLmddA−143は、PSA融合にもかかわらず機能的なLLOを分泌する。
実施例13:Lmdd−143およびLmddA−143は、PSA融合にもかかわらず機能的なLLOを分泌する。
Lmdd−143およびLmddA−143は、相同組換えにより染色体中のhly遺伝子の下流にインフレームで挿入されたPSAタンパク質をコードする全長型ヒトklk3遺伝子を含む。これらのコンストラクトは、温度感受性レプリコンを有し、hly−klk3−mpl組換えカセットを保有するpKSV7プラスミド(Smith and Youngman, Biochimie. 1992; 74(7−8) p705−711)を使用する相同組換えにより作製された。その第2の組換え事象後のプラスミドの切除のため、組込みの選択に使用される抗生物質耐性マーカーが失われている。さらに、LmddA−143株ではactA遺伝子が欠失している(図17A)。両方のコンストラクトにおいてhlyとインフレームのklk3の染色体への挿入をPCR(図17B)とシーケンシング(データ非表示)により確認した。
これらの染色体コンストラクトの一つの重要な面は、LLO−PSAが生成されてもファゴソームからのリステリアの回避、細胞質侵入、およびL.モノサイトゲネスによって生じる効率的な免疫に必要とされるLLOの機能が完全には消滅しないことである。Lmdd−143およびLmddA−143の培養上清由来の分泌タンパク質のウエスタンブロット分析によりLLO−PSA融合タンパク質に対応する約81kDaのバンドおよびLLOの期待サイズである約60kDaのバンド(図18A)が明らかになり、LLOがL.モノサイトゲネスによってLLO−PSA融合体から切断されるか、または染色体中での融合遺伝子にもかかわらずなおも単一のタンパク質として産生されるかのどちらかであることがこれにより示された。野生型L.モノサイトゲネス10403Sと比較して、Lmdd−143およびLmddA−143によって分泌されたLLOは50%の溶血活性を保持した(図18B)。これらの結果と一致して、Lmdd−143とLmddA−143の両方がマクロファージ様J774細胞株において細胞内で複製可能であった(図18C)。
実施例14:Lmdd−143とLmddA−143の両方がPSA抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発する。
実施例14:Lmdd−143とLmddA−143の両方がPSA抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発する。
Lmdd−143とLmddA−143の両方がLLOに融合されたPSAを分泌できることを示した後、これらの株がPSA特異的免疫応答をインビボで誘導できるかという問題を調査した。C57BL/6マウスを未処置のままにするか、またはLmdd−143、LmddA−143、もしくはLmddA−142で2回免疫した PSA特異的CD8+T細胞応答をPSA65〜74ペプチドでの脾細胞の刺激、およびIFN−γについての細胞内染色により測定した。図19に示されるとおり、染色体ベクターおよびプラスミドベースのベクターにより誘導された免疫応答は同様である。
材料および方法(実施例15〜20)
材料および方法(実施例15〜20)
オリゴヌクレオチドはInvitrogen(カリフォルニア州カールスバッド)によって合成され、DNA配列決定はGenewiz Inc(米国ニュージャージー州サウスプレインフィールド)によって行われた。フローサイトメトリー試薬をBecton Dickinson Biosciences(BD、カリフォルニア州サンディエゴ)から購入した。細胞培養培地、添加物、および他の全ての試薬は、表示されない限り、Sigma(米国ミズーリ州セントルイス)のものである。Her2/neu HLA−A2ペプチドはEZbiolabs(米国インディアナ州ウェストフィールド)によって合成された。完全RPMI1640(C−RPMI)培地は2mMのグルタミン、0.1mMの非必須アミノ酸、および1mMのピルビン酸ナトリウム、10%のウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、Hepes(25mM)を含有した。ポリクローナル抗LLO抗体は以前に記載があるものであり、抗Her2/neu抗体はSigmaから購入されたものである。
マウスおよび細胞株
マウスおよび細胞株
全ての動物実験はペンシルバニア大学またはラトガース大学のIACUCによって認可されたプロトコルに従って実施された。FVB/NマウスはJackson laboratories(米国メーン州バーハーバー)から購入された。ラットHer2/neu癌タンパク質を過剰発現するFVB/N Her2/neuトランスジェニックマウスはペンシルバニア大学の実験動物コア施設で収容および飼育された。NT−2腫瘍細胞株は高レベルのラットHer2/neuタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述されたように培養された。DHFR−G8(3T3/neu)細胞はATCCから入手され、ATCCの推奨に従って培養された。EMT6−Luc細胞株はJohn Ohlfest博士(ミネソタ大学、ミネソタ州)からの寛大な供与物であり、完全C−RPMI培地中で培養された。生物発光作業はペンシルバニア大学(米国ペンシルバニア州フィラデルフィア)の小動物撮像施設(SAIF)による指導の下で実行された。
リステリア構成体および抗原発現
リステリア構成体および抗原発現
Her2/neu−pGEM7Zは親切にもペンシルバニア大学のMark Greene博士によって供与され、これはpGEM7Zプラスミド(Promega、ウィスコンシン州マディソン)にクローニングされた全長のヒトHer2/neu(hHer2)遺伝子を含んだ。pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)および表4に示されるオリゴを使用するPCRによってhHer−2/neuの3つの部分、すなわちEC1、EC2、およびIC1を増幅するためのテンプレートとしてこのプラスミドを使用した。
表4:ヒトHer−2−キメラのクローニング用のプライマー
Her−2/neuキメラコンストラクトは、SOEing PCR法およびテンプレートとしてそれぞれ分かれているhHer−2/neu部分による直接融合によって作製された。プライマーが表5に示されている。
表5
異なる部分のヒトHer2領域の増幅のためのプライマーの配列
ChHer2遺伝子を、XhoIおよびSpeI制限酵素を使用してpAdv138から切り出し、LmddシャトルベクターであるpAdv134中にLLOの短縮型非溶血性断片とインフレームでクローニングした。挿入断片、LLO、およびhlyプロモーターの配列をDNAシークエンシング分析によって確認した。エレクトロコンピテントactA、dal、dat突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、すなわちLmddAにこのプラスミドを電気穿孔により導入し、ストレプトマイシン(250μg/mL)を含有するブレインハートインフージョン(BHI)寒天プレート上で陽性クローンを選択した。幾つかの実験ではhHer2/neu(Lm−hHer2)断片を発現する類似のリステリア株を比較目的で使用した。全ての試験研究において、免疫系に対するリステリアの抗原非依存的効果を説明するために無関連のリステリア構成体(Lm対照)を含めた。Lm対照はADXS31−164(LmddA−ChHer2)と同一のリステリアプラットフォームに基づいているが、HPV16−E7またはNY−ESO−1などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現と分泌を試験した。各構成体をインビボで2回継代した。
細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイ
3〜5匹のFVB/Nマウスからなる群を、1×108コロニー形成単位(CFU)のLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164、Lm−hHer2 ICI、またはLm対照(無関連抗原を発現する)を用いて1週間の間隔で3回免疫するか、または未感作のままとした。NT−2細胞をインビトロで培養し、トリプシンにより剥離し、マイトマイシンC(無血清C−RPMI培地中に250μg/mL)で37℃において45分間にわたって処置した。これらの細胞を5回洗浄した後、免疫した動物または未感作動物から採取された脾細胞と1:5の比率(スティミュレーター:レスポンダー)で5日間にわたり37℃および5%CO2で共培養した。以前に記載された方法に従い、標的としてのユーロピウム標識3T3/neu(DHFR−G8)細胞を使用して標準的な細胞傷害性アッセイを実施した。分光光度計(Perkin Elmer、Victor2)を590nmにて使用して、4時間の培養の後に死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。比溶解率を(実験群での溶解−自然発生的溶解)/(最大溶解−自然発生的溶解)として定義した。
免疫されたマウスに由来する脾細胞によるインターフェロン−γの分泌
免疫されたマウスに由来する脾細胞によるインターフェロン−γの分泌
3〜5匹のFVB/NマウスまたはHLA−A2トランスジェニックマウスからなる群を、1×108CFUのADXS31−164、陰性リステリア対照(無関連抗原を発現する)を用いて1週間の間隔で3回免疫するか、または未感作のままとした。最後の免疫の1週間後、FVB/Nマウスに由来する脾細胞を単離し、C−RPMI培地中にマイトマイシンCで処置されたNT−2細胞が存在する状態で5×106細胞/ウェルの割合で24ウェルプレートにおいて共培養した。HLA−A2トランスジェニックマウスに由来する脾細胞は、1μMのHLA−A2特異的なペプチド、または大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された1μg/mLの組換え型Hisタグ付きChHer2タンパク質が存在する状態で培養された。上清のサンプルを24時間後または72時間後に取得し、製造業者の推奨に従ってマウスIFN−γ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを使用してインターフェロン−γ(IFN−γ)の存在について試験した。
Her2トランスジェニック動物での腫瘍研究
Her2トランスジェニック動物での腫瘍研究
6週齢のFVB/NラットHer2/neuトランスジェニックマウス(9〜14匹/群)を5×108CFUのLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164、またはLm対照で6回免疫した。これらのマウスを自然発生的乳腺腫瘍の出現について週に2回観察し、最高52週間まで電子カリパスを使用してそれらの腫瘍を測定した。平均直径が1cm2のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を摘出し、RNAlater中に−20℃で保存した。これらの腫瘍のエスケープに対するHer2/neuタンパク質内の突然変異の効果を決定するため、ゲノムDNA単離キットを使用してゲノムDNAを抽出し、配列決定した。
脾臓および腫瘍内の制御性T細胞に対するADXS31−164の効果
脾臓および腫瘍内の制御性T細胞に対するADXS31−164の効果
マウスに1×106細胞のNT−2細胞を皮下(s.c.)移植した。7日目、14日目、および21日目にこれらのマウスを1×108CFUのADXS31−164またはLmddA対照で免疫するか、または未感作のままにした。28日目に腫瘍および脾臓を摘出し、FACS分析によってCD3+/CD4+/FoxP3+Tregの存在について検査した。簡潔に述べると、C−RPMI培地中で2枚のスライドグラスの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を単離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、PBS中にDNase(12U/mL)およびコラゲナーゼ(2mg/mL)を含有するバッファーを用いてそれらを消化した。室温にて撹拌しながら60分間インキュベーションした後、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をRBC溶解バッファーによって溶解し、続いて10%FBSを含有する完全RPMI−1640培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通す濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をFACSバッファー(2%FBS/PBS)中に再懸濁し、抗CD3−PerCP−Cy5.5抗体、抗CD4−FITC抗体、抗CD25−APC抗体で染色し、続いて透過処理し、そして抗Foxp3−PEで染色した。4カラーFACSキャリバー(BD)を使用してフローサイトメトリー分析を実施し、cell questソフトウェア(BD)を使用してデータを分析した。
統計分析
統計分析
生存データについてログランクχ二乗検定を使用し、三回行われたCTLアッセイおよびELISAアッセイについてスチューデントのt検定を使用した。これらの分析では0.05未満のp値(*印をつけた)を統計的に有意であると考えた。Prismソフトウェア、V.4.0a(2006)またはSPSSソフトウェア、V.15.0(2006)のどちらかを用いて全ての統計分析を行った。別段の記載がない限り、我々は全てのFVB/NラットHer2/neuトランスジェニック試験研究のために群あたり8〜14匹のマウスを使用し、全ての野生型FVB/N研究のために群あたり少なくとも8匹のマウスを使用した。Her2/neuトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍試験研究を除き、全ての研究を少なくとも1回は繰り返した。
実施例15:Her−2断片に融合されたLLO断片を分泌するL.モノサイトゲネス株の生成:ADXS31−164の構築
実施例15:Her−2断片に融合されたLLO断片を分泌するL.モノサイトゲネス株の生成:ADXS31−164の構築
キメラHer2/neu遺伝子(ChHer2)の構築は以下の通りであった。簡潔に述べると、ChHer2遺伝子は、SOEing PCR法によるHer2/neuタンパク質の2つの細胞外断片(aa40〜170およびaa359〜433)と1つの細胞内断片(aa678〜808)の直接融合によって作製された。そのキメラタンパク質はそのタンパク質の既知のヒトMHCクラスIエピトープの大半を有する。ChHer2遺伝子をpAdv138プラスミド(Lm−LLO−ChHer2の構築に使用された)から切り出し、LmddAシャトルプラスミドにクローニングし、それによりプラスミドpAdv164を得た(図20A)。これらの2つのプラスミド骨格の間には2つの大きい違いがある。1)pAdv138が組換え型細菌のインビトロ選別のためにクロラムフェニコール耐性マーカー(cat)を使用するのに対し、pAdv164は枯草菌由来のD−アラニンラセマーゼ遺伝子(dal)を保持し、その遺伝子がdal−dat遺伝子を持たないLmddA株でのインビトロ選別とインビボプラスミド保持のために代謝経路の相補を利用する。この免疫療法プラットフォームは、改変リステリア株の抗生物質耐性についてのFDAの憂慮に対処するために設計および開発された。2)prfA遺伝子はLmdd株のインビボでの相補に必要ではないので、pAdv138とは異なりpAdv164はそのプラスミド中にこの遺伝子のコピーを保持しない(以下の配列および図20Aを参照されたい)。LmddA免疫療法株はactA遺伝子(リステリアの細胞内運動および細胞から細胞への伝播に関係する)も欠いており、そのためにこのバックボーンに由来する組換え型免疫療法株はその親株であるLmddに由来する株よりも病原性が100倍弱い。LmddAベースの免疫療法はまた、免疫されたマウスの脾臓に由来するLmddベースの免疫療法よりもずっと速く(48時間未満の間に)除去される。この株からの融合タンパク質tLLO−ChHer2の発現と分泌は、ウエスタンブロット分析を用いて約104KDのバンドが抗LLO抗体によって検出されたように、インビトロで8時間培養した後のTCA沈殿した細胞培養上清の中のLm−LLO−ChHer2のもの(図20B)と同等であった。陰性対照としてtLLOのみを発現するリステリアバックボーン株を使用した。
pAdv164配列(7075塩基対)(図20Aおよび図20Bを参照されたい):
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(配列番号87)
実施例16:ADXS31−164はLm−LLO−ChHER2と同じく免疫原性である
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(配列番号87)
実施例16:ADXS31−164はLm−LLO−ChHER2と同じく免疫原性である
抗Her2/neu特異的細胞傷害性T細胞の生成に関するADXS31−164の免疫原性を標準的なCTLアッセイでLm−LLO−ChHer2免疫療法のものと比較した。両方の免疫療法により、3T3/neu標的細胞によって発現されるHer2/neu抗原に対する強力であるが同等の細胞傷害性T細胞応答が誘発された。したがって、LLOに融合されたHer2細胞内断片のみを発現するリステリアで免疫されたマウスは、より多くのMHCクラスIエピトープを含有するキメラよりも低い溶解活性を示した。未感作動物、または無関連のリステリアを注射されたマウスではCTL活性は検出されなかった(図21A)。ADXS31−164は野生型FVB/Nマウスに由来する脾細胞によるIFN−γの分泌を刺激することもできた(図21B)。これは、高レベルのHer2/neu抗原を発現するマイトマイシンCで処理されたNT−2細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清の中に検出された(図21C)。
ADXS31−164での免疫後のヒトMHCクラスIエピトープの適切なプロセッシングと提示をHLA−A2マウスで検査した。免疫されたHLA−A2遺伝子導入体に由来する脾細胞を、Her2/neu分子の細胞外ドメイン(配列番号59のHLYQGCQVVまたは配列番号60のKIFGSLAFL)または細胞内ドメイン(配列番号61のRLLQETELV)に位置するマップされたHLA−A2制限エピトープに対応するペプチドと共に72時間にわたって共培養した(図21C)。組換え型ChHer2タンパク質を陽性対照として使用し、無関連のペプチドまたはペプチド無しを陰性対照として使用した。この実験のデータは、標的とされた抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープに対する抗Her2/neu特異的免疫応答がADXS31−164により誘発され得ることを示している。
実施例17:ADXS31−164は自然発生的乳腺腫瘍の発症防止に関してLM−LLO−ChHER2よりも有効である
実施例17:ADXS31−164は自然発生的乳腺腫瘍の発症防止に関してLM−LLO−ChHER2よりも有効である
20〜25週齢でゆっくりと増殖する自然発生的乳腺腫瘍を発生するHer2/neuトランスジェニック動物においてADXS31−164の抗腫瘍効果をLm−LLO−ChHer2の抗腫瘍効果と比較した。無関連のリステリア対照免疫療法で免疫された全ての動物が21〜25週目の内に乳房腫瘍を発生し、33週目の前に殺処理された。対照的に、リステリア−Her2/neu組換え型免疫療法によって乳腺腫瘍形成の著しい遅延が生じた。45週目では、Lm−LLO−ChHer2で免疫されたマウスの25%と対照的に、ADXS31−164ワクチン接種マウスの50%超(9匹のうち5匹)に未だに腫瘍が無かった。52週目では、ADXS31−164で免疫された8匹のうち2匹のマウスがまだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験群の全てのマウスが既に病気のために死んでいた(図22)。これらの結果は、ADXS31−164は、より弱毒化されているにもかかわらず、Her2/neuトランスジェニック動物の自然発生的乳腺腫瘍の発症の防止に関してLm−LLO−ChHer2よりも有効であることを示している。
実施例18:ADXS31−164で免疫時のHER2/NEU遺伝子内の突然変異
実施例18:ADXS31−164で免疫時のHER2/NEU遺伝子内の突然変異
Her2/neuのMHCクラスIエピトープ内の突然変異は、小断片免疫療法で、またはHer2/neuの細胞外ドメイン内のエピトープを標的化するモノクローナル抗体であるトラスツズマブ(ハーセプチン)で免疫されたときの腫瘍エスケープに関係すると考えられている。これを評価するため、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム物質を抽出し、キメラ免疫療法または対照免疫療法で免疫された腫瘍内のneu遺伝子の対応する断片を配列決定した。どのワクチン接種されたた腫瘍試料のHer−2/neu遺伝子内にも突然変異が観察されなかった。これは代替的なエスケープ機構を示唆している(データを示さず)。
実施例19:ADXS31−164は腫瘍内制御性T細胞の著しい減少を引き起こす
実施例19:ADXS31−164は腫瘍内制御性T細胞の著しい減少を引き起こす
脾臓および腫瘍内での制御性T細胞の頻度に対するADXS31−164の効果を解明するため、マウスにNT−2腫瘍細胞を移植した。3回の免疫の後、脾細胞および腫瘍内リンパ球を単離し、Tregを染色し、これらがCD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+細胞として明らかにされたが、別々に分析したときにFoxP3マーカーまたはCD25マーカーのどちらかを用いて同等の結果が得られた。それらの結果は、無関連のリステリア免疫療法または未感作動物と比較すると、ADXS31−164での免疫は、脾臓内のTregの頻度に対して効果を有しないことを示した(図23)。対照的に、リステリア免疫療法での免疫は腫瘍内のTregの存在に少なからぬ影響を引き起こした(図24A)。無処置の腫瘍内の全CD3+T細胞の平均で19.0%がTregであったが、この頻度は無関連免疫療法については4.2%に減少し、ADXS31−164ついては3.4%に減少し、これは腫瘍内Treg頻度の5倍の減少であった(図24B)。LmddA免疫療法のいずれかで処置されたマウスにおける腫瘍内Treg頻度の減少を腫瘍サイズの差の原因とすることはできなかった。代表的実験では、ADXS31−164で免疫されたマウスの腫瘍(平均直径(mm)±SD:6.71±0.43、n=5)は、無処置マウスの腫瘍(8.69±0.98、n=5、p<0.01)または無関連の免疫療法で処置されたマウスの腫瘍(8.41±1.47、n=5、p=0.04)よりも有意に小さかったが、一方で後者のこれら2群の比較は腫瘍サイズの統計的有意差を示さなかった(p=0.73)。LmddA免疫療法で処置された腫瘍内のTregの頻度が低いほど腫瘍内のCD8/Treg比率が上昇した。これは、LmddA免疫療法での免疫後により好ましい腫瘍微小環境が得られることを示唆する。しかしながら、標的抗原HER2/neu(ADXS31−164)を発現する免疫療法だけが腫瘍増殖を低下させることができ、Tregの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示した。
実施例20:ADXS31−164での末梢免疫は転移性乳癌細胞株の脳内での増殖を遅延させることができる
実施例20:ADXS31−164での末梢免疫は転移性乳癌細胞株の脳内での増殖を遅延させることができる
ADXS31−164免疫療法または無関連のLm対照免疫療法でマウスを腹腔内免疫し、次いでルシフェラーゼおよび低レベルのHer2/neuを発現する5,000細胞のEMT6−Luc腫瘍細胞を頭蓋内に移植した(図25A)。麻酔されたマウスの生体外撮像によって接種後の様々な時点で腫瘍をモニターした。腫瘍接種後8日目に全ての対照動物で腫瘍が検出されたが、ADXS31−164群のマウスではどんな検出可能な腫瘍も示すマウスが無かった(図25Aおよび図25B)。腫瘍接種後11日目には陰性対照群の全てのマウスが既に腫瘍のために死んでいたが、ADXS31−164群の全てのマウスがまだ生存しており、腫瘍増殖の小さい兆候を示すのみであったので、ADXS31−164はこれらの腫瘍の発症を明らかに遅延させることができた。これらの結果は、ADXS31−164の末梢投与で得られた免疫応答が中枢神経系に到達し得る可能性があること、およびLmddAベースの免疫療法がCNS腫瘍の治療のために使用される可能性があり得ることを強く示唆する。
実施例21:ペプチド「ミニ遺伝子」発現系
材料および方法
実施例21:ペプチド「ミニ遺伝子」発現系
材料および方法
この発現系は、カルボキシ末端において独特のペプチド部分を含有する組換えタンパク質群のクローニングを促進するように設計されている。これは、テンプレートとしてSS−Ub−ペプチドコンストラクトのうちの1つをコードする配列を利用する単純なPCR反応によって達成される。Ub配列のカルボキシ末端領域にまで延びるプライマーを使用し、且つ、そのプライマーの3’端に所望のペプチド配列のためのコドンを導入することにより、一回のPCR反応で新しいSS−Ub−ペプチド配列を生成することができる。細菌プロモーターおよびActAシグナル配列の最初の数ヌクレオチドをコードする5’プライマーは、全てのコンストラクトに対して同一である。この戦略を使用して作製されたコンストラクトを図26A〜26Cに概略的に表す。この実施例では2つのコンストラクトを説明する。1つのコンストラクトはマウスMHCクラスI上に提示されるモデルペプチド抗原を含有し、第2のコンストラクトは、ヒト膠芽腫(GBM)TAAに由来するものなどの治療的に適切なペプチドが置換されることになる場所を示している。明確にするため、図26A〜Cで図示されているコンストラクトをActA1〜100分泌シグナルを含有するものとして指定した。しかしながら、同等の効果によってLLOベースの分泌シグナルが置き換わってもよい。
提案されている系の利点のうちの1つは、単一のリステリアベクターコンストラクトを使用して複数のペプチドを細胞に負荷することが可能になることである。複数のペプチドは、上述の単一ペプチド発現系の改造を用いて組換え型弱毒化リステリア(例えば、prfA突然変異リステリアまたはdal/dat/actA突然変異リステリア)の中に導入されることになる。1つの挿入断片の中にコードされる連続的なSS−Ub−ペプチド配列に由来する複数の別個のペプチドをコードするキメラタンパク質。シャイン・ダルガノリボソーム結合部位が各SS−Ub−ペプチドコード配列の前に導入されてそれらのペプチドコンストラクトの各々の別々の翻訳が可能になる。図26Cは、組換え型リステリアの1つの株から4つの別個のペプチド抗原を発現するように設計されたコンストラクトの概略図を示している。これは厳密には一般的な発現戦略を表したものであるので、公知のマウスまたはヒトの腫瘍関連抗原または感染症抗原に由来する4つの独特のMHCクラスI結合ペプチドが含まれている。
材料および方法(実施例22〜24)
材料および方法(実施例22〜24)
実施例7にpAdv142プラスミドおよびLmddA142株のことが記載されている。その他の詳細を以下に提供する。
pAdv142プラスミドおよびLmddA142株の構築
pAdv142プラスミドおよびLmddA142株の構築
このプラスミドはVerchらによって以前に構築された次世代の抗生物質を含まないプラスミドであるpTV3である。Lm−ddAは染色体中に1コピーのprfA遺伝子を含むので、病原性遺伝子転写活性化因子prfAの不必要なコピーをpTV3プラスミドから欠失した。したがって、そのdal含有プラスミド中にprfA遺伝子が存在することは必須ではなかった。さらに、NheI/PacI制限部位でのp60−リステリアdalのカセットをp60−枯草菌dal(dalBs)により置換してプラスミドpAdv134を得た。さらに、pAdv134をXhoI/XmaIで制限処理してヒトPSAであるklk3をクローニングしてプラスミドpAdv142を得た。その新しいプラスミドであるpAdv142(図11C)はdalBsを含んでおり、その発現はLm p60プロモーターの制御下にあった。そのシャトルプラスミドpAdv142は外因性D−アラニンの非存在下で大腸菌ala drx MB2159とLmddの両方の増殖を相補することができた。プラスミドpAdv142内の抗原発現カセットはhlyプロモータープロモーターおよびtLLO−PSA融合タンパク質から構成される(図27)。
プラスミドpAdv142でリステリアのバックグラウンド株であるLmddA株を形質転換してLmddA142またはADXS31−142を得た。ADXS31−142株によるLLO−PSA融合タンパク質の発現と分泌を、抗LLO抗体および抗PSA抗体を使用するウエスタンブロットにより確認した。それらは図11Dに示されている。C57BL/6マウスのインビボでの2継代後にADXS31−142株によるLLO−PSA融合タンパク質の安定した発現および分泌が存在した。
LmddA211株、LmddA223株、およびLmddA224株の構築
LmddA211株、LmddA223株、およびLmddA224株の構築
ActAタンパク質の異なる短縮断片を含む3種類の異なるプラスミドpAdv211、pAdv223、およびpAdv224を作製するために異なるActA/PEST領域をプラスミドpAdv142中にクローニングした。
LLOシグナル配列(LLOss)−ActAPEST2(pAdv211)/LmddA211
LLOシグナル配列(LLOss)−ActAPEST2(pAdv211)/LmddA211
25塩基の重複を用いるSOEing PCR法を用いて最初に2つの断片であるPsiI−LLOss−XbaI(817bpのサイズ)とLLOss−XbaI−ActA−PEST2(602bpのサイズ)を増幅し、次に一つに融合した。このPCR産物はこの時点で762bpのサイズの断片であるPsiI−LLOss−Xbal−ActAPEST2−XhoIを含んでいる。その新しいPsiI−LLOss−Xbal−ActAPEST2−XhoI PCR産物およびpAdv142(LmddA−PSA)プラスミドをPsiI/XhoI制限酵素で消化し、そして精製した。ライゲーションを行い、MB2159エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、そしてLB寒天プレート上に播種した。PsiI−LLOss−Xbal−ActAPEST2/pAdv142(PSA)クローンを挿入断片特異的PCR反応により選択およびスクリーニングし、PsiI−LLOss−Xbal−ActAPEST2/pAdv142(PSA)クローンの9番、10番が陽性であり、そのプラスミドをミニプレップ精製した。PCRスクリーニングによるそれらのクローンのスクリーニングの後、陽性クローンの挿入断片を配列決定した。pAdv211.10と呼ばれるプラスミドPsiI−LLOss−Xbal−ActAPEST2/pAdv142(PSA)でリステリアLmddA突然変異体エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、BHI/ストレプトマイシン寒天プレート上に播種した。生じたLmddA211株をコロニーPCRによりスクリーニングした。幾つかのリステリアコロニーを内在性LLOタンパク質とActAPEST2−PSA(LA229−PSA)タンパク質の発現と分泌について選択およびスクリーニングした。マウスのインビボでの2継代後にActAPEST2−PSA融合タンパク質の安定した発現が存在した。
LLOss−ActAPEST3およびPEST4:
LLOss−ActAPEST3およびPEST4:
ActAPEST3断片とActAPEST4断片をPCR法により作製した。LLOss−XbaI−ActAPEST3−XhoI断片(839bpのサイズ)とLLOss−XbaI−ActAPEST4−XhoI断片(1146bpのサイズ)を含むPCR産物をpAdv142中にクローニングした。生じたプラスミドpAdv223(PsiI−LLOss−Xbal−ActAPEST3−XhoI/pAdv142)クローンおよびpAdv224(PsiI−LLOss−Xbal−ActAPEST4/pAdv142)クローンを挿入断片特異的PCR反応により選択およびスクリーニングした。それらのpAdv223およびpAdv224プラスミドでLmddAバックボーンを形質転換してそれぞれLmddA223およびLmddA224が生じた。幾つかのリステリアコロニーを内在性LLOタンパク質、ActAPEST3−PSA(LmddA223)タンパク質、またはActAPEST4−PSA(LmddA224)タンパク質の発現と分泌について選択およびスクリーニングした。マウスのインビボでの2継代後に融合タンパク質ActAPEST3−PSA(LmddA223)またはActAPEST4−PSA(LmddA224)の安定した発現と分泌が存在した。
実験プラン1
実験プラン1
TPSA23(PSA発現性腫瘍モデル)を使用するActA−PEST−PSA(PEST3配列、PEST2配列、およびPEST4配列)およびtLLO−PSAの治療効力を評価および比較した。無処置マウスを対照群として使用した。インターフェロンγの細胞内サイトカイン染色およびPSA四量体染色も用いて免疫応答を並行して評価した。
腫瘍退行試験のために
腫瘍退行試験のために
8匹のC57BL/6マウス(7週齢のオス)からなる10群に1×106細胞のTPSA23細胞を0日目に皮下移植した。6日目にそれらのマウスは免疫を受け、それに続いて1週間離れている2回の追加用量を受けた。腫瘍が平均直径で1.2cmのサイズに到達するまで毎週腫瘍増殖をモニターした。
免疫原性試験
免疫原性試験
2群のC57BL/6マウス(7週齢のオス)を下の表に記載される免疫療法で1週間の間隔で3回にわたり免疫した。最後の追加免疫注射から6日後、マウスを殺処理し、脾臓を採取し、四量体染色および細胞内サイトカイン染色によるIFN−γ分泌に関して免疫応答を検査した。
実験プラン2
実験プラン2
この実験は実験プラン1の繰返しであるが、未感作群、tLLO群、ActA/PEST2−PSA群、およびtLLO−PSA群だけが含まれた。実験プラン1と同様に、TPSA23(PSA発現性腫瘍モデル)を使用して治療効力を評価した。群当たり5匹のC57BL/6マウスに1×106細胞のTPSA23細胞を0日目に皮下移植した。6日目にそれらのマウスは免疫(1×108CFU/mL)を受け、それに続いて1週間後に追加免疫を受けた。最後の処置から6日目に脾臓と腫瘍を採取した。脾臓と腫瘍の両方においてPSA五量体染色を用いて免疫応答をモニターした。
材料および方法:
材料および方法:
TPSA23細胞を完全培地中で培養する。マウスに腫瘍細胞を移植する2日前にTPSA23細胞を完全培地中に継代培養した。実験当日(0日目)に細胞をトリプシン処理し、PBSで二回洗浄した。細胞を計数し、注射用にマウス当たり200ulのPBS中に1×106細胞の濃度で再懸濁した。各マウスの脇腹に腫瘍細胞を皮下注射した。
TPSA23細胞用の完全培地
TPSA23細胞用の完全培地
430mlのグルコース含有DMEM、45mlのウシ胎児血清(FCS)、25mlのヌー・セラムIV、5mlの100×L−グルタミン、5mlの100mMピルビン酸ナトリウム、5mlの10,000U/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを混合することによりTPSA23細胞用の完全培地を調製した。細胞を分割する間に0.005mg/mlのウシインスリンおよび10nMのデヒドロイソアンドロステロンをフラスコに添加した。
脾細胞用の完全培地(c−RPMI)
脾細胞用の完全培地(c−RPMI)
450mlのRPMI1640、50mlのウシ胎児血清(FCS)、5mlの1M HEPES、5mlの100×非必須アミノ酸(NEAA)、5mlの100×L−グルタミン、5mlの100mMピルビン酸ナトリウム、5mlの10,000U/mLのペニシリン/ストレプトマイシンおよび129ulの14.6Mの2−メルカプトエタノールを混合することにより完全培地を調製した。
単離された脾細胞の調製
単離された脾細胞の調製
生物安全フード内で作業を行った。滅菌したピンセットとハサミを使用して実験マウス群と対照マウス群から脾臓を採取した。10mlのPBSを含む15mlのチューブに入れてそれらの脾臓を実験室に運んだ。各マウスの脾臓を別々に処理した。脾臓を無菌ペトリ皿に取り、3mLの注射筒のピストン棒の後端を使用してすりつぶした。10mlのRPMI1640を含む15mlのチューブに脾臓細胞を移した。4℃で5分間にわたる1,000RPMでの遠心分離により細胞を沈殿させた。10%の漂白剤中に上清を捨てた。タッピングで細胞ペレットを穏やかに壊した。脾臓当たり2mlのRBC溶解緩衝液をその細胞ペレットに添加することによりRBCを溶解した。RBCは2分間で溶解された。すぐに10mlのc−RPMI培地をその細胞懸濁液に添加してRBC溶解緩衝液を不活化した。4℃で5分間にわたる1,000RPMでの遠心分離により細胞を沈殿させた。上清を捨て、細胞ペレットを10mlのc−RPMI中に再懸濁し、セルストレーナーに通した。血球計算盤を使用して細胞を計数し、10ulの細胞懸濁液を90ulのトリパンブルー染色液と混合して生存度をチェックした。約2×106細胞を五量体染色に使用した。(注記:各脾臓は1〜2×108細胞を産するはずである)。
ミルテニー・マウス腫瘍解離キットを使用する腫瘍からの単細胞懸濁液の調製
ミルテニー・マウス腫瘍解離キットを使用する腫瘍からの単細胞懸濁液の調製
2.35mlのRPMI1640、100μLの酵素D、50μLの酵素R、および12.5μLの酵素AをgentleMACS Cチューブに加えることにより酵素ミックスを調製した。腫瘍(0.04〜1g)を2〜4mmの小片に切断し、酵素ミックスを含むgentleMACS Cチューブに移した。そのチューブの上端を下にしてgentleMACSディソシエーターの筒状ケースに取り付け、プログラムm_impTumor_02を実行した。プログラムの終了後、CチューブをgentleMACSディソシエーターから取り外した。MACSmixチューブローテーターを使用して連続的に回転させながら試料を37℃で40分間にわたってインキュベートした。インキュベーションの完了後に再びCチューブの上端を下にしてgentleMACSディソシエーターの筒状ケースに取り付け、プログラムm_impTumor_03を2回実行した。15mLのチューブ上に置かれた70μmフィルターにその細胞懸濁液を通した。そのフィルターも10mlのRPMI1640で洗浄した。細胞を300×gで7分間にわたって遠心分離した。上清を捨て、細胞を10mlのRPMI1640中に再懸濁した。この時点でそれらの細胞を五量体染色のために分割することができる。
脾細胞の五量体染色
脾細胞の五量体染色
ProImmune社の市販のPSA−H−2Db五量体を使用して製造業者が推奨するプロトコルを用いてPSA特異的T細胞を検出した。CD8、CD62L、CD3、および五量体について脾細胞を染色した。一方でCD8、CD62L、CD45、および五量体について腫瘍細胞を染色した。CD3+CD8+CD62Llow細胞をゲーティングで絞り込んでCD3+CD8+CD62LlowPSA五量体+細胞の頻度を決定した。Cell questソフトウェアを使用してFACS Calibur上で染色細胞を取得および分析した。
五量体染色に必要な材料
五量体染色に必要な材料
脾細胞(上記の調製物)、Pro5(登録商標)PE結合組換えMHC PSA五量体 (注記:蓋をきつく締め、暗所に4℃で一貫して五量体ストックが保存されることを確実にされたい)、PerCP Cy5.5結合抗CD3抗体、FITC結合抗CD8抗体およびAPC結合抗CD62L抗体、洗浄緩衝液(PBS中の0.1%BSA)および固定溶液(PBS中の1%熱不活化ウシ胎児血清(HI−FCBS)、2.5%ホルムアルデヒド)
標準的染色プロトコル
標準的染色プロトコル
Pro5(登録商標)PSA五量体を冷却済みマイクロ遠心分離機中で5〜10分間にわたって14,000×gで遠心分離してその溶液中に存在するあらゆるタンパク質凝集物を除去した。これらの凝集物は、検査容量中に含まれていると非特異的染色の原因となる場合がある。染色条件当たり2×106脾細胞を割り当て、チューブ当たり1mlの洗浄緩衝液を加えた。細胞を4℃の冷却済み遠心分離機中で5分間にわたって500×gで遠心分離した。細胞ペレットを残留量(約50μl)中に再懸濁した。別段の表示がある場合を除き、その後の全てのステップについて全てのチューブを氷上で冷やした。10μLの標識済み五量体を細胞に添加し、ピペット操作により混合した。それらの細胞を光から遮断して室温(22℃)で10分間にわたってインキュベートした。細胞をチューブ当たり2mlの洗浄緩衝液で洗浄し、残留液(約50μl)中に再懸濁した。最適量の抗CD3抗体、抗CD8抗体、および抗CD62L抗体(1:100希釈)を添加し、ピペット操作により混合した。単染色対照試料もこの時点で作製した。試料を光から遮断して20分間にわたって氷上に放置した。細胞をチューブ当たり2mlの洗浄緩衝液で二回洗浄した。細胞ペレットを残留量(約50μl)中に再懸濁した。200μLの固定溶液を各チューブに添加し、ボルテックス混合した。データ取得の準備ができるまでそれらのチューブを冷蔵庫内に暗くして保存した。(注記:細胞の形態が固定後に変化するので、データ取得に進む前に3時間にわたって試料を放置することが得策である。試料は最大で2日間にわたって保存可能である)。
細胞内サイトカイン染色(IFN−γ)プロトコル:
細胞内サイトカイン染色(IFN−γ)プロトコル:
2×107細胞/ml脾細胞をFACSチューブ中に取り、100μLのブレフェルジンA(BD Golgi Plug)をそのチューブに添加した。刺激のために2μMのペプチドをそのチューブに添加し、細胞を室温で10〜15分間にわたってインキュベートした。陽性対照試料についてはPMA(10ng/ml)(2×)とイオノマイシン(1μg/ml)(2×)を対応するチューブに添加した。各処理に由来する100μLの培地をU字底96ウェルプレートの対応するウェルに添加した。100μLの細胞を対応するウェルに添加した(培地+細胞で200μlの終体積)。そのプレートを2分間にわたって600rpmで遠心分離し、37℃、5%CO2で5時間にわたってインキュベートした。そのプレートの内容物をFACSチューブに移した。1mlのFACS緩衝液を各チューブに添加し、5分間にわたって1200rpmで遠心分離した。上清を捨てた。200μLの2.4G2上清および10μLのウサギ血清をそれらの細胞に添加し、室温で10分間にわたってインキュベートした。それらの細胞を1mLのFACS緩衝液で洗浄した。それらの細胞を1200rpmで5分間にわたる遠心分離により収集した。フルオロクローム結合モノクローナル抗体(CD8 FITC、CD3 PerCP−Cy5.5、CD62L APC)を含む50μLのFACS緩衝液中に細胞を懸濁し、暗所で30分間にわたって4℃でインキュベートした。細胞を1mLのFACS緩衝液で二回洗浄し、200μLの4%ホルマリン溶液中に再懸濁し、20分間にわたって4℃でインキュベートした。それらの細胞を1mLのFACS緩衝液で二回洗浄し、BD Perm/Wash(0.25ml/チューブ)中に15分間にわたって再懸濁した。細胞を遠心分離により収集し、目的のサイトカインに対するフルオロクローム結合モノクローナル抗体(IFNg−PE)を含む50μLのBD Perm/Wash溶液中に再懸濁した。それらの細胞を暗所で30分間にわたって4℃でインキュベートした。BD Perm/Wash(チューブ当たり1ml)を使用して細胞を二回洗浄し、分析前に200μlのFACS緩衝液中に再懸濁した。
結果
実施例22:組換え型リステリア構成体を用いるワクチン接種により腫瘍退行が生じる
結果
実施例22:組換え型リステリア構成体を用いるワクチン接種により腫瘍退行が生じる
1週目までに全ての群が2〜3mmの平均サイズを有する腫瘍を発生させたことがデータにより示された。3週目(20日目)にActA/PEST2(「LA229」としても知られる)−PSA、ActA/PEST3−PSAおよびActA/PEST3−PSA、およびPSAに融合されたtLLOを発現するLmddA−142(ADXS31−142)で免疫されたマウスが腫瘍退行および腫瘍増殖の遅延を示した。6週目までに未感作群の全てのマウスとActAPEST4−PSA処置群の大半が大きな腫瘍を有し、安楽死させられねばならなかった(図28A)。ところが、LmddA−142マウス群、ActA−PEST2マウス群、およびActA−PEST3マウス群はより良好な腫瘍退行と生存率を示した(図28Aおよび図28B)。
実施例23:組換え型リステリアを用いるワクチン接種により高レベルの抗原特異的T細胞が生じる
実施例23:組換え型リステリアを用いるワクチン接種により高レベルの抗原特異的T細胞が生じる
LmddA−ActAPEST2−PSA免疫療法により、LmddA−ActAPEST(3または4)−PSAまたはLmddA−142と比較して高レベルのPSA特異的T細胞応答が生じた(図29A)。PSA特異的免疫療法におけるPSA四量体特異的T細胞の規模は未感作マウスよりも30倍大きかった。同様に、PSA特異的抗原での刺激に応答した高レベルのIFN−γ分泌がLmddA−ActAPEST2−PSA免疫療法について観察された(図29B)。
実施例24:ACTA/PEST2(LA229)を用いるワクチン接種により脾臓に多数の抗原特異的CD8+ T細胞が生じる
実施例24:ACTA/PEST2(LA229)を用いるワクチン接種により脾臓に多数の抗原特異的CD8+ T細胞が生じる
ActA/PEST2融合PSAを発現するLmは、tLLO融合PSAを発現するLm、またはtLLO処置群と比較して、より多数のPSA特異的CD8+ T細胞を脾臓中に生成することができた。腫瘍に浸潤するPSA特異的CD8+ T細胞の数はLm−tLLO−PSA免疫マウスとLm−ActA/PEST2−PSA免疫マウスの両方について同様であった(図30Bおよび30C)。また、ActA/PEST2−PSAを発現するLmの腫瘍退行能力は、tLLO−PSAを発現するLmddA−142について見られるものと同様であった(図30A)。
実施例25:LLOコレステロール結合ドメインの部位特異的突然変異形成
実施例25:LLOコレステロール結合ドメインの部位特異的突然変異形成
CBD内に不活性化点突然変異を導入するため、以下の戦略を使用して部位特異的突然変異形成をLLOに対して実施した。結果として得られるタンパク質は、「mutLLO」と称される。
LLOのpET29bへのサブクローニング
LLOのpET29bへのサブクローニング
野生型LLOのアミノ酸配列は、
(配列番号2)である。シグナルペプチドおよびコレステロール結合ドメイン(CBD)は下線付きであり、CBD内の3つの重要な残基(C484、W491、およびW492)は太字の斜字体である。
6×Hisタグ(HHHHHH)をLLOのC末端領域に付加した。Hisタグ付きLLOのアミノ酸配列は、
(配列番号62)である。
Hisタグ付きLLOタンパク質をコードする遺伝子をNdeI/BamHIで消化し、そのNdeI/BamHIをNdeI部位とBamHI部位との間で発現ベクターpET29bにサブクローニングした。LLOタンパク質をコードする遺伝子の配列は、
(配列番号63)である。下線付き配列は、配列の最初から順に、NdeI部位、NheI部位、CBGコード領域、6×Hisタグ、およびBamHI部位である。次のステップにおいて突然変異形成されるCBD残基が太字の斜字体である。
スプライシング・バイ・オーバーラップエクステンション(SOE)PCR
スプライシング・バイ・オーバーラップエクステンション(SOE)PCR
ステップ1:第1と第2のPCR反応をpET29b−LLOテンプレートに対して実施した。第1プライマーと第2プライマーを利用する第1PCR反応はNheI部位とCBDとの間の断片を増幅し、CBDへの突然変異の導入を含んだ。第3プライマーと第4プライマーを利用する第2PCR反応は、CBDとBamHI部位との間の断片を増幅し、CBDへの同じ突然変異の導入を含んだ(図31A)。
PCR反応第1サイクル:A)94℃で2分30秒、B)94℃で30秒、C)55℃で30秒、D)72℃で1分、ステップB〜Dを29回繰り返す(合計30サイクル)、E)72℃で10分。
PCR反応第2サイクル:A)94℃で2分30秒、B)94℃で30秒、C)60℃で30秒、D)72℃で1分、ステップB〜Dを29回繰り返す(合計30サイクル)、E)72℃で10分。
ステップ2:第1と第2のPCR反応の産物を混合し、(突然変異形成されたCBDをコードする領域において)アニールさせ、第1プライマーと第4プライマーを用いてPCRをさらに25サイクル実施した(図31B)。PCR反応サイクル:A)94℃で2分30秒、B)94℃で30秒、C)72℃で1分、ステップB〜Cを9回繰り返す(合計10サイクル)、第1プライマーと第4プライマーを添加する、D)94℃で30秒、E)55℃で30秒、F)72℃で1分、ステップD〜Fを24回繰り返す(合計25サイクル)、G)72℃で10分。
プライマー配列:
プライマー配列:
プライマー1:GCTAGCTCATTTCACATCGT (配列番号64;NheI配列は下線付き)。
プライマー2:
(配列番号65;CBDコード配列は下線付き、突然変異形成されたコドンは太字の斜字体)。
プライマー3:
(配列番号66;CBDコード配列は下線付き、突然変異形成されたコドンは太字の斜字体)。
プライマー4:GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG(配列番号67;BamHI配列は下線付き)。
野生型CBD配列はECTGLAWEWWR(配列番号68)である
突然変異形成されたCBD配列はEATGLAWEAAR(配列番号69)である
突然変異形成されたNheI−BamHI断片の配列は、
(配列番号70)である。
実施例26:LLO CBDの一部のCTLエピトープとの置換
実施例26:LLO CBDの一部のCTLエピトープとの置換
CBDの9アミノ酸(AA)をNY−ESO−1抗原由来のCTLエピトープで置換するため、部位特異的突然変異形成をLLOに対して実施した。NY−ESO−1に由来する「ctLLO」という名称のHLA−A2拘束性エピトープ157〜165を含む配列ESLLMWITQCR(配列番号71;突然変異形成された残基は下線付き)でCBDの配列(配列番号68)を置き換えた。
使用されるサブクローニング戦略は前出の実施例と同様であった。
使用されるプライマーは以下のとおりであった。
プライマー1:GCTAGCTCATTTCACATCGT(配列番号64;NheI配列は下線付き)。
プライマー2:
(配列番号72;CBDコード配列は下線付き、突然変異形成された(NY−ESO−1)コドンは太字の斜字体)。
プライマー3:
(配列番号73;CBDコード配列は下線付き、突然変異形成された(NY−ESO−1)コドンは太字の斜字体)。
プライマー4:GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG(配列番号67;BamHI配列は下線付き)。
結果として得られるNheI/BamHI断片の配列は以下のとおりである:
(配列番号74)。
実施例27:mutLLOとctLLOは大腸菌発現系において発現および精製可能である
実施例27:mutLLOとctLLOは大腸菌発現系において発現および精製可能である
mutLLOとctLLOは大腸菌中で発現し得ることを示すため、pET29bで大腸菌を形質転換し、且つ、0.5mMのIPTGで誘導し、次いで4時間後に細胞溶菌液を回収し、総タンパク質をSDS−PAGEゲル中で分離し、そしてクマシー染色(図32A)とモノクローナル抗体B3−19を使用する抗LLOウエスタンブロットの対象とした(図32B)。このように、CBD内に点突然変異または置換を含むLLOタンパク質が大腸菌発現系において発現および精製可能である。
実施例28:mutLLOとctLLOは溶血活性の著しい低下を示す
材料および実験方法
溶血アッセイ
実施例28:mutLLOとctLLOは溶血活性の著しい低下を示す
材料および実験方法
溶血アッセイ
1.野生型および変異型のLLOを図33A〜Bに表示される希釈度で900μLの1×PBS−システイン(PBSを0.5Mシステイン塩酸でpH5.5に調節するか、または7.4に調節した)中に希釈した。2.LLOを37℃で30分間にわたってインキュベートすることにより活性化した。3.ヒツジ赤血球(200μl/試料)をPBS−システインで二回洗浄し、上清が比較的に明るくなるまで1×PBSで3〜5回洗浄した。4.ヒツジ赤血球の最終ペレットをPBS−システインに再懸濁し、100μLのその細胞懸濁液を900μLのLLO溶液に添加した(10%の終濃度)。5.50μLのヒツジ赤血球を950μLの水+10%ツイーン20に添加した(溶解についての陽性対照。他のチューブに加えられる細胞の総量としての溶解細胞の50%の量を含むことになるので「50%対照」)。6.全てのチューブを穏やかに混合し、37℃で45分間にわたってインキュベートした。7.赤血球をマイクロ遠心分離機中で10分間にわたって1500rpmで遠心分離した。8.その上清の200μlのアリコットを96ウェルELISAプレートに移し、570nmで読んで溶血後に放出されたヘモグロビンの濃度を測定し、そして50%対照に対して試料を用量決定した。
結果
結果
ヒツジ赤血球アッセイを用いてmutLLOとctLLOの溶血活性を決定した。mutLLOはpH5.5において著しく減少した(100倍と1000倍の間)溶血タイターを示し、且つ、pH7.4において検出不可能な溶血活性を示した。ctLLOはどちらのpHでも検出不可能な溶血活性を示した(図33A〜B)。
したがって、C484、W491、およびW492を含むLLO CBD残基、の点突然変異(mutLLO)または置換突然変異(ctLLO)により溶血活性が消失するか、または大きく低下する。さらに、異種抗原ペプチドでのCBDの置換は、野生型LLOと比べて著しく低下した溶血活性を持つ異種エピトープの免疫原性担体を作製する効果的な手段である。
実施例29:完全閉鎖単回使用細胞増殖系
実施例29:完全閉鎖単回使用細胞増殖系
その革新的システムは、独特な構成で配置されている容易に利用可能なバイオプロセッシング要素および技術を活用することで単一完全閉鎖系を使用して改変型Lm細菌を培養し、その発酵ブロスを濃縮し、それらの細胞を洗浄および精製し、発酵培地を製剤緩衝液に交換し、且つ、患者特異的用量をすぐに使用可能なIVバッグに分配する。このタイプの系はそれぞれの患者の免疫療法の隔離と管理を提供する。この系は、免疫療法を標的とする個別化ネオエピトープの特定と臨床使用についての全体的なワークストリームに組み込むのに特によく適している(図37A〜B)。
そのカスタム設計の系は、単回使用バイオプロセッシングバッグ、患者IVバッグ、サンプリングバッグ、チューブ類、フィルター、クイックコネクター、およびセンサーを使用して組み立てられる。その系が省スペースであることで個々の患者向けに製造することが可能になるが、それを増やして複数の患者向けの製品を並行して製造することができる(図38)。その組立品全体は4つの区画、すなわち、1)接種と発酵、2)濃縮、3)透析濾過、および4)医薬製品充填から構成される。その系は完全閉鎖液体流路を有し、且つ、使用前に滅菌されるので、最終製剤免疫療法は直接的にIVバッグに分配され、凍結され、そして医療センターに発送される。したがって、バイアル瓶または事前充填注射筒に分配するときに伴われる典型的な充填/仕上げおよび包装の必要性がこれにより排除される。このことは、期待される患者への短時間での納品と送達に対処する。
その組立品の接種および発酵区画(図39)は増殖培地で充填され、且つ、指定温度まで温められる。次に細胞バンクを単回使用揺動式バッグ型発酵機か単回使用撹拌式バイオリアクター容器のどちらかに接種する。細菌が特定の密度まで増殖したところでその組立品の濃縮区画(図40)を使用することで中空繊維フィルターを使用して発酵培地を除去し、且つ、そのバッチを濃縮する 洗浄/製剤緩衝液バッグがその組立品の透析濾過区画(図41)に接続されており、細菌細胞が洗浄/精製され、残っている培地が中空繊維フィルター中でのクロスフロー濾過を介して製剤緩衝液と交換され、そして製品が終濃度まで希釈される。最後にそのバッチがその組立品の医薬製品充填区画(図42)を使用して無菌単回使用IVバッグおよびQC検査用のサンプリングバッグに分割される。患者特異的免疫療法は、生きた弱毒化改変型Lm細菌の純粋な培養株を指定の濃度で含む少量非経口のIVバッグの中で凍結されて供給される。患者へ投与する前にそのIVバッグが融解され、細胞が再懸濁され、そして必要な用量が注射筒を用いて取り出され、且つ、より大きな注入用IVバッグに添加される。
数個の完全閉鎖組立品を並行使用して数人の患者または一人の患者のどちらかのために個別免疫療法組成物を製造する(図43)。スループットを増やすため、追加の揺動式バイオリアクターシステムまたは撹拌容器バイオリアクターシステムが必要に応じて処理列に加えられる(例えば図38参照)。
その培養系の完全閉鎖設計により、製造過程において追加的に時間節約になると共に免疫療法組成物の完全な品質管理が可能になる。完全分析管理行動計画をリステリア送達ベクターの培養と並行して実施する(表6)。したがって、分配された製品は、追加の検査を必要とせずに患者に即時に送達されるように準備できている。
表6. 分析管理行動計画
実施例30:ネオエピトープ発現ベクターの構築
以下に詳細が記載されるステップを用いて1つ以上のネオエピトープを含むLmベクターの構築を実施する。
ホールゲノムシーケンシング
ホールゲノムシーケンシング
まず、腫瘍細胞の約20%超に存在する非同義突然変異の位置を突き止めることを含む比較的ホールゲノムシーケンシングを実施し、FASTA形式で結果を提供する。全エクソームに由来する一致した正常試料/腫瘍試料は外部供給業者により配列決定されており、出力データは、21アミノ酸配列ペプチドとしての全ての新抗原、例えば変異アミノ酸の両側に10非変異アミノ酸を有するペプチドを記載する好ましいFASTA形式で提供される。患者HLAタイプも含まれる。
ヒト組織(またはあらゆる非ヒト動物)から得られた生体試料に由来するDNAとRNAは三組抽出される。新抗原の別の供給源は順次生じる転移癌または循環腫瘍細胞に由来する可能性がある。それらの新抗原は最初の生検材料には存在しないが、細胞傷害性T細胞(CTC)を特異的に標的とするベクター、 または シーケンシングされた最初の生検材料とは異なるように変異形成した転移癌には含まれる可能性がある追加の突然変異を含む場合があり得る。三組の各試料をDNAエクソームシーケンシングにより配列決定する。簡潔に述べると、超音波装置を使用して3μgの精製ゲノムDNA(gDNA)を約150〜200bpに断片化する。断片を末端修復し、5’末端リン酸化し、3’末端アデニル化し、その次に製造業者の指示に従ってイルミナ・ペアードエンドアダプターをそれらのgDNA断片にライゲーションする。イルミナ・PE PCRプライマーを使用してキャプチャ前増幅フローセル特異的配列を付加する。約500ngのアダプターライゲーション済みPCR増幅gDNA断片をビオチン化エクソーム(ヒトエクソームまたは他のあらゆる非ヒト動物、例えば、マウス、モルモット、ラット、イヌ、ヒツジのエクソーム)にハイブリダイズする。RNAライブラリーが65℃で24時間にわたってベイトになる。次にストレプトアビジン被覆磁性ビーズを使用してハイブリダイズしたgDNA/RNAベイト複合体を取り出し、洗浄し、そしてRNAベイトを切り出す。これらの溶出gDNA断片をPCR増幅し、その後でイルミナ・シーケンシング装置上で配列決定する。
RNA遺伝子発現プロファイリング(RNA−Seq)
RNA遺伝子発現プロファイリング(RNA−Seq)
総計で約5μgの全RNAよりバーコードmRNA−seq cDNAライブラリーを調製する。その次に、簡潔に述べると、mRNAを単離および断片化する。その後、標準的イルミン・プロトコルに従ってmRNA断片をcDNAに変換し、特定のイルミナ・アダプターに結合し、クラスター化し、そして配列決定する。出力配列リードを参照配列(RefSeq)に対して整列させる。ゲノムアラインメントおよびトランスクリプトームアラインメントを作成する。エクソン間接合部に対してもリードを整列させる。RefSeq転写物の座標でリード座標を分割し、重なり合うエクソン間接合部リードを計数し、そしてRPKM発現単位(転写物のキロベース当たりとマップ済み100万リード当たりの転写物キロベース当たりでマップするリード)などの標準的正規化単位に正規化することにより発現値を決定する。
突然変異の検出
突然変異の検出
疾患または症状を担持する組織試料に由来する単離gDNAの断片を供給業者が用意したソフトウェア、例えばSamtools、GATK、およびSomatic Sniperにより健常組織の参照一致gDNAに対して整列させる。
異なるHLA TCRリーディングフレームのうちの少なくとも幾つかを提供するため、検出される突然変異の両側にある約10隣接アミノ酸を組み入れてクラス1MHC−1提示を構成する。
表7は、各突然変異が太字のアミノ酸を表す文字によって表示されており、且つ、両側に10アミノ酸を隣接させて21アミノ酸ペプチドネオエピトープを提供する50種類のネオエピトープペプチドの試料リストを示している。
表7.
出力FASTAファイルを使用して以下に詳細が記載される基準のうちの1つ以上に従って手作業か、またはプログラムされたスクリプトのどちらかによって患者特異的コンストラクトを設計する。そのプログラムされたスクリプトは一連のプロトコルを使用して各対象向けの1つ以上のネオエピトープを含有する個別化血漿コンストラクトの作製を自動化する(図45)。その出力FASTAファイルを入力し、それらのプロトコルが実行された後に1つ以上のネオエピトープを含むLMベクターのDNA配列が出力される。そのソフトウェアプログラムは各対象向けの個別免疫療法の作成に有用である。
コンストラクトに組み込むためのネオエピトープの優先順位付け
コンストラクトに組み込むためのネオエピトープの優先順位付け
カイト・ドゥーリトル・ハイドロパシーインデックス21アミノ酸ウィンドウによりネオエピトープにスコアを付け、カットオフ(1.6付近)よりも上の全てのスコアを取ったものをリステリア・モノサイトゲネスによって分泌可能である可能性が無いとして除外する。次に患者HLAに結合する残りの21アミノ酸長のペプチドの能力について(例えばIEDB、免疫エピトープデータベースおよび分析ソース、www.iedb.org/を使用することにより)それらにスコアを付け、各21アミノ酸配列ペプチドの最良のMHC結合スコアによってそれらのペプチドの順位を決定する。サルモネラなどの異なる発現ベクターについてはカットオフが異なっていてよい。
ネオエピトープの発現と分泌の効率を決定するために突然変異数に対するコンストラクト数を決定する。ベクター当たり約50エピトープから開始して、直鎖状ネオエピトープの範囲を検査する。ある特定の事例ではコンストラクトはベクター当たり少なくとも1つのネオエピトープを含む。使用されるベクターの数は、単一のベクターに由来する複数のエピトープの翻訳と分泌の効率および特定のネオエピトープを保持する各Lmベクターに必要とされるMOIを考慮して、またはネオエピトープ数を参照して決定される。別の考慮事項は、循環腫瘍細胞に見出される公知の腫瘍関連突然変異、公知の癌「ドライバー」突然変異、公知の化学療法耐性突然変異からなる群を事前に定義し、且つ、21アミノ酸配列ペプチド選択においてこれらを優先することによるものであり得る。これは、特定された変異遺伝子をCOSMIC(癌体細胞突然変異カタログ、cancer.Sanger.ac.uk)またはキャンサーゲノムアナリシスまたは他の類似の癌関連遺伝子データベースに対してスクリーニングすることにより行われ得る。さらに、免疫抑制性エピトープ(Tregエピトープ、IL−10誘導性Tヘルパーエピトープ、等)のスクリーニングを利用して脱選択する、またはベクターに対する免疫抑制的影響を回避する。選択されたコドンは、特定のリステリア株に応じて効率的な翻訳および分泌になるようにコドン最適化される。当技術分野において知られているL.モノサイトゲネスについて最適化されたコドンの例が表8に提示されている。
表8. 予備段階のリステリア・モノサイトゲネスにとり好ましい(最も一般的な)コドンの表
残りの21アミノ酸ペプチドネオエピトープをpAdv134−MCS(配列番号138)プラスミドに、または所望により上の実施例8において示されているようにLLO−E7カセットを交換してtLLO−ネオエピトープ−タグ融合ポリペプチドを作製するpAdv134に組み入れる。アミノ酸配列としてのその適合可能な挿入断片および全挿入断片をカイト・ドゥーリトル・テストにより再チェックしてコンストラクト全体にわたって何のハイドロパシーの問題も無いことを確認する。必要な場合は、挿入断片の順序を再構成するか、または問題の21アミノ酸配列ペプチドをコンストラクトから除去する。
DNA合成/pAdv134−MCS配列番号138、すなわち、へのクローニングのためにコンストラクトのアミノ酸配列を対応するDNA配列に逆翻訳する。cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatCTCGAGGAGCTCCTGCAGTCTAGAGTCGACACTAGTGGATCCAGATCTCCCGGGccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaagccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggacattagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaaccaggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcattaaattaaaaaaagaagaacgagaaagctatataaaggcgctgacagcttcgtttaatttagaacgtacatttattcaagaaactctaaacaaattggcagaacgccccaaaacggacccacaactcgatttgtttagctacgatacaggctgaaaataaaacccgcactatgccattacatttatatctatgatacgtgtttgtttttctttgctggctagcttaattgcttatatttacctgcaataaaggatttcttacttccattatactcccattttccaaaaacatacggggaacacgggaacttattgtacaggccacctcatagttaatggtttcgagccttcctgcaatctcatccatggaaatatattcatccccctgccggcctattaatgtgacttttgtgcccggcggatattcctgatccagctccaccataaattggtccatgcaaattcggccggcaattttcaggcgttttcccttcacaaggatgtcggtccctttcaattttcggagccagccgtccgcatagcctacaggcaccgtcccgatccatgtgtctttttccgctgtgtactcggctccgtagctgacgctctcgccttttctgatcagtttgacatgtgacagtgtcgaatgcagggtaaatgccggacgcagctgaaacggtatctcgtccgacatgtcagcagacgggcgaaggccatacatgccgatgccgaatctgactgcattaaaaaagccttttttcagccggagtccagcggcgctgttcgcgcagtggaccattagattctttaacggcagcggagcaatcagctctttaaagcgctcaaactgcattaagaaatagcctctttctttttcatccgctgtcgcaaaatgggtaaatacccctttgcactttaaacgagggttgcggtcaagaattgccatcacgttctgaacttcttcctctgtttttacaccaagtctgttcatccccgtatcgaccttcagatgaaaatgaagagaaccttttttcgtgtggcgggctgcctcctgaagccattcaacagaataacctgttaaggtcacgtcatactcagcagcgattgccacatactccgggggaaccgcgccaagcaccaatataggcgccttcaatccctttttgcgcagtgaaatcgcttcatccaaaatggccacggccaagcatgaagcacctgcgtcaagagcagcctttgctgtttctgcatcaccatgcccgtaggcgtttgctttcacaactgccatcaagtggacatgttcaccgatatgttttttcatattgctgacattttcctttatcacggacaagtcaatttccgcccacgtatctctgtaaaaaggttttgtgctcatggaaaactcctctcttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttgagaattaattttatattgattaatactaagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatgatgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaactatttgttaattaa大文字は外部供給業者によるマルチクローニング部位を指す。個々の21アミノ酸ペプチド配列およびSIINFEKL−6×HisタグDNA配列(例えば配列番号87)をL.モノサイトゲネス内での発現と分泌について最適化し、一方で4×グリシンリンカー配列は11種類の事前決定DNA配列(G1〜G11、配列番号76〜86)のうちの1つである。より良好なDNA合成を可能にするためにリンカー配列コドンを変更して過剰な反復を回避する。4×グリシンリンカーの異なる配列コドンの例(G1〜G11、配列番号76〜86)が表9に提示されている。
表9. 4×グリシンリンカーDNA配列および終末タグ配列
各ネオエピトープをリンカー配列によって同じベクター上にコードされる次のネオエピトープに結合する。挿入断片中の最後のネオエピトープをタグ配列とそれに続く終止コドンに融合する。融合されるタグ、すなわち、C末端SIINFEKLおよび6×Hisアミノ酸配列が配列番号87で表される。例えばLmベクターからの分泌時に、または特定のT細胞への親和性、または抗原提示細胞による提示についてコンストラクトを検査するときにそのタグによってtLLO−ネオエピトープの簡単な検出が可能になる。そのリンカーは、G1〜G11(配列番号76〜86)を含む群より選択される4×グリシンDNA配列であり、したがって、またはそれらのあらゆる組合せである。
単一のプラスミド中に適合し得る(最大積載量は現在検査中である)ものよりも使用しやすい21アミノ酸ペプチドが存在する場合、それらの異なる21アミノ酸ペプチドを必要に応じて/要望に応じて優先順位によって第1コンストラクト、第2コンストラクト等と呼ぶ。所望のネオエピトープのセット全体を含む複数のベクターのうちの1つに対する優先度の割り当てが、相対的サイズ、転写優先度、および翻訳されたポリペプチドの全体的疎水性のような因子に基づいて決定される。
1つの実施形態では本明細書において開示されるコンストラクトの構造は、N末端短縮型LLOが融合している1つ以上の21merネオエピトープアミノ酸配列とそれに隣接するリンカー配列、および別のリンカーが隣接し、且つ、そのオープン・リーディング・フレームを終えるSIINFEKL−6×Hisタグ−2×終止コドンによって終わる後続の少なくとも1つの第2ネオエピトープをコードする核酸配列、すなわち、pHly−tLLO−第一21mer−4×グリシンリンカーG1−第二21mer−4×グリシンリンカーG2−…−SIINFEKL−6×Hisタグ−2×終止コドンを含む。別の実施形態では上のコンストラクトの発現は、hly遺伝子プロモーター配列または当技術分野において知られており、且つ、本明細書においてさらに開示される他の適切なプロモーター配列によって引き起こされる。当業者は、各21merネオエピトープ配列が本明細書において開示されるtLLO、短縮型ActAまたはPESTアミノ酸配列などの免疫原性ポリペプチドに融合されてもよいことを理解する。
反復を最小限にするためにネオエピトープ間に異なるリンカー配列を配置する。これにより可能性がある二次構造が低減され、それによりLm組換えベクター株集団内の挿入断片を含むプラスミドの効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化が可能になる。
少なくとも1つのネオエピトープに融合されたtLLOまたはtActAまたはActAまたはPESTアミノ酸配列を備えるオープン・リーディング・フレームを含むコンストラクトを含む供給業者由来のヌクレオチド配列を注文することによりDNA合成を行う。加えて、または代わりに、複数のネオエピトープを1つ以上のリンカー4×グリシン配列によって分ける。加えて、または代わりに、分子生物学技法により、例えば:特定の重複性プライマーおよび特定のプライマーを使用するソーイングPCRにより、または適切な酵素(例えば、ライゲース)によって異なるヌクレオチド配列をライゲーションし、所望により続いて制限酵素によって切断することにより、およびそれらのあらゆる組合せにより所望の配列を含むように挿入断片を構築する。
一実施形態では反復を最小限にするためにネオエピトープ間に異なるリンカー配列を配置する。これにより可能性がある二次構造が低減され、それによりLm組換えベクター株集団内の挿入断片を含むプラスミドの効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化が可能になる。
選択されたDNA挿入断片を当技術分野において標準的な技法(例えば、PCR、DNA複製・生物複製、オリゴヌクレオチド化学合成)により合成し、プラスミド、例えば実施例8において提示されるプラスミドにクローニングする。次にLmベクターをそのプラスミドで形質転換するか、または接合でそのプラスミドを導入する。加えて、または代わりに、その挿入断片をファージベクターに組み込み、そしてファージ感染によりLmベクターに挿入する。当技術分野において知られている技法、例えば挿入断片特異的プライマーを用いる細菌コロニーPCRを利用して、または前記プラスミドを精製し、その挿入断片を含む少なくとも一部分をシーケンシングしてそのコンストラクトの確認を実施する。
実施例31:ネオエピトープ発現ベクターからのネオエピトープの発現
実施例31:ネオエピトープ発現ベクターからのネオエピトープの発現
癌は突然変異によって引き起こされるので、個々の腫瘍における体細胞突然変異の包括的マップを提供する能力は、癌をより良好に理解し、且つ、癌に対して介入するための強力なツールを提供する。ヒトの癌は数十から数百の非同義突然変異を担持する。例えば、全ての目的のために全体が参照により本明細書に援用されるCastle et al. (2012) Cancer Res. 72(5):1081−1091を参照されたい。ところが、患者の間で共有される突然変異はまれであり、且つ、突然変異の大多数は患者特異的であり、そのことが.広範囲に適用可能な薬品の開発向けのミュータノームの開発を妨げている。
この実施例では、健常肺組織には存在しない肺非小細胞癌組織において特定された約200の非同義突然変異に基づいて実施例30のようにネオエピトープ発現ベクターを構築した。組織はマサチューセッツ大学医学部癌中核的研究拠点組織バンク(http://www.umassmed.edu/ccoe/core−services/tissue−and−tumor−bank/banked−tumor−by−organ−of−origin)より取り寄せた。他のものは典型的にはエピトープの免疫原性についての予測アルゴリズムに基づいてスクリーニングする。これらのアルゴリズムは、どのペプチドがT細胞応答を生成するか予測することに関して最良でも20%正確なだけである。それらのアルゴリズムは200突然変異全てを含むことができないのでこれを行う。ここでは全ての突然変異を含めることができたので、スクリーニング/予測アルゴリズムを使用しなかった。Lm株は何を分泌できそうか(すなわち、あまり疎水性ではなさそうか)判断するために疎水性についてスクリーニングを実施した。下の表に非同義突然変異(ネオエピトープ)が提示されている。
試薬
肺パーミューテーションコンストラクトを試験するために次の試薬を使用した。
・ 細菌:BHI中で終夜培養したタグ付きLmddaコンストラクト
・ 細胞株:DC2.4
・ HBSS中の2%トリプシン
・ RPMI 10%FBS グルタマックス
・ FACS緩衝液(PBS 2%FBS)
・ 細胞計数溶液
・ ゲンタマイシン抗生物質
・ 25D−APC結合抗体、100倍
抗原提示細胞の回収
・ 細菌:BHI中で終夜培養したタグ付きLmddaコンストラクト
・ 細胞株:DC2.4
・ HBSS中の2%トリプシン
・ RPMI 10%FBS グルタマックス
・ FACS緩衝液(PBS 2%FBS)
・ 細胞計数溶液
・ ゲンタマイシン抗生物質
・ 25D−APC結合抗体、100倍
抗原提示細胞の回収
幾つかの実験ではマウス樹状DC2.4細胞を20ng/mLの組換えマウスIFNγで48時間にわたって刺激した。培地を除去し、フラスコ当たり2本の50mLコニカルチューブに収集した。10mlの体積の2%トリプシンHBSS溶液をフラスコに加えて残っているFBSを除去し、2本の50mLの収集用チューブに等しく移した(5mLずつ)。10mLの体積の2%トリプシンHBSS溶液をフラスコに添加して被覆し、顕微鏡下で固着性をチェックし、そして37℃で5分間のインキュベーションが続いた。その懸濁液を2本の50mLの収集用チューブに収集し(5mLずつ)、そして1200rpmで5分間にわたって遠心分離した。上清を捨て、25mLのRPMI 10%FBS グルタマックス溶液を含むチューブ1中でペレットを再懸濁した。次にこれを2本目の収集用チューブに移してそれらの2本のチューブを1本にまとめた。
その後、計数するためにチューブ(1.5mL)にラベルを付けた。135uLの体積の計数溶液および15uLの体積の細胞を加え、細胞を室温で2分間にわたってインキュベートした。その後、24ウェルプレート中で感染させるためにそれらのDC2.4細胞を準備した。それらの24ウェルプレートを37℃(5%CO2)で一晩インキュベートした。その後、それらのプレートを2000rpmで5秒間にわたって遠心分離し、上清を除去し、そして1mLの新しいc−RPMIを各ウェルに添加した。
感染
感染
その後、それらの細胞にLmdda−PSA−サバイビン−タグ発現ベクター(37度で終夜培養)を感染させた。合計のLmdda−ネオ・コンストラクトcfuは1×109/mLであった。そのLmddaを1.5mL中で遠心分離し、室温で1mLのRPMI−10%FBS培地中に再懸濁した。ある体積のそのLmddaを、2×106細胞に対する正しいMOIに達するようにDC2.4ウェルに添加した(MOI:10=20uLのLmdda)。その後、そのプレートを1200rpmで15分間にわたって遠心分離し、そして5%CO2を含む37℃のインキュベーターの中に4時間の感染のために配置した。それらの細胞のLmdda殺滅を停止するため、そのインキュベーションの1時間後に10ug/mLのゲンタマイシンを添加した。
25D−APC(SIINFEKL)を用いる染色とフローサイトメトリー
25D−APC(SIINFEKL)を用いる染色とフローサイトメトリー
4時間の感染後、そのプレートを2000rpmで30秒間にわたって遠心分離し、上清を捨てた。ブロックするためにそれらの細胞を200uLの2.4G2中に再懸濁し、氷上で10分間にわたって96ウェルプレートに移した。それらの細胞をFACS緩衝液(PBS+2%FBS)で洗浄した。その後、染色マスターミックスを添加し、それらの細胞をボルテックス混合し、そして氷上に20分間にわたって放置した。その後、それらの細胞をFACS緩衝液で洗浄し、約300uLのFACS緩衝液(ペレットのサイズ/細胞数による)中に再懸濁した。その後、25D−APCの検出のためにフローサイトメーターにそれらの試料を流した。
実験1
実験1
表10. 25D−APCの検出のために検査された試料
コンストラクトの末尾の「H」(例えば「121−140H」)は、そのペプチド配列がそのHを持っていないコンストラクトと同一であるが、同じペプチド配列を生じるその基底となるヌクレオチド配列が改変されたことを表す。
表11. 25D−APCの検出
25D−APC結合抗体を用いるC末端SIINFEKLタグの検出が表11に示されている。表11に示されているように、SVN−タグ陽性対照とPSMA−タグ陽性対照は高レベルの陽性染色を示し、一方でSVN−noタグ陰性対照、無感染陰性対照、および未染色陰性対照は検出限界未満であった。同様に、試料4〜7、10、12、16、20〜23、25、および27〜29は高レベルの陽性染色を示した。これにより、感染すると抗原提示細胞において新抗原が発現および分泌することの確証が示される。
実験2
実験2
表12に示される追加の肺ネオエピトープコンストラクトを用いる第2の実験において上記のことを反復した。この実験では肺コンストラクトの様々な位置にタグを移動した。
表12. 25D−APCの検出のために検査された試料
表13. 25D−APCの検出
25D−APC結合抗体を用いるC末端SIINFEKLタグの検出が表13に示されている。表13に示されているように、SVN−タグ陽性対照は高レベルの陽性染色を示し、一方でタグ無し陰性対照、無感染陰性対照、および未染色陰性対照は検出限界未満であった。同様に、試料3、7、および8は高レベルの陽性染色を示した。これにより、感染すると抗原提示細胞において新抗原が発現および分泌することの確証が示される。
実験3
実験3
表14に示される追加の肺ネオエピトープコンストラクトを用いる第3の実験において上記のことを反復した。これらの肺コンストラクトではコンストラクトの様々な位置にタグを移動した。
表14. 25D−APCの検出のために検査された試料
表15. 25D−APCの検出
25D−APC結合抗体を用いるC末端SIINFEKLタグの検出が表15に示されている。表15に示されているように、PSA サバイビン陽性対照とミニ遺伝子陽性対照は高レベルの陽性染色を示し、一方でタグ無し陰性対照と無感染陰性対照は検出限界未満であった。同様に、試料4、および5〜12は高レベルの陽性染色を示した。これにより、感染すると抗原提示細胞において新抗原が発現および分泌することの確証が示される。
図45は、様々な位置にSIINFEKLを含むLmコンストラクトに感染したDC2.4細胞上の表面Kb−SIINFEKLを示している。そのグラフは、SIINFEKLがC末端、N末端、または内部に位置する場合に分泌されたネオエピトープがSIINFEKLにより特定されることを示す、生25Dデータの要約を示している。最後の5本のバーは次のコンストラクトに対応する:それぞれ、2712 SIINFEKL−121−140−6xHIS、2712 121−125−SIINFEKL−126−140−6xHIS、2712 121−130−SIINFEKL−131−140−6xHIS、2712 121−135−SIINFEKL−136−140−6xHIS、および2712 121−140−SIINFEKL−6xHIS。
実験4
実験4
表16に示される追加のLmddaコンストラクトを用いる第4の実験において上記のことを反復した。
表16. 25D−APCの検出のために検査された試料
表17. 25D−APCの検出
25D−APC結合抗体を用いるC末端SIINFEKLタグの検出が表17に示されている。表17に示されているように、SVN陽性対照は高レベルの陽性染色を示し、一方でタグ無し陰性対照は低レベルの染色を示した。同様に、試料43〜12、15、18、19、21、22、24、および27〜30は高レベルの陽性染色を示した。これにより、感染すると抗原提示細胞において新抗原が発現および分泌することの確証が示される。図50は、ネオエピトープの提示および分泌に対するそれらのネオエピトープの順序のランダム化の効果を示している。1から20まで順に並べたものは分泌しない。ところが、順序全体をランダム化する、または個々の断片に分解する、またはそれらの断片をランダム化することにより分泌がうまくいくことになる。同様に、21から40まで順に並べたものは分泌しない。その20mer(1〜5、6〜10)の個々の領域が作用せず、他の領域(16〜20)が作用する。ところが、個々の領域をランダム化することによりそれぞれ個々の領域の分泌がうまくいくことになる。
実施例32:B16F10マウス黒色腫モデルにおけるLm新抗原コンストラクトの治療効果
実施例32:B16F10マウス黒色腫モデルにおけるLm新抗原コンストラクトの治療効果
癌細胞にあって対応する健常細胞には存在しない非同義突然変異を特定した後、それらの突然変異の機能上の影響、例えば、癌パッセンジャー状態と比べた癌ドライバー状態などを決定して治療標的選択の基礎を形成することに大きな努力が払われることが典型的である。ところが、これらの突然変異の免疫原性を明らかにすることにも、それらが誘発する免疫応答の特徴を分析することにもほとんど注意が払われていなかった。免疫学的見地より、突然変異により中枢性免疫寛容の対象ではない新抗原が創出され得るので、突然変異は特に強力なワクチン接種標的である。これらの突然変異の免疫原性を明らかにすること、またはそれらが誘発する免疫応答の特徴を分析することに注意が払われているとき、免疫のためにペプチド内に含まれるべき単一の突然変異にそれらの非同義突然変異を絞り込むことに努力が向けられることが典型的である。例えば、Castleらの著作では、B16F10マウス黒色腫細胞において962非同義点突然変異が特定され、それらの突然変異のうちの563突然変異が発現遺伝子内にあった。これらの突然変異のうちの50突然変異が、低い偽陽性率(FDR)信頼値、発現遺伝子内の位置、および予測される免疫原性をはじめとする選択基準に基づいて選択された。これらの50突然変異のうち16突然変異だけが免疫されたマウスにおいて面機応答を誘発することがわかり、それらの16突然変異の内の11突然変異だけが変異型エピトープを優先的に認識する免疫応答を誘導した。次にそれらの突然変異のうちの2突然変異が腫瘍増殖阻害を誘導することがわかった。例えば、全ての目的のために全体が参照により本明細書に援用されるCastle et al. (2012) Cancer Res. 72(5):1081−1091を参照されたい。ところが、以下の実験において記述されるコンストラクトでは、腫瘍増殖の抑制に関してNeo20およびNeo30の方が良好であることが我々のデータより示唆される。我々のコンストラクトでは、Neo12は12種類の最も免疫原性のエピトープを含む。Neo12は両方の腫瘍抑制エピトープ(表7において既に開示されたMut30およびMut44)を含む。Neo20はMut30−Mut2−Mut3−Mut3−Mut4…Mut19)を含む。Neo30はMut30−Mut2−Mut3…Mut−29)を含む。Neo20およびNeo30だけがCastleによって特定された腫瘍抑制エピトープのうちの1つ(Mut30)を含み、次にそれらは免疫原性エピトープと非免疫原性エピトープの両方を含む。複数の腫瘍抑制エピトープを持たず、且つ、多数の非腫瘍抑制エピトープおよび非免疫原性エピトープさえも含むにもかかわらず。
実験1
実験1
Lm新抗原コンストラクトによって生じる治療応答を決定するため、B16F10 C57Bl/6マウス黒色腫モデルにおける腫瘍増殖に対するそのようなコンストラクトの治療効果を調査するように腫瘍退行試験を設計した。具体的には、Castleらによって特定された12種類の新抗原(Mut30、Mut5、Mut17、Mut20、Mut22、Mut24、Mut25、Mut44、Mut46、Mut48、およびMut50を含むLm−Castle12)または20種類の新抗原(Mut30、Mut2、Mut3、Mut4、Mut5、Mut6、Mut7、Mut8、Mut9、Mut10、Mut11、Mut12、Mut13、Mut14、Mut15、Mut16、Mut17、Mut18、Mut19、およびMut20を含むLm−Castle20)を用いてLm新抗原ベクターを設計した。例えば、全ての目的のために全体が参照により本明細書に援用されるCastle et al. (2012) Cancer Res. 72(5):1081−1091を参照されたい。
腫瘍細胞株の増殖 10%FBS(50mL)および1×グルタマックス(5mL)を含むc−RPMI中でB16F10黒色腫細胞株を培養した。c−RPMI培地は次の成分を含む:
RPMI1640 450mL
FCS 50mL
HEPES 5mL
NEAA 5ml
L−グルタミン 5mL
ピルビン酸ナトリウム 5mL
ペニシリン/ストレプトマイシン 5mL
2−ME(14.6M) 129μL
RPMI1640 450mL
FCS 50mL
HEPES 5mL
NEAA 5ml
L−グルタミン 5mL
ピルビン酸ナトリウム 5mL
ペニシリン/ストレプトマイシン 5mL
2−ME(14.6M) 129μL
腫瘍接種 0日目にB16F10細胞をトリプシン処理し、培地で二回洗浄した。細胞を計数し、注射用に200ulのPBS当たり1×105細胞の濃度で再懸濁した。その後、各マウスの右脇腹にB16F10細胞を皮下移植した。試験3日目にマウスにワクチン接種を行った。直径が12mmの大きさに達するまで腫瘍を週に二回測定し、記録した。殺処理基準に腫瘍が合致したところでマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して測定した。
免疫療法処置 3日目に免疫療法および処置が始まった。群をLmで処置し(IP)、追加免疫を二回行った。表18に詳細が記載されている。
表18.治療スケジュール
免疫療法処置の調製
1. PBSのみ − 200uL/マウスIP
2. LmddA−274(タイター:1.5×109CFU/mL)
a. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
b. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
d. 5×108CFU/mLの終濃度になるようにPBS中に再懸濁する。
3. Lm−Castle12(タイター:1.59×109CFU/mLとLm−Castle20(タイター:1.6×109CFU/mL)
a. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
b. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
d. 5×108CFU/mLの終濃度になるようにPBS中に再懸濁する。
1. PBSのみ − 200uL/マウスIP
2. LmddA−274(タイター:1.5×109CFU/mL)
a. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
b. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
d. 5×108CFU/mLの終濃度になるようにPBS中に再懸濁する。
3. Lm−Castle12(タイター:1.59×109CFU/mLとLm−Castle20(タイター:1.6×109CFU/mL)
a. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
b. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
d. 5×108CFU/mLの終濃度になるようにPBS中に再懸濁する。
図46Bに示されているように、腫瘍増殖は、対照群(PBSとLmddA274)と比較すると、Lm−Neo12およびLm−Neo20によって抑制された。LmddA274はリステリア対照であり、且つ、空ベクターである。それは短縮型LLO(tLLO)を含むが、しかしながら付随するネオエピトープは無い。加えて、20種類の新抗体を含有するLm−Neo20は、12種類の新抗体を含有するLm−Neo12よりも大幅に腫瘍増殖を抑制した。同様にLm−Neo20およびLm−Neo12は対照群と比較するとそれぞれ生存時間を増加させ、Lm−Neo20は最も大きな防護効果をもたらす(図46C)。これらのデータは、ネオエピトープを担持するLmを用いるワクチン接種により抗腫瘍効果を付与することが可能であること、およびネオエピトープ数の増加により抗腫瘍効果が増大することを示している。
実験2
実験2
様々なLm新抗原コンストラクトにより生じる治療応答をさらに比較するため、B16F10 C57Bl/6マウス黒色腫モデルにおける腫瘍増殖に対するそのようなコンストラクトの治療効果を調査するように腫瘍退行試験を設計した。具体的には、Castleらによって特定された12種類の新抗原(Lm−Castle12)、20種類の新抗原(Lm−Castle20)、または39種類の新抗原(Lm−Castle39;リンカー無し、20〜29無し(Lm−Castle30))を用いてLm新抗原ベクターを設計した。例えば、全ての目的のために全体が参照により本明細書に援用されるCastle et al. (2012) Cancer Res. 72(5):1081−1091を参照されたい。
腫瘍細胞株の増殖 10%FBS(50mL)および1×グルタマックス(5mL)を含むc−RPMI中でB16F10黒色腫細胞株を培養した。
腫瘍接種 0日目にB16F10細胞をトリプシン処理し、培地で二回洗浄した。細胞を計数し、注射用に200ulのPBS当たり1×105細胞の濃度で再懸濁した。その後、各マウスの右脇腹にB16F10細胞を皮下移植した。試験4日目にマウスにワクチン接種を行った。体積が1500mm3の大きさに達するまで腫瘍を週に二回測定し、記録した。殺処理基準に腫瘍が合致したところでマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して測定した。
免疫療法処置 4日目に免疫療法および処置が始まった。試験終了まで7日毎に一度動物を処置した。表19に詳細が記載されるように群をPBS、LmddA274、Lm−Castle12、Lm−Castle20、Lm−Castle39リンカー無し20〜29無しのいずれかで処置した。
表19. 治療スケジュール
免疫療法処置の調製
1. PBSのみ − 200uL/マウスIP
2. LmddA−274(タイター:1.7×109CFU/mL)
a. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
b. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
d. 5×108CFU/mLの終濃度になるようにPBS中に再懸濁する。
3. Lm−Castle12(タイター:1.59×109CFU/mLとLm−Castle20(タイター:1.6×109CFU/mL)とLm−Castle39(タイター:1×109CFU/mL)
a. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
b. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
d. 5×108CFU/mLの終濃度になるようにPBS中に再懸濁する。
1. PBSのみ − 200uL/マウスIP
2. LmddA−274(タイター:1.7×109CFU/mL)
a. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
b. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
d. 5×108CFU/mLの終濃度になるようにPBS中に再懸濁する。
3. Lm−Castle12(タイター:1.59×109CFU/mLとLm−Castle20(タイター:1.6×109CFU/mL)とLm−Castle39(タイター:1×109CFU/mL)
a. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
b. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
c. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
d. 5×108CFU/mLの終濃度になるようにPBS中に再懸濁する。
採取の詳細. 5mlのc−RPMI培地を含む個々のチューブに各マウスの脾臓を収集した。以下に詳述したステップを記載する。試験終了時に全ての腫瘍を摘出し、測定した。
1. 滅菌したピンセットとハサミを使用して脾臓を採取する。
2. 2枚のスライドグラスまたは3mLの注射筒のピストン棒の後端を使用して洗浄培地(RPMIのみ)中で各脾臓をすりつぶす。
3. その培地中の細胞を15mLのチューブに移す。
4. 細胞を室温で5分間にわたって1,000rpmで沈殿させる。
5. 上清を捨て、残っている洗浄緩衝液中に細胞を穏やかに再懸濁し、そして脾臓当たり2mLのRBC溶解緩衝液をその細胞ペレットに添加する。そのチューブを叩くことにより溶解緩衝液で細胞を穏やかに混合し、そして1分間待機する。
6. 直ちに10mlのc−RPMI培地をその細胞懸濁液に添加して溶解緩衝液を不活化する。
7. 細胞を室温で5分間にわたって1,000で遠心分離する。
8. それらの細胞をセルストレーナーに通し、10mLのc−RPMIでもう1回それらの細胞を洗浄する。
9. 血球計算盤/Moxi Flowを使用して細胞を計数し、トリパンブルー染色により生存度をチェックする。脾臓はそれぞれ約1〜2×108細胞を産するはずである。
10. 染色用にそれらの細胞を分ける。
11. 染色緩衝液の代わりに細胞表面抗体(CD8、CD62L)を2.4G2中に添加することを例外として、イムデックス社のデキストラマー染色プロトコルに従う(www.immudex.com/media/12135/tf1003.03_general_staining_procedure_mhc_dextramer.pdf)。
1. 滅菌したピンセットとハサミを使用して脾臓を採取する。
2. 2枚のスライドグラスまたは3mLの注射筒のピストン棒の後端を使用して洗浄培地(RPMIのみ)中で各脾臓をすりつぶす。
3. その培地中の細胞を15mLのチューブに移す。
4. 細胞を室温で5分間にわたって1,000rpmで沈殿させる。
5. 上清を捨て、残っている洗浄緩衝液中に細胞を穏やかに再懸濁し、そして脾臓当たり2mLのRBC溶解緩衝液をその細胞ペレットに添加する。そのチューブを叩くことにより溶解緩衝液で細胞を穏やかに混合し、そして1分間待機する。
6. 直ちに10mlのc−RPMI培地をその細胞懸濁液に添加して溶解緩衝液を不活化する。
7. 細胞を室温で5分間にわたって1,000で遠心分離する。
8. それらの細胞をセルストレーナーに通し、10mLのc−RPMIでもう1回それらの細胞を洗浄する。
9. 血球計算盤/Moxi Flowを使用して細胞を計数し、トリパンブルー染色により生存度をチェックする。脾臓はそれぞれ約1〜2×108細胞を産するはずである。
10. 染色用にそれらの細胞を分ける。
11. 染色緩衝液の代わりに細胞表面抗体(CD8、CD62L)を2.4G2中に添加することを例外として、イムデックス社のデキストラマー染色プロトコルに従う(www.immudex.com/media/12135/tf1003.03_general_staining_procedure_mhc_dextramer.pdf)。
CD8+ T細胞応答 抗原提示細胞におけるLm−Neo20コンストラクトの発現と分泌を測定するために上で説明されたように25Dアッセイを行った。図47Aは陽性対照(PSA−サバイビン−SIINFEKL)であり、図47Bは陰性対照(SIINFEKLを含まないPSA−サバイビン)であり、そして図47CはLm−Neo20(C末端にSIINFEKLタグを有する)である。図47に示されているように、Lm−Neo20が発現し、分泌されるが、陽性対照と比較すると低レベルでしかない。ところが、これらの低い分泌レベルにもかかわらず、SIINFEKLに対する特異的CD8+ T細胞応答が観察された。図48は「低分泌」Lm−Neo20コンストラクトに対するSIINFEKL特異的CD8+ T細胞応答を示している。図48に示されているように、CD8+ T細胞の約20%がLm Neo20コンストラクト内の抗原に対して特異的である。
抗腫瘍効果 図49Aに示されているように、腫瘍増殖は、対照群(PBSとLmddA274)と比較すると、Lm−Neo12、Lm−Neo20、およびLm−Neo30によって抑制された。加えて、30種類の新抗原を含むLm−Neo30は、20種類の新抗原を含むLm−Neo20よりも大幅に腫瘍増殖を抑制し、それは12種類の新抗原を含むLm−Neo12よりも大幅に腫瘍増殖を抑制した。同様に、Lm−Neo30、Lm−Neo20、およびLm−Neo12は対照群と比較するとそれぞれ生存時間を増加させ、Lm−Neo30は最も大きな防護効果をもたらし、Lm−Neo20は次に最も大きな防護効果をもたらす(図46C)。これらのデータは、ネオエピトープを担持するLmを用いるワクチン接種により抗腫瘍効果を付与することが可能であること、およびネオエピトープ数の増加により抗腫瘍効果が増大することを示している。
実施例33:Lm新抗原コンストラクトで免疫されたマウスにおけるネオエピトープ特異的免疫質
実施例33:Lm新抗原コンストラクトで免疫されたマウスにおけるネオエピトープ特異的免疫質
r M2、1−20、81−100、101−120、121−140、Lm2712#1、およびLm2712#3ネオエピトープコンストラクトを用いる免疫後のC57BL/6マウスにおけるネオエピトープおよびシグナルペプチド特異的応答を評価するために実験を設計した。公知のT細胞H−2Db PSA65〜73(HCIRNKSVI)、VvB8R(TSYKFESV)、IAV PA(SSLENFRAYV)を用いる五量体染色、ならびにIFN−γの細胞内サイトカイン染色により評価されるネオエピトープペプチド特異的応答によってネオエピトープおよびシグナルペプチド特異的免疫応答を検出する。免疫スケジュールおよび株の詳細が表20に提示されている。
表20. 免疫スケジュール
これらのコンストラクトの各々は、肺コンストラクト実験の全てにおいて使用された同一の2712肺試料に由来する突然変異を標的とする。rM2は、200非同義突然変異プールに由来する20種類の21merの無作為順序である。1−20はその順序で最初の20非同義突然変異を含む。同じことが81−100、101−120、および121−140に付いて当てはまる。2712#1は50種類の21mer(1〜50)を含む。2712#3は50種類の21mer(101〜150)を含む。
免疫療法の調製.
1. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
2. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
3. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
4. 適切な終濃度までPBS中に再懸濁する。
1. −80℃の1バイアルを37℃の水槽内で融かす。
2. 14,000rpmで2分間にわたって遠心分離し、上清を捨てる。
3. 1mLのPBSで2回洗浄し、PBSを捨てる。
4. 適切な終濃度までPBS中に再懸濁する。
単離された脾細胞の調製
1. 滅菌したピンセットとハサミを使用して脾臓を採取する。
2. 2枚のスライドグラスまたは3mLの注射筒のピストン棒の後端を使用して洗浄培地(RPMIのみ)中で各脾臓をすりつぶす。
3. その培地中の細胞を15mLのチューブに移す。
4. 細胞を室温で5分間にわたって1,000rpmで沈殿させる。
5. 上清を捨て、残っている洗浄緩衝液中に細胞を穏やかに再懸濁し、そして脾臓当たり2mLのRBC溶解緩衝液をその細胞ペレットに添加する。そのチューブを叩くことにより溶解緩衝液で細胞を穏やかに混合し、そして1分間待機する。
6. 直ちに10mlのc−RPMI培地をその細胞懸濁液に添加して溶解緩衝液を不活化する。
7. 細胞を室温で5分間にわたって1,000で遠心分離する。
8. それらの細胞をセルストレーナーに通し、10mLのc−RPMIでもう1回それらの細胞を洗浄する。
9. 血球計算盤/Moxi Flowを使用して細胞を計数し、トリパンブルー染色により生存度をチェックする。脾臓はそれぞれ約1〜2×108細胞を産するはずである。
10. 五量体染色とELISpot用にそれらの細胞を分ける。
IFNγ向けのELISpot
1. 滅菌したピンセットとハサミを使用して脾臓を採取する。
2. 2枚のスライドグラスまたは3mLの注射筒のピストン棒の後端を使用して洗浄培地(RPMIのみ)中で各脾臓をすりつぶす。
3. その培地中の細胞を15mLのチューブに移す。
4. 細胞を室温で5分間にわたって1,000rpmで沈殿させる。
5. 上清を捨て、残っている洗浄緩衝液中に細胞を穏やかに再懸濁し、そして脾臓当たり2mLのRBC溶解緩衝液をその細胞ペレットに添加する。そのチューブを叩くことにより溶解緩衝液で細胞を穏やかに混合し、そして1分間待機する。
6. 直ちに10mlのc−RPMI培地をその細胞懸濁液に添加して溶解緩衝液を不活化する。
7. 細胞を室温で5分間にわたって1,000で遠心分離する。
8. それらの細胞をセルストレーナーに通し、10mLのc−RPMIでもう1回それらの細胞を洗浄する。
9. 血球計算盤/Moxi Flowを使用して細胞を計数し、トリパンブルー染色により生存度をチェックする。脾臓はそれぞれ約1〜2×108細胞を産するはずである。
10. 五量体染色とELISpot用にそれらの細胞を分ける。
IFNγ向けのELISpot
1日目 チューブの調製:PMA(完全培地中に1:1000に希釈) 下で述べられるように細胞を調製した(各マウスについて5×106/ml) 。
1) 完全培地(BMEを含む)を調製する 100mL
2) 第1群/第1マウス細胞(5×106/mLのBME含有完全培地) 2mL
3) 第2群/第1マウス細胞(5×106/mLのBME含有完全培地) 2mL
4) 第3群/第1マウス細胞(5×106/mLのBME含有完全培地) 2mL
5) 第1群/第1マウス細胞(5×104/mLのBME含有完全培地) 2mL
6) 第2群/第1マウス細胞(5×104/mLのBME含有完全培地) 2mL
7) 第3群/第1マウス細胞(5×104/mLのBME含有完全培地) 2mL
8) エピトープ無し(チューブ1の培地) 3mL
9) E7ペプチド(チューブ1の培地mL当たり1mMのペプチドの2ulを添加する)‐ 16mL
10) PMA(チューブ1の培地mL当たり1ug/mLのストックの10ulを添加する)+イオノマイシン(チューブ1の培地mL当たり1mg/mLのストックの1μLを添加する) 5mL
1) 完全培地(BMEを含む)を調製する 100mL
2) 第1群/第1マウス細胞(5×106/mLのBME含有完全培地) 2mL
3) 第2群/第1マウス細胞(5×106/mLのBME含有完全培地) 2mL
4) 第3群/第1マウス細胞(5×106/mLのBME含有完全培地) 2mL
5) 第1群/第1マウス細胞(5×104/mLのBME含有完全培地) 2mL
6) 第2群/第1マウス細胞(5×104/mLのBME含有完全培地) 2mL
7) 第3群/第1マウス細胞(5×104/mLのBME含有完全培地) 2mL
8) エピトープ無し(チューブ1の培地) 3mL
9) E7ペプチド(チューブ1の培地mL当たり1mMのペプチドの2ulを添加する)‐ 16mL
10) PMA(チューブ1の培地mL当たり1ug/mLのストックの10ulを添加する)+イオノマイシン(チューブ1の培地mL当たり1mg/mLのストックの1μLを添加する) 5mL
ペプチドを用いる刺激:
a) 無菌PBS(200uL/ウェル)でプレートを4回洗浄する。
b) 200uL/ウェルの完全培地を添加する。室温で少なくとも30分間にわたってインキュベートする。
c) 培地を除去し、表において計画されているように細胞懸濁液(100uL/ウェル)と刺激因子(100uL/ウェル)を添加する。
d) アルミホイルでプレートを包み、37℃、5%CO2で24時間にわたってインキュベートする。
a) 無菌PBS(200uL/ウェル)でプレートを4回洗浄する。
b) 200uL/ウェルの完全培地を添加する。室温で少なくとも30分間にわたってインキュベートする。
c) 培地を除去し、表において計画されているように細胞懸濁液(100uL/ウェル)と刺激因子(100uL/ウェル)を添加する。
d) アルミホイルでプレートを包み、37℃、5%CO2で24時間にわたってインキュベートする。
2日目 スポットの検出
a) プレートを空にして細胞に対して除去処理を施し、PBS(200uL/ウェル)で5回洗浄する。
b) 100uL/ウェルの希釈R4−6A2−ビオチンを添加し、室温で2時間にわたってインキュベートする。
c) PBS(200uL/ウェル)で5回洗浄する。
d) 100uL/ウェルの希釈ストレプトアビジン−ALPを添加し、室温で1時間にわたってインキュベートする。
e) PBS(200uL/ウェル)で5回洗浄する。
f) フィルター(0.45μmフィルター)濾過したすぐに使用可能な100uL/ウェルの基質溶液(BCIP/NBT)を添加し、明確なスポットが現れるまで現像する。
g) 水道水中で徹底的に洗浄することによりカラー現像を停止する。
h) プレートを放置して乾燥させ、次の日にスポットを数える。
a) プレートを空にして細胞に対して除去処理を施し、PBS(200uL/ウェル)で5回洗浄する。
b) 100uL/ウェルの希釈R4−6A2−ビオチンを添加し、室温で2時間にわたってインキュベートする。
c) PBS(200uL/ウェル)で5回洗浄する。
d) 100uL/ウェルの希釈ストレプトアビジン−ALPを添加し、室温で1時間にわたってインキュベートする。
e) PBS(200uL/ウェル)で5回洗浄する。
f) フィルター(0.45μmフィルター)濾過したすぐに使用可能な100uL/ウェルの基質溶液(BCIP/NBT)を添加し、明確なスポットが現れるまで現像する。
g) 水道水中で徹底的に洗浄することによりカラー現像を停止する。
h) プレートを放置して乾燥させ、次の日にスポットを数える。
結果
表21は、25Dアッセイを介して21merの分泌を検出できたのか詳細に示している。
表21 肺免疫原性のまとめ
図51は様々なコンストラクトで免疫されたマウスにおけるSIINFEKL特異的CD8 T細胞応答をまとめている。2712#1 50−21−merコンストラクトを除く全てのコンストラクトにおいてSIINFEKLに対する免疫応答が検出された(例えば、ネオエピトープ21merアミノ酸鎖の代用タグが宿主に分泌し、その宿主はその21merアミノ酸鎖に対する免疫応答を生成する)。
重要なことに、25Dアッセイを介して陽性選別体としてスクリーニングされなかった3種類のコンストラクト(rM2、1−20、および2712#3)は実際にはインビボ免疫応答を生成した(その応答は、25Dによって陽性とスクリーニングされるコンストラクトよりもかなり小さいが)。さらに、最大で50種類の21merを含むコンストラクトに対する免疫応答を生成することができた。
実施例34:27merの試験
27アミノ酸から構成されるネオエピトープコンストラクト、すなわち「27mer」を使用して上記のように25Dアッセイを実施した。結果が下の表22に示されており、それらの結果はそれらのコンストラクトが21mer以外のオリゴマーから構成され得ることを示している。
表22:25D−APCの検出(27merを使用するアッセイ)
上または下で引用されている全ての特許提出物、ウェッブサイト、他の刊行物、受託番号などは、それぞれ個々のものが参照により援用されると具体的および個別に示された場合と同じ程度で全ての目的のために全体が参照により援用される。異なるバージョンの配列がある受託番号と異なる時点で関連する場合、本出願の有効な提出日におけるその受託番号と関連するバージョンとする。有効な提出日は、実際の提出日、または該当する場合はその受託番号について言及している優先出願の提出日のうちの早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェッブサイトなどが異なる時点で公開されている場合、別段の指示が無い限り、本出願の有効提出日の時点で最も細菌に公開されたバージョンとする。本発明のあらゆる特徴、工程、要素、実施形態、または態様は、別途具体的な指示が無い限り、他のあらゆるものと併用され得る。本発明のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、この時点で当業者には数多くの改変、置換、変更、および均等物が思い浮かぶだろう。したがって、本発明の真の趣旨内に含まれるかかるすべての改変および変更が添付の特許請求の範囲により網羅されるものされることを理解すべきである。
(項目1)
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 前記対象の疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) ステップ(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、および
(c) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリア株を保存するか、あるいは(ii)前記弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。
(項目2)
をさらに含む項目1に記載の方法。
(d) ステップ(c)の前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
(e) ステップ(d)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
(f) 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換すること、および
(g) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは(ii)前記第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与すること
(項目3)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約5〜50アミノ酸長である、項目1〜2のいずれか一項に記載の方法。
(項目4)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約8〜27アミノ酸長である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記1つ以上のネオエピトープが5〜100個のネオエピトープを含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記1つ以上のネオエピトープが15〜35個のネオエピトープ、8〜11個のネオエピトープまたは11〜16個のネオエピトープを含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記1つ以上のネオエピトープが複数のネオエピトープを含み、ステップ(b)の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドの順序のランダム化を1回以上繰り返すことがステップ(b)に含まれる、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
それぞれが異なるセットの1つ以上のネオエピトープを含む複数の弱毒化組換え型リステリア株を作成するために前記方法が繰り返される、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株が5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の弱毒化組換え型リステリア株を含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株の混合物が約5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを含む、項目8または9に記載の方法。
(項目11)
ステップ(a)における前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFを前記健常生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記ORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
ステップ(d)において前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む生体試料の獲得を含む、項目1〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記疾患担持生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、項目12に記載の方法。
(項目14)
ステップ(d)の前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、項目1〜13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
ステップ(ii)の前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記疾患または症状が感染症、腫瘍、または癌である、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、項目1〜17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列と前記健常生体試料より抽出された前記核酸配列がエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、項目1〜19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、項目1〜20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、項目1〜21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記弱毒化組換え型リステリアが前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを分泌する、項目1〜22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記1つ以上のネオエピトープがT細胞エピトープを含む、項目1〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
プラスミドベクターまたはファージベクターを使用してステップ(b)の前記形質転換が行われる、項目1〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、項目1〜25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
ミニ遺伝子核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターを使用してステップ(b)の前記形質転換が行われ、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含み、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、および
(c) 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、
前記細菌分泌シグナル配列、前記ユビキチンタンパク質、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、項目1〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
ステップ(b)が、前記1つ以上のペプチドの発現および分泌を確認するために前記弱毒化組換え型リステリア株を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、項目1〜27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記プラスミドが組込み型プラスミドである、あらゆる前記の項目25に記載の方法。
(項目30)
前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、項目29に記載の方法。
(項目31)
抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、項目29または30に記載の方法。
(項目32)
前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、項目26に記載の方法。
(項目33)
前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、項目32に記載の方法。
(項目35)
前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、項目32に記載の方法。
(項目36)
前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、項目32に記載の方法。
(項目37)
前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、項目36に記載の方法。
(項目39)
前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、項目36に記載の方法。
(項目40)
前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む、項目1〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、項目1〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、項目1〜41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、項目1〜42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、項目1〜43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連エピトープを含む、項目1〜44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記感染症が感染性ウイルス病である、項目1〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記感染症が感染性細菌病である、項目1〜46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記弱毒化リステリアが1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、項目1〜48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記突然変異がactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、dal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、項目1〜49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記突然変異が前記1つ以上の内在性遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、項目1〜50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記ベクターが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームをさらに備える、項目1〜51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、項目1〜53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
ステップ(c)(ii)が前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む、項目1〜54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、項目55に記載の方法。
(項目57)
ステップ(c)(ii)が免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む、項目1〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、項目57に記載の方法。
(項目60)
ステップ(c)(ii)の前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、項目1〜59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記免疫応答が抗感染症応答を含む、項目60に記載の方法。
(項目63)
前記感染症がウイルス感染症を含む、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記感染症が細菌感染症を含む、項目62に記載の方法。
(項目65)
前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、項目1〜64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が前記個別免疫療法により増加する、項目1〜65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
項目1〜66のいずれか一項に記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
(項目68)
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) ステップ(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、またはステップ(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製するステップ、および
(c) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは(ii)前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。
(項目69)
をさらに含む項目68に記載の方法。
(d) ステップ(c)の前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
(e) ステップ(d)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
(f) ステップ(d)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする前記1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用して第2DNA免疫療法ベクターまたは第2ペプチド免疫療法ベクターを作製するステップ、および
(g) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために前記第2ベクターまたは前記第2DNA免疫療法または前記第2ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記第2ベクター、前記第2DNA免疫療法、または前記第2ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップ
(項目70)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約5〜50アミノ酸長である、項目68または69のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約8〜27アミノ酸長である、項目70に記載の方法。
(項目72)
前記1つ以上のネオエピトープが5〜100個のネオエピトープを含む、項目68または69のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
前記1つ以上のネオエピトープが15〜35個のネオエピトープ、8〜11個のネオエピトープまたは11〜16個のネオエピトープを含む、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記1つ以上のネオエピトープが複数のネオエピトープを含み、ステップ(b)の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドの順序のランダム化を1回以上繰り返すことがステップ(b)に含まれる、項目68〜73のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
それぞれ異なるセットの1つ以上のネオエピトープを含む複数のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法を作製するために前記方法が繰り返される、項目68〜74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
前記複数のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法が5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の弱毒化組換え型リステリア株を含む、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記複数のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法の混合物が約5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを含む、項目75または76に記載の方法。
(項目78)
ステップ(a)における前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFを前記健常生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記ORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、項目77に記載の方法。
(項目79)
ステップ(d)における前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む前記組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む第2生体試料の獲得を含む、項目69〜78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
前記疾患担持生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、項目68〜79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
ステップ(d)の前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、項目69〜80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
ステップ(ii)の前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、項目82に記載の方法。
(項目84)
前記疾患または症状が感染症、腫瘍、または癌である、項目68〜83のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、項目84に記載の方法。
(項目86)
前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、項目68〜86のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列と前記健常生体試料より抽出された前記核酸配列がエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、項目68〜87のいずれか一項に記載の方法。
(項目89)
前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、項目68〜88のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、項目68〜89のいずれか一項に記載の方法。
(項目91)
前記1つ以上のネオエピトープがT細胞エピトープを含む、項目68〜90のいずれか一項に記載の方法。
(項目92)
前記ベクターがワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子である、項目68〜91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
ステップ(b)が、前記1つ以上のペプチドの発現を確認するために前記ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記DNA免疫療法が前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含む前記核酸配列を含む、項目68〜93のいずれか一項に記載の方法。
(項目95)
前記核酸配列がプラスミドの形態である、項目94に記載の方法。
(項目96)
前記プラスミドが組込み型プラスミドまたは染色体外マルチコピープラスミドである、項目68〜95のいずれか一項に記載の方法。
(項目97)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、項目68〜96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
前記ペプチド免疫療法が前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、各ペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片と融合しているか、または混合されている、項目68〜96のいずれか一項に記載の方法。
(項目99)
前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、項目97〜98のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、項目99に記載の方法。
(項目102)
前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、項目99に記載の方法。
(項目103)
前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、項目99に記載の方法。
(項目104)
前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、項目103に記載の方法。
(項目106)
前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、項目103に記載の方法。
(項目107)
前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む、項目68〜106のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、項目107に記載の方法。
(項目109)
前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、項目68〜108のいずれか一項に記載の方法。
(項目110)
前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、項目108〜109のいずれか一項に記載の方法。
(項目111)
前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、項目84に記載の方法。
(項目112)
前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連エピトープを含む、項目68〜111のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
前記感染症が感染性ウイルス病または感染性細菌病である、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、項目113に記載の方法。
(項目115)
ステップ(c)(ii)が前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む、項目68〜114のいずれか一項に記載の方法。
(項目116)
前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、項目115に記載の方法。
(項目117)
ステップ(c)(ii)が免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む、項目68〜116のいずれか一項に記載の方法。
(項目118)
前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、項目117に記載の方法。
(項目119)
ステップ(c)(ii)の前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、項目68〜118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、項目119に記載の方法。
(項目121)
前記免疫応答が抗感染症応答を含む、項目119に記載の方法。
(項目122)
前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、項目121に記載の方法。
(項目123)
前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、項目68〜122のいずれか一項に記載の方法。
(項目124)
項目68〜123のいずれか一項に記載の方法により作製された1つ以上の弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
(項目125)
各弱毒化組換え型リステリア株が疾患または症状を有する対象の疾患担持生体試料に存在する1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含んでいる1つ以上の弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
(項目126)
前記1つ以上の弱毒化組換え型リステリア株が複数の弱毒化組換え型リステリア株を含み、各弱毒化組換え型リステリア株の前記核酸配列が異なるセットの1つ以上のネオエピトープをコードする、項目125に記載の免疫原性混合物。
(項目127)
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株が5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の弱毒化組換え型リステリア株を含む、項目125〜126のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
(項目128)
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株の混合物が約5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを含む、項目125〜127のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
(項目129)
前記混合物中の前記弱毒化組換え型リステリア株の各々が1つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む、項目128に記載の免疫原性混合物。
(項目130)
前記混合物中の前記組換え型リステリア株の各々が1〜20個のネオエピトープを発現する、項目129に記載の組成物の免疫原性混合物。
(項目131)
対象において個別化抗腫瘍応答を誘発する方法であって、項目128〜131のいずれか一項に記載の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法。
(項目132)
対象において腫瘍を予防または治療する方法であって、項目125〜130のいずれか一項に記載の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与することを含む前記方法。
(項目132)
次の要素、すなわち、免疫原性ポリペプチドが融合している第1ネオエピトープアミノ酸配列、第1リンカー配列を介して機能的であるように前記第1ネオエピトープアミノ酸配列が連結している第2ネオエピトープアミノ酸配列、および第2リンカー配列を介して機能的であるように前記第2ネオエピトープアミノ酸配列が連結している少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクト。
(項目133)
次の要素、すなわち、N末端短縮型LLO(tLLO)が融合している第1ネオエピトープアミノ酸配列、第1リンカー配列を介して機能的であるように前記第1ネオエピトープアミノ酸配列が連結している第2ネオエピトープアミノ酸配列、第2リンカー配列を介して機能的であるように前記第2ネオエピトープアミノ酸配列が連結している少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列、および第3リンカー配列を介して機能的であるようにC末端ヒスチジンタグに連結している最後のネオエピトープを含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクト。
(項目134)
前記第1ネオエピトープアミノ酸配列、前記第2ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約5〜50アミノ酸である、項目133に記載の核酸コンストラクト。
(項目135)
前記第1ネオエピトープアミノ酸配列、前記第2ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約8〜27アミノ酸、8〜11アミノ酸、または11〜16アミノ酸である、項目134に記載の核酸コンストラクト。
(項目136)
前記第1ネオエピトープアミノ酸配列、前記第2ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ21アミノ酸を含む、項目135に記載の核酸コンストラクト。
(項目137)
前記核酸コンストラクトが5〜100個のネオエピトープをコードする、項目132〜136のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目138)
前記核酸コンストラクトが15〜35個のネオエピトープをコードする、項目137に記載の核酸コンストラクト。
(項目139)
前記要素がN末端からC末端へと配置されているか、または機能的であるように連結されている、項目132〜138のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目140)
前記tLLOが機能的であるようにプロモーター配列に連結されている、項目137〜139のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目141)
前記プロモーター配列がhlyプロモーター配列である、項目140に記載の核酸コンストラクト。
(項目142)
前記核酸コンストラクトが前記ヒスチジンタグをコードする配列の後に2つの終止コドンを含む、項目132〜141のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目143)
前記ヒスチジンタグが、機能的であるようにN末端でSIINFEKLペプチドに連結されている6×ヒスチジンタグである、項目132〜142のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目144)
前記第1リンカー配列、前記第2リンカー配列、および前記第3リンカー配列のうちの1つ以上が4×グリシンリンカーである、項目132〜143のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目145)
前記コンストラクトが次の構成成分、すなわち、pHly−tLLO−第一21mer−4×グリシンリンカーG1−第二21mer−4×グリシンリンカーG2−…−SIINFEKL−6×Hisタグ−2×終止コドンを含む、項目132〜144のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目146)
項目132〜145のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトによってコードされるキメラタンパク質。
(項目147)
項目132〜145のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、または項目146に記載のキメラタンパク質を発現する組換え型リステリア株。
(項目1)
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 前記対象の疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) ステップ(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、および
(c) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換え型リステリア株を保存するか、あるいは(ii)前記弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。
(項目2)
をさらに含む項目1に記載の方法。
(d) ステップ(c)の前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
(e) ステップ(d)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
(f) 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで第2弱毒化組換え型リステリア株を形質転換すること、および
(g) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは(ii)前記第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与すること
(項目3)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約5〜50アミノ酸長である、項目1〜2のいずれか一項に記載の方法。
(項目4)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約8〜27アミノ酸長である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記1つ以上のネオエピトープが5〜100個のネオエピトープを含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記1つ以上のネオエピトープが15〜35個のネオエピトープ、8〜11個のネオエピトープまたは11〜16個のネオエピトープを含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記1つ以上のネオエピトープが複数のネオエピトープを含み、ステップ(b)の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドの順序のランダム化を1回以上繰り返すことがステップ(b)に含まれる、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
それぞれが異なるセットの1つ以上のネオエピトープを含む複数の弱毒化組換え型リステリア株を作成するために前記方法が繰り返される、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株が5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の弱毒化組換え型リステリア株を含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株の混合物が約5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを含む、項目8または9に記載の方法。
(項目11)
ステップ(a)における前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFを前記健常生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記ORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
ステップ(d)において前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む生体試料の獲得を含む、項目1〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記疾患担持生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、項目12に記載の方法。
(項目14)
ステップ(d)の前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、項目1〜13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
ステップ(ii)の前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記疾患または症状が感染症、腫瘍、または癌である、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、項目1〜17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列と前記健常生体試料より抽出された前記核酸配列がエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、項目1〜19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、項目1〜20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、項目1〜21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記弱毒化組換え型リステリアが前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを分泌する、項目1〜22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記1つ以上のネオエピトープがT細胞エピトープを含む、項目1〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
プラスミドベクターまたはファージベクターを使用してステップ(b)の前記形質転換が行われる、項目1〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、項目1〜25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
ミニ遺伝子核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターを使用してステップ(b)の前記形質転換が行われ、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含み、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、および
(c) 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、
前記細菌分泌シグナル配列、前記ユビキチンタンパク質、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、項目1〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
ステップ(b)が、前記1つ以上のペプチドの発現および分泌を確認するために前記弱毒化組換え型リステリア株を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、項目1〜27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記プラスミドが組込み型プラスミドである、あらゆる前記の項目25に記載の方法。
(項目30)
前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、項目29に記載の方法。
(項目31)
抗生物質選択が無い状態で前記リステリア株において前記プラスミドが安定的に維持される、項目29または30に記載の方法。
(項目32)
前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、項目26に記載の方法。
(項目33)
前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、項目32に記載の方法。
(項目35)
前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、項目32に記載の方法。
(項目36)
前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、項目32に記載の方法。
(項目37)
前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、項目36に記載の方法。
(項目39)
前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、項目36に記載の方法。
(項目40)
前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む、項目1〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、項目1〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、項目1〜41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、項目1〜42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、項目1〜43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連エピトープを含む、項目1〜44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記感染症が感染性ウイルス病である、項目1〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記感染症が感染性細菌病である、項目1〜46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記弱毒化リステリアが1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、項目1〜48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記突然変異がactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、dal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択される、項目1〜49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記突然変異が前記1つ以上の内在性遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、項目1〜50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記ベクターが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームをさらに備える、項目1〜51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、項目1〜53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
ステップ(c)(ii)が前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む、項目1〜54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、項目55に記載の方法。
(項目57)
ステップ(c)(ii)が免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む、項目1〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、項目57に記載の方法。
(項目60)
ステップ(c)(ii)の前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、項目1〜59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記免疫応答が抗感染症応答を含む、項目60に記載の方法。
(項目63)
前記感染症がウイルス感染症を含む、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記感染症が細菌感染症を含む、項目62に記載の方法。
(項目65)
前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、項目1〜64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
前記疾患または症状を有する前記対象の生存時間が前記個別免疫療法により増加する、項目1〜65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
項目1〜66のいずれか一項に記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
(項目68)
疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) ステップ(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、またはステップ(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製するステップ、および
(c) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは(ii)前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。
(項目69)
をさらに含む項目68に記載の方法。
(d) ステップ(c)の前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
(e) ステップ(d)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
(f) ステップ(d)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする前記1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用して第2DNA免疫療法ベクターまたは第2ペプチド免疫療法ベクターを作製するステップ、および
(g) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために前記第2ベクターまたは前記第2DNA免疫療法または前記第2ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記第2ベクター、前記第2DNA免疫療法、または前記第2ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与するステップ
(項目70)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約5〜50アミノ酸長である、項目68または69のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約8〜27アミノ酸長である、項目70に記載の方法。
(項目72)
前記1つ以上のネオエピトープが5〜100個のネオエピトープを含む、項目68または69のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
前記1つ以上のネオエピトープが15〜35個のネオエピトープ、8〜11個のネオエピトープまたは11〜16個のネオエピトープを含む、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記1つ以上のネオエピトープが複数のネオエピトープを含み、ステップ(b)の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドの順序のランダム化を1回以上繰り返すことがステップ(b)に含まれる、項目68〜73のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
それぞれ異なるセットの1つ以上のネオエピトープを含む複数のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法を作製するために前記方法が繰り返される、項目68〜74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
前記複数のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法が5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の弱毒化組換え型リステリア株を含む、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記複数のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法の混合物が約5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを含む、項目75または76に記載の方法。
(項目78)
ステップ(a)における前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFを前記健常生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記ORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、項目77に記載の方法。
(項目79)
ステップ(d)における前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む前記組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む第2生体試料の獲得を含む、項目69〜78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
前記疾患担持生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、項目68〜79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
ステップ(d)の前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、項目69〜80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
ステップ(ii)の前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、項目82に記載の方法。
(項目84)
前記疾患または症状が感染症、腫瘍、または癌である、項目68〜83のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、項目84に記載の方法。
(項目86)
前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、項目68〜86のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列と前記健常生体試料より抽出された前記核酸配列がエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、項目68〜87のいずれか一項に記載の方法。
(項目89)
前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、項目68〜88のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、項目68〜89のいずれか一項に記載の方法。
(項目91)
前記1つ以上のネオエピトープがT細胞エピトープを含む、項目68〜90のいずれか一項に記載の方法。
(項目92)
前記ベクターがワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子である、項目68〜91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
ステップ(b)が、前記1つ以上のペプチドの発現を確認するために前記ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記DNA免疫療法が前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含む前記核酸配列を含む、項目68〜93のいずれか一項に記載の方法。
(項目95)
前記核酸配列がプラスミドの形態である、項目94に記載の方法。
(項目96)
前記プラスミドが組込み型プラスミドまたは染色体外マルチコピープラスミドである、項目68〜95のいずれか一項に記載の方法。
(項目97)
前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、項目68〜96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
前記ペプチド免疫療法が前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、各ペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片と融合しているか、または混合されている、項目68〜96のいずれか一項に記載の方法。
(項目99)
前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、項目97〜98のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
前記tLLOタンパク質が配列番号3で表される、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記actAが配列番号12〜13および配列番号15〜18で表される、項目99に記載の方法。
(項目102)
前記PESTアミノ酸配列が配列番号5〜10で表される配列から選択される、項目99に記載の方法。
(項目103)
前記変異型LLOがコレステロール結合ドメイン(CBD)に突然変異を含む、項目99に記載の方法。
(項目104)
前記突然変異が配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せを含む、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換を含み、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む、項目103に記載の方法。
(項目106)
前記突然変異が配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、項目103に記載の方法。
(項目107)
前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む、項目68〜106のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、項目107に記載の方法。
(項目109)
前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、項目68〜108のいずれか一項に記載の方法。
(項目110)
前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、項目108〜109のいずれか一項に記載の方法。
(項目111)
前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、項目84に記載の方法。
(項目112)
前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連エピトープを含む、項目68〜111のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
前記感染症が感染性ウイルス病または感染性細菌病である、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、項目113に記載の方法。
(項目115)
ステップ(c)(ii)が前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む、項目68〜114のいずれか一項に記載の方法。
(項目116)
前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、項目115に記載の方法。
(項目117)
ステップ(c)(ii)が免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む、項目68〜116のいずれか一項に記載の方法。
(項目118)
前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、項目117に記載の方法。
(項目119)
ステップ(c)(ii)の前記投与により前記対象において個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じる、項目68〜118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
前記免疫応答が抗癌応答または抗腫瘍応答を含む、項目119に記載の方法。
(項目121)
前記免疫応答が抗感染症応答を含む、項目119に記載の方法。
(項目122)
前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、項目121に記載の方法。
(項目123)
前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、項目68〜122のいずれか一項に記載の方法。
(項目124)
項目68〜123のいずれか一項に記載の方法により作製された1つ以上の弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
(項目125)
各弱毒化組換え型リステリア株が疾患または症状を有する対象の疾患担持生体試料に存在する1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含んでいる1つ以上の弱毒化組換え型リステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
(項目126)
前記1つ以上の弱毒化組換え型リステリア株が複数の弱毒化組換え型リステリア株を含み、各弱毒化組換え型リステリア株の前記核酸配列が異なるセットの1つ以上のネオエピトープをコードする、項目125に記載の免疫原性混合物。
(項目127)
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株が5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の弱毒化組換え型リステリア株を含む、項目125〜126のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
(項目128)
前記複数の弱毒化組換え型リステリア株の混合物が約5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを含む、項目125〜127のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
(項目129)
前記混合物中の前記弱毒化組換え型リステリア株の各々が1つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む、項目128に記載の免疫原性混合物。
(項目130)
前記混合物中の前記組換え型リステリア株の各々が1〜20個のネオエピトープを発現する、項目129に記載の組成物の免疫原性混合物。
(項目131)
対象において個別化抗腫瘍応答を誘発する方法であって、項目128〜131のいずれか一項に記載の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法。
(項目132)
対象において腫瘍を予防または治療する方法であって、項目125〜130のいずれか一項に記載の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与することを含む前記方法。
(項目132)
次の要素、すなわち、免疫原性ポリペプチドが融合している第1ネオエピトープアミノ酸配列、第1リンカー配列を介して機能的であるように前記第1ネオエピトープアミノ酸配列が連結している第2ネオエピトープアミノ酸配列、および第2リンカー配列を介して機能的であるように前記第2ネオエピトープアミノ酸配列が連結している少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクト。
(項目133)
次の要素、すなわち、N末端短縮型LLO(tLLO)が融合している第1ネオエピトープアミノ酸配列、第1リンカー配列を介して機能的であるように前記第1ネオエピトープアミノ酸配列が連結している第2ネオエピトープアミノ酸配列、第2リンカー配列を介して機能的であるように前記第2ネオエピトープアミノ酸配列が連結している少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列、および第3リンカー配列を介して機能的であるようにC末端ヒスチジンタグに連結している最後のネオエピトープを含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクト。
(項目134)
前記第1ネオエピトープアミノ酸配列、前記第2ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約5〜50アミノ酸である、項目133に記載の核酸コンストラクト。
(項目135)
前記第1ネオエピトープアミノ酸配列、前記第2ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約8〜27アミノ酸、8〜11アミノ酸、または11〜16アミノ酸である、項目134に記載の核酸コンストラクト。
(項目136)
前記第1ネオエピトープアミノ酸配列、前記第2ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ21アミノ酸を含む、項目135に記載の核酸コンストラクト。
(項目137)
前記核酸コンストラクトが5〜100個のネオエピトープをコードする、項目132〜136のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目138)
前記核酸コンストラクトが15〜35個のネオエピトープをコードする、項目137に記載の核酸コンストラクト。
(項目139)
前記要素がN末端からC末端へと配置されているか、または機能的であるように連結されている、項目132〜138のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目140)
前記tLLOが機能的であるようにプロモーター配列に連結されている、項目137〜139のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目141)
前記プロモーター配列がhlyプロモーター配列である、項目140に記載の核酸コンストラクト。
(項目142)
前記核酸コンストラクトが前記ヒスチジンタグをコードする配列の後に2つの終止コドンを含む、項目132〜141のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目143)
前記ヒスチジンタグが、機能的であるようにN末端でSIINFEKLペプチドに連結されている6×ヒスチジンタグである、項目132〜142のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目144)
前記第1リンカー配列、前記第2リンカー配列、および前記第3リンカー配列のうちの1つ以上が4×グリシンリンカーである、項目132〜143のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目145)
前記コンストラクトが次の構成成分、すなわち、pHly−tLLO−第一21mer−4×グリシンリンカーG1−第二21mer−4×グリシンリンカーG2−…−SIINFEKL−6×Hisタグ−2×終止コドンを含む、項目132〜144のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
(項目146)
項目132〜145のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトによってコードされるキメラタンパク質。
(項目147)
項目132〜145のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、または項目146に記載のキメラタンパク質を発現する組換え型リステリア株。
Claims (96)
- 疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 前記対象の疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) ステップ(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換するステップ、および
(c) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために前記弱毒化組換えリステリア株を保存するか、あるいは(ii)前記弱毒化組換えリステリア株を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。 - をさらに含む請求項1に記載の方法。
(d) ステップ(c)の前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
(e) ステップ(d)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
(f) 前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで第2弱毒化組換えリステリア株を形質転換すること、および
(g) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために第2弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは(ii)前記第2弱毒化組換え型リステリア株を含む第2組成物を前記対象に投与すること - ステップ(d)において前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記弱毒化組換え型リステリア株を含む前記組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む生体試料の獲得を含む、請求項2に記載の方法。
- ステップ(d)の前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、請求項2または3に記載の方法。 - ステップ(ii)の前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、請求項5に記載の方法。
- それぞれが異なるセットの1つ以上のネオエピトープを含む複数の弱毒化組換えリステリア株を作成するために前記方法が繰り返される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の弱毒化組換えリステリア株が5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の弱毒化組換えリステリア株を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記複数の弱毒化組換えリステリア株の混合株が約5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを含む、請求項7または8に記載の方法。
- 前記弱毒化組換え型リステリア株が前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを分泌する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)が、前記1つ以上のペプチドの発現および分泌を確認するために前記弱毒化組換えリステリア株を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- プラスミドベクターまたはファージベクターを使用してステップ(b)の前記形質転換が行われる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- ミニ遺伝子核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターを使用してステップ(b)の前記形質転換が行われ、前記コンストラクトがキメラタンパク質をコードする1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含み、前記キメラタンパク質が
(a) 細菌分泌シグナル配列、
(b) ユビキチン(Ub)タンパク質、および
(c) 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、
前記細菌分泌シグナル配列、前記ユビキチンタンパク質、および前記1つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記プラスミドが組込み型プラスミドである、請求項12に記載の方法。
- 前記プラスミドが染色体外マルチコピープラスミドである、請求項12に記載の方法。
- 抗生物質選択が無い状態で前記プラスミドが前記組換え型リステリア株内で安定的に維持される、請求項14または15に記載の方法。
- 前記弱毒化組換え型リステリア株が1つ以上の内在性遺伝子に突然変異を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記突然変異がactA遺伝子突然変異、prfA突然変異、actAおよびinlB二重突然変異、dal/dal遺伝子二重突然変異、dal/dat/actA遺伝子三重突然変異、またはそれらの組合せから選択され、且つ、前記突然変異が前記1つ以上の内在性遺伝子の不活性化、短縮化、欠失、置換、または分断を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記ベクターが代謝酵素をコードするオープン・リーディング・フレームをさらに備える、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項19に記載の方法。
- 前記リステリアがリステリア・モノサイトゲネスである、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
(a) 疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を健常生体試料より抽出された核酸配列内の1つ以上のORFと比較し、前記疾患担持試料の1つ以上のORF内にコードされる1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を前記比較により特定するステップ、
(b) ステップ(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換するか、またはステップ(a)において特定された前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用してDNA免疫療法ベクターまたはペプチド免疫療法ベクターを作製するステップ、および
(c) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために前記ベクターまたは前記DNA免疫療法または前記ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは(ii)前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与し、前記投与によって前記疾患または症状に対する個別化T細胞免疫応答を生じさせるステップを含む前記方法。 - をさらに含む請求項22に記載の方法。
(d) ステップ(c)の前記T細胞免疫応答に由来するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む前記対象の第2生体試料を獲得し、前記T細胞上のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子が結合する1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析すること、
(e) ステップ(d)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択すること、
(f) ステップ(d)において特定された前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする前記1つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸配列で第2ベクターを形質転換するか、または前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を使用して第2DNA免疫療法ベクターまたは第2ペプチド免疫療法ベクターを作製すること、および
(g) 二者択一的に、(i)所定の時点で前記対象に投与するために前記第2ベクターまたは前記第2DNA免疫療法または前記第2ペプチド免疫療法を保存するか、あるいは前記第2ベクター、前記第2DNA免疫療法、または前記第2ペプチド免疫療法を含む組成物を前記対象に投与すること - ステップ(d)における前記対象より第2生体試料を獲得する工程が、前記ベクター、前記DNA免疫療法、または前記ペプチド免疫療法を含む前記組成物の投与の後に増殖するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を含む第2生体試料の獲得を含む、請求項23に記載の方法。
- ステップ(d)の前記特徴分析過程が
(i) 前記疾患に対して応答するT細胞クローンまたはT浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させるステップ、および
(ii) 前記T細胞上のT細胞受容体が結合する特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子上に負荷された1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定するステップを含む、請求項23または24に記載の方法。 - ステップ(ii)の前記スクリーニングおよび特定がT細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記シーケンシングが関連デジタルソフトウェアおよびデータベースの使用を含む、請求項26に記載の方法。
- それぞれ異なるセットの1つ以上のネオエピトープを含む複数のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法を作製するために前記方法が繰り返される、請求項22〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法が5〜10種類、10〜15種類、15〜20種類、10〜20種類、20〜30種類、30〜40種類、または40〜50種類のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記複数のベクター、DNA免疫療法、またはペプチド免疫療法の混合物が約5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを含む、請求項28または29に記載の方法。
- 前記ベクターがワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子である、請求項22〜30のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)が、前記1つ以上のペプチドの発現を確認するために前記ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子を培養し、且つ、その特徴を分析することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
- 前記DNA免疫療法が前記1つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含む前記核酸配列を含む、請求項22〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸配列がプラスミドの形態である、請求項33に記載の方法。
- 前記プラスミドが組込み型プラスミドまたは染色体外マルチコピープラスミドである、請求項22〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチド免疫療法が前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドを含み、各ペプチドが免疫原性ポリペプチドまたはその断片と融合しているか、または混合されている、請求項22〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約5〜50アミノ酸長である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドのそれぞれが約8〜27アミノ酸長である、請求項37に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープが5〜100個のネオエピトープを含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープが15〜35個のネオエピトープ、8〜11個のネオエピトープまたは11〜16個のネオエピトープを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープが複数のネオエピトープを含み、ステップ(b)の前記核酸配列内の前記複数のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドの順序のランダム化を1回以上繰り返すことがステップ(b)に含まれる、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)における前記比較がスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFを前記健常生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記1つ以上のORFと比較するための関連のデジタルソフトウェアの使用を含み、
前記関連デジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性の特定のために前記疾患担持生体試料から抽出された前記核酸配列内の前記ORF中の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。 - 前記疾患担持生体試料が組織、細胞、血液、または血清である、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患または症状が感染症、腫瘍、または癌である、請求項1〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患または症状が感染症であり、前記感染症がウイルス感染症または細菌感染症を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記疾患または症状が前記腫瘍または癌であり、前記腫瘍または癌が乳癌または乳房腫瘍、子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍、Her2発現性癌またはHer2発現性腫瘍、黒色腫、膵臓癌または膵臓腫瘍、卵巣癌または卵巣腫瘍、胃癌または胃腫瘍、膵臓の癌病巣、肺腺癌、多形神経膠芽腫、大腸腺癌、肺扁平腺癌、胃腺癌、卵巣表面上皮性新生物、口腔扁平上皮癌、肺非小細胞癌、子宮内膜癌、膀胱癌または膀胱腫瘍、頭部頸部癌または頭部頸部腫瘍、前立腺癌、腎臓癌または腎臓腫瘍、骨癌または骨腫瘍、血液癌、または脳癌もしくは脳腫瘍を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記健常生体試料が前記疾患または症状を有する前記対象より獲得される、請求項1〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患担持生体試料より抽出された前記核酸配列と前記健常生体試料より抽出された前記核酸配列がエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを用いて決定される、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープがT細胞エピトープを含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープを含む前記1つ以上のペプチドがそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫原性のポリペプチドが変異型リステリオリジンO(LLO)タンパク質、短縮型LLO(tLLO)タンパク質、短縮型ActAタンパク質、またはPESTアミノ酸配列である、請求項52に記載の方法。
- 前記免疫原性ポリペプチドが配列番号3で表されるtLLOタンパク質である、請求項53に記載の方法。
- 前記免疫原性ポリペプチドが配列番号12〜13および配列番号15〜18のいずれか1つで表される短縮化ActAタンパク質である、請求項53に記載の方法。
- 前記免疫原性ポリペプチドが配列番号5〜10のいずれか1つで表されるPESTアミノ酸配列である、請求項53に記載の方法。
- 前記免疫原性ポリペプチドが前記変異型LLOタンパク質であり、前記変異型LLOタンパク質がコレステロール結合ドメイン(CBD)内に突然変異を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記突然変異が、(i)配列番号2の残基C484、W491、またはW492の置換、またはそれらのあらゆる組合せ、配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の1〜50アミノ酸非LLOペプチドによる置換であって、前記非LLOペプチドがネオエピトープを含むペプチドを含む前記置換、または配列番号68で表されるCBD内の1〜11アミノ酸の欠失を含む、請求項57に記載の方法。
- 前記1つ以上のペプチドが前記疾患に関連する異種抗原または自己抗原を含む、請求項1〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異種抗原または前記自己抗原が腫瘍関連抗原またはその断片である、請求項59に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープが癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む、請求項1〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腫瘍関連抗原またはその断片がヒトパピローマウイルス(HPV)−16−E6、HPV−16−E7、HPV−18−E6、HPV−18−E7、Her/2−neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体(AR)、PAK6、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、NY−ESO−1、角質層キモトリプシン酵素(SCCE)抗原、ウィルムス腫瘍抗原1(WT−1)、HIV−1 Gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、滑膜肉腫、X(SSX)−2、癌胎児性抗原(CEA)、黒色腫関連抗原E(MAGE−A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4)、インターロイキン13受容体α(IL13−R α)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97黒色腫抗原、KLH抗原、癌胎児性抗原(CEA)、gp100、MART1抗原、TRP−2、HSP−70、β−HCG、またはテスティシンを含む、請求項60または61に記載の方法。
- 前記1つ以上のネオエピトープが感染症関連エピトープ、感染性ウイルス病関連エピトープ、または感染性細菌病関連エピトープを含む、請求項1〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記感染症が以下の病原体のうちの1つ、すなわち、リーシュマニア、赤痢アメーバ(アメーバ症を発生する)、鞭虫属、BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、一価、二価、および三価の経口ポリオワクチン、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)ウイルスおよび他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シュードマレイ、コクシエラ・バーネッティイ(Q熱)、ブルセラ属の種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シッタシ(オウム病)、リシン毒素(トウゴマ由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア、食品担持および水担持病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ属の種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス,クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス,C型肝炎ウイルス,単純ヘルペスウイルス(HSV),ヒト免疫不全ウイルス(HIV),ヒトパピローマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性膣症、クラミジア・トラコマチス,サイトメガロウイルス,鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、ミュータンス菌、または腟トリコモナスによって引き起こされる、請求項63に記載の方法。
- ステップ(c)(ii)が前記対象へのアジュバントの投与をさらに含む、請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アジュバントが顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質、GM−CSFタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンQS21、モノホスホリルリピッドA、または非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項65に記載の方法。
- ステップ(c)(ii)が免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストの投与をさらに含む、請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害薬が抗PD−L1/PD−L2抗体もしくはその断片、抗PD−1抗体もしくはその断片、抗CTLA−4抗体もしくはその断片、または抗B7−H4抗体もしくはその断片である、請求項67に記載の方法。
- ステップ(c)(ii)の投与により前記対象における個別化増強抗疾患免疫応答または抗症状免疫応答が生じ、前記対象における抗癌免疫応答または抗腫瘍免疫応答が生じ、前記対象における抗感染症免疫応答が生じ、前記対象におけるウイルス感染症を含む感染症に対する抗感染症免疫応答が生じ、または前記対象における細菌感染症を含む感染症に対する抗感染症免疫応答が生じる、請求項1〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法により前記対象の前記疾患または症状の個別化治療または個別化予防が可能になる、請求項1〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜21および請求項37〜70のいずれか一項に記載の方法により作製される組換え型弱毒化リステリア株。
- 請求項22〜70のいずれか一項に記載の方法によって作製されるDNA免疫療法またはペプチド免疫療法。
- 請求項1〜21および請求項37〜70のいずれか一項に記載の方法により作製された1つ以上の弱毒化組換えリステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
- 各弱毒化組換えリステリア株が疾患または症状を有する対象の疾患担持生体試料に存在する1つ以上のネオエピトープを含む1つ以上のペプチドをコードする核酸配列を含んでいる1つ以上の弱毒化組換えリステリア株を含む組成物の免疫原性混合物。
- 前記1つ以上の弱毒化組換えリステリア株が複数の弱毒化組換えリステリア株を含み、各弱毒化組換えリステリア株の前記核酸配列が異なるセットの1つ以上のネオエピトープをコードする、請求項73または74に記載の免疫原性混合物。
- 前記複数の弱毒化組換えリステリア株が5〜10株、10〜15株、15〜20株、10〜20株、20〜30株、30〜40株、または40〜50株の弱毒化組換えリステリア株を含む、請求項73〜75のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
- 前記複数の弱毒化組換えリステリア株の混合株が約5〜10個、10〜15個、15〜20個、10〜20個、20〜30個、30〜40個、40〜50個、50〜60個、60〜70個、70〜80個、80〜90個、90〜100個、または100〜200個のネオエピトープを含む、請求項73〜76のいずれか一項に記載の免疫原性混合物。
- 前記混合物中の前記弱毒化組換えリステリア株の各々が1つ以上のネオエピトープを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項77に記載の免疫原性混合物。
- 前記混合物中の前記組換えリステリア株の各々が1〜20個のネオエピトープを発現する、請求項78に記載の組成物の免疫原性混合物。
- 対象において個別化抗腫瘍応答を誘発する方法、または対象において腫瘍を予防または治療する方法であって、請求項73〜79のいずれか一項に記載の免疫原性混合物を前記対象に同時または順次投与するステップを含む前記方法。
- 次の要素、すなわち、免疫原性ポリペプチドが融合している第1ネオエピトープアミノ酸配列、第1リンカー配列を介して機能的であるように前記第1ネオエピトープアミノ酸配列が連結している第2ネオエピトープアミノ酸配列、および第2リンカー配列を介して機能的であるように前記第2ネオエピトープアミノ酸配列が連結している少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸コンストラクト。
- 前記免疫原性ポリペプチドがN末端短縮型LLO(tLLO)であり、且つ、最後のネオエピトープが第3リンカー配列を介して機能的であるようにC末端タグに連結している、請求項81に記載の核酸コンストラクト。
- 前記核酸コンストラクトが前記タグをコードする配列の後に2つの終止コドンを含む、請求項81または82に記載の核酸コンストラクト。
- 前記ヒスチジンタグが、機能的であるようにN末端でSIINFEKLペプチドに連結されている6×ヒスチジンタグである、請求項81〜83のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
- 前記第1リンカー配列、前記第2リンカー配列、および前記第3リンカー配列のうちの1つ以上が4×グリシンリンカーである、請求項81〜84のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
- 前記第1ネオエピトープアミノ酸配列、前記第2ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約5〜50アミノ酸である、請求項81〜85のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
- 前記第1ネオエピトープアミノ酸配列、前記第2ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ約8〜27アミノ酸、8〜11アミノ酸、または11〜16アミノ酸である、請求項86に記載の核酸コンストラクト。
- 前記第1ネオエピトープアミノ酸配列、前記第2ネオエピトープアミノ酸配列、および前記少なくとも1つの追加ネオエピトープアミノ酸配列がそれぞれ21アミノ酸である、請求項87に記載の核酸コンストラクト。
- 前記核酸コンストラクトが5〜100個のネオエピトープをコードする、請求項81〜88のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
- 前記核酸コンストラクトが15〜35個のネオエピトープをコードする、請求項89に記載の核酸コンストラクト。
- 前記キメラタンパク質の前記要素がN末端からC末端へと配置されているか、または機能的であるように連結されている、請求項81〜90のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
- 前記tLLOが機能的であるようにプロモーター配列に連結されている、請求項91に記載の核酸コンストラクト。
- 前記プロモーター配列がhlyプロモーター配列である、請求項92に記載の核酸コンストラクト。
- 前記コンストラクトが次の構成成分、すなわち、pHly−tLLO−[第一21mer]−[4×グリシンリンカーG1]−[第二21mer]−[4×グリシンリンカーG2]−…−SIINFEKL−[6×Hisタグ]−[2×終止コドン]を含む、請求項81〜93のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
- 請求項81〜94のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトによってコードされるキメラタンパク質。
- 請求項81〜94のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、または請求項95に記載のキメラタンパク質を発現する組換えリステリア株。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018522548A (ja) * | 2015-06-24 | 2018-08-16 | アドバクシス, インコーポレイテッド | 個別化送達ベクターを基にした免疫療法のための方法及びデバイス製造方法 |
JP2023509540A (ja) * | 2020-01-07 | 2023-03-08 | コリア アドバンスド インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー | 新生抗原をスクリーニングする方法、システム及びその用途 |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9012141B2 (en) | 2000-03-27 | 2015-04-21 | Advaxis, Inc. | Compositions and methods comprising KLK3 of FOLH1 antigen |
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BR112014022662A2 (pt) | 2012-03-12 | 2017-10-03 | Advaxis Inc | Inibição da função de célula supressora seguindo tratamento de vacina de listeria |
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MA41644A (fr) | 2015-03-03 | 2018-01-09 | Advaxis Inc | Compositions à base de listeria comprenant un système d'expression de minigènes codant pour des peptides, et leurs procédés d'utilisation |
CN108604257B (zh) * | 2015-10-12 | 2022-12-13 | 南托米克斯有限责任公司 | 产生特异性免疫治疗组合物及其相关核酸构建体的方法 |
PE20181535A1 (es) | 2015-12-16 | 2018-09-26 | Gritstone Oncology Inc | Identificacion, fabricacion y uso de neoantigeno |
EP3475434A4 (en) | 2016-03-24 | 2020-07-29 | Nantcell, Inc. | SEQUENCE ARRANGEMENTS AND SEQUENCES FOR NEOEPITOP REPRESENTATION |
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NZ753307A (en) | 2016-11-30 | 2023-10-27 | Advaxis Inc | Immunogenic compositions targeting recurrent cancer mutations and methods of use thereof |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
US20210113672A1 (en) * | 2016-12-08 | 2021-04-22 | Nantbio, Inc. | Method of validating the triggering of an immune response to a neoepitope of a tumor with t-cells |
CN109963570A (zh) | 2017-01-21 | 2019-07-02 | 宁波知明生物科技有限公司 | 芍药苷-6’-o-苯磺酸酯在治疗干燥综合征的应用 |
KR102306403B1 (ko) | 2017-04-24 | 2021-09-28 | 난트셀, 인크. | 표적화된 네오에피토프 벡터 및 그에 관한 방법 (targeted neoepitope vectors and methods therefor) |
WO2018234506A2 (en) | 2017-06-21 | 2018-12-27 | Transgene Sa | PERSONALIZED VACCINE |
WO2019006401A2 (en) * | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Advaxis, Inc. | LISTERIA-BASED IMMUNOGENIC COMPOSITIONS COMPRISING HETERICCLIENT WILMS TUMOR PROTEIN ANTIGENS AND METHODS OF USE THEREOF |
KR20200044982A (ko) | 2017-09-19 | 2020-04-29 | 어드박시스, 인크. | 박테리아 또는 리스테리아 균주의 동결건조를 위한 조성물 및 방법 |
EP3688165A4 (en) * | 2017-09-25 | 2021-09-29 | Nant Holdings IP, LLC | NEO-EPITOPE PRESENTATION VALIDATION |
JP7227237B2 (ja) | 2017-10-10 | 2023-02-21 | グリットストーン バイオ インコーポレイテッド | ホットスポットを利用した新生抗原の特定 |
AU2018373154A1 (en) | 2017-11-22 | 2020-07-02 | Gritstone Bio, Inc. | Reducing junction epitope presentation for neoantigens |
CN108564661B (zh) * | 2018-01-08 | 2022-06-28 | 佛山市超体软件科技有限公司 | 一种基于增强现实场景的记录方法 |
CN110408634B (zh) * | 2018-04-27 | 2021-08-03 | 苏州若泰医药科技有限公司 | 一种非整合李斯特菌疫苗及抗肿瘤免疫应答方法 |
WO2020024982A1 (zh) * | 2018-08-02 | 2020-02-06 | 苏州若泰医药科技有限公司 | 一种基于减毒李斯特菌激活的抗原提呈细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用 |
CN111334521B (zh) * | 2018-12-18 | 2022-02-18 | 上海若泰医药科技有限公司 | 一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法 |
CN113631185A (zh) * | 2019-02-27 | 2021-11-09 | 尼克塔治疗公司 | 用于治疗癌症的免疫治疗组合 |
KR20220074917A (ko) * | 2019-09-30 | 2022-06-03 | 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 | Hbv 백신 및 hbv를 치료하는 방법 |
WO2023068931A1 (en) | 2021-10-21 | 2023-04-27 | Curevac Netherlands B.V. | Cancer neoantigens |
CN114134165B (zh) | 2022-01-27 | 2022-04-29 | 北京循生生物医学研究有限公司 | 一种新型hpv治疗性核酸疫苗 |
WO2023209068A1 (en) | 2022-04-28 | 2023-11-02 | Carbocalyx Gmbh | Personalized anticancer vaccine comprising glycoengineered tumour cells or tumour cell fragments |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013526837A (ja) * | 2009-11-11 | 2013-06-27 | アドバクシス | 組換えリステリア株およびそれを含む医薬組成物 |
WO2014082729A1 (en) * | 2012-11-28 | 2014-06-05 | Biontech Ag | Individualized vaccines for cancer |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6099848A (en) * | 1997-11-18 | 2000-08-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Immunogenic compositions comprising DAL/DAT double-mutant, auxotrophic, attenuated strains of Listeria and their methods of use |
CN1548537B (zh) * | 2002-12-27 | 2010-05-05 | 深圳市源兴生物医药科技有限公司 | 疫苗制备方法和抗肿瘤疫苗 |
CN101528254A (zh) * | 2006-07-14 | 2009-09-09 | 赛诺菲巴斯德生物制剂公司 | 通过向载体病毒蛋白中直接转座子介导插入外源免疫决定簇构建重组病毒疫苗 |
CN102272153B (zh) * | 2008-11-24 | 2015-04-15 | 德国慕尼黑亥姆霍兹研究中心健康和环境有限公司 | 高亲和力t细胞受体及其应用 |
EP2292258A1 (en) * | 2009-08-18 | 2011-03-09 | Pevion Biotech Ltd. | Multiepitope vaccine for Her2/neu-associated cancers |
HUE039747T2 (hu) * | 2010-11-17 | 2019-02-28 | Aduro Biotech Inc | Eljárások és kompozíciók EGFRVIII-ra való immunválasz indukálására |
AU2013323368B2 (en) * | 2012-09-28 | 2019-03-21 | The University Of Connecticut | Identification of tumor-protective epitopes for the treatment of cancers |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013526837A (ja) * | 2009-11-11 | 2013-06-27 | アドバクシス | 組換えリステリア株およびそれを含む医薬組成物 |
WO2014082729A1 (en) * | 2012-11-28 | 2014-06-05 | Biontech Ag | Individualized vaccines for cancer |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
GASTROENTEROLOGY, (2014), 146, [7], P.1784-1794, JPN6020017586, ISSN: 0004413722 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018522548A (ja) * | 2015-06-24 | 2018-08-16 | アドバクシス, インコーポレイテッド | 個別化送達ベクターを基にした免疫療法のための方法及びデバイス製造方法 |
JP2023509540A (ja) * | 2020-01-07 | 2023-03-08 | コリア アドバンスド インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー | 新生抗原をスクリーニングする方法、システム及びその用途 |
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Solomon et al. | On the development of a neoantigen vaccine for the prevention of Lynch Syndrome |
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