KR20060008860A

KR20060008860A - 변형된 독립생존 미생물, 백신 조성물 및 그것의 사용방법

Info

Publication number: KR20060008860A
Application number: KR1020057014537A
Authority: KR
Inventors: 토마스 더블유. 쥬니어 두벤스키; 더크 지. 브록스테드트; 케이트 바자트; 죤 이. 허스트; 데이비드 쿡
Original assignee: 세루스 코포레이션
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2006-01-27
Also published as: AU2004224425B2; CA2515298C; JP4839209B2; AU2004224425A1; CA2515298A1; JP2007131639A; WO2004084936A2; US20040197343A1; AU2010202434A1; MXPA05008340A; JP2006521376A; EP1592442A2; WO2004084936A8; US7833775B2; KR101173871B1; WO2004084936A3

Abstract

증식을 약화시키고/또는 핵산을 수복하는 미생물의 능력을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하도록 변형된 핵산을 갖는 독립생존 미생물이 제공된다. 항원제시세포의 적재, 활성화 및/또는 성숙에서 변형된 미생물을 사용하는 방법 또한 제공된다. 변형된 미생물 및/또는 항원제시세포를 포함하는 백신 조성물 및 백신을 사용하는 방법 또한 제공된다. 암 또는 감염질환에 대한 백신을 사용하기 위하여 미생물은 종양 항원 또는 감염질환 항원 같은 이종 항원을 함유하도록 더 변형될 수 있다.

백신, 항원제시세포, 변형된 미생물, 소라렌

Description

변형된 독립생존 미생물, 백신 조성물 및 그것의 사용방법{MODIFIED FREE-LIVING MICROBES, VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF}

(관련 출원)

본 출원은 2003년 2월 6일 출원된 미국 가출원 제 60/446,051 호, 2003년 2월 21일 출원된 미국 가출원 제 60/449,153 호, 2003년 7월 24일 출원된 미국 가출원 제 60/490,089 호, 2003년 10월 15일 출원된 미국 가출원 제 60/511,869 호, 및 2004년 2월 2일 출원된 "비-포식작용 세포로 침투가 약화된 리스테리아 (Listeria), 리스테리아 (Listeria)를 포함하는 백신, 및 그것의 사용방법"이라는 명칭의 Cells, Va 미국 가출원의 우선권의 이익을 주장한다.

(기술분야)

본 발명은 일반적으로 백신 조성물 및 면역요법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 개체에 특정 항원을 송달하기 위하여 사용될 수 있는 변형된 독립생존 미생물 집단을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 이 같은 조성물에서, 백신은 미생물 자체에 대하여 또는 미생물 내로 통합된 이형 항원에 대하여 유발된다. 본 발명은 또한, 수지상 세포 같은 항원제시세포의 활성화 및 성숙을 제공하고 유발하기 위하여 변형된 미생물의 사용에 관한 것이기도 하다.

다양한 백신은 임상적 용도로, 대부분 바이러스, 박테리아 및 기생체에 기인한 감염질환의 예방 목적으로 개발되었다. 백신은 살아있는 약독 미생물, 불활성화된 (사멸된) 미생물, 또는 미생물 자신의 구성성분으로부터 제조될 수 있다. 살아있는 약독 미생물은 병원성 인자의 결실 같은 유전자 변형을 함유하여 덜 병원성인 미생물을 결과한다. 불활성화된 백신에서는, 미생물은 화학적 또는 물리학적으로 불활성화된다. 이상적으로는, 이 같은 백신은 감염은 일으킬 수 없지만, 소망의 면역반응은 촉발할 수 있다. 불활성화된 백신의 예는 폴리오 바이러스 및 인플루엔자 바이러스, 및 콜레라 및 백일해에 대한 박테리아 백신을 포함하지만, 살아있는 약독 백신 또한 폴리오, 인플루엔자 및 콜레라에 대한 대안이기도 하다. 소망의 면역반응을 일으키기 위하여는, 불활성화된 미생물이 불활성화되기 전에 적당한 항원을 포함하는 것이 중요하다. 몇몇 경우에서, 미생물의 불활성화가 면역반응의 유의한 감소를 결과하는 것이 관찰되어 왔는데, 이는 감염 미생물에 의한 신규 유전자 발현이 최적 면역반응을 촉발시키는데 필수적이기 때문이다. 이것은 세포내 박테리아에 대하여 특히 중요하다. 박테리아를 불활성화하는데 사용되어 온 방법은 아세톤, 알코올, 포르말린, 글루타르알데히드, 파라포름알데히드, 또는 페놀의 사용, 가열, 또는 자외선 조사를 포함한다. [Pace et al., Vaccine 16(16):1563(1998)].

미생물 자체에 기인한 감염질환을 예방하기 위하여, 미생물 백신을 사용하는 것 외에, 특정 단백질이나 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 함유하도록 미생물이 변형될 수 있다. 이 같은 재조합 미생물은 송달 비히클로 사용될 수 있고 이종 항원에 대하여 면역반응을 촉발하기 위한 백신으로서 사용될 수 있다. 이들 재조합 백신은 동물 모델에서 유효한 것으로 밝혀졌다. 플라즈모듐 벌게이 (Plasmodium berghei) 포자소체 항원을 발현하도록 변형된 살아있는 약독 살모넬라의 경구 백신은 말라리아로부터 마우스를 보호하는 것으로 밝혀졌다. [Aggarwal et al., J Exp Med 172(4):1083 (1990)]. 유사하게, 미국 특허 제 6,051,237 호는 암 백신 용도의 종양 특이적 항원을 성장, 유포시키고 발현시키는 Listeria monocytogenes의 살아있는 재조합체 형태를 기술하고 있다. 이 같은 재조합 백신이 유효하려면, 각 미생물 균주는 백신을 제공하기 위하여 유전적으로 변형되어야만 한다. 그러므로, 미생물이 재조합 항원을 포함하는지 여부에 관계없이 어떤 미생물에도 적용할 수 있는 안전하고 유효한 미생물 백신의 생산 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 수지상 세포 (DC)에 기초한 면역요법이 광범위하게 관찰되고 다양한 범위의 종양 타입의 치료에 임상적 이점을 제공하는 것으로 알려져 왔다. 자기유래 수지상 세포 (DC)를 분리하고 생산하고, 이어서 환자 백신접종 이전에 그것에 항원 또는 펩티드를 생체 외 적재시키기 위한 다양한 방법이 현재 개발되고 있다. 효율적 항원 적재 뿐 아니라 면역 기작의 이해에 있어서의 최근의 진전은 암 면역요법의 효율에 있어서 백신에 사용되는 DC의 활성화 및 성숙 상태의 중요성을 강조하여 왔다. 항원의 섭취와 프로세싱에서는 비성숙 DC가 더 효율적이고, 활성화된 성숙 DC는 이 능력에서는 뒤지지만 MHC 분자 문맥에서 나이브 (naive) T 림프구에 항원을 제시하는 면에서는 더 강력하다. 실제로, 성숙 DC는 말초 T세포 관용을 극복하고 일차 T 림프구 반응을 유발하고 항종양 면역성을 강화하기 위한 강력한 항 원제시세포(APC)로 밝혀졌다. 임상적 데이타를 장려하도록 유도하는 DC의 활성화 및 성숙을 제공하고 촉발하기 위한 다양한 방법의 개발에도 불구하고, 항원 적재와 DC 활성화 및 성숙을 조합하기 위한 유효하고 비용 효율적인 표준 방법이 아직 없다.

(발명의 요약)

본 발명은 미생물 증식이 약화하지만 충분한 미생물 유전자 발현이 유지되고 약화는 투여량 의존적 방식으로 제어될 수 있는 독립생존 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 독립생존 미생물의 이 같은 약화 방법을 포함한다. 본 발명은 이들 약독 미생물을 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 변형된 미생물, 약독 Listeria의, 특히 수지상세포 같은 항원제시세포의 시험관 내 또는 생체 외 활성화와 성숙을 제공하고 유도하기 위한, 신규 사용을 제공한다. 결과의 항원제시세포는 백신 및 면역요법에서 유용하다. 한 구체예에서, 백신과 면역요법은 암에 대하여 유발된다.

한 양태에서, 본 발명은 미생물이 증식이 약화되도록 미생물의 핵산 (예를 들어 게놈 핵산)이 변혀된 독립생존 미생물을 포함하는 백신을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 증식의 약화는 투여량 의존적 방식으로 제어된다. 몇몇 구체예에서, 미생물 내 미생물 유전자 발현은 미생물의 증식의 약화에 의해 실질적으로 영향받지 않는다. 몇몇 구체예에서, 백신 내 미생물은 개체에 백신을 접종한 후 개체 내에서 항원에 대해 면역반응을 일으키기에 충분한 수준으로 항원을 발현한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 핵산과 직접 반응하는 (핵산 "표적화" 화합물이라고 도 지칭하는) 핵산 표적화된 화합물과 반응함에 의하여 변형된다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르 같은 알킬화제이다. 다른 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌 (psoralen) 화합물 (예를 들어, "S-59"라고도 지칭되는 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소라렌)이다. 몇몇 구체예에서, 백신 내의 미생물은 미생물이 그것의 변형된 핵산을 수복하는 능력을 약화시키는 유전적 변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 또는 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes) 같은 박테리아이다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 백신은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 아쥬반트를 더 포함한다. 본 발명은 유효량의 백신을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 또한 항원을 발현하는 미생물인 유효량의 백신을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 DNA 수복 효소가 결여된 독립생존 미생물 (예를 들어, 박테리아)을 포함하는 백신을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 독립생존 미생물은 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA, 또는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 기능적 등가물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에서 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 uvrA 및 uvrB 둘 다 (또는 미생물의 속과 종에 따라 uvrA 및 uvrB 둘다의 기능적 등가물)에서 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 RecA (또는 미생물의 속과 종에 따라 RecA의 기능적 동등물)가 결여된다. 몇몇 구체예에서, 항원 (예를 들어, 암 항원, 또는 미생물에 대하여 외래의 것인 감염질환 항원을 암호화하는 이종 핵산서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 백신은 약학적으로 허용되는 담체 또는 아쥬반트를 더 함유한다. 본 발명은본 발명은 유효량의 백신을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 항원을 발현하는 미생물인 유효량의 백신을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내에서 항원에 대한 반응을 유발하는 방법을 더 제공한다.

한 구체예에서, 본 발명은 핵산을 수복하는 능력이 약화된 유전자 돌연변이를 포함하는 돌연변이 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 같은 분리된 돌연변이 리스테리아(Listeria) 균주를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 리스테리아(Listeria) 균주는 적어도 하나의 (uvrA 및/또는 uvrB 같은) DNA 수복 효소가 결여된다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 리스테리아(Listeria) 균주는 적어도 하나의 uvrA 유전자 및/또는 uvrB 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁되고 수탁번호 PTA-5563로 표시되는 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) actA ^- / uvrAB ^- 균주이다. 다른 구체예에서, 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁되고 수탁번호 PTA-5563로 표시되고, 기탁된 균주의 돌 연변이는 UvrA, UvrB, 및 ActA가 결여된 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) actA ^- / uvrAB ^- 균주이다. 본 발명은 돌연변이 리스테리아(Listeria) 균주를 포함하는 백신 및 전문 항원제시세포를 더 제공한다. 변형된 리스테리아(Listeria) 균주를 사용하여 면역반응을 유발하고 질병을 예방 또는 치료하는 방법이 또한 제공된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 핵산을 수복하는 능력이 약화된 유전자 돌연변이를 포함하는 분리된 돌연변이 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 균주를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 적어도 하나의 (UvrA 및/또는 UvrB 같은) DNA 수복 효소가 결여된 돌연변이이다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 uvrA 유전자 및/또는 uvrB 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 RecA가 약화된다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 recA 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, lef 유전자, cya 유전자 또는 두 유전자 다의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 균주를 포함한다. 본 발명은 돌연변이 균주를 포함하는 백신 및 전문 항원제시세포를 더 제공한다. 변형된 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 균주를 사용하여 면역반응을 유발하고 질병을 예방 또는 치료하는 방법이 또한 제공된다.

한 구체예에서, 본 발명은 소라렌 화합물 및 UVA 광과 반응한 박테리아로서, 박테리아의 증식이 약화된 박테리아를 포함하는 백신을 포함한다. 한 구체예에서, 소라렌 변형 후에 박테리아 발현은 충분히 활성이어서 소라렌 약독 박테리아가 단 백질 항원을 계속 발현하고, 박테리아가 개체에 투여되었을 때, 항원에 대한 면역반응을 일으킨다. 한 구체예에서, 소망의 면역반응은 박테리아 자체에 대하여 일어난다. 한 구체예에서, 박테리아는 이종 단백질 항원을 발현하는 재조합 균주인데, 박테리아를 개체에 투여하였을 때, 이종 항원에 대한 면역반응이 유발된다. 이종 항원을 포함하는 이 같은 백신은 감염질환, 자가면역질환, 알레르기, 암, 및 다른 과다증식 질환을 포함하는 다양한 질병을 치료 또는 예방하도록 디자인된다.

감염질환의 치료 또는 예방을 위하여, 백신으로 사용되기 위하여 본 발명의 방법에 따라 질병 유발제가 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 바이러스, 박테리아, 또는 기생체 같은 질병유발제로부터의 이종 항원을 포함하는 본 발명의 미생물로부터 백신이 제조될 수 있다. 이 같은 백신은 박테리아 벡터를 받게될 위생상의 위험이 감염제에 의한 감염과 관련된 잠재적 감염 위험보다 유의하게 낮은 정도 수준이라는 이점을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하여 약독된, 감염질환의 치료 또는 예방을 위한 이종 백신은 다른 이점 또한 갖는다. 첫째로, 감염제 자체로부터 직접 약독된 생백신 또는 사멸백신을 제조하는 것이 가능하지 않을 수 있다. 둘째로, 만약 생백신이 필요하다면, 그렇지 않다면 감염제를 약독하고도 적당한 면역 반응을 유지하는 것이 가능하지 않을 수 있다.

다른 가능성은 박테리아 벡터 내로 삽입된 항원이 박테리아 벡터에 의하여 유발되는 선천적 면역반응이 부재하는 개체에서 면역반응을 촉발하지 않을 수 있다는 것이다. 예를 들어, 자기유래 세포가 부적당하게 증식하는 질환은 면역반응을 전형적으로 촉발하지 않는 항원을 함유할 수 있다. 자가항원에 대항하는 이 같은 면역반응을 촉발하는 방법을 찾음으로써 이 같은 질병과 싸우는 것이 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 면역반응이 증식하는 세포에 대하여 널리 특이적이도록 증식세포가 정상세포보다 높은 수준에서 항원을 발현 또는 다량 발현한다. 이 같은 백신으로 치료될 수 있는 질환은 자가면역질환, 알레르기, 암 및 다른 과다증식 세포질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 구체예에서, 백신은 질환 세포 그 자체보다는 질환 또는 질환관련 표적의 생성물을 표적화한다. 예를 들어, 종양은, 종양세포에 영양을 공급하는데 필요한 신생 혈관의 생성에 필수적인 혈관내피성장인자 (VEGF)를 표적화하는 백신으로 처리될 수 있다. VEGF는 면역 세포 자체에 대하여는 주변이지만 종양성장 영역에서는 널리분포하고 종양세포의 성장을 잠재적으로 제한할 수 있는 유효한 백신 표적이다. 다른 예는 알츠하이머병이나 크로츠펠트-제콥 병의 아밀로이드 플라크 특성을 유발하는 단백질 같은 질병 관련 단백질에 대한 반응을 유발할 항원을 포함하는 백신이다. 유사하게, 백신은 자가면역 또는 알레르기 반응에 관련된 단백질을 표적화한다. 백신은 B 세포 또는 T 세포 같은 특이적 항체나 세포에 대한 반응을 유발하여 자가면역 또는 알레르기 반응을 유발할 수 있는 이디오타입 항원을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 미생물 집단의 증식이 약화되도록 미생물 핵산이 변형된 독립생존 미생물 집단을 포함하는 백신 조성물로서, 미생물 유전자 발현이 유의하게 영향받지 않은 백신 조성물을 포함한다. 한 구체예에서, 미생물 유전자 발현은 유의하게 영향받지 않아서, 개체에 미생물집단의 투여가 있은 후에 면역반응을 촉발시키기에 충분한 수준으로 항원이 발현된다. 한 구체예에서, 미생물 집 단의 증식은 적어도 약 0.3 log, 또한 적어도 약 1 log, 약 2log, 약 3log, 약 4log, 약 6log, 또는 약 8log 만큼 약화된다. 한 구체예에서 미생물 집단의 증식은 약 0.3 내지 > 10 log, 약 2 내지 > 10 log, 약 4 내지 > 10 log, 약 6 내지 > 10 log, 약 0.3 - 8 log, 약 0.3-6 log, 약 0.3-5 log, 약 1-5 log, 약 2-5 log 만큼 약화된다. 한 구체예에서, 미생물 집단에 의한 항원의 발현은 미생물 핵산이 변형되지 않은 미생물 집단에 의한 항원의 발현의 적어도 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 90%이다. 다른 구체예에서, 발현된 항원은 미생물 자신으로부터의 항원이다. 한 구체예에서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산서열을 포함한다. 한 구체예에서, 항원은 질환 관련 항원이다. 한 구체예에서, 항원은 감염질환, 자가면역질환, 알레르기, 암 및 다른 과다증식질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환 관련 항원이다. 한 구체예에서, 항원은 종양관련 항원이다. 한 구체예에서, 종양항원은 분화 항원, 조직 특이적 항원, 발생 항원, 종양관련 바이러스 항원, 암-고환 항원, 배아 항원, 옹코단백질 항원, 다량발현된 단백질 항원 및 돌연변이 단백질 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 종양항원은 메소텔린, Sp17, gp100, EphA2, PR3, PAGE-4, TARP, 및 SPAS-1으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 미생물 항원 핵산은 미생물을 광조사에 노출시키는 것 및 미생물을 미생물 핵산 변형을 유발하는 핵산 표적화 화합물과 반응시키는 것으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 변형된다. 바람직한 구체예에서, 미생물 핵산은 미생물 집단을 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응시킴으로써 변형된다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 인터칼레이션, 마이너 그루브 결합, 메이저 그루브 결합, 정전기 결합 및 서열 특이적 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 핵산으로 표적화된다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 핵산 알킬화제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르이다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 광조사, 바람직하게는 UVA 조사에 의한 화합물의 활성화 후에 핵산과 직접 반응한다. 한 구체예에서, UVA 조사에 의하여 활성화되는 핵산 표적화 화합물은 소라렌이다. 바람직한 구체예에서, 소라렌 화합물은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5', 8-트리메틸소라렌이다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 핵산의 변형을 직접 유발한다. 한 구체에에서, 핵산 표적화 화합물은 광조사, 바람직하게는 UVA 조사에 의한 활성화 후에 변형을 간접적으로 유발한다. 한 구체예에서, 미생물은 유전자 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 변형된 미생물 핵산을 수복하는 미생물의 능력의 약화를 결과한다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자, 또는 미생물의 속과 종에 따라서는 그것의 기능적 등가 유전자에 있다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 미생물의 속과 종에 따라서는 그것의 기능적 등가 유전자에 있다. 돌연변이가 recA 유전자에 있는 한 구체예에서, 단독 또는 하나 이상의 다른 돌연변이와 조합하여 recA 돌연변이는 조건 돌연변이이다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 적 어도 하나의 DNA 수복 효소의 활성의 약화를 결과한다. 한 구체예에서, RecA의 활성도의 약화는 조건적이다. 더 나아간 구체예에서, 이들 돌연변이를 함유하는 미생물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌과 반응함으로써 변형된다. 바람직한 구체예에서, 소라렌은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5', 8-트리메틸소라렌이다. 한 구체예에서, 미생물은 박테리아, 원생동물 또는 균류로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 미생물은 박테리아이다. 한 구체예에서 박테리아는 마이코박테리아이다. 한 구체예에서 마이코박테리아는 마이코박테리아 투베르큘로시스 (Mycovacterium tuberculosis) 이다. 한 구체예에서, 박테리아는 세포 내 박테리아이다. 한 구체예에서, 세포 내 박테리아는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)이다. 한 구체예에서, 세포 내 박테리아는 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis)이다. 바람직한 구체예에서, 박테리아는 리스테리아 (Listeria), 바람직하게는 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 이다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria)는 포식세포에 의한 리스테리아 (Listeria)의 섭취에 유의한 영향을 끼치지 않고 포식세포 아닌 세포로 리스테리아 (Listeria)가 침입하는 능력을 약화하는 결과를 낳는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 인터날린 유전자에 있다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 inlA, inlB, 및 인터날린을 암호화하는 다른 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 있다. 한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)는 inlA 및 inlB 유전자 둘 다에 있는 유전자 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria)는 감염된 세포의 파고라이소좀을 이탈하는 리스테리아 (Listeria) 의 능력을 약화시키는 결과를 낳는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 hly 유전자에 있다. Y 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria)는 리스테리아 (Listeria)에 의한 액틴의 중합화의 약화를 결과하는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 actA 유전자에 있다. 한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 actA 및 inlB 유전자 둘 다에 있고, 바람직하게는 actA 및 inlB 유전자 둘 다의 결실 돌연변이이다.

한 구체예에서, 본 발명은 미생물 집단의 증식이 약화되도록 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응함으로써 미생물 핵산이 변형되는 미생물 집단을 포함하는 백신을 포함하는데, 여기서 미생물 유전자 발현은 실질적으로 영향받지 않고, 여기서 집단 내 미생물은 종양 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 미생물 유전자 발현은 실질적으로 영향받지 않아서 개체에 미생물을 투여한 후에 면역반응을 촉발시키기에 충분한 수준으로 종양 항원을 발현시킨다. 한 구체예에서, 미생물 집단의 증식은 적어도 약 0.3 log, 또한 적어도 약 1 log, 약 2log, 약 3log, 약 4log, 약 6log, 또는 약 8log 만큼 약화된다. 한 구체예에서 미생물 집단의 증식은 약 0.3 내지 > 10 log, 약 2 내지 > 10 log, 약 4 내지 > 10 log, 약 6 내지 > 10 log, 약 0.3 - 8 log, 약 0.3-6 log, 약 0.3-5 log, 약 1-5 log, 약 2-5 log 만큼 약화된다. 한 구체예에서, 미생물 집단에 의한 종양 항원의 발현은 미생물 핵산이 변형되지 않은 미생물 집단에 의한 종양 항원의 발현의 적어도 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 90%이다. 한 구체예에서, 종양항원은 분화 항원, 조직 특이적 항원, 발생 항원, 종양관련 바이러스 항원, 암-고환 항원, 배아 항원, 옹코단백질 항원, 다량발현된 단백질 항원 및 돌연변이 단백질 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 종양항원은 메소텔린, Sp17, gp100, EphA2, PR3, PAGE-4, TARP, 및 SPAS-1으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 알킬화제를 포함한다. 한 구체예에서, 알킬화제는 머스타드, 머스타드 중간체 및 머스타드 균등물로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 인터칼레이션, 마이너 그루브 결합, 메이저 그루브 결합, 정전기 결합 및 서열 특이적 결합제로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 표적 기를 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르이다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 화합물의 활성화 후에 핵산과 직접 반응한다. 한 구체예에서, 화합물의 활성화는 광조사에 의한다. 한 구체예에서, 광조사는 UVA 조사이다. 바람직한 구체예에서, UVA 조사에 의하여 활성화되는 핵산 표적화 화합물은 소라렌이다. 바람직한 구체예에서, 소라렌 화합물은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5', 8-트리메틸소라렌이다. 한 구체예에서, 집단 내 미생물은 유전자 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 변형된 미생물 핵산을 수복하는 미생물의 능력의 약화를 결과한다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 유 전자, 또는 미생물의 속과 종에 따라서는 그것의 기능적 등가 유전자에 있다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 미생물의 속과 종에 따라서는 그것의 기능적 등가 유전자에 있다. 돌연변이가 recA 유전자에 있는 한 구체예에서, 단독 또는 하나 이상의 다른 돌연변이와 조합하여 recA 돌연변이는 조건 돌연변이이다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 수복 효소의 활성의 약화를 결과한다. 한 구체예에서, RecA의 활성도의 약화는 조건적이다. 더 나아간 구체예에서, 이들 돌연변이를 함유하는 미생물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌과 반응함으로써 변형된다. 바람직한 구체예에서, 소라렌은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5', 8-트리메틸소라렌이다. 한 구체예에서, 미생물은 박테리아, 원생동물 또는 균류로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 미생물은 박테리아이다. 한 구체예에서 박테리아는 리스테리아 (Listeria), 바람직하게는 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)이다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria)는 포식세포에 의한 리스테리아 (Listeria)의 섭취에 유의한 영향을 끼치지 않고 포식세포 아닌 세포로 리스테리아 (Listeria)가 침입하는 능력을 약화하는 결과를 낳는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 inlA, inlB, 및 인터날린을 암호화하는 다른 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 있다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria)는 감염된 세포의 파고라이소좀을 이탈하는 리스테리아 (Listeria) 의 능력을 약화시키는 결과를 낳 는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 hly 유전자에 있다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria)는 리스테리아 (Listeria)에 의한 액틴의 중합화의 약화를 결과하는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 actA 유전자에 있다. 한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 actA 및 inlB 유전자 둘 다에 있고, 바람직하게는 actA 및 inlB 유전자 둘 다의 결실 돌연변이이다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) actA/inlB 결실 돌연변이는 uvrAB 유전자에서의 결실 돌연변이를 더 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌과 반응함으로써 리스테리아 핵산이 변형되어 리스테리아 집단이 약독되고, 리스테리아 유전자 발현이 실질적으로 영향받지 않으며 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)가 종양 항원을 암호화하는 이종 핵산서열을 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 집단을 포함하는 백신을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 소라렌은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5', 8-트리메틸소라렌이다. 한 구체예에서, 리스테리아 유전자 발현은 실질적으로 영향받지 않아서 리스테리아를 개체에 투여한 후에 면역반응이 촉발되기에 충분한 수준으로 종양 항원이 발현된다. 한 구체예에서, 리스테리아 집단의 증식은 적어도 약 0.3 log, 또한 적어도 약 1 log, 약 2log, 약 3log, 약 4log, 약 6log, 또는 약 8log 만큼 약화된다. 다른 구체예에서 리스테리아 집단의 증식은 약 0.3 내지 > 10 log, 약 2 내지 > 10 log, 약 4 내지 > 10 log, 약 6 내지 > 10 log, 약 0.3 - 8 log, 약 0.3-6 log, 약 0.3-5 log, 약 1-5 log, 약 2-5 log 만큼 약화된다. 한 구체예에서, 리스테리아 집단에 의한 종양 항원의 발현은 리스테리아 핵산이 변형되지 않은 리스테리아 집단에 의한 종양 항원의 발현의 적어도 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 90%이다. 한 구체예에서, 종양항원은 분화 항원, 조직 특이적 항원, 발생 항원, 종양관련 바이러스 항원, 암-고환 항원, 배아 항원, 옹코단백질 항원, 다량발현된 단백질 항원 및 돌연변이 단백질 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 종양항원은 메소텔린, Sp17, gp100, EphA2, PR3, PAGE-4, TARP, 및 SPAS-1으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)는 유전자 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 변형된 핵산을 수복하는 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)의 능력의 약화를 결과한다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 있다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 있다. 돌연변이가 recA 유전자에 있는 한 구체예에서, 단독으로든 또는 하나 이상의 다른 돌연변이와 조합하여서든 recA 돌연변이는 조건 돌연변이이다. 한 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 수복 효소의 활성의 약화를 결과한다. 한 구체예에서, RecA의 활성도의 약화는 조건적이다. 한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)는 포식세포에 의한 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)의 섭취에 유의한 영향을 끼치지 않고 포식세포 아닌 세포로 침입하는 능력을 약화하는 결과를 낳는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 inlA, inlB, 및 인터날린을 암호화하는 다른 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에 있다. 한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) inlA 및 inlB 유전자 둘다에 유전자 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria)는 감염된 세포의 파고라이소좀을 이탈하는 리스테리아 (Listeria) 의 능력을 약화시키는 결과를 낳는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 hly 유전자에 있다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria)는 리스테리아 (Listeria)에 의한 액틴의 중합화의 약화를 결과하는 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 actA 유전자에 있다. 한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아 (Listeria) 돌연변이는 actA 및 inlB 유전자 둘 다에 있고, 바람직하게는 actA 및 inlB 유전자 둘 다의 결실 돌연변이이다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) actA/inlB 결실 돌연변이는 uvrAB 유전자에서의 결실 돌연변이를 더 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 독립생존 미생물을 포함하는 전문 항원제시세포 (예를 들어, 수지상 세포)를 제공하는데, 여기에서 미생물의 증식이 약화되도록 미생물의 핵산이 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 증식의 약화는 투여량 의존 방식으로 제어된다. 몇몇 구체예에서, 미생물 내 미생물 발현은 미생물의 증식의 약화에 의하여 실질적으로 영향받지 않는다. 몇몇 구체예에서, 백신 내 미생물은 개체에 백신을 투여한 후에 개체 내에서 항원에 반응한 면역 반응을 유발하기 에 충분한 수준으로 항원을 발현한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응함으로써 변형되었다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르 같은 알킬화제이다. 다른 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌 (psoralen) 화합물 (예를 들어, "S-59"라도 불리우는 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소라렌)이다. 몇몇 구체예에서, 백신 내의 미생물은 미생물이 그것의 변형된 핵산을 수복하는 능력을 약화시키는 유전적 변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 박테리아이다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한, 항원제시세포를 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명은 유효량의 항원제시세포를 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 또한 항원을 발현하는 미생물인 유효량의 항원제시세포를 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 적당한 조건 하에서 나이브 T 세포를 활성화시키기 충분한 시간 동안 나이브 T 세포를 전문 항원제시세포와 접촉시키는 것을 포함하는, (상호 배타적이지는 않게) 생체 외 및/또는 시험관 내에서 나이브 T 세포를 활성화시키는 방법을 더 제공한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 DNA 수복 효소가 결여된 독립생 존 미생물 (예를 들어, 박테리아)을 포함하는 분리된 전문 항원제시세포 (예를 들어, 수지상 세포)를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA, 또는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 기능적 등가물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에서 유전자 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 미생물은 uvrA 및 uvrB 둘 다 (또는 미생물의 속과 종에 따라서는) uvrA 및 uvrB 둘다의 기능적 등가물에서 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항원제시세포는 RecA, 또는 RecA의 기능적 동등물이 결여된다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산서열을 포함한다. 유효량의 항원제시세포를 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 또한 제공된다. 본 발명은 항원을 발현하는 미생물인 유효량의 항원제시세포를 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내에서 항원에 대한 반응을 유발하는 방법을 더 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 적당한 조건과 전문 항원제시세포를 적재하기에 충분한 시간 동안 전문 항원제시세포에 (시험관 내 또는 생체 내)로 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 접촉시켜 전문 항원제시세포를 적재하는 것을 포함하는, 전문 항원제시세포에 항원을 적재하는 방법을 제공하는데, 여기에서 미생물의 핵산은 변형되어 (예를 들어, 핵산에 직접 반응하는 핵산 표적 화합물과 반응함으로써 변형되어) 미생물은 증식이 약화된다.

다른 양태에서, 본 발명은 적당한 조건과 전문 항원제시세포를 적재하기에 충분한 시간 동안 전문 항원제시세포에 (시험관 내 또는 생체 내)로 항원을 암호화 하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 접촉시켜 전문 항원제시세포를 적재하는 것을 포함하는, 전문 항원제시세포를 활성화 및/또는 성숙시키는 방법을 제공하는데, 여기에서 미생물의 핵산은 변형되어 (예를 들어, 핵산에 직접 반응하는 핵산 표적 화합물과 반응함으로써 변형되어) 미생물은 증식이 약화된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 다음: (a) 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 세포에 접촉시킴으로써 항원을 전문 항원제시세포에 적재하는 단계로서, 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형되는 것을 특징으로 하는 단계; 및 (b) 적재된 전문 항원제시세포를 포함하는 조성물의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응함으로써 변형되었다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 적당한 조건 하와 항원제시세포를 적재하기에 충분한 시간 동안 시험관 내 또는 생체 외에서 세포에 항원을 발현하는 변형된 미생물을 접촉시키는 것을 포함하는, 수지상 세포 같은 전문 항원제시세포에 항원을 적재하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 증식이 약화된다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 증식은 비록 약화되지만, 미생물은 세포에 의한 항원제시 작용을 하기에 충분한 유전자 발현을 유지한다. 항원제시는 MHC 클래스 I 제시 또는 MHC 클래스 II 제시일 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 적당한 조건 하와 수지상 세포가 활성화되고/또는 항원제시세포가 성숙되도록 허용하기에 충분한 시간 동안 항원제시세포를 변형된 미생물에 시험관 내 또는 생체 외로 접촉시키는 것을 포함하는, 항원제시세포 (예를 들어, 수지상 세포)를 활성화 및/또는 성숙시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 미생물의 증식은 약화된다. 다른 구체예에서, 미생물의 증식은 비록 약화되지만, 미생물은 세포의 활성화 및/또는 성숙이 작용하기에 충분한 유전자 발현을 유지한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 항원을 제시하는 (수지상 세포 같은) 항원제시세포를 포함하는 유효량의 면역유발성 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 제공하는데, 여기서 항원제시세포는 변형된 미생물을 포함한다. 한 구체예에서, 미생물의 증식은 약화되었다. 다른 구체예에서, 미생물의 증식은 비록 약화되지만, 미생물은 세포에 의한 항원제시 작용을 하기에 충분한 유전자 발현을 유지한다. 한 구체예에서, 면역 반응은 CD8⁺ T 세포 반응이다. 다른 구체예에서 면역반응은 CD4⁺ T 세포 반응이다.

다른 양태에서, 본 발명은 다음: (a) 적당한 조건 하와 항원제시세포를 적재하기에 및 항원제시세포의 활성화 및/또는 성숙 작용에 충분한 시간 동안 시험관 내 또는 생체 외에서 항원제시세포에 항원을 발현하는 리스테리아(Listeria)를 접촉시키는 단계; 및 (b) 숙주에 유효량의 항원제시세포를 투여하는 단계를 포함하는 하우언에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 미생물의 증식은 약화되었다. 다른 구체예에서, 비록 미생물의 증식은 약화되었지만, 항원제시세포와 접촉된 미생물은 항원제시세포 상의 항원 제시 및 항원제시세포의 활성 화 및/또는 성숙 둘 다의 작용에 충분한 유전자를 유지하였다. 한 구체예에서, 면역 반응은 CD8⁺ T 세포 반응이다. 다른 구체예에서 면역반응은 CD4⁺ T 세포 반응이다.

다른 양태에서, 본 발명은 변형된 미생물을 포함하는 생체 외 또는 시험관 내 전문 항원제시세포를 제공하는데, 여기에서 미생물의 증식은 약화된다. 다른 구체예에서, 변형된 미생물은 비록 증식이 약화되었지만, 수지상 세포에 의한 항원제시 작용에 충분한 유전자 발현을 유지한다. 한 구체예에서, 항원제시세포는 수지상 세포이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 (수지상 세포 같은) 항원제시세포를 포함하는 백신을 제공하는데, 여기에서 항원제시세포는 변형된 미생물을 포함한다. 다른 구체예에서, 미생물은 리스테리아(Listeria)이다. 한 구체예에서, 리스테리아(Listeria)의 증식은 약화되었다. 다른 구체예에서 리스테리아(Listeria)의 증식은 비록 약화되었지만, 리스테리아(Listeria)는 세포 상에 항원제시 작용에 충분한 유전자 발현을 유지하였다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 (수지상 세포 같은) 항원제시세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 항원제시세포는 변형된 리스테리아(Listeria)를 포함한다. 한 구체예에서, 리스테리아(Listeria)의 증식은 약화되었다. 다른 구체예에서 리스테리아(Listeria)의 증식은 비록 약화되었지만, 리스테리아(Listeria)는 세포 상에 항원제시 작용에 충분한 유전자 발현을 유지하였다.

전기한 양태 각각의 몇몇 구체예에서, 변형된 미생물은 변형된 리스테리아(Listeria)이다. 전기한 양태 각각의 추가적 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes)이다. 더 나아간 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함한다. 예를 들어, 전기한 양태 중 어느 것에서, 리스테리아(Listeria)는 선택적으로 uvrAB 에서 돌연변이를 포함한다. 대안의 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 선택적으로 uvrAB 및 actA 둘 다에서 돌연변이를 포함한다.

전기한 양태 각각의 다른 구체예에서, 리스테리아(Listeria)의 약독은 가교형성제에 리스테리아(Listeria)를 노출시킴으로써 영향받았다. 전기한 양태 각각의 몇몇 구체예에서, 가교형성제는 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르이다. 전기한 양태 각각의 다른 구체예에서, 가교형성제는 소라렌 유도체이고 리스테리아(Listeria)는 UVA 광에 노출된다. 전기한 양태 각각의 몇몇 구체예에서, 가교형성제는 (여기에서 "S-59"라고도 지칭되는) 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소라렌이다.

도 1은 OVA 항원을 함유한 야생형 리스테리아(Listeria)DP-L4056의 약화를, 수지상 셀라인에 대한 OVA 항원제시 측정값에 따른 소라렌 S-59 농도 (2 J/cm² UVA) 의 함수로서 도시한다. 미처리 군에 비교한 박테리아 log 적정값 및 제시된 항원의 %가 nM S-59에 대하여 플롯팅 되었다 (데이터는 DC 2.4 세포당 100 개 리스테리아(Listeria) ).

도 2는 OVA 항원을 함유한 야생형 리스테리아(Listeria)DP-L4056 (2A) 및 LLO-돌연변이DP-L4027 (2B)의 약화를, 수지상 셀라인에 대한 OVA 항원제시 측정값에 따른 알킬화제 화합물 I의 함수로서 도시한다. 미처리 군에 비교한 박테리아 log 적정값 및 제시된 항원의 %가 μM 화합물 I에 대하여 플롯팅 되었다 (데이터는 DC 2.4 세포당 100 개 리스테리아(Listeria) )

도 3은 야생형 E.coli 대 수복 결손 돌연변이체 CSR 603 (uvrA recA phr 돌연변이체)의 불활성화의 비교를, S-59 농도 (2 J/cm² UVA)의 함수로서 나타낸다. 박테리아 log 적정값이 nM S-59에 대하여 플롯팅 되었다 (log 법으로 나타냄).

도 4는 평균 종양 부피를, 제 3, 7 및 14일에 백신 투여된 C57Bl/6 마우스 내로 B16 OVA 종양을 이식 한 경과 일 수의 함수로서 나타낸다. 시험된 백신은 S-59 처리를 한 것과 하지 않은 것이 있다.

도 5는 생존 백분률을, 제 3, 7 및 14일에 백신접종된 C57Bl/6 마우스 내로 B16 OVA 종양을 이식 한 경과 일 수의 함수로서 나타낸다. 시험된 백신은 S-59 처리를 한 것과 하지 않은 것이 있다.

도 6은 OVA 발현이 있는 경우와 없는 경우, S-59 UVA 처리 (PCT)가 있는 경우와 없는 경우의, 야생형 리스테리아 (Listeria)로 백신 접종한 마우스로부터의 TNF-α 및 IFN-γ 포지티브인 비장 세포의 집단을 나타내는 유동세포계측결과를 나타낸다.

도 7은 S-59 UVA 처리 (PCT)가 있는 경우와 없는 경우의, 야생형 리스테리아 (Listeria)로 백신접종한 마우스로부터의 SL8, LLO₁₉₀ _-201, 또는 LLO₂₉₆ _-304로 자극한 후에 2 x 10⁵ 비장 세포당 IFN-γ 형성 세포의 수를 나타내는 ELISPOT 결과를 나타낸다.

도 8은 uvrAB의 결실이 있는 및 없는 리스테리아 (Listeria) 균주의 약화를 나타낸다. log 적정값은 사용된 소라렌 S-59의 nM 농도 (6 J/cm² )에 대하여 플롯팅한다. 도 8A, 균주 DP-L4017 (L461T LLO 돌연변이체) 및 야생형 (DP-L4056). 도 8B, DP-L4017 및 DP-L4029 (△actA).

도 9는 DP-L4029 (△actA) 리스테리아 (Listeria) 균주의 약화를, 수지상 셀라인에 대한 OVA 항원제시 측정값에 따른 소라렌 S-59 농도의 함수로서 도시한다. 모 균주 (여기에서는 △actA; 9A, 9C)가 uvrAB 결실을 갖는 균주 (△uvrAB; 9B, 9D)와 비교된다. 미처리 군에 비교한 박테리아 log 적정값 및 제시된 항원의 %가 nM S-59에 대하여 플롯팅 되었다. 도 9A, 9B, 0.5J/cm² UVA로 투여하고, 리스테리아 (Listeria)를 한 차례 세척하고 재차 5.5J/cm² UVA로 투여하고 항원의 제시를 DC 2.4 세포당 1 개 리스테리아(Listeria)에서 측정하였다. 9C, 9D, 리스테리아(Listeria)를 S-59 존재하에서 성장시킨 후, 6J/cm² UVA를 투여하고 항원의 제시를 DC 2.4 세포당 10 개 리스테리아(Listeria)에서 측정하였다. (데이터의 확대된 플롯 또한 도 9C 및 9D에 제공됨)

도 10은 S-59/UVA 처리된 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 균주 DP-L4029 (△actA) 및 DP-L4029 uvrAB(△actA △uvrAB)에 의하여 합성된 단백질 내로 혼입된 ³⁵S 메티오닌/시스테인의 폴리아크릴아미드 겔을 나타낸다.

도 11은 SL8, LLO 특이적 항원 LLO 190 및 LLO 296으로 자극된, 59/UVA (두 가지 방법에 의하여) 처리된 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 균주 DP-L4029 (△actA)-OVA 또는 △actA △uvrAB-OVA 로 백신 접종한 마우스로부터의 비장 세포에 대한 ELISPOT 결과를 나타낸다. 도 11A는 OVA 특이적 항원으로 자극한 플레이트 상 스폿 형성 콜로니를 나타내고, 도 11B는 2 x 10⁵ 비장 세포당 IFN-γ 스폿 형성 세포를 플롯한다.

도 12는 SL8 (12A), LLO 특이적 클래스 II 항원 LLO _190-201 (12B) 및 LLO 특이적 클래스 I 항원 LLO _296-304 (12C)으로 자극된, 59/UVA (두 가지 방법에 의하여) 처리된 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 균주 DP-L4029 (△actA)-OVA 또는 △actA △uvrAB-OVA 로 백신 접종한 마우스로부터의 비장 세포에 대한 세포내 사이토킨 염색법 (ICS) 분석을 나타낸다. 도면에서 S-59/UVA 처리된 리스테리아 (Listeria)는 (광화학적 처리를 나타내는) "PCT"로 표시하였다.

도 13은 S-59/UVA (두 가지 방법에 의하여) 처리된 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 균주 DP-L4029 (△actA)-OVA 또는 △actA △uvrAB-OVA 로 백신 접종한 후, 백신 접종 30일 후에 야생형 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)로 항원자극된 마우스로부터의 비장 세포로부터 분리된 콜로니 형성 단위의 수를 나타낸다.

도 14는 S-59/UVA 처리된 (소라렌 존재 하에서 성장되고 그 후 UVA 처리된) 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 균주 DP-L4029 (△actA)-OVA 또는 △actA △uvrAB-OVA 로 (1x, 3x 또는 5x 백신 접종) 백신 접종한 후, 백신 접종 30일 후에 야생형 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)로 항원자극된 마우스로부터의 비장 세포로부터 분리된 콜로니 형성 단위의 수를 나타낸다.

도 15는 S-59/UVA 처리된 (소라렌 존재 하에서 성장되고 그 후 UVA 처리된) 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 균주 DP-L4029 (△actA)-OVA 또는 △actA △uvrAB-OVA 로 (1x, 3x 또는 5x 백신 접종) 백신 접종된 마우스의 혈청으로부터의 리스테리아(Listeria) 특이적 항체의 항체 적정값을 나타낸다.

도 16은 S-59/UVA 처리된 (소라렌 존재 하에서 성장되고 그 후 UVA 처리된) 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 균주 DP-L4029 (△actA)-OVA 또는 △actA △uvrAB-OVA 로 (1x, 3x 또는 5x 백신 접종) 백신 접종한 후, 백신 접종 30일 후에 야생형 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 로 20 x LD₅₀ 또는 100 x LD₅₀으로 항원자극된 마우스의 생존 백분율 (항원자극 10일 후)을 나타낸다.

도 17은 항원 LLO91, AH1, AH1A5 또는 세포 P815 또는 CT26 세포로 자극된, S-59/UVA 처리된 (소라렌 존재 하에서 성장되고 그 후 UVA 처리된) 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 균주 DP-L4029 (△actA)-OVA AH1A5 또는 △actA △uvrAB-OVA AH1A5로 백신 접종된 마우스로부터의 비장 세포에 대한 ICS 분석의 결과를 나타낸다.

도 18은 AH1A5(18A) 또는 AH1(18B) 항원으로 자극된, S-59/UVA 처리된 (소라렌 존재 하에서 성장되고 그 후 UVA 처리된) 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 균주 DP-L4029 (△actA)-OVA AH1A5 또는 △actA △uvrAB-OVA AH1A5로 백신 접종된 마우스로부터의 비장 세포에 대한 스폿 형성 콜로니를 갖는 플레이트를 나타내는 ELISPOT 분석의 결과를 나타낸다.

도 19는 △uvrAB 돌연변이가 있는 및 없는, S-59/UVA 처리된 DP-L4029로 치료적 백신 접종을 받은 확립된 CT26 허파 종양을 갖는 마우스로부터의 허파를 나타낸다 (19A). 허파 전이의 수가 각 백신 균주에 대하여 플롯화된다 (19B). 잔여 마우스의 생존이 도 19C에 플롯화된다.

도 20은 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) △actA, △actA AH1-A5, △actA △uvrAB AH1A5, 및 △actA △inlB AH1A5로 치료적 백신 접종을 받은 확립된 CT26 종양을 갖는 마우스를 나타낸다. △uvrAB 균주는 미처리, 가 열사멸(HK), 또는 S-59 UVA (PCT) 처리하였다. 마우스의 서브세트로부터 회수된 허파를 도 20A에 나타낸다. 플롯된 각 그룹 내의 허파 전이의 수가 도 20B에 나타난다. 잔여 마우스의 생존이 도 20C (모 균주) 및 20D (△uvrAB)에 플롯화된다.

도 21A는 S-59/UVA 처리된 야생형 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) uvrAB 돌연변이에 의하여 감염된 DC 2.4 세포의 형광현미경 이미지를 나타내는데, 결합된 이미지 (리스테리아(Listeria) 및 액틴 둘 다 포지티브) 및 로다민 이미지 (액틴만 포지티브)를 나타낸다.

도 22는 S-59/UVA 처리된, 그람 염색된 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 야생형 및 △uvrAB 균주의 네거티브 이미지 광학현미경을 나타낸다.

도 23은 지시된 리스테리아(Listeria) 균주 및 비히클 대조표준으로 백신 접종된 마우스 내로 주입한 후의 표적 세포 집단을 나타낸다. 비특이적 표적세포에 비교한 항원 특이적 표적세포의 감소수준은 백신 접종에 반응하여 T 세포의 생체 내 세포독성을 나타낸다. 도 23A는 제 0 일에 (S-59/UVA 처리된 균주에 대하여는 제 1 일 및 제 2 일에도) 백신 접종된 AH1A5 발현 백신에 대한 결과를 나타낸다. (23A 및 23B의 윗줄은 AH1 표적 세포에 대하여 지시 백신으로 백신 접종된 마우스에 대한 결과를 나타낸다. 아랫줄은 AH1-A5 표적 세포에 대하여 지시 백신으로 백신 접종된 마우스에 대한 결과를 나타낸다.) 도 23B는 제 14 일에 (S-59/UVA 처리된 균주에 대하여는 제 15 일 및 제 16 일에도) 재차 백신 접종을 나타낸다. 도 23 C는 OVA 특이적 반응을 관찰하였다.

도 24는 uvrAB의 결손이 있는 및 없는, 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) Sterne 균주의 약화를 나타낸다. 성장 및 UVA 조사 (6 J/cm²) 동안에 존재한 소라렌 S-59의 nM 농도에 대하여 log 적정값이 플롯팅되었다.

도 25는 리스테리아(Listeria) uvrAB^- 가 S-59/UVA 광 불활성화에 더 민감하다는 것을 나타낸다. 리스테리아(Listeria)를 중간-지수상승기까지 성장시킨 후, PBS로 세척하고 5 분 동안 다양한 농도의 S-59와 인큐베이션시키고 2.1 J/cm²의 UVA 조사하였다. 리스테리아(Listeria)의 생존도는 BHI 한천 플레이트 상 성장에 의하여 평가되었다. (A) 100nM S-59에서 처리된 리스테리아(Listeria)의 대표적 BHI 한천 플레이트. 가열사멸된 리스테리아(Listeria)를 대조표준으로 사용; (B) 다양한 농도의 S-59로 처리된 리스테리아(Listeria)가 BHI 한천 플레이트 상에서 콜로니를 형성하는 생존도.

도 26은 S-59/UVA 처리된, 생존불능 리스테리아(Listeria) uvrAB는 그것의 대사활성 및 그것의 게놈 레퍼토리의 복제를 유지하였음을 나타낸다. (A) S-59/UVA 불활성화 리스테리아(Listeria) uvrAB의 MTT 분석에서 측정되는 대사 활성. 살아있는 및 가열사멸된 리스테리아(Listeria) uvrAB 균주가 대조표준으로 기능함; (B) MTT 분석에서 측정되는 불활성화된 리스테리아(Listeria) uvrAB 균주의 대사활성의 정량화.

도 27은 완전히 불화성화된 리스테리아(Listeria) uvrAB 가 DC를 감염시키고 파고리소좀으로부터 이탈하는 능력은 유지하는 것을 나타낸다. 커버슬립 상에서 성장시킨 마우스의 DC 셀라인, DC 2.4에 MOI 1에서, 37 ℃ 30분 동안 감염시켰다. 세포외 박테리아는 수차례의 세척에 의하여 제거하였고 감염된 세포는 세포외 박테리아의 성장을 방지하기 위하여 겐타마이신 존재 하에 37 ℃에서 5 시간동안 인큐베이션하였다. DC 2.4 세포를 3.5% 포름알데히드로 고정시킨 후에 토끼 항-리스테리아(Listeria) 항체로 염색하고, 염소-항-토끼 FITC 이차 항체로 검출하였다. 액틴을 팔로이딘-로다민으로 검출하고 핵을 DAPI를 사용하여 가시화하였다.

도 28은 완전히 불화성화된 리스테리아(Listeria) uvrAB 가 유효하게 항원을 마우스 골수 유래 DC (BM-DC)의 MHC 클래스 I 경로 내로 적재하는 것을 나타낸다. 제 5 일 BM-DC를 MOI 100에서, 37 ℃ 30분 동안 감염시켰다. 세포 외 박테리아를 수차례의 세척에 의하여 제거하였다. 감염된 BM-DC를 B3Z와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션 시켰고 색소생산성 기질 CPRG (흡광) 의 가수분해에 의하여 측정하였다.

도 29는 리스테리아(Listeria) 감염된 인간 미성숙 단핵구-유래 DC가 활성화(29A) 및 성숙 마커 (29B) 뿐 아니라 분비성 염증전 사이토킨 (29C)을 상향조절한다는 것을 나타낸다. 감염된 DC는 세포외 박테리아의 성장을 방지하기 위하여 겐타마이신 존재 하에 24 시간 동안 추가적으로 배양하였다. 표현형 변화는 유동세포계측법으로 측정하였다. 사이토킨의 농도를 세포계측 비드 분석 키트 (Pharmingen)을 사용하여 세포 상청액으로부터 측정하였다.

도 30은 S-59/UVA 불활성화된 리스테리아(Listeria) uvrAB는 OVA-특이적 생체 내 면역을 유발하는 것을 나타낸다. 암컷 C53BL/6 마우스에 S-59/UVA 불활성화 된 리스테리아(Listeria) uvrAB OVA를 1 x 10⁸ CFU로 투여하였다. S-59/UVA 불활성화된 모 리스테리아(Listeria) 및 가열사멸된 리스테리아(Listeria)를 대조표준으로 사용하였다. 7일 후, 비장을 수집하고 OVA 특이적 CD8+ T 세포 반응을 IFN-γ ELISPOT에 의하여 평가하였다. (A) 대표적인 ELISPOT 웰을 나타냄; (B) ELISPOT에 의하여 평가된 OVA-특이적 면역도. 백신접종된 마우스의 비장 세포를 OVA257-264 펩티드 존재 또는 부재하에서 배양하였다.

도 31은 이종 항원 LLO-OVA/PR3 (SEQ ID NO:48)의 일차 아미노산 서열을 나타낸다. 도면은 또한 OVA H-2K^b 에피토프 (SEQ ID NO:49) 및 PR3 HLA A-2 제한된 클래스 I 에피토프 (a.k.a. PRI) (SEQ ID NO:50).

도 32는 화합물 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5', 8-트리메틸소라렌 (S-59)를 나타낸다.

본 발명은 변형된 독립생존 미생물 및 백신 조성물에서 변형된 독립생존 미생물의 사용에 관한 것인데, 여기에서 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물 유전자 발현은 변형에 의하여 실질적으로 영향받지 않는다. 본 발명은 또한 항원 적재 및 항원제시세포의 시험관 내 또는 생체 외 활성화/성숙의 유발에서의 변형된 미생물의 사용에 관한 것이다. 항원은 변형된 미생물에 의하여 천연적으로 생산되는 항원일 수도 있고 재조합 미생물에 의하여 발현되는 이종 항원일 수도 있다. 결과의 항원제시세포는 백신 조성물 용도 및 면역요법 용도에 적당하다. 결과의 백신 조성물의 투여에 의하여 촉발되는 면역반응은 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 면역반응일 수 있다.

이 같은 변형된 미생물의 하나는 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes)이다. 본 발명자는 자외선 A (UVA) 광으로 조사된 후 박테리아의 게놈에서 비가역적 가교결합을 형성하는 일군의 화합물인 소라렌에 의한 불활성화에 특히 민감하여 생존 불가능하도록 리스테리아(Listeria)를 조작하였다. (하기 실시예 3 참조) 모델 항원의 발현을 유지하면서 야생종 및 변형된 리스테리아(Listeria)의 증식의 약화가 지금 도시되었다 (하기 실시예 1-2 및 11 참조). 변형된 리스테리아(Listeria)는 또한 항종양 반응을 제공하고 (하기 실시예 4 및 14-16), 항원 특이적 T 세포 반응을 유발하고 (실시예 5), 그리고 생체 내 세포독성 반응을 나타내는 (실시예 20) 것으로 나타난다. 리스테리아(Listeria)는 DC에 의하여 신속하게 포식되고 파고라이소좀 구획 내로 수송된다. 이 현상은 DC의 표현형 성숙 및 그에 이은 IFN-γ, IL-12 및 TNF-를 포함하는 면역자극성 사이토킨의 광범위한 프로파일의 분비를 결과한다. 본 발명자는 이제 비성숙 DC에 재조합 리스테리아(Listeria)를 감염시키는 것은, 암호화된 이종 항원의 MHC 클레스 I-한정 제시와 함께 신속한 활성화/성숙을 결과한다는 것을 설명한다. 또한, 파고리소좀 내에서의 리스테리아(Listeria) 백신의 퇴화는 MHC 클레스 II 경로를 통한 암호화 항원의 제시를 결과한다. (하기 실시예 참조)

이 같이 변형된 다른 미생물은 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)이다. 본 발명자는 또한 소라렌에 의한 불활성화에 특히 민감한 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)의 약독 균주를 조작하였다 (하기 실시예 21 참조)

따라서, 본 발명은 독립생존 미생물을 포함하는 백신을 제공하는데, 여기에서 미생물의 핵산은 미생물 증식이 약되도록 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 증식의 약화는 투여량 의존적 방식으로 제어된다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 미생물 유전자 발현은 미생물의 증식의 약화에 의하여 실질적으로 영향받지 않는다. 몇몇 구체예에서, 백신 내 미생물은 개체에 백신의 투여 후에 개체에서 항원에 대한 면역반응을 유발하기에 충분한 수준으로 항원을 발현한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과의 반응에 의하여 변형되었다. 한 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르 같은 알킬화제이다. 다른 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌 (psoralen) 화합물 (예를 들어, "S-59"라고도 지칭되는 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소라렌)이다. 몇몇 구체예에서, 백신 내의 미생물은 미생물이 그것의 변형된 핵산을 수복하는 능력을 약화시키는 유전적 변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 또는 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes) 같은 박테리아이다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 백신은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 아쥬반트를 더 포함한다. 본 발명은 유효량의 백신을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 또한 항원을 발현하는 미생물인 유효량의 백신을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 더 제공하는데, 여기에서 미생물은 항원을 발현한다.

본 발명은 핵산을 수복하는 능력이 약화된 유전자 돌연변이를 포함하는 돌연변이 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 같은 분리된 돌연변이 리스테리아(Listeria) 균주를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 리스테리아(Listeria) 균주는 적어도 하나의 (uvrA 및/또는 uvrB 같은) DNA 수복 효소가 결여된다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 리스테리아(Listeria) 균주는 적어도 하나의 uvrA 유전자 및/또는 uvrB 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁되고 수탁번호 PTA-5563로 표시되는 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) △actA /△uvrAB 균주이다. 다른 구체예에서, 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁되고 수탁번호 PTA-5563로 표시되고, 기탁된 균주의 돌연변이는s UvrA, UvrB, 및 ActA가 결여된 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) △actA /△uvrAB 균주이다. 본 발명은 돌연변이 리스테리아(Listeria) 균주를 포함하는 백신 및 전문 항원제시세포를 더 제공한다. 변형된 리스테리아(Listeria) 균주를 사용하여 면역반응을 유발하고 질병을 예방 또는 치료하는 방법이 또한 제공된다.

본 발명은 핵산을 수복하는 능력이 약화된 유전자 돌연변이를 포함하는 분리된 돌연변이 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 균주를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 적어도 하나의 (UvrA 및/또는 UvrB 같은) DNA 수복 효소가 결여된 돌연변이이다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 uvrA 유전자 및/또는 uvrB 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 RecA가 약화된다. 몇몇 구체예에서, 돌연변이 균주는 recA 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 균주의 독성을 감소시키는, lef 유전자, cya 유전자 또는 두 유전자 다의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 균주를 포함한다. 본 발명은 돌연변이 균주를 포함하는 백신 및 전문 항원제시세포를 더 제공한다. 변형된 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 균주를 사용하여 면역반응을 유발하고 질병을 예방 또는 치료하는 방법이 또한 제공된다.

또한, 본 발명은 독립생존 미생물을 포함하는 전문 항원제시세포 (예를 들어, 수지상 세포)를 제공하는데, 여기에서 미생물의 증식이 약화되도록 미생물의 핵산이 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 증식의 약화는 투여량 의존 방식으로 제어된다. 몇몇 구체예에서, 미생물 내 미생물 발현은 미생물의 증식의 약화에 의하여 실질적으로 영향받지 않는다. 몇몇 구체예에서, 백신 내 미생물은 개체에 백신을 투여한 후에 개체 내에서 항원에 반응한 면역 반응을 유발하기에 충분한 수준으로 항원을 발현한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응함으로써 변형되었다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르 같은 알킬화제이다. 다른 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌 (psoralen) 화합물이다. 몇몇 구체예에서, 백신 내의 미생물은 미생물이 그것의 변형된 핵산을 수복하는 능력을 약화시키는 유전적 변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 박테리아이다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한, 항원제시세포를 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명은 유효량의 항원제시세포를 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 또한 항원을 발현하는 미생물인 유효량의 항원제시세포를 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 적당한 조건 하에서 나이브 T 세포를 활성화시키기 충분한 시간 동안 나이브 T 세포를 전문 항원제시세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 생체 외 및/또는 시험관 내에서 나이브 T 세포를 활성화시키는 방법을 더 제공한다.

본 발명은 적당한 조건과 전문 항원제시세포를 적재하기에 충분한 시간 동안 전문 항원제시세포에 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 접촉시켜 전문 항원제시세포를 적재하는 것을 포함하는, 전문 항원제시세포에 항원을 적재하는 방법을 제공하는데, 여기에서 미생물 증식이 약화되도록 미생물의 핵산이 변형된다.

본 발명은 적당한 조건 하 및 전문 항원제시세포를 적재하기에 충분한 시간 동안 전문 항원제시세포에 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 접촉시켜 전문 항원제시세포를 적재하는 것을 포함하는, 전문 항원제시세포를 활성화 및/또는 성숙시키는 방법을 제공하는데, 여기에서 미생물의 핵산은 미생물 증식이 약화되도록 변형된다.

본 발명은 다음: (a) 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 세포에 접촉시킴으로써 항원을 전문 항원제시세포에 적재하는 단계로서, 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형되는 것을 특징으로 하는 단계; 및 (b) 적재된 전문 항원제시세포를 포함하는 조성물의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 적당한 조건 하와 항원제시세포를 적재하기에 충분한 시간 동안 시험관 내 또는 생체 외에서 세포에 항원을 발현하는 변형된 미생물을 접촉시키는 것을 포함하는, 수지상 세포 같은 전문 항원제시세포에 항원을 적재하는 방법을 제공한다.

본 발명은 적당한 조건 하 및 수지상 세포 활성화 및/또는 성숙 작용이 이루어지고/또는 항원제시세포가 성숙되도록 허용하기에 충분한 시간 동안 항원제시세포를 변형된 미생물에 시험관 내 또는 생체 외로 접촉시키는 것을 포함하는, 항원제시세포를 활성화 및/또는 성숙시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 항원을 제시하는 항원제시세포를 포함하는 유효량의 면역유발성 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 제공하는데, 여기서 항원제시세포는 변형된 미생물을 포함한다.

본 발명은 다음: (a) 적당한 조건 하와 항원제시세포를 적재하기에 및 항원제시세포의 활성화 및/또는 성숙 작용에 충분한 시간 동안 시험관 내 또는 생체 외에서 항원제시세포에 항원을 발현하는 리스테리아(Listeria)를 접촉시키는 단계; 및 (b) 숙주에 유효량의 항원제시세포를 투여하는 단계를 포함하는 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 제공한다.

본 발명은 변형된 미생물을 포함하는 생체 외 또는 시험관 내 전문 항원제시세포를 제공하는데, 여기에서 미생물의 증식은 약화된다.

또한, 본 발명은 변형된 미생물을 포함하는 항원제시세포를 포함하는 백신 및 리스테리아(Listeria)를 포함하는 항원제시세포와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

미생물-기초 백신

본 발명은 변형된 독립생존 미생물 및 백신 조성물 내의 독립생존 미생물의 사용에 관한 것인데, 여기서 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 유전자 발현은 변형에 의하여 영향받지 않는다.

살아 있는 약독 미생물 백신에 비교하여 사멸 미생물 백신이 종종 품질이 떨어지는 것이 관찰되어 왔다 [Lauvau et al., Science 294:1735-1739 (2001)]. 완전 사멸시킨 미생물에서는 신규 미생물 유전자 발현이 본질적으로 제거된다. 그러므로, 백신이 미생물 백터로 유발된 감염질환의 예방을 목적으로 하든 벡터가 이종 항원의 송달에 사용되든 관계없이, 증식은 약화되지만 미생물 유전자 발현 수준을 충분히 유지시키도록 적정 수준으로 미생물 핵산을 변형하는 것이 사멸된 미생물 백신보다 더 효율적일 수 있고 어떤 미생물 백터에도 적용될 수 있는 백신 제제에 대한 접근법을 제공한다. 용어 미생물은 본 발명의 모든 구체예와 관련하여서 독립생존 미생물을 의미하려는 의도이고 바이러스를 포함하려는 의도가 아님이 이해될 것이다. 이 같은 미생물-기초 백신은 개체에 특이적 항원을 송달하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 백신은 하나 이상의 항원을 송달한다. 이 같은 백신은 항원 또는 항원들에 대하여 면역화된 개체를 결과하는 항나 이상의 항원에 대한 면역반응을 촉발하도록 고안된다. 생성된 면역반응은 항원 매개 반응, 세포 매개 반응 또는 둘 다일 수 있다. 용어 백신은 예방백신, 즉 면역반응을 촉발시키도록 제공되어서 만일 개체가 그 후 자연적으로 그 항원에 노출되면 미리 형성된 항원반응이 항원 또는 항원을 갖는 세포와 싸울 수 있는 능력을 증가시키는 백신을 포괄하도록 의도된다. 용어 백신은 또한 치료백신, 즉 백신 항원과 관련된 질환에 이미 걸린 개체에 제공되는 백신을 포괄하도록 의도되는데, 여기에서 백신은 면역반응을유발하거나 개체에게 존재하는 항원에 대한 면역 반응을 상승시켜 작용제 또는 항원을 운반하는 세포와 싸우는 능력의 증가를 제공한다. 이것은 암세포 같은 질환세포에 대한 면역반응뿐 아니라 프라이온 같은 질병 관련 단백질에 대한 면역반응을 포함한다. 한 구체예에서, 독립생존 미생물은 박테리아, 원생생물 및 균류로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 독립생존 미생물은 그램 양성, 그램 음성, 세포 내 박테리아 및 마이코박테리아로 구성되는 군으로부터 선택되는 박테리아이다.

본 발명은 다양한 수준의 미생물의 핵산의 변형을 포함한다. 미생물 핵산의 대사는 몇몇 방법으로 일어난다는 것이 이해된다. 미생물의 복제는, 미생물을 복제하기 위하여 전체 미생물 게놈의 복제하는 것과 이어서 개별 세포로 DNA 분자를 구회화하는 것, 즉 세포가 분열되어 결과의 세포 둘 다 미생물 게놈의 DNA의 완전한 복제물을 갖게 되는 것을 포함한다. 미생물 핵산 대사는 또한 DNA가 RNA로 전사되는 것과 RNA가 단백질로 번역되는 것의 조합을 포함한다. 미생물 게놈의 전사는 미생물 게놈의 DNA 일부가 메신저 또는 트렌스퍼 RNA인 RNA로 복제되는 과정을 포함한다. 메신저 RNA의 번역은 이 RNA를 특이적 단백질 또는 단백질의 부분을 생산산하기 위하여 판독하는 과정을 포함한다. 본 발명에서, 미생물의 집단의 핵산은 미생물의 특성 및 그것의 용도에 기초하여 바람직한 정도로 변형된다. 몇몇 구체예에서, 바람직한 정도의 변형은 단백질의 생산은 충분하게 활성이면서 (즉, 미생물의 대사는 활성이면서) 미생물의 게놈의 복제는 유의하게 약화되는 정도이다. 변형의 특성이 어떠하든지, 변형의 수준은 미생물 게놈의 염기쌍 대비 평균적 변형의 개수와 관련하여 표현될 수 있다. 예를 들어, 변형이 핵산에 대한 화합물의 공유결합에 기인한 것 (부가물(adduct))이라면, 변형은 부가물 사이의 염기쌍의 평균 개수와 관련하여 표현될 수 있다. 본 발명의 미생물은 약 10⁴-10⁸ 염기쌍 당 1개 변형, 또한 약 10⁴-10⁷ 염기쌍 당 1개 변형, 또한 약 10⁵-10⁷ 염기쌍 당 1개 변형, 또한 약 10⁵-10⁶ 염기쌍 당 1개 변형의 수준으로 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 변형의 수준은 미생물 집단 내 DNA 복제를 방해하는데 필요한 최소량으로 조정되어 집단이 관찰 가능한 증식을 보이지 않도록 하면서, 개별 유전자 전사 및 번역의 활성은 충분하게 유지하여 (즉 대사 활성은 어느 정도 유지하여) 안전하고 유효한 백신을 달성한다.

한 양태에서, 본 발명은 독립생존 미생물을 포함하는 백신을 제공하는데, 여기서 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 증식의 약화는 투여량 의존 방식으로 제어될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 미생물 유전자 발현은 미생물의 증식의 약화에 의하여 실질적으로 영향받지 않는다. 몇몇 구체예에서, 백신 내 미생물은 개체에 대하여 백신의 투여 후에 개체 내의 항원에 대한 면역을 유발하기에 충분한 수준으로 항원을 발현한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응함으로써 변형되었다. 한 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르 같은 알킬화제이다. 다른 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌 (psoralen) 화합물 (예를 들어, "S-59"라고도 지칭되는 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소라렌)이다. 몇몇 구체예에서, 백신 내의 미생물은 미생물이 그것의 변형된 핵산을 수복하는 능력을 약화시키는 유전적 변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 또는 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes) 같은 박테리아이다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 백신은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 아쥬반트를 더 포함한다. 본 발명은 유효량의 백신을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 또한 항원을 발현하는 미생물인 유효량의 백신을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 더 제공하는데, 여기에서 미생물은 항원을 발현한다.

본 발명은 돌연변이 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes) 균주 또는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)가 그것의 핵산을 수복하는 능력이 약화된 유전자 돌연변이를 포함하는 돌연변이 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes) 균주 또는 돌연변이 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)를 포함하는 백신을 더 제공한다.

항원제시세포 백신

본 발명은 변형된 독립생존 미생물 ,및 미생물의 증식이 약화되도록 미생물의 핵산이 변형된 항원제시세포에 기초한 백신 조성물의 제조에 있어서 변형된 독립생존 미생물의 사용을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 변형된 미생물의 미생물 유전자 발현은 실질적으로 영향받지 않는다.

본 발명의 한 구체예에서, 백신에 사용된 항원제시세포는 전문 항원지시세포이다. 전문 항원지시세포는 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포를 포함한다. 다른 전문 항원지시세포는 단핵구, 변연 영역 쿠퍼 (Kupffer) 세포, 마이크로글리아, 랑게르한스 세포, 깍지낀 수지상 세포, 여포 수지상 세포 및 T 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 전문 항원제시세포는 수지상 세포이다. 다른 구체예에서, 전문 항원제시세포는 대식세포 또는 수지상 세포 (DC)이다. 한 구체예에서 항원제시세포는 인간 세포이다.

한 구체예에서, DC 같은 미성숙 항원제시세포를 환자로부터 분리하여 항원을 발현하는 변형된 미생물로 감염시킨다. 그 후, 결과의, 적재된 항원제시세포를 자가 APC 백신으로서 환자에게 다시 전달시킴으로써 CD4+ 또는 CD8+ 면역반응을 유발한다.

따라서, 본 발명의 항원제시세포 백신을 제조하고 사용하는 방법은 다음과 같다: 미성숙 DC을 결장암 환자로부터 분리하여 S-59/UVA-불활성화되고, 생존불능이며, 대사 활성인 재조합 리스테리아(Listeria)-CEA 백신에 감염시킨다. 리스테리아(Listeria)에 대한 DC 감염은 MHC 클래스 I 및 II 경로 내로 CEA 종양 항원의 유효한 적재를 결과한다. 리스테리아(Listeria) 감염은 DC가 신속하게 활성화 및 성숙되도록 자극하고, 이는 DC가 생체내에서 일차 T 세포 반응을 유도할 수 있는 강력한 APC가 되도록 하는데 결정적이다. 성숙 DC는 CD83, CD80, CD86 같은 공동-자극 분자 및 MHC 분자의 발현을 상향조절한다. 리스테리아(Listeria) 백신이 적재된 DC를 세척하여 자가 DC 백신으로서 환자 체내로 다시 주입하여 CEA 특이적 T 세포 반응을 자극한다.

특정 구체예가 하기 구체적 실시예에서 설명된다. 그러나, 여기에 기재된 일반 방법과 기술은 다양한 변형된 미생물, 항원 및 질병에 널리 적용될 수 있다는 것이 이해된다. 당업자는 여기에 기재된 기술을 용이하게 적용할 수 있을 것이다.

대안적 구체예에서, 미성숙된 DC 같은 항원제시세포를 시험관 내로 항원을 발현하는 변형된 미생물에 감염시킨다. 그 후, 결과의, 적재된 항원제시세포를 환자에게 다시 전달시켜 T cell 집단을 초회항원자극하는데 사용함으로써 CD4+ 또는 CD8+ 면역반응을 유발한다.

다른 양태에서, 본 발명은 독립생존 미생물을 포함하는 전문 항원제시세포를 제공하는데, 여기에서 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 증식의 약화는 투여량 의존적 방식으로 제어된다. 몇몇 구체예에서, 미생물 내 미생물 발현은 미생물의 증식의 약화에 의하여 실질적으로 영향받지 않는다. 몇몇 구체예에서, 백신 내 미생물은 개체에 백신을 투여한 후에 개체 내에서 항원에 반응한 면역 반응을 유발하기에 충분한 수준으로 항원을 발현한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응함으로써 변형되었다. 한 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르 같은 알킬화제이다. 다른 구체예에서, 핵산 표적화 화합물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌 화합물이다. 몇몇 구체예에서, 백신 내의 미생물은 미생물이 그것의 변형된 핵산을 수복하는 능력을 약화시키는 유전적 변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 박테리아이다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한, 항원제시세포를 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명은 유효량의 항원제시세포를 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 또한 항원을 발현하는 미생물인 유효량의 항원제시세포를 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주 내에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 적당한 조건 하에서 나이브 T 세포를 활성화시키기 충분한 시간 동안 나이브 T 세포를 전문 항원제시세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 생체 외 및/또는 시험관 내에서 나이브 T 세포를 활성화시키는 방법을 더 제공한다.

미생물 복제의 약화

본 발명은 미생물의 복제를 약화시키기 위한 미생물 핵산의 변형에 관한 것이다. 복제 중의 이러한 약화는 개체에 미생물의 투여에 대한 안전도 레벨을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 미생물이 증식하는 능력은 정상 성장을 제공하는 조건하에서 미생물 집단을 배양함으로써 측정될 수 있다. 미생물의 집단의 정상 성장은 미생물의 핵산에 변형되지 않은 미생물의 성장으로 간주된다. 미생물 게놈의 변화는 어느 정도의 약화를 야기시켜 미생물이 정상 성장을 경험하지 못하게 할 것이다. 몇몇 미생물은 응결된 성장 배지에 계수될 수 있는 콜로니를 형성할 것이다. 따라서, 미생물의 복제의 약화는 콜로니 형성 단위(CFU)의 수의 감소로서 측정될 수 있다. 콜로니 형성 단위의 수가 용이하게 측정될 수 있을 때까지(예. 50-500 CFU) 미생물 콜로니의 원액은 연속적으로 희석될 것이다. 전형적으로, 희석은 10배이고, 하나 또는 그 이상의 희석된 샘플에 대하여 계수된 콜로니의 수는 log 역가를 평가하는 데 사용된다. 예를 들어서, 희석된 미생물 스톡의 부분표본은 성장 배지에서 플레이팅되며, 결과의 콜로니가 계수된다. 희석의 ml 당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)는 계산되고, 원액(역가로 공지된)의 ml 당 콜로니 형성 단위는 희석으로부터 계산된다. log 수는 log 역가로서 공지된다. 예로서, 1 x 10⁵희석의 0.2 mL 부분표본을 플레이팅하는 24 콜로니 형성 단위는 1.2 x 10⁷역가, 또는 7.08 log 역가 스톡을 제공한다. 약화는 미생물 핵산의 변형 이전의 미생물 역가와 미생물 핵산의 변형 이후의 역가의 비교로서 측정될 수 있다. 변형되지 않은 미생물의 역가 대 변형된 이후의 미생물의 역가의 비의 log는 log 역가를 나타낸다(또는 단순히 두 가지 log 역가의 차이). 예를 들어서, 변형되지 않은 미생물 역가가 1.2 x 10⁷로 측정되고, 변형된 미생물 역가가 4.3 x 10²로 측정되었다면, 결과의 약화의 레벨은 4.45 log이다. 이러한 방법은 병원성 또는 비병원성이냐 하는, 임의의 미생물의 약화를 평가하는 데 사용될 수 있다. 몇몇 미생물에 대하여, 직접 미생물의 성장을 측정하기보다는, 감염된 세포를 죽이는 미생물의 능력에 의하여 미생물을 측정하는 플라크 분석이 사용될 수 있다. 예를 들어서, 특정한 세포내 박테리아는 그것이 감염시킬 수 있는 포유류 세포의 론에서 성장할 수 있다. 적합한 인큐베이션 상태 이후에, 론은 플라크에 대하여 관찰될 수 있다(죽은 세포를 대표하는 세포층에서 투명한 영역). 미생물의 핵산의 변형에 의한 플라크 형성 단위의 수의 약화를 평가하기 위하여 플라크 형성 단위의 수가 콜로니 형성 단위 대신 사용된 경우, 상기 계산은 유사하다. 발명의 구체예에서, 약화의 소망의 양은 안전도의 소망의 레벨 및 미생물의 의도된 적용에 따라서, 증식이 본질적으로 관찰되지 않는 위치의 레벨을 포함하여, 두 배의 감소로부터 약화의 훨씬 더 큰 레벨까지의 범위에 이를 수 있다. 제공된 희석에 대하여 핵산이 미생물의 변형되지 않은 집단에서 존재할 수 있을 정도로 변형된 경우(약 0.3 log 약화), 미생물의 집단에서 콜로니(또는 플라크)의 절반이 존재한다면, 복제 중에 두 배의 약화를 관찰할 수 있을 것이다. 몇몇 구체예에서, 약화는 적어도 약 0.3 log, 약 1 log, 약 2 log, 약 3 log, 약 4 log, 약 5 log, 약 6 log, 또는 적어도 약 8 log이다. 몇몇 구체예에서, 약화는 약 0.3 내지 10 log 이상, 약 2 내지 10 log 이상, 약 4 내지 10 log이상, 약 6 내지 10 log 이상, 약 0.3 내지 8 log, 또한 약 0.3 내지 7 log, 또한 약 0.3 내지 6 log, 또한 약 0.3 내지 5 log, 또한 약 0.3 내지 4 log, 또한 약 0.3 내지 3 log, 또한 약 0.3 내지 2 log, 또한 약 0.3 내지 1 log의 범위에 이른다. 몇몇 구체예에서, 약화는 약 1 내지 10 log 이상, 1 내지 8 log, 1 내지 6 log, 또는 약 2 내지 6 log, 또는 약 2 내지 5 log, 또는 약 3 내지 5 log의 범위에 이른다. 발명의 한 구체예에서, 약화는 본질적으로 완전한 불활성을 야기하며(예. 콜로니 또는 플라크가 검출의 한계까지 관찰되는 경우), 거기서 미생물 유전자 발현은 충분히 활성화된다. 이러한 미생물의 집단은 최저 농도를 찾기도록 미생물 핵산을 변형시키는 데 사용되는 약물의 농도를 적정시킴으로써 달성될 수 있으며, 이러한 농도에서 콜로니 또는 플라크는 검출의 한계에서 관찰되지 않는다.

병원성 미생물의 경우, 미생물의 생물학적 효과에 의하여 약화를 평가하는 것이 또한 가능하다. 예를 들어서, 미생물의 병원성은 마우스 또는 다른 척추동물에서 메디안 치사율(LD₅₀)의 측정에 의하여 평가될 수 있다. LD₅₀는 척추동물의 집단의 절반의 사망을 야기시킬 수 있는, 척추동물로 주입된 미생물의 양(예. CFU)이다. LD₅₀ 값은 약화의 양의 측정으로서, 변형된 그리고 변형되지 않은 미생물에 대하여 비교될 수 있다. 예를 들어서, 미생물의 변형되지 않은 집단이 10³미생물의 LD₅₀를 갖고 핵산이 변형된 미생물의 집단이 10⁵미생물의 LD₅₀를 갖는다면, 미생물은 약화되어서 그것의 LD₅₀는100 배, 또는 2 log로 증가한다. 몇몇 구체예에서, LD₅₀는 두 배 내지 천 배 높아진다. 몇몇 구체예에서, 상대적으로 높은 LD₅₀를 이미 갖고 있는 약독 균주가 사용된다. 이러한 경우에, LD₅₀중의 변형 미생물의 증가는 손상을 야기시키지 않으면서 얼마나 많은 물질인 주입될 수 있는가에 의하여 제한될 것이다. 예를 들어서, 열 사멸 세균의 LD₅₀는생물학적 물질의 마우스로의 적재 및/또는 박테리아 벽 성분에 대한 염증 반응 때문에, 단지 약 1-5 x 10⁹보다 훨씬 크지 않을 것이다. 약화의 정도는 조직 병리학의 범위 또는 혈청 간 효소 레벨과 같은, 다른 생물학적 효과에 의하여 정성적으로 또한 측정될 수 있다. 전형적으로, 혈청중의 알라닌아미노전이효소(ALT), 아스파르테이트 아미노전이효소(AST), 알부민 및 빌리루빈 레벨은, 본 발명의 미생물이 주입된 마우스에 대하여 임상실험에서 측정된다. 마우스 또는 다른 척추동물 중에서 이러한 효과는 미생물의 약화를 평가하는 방법으로서 변형되지않고 그리고 변형된 미생물에 대하여 비교될 것이다. 조직에서 미생물의 효과의 측정에 덧붙여서, 시간에 대한 함수로서, 간 또는 비장과 같은 감염된 조직으로부터 회수될 수 있는 생존가능 미생물의 양은, 변형된 대 변형되지 않은 미생물이 주입된 마우스 중에서 이러한 값의 비교에 의하여 약화의 측정으로서 또한 사용될 수 있다.

발명의 미생물에 의한 단백질의 발현

미생물의 약화 증식에 덧붙여서, 미생물의 핵산의 변형은 제어되어서, 미생물 유전자 발현이 실질적으로 영향을 받지 않는다. 실질적으로 영향을 받지 않기 위하여, 미생물 유전자 발현은 핵산의 변형에 완전히 활성될 필요는 없다. 핵산이 복제를 약화시키도록 변형된 미생물의 집단 중에서, 미생물 유전자 발현은 미생물에 의한 소망의 단백질의 적당한 발현 레벨을 제공하기에 충분할 만큼 능동적이어야 한다는 것이 필요할 뿐이다. 발현의 적당한 레벨은 어느 정도 미생물의 의도된 사용에 달려있다. 예를 들어서, 미생물이 백신으로서 사용될 특정한 항원을 함유한다면, 적당한 발현은 백신에 반응하여 효과적인 방어 또는 치료적 면역을 제공하는 발현의 최소 레벨로서 결정될 것이다. 미생물 유전자 발현은 이러한 백신이 효과적인 면역 반응을 제공하는 지의 여부를 평가하도록, 생체외 그리고 생체내의 방법 모두에 의하여 평가될 수 있다. 통상적으로, 핵산이 변형된 미생물의 집단은 특정한 항원에 대하여 변형되지 않은 미생물의 집단과 비교될 수 있다.

하나의 가능성은 미생물의 집단과 혼합된 항원 제시 세포에 의하여 관심의 항원의 제시를 측정하는 것이다. 미생물은 적합한 항원 제시 세포 또는 세포주와 함께 혼합될 수 있으며, 예를 들어 수지상 세포는, 수지상 세포에 의하여 항원을 인식하는 T 세포로의 항원 제시가 측정될 수 있다. 미생물이 충분한 레벨에서 항원을 발현한다면, 수지상 세포에 의하여 펩티드 단편으로 프로세싱되며, MHC 클래스 I 또는 클래스 II의 환경에서 CD8 + 또는 CD4+ T 세포로 각각 제시될 것이다. 제시된 항원의 검출을 목표로, 특정한 항원에 반응하는 T 세포 클론 또는 T 세포주가 사용될 수 있다. T 세포가 종양 세포주와 함께 융합됨으로써 불멸하는 경우, T 세포는 T 세포 하이브리도마가 또한 될 수 있다. 이러한 T 세포 하이브리도마, T 세포 클론, 또는 T 세포주는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포를 포함할 수 있다. 항원이 프로세싱되는 경로에 따라서, 항원 제시 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포에 제시할 수 있다. CD4+ T 세포가 MHC 클래스 II의 환경에서 항원을 인식할 때, CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I의 이여 특이적 인식을 통하여 제시된 항원에 의하여 자극될 것이며, 정량적으로 측정될 수 있는(예를 들어, ELISA 분석을 사용하여), IL-2 또는 인터페론-γ(IFN-γ)와 같은 특정한 단백질의 생산을 유발한다. 대안으로, 하이브리도마는 제시된 항원에 의하여 T 세포 하이브리도마의 자극에 활성화되는 β-갈락토시다아제와 같은, 정보제공유전자를 포함하도록 디자인될 수 있다. β-갈락토시다아제의 생산의 증가는 색 변화를 유발하는 클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노시드와 같은, 기질에서 그것의 활성도에 의하여 용이하게 측정될 수 있다. 색 변화는 특이적 항원 제시의 지시제로서 직접적으로 측정될 수 있다(실시예 1,2 및 11). 본 발명의 미생물 백신의 항원 발현을 평가하는 부가적인 생체외 및 생체내 방법은 실시예 5에서 발견될 수 있다. 본 발명의 미생물에 의한 특정한 단백질의 발현을 직접적으로 측정하는 것은 또한 가능하다. 예를 들어서, 방사성으로 표지된 아미노산은 세포 집단에 첨가될 수 있고, 특정한 단백질에 통합된 방사선의 양을 측정할 수 있다. 세포 집단에 의하여 합성된 단백질은, 예를 들면 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동에 의하여, 관심의 단백질로서 확인되며, 즉 단백질에 대한 항체 특이성을 갖는 결합에 의하여 고립될 수 있으며, 방사선의 양은 특정한 단백질의 발현 레벨을 평가하도록 정량적으로 측정될 수 있다.

대안으로, 단백질은 방사선 없이 발현될 수 있고, 효소 결합 항체 또는 형광적으로 표지된 항체를 사용하여 검출하는 웨스턴 블롯 및 겔 전기영동에 의하여, 또는 ELISA 분석과 같은 다양한 방법에 의하여 검출될 수 있다.

변형되지 않은 미생물과 비교할 때, 미생물 핵산의 변형이 단백질 발현 레벨을 감소시키는 것이 가능한 경우, 이것은 효과적인 백신을 여전히 제공할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이는 본 발명의 몇몇 구체예에서 중요한, 적합한 단백질 발현과 함께 증식의 약화의 조합이다. 백신의 효능이 통상적으로 미생물에 의하여 전달될 수 있는 항원의 투여량과 관련되고, 그리고 어느 정도는 미생물에 의한 활성 유전자 발현의 어느 정도의 레벨이 필요하다. 미생물 유전자 발현이 여전히 충분히 유지될 경우, 미생물 복제의 약화는 몇몇 log가 될 수 있다. 약독 미생물의 동일한 투여는 변형되지 않은 미생물의 투여량과 비교해본다면, 약독 미생물 집단 중에서 결과의 항원 발현(상기 논의된 방법에 의하여 평가됨)은, 변형되지 않은 미생물 집단 중에서의 항원의 발현의 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75% 또는 적어도 약 90%이다. 복제에서 몇몇 log 약화가 존재하기 때문에, 변형된 미생물의 투여량은 몇몇 log까지 안전하게 증가할 수 있으므로, 백신접종에 변형되지 않은 미생물과 비교하여, 약독 미생물에 의하여 제시되는 항원의 대등하거나 또는 더 많은 양을 유발한다.

몇몇 구체예에서, 단백질을 코딩하는 이종 핵산 서열은 코돈-최적화될 수 있어서 단백질을 발현시키는 박테리아 숙주의 코돈 선호도를 매치시킨다. 게다가, 발현된 단백질에 융합된 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 또한 코돈-최적화될 수 있으며, 박테리아 숙주의 코돈 선호도를 매치시킨다. 바람직한 구체예에서, 박테리아 숙주는 리스테리아(Listeria)이고, 그리고 신호펩티드를 코딩하는 서열 및 이종 단백질 코딩 서열 모두, 또는 둘 중 하나는 코돈-최적화될 수 있다. 항원의 코돈 최적화 및 리스테리아(Listeria) 중의 신호서열에 대한 더 나아간 정보에 대하여, 본원에 참고문헌으로 수록된, 미국 출원 Serial No_60/532,598을 참조하시오.

미생물 핵산 변형

미생물 집단의 핵산은 다양한 방법에 의하여 변형될 수 있다. 미생물의 핵산은 물리적 수단, 예를 들어 자외선 또는 전리 방사선의 조사에 의하여 변형될 수 있다. 엑스선 또는 감마선 같은 전리 방사선은 핵산 중에서 단일-가닥 또는 이중-가닥 손상을 야기시는 데 사용될 수 있다. 자외선은 핵산 중에서 피리미딘 이합체를 야기시키는 데 사용될 수 있다. 방사선의 적합한 방사선량은 상기 상술한 바와 같이 복제 및 단백질 표현에 대한 방사선의 영향을 평가함으로써 결정된다.

미생물의 핵산은 또한 화학적 수단에 의하여, 예를 들어 핵산 표적화된 화합물과 반응하여, 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 미생물은 미생물의 증식이 약화되도록 핵산을 변형시킬 수 있는 핵산 표적화 화합물로 처리되며, 그 곳에서 미생물 집단이 면역 반응을 유발시키기에 충분한 정도로 여전히 소망의 단백질 항원을 발현시킬 수 있다. 핵산 표적화 화합물은 핵산을 변형시키는 특정한 메카니즘에 제한되지 않는다. 이러한 화합물은 핵산과 직접적으로 반응함으로써(즉, 화합물의 몇몇 부분 또는 모두가 핵산과 공유 결합한다), 또는 핵산의 변형을 간접적으로 야기시킴으로써 핵산을 변형시킨다(예. 단관체 산소 또는 산소 라디칼의 생성을 통한 산소 손상을 야기시킴으로써, 손산을 야기시키는 화합물 라디칼의 생성에 의하여, 또는 핵산의 환원 또는 산화의 다른 메카니즘에 의하여). 에네디인은 DNA 이중 가닥의 분할을 유도하는 라디칼 종을 형성하는 화합물의 부류의 하나의 예이다[Nicolaou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5881-5888 (1993)]. 핵산과 직접적으로 반응하는 화합물은 예를 들어 화합물의 방사선에 대하여, 화합물의 활성화에 반응할 수 있다. 핵산의 변형을 야기시키도록 간접적으로 반응하는 화합물은 유사한 활성화를 요할 수 있으며, 화합물의 활성화 종을 생성하거나, 또는 몇몇 다른 활성 종을 생성한다. 핵산 표적화 화합물에 대한 수단이 제한되지 않는 경우, 핵산과 그 후에 반응하여 반응 산소 종(예. 단관체 산소)과 같은 반응 종을 생성하거나 또는 핵산과 직접적으로 반응하는, 광활성 화합물의 사용을 포함한다.

핵산 표적화 화합물은 우선적으로 생물학적 샘플의 다른 성분을 현저히 변형시키지 않으면서 핵산을 변형시킨다. 이러한 화합물은 세포막, 단백질 및 지질을 변화시키거나 또는 손상시키지 않고 핵산의 적합한 변형을 제공한다. 성분의 생물학적 기능이 충분히 유지된다면, 세포막, 단백질 및 지질과 같은 이러한 세포 성분은 현저히 변화되지 않는다. 핵산 표적화 화합물로 미생물을 처리하는 경우, 핵산 변형은 미생물의 복제가 약화되며, 미생물의 세포막, 단백질 및 지질은 본질적으로 영향을 받지 않아서 미생물 유전자 발현이 활성화되고(예. 이에 요구되는 효소는 현저히 영향을 받지 않는다), 미생물의 표면은 화합물로 처리되지 않은 미생물과 본질적으로 동일한 항원성을 유지한다. 결과적으로, 이러한 화합물은, 충분한 항원성 또는 면역원성이 백신으로서 유용하도록 유지되면서, 미생물의 증식이 충분히 약화되기 때문에, 불활성 미생물이 백신으로서 사용되도록 준비되는 데 유용하다. 화합물은 특이적으로 핵산을 변화시키기 때문에, 변형은 소망의 레벨로 제어될 수 있어서 단백질 발현의 충분한 레벨을 유지하면서 복제가 약화된다. 변형은 화합물의 농도, 반응 매체, 경미한 투여량 또는 pH와 같은 제어 화합물 활성 요소, 또는 산소 농도의 제어제(예를 들어, 가스발형에 의한 물리적인, 또는 산소 제거제의 사용에 의한 화학적인)에 의한 산소 손상을 야기시키는 제어 화합물과 같은, 반응의 파라미터를 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 핵산 표적화 화합물은 우선적으로 핵산과 결합하는 경향이 있는, 즉 핵산에 대하여 측정가능 친화성을 갖는, 임의의 화합물이다. 이러한 화합물은 생물학적 샘플의 다수의 다른 성분에 대한 것보다, 특히 단백질, 효소, 지질 및 막과 같은 성분에 대한 것보다, 핵산에 대한 친화성이 더 크다. 핵산 표적화는 유전자 전사 및 단백질 유전암호해독에 대한 기구와 같은 생물학적 샘플의 다른 성분에 현저히 영향을 미치지 않고 핵산의 변형에 대하여 특이성을 제공한다.

화합물은 여러가지 모드로 핵산에 표적화될 수 있다. 임의의 다음의 모드 또는 그것의 조합에 의하여 결합하는 화합물은 핵산 표적화된 화합물로 간주된다. 삽입, 마이너 그루브 결합, 메이저 그루브 결합, 정전기 결합(예. 인산염 골격 결합), 및 서열-특이적 결합(메이저 또는 마이너 그루브 중의 서열 인식을 통하여)은 모두 핵산에 결합된 비공유 모드이다. 이러한 결합의 모드의 하나 또는 그 이상을 포함하는 화합물은 핵산에 대하여 높은 친화성을 갖을 것이다. 발명이 다음의 화합물에 제한되지 않으나, 핵산에 결합된 이러한 모드를 갖는 화합물의 몇몇 예는 다음과 같다: 인터칼레이터는 아크리딘, 아크리돈, 프로플라빈, 아크리플라빈, 악티노마이신, 안쓰라싸이클리논, 베타-로도마이신 A, 다우나마이신, 티아잔데논, 마리실 D, 안쓰라마이신, 미토마이신, 에키노마이신, 퀴노마이신, 트리오스틴, 디아크리딘, 엘립티신(이합체, 삼합체 및 유사체 포함), 노르피린 A, 플루오렌 및 플루오레논, 플루오레노디아민, 퀴나크린, 벤자크리딘, 페나진, 페난쓰라딘, 페노티아진, 클로르프로마진, 페녹사진, 벤조티아졸, 잔덴 및 티오-잔덴, 안쓰라퀴논, 안쓰라피라졸, 벤조티오피라노인돌, 3,4-벤즈피린, 벤조피린 디올 에폭시디, 1-피렌일옥시란, 벤잔쓰라센-5,6-옥시드, 벤조디피론, 벤조티아졸, 퀴놀론, 클로로퀸, 퀴닌, 페닐퀴놀린 카복사마이드, 푸로쿠마린(예. 소라렌, 이소소라렌, 및 그것의 황 유사체), 에티듐 염, 프로피듐, 코랄린, 엘립티신 양이온 및 유도체, 폴리시클릭 탄화수소 및 그것의 옥시란 유도체, 및 에키니마이신이다; 마이너 그루브 결합체는 디스타마이신, 미토마이신, 네트롭신, 다른 렉시트롭신, 훽스트 33258 및 다른 훽스트 염료, DAPI(4',6'-디아미딘-2-페닐린돌), 베레닐, 및 트리아릴메탄 염료로 대표된다; 메이저 그루브 결합체는 아플라톡신으로 대표된다; 정전기 결합체는 스퍼민, 스퍼미딘, 및 다른 폴리아민으로 대표된다; 그리고 서열-특이적 결합체는 핵산 또는 유사체에 의하여 대표되며, 이것은 삼중 헬릭스 형성, D-루프 형성, 및 단일 가닥 표적에 직접적인 염기쌍 형성으로, 이러한 서열-특이적 상호작용에 의하여 결합한다. 다른 서열-특이적 결합 화합물은 폴리 피롤 화합물, 폴리 피롤 이미다졸 화합물, 시클로프로필피롤로인돌 화합물 및 관련된 마이너 그루브 결합 화합물을 포함한다[Wemmer, Nature Structural Biology, 5(3):169-171 (1998), Wurtz et al., Chemistry & Biology 7(3):153-161 (2000), Anthoney et al., Am. J. Pharmacogenomics 1(1):67-81 (2001)].

본 화합물은 핵산을 표적화하는 이외에도 핵산과 반응하여 핵산에 공유결합할 수도 있다. 핵산 알킬화제(alkylator)는 핵산과 공유결합할 수 있는 화합물의 일 분류로서 머스타드(예: 모노 또는 비스 할로에틸아민기, 및 모노 할로에틸설파이드기), 머스타드 동등체(equivalent)(예: 에폭사이드, 알파-할로 케톤) 및 머스타드 중간체(예: 아지리딘, 아지리디늄 및 그 황 유사체(analog)), 메탄설포네이트 에스테르, 및 니트로소 우레아 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 핵산 알킬화제는 일반적으로 핵산 상에서 친핵성(nucleophilic)기와 반응한다. 이들 화합물이 핵산과 특이적으로 공유반응할 수 있는 것은 다름 아닌 이들 화합물의 핵산 알킬화 활성 및 핵산 표적화능의 조합(combination)에 의한 것이며, 이는 본 발명에 사용하기 위한 미생물 핵산의 바람직한 변형을 제공한다. 이들 화합물의 특이성은 미생물 내로 들어가지 않을 흡광제(quencher)의 사용으로 더욱 강화될 수 있다. 상기 흡광제는 핵산 표적 화합물(nucleic acid targeted compound)이 미생물 핵산과 반응하도록 하면서 미생물 표면과 흡광 반응할 것이다. 상기 흡광(quenching)에 대해서는 미국특허 제6,270,952호에 기재되어 있고, 그 개시는 참조문헌으로서 본 발명에 포함된다. 화합물 농도와 반응 조건을 조정함으로써 미생물 핵산의 변형을 조절할 수 있다. 적당한 농도와 반응 조건은 상술한 복제 및 단백질 발현에 대한 그들의 영향을 평가함으로써 결정된다. 본 발명에 사용된 화합물은 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 100 pM 내지 1 mM, 또한 약 1 nM 내지 10 μM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 1-200 nM 또는 약 1-100 nM의 농도에서 효과적이다. 핵산, 특히 미생물 핵산과 특이 반응하는, 핵산 표적, 핵산 반응성 화합물에 대한 내용이 미국특허 제6,143,490호 및 제6,093,725호에 기재되어 있고, 그 개시는 참조문헌으로서 본 발명에 포함된다.

핵산은 핵산 변형을 위해서 조사(radiation)에 의한 활성화를 요하는 핵산 표적 화합물을 이용하여 변형될 수 있다. 상기 화합물은 상술한 바와 같이 핵산을 표적으로 한다. 이들 화합물은 아크리딘, 아크리돈, 안트릴 유도체, 알록사진(예: 리보플라빈), 벤조트리아졸 유도체, 평면 방향족 디아조 유도체, 평면 방향족 시아노 유도체, 톨루이딘, 플라빈, 페노티아진(예: 메틸렌 블루), 퓨로쿠마린, 안젤리신, 소랄렌(psoralen), 소랄렌 황 유사체, 퀴놀론, 퀴놀린, 퀴녹살린, 나프티리딘, 플루오로퀴놀론, 안트라퀴논, 안트라센 등을 포함하여 이에 제한되지 않는다. 이들 중 다수의 화합물은 DNA 광분해제(photocleavage agent)로 이용된다 [Da Ros 등, Current Pharmaceutical Design 7:1781(2001)]. 본 발명은 핵산 표적 화합물의 활성화 방법에만 제한되지 않는 한편, 일반적으로 특정 파장의 빛으로 이들 화합물을 활성화시킬 수 있다. 화합물의 본질에 따라 빛의 유효 파장은 달라지며 대략 200 내지 1200 nm의 범위에서 임의로 변동될 수 있다. 이들 중 몇몇 화합물의 활성화는 핵산에 직접 결합하지 않고, 예를 들어 핵산 인근에 활성 산소종(reactive oxygen species)을 발생시킴으로써 핵산을 변형시킬 수 있다. 이들 중 몇몇 화합물의 활성화는 핵산에 화합물을 직접 결합시킨다(즉 화합물이 공유결합한다). 이들 중 몇몇 화합물은 핵산과 반응하여 사슬간 교차연결(interstrand crosslink)을 형성할 수 있다. 소랄렌은 핵산을 교차연결시키는 화합물 분류에 속하는 예이다. 이들 화합물은 일반적으로 UVA 빛(320-400 nm)으로 활성화된다. 본 발명에 사용된 소랄렌 화합물은 미국특허 제6,133,460과 제5,593,823에 예시되어 있으며, 그 개시는 본원에 참조문헌으로 포함된다. 또한, 활성화에 의한 핵산의 변형능과 핵산 표적화의 조합이야말로 핵산과의 특이 반응성을 제공한다. 미생물 핵산의 변형은 화합물 농도, 반응 조건 및 빛 조사량(light dose)을 조정함으로써 조절 가능하다. 적당한 농도와 빛 조사량은 상술한 복제 및 단백질 발현에 대한 그들의 영향을 평가함으로써 결정된다. 화합물 농도와 빛 노출 정도 외에, 그 반응은 UVA 빛으로 샘플을 조사하는 조건에 영향을 받는다. 예를 들어, 완충 배지 내의 미생물 개체군에 조사하는데 필요한 총(overall) 농도는 성장용 배지(예: BHI, Triptase Soy Broth)에서 배양된 개체수에 따라 변할 것이다. 광반응은 소랄렌과 상호작용할 수 있는 성장용 배지 함량의 영향을 받아 필요한 소랄렌의 총 농도를 높일 수 있다. 또한, 미생물의 유효 용량(dosing)은 생물체의 성장기(growth phase) 및 성장기 동안 화합물의 존재 유무에 따라 달라질 수 있다. 일 구체예에서, 미생물 개체군은 소랄렌 UVA 처리 동안에는 성장용 배지를 포함한다. 일 구체예에서, 미생물 개체군에 소랄렌을 가하고, 소랄렌 및 성장용 배지의 존재 하에 그 개체군을 배양하여 미생물을 성장시키고, 미생물 성장기의 몇몇 지점에서 UVA 처리한다. 일 구체예에서, 상기 개체군은 적당량의 UVA 빛 조사 전 소랄렌 존재시, OD 값 0.5-1(1x10 내지 1x10⁹ CFU/mL)까지 성장한다. 소랄렌 화합물은 약 0.1-100 J/cm², 또한 약 0.1-20 J/cm², 또는 약 0.5-10 J/cm², 0.5-6 J/cm² 또는 약 2-6 J/cm²의 UVA 조사량과 함께, 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 100 pM 내지 1 mM, 또한 약 1 nM 내지 10 μM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 1-200 nM 또는 약 1-100 nM의 농도에서 효과적이다. 일 구체예에서, 미생물은 성장용 배지 존재 하에 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 1-5000 nM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 5-500 nM, 또는 약 10-400 nM의 소랄렌 농도로 처리된다. 일 구체예에서, 성장용 배지의 존재 하에서 처리된 미생물은 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 1-5000 nM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 5-500 nM, 또는 약 10-400 nM 농도의 소랄렌 존재 하에 0.5-1의 OD 값까지 성장한다. OD 값 0.5-1까지 성장시킨 다음에, 미생물 개체군에 약 0.1-100 J/cm², 또한 약 0.1-20 J/cm², 또는 약 0.5-10 J/cm², 0.5-6 J/cm² 또는 약 2-6 J/cm²의 조사량으로 UVA 빛을 조사한다.

이종(heterologous) 핵산 서열을 함유하는 미생물

미생물은 스스로 발현시킬 수 있는 이종 핵산 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. 이종 서열은 적어도 하나의 특이 단백질 항원을 코딩할 수 있다. 미생물은 당해 기술 분야의 종사자에게 공지된 방법 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2000)]에 의하여 변형될 수 있다. 미생물은 하나 이상의 항원을 코딩하는 하나 이상의 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. 특이 항원을 코딩하는 이종 핵산 서열은 정확한 핵산 서열에 제한되지 않으며, 개체 투여시 바람직한 면역 반응을 유도하는 항원 발현을 제공하는 서열이면 충분하다. 이종 서열은 특정 질환과 관련된 항원으로서 발현될 수 있다. 상기 항원을 발현시키는 미생물은 백신으로서 사용 가능하며, 이러한 백신은 예방적 치료 또는 요법적 치료에 이용될 수 있다. 상기 백신으로 치료가능한 질환으로는 감염성 질환, 자가면역 질환, 알레르기, 암, 및 기타 과증식성(hyperproliferative) 질환 등이 있다.

본 발명에 따른 미생물은 특이 종양 항원을 코딩하는 이종 핵산 서열을 함유하도록 변경될 수 있다. T 세포가 인지하는 다수의 종양 특이성 항원이 확인된 바 있다[Renkvist 외, Cancer Immunol Innumother 50:3-15(2001)]. 이들 종양 항원으로는 분화 항원(예: PSMA, 티로시나제, gp100), 조직-특이성 항원(예: PAP, PSA), 발육(developmental) 항원, 종양-관련 바이러스성 항원(예: HPV 16E7), 암-고환 항원(예: MAGE, BAGE, NY-ESO-1), 태아성 항원(예: CEA, 알파-페토단백질), 종양유발단백질(oncoprotein) 항원(예: Ras, p53), 과발현 단백질 항원(예: ErbB2(Her2/Neu), MUC1), 또는 변성(mutated) 단백질 항원 등이 있다. 이종 핵산 서열이 코딩할 수 있는 종양 항원은 707-AP, 아넥신(Annexin) II, AFP, ART-4, BAGE, β-카테닌/m, BCL-2, bcr-abl, ber-abl p190, bcr-abl p210, BRCA-1, BRCA-2, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, CEA, CT9, CT10, Cyp-B, Dek-cain, DAM-6(MAGE-B2), DAM-10(MAGE-B1), ELF2M, EphA2, ETV6-AML1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GnT-V, gplOO, HAGE, HER2/neu, HLA-A^*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, 세포고사(apoptosis) 억제제(예:서비빈), KIAA0205, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, MAGE-1, MAGE-2, MGGE-3, MGAE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D, MART-1, MART-1/Melan-A, MC1R, MDM-2, 메조텔린, 미오신/m, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 네오-폴리A 폴리머라제, NA88-A, NY-ESO-1, NY-ESO-1a(CAG-3), PAGE-4, PAP, 프로테이나제 3(PR3), P15, p190, Pm1/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP17, SPAS-1, TEL/AML1, TPI/m, 티로시나제, TARP, TRP-1(gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, WT-1, 그리고 NY-ESO-1 및 LAGE-1 유전자로부터 유도된 교대 번역된(alternatively translated) NY-ESO-ORF2와 CAMEL 단백질을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 미생물은 앞으로 동정될 항원을 포함하여 종양-특이성 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 종양 항원을 포함한다. 미생물은 하나 이상의 종양 항원을 코딩하는 하나 이상의 이종 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. 바람직한 항원은 메조텔린 [Argani 등, Clin Cancer Res. 7(12):3862-8(2001)], Sp17 [Lim 등, Blood. 97(5):1508-10(2001)], gp100 [Kawakami 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6458(1994)], PAGE-4 [Brinkmann 등, Cancer Res. 59(7):1445-8(1999)], TARP [Wolfgang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(17):9437-42(2000)], EphA2 [Tatsumi 등, Cancer Res. 63(15):4481-9(2003)], PR3 [Muller-Berat 등, Clin. Immunol. Immunopath. 70(1):51-9(1994)] 및 SPAS-1 [미국특허공개 제20020150588호]를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 변형(modified) 미생물에 의해 발현되는 이종성 항원은 CEA이다. CEA는 180-kDA의 막 세포간 부착 당단백질(membrane intercellular adhesion glycoprotein)로서 상당한 비율의 사람 종양, 예컨대 대장(colorectal)암, 위암, 및 췌장암의 90 %, 비소세포성(non-small cell) 폐암의 70 %, 그리고 유방암의 50 %에서 과발현된다(Hammarstrom, Semin. Cancer Biol., 9:67-81). CEA를 흉내내는(mimicking) 항-이디오타이프 단일클론 항체(anti-idiotype monoclnal antibody)(Foon 등, Clin. Cancer Res., 87:982-90(1995)), 또는 CEA를 발현시키는 재조합 백시니아 바이러스를 이용한 백신접종(Tsang 등, J. Natl. Cancer Inst., 87:982-90(1995)) 등의 다양한 면역요법이 연구되어 왔으나, 불행히도 그 성공은 제한적이었다. 그럼에도 불구, 연구자들은 백신접종 환자들에서 생성된 사람 T 세포주에 의해 인지되는 HLA^*0201로 제한된 에피토프(HLA^*0201-restricted epitope), 즉 CAP-1(CEA605-613)을 동정한 바 있다. 이 에피토프로 펄스된(pulsed) DC를 이용하여 환자들을 백신접종하였으나 임상 반응을 유도하지는 못하였다 (Morse 등, Clin. Cancer Res., 5:1331-8(1999)). 최근에는 CEA605-613 펩타이드 아고니스트(agonist)가 610번 위치의 아스파라긴 치환으로 헤테로클리틱(heteroclitic) 아스파테이트와 동일한 것으로 확인되었다. 이러한 아미노산 치환이 상기 펩타이드의 MHC 결합 친화력을 바꾸지는 못하였지만 변성 펩타이드 리간드(altered peptide ligand)(APL)로 인하여 생체외에서(in vitro) CEA-특이성 세포독성 T 림프구(CTL)의 생성은 향상되었다. CAP1-6D-특이성 CTL은 천연 CEA를 발현시키는 종양 세포를 인지하고 분해하는 능력을 유지하였다 (Zaremba 등, Cancer Res., 57:4570-7(1997); Salazar 등, Int. J. Cancer, 85:829-38(2000)). Fong 등은 이 APL과 함께 배양한 Flt3-리간드로 확장된(Flt3-ligand expanded) DC로 백신접종한 결장(colon)암 환자 내의 CEA-특이 면역의 유도를 설명하였다. 백신접종 후 12 명 중 2 명의 환자에게서 나타난 펩타이드-MHC 테트라머⁺ T 세포의 유도와 서로 관련이 있는 극적인 종양 퇴행(regression)은 고무적인 것이었다(Fong 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98:8809-14(2001)). 이와 합쳐서, 이는 CEA가 표적된(CEA-targeted) 면역요법이 대장암 치료용으로 상당히 유효할 것임을 시사한다.

또다른 구체예에서, 변형 미생물에 의해 발현된 이종 항원은 프로테이나제-3(proteinase-3)이거나 또는 프로테이나제-3에서 유도된 것이다. 예를 들어, 일 구체예에서, 상기 항원은 HLA-A2.1로 제한된 펩타이드 PR1(aa 169-177: VLQELNVTV (SEQ ID NO:50))을 포함한다. 프로테이나제-3 및/또는 상기 PR1 에피토프에 관한 정보는 하기 참조문헌을 통해 공개적으로 입수가능하다: 미국특허 제5,180,819호, Molldrem 등, Blood, 90:2529-2534(1997); Molldrem 등, Cancer Research, 59:2675-2681(1999); Molldrem 등, Nature Medicine, 6:1018-1023(2000); 및 Molldrem 등, Oncogene, 21:8668-8673(2002).

따라서, 몇몇 구체예에서, 변형 미생물은 메조텔린(mesothelin), SPAS-1, 프로테이나제-3, EphA2, SP-17, gp100, PAGE-4, TARP, Her-2/neu, WT-1, NY-ESO-1, PSMA, K-ras, 또는 CEA 등의 항원 또는 이들 중 하나의 단백질에서 유도된 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 변형 미생물은 메조텔린(mesothelin), SPAS-1, 프로테이나제-3, SP-17, gp100, PAGE-4, TARP, WT-1, NY-ESO-1 또는 CEA 등의 항원 또는 이들 중 하나의 단백질에서 유도된 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 변형 미생물은 사람 메조텔린, 또는 사람 메조텔린에서 유도된 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 변형 미생물은 사람 EphA2, 또는 사람 EphA2에서 유도된 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 미생물은 특이 감염성 질환 항원을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. 일 구체예에서, 항원은 사람이나 동물 병원체(pathogen)로부터 유도된다. 병원체는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 또는 원생동물일 수 있다. 예를 들어, 항원은 바이러스성이거나 곰팡이성이거나 또는 박테리아성 항원일 수 있다.

예를 들어, 항원은 사람 면역결핍 바이러스(예컨대 gp 120, gp 160, gp41, gag 항원 예컨대 p24gag와 p55gag, 그리고 pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu 및 HIV의 LTR 영역에서 유도된 단백질), 고양이(feline) 면역결핍 바이러스, 또는 사람이나 동물의 헤르페스(herpes) 바이러스로부터 유도될 수 있다. 일 구체예에서, 항원은 1형 및 2형 단순포진(herpes simplex) 바이러스(HSV)(예컨대 gD, gB, gH, 극초기(Immediate Early) 단백질 예컨대 ICP27), 거대세포바이러스(cytomegalovirus)(예컨대 gB와 gH), 사람 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 또는 수두(Varicella Zoster) 바이러스(예컨대 gpI, II 또는 III)에서 유도된다 (Chee 등(1990) Cytomegaloviruses(J.K. McDougall, ed., Springer Verlag, pp. 125-169); McGeoch 등(1988) J. Gen. Virol. 69:1531-1574; 미국특허 제5,171,568호; Baer 등(1984) Nature 310:207-211; 및 Davison 등(1986) J. Gen. Virol. 67:1759-1816 등 참조).

또다른 구체예에서, 항원은 간염 바이러스 예컨대 간염 B 바이러스(예컨대 간염 B 표면 항원), 간염 A 바이러스, 간염 C 바이러스, 델타 간염 바이러스, 간염 E 바이러스, 또는 간염 G 바이러스로부터 유도된다 (WO89/04669, W0/11089; 및 WO90/14436 등 참조). HCV 게놈은 E1과 E2를 포함한 몇몇 바이러스성 단백질을 코딩한다 (Houghton 등, Hepatology 14:381-388(1991) 등 참조).

바이러스성 항원으로서의 항원은 피코르나바이러스(Picornaviridae)과(예: 소아마비바이러스(poliovirus), 리노바이러스(rhinovirus) 등); 칼리시바이러스(Caliciviridae)과; 토가바이러스(Togaviridae)과(예: 풍진바이러스(rubella virus), 뎅기 바이러스(dengue virus) 등); 플라비바이러스(Flaviviridae)과; 코로나바이러스(Coronaviridae)과; 레오바이러스(Reoviridae)과(예: 로타바이러스(rotavirus) 등 ); 비르나바이러스(Birnaviridae)과; 랍도바이러스(Rhabodoviridae)과(예: 광견병 바이러스(rabies virus) 등); 오르쏘믹소바이러스(Orthomyxoviridae)과(예: 독감 바이러스(influenza virus) A형, B형 및 C형 등); 필로바이러스(Filoviridae)과; 파리믹소바이러스(Paramyxoviridae)과(예: 볼거리 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), 호흡계 발진 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus) 등); 분야바이러스(Bunyaviridae)과; 아레나바이러스(Arenaviridae)과; 레트로바이러스(Retroviridae)과(예: HTLV-I; HTLV-11; 분리주(isolate) HIVI11b, HIVSF2, HTVLAV, HIVLAI, HIVMN의 항원을 포함하며 이에 제한되지 않는 HIV-1(HTLV-111, LAV, ARV, hTLR 등으로 알려져 있음)); HIV-1CM235, HIV-1; 그밖에 HIV-2; 원숭이(simian) 면역결핍 바이러스(SIV); 파필로마바이러스(Papillomavirus), 진드기 매개 뇌염(tick-borne encephalitis) 바이러스; 기타 등등 중에서 선택된 임의의 하나의 바이러스로부터 임의적으로 유도될 수 있다. Virology, 3rd Edition(W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2,sup.nd Edition(B.N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991) 등 참조.

몇몇 대체예에서, 항원은 박테리아성 병원체, 예컨대 미코박테리움(Mycobacterium), 바실러스(Bacillus), 예르시니아(Yersinia), 살모넬라(Salmonella), 나이세리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia)(예컨대, OspA 또는 OspB 또는 이들의 유도체), 클라미디아(Chlamydia) 또는 보르데텔라(Bordetella)(예컨대, P.69, PT 및 FHA)로부터 유도되거나, 또는 플라스모듐(plasmodium)이나 톡소플라즈마(Toxoplasma) 등의 기생충(parasite)으로부터 유도된다. 일 구체예에서, 항원은 미코박테리움 투버쿨러시스(Mycobacterium tuberculosis)(예: ESAT-6, 85A, 85B, 72F), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)(예: PA), 또는 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)(예: F1, V)에서 유도된다. 또한, 본 발명의 사용에 알맞은 항원은 디프테리아, 백일해, 파상풍, 결핵, 박테리아성 또는 곰팡이성 폐렴, 중이염, 임질, 콜레라, 장티푸스, 뇌막염, 단핵세포증, 흑사병, 쉬겔라증 또는 살모넬라증, 레지오넬라병, 라임병, 나병, 말라리아, 구충, 회선사상충증, 주혈흡충증, 수면병, 리슈만편모충증, 편모충증, 아메바증, 사상충증, 보렐리아증, 및 선모충증을 포함하며 이에 제한되지 않는 질환들의 원인인 공지의 병인(causative agent)로부터 얻어지거나 또는 유도된다.

본 발명에 따른 미생물은 자가면역 질환-특이 항원을 코딩하는 이종 핵산 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. T 세포 매개성(mediated) 자가면역 질환에서는, 자기(self) 항원에 대한 T 세포 반응으로 인해 자가면역 질환이 생긴다. 본 발명에 따른 백신으로 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항원은 자가면역 질환의 원인인 특이 T 세포를 표적할 수 있는 형태이다. 예를 들어, 자가면역 질환을 일으키는 T 세포에 특이적인 면역 반응을 유도하는 본 발명에 따른 백신에 통합된 항원은, T 세포 수용체 일부, 즉 자가면역 질환을 일으키는 T 세포에 특이적인 이디오타이프(idiotype)일 수 있다. 이들 T 세포의 제거는 자가면역 질환을 경감시키는 치료 기전일 수 있다. 또다른 가능성은 항원을 통합하여 자가면역 질환에서 자기 항원에 대해 생성되는 항체를 표적하거나 또는 항체를 분비하는 특이 B 세포 클론을 표적하는 면역 반응을 일으킬 수도 있다는 것이다. 예를 들어, 이디오타이프 항원을 미생물에 통합시켜 B 세포 및/또는 자가면역 질환에서 자기 항원과 반응하는 항체에 대한 항-이디오타이프 면역 반응을 일으킬 수 있다. 본 발명에 따른 백신 미생물로 치료가능한 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론씨병, 루푸스, 중증근무력증, 백반증, 경피증, 건선, 심상성천포창, 섬유근육통, 장염 및 당뇨병 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 알레르기 반응의 치료에도 이와 유사하게 접근할 수 있는데, 그때는 백신 미생물에 통합된 항원이 T 세포, B 세포 또는 알레르기 반응 조절에 효과적인 항체를 표적한다. 몇몇 자가면역 질환, 예컨대건선의 경우에는 표적 가능한 항원의 발현은 물론 과증식성 세포 성장이 함께 일어난다. 상기 항원이 과증식성 세포에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다고 보인다.

본 발명에 따른 미생물은, 질환의 기능장애(malfunctioning) 세포를 표적하기보다는 오히려 질환과 관련 있는 고유한(unique) 단백질 구조를 표적하는 항원을 포함한다. 그 예로 위에서 논의한 바 있는 이디오타이프 항원을 이용한 항체, B 세포 또는 T 세포의 표적을 들 수 있다. 또다른 가능성은 특정 질환으로부터 비롯되는 고유한 단백질 구조를 표적하는 것이다. 그 예로는 항원을 통합하여 알츠하이머병, 크루츠펠트-야콥병(CJD) 및 광우병(소해면상뇌증)(BSE) 등의 질환에서 관찰되는 아밀로이드 플라크(amyloid plaques)를 형성하는 단백질에 대한 면역 반응을 일으키는 것을 들 수 있다. 이러한 접근으로는 단지 플라크 형성을 감소시킬 수 있을 뿐이며, CJD와 같은 질환의 경우에는 치료(curative) 백신을 제공할 수 있다. 이러한 질환의 원인은 감염성 형태의 프리톤 단백질이다. 백신은 감염성 형태의 프리온 단백질에 항원을 통합시킬 수 있고 그러므로 백신에 의한 면역 반응은 CJD를 일으키는 감염성 단백질을 제거, 감소 또는 조절할 수 있다.

돌연변이 함유 미생물

일 구체예에서, 본 발명은 그 미생물 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 가지며, 면역 반응을 유도하기에 충분한 정도의 바람직한 항원을 또한 발현시킬 수 있는 미생물 개체군을 가지며, 적어도 하나 이상의 유전자 돌연변이에 의해 한층더 약화된, 미생물을 포함하는 백신을 포함한다. 미생물의 돌연변이는 미생물의 여러가지 특징들에 영향을 미칠 수 있다. 몇몇 돌연변이의 경우는 특정 세포에 대한 미생물의 침입능에 영향을 끼친다. 예를 들어, 특정 세포내 박테리아(intracellular bacteria)는 그 박테리아에 존재하는 수용체에 따라 여러 수지상 세포형(cell type)에 침입할 수 있다. 돌연변이는 그 박테리아가 몇몇 세포형에 의해서만 흡수되고 나머지 세포 형태에 의해서는 흡수되지 않도록 특정 수용체의 발현을 변형시킬 수 있다. 그 예로서, 리스테리아(Listeria)는 일반적으로 식세포(phagocytic cell)에 의해서만 흡수되고 비-식세포(예: 간세포)를 적극적으로 침입한다. 리스테리아(Listeria) 돌연변이는 식세포에 의해 충분히 적극적으로 흡수되면서 비-식세포의 침입을 유의적으로 줄이거나 제거하는데 이용될 수 있다. 상기 돌연변이는 백신이 면역계에 박테리아성 항원을 제공하는 데 있어 중요한 식세포에 의해 우선 흡수됨으로써 더욱 우수한 면역 반응을 제공할 수 있다. 돌연변이는 특정 세포형에 대한 미생물의 침입능을 약화시키는 임의의 유전자일 수 있으며, 그 예로서 리스테리아(Listeria)의 인터날린 유전자(예: inlA, inlB)에 대한 돌연변이를 들 수 있다. 비슷한 유전자(살모넬라(Salmonella), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 및 예르시니아(Yersinia))의 침입 유전자)가 다른 박테리아에 존재할 수 있으며, 이들 유전자의 돌연변이는 본 발명에 포함된다. 돌연변이는 미생물의 다른 특징들, 예컨대 병독 인자 또는 성장 및 전파 허여 유전자에 영향을 주어 미생물의 병독성을 감소시킬 수도 있다. 예를 들어, 리스테리아(Listeria) actA 유전자의 돌연변이는 리스테리아(Listeria)의 다른 세포로의 전파능을 억제하는 숙주 세포 액틴의 중합화에 결함을 가져온다. 리스테리아(Listeria) hly 유전자(리스테리오라이신(LLO) 단백질)의 돌연변이는 감염 세포의 포식용해소체(phagolysosome)에 대한 리스테리아(Listeria)의 이탈능에 강한 영향을 준다. 리스테리아(Listeria) plcA 또는 plcB 유전자의 돌연변이는 리스테리아(Listeria)의 세포간 전파능에 강한 영향을 준다. 예르시니아(Yersinia) yop 유전자의 돌연변이는 대식세포(macrophage)에 의한 포식작용(phagocytosis) 방지능에 영향을 미친다. 또다른 구체예에서, 유전자 돌연변이는 특정 항원, 예컨대 미생물 그 자체에 대한 정상적인 면역 반응을 가져오는 항원의 발현을 약화시킨다. 비-변성 미생물에 비하여 운반(delivery) 미생물에 대한 면역 반응은 감소시키면서도 이종 항원에 대한 강한 면역 반응은 자극하기 위하여 미생물을 이종 항원을 포함하는 백신으로서 이용하는 경우라면 상기 돌연변이가 유용할 수 있다. 일 구체예에서, 미생물은 하나 이상의 돌연변이로 인하여 약화된다. 일 구체예에서, 하나의 돌연변이가 리스테리아(Listeria)의 인터날린 유전자 또는 다른 박테리아의 비슷한 유전자에 존재한다. 일 구체예에서, 하나의 돌연변이가 actA 유전자에 존재한다. 일 구체예에서, 미생물은 actA 유전자와 하나 이상의 인터날린 유전자에 돌연변이가 있는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 actA 유전자와 inlB 유전자의 돌연변이를 포함하며, 바람직한 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 (본원에서 각각 △actA△uvrAB 또는 actA ^- /uvrAB ^- 로 나타나는) actA/inlB 결실 돌연변이를 포함한다. 본원에 기재된 서열을 포함하여 다수의 리스테리아 유전자 서열이 Genbank 기탁번호 NC_003210로 밝혀져 있다.

미생물은 변형된 핵산에 대한 미생물의 수복능을 유의적으로 감소시키는 돌연변이를 함유할 수 있다. 상기 돌연변이는 미생물의 DNA 수복 메카니즘에 연관이 있는 임의의 여러 유전자에서 일어날 수 있다 [Aravind 등, Nucleic Acids Research 27(5):1223-1242(1999)]. 핵산의 손상에 대한 수복능에 결함이 있는 미생물은 본 발명에 따른 미생물을 이용함으로써 그 안정성과 효능의 수준이 증가한다. 적당한 수복 결손 돌연변이체를 이용하면 미생물은 핵산 변형에 아주 민감해진다. 미생물 핵산은 다소 낮은 정도로 변형될 수 있으나 여전히 바람직한 양의 증식 약화는 가능하도록 한다. 이로써 미생물 핵산이 바람직한 단백질을 만들기에 충분하게 발현되도록 작동할 수 있는 더욱 커다란 적정 농도(window of efficacy)가 제공된다. 이로써 새로이(de novo) 항원의 발현이 필요한 경우에는 효과적인 면역 반응을 유도하는 백신을 제공하게 된다. 또한 이로써 달성된 증식 약화의 수준이 변형 핵산의 수복으로 절충될 수 없기에 추가된 수준의 안전성이 제공된다. 또다른 구체예에서, 유전자 돌연변이는 핵산 표적 화합물 처리를 통해, 예를 들어, 화합물에 대한 미생물의 투과성을 변형시키거나 또는 미생물 핵산에 대한 화합물의 접근능 및 결합능을 변형시킴으로써, 미생물의 감수성(susceptibility)을 변형시킨다. 또한 상기 돌연변이는 미생물 유전자 발현에는 실질적인 영향이 없이 증식 약화 과정의 효능에 강력한 영향을 준다.

수복 결실 돌연변이의 사용상 이점을 설명하기 위해서 미생물의 증식 약화 기전을 생각해볼 수 있다. 미생물 핵산은 사슬 분해(strand breakage)나 피리미딘 다이머에 의하거나, 또는 화학적 변형 예컨대 모노어덕트나 교차연결형태에 의하여 변형된다. 이들 변형 수복 기전이 완전하다면 충분한 증식 약화를 위해서는 어느 정도의 변형이 필요할 수 있다. 핵산이 많이 변형되면 될수록, 단백질의 발현은 더욱 감소한다. 증식 약화에 필요한 변형 수준이 단백질 발현을 중단하는데 필요한 수준보다 훨씬 낮다 해도, 단백질 발현은 여전히 어느 정도, 도저히 받아들일 수 없는 수준으로 감소될 수 있다. 수복 결실 돌연변이를 이용하면 증식을 약화시키는데 필요한 수준을 유의적으로 감소시킬 수 있고 그래서 더욱 낮은 변형 수준으로 인해 적당하게 증식이 약화된다. 핵산 변형이 훨씬 낮으므로, 단백질 발현은 적게 영향을 받게 되고 따라서 높은 수준의 목적 단백질 발현을 제공한다. 상기 수복 결실 돌연변이는 예컨대 충분히 높은 수준으로 단백질, 특히 면역 반응에서 표적되는 항원을 발현시키면서 근소한 핵산 변형에 의해 백신의 안전성이 증가되는 미생물 자체에 대한 백신 등의 백신 제조에 유용하다. 일 구체예에서 수복 결실 돌연변이는 피리미딘 다이머를 수복하는 PhrB(포토리아제)의 제조능을 상실한다. 예를 들어, 돌연변이는 미생물의 종과 속에 따라 phrB 유전자, 또는 그 기능적 동등 유전자에 있을 수 있다. 상기 돌연변이를 미생물에 대한 자외선 조사(예: UVB, UVC)와 함께 사용하여 미생물 핵산에 피리미딘 다이머를 형성할 수 있다. 일 구체예에서, 수복 결실 돌연변이는 사슬간 교차연결을 수복할 수 없다. 돌연변이는 미생물의 종과 속에 따라 uvr 유전자, 즉 uvrA, uvrB, uvrC, 및 uvrD 유전자는 물론 recA 유전자, 또는 그 기능적 동등 유전자의 돌연변이를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 돌연변이는 하나 이상의 이들 유전자에 존재할 수 있다. 돌연변이로 인해 이에 상응하는 효소인 UvrA(ATP아제), UvrB(헬리카제), UvrC(뉴클레아제), UvrD(헬리카제 II) 및 RecA(재조합효소)이 활성에 약화된다. 이들 돌연변이를 소랄렌 등의 교차연결 화합물과 함께 사용할 수 있다. 미생물 핵산은 몇몇 위치에서 교차연결되고 이들 교차연결이 수복될 수 없으므로, 핵산의 본래 사슬을 분리할 수 없음에 따라 미생물은 복제가 할 수 없게 된다. 수복 불가능하기 때문에, 교차연결을 거의 필요로 하지 않고 그 미생물 핵산은 전사에 접근가능하면 되고 단백질 발현은 유의적으로 변형되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 사슬간 교차연결 수복이 불가능한 수복 결실 미생물 돌연변이 개체군이 알맞게 교차연결되므로, 그래서 개체군 내의 모든 미생물은 필히 적어도 하나 이상의 교차연결을 함유하게 되고, 그래서 개체군의 미생물 유전자 발현은 충분히 활발하면서 복제는 완전히 약화되어 버리는 것이다. 일 구체예에서, recA 유전자의 돌연변이는 조건 돌연변이다. 그러한 돌연변이에서, recA 유전자의 돌연변이는 예컨대 미생물 개체군에 알맞은 pH나 온도 등과 같이 단지 특정 조건(즉 비허용(non-permissive) 조건) 하에서만 recA의 활성이 약화시킨다. 조건 recA 돌연변이를 포함하는 미생물은 충분한 수준으로 성장하도록 허용 조건 하에서 배양한 다음, 핵산 변형 처리를 위해 비허용 조건으로 옮긴 후, 비허용 조건 하에서 보관하므로 그 결과 핵산 손상이 적절하게 수복되지 않는 것이다. 그 예로서, recA 온도 민감성 돌연변이는 성장이 잘되는 30 ℃에서 성장시키고, 소랄렌 교차연결과 같은 처리에 아주 민감한 recA에 비허용 조건인 42 ℃에서 핵산 변형 처리된다. 처리 미생물은 비허용 조건 하에서 보관되는 한편, 백신접종시에는 그 조건이 recA의 발현을 허용하여 약간의 수복을 일으키고 안정성을 제공할 수 있다. recA가 lac 억제자의 조절 하에 있고, 불활성 및/또는 면역 단계에 앞서 성장이 바람직한 경우 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의해 균주 성장이 유도될 수 있는 그러한 미생물의 작제가 가능하다. 그 후 recA 발현 가능성은 균주에서 IPTG의 추가 억제(withhold) 및/또는 균주 주위에서 IPTG의 제거에 의해 불활성 및/또는 면역 단계에서 제거될 수 있다.

하나의 구체예에서, 미생물은 수복 메카니즘과 무관한 적어도 하나의 돌연변이와 결합하여 변형된 핵산에 대한 미생물의 수복능을 유의적으로 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 수복 메카니즘과 무관한 돌연변이는 미생물의 다양한 특징, 예컨대 특정 세포에 대한 미생물의 침입능, 병독 인자(virulence factor)의 돌연변이나 성장(growth) 및 전파(spreading) 허여 유전자의 돌연변이, 또는 특정 항원의 발현을 약화시키는 돌연변이에 영향을 끼친다. 상기 돌연변이는 앞서 논의된 바 있으며, 인터날린(internalin) 유전자(예: inlB), 리스테리아(Listeria)의 actA 유전자, hly 유전자, plcA 유전자, 또는 plcB 유전자, 침입(invasion) 유전자(예: 살모넬라(Salmonella), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 및 예르시니아(Yersinia)) 또는 예르시니아(Yersinia)의 yop 유전자를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 하나의 구체예에서, 미생물은 actA 유전자에 돌연변이를 가진 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 포함한다. 하나의 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 actA 돌연변이와 uvrAB 돌연변이, 바람직하게는 actA/uvrAB 결실 돌연변이(△actA△uvrAB 또는 actA ^- /uvrAB ^- 로 나타낼 수 있다)를 포함한다. 하나의 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 actA 돌연변이, inlB 돌연변이 및 uvrAB 돌연변이, 바람직하게는 actA/inlB/uvrAB 결실 돌연변이를 포함한다. 몇몇 다른 구체예에서, 미생물은 결실과 같은 uvrAB 돌연변이를 갖는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)를 포함한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 핵산 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는, 분리된 리스테리아(Listeria) 변이 균주, 예컨대 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 변이 균주를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 변이 균주는 적어도 하나의 DNA 수복 효소(예컨대 UvrA 및/또는 UvrB)에 결함이 있다. 몇몇 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 변이 균주는 uvrA 유전자 및/또는 uvrB 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 수탁번호 PTA-5563으로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)에 기탁된 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) △actA△uvrAB 균주이다. 다른 구체예에서, 균주는 수탁번호 PTA-5563으로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)에 기탁된 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) △actA△uvrAB 균주의 변이체로서 UvrA, UvrB 및 ActA에 결함이 있다.

몇몇 구체예에서, 본 발명은 (야생형에 비하여) 적어도 하나의 DNA 수복효소에 결함이 있는 독립생활(free-living) 미생물을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 적어도 하나의 DNA 수복효소에 결함이 있는 미생물은 야생형에 비하여 DNA 수복이 약하다. 몇몇 구체예에서, 미생물의 DNA 수복량(capacity)은 야생형에 비하여 적어도 약 10 %, 적어도 약 25 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 75 %, 또는 적어도 약 90 %까지 떨어진다. 미생물의 DNA 수복능(ability)을 평가하는 방법은 당해 기술 분야의 종사자들에게 잘 알려져 있다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 PhrB, UvrA, UvrB, UvrC, UvrD 및 RecA 중 한가지 이상의 효소에 결함이 있다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 UvrA, UvrB, 또는 양 효소 모두에 결함이 있다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 RecA 또는 RecA의 기능적 동등체(functional equivalent)에 결함이 있다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자의 기능적 동등체에 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 uvrA와 uvrB 모두 또는 uvrA와 uvrB 모두의 기능적 동등체에 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 recA에 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 박테리아이다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 미생물은 미코박테리움 투버쿨러시스(Mycobacterium tuberculosis), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 또는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)이다.

또한 본 발명은 핵산 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는, 분리된 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 변이 균주를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 적어도 하나의 DNA 수복 효소(예컨대 UvrA 및/또는 UvrB)에 결함이 있다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 uvrA 유전자 및/또는 uvrB 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, uvrA 유전자, uvrB 유전자, 또는 양 유전자 모두가 결실된다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 RecA가 약해진다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 recA 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 변이 미생물은 수탁번호 PTA-5563로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)에 기탁된 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) actA ^- /uvrAB ^- 균주이거나 또는 UvrA, UvrB 및 ActA에 결함이 있는 기탁 균주의 변이체이다.

또한 본 발명은 핵산 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는, 분리된 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 변이 균주를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 적어도 하나의 DNA 수복 효소(예컨대 UvrA 및/또는 UvrB)에 결함이 있다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 uvrA 유전자 및/또는 uvrB 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, uvrA 유전자(서열번호 18), uvrB 유전자(서열번호 19), 또는 양 유전자 모두가 결실된다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 RecA가 약해진다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 recA 유전자의 유전자 돌연변이를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 recA 단백질 발현을 온도 민감성으로 만드는 recA 유전자의 돌연변이를 포함한다. 몇몇 대체예에서, 비. 안트라시스(B. anthracis) 변이 균주는 (IPTG로 유도가능한) lac 억제자의 조절 하에, 성장 기간 동안에는 recA를 발현시키지만, (예컨대 S-59/UVA를 사용한) 불활성화 및/또는 면역후(post-immunization) 기간 동안에는 발현되지 않도록 작제된다. 몇몇 구체예에서, 변이 균주는 균주의 독성을 감소시키는 lef 유전자, cya 유전자, 또는 양 유전자 모두에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

본 발명에 따른, 임의의 미생물에서와 같이, 소랄렌을 이용한 수복 결손(예: uvr 결손) 박테리아 DNA의 변형은 화합물 농도, 반응 조건 및 빛 조사량을 조정함으로써 조절될 수 있다. 적당한 농도, 반응 조건 및 빛 조사량은 상술한 복제와 단백질 발현에 대한 그들의 영향을 평가함으로써 결정된다. 수복 결손 돌연변이의 이용으로 적당한 단백질 발현을 유지하면서 부가적인 수준으로 증식을 조절할 수 있게 되고 그래서 농도, 반응 조건 및 빛 조사량의 파라미터를 더욱 광범위한 조건 범위에 걸쳐 조정하여 알맞은 미생물 개체군을 제공할 수 있게 되는 것이다. 예를 들어, 단백질 발현에 대한 유의적인 영향 없이 증식을 완전히 억제시킬 수 있는 보다 넓은 범위에 걸친 핵산 변형 밀도(density)가 있을 수 있다. 수복 결손 균주를 완전히 억제하는데 최소한으로 필요한 변형 수준은 비-수복 결실 균주의 경우보다 훨씬 낮다(실시예 3, 7, 11, 및 21 참조). 그 결과, 그 변형 수준은 증식을 중단하는데 필요한 최소 수준보다는 높을 수 있으나 여전히 단백질 발현에 불리한 수준보다는 낮다. 따라서, 본 발명은 비-수복 결실 균주에 효과적이면서, uvr 결실 균주로 인하여 백신으로서 효과가 있는 바람직한 미생물 개체군을 제조하는 데 있어 더욱 뛰어난 유연성을 부여한다. 소랄렌 화합물은 약 0.1-100 J/cm², 또한 약 0.1-20 J/cm², 또는 약 0.5-10 J/cm², 0.5-6 J/cm² 또는 약 2-6 J/cm²의 UVA 조사량과 함께, 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 100 pM 내지 1 mM, 또한 약 1 nM 내지 10 μM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 1-200 nM 또는 약 1-100 nM의 농도에서 효과적이다. 일 구체예에서, 미생물은 성장용 배지 존재 하에 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 1-5000 nM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 5-500 nM, 또는 약 10-400 nM의 소랄렌 농도로 처리된다. 일 구체예에서, 성장용 배지의 존재 하에서 처리된 미생물은 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 1-5000 nM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 5-500 nM, 또는 약 10-400 nM 농도의 소랄렌 존재 하에 0.5-1의 OD 값까지 성장한다. OD 값 0.5-1까지 성장시킨 다음에, 미생물 개체군에 약 0.1-100 J/cm², 또한 약 0.1-20 J/cm², 또는 약 0.5-10 J/cm², 0.5-6 J/cm² 또는 약 2-6 J/cm²의 조사량으로 UVA 빛을 조사한다.

임의의 미생물, 특히 uvr 결실 변이 박테리아에서 소랄렌 교차연결(crosslink)을 형성하기 위해서, 소랄렌 및 UVA 빛을 초기에 투여하여 어덕트(adduct)를 형성한 다음 2 회째는 UVA 빛을 단독 투여하여 몇몇 또는 대부분의 모노어덕트(monoadduct)를 교차연결 형태로 변환시킬 수 있다. 소랄렌 광화학은 적당한 에너지의 광자(photon)를 흡수하면 먼저 모노어덕트를 형성하는 것이다. 부가 광자의 흡수로 인하여 DNA 이중나선(double helix) 구조 내에 퓨란측(furan side) 모노어덕트가 적절하게 위치하는 경우에는 모노어덕트가 교차연결 형태로 변환된다 [Tessman 등, Biochemistry 24:1669-1676(1985)]. 샘플을 바람직한 농도의 소랄렌과 보다 적은 UVA 조사량과 함께 투여한 다음 미반응 소랄렌을 박테리아의 한외여과(ultrafiltration), 투석 또는 세척 등의 방법으로 제거할 수 있다. 소랄렌 어덕트(모노어덕트와 교차연결 형태)를 함유하는 박테리아에 UVA 빛을 추가 투여하여 박테리아에 대한 부가적인 어덕트를 유의적으로 생성시키지 않고 몇몇 또는 대부분의 모노어덕트를 교차결합 형태로 변환시킬 수 있다. 이로써 초기 빛 투여와 함께 소수의 소랄렌 어덕트를 조절해가면서 첨가한 다음, 두번째 빛 투여로 다수의 임의 모노어덕트를 교차연결 형태로 전환시킬 수 있게 된다. 이로써 미생물 게놈은 형성된 대다수의 어덕트가 교차연결 형태가 되는 충분히 낮은 수준에서 변형된다. 이는 uvr 결실 돌연변이로 복제를 차단(blocking)하는데 특히 효과적이다. 그러한 구체예에서, 소랄렌 화합물은 약 0.1-10 J/cm², 또한 약 0.1-2 J/cm², 또는 약 0.5-2 J/cm²의 UVA 조사량과 함께, 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 100 pM 내지 1 mM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 1-200 nM 또는 약 1-100 nM의 농도에서 효과적이다. 박테리아의 한외여과, 투석, 또는 세척에 의해 대부분의 미반응 소랄렌을 제거한 후, 0.1-100 J/cm², 또한 약 0.1-20 J/cm², 또는 약 0.5-10 J/cm² 또는 약 2-6 J/cm²의 UVA 빛을 박테리아에 조사할 수 있다.

백신 조성물과 생체내(in vivo) 효능

본 발명에 따른 백신 조성물은 상기 논의한 바와 같이 그 미생물의 유전자 발현에 실질적인 영향이 없으며 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 갖는 미생물에 의한 감염으로 활성화/성숙화 및/또는 항원-로딩화된 항원제공세포 및/또는 그 미생물 핵산이 변형된 미생물을 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 본 발명에 따른 백신 조성물을 사용하여 개체 내 면역 반응을 자극시킬 수 있다. 제제물(formulation)은 여러가지 투여 경로로 개체에 투여될 수 있다. 백신 조성물의 투여 방법은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의하며 경구, 경비, 정맥내, 피내, 복강내, 근육내, 림프내, 및 피하 경로로의 투여를 포함한다. 백신 조성물은 당해 기술 분야에서 백신에 대한 면역 반응을 개선시킨다고 알려진 부가 성분, 예컨대 면역보강제(adjuvant)나 T 세포 공동자극(co-stimulatory) 분자를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 의약품을 포함한다. 백신 치료될 개체는 척추동물, 바람직하게는 가축, 스포츠 동물, 및 사람을 포함한 영장류를 포함하는 포유동물이다. 백신은 개체를 백신접종하여 그 개체가 특정 질환에 대한 면역을 가질 수 있도록 하는 예방적(prophylactic) 투여가 가능하다. 임의의 개체에 백신, 예컨대 암 백신을 투여하는 경우, 그 치료 개체는 암 성장 위험이 큰 개체들로 제한될 수 있다. 또한 백신은 특정 질환을 갖는 개체에 백신접종하여 질환이나 질환 관련 단백질에 대한 면역 반응을 개선시킬 수 있도록 치료적(therapeutic) 투여될 수 있다. 이 구체예에서, 백신은 질환과 관련있는 육체적 증상을 완화시킬 수 있다. 예를 들어, 암 백신에 의한 백신접종은 종양 성장의 중단, 바람직하게는 평균 종양 용적의 감소, 더욱 바람직하게는 임의 종양의 제거를 가져온다. 일 구체예에서, 평균 종양 용적은 적어도 약 5 %, 또한 약 10 %, 또한 약 25 %, 또한 약 50 %, 또한 약 75 %, 또한 약 90 % 또는 약 100 %까지 줄어든다. 유사하게, 백신접종은 종양 전이의 중단, 바람직하게는 종양 전이수의 감소를 가져온다. 암 백신은 개체의 중간 생존(median survival)을 연장시키는 부가적 효과가 있다. 사람에 있어서는 적어도 약 3 개월, 또한 적어도 약 6 개월, 또는 적어도 약 12 개월 정도까지 중간 생존 기간이 연장될 수 있다.

백신 제제물은 당해 기술 분야에 알려져 있으며 수많은 첨가제(additives), 예컨대 보존제(preservative), 안정제, 면역보강제, 항생제 및 기타 물질을 포함한다. 치메로살(thimerosal) 또는 2-페녹시 에탄올 등의 보존제의 첨가로 부주의한 오염에 의해 특히 복합 용도(multiple use)나 다회 투여(multiple dose)를 위한 백신 바이얼(vial)에서 생길 수 있는 박테리아나 곰팡이의 성장이 느려지거나 멈추게 된다. 락토스 또는 글루탐산나트륨(MSG) 등의 안정제의 첨가로 여러 가지 조건, 예컨대 온도 변화라든지 냉동건조(freeze-drying) 공정에 대해 백신 조성물이 안정하게 된다. 수산화알루미늄이나 알루미늄인산염 등의 면역보강제의 첨가로 백신의 면역반응 유발(trigger)능, 강화(enhance)능, 또는 지속(prolong)능이 증가한다. 사이토카인, 케모카인, 및 CpG 같은 박테리아성 핵산 서열 등의 부가 물질 또한 잠재 백신 면역보강제이다. 네오마이신과 스트렙토마이신 등의 항생제의 첨가로 유해한 병균(germ) 성장을 잠재적으로 방지된다. 또한 백신은 증류수나 식염수(saline) 등의 부유액(suspending fluid)을 포함할 수 있다. 또한 백신은 제조공정에 생기는 소량의 잔류 물질, 예컨대 세포나 박테리아성 단백질, (달걀에서 생산되는 백신에서 생기는) 달걀 단백질, DNA나 RNA, 또는 변성독소화(toxoiding) 공정에서 생기는 포름알데히드 등을 함유한다.

백신의 효능은 개체, 예를 들어 마우스에서 구할 수 있다. 마우스 모델은 사람에서의 효능 모델로 인식되며 본 발명의 백신을 평가하고 정의하는데 유용하다. 마우스 모델을 이용하여 임의 개체 내에서 백신의 잠재 효과를 증명할 수 있다. 백신은 특정 질환에 대한 예방 또는 치료 효과 제공능으로 평가받을 수 있다. 예를 들어, 감염성 질환의 경우에는, 감염성 질환 관련 항체를 발현하는 마우스 개체군에 본 발명에 따른 적절한 백신을 바람직한 양으로 백신접종할 수 있다. 항원은 운반(delivery) 미생물 그 자체의 항원이거나 또는 이종 항원일 수 있다. 마우스를 백신 항원과 관련 있는 감염성 제제(agent)로 감염시킨 후에 감염에 대한 보호 정도를 평가할 수 있다. (백신접종되지 않거나 비히클만으로 백신접종되거나 또는 적합한 항원을 함유하지 않은 미생물로 백신접종된) 대조 개체군과 비교하여 보면 감염성 질환의 진행을 관찰할 수 있다.

암 백신의 경우에는, 바람직한 종양 항원을 함유한 본 발명의 미생물로 백신접종하기 전(치료 모델)이나 또는 백신접종한 후(예방 모델)에 바람직한 종양 항원을 발현하는 종양 세포주를 마우스 개체군에 주입하는, 종양 세포 모델을 이용할 수 있다. 종양 항원을 함유한 미생물에 의한 백신접종은, 백신접종되지 않거나 비히클로 백신접종되거나 또는 무관한 항원을 발현하는 미생물로 백신접종된 대조 개체군과 비교될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 백신의 상대적 효능은, 변형되지 않은 미생물 핵산을 갖는 미생물 개체군과 비교될 수 있다. 상기 모델에서 백신의 효과는 종양 주입 후 시간의 함수로서의 종양 용적 또는 종양 주입 후 시간 함수로서의 생존 개체수로 평가될 수 있다(실시예 4). 일 구체예에서, 핵산 변형 미생물로 백신접종된 마우스 내의 종양 용적은 백신접종되지 않거나 또는 비히클 또는 무관한 항원을 발현하는 미생물로 백신접종된 마우스 내의 종양 용적보다 적어도 약 5 %, 약 10 %, 약 25 %, 약 50 %, 약 75 %, 약 90 %, 또는 약 100 % 정도 작다. 또다른 구체예에서, 이러한 종양 용적의 차이는 마우스 내로 종양을 이식하고 적어도 약 10 일, 약 17 일, 또는 약 24 일 경과 후에 관찰된다. 일 구체예에서, 핵산 변형된 미생물로 백신접종한 마우스의 중간 생존 기간(median survival time)은 백신접종되지 않거나 또는 비히클 또는 무관한 항원을 발현하는 미생물로 백신접종된 마우스보다 적어도 약 2 일, 약 5 일, 약 7 일 또는 적어도 약 10 일 정도 길다. 본 발명에 따른 백신에 대한 효과적인 면역 반응 외에도, 변형 미생물은 그 안전성의 정도를 높여서 그 결과 상응하는 비변형 미생물보다 높은 용량의 미생물을 투여할 수 있도록 한다. 본 발명의 일 구체예에서는, 상응하는 비변형 미생물과 동일한 미생물 용량으로 핵산 변형 미생물에 의한 백신접종이 수행된다. 또다른 구체예에서, 핵산 변형 미생물의 백신접종은 상응하는 비변형 미생물의 백신접종량보다 적어도 약 2 배, 약 5 배, 약 10 배, 약 10² 배, 약 10³ 배 또는 적어도 약 10⁴ 배 이상의 수준으로 안전하게 투여되며, 이 때 핵산 변형 미생물에서는 상기에서 논의된 종양 용적과 중간 생존 시간이 나타난다.

이용 방법

본 발명은 본원에 기재된 변형 미생물, 항원제공세포(antigen-presenting jcell), 백신, 및 약학적 조성물의 다양한 이용 방법을 제공한다. 예를 들어, 면역 반응의 유도 및/또는 질환의 예방이나 치료를 위하여 본원에 기재된 변형 미생물, 항원제공세포, 백신, 및 약학적 조성물을 이용하는 방법이 제공된다. 백신과 기타 조성물을 제조하기 위하여 변형 미생물 및/또는 변이 균주를 이용하는 방법 또한 제공된다.

예를 들어, 일 측면에서, 본 발명은 그 미생물의 증식(proliferation)이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 가지며 항원을 발현하는 독립생활 미생물을 포함하는 유효량의 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 숙주 내에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 미생물을 포함하는 조성물은 백신이다. 몇몇 구체예에서, 미생물을 포함하는 조성물은 전문적인(professional) 항원제공세포이다. 항원은 상기한 바와 같이 미생물에 대한 이종 또는 자가(autologous) 항원일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 미생물 핵산은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적 화합물(nucleic acid targeted compound)과의 반응에 의하여 변형된다.

또한 본 발명은 그 핵산의 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하며 항원을 발현하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 변이 균주를 포함하는 유효량의 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 숙주 내에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 항원은 리스테리아성 또는 비-리스테리아성 항원일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 리스테리아(Listeria)의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형되었다(예: S-59/UVA 처리에 의해).

또한 본 발명은 그 핵산의 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하며 항원을 발현하는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 변이 균주를 포함하는 유효량의 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 숙주 내에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 바실러스(Bacillus)의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형되었다(예: S-59/UVA 처리에 의해).

또한 본 발명은 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 갖는 독립생활 미생물을 포함하는 유효량의 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 숙주 내 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 미생물을 포함하는 조성물은 백신이다. 몇몇 구체예에서, 미생물을 포함하는 조성물은 전문적인 항원제공세포이다.

또한 본 발명은 그 핵산의 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함한 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 변이 균주를 포함하는 유효량의 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 숙주 내 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 리스테리아(Listeria)의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형되었다(예: S-59/UVA 처리에 의해). 몇몇 구체예에서, 질환은 감염성 질환이다. 다른 구체예에서, 질환은 암이다.

또한 본 발명은 그 핵산의 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함한 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 변이 균주를 포함하는 유효량의 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 숙주 내 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 바실러스(Bacillus)의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 변형되었다(예: S-59/UVA 처리에 의해).

또한 본 발명은 그 미생물 핵산이 미생물의 증식 약화 및/또는 미생물의 DNA 수복 효소 결손을 초래하도록 변형된 독립생활 미생물의 의약적 용도를 제공한다. 의약적 용도라 함은 치료 의약으로서의 용도는 물론 예방 의약으로서의 용도(예: 백신으로서의 용도)를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적 화합물과의 반응에 의하여 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)이거나 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)이다.

다른 측면에서, 본 발명은 그 미생물 핵산이 미생물의 증식 약화 및/또는 미생물의 DNA 수복 효소 결손을 초래하도록 변형된 독립생활 미생물을 포함하는, 전문적인 항원제공세포의 의약적 용도를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적 화합물과의 반응에 의하여 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)이거나 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)이다.

또한 본 발명은 그 핵산의 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함한 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 변이 균주의 의약적 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 그 핵산의 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함한 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 변이 균주의 의약적 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 독립생활 미생물과 무관한 질환 및/또는 독립생활 미생물이 원인이 아닌 질환에 사용하는 의약품의 제조를 위한, 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 핵산을 갖는 독립생활 미생물의 용도를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 그 질환은 암이다. 몇몇 구체예에서, 그 질환은 독립생활 미생물과 무관한 감염성 질환이다.

또한 본 발명은 그 미생물과 무관한 질환 및/또는 그 미생물이 원인이 아닌 질환에 사용하는 의약품의 제조를 위한, 적어도 하나의 DNA 수복 효소에 결함이 있는 독립생활 미생물의 용도를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 그 질환은 암이다. 몇몇 구체예에서, 그 질환은 그 미생물과 무관한 감염성 질환이다.

또한 본 발명은 독립생활 미생물과 무관한 질환 및/또는 독립생활 미생물이 원인이 아닌 질환에 사용하는 의약품의 제조를 위한, 그 미생물 핵산이 미생물의 증식 약화 및/또는 미생물의 적어도 하나의 DNA 수복 효소 결손을 초래하도록 변형된 독립생활 미생물을 포함하는 전문적인 항원제공세포의 용도를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 그 질환은 암이다. 몇몇 구체예에서, 그 질환은 독립생활 미생물과 무관한 감염성 질환이다.

또한 본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)와 무관한 질환 및/또는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)가 원인이 아닌 질환에 사용하는 의약품의 제조를 위한, 그 핵산의 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 변이 균주의 용도를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 그 질환은 암이다. 몇몇 구체예에서, 그 질환은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)와 무관한 감염성 질환이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 천연 T 세포와, 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 갖는 독립생활 미생물을 포함하는 전문적인 항원제공세포를, 천연 T 세포가 활성화되기에 충분한 시간 동안 알맞은 조건 하에서 접촉시키는 것을 포함하여, 천연 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법의 접촉 단계는 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 실행될 수 있다. 천연 T 세포를 활성화시키는데 충분한 시간과 알맞은 조건에 대해서는 당해 기술분야의 종사자라면 익히 알고 있는 바이다. 또한 상기 조건의 예들을 아래 특정 실시예에서 기재하고 있다.

또한 전문적인 항원제공세포에 항원을 로딩하는 방법이 제공된다. 이 방법은 전문적인 항원제공세포와, 그 미생물의 증식 약화 및/또는 미생물의 적어도 하나의 DNA 수복 효소 결손을 초래하도록 변형된 미생물 핵산을 가지며 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 독립생활 미생물을, 전문적인 항원제공세포(예: 수지상세포(dendritic cell))에 로딩시키에 충분한 시간 동안 알맞은 조건 하에서 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법의 접촉 단계는 시험관내(in vitro), 생체외(ex vivo) 또는 생체내(in vivo)에서 실행될 수 있다. 항원은 미생물에 대한 이종 항원이거나 자가 항원일 수 있다. 항원제공세포에 로딩시키는데 충분한 시간과 알맞은 조건은 당해 기술 분야의 종사자들에게 일반적으로 알려져 있다. 또한 상기 조건의 예들을 아래 특정 실시예에서 기재하고 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 전문적인 항원제공세포(시험관내(in vitro), 생체외(ex vivo) 및/또는 생체내(in vivo))와, 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 가지며 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 독립생활 미생물을, 전문적인 항원제공세포를 활성화 및/또는 성숙화시키기에 충분한 시간 동안 알맞은 조건 하에서 접촉시키는 것을 포함하여, 전문적인 항원제공세포를 활성화 및/또는 성숙화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법의 접촉 단계는 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 실행될 수 있다. 항원은 미생물에 대한 이종 항원 또는 자가 항원일 수 있다. 항원제공세포를 활성화 및/또는 항원제공세포를 성숙화시키는데 충분한 시간과 알맞은 조건은 당해 기술 분야의 종사자들에게 일반적으로 알려져 있다. 또한 상기 조건의 예들을 아래 특정 실시예에서 기재하고 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 가지며 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 독립생활 미생물과 전문적인 항원제공세포를 접촉시켜 항원을 그 항원제공세포에 로딩하고, (b) 로딩된 전문적인 항원제공세포를 포함하는 유효량의 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 숙주 내 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 가지며 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 독립생활 미생물과 전문적인 항원제공세포를 접촉시켜 항원을 그 항원제공세포에 로딩하고, (b) 로딩된 전문적인 항원제공세포를 포함하는 유효량의 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 숙주 내에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

키트(kit)

또한 본 발명은 본 발명에 따른 변형 미생물과 변이 균주를 포함하는 키트(또는 제조품)를 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 (a) 그 핵산 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 변이 균주, 그 핵산 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 바실러스 안트라시스(Bacilluss anthracis) 변이 균주, 또는 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 갖는 독립생활 미생물을 포함하는 조성물; 및 (b) 숙주 내 질환을 예방 또는 치료하는데 그 조성물을 사용하기 위한 지침(instruction)을 포함하는 키트를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 지침은 표지(label) 상에 있다. 다른 구체예에서, 지침은 키트 내에 함유된 인서트(insert) 상에 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 그 핵산 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 변이 균주, 그 핵산 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 바실러스 안트라시스(Bacilluss anthracis) 변이 균주, 또는 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 갖는 독립생활 미생물을 포함하는 조성물; 및 (b) 숙주로 그 조성물을 투여하기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 지침은 표지 상에 있다. 다른 구체예에서, 지침은 키트 내의 인서트 상에 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 그 핵산 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 변이 균주, 그 핵산 수복능을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 바실러스 안트라시스(Bacilluss anthracis) 변이 균주, 또는 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 갖는 독립생활 미생물을 포함하는 조성물; 및 (b) 그 조성물을 투여할 숙주를 선별하기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 지침은 표지 상에 있다. 다른 구체예에서, 지침은 키트 내의 인서트 상에 있다.

앞선 언급한 각 측면에 대한 몇몇 구체예에서, 조성물은 백신이다. 앞선 언급한 각 측면에 대한 몇몇 구체예에서, 조성물은 전문적인 항원제공세포이다. ㅍ앞선 언급한 각 측면에 대한 몇몇 구체예에서, 독립생활 미생물 핵산은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적 화합물과의 반응에 의하여 변형된다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 s-59/UVA 처리되었다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 DNA 수복 효소에 결함이 있다.

본 발명의 부가적 구체예

일 구체예에서, 본 발명은 그 미생물의 유전자 발현에 실질적인 영향이 없으며 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 갖는 독립생활 미생물을 포함하는 백신 조성물, 및/또는 그 미생물의 유전자 발현에 실질적인 영향이 없으며 그 미생물의 증식이 약화되도록 변형된 미생물 핵산을 갖는 독립생활 미생물에 의한 감염으로 활성화 또는 성숙화 및/또는 항원-로딩화된 항원제공세포를 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 일 구체예에서, 미생물의 유전자 발현에는 실질적인 영향이 없으므로 미생물을 개체 투여하는 경우 면역 반응을 자극하기에 충분한 수준으로 항원이 발현된다. 일 구체예에서, 미생물은 적어도 약 0.3 log, 또한 적어도 약 1 log, 약 2 log, 약 3 log, 약 4 log, 약 6 log, 또는 적어도 약 8 log까지 그 증식이 약화된다. 또다른 구체예에서, 미생물은 약 0.3 내지 >10 log, 약 2 내지 > 10 log, 약 4 내지 > 10 log, 약 6 내지 > 10 log, 약 0.3-8 log, 약 0.3-6 log, 약 0.3-5 log, 약 1-5 log, 또는 약 2-5 log까지 그 증식이 약화된다. 일 구체예에서, 미생물에 의한 항원 발현은 미생물 핵산이 변형되지 않은 미생물에 의한 항원 발현의 적어도 약 10 %, 약 25 %, 약 50 %, 약 75 %, 또는 적어도 약 90 % 정도이다. 일 구체예에서, 발현 항원은 미생물 그 자체의 항원이다. 일 구체예에서, 미생물은 항원을 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 항원은 질환 관련 항원이다. 일 구체예에서, 항원은 감염성 질환, 자가 면역 질환, 알레르기, 암, 및 기타 과증식성 질환으로 구성된 군 중에서 선택된 질환과 관련 있다. 일 구체예에서, 항원은 종양 관련 항원이다. 일 구체예에서, 종양 항원은 분화 항원, 조직-특이성 항원, 발육 항원, 종양-관련 바이러스성 항원, 암-고환 항원, 태아성 항원, 종양유발단백질 항원, 과발현 단백질 항원 및 변성 단백질 항원으로 구성된 군 중에서 선택된 항원이다. 일 구체예에서, 종양 항원은 메조텔린, Sp17, gp100, PR3, PAGE-4, TARP, WT-1, NY-ESO-1 및 SPAS-1으로 구성된 군 중에서 선택된다. 일 구체예에서, 미생물 핵산은 미생물을 노출시켜 조사 처리하는 방법 그리고 미생물 핵산 변형을 일으키는 핵산 표적 화합물과 미생물을 반응시키는 방법으로 구성된 군 중에서 선택된 방법에 의하여 변형된다. 바람직한 구체예에서, 미생물 핵산은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적 화합물과 미생물과의 반응에 의하여 변형된다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 층간삽입(intercalation), 소홈 결합(minor groove binding), 대홈 결합(major groove binding), 정전기적 결합, 및 서열-특이적 결합으로 구성된 군 중에서 선택된 방식(mode)으로 핵산을 표적한다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 핵산 알킬화제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르이다. 일 구체예에서, 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적 화합물은 조사(irradiaton), 바람직하게는 UVA 조사 처리에 의해 화합물이 활성화될 때 반응한다. 일 구체예에서, UVA 조사로 활성화되는 핵산 표적 화합물은 소랄렌이다. 바람직한 구체예에서, 소랄렌은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소랄렌이다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 간접적으로 핵산을 변형시킨다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 간접적으로 조사, 바람직하게는 UVA 조사 처리에 의한 활성화로 간접적인 변형을 일으킨다. 일 구체예에서, 미생물은 유전자 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이로 인하여 변형된 미생물 핵산에 대한 미생물의 수복능이 약화된다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이는 미생물의 종과 속에 따라 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA 또는 이들의 기능적 동등체로 구성된 군 중에서 선택된 유전자 상에 존재한다. 일 구체예에서, 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA 또는 이들의 기능적 동등체로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자이다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이로 인하여 PhrB, UvrA, UvrB, UvrC, UvrD, 및 RecA로 구성된 군 중에서 선택된 DNA 수복 효소의 활성이 약화된다. 부가 구체예에서, UVA 조사로 인해 활성화된 소랄렌과 반응시키면 이들 돌연변이를 함유한 미생물이 변형된다. 바람직한 구체예에서, 소랄렌은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소랄렌이다. 일 구체예에서, 미생물은 박테리아, 원생동물 및 곰팡이로 구성된 군 중에서 선택된다. 일 구체예에서, 미생물은 박테리아이다. 일 구체예에서, 박테리아는 세포내 박테리아이다. 바람직한 구체예에서, 박테리아는 리스테라아(Listeria), 바람직하게는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)이다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 식세포에 의한 리스테리아(Listeria)의 흡수에는 현저한 영향 없이 비-식세포에 대한 리스테리아(Listeria)의 침입능을 약화시키는 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 돌연변이는 인터날린 유전자(들)에 존재한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 돌연변이는 inlA, inlB, 및 인터날린을 코딩하는 임의의 유전자로 구성된 군 중에서 선택된 유전자에 존재한다. 일 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 양 inlA 및 inlB, 모두에 유전자 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 감염 세포의 포식용해소체에 대한 리스테리아(Listeria)의 이탈능을 약화시키는 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 돌연변이는 hly 유전자에 존재한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 리스테리아(Listeria)에 의한 액틴의 중합화를 약화시키는 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 돌연변이는 actA 유전자에 존재한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 actA 유전자 및 하나 이상의 인터날린 유전자의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 actA 유전자 및 inlB 유전자의 돌연변이를 포함하며, 바람직하게는 리스테리아(Listeria)는 actA/inlB 결실 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) actA/inlB 결실 돌연변이는 또한 uvrAB 유전자의 결실 돌연변이를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명은 그 박테리아의 유전자 발현에 실질적인 영향이 없으며 그 박테리아의 증식이 약화되도록 변형된 박테리아성 핵산을 갖는 박테리아를 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 일 구체예에서, 박테리아의 유전자 발현에는 실질적인 영향이 없으므로 박테리아를 개체 투여하는 경우 박테리아에 대한 면역 반응을 자극하기에 충분한 수준으로 항원이 발현된다. 일 구체예에서, 박테리아는 적어도 약 0.3 log, 또한 적어도 약 1 log, 약 2 log, 약 3 log, 약 4 log, 약 6 log, 또는 적어도 약 8 log까지 그 증식이 약화된다. 또다른 구체예에서, 박테리아는 약 0.3 내지 >10 log, 약 2 내지 > 10 log, 약 4 내지 > 10 log, 약 6 내지 > 10 log, 약 0.3-8 log, 약 0.3-6 log, 약 0.3-5 log, 약 1-5 log, 또는 약 2-5 log까지 그 증식이 약화된다. 일 구체예에서, 박테리아에 의한 항원 발현은 박테리아성 핵산이 변형되지 않은 박테리아에 의한 항원 발현의 적어도 약 10 %, 약 25 %, 약 50 %, 약 75 %, 또는 적어도 약 90 % 정도이다. 일 구체예에서, 박테리아성 핵산은 박테리아를 노출시켜 조사 처리하는 방법 그리고 박테리아성 핵산의 변형을 일으키는 핵산 표적 화합물과 박테리아를 반응시키는 방법으로 구성된 군 중에서 선택된 방법에 의하여 변형된다. 바람직한 구체예에서, 박테리아성 핵산은 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적 화합물과 박테리아와의 반응에 의하여 변형된다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 층간삽입, 소홈 결합, 대홈 결합, 정전기적 결합 및 서열-특이적 결합으로 구성된 군 중에서 선택된 방식으로 핵산을 표적한다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 핵산 알킬화제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르이다. 일 구체예에서, 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적 화합물은 조사, 바람직하게는 UVA 조사 처리에 의하여 화합물이 활성화될 때 반응한다. 일 구체예에서, UVA 조사로 활성화되는 핵산 표적 화합물은 소랄렌이다. 바람직한 구체예에서, 소랄렌은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소랄렌이다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 간접적으로 핵산을 변형시킨다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 조사, 바람직하게는 UVA 조사 처리에 의한 활성화로 간접적인 변형을 일으킨다. 일 구체예에서, 박테리아는 유전자 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이로 인하여 변형된 박테리아성 핵산에 대한 박테리아의 수복능이 약화된다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이는 박테리아의 종과 속에 따라 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA 또는 이들의 기능적 동등체로 구성된 군 중에서 선택된 유전자 상에 존재한다. 일 구체예에서, 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA 또는 이들의 기능적 동등체로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자이다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이로 인하여 PhrB, UvrA, UvrB, UvrC, UvrD, 및 RecA로 구성된 군 중에서 선택된 DNA 수복 효소의 활성이 약화된다. 바람직한 구체예에서, UVA 조사로 인해 활성화된 소랄렌과 반응시키면 이들 돌연변이를 함유한 박테리아가 변형된다. 바람직한 구체예에서, 소랄렌은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소랄렌이다. 일 구체예에서, 박테리아는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 세포내 박테리아 및 미코박테리아(mycobacteria)로 구성된 군 중에서 선택된다. 일 구체예에서, 박테리아는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 콜레라(Cholera), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 대장균(E. coli), 보렐리아 부르그도페리(Borrelia burgdorferi)(Lyme), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스 종(Staphylococcus sp.), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 나이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 쉬겔라 종(Shigella sp.), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 및 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)로 구성된 군 중에서 선택된다. 일 구체예에서, 박테리아는 미코박테리아이다. 일 구체예에서, 미코박테리아는 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)이다. 일 구체예에서, 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)는 uvrAB 결실 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)는 조건(conditional) recA 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 박테리아는 세포내 박테리아이다. 일 구체예에서, 세포내 박테리아는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)이다. 일 구체예에서, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)는 uvrAB 결실 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)는 조건 recA 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)는 uvrAB 결실 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)는 조건 recA 돌연변이를 포함한다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는 의약품과 상기 조성물의 사용 방법, 예컨대 개체의 백신접종을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 백신을 개체에 투여하는 것을 포함하는 백신의 사용 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 백신접종은 경구, 경비, 정맥내, 피내, 복강내, 근육내, 림프내, 및 피하 경로로 구성된 군 중에서 선택된 경로로 백신을 투여함으로써 수행된다. 일 구체예에서, 예방적 처방(prophylactic regimen)을 사용하여 백신이 표적하는 질환의 징후(sign)가 없는 개체에게 백신을 투여한다. 일 구체예에서, 예방적 처방을 사용하여 백신이 표적하는 질환의 증상(symptom)을 갖는 개체에게 백신을 투여한다. 일 구체예에서, 백신은 암을 표적하는 종양 항원을 포함하고 치료적 백신접종은 암의 증상을 완화시킨다. 일 구체예에서, 백신접종한 개체 내의 평균 종양 용적(mean tumor volume)은 적어도 약 5 %, 또한 약 10 %, 또한 약 25 %, 또한 약 50 %, 또한 약 75 %, 또한 약 90 %, 또는 약 100 %까지 줄어든다. 일 구체예에서, 예방 또는 치료적 처방을 사용하여 마우스 종양 모델 확립을 위해 종양 세포가 이식가능한 모델 마우스에 이식된 종양 항원을 적어도 하나 이상 함유하는 백신을 투여한다. 종양은 백신을 마우스로 투여한 후(예방적 처방) 또는 투여하기 전(치료적 처방)에 마우스 내로 이식된다. 일 구체예에서, 예방 또는 치료적 처방을 사용하여 백신접종된 마우스 내의 평균 종양 용적은 백신접종되지 않은 유사 마우스 또는 무관한 항원을 발현시키는 유사 백신 비히클(vehicle)로 백신접종된 유사 마우스(대조 마우스) 내의 평균 종양 용적보다 작다. 일 구체예에서, 백신접종된 마우스 내 평균 종양 용적은 적어도 약 5 %, 약 10 %, 약 25 %, 약 50 %, 약 75 %, 약 90 %, 또는 약 100 % 정도 대조 마우스 내의 평균 종양 용적보다 작다. 일 구체예에서, 예방 또는 치료적 처방을 사용하여 백신접종된 마우스의 중간 생존 기간(median survival time)은 적어도 약 2 일, 약 5 일, 약 7 일 또는 적어도 약 10 일 정도 대조 마우스보다 길다.

일 구체예에서, 본 발명은 미생물 개체군을 처리하여 그 미생물의 유전자 발현에 실질적인 영향이 없으며 그 미생물의 증식이 약화되도록 미생물 핵산을 변형시키는 것을 포함하여, 백신 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 미생물 개체군을 처리하여 그 미생물의 유전자 발현에 실질적인 영향이 없으며 그 미생물의 증식이 약화되도록 미생물 핵산을 변형시킨 다음, 그 미생물 개체군을 항원제공세포에 항원을 로딩하고 항원제공세포의 활성/성숙을 유도하는데 사용하는 것을 포함하여, 백신 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 미생물 개체군을 조사 처리한다. 일 구체예에서, 미생물 개체군과 간접적으로 핵산 변형을 가져오는 핵산 표적 화합물을 반응시킨다. 부가 구체예에서, 조사 처리하면 간접적인 핵산 변형을 일으키는 핵산 표적 화합물의 활성화가 진행된다. 부가 구체예에서, 핵산 표적 화합물의 활성화로 인하여 핵산을 변형시키는 활성 산소종이 발생한다. 일 구체예에서, 미생물 개체군을 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적 화합물과 반응시킨다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 100 pM 내지 1 mM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 1-200 nM 또는 약 1-100 nM의 농도로 반응한다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 알킬화제를 포함한다. 일 구체예에서, 알킬화제는 머스타드, 머스타드 중간체 및 머스타드 동등체로 구성된 군 중에서 선택된다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 층간 삽입 물질, 소홈 결합 물질, 대홈 결합 물질, 정전기적 결합 물질, 및 서열-특이적 결합 물질로 구성된 군 중에서 선택된 핵산 표적기를 포함한다. 일 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 화합물의 활성화시 핵산과 직접 반응한다. 일 구체예에서, 조사 처리하면 화합물이 활성화된다. 일 구체예에서, 조사는 UVA 조사이다. 바람직한 구체예에서, 핵산 표적 화합물은 UVA 조사로 활성화된 소랄렌 화합물이다. 일 구체예에서, 소랄렌 화합물은 약 10 pM 내지 10 mM, 또한 약 100 pM 내지 1 mM, 또한 약 1-500 nM, 또한 약 1-200 nM 또는 약 1-100 nM의 농도이고, UVA 조사량은 약 0.1-100 J/cm², 또한 약 0.1-20 J/cm², 또는 약 0.5-5 J/cm², 또는 약 2-4 J/cm²이다. 일 구체예에서, 미생물 개체군은 적어도 약 0.3 log, 또한 적어도 약 1 log, 약 2 log, 약 3 log, 약 4 log, 약 6 log, 또는 적어도 약 8 log까지 그 증식이 약화된다. 또다른 구체예에서, 미생물 개체군은 약 0.3 내지 >10 log, 약 2 내지 > 10 log, 약 4 내지 > 10 log, 약 6 내지 > 10 log, 약 0.3-8 log, 약 0.3-6 log, 약 0.3-5 log, 약 1-5 log, 또는 약 2-5 log까지 그 증식이 약화된다. 일 구체예에서, 미생물 개체군에 의한 항원 발현은 핵산이 변형되도록 처리되지 않은 미생물 개체군에 의한 항원 발현의 적어도 약 10 %, 약 25 %, 약 50 %, 약 75 %, 또는 적어도 약 90 % 정도이다. 일 구체예에서, 발현 항원은 미생물 그 자체의 항원이다. 일 구체예에서, 미생물은 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)이고 그 항원은 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 항원이다. 일 구체예에서, 미생물은 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)이고 그 항원은 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)의 항원이다. 일 구체예에서, 미생물은 항원을 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 항원은 질환 관련 항원이다. 일 구체예에서, 항원은 감염성 질환, 자가 면역 질환, 알레르기, 암, 및 기타 과증식성 질환으로 구성된 군 중에서 선택된 질환과 관련 있다. 일 구체예에서, 항원은 종양 관련 항원이다. 일 구체예에서, 종양 항원은 분화 항원, 조직-특이성 항원, 발육 항원, 종양-관련 바이러스성 항원, 암-고환 항원, 태아성 항원, 종양유발단백질 항원, 과발현 단백질 항원 및 변성 단백질 항원으로 구성된 군 중에서 선택된 항원이다. 일 구체예에서, 종양 항원은 메조텔린, Sp17, gp100, PR3, PAGE-4, TARP, WT-1, NY-ESO-1 및 SPAS-1으로 구성된 군 중에서 선택된다. 일 구체예에서, 미생물은 유전자 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이로 인하여 변형된 미생물 핵산에 대한 미생물의 수복능이 약화된다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이는 미생물의 종과 속에 따라 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA 또는 이들의 기능적 동등체로 구성된 군 중에서 선택된 유전자 상에 존재한다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA 또는 이들의 기능적 동등체로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자이다. 일 구체예에서, 유전자 돌연변이로 인하여 PhrB, UvrA, UvrB, UvrC, UvrD, 및 RecA로 구성된 군 중에서 선택된 DNA 수복 효소의 활성이 약화된다. 부가 구체예에서, 이러한 돌연변이를 갖는 미생물은 UVA 조사로 인해 활성화된 소랄렌과 반응시키면 변형된다. 일 구체예에서, 미생물은 박테리아, 원생동물 및 곰팡이로 구성된 군 중에서 선택된다. 일 구체예에서, 미생물은 박테리아이다. 일 구체예에서, 박테리아는 세포내 박테리아이다. 바람직한 구체예에서, 박테리아는 리스테라아(Listeria), 바람직하게는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)이다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 식세포에 의한 리스테리아(Listeria)의 흡수에는 현저한 영향 없이 비-식세포에 대한 리스테리아(Listeria)의 침입능을 약화시키는 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 돌연변이는 인터날린 유전자(들)에 존재한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 돌연변이는 inlA, inlB, 및 인터날린을 코딩하는 임의의 유전자로 구성된 군 중에서 선택된 유전자에 존재한다. 일 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 양 inlA 및 inlB, 모두에 유전자 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 감염 세포의 포식용해소체에 대한 리스테리아(Listeria)의 이탈능을 약화시키는 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 돌연변이는 hly 유전자에 존재한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 리스테리아(Listeria)에 의한 액틴의 중합화를 약화시키는 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아(Listeria) 돌연변이는 actA 유전자에 존재한다. 일 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 actA 유전자 및 하나 이상의 인터날린 유전자의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아(Listeria)는 actA 유전자 및 inlB 유전자의 돌연변이를 포함하며, 바람직하게는 리스테리아(Listeria)는 actA/inlB 결실 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) actA/inlB 결실 돌연변이는 또한 uvrAB 유전자의 결실 돌연변이를 포함한다.

실시예 1

OVA 항원의 발현을 유지하면서 증식의 경감을 제공하는 리스테리아 균주의 소라렌 처치

이종 기원의 닭 OVA 항원인 난백 알부민을 발현하도록 변성된 리스테리아 모노시토게네스의 몇 가지 균주를 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸프소라렌(미국 오하이오주 클리블랜드에 소재하는 벤 베뉴에 의해 3 mM 용액으로서 고체 로부터 제조한 S-59(애쉬-스티븐스, 미국 미시건주 리버뷰 소재)(미국 특허 제5,399,719호 참조) 및 UVA 광(320 nm - 400 nm)과 반응시켰다. 생성된 리스테리아를 분석하여 생존 가능한 리스테리아의 장기간 역가의 감소뿐만 아니라 리스테리아에 의한 OVA 항원의 발현에 대하여 평가하였다. 리스테리아 균주는 버클리 소재 캘리포니아 대학의 댄 포트니 박사가 제공하였으며, 실시예 8에서 논의되는 바와 같이 OVA 항원을 함유하도록 변성하였다. 이들은 DP-L4056(야생형), DP-L4029(10403S ΔactA, act A, Act A 유전자 내 파지 처치된 결실 돌연변이, Skoble et al., Journal of Cell Biology, 150: 527-537 (2000) 및 Laure et al., Jounal of Bacteriology 184(15): 4177-4186 (2002) 참조), DP-L4364(10403S ΔlplA, 포스포리파제 A 유전자 내 결실 돌연변이) 및 DP-L4017(10403S hly_L461T, 헤모리신 유전자 내 점 돌연변이, Glomski et al., Journal of Cell Biology 156(6): 1029-1038, (2002) 참조)이 있다. 균주를 37℃ 및 300 rpm으로 BHI 배지(뇌 심장 주입, 피셔 사이언티픽)에서 대략 1 x 10⁹ CFU/㎖의 농도로(600 nm에서 흡광도 0.5로) 배양하였다. 각각의 균주 1.0 ㎖를 두 벌 15 ㎖ 튜브로 옮겼다. 각각의 튜브를 4℃에서 20 분 동안 2300 x g로 원심분리하고, 상청액을 제거하였으며, S-59 유무 하의 1% BSA를 함유하는 PBS(인산염 완충 염수, 하이클론)를 두 벌 튜브(1 x 10⁸ CFU/㎖)에 가하였다. S-59를 100 nM의 농도로 가하였다. 샘플을 6웰 배양 플레이트에 넣고, 대략 2 J/㎠의 조사량으로 UVA 조사하였다(FX1019 조사 장치,백스터 펜월, 미국 일리노이주 라운드 레이크 소재). 그 다음, 각각의 샘플을 15 ㎖의 PBS 튜브로 옮기고, 상기와 같이 원심분리하였으며, 상청액을 제거하였다. 이것을 5 ㎖ PBS로 세척하고, 원심분리하였으며, 상청액을 제거하고, 최종 박테리아 펠렛을 0.5 ㎖ PBS에 현탁시켰다. 각각의 100 ㎕ 샘플을 사용하여 연속 희석에 의해 박테리아 역가를 결정하였다. 각각의 희석물을 LB(Luria-Bertani, Q-Biogene, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 플레이트에 넣고, 37℃에서 밤새도록 항온처리하였으며, 콜로니를 계수하여 박테리아 역가를 측정하였다.

박테리아 샘플의 항원 제시는 쥐과 DC 2.4 세포주(다나 파버 캔서 인스티튜트에서 입수한 수지상 세포주, Shen et al., J Immunol 158(6): 2723-30(1997) 참조) 및 B3Z T 세포 하이브리도마(Dr. Shastri, University of California, Berkeley에서 입수함)를 사용하여 평가하였다. B3Z는 MHC 부류 I 분자에 관한 OVA 항원의 인지시 β-갈락토시다제 유전자를 발현하는 lacZ 유도성 CD8+T 세포 하이브리도마이다. β-갈락토시다제에 대한 기질인 CPRG(클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노시다제, 칼비오켐, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 DC 2.4 세포에 의해 제공되는 OVA 항원의 양에 직접 상관하는 β-갈락토시다제의 생성 레벨을 평가하였다. DC 2.4 세포 및 B3Z T 세포 하이브리드는 10% FBS(태아 소 혈청, HyClone)를 함유하는 RPMI 1640 배양 배지(RPMI, 인비트로겐)에 유지시켰다. DC2.4 세포를 200 ㎕ 분액으로 96 웰 배양 블레이트의 웰(웰 당 1 x 10⁵ DC2.4)에 옮겼다. 박테리아 샘플은 50 ㎕ 스톡을 450 ㎕ PBS로 1 x 10⁵ CFU/㎖로 연속적으로 희석하였다(S-59 처치된 샘플은 CFU 등가인데, 즉 S-59 처치 전 콜리니 형성 유닛의 수이 다). 각각의 희석물의 20 ㎕ 분액을, DC2.4 세포를 함유하는 웰에 옮겨서 대략 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10⁶, 1 x 10⁷ 또는 1 x 10⁸ CFU/㎖를 제공한다. 또한, PBS만의 20 ㎕ 분액을 음성 콘트롤로서 첨가하였다. 샘플을 1 시간 동안 37℃에서 5% CO₂ 중에 항온처리하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하여 세포외 박테리아를 제거하였다. 200 ㎕ 분액의 B3Z T 세포(1 x 10⁵ 세포) 및 100 ㎕/㎖ 겐타마이신(시그마)을 각각의 웰에 가하였다. 양성 콘트롤로서, 100 nM SL8 OVA257-264 펩티드(SL8 OVA 항원, SHINFEKL, 서열 번호 1, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를, DC 2.4 및 B3Z 세포 각각 1 x 10⁵를 함유하는 웰에 가하였다. 샘플을 37℃ 5% CO₂에서 밤새도록 항온처리하였다. 플레이트를 3 분 동안 400 x g에서 원심분리하고, 각각의 웰을 PBS 250 ㎕로 세척하였다. 100 μM 2-메르캅토에탄올, 9 mM MgCl₂, 0.125% Igepal CA-630((옥타페녹시)폴리에톡시에탄올, 시그마) 및 0.15 mM CPRG를 함유하는 PBS 100 ㎕ 분액을 각각의 웰에 가하였다.샘플을 37℃에서 4 시간 이상 동안 항온처리하였다. 흡광도는 플레이트 판독기를 사용하여 기준 측정을 655 nm에서 하면서 595 nm에서 측정하였다. 박테리아 역가 및 미처치군에 대한 S-59 처치군의 항원 제시 결과(DC 2.4 당 100 박테리아)를 표 1에 제공한다. 결과는 DC2.4 당 첨가된 100 박테리아의 레벨에서, 항원 제시는 미처치 샘플의 대략 55 내지 85%인 것으로 나타났다. 박테리아 역가가 대략 104로 감소되었기 때문에 이는 충분한 항원 제시가 리스테리아 증식의 상당한 약화로 유지된다는 것을 의미한다.

DP-L4056 야생형 균주를 사용하여 유사한 절차를 수행하였다. 박테리아를 100, 200, 400, 800 또는 1000 nM S-59로 처치하고, 나머지 역가를 결정하였으며, 항원 제시를 전술한 바와 같이 측정하였다. 박테리아 역가 및 항원 제시(DC 2.4 세포 당 100 리스테리아)의 결과는 표 2에 나타내며, 도 1에 도시한다. 이 데이타는 항원 제시가 증식의 완전 억제(즉, 검출 한계)를 가진 항원의 제시를 비롯하여 리스테리아 성장에서 넓은 약독 범위에 걸쳐서 유의적이라는 것을 가리킨다.

실시예 2

OVA 항원의 발현을 유지하면서 증식 약화를 제공하는 리스테리아 균주의 DNA 표적된 알킬화제 처리

절차는 화합물 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르(화합물 1, ChemSyn, 미국 미주리주 해리슨빌 소재, 미국 특허 제6,093,725호 참조)만을 사용하여 실시예 1과 유사하게 수행하였다. 사용된 리스테리아 균주는 DP-L4056 및 DP-L4017이었다. 화합물 1(100 ㎖ BBS 당 1.48 M H3PO4) 135 ㎕를 1 x 108 CFU/㎖의 박테리아 5 ㎖에 0, 0.5, 1, 2, 5 및 10 μM의 농도로 가하고, 샘플을 2 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 박테리아 역가 및 항원 제시를 실시예 1에서와 같이 평가하였다. 항원 제시의 경우, 리스테리아 균주를 1 x 10², 1 x 10³, 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10⁶ 또는 1 x 10⁷ CFU/㎖로 희석하였다. 화합물 1 농도의 함수로서 로그 역가, 로그 약독 및 항원 제시를 미처리군의 백분율로서(DC 2.4 당 1 리스테리아) 표 3 및 도 2a, b에 제공한다. 결과는 화합물 1도, 예를 들면 1 μM에서 유효하였는데, 리스테리아의 증식을 상당히 약화시키면서 충분한 항원 제시를 제공하는 것으로 나타났다.

실시예 3

uvr AB 돌연변이체 대 야생형 대장균의 소라렌처리에 의한 증식의 약화 비교

핵산 손상을 수복하는 능력이 결여된 돌연변이체 대장균(이. 콜리)의 소라렌 처리를 야생형 균주 이. 콜리 균주 AB1157(야생형) 및 CSR 603(uvrT, recA, phr 돌연변이체, Dr. Aziz Sancar, University of North Carolina에서 입수함, Harm, Mutation Research 60:263-270(1979) 참조)과 비교하였다. 이 실시예는 250 rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 37℃의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 배지 3 ㎖ 중에 밤새도록 성장시킨 AB1157 대 돌연변이체 CSR603의 약독을 비교한다. 이것의 2 ㎖ 분액을 30℃ LB 배지 100 ㎖에 가하고, 600 nm에서의 흡광도가 0.9 OD, 대략 1 x 10⁹ CFU/㎖가 될 때까지 대략 5 시간 동안 쉐이커 상에 놓았다. 각각의 균주에 대하여 대략 0.5 ㎖의 스톡을 15 ㎖ 튜브에 가하고, 4℃에서 20 분 동안 2300 x g로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 각각의 펠렛을, 0, 1, 10, 100 및 1000 nM의 소라렌 S-59을 함유하는 PBS 5 ㎖에 현탁시켰다. 각각의 샘플을 6 웰 배양 플레이트로 옮기고, 실시예 1에서와 같이 조사하였다. 샘플을 연속 희석하고, 역가를 실시예 1에서와 같이 결정하였다. 결과를 표 4 및 도 3에 나타낸다. 결과는 uvrABC 돌연변이체를 소라렌 처리하면 소정의 소라렌 농도에 대하여 박테라 증식의 약화(잔류 역가 저하)가 더 커지는 것으로 나타났다.

실시예 4

S-59 처리 유무 하에 리스테리아 균주를 사용한 마우스의 치료 백신화

백신으로서 S-59 처리된 리스테리아의 용도를 평가하기 위하여, C57Bl/6 마우스 흑색종 종양 모델을 사용하였다. C57Bl/6 마우스(찰스 리버, 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재)를 제모하고, HBSS 100 ㎕ 중에 2 x 10⁵ B16.F10.Mo520.10 세포(매사츄세츠 대학의 Dr. Kenneth Rock로부터 입수한 흑색종 세포를 발현하는 B16-OVA)를 피하 이식하였다. OVA 항원을 함유하는 리스테리아 모노시토게네스 균주 DP-L4056 및 DP-L4017을 S-59 처리(실시예 1에서와 같이 20 nM S-59 UVA 조사됨) 유무 하에 제조하였다. 또한, OVA 항원이 없는 야생형 균주 DP-L4056을 콘트롤로서 사용하였다. S-59 처리된 샘플의 로그 역가를 결정하여 소라렌 처리에 기인한 로그 약독을 평가하였다(표 6). 리스테리아를 HBSS(행크스 평형 염 배지, 기브코)에 현탁시키고, 10 내지 12 마수스의 군에게 각 균주의 100 ㎕ 복강내 주사로 3회 백신 접종하였을 뿐만 아니라, 한 군에게는 HBSS 비히클을 주사하였다. 다양한 균주에 대한 백신 접종량(백신 당 총 CFU)을 표 6에 나타내었다. 투여량은 S-59 비처리된 리스테리아에 대하여 0.1 LD₅₀, 그리고 S-59 처리된 리스테리아에 대하여 최대 가능한 투여량에 해당한다. 백신 접종은 종양 이식 후 3, 10 및 17일째에 행하였다. 마우스에게서 촉진 가능한 종양이 관찰되었다. 일단 관찰되면, 종양의 반대 직경을 주 2회 측정하였다. 종앵이 임의의 방향으로 20 mm 측정되었을 때, 그 마우스를 희생하였다. B16-OVA 후 일수의 함수로서 평균 종양 부피는 도 4 및 표 5에 나타낸다. 군 당 마우스의 생존 백분율은 도 5에 도시하며, 평균 생존률은 표 6에 제공한다. 이 실시예는 S-59 처리된 리스테리아 균주의 고 투여량이 마우스에게 안전하게 제공될 수 있어서 양호한 항종양 반응을 가져온다는 것을 보여준다.

실시예 5

백신 접종 후 항원 특이적인 면역 반응의 평가

본 발명의 백신은 다양한 시험관내 및 생체내 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 리스테리아계 백신을 사용하는 이러한 방법을 예로 들지만, 본 발명의 어떠한 미생물계 백신의 잠재 효능도 평가하는 데 사용할 수 있다.

일부 어세이는 백신 접종된 마우스의 비장으로부터의 항원 특이적인 T 세포의 분석을 수반한다. C57Bl/6 마우스를 백신 접종, 예를 들면 리스테리아-OVA 균주로 0.1 LD50의 복강내 주사하는데, 여기서 리스테리아는 증식을 약화시키도록 처리할 수 있다(예컨대, S-59 처리). 백신 접종 후 7일째에 마우스의 비장 세포를, 비장을 빙냉 RPMI 1640 배지에 넣고, 이로부터 단일 세포 현탁액을 제조함으로써 수거한다(통상적으로 군 당 3 마리 마우스). 대안으로서, 마우스의 림프절은 단일 세포 현탁액과 유사하게 수거, 제조할 수 있으며, 후술되는 어세이에서 비장 세포를 대체할 수 있다. 통상적으로, 비장 세포는 백신의 정맥내 도는 복강내에 대해 평가하는 한편, 비장 세포와 림프절로부터의 세포는 백신의 근육내, 피하 또는 피부내 투여에 대하여 평가한다.

달리 설명하지 않는 한, 세 실시예에 사용된 모든 항체는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 파밍젠에서 입수할 수 있다.

ELISPOT 어세이:

OVA 항원을 가진 리스테리아 균주는 ELISPOT 분석을 사용하여 마우스 모델 내 면역화시 발생되는 항원 특이적인 T 세포의 정량적 빈도에 대하여 평가한다. 평가된 항원 특이적인 T 세포는 OVA 특이적인 CD8+ 또는 LLO 특이적인 CD8+ 또는 CD4+ T 세포이다. 이 OVA 항원 모델은 백신에 삽입되는 이종 종양 항원에 대한 면역 반응을 평가하며, 임의의 관심 대상의 항원과 대체될 수 있다. LLO 항원은 리스테리아에 특이적이고, 백신 비히클로서 사용되는 임의의 미생물 벡터에 적당한 항원과 대체할 수 있다. 특이적인 T 세포는 특이적인 항원의 인지시 시토킨 방출(예컨대, IFN-γ)의 검출에 의해 평가한다. PVDF계 96 웰 플레이트(BD 바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 새너제이 소재)를 4℃에서 항쥐과 IFN-γ 모노클로날 항체(mAb R4; 5 ㎍/㎖)로 밤새도록 코팅한다. 플레이트를 세척하고, 2 시간 동안 실온에서 200 ㎕의 완전 RPMI로 차단한다. 백신 접종된 마우스(비백신 접종 콘트롤 마우스)로부터의 비장 세포를 웰 당 2 x 10⁵ 세포로 첨가하고, 20 내지 22 시간 동안 37℃에서 약 0.01 내지 10 μM 범위의 다양한 농도의 펩티드의 존재 하에 항온처리하였다. 사용된 펩티드는 OVA에 대하여 SL8, MHC 부류 I 에피토프, 리스테리오리신 O(리스테리아 항원)에 대하여 LLO₁₉₀(NEKYAQAYPNVS, 서열 번호 2, 인비트로겐) MHC 부류 II에피토프, 또는 리스테리오리신 O에 대하여 LLO₂₉₆(VAYGRQVYL, 서열 번호 3), MHC 부류 I 에피토프이다. 세척 후, 플레이트는 PBS 중에 0.5 ㎍/㎖로 희석시킨 IFN-γ(XMG1.2)에 특이적인 2차 비오틴화 항체로 항온처리한다. 실온에서 2 시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 세척하고, 1 시간 동안 37℃에서, 1% BSA를 함유하는 PBS 중에 희석시킨 1 nm 금염소 항비오틴 콘쥬게이트(GAB-1; 1:200 희석; 테드 펠라, 미국 캘리포니아주 레딩 소재)로 항온처리한다. 철저하게 세척한 후, 플레이트를 실온에서 2 내지 10 분 동안 점 형성을 위하여 기질(은 강화 키트; 30 ㎕/웰; 테드 펠라)로 항온처리한다. 그 다음, 플레이트를 증류수로 세정하여 기질 반응을 중지시킨다. 플레이트를 공기 건조시킨 후, 각 웰 내 점을, 자동 ELISPOT 플레이트 판독기(CTL, 미국 오하이오주 클리블랜드 소재)를 사용하여 계수한다. 시토킨 반응은 OVA 특이적인 T 세포 또는 리스테리아 특이적인 T 세포에 대하여 10⁶ 비장 세포 당 IFN-γ 점 형성 세포(SFC)의 수로 표현한다.

세포내 시토킨 염색 어세이(ICS):

항원 특이적인 CD8+ 또는 CD4+T 세포의 수를 더 평가하고, 그 결과를 ELISPOT 어세이에서 얻어진 것과 상관시키기 위하여, ISC를 수행하고, 세포를 유동 세포계 분석에 의해 평가한다. 비장 세포를 백신 접종하고, 마우스의 컨트롤군을 SL8(OVA 특이적인 CD8+ 세포를 자극함) 또는 LLO₁₉₀(LLO 특이적인 CD4+ 세포를 자극함)으로 5 시간 동안 브레펠딘 A(파밍겐)의 존재 하에 항온처리하였다. 브레펠딘 A는 T 세포의 자극시 생성되는 시토킨의 분비를 억제한다. 비관련 MHC 부류 I 펩티드로 항온처리된 비장 세포는 콘트롤로서 사용한다. PMA(포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트, 시그마) 20 ng/㎖ 및 이오노마이신(시그마) 2 ㎍/㎖ 자극된 비장 세포를 IFN-γ 및 TNF-α 세포질내 시토킨 염색을 위한 양성 콘트롤로서 사용한다. 세포질 시토킨 발현의 검출을 위하여, 세포를 FITC-항-CD4 mAb(RM 4-5) 및 PerCP-항-CD8 mAb(53-6.7)로 염색하고, 고정하며, Cytofix/CytoPerm 용액(파밍젠)으로 투과시키고, PE 컨쥬게이트된 항TNF-α mAb(MP6-XT22) 및 APC 컨쥬게이트된 항INF-γ mAb(XMG 1.2)로 30 분 동안 얼음 상에서 염색한다. 세포내 IFN-γ 및/또는 TNF-α를 발현하는 세포의 백분율은 유동 세포계(FACSclibur, 벡톤 디킨슨 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에 의해 결정하고, 데이터는 CELLQuest 소프트웨어(벡톤 디킨슨 임뮤노사이토메트리 시스템)을 사용하여 분석하였다. 다양한 항체 상의 형광 표지는 FACScalibur에 의해 모두 구별할 수 있기 때문에, 적당한 세포는 항IFN-γ 또는 항TNF-α 중 어느 하나 또는 둘 다로 염색된 CD8+ 및 CD4+에 대해 게이팅함으로써 확인한다. 또한, 이 방법은 미생물 백신의 면역원성을 결정하는 데 사용될 수 있는데, 수지상 세포 집단 또는 다른 항원 제시 세포, 예컨대 대식세포 집단은 미생물 벡터로 항온처리한다. 생성된 항원 제시 세포를 마우스의 발에 주사하고, 림프절로부터의 세포 집단을 T 세포에 대해 상기와 같이 평가한다.

자극된 비장 세포의 시토킨 발현:

또한, 마우스의 비장 세포에 의한 시토킨 분비의 레벨은 콘트롤 및 백신 접종된 C57Bl/6 마우스에 대해 평가할 수 있다. 비장 세포를 24 시간 동안 SL8 또는 LLO₁₉₀으로 자극한다. 비관련 펩티드 HSV-gB²(인비트로겐, SSIEFARL, 서열 번호 4)에 의한 자극은 콘트롤로서 사용한다. 자극된 세포의 상청액을 수집하고, T 헬퍼-1 및 T 헬퍼 2 시토킨의 레벨은 ELISA 어세이(eBiosciences, CO) 또는 세포계 비드 어레이 키트(파밍겐)를 사용하여 결정한다.

세포독성 T 세포 활성의 평가:

OVA 특이적인 CD8+ T 세포는 그 세포독성 활성을 시험관내 또는 직접 C57Bl/6 마우스에게서 생체내 평가함으로써 더 평가할 수 있다. CD8+ T 세포는 항원 특이적인 방식으로 그 각각의 표적 세포를 인식하여 용해시킨다. 시험관내 세포독성은 크롬 방출 어세이를 사용하여 결정한다. 나이브 및 리스테리아-OVA(내부) 백신 접종된 마우스의 비장 세포는, OVA 특이적인 T 세포를 비장 세포 집단에서 늘리기 위하여 조사된 EG7.OVA 세포(OVA를 발현하도록 형질감염된 EL-4 종양 세포주, ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재로, 또는 100 nM SL8로 10:1 비율로 자극한다. 배양 7 일 후, 효과인자 세포의 세포독성 활성은 표적 세포로서 EG7.OVA 또는 SL8 펄스 EL-4 세포(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재) 및 음성 콘트롤로서 EL-4 세포 단독을 사용하여 표준 4 시간 ⁵¹Cr-방출 어세이로 결정한다. T 세포에 기인하는 활성을 NK 세포에 기인하는 활성과 구별하기 위하여 YAC-1 세포주(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재)를 표적으로서 사용하여 NK 세포 활성을 결정한다. 특이적인 세포독성의 백분율은 100 x (실험적 방출 -자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출)로서 산출한다. 자발적 방출은 효과인자 세포없이 표적 세포의 항온처리에 의해 결정한다. 최대 방출은 0.1% 트리톤 X-100으로 세포를 용해시킴으로써 결정된다. 실험은 자발적 방출이 최대 방출의 <20%인 경우에 분석에 유효한 것으로 간주한다.

OVA 특이적인 CD8+ T 세포의 생체내 세포독성 활성의 평가를 위하여, 나이브 C57Bl/6 마우스로부터의 비장 세포를 2 당량 분액으로 분할한다. 각각의 군은 특이적인 펩티드, 즉 표적(SL8)이나 콘트롤(HSV-gB²)로 0.5 ㎍/㎖에서 90 분 동안 37℃에서 펄스화한다. 그 다음, 세포를 배지 내에서 3회, 그리고, PBS + 0.1% BSA 내에서 2회 세척한다. 세포를, 카르복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE, 몰레큘라 프로브스, 미국 오레곤주 유진 소재)로 표지화하기 위하여 가온된 PBS + 0.1% BSA(10 ㎖ 이하) 중에 ㎖ 당 1 x 10⁷로 재현탁시킨다. 표적 세포 현탁액에 CFSE의 5 mM 스톡 1.25 ㎕를 가하고, 샘플을 와류 혼합한다. 콘트롤 세포 현탁액에, CFSE 스톡의 10 배 희석액을 가하고, 샘플을 와류 혼합한다. 세포를 37℃에서 10 분 동안 항온처리한다. 염색을 대용적(>40 ㎖)의 빙냉 PBS를 첨가함으로써 중지시킨다. 각각의 세포 현탁액을 ㎖ 당 50 x 10⁶으로 희석시키고, 각각의 집단 100 ㎕를 혼합하며, 나이브 또는 백신 접종된 마우스의 꼬리 정맥에 주사한다. 12 내지 24 시간 후, 비장을 수거하고, 총 5 x 10⁶ 세포를 유동 세포계에 의해 분석한다. 고(표적) 및 저(콘트롤) 형광 피크를 계산하고, 둘의 비율을 사용하여 표적 세포 용해의 백분율을 구한다. 시험관내 세포독성 어세이는 시험관내 재자극의 필요성없이 항원 특이적인 T 세포의 용해 활성을 평가할 수 있다. 또한, 이 어세이는 그 원래의 환경에서 T 세포 기능을 평가한다.

실시예 6

S-59 처리 유무 하에 리스테리아 DP-L4056으로 백신 접종한 마우스로부터의 비장 세포의 ELISPOT 및 ICS 분석

OVA 항원 유무하의 리스테리아 균주 DP-L4056을 S-59 처리 유무 하에 제조하고, 실시예 4에서와 같이 C57Bl/6 마우스를 백신 접종하는 데 사용하였으나, 다만 투여는 정맥내로 하였다. 백신 접종은 표 7 및 8에 나타낸 투여량으로 나이브 마우스에 행하였다. 비장을 백신 접종 후 12일째에 수거하였다. 비장을 실시예 5에서와 같이 ICS 및 ELISPOT 어세이에 의해 평가하였다. 또한, LD50을 이러한 리스테리아에 대하여 평가하였다. LLP₁₉₀ 특이적인 CD4⁺ T 세포 및 OVA 특이적인 CD8⁺ T 세포에 대한 ICS 어세이 결과는 TNF-α 및 IFN-γ 둘 다에 양성인 세포의 백분율에 관하여 표 7 및 도 6a, b에 제공한다. ELISPOT 어세이는 2 x 10⁵ 비장 세포 당 IFN-γ SFC에 관하여 표 8 및 도 7에 제공한다. 이러한 결과는 OVA를 가진 S-59 처리된 샘플, 비S-59 처리된 샘플의 100 배 과량으로 투여될 때 OVA 특이적인 반응을 자극한다는 것을 가리킨다. 양성 OVA 특이적인 반응이 저 투여량에서 관찰되지는 않아도, 이는 여전히 증가된 안전성 이점을 제공하는데, 그 이유는 S-59 처리된 샘플이 4 로그 약화되었기 때문이다. 또한, LD50은 미처리 샘플에 비하여 처리된 S-59에 대해 10³ 배 더 높았는데, 이는 100 배 더 높은 레벨로 투약하더라도, 미처리 리스테리아에 비하여 안전성이 10 배 수준이라는 것을 가리킨다.

실시예 7

유전자 교환으로부터 uvr AB의 결실에 대한 pKSV7-dlBsrFI uvr AB의 구성

소라렌 및 UVA 광 처리에 의해 유도된 DNA에 대한 손상을 수복할 수 없는 리스테리아의 돌연변이 균주를, 리스테리아 내 자외선 내성(uvr)AB 유전자(uvrAB)를 실질적으로 결실시킴으로써 생성하엿다. 리스테리아로부터의 uvrAB의 결실은 유전자 교환에 의해 달성하였다[Camilli et al., Molecular Microbiology 8:143-147 (1993)]. uvrAB가 임의의 리스테리아 균주로부터 결실될 수 있는 예로서 uvrAB를 표 9에 나타낸 리스테리아 모노시토게네스로부터 결실하였다.

uvrA 및 uvrB 유전자는 UV 및 다른 시약에 의해 가해진 DNA 손상의 리스테리아 및 다른 박테리아 균주 내 뉴클레오티드-삭제 수복(NER)에 요구되는 ABC 엑시뉴클레아제 복합체의 3 개의 단백질 중 2 개를 암호화한다. uvrA 및 uvrB 유전자는 리스테리아 게놈 내 동일한 오페론을 포함하고, 따라서 표 9에 나타낸 리스테리아 균주에서 함께 결실되었다. uvrA 유전자는 리스테리아 nts. 2562547에서 2565461로 매핑되고(서열 번호 5), uvrB는 리스테리아 nts. 256469에서 2567459로 매핑된다(서열 번호 6)[Glaser et. al., Sience 294: 849-852 (2001)]. 유전자 교환에 의해 uvrAB를 결실하기 위하여, 각각 uvrAB의 상류 및 하류에 대략 900 염기쌍(bp)이 있었다. 리스테리아 uvrAB 앰플리콘은 PCR 프라이머 Lm-2561677F(서열 번호 7) 및 Lm-2568330R(서열 번호 8) 그리고 주형으로서 DP-L4056d을 사용하여 발생하였으며, 6654 염기 bp 길이이고, 리스테리아 nts. 2561677-2568330(서열 번호 9)을 포함한다. 리스테리아 야생형 균주 DP-L4056을 밤새도록 30℃에서 뇌심 주입 브로스(BHI, 디프코)에서 배양하고, 10 ㎕의 세척된 박테리아 현탁액(3 ㎖ 하룻밤 배양물을 원심분리하고, 5 ㎖ PBS 중에 재현탁시켰으며, 재원심분리하고, 이어서 PBS 1 ㎖에 리스테리아 펠렛을 최종 재현탁시킴으로써 제조함)을, 최종 부피가 100 ㎕인 PCR 반응물에 가하였으며, 공급자의 권장에 따라서, 0.2 μM의 각각 Lm-2561677F 및 Lm-2568330R 프라이머, 2 ㎕의 Vent DNA 폴리머라제(뉴잉글랜드 바이오랩스)를 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충제 및 MgSO₄도 함유하였다. 성공적인 PCR은 에티듐 브로마이드로 염색한 후 상이한 6654 bp 밴드의 존재에 의해 나타난 바와 같이, TAE 완충제 내 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하고, UV 광을 이용한 조사에 의해 가시화하였다. 앰플리콘 생성물은 GeneClean(Qbiogene, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하여 50 ㎕의 최종 부피로 PCR 반응으로부터 정제하였다. 이어서, 앰플리콘을, 결찰 혼합물 내 정제된 uvrB의 5 ㎕를 사용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(인비트로겐, 미국 칼스바드 소재)에 삽입하였다. 제한 효소는 뉴잉클랜드 바이오랩스(미국 매사츄체츠주 베벌리 소재)에서 구입하였다. pCR2.1-TOPO-uvrAB 플라스미드의 정확한 구성은 BsrFI에 의한 분해(뉴잉글랜드 바이오랩스), 이어서 1% 아가로스/TAE 전기영동에 의해 행하고, 4612, 1388, 1094, 181, 886 및 2424 염기쌍의 단편을 얻었다.

pCR2.1-TOPO-uvrAB 플라스미드를 연속적으로 사용하여 유전자 교환에 대한 플라스미드를 생성하였으며, 여기서 uvrAB(4612 bp)의 nts 2562709 내지 2567320이 결실되었다. 재조합 플라스미드 구성을 위한 모든 제한 효소 및 T4 DNA 리가제는 뉴잉글랜드 바이오랩스에서 입수하였다. uvrAB 서열의 결실을 달성하기 위하여, pCR-TOPO/uvrAB 플라스미드(대략 2 ㎍)의 1 분취물을 HindIII, BsrFI 및 BglII로 분해하고, 1092 염기쌍 단편을 1% 아가로스/TAE 겔 전기 영동 및 GeneClean에 의해 정제하였다. 병행하여, 제2 분취물(대략 2 ㎍)을 XhoI, BsrFI 및 BglII 효소로 분해하고, 1050 염기쌍 단편을 1% 아가로스/TAE 겔 전기영동 및 GeneClean에 의해 정제하였다. 융화성 BsrFI 말단을 함유하는 두 개의 1092 bp 및 1050 bp 단편을 함께 결찰하고, 2142 bp 결찰 산물은 GeneClean을 사용하여 정제하였다. 2142 bp 결잘 산물 중 일부분을 PstI로 분해하고, 1486 단편을 1% 아가로스/TAE 겔 전기영동 및 GeneClean으로 정제하였다. 2142 bp 결찰 산물의 제2 부분을 KpnI 및 PstI로 분해하고, 622 bp 단편을 1% 아가로스/TAE 겔 전기영동 및 GeneClean에 의해 정제하였다. 유전자 교환용 모체 플라스미드 벡터, pKSV7[Camilli etl al., Molecular Microbiology 8:143-147 (1993)]을 KpnI 및 PstI로 분해하고, 소 내장 알칼리성 포스파타제(CIAP, 뉴잉글랜드 바이오랩스)로 처리하였으며, KpnI 및 PstI 융화성 말단을 가진 622 bp 단편을 pKSV7 플라스미드 벡터에 삽입하여 pKSV7-K/P-338을 얻었다. 이어서, PstI 융화성 단편을 가진 1486 bp 단편을, PstI로 분해하고, CIAP로 처리한 벡터 구성물 pKSV7-K/P-338에 삽입하였다. 정확한 배향에서 1486 bp 구성물의 삽입은 KpnI 및 HindIII에 의한 분해에 결정하여 1253 bp, 865 bp 및 6.9 kb의 단편 크기를 얻었다. 이 플라스미드 구성물은 pKSV7-dlBsrFI uvrAB로 알려져 있다. 리스테리아 pKSV7 재조합 플라스미드의 dlBsrFI uvrAB 부분을 서열 결정하여 리스테리아 서열의 적합도 및 nts. 2562709 내지 2567320의 uvrAB 내 정확한 결실(uvr 배위 nts. 2562547에서 2567459의 결실)을 검증하였다. 결실된 영역은 서열 번호 10이고, 잔존하는 앰플리콘 서열은 서열 번호 11에 제공한다.

리스테리아 균주 DP-L4056, DP-L4017 및 DP-L4029의 uvrAB 유전자(표 9)는 전술한 바와 같이[Camilli etl al., Molecular Microbiology 8:143-147 (1993)] 플라스미드 pKSV7-dlBsrFI uvrAB를 사용하여 유전자 교환에 의해 결실하였다. 플라스미드 pKSV7-dlBsrFI uvrAB를 전기영동에 의해 리스테리아 균주 DP-L4056, DP-L4017 및 DP-L4029에 도입하였다. 리스테리아 균주는 37℃에서 진탕하면서 BHI 내 분리된 박테리아 콜로니로부터 10 ㎖ 하룻밤 배양물을 먼저 성장시킴으로써 전기영동에 적합하게 한다. 그 다음, 각각의 균주의 로그상 배양물은 250 ㎖ 플라스크 내에 100 ㎖ 0.5 M 수크로스/BHI(멸균 여과됨)에 하룻밤 배양물 2 ㎖를 접종함으로써 유도하였다. 배양물은 OD₆₀₀ = 0.2의 박테리아 밀도에 도달할 때까지 2 내지 3 시간 동안 37℃에서 진탕함으로써 중간 로그상으로 성장시켰다. 이어서, 배양물을 처리하여 스페로플라스트로 알려진, 펩티도글리칸 세포벽이 결여된 박테리아를 생성하였다. 페니실린 G 스톡 용액(10 mg/㎖, 멸균 여과됨) 100 uL을 중간 로그상 배양물에 가한 후, 37℃에서 2 시간 동안 진탕하였다. 스페로플라스트 배양물을 100 ㎖ 원심분리 병에서 펠렛화하고, 빙냉 HEPES/수크로스 스톡 용액(1 mM HEPES, pH7.0/0.5 M 수크로스, 멸균 여과됨) 45 ㎖로 재현탁하고, 원심분리에 의해 다시 펠렛화하였다. 박테리아 펠렛을 HEPES/수크로스 20 ㎖로 재현탁하고, 40 ㎖ 원심분리 관에 옮겼으며, 펠렛화하고, 10 ㎖ HEPES/수크로스에 재현탁하였다. 그 다음, 10 mg/㎖ 리소자임 스톡 100 ㎕를 박테리아 용액에 가하고, 철저히 혼합하였으며, 배양물을 15 분 동안 37℃에서 진탕하지 않고 항온처리하였지만, 5 분 간격으로 완만하게 2회 뒤집었다. 그 다음, 리소자임 처리된 배양물을 5000 rpm(3000 x g)에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심분리하고, 10 ㎖ HEPES/수크로스에 재현탁시켰으며; 이 과정을 2회 반복하였으며, 매번 신중하고 철저하게 재현탁하였다. 전기적합성 리스테리아를 얻기 위한 최종 단계는 500 ㎕ HEPES/수크로스 내에 박테리아 펠렛을 재현탁하는 것이었다.

전기영동을 위하여, pKSV7-dlBsrFl uvrAB 플라스미드 DNA 2 ㎍을 DP-L4056, DP-L4017 및 DP-L4029 전기적합성 리스테리아 10 ㎕에 가하고, 용액을 0.1 cm 큐벳에 가하였다. 큐벳을 전기영동 장치에 넣고, 1 KV, 400 옴 및 25 μFD로 설정한 다음, 펄스화하였다. 통상적으로, 이는 약 5 밀리초의 시간 상수를 가져왔다. 세포를 즉시, 30℃로 예비 가온한 1 ㎖ BHI/수크로스 배지에 가한 다음, 1 시간 동안 30℃에서 진탕없이 항온처리하였다. 항온처리 기간 후, 박테리아를 펠렛화하고, BHI 브로스 200 ㎖에 재현탁하였으며, 현탁액을, 10 ㎍/㎖ 클로르암페니콜(BHI/CM10)을 함유하는 BHI 한천에 놓았다. 그 다음, 플레이트를 30℃에서 밤새도록 항온처리한 후, pKSV7-dlBsrFI uvrAB 플라스미드 형질전환체에 해당하는 콜로니를 가시화하였다. 플라스미드 pKSV7은 온도 민감성 리스테리아 레플리콘을 함유하고, 따라서 클로르암페니콜 내성 콜로니를 가시화하기 위하여 플레이트는 30℃에서 항온처리하여야 한다.

uvrAB 내 4612 bp 결실을 함유하는 pKSV7-dlBsrFI uvrAB 플라스미드로 전기영동함으로써 형질전환된 리스테리아 균주 DP-L4056, DP-L4017 및 DP-L4029 내 나이브 uvrAB의 유전자 교환은 전술한 바와 같이[Camilli etl al., Molecular Microbiology 8:143-147 (1993)] 플라스미드 통합, 이어서 플라스미드 제거(나이브 uvrAB를 포함함) 및 경화로 구성된 2 단계로 수행하였다. pKSV7-dlBsrFI uvrAB 플라스미드로 전기영동된 리스테리아 균주 DP-L4056, DP-L4017 및 DP-L4029 각각으로부터 새성된 두 개의 단리된 클로르암페니콜 내성 콜로니를 선택한 다음, 각각의 선택된 콜로니를 새로운 BHI/CM10 플레이트에서 스트리킹하고, 30℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 그 다음 날, 콜로니를 각각의 플레이트 중에서 선택하고, 250 ㎖ 플라스크 내에 함유된 BHI/CM10 10 ㎖를 접종하는 데 사용하였으며, 그 후 새로운 BHI/CM10 배지(1:1000 희석) 10 ㎖를 접종하는 데 사용한 다음, 배양물이 정상 상태에 도달할 때까지 진탕하면서 41℃에서 성장시켰다. 10 ㎕ 샘플링한 후, 플라스미드 제조를 나머지 하룻밤 리스테리아 배양물로 수행하여 pKSV7-dlBsrFI uvrAB 플라스미드 DNA의 존재를 확실히 하였다. 정상 상태에 도달하면, 배양물 10 ㎕를 사용하여 41℃로 예비 가온한 새로운 BHI/CM10 배지 10 ㎖를 접종한 다음, 진탕하면서 41℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 그 다음, 샘플을 각각 41℃ 하룻밤 배양물에서 취하고, 41℃로 예비 가온한 BHI/CM10 플레이트 상의 분리된 콜로니를 스트리킹하는 데 사용하였다. 플라스미드 pKSV7이 온도 민감성 리스테리아 레플리콘을 함유하고 있기 때문에, 41℃ 항온처리는 리스테리아 게놈 내에 나이브 uvrAB 유전자를 가진 pKSV7-dlBsrFI uvrAB 플라스미드의 상동 재조합을 통한 통합, 및 따라서 박테리아 세포 성장 및 분화를 통한 클로르암페니콜 약물 내성 마커의 증폭 및 발현으로부터 생기는 콜로니에 대해서 선택한다. 이 점에서, 리스테리아 균주는 pKSV7-dlBsrFI uvrAB 플라스미드의 상동 재조합에 의한 통합으로부터 생기는, 나이브 uvrAB 유전자 및 4612 bp 결실된 uvrAB 유전자로 구성된 uvrAB 유전자에 대한 메로디플로이드이다.

pKSV7 플라스미드를 사용하여 나이브 uvrAB 유전자의 제거 및 경화를 위하여, 단일 콜로니를 상기 단계로부터 41℃에서 항온처리된 BHI/CM10 플레이트 각각으로부터 선택하였으며, 클로르암페니콜없이 BHI 배지 10 ㎖를 접종하는 데 사용한 다음, 30℃에서 밤새도록 진탕하면서 항온처리하였다. 그 다음, 배양물을 클로르암페니콜을 함유하지 않는 새로운 BHI 배지 10 ㎖ 중에 1:1000으로 희석한 다음, 30℃에서 6 시간 동안 진탕하면서 밤새도록 항온처리하였다. 이 단계를 2회 반복하였다. pKSV7 플라스미드 레플리콘에 투과성인 온도에서 약물 선택적 압력없이 수 세대동안 메로디플로이드 중간 균주의 계대시, 통합된 pKSV7 플라스미드의 자발적 제거가 일어나고, 박테리아로부터 사전에 플라스미드의 궁극적인 경화가 일어난다[Camilli etl al., Molecular Microbiology 8:143-147 (1993)]. 제3 1:1000 희석 및 6 시간 항온처리 기간 후, 각 배양물로부터 샘플을 취하고, 37℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 100 개의 분리된 콜로니를 이쑤시게로 각각의 BHI 플레이트 중에서 선택하고, 5 mM 길이의 스트릭을 먼저 BHI/CM10 플레이트, 이어서 BHI 플레이트에서 각각의 콜로니로 만들었다. 플레이트는 그리드를 사용하여 표지하여 BHI/CM10과 BHI 플레이트의 각각의 정합된 쌍이 복제되도록 하엿다. BHI/CM1O 및 BHI 복제 플레이트를 밤새도록 37℃에서 항온처리하였다. pKSV7-dlBsrFI uvrAB 플라스미드 DNA를 가진 DP-L4056, DP-L4017 또는 DP-L4029를 이용한 전기영동으로부터 두 개의 클로르암페니콜 내성 콜로니로부터 기원하는 BHI/CM10 및 BHI 플레이트 상에 놓인 콜로니 복제물의 대략 5%는 약물 민감성이었다(즉, BHI 플레이트 상에서만 성장). 이러한 약물 민감성 콜로니는 uvrA 내 4612 bp 결실을 함유하는 후보를 나타내었다. 각각의 약물 내성 콜로니를, BHI/CM10 및 BHI 플레이트 상의 단리된 콜로니에 대해 재스트리킹하고, 37℃에서 밤새도록 항온처리하여 후보 클론이 순수하고 약물 민감성이 되게 하였다. 클로르암페니콜 민감성 클론은 프라이머 Lm-2561677F 및 Lm-2568330R(동일 장소)을 사용하여 PCR을 수행하여 uvrAB 결실을 함유하는 클론을 동정하였다. 나이브 AB 유전자를 가진 클론의 앰플리콘 크기는 6654 bp였으며, 결실된 uvrAB의 앰플리콘 크기는 2042 bp였는데, 클로르암페니콜 민감성 클론의 약 50%도 결실된 uvrAB 유전자를 함유하였다. DP-L4056, DP-L4017 및 DP-L4029로부터 유도된 uvrAB 결실된 균주의 두 클론을 추가 특성화를 위해 선택하였다. 글리세롤 스톡(멸균 LB/40% 글리세롤로 희석된 30℃ 하룻밤 배양물)을 각각의 uvrAB 돌연변이체 균주에 대해 제조하였으며, -80℃에서 저장하엿다. 이들 균주는 표 10에 나타낸 바와 같이 알려져 있다. DP-L4029 uvrAB(actA/uvrAB)는 2003년 10월 3일 ATCC에 PTA-5563으로 기탁되었다.

S-59 소라렌 및 UVA 광에 의한 약독에 대한 증가된 민감성을 설명하기 위하여 표 10에 나타낸 uvrAB 돌연변이체 리스테리아 균주의 1 x 109 CFU의 제조물을 2, 20, 100 및 500 nM S-59(L4017/uvrAB 및 L4056/uvrAB) 또는 2, 10, 20 및 100 nM S-59(L4017/uvrAB의 클론 1 및 L4029/uvrAB의 두 클론)으로 처리하고, 6 J/㎠(FX1019)의 조사량으로 UVA를 조사하였으며, 정확하게 실시예 1에 기재된 바와 같이 BHI 플레이트에 희석물을 넣음으로써 생존가능성에 대해 테스트하였다. 이 연구의 결과는 표 11A-B(S-59 투여량의 함수로서 로그 약독) 및 도 8a-b(S-59 투여량의 함수로서 잔존하는 로그 역가)에 나타낸다. 결과는 표 10에 나타낸 DNA NER 수복 돌연변이체 균주가 모체 균주와 비교하였을 때 소라렌 및 UVA 조사로 과화학적 약독에 극적으로 보다 민감하게 되었다. 이 데이타는 S-59 소라렌의 유의적이고 실질적으로 더 낮은 레벨을 사용하여 동종 동계 대응부와 비교하였을 때 동일한 정도로 uvrAB 돌연변이체 박테리아를 비활성화시킬 수 있다는 명백한 증거를 제공한다.

uvrAB 돌연변이 균주를 악성 또는 전염성 질환과 관련된 이종 항원을 암호화하는 발현 카세트를 통합하기 위한 모체 균주로서 직접 사용할 수 있다. 이 구조에서, S-59 및 UVA 광에 의한 광화학적 약독 후에, 박테리아는 MHC 부류 I 제한 반응을 프로그램하는 능력을 유지하는데, 그 이유는 그 DNA를 복제하는 능력이 가교에 의해 폐기되는 반면에, 유전적 보체를 발현하는 능력은 필수적으로 그대로 남아있기 때문이다. 또한, 백신 투약을 포함하는 박테리아 게놈의 집단에 관하여 uvrAB 돌연변이체를 비활성화시키기 위한 유의적으로 더 적은 DNA 가교 결합의 요건의 결과로서, 임의의 한 게놈의 발현은 소정의 유전자에서 발현의 간섭이 거의 없게 하는 낮은 레벨의 DNA 가교 결합에 기인하여 유의적으로 영향을 받지는 않을 것이다. 최종적으로, uvrAB 돌연변이는 광화학적 및 유전학적 약독을 조합하는 안전하고 효과적인 백신 플랫폼을 유도하기 위하여 임의의 다른 약화 돌연변이(들)와 조합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성에서, uvrA, uvrB 또는 uvrC 유전자, 또는 NER에 수반되는 임의의 리스테리아 유전자 단독 또는 임의의 조합이 단백질의 기능성 형태를 발현하지 않도록 돌연변이될 수 있다. 이러한 조성을, 백신 접종된 개체에서 야생형 병원체와의 챌린지에 대하여 보호하기 위하여 선택된 박테리아 병원체로부터 유도된 안전하고 효과적인 백신을 유도하기 위한 접근법으로서 사용될 수 있다. 대안으로, 이러한 조성은 임의의 선택된 감염성 또는 악성 질환에 관한 이종 항원의 발현에 대한 안전하고 효과적인 재조합 백신 플랫폼을 유도하기 위한 접근법으로서 사용될 수 있다.

실시예 8

대립형질 교환 또는 부위-특이적 통합 벡터에 의한 선택된 리스테리아 ( Listeria) 균주의 게놈으로의 항원 발현 카세트의 삽입

실시예 7에 설명된 균주, 어떤 선택된 리스테리아 (Listeria)균주, 또는 어떤 박테리아 균주는 악성 또는 감염성 질환에 관련된 이종 단백질이나 항원을 발현하도록 더 변형될 수 있다. 이종 단백질의 발현은 선택된 숙주 박테리아와 양립할 수 있는 레플리콘을 함유하는 플라스미드에 의해 일어날 수 있으며 이로써 플라스미드는 안정하게 유지된다. 또 다르게는, 원핵생물 발현 카세트가 실시예 7에 설명된 대립형질 교환을 포함하는 다양한 방법을 사용하거나, 또는 선택된 트랜스포존 또는 박테리오파지로부터 유래된 무작위적으로 또는 부위-특이적으로 통합하는 벡터를 사용하여 숙주 박테리아의 게놈에 안정하게 통합될 수 있다.

예로서, 리스테리오파지 PSA(ScottA로부터의 파지)로부터 유래된 pPL2로 알려진 부위-특이적 통합 벡터를 이용함으로써, 실시예 7에 설명된 uvrAB 뉴클레오티드 절단 수복(NER) 돌연변이 균주로부터 유래된 재조합 Listeria monocytogenes를 유도하는 것이 여기에 설명된다[Lauer 등, J. Bacteriol. 184: 4177-4186 (2002)]. 구체적으로는, pPL2 통합 벡터는 분비 신호와 PEST 서열은 포함하지만[Decatur and Portnoy, Science 290: 9 92-995 (2000)] 헤몰리신 활성은 없는 OVA와 프레임내 융합되는 리스테리오리신 O(LLO)의 아미노-말단 반과의 융합 파트너로서 닭 오브알부민(OVA) 모델 항원을 발현하도록 조작된다. 절형 LLO-OVA 융합 단백질 발현은 LLO를 포함하는 리스테리아 (Listeria) 독성 유전자의 발현을 유도하는 prfA-의존성 프로모터인 hly 프로모터에 의해 유도된다. 이 벡터는 pPL2/LLO_ss-PEST-OVA로 알려져 있다. pPL2 벡터는 성공적인 통합시 tRNA 유전자의 자생 서열이 회복됨으로써 그것의 자생 발현된 기능이 원래대로 유지되는 방식으로 리스테리아 (Listeria)의 tRNA^Arg 유전자 내로 통합된다.

pPL2/LLO_ss _-PEST-OVA 구성의 제 1 단계는 DP-L4056 야생형 리스테리아 (Listeria) 게놈 DNA로부터 hly 프로모터와 LLOss-PEST 서열을 함께 증폭시키는 것으로, 이것은 포워드 프라이머 KpnI-LLO nts.1257-1276(SEQ ID NO:12)와 리버스 프라이머 XhoI-LLO1665R (SEQ ID NO:13)의 프라이머 쌍을 사용하는 PCR에 의해 수행된다. 426bp 증폭체를 GeneClean으로 정제하고 KpnI와 XhoI로 소화시키고 KpnI와 XhoI로 소화시킴으로써 제조된 pPL2 플라스미드로 리게이션하고 송아지 장의 알칼리성 포스파타제(CIAP)로 처리하고 GeneClean으로 정제한다. LLO_ss-PEST 서열을 함유하는 정확한 플라스미드를 KpnI와 XhoI로 소화시켜 확인하고 1% 아가로스/TAE 전기영동하여 418bps와 6112bps의 DNA 단편을 얻는다. 이 중간체 플라스미드 DNA 구성물은 pPL2/LLO_ss-PEST-OVA라고 알려져 있다.

당업자에 의해 사용되는 많은 플라스미드, 예를 들어 DP-E3616 E. coli로부터의 pDP3616 플라스미드 DNA[Higgins 등, Mol. Molbiol. 31: 1631-1641 (1999)]으로부터의 포워드 프라이머 XhoI-NcoI OVA cDNA nts.174-186(SEQ ID NO:14)와 리버스 프라이머 Xhol-NotI-HindIII(SEQ ID NO:15)의 프라이머 쌍을 사용하는 PCR에 의해 OVA 서열이 증폭될 수 있다.

1013bp 증폭체를 GeneClean으로 정제하고 XhoI와 NotI로 소화시키고 XhoI와 NotI로 소화시킴으로써 제조된 pPL2/LLO_ss-PEST 플라스미드로 리게이션하고 CIAP로 처리하고 GeneClean으로 정제한다. LLO_ss-PEST와 OVA 서열을 함유하는 정확한 플라스미드를 KpnI, XhoI 및 NotI로 소화시켜서 확인하고 1% 아가로스/TAE로 전기영동하여 994bps, 1560bps, 및 6039bps의 DNA 단편을 얻는다. 플라스미드 pPL2/LLO_ss-PEST-OVA의 LLO와 OVA 영역의 정확한 예상 서열은 서열화에 의해 확인된다.

실시예 7에 설명된, 정확히는 이전에 설명된 방법[Lauer 등, J. Bacteriol. 184, 4177-4186(2002)]에 따라서, pPL2/LLO_ss _-PEST-OVA 플라스미드를 선택된 리스테리아 (Listeria) uvrAB 돌연변이 균주의 게놈에 있는 tRNA^Arg 유전자에 통합한다. 간단히 말하자면, 먼저 전기천공이나 화학적 수단에 의해 플라스미드 pPL2/LLO_ss-PEST-OVA를 E. coli 숙주 균주 SM10(Simon 등, Bio/Technology 1: 784-791 (1983)]에 도입한다. 이어서 pPL2/LLO_ss-PEST-OVA 플라스미드를 콘쥬게이션에 의해 형질변형된 SM10으로부터 선택된 리스테리아 (Listeria) 균주로 이전시킨다. 설명된 대로 ml 당 7.5㎍의 클로르암페니콜과 ml 당 200㎍의 스트렙토마이신을 함유하는 약물-선택적 BHI 아가 플레이트 상에서 인큐베이션한 후에 선택된 콜로니를 동일한 조성을 갖는 플레이트 위를 3회 통과시켜 정제한다. 파지 부착 부위에 pPL2 벡터가 통합된 것을 확인하기 위해서 각 콜로니를 조금 집어서 포워드 프라이머 NC16(SEQ ID NO:16)와 리버스 프라이머 PL95(SEQ ID NO:17)의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR로 스크리닝한다. 선택된 리스테리아 (Listeria) uvrAB 돌연변이 균주의 게놈에 있는 tRNA^Arg 유전자에 통합된 pPL2/LLO_ss-PEST-OVA 플라스미드를 갖는 선택된 콜로니는 499bps의 진단 DNA 증폭체를 산출할 것이다.

pPL2/LLO_ss _-PEST-OVA의 안정한 통합체를 품고 있는 재조합 리스테리아 (Listeria) uvrAB 돌연변이가 항원제시세포에 의해 흡수될 수 있는 능력과 이어지는 MHC 클래스 I 경로에 의한 OVA의 프로그램 제시를 실시예 1에 설명된 클론된 C57B1/6-유래 수지상 셀라인 DC2.4를 사용하여 시험한다. 리스테리아 (Listeria)의 포식작용 후에 클래스 I 분자 상의 DC2.4 세포에 의한 OVA 펩티드의 제시를 실시예 1에 설명된 대로 B3Z와의 인큐베이션 후에 측정한다. 이들 과정으로 재조합 리스테리아 (Listeria) uvrAB가 기능적이며 본원에 포함된 실시예들에 설명된 대로 더 사용될 수 있음이 확인된다.

따라서, 이 실시예는 uvrAB 유전자 내에 결실을 함유하는 DNA 수복 돌연변이 리스테리아 (Listeria) 균주에 선택된 감염성 및 악성 질환에 관련된 어떤 바람직한 항원(들)을 암호화하는 원핵생물 발현 카세트를 도입하기 위한 지침을 제공한다. 상기 재조합 리스테리아 (Listeria) 균주는 실시예 1에 설명된 대로 소라렌으로 처리되어 불활성화될 수 있으며, 예를 들어 감염성 및 악성 질환의 예방 및 치료 백신을 포함하는 다양한 적용분야에 계속 사용될 수 있다.

실시예 9

뉴클레오티드 절단 수복(NER) 돌연변이로부터 유래된 박테리아 백신

본 특허에 설명된 실시예는 감염성 및 악성 질환에 관련된 항원을 암호화하는 재조합 송달 플랫폼의 광화학적 처리를 통한 게놈 비활성화를 이용한 백신 조성물의 효능을 예시한다. 이 조성물에 따르면, 게놈은 비활성화되어 복제 동안 분리될 수 없는 반면 전사 프로파일은 큰 손상 없이 그대로 유지되어, 그 결과 백신접종된 개체에서 새롭게 항원이 발현되고 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL)을 포함하는 최적의 병원균-특이적 면역반응이 유도된다. 더욱이, 실시예 7에 설명된 대로, DNA 뉴클레오티드 절단 수복(NER) 기구가 조작된 유전자 결실에 의한 것을 포함하는 많은 수단에 의해서 비활성화된 이 조성물에 있는 백신 플랫폼을 이용함으로써, 이들 돌연변이의 광화학적 비활성화에 대한 민감성이 비약적으로 증가된다.

백신 용량을 포함하는 박테리아 게놈 집단의 관계에서, DNA 수복 돌연변이를 비활성화하기 위해서 현저히 더 적은 DNA 교차결합이 필요하기 때문에, 그 결과 어떤 한 유전자의 발현은 낮은 수준의 DNA 교차결합으로 인해 그다지 영향받지 않을 것이므로, 본질적으로 이 주어진 유전자에서는 발현이 중단되지 않을 것이다.

따라서, 병원균로부터 유래된 박테리아 플랫폼을 이용한 유전자-기제 백신의 전체적인 효용은 광화학적 비활성화와 NER이 결여된 벡터를 조합함으로써 비약적으로 증가될 것이다. 비활성화된 백신은 질환을 일으킬 수는 없지만, 벡터-발현 이종 항원에 대해 특이적인, T-세포 매개 세포 면역성을 포함하는 효능 있는 면역성을 유도하는 효과적인 능력은 여전히 보유하고 있다. 더 나아가, uvrAB 돌연변이는 어떤 다른 약화된 돌연변이(들)과 조합될 수 있으며, 이로써 광화학적인 약화와 유전적인 약화가 조합된 안전하고 효과적인 백신 플랫폼을 유도할 수 있다.

유의하게도, 이들 조성물은 선택된 박테리아 병원균로부터 유래된 안전하고 효과적인 백신을 유도하기 위한 접근법으로서 사용될 수 있으며, 이로써 백신접종된 개체를 야생형 병원균을 사용한 시험감염에 대해 예방할 수 있다. 이런 용도에 따르면, 백신을 받은 특정한 개체에서 반응성과 질환 발병의 가능성이 높게 유지되기 때문에, 많은 경우에 약화된 살아 있는 형태의 병원균로부터 유래되는 안전하고 효과적인 백신을 유도하는 것이 가능하지 않다. 선택된 박테리아 병원체에 관련된 서브유닛 또는 비활성화된 백신은 안전할 수는 있지만, 한편 이들 백신은 상기 병원균의 야생형 형태를 사용한 시험감염에 대해 백신접종된 개체를 예방하는데 요구되는 병원균-특이적 면역반응의 폭, 깊이 및 내구성을 효과적으로 도출하지 못하기 때문에 주로 비효과적이다. 따라서, 본 분야에서는 예방되는 백신접종된 개체에서 면역반응의 종류를 도출하는 효과적인 능력과 안전성이 조합된 백신 조성물에 대한 명백한 필요성이 잘 알려져 있다.

이와 같이, 병원성 미생물의 뉴클레오티드 절단 수복(NER) 경로에 있는 돌연변이는 백신접종되지 않은 개체에서 질환을 일으키는데 충분한 양의 상기 미생물로 백신접종된 개체에서 시험감염에 대한 예방을 도출하는 안전하고 효과적인 백신에 사용될 수 있는 조성물을 제공한다. NER은 ABC 엑시뉴클레아제로 알려진 3가지 서브유닛으로 제조된 ATP-의존성 뉴클레아제에 의해 촉매되고, uvrA, uvrB, 및 uvrC 유전자에 의해 암호화된다. 3개의 uvr 유전자 중 어느 1개 또는 1개 이상에 있는 돌연변이는 소라렌과 UVA 광을 이용한 광화학적 비활성화에 극도로 민감한 병원성 유기체의 미생물을 포함하는 세포를 가져온다.

예로서, 탄저병의 병인인 Bacllus anthracis(B. anthracis)의 uvr 유전자의 돌연변이가 제공된다. 현재 인체용으로 허가된 무세포 탄저병 백신은 명반 수산화물에 흡착(U.S.백신)되거나 또는 명반 인산염과 함께 침전(U.K.백신)된 약화된 B. anthracis의 멸균 배양 상청액에 기초하고 있다. 이들 백신은 다소 약하기 때문에 예방을 위해서 적어도 6회의 백신접종과 매년의 추가접종이 필요하다는 것이 잘 알려져 있다.

본원에 설명된 조성물에서, uvrA, uvrB 또는 uvrC 유전자, 또는 NER에 연루된 어떤 B. anthracis 유전자는 단독으로 또는 어떤 조합으로 기능적 형태의 단백질이 발현되지 않도록 돌연변이된다.

예로서, uvrA, uvrB 또는 uvrC 유전자 또는 NER에 연루된 어떤 B. anthracis 유전자에서 돌연변이는, 예를 들어 실시예 7에 설명된 대립형질 교환에 의해 수행될 수 있다. B. anthracis의 uvr 유전자들은 표적 결실 및 결과의 돌연변이 균주의 표현형의 특성화에 의해서는 확인되지 않았지만, 이 uvr 유전자들은 uvr 유전자가 공지된 관련 유기체의 게놈을 사용한 동종성 연구에 의해서는 확인될 수 있다. 예를 들어, B. anthracis의 게놈, 즉 주요 염색체 및 2개의 독성 플라스미드가 B. anthracis와 동일한 속의 관련 박테리아인 Bacillus Subtilis(B. Subtilis)와 비교될 수 있다. 플로리다 B. anthracis 분리주의 주요 염색체를 나타내는 게놈 스캐폴드(Read 등, 2002, Science 296, 2028-2033)는 GeneBank 수탁번호 AAAC010000001이다. B. subtilis는 GeneBank 수탁번호 NC_000964이다. B. subtilis uvrA 유전자는 nts.3609064에서 3611997을 포함하고 B. subtilis uvrB 유전자는 nts.3612005 -3613990을 포함한다. B. anthracis 서열에 대한 B. subtilis uvrA 및 uvrB 코딩 서열을 사용하여 BLAST 연구를 수행했다. 이 분석으로 이 유기체의 uvrA 및 uvrB 유전자에 상응하는 B. anthracis의 게놈에서 72% 서열 동일성의 영역을 확인했다. 226021-228783로부터 B. anthracis uvrA 유전자를 지도화하며 이것은 B. subtilis uvrA 유전자와 72%의 서열 동일성을 지닌다(2082/2867 동일한 서열 동일성 정렬). 228864-230771로부터 B. anthracis uvrB 유전자를 지도화하면 이것은 B. subtilis uvrB 유전자와 72%의 서열 동일성을 지닌다(1041/1925 동일한 서열 동일성 정렬). 따라서, B. anthracis uvrAB 유전자는 B. anthracis의 주요 염색체의 nts.226021에서 230771을 포함한다.

주요 박테리아 염색체의 nts.226021-230771을 포함하는 B. anthracis uvrAB 유전자의 결실은 L. monocytogenes에서의 uvrAB 유전자 결실에 대해 실시예 7에 설명된 방법에 따라 수행될 수 있다. 간단히 말해서, B. anthracis 게놈의 이 영역과 약 1000bps 상류 및 하류를 PCR에 의해 증폭시킨 다음 pKSV7 대립형질 교환 플라스미드 벡터로 클론한다. 대안으로, Bacillus 속-특이적 또는 B. anthracis 속-특이적 온도-감응(ts) 레플리콘이 pKSV7 대립형질 교환 플라스미드 벡터에 존재하는 리스테리아 (Listeria) ts 레플리콘 대신에 치환될 수 있다. uvrAB 영역 내에서 특이적으로 지도화되는 편리한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 사용하여 uvrA, uvrB의 어떤 부부 또는 uvrAB 유전자 서열 전부를 결실시킨다. 마지막으로, 실시예 7에 설명된 대로 대립형질 교환 플라스미드를 B. anthracis로 도입하고 NER 돌연변이를 선택한다. 어떤 선택된 B. anthracis 균주가 NER-결여 백신의 유도를 위한 모 균주로서 사용될 수 있으며, 예를 들어 Ames, Vollum, A1.a/10, A1.b/23, A2/29, A3.a/34, A3.b/57, A4/69, B/80, Δsterne, VN41Δ1, Dames, NNR1_Δ1, 및 DNH1 균주들을 포함한다. 추가로, 다른 약화된 돌연변이가 선택된 NER 돌연변이 B. anthracis 균주의 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써 광화학적 비활성화와 유전적 비활성화를 조합시킨 백신 조성물이 가능해진다. 그러한 B. anthracis 백신 조성물은 탄저병 면역성과 예방의 공지된 상관물들, 예를 들어 치사인자(LF), 부종인자(EF) 및 예방항원(PA)에 대한 면역반응을 유도할 수 있다. 추가로, NER 돌연변이 백신 조성물의 발현 프로파일이 그대로 유지된 결과로서, 탄저병 면역성과 예방에 관한 다른 미지의 상관물들, 예를 들어 2개의 독성 플라스미드 pXO1 및 pXO2와 주요 염색체로부터 발현된 것들에 대한 면역반응이 또한 유도된다.

백신 성분으로서 NER 돌연변이를 이용한, 예를 들어 B. anthracis를 사용한본원에 설명된 조성물은 피부, 위장 및 호흡기를 포함하는 감염 경로에 따른 3가지 종류의 탄저병 모두에 대한 예방 또는 치료 백신접종에서 사용될 수 있다. 더 나아가, B. anthracis의 NER 돌연변이를 발생시켜 안전하고 효과적인 백신을 유도하는 접근법이 NER을 이용하는 어떤 미생물 병원균에 대한 안전하고 효과적인 백신을 유도하는데도 적합하다는 것이 인정될 수 있다.

실시예 10

사람 암의 생체내 치료를 위한 본 발명의 백신의 사용

사람 암의 치료 또는 예방의 예로서, 미생물의 유전자 발현은 실질적으로 영향받지 않으면서 미생물 개체군의 증식이 약화되도록 미생물 핵산이 변형된 미생물 개체군을 포함하는 백신이 개체에게 투여된다. 미생물은 실시예 7 및 8의 프로토콜에 따라 제조될 수 있으며, 여기서는 예를 들어 실시예 8에 설명된 pPL2 통합 백터나 그의 어떤 변형체를 이용하거나, 또는 당업자에게 통상적인 어떤 방법에 의해서, 사람 종양 항원(들)을 암호화하는 어떤 바람직한 원핵생물 발현 카세트가 미생물에 통합된다. 결과의 개체군은 정제되지 않은 상태로, 또는 바람직하게는 정제된 형태로 제조될 수 있다. 이들은 액체 현탁액으로 제조되거나, 동결건조된 다음 투여를 위해 적합한 담체에 재현탁될 수 있다. 게다가, 이들은 보존제(예를 들어, 티메로살, 2-페녹시에탄올), 안정제(예를 들어, 락토스, 글루탐산 일나트륨염), 아쥬반트(예를 들어, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 사이토카인), 항생제(예를 들어, 네오마이신, 스트렙토마이신) 또는 다른 물질들과 같은 첨가제와 함께 제조될 수 있다. 제제는 멸균수, 식염수, 등장 완충 식염수(예를 들어, 생리학적 pH로 완충된 포스페이트) 또는 다른 적합한 희석제와 같은 적합한 희석제에 현탁되거나 희석될 수 있다.

백신은 경구, 비강, 정맥내, 피내, 복강내, 근육내, 림프관내 및 피하 경로 포함하는 다양한 경로에 의해서, 그리고 어떤 주어진 악성 또는 감염성 질환에 적합한 어떤 경로에 의해서 투여될 수 있다. 유효량의 백신이 치료를 위해 개체에게 투여될 것이다. 치료적 처치를 위한 유효량은 바람직한 면역반응을 가져오는 용량이며, 여기서 면역반응은 표적 종양의 성장을 늦추거나, 종양의 크기를 감소시키거나, 또는 바람직하게는 종양을 완전히 제거한다. 백신의 투여는 적합한 간격으로 반복될 수 있고, 백신접종된 개체에서 복수의 다른 부위들에 동시에 투여될 수 있다. 예방적 처치를 위한 유효량은 개체에서 암이 발생할 가능성이 현저히 감소되도록 예방적 면역반응을 가져오는 용량이다. 백신접종 섭생법은 단일 용량으로 이루어질 수 있거나, 또는 예방적 면역반응이 확고해질 때까지 적합한 간격으로 반복될 수 있다.

개체의 치료적 처치는 초기 치료에 따라 암을 가진다고 진단된 개체에서 시작될 수 있거나, 또는 다른 치료와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 수술로 종양이 제거되거나 방사선요법이나 화학요법으로 치료된 개체가 개체에서 어떤 잔류한 종양을 감소 또는 제거하거나 암이 재발할 위험을 줄이기 위해서 백신으로 치료될 수 있다. 개체의 예방적 처치는 환경적 조건이나 유전적 소인으로 인해 어떤 암과 접촉할 위험이 증가된 개체에서 시작될 수 있다.

실시예 11

S-59 소라렌 UVA 처리 후 uvrAB 돌연변이를 갖거나 갖지 않는 리스테리아 ( Listeria ) 균주DP- L4029 의 항원 제시

실시예 7의 Listeria 균주 DP-L4029 uvrAB 돌연변이 클론 1을 실시예 8의 과정을 사용하여 OVA 항원을 발현하도록 변형했다. 이 균주와 OVA를 발현하도록 변형된 DP-L4029를 다양한 농도의 소라렌 S-59로 처리했다. 리스테리아 (Listeria) 균주를 37℃에서 하룻밤 성장시키고 2ml 알리쿼트를 100ml BHI로 희석하여 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 37℃에서 약 4시간 성장시켰다(약 1x10⁹CFU/ml). 각 리스테리아 (Listeria) 균주의 5ml 알리쿼트를 15ml 튜브에 넣고 2300xg에서 20분간 원심분리한 후 상청액을 제거하고, 이 박테리아를 5ml PBS에 재현탁하여 약 1x10⁹CFU/ml로 만들었다. uvrAB 돌연변이 균주에 대해서, 3mM S-59 스톡을 33.3㎕를 10ml PBS에 희석하여 10μM 용액을 얻었고 이것의 적합한 알리쿼트를 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 및 100nM의 최종 농도로 리스테리아 (Listeria)에 가했다. DP-L4029에 대해서는, S-59를 5ml의 최종 부피로 100, 200, 400, 800 및 1000nM의 최종 농도로 가했다. 이들을 6-웰 배양 플레이트로 옮기고 0.5J/cm² 선량으로 조사했다(FX1019 UVA 장치). 이 샘플들을 15ml 튜브로 옮기고 5ml PBS를 가한 다음 2300xg에서 20분간 원심분리하여 반응하지 않은 소라렌을 씻어낸다. 상청액을 제거하고 박테리아를 5ml PBS에 재현탁한 다음 새로운 6-웰 플레이트로 옮긴다. 이들을 5.5J/cm²의 UVS 선량으로 조사하여 소라렌 모노애덕트를 전환시켜 교차결합시킨다. 또한, 72℃에서 3시간 처리함으로써 각 리스테리아 (Listeria) 균주의 샘플을 열살시켰다. 실시예 1에 따라 log 역가와 OVA 항원 제시를 평가했다. S-59 처리된 샘플에 대한 결과를 표 12A와 도 9A 및 9B에 나타낸다(DC2.4 세포 당 1 리스테리아 (Listeria)에서 항원 제시, 바탕값을 빼지 않고 계산함). 검출한계 이하의 역가를 나타낸 가열하여 죽인 균주(완전한 비활성)와 가열하여 죽인 박테리아에 대한 결과는 B3Z 분석에서 OVA 항원을 나타내지 않았다. 이 결과는 비 uvrAB 돌연변이 균주가 증식 약화의 함수로서 항원 제시의 큰 감소를 나타내는 경우(본질적으로 완전한 비활성화에 있어서 대략 바탕값까지)인 검출한계까지 증식이 약화되었을 때조차도 uvrAB 돌연변이가 매우 강한 항원 제시를 보인다는 것을 나타낸다. 이것은 uvrAB 돌연변이가 소라렌 약독 리스테리아 (Listeria)에 관해서 MHC 클래스 I 제시를 계속 유지하고 있으며, 효과적인 면역반응을 가지며 안전성 수준이 현저히 증가된 백신을 제공해야 한다는 것을 나타낸다.

동일한 균주를 사용하여 다른 연구를 수행했다. 이 연구에서는 리스테리아 (Listeria)를 37℃에서 BHI 중에 하룻밤 성장시켰다. 이들을 BHI로 1:50으로 희석하고 300rpm에서 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. OD₆₀₀이 0.5가 되었을 때 용액 50ml를 깨끗한 플라스크로 옮기고 표 12B에 나타낸 수준으로 S-59를 가했다. 이들 샘플을 300rpm에서 37℃에서 약 1시간 인큐베이션했다(OD₆₀₀ 약 1.0, 약 1x10⁹/ml). 1ml 알리쿼트를 취하여 역가를 평가하고 나머지를 150mm 페트리디쉬로 옮겨 6J/cm²의 선량으로 조사했다(FX1019). 각 샘플에 대해 조사 후의 역가를 측정하고 상기와 같이 OVA 항원 제시를 평가했다. 이 결과를 표 12B와 도 9C 및 9D에 나타낸다(DC2.4 세포 당 10 리스테리아 (Listeria)에서 항원 제시, 바탕값을 빼지 않고 계산함). 이 결과는, 모 균주에 대해서는 항원 제시가 본질적으로 완전히 비활성화된 경우인 바탕값 수준인 반면 uvrAB 돌연변이에 대해서는 S-59 농도의 약 10배 범위이고, 이 이상에서는 충분한 항원 제시와 함께 본질적으로 완전히 비활성화된다는 것을 나타낸다.

실시예 12

DP-L4029 uvrAB와 비교한 S-59/UVA 처리된 Listeria monocytogenes DP-O4029에서의 단백질 합성

Listeria monocytogenes DP-L4029 및 DP-L4029 uvrAB를 37℃에서 BHI 중에서 하룻밤 성장시켰다. 이들을 BHI로 1:50으로 희석하고 300rpm에서 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. OD₆₀₀이 0.5가 되었을 때 용액 50ml를 깨끗한 플라스크로 옮기고, 4029에 대해서 2500nM 그리고 4029 uvrAB 돌연변이 균주에 대해서는 200nM의 수준으로 S-59를 가했다. 이들 샘플을 300rpm에서 37℃에서 약 1시간 인큐베이션했다(OD₆₀₀ 약 1.0). 1ml의 알리쿼트를 취하여 역가를 평가하고 나머지를 150mm 페트리디쉬로 옮겨 6J/cm²의 선량으로 조사했다(FX1019). 각 샘플에 대해 조사 후의 역가를 측정하여 비활성화 수준을 측정한 결과, 본질적으로 완전한 비활성화를 나타냈다. 이것은 이 처리가 두 균주에 대해 검출한계까지의 비활성화를 제공하는 최저의 S-59 용량에 근접함을 증명했다. 각 균주에 대해서, OD₆₀₀ 대 역가 CFU/ml 성장곡선에 기초하여 1x10¹⁰ 박테리아를 15ml 원심분리 튜브로 옮겼다. 샘플을 4℃에서 2300xg에서 20분간 원심분리하고 상청액을 제거한 다음 펠릿을 50ml PBS로 세척했다. 이 과정을 반복하여 총 3회 세척했다. 최종 펠릿을 메티오닌이나 시스테인이 없는 DMEM(Gibco) 2ml에 현탁한 다음 30℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 30분간 쉐이킹하면서 인큐베이션했다. 샘플을 2ml 원심분리 튜브에서 1600rpm에서 2분간 원심분리하고 상청액을 제거한 다음에, 메티오닌이나 시스테인이 없는 DMEM을 2ml 가했다. ³⁵S 메티오닌-시스테인의 80μCi 알리쿼트를 가하고(Perkin Elmer Life Sciences), 이 샘플을 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 30분간 쉐이킹하면서 인큐베이션했다. 샘플을 상기와 같이 원심분리하고 상청액을 제거했다. 각 상청액의 50㎕ 알리쿼트를 SDS-PAGE 겔(Invitrogen, NuPage 4-12% 비스-트리스 겔) 위의 인접한 레인들에 로딩하고 약 1.5시간 동안 100볼트로 작동시켰다. 겔을 10% 아세트산과 30% 에탄올에 고정시킨 다음, 인핸서(Enlightning, NEN Life Sciences)에서 15분 소킹했다. 겔을 80℃에서 3시간 건조시키고, x-선 필름에 노출시켜 밴드를 시각화했다. 두 연구에 대한 결과를 도 10에 나타내며, 이 결과에서 모 균주는 제한된 단백질 합성을 보인 반면 uvrAB 돌연변이 균주는 상당한 단백질 합성을 나타낸다.

실시예 13

리스테리아 ( Listeria )의 성장 동안 존재하는 S-59를 사용하거나 사용하지 않은 S-59/UVA 비활성화의 비교

Listeria monocytogenes 균주의 비활성화에 관하여 두 비활성화 방법을 비교했다. 첫번째 방법에서, 리스테리아 (Listeria)를 37℃에서 300rpm에서 BHI 중에 하룻밤 성장시킨 다음, BHI로 1:50으로 희석하고 37℃에서 300rpm에서 OD₆₀₀이 0.7-1.00이 될 때까지 성장시켰다. 이들을 원심분리하고 1x10⁹/ml 수준으로 1% BSA를 갖는 PBS에 현탁했다. S-59를 모 균주에 대해 120nM의 수준으로 그리고 uvrAB 돌연변이 균주에 대해 30nM 수준으로 가했다. 샘플을 약 60분간 얼음에서 인큐베이션한 다음 150mm 페트리디쉬로 옮겨 6J/m² 선량으로 조사했다(FX1019). 두번째 방법에서, 리스테리아 (Listeria)를 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 유사하게 성장시키고 OD₆₀₀이 0.5가 되었을 때 용액 50ml를 깨끗한 플라스크로 옮겨, S-59를 모 균주에 대해 2500nM 수준으로 그리고 uvrAB 돌연변이 균주에 대해 200nM의 수준으로 가했다. 이들 샘플을 약 1시간 동안 30℃에서 300rpm에서 인큐베이션했다(OD₆₀₀ 약 1.0, 약 1x10⁹/ml). 1ml 알리쿼트를 취하여 역가를 평하가고 나머지를 150mm 페트리디쉬로 옮겨 첫번째 방법대로 조사했다. 조사 후 역가를 각 샘플에 대해 측정한 결과, 모든 샘플에 대해 증식이 본질적으로 완전히 억제되었다(>8log 비활성화). DP-14029 대 DP-L4029uvrAB를 사용하여 수행한 연구에서, 약 1x10¹¹ 박테리아를 함유하는 전체 샘플을 두번째 방법으로 처리한 다음 플레이팅했다. 이것은 모 균주에 대해 약 9log의 사살을 그리고 uvrAB 돌연변이에 대해 >10log의 사살을 나타낸다. 4가지 상이한 리스테리아 (Listeria) 제제에 대한 결과를 표 13에 나타낸다.

Listeria monocytogeres DP-L4029-OVA 및 DP-L4029 uvrAB-OVA를 사용하여 한 연구에서 2가지 방법을 비교했다. 상기와 같이 샘플을 제조하고 2300xg에서 20분간 원심분리한 다음, 상청액을 제거하고 박테리아를 PBS로 한번 세척했다. PBS 세척액을 원심분리하여 제거한 후, 최종 펠릿을 PBS 중의 8% DMSO에 재현탁하고 액체 질소나 드라이아이스를 사용하여 저온-바이알에서 빠르게 냉동시켜 -80℃에 저장했다. 3마리 마우스(C57B1/6) 세트에 200㎕ 중의 1x10⁸ 리스테리아 (Listeria)(HBSS에 약 1:40으로 희석된 냉동 스톡)를 정맥내 주사했다. S-59/UVA 처리된 균주에 더하여, 살아있는 DP-L4029uvrAB-OVA와 열살된 DP-L4029 uvrAB-OVA 그리고 대조표준으로서 HBSS를 주사했다. 두 S-59 방법을 비교하기 위해서 마우스에 0일째에 주사했다. 두번째 방법에 의해 제조된 샘플에 대해서, 추가의 마우스 세트에 2일과 3일째 또는 2, 3, 4 및 5일째에 다시 주사했다. 모든 마우스를 백신접종 후 7일째에 죽여서 비장을 꺼내 분석했다. SL8(OVA 특이적)을 갖는 세포 개체군을 자극하면서 실시예 5에 설명된 ELISPOT 분석에 의해 OVA 특이적 면역반응에 대해 비장세포를 평가했다. 결과를 도 11A에 나타내며, 이 결과는 모 균주와 uvrAB 돌연변이 모두에 대해서 두번째 방법에 의해 제조된 리스테리아 (Listeria)가 첫번째 방법에 의해 제조된 균주보다 더 효능 있는 OVA 특이적 면역반응을 가져온 것을 나타낸다. 또, LLO 클래스 II 항원 LLO190 또는 클래스 I 항원 LLO296을 사용하여 자극하면서 ELISPOT 분석을 수행했다. 3개의 항원을 전부 비교한 ELISPOT의 결과를 도 11B에 나타내며, 이것은 LLO 특이적 CD4+ 반응이 OVA 특이적 반응과 유사함을 나타낸다. 또한, 비장세포를 SL8, LLO190 또는 LLO296을 사용하여 자극하면서 실시예 5에 설명된 ICS에 의해 평가했다. 이 결과를 도 12A-C에 나타내며, 이것은 두번째 방법에서 OVA 및 LLO에 대한 더 강한 면역반응을 나타낸다. 이 데이타는 또한 모 균주에 비해 uvrAB에 대한 반응이 개선되었음을 나타낸다. 두 균주에서 후일의 추가의 백신접종은 OVA 및 LLO 항원 모두에 대한 개선된 반응을 가져온다(1 대 3일).

다른 연구에서, 마우스에서 야생형 시험감염에 대한 예방적 면역성을 제공하는 능력에 대해 DP-L4029 및 DP-L4029 uvrAB 균주를 평가했다. HBSS, DP-L4056 야생형(+/- 열살), DP-L4027(LLO 결실), DP-L4029 S-59/UVA 처리(상기 설명된 첫번째 와 두번째 방법), DP-L4029l uvrBA S-59/UVA 처리(상기 설명된 첫번째와 두번째 방법)을 사용하여 표 14에 설명된 그룹대로 balb/c 마우스에 백신을 접종했다. 백신접종 27일 후에 야생형 Listeria monocytogeres를 사용하여 그룹 당 3마리 마우스를 2xLD₅₀으로 그리고 그룹 당 6마리 마우스를 100xLD₅₀으로 시험감염시켰다. 시험감염 3일 후 2xLD₅₀으로 시험감염된 마우스를 죽이고 비장과 간을 분리한 다음 배양하여 리스테리아 (Listeria)를 성장시켰다. 각 마우스의 비장과 간을 0.5% 트리톤 X-100(Sigma)를 갖는 멸균 증류수에서 균질화했다. 일련의 10배 희석액을 스트렙토마이신(50㎍/ml)을 함유하는 BHI 아가 플레이트 위에 플레이팅하고 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 비장 또는 간에 대하여 콜로니 형성 단위의 수를 측정했으며, 이것은 야생형 시험감염에 대한 면역성의 표지이다. 도 13A 및 B는 S-59/UVA 처리된 샘플이 HBSS(백신접종되지 않은) 대조표준에 비해 기관 당 CFU에 있어 약 3log의 감소를 제공하며, 두번째 방법으로 제조된 샘플은 첫번째 방법으로 제조된 것들보다 CFU에서 더 많은 감소를 나타낸다는 것을 보인다. 게다가, 처리된 uvrAB 돌연변이 균주는 처리된 모 균주보다 약간 나은 CFU를 나타낸다. CFU 감소가 야생형을 사용한 백신접종만큼 우수하지는 않지만, S-59/UVA 처리된 균주는 CFU의 감소에서 약간의 효능을 나타내는데, 이것은 일반적으로 예방적 면역성과 상호관련된다. 100xLD₅₀로 시험감염된 6마리의 마우스를 10일 동안의 생존에 대해 모니터한 결과 야생형으로 백신접종된 한마리 만이 생존했다.

HBSS, DP-L4056 야생형(+/-열살), DP-L4027(LLO 결실), DP-L4406actA(actA/ inlB 결실 이중 돌연변이, ATCC 번호 PTA-5562으로 2003년 10월 3일 기탁됨), DP-L4029+S-59/UVA(두번째 방법), DP-L4029uvrAB+/-S-59/UVA 처리(두번째 방법만) 또는 + 열살을 사용하여 Balb/c 마우스에서 추가 연구를 수행했으며, 이때 백신접종은 S-59 및 열살 균주에 대해 1, 3 또는 5일 동안 매일 수행했다. 용량을 표 15에 요약한다. 1차 백신접종 후 29일 후에 야생형 Listeria monocytogeres를 사용하여 그룹 당 3마리 마우스를 2xLD₅₀으로 그리고 그룹 당 6마리 마우스를 100xLD₅₀으로 시험감염시켰다. 이들 마우스의 생존에 대해 10일 동안 모니터했다. 1차 백신접종 후 32일 후 각 그룹으로부터 3마리의 추가 마우스를 야생형 2xLD₅₀으로 시험감염시키고 3일 후에 죽여서 비장과 간을 분리한 다음 배양하여 리스테리아 (Listeria)를 성장시켰다. 추가로 마우스 혈청의 항-리스테리아 (Listeria) 항체 역가를 ELISA 분석에 의해 평가했다. 중탄산나트륨 완충액 중의 냉동된 그라운드 리스테리아 (Listeria)를 플레이팅하고 연속 희석한 백신접종 마우스 혈청과 함께 인큐베이션한 다음, HRP에 콘쥬게이트된 염소 항-마우스 항체를 사용하여 결합된 항체를 검출했다. HRP 기질을 가하고 색변화를 정량적으로 측정하여 항체 수준을 측정했다. 이들을 나이브 마우스와 비교하여 리스테리아 (Listeria) 특이적 항체를 평가했는데, 이 경우 만일 나이브 혈청 샘플의 측정치 위로 1 표준편차 이상이라면 샘플은 리스테리아 (Listeria)에 대해 양성인 것으로 간주했다. 비장 또는 간에 대한 CFU를 도 14A 및 B에, 항-리스테리아 (Listeria) 항체 역가를 도 15에, 생존 결과를 도 16에 나타낸다. 이 연구는 3 또는 5회 백신접종했을 때 S-59 처리된 uvrAB 균주의 우수한 CFU 감소 및 예방적 면역성을 증명하며, 이것은 처리되지 않은 uvrAB 균주와 거의 비슷하고 거의 야생형 균주만큼 효과적이다.

실시예 14

마우스 모델에서 S-59/UVA 처리된 균주를 사용한 면역내성 파괴의 증명

Gp-70-AHlA5 및 OVA를 발현하는 DP-L4029 및 DP-L4029 uvrAB 균주를 실시예 13의 두번째 방법에 따라서 S-59/UVA 처리했다. Gp-70은 CT-26 종양세포에 의해 발현되는 자가조직 마우스 항원이다. AH1A5는 살아 있는 균주에서 발현되었을 때 면역반응을 유도한다고 알려진 천연 서열의 단일 염기 돌연변이이다(AH1 펩티드는 SPSYVYHQF(SEQ ID NO:20), AH1A5 펩티드는 SPSYAYHQF(SEQ ID NO:21)). 예방적 면역화 연구에서, Balb/c 마우스를 표 16에 따라 8마리 마우스의 그룹들에 정맥내 백신접종(100㎕)했다(1차 세트의 백신접종 후 7일 후, 그룹 당 3마리의 마우스를 죽여서 비장을 수집했다). 초기 백신접종 후 21일째에 그룹 당 나머지 5마리의 마우스에 1x10⁵ CT-26 결장 상피종양세포(ATCC)를 정맥내 주사하고 생존을 모니터했다.

수집된 비장세포의 T 세포 개체군을 실시예 5에 따라 ICS로 평가했으며, 세포를 자극하기 위해 LL091, AH1, AH1/A5 펩티드 또는 P815 및 CT26 세포(150mM S-59 및 3J/cm²의 UVA로 완전히 비활성화된)를 사용했다. P815 용량이 gp70 항원을 발현하지 않으므로 P815 세포를 CT26 전체 세포 자극에 대한 음성 대조표준으로 사용한다. 결과를 도 17에 나타내며, 이 결과는 처리된 uvrAB 돌연변이가 AH1A5 또는 AH1 특이적 반응을 가져오며 이것은 추가의 백신접종에 의해 개선될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 세포를 실시예 5에 따라 ELISPOT에 의해 평가했다. 세포는 AH1A5 또는 AH1 펩티드로 자극했다. 이 결과를 도 18A에 나타내며, 이것은 uvrAB 돌연변이 균주를 사용했을 때 AH1A5 및 AH1에 대한 면역반응을 나타낸다.

실시예 15

uvrAB 결실을 갖는 소라렌 약독된 리스테리아 ( Listeria ) 균주를 사용한 마우스의 치료적 백신접종

C57B1/6 마우스를 사용하여, B16.F10.MO5.10.H3(OVA+, 이것은 OVA 발현에 대한 동종성이 증가된 실시예 4에 사용된 세포의 서브클론이다) 흑색종 종양세포를 마우스에 주입(100㎕ HBSS 중의 1x10⁶, 정맥내)하여 폐 전이를 수행했다. Listeria monocytogenes 균주 DP-L4029-OVA, DP-L4027-OVA, DP-L4038-OVA(actA/461T 이중 돌연변이) 및 DP-L4029uvrAB-OVA를 사용하여 10마리 마우스의 그룹들에 백신을 접종했다. S-59 처리(실시예 13의 첫번째 방법에 의해 >8log 사살)한 DP-L4029uvrAB-OVA 균주와 처리하지 않은 이 균주를 사용했고, 열살된 DP-L4029-OVA를 HBSS와 함께 대조표준으로서 사용했다. 마우스를 종양이식 후 3일째에 표 16에 제공된 용량에 따라서 백신접종했다(HBSS 중의 100㎕, 정맥내). 종양이식 후 30일 후에 그룹 당 5마리의 마우스를 죽인 다음 폐를 수집했다. 폐 당 전이된 수를 세었다. 그룹 당 나머지 5마리의 마우스는 생존에 대해 모니터했다. 폐 전이의 수와 중간 생존일을 표 17에 나타낸다. actA-, actA-OVA, 및 actA-uvrAB-OVA S-59/UVA 처리된 것과 열살된 것에서의 폐를 도 19A에, 폐 전이의 수를 도 19B에, 생존을 도 19C에 나타낸다. 이 데이타는 S-59/UVA 처리된 uvrAB 돌연변이가 치료적 백신으로서 투여될 수 있고, 그 결과 백신접종되지 않은 열살 대조표준, 또는 OVA 없는 DP-L4029에 비해 상당히 감소된 폐 전이와 연장된 생존을 가져온다는 것을 나타낸다.

실시예 16

gp70 마우스 항원을 발현하는 S-59 비활성화된 리스테리아 ( Listeria ) 균주를 사용한 치료적 백신접종

Balb/c 마우스를 사용하여, 사람 항원(이 실험과 관련 없는 사람 항원)을 발현하도록 변형된 CT26 종양세포(이것은 AH1을 발현한다)를 마우스에 주사(HBSS 중에서, 100㎕ 정맥내, 2x10⁵)하여 폐 전이를 수행했다. Listeria monocytogezzes 균주 DP-L4029, DP-L4029-AH1A5, DP-L4029uvrAB-AHlA5, 및 DP-L4406act-AH1A5(actA/ inlB 이중 돌연변이)를 사용하여 13마리 마우스의 그룹들에 백신을 접종했다. 또한 AH1A5 균주가 OVA 항원을 발현한다. DP-L4029uvrAB-AH1A5 균주는 처리하지 않은 것, 열살된 것, 또는 S-59 처리(실시예 13의 두번째 방법에 따라)된 것을 사용했다. 마우스를 표 18에 따라서 종양이식 후 4일째에 시작하여 백신접종했다(100㎕ HBSS). 종양이식 후 19일 후 그룹 당 3마리의 마우스를 죽여서 폐를 수집했다. 폐 당 전이의 수를 세었다. 그룹 당 나머지 10마리의 마우스를 생존에 대해 모니터했다. 폐 전이의 결과를 도 20A(폐 그림) 및 20B(폐 전이의 수를 도표로 그림)에, 생존을 표 18 및 도 20C(ΔactA 샘플)과 20D(ΔactAΔuvrB 샘플)에 나타낸다. AH1A5 항원은 마우스에 대해 내인성이며, 이로써 어떤 면역 효과가 마우스에서 면역내성을 파괴할 것이다. 이 결과는 S-59 처리된 uvrAB 돌연변이 균주가 마우스에서 내성을 파괴할 수 있으며, 그 결과 폐 전이가 상당히 감소하고 생존이 연장된다는 것을 나타낸다. 1회의 백신접종에 비해 백신이 3일에 걸쳐 투약될 때 치료 효과가 개선된다(3일에 걸쳐 송달된 총 용량이 단 하루의 동일하다).

실시예 17

수지상 세포에서 S-59/UVA 처리된 Listeria monocytogenes 국소화의 형광분광기를 사용한 평가

항원제시세포 내에서 Listeria monocytogenes의 흡수 및 분포를 형광분광기로 평가했다. 페트리디쉬의 커버슬립 위에서, 10% FBS(clone), 1x 비필수 아미노산(Cellgro), 5x10⁴I.U. 페니실린/5x10⁴㎍ 스트렙토마이신(Irvine Scientific), 2mM L-글루타민(Irvine Scientific) 및 1nM 나트륨 피루베이트(Sigma)로 보충된, 완전 RPMI 배지 RPMI-1640(Gibco) 중에서 수지상 셀라인 DC2.4를 디쉬 당 5x10⁵으로 배양하고 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다(이것은 다른 셀라인들, 예를 들어 마크로파지 J774과 유사하게 수행될 수 있다). 박테리아 콜로니를 갖는 BHI 배지 3ml를 파종하고 30℃에서 하룻밤 성장시켜 리스테리아 (Listeria) 균주(DP-L4056, DP-L4027(LLO-) 및 DP-L4056uvrAB)의 정지상 배양물을 제조했다.

리스테리아 (Listeria)의 하룻밤 배양물을 신선한 BHI 배지에 1:20으로 희석하고 30℃에서의 정지상 배양물을 0.5-0.6의 OD₆₀₀까지 성장시켰다. DP-L4056 및 DP-L4056uvrAB 균주의 하룻밤 배양물 약 1ml를 72℃에서 3-4시간 열살시켰다. 실시예 13의 두번째 방법에 따라서 제조된 소라렌 비활성화된 DP-L4056 및 DP-L4056uvrAB의 냉동 스톡을 해동하여 30℃에서 1시간 정지상으로 회복시켰다. 감염 전에, 모든 리스테리아 (Listeria) 제제의 OD₆₀₀을 판독하고 커버슬립 당 DC2.4 세포수를 계수하고 각 균주에 대해 감염다중도(MOI, DC2.4 세포 당 박테리아수)를 계산했다. 신선한 log상 배양물로 세포를 MOI 5로 감염시키고, 열살된 배양물로 MOI 20으로 감염시키고, S-59/UVA 처리된 균주로 MOI 10으로 감염시켰다.

커버슬립을 24-웰 디쉬로 옮기고 Pen/Strep가 없는 RPMI로 3회 세척하고 원하는 MOI를 제공하는 리스테리아 (Listeria) 균주의 적합한 희석액을 37℃에서 30분간 Pen/Strep가 없는 배지 중에서 세포와 함께 인큐베이션했다. 다음에, 커버슬립을 Pen/Strep가 없는 배지로 3회 세척하고 30℃에서 30분 더 인큐베이션했다. 인큐베이션 마지막에, 커버슬립을 세척하고 37℃에서 4시간 동안 50㎍/ml 겐타마이신을 갖는 배지 중에서 인큐베이션했다. 다음에, 커버슬립을 PBS로 세척하고 실온에서 3.5% 포름알데히드/PBS에 15분간 고정시켰다. 고정 후, 커버슬립을 TBS-Tx 완충액(25mM 트리스-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100)으로 세척/투과시키고, 실온에서 15분간 1% BSA/TBS-Tx 중에서 차단시켰다. 커버슬립을 토끼 항-리스테리아 (Listeria) O 항원 항-혈청((Difco)으로 실온에서 30분간 염색하고 TBS-Tx 완충액으로 세척했다. 다음, 샘플을 플루오레세인 표지된 항-토끼 2차 항체(Vector Laboratories)로 염색하고, 액틴을 로다민-팔로이딘(Molecular Probes)으로 염색했다. 커버슬립을 TBS-Tx로 세척하고, VectaShield+DAPI-hardset(Vector Laboratories)에 있는 슬라이드에 장착하여 세포핵을 염색시켰다. 슬라이드를 적어도 8시간 건조시킨 다음 Nikon TE300-U 역전현미경 상에서 세포를 시각화했다. CCD Hamamatsu C4742-95-12NR 카메라로 영상을 찍어 Phase 3 Imaging Systems의 Image-Pro 소프트웨어를 사용하여 분석했다.

첫번째는 UV-2E/C 필터(CHROMA Technology Corp, DAPI/핵 시각화)를 사용하고, 두번째는 HYQ TRITC 필터(CHROMA Technology Corp, 액틴 시각화)를 사용하고,세번째는 B-1A(HYQ-FITC) 필터(CHROMA Technology Corp, 리스테리아 (Listeria) 시각화)를 사용하여 각 필드에 대해 3개의 영상을 찍었다. 다음, 3개의 영상을 합쳐서 리스테리아 (Listeria)의 염색이 액틴의 염색과 함께 공동-국소화되었는지 측정했다. 포식리소좀을 이탈할 수 없었던 리스테리아 (Listeria)는 녹색으로 나타난 반면, 시토졸로 이탈할 수 있었던 것들은 액틴을 핵화할 수 있었고, 따라서 액틴(적색)과 Listeria(녹색)의 공동-국소화로 인해 황색으로 나타났다. 리소좀을 이탈할 수 있었던 Listeria의 퍼센트를 정량하기 위해, 필드에 있는 Listeria의 총수를 계수하고, 황색 박테리아를 계수하거나 또는 로다민 영상으로부터 액틴의 존재를 확인함으로써 황색을 나타낸 Listeria의 수를 측정했다(도 21A을 참조). 포식리소좀을 이탈한 Listeria의 수를 계수된 Listeria의 총수로 나누어 파고리소좀 이탈 퍼센트를 계산했고, 이것을 표 19와 도 21B에 나타낸다. 이 결과는 열살된 균주 및 S-59/UVA 처리된 야생형 균주는 LLO- 균주처럼 행동하고, 즉 포식리소좀을 이탈할 수 없고, 반면 S-59/UVA 처리된 uvrAB 돌연변이는 파고리소좀을 이탈하는 실질적인 능력을 보인다는 것을 나타낸다.

실시예 18

그람 염색을 사용한 S-59/UVA 처리된 Listeria monocytogenes uvrAB 균주의 시각화

Listeria monocytogenes의 야생형 및 uvrAB-균주를 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 성장시키고, 이때 용액 50ml를 깨끗한 플라스크로 옮겨 S-59를 야생형 균주에 대해 2500nM 수준으로, uvrAB-돌연변이 균주에 대해 200nM 수준으로 가했다. 이들 샘플을 37℃에서 300rpm에서 약 1시간 동안 인큐베이션했다(OD₆₀₀ 약 1.0, 약 1x10⁹/ml). 1ml 알리쿼트를 취하여 역가를 평가하고, 나머지를 150mm 페트리디쉬로 옮겨 6J/cm²의 UVA 선량을 조사(FX-1019)하여 두 균주 모두에 대해 >8log의 비활성화를 가져왔다. 처리된 균주를 실시예 13에 설명된 대로 냉동저장했다. 이들을 해동하고 약 1-2x10⁹/ml의 농도로 15ml 튜브에서 BHI 배지로 1:10으로 희석했다. 이들을 37℃에서 300rpm에서 인큐베이션하고, 0, 2, 4, 6, 8시간 및 하룻밤(약 18시간)째에 알리쿼트를 취했다. 알리쿼트를 유리 슬라이드 위에 산포시키고(약 50㎕) 공기건조시켰다. 화염에 3번 통과시켜 도말표본을 열고정시킨 다음, Fisher Gram Stain 세트(카탈록 #282-407)를 사용하여 그람 염색하기 전에 냉각시켰다. 현미경으로 슬라이드를 보고 사진을 찍었다. 이 네가티브 영상을 도 22에 나타낸다. 이것은 처리된 수복 결여 균주의 독특한 성질을 분명히 나타내고 있으며, 이것은 분할될 수 없는 유전자 발현을 지시하는 사슬을 나타내며, 이로써 박테리아는 증식하지 않는다.

실시예 19

추가의 돌연변이 리스테리아 균주의 제작.

돌연변이 리스테리아 균주의 제조. 리스테리아 균주는 10403S로부터 유도되었다 (Bishop et al., J ImmunoL 139: 2005 (1987)). 지시된 유전자의 프레임내 결손을 갖는 리스테리아 균주는 SOE-PCR 및 확립된 방법과의 대립 교환에 의해 생생되었다 (Camilli, et al, Mol. Microbiol. 8: 143 (1993)). 돌연변이 균주 LLO L461T (DP-L4017)는 Glomski, et al, J. Cell. Biol. 156 : 1029 (2002)에서 기술되었고, 이것은 본원에서 참고문헌에 의해 포함된다. actA ^- 돌연변이 (DP-L4029)는 본원에서 그 전문이 참고문헌에 의해 포함되는 Skoble et al., J. of Cell Biology, 150: 527-537 (2000)에서 기술된 DP-L3078 균주이고, 이것은 그것의 프로파지가 치료되었다(프로파지 치료는 (Lauer et al., J. Bacteriol. 184: 4177 (2002); U. S. 특허 공보 No. 2003/0203472)에서 기술된다). LLO^-돌연변이 (DP-L4027) (Lauer et al., J. of Bacteriology, 184: 4177- 4186 (2002)), 및LLOA26(DP-L4042) (Decatur et al,Science 290~992 (2000))는 또한 이전에 기술되었다. actA ^- uvrAB ^- 균주의 제작은 L4029/uvrAB 으로서, 2003년 2월 6일 출원된, 공동계류 U. S. 가출원 60/446, 051,(예를 들어 그 출원의 실시예 7을 참조하라)에 기술된다. DP-L4029uvrAB (actA^-/uvrAB^-)은 2003년 10월 3일, ATCC에 할당된 PTA-5563으로 기탁되었다.

대립 교환에 의해 리스테리아로부터 inlB의 결손을 위한 pKSV7-dl inlB 의 제작. 리스테리아 DP-L4029으로부터(또는 다른 선택된 돌연변이 균주로부터 또는 야생형 리스테리아로부터) inlB의 결손은 Camilli et al., Mol. Microbiol. 8: 143-147 (1993)에 의해 기술된 바와 같이, 대립 교환에 의해 달성될 수 있다. 오버랩 PCR 은 대립 교환 과정에서 사용된 구성체를 제조하는데 사용된다. 인터날린 B 유전자의 공급원은 Genbank 수탁 번호 AL591975으로 열거된 서열 (리스테리아 단핵구유전자 균주EGD, 완전한 게놈, 분절 3/12; inlB 유전자 영역: nts. 97008-98963) 및/또는 Genbank 수탁 no.NC_003210으로서 열거된 서열이고(리스테리아 단핵구유전자 균주 EGD, 완전한 게놈, inlB 유전자 영역 ; nts.457008-458963) 이들 둘다 그 전체가 본원에서 참조에 의해 포함된다.

1차 PCR 반응에서, 리스테리아 inlB 유전자 5' 및 3'말단으로부터 상류와 하류에 있는 대략 1000 bps의 서열은, 각각, 하기의 주형 및 프라이머를 사용하여 증폭된다:

주형 : DP-L4056 또는 DP-L4029 유전체 DNA

프라이머 쌍 1 (inlB의 5' 말단으로부터 상류 영역의 증폭을 위해) :

Lm-9603 1F :5'-GTTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG (SEQ ID

NO : 22) (T_m : 72℃)

Lm-(3' inlB-R +)97020R : 5'-

AGGTCTTTTTCAGTTAACTATCCTCTCCTTGATTCTAGTTAT

(SEQ ID NO : 23) (T_m :114 ℃)

(밑줄친 서열은 InlB 카르복시 종말의 하류 영역에 상보적이다.)

(암플리콘 크기 (bps): 1007)

프라이머 쌍 2 (inlB의 3'말단 으로부터 하류 영역의 증폭을 위해) :

Lm- (5' in/B-F +) 98911F : 5'-

CAAGGAGAGGATAGTTAACTGAAAAAGACCTAAAAAAGA

AGGC (SEQ ID NO : 24) (T_m:18 ℃) (밑줄친 서열은 InlB 아미노 종말의 상류 영역과 상보적이다.)

Lm-99970R:5'-TCCCCTGTTCCTATAATTGTTAGCTC (SEQ IDN0 : 25) (Tm: 74 ℃)

암플리콘 크기 (bps): 1074)

2차 PCR 반응에서, 1차 PCR 암플리콘은 오버랩 PCR을 통해 융합되고, 쌍 1 로부터의 역 프라이머와 쌍 2의 전방 프라이머 사이의 상보성을 이용한다. 이는 inlB 코딩 서열의 정확한 결손을 초래한다: nts.97021-98910=1889 bps. 하기의 주형과 프라이머는 2차 PCR 반응에서 이용되었다:

주형: 깨끗한 1차 PCR 반응

프라이머 쌍 :

Lm-96043F: 5'-GTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAG (SEQ ID

NO:26) (Tm: 74 ℃)

Lm-99964R :5'-GTTCCTATAATTGTTAGCTCATTTTTTTC (SEQ ID

NO:27) (Tm: 74 ℃) (암플리콘 크기 (bps): 2033)

구성 공정을 완성하기 위한 프로토콜은 다음과 같다:

1차 PCR 반응 (3 온도 싸이클)은 Vent DNA 폴리머라아제(NEB) 및 10μl 의 세척된 30℃ 리스테리아 DP-L4056 또는 DP-L4029를 사용하여 수행되고 밤새 배양을 하였다. 리스테리아 암플리콘의 예상된 크기는 1% 아가로스 겔 만큼(1007 bps 및 1074 bps). 1차 PCR 반응은 겔 정제되고 GeneClean (BIO101)DNA로 용출시킨다.

주형 (ca. 5μL)으로서 대략 동일한 양의 각각의 1차 반응을 이용하여, 2차 PCR 반응을 수행한다. 2차 PCR 반응으로부터 리스테리아 암플리콘의 예상된 크기는 1% 아가로스 겔 (2033 bps)에 의해 확인된다. 아데노신 잔기를 Taq 폴리머라아제와 함께 리스테리아 dl inlB 암플리콘의 3'말단에 첨가한다.

리스테리아 dl inIB 암플리콘은 그후 pCR2.1-TOPO 벡터 안으로 삽입된다. pCR2. 1-TOPO-dl inlB 플라스미드 DNA는 XhoI 및 KpnI으로 소화되고 2123 bp 단편은 겔 정제된다. KpnI/XhoI 2123 bp 단편은 KpnI 및 NoI로의 소화와 CIAP (pKSV7- dl inlB)로의 처리에 의해 제조된 pKSV7 벡터 안으로 삽입된다. [정정?] pKSV7-dl inlB에서 dl inlB 서열의 충실도는 그후 확인된다. inlB 유전자는 pKSV7-dl inlB 플라스미드와의 대립 교환에 의해 원하는 리스테리아 균주로부터 삭제된다.

항원-발현 균주의 제작. 모델 항원 난백 알부민 (OVA)의 절두 형태를 발현하는 돌연변이 리스테리아 균주, AH1 (SPSYVYHQF; SEQ ID NO : 20)으로 알려진 마우스 직장결장 암 (CT26)로부터의 면역우성 에피토프, 및 변경된 에피토프 AH1-A5 (SPSYAYHQF; SEQ ID NO : 21; Slansky et al., 면역, 13: 529-538 (2000)) 가 제조되었다. pPL2 통합 벡터 (Lauer et al., J. Bacteriol. 184: 4177 (2002) ; U. S. 특허 공보 No. 2003/0203472)가 리스테리아 게놈의 독이 없는 부위 안으로 통합된 단일 복사를 함유하는 OVA 및 AH1-A5/OVA 재조합 리스테리아 균주를 유도하는데 사용되었다.

OVA-발현 리스테리아 (DP-L4056)의 제작. 절두의 OVA와 융합되고 pPL2 통합 벡터 (pPL2/LLO-OVA)에 함유된 용혈소-제거된 LLO 로 이루어지는 항원 발현 카세트가 먼저 제조된다. 리스테리아- OVA 백신 균주는 pPL2/LLO-OVA을 PSA (ScottA로부터의 파지) 부착 부위 tRNA^Arg- attBB'에서 파지-치료된 L. 단핵구유전자 균주 DP-L4056 안으로 도입함으로써 유도된다.

PCR은 하기의 주형 및 프라이머를 사용하여 용혈소-제거된 LLO를 증폭하는데 사용된다:

공급원: DP-L4056 유전체 DNA

프라이머:

전방 (Kpnl-LLO nts. 1257-1276):

5'-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC (SEQ ID NO : 28)

(T_m : LLO-spec : 52 ℃. 총체적 : 80 ℃.)

역방 (BamHl Xhol-LLO nts. 2811-2792) :

5'-CAATGGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC (SEQ ID NO : 29)

(Tm : LLO-spec : 52 ℃. 총체적 : 102 ℃.)

PCR는 또한 하기의 주형 및 프라이머를 사용하여 절두의 OVA를 증폭하는데 사용된다:

공급원 : DP-E3616 E. coli로부터의 pDP3616 플라스미드 DNA (Higgins et al. , Mol. Molbiol. 31: 1631-1641 (1999)).

프라이머 :

전방 (XhoI-NcoI OVA cDNA nts. 174-186) :

5'-ATTTCTCGAGTCCATGGGGGGTTCTCATCATC (SEQ ID NO : 30)

(T_m OVA-spec : 60℃. 총체적: 88 ℃.)

--역방. (XhoINotl-HindII :--

5'-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT (SEQID NO :31)

(T_m : 총체적 : 82 ℃.)

제작 공정을 완성하기 위한 하나의 프로토콜은 먼저 KpnI 및 BamHI으로 LLO 암플리콘을 절단하는 것 그리고 KpnI/BamHI 벡터를 pPL2 벡터 (pPL2-LLO) 안으로 삽입하는 것을 수반한다. OVA 암플리콘은 그후 XhoI 및 Notl 으로 절단하고 XhoI/Notl으로 절단된 pPL2-LLO 안으로 삽입된다. (주의: pPL2 벡터는 어떠한 XhoI 부위를 함유하지 않고; pDP-3616 는 하나의 XhoI 부위를 함유하고, 그것은 OVA 역방 프라이머 디자인에서 이용된다.) 구성체 pPL2/LLO-OVA는 제한 분석 (KpnI-LLO-XhoI-OVA-NotI) 및 염기순서분석에 의해 확인된다. 플라스미드 pPL2/LLO-OVA는 Lauer et al.에 의해 정확히 기술된 바와 같이, 형질전환에 의해 E. coli안으로 도입되고, 이어서 접합에 의해 리스테리아 (DP- L4056)안으로 도입 및 통합된다 (또는 inlB ^- 돌연변이 또는 inlB-actA ^- 이중 돌연변이로서와 같이 리스테리아의 또다른 원하는 균주안으로).

OVA를 발현하는 항원 발현 카세트의 삽입의 설명은 U. S. 가출원 표제 "자유-생활 병원균 기반 백신 조성물", 2003년 10월 15일 출원된 US Serial No. 60/511,869의 실시예 8에서 발견할 수 있다.

AH1/OVA 또는 AH1-A5/OVA을 발현하는 리스테리아 균주의 구성. AH1/OVA 또는 AH1-A5/OVA 항원 서열 중의 하나를 발현하는 리스테리아를 제조하기 위해서, 항원을 갖는 삽입체는 먼저 올리고뉴클레오티드로부터 제조되고 그후 벡터 pPL2-LLO-OVA 안으로 결찰된다(위에서 기술한 바와 같이 제조됨).

하기의 올리고뉴클레오티드는 AH1 또는 AH1- A5 삽입체의 제조에 사용된다:

AH1 에피토프 삽입체 (Clal-Pstl 호환가능 말단) :

꼭대기 가닥 올리고 (AH1 Top):

5'-CGATTCCCCTAGTTATGTTTACCACCAATTTGCTGCA ID NO : 32)

바닥 가닥 올리고 (AH1 바닥) :

5'-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT (SEQ : 33)

AH1-A5 에피토프 삽입 (ClaI-AvaII 호환가능 말단)

AH1-A5 에피토프의 서열은 SPSYAYHQF (SEQ ID NO : 21) 이다

(5'-AGT CCA AGT TAT GCA TAT CAT CAA TTT-3' (SEQ ID NO : 34)).

꼭대기 : 5'-CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC (SEQ ID NO : 35)

바닥 : 5'-GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT (SEQ ID : NO : 36)

주어진 에피토프에 대한 올리고뉴클레티드 쌍은 동일한 몰비로 함께 혼합되고, 95℃에서 5분동안 가열된다. 올리고뉴클레오티드 혼합물은 그후 천천히 냉각된다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 쌍들은 그후 관련된 제한 효소로 소화함으로써 제조된 pPL2-LLO/OVA 플라스미드와 함께 200 내지 1 몰비로 결찰된다. 새로운 구성체의 정체는 제한 분석 및/또는 염기순서분석에 의해 확인될 수 있다.

플라스미드는 Lauer et al.에 의해 기술된 바와 같이 정확하게, 형질전환에 의해 E. coli 안으로 도입되고, 이어서 접합에 의해 리스테리아 (DP-L4056) 안으로 (또는 inlB^- 돌연변이 또는 inlB ^- actA ^- 이중 돌연변이와 같은 리스테리아의 또다른 원하는 균주 안으로) 도입 및 통합된다.

실시예 20

리스테리아 단일세포로 백신접종된 마우스에서 생체내 세포독성 활성의 평가.

백신접종된 마우스가 생체내에서 항원 특이성 표적 세포를 용해분리하는 능력을 평가하기 위해 일련의 연구를 수행하였다. 첫번째 연구에서, Balb/c 마우스 는 리스테리아 단핵구유전자 균주DP-IA029 (actA^-), DP-L4029 발현 AH1/A5, 및 DP-LA029 uvrAB^-발현 AH1/A5중의 하나로 정맥내 (IV) 백신접종되었다. AH1/A5 발현 균주는 또한 실시예 13의 두번째 방법에 따라서 S-59 UVA로 처리하였다. AH 1-A5를 발현하는 리스테리아 구성체는 또한 LLO과 OVA도 발현한다.

백신접종은 모든 그룹에 대해서 0일날 수행되었고, 추가로 S- 59 처리된 균주에 대해서는 표 20에 지시된 용량으로 (0.1 LD₅₀) 1일 및 2일째에 수행되었다. 각각의 균주와 대조군에 있어서, 2 그룹의 3 마우스는 백신접종되었다. 표적 세포 집단은 RPMI 1640 배지에서 20마리의 투약하지 않은 Balb/c 마우스의 비장을 수집함으로써 제조되었다. 세포는 분열되었고 적혈구를 용해분리하엿다. 백혈구를 카운팅하였고 4개의 동일한 집단으로 나누었다. 각각의 그룹은 특이성 펩티드로, 37 ℃에서 90 분동안 0.5 μg/mL에서, 표적 AH1 (SynPep, Dublin, CA로부터의 SPSYVYHQF (SEQ ID NO : 20)), 표적 AH1-A5 (SPSYAYHQF(SEQ ID N0 :21), SynPep), 또는 대조군의 두개의 집단 (β-갈, TPHPARIGL (SEQ ID NO :37))중의 하나로 진동하였다. 세포는 그후 배지에서 3회, PBS + 0. 1% BSA에서 2회 세척하였다. 세포는 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르 (CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR)으로 표지화하기 위해 따뜻한 PBS +0.1% BSA (10 mL 이하)에서 mL당 1 x10⁷로 재현탁시켰다. 표적 세포 현탁액에, 1.25μL 의 5mM 스톡의 CFSE를 첨가하고 샘플을 소용이와 함께 혼합하였다. 대조군 세포 현탁액에, 10배 희석의 CFSE 스톡을 첨가하고 샘플을 소용돌이와 함께 혼합하였다. 세포는 37℃에서 10 분동안 배양하였다. 큰 부피의( > 40 mL) 얼음냉각 PBS을 첨가함으로써 염색을 멈췄다. 세포를 실온에서 PBS로 두번 세척하고, 그후 재현탁시키고 카운팅하였다. 각각의 세포 현탁액을 mL당 50 x 10⁶로 희석하고 100 μL의 각각의 개체를 혼합하고 6일째에 투약하지 않은 또는 백신접종된 마우스 중의 하나의 꼬리 정맥을 통해 주사되었다. 각각의 균주 또는 대조군에 대해서, 3 마우스의 그룹에 β-갈 및 AH-1 또는 β-갈 및 AH1-A5를 주사하였다. 12-24 시간 후에, 비장을 수집하고 총 5 x 10⁶ 세포를 흐름세포측정에 의해 분석하였다. 높은(표적) 및 낮은(대조군) 형광 피크가 계산되었고, 두개의 비를 사용하여 HBSS 대조군 집단에 대한 표적 세포 용해의 퍼센트를 확립하였다. 결과는 표 20과 도 23A에 나와있다. (이 실시예에서의 표는 3 마우스에 대한 평균을 보여주고, 도면은 지시된 샘플에 대한 각각의 마우스로부터 대표적인 히스토그램이다(꼭 동일한 마우스일 필요는 없다).) S-59 처리된 균주를 사용하는 백신접종은 S-59 처리된 actA^-균주에 비해서, uvrAB^- 돌연변이에 있어서 AH1에 대한 약간 더 우수한 반응을 나타내고 uvrAB^-돌연변이에 있어서 AH1-A5에 대해 약간 더 높은 반응을 나타낸다.

이 연구는 모든 그룹에 대해서 14일째에 추가의 백신접종 그리고 추가로 S-59 처리된 균주에 대해서 15일과 16일에 백신접종을 반복하였다. 이 표지화된 표적 세포는 20일째에 주사되었다. 결과는 표 21 및 도면 23B에 나와있다. S-59 처리된 uvrAB ^- 돌연변이에 대한 반응은 추가 백신접종으로 상당히 개선될 수 있고, 이는 S-59 처리된 actA^-균주에 대한 경우가 아니다.

OVA 발현 균주에 대해서 S-59 처리 한것과 안한 것을 포함하여, OVA를 발현하는 actA^-, actA^- 및 OVA를 발현하는 actA ^- uvrAB ^- 를 사용하여 유사한 연구를 수행하였다. 이 연구는 C57B1/6 마우스를 사용하였다. 6마리 마우스의 그룹들은 0일째에 (또한 1일과 2일에 S-59 처리됨) 백신접종되었고 각각의 그룹중 3개는 6일째에 표지화된 표적 세포를 주사하였다. 남아있는 마우스는 14일째에 백신접종되었고 (또한 15 및 16일에 S-59 처리됨) 20일에 표지화 표적 세포로 주사되었다. 이 연구에서, 투약받지않은 표적 비장 세포는 β-갈 (낮은 CFSE) 또는 SL8 (높은 CFSE)로 진동되었다. 결과는 표 22와 도면 23C에 나타낸다. 다시, S-59 처리된 uvrAB^-돌연변이에 대한 반응은 추가 백신접종으로 상당히 강화된다.

실시예 21

uvrAB 결손이 있고 없는 탄저균의 S-59/UVA 처리.

실시예 7-9 및 Camilli et al., Molecular Micro., 8: 143-147 (1993)에서 상술된 대립 교환 방법을 사용하여 Bacillus anthracis Sterne 균주를 변형시켰다.균주의 독성은 약화된다(pXO1⁺, pX02^-).

탄저균으로부터의 uvrAB 유전자는 확인되었다(Genbank 수탁 번호 AE017040, 탄저균 Ames 균주, 완전한 게놈의 18의 섹션 17, uvrAB 유전자 코딩 서열: nts. 212613-217471) 및 uvrAB 유전자 결손을 갖는 pKSV7에 기반한 플라스미드가 스플라이스 오버랩 확장 (SOE) PCR 및 아래에 기술된 단계들을 사용하여 제작되었다 (pKSV7-dl uvrAB) :

1차 PCR 반응 : B. anthracis uvrAB 유전자 5' 및 3' 말단으로부터 상류와 하류의 서열의 대략 1000 bps이 각각, 증폭되었다.

주형: B. anthracis Sterne 유전체 DNA

프라이머 쌍 1: uvrB의 5'말단으로부터 상류의 영역 1000 bp의 증폭.

(암플리콘 크기 (bps):1029)

Ba-225099F:5'-CTGTGCTTTGCGAATGGAAAGAAGC (SEQ ID

NO : 38)(Tm: 74 ℃)

Ba- (3' uvrA-R +)226109R :

5'-GTTTTCATTCATACACTTAGACAAGCGTTGGCTTTTGCA

CTTC (SEQ ID NO : 39) (Tm: 120 ℃) (밑줄친 서열은 uvrA 카르복시 종말의 하류 영역과 상보적이다.) 또는

Ba-226109R: 5'-GACAAGCGTTGGCTTTTGCACTTC (SEQ ID NO : 40)

(Tm: 72 ℃).

프라이머 쌍 2: uvrA의 3'말단으로부터 하류 영역의 증폭.

(암플리콘 크기 (bps): 990)

Ba- (3' uvrA-R +) 230779F:

5'-CAAAAGCCAACGCTTGTCTAAGTGTATGAATGAAAACC

GAGTGG (SEQ ID NO : 41) (Tm: 126℃) (밑줄친 서열은 uvrB 아미노 종말의 하류 영역에 상보적이다. ) 또는 Ba- 230779F:5'-AAGTGTATGAATGAAAACCGAGTGG (SEQ ID NO : 42) (Tm : 70 ℃)

Ba-231769R :5'-CATATAAAGGTTCCACAATTGCCTTTTC (SEQ ID NO : 43)

(Tm : 76 ℃)

2차 PCR 반응 : 쌍 1의 역방 프라이머와 쌍 2의 전방 프라이머 사이의 상보성을 이용하는, SOE PCR을 통해 1차 PCR 암플리콘의 융합. uvrAB 코딩 서열의 정확한 결손을 초래한다: nts. 226110-230779=4670 bps.

주형: 깨끗한 1차 PCR 반응

프라이머 쌍: (암플리콘 크기 (bps): 1973)

Ba-225118F :5'-GAAGCAGAAATGAAGCCAATACTCAATC (SEQ ID

NO : 44)(Tm : 78 ℃)

Ba-231761R : 5'-GGTTCCACAATTGCCTTTTCAATAATC (SEQ ID

NO : 45)(Tm : 74 ℃)

제작 : 1차 PCR 반응 (3 온도 싸이클)은 Vent DNA 폴리머라아제 (NEB) 및 Sterne 균주 유전체 DNA를 사용하여 수행된다. 4개의 1차 PCR 반응은 스플라이스 오버랩 확장(SOE)에 사용된 프라이머와 함께 및 프라이머없이 둘다 수행된다. (만일 Ba- (3' uvrA-R +) 226109R 또는 Ba- (3' uvrA-R +) 226109R 프라이머를 함유하는 반응이 상당한 암플리콘 생성물을 산출하지 않았다면, Ba-225099F/Ba-226109R 또는 Ba-230779F/Ba-231769R 프라이머 쌍과의 반응으로부터 암플리콘에서의 이들 프라이머가 사용되었다.) 1% 아가로스 겔(1029 bps 및 990 bps)에 의한 안트라시스 1차 암플리콘의 예상된 크기가 확인되었다. 반응은 S6 칼럼 (BioRad) 또는 GeneClean (BIO 101)으로 세척되었다.

2차 PCR 반응은, 주형 (ca. 5μl)과 대략 동일한 양의 각각의 1차 반응을 이용하여 수행되었다. 1% 아가로스 겔 (1973 bps)에 의해 2차 PCR 반응으로부터 리스테리아 암플리콘의 예상된 크기를 확인하였다.

anthracis dl uvrAB 암플리콘을 pCR2.1-Blunt II-TOPO 벡터 안으로 삽입하였다. 플라스미드 pCR2.1-TOPO-dl uvrAB 플라스미드 DNA을 Kpnl 및 Pstl으로 소화시키고 2033 bp 단편을 겔 정화한다. KpnIlPstI 2033 bp 단편을, Kpnl 및 Pstl 로 소화되고 CIAP (pKSV7-dl uvrAB)로 처리에 의해 제조된 pKSV7 벡터 안으로 삽입하였다. pKSV7-dl uvrAB 에서 dl uvrAB 서열의 충실도를 확인하였다.

uvrAB 유전자는 pKSV7-dl uvrAB 플라스미드와의 대립 교환에 의해 B. anthracis Sterne로부터 제거되었다. 플라스미드 pKSV7-dl uvrAB는 클로람페니콜 저항성을 위해 전기천공법 선택에 의해 B. anthracis Sterne 균주 안으로 도입되었다. 전기천공법의 진동수를 상당히 증가시킨 동결 단계를 사용하여 전기천공법을 수행하였다. B.anthracis 배양은 37℃에서 3 ml BHI 0.5% 글리세롤에서 진탕하면서 O/N 성장되었다. 0.5 ml 배양은 500 ml E- 플라스크에서 50 ml BHI 0.5 % 글리세롤(OD₆₀₀=0.1)로 이동시켰다. 샘플을 200 rpm에서 37℃에서 배양하였다. (또는 250 ml 플라스크에서 0.1-0.2 ml 내지 25 ml BHI 0.5% 글리세롤). OD₆₀₀=0.6-0.8 (대략 1 시간 45분)에서, 벌레들을 500 ml 일회용 살균 필터 장치에서 수집하였다. 벌레들을 냉각 전기천공법 완충액 (1 mM HEPES 10% 글리세롤 pH 7.4)으로 3 x 25 ml 각각 세척하였다. 세포는 1/20 원래 부피 (50 ml 배양을 위한 2.45 ml의 전기천공 완충액)에 재현탁하고 얼음위에 유지시켰다. 1 μg (1 내지 5 ul의 미니프레프)의 "매우 깨끗한" 비메틸화 플라스미드 DNA를 0.2 cm 갭 전기천공 큐벳 (대조군=no DNA)에서 0.2 ml 세포 현탁액으로. 샘플을 그후 15 min간 얼음에 유지시켰다. 세포는 그후 25μFD, 200Ω, 2.5 kV에서 펄스하였다 (또는, 대안으로서는, 0.4 ml 세포를 400Ω에서 0.4cm 큐벳에 펄스하였다). 시간 상수는 대략 4-5 msec였다. 펄스 직후에, 1ml BGGM (10% 글리세롤, 0.4% 글루코스 및 10 mMMgC1₂을 함유하는 BHI)를 첨가하였다. 세포는 살균 폴리프로프. 튜브로 이동시키고 진탕하면서 37℃ 1 시간 30분 배양하였다. 세포는 펠릿화하고, 200μl BGGM 에 재현탁하고 선택적인 배지에 플레이팅한다.

pKSV7-dl uvrAB을 41℃에서 B. anthracis 염색체 안으로 통합시켰다. pKSV7-dl uvrAB를 허용하는 온도에서 삭제하고 치료하여, 클로람페니콜 민감한 콜로니를 초래한다. PCR 프라이머는 염색체에서 결손을 검출하도록 설계되었다. 20%의 클로람페니콜 민감한 콜로니는 B anthracis 염색체에서 결손을 정박시켰다. PCR 분석은 pXO1 독성 플라스미드의 uvrAB^- 균주 지시된 보유의 것이다.

두개의 uvrAB^-클론 (클론 8 및 클론 32A)은 모 균주와 함께, 37℃에서 300 rpm에서 0.3의 OD₆₀₀ 까지 BHI에서 성장시킴으로써 S-59-처리되었고, 그 지점에서 50 mL의 용액을 깨끗한 플라스크로 이동시키고 S-59를 표 23에 지시된 농도에 첨가되었다. 이들 샘플은 격렬한 교반과 함께 대략 1 시간동안 37℃에서 300 rpm 로 배양하였다(OD₆₀₀ 대략 1.0, 대략 1 x 10⁹/mL). 1 mL 알리콧을 제거하여 적정농도를 평가하고 나머지를 150 mm Petri 접시로 옮기고 6 J/cm² 의 UVA 선량의 (FX-1019)에서 조사하여, 하기 표 23와 도면 24에서 지시된 바와 같이, 모체 균주와 비교할때, 적정농도에서 6-log 감소를 얻었다. 이는 리스테리아 단핵구유전자 uvrAB ^- 균주에 대해 관찰된 것과 유사한 B. anthracis 에서 소라렌 처리에 대한 민감성을 증명한다.

실시예 22

사람 암의 생체내 치료를 위한 본 발명의 백신의 사용

사람 암의 치료 또는 예방의 예로서, 병원균에 의한 감염에 의해 로딩되고 활성화된 항원-나타내는 세포를 포함하는, 병원균의 증식이 약화되도록 변형된 백신을 (이때 미생물 유전자 발현은 실질적으로 영향받지 않는다), 개체에게 투여한다. 병원균은 실시예 4 및 5의 하기의 프로토콜에 따라 제조될 수 있고, 이때 사람 종양 항원(들)을 인코딩하는 어떠한 원하는 원핵 발현 카세트는 예를 들어 실시예 8에서 기술된 pPL2 통합 벡터 또는 그것의 어떠한 변형을 사용함으로써, 또는 당업자들에게 통상적인 어떠한 방법에 의해 병원균 안에 통합된다.

항원-나타내는 세포(APCs)는 그후 본원에서 약술한 것들과 같은 방법을 사용하여, 변형된 병원균으로 로딩되고 활성화된다.

결과의 APC 백신은 미정제, 또는 바람직하게 정제된 형태로 조제화될 수 있다. 백신 조성물은 액체 현탁액으로서 제조될 수 있다. 게다가, 그들은 방부제(예를 들어 티메로살, 2- 페녹시 에탄올), 안정화제 (예를 들어 락토오스, 모노소듐 글루타메이트), 아쥬반트 (예를 들어 수산화알루미늄, 알루미늄 포스페이트, 시토카인), 항생제 (예를 들어 네오마이신, 스트렙토마이신)와 같은 첨가제 또는 다른 물질들과 함께 조제화될 수 있다. 제제는 살균 물, 식염수, 등장 완충화 식염수(예를 들어 생리학적 pH로 완충화된 포스페이트), 또는 다른 적절한 희석제와 같은, 적절한 희석제에 재현탁 또는 희석될 수 있다.

백신은 어떠한 주어진 악성의 또는 전염성 질환에 적절한 어떠한 경로에 의해서는 물론이고, 경구, 경비, 정맥내, 진피내, 복막내, 근육내, 림프액내 및 피하 경로를 포함하는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 유효량의 백신은 치료를 위해 개체에게 투여될 것이다. 치료를 위해서, 유효량은 원하는 면역 반응을 가져올 복용량이고, 이때 면역 반응은 표적화 종양의 성장을 늦추고, 종양의 크기를 감소시키거나, 또는 바람직하게는 종양을 완전히 제거한다. 백신의 투여는 적절한 간격을 두고 반복될 수 있고, 백신접종된 개체에서 다중의 별개의 부위에서 동시에 투여될 수 있다. 예방 처리를 위해서, 유효량은 암을 발전시키는 개체의 가능성이 상당히 감소되도록 보호 면역 반응을 초래할 복용량이다. 백신접종 요법은 단일 복용량으로 구성될 수 있고, 또는 보호 면역 반응이 성립될때까지 적절한 간격으로 반복될 수 있다.

각 개체의 치료적 처리는 암으로 진단된 각 개체에서 초기 치료로서 시작될 수 있고, 또는 다른 치료와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양이 외과수술로 제거된 개체 또는 방사선 치료법으로 또는 화학요법에 의해 치료된 개체는 각 개체에서 어떠한 잔여 종양을 감소시키거나 제거하기 위해서 또는 암의 재발의 위험을 줄이기 위해서 백신으로 치료될 수 있다. 각 개체의 예방 처리는 환경적 조건 또는 유전적인 경향(소질)로 인해서 특정 암에 걸릴 증가된 위험을 갖는 각 개체각 개체작될 것이다.

실시예 23

리스테리아의 약화된 균주에 기반한 재조합 종양 Ag-분비 백신의 생성

항원 분비 및 MHC 클래스 I 공정을 촉진하기 위한 리스테리올리신(Listeriolysin O) (LLO)의 절두의 형태와 융합된 닭 난백 알부민 (OVA)은 선택된 약화된 리스테리아 균주의 면역원성을 평가하기 위한 연구에서 모델 항원으로서 사용되었다: 종양 항원 발현 카세트는 독점적인 pPL2 통합 벡터를 갖는 약화된 리스테리아 균주의 패널의 염색체 위에서 부위-특이적으로 독이 없는 부위 안으로 통합되었다. 재조합 리스테리아 균주는 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이(데이타는 도시하지 않음) 예측된 변형된 LLO-OVA 융합 단백질을 발현하고 분비하였다. 세포내 성장 동역학은 물론이고 액체 배양액 배양에서 이들 재조합의 각각의 성장은 또한 그것의 모체와 구별할 수 없었다. 더욱이, 재조합 OVA-발현 균주는 변형되지 않은 모체 균주 중 두개의 인자내에 있는 IV LD₅₀ 을 가지는 것으로 나타났다(표 24).

통합 벡터는 다중의 재조합 리스테리아 백신 후보자의 신속한 유도를 촉진한다. 단일 구성체는 어떠한 수의 유일한 유전학적 배경안으로 평행하게 매칭되어 신속하게 동질유전자형 균주를 만들 수 있다.

실시예 24

생존가능하지 않지만 대사적으로 활성인 리스테리아를 제조하기 위한 소라렌-유발 DNA 가교결합

유전학적으로 약화된 리스테리아를 사용하는 것에 더하여, 리스테리아-기반 생체외 항원 전달 플랫폼을 위한 안전을 확보하기 위해, 본 발명자들은 소라렌으로의 처리를 통해서 완전히 비활성될 수 있지만 대사적으로 활성이고 따라서 세포를 감염시킬수 잇는 능력을 보유하고, 포식리소좀으로부터 벗어나고 클래스 I 경로를 통해 인코딩된 항원의 제시를 촉진하는 리스테리아 균주를 엔지니어링하였다. 엔지니어링된 리스테리아 균주는 정교하게 소라렌, 즉 UVA 광으로 조사한 후에, 박테리아의 게놈에서 비가역적인 가교결합을 형성하는 화합물의 그룹과의 비활성화에 민감하고, 따라서 그들은 다중화가 불가능하다. 소라렌-매개된 DNA 손상을 수복할 수 없는 리스테리아의 돌연변이균주는 자외선 광 저항 (uvr) AB 유전자 (uvrAB)을 삭제함으로써 생성되었고, 이것은 리스테리아 및 다른 박테리아에서 뉴클레오티드-절단 수복을 필요로한다 (Sancar et al. , Ann. Rev. Biochem., 57: 29-67(1988)). 소라렌 S-59는 Helinx 로 알려진 DNA 가교결합 기술에서 사용된 많은 Cerus 화합물 중의 하나이다 (Lin, L., Psoralen photochemical treatment of platelets, Science and Medicine,1998 ; Hei, et al., Transfusion, 39: 239-48 (1999) ). 리스테리아 uvrAB 결손 돌연변이를 검출의 제한까지 비활성화하는 소라렌 농도에서 , 손상되지 않은 DNA 수복 메카니즘을 갖는 모체, 비-돌연변이 균주는 UVA 광 비활성화에 덜 민감한 4개의 log 이상이다(도면 25B). S-59/UVA 비활성화 리스테리아 uvrAB는 MTT 검정법에서 결정된 바와 같이 그들의 사립체 활성을 유지하였고 ³⁵S-메티오닌-표지화 펄스-추적 실험에서 결정된 바와 같이, 그들의 유전체 레퍼토리를 발현하는 그들의 능력을 보유하였다 (도면 26 및 도면 10). S-59/UVA 비활성화 리스테리아 uvrAB 이지만 비활성화 모체 균주는 아닌 것은 그들의 유전학적 레퍼토리의 계속적인 발현을 증명하였다. 비활성화 모체 균주의 발현 수준은 상당히 감소되었고, 전체적인 비활성화에 요구되는 S-59 농도에서 S-59/UVA 처리는 아마도 인코딩된 종양 항원의 발현을 포함하여, 리스테리아 유전자 생성물의 발현을 상당히 감소시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 25

생존가능하지 않은 리스테리아 uvrAB은 DC을 감염시키고 포식리소좀으로부터 벗어나는 능력을 보유한다.

대사 활성을 보존하는 것에 더하여, 수지상 세포 (DC)의 감염시에 S-59/UVA 비활성화 리스테리아 uvrAB 균주에 의해 MHC 클래스 I 경로 안으로의 효과적인 항원 로딩을 증명하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 이제 LLO를 인코딩하는 hly 유전자의 결손으로 인한, 포식리소좀으로부터 벗어날 수 없는 리스테리아 돌연변이 (DP-L4027)로의 DC 감염이 MHC 클래스 I의 문맥에서 항원의 제시를 제거한다는 것을 증명하였다.

리스테리아 uvrAB 감염된 DC의 포식리소좀으로부터의 벗어남을 증명하기 위해 , 본 발명자들은 세포질 리스테리아가 숙주-세포 액틴 필라멘트, 소위 "액틴 구름"에 의해 둘러싸이고, 그것은 형광 현미경검사법에 의해 시각화될 수 있다는 사실을 이용하였다. 리스테리아 표면위의 액틴 중합은 박테리아 ActA 단백질 및 다른 숙주 세포 인자들에 의해 매개된다. 쥐과동물 DC 세포주, DC2.4은, 1의 감염의 다중성(MOI)에서 30 분동안 37 ℃에서 리스테리아 wt, S-59/UVA 비활성화 리스테리아 uvr AB 및 리스테리아 △ZZO (DP-L4027)로 감염되었다. 세포외 박테리아는 몇번 세척에 의해 조심스럽게 제거되었고 DC는 세포외 박테리아의 성장을 방지하기 위한 겐타마이신의 존재하에서 37 ℃에서 추가의 5 시간동안 배양되었다. 야생형 리스테리아 또는 완전히 비활성화 리스테리아 uvrAB 로 감염된 DC2.4는 전형적인 리스테리아의 세포질 국소화에서 전형적인, 액틴 구름 또는 액틴 혜성 꼬리를 증명하였다 (도면 27). 그러나, 리스테리아 LLO 무효 돌연변이로 감염된 DC2.4 세포에서는 액틴과 리스테리아의 어떠한 공동국소화가 관찰되지 않았고, 이는 박테리아가 포식리소좀으로부터 벗어날 수 없었다는 것을 암시한다. 이 결과는 이들 DNA 수복 돌연변이는 포식리소좀으로부터 벗어나고 감염된 세포의 시토졸 안으로 들어가는 능력을 보유하고 한다는 것을 증명하였고, 여기서 항원은 분비될 수 있고, MHC 클래스 I 경로를 통한 직접적인 제시를 위한 필수의 단계이다. 또한 상기 실시예 17, 및 도면 21을 참조하라.

실시예 26

생존가능하지 않은 리스테리아 uvrAB은 항원을, 감염된 수지상 세포 (DC)의 MHC 클래스 I 경로 안으로 효과적으로 로딩한다.

S-59 소라렌 비활성화 리스테리아 uvrAB가 감염된 세포 내에서 포식리소좀을 벗어나는 유일한 능력으로 인해, 시토졸 리스테리아에 의해 분비된 유전자 생성물은 가공되고 MHC 클래스 I 경로를 통해 제시된다. 항원을 DC의 MHC 클래스 I 경로 안으로 로딩하는 S- 59/UVA 비활성화 리스테리아 uvrAB 의 능력을 테스트하기 위해, DC2.4 세포를, 다른 농도의 S-59으로 비활성화된 OVA- 발현하는 리스테리아 균주, L4029 uvrAB OVA로 1의 감염의 다중성(MOI)으로 감염시켰다. 모체 리스테리아 OVA 및 가열 사멸된 리스테리아 uvrAB OVA은 대조군의 역할을 하였다.

B3Z 세포로의 배양후에 리스테리아의 포식후에 클래스 I 분자위에서 DC2.4에 의한 OVA 펩티드의 제시는 측정되었다. B3Z는 쥐과동물 K^b 클래스 I 분자에서 제시된 OVA_257-264 (SL8) 에피토프에 대해 특이성인, LacZ-유도성 CD8⁺T- 세포 하이브리도마이다(Sanderson, Int. Immunol., 6:369-76 (1994) ). SL8 의 클래스 I-제한된 B3Z 세포로의 제시는 B3Z에 의한 β-갈 합성의 유도를 초래한다. 생산된 β-갈의 양은 색소 기질 CPRG의 가수분해에 의해 측정될 수 있고 APCs의 표면위에서 제시된 SL8/Kb 복합체의 양의 지표이다. 도면 9A 및 9B에서 나타낸 바와 같이, 동족 모체 균주가 아닌, S-59/UVA 비활성화 리스테리아 uvrAB OVA 균주는, 그것의 번식 능력에 상관없는 MHC 클래스 I 경로 안으로 항원을 로딩하는 그것의 능력을 유지하였다. (이는 실시예11에서 기술된 것과 동일한 데이타이다.) 70 내지 100 nM,의 S-59 농도를 사용하는 전체 비활성화에서도, B3Z 활성화의 90%이상은 유지되었다. 대조적으로, 손상되지 않은 DNA 수복을 갖는 모체 리스테리아 OVA 균주는 더 높은 농도의 S-59 가 비활성화를 위해 사용될 때, B3Z T-세포 하이브리도마를 활성화하는 그것의 능력을 잃는다. 리스테리아 uvrAB OVA 균주와 대조적으로, B3Z 활성화 및 BHI 한천 플레이트에서 콜로니를 형성하는 모체 리스테리아 OVA 균주의 능력은 밀접하게 상호관련이 있었고, 오직 생존가능한 리스테리아 OVA만이 DC2.4 세포를 감염시키고 항원을 MHC 클래스I 경로안으로 로딩할 수 있다는 것을 암시한다.

게다가, 가열 사멸된 리스테리아 uvrAB OVA는 B3Z 활성화를 초래하지 않았다. 이 결과는 리스테리아가 항원을 MHC 클래스 I 경로안으로 로딩하는 능력이 소라렌-매개된 DNA 손상을 수복하는 그들의 능력을 막도록 변형된 S-59/UVA 비활성화 리스테리아를 사용하여, 증식을 위한 요구조건으로부터 빠질 수 있다는 것을 증명한다.

항원을 1차 DC의 MHC 클래스 I 경로 안으로 로딩하는 리스테리아 uvrAB OVA의 능력을 평가하기 위해, 미성숙 쥐과동물 BM-DC을 충분히 비활성화 S-59/UVA 처리된 리스테리아 uvrAB OVA으로 감염시켰다. 생존가능한 리스테리아 uvrAB OVA, 모체 균주 및 L4027는 대조군 역할을 하였다. 도면 28에 나타난 바와 같이, OVA-발현으로 BM-DC 감염되지만 모 균주가 아닌것은 시험관내에서 B3Z 세포를 자극하였다. 살아있는 그리고 생존가능하지 않은 S-59/UVA 처리된 리스테리아 uvrAB 돌연변이 균주 (LA029 uvrAB OVA)사이에 어떠한 유의적 차이도 관찰되지 않았고, 이는 포식리소좀으로부터의 박테리아의 벗어난 후에, 리스테리아 uvrAB의 번식 능력이 없음에도 불구하고, 1차 DC의 MHC 클래스 I 분자가 효과적으로 리스테리아-유도된 펩티드와 함께 시토졸 안으로 로딩된다는 것을 암시한다. 중요하게는, 열 사망에 의한 리스테리아 actA OVA 비활성화는 MHC 클래스 I 경로에서 OVA 펩티드의 어떠한 유의한 제시도 초래하지 않았고 이는 가열 사멸된 박테리아로 DC를 배양하는 것은 MHC 클래스 I 분자의 어떠한 유의한 항원 로딩을 초래하지 않는다는 것을 암시한다.

실시예 27

리스테리아는 직접적으로 사람 DC를 감염시키고 활성화한다

강력한 항원 전달 플랫폼의 개발을 위해서 DC의 활성화/성숙은 항원을 MHC 클래스 I 경로 안으로 효과적으로 전달하는데 더하여 요구된다고 널리 생각된다. 인 시투, 미성숙 DC는 주변 조직에 존재하고 거기서 그들은 연속적으로 항원을 흡수하고 프로세싱하지만, 그것은 박테리아가 제공하도록 하는 것, 활성화/성숙 프로세스를 개시하는 것과 같은, 활성화 자극의 충돌이고, 케모킨 리셉터의 조정 및 DC의 배수 림프절의 T 세포 영역으로의 이동을 초래한다. 본 발명자들은 사람 단핵세포-유도된 DC의 표현형 성숙 및 시토카인 생산을 유발하는 야생형 리스테리아 (L4056)의 효능을 평가하였다.

도면 29에 나타낸 바와 같이, 리스테리아와 사람 미성숙 DC의 충돌은 성숙 마커, CD83는 물론이고(도 29B), 활성화 마커, CD86 및 HLA-DR의 상향조절을 초래하였다(도 29A). 더욱이, IL-12p70 및 TNF-o와 같은 높은 수준의 전-염증 시토카인을 분비하는 그들의 능력에 의해 보여진 바와 같이, 사람 미성숙 DC의 리스테리아로의 노출은 그들의 면역-자극 능력을 증가시킨다(도 29C).

실시예 28

S-59/UVA 비활성화 리스테리아 uvrAB OVA은 시험관내에서 OVA-특이성 면역을 유도한다

본 발명자는 생체내에서 OVA-특이성 면역을 유발하는 S-59/UVA 비활성화 리스테리아 uvrAB OVA 백신의 효능을 평가하였다. 암컷 C57BL/6 마우스는 S-59/UVA 비활성화 리스테리아 uvrAB OVA의 1 x 10⁸ 입자들로 정맥내로 백신접종되었다. OVA-특이성 면역의 유도는 백신접종 7 일후에 평가되었다. 현저하게, 모 리스테리아 OVA 균주는 아닌, S-59/UVA 비활성화 리스테리아 uvrAB OVA를 받은 마우스는 도면 30에 나타낸 바와 같이, 상당한 OVA-특이성 CD8⁺ T 세포 반응을 갖추었다. 더욱이, 가열 사멸된 리스테리아 uvrAB OVA로 마우스를 백신접종하면 OVA-특이성 면역의 유발을 초래하지 않았다.

실시예 29

천연 (CAP1) 또는 강화된 작용제 세포독성 T 림프구 에피토프(CAPL-6D) 중의 하나를 함유하는 전장 CEA을 발현하는 두개의 재조합 약화된 리스테리아 actA/uvrAB 균주의 제작

CEA는 내피에서 유도된 소화계 상피 및 태아 결장의 선암에서 발견되는 180 kDa 큰 단백질이다. CEA는 GPI-앵커에 의해 세포막에 부착된다. 단백질은 7 면역글로불린-형 도메인을 함유하고 C-종말은 비-특이성 교차-작용 단백질, NCA, 종양태아 항원 유전자 패밀리의 한 멤버와의 상동관계를 증명한다. 본 발명자들은 암 환자에서 CEA-특이성 면역을 유발하는데 보다 강력한 것으로 증명된 (표 25) HLA^*A0201-제한된-CEA 천연 T 세포 에피토프 CAP 1(YLSGANLNL) (SEQ ID NO :51) 또는 인핸서 작용제 세포독성 T 림프구 펩티드 CAP1-6D (YLSGADLNL) (SEQ ID NO: 52)(Zaremba-etal.-, Cancer Res., 57: 4570-7 (1997) )중의 어느 하나를 함유하는 전장 CEA를 제작하는 것을 제안한다(Fong et al., Proc. Natl. Acczd. Sci. U. S. A., 98: 8809-14 (2001) ).

CEA 종양 항원 발현 플라스미드는 부위-특이적으로 게놈 안으로 통합되는 벡터인 pPL2 백본 위에 구성된다(Lauer etal.,J. Bacteriol., 184: 4177-86 (2002) ). 두개의 플라스미드는 리스테리아 LLO로부터 유도된 분비 신호 및 PEST 요소들이 유전학적으로 전장 CEAcDNA과 융합되도록 구성될 것이다. 유전자 구성체의 5'말단으로부터 시작하여, 융합 단백질은 CEA에 융합된 박테리아 분비를 촉진하기 위한 LLO의 N-종말 영역으로 이루어질 것이다. 도메인의 정확한 연결은 오버랩 PCR에 의해 수행될 것이다. 모든 플라스미드 구성체의 충실도는 DNA 염기순서분석에 의해 확인될 것이다.

실시예 30

리스테리아 균주 L4029 uvr AB (△actA, △uvrAB)안으로 통합된 pPL2 CEAwt 및 pPL2 CEA-610D을 함유하는 두개의 약화된 재조합 리스테리아 균주의 유도, 및 CEK 항원의 발현과 분비를 입증한다

리스테리아 균주 L4029 uvrAB의 게놈에서 tRNA^Arg 유전자에 인접한 pPL2-CEA 구성체의 통합은 Lauer et al., J. Bacteriol., 184 : 4177-86 (2002)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 수행된다. 간단히 말해서, 플라스미드는 먼저 형질전환에 의해 E. coli 균주 SM10안으로 도입되고, 그후 접합에 의해 리스테리아의 원하는 균주 안으로 도입된다. 리스테리아 트랜스-접합체는 클로람페니콜 (pPL2) 및 스트렙토마이신 (리스테리아 균주) 선택적인 배지에 의해 선택되고 ; 이 프로세스의 효율은 대략 1 x 10^-4이다. 트랜스-접합체의 순도를 확보하기 위해서, 그리고 pPL2 백본의 박테리아 염색체 안으로의 통합을 확보하기 위해서, 제한된 수의 후보자 콜로니는 신선한 선택적인 배지 위로 스트리킹함으로써 3회 통과한다. CEA 구성체의 리스테리아 게놈 안으로의 정확한 통합은 콜로니-PCR에 의해 확인된다.

LLO-CEA 융합 단백질의 항원 발현 및 분비는 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅에 의해 결정되고, TCA는 박테리아 배양 유체를 침전하였다. LLO-특이성 토끼 다클론 항체 및 CEA-특이성 단일클론 항체는 재조합 리스테리아로부터 LLO-CEA 융합 단백질의 발현 및 분비를 확인하기 위해 사용된다. 누구나 균주 CEA를 발현하는 재조합 리스테리아의 생물학적 성질을 그들의 각각의 모체 균주와 비교할 수 있다. 정지 상태 배양 1: 100의 희석에 의해 신선한 배지 안으로 접종한 후에 뇌심장육수 (BHI) 액체배지에서의 성장 동역학을 결정한다. 과거에 본 발명자들은 리스테리아에서 유사한 또는 더큰 크기의 단백질을 발현하였다. 그러나, 박테리아에서 포유류 유전자 생성물의 재조합 단백질 발현은 각 개개의 단백질에 의존하는 도전(공격)을 낼지도 모른다. 만일 리스테리아에서 CEA 발현이 문제를 내면, CEA의 단편 또는 T 세포 미니-에피토프 중의 하나를 발현하는 하나는 리스테리아 균주를 구성할 수 있다. HLA*A0201-제한된 CEA 천연 T 세포 에피토프 CAP1 (YLSGANLNL) (SEQ ID NO :51) 또는 인핸서 작용제 세포독성 T 림프구 펩티드 CAP1-6D (YLSGADLNL) (SEQ ID NO : 52)는 본 발명자들의 존재하는 발현 구성체의 난백 알부민(OVA)내의 프레임내 임베딩 될 것이고, 그로인해 리스테리아 LLO 로부터 유도된 분비 신호 및 PEST 요소들은 유전학적으로 OVA와 융합된다. T 세포 미니-에피토프의 발현 및 면역원성은 gp70 T 세포 미니-에피토프, AH1 및 AH1- A5 및 B 16 Trp 1, Trp2, 및 gp1O0와 함께 이전에 증명된 바와 같이 보존된다(데이타는 도시하지 않음).

실시예 31

S-59/UVA. 처리에 의해 리스테리아 actA/uvrAB CEA 균주를 충분히 비활성화 하는데도, 최적의 대사 활성, 종양 항원 발현, 항원 제시 세포의 감염 및 포식리소좀의 이탈을 보유하는 조건의 확립.

유전자 발현의 결과로서 대사 활성은 최소수의 가교결합과 함께 가장 잘 유지된다. 항원 발현 수준을 손상되지 않은 채로 놔두고, 충분히 리스테리아 actA/uvrAB CEA 백신을 비활성화하는 최소량의 S-59/WA 처리를 위한 조건을 쉽게 성립할 수 있다. 비활성화 조건의 예는 OD₆₀₀=0.5의 log-상태 배양에서 200 nM까지 S-59 소라렌을 첨가하고, 이어서 배양이 하나의 최적의 밀도에 도달할때 6 J/m²의 UVA 광으로 비활성화한다. 비활성화 조건은 리스테리아 actA/uvrAB CEA 균주의 박테리아 성장 동안에 처리 시간의 변화는 물론이고, 변하는 농도의 S-59, UVA 용량, UVA 처리에 앞선 S-59 노출 시간에 의해 최적화된다. 모체 리스테리아 균주는 대조군으로서 사용된다. 리스테리아 (log-사망)의 비활성화는 BHI (뇌심장육수) 한천 플레이트위에서 콜로니를 형성하는 박테리아의 무능력에 의해 결정된다. 게다가, S-59/UVA 비활성화 후에 새롭게 발현된 단백질의 합성과 분비를 결정하기 위한 35S-펄스-추적 실험을 사용하여, S-59/UVA 비활성화 리스테리아의 CEA 및 LLO 및 p60와 같이, 독성 인자들의 발현을 확인할 수 있다. ³⁵S-대사 표지화를 사용하는 LLO 및 p60의 발현은 일상적으로 결정될 수 있다. S-59/UVA 비활성화 리스테리아 actA / uvr4B CEA는 1시간동안 35S-매티오닌의 존재하에서 배양될 것이다. LLO-CEA 융합 단백질, 내생 LLO, 및 p60의 항원 발현 및 분비는 전체 세포 용해물과, 박테리아 배양 유체의 TCA 침전 둘다의 결정될 것이다.

LLO-, p60-및 CEA-특이성 단일클론 항체는 면역- 침전에 있어서 비활성화후의 계속된 발현과 재조합 리스테리아부터의 분비를 확인하기 위해 사용될 것이다. S-59/UVA 비활성화 리스테리아 actA/uvrAB CEA의 발현 수준은 강력한 항원-특이성 T 세포 반응의 유도를 초래하는 본 발명자들의 현재 리스테리아-OVA 백신 균주와 비교될 것이다. 누구나 평가된 유전자 생성물의 발현 수준에 대한 제한된 효과와 함께 재생산가능한 전체 비활성화를 초래하는 S-59/UVA 조건을 선택할 수 있다.

실시예 32

비활성(S-59/UVA) 리스테리아(Listeria) actA/uvrAB CEA 백신을 갖는 사람의 미성숙 수지상 세포(DC)의 감염을 위한 프로토콜 및 백신 균주의 확립, 그것은 MHC 클래스 I의 문맥에서 CEA의 효과적인 제시를 야기한다.

DC의 생체 외 감염을 위한 최적의 조건은 3가지 독립적인 분석의 결과에 기초하여 결정된다:(1) 감염 상의 사람 미성숙 DC의 표현형 및 사이토카인 프로파일의 변화, (2) 동종이형 T 림푸구 반응을 야기하도록 하는 리스테리아(Listeria)-감염 DC의 효능, 및 (3) 시험관 내 CEA-특이적 HLA*A0201-제한 T 셀라인을 자극하도록 하는 리스테리아(Listeria) actA/uvrAB CEA 감염 DC의 효능.

1. 살아있고 완전히 비활성인 리스테리아(Listeria)-CEA 균주로 감염된 사람의 미성숙 DC의 표현셩 및 사이토카인 분비 프로파일의 결정 및 비교. 통상 사용되는 LPS, TNF-α, 및 α-CD40과 같은 활성 신호를 갖는 리스테리아(Listeria)-감염 사람 DC의 활성의 비교.

한가지는 주요한 사람 DC를 감염시키고 활성화하는 S-59/UVA 비활성 리스테리아(Listeria) actA/uvrAB CEA 균주의 효능을 특성화하고 최적화할 수 있으며, 사람 DC는 사전에 설명된 바와 같이(Fong et al., J. Virol., 76: 11033-41 (2002)) 고정 말초 혈액으로부터 풍부해 진다. 간단히 말해, PBMC는 Ficoll-Hypaque(스웨덴 업살라 파마시아) 위에서 원심분리에 의해 얻어지며, 그 후 단핵구는 이미 설명된 Mayordomo et al., Net. Med., 1: 1297-302(1995)와 같이 Percoll(파마시아)을 통해 밀도 원심분리에 의해 고갈된다. 단핵구-고갈 PBMC는 외인성 사이토카인을 첨가 하지 않은 10% 풀된 사람 AB 혈청으로 보충된 RPMI 1640(BioWhittaker, Walkersville, MD)에서 배양된다. 10% CO2를 포함하는 37℃의 습화된 배양기에서 24시간 배양한 후, DC는 15%(w/v) 메트리자마이드 구배(Sigma, St. Louis, MO)를 통해 원심분리 하여 림프구로부터 더 풍부해 진다. 풍부해진 DC 집단의 표현형은 유동 세포 측정기(HLA-DR 발현 및 CD3,CD 14, CD19, 및 CD56 발현의 결핍) 및 덱스트란 흡수에 의해 확인되어 진다. 리스테리아(Listeria)를 갖는 DC의 감염성을 평가 하기 위해, DC는 1시간 동안 S-59/UVA 비활성 리스테리아(Listeria) actS/uvrSB CEA 균주를 갖는 다른 MOI에서 배양되어 진다. 살아있는 리스테리아(Listeria)가 대조로서 이용될 것이다. 어떤 세포외적 리스테리아(Listeria)를 제거하기 위해 광범위한 세척을 한 후, 감염된 DC를 세포외 박테리아를 죽이기 위한 50 ㎍/mL 젠타마이신의 존재 하에서 더 배양시킨다. 리스테리아(Listeria)△actA△uvrAB CEA 균주를 갖는 DC의 감염에 있어서 표현형의 변화는 감염 후 다른 시지점에서 유동 세포측정기를 이용하여 CD80, CD83, CD86 및 MHC 클래스 II의 세포 표면 발현을 결정함으로써 평가되어 진다. T 헬퍼-1 및 T 헬퍼-2 타입 사이토카인의 발현은 세포측정 비드 어레이 키트(Pharmingen)을 이용하여 감염 DC 배양의 상청액으로부터 측정되어 진다. 감염 및 활성 조건은 LPS, TNF-α, 및 α-CD40와 같이 통상적으로 사용되는 자극제에 대하여 비교되어 진다. 감염 조건이 선택되어, 부모의 살아있는 리스테리아(Listeria) 균주에 가장 유사한 사이토카인의 분비 뿐만 아니라 시험관 내 사람 DC의 효능있고 일관된 자극 및 활성을 가져온다. 사이토카인을 사용하지 않는 말초 혈액으로부터 단리된 DC의 전체적 감염성이 저조하다면, 밀도 구배 원심분리 이전에 DC의 감염이 평가될 것이다. 더욱이, 단핵구-유도 DC와 같은 DC의 추가적 공급원은 비-생존적이고 살아있는 리스테리아(Listeria)에 대한 그들의 감염성에 대하여 평가되어 질 것이다. 간단히 말해, 사람 단핵구는 음성 선택을 이용하여 풍부해지고 1x10⁶ 세포/mL에서 배지(RPMI-1640+10% FCS)에서 부유되며, 1000 U/mL GM-CSF 및 1000 U/mL IL-4로 보충된다. 6-7일의 배양 후, 시험관 내 배양된 DC 집단의 표현형이 유동 세포측정기 및 덱스트란 흡수에 의해 확인되어 진다. 리스테리아(Listeria) 감염에 있어서 단핵구-유도 DC의 사이토카인 분비 패턴 뿐만 아니라 표현형의 변화가 앞서 설명되는 바와 같이 평가되어 진다.

2. 시험관 내에서 동종이형 T 세포를 활성화시키기 위한 살아 있거나 완전히 비활성인 리스테리아(Listeria)-CEA 균주와 함께 감염된 사람 미성숙 DC의 자극형 효능의 결정 및 비교.

리스테리아(Listeria)-감염 DC 집단의 자극형 수용능력을 다루기 위해, 한가지는 혼합 밸혈구 반응(MLR)에 있어서 제 1의 알로-반응성 T 세포를 자극하는 능력을 결정할 수 있다. 생체 내 면역 반응을 이끌어 내는 APC의 상대적인 효능은, 그들의 활성/성숙 상태에 따라서, 시험관 내 동종이형 T 세포 반응을 자극하는 그들의 수용능력에 의해 반영된다(Jung et al., Immunity, 17: 211 (2002)). 간단히 말해, DC는 완전히 비활성인 리스테리아(Listeria) actA/uvrAB CEA로 단리되고 감염되어 있다. 감염된 세포 집단의 표현형은 유동 세포측정기에 의해 확인될 것이다. 다양한 많은 수의 방사능 노출된(3000 rad) DC가 96-웰 U-바닥 플레이트(Costar, Cambridge, MA) 내에서 5×10⁴ 동종이형 반응자와 함께 공동-배양되어 진다. 무작위의 도너로부터 PBMC가 반응자로서 사용되어 진다. 6일 후, 배양액을 18시간 동안 [³H] 티민 중 1μCi와 함께 펄스화 시킨다. 세포는 유리 섬유 시트 상에서 수확되고 [³H] 티민의 통합은 섬과 계수기 상에서 방사능을 측정함으로써 결정될 것이다. 비-생존적인 리스테리아(Listeria)로 감염된 DC의 자극형 수용능력은 LPS ,TNF-α, 및 α-CD40과 같은 자극제를 이용하여 활성된 DC 뿐 아니라 살아있는 리스테리아(Listeria)로 감염된 DC에 대하여 비교되어 진다.

3. 시험관 내 CEA-특이적 HLA*A0201-제한 T 셀라인을 활성화시키기 위한 리스테리아(Listeria)-감염 사람 DC의 효능의 평가. 펩티드 첨가된 DC에 살아있거나 또는 완전히 비활성인 리스테리아(Listeria)로 감염된 미성숙 사람 DC의 비교.

DC의 알로-자극형 수용능력 뿐만 아니라 표현형 변화, 사이토카인 분비 프로파일은 생체 내 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하기 위한 DC의 효능에 대하여 간접적인 측정을 나타낸다. 완전히 비활성인 리스테리아(Listeria) actA/uvrAB CEA 균주에 의해 발현된 재조합 종양 항원을 제기하기 위한 DC의 효능은 L. Fong (출간되지 않은 자료)에 의해 생성된 CEA-특이적 HLA*A0201-제한 T 셀라인의 활성을 기초로 하여 평가되어 진다. 간단히 말해서, DC는 Milestone 3-1에 설명된 바와 같이 HLA*A0201 양성 도너의 말초 혈액으로부터 단리되어 진다. 최적 조건 하에서 감염된, 매우 다양한 수의 방사능 노출된(3000 rad)DC를 96-웰 U-바닥 플레이트(Costar, Cambridge, MA) 내에서 5×10⁴ CEA-특이적 HLA*A0201-제한 T 세포와 함께 공동-배양 시킨다. 24 시간 후, 세포 상청액을 수집한다. T 세포 활성은 IFN-γ, GM-CSF, 또는 IL-2 분비를 기초로 하여 측정되어 진다. 분비된 사이토카인은 상업적으로 이용가능한 세포측정 비드 어레이 키트(Pharmingen)를 사용하여 측정되어 진다. 비-생존적인 리스테리아(Listeria)로 감염된 DC의 자극형 수용능력은 LPS, TNF-α, 및 α-CD40과 같은 자극제를 이용하여 활성화된 DC 뿐만 아니라 살아있는 리스테리아(Listeria)로 감염된 DC에 대하여 비교되어 진다.

실시예 33

시험관 내 CEA-특이적 면역을 시동하고 추가적 전개를 위한 lead 리스테리아(Listeria)를 선택하도록 하는 리스테리아(Listeria)-로딩된 제 1의 사람 DC의 효능의 확인.

S-59/UVA 비활성 리스테리아(Listeria)-감염된 DC가 시험관 내에서 나이브 CEA-특이적 CD8+ T 세포 반응을 시동하는 것이 가능함을 확인 하기 위해, 리스테리아(Listeria) actA/uvrAB CEA를 갖는 확립된 최적 조건 하에서 감염된, 사람 미성숙 DC각 시험관 내 나이브 T 세포를 자극하는데 사용되어 진다. 나이브 또는 변형된 T 세포 에피토프를 함유하는 리드 리스테리아(Listeria) actA/uvrAB CEA 균주는 3가지 독립적 분석에 의해 결정되는 바와 같이 나이브 CEA-특이적 T 세포 반응을 유도하도록 하는 그것의 효능에 기초하여 선택되어 진다: (1) DC-시동된 T-세포 배양약의 [³H] 티미딘 통합; (2)⁵¹Cr 방출 분석에 있어서 측정된 시동된 CEA-특이적 T 세포 배양약의 세포독성 활성; 및 (3) 펩티드:MHC 테트라머 염색에 의해 결정된 CEA-특이적 T 세포의 빈도. 최적의 감염은 유동 세포측정기를 이용하여 CD80, CD83, CD86, 및 MHC 클래스 II의 세포 표면 발현을 결정함으로써 평가되는, DC의 표현형 변화, 및 감염 DC에 의해 분비된 사이토카인 프로파일에 의해 확인된다. 제 1의 T 세포 반응을 유도하기 위해, 일정한 수의 CD45RA⁺ T 림프구(2 x 10⁵/웰)를 96-웰, 둥근 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 7일 동안 방사능 노출된(3,000 R)리스테리아(Listeria)-로딩된 DC의 수를 변화시키면서 공동-배양하였다. 6일 후, 배양액을 18시간 동안 [³H]티민 중 1μCi와 함계 펄스화 시킨다. 세포를 유리 섬유 시트 상에서 수확하고 [³H]티민의 통합을 섬과 계수기(Wallac, Turku, Finland) 상에서 방사능을 측정함으로써 결정할 것이다. 또한, CEA-특이적 T 세포의 유도는 세포독성 T 세포 분석에서 평가되어 진다. 간단히 말해서, 5 x10⁶ CD45RA+ T 림프구를 5 x10⁶ 세포/1. 5mL의 배지에서 24-웰 플레이트(Costar)내에서 10:1 비율로 방사능 노출된(3,000 R) 리스테리아(Listeria)-로딩된 DC와 동시에 배양시킨다. T-세포의 세포독성 활성은 7일 후 표준 4시간 ⁵¹Cr-방출 분석에 있어서 평가된다. 간단히 말해서, 표적 셀라인 SW403, SW1417, A375, 및 T2를 2시간 동안 [⁵¹Cr]중 250μCi에서 배양시킨다. 표적 셀라인을 RPMI와 함께 3회 세척시키고 96-웰 U-바닥 플레이트(Costar) 내에서 적어도 5,000 표적/웰로 세배 평판배양 시킨다. 작동자 세포를 설명된 작동자/표적 비율로 ⁵¹Cr-표지된 표적 세포와 함께 공동-배양시킬 것이다. 4시간 배양한 후, 상청액을 수확하고 마이크로베타 카운터(Wallac, Turku, Finland)에서 계산한다. %특이적 용해는 다음 식으로써 계산될 것이다: 100% x (실험적 방출-자발적 방출)/ (최대 방출-자발적 방출). 최대 방출은 Triton X-100 (Sigma)를 함유하는 PBS 내 표적 세포의 용해에 의해 결정되어 진다. 마지막으로, 하나는 앞서서 설명된 바와 같이(Fong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 98: 8809-14 (2001)), MHC/테트라머 제시 CAP1 또는 CAP1-6D를 이용하여 시험관 내 시동 이후 CEA-특이적 T 세포의 빈도를 결정할 수 있다. 시험관 내 시동하기 전에 얻은 냉동저장된 CD45RA⁺ T 세포는 시험관 내 시동된 T 세포 배양액과 동시에 분석되어 진다. 총 1 x10⁶ 세포는 실온에서 30분 동안 대응 HLA*A0201 피코에리트린-표지된 MHC/테트라머를 이용하여 염색될 것이다. CD8(음성 게이트에 대하여 사용됨) 및 CD4, CD14, CD19, 및 CD56 (음성 "덤프" 게이트)에 대한 항체를 추천된 농도로 첨가시키고 4℃에서 30분 동안 배양시킨다. 염색 후, 샘플을 2번 세척하고 4가지 색상 유동 세포측정기로 분석시킨다. 본 발명자들은 사전에 테트라 염색을 위한 배경을 수립하였다. 20개의 지원자 혈액 도너를 동일한 방법론으로 분석하고 각각 CEA605-613 및 610D 테트라머에 대하여 0.30%±0.18% 및 0.27%±0.14%를 가졌다(Fong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 98:8809-14 (2001)).

실시예 34

이종 항원으로서 프로테나제 3 또는 PR1의 사용.

상기 특이적 실시예에 있어서 개략된 일부의 과정이 변형된 리스테리아(Listeria)에 의해 발현된 항원으로서 CEA 항원의 이용을 설명하지만, 당업계 통상의 기술을 가진 자가 유사한 과정이 예를 들어 프로테나제-3 또는 프로테나제-3 유도 항원과 같은 다른 항원을 발현시켜서, 로딩 및 활성/성숙을 결과로 가져오기 위해 시험관 내 생체 외에서 수지상 세포를 감염시키는 변형 리스테리아(Listeria)를 제조하는데 사용될 수도 있다. 당업계 통상의 기술을 가지는 자는 또한 결과의 DC 백신이 이후에 동물 또는 환자에게 투여되어서 프로테나제-3 및/또는 PR1에 대한 면역 반응을 유도시킬 수도 있음을 인지할 것이다.

예를 들어, 상기 실시예에서 기술된 L4029-uvrAB 리스테리아(Listeria) 균주는 프로테아제-3 유전자를 암호화하는 pPL2 벡터 백본 등 및/또는 리스테리아(Listeria) 의 게놈으로 항원-발현 서열을 통합시키기 위한 PR1 에피토프를 포함하는 벡터를 이용하여 변형될 수도 있다. 한 실시예에서, PR1 항원은 OVA에 융합된 결절 LLO 서열을 포함하는 LLO-OVA/PR1 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 일부로서 발현될 수 있는데, PR1 에피토프가 끼워졌다. 변형된 리스테리아(Listeria)에 의해 발현될 수 있는 이러한 항원 단백질(LLO-OVA/PR3)의 서열은 도 31에 나타낸다.

실시예 35

파고리소좀을 피하고 클래스 I 항원 제시를 촉진하기 위한 돌연변이체 리스테리아(Listeria)의 능력 측정

항원-제시 세포의 파고리소좀을 피하고 상기 세포에 의한 클래스 I 항원 제시를 촉진하기 위한 특정 후보자 돌연변이체 리스테리아(Listeria)의 능력을 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 다음과 같다: 첫째로, DC2.4 세포를 커버슬립 위에서 성장시킨다. 그 후 세포를 원하는 리스테리아(Listeria) 균주(MOI=100)을 이용하여 감염 시킨다. 0.5 hpi에서, 세포를 리스테리아(Listeria)를 세척 제거하기 위해 헹구었다. 1hpi에서, 젠타마이신을 50㎍/mL로 첨가시킨다. 5 hpi에서, 커버슬립을 세척하고 3.5% 포름알데히드 내에서 고정시킨다. 커버슬립을 차단시키고, 래빗 항-리스테리아(Listeria) 항체(Difco)로 염색하고, 2차적인 염소-항-래빗 FITC(Vector Labs)를 이용하여 검출시킨다. 액틴은 Phalloidin-rhodamine(Molecular Probes)을 이용하여 검출되어 진다. 커버슬립을 Vectamount+DAPI(Vector Labs)과 함께 장착 시키고 조사한다. 또한 상기 실시예 17 및 실시예 25를 참조하시오.

실시예 36

사람의 단핵구-유도된 수지상 세포의 생성 및 리스테리아(Listeria) 백신을 이용한 감염

사람의 단핵구-유도된 수지상 세포의 생성 및 리스테리아(Listeria) 백신을 이용한 감염을 위한 전형적인 프로토콜의 윤곽이 하기에 제시된다:

재료: 사람 말초 혈액(바람직한 혈액 도너로부터의 백혈구 연층); Ficoll-Hypaque (Amersham); dPBS w/o Ca, Mg (MediaTech); RPMI-1640 w/L-글루타민 (MediaTech); 한정되고, 열 비활성된 태아 소 혈청(HyClone); 사람 GM-CSF(R & D Systems)-원액은 500U/μL로 구성되고 -20℃에서 저장됨; 사람 IL-4(R&D Systems)-원액은 200U/μL로 구성되고 -20℃에서 저장됨; Costar 24-웰 플레이트(Fisher).

단핵구 단리 배지(MIM): 용액 1(Isosmotic Percoll)을 제조하기 위해, 50 mL의 NaCl 용액(500 mL dH₂O, 43.84 g NaCl(1.5M))을 450 mL Percoll에 첨가하고 혼합한다. 용액 2(PBS/Citrate)는 1000 mL dH₂O, 205.6 mg NaH₂P0₄*2H₂0(1.49mM), 1.30 g Na₂HPO₄(9.15 mM)), 8.18 g NaCl(139.97 mM), 및 3.82g C₆H₅Na₃0₇*2H₂0(13 mM)을 혼합하고 pH를 7.2로 함으로써 제조된다. 이어서 250 mL의 등장 percoll을 250 mL의 PBS/시트레이트와 혼합한다. 용액을 무균 여과시키고 4℃에서 저장시킨다.

배양 배지: RPMI-1640w. GlutaMax(Gibco) + 10% 태아 송아지 혈청(HyClone로부터의 한정되고, 열 비활성 된 FCS가 사용됨).

방법: Ficoll 및 MIM을 실온에서 가온시킨다. 250mL 원뿔형 관의 각각으로 20 mL의 Ficoll. 혈액을 dPBS를 이용하여 2배 희석시키고 잘 혼합한다. 250 mL의 혈액을 각각의 관에서 Ficoll의 꼭대기 위에 층으로 만든다. 관을 18-20°에서 30분 동안 400 xg에서 원심분리시킨다.

단핵 경계면을 상기 구배로부터 조심스럽게 수확하고, 깨끗한 50mL 관에 둔다. 나머지 관을 dPBS로 채운다. 관을 15분간 100xg에서 원심분리 시킨다. 이것을 림프구와 단핵구로 펠릿화하되, 현탁된 펠릿을 남겨둔다. 상청액을 빨아들인다. dPBS로 관의 나머지를 채우고, 원심분리하고, 빨아들이는 단계를 총 3번의 세척 동안, 2회 더 반복한다.

상기 펠릿을 20mL의 dPBS에 현탁시킨다. 현탁액을 20mL의 MIM 위에 층상화 한다. 샘플을 실온에서 35분 동안 400xg에서 원심분리 시킨다. 단핵구를 경계면으로부터 수확하고 배양 배지를 함유하는 깨끗한 관으로 옮긴다. 박테리아와 함께 이용하도록 DC를 배양한다면, 항생제를 사용하지 말것.)

샘플을 10분 동안 400xg에서 원심분리하고 상청액을 빨아들인다. 펠릿을 dPBS에서 4x 세척시킨다. 최종 세척 후, 세포 펠릿을 RPMI-1640+10% FCS에서 재현탁한다. 이어서 샘플을 Trypan Blue 또는 자동 계산기를 사용하는 혈구 계산기 상에서 계산한다. 세포 현탁액을 mL 당 1×10⁶세포로 희석시킨다. 각 mL의 세포 현탁액에 대하여, 500U GM-CSF 및 200U IL-4를 첨가시킨다(원액이 상기 설명되는 바와 같이 제조된다면 각각의 1mL 당 1μL). 웰 당 1 mL를 Costar 24-웰 플레이트로 평판배양 시킨다. 플레이트를 48 시간 동안 37℃, 5% CO₂, 100% 습기에 둔다.

두번째 날에, 수지상 세포를 위한 먹이 배지를 제작한다. 이것은 500U/mL GM-CSF 및 200U/mL IL-4와 함께 배양된 웰 당 0.5 mL 배양 배지(사용 전에 37℃까지 가온)로 구성된다. 각 웰의 꼭대기로부터 0.5 mL를 빨아들이고 0.5 mL의 신선한 먹이 배지로 대체시킨다. 플레이트를 추가적 48 시간 동안 37℃, 5% CO₂, 100% 습기에 둔다. 5일에, 세포를 사용을 위해 준비한다. 세포는 항상 GM-CSF 및 배지를 함유하는 IL-4내에 유지시켜야 하고, 또는 그들을 마크로파지로 되돌아갈 것이다. 수지상 세포를 HLA-DR, CD1a, CD83, 및 CD86에서 관찰하는 세포 측정기 상에서 표현형으로 조사된다.

사람 DC의 리스테리아(Listeria) 감염:

5일의 수지상 세포(DC)를 펠릿화 하고 1mL 당 2 × 10⁶ 세포에서 GM-CSF 및 IL-4를 포함하는 신선한 배지에 재현탁시킨다.500 μL의 현탁액을 24 웰 플레이트의 각 웰에 분취시킨다. 돌연변이 자극제 또는 박테리아를 500μL에 첨가시킨다. 1㎍의 LPS를 성숙 대조군에 대하여 이용한다. (100OU의 IFN-γ 또는 1㎍의 sCD40L를 이러한 반응을 증가시키도록 첨가할 수 있다.) 리스테리아(Listeria) 감염을 위해, 각 DC 당 10-100 리스테리아(Listeria)가 사용되어 진다. 세포를 1시간 동안 감염시킨 후, 세포외 박테리아를 세척 제거시키고 세포를 50㎍/mL 젠타마이신을 함유하는 배지에서 재현탁시킨다. sCD40L을 DC 생존을 증가시키고 보다 많은 IL-12p70 방출을 촉진하기 위해 첨가시킬 수 있다. 1000U/mL IFN-γ는 성숙 및 IL-12p70 분비를 증대시키기 위해 첨가될 수 있다. DC는 HLA-DR, CD1a, CD83, 및 CD86에서 관찰되는 세포 측정기 상에서 표현형으로 조사된다.

실시예 37

무포자성 비.안트라시스(B. anthracis) 백신 균주

spoIIE 프레임-내 결실. 비.안트라시스(B. anthracis)의 spoIIE 영역은 비. 서브틸리스(B. subtilis) 내 동일한 유전자에 대한 동종관계에 의해 동정된다. 비.안트라시스(B. anthracis) SpoIIE의 프레임-내 결실을 단리시키기 위해, spoIIE 유전자가 PCR에 의해 첫번째로 증폭되고 PCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen)으로 클로닝된다. 다음으로, 대부분의 spoIIE 유전자를 중첩 신장에 의한 유전자 스플라이싱(SOE)의 기법을 이용하여 결실된다(Horton et al., Biotechniques8: 528-35(1990)). 이러한 프레임-내 결실된 spoIIE 유전자는 셔틀 벡터 pKSV7으로 클로닝 되고, 이것은 클로르암페니콜-내성 유전자를 함유하며 42℃에서 복제될 수 없다(Smith et al., Biocheimie, 74: 705-11(1992)). 그 후 결실된 spoIIE 유전자를 함유하는 pKSV7를 비.안트라시스(B.anthracis)로 전기천공화하고, 세포를 클로르암페니콜의 존재 하에서 42℃에서 성장시켜서 플라스미드가 spIIE 유전자로 동종 재조합에 의해 통합된 균주에 대하여 선택한다. 또한 클로르암페니콜 선택없이 30℃에서의 성장은 플라스미드의 제거 및 손실을 야기한다. 클로르암페니콜-민감성 균주는 약 1%로 발견되어야 하고, 그들의 약 1/2는 결실 spoIIE 대립유전자(Camilli et al., (1993))를 함유해야 한다. 결실의 존재는 PCR 및 서던 블롯 분석에 의해 확인된다.

spoIIE/uvrAB 이중 결실 균주. spoIIE 결실 균주와 함께 시작하여, uvrA 및 uvrB 유전자의 프레임-내 결실이 이루어진다. 다시 한번, 관심있는 유전자를 증폭시키고 PCR-Blunt II-TOPO로 클로닝한다. 이어서 본 발명자들은 SOE 기술에 의해 대부분의 uvrA 및 uvrB 유전자를 결실할 것이다. 이러한 프레임-내 결실된 uvrAB 영역은 pKSV7로 클로닝되고, 상기 구조를 비.안트라시스(B. anthracis) spoIIE 결실 균주로 전기천공화 한다. 클로르암페니콜-내성이 uvrAB 영역으로 플라스미드의 통합에 대하여 선택되기 위해 42℃에서 선택된다. 약물 선택없이 30℃에서의 성장은 플라스미드를 손실한 분리체의 성장을 촉진시키기 위해 허용된다. 클로르암페니콜-민감성 콜로니를 집어내어 uvrAB 영역의 손실에 대하여 PCR에 의해 테스트하고, 상기 손실을 서던 블롯 분석에 의해 확인될 것이다.

실시예 38

비.안트라시스(B. anthracis)의 온도 민감성 recA 돌연변이체

30C에서 잘 성장하고 42C에서 소라렌에 대하여 매우 민감한 비.안트라시스(B. anthracis)의 온도 민감성 recA 돌연변이체를 생성하기 위해, 돌연변이를 E.Coli, recA44의 온도 민감성 recA 돌연변이체의 V246 돌연변이에 유사한 비.안트라시스(B. anthracis)에서 만들어진다(Kawashima et al., 193: 288-92 (1984)). 비.안트라시스(B. anthracis) 돌연변이체를 만들기 위해, E. coli 및 비.안트라시스(B. anthracis) 사이에 보존된 서열 245KVVKNK250(SEQ ID NO:46)이 돌연변이 된다. V246M 돌연변이가 스트라제네 퀵 체인지 키트를 이용하여, 잘못 매칭된 올리고뉴클레오티드 돌연변이유발에 의해 클로닝 된 비.안트라시스(B.anthracis) recA 유전자로 도입된다. 돌연변이는 서열 분석에 의해 확인되고, 돌연변이 된 유전자는 그들이 대립유전자 교환에 의해 비.안트라시스(B. anthracis) spoIIE uvrAB의 염색체로 도입될 수 있도록 하기 위해, pKS V7로 전달된다. 택일적으로, 비.안트라시스(B. anthracis) 균주로부터의 recA 유전자는 결실되고 E.Coli의 recA44(ts) 대립유전자로 치환된다.(E.Coli 내 비.안트라시스(B. anthracis) recA가 작용하는 것으로 알려짐(Ko et al., J. Bacteriol 184: 3917-22 (2002)).)

실시예 39

비.안트라시스(B. anthracis) 항원의 활성 부위 내 돌연변이의 도입

치사 인자 돌연변이 H686A는 그것의 프로테아제 활성을 비활성화하고, 부종 인자 돌연변이 K346Q 및 K353Q는(함께)그것의 아데닐 시클라제 활성을 비활성화한다(Brossier et al., Infect. Immun., 68: 1781-6 (2000)). 이들 돌연변이는 비.안트라시스(B. anthracis) 균주로 도입되어 spoIIE uvrAB 및 spoIIE uvrAB recAts 균주와 같은 백신으로 사용되어 진다. lef(치사 인자) 및 cya(부종 인자, 아데닐 시클라제) 유전자는 클로닝되고 퀵 체인지 키트(스트라제네)를 이용하여 돌연변이를 일으켜서 돌연변이체 유전자를 생성한다. 그 후 돌연변이체 유전자는 pKSV7로 옮겨지고 최종적으로 대립유전자 교환에 의해 숙주 pXO1 플라스미드로 도입된다.

실시예 40

고 수준에서 보호 항원을 발현시키기 위한 SOS 조절 서열의 사용

Cheo et al(Cheo et al., J. Bacteriol., 175: 5907-15 (1993))는 일치서열GAACN4GTTC(SEQ ID NO:47)이 비.서브틸리스(B. subtilis)의 SOS 반응에에서 유전자에 대한 LexA 리프레서 부위를 구성한다는 것을 보여준다. SOS 레귤론(regulon)의 일부인, 비.안트라시스(B. anthracis) recA 및 uvrAB 유전자에 대한 프로모터의 유사함 일치 서열 업스트림이 위치된다. 고 수준에서 보호 항원을 발현하는 B.anthracis 균주를 만들기 위해서, 보호 항원 유전자는 SOS 조절 서열의 대조하에서 놓여지고 그것이 B.anthracis spoIIE uvrAB 균주로 도입되어, 소라렌과 함께 처리되어 만들어지는 보호 항원의 고 수준을 야기한다. 이러한 인공 유전자를 비.안트라시스(B. anthracis) 염색체 내로 삽입하기 위해, pPL2와 같은 통합 벡터가 사용되어 진다(Lauer et al, J. acteriol., 184: 4177-86(2002)). 프로모터의 대조하에서 보호 항원 유전자의 경우에 있어서, 관심있는 유전자를 복합 클로닝 부위로 삽입 시킨다. 상기 플라스미드는 E.Coli로부터 비.안트라시스(B. anthracis) 균주로 짝지어진다. 그것은 그람-양성 박테리아로 복제할 수 없기 때문에, 단지 염색체 내로 통합함으로써 유지될 수 있다. 현재의 pPl2 벡터는 L.monocytogenes로부터의 파지 인테그라제 및 파지 부착 부위를 함유하며, 그러므로, L.monocytogenes 파지 인테그라제 및 파지 부착 부위를 제거하고 감마 파지와 같은 B.anthracis의 파지로부터 유사한 요소와 그들을 치환함으로써 변형되어져야 한다(Brown et al., J. Infect Dis., 96: 34-9 (1955)). 또한, pPL2 벡터는 전형적으로 선택을 위한 클로르암페니콜-내성 유전자를 함유한다. 내약성 유전자는 백신 작업을 위해 바람직하기 않으므로, 그들을 제거시킨다. 내약성 유전자 중 하나를 D-알라닌 레이스마제에 대한 유전자로써 치환시켰으며, 이것은 D-알라닌을 합성하고 D-알라닌 영양요구체가 D-알라닌의 첨가 없이 풍부한 배지 상에서 자라도록 허용한다. 다른 내약성 유전자는 클루타민 합성효소에 대한 유전자에 의해 치환되는데, 이것은 클루타민을 합성하고 글루타민 없이 풍부한 배지 상에서 글루타민 합성효소 돌연변이체 박테리움의 성장을 허용한다.

실시예 41

전형적인 돌연변이체 B.anthracis 균주

많은 상이한 돌연변이체 비.안트라시스(B. anthracis) 균주는 상기 실시예에 설명된 방법의 조합을 이용하여 제조되어 진다. 백신 조성물에서 사용되는 전형적인 돌연변이체 비.안트라시스(B. anthracis) 균주가 표 26에 열거된다.

실시예 42

소라렌-비활성 B.anthracis 균주 내, 보호 항원 및 캡슐을 포함하는, 단백질 발현 수준의 특성화

비활성 비.안트라시스(B. anthracis) 균주가 여전히 물질대사 할 수 있음을 나타내기 위해, 세포를 비카르보네이트와 함께 최소 배지에서 배양시킨다(Thorne et al., J. Gen. Microbiol., 17: 505-16 (1957)). 이러한 배양 이후에 세포를 원심분리에 의해 제거시키고 상청액을 저장하였다.상청액을 SDS-폴리크릴아미드 겔 전기천공법을 겪게 한다. 코마시 블루로 염색한 후, 보호 항원이 눈에 띄고, 그것의 존재는 웨스턴 클롯 분석(Brossier et al., Infect. Immun. 68: 5731-4 (2000))및 질량 분석법에 의해 확인된다. 또한, 질량 분석법은 문헌[Lenz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100: 12432-12437 (2003)]에 설명되는 방법을 이용하여, 이들 조건하에서 분비되는 다른 단백질들을 동정하는데 사용되어 진다. 폴리글루타메이트 캡슐이 이들 조건하에서 만들어지는지 여부를 평가하기 위해서, 캡슐 합성을 위한 유전자를 코딩하는 pXO2가 형질도입에 의해 균주로 도입되어 진다(Green et al., Infect. Immun., 49:291-7 (1985). 캡슐은 로켓 면역전기천공법에 의해 측정되어 진다(Uchida et al., Mol. Microbiol, 23: 1229-40(1997)).

실시예 43

스위스 웹스터의 체액 및 점액 반응의 특성화 및 약화된 비.안트라시스(B. anthracis) 균주로 면역화된 A/J 마우스

마우스 면역화. 마우스를 최상의 박테리아-특이적 체액 및 세포질 반응을 야기하는 면역화의 경로를 결정하도록 하는 근육내(IM) 또는 피하(SC) 경로에 의해 S-59/UVA 백신으로 주사한다. 또한 마우스의 비강(IN) 면역화는 후보자 백신에 의해 유도된 점액 반응을 평가하도록 테스트되어 진다. 각각의 비강이 경미하게 마취된 마우스로 5의 명시된 백신 제제를 갖는 IN 면역화는 앞서서 기술된 바와 같이 수행되어 진다:(Boyaka, etal.,J. Immunol., 170: 5636-43 (2003)) 마우스를 0.1 LD_5O 선량의 후보자 백신으로 면역화 시킨다. 중간의 치명적 수준이 관찰되지 않는 8개의 S-59/UVA 비활성 백신 후보자 중 어떤 것이 초기의 선량 10⁸ 입자에서 제공되어 진다. 하나 이상의 경로에 의해 면역화 된 마우스는 0.1 LD₅₀ 선량을 넘는 혼합된 선량으로 주사되지 않으며, 또는 10⁸입자 이상이다. 복합 면역화 제공된 마우스는 모든 주사를 포함하는 일정한 백신 을 수용한다. 연속 3일에 있어서 S-59/UVA비활성 리스테리아(Listeria) uvrAB를 갖는 명역화는 단일 면역화에 비하여 증가된 체액 및 세포질 면역화를 야기하기때문에, 동일한 전략이 비.안트라시스(B. anthracis) 균주 백신과 함께 이용되어 진다. 또한 마우스는 14일 및 28일에 추가 면역화가 제공된 후 제 1의 면역화가 제공된다.

PA, LF, EF, 캡슐 및 전체 박테리아에 대한 항체의 정량화.

각종 백신 후보자를 갖는 면역화된 마우스 내 점액 및 항체 반응이 특성화되어 진다. 혈청이 레트로오비탈 망으로부터 취해진 후 면역화 및 각각의 면역화 1주일 후에 취해진다(본 발명자들은 1주 당 하나를 넘지 않고, 바뀐 눈으로부터 취해지지 않은 혈액 샘플링과 함께 1 마우스 당 최대의 5 레트로오비탈 망 과정에 대한 IACUUC 승인을 가진다). IgA 수준의 측정을 위한 샐비어 및 코의 세척이최종 면역화 1주일 후 희생의 시간에 수행되어 진다. 최종 면역화 45일 후에 면역화 백신에 의해 유도된 체액 및 점액 면역의 내구력이 또한 특성화된다. PA, 캡슐, 및 식물성 박테리아(Sterne 균주)에 대한 체액 및 점액 반응은 이미 출판된 바와 같이(Ballard et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A, 93: 12531-4 (1996); Rhie et al., Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A., 100:10925-30 (2003)), 효소-연결된 면역흡착제 분석(ELISAs)에 의해 결정되어 진다. 간단히 말해서, 이뮬론 96-웰 맥시솔프 플레이트(Nalge Nunc)는 이미 설명된 바와 같이 제조된 폴리-γ-D-굴루탐산(PGA) 캡슐과 결합된 5㎍ 정제된 PA, LF, EF, BSA에 의해 첫번째로 코팅되어진다. (Rhie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 100: 10925-30 (2003)), 또는 16시간 동안 4℃에서 50mM 카르보네이트 완충제(pH9.6) 중 모르타르(mortar) 및 페스틀(pestle)을 이용하여 액체 질소하에서 S-59 소라렌/UVA 비활성 박테리아 그라운드(ground)와 함께, 그리고 TSAT 완충제(50mM Tris [pH 7.6], 142 mM NaCl, 0.05% 소디움 아지드, 0.05% Tween 20, 2% 소 혈청 알부민)를 이용하여 차단된다. 마우스 혈장 또는 점액 분비의 일련의 2배 희석은 각각 PA, PGA-BSA, 또는 Sterne으로 코팅된 96-웰 플레이트로 첨가되어 진다. 고정된 항원에 대한 Abs의 결합은 서던 바이오테크놀로지 사(Birmingham, AL)로부터의 동형-특이적 퍼옥시다제 양 항-마우스 μ,γ, 또는 α H 사슬-특이적 항체를 이용한 배양에 의해 결정되어 진다. 비오틴화된 랫트 항-마우스 γ1(클론 G1-7.3), γ2a(클론 R19-15), γ2b(클론 R12-3), 또는 γ3(클론 R40-82) H 사슬-특이적 mAbs(BD PharMingen, San Diego, CA) 및 스트렙타비딘-결합된 퍼옥시다제가 IgG Ab 서브클래스 분석법에 대하여 이용되어 진다(Cole, J.BacterioL, 107: 846-52 (1971); Cole etal.,Basic Life Sci., 5B : 487-95 (1975)). 측색적(colorirmetric) 반응은 ABTS 기판의 첨가에 의해 전개되어 진다(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 말달부 타이터는 대조, 비-면역화 마우스를 이용하여 상기 얻은 것을 OD415>2 표준 편차를 제공하는 역 log₂ 희석으로서 펴현되어 진다.

Ig-분비 세포의 검출을 위한 효소-연결된 면역지점(ELISPOT) 분석법. PA-특이적 Ig-분비 림프구의 빈도는 ELISPOT 분석법(Boyaka et al., J. Immunol., 170: 5636-43 (2003))에 의해 결정되어 진다. 간단히 말해서, 접종 및 대조군 마우스의 골수 또는 자궁경부 림프절은 급속하게 절개되고 빙냉된 RPMI 1640 배지에 위치되며 단일 세포 현탁액이 제조된다. 96-웰 PVDF-기초 플레이트(BD Biosciences, San Jose)는 2.5μg/ml 정제 PA를 이용하여 밤새 코팅된다(List Biological Laboratories, Campbell, CA). 상기 플레이트를 세척하고, 200μl 완전한 RPMI과 함께 37℃에서 2시간 동안 차단시키고, 세포 현탁액의 일련의 희석액을 96-웰 플레이트에 첨가한다. 세포를 5% CO2 중에서 37℃로 6시간동안 플레이트 상에서 배양시킨다. 항원-특이적 항체 형상 세포(AFC)는 동형-특이적 비오틴-표지된 항체-마우스 μ,γ, 또는 α H 사슬-특이적 항체를 이용하여 검출되어 진다(서던 바이오테크놀러지 사). 2시간 동안 RT에서 배양한 후, 플레이트를 세척하고, 양 항-비오틴:1 nm 금 콘쥬게이트(GAB1 ; Ted Pella)가 RT에서 1시간 동안 첨가되어 진다. 방대한 세척 후, 30μl의 은 기판(Silver Enhancing Kit; Ted Pella)이 각 웰에 첨가되고 점 전개가 모니터링 된다. 각 웰의 점이 자동화된 ELISPOT 플레이트 판독기(CTL, Cleveland)를 이용하여 계산되어 진다. 체액 반응은 106 골수 또는 림프절 세포 당 항체 형성 세포의 수로서 표현된다.

독성 중성화 분석법. 백신 후보자를 이용하여 면역화된 마우스에서 유도된 중성화 항체는 치명적 독성물질(PA+LF)로부터 J774 마크로파지 셀라인을 보호하도록 하는 능력에 대하여 평가된다(Mock et al., Annu. Rev. Microbiol., 55 : 647-71(2001); Boyaka et al. (2003); Rhie et al. (2003)) 간단히 말해서, J774 세포(ATCC, Manassus, VA)는 5×10⁴ 세포/웰에서 96-웰 평평한 바닥 플레이트(Nunc)로 첨가되며 5% CO₂에서 37℃에서 12시간 동안 배양된다. 테스트 세럼 또는 점액 분비는 TSTA 완충제 내에서 연속적으로 2배 희석된다. PA 및 LF(400 ng/ml PA 및 40 ng/ml LF)가 항혈청 희석액에 첨가된다. 1시간 동안 배양한 후, 항혈청/치명 독성물질 복합체 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하고 추가적인 5시간 동안 배양한다. 세포 생존도는 MMT 분석법에 의해 모니터링 된다(540nm에서 흡광도 측정됨). 분석은 각각의 플레이트 내에 포함되는 음성 대조군(표준 혈청) 및 양성 대조군(MAbs, 14B7 및 1G3) (Mikesell et al., Infect Immun., 39: 371-6 (1983);Starnbach et al., Nature,9,(2003))을 이용하여 3배로 수행된다. 각 3배 샘플 희석액의 평균 및 표준 편차가 계산되어 진다. 말단부는 표준 대조군 혈청과 비교하여 탄저균 독성물질의 50% 중화를 보이는 최고 혈청 희석액으로서 표현된다.

실시예 44

변형된 비.안트라시스(B. anthracis)를 이용하여 접종된 A/J 마우스의 PA-, LF-, 및 EF-특이적 CD4+ T 세포-매개 반응

T 세포 증식. CD4+ T 세포 증식은 접종되고 나이브 한 A/L 마우스의 PBMC, 골수 및 림프절 세포로부터 결정된다. 골수 및 자궁경부 림프절이 분산되어 앞서 설명한 바와 같이 단일 세포 현탁액을 얻는다(Boyaka et al., J. Immunol, 162: 122-8 (1999);Lillard et al, J. Immunol., 166: 162-169 (2001); Little et al. , Infect. Immun., 65: 5171-5 (1997)). CD4+ T 세포는 Miltenyi Biotec(Auburn, CA)로부터의 마우스 CD4+ T 세포 단리 키트를 이용하여 음성적 선택에 의해 단리되어 진다. 개별 마우스 골수로부터, 풀된 림프절 또는 PBMC로부터의 정제된 CD4+ T 세포가 4×106세포/ml에서 배양되어 지며 완전한 RPMI(RPMI supplemented with 10% FBS, 10mM Hepes, 2 mM L-글루타민, 1mM 소디움 피루베이트, 비-필수 아미노산, 23.8 mM 소디움 비카르보네이트, 5×10^-5M μ-메르캅토에탄올, 100 U/ml 페니실린 및 100 Ug/ml 스트렙토마이신) 내에 T-세포-고갈의, 비-분화 공통 유전자의 나이브 골수 피더셀(8×10⁶ 세포/ml)의 존재하에서 PA, LF 또는 EF의 다양한 농도를 이용하여 자극된다. 골수 피더셀의 복제는 S-59 소라렌을 이용한 간단한 광화학 처리에 의해 정지된다. 배양액을 4일 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 배양한 후 최종 18 내지 20 시간 동안 0.5 μCi의 적정된 티미딘([3H]TdR)을 첨가한다. 세포를 유리 섬유 시트 상으로 거두어 들이고 통합된 티민의 양은 섬광 계수기(Wallac, Turku, Finland) 상에서 방사능을 측정함으로써 결정된다.

PA-, EF- 또는 LF-유도된 사이토카인 반응의 분석. CD4+ T 세포를 Miltenyi Biotec(Auburn, CA)로부터의 마우스 CD4+ T 세포 단리 키트를 이용하여 음성 선택에 의해 단리시킨다. 개별 마우스의 골수 또는 림프절로부터의 정제된 CD4+ T 세포를 1×10⁵세포/웰에서 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내에서 배양시키고 완전한 RPMI 내에 T-세포-고갈의, 비-분화 공통 유전자의 나이브 골수 피더셀(1×10⁵ 세포/웰)의 존재하에서 PA, LF 또는 EF의 다양한 농도를 이용하여 자극시킨다. T 세포-고갈된 골수 피더셀은 S-59 소라렌을 이용한 간단한 광화학 처리에 의해 정지된다. T 세포 배양액을 2일 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 배양시킨다. T 헬퍼-1 및 T 헬퍼-2 사이토카인의 발현은 Th1/Th2 세포측정 비드 어레이 키트(BD Pharmingen, San Diego, CA)를 이용하여 항원-자극된 CD4+ T 세포의 상청액으로부터 결정되어 진다.

실시예 44

변형된 B.anthracis 백신을 이용하여 마지막 면역화 투여 45일 후 Swiss Webster 및 A/J 마우스 내 포자 및 치사 독성물질 자극에 대한 보호의 범위의 특성화

치명적 독성물질 자극에 대한 마우스의 보호. 선택된 후보자 백신으로 면역화된 마우스는 앞서서 설명한 바와 같이(Price et al., Infect. Immun., 69: 4509-15(2001) ; Rhie et al.(2003)), 치명적 독성물질로의 꼬리 정맥 주사에 의해 자극받는다. 치명적 독성물질은 기술된 바와 같이(Rhie et al. (2003)) 재조합체 PA 및 LF 재조합체 단백질(List Biological Laboratories, Campbell, CA)을 혼합함으로써 제조된다. 1 마우스 당 치명적 독성물질 IV LD50은 6㎍의 LF와 함께 혼합된 약 12㎍의 PA이다. 신선하게 제제된 치명적 독성물질의 마우스 내 중간 치사성은 공표된 수치의 0.1-10 LD₅₀ 선량 범위 이상으로 꼬리 정맥 주사에 의해 결정되어 진다. 보호 연구는 5-10배 범위의 LD₅₀ 선량 이상으로 치명적 독성물질 자극을 거의 포함할 것이다. 이러한 모델에서, 비보호 마우스는 24시간 내에 굴복된다. 처음으로, 탄저균에 의한 죽음은 트립신 대두 한천 상에 혈액을 평판배양하고 37℃에서 밤샘 배양함으로써 선택된 마우스 내에서 확인된다. 플레이트는 2-3 mm 전형적인 안트라시스(anthracis)-유사 "그라운드 유리" 외관을 갖는 콜로니에 대하여 관찰되어 진다. 치명적인 독성물질로 처리된 모든 마우스는 매일 모니터링되며, 실험은 2주 후에 종결되며 모든 보호 마우스는 희생된다.

포자 제조. Sterne 균주 포자는 기술되는 바와 같이 제제된다(Barnard and Friedlander,1999). 간단히 말해서, 단일 콜로니를 100-ml 보틀 내 함유된 5 ml의 FA 배지(3.3% 트립톤, 2% 효모 추출물[물에 대하여 밤새 투석됨], 0.2% L-히스티딘, 0.8%Na₂HP0₄, 0.4% KH₂PO₄, 0.74% NaCl)로 접종시키고 37℃에서 5시간 동안 진탕시킨다. 1/10 ml 분취량을 L 한천 플레이트 상에 퍼트리고, 37℃에서 배양시킨다. 세균 층을 플레이트로부터 벗겨내고, 살균수로 방대하게 세척하고, 60℃에서 30분 동안 열 충격을 가하고, 물로 세척하고, 물 중 58% Renografin-76 (Bristol-Myers Squibb, Princeton, N.J.) 상에서 정제하였는데, 이는 앞서서 설명된 바와 같으며(Palucka et al., Nature Medicine, 5:868-870 (1999)), 물로 한번 더 세척한다. 그 후 포자를 10,000 xg에서 펠릿으로 침전시키고 물 중 1% 페놀에 재현탁시킨다. 이러한 과정의 이 수득율은 플레이트 당 0.5×10⁹ 내지 5.0×10⁹ 포자의 범위로 공표되었다.

치명적인 포자 자극에 대한 마우스의 보호. 근육내(IM) 주사에 의해 제공된 열-충격받은 Sterne 균주 포자의 LD₅₀ 수치는 10³ 내지 10⁸포자의 선량 범위 이상으로 결정되어 진다. 흡입 단저균에 대하여 접종된 마우스 내 보호를 평가하기 위해, 자극 실험이 또한 앞서서 기술된 바와 같이(Brook et al, J. Med. Microbiol., 50: 702-11 (2001)), 기관내(IT) 포자 투여에 의해 수행된다. 간단히 말해서, 고정되고 마취된 마우스의 혀를 핀셋으로 외부로 그리고 뒷면으로 부드럽게 꺼내고, 백신을 팁으로부터 약 1인치인, 부드러운 각도로 구부려진 굵은 1.5 인치 22-게이지 바늘을 이용하여 적합화 된 주사기를 이용하여 옮긴다. 본 발명자들은 IM 또는 IT 경로에 의해 투여된 Sterne 균주 LD₅₀ 수치가 A/J 마우스 내 약 10³이고, Swiss Webster 마우스 내에서 최대 10배 높다고 기대한다. 보호 연구는 최대 LD₅₀ 선량 포자 자극을 포함한다. 포자로 처리된 모든 마우스는 매일 모니터링되고, 실험은 2주후에 종결되며 보호된 모든 마우스는 희생된다. 모든 자극 실험에 있어서, 죽음에 대한 평균 시간은 살아남지 않은 코호트에서 측정된다.

실시예 45

마우스 내 우두 발현 OVA 모델 항원을 이용한 자극에 대한 리스테리아(Listeria) 백신의 보호 면역

본 발명의 백신은 리스테리아(Listeria) 자극에 대한 보호 면역을 나타낸다. 병원균에 대하여 면역화하고 보호하는 능력을 더 설명하기 위해, OVA 항원을 갖거나 갖지 않고 S-59 UVA 처리(상기, 실시예 13의 두번째 방법)를 한 그리고 하지 않은 리스테리아(Listeria) 백신은 OVA 항원(VV-OVA)을 발현시키는 예를 들어, 우두 바이러스와 같은 다른 미생물에 대하여 면역화하는데 사용되어 진다. 이것은 다른 미생물에 대한 항원 특이적 면역화가 리스테리아(Listeria) 백신을 이용하여 이루어지는 것을 설명할 것이다.

우두 바이러스(WR 균주) 발현 OVA는 La Jolla Research Institute로부터 입수되며 옵티셀 챔버(BioCrystal, OH)를 이용하여 Vero 세포에서 제조된다. 옵티셀 챔버는 L-글루타민, P/S(페니실린/스트렙토마이신), NEAA(비-필수 아미노산), NaHC0₃, 및 10% FBS로 보충된 이글스 최소 필수 배지내에서 Vero 세포를 이용하여 시딩된다. 세포가 약 75% 합류일 경우, 성장 배지를 제거시키고 VV-OVA의 약 1×10⁵PFU/mL를 함유하는 신선한 배지로 대체시킨다. 단일 층이 >50%의 세포 변성 결과를 보일 경우, 세포와 상청액을 거두어 들이고, 3번의 냉각-해동 사이클을 겪게 하고, 정화하고 -80℃에서 저장시킨다. 타이터는 Vero-76 세포 상 플라크 분석에 의해 결정되어 진다. 우두에 의한 난백 알부민 발현은 마우스 내 주사 전에 웨스턴 블롯 분석법에 의해 확인된다.

C57BI/6 마우스(그룹 당 3)를 표 27에 따라서 IV를 접종시키고 VV-OVA의 1×10⁷ PFU IP 주사로 7일에 자극시킨다. 12일에, 마우스를 안락사시키고 난소를 총체적인 병리학을 위해 거두어 들이고 관찰한다. 또한 난소를 우두 플라크 형성 단위에 대하여 분석한다. 개별 마우스로부터의 쌍을 이루는 난소를 1 mL의 완충제에 균질화시키고, 냉동시키고(액체 질소) 3번 해동(37℃)시키고, 각 사이클 간에 와류하여, -80℃에서 저장시킨다. 분석을 위해, 샘플을 해동시키고, 4℃에서 원심분리하여 잔여물을 제거하고, 연속하여 Vero 세포로 적용을 위해 희석시킨다. Vero-76 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트에 평판배양시킨다. 세포 단일층이 약 70-85%의 합류에 이를 때, 배지를 각 웰로부터 흡인시키고 세포를 난소 균질 현탁액 제조의 1mL 적당한 희석액으로 접종시킨다. 최소 1시간 후, 배지를 흡인시키고 3 mL의 1:12x 성장 배지:1.5% 아가로스로 대체시킨다. 플라크를 배양의 3-4일 후 낱낱이 계산한다.

본원에 인용된 모든 문헌, 특허, 특허 출원, 및 승인 번호(폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 모두를 포함)는 각각의 개별 문헌, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로서 이와 같이 인용되도록 지시되는 바와 같은 정도로 모든 목적에 대하여 그들 전체가 참고로서 본원에서 인용되어 진다.

SEQUENCE LISTING <110> Cerus Corporation DUBENSKY Jr., Thomas W. BROCKSTEDT, Dirk G. BAHJAT, Keith HEARST, John E. COOK, David <120> MODIFIED FREE-LIVING MICROBES, VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 282172002840 <140> PCT/US2004/003671 <141> 2004-02-06 <150> US 60/446,051 <151> 2003-02-06 <150> US 60/449,153 <151> 2003-02-21 <150> US 60/490,089 <151> 2003-07-24 <150> US 60/511,869 <151> 2003-10-15 <150> US 60/541,515 <151> 2004-02-02 <160> 52 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Murine <400> 1 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 2 Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 3 Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Herpes simplex virus <400> 4 Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu 1 5 <210> 5 <211> 2915 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 5 atcacgaaaa atcccgctta tattttgaat aagcgggatt ttgattattt tttcttagct 60 gttgcaattc gttcttccgt gcgttcttta tcgcgttcta aaattggttt caagtattta 120 cctgtataag atttttttga gcgagcgatt ttttcaggtg tgccggttgc aataatttga 180 ccgccaccat cgccaccttc tggacctaaa tcaatcaagt aatcagcttg tttgataacg 240 tcaagattat gctcaataac aagtactgta tcgccattct cttctacaag tctttgtaat 300 actttgagta aacgaccaat atcatctgcg tggagtccgg tagttggttc atccagaata 360 tagaaagatt ttccgttact acgtttatga agttccgaag ctagtttgac gcgctgcgct 420 tcaccacctg aaagcgtagt tgcaggttgt ccaagtcgaa tatagccaag accaacatct 480 acaattgttt gaagtttacg cgcaattctt ggttggttgg tgaaatattc tagtccttcc 540 tctacagtca tttctaatac ttcagcaata tttttgcctt tataacgaat atctaacgtc 600 tcaccattgt atcgttttcc atgacaaact tcacagggta catatacatc aggcaagaaa 660 tgcatttcaa ttttgatgat tccgtcgcct ttacacgcct cgcaacggcc accttttacg 720 ttaaaactaa agcgaccttt tttataacca cgaactttgg cttcattagt acttgcgaaa 780 aggtcacgaa tatcatcgaa agctcctgta taagtagctg gattcgatct cggtgttctt 840 ccgattggtg attggtcaat attgataatt ttttctaggt tttcgatgcc ttttatttct 900 ttgtgttcac ctggttttgc gtggtttcta tttagttttc tcgctaacgc ttttcgcagt 960 acttcattca ctaacgaact tttacctgaa cctgaaactc cagttacaca ggaaaaagta 1020 gctagtggaa tttttgcatt tacgtttttg agattatttg ctttagcacc aataatttct 1080 aattctagtc cgttaccttt tctacgttta gcagggactg gaataaattt tttacctgaa 1140 agatagtcac cagtgatgga atttttatta ttggcaactt cttctggtgt tccggctgca 1200 acaattcgtc cgccgtgttc tcctgcacct ggaccaatat caataagata atctgcggcc 1260 atcatcgtat cttcgtcatg ctcaacgaca ataagcgtgt ttccaatgtc acgcatactt 1320 tggagtgtgc tgattaaacg atcattatct cgttgatgaa gaccgatgga aggttcatct 1380 aaaatataaa gtacaccagt aagtctggaa ccgatttgtg tagcaagtcg aattcgttgc 1440 gcttcgccac cagaaagcgt cccagctgca cggctcattg ttaggtagtc gagcccaaca 1500 ttttttaaga agcctagtct agcacgaact tctttgaaaa ttggcgctgc aatttgtgtt 1560 tctttttcag atagttctaa gccatcgaag aaagcaagtg cttcattaat agaaaactca 1620 ctgatttgcc caatatgatg gtcgtttact ttaacggaaa gtgtttcttc ttttagacga 1680 tagcctttac aagatggaca tggtaaatca gtcatatatt gcgccatttg atcgcgtgtg 1740 aaatcggaat ttgtttcacg atagcgacgt tcgatatttg gaagtatccc ttcaaacgga 1800 atccacgttt cgcgtgtcat accgaaatca tttttgtatt cgaagtagaa ttctttatct 1860 tttgatccat ttaaaataat atctaattct tctttggata gcttctcaag aggtgtatcc 1920 atatctattc caaattcttt acaggcagaa gctagcattt gcgggtagta ctgtgaacta 1980 attgggcgcc aaggaataat agcaccttca tttagagaca tacttctatc aggaataacc 2040 gtgtcgacat cgacttcaag tttagtccca agtccatcac atgtggggca agcgccaaat 2100 gggctgttga aagagaacat tcttggttct aattcaccaa cggaaaaacc acaataaggg 2160 cacgcatagt gttcactaaa taataattct ttatccccca ttatatcaac aaccgcataa 2220 ccatcagcta aacgaagagc agcttcaatg gaatcataca gacgagtatt gatgccctct 2280 ttaatcacaa tgcgatcaat aatgatttca atagaatgct ttttgttttt ctcaatttca 2340 atttcgtcat tgatatcata aatttctcca tcaacacgaa ttcgaacata tccttctttt 2400 ttgatttcct caatagtttt cttatgtgtc ccttttttac cagaaacgat tggagccatt 2460 atttgaatac gtgttttttc tgggtattct agaacacgat ctaccatttg ttcgattgtt 2520 tgagaagtga tttcaatacc gtgatttgga caaaccggat gcccaacacg agcataaagt 2580 aagcgcaaat agtcatggat ttctgtaact gtcccaacag tggaacgtgg attacggctt 2640 gttgtttttt gatcaatcga aatggcaggg cttaatcctt caattaaatc cacatctggt 2700 ttatccattt gccctaaaaa ttggcgtgca tatgcggaca aagactctac ataacgtctt 2760 tgtccttctg cataaatcgt atcaaaagca agcgaagatt tacctgaacc tgaaagccca 2820 gtcataacta ctaatttgtc tctaggaatc tctacatcaa tgttttttaa gttatgggct 2880 cttgcaccct gaattactat tttctcttta tccaa 2915 <210> 6 <211> 1991 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 6 tcatccttcc gcttttattt ccagtaaagc atcgcgaagt tcagcagcac gttcgaaatc 60 aagtgcttta gctgcttctt tcatttcatg ttccatacct tcaatgaata catcgcgttc 120 tttcttagac attttgctta aatcatgttg cttcactgct tctctttcat ctgcggcaga 180 agtcgctgcg atgataccac gaatttcttt tttgattgtt tttggcgtaa tgccgtgttt 240 ttcattatat tcaatttgga ttttacgacg gcgttctgtt tcgccaatag aattgcgcat 300 cgaatcggtc attttatcag catacatgat tactcgaccg ttttcattac gagcagctcg 360 acccattgtt tgaattaagg aacgctcgga acgaaggaat ccttctttgt ccgcatctaa 420 aatagcgaca agagatactt caggtaaatc gattccttca cgaagtaagt taattccaac 480 gataacatca tacacaccaa gtcgaaggtc acgaatgatt tcgattcgct cgagcgtctt 540 cacttccgag tggagatact gtactttaac accagcttct ttgagatagt tggttaaatc 600 ctcggacatt tttttcgtta aggtggtgat taaaacacgt tcatttttct cgacgcgatc 660 gttaatctca tccattaagt catcaatttg tccttgaatc ggacggattt ctacgattgg 720 gtctagcaag ccagttggtc gaatgatttg ttcaatgaca tctggatttt tttctaattc 780 gtaagggcct ggtgtagcgg atataaacat aatttgattg atatgcttct caaattcttc 840 taaacgaagc ggcctattat ctagagcgct aggcaatcta aagccatgat caactagcat 900 ttgttttctg gcttggtccc cgttaaacat accacgaatt tgcggcatcg taacgtgtga 960 ctcatcaatt accatttgga aatcatctgg gaagtaatcg agtaacgtgt atggtgtaac 1020 tcccgctgga cgaagggata aatgtctaga atagttctca ataccagagc aatagcccat 1080 ttcttccatc atttccaaat cataattcgt tcgctgttca aggcgctgag cttctagcaa 1140 tttattatct gcacgtaaaa ctttaagacg gtcttcgagt tcagctttta tattaacaat 1200 tgcttttttc ataatatcag gtctggtgac aaagtgagat gccgggaaaa tggaaacatg 1260 ttctctttct cctataattt caccagtaag tgcatctact tctctaattc gttcaatttc 1320 atcaccgaaa aattcaatcc gcatacagtg ttcatctctt gaagctggga aaatttcgac 1380 aacatcaccg cgaacacgga agcgtccacg ttgaaaatct atatcatttc gatcatattg 1440 aatatctact aatttgcgca gtagctgatc acggctaatt tccatgccaa cacgaagcga 1500 aacgagcatc tctccatatt caatcggcga acctaagcca tagatacacg atacactcgc 1560 aatgataatt acatcgcgac gttcaaaaag cgcagcagta gcagagtgac gaagcttatc 1620 gatttcatca ttgatacttg catctttttc gatatatgtg tcactttgcg gaacataggc 1680 ttctggttga tagtaatcat agtaactgac aaaatattct acagcgttat ttgggaaaaa 1740 ctctttaaac tcgctataca gctgtcccgc taacgtctta ttgtgagcca tgacaagtgt 1800 cggcttattt acttcttgaa tcacattgga tacggtaaaa gttttccctg taccggttgc 1860 accaagtaaa gtttggtgtt tcaagccttt ttttaatccc gcaactaatt gttctatcgc 1920 tctaggttgg tctccttgtg ggctatactt agaaactaac tcaaatttat ccttcaactc 1980 ggattccccc t 1991 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 7 gcaagtatac agttaagttt gtaacg 26 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 8 ctttccgaag tggaagaaag catg 24 <210> 9 <211> 6654 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 9 gcaagtatac agttaagttt gtaacgattt gttttgattt agactcaaaa cgtaaagttt 60 cttcatctac acgtaaagtc gttttatcaa agaagatttt aagtgcttca tcttctggat 120 attctttgaa tagtttaatc atcgcgtgaa ctttgatatc gttcgaatcg gatggtttaa 180 attcaatatt accattagca atttcgaatt ctaaaataga aagtgttgtg tcatgataaa 240 tgaaatcacg ttcgattttc gttgaagtta agaacgggaa tggcatatct ttcacttgtt 300 taaatgcact atttaggaaa gaaccgattt tttcaccagc ttgggataaa tcattaacca 360 tattgcgcat ggagtcttca cgatctttag aagaattttc gccgccttct tcttcatctc 420 tttcatgatt ttctggagtc ggttctgggc gtcttttacg actttttgga ggtgtataag 480 gatttccttg attgttccaa cctttactgt aatcatatga tggttcttct tttgtttctt 540 cttcgatttg ttcttcttct ctcggagctg cagatcgacg aatattttct tttgctgctg 600 ttttaccttc ttttttggaa atattttcaa gtagagtaag ggcttcttca gtggatataa 660 taccttgttt tactaattcg agaatacgtt tacgttcatt ttccattttc atttcctcct 720 ataatttagg ctaaactatt ttaggcttgc tttcacatgc aagtgacata tctgttttat 780 ctatgactct attatgaagg aaaatataat ttctgtcata caaccagagg atgattattt 840 gtttggactt tgggtggttt ggtcttaaga atcacgaaaa atcccgctta tattttgaat 900 aagcgggatt ttgattattt tttcttagct gttgcaattc gttcttccgt gcgttcttta 960 tcgcgttcta aaattggttt caagtattta cctgtataag atttttttga gcgagcgatt 1020 ttttcaggtg tgccggttgc aataatttga ccgccaccat cgccaccttc tggacctaaa 1080 tcaatcaagt aatcagcttg tttgataacg tcaagattat gctcaataac aagtactgta 1140 tcgccattct cttctacaag tctttgtaat actttgagta aacgaccaat atcatctgcg 1200 tggagtccgg tagttggttc atccagaata tagaaagatt ttccgttact acgtttatga 1260 agttccgaag ctagtttgac gcgctgcgct tcaccacctg aaagcgtagt tgcaggttgt 1320 ccaagtcgaa tatagccaag accaacatct acaattgttt gaagtttacg cgcaattctt 1380 ggttggttgg tgaaatattc tagtccttcc tctacagtca tttctaatac ttcagcaata 1440 tttttgcctt tataacgaat atctaacgtc tcaccattgt atcgttttcc atgacaaact 1500 tcacagggta catatacatc aggcaagaaa tgcatttcaa ttttgatgat tccgtcgcct 1560 ttacacgcct cgcaacggcc accttttacg ttaaaactaa agcgaccttt tttataacca 1620 cgaactttgg cttcattagt acttgcgaaa aggtcacgaa tatcatcgaa agctcctgta 1680 taagtagctg gattcgatct cggtgttctt ccgattggtg attggtcaat attgataatt 1740 ttttctaggt tttcgatgcc ttttatttct ttgtgttcac ctggttttgc gtggtttcta 1800 tttagttttc tcgctaacgc ttttcgcagt acttcattca ctaacgaact tttacctgaa 1860 cctgaaactc cagttacaca ggaaaaagta gctagtggaa tttttgcatt tacgtttttg 1920 agattatttg ctttagcacc aataatttct aattctagtc cgttaccttt tctacgttta 1980 gcagggactg gaataaattt tttacctgaa agatagtcac cagtgatgga atttttatta 2040 ttggcaactt cttctggtgt tccggctgca acaattcgtc cgccgtgttc tcctgcacct 2100 ggaccaatat caataagata atctgcggcc atcatcgtat cttcgtcatg ctcaacgaca 2160 ataagcgtgt ttccaatgtc acgcatactt tggagtgtgc tgattaaacg atcattatct 2220 cgttgatgaa gaccgatgga aggttcatct aaaatataaa gtacaccagt aagtctggaa 2280 ccgatttgtg tagcaagtcg aattcgttgc gcttcgccac cagaaagcgt cccagctgca 2340 cggctcattg ttaggtagtc gagcccaaca ttttttaaga agcctagtct agcacgaact 2400 tctttgaaaa ttggcgctgc aatttgtgtt tctttttcag atagttctaa gccatcgaag 2460 aaagcaagtg cttcattaat agaaaactca ctgatttgcc caatatgatg gtcgtttact 2520 ttaacggaaa gtgtttcttc ttttagacga tagcctttac aagatggaca tggtaaatca 2580 gtcatatatt gcgccatttg atcgcgtgtg aaatcggaat ttgtttcacg atagcgacgt 2640 tcgatatttg gaagtatccc ttcaaacgga atccacgttt cgcgtgtcat accgaaatca 2700 tttttgtatt cgaagtagaa ttctttatct tttgatccat ttaaaataat atctaattct 2760 tctttggata gcttctcaag aggtgtatcc atatctattc caaattcttt acaggcagaa 2820 gctagcattt gcgggtagta ctgtgaacta attgggcgcc aaggaataat agcaccttca 2880 tttagagaca tacttctatc aggaataacc gtgtcgacat cgacttcaag tttagtccca 2940 agtccatcac atgtggggca agcgccaaat gggctgttga aagagaacat tcttggttct 3000 aattcaccaa cggaaaaacc acaataaggg cacgcatagt gttcactaaa taataattct 3060 ttatccccca ttatatcaac aaccgcataa ccatcagcta aacgaagagc agcttcaatg 3120 gaatcataca gacgagtatt gatgccctct ttaatcacaa tgcgatcaat aatgatttca 3180 atagaatgct ttttgttttt ctcaatttca atttcgtcat tgatatcata aatttctcca 3240 tcaacacgaa ttcgaacata tccttctttt ttgatttcct caatagtttt cttatgtgtc 3300 ccttttttac cagaaacgat tggagccatt atttgaatac gtgttttttc tgggtattct 3360 agaacacgat ctaccatttg ttcgattgtt tgagaagtga tttcaatacc gtgatttgga 3420 caaaccggat gcccaacacg agcataaagt aagcgcaaat agtcatggat ttctgtaact 3480 gtcccaacag tggaacgtgg attacggctt gttgtttttt gatcaatcga aatggcaggg 3540 cttaatcctt caattaaatc cacatctggt ttatccattt gccctaaaaa ttggcgtgca 3600 tatgcggaca aagactctac ataacgtctt tgtccttctg cataaatcgt atcaaaagca 3660 agcgaagatt tacctgaacc tgaaagccca gtcataacta ctaatttgtc tctaggaatc 3720 tctacatcaa tgttttttaa gttatgggct cttgcaccct gaattactat tttctcttta 3780 tccaatttcg cttcatcctt ccgcttttat ttccagtaaa gcatcgcgaa gttcagcagc 3840 acgttcgaaa tcaagtgctt tagctgcttc tttcatttca tgttccatac cttcaatgaa 3900 tacatcgcgt tctttcttag acattttgct taaatcatgt tgcttcactg cttctctttc 3960 atctgcggca gaagtcgctg cgatgatacc acgaatttct tttttgattg tttttggcgt 4020 aatgccgtgt ttttcattat attcaatttg gattttacga cggcgttctg tttcgccaat 4080 agaattgcgc atcgaatcgg tcattttatc agcatacatg attactcgac cgttttcatt 4140 acgagcagct cgacccattg tttgaattaa ggaacgctcg gaacgaagga atccttcttt 4200 gtccgcatct aaaatagcga caagagatac ttcaggtaaa tcgattcctt cacgaagtaa 4260 gttaattcca acgataacat catacacacc aagtcgaagg tcacgaatga tttcgattcg 4320 ctcgagcgtc ttcacttccg agtggagata ctgtacttta acaccagctt ctttgagata 4380 gttggttaaa tcctcggaca tttttttcgt taaggtggtg attaaaacac gttcattttt 4440 ctcgacgcga tcgttaatct catccattaa gtcatcaatt tgtccttgaa tcggacggat 4500 ttctacgatt gggtctagca agccagttgg tcgaatgatt tgttcaatga catctggatt 4560 tttttctaat tcgtaagggc ctggtgtagc ggatataaac ataatttgat tgatatgctt 4620 ctcaaattct tctaaacgaa gcggcctatt atctagagcg ctaggcaatc taaagccatg 4680 atcaactagc atttgttttc tggcttggtc cccgttaaac ataccacgaa tttgcggcat 4740 cgtaacgtgt gactcatcaa ttaccatttg gaaatcatct gggaagtaat cgagtaacgt 4800 gtatggtgta actcccgctg gacgaaggga taaatgtcta gaatagttct caataccaga 4860 gcaatagccc atttcttcca tcatttccaa atcataattc gttcgctgtt caaggcgctg 4920 agcttctagc aatttattat ctgcacgtaa aactttaaga cggtcttcga gttcagcttt 4980 tatattaaca attgcttttt tcataatatc aggtctggtg acaaagtgag atgccgggaa 5040 aatggaaaca tgttctcttt ctcctataat ttcaccagta agtgcatcta cttctctaat 5100 tcgttcaatt tcatcaccga aaaattcaat ccgcatacag tgttcatctc ttgaagctgg 5160 gaaaatttcg acaacatcac cgcgaacacg gaagcgtcca cgttgaaaat ctatatcatt 5220 tcgatcatat tgaatatcta ctaatttgcg cagtagctga tcacggctaa tttccatgcc 5280 aacacgaagc gaaacgagca tctctccata ttcaatcggc gaacctaagc catagataca 5340 cgatacactc gcaatgataa ttacatcgcg acgttcaaaa agcgcagcag tagcagagtg 5400 acgaagctta tcgatttcat cattgatact tgcatctttt tcgatatatg tgtcactttg 5460 cggaacatag gcttctggtt gatagtaatc atagtaactg acaaaatatt ctacagcgtt 5520 atttgggaaa aactctttaa actcgctata cagctgtccc gctaacgtct tattgtgagc 5580 catgacaagt gtcggcttat ttacttcttg aatcacattg gatacggtaa aagttttccc 5640 tgtaccggtt gcaccaagta aagtttggtg tttcaagcct ttttttaatc ccgcaactaa 5700 ttgttctatc gctctaggtt ggtctccttg tgggctatac ttagaaacta actcaaattt 5760 atccttcaac tcggattccc cctattctgt atctgtccga ttctggtatc tgaaaagctt 5820 tgtttgtaaa aggtctagca aagcaaaaag cggatttttc agatccgtta atgtttctat 5880 tttatcataa atattttaat tagcctagca aaaaccgaac atattttcgc atttgttgaa 5940 aaataaaaaa cgcaacctgt tgattacgct tttctttatt ttatcacttt tacgcttttc 6000 tacctatata tttgctttgt taaaaatcac tgccactctt ctttaaacgt cgcagcatat 6060 acgttgcaag cacaaaacca atggtcatcg aaaaagcatc aataataatt agccacatag 6120 aactcgtata acctaacttg gcagaagcag caatcaaaat caccatcaaa agcaagccga 6180 cataacgatt ataagtgatt ctcgcaaaaa gaataacaag gaggcaaggg aaaataagcg 6240 cagatataat ttgatccatc ttacgttcct cccccttttt tatgcgtctc gtaatgcttt 6300 ggtcgttatt tccgttgtaa gctgtggtaa ttctgttttt tcgatacctt tttcagcaag 6360 catatctggt aaaatttctt ttaaaaagta cttaacgctc gccatttctc ggtactcata 6420 aatggttgca agtgcctcac tatagatttc cacaaaaata ttttctggat ttcctttttg 6480 aatttcgcca aaggattcat ataacaaatc tactttatca gaaattgcga ggattttccc 6540 ttccaacgta ctgtccttac cttcttttag caaatgacga taaatcggct ggtacgtttc 6600 tggaatttcc cgttcaataa agttttttgt catgctttct tccacttcgg aaag 6654 <210> 10 <211> 4612 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 10 ccggttgcaa taatttgacc gccaccatcg ccaccttctg gacctaaatc aatcaagtaa 60 tcagcttgtt tgataacgtc aagattatgc tcaataacaa gtactgtatc gccattctct 120 tctacaagtc tttgtaatac tttgagtaaa cgaccaatat catctgcgtg gagtccggta 180 gttggttcat ccagaatata gaaagatttt ccgttactac gtttatgaag ttccgaagct 240 agtttgacgc gctgcgcttc accacctgaa agcgtagttg caggttgtcc aagtcgaata 300 tagccaagac caacatctac aattgtttga agtttacgcg caattcttgg ttggttggtg 360 aaatattcta gtccttcctc tacagtcatt tctaatactt cagcaatatt tttgccttta 420 taacgaatat ctaacgtctc accattgtat cgttttccat gacaaacttc acagggtaca 480 tatacatcag gcaagaaatg catttcaatt ttgatgattc cgtcgccttt acacgcctcg 540 caacggccac cttttacgtt aaaactaaag cgaccttttt tataaccacg aactttggct 600 tcattagtac ttgcgaaaag gtcacgaata tcatcgaaag ctcctgtata agtagctgga 660 ttcgatctcg gtgttcttcc gattggtgat tggtcaatat tgataatttt ttctaggttt 720 tcgatgcctt ttatttcttt gtgttcacct ggttttgcgt ggtttctatt tagttttctc 780 gctaacgctt ttcgcagtac ttcattcact aacgaacttt tacctgaacc tgaaactcca 840 gttacacagg aaaaagtagc tagtggaatt tttgcattta cgtttttgag attatttgct 900 ttagcaccaa taatttctaa ttctagtccg ttaccttttc tacgtttagc agggactgga 960 ataaattttt tacctgaaag atagtcacca gtgatggaat ttttattatt ggcaacttct 1020 tctggtgttc cggctgcaac aattcgtccg ccgtgttctc ctgcacctgg accaatatca 1080 ataagataat ctgcggccat catcgtatct tcgtcatgct caacgacaat aagcgtgttt 1140 ccaatgtcac gcatactttg gagtgtgctg attaaacgat cattatctcg ttgatgaaga 1200 ccgatggaag gttcatctaa aatataaagt acaccagtaa gtctggaacc gatttgtgta 1260 gcaagtcgaa ttcgttgcgc ttcgccacca gaaagcgtcc cagctgcacg gctcattgtt 1320 aggtagtcga gcccaacatt ttttaagaag cctagtctag cacgaacttc tttgaaaatt 1380 ggcgctgcaa tttgtgtttc tttttcagat agttctaagc catcgaagaa agcaagtgct 1440 tcattaatag aaaactcact gatttgccca atatgatggt cgtttacttt aacggaaagt 1500 gtttcttctt ttagacgata gcctttacaa gatggacatg gtaaatcagt catatattgc 1560 gccatttgat cgcgtgtgaa atcggaattt gtttcacgat agcgacgttc gatatttgga 1620 agtatccctt caaacggaat ccacgtttcg cgtgtcatac cgaaatcatt tttgtattcg 1680 aagtagaatt ctttatcttt tgatccattt aaaataatat ctaattcttc tttggatagc 1740 ttctcaagag gtgtatccat atctattcca aattctttac aggcagaagc tagcatttgc 1800 gggtagtact gtgaactaat tgggcgccaa ggaataatag caccttcatt tagagacata 1860 cttctatcag gaataaccgt gtcgacatcg acttcaagtt tagtcccaag tccatcacat 1920 gtggggcaag cgccaaatgg gctgttgaaa gagaacattc ttggttctaa ttcaccaacg 1980 gaaaaaccac aataagggca cgcatagtgt tcactaaata ataattcttt atcccccatt 2040 atatcaacaa ccgcataacc atcagctaaa cgaagagcag cttcaatgga atcatacaga 2100 cgagtattga tgccctcttt aatcacaatg cgatcaataa tgatttcaat agaatgcttt 2160 ttgtttttct caatttcaat ttcgtcattg atatcataaa tttctccatc aacacgaatt 2220 cgaacatatc cttctttttt gatttcctca atagttttct tatgtgtccc ttttttacca 2280 gaaacgattg gagccattat ttgaatacgt gttttttctg ggtattctag aacacgatct 2340 accatttgtt cgattgtttg agaagtgatt tcaataccgt gatttggaca aaccggatgc 2400 ccaacacgag cataaagtaa gcgcaaatag tcatggattt ctgtaactgt cccaacagtg 2460 gaacgtggat tacggcttgt tgttttttga tcaatcgaaa tggcagggct taatccttca 2520 attaaatcca catctggttt atccatttgc cctaaaaatt ggcgtgcata tgcggacaaa 2580 gactctacat aacgtctttg tccttctgca taaatcgtat caaaagcaag cgaagattta 2640 cctgaacctg aaagcccagt cataactact aatttgtctc taggaatctc tacatcaatg 2700 ttttttaagt tatgggctct tgcaccctga attactattt tctctttatc caatttcgct 2760 tcatccttcc gcttttattt ccagtaaagc atcgcgaagt tcagcagcac gttcgaaatc 2820 aagtgcttta gctgcttctt tcatttcatg ttccatacct tcaatgaata catcgcgttc 2880 tttcttagac attttgctta aatcatgttg cttcactgct tctctttcat ctgcggcaga 2940 agtcgctgcg atgataccac gaatttcttt tttgattgtt tttggcgtaa tgccgtgttt 3000 ttcattatat tcaatttgga ttttacgacg gcgttctgtt tcgccaatag aattgcgcat 3060 cgaatcggtc attttatcag catacatgat tactcgaccg ttttcattac gagcagctcg 3120 acccattgtt tgaattaagg aacgctcgga acgaaggaat ccttctttgt ccgcatctaa 3180 aatagcgaca agagatactt caggtaaatc gattccttca cgaagtaagt taattccaac 3240 gataacatca tacacaccaa gtcgaaggtc acgaatgatt tcgattcgct cgagcgtctt 3300 cacttccgag tggagatact gtactttaac accagcttct ttgagatagt tggttaaatc 3360 ctcggacatt tttttcgtta aggtggtgat taaaacacgt tcatttttct cgacgcgatc 3420 gttaatctca tccattaagt catcaatttg tccttgaatc ggacggattt ctacgattgg 3480 gtctagcaag ccagttggtc gaatgatttg ttcaatgaca tctggatttt tttctaattc 3540 gtaagggcct ggtgtagcgg atataaacat aatttgattg atatgcttct caaattcttc 3600 taaacgaagc ggcctattat ctagagcgct aggcaatcta aagccatgat caactagcat 3660 ttgttttctg gcttggtccc cgttaaacat accacgaatt tgcggcatcg taacgtgtga 3720 ctcatcaatt accatttgga aatcatctgg gaagtaatcg agtaacgtgt atggtgtaac 3780 tcccgctgga cgaagggata aatgtctaga atagttctca ataccagagc aatagcccat 3840 ttcttccatc atttccaaat cataattcgt tcgctgttca aggcgctgag cttctagcaa 3900 tttattatct gcacgtaaaa ctttaagacg gtcttcgagt tcagctttta tattaacaat 3960 tgcttttttc ataatatcag gtctggtgac aaagtgagat gccgggaaaa tggaaacatg 4020 ttctctttct cctataattt caccagtaag tgcatctact tctctaattc gttcaatttc 4080 atcaccgaaa aattcaatcc gcatacagtg ttcatctctt gaagctggga aaatttcgac 4140 aacatcaccg cgaacacgga agcgtccacg ttgaaaatct atatcatttc gatcatattg 4200 aatatctact aatttgcgca gtagctgatc acggctaatt tccatgccaa cacgaagcga 4260 aacgagcatc tctccatatt caatcggcga acctaagcca tagatacacg atacactcgc 4320 aatgataatt acatcgcgac gttcaaaaag cgcagcagta gcagagtgac gaagcttatc 4380 gatttcatca ttgatacttg catctttttc gatatatgtg tcactttgcg gaacataggc 4440 ttctggttga tagtaatcat agtaactgac aaaatattct acagcgttat ttgggaaaaa 4500 ctctttaaac tcgctataca gctgtcccgc taacgtctta ttgtgagcca tgacaagtgt 4560 cggcttattt acttcttgaa tcacattgga tacggtaaaa gttttccctg ta 4612 <210> 11 <211> 2042 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 11 gcaagtatac agttaagttt gtaacgattt gttttgattt agactcaaaa cgtaaagttt 60 cttcatctac acgtaaagtc gttttatcaa agaagatttt aagtgcttca tcttctggat 120 attctttgaa tagtttaatc atcgcgtgaa ctttgatatc gttcgaatcg gatggtttaa 180 attcaatatt accattagca atttcgaatt ctaaaataga aagtgttgtg tcatgataaa 240 tgaaatcacg ttcgattttc gttgaagtta agaacgggaa tggcatatct ttcacttgtt 300 taaatgcact atttaggaaa gaaccgattt tttcaccagc ttgggataaa tcattaacca 360 tattgcgcat ggagtcttca cgatctttag aagaattttc gccgccttct tcttcatctc 420 tttcatgatt ttctggagtc ggttctgggc gtcttttacg actttttgga ggtgtataag 480 gatttccttg attgttccaa cctttactgt aatcatatga tggttcttct tttgtttctt 540 cttcgatttg ttcttcttct ctcggagctg cagatcgacg aatattttct tttgctgctg 600 ttttaccttc ttttttggaa atattttcaa gtagagtaag ggcttcttca gtggatataa 660 taccttgttt tactaattcg agaatacgtt tacgttcatt ttccattttc atttcctcct 720 ataatttagg ctaaactatt ttaggcttgc tttcacatgc aagtgacata tctgttttat 780 ctatgactct attatgaagg aaaatataat ttctgtcata caaccagagg atgattattt 840 gtttggactt tgggtggttt ggtcttaaga atcacgaaaa atcccgctta tattttgaat 900 aagcgggatt ttgattattt tttcttagct gttgcaattc gttcttccgt gcgttcttta 960 tcgcgttcta aaattggttt caagtattta cctgtataag atttttttga gcgagcgatt 1020 ttttcaggtg tgccggttgc accaagtaaa gtttggtgtt tcaagccttt ttttaatccc 1080 gcaactaatt gttctatcgc tctaggttgg tctccttgtg ggctatactt agaaactaac 1140 tcaaatttat ccttcaactc ggattccccc tattctgtat ctgtccgatt ctggtatctg 1200 aaaagctttg tttgtaaaag gtctagcaaa gcaaaaagcg gatttttcag atccgttaat 1260 gtttctattt tatcataaat attttaatta gcctagcaaa aaccgaacat attttcgcat 1320 ttgttgaaaa ataaaaaacg caacctgttg attacgcttt tctttatttt atcactttta 1380 cgcttttcta cctatatatt tgctttgtta aaaatcactg ccactcttct ttaaacgtcg 1440 cagcatatac gttgcaagca caaaaccaat ggtcatcgaa aaagcatcaa taataattag 1500 ccacatagaa ctcgtataac ctaacttggc agaagcagca atcaaaatca ccatcaaaag 1560 caagccgaca taacgattat aagtgattct cgcaaaaaga ataacaagga ggcaagggaa 1620 aataagcgca gatataattt gatccatctt acgttcctcc ccctttttta tgcgtctcgt 1680 aatgctttgg tcgttatttc cgttgtaagc tgtggtaatt ctgttttttc gatacctttt 1740 tcagcaagca tatctggtaa aatttctttt aaaaagtact taacgctcgc catttctcgg 1800 tactcataaa tggttgcaag tgcctcacta tagatttcca caaaaatatt ttctggattt 1860 cctttttgaa tttcgccaaa ggattcatat aacaaatcta ctttatcaga aattgcgagg 1920 attttccctt ccaacgtact gtccttacct tcttttagca aatgacgata aatcggctgg 1980 tacgtttctg gaatttcccg ttcaataaag ttttttgtca tgctttcttc cacttcggaa 2040 ag 2042 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 12 ctctggtacc tcctttgatt agtatattc 29 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 13 ctcctcgaga tccgcgtgtt tcttttcgat tg 32 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 14 ctcctcgagt ccatgggggg ttctcatcat c 31 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 15 ctcctcgagt gcggccgcaa gctt 24 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 16 gtcaaaacat acgctcttat c 21 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 17 acataatcag tccaaagtag atgc 24 <210> 18 <211> 2762 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 18 actacttgct ctggcgttcc ggaagcaacg atttgtccac ctttgtctcc gccttctggt 60 ccaaggtcaa cgatataatc cgctgtttta attacatcta aattatgttc aatgacaagt 120 accgtctcac cgctctcaac aagacgttgc agcacttcta gaagacgggc gatatcatgc 180 gcatgtaaac cagtcgttgg ctcgtctaaa atgtatagtg tacgtcctgt agaacgacgg 240 tgtaattcag aagctaattt cacacgctgt gcttcaccac cagataaagt cgtggctggt 300 tgccctaatt tcatataacc aagcccaacg tctacaagcg tttgaagttt acgtttaatt 360 tttgggatat tagcgaagaa ctctactccg tcttcaatcg tcatccctaa cacttcagaa 420 atgtttttat ctttatattt cacttctaac gtttcacggt tgtaacgttt accgtgacaa 480 acttcacacg gaacgtatac gtctggtaag aagtgcatct caattttaat aattccatca 540 ccacggcacg cttcacaacg tccacctttt acgttaaagc tgaaacgccc tttttgatat 600 ccgcgcactt tcgcttcatt cgtttgcgca aacacatcac gaatatcatc gaacacacct 660 gtataggttg ctggattaga acgtggtgta cgaccgattg gcgattgatc aatatcgata 720 actttatcta aatgctcaag acctttaatt tctttatgag tacctggctt cgctttcgct 780 ttatataact tttgcgctaa cgatttatat agtacttcat taatcatcgt acttttacct 840 gatccagata cacccgttac cgctacaaac gtaccaagcg ggaatgacat cttcgcgttc 900 tttaagttat tctcttttgc accgacaatc tccactttac gtccatcacc tttacgtctt 960 tcaagtggaa ctggaataaa ctctttaccg cttaaatact tacctgttag tgaattctca 1020 tcttgcatca cttcagctgg tgtacccgct gatacaactt gtccaccgtg aatacctgcg 1080 ccaggcccga tatccagtaa ataatcagct gccatcatcg tatcttcatc atgctcaaca 1140 acaattaacg tattacctaa atcacgcatt tcttgcaatg tacgaataag acgatcgtta 1200 tcgcgctgat gcaaaccgat agaaggctca tcaagaatgt aaagcacccc agtaagacgc 1260 gaaccaattt gcgttgctaa acgaatacgt tgcgcctcac caccagataa agttcctgcg 1320 gcacgactta acgttaaata atctaaacca acgtttacta agaacccaac gcgctcttga 1380 atttctctta aaattaaatg ggcaattttt tgttgtttct ctgttagctc cacatttgag 1440 aagaattcct gtacttcttg aacagaatac ttcgttacat cagcaatcgt ttttccgcca 1500 acgaaaacag ctaaactttc aggctttaag cgtccgcctt tacacttcgg acaagcttgt 1560 tctgccatat acttttccat ttgctcacga atgtaatccg aactcgtctc acgataacga 1620 cgttcaatat ttggaataac accttcaaat aaaatctcat tttcctttac ttgaccaaat 1680 tcatttacat agcggaaata aactttctct tcaccgcttc cgtacaacac tttatcaaat 1740 aaatctttcg gtatatcttt tacaggcaca tccatatcca cgccataatg attacataca 1800 gattgtaaaa gctgtgggta atattgtgaa cttgtcggtt cccaaggcgc aatcgcatgc 1860 tcatttaatg ataaatccca gttcggaata acaagttcta aatctacctc taactttgag 1920 ccaagcccat cacaagaagg acatgcaccg aacggactat tgaatgagaa catacgcggc 1980 tctaattctc caattgaaaa accacaatgc ggacaagcat gatgttcact aaatagaagc 2040 tcctcttctc ccataacatc gattaacact cgtcccccgc caagctttaa tgcactttca 2100 agagaatcag caagacggct tgcgattcct tcttttacaa caatacggtc aattacaact 2160 tcaatagaat gcttcttatt tttatctaac gcaatatctt cagacacatc gagcatttca 2220 ccatcaacac gtacacgaac ataaccttgc ttcttaatat cttcaagtac ttttacatgt 2280 gcacctttac gcccagaaac gataggagct aacacttgta atttcgtacg ttcagggtac 2340 tcaagtacac ggtctaccat ttgctctact gtttgcgatg taatttcaat gccatgattc 2400 ggacaaattg gcgtaccaat tcgcgcaaat aataaacgta agtaatcata aatctccgtt 2460 accgttccaa cagttgaacg cggattacga ctcgtcgttt tttgatcgat tgaaatcgct 2520 ggagataagc cttcaatcgt atctacatcc ggcttatcca tttgccctaa aaactggcgt 2580 gcatacgcag ataacgattc tacgtatctg cgctgccctt ctgcataaat cgtatcaaat 2640 gctaatgagg atttccctga accagacaat cctgttacaa cgacaagttg atttctcgga 2700 atggttacat caatattttt taagttatgt gctctagcac cttttacaac gataaaatcc 2760 tt 2762 <210> 19 <211> 1908 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 19 tgcttttgct gcttctttca tttctgcttc catcttcgca attgtctttt cacgctcttt 60 tttcgtcatc ttcttagctg gcgtcgcttc atatgtttcc ggctcttcag cagctgtcgt 120 tgcacggatt acatcacgca cacctttttg aatcgttttc ggcgtaatac catgctcttc 180 attgtaagct tcttgtatac tacgacgacg cttcgtctct tcaatcgcaa tccccatcga 240 tctcgttata cgatctgcgt acataataac gcgaccgttt tcattacgtg ctgcacggcc 300 aattgtttga attaacgaac gctctgaacg caagaatcct tccttatcgg catctaaaat 360 agctacaagg gatacttctg gaatatctaa tccttctcgc aataagttaa taccaacgag 420 aacatcaaac ttaccaaggc gaagatctcg tataatttca atacgttcta acgttttcac 480 ttcagaatgc agataattca ccttaattcc tacatctttt aagtagtctg ttaaatcctc 540 tgacatcttc ttcgttaaag ttgtaattaa tacacgttca ttttttgcaa tgcgatcttg 600 aatctctcct aatagatcgt caatctgccc ttcaattggt cgtatatcaa ttggcggatc 660 taaaagccct gttggacgaa taatttgttc tattacttct ggcgactgct ctaattcata 720 cggtcctggc gttgctgaaa cgtaaataac ttgattcgtt ttctcttcaa actcatcaaa 780 tgtgagcggt ctattatcta aagctgatgg cagacggaat ccatgatcca caagcacttg 840 tttacgcgct tggtccccgt tatacatcgc tcttacttgc ggcactgata cgtgggactc 900 atccataacg attaagaaat ctttcgggaa atagtctaat aacgtatacg gcgttgcacc 960 cgctggacga agtgttaaat gacgggaata gttttcaatc cctgaacaaa agcccatctc 1020 gcgcatcatt tctaaatcat aacgtgtacg ctgttctata cgctgcgctt ctaacaactt 1080 accgttatca tttaattcct ttaaacgctc ttctaattct ttttcgatat tttcaatagc 1140 gaccttcatc ttttcttcac gtgtaacgaa gtgagatgct gggaagattg ctacatgatc 1200 acgttctgct aatacttctc ccgttaaagc atttacttcg cgaatacgat caatttcatc 1260 gccaaaaaac tcaattcgaa tgcaatgctc gtcaagtgat gccgggaaga tttcaactac 1320 atctccgcgc acgcggaatg taccacgctt gaaatcaata tcattacgtc catactgcac 1380 atcaacaagt tcacgaagca attgattgcg gtccttttcc ataccaactc gaagtgaaac 1440 aactaactcg cggtattctt ctggagaacc taaaccatat atacacgaaa cactcgcaac 1500 aataattaca tcatcccgtt caaataatgc ggacgttgct gagtgacgca atttatcgat 1560 ttcatcatta atctgcgcgt ctttttcaat aaacgtatct gtttgtggca catacgcttc 1620 tggctgataa taatcgtaat aactaacaaa atattcaact gcattattcg ggaaaaagtc 1680 tttcaactca ctatataact gtcctgctaa cgttttattg tgagccatga caagcgttgg 1740 cttttgcact tctttaatga catttgaaat cgtaaatgtc ttacccgttc ctgtcgcccc 1800 aagcaacact tgctttttct ttccactatt aattccctct acaagcttct ctatagctac 1860 cggctgatca ccttgcgggg aatacgctga gacaatttca aattgacg 1908 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 20 Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 21 Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 22 gttaagtttc atgtggacgg caaag 25 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 23 aggtcttttt cagttaacta tcctctcctt gattctagtt at 42 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 24 caaggagagg atagttaact gaaaaagacc taaaaaagaa ggc 43 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 25 tcccctgttc ctataattgt tagctc 26 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 26 gtggacggca aagaaacaac caaag 25 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 27 gttcctataa ttgttagctc atttttttc 29 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 28 ctctggtacc tcctttgatt agtatattc 29 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 29 caatggatcc ctcgagatca taatttactt catccc 36 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 30 atttctcgag tccatggggg gttctcatca tc 32 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 31 ggtgctcgag tgcggccgca agctt 25 <210> 32 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 32 cgattcccct agttatgttt accaccaatt tgctgca 37 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 33 gcaaattggt ggtaaacata actaggggaa t 31 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 34 agtccaagtt atgcatatca tcaattt 27 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 35 cgatagtcca agttatgcat atcatcaatt tgc 33 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 36 gtcgcaaatt gatgatatgc ataacttgga ctat 34 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> E. coli <400> 37 Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu 1 5 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 38 ctgtgctttg cgaatggaaa gaagc 25 <210> 39 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 39 gttttcattc atacacttag acaagcgttg gcttttgcac ttc 43 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 40 gacaagcgtt ggcttttgca cttc 24 <210> 41 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 41 caaaagccaa cgcttgtcta agtgtatgaa tgaaaaccga gtgg 44 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 42 aagtgtatga atgaaaaccg agtgg 25 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 43 catataaagg ttccacaatt gccttttc 28 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 44 gaagcagaaa tgaagccaat actcaatc 28 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 45 ggttccacaa ttgccttttc aataatc 27 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 46 Lys Val Val Lys Asn Lys 1 5 <210> 47 <211> 12 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> misc_feature <222> 5, 6, 7, 8 <223> n = A,T,C or G <400> 47 gaacnnnngt tc 12 <210> 48 <211> 331 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 48 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Ser Pro 50 55 60 Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu Leu Ile 65 70 75 80 Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg Asn Val Leu 85 90 95 Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val Asn Ala 100 105 110 Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Thr Phe Lys Asp Glu Asp Thr 115 120 125 Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro Val Gln 130 135 140 Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala Ser Glu 145 150 155 160 Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala Ser Gly Thr Met Ser Met 165 170 175 Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser 180 185 190 Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Val Leu Gln Glu Leu 195 200 205 Asn Val Thr Val Arg Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg Lys Ile 210 215 220 Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr 225 230 235 240 Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala 245 250 255 Asn Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala 260 265 270 Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val 275 280 285 Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe 290 295 300 Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys Ile Lys His Ile Ala Thr Asn 305 310 315 320 Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val Ser Pro 325 330 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 49 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 50 Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr Val 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 51 Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 52 Tyr Leu Ser Gly Ala Asp Leu Asn Leu 1 5

Claims

독립생존 미생물을 포함하는 백신으로서, 미생물의 핵산은, 미생물의 증식이 약화되도록 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응시킴으로써 변형된 것임을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 핵산 표적화 화합물은 핵산 알킬화제인 것을 특징으로 하는 백신.
제 2 항에 있어서, 핵산 알킬화제는 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 핵산 표적화 화합물은 광조사에 의하여 활성화되는 것을 특징으로 하는 백신.
제 4 항에 있어서, 핵산 표적화 화합물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌 화합물인 것을 특징으로 하는 백신.
제 5 항에 있어서, 핵산 표적화 화합물은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소라렌인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 미생물은 그것의 변형된 핵산을 수복하는 미생물의 능력을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 7 항에 있어서, 미생물은 DNA 수복 효소가 결손된 것을 특징으로 하는 백신.
제 8 항에 있어서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 기능적 등가물에 존재하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 9 항에 있어서, 미생물은 uvrA 및 uvrB 둘 다 uvrA 및 uvrB 둘 다의 기능적 등가물에 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 8 항에 있어서, RecA, 또는 RecA의 기능적 등가물이 결손된 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 미생물은 박테리아인 것을 특징으로 하는 백신.
제 12 항에 있어서, 미생물은 마이코박테리움 투베르귤로시스 (Mycobacterium tuberculosis)인 것을 특징으로 하는 백신.
제 12 항에 있어서, 미생물은 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)인 것을 특징으로 하는 백신.
제 12 항에 있어서, 미생물은 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes)인 것을 특징으로 하는 백신.
제 15 항에 있어서, 미생물은 uvrA 및 uvrB 둘 다에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 16 항에 있어서, 미생물은 actA 유전자, inlB 유전자, 또는 둘 다에 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 백신은 약학적으로 허용되는 담체 또는 아쥬반트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항의 백신의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주 내 질환의 예방 또는 치료방법.
제 1 항의 백신의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주 내에서 항원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법에 있어서, 미생물은 항원을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
독립생존 미생물을 포함하는, 분리된 전문 항원제시세포로서, 미생물의 핵산은, 미생물의 증식이 약화되도록 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응시킴으로써 변형된 것임을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 22 항에 있어서, 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 22 항에 있어서, 핵산 표적화 화합물은 핵산 알킬화제인 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 24 항에 있어서, 핵산 알킬화제는 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르인 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 22 항에 있어서, 핵산 표적화 화합물은 광조사에 의하여 활성화되는 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 26 항에 있어서, 핵산 표적화 화합물은 UVA 조사에 의하여 활성화된 소라렌 화합물인 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 27 항에 있어서, 핵산 표적화 화합물은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소라렌인 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 22 항에 있어서, 미생물은 그것의 변형된 핵산을 수복하는 미생물의 능력을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 29 항에 있어서, 미생물은 DNA 수복 효소가 결손된 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 30 항에 있어서, 유전자 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 기능적 등가물에 존재하는 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 31 항에 있어서, 미생물은 uvrA 및 uvrB 둘 다 uvrA 및 uvrB 둘 다의 기능적 등가물에 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 31 항에 있어서, RecA, 또는 RecA의 기능적 등가물이 결손된 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 23 항에 있어서, 미생물은 박테리아인 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 34 항에 있어서, 미생물은 마이코박테리움 투베르귤로시스 (Mycobacterium tuberculosis)인 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 34 항에 있어서, 미생물은 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes)인 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 32 항에 있어서, 미생물은 uvrA 및 uvrB 둘 다에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 22 항에 있어서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 22 항의 전문 항원제시세포를 포함하는 백신.
제 22 항의 전문 항원제시세포의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주 내 질환의 예방 또는 치료방법.
제 22 항의 전문 항원제시세포의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주 내에서 항원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법에 있어서, 미생물은 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
적당한 조건 하에서 나이브 T 세포를 활성화시키기 충분한 시간 동안 나이브 T 세포를 제 22 항의 전문 항원제시세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 시험관 내 나이브 T 세포 활성화 방법.
적당한 조건하에서 및 전문 항원제시세포를 적재하기에 충분한 시간 동안 전문 항원제시세포에 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 시험관 내 접촉시키는 단계를 포함하는, 전문 항원제시세포에 항원을 적재하는 방법으로서, 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 접촉함으로써 변형된 것을 특징으로 하는, 전문 항원제시세포에 항원을 적재하는 방법.
적당한 조건 하 및 전문 항원제시세포가 활성화 되고/또는 성숙되도록 허용하기에 충분한 시간 동안 전문 항원제시세포에 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 시험관 내 접촉시키는 단계를 포함하는, 전문 항원제시세포를 활성화 및/또는 성숙시키는 방법으로서, 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 접촉함으로써 변형된 것을 특징으로 하는, 전문 항원제시세포를 활성화 및/또는 성숙시키는 방법.
(a) 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 세포에 접촉시킴으로써 항원을 전문 항원제시세포에 적재하는 단계로서, 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 접촉함으로써 변형된 것을 특징으로 하는 단계; 및 (b) 적재된 전문 항원제시세포를 포함하는 조성물의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
(a) 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 독립생존 미생물을 세포에 접촉시킴으로써 항원을 전문 항원제시세포에 적재하는 단계로서, 미생물의 핵산은 미생물의 증식이 약화되도록 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 접촉함으로 써 변형된 것을 특징으로 하는 단계; 및 (b) 적재된 전문 항원제시세포를 포함하는 조성물의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법.
핵산을 수복하는 능력을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 분리된 돌연변이 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes) 균주.
제 47 항에 있어서, 적어도 하나의 DNA 수복 효소가 결손된 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 47 항에 있어서, UvrA, UvrB, 또는 UvrA 및 UvrB 둘 다가 약화된 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 49 항에 있어서, uvrA 유전자, uvrB 유전자, 또는 uvrA 및 uvrB 유전자 둘 다에 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 47 항에 있어서, 박테리아 균주의 핵산은 박테리아의 증식이 약화되도록 변형된 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 47 항에 있어서, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁되고 수탁번호 PTA-5563로 표시되는 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) actA ^- /uvrAB ^- 균주 또는 그 균주의 UvrA, UvrB, 및 ActA가 결여된 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 52 항에 있어서, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁되고 수탁번호 PTA-5562로 표시되는 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) actA ^- /inlB ^- 균주 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 47 항의 돌연변이 균주 및 약학적으로 허용되는 담체 및 아쥬반트를 포함하는 백신.
제 47 항의 균주를 포함하는 조성물의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법에 있어서, 균주는 항원을 암호화하는 핵산분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 숙주에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법.
제 47 항의 균주를 포함하는 조성물의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주의 질환의 예방 또는 치료방법.
제 47 항의 균주를 포함하는 전문 항원제시세포.
핵산을 수복하는 능력을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는 분리된 돌연변이 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 균주.
제 58 항에 있어서, 적어도 하나의 DNA 수복 효소가 결손된 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 59 항에 있어서, UvrA, UvrB, 또는 UvrA 및 UvrB 둘 다가 약화된 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 60 항에 있어서, uvrA 유전자, uvrB 유전자, 또는 uvrA 및 uvrB 유전자 둘 다에 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 58 항에 있어서, 균주의 독성을 감소시키는 lef 유전자, cya 유전자, 또는 두 유전자 다에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 58 항에 있어서, 박테리아 균주의 핵산은 박테리아의 증식이 약화되도록 변형된 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
제 58 항의 균주를 포함하는 조성물의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법.
제 58 항의 균주를 포함하는 조성물의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 감염의 예방 또는 치료방법.
적어도 하나의 DNA 수복 효소가 결손된 독립생존 미생물을 포함하는 백신.
제 66 항에 있어서, 미생물은 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 기능적 등가물에 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 67 항에 있어서, 미생물은 uvrA 및 uvrB 둘 다 uvrA 및 uvrB 둘 다의 기능적 등가물에 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 66 항에 있어서, RecA, 또는 RecA의 기능적 등가물이 결손된 것을 특징으로 하는 백신.
제 66 항에 있어서, 미생물은 박테리아인 것을 특징으로 하는 백신.
제 66 항에 있어서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 66 항에 있어서, 백신은 약학적으로 허용되는 담체 또는 아쥬반트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 66 항의 백신의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 질환의 예방 또는 치료방법.
제 66 항의 백신의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법으로서, 미생물은 항원을 발현하는 것을 특징으로 하는 숙주에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법.
적어도 하나의 DNA 수복 효소가 결손된 독립생존 미생물을 포함하는 분리된 전문 항원제시세포.
제 75 항에 있어서, 미생물은 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 기능적 등가물에 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 76 항에 있어서, 미생물은 uvrA 및 uvrB 둘 다 uvrA 및 uvrB 둘 다의 기능적 등가물에 유전자 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 75 항에 있어서, RecA, 또는 RecA의 기능적 등가물이 결손된 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 75 항에 있어서, 전문 미생물은 박테리아인 것을 특징으로 하는 항원제시세포.
제 75 항에 있어서, 미생물은 항원을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 전문 항원제시세포.
제 75 항의 항원제시세포의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙 주에서 질환의 예방 또는 치료방법.
제 75 항의 항원제시세포의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법으로서, 미생물은 항원을 발현하는 것을 특징으로 하는 숙주에서 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법.
의학 용도의 독립생존 미생물로서, 미생물의 핵산은 미생물의 증식을 약화하도록 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응함으로써 변형된 것을 특징으로 하는 독립생존 미생물.
독립생존 미생물을 포함하는 의학 용도의 항원제시세포로서, 미생물의 핵산은 미생물의 증식을 약화하도록 핵산과 직접 반응하는 핵산 표적화 화합물과 반응함으로써 변형된 것을 특징으로 하는 항원제시세포.
핵산을 수복하는 능력을 약화시키는 유전자 돌연변이를 포함하는, 의학 용도의 돌연변이 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes) 균주.
적어도 하나의 DNA 수복 효소가 결손된, 의학 용도의 독립생존 미생물.
제 86 항에 있어서, 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 또는 리스테 리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes)인 미생물.
의학 용도의 항원제시세포로서, 항원제시세포는 적어도 하나의 DNA 수복 효소가 결손된 독립생존 미생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포.
(a) 제 47 항의 돌연변이 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes) 균주, 제 58 항의 돌연변이 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 균주, 또는 독립생존 미생물을 포함하는 조성물로서, 독립생존 미생물은 핵산 표적화 화합물과 반응함으로써 변형된 것을 특징으로 하는 조성물; 및 (b) 조성물을 숙주의 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 사용설명서 둘 다를 포함하는 키트.