JP2011155988A

JP2011155988A - 抗原および細菌分泌シグナルポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする組換え核酸分子、発現カセット、および細菌、ならびにこれらを使用する方法

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Publication number: JP2011155988A
Application number: JP2011115257A
Authority: JP
Inventors: Thomas W Dubensky Jr; ダブリュー．ドゥベンスキージュニアトーマス; Daniel A Portnoy; エー．ポートノイダニエル; Jr William S Luckett; エス．ルッケットジュニアウィリアム; David N Cook; エヌ．クックデーヴィッド
Original assignee: Anza Therapeutics Inc
Current assignee: Anza Therapeutics Inc
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2011-05-23
Publication date: 2011-08-18
Also published as: JP2007518405A; TW200530399A; JP5532280B2; HK1098673A1; CN1921884B; CN1921884A

Abstract

【課題】異種タンパク質の発現および分泌の効率を最大化して、Ｌｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンおよび他の細菌ベースのワクチンの能力を最大化する新規な方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、細菌における、抗原のような異種ポリペプチドを含めたポリペプチドの発現で有用な、組換え核酸分子、発現カセット、およびベクターを提供する。組換え核酸分子、発現カセットおよびベクターのいくつかは、ポリペプチドおよび／またはシグナルペプチドをコードするコドン最適化配列を含む。組換え核酸分子、発現カセット、および発現ベクターのいくつかは、ポリペプチドの分泌のための、非リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ）および／または非ｓｅｃＡ１シグナルペプチドをコードする配列を含む。本発明は、核酸分子、発現カセット、および発現ベクターを含む細菌、ならびに該細菌を含むワクチンのような組成物も提供する。
【選択図】なし

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、以下の米国仮特許出願の各々の米国特許法第１１９条（ｅ）のもとの優先権の利益を主張し、以下の各々の開示は、その全体が、本明細書において参考として援用される：「ＢａｃｔｅｒｉａｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣａｓｓｅｔｔｅｓ，ＢａｃｔｅｒｉａｌＶａｃｃｉｎｅＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｏｆＵｓｅＴｈｅｒｅｏｆ」と表題付けられたＴｈｏｍａｓＷ．Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．らによる米国仮特許出願第６０／６１６，７５０号（２００４年１０月６日出願）（事件整理番号２８２１７３００３９２３）；「ＢａｃｔｅｒｉａｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣａｓｓｅｔｔｅｓ，ＢａｃｔｅｒｉａｌＶａｃｃｉｎｅＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｏｆＵｓｅＴｈｅｒｅｏｆ」と表題付けられたＴｈｏｍａｓＷ．Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．らによる米国仮特許出願第６０／６１５，２８７号（２００４年１０月１日出願）（事件整理番号２８２１７３００３９２２）；米国仮特許出願第６０／５９９，３７７号（２００４年８月５日出願）；米国仮特許出願第６０／５５６，７４４号（２００４年３月２６日出願）；米国仮特許出願第６０／５４１，５１５号（２００４年２月２日出願）；および米国仮特許出願第６０／５３２，５９８号（２００３年１２月２４日出願）。さらに、本出願は、以下の出願の各々の一部係属出願であり、以下の各々の開示は、その全体が、本明細書において参考として援用される：国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／２３８８１（２００４年７月２３日出願）；米国特許出願第１０／８８３，５９９号（２００４年６月３０日出願）；米国特許出願第１０／７７３，６１８号（２００４年２月６日出願）；および米国特許出願第１０／７７３，７９２号（２００４年２月６日出願）。

（連邦政府によって後援を受けた研究または開発に関する声明）
本発明は、一部には、国立衛生研究所によって与えられたＳＢＩＲ助成金番号１Ｒ４３ＣＡ１０１４２１−０１のもと、政府の支持によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有し得る。

（発明の分野）
本発明の分野は、一般に、組換え細菌において、異種ポリペプチドを含めたポリペプチドの発現で有用な新規なポリヌクレオチドおよび発現カセットに関する。特に、本発明は、ワクチン組成物で有用な、新規の発現カセットおよび／または核酸分子を含む組換え細菌に関する。

（発明の背景）
異種抗原を送達するワクチンとして用いるために微生物が開発し始められている。異種抗原送達は、異なる種に由来するタンパク質または抗原をコードする核酸配列を含有するように修飾された微生物によって提供される。異種抗原送達は、天然感染剤または癌細胞の注入は受容生物に対して潜在的に有害であり、減弱されたまたは殺された剤または細胞の投与は効果的な免疫応答を誘導するのに成功しないことが判明しており、または感染剤または癌細胞の十分な減弱が許容される確実性をもって確保できない、癌および病原体（例えば、ＨＩＶまたはＢ型肝炎）のような特にビルレントなまたは致死的な源に由来する疾患または状態を治療または予防するのに特に有利である。最近、ある種の細菌株が組換えワクチンとして開発されている。例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｂｅｒｇｈｅｉサーカムスポロザイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｉｔｅ）抗原を発現するように修飾された減弱化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの経口ワクチンは、マラニアに対してマウスを保護することが示されている（非特許文献１）。

Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの双方の抗原提示経路を介して優れたＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ−細胞媒介応答を始動させるその能力のため、抗原特異的ワクチンで用いるために開発されているグラム−陽性通性細胞内細菌である。例えば、特許文献１、特許文献２、および特許文献３参照。

Ｌｉｓｔｅｒｉａは、先天性および適応Ｔ細胞依存性抗菌免疫を共に刺激するためのモデルとして長年研究されてきた。細胞性免疫を効果的に刺激するＬｉｓｔｅｒｉａの能力は、その細胞内ライフサイクルに基づく。宿主を感染させるに際して、該細菌は、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）を含めた食細胞によって、ファゴリソソーム区画に迅速に取り込まれる。該細菌の大部分は引き続いて分解される。感染されたＡＰＣのファゴソーム内での病原体のタンパク質分解による分解から得られるペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に直接負荷され、処理された抗原はクラスＩＩエンドソーム経路を介して抗原提示細胞の表面に発現され、これらのＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体は、抗体の生産を刺激するＣＤ４＋「ヘルパー」Ｔ細胞を活性化する。酸性区画内では、ある種の細菌遺伝子が活性され、これはコレステロール依存性サイトリシンＬＬＯを含み、これはファゴリソソームを分解することができ、該細菌を宿主細胞のサイトゾル区画に放出させ、そこで生き残ったＬｉｓｔｅｒｉａは増殖する。ＭＨＣクラスＩ経路を介する異種抗原の効果的な提示は、Ｌｉｓｔｅｒｉａによるデ・ノボ内因性タンパク質発現を必要とする。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞内では、Ｌｉｓｔｅｒｉａによって合成され分泌されたタンパク質がサンプリングされ、プロテオソームによって分解される。得られたペプチドはＴＡＰタンパク質によって小胞体にシャトルされ、ＭＨＣクラスＩ分子に負荷される。ＭＨＣＩ−ペプチド複合体は細胞表面に送達され、それは、効果的な共刺激（シグナル２）と組み合わされて、同属Ｔ細胞受容体を有する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化し、刺激して、例えば、腫瘍細胞に提示されたＭＨＣＩ−ペプチド複合体を拡大し、引き続いてそれを認識する。適当なミクロ環境においては、活性化されたＴ細胞は癌性細胞を標的とし、それを殺す。
ＬｉｓｔｅｒｉａがＭＨＣクラスＩ経路を介する異種抗原の提示をプログラムすることによるメカニズムを仮定すれば、異種遺伝子の発現および細菌からの新たに合成されたタンパク質の感染された（抗原提示）細胞の細胞質への分泌の双方の効率は、ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングおよび／または活性化の能力に直接関連する。Ａｇ特異的Ｔ細胞プライミングのレベルはワクチン効率に直接関連するため、異種タンパク質の発現および分泌の効率はワクチン能力に直接関連する。

米国特許第６，０５１，２３７号明細書米国特許第６，５６５，８５２号明細書米国特許第５，８３０，７０２号明細書

Ａｇｇａｒｗａｌら、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」１９９０年、第１７２巻：１０８３

かくして、異種タンパク質の発現および分泌の効率を最大化して、Ｌｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンおよび他の細菌ベースのワクチンの能力を最大化する新規な方法が当該分野で求められる。また、多量の異種タンパク質の発現および分泌が望まれる細菌宿主発現系における、異種タンパク質の発現の分泌および効率を最大化するのは有益であろう。

（発明の要旨）
本発明は、一般に、細菌、特にＬｉｓｔｅｒｉａにおいて、ポリペプチド（例えば、異種ポリペプチド）を発現し、および／または分泌するのに用いられる、新規な組換え核酸分子、発現カセット、およびベクターを含めた新規なポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、これらのポリヌクレオチドは、細菌においてポリペプチドの増強された発現および／または分泌を提供する。また、本発明は、一般には、組換え核酸分子、発現カセット、またはベクターを含む細菌、ならびに該細菌を含む医薬、免疫原性、およびワクチン組成物も提供する。これらの細菌および組成物は、免疫応答の誘導、および癌、感染症および自己免疫疾患を含めた広い範囲の疾患または他の状態の治療および／または予防で有用である。
１つの態様において、本発明は、シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌における発現に対してコドン最適化されており、およびポリペプチド（例えば、抗原）をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は、該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａのような細菌における発現についてもコドン最適化されている。また、本発明は、この組換え核酸分子を含み、さらに、該組換え核酸分子に操作可能に連結したプロモーターを含む発現カセットも提供する。該細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンがそうであるように、組換え核酸分子および／または発現カセットを含むベクターおよび細菌も提供される。宿主において免疫応答を誘導し、および／または疾患のような状態を予防しまたは治療するための、該細菌を用いる方法、または該細菌を含む組成物も提供される。

もう１つの態様において、本発明は、（ａ）細菌本来のシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは該細菌における発現に対してコドン最適化されており、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは該シグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは該細菌に対して外来性である。また、本発明は、この組換え核酸分子を含み、かつ該組換え核酸分子に操作可能に連結したプロモーターをさらに含む発現カセットも提供する。該細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンがそうであるように、該組換え核酸分子および／または発現カセットを含むベクターおよび細菌も提供される。宿主において免疫原性を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、該細菌を用いる方法、または該細菌を含む組成物も提供される。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該組換え核酸分子は、（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現についてコドン最適化されており、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにおけるものであり；を含み、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａに対して天然である。該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、該Ｌｉｓｔｅｒｉａを用いる方法（または該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む組成物）も提供される。

もう１つの態様において、本発明は、非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（抗原のような）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、およびここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは該シグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のポリヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａのような細菌において発現につきコドン最適化されている。本発明は、この組換え核酸分子を含み、かつ該組換え核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットも提供する。該細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンのように、該組換え核酸分子および／または発現カセットを含むベクターおよび細菌も提供される。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または疾患のような状態を治療するための、該細菌を用いる方法、または該細菌を含む組成物も提供される。

なおさらなる態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）該シグナルペプチドに対して異種である、または該細菌に対して外来性であるのいずれかであるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここに、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは該シグナルペプチドに対して異種であるか、または該細菌に対して外来性であり（すなわち、該細菌に対して異種であり）、または双方である。該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、該Ｌｉｓｔｅｒｉａを用いる方法（または該Ｌｉｓｔｅｒｉａ）を含む組成物）も提供される。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子はＬｉｓｔｅｒｉａに対して外来性であるポリペプチド（例えば、癌または非Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染症抗原）をコードするポリヌクレオチドを含み、ここに、外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、さらに、Ｌｉｓｔｅｒｉａに対して外来性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して天然である。他の実施形態において、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきやはりコドン最適化されている。該組換え核酸分子を含むＬｉｓｔｅｒｉａも提供される。該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。加えて、本発明は、宿主において、免疫応答を誘導し、および／または（限定されるものではないが、疾患のような）状態を予防しまたは治療するための、該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を用いる方法を提供する。

もう１つの態様において、本発明は、発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該発現カセットは、Ｌｉｓｔｅｒｉａに対して外来性であるポリペプチド（例えば、癌または非Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染症抗原）をコードするポリヌクレオチド、ここに、外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されており、および外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、該発現カセットは、さらに、発現カセットがシグナルペプチドおよび外来性ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するように、Ｌｉｓｔｅｒｉａに対して外来性であるポリペプチドをコードし、かつプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、シグナルペプチド（Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して天然または外来性いずれかであるシグナルペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきやはりコドン最適化されている。Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。加えて、本発明は、宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を用いる方法を提供する。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここに、該組換え核酸分子は非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよびポリペプチドを共に含む融合タンパク質をコードする。本発明は、該組換え核酸分子を含む発現カセットも提供し、ここに、該発現カセットは、さらに、該組換え核酸分子の第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターも含む。組換え核酸分子および／または発現カセットを含むベクターも提供される。加えて、該組換え核酸分子および／または該発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌も提供される。該Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、該Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌を用いる方法（またはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物）も提供される。

さらなる態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここに、該組換え核酸分子は非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよび該ポリペプチドを共に含む融合タンパク質をコードする。該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、該Ｌｉｓｔｅｒｉａを用いる方法（または該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む組成物）も提供される。

なおさらなる態様において、本発明は、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチド（例えば、抗原）をコードする第二のポリヌクレオチド、および第一および第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む（例えば、種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの）Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。該発現カセットは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよびポリペプチドを共に含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されている。該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。加えて、本発明は、宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防または治療するための、該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を用いる方法を提供する。

また、本発明は、（ａ）細菌自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供し、ここに、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、ここに、該組換え核酸分子は第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種を含むタンパク質キメラをコードし、ここに、該タンパク質キメラにおいては、ポリペプチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種に融合されるか、またはそれ内に位置する。該細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンのような、該組換え核酸分子および／または発現カセットを含むベクターおよび細菌も提供される。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または疾患のような状態を治療するための、該細菌または該細菌を含む組成物を用いる方法も提供される。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を提供し、ここに、該核酸分子は少なくとも２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする。本発明は、さらに、該組換え核酸分子を含み、かつプロモーターをさらに含む発現カセットを提供し、ここに、該プロモーターは該組換え核酸分子に操作可能に連結されている。該組換え核酸分子および／または発現カセットを含むベクターがさらに提供される。加えて、該組換え核酸分子（および／または発現カセット）を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌も提供される。該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、該Ｌｉｓｔｅｒｉａを用いる方法（または該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む組成物）も提供される。

さらなる態様において、本発明はポリシストロニック発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該ポリシストロニック発現カセットは少なくとも２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする。該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、該Ｌｉｓｔｅｒｉａを用いる方法（または該Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む組成物）も提供される。

他の態様において、本発明は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、（ｂ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および（ｃ）該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに対して異種であるポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド、ここに、該第三のポリヌクレオチドは第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチド、該第三のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、および該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントを含むタンパク質キメラをコードし、およびここに、該第三のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、該タンパク質キメラにおいて、該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに融合されているか、あるいは該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメント内に位置する。該組換え核酸分子を含み、および該組換え核酸分子の第一、第二および第三のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットも提供される。該細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンのような、該組換え核酸分子および／または発現カセットを含むベクターおよび細菌も提供される。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態を予防しまたは治療するための、該細菌を用いる方法、または該細菌を含む組成物も提供される。

いくつかの実施形態において、抗原に対して宿主において免疫応答を誘導する方法は、（例えば、前記態様のいずれかにおける、または以下の発明の詳細な記載または実施例における）宿主に対するここに記載された組換え細菌を含む組成物の有効量を宿主に投与することを含み、ここに、該細菌における該組換え核酸分子、発現カセットおよび／またはベクターによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。いくつかの実施形態において、宿主において疾患のような状態を予防または治療する方法は、有効量の宿主に対するここに記載された組換え細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む。

本発明は、さらに、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における、（例えば、前記態様のいずれかにおける、または以下の発明の詳細な記載または実施例における）ここに記載された組換え細菌の使用を提供し、ここに、該細菌における該組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターによってコードされたポリペプチドは抗原を含む。いくつかの実施形態において、該抗原は異種抗原である。また、本発明は、宿主において状態（例えば、癌または感染症のような疾患）を予防し、または治療するための医薬の製造における、本明細書中に記載された組換え細菌の使用も提供する。本発明は、さらに、抗原に対して宿主において免疫応答を誘導するのに用いる本明細書中に記載された組換え細菌を提供し、ここに、該細菌における該組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターは抗原を含む。本発明は、さらに、宿主において（疾患のような）状態の予防または治療で用いられる本明細書中に記載された組換え細菌を提供する。

さらなる態様において、本発明は、宿主細菌において異種タンパク質を発現し、および分泌する改良された方法を提供する。

前記された組換え核酸分子および発現カセットの各々を含む細菌を生産する方法も提供される。ワクチンを生産するための該細菌の使用方法も提供される。

本発明は、さらに、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されているポリヌクレオチドを含めた、シグナルペプチドおよび／または抗原をコードする種々のポリヌクレオチドを提供する。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
組換え核酸分子であって、該組換え核酸分子は、
（ａ）細菌本来のシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドであって、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌における発現に対してコドン最適化されいる、第一のポリヌクレオチド；および
（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドであって、ここに、該第二のポリヌクレオチドは該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、第二のポリヌクレオチド
を含み、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、組換え核酸分子。
（項目２）
前記細菌がＬｉｓｔｅｒｉａ細菌である、項目１に記載の組換え核酸分子。
（項目３）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、腫瘍関連抗原、腫瘍関連抗原に由来するポリペプチド、感染症抗原、および感染症抗原に由来するポリペプチドからなる群より選択される抗原を含む、項目１に記載の組換え核酸分子。
（項目４）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、シグナルペプチドに対して異種であるか、細菌に対して外来性であるか、または双方である、項目１に記載の組換え核酸分子。
（項目５）
前記シグナルペプチドが、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＬＬＯシグナルペプチドであるか、またはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドである、項目１に記載の組換え核酸分子。
（項目６）
前記組換え核酸分子の第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、項目１に記載の組換え核酸分子を含む発現カセット。
（項目７）
前記第一のポリヌクレオチドが、前記組換え細菌における発現に対してコドン最適化されている、項目１に記載の組換え核酸分子を含む組換え細菌。
（項目８）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目７に記載の組換え細菌を含む組成物を投与する工程
を包含し、ここに、前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、該抗原を含む、方法。
（項目９）
組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌であって、ここに、該組換え核酸分子は、
（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドであって、ここに、該第一のポリヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌における発現に対してコドン最適化されている、第一のポリヌクレオチド；および
（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドであって、ここに、該第二のポリヌクレオチドは該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、第二のポリヌクレオチド
を含み、
ここに、該組換え核酸分子は、該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１０）
前記組換え核酸分子を含む発現カセットを含み、ここに、該発現カセットは、該組換え核酸分子の第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドの双方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１１）
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌が、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種に属する、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１２）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、腫瘍関連抗原、腫瘍関連抗原に由来するポリペプチド、感染症抗原、および感染症抗原に由来するポリペプチドからなる群より選択される抗原を含む、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１３）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原を含むか、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来するポリペプチドを含む、項目１２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１４）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、メソセリン、またはその抗原性フラグメントもしくは抗原性改変体を含むか、あるいはＮＹ−ＥＳＯ−１、またはその抗原性フラグメントもしくは抗原性改変体を含む、項目１３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１５）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、そのシグナルペプチドおよびＧＰＩリンカードメインを欠失したヒトメソセリンを含む、項目１４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１６）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、前記シグナルペプチドに対して異種である、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１７）
前記シグナルペプチドが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１８）
前記シグナルペプチドが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌本来のものである、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目１９）
前記シグナルペプチドが、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＬＬＯシグナルペプチド、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチド、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのＰｈｏＤシグナルペプチドからなる群より選択されるシグナルペプチドである、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目２０）
細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖に対して減弱化されている、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目２１）
ＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方が欠損した、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目２２）
前記組換え細菌の核酸が、核酸標的化合物との反応によって修飾されている、項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目２３）
項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む、免疫原性組成物またはワクチン。
（項目２４）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与する工程
を包含し、ここに、前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、該抗原を含む、方法。
（項目２５）
宿主において状態を予防または処置する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目２６）
組換え核酸分子であって、該組換え核酸分子は、
（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；および
（ｂ）該シグナルペプチドに対して異種であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドであって、ここに、該第二のポリヌクレオチドは該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、第二のポリヌクレオチド
を含み、そして、
ここに、該組換え核酸分子は、該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、組換え核酸分子。
（項目２７）
前記第一のポリヌクレオチド、前記第二のポリヌクレオチド、または該第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド双方が、細菌における発現に対してコドン最適化されている、項目２６に記載の組換え核酸分子。
（項目２８）
前記シグナルペプチドが、Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナルペプチドである、項目２６に記載の組換え核酸分子。
（項目２９）
前記シグナルペプチドが、ｓｅｃＡ２シグナルペプチドまたはＴａｔシグナルペプチドである、項目２６に記載の組換え核酸分子。
（項目３０）
前記シグナルペプチドが、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドであるか、またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｐｈｏＤシグナルペプチドである、項目２６に記載の組換え核酸分子。
（項目３１）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、腫瘍関連抗原、腫瘍関連抗原に由来するポリペプチド、感染症抗原、および感染症抗原に由来するポリペプチドからなる群より選択される抗原を含む、項目２６に記載の組換え核酸分子。
（項目３２）
前記組換え核酸分子の第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、項目２６に記載の組換え核酸分子を含む発現カセット。
（項目３３）
項目２６に記載の組換え核酸分子を含む、組換え細菌。
（項目３４）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌である、項目３３に記載の組換え細菌。
（項目３５）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目３３に記載の組換え細菌を含む組成物を投与する工程
を包含し、ここに、前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、該抗原を含む、方法。
（項目３６）
組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌であって、ここに、該組換え核酸分子は、
（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；および
（ｂ）該シグナルペプチドに対して異種であるか、または該細菌に対して外来性であるか、または双方であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドであって、ここに、該第二のポリヌクレオチドは該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、第二のポリヌクレオチド
を含み、
ここに、該組換え核酸分子は、該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目３７）
前記組換え核酸分子を含む発現カセットを含み、ここに、該発現カセットは、該組換え核酸分子の第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目３８）
前記第一のポリヌクレオチド、前記第二のポリヌクレオチド、または該第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド双方が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌における発現に対してコドン最適化されている、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目３９）
前記細菌が、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種に属する、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４０）
前記非ｓｅｃＡ１シグナルペプチドが、非Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナルペプチドである、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４１）
前記非ｓｅｃＡ１シグナルペプチドが、Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナルペプチドである、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４２）
前記シグナルペプチドが、ｓｅｃＡ２シグナルペプチドである、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４３）
前記組換え核酸分子が、さらに、
（ｃ）前記第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、ｓｅｃＡ２自己溶解素、またはそのフラグメントをコードする第三のポリヌクレオチド
を含み、ここに、該第二のポリヌクレオチドは、該第三のポリヌクレオチド内に位置するか、または該第一のポリヌクレオチドと該第三のポリヌクレオチドとの間に位置する、項目４２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４４）
前記シグナルペプチドが、Ｔａｔシグナルペプチドである、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４５）
前記シグナルペプチドが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのＰｈｏＤシグナルペプチドであるか、またはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドである、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４６）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドが、腫瘍関連抗原、腫瘍関連抗原に由来するポリペプチド、感染症抗原、および感染症抗原に由来するポリペプチドからなる群より選択される抗原を含む、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４７）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原を含むか、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来するポリペプチドを含む、項目４６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４８）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、メソセリン、またはその抗原性フラグメントもしくは抗原性改変体を含む、項目４７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目４９）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、そのシグナルペプチドおよびＧＰＩアンカーを欠失したヒトメソセリンを含む、項目４８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目５０）
細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖に対して減弱化されている、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目５１）
ＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方が欠損している、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目５２）
前記組換え細菌の核酸が、核酸標的化合物との反応によって修飾されている、項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目５３）
項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む、免疫原性組成物またはワクチン。
（項目５４）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与する工程
を包含し、ここに、前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、該抗原を含む、方法。
（項目５５）
宿主において状態を予防または処置する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目５６）
組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌であって、ここに、該組換え核酸分子は、
（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；および
（ｂ）該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド
を含み、
ここに、該組換え核酸分子は、該非Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナルペプチドおよび該ポリペプチド双方を含む融合タンパク質をコードする、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目５７）
前記組換え核酸分子を含む発現カセットを含み、ここに、該発現カセットは、該組換え核酸分子の第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目５８）
前記第一のポリヌクレオチド、前記第二のポリヌクレオチド、または該第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド双方が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌における発現に対してコドン最適化されている、項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目５９）
前記細菌が、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６０）
前記シグナルペプチドが細菌性である、項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６１）
前記シグナルペプチドがグラム陽性菌に由来する、項目６０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６２）
前記シグナルペプチドが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌に由来する、項目６１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６３）
前記シグナルペプチドが、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓに由来するＵｓｐ４５シグナルペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓに由来する保護抗原シグナルペプチド、およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓからのＰｈｏＤシグナルペプチドからなる群より選択されるシグナルペプチドである、項目６２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６４）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、腫瘍関連抗原、腫瘍関連抗原に由来するポリペプチド、感染症抗原、および感染症抗原に由来するポリペプチドからなる群より選択される抗原を含む、項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６５）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原を含むか、またはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来するポリペプチドを含む、項目６４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６６）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、メソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体を含む、項目６５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６７）
前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、そのシグナルペプチドおよびＧＰＩアンカーを欠失したヒトメソセリンを含む、項目６６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６８）
細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖に対して減弱化されている、項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目６９）
ＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方が欠損している、項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目７０）
前記組換え細菌の核酸が、核酸標的化合物との反応によって修飾されている、項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目７１）
項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む、免疫原性組成物またはワクチン。
（項目７２）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与する工程
を包含し、ここに、前記第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、該抗原を含む、方法。
（項目７３）
宿主において状態を予防または処置する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目７４）
組換え核酸分子であって、該組換え核酸分子は、
（ａ）細菌自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントもしくは触媒的に活性な改変体をコードする第一のポリヌクレオチド；および
（ｂ）該細菌自己溶解素に対して異種であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドであって、ここに、該第二のポリヌクレオチドは、該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、第二のポリヌクレオチド
を含み、
ここに、該組換え核酸分子は、該第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および該自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントもしくは触媒的に活性な改変体を含むタンパク質キメラをコードし、ここに、該タンパク質キメラにおいて、該ポリペプチドは、該自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントもしくは触媒的に活性な改変体に融合しているか、あるいは該自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントもしくは触媒的に活性な改変体内に位置している、組換え核酸分子。
（項目７５）
項目７４に記載の組換え核酸分子を含む、組換え細菌。
（項目７６）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目７５に記載の組換え細菌を含む組成物を投与する工程
を包含し、ここに、該第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、該抗原を含む、方法。
（項目７７）
ポリシストロニック発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌であって、ここに、該ポリシストロニック発現カセットは、少なくとも２つの別個の非Ｌｉｓｔｅｒｉａポリペプチドをコードする、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目７８）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目７７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与する工程
を包含し、ここに、前記ポリシストロニック発現カセットによってコードされる非Ｌｉｓｔｅｒｉａポリペプチドの少なくとも１つが、該抗原を含む、方法。
（項目７９）
組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌であって、ここに、該組換え核酸分子は、該Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここに、該ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現に対してコドン最適化されている、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌。
（項目８０）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目７９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与する工程
を包含し、ここに、前記外来性ポリペプチドが、該抗原を含む、方法。
（項目８１）
組換え核酸分子であって、該組換え核酸分子は、
（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；
（ｂ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチドであって、ここに、該第二のポリヌクレオチドは、該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、第二のポリヌクレオチド；および
（ｃ）該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに対して異種であるポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチドであって、ここに、該第三のポリヌクレオチドは、該第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、第三のポリヌクレオチド
を含み、
ここに、該組換え核酸分子は、該シグナルペプチド、該第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントを含むタンパク質キメラをコードし、そして、該タンパク質キメラにおいて、該第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに融合しているか、あるいは該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメント内に位置する、組換え核酸分子。
（項目８２）
項目８１に記載の組換え核酸分子を含む、組換え細菌。
（項目８３）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、
該宿主に有効量の項目８２に記載の組換え細菌を含む組成物を投与する工程
を包含し、ここに、前記第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、該抗原を含む、方法。
（項目８４）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬を製造する際の項目７、９、３３、３６、５６または７５に記載の組換え細菌の使用であって、ここに、該第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、該抗原を含む、使用。
（項目８５）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬を製造する際の項目７７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の使用であって、ここに、前記ポリシストロニック発現カセットによってコードされる非Ｌｉｓｔｅｒｉａポリペプチドの少なくとも１つは、該抗原を含む、使用。
（項目８６）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬を製造する際の項目７９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の使用であって、ここに、前記外来性ポリペプチドは、該抗原を含む、使用。
（項目８７）
抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬を製造する際の項目８２に記載の組換え細菌の使用であって、ここに、前記第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、該抗原を含む、使用。
（項目８８）
宿主において状態を予防または処置するための医薬を製造する際の項目７、９、３３、３６、５６、７５、７７、７９または８２に記載の組換え細菌の使用。

図１は、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０５６（配列番号：１）（底部配列）およびＥＧＤ株（配列番号：２）（頂部配列）についてのｈｒｙプロモーターアラインメントを示す。図２は、ＬＬＯシグナルペプチド、ＬＬＯＰＥＳＴ配列、および全長ヒトＥｐｈＡ２抗原を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号：３）を示す。図３は、図２に示されたポリヌクレオチドによってコードされた融合タンパク質の配列（配列番号：４）を示す。図４は、ヒトＥｐｈＡ２細胞外ドメイン（ＥＸ２）をコードする天然ヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す。図５は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されているヒトＥｐｈＡ２細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す。図６は、ヒトＥｐｈＡ２細胞外ドメイン（ＥＸ２）のアミノ酸配列（配列番号：７）を示す。図７は、ＬＬＯシグナルペプチド、ＬＬＯＰＥＳＴ配列、およびヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードする非コドン最適化ポリヌクレオチド配列（配列番号：８）を示す。図８は、図７に示されたコード配列によってコードされた融合タンパク質の配列（配列番号：９）を示す。図９は、ｈｌｙプロモーターを含み、かつＬＬＯシグナルペプチド、ＬＬＯＰＥＳＴ配列およびヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現カセット（配列番号：１０）を示す。この配列においては、ヒトＥｐｈＡ２細胞外ドメインをコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。図１０は、図９の発現カセットによってコードされたアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。図１１は、ｈｌｙプロモーターを含み、かつＬＬＯシグナルペプチド、ＬＬＯＰＥＳＴ配列およびヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現カセット（配列番号：１２）を示す。この配列においては、ＬＬＯシグナルペプチド、ＬＬＯＰＥＳＴ、およびヒトＥｐｈＡ２細胞外ドメインをコードする配列は、全て、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。図１２は、図１１の発現カセットによってコードされたアミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。図１３は、ｈｌｙプロモーターを含み、かつｐｈｏＤＴａｔシグナルペプチドおよびヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現カセット（配列番号：１４）を示す。この配列においては、ｐｈｏＤＴａｔシグナルペプチドおよびヒトＥｐｈＡ２細胞外ドメインをコードする配列は、共に、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。図１４は、図１３の発現カセットによってコードされたアミノ酸配列（配列番号：１５）を示す。図１５は、ヒトＥｐｈＡ２細胞内ドメイン（ＣＯ）をコードする天然ヌクレオチド配列（配列番号：１６）を示す。図１６は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されているヒトＥｐｈＡ２細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号：１７）を示す。図１７は、ヒトＥｐｈＡ２細胞内ドメイン（ＥＸ２）のアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。図１８は、ＬＬＯシグナルペプチド、ＬＬＯＰＥＳＴ配列およびヒトＥｐｈＡ２の細胞内ドメインを含む融合タンパク質をコードする非コドン最適化ポリヌクレオチド配列（配列番号：１９）を示す。図１９は、図１８に示されたコード配列によってコードされた融合タンパク質の配列（配列番号：２０）を示す。図２０は、ｈｌｙプロモーターを含み、かつＬＬＯシグナルペプチド、ＬＬＯＰＥＳＴ配列、およびヒトＥｐｈＡ２の細胞内ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現カセット（配列番号：２１）を示す。この配列においては、ヒトＥｐｈＡ２細胞内ドメインをコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。図２１は、図２０の発現カセットによってコードされたアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。図２２は、ｈｌｙプロモーターを含み、かつＬＬＯシグナルペプチド、ＬＬＯＰＥＳＴ配列、およびヒトＥｐｈＡ２の細胞内ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現カセット（配列番号：２３）を示す。この配列においては、ＬＬＯシグナルペプチド、ＬＬＯＰＥＳＴ、およびヒトＥｐｈＡ２細胞内ドメインをコードする配列は、全て、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。図２３は、図２２の発現カセットによってコードされたアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。図２４は、ｈｌｙプロモーターを含み、かつｐｈｏＤＴａｔシグナルペプチドおよびヒトＥｐｈＡ２の細胞内ドメインを含む融合タンパク質をコードする発現カセット（配列番号：２５）を示す。この配列においては、ｐｈｏＤＴａｔシグナルペプチドおよびヒトＥｐｈＡ２細胞内ドメインを共にコードする配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。図２５は、図２４の発現カセットによってコードされたアミノ酸配列（配列番号：２６）を示す。図２６は、ｈｌｙプロモーターを含み、かつＬＬＯシグナルペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を含む融合タンパク質をコードするコドン最適化発現カセット（配列番号：２７）を示す。シグナルペプチドおよび抗原をコードする配列は共にＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。図２７は、図２６の発現カセットによってコードされたアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す。図２８は、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドをコードするコドン最適化配列に操作可能に連結されたｈｌｙプロモーターを含むポリヌクレオチド（配列番号：２９）を示す。図２９は、ｐ６０シグナルペプチドをコードする天然配列に操作可能に連結されたｈｌｙプロモーターを含むポリヌクレオチド（配列番号：３０）を示す。図３０は、ｐ６０シグナルペプチドをコードするコドン最適化配列に操作可能に連結されたｈｌｙプロモーターを含むポリヌクレオチド（配列番号：３１）を示す。図３１は、ｈｌｙＰ−ｐ６０遺伝子フラグメントの配列（配列番号：３２）を示す。図３２Ａは、ｐＡＭ４０１−ＭＣＳの配列（配列番号：３３）を示し、該ｐＡＭ４０１プラスミドはｐＰＬ２ベクターからの多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含有する。図３２Ｂは、ｐＡＭ４０１−ＭＣＳの配列（配列番号：３３）を示し、該ｐＡＭ４０１プラスミドはｐＰＬ２ベクターからの多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含有する。図３２Ｃは、ｐＡＭ４０１−ＭＣＳの配列（配列番号：３３）を示し、該ｐＡＭ４０１プラスミドはｐＰＬ２ベクターからの多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含有する。図３３は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されているヒトメソセリンについてのコード配列（配列番号：３４）を示す。図３４は、ヒトメソセリンのアミノ酸配列（配列番号：３５）を示す。図３５は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されているマウスメソセリンについてのコード配列（配列番号：３６）を示す。図３６は、マウスメソセリンのアミノ酸配列（配列番号：３７）を示す。図３７は、天然ＥｐｈＡ２ＣＯドメイン配列をコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの分泌されたタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。図３８は、コドン最適化ＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメイン配列と融合された、組換えＬｉｓｔｅｒｉａコーディング天然またはコドン最適化ＬＬＯｓｅｃＡ１シグナルペプチドからの分泌されたタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。図３９は、コドン最適化ＥｐｈＡ２ＣＯドメイン配列に融合された天然またはコドン最適化ＬＬＯｓｅｃＡ１シグナルペプチドまたはコドン最適化Ｔａｔシグナルペプチドをコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの分泌されたタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。図４０は、全長天然ＥｐｈＡ２配列をコードするｐＣＤＮＡ４プラスミドＤＮＡでのトランスフェクションから４８時間後における２９３細胞からの溶解物ウェスタンブロット分析を示す。図４１は、ＯＶＡ．ＡＨ１またはＯＶＡ．ＡＨ１−Ａ５をコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａでのＣＴ２６．２４（ｈｕＥｐｈＡ２＋）肺腫瘍を担うＢａｌｂ／Ｃマウスの免疫化が、長期生存を付与することを示すグラフである。図４２は、コドン最適化ＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメイン配列と融合されたコドン最適化ｓｅｃＡ１シグナルペプチドをコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａで免疫化した場合の、ＣＴ２６．２４（ｈｕＥｐｈＡ２＋）肺腫瘍を担うＢａｌｂ／Ｃマウスの増大した生存を示すグラフである。図４３は、ＥｐｈＡ２ＣＯドメインをコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａでのＣＴ２６．２４（ｈｕＥｐｈＡ２＋）肺腫瘍を担うＢａｌｂ／Ｃマウスの免疫化が長期生存を付与することを示すグラフである。図４４は、全長ＥｐｈＡ２をコードするプラスミドＤＮＡではなく、ＥｐｈＡ２ＣＯドメインをコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａでのＣＴ２６．２４（ｈｕＥｐｈＡ２＋）肺腫瘍を担うＢａｌｂ／Ｃマウスの免疫化が長期生存を付与することを示すグラフである。図４５は、ｈＥｐｈＡ２を発現するＬｉｓｔｅｒｉａがＥｐｈＡ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示すグラフである。図４６は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方がｈＥｐｈＡ２を発現するＬｉｓｔｅｒｉａのｈＥｐｈＡ２指向性抗腫瘍効果に寄与することを示すグラフである。図４７は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける分泌につきコドン最適化された、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチドに操作可能に連結されたＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株１０４０３Ｓｈｌｙプロモーターの配列（配列番号：３８）を示す。ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位に対応する６つのさらなるヌクレオチド（５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’）がシグナルペプチド配列のカルボキシ末端に含まれ、いずれかの選択されたコード配列に対する操作可能なイン−フレーム結合を容易とした。ｈｌｙプロモーターの５’末端はユニークなＫｐｎＩ制限酵素認識部位を含有する。図４８は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの全長ヒト腫瘍抗原の効果的な発現および分泌を示す。図４８Ａは、天然コドンを用いる、ヒトメソセリンと融合されたＬＬＯシグナルペプチドよりなる構築体でのメソセリン発現／分泌を示す。図４８は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの全長ヒト腫瘍抗原の効果的な発現および分泌を示す。図４８Ｂは、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されたヒトメソセリンと融合された種々のシグナルペプチドを含む構築体でのメソセリンの発現／分泌を示す。図４８は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの全長ヒト腫瘍抗原の効果的な発現および分泌を示す。図４８Ｃは、ヒトメソセリンコドン最適化ＮＹ−ＥＳＯ−１と融合されたコドン最適化ＬＬＯシグナルペプチドを含む構築体でのＮＹ−ＥＳＯ−１の発現／分泌を示す。図４９は、ｐｈＥｐｈＡ２ＫＤのコード配列（配列番号：３９）を示す。図５０は、ａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間領域を含有するコドン最適化ヒトＥｐｈＡ２のＭｌｕ１サブフラグメント（配列番号：４０）を示す。図５１は、ｈｌｙプロモーター−７０Ｎ−末端ｐ６０アミノ酸の配列（配列番号：４１）を示す。図５２は、プラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサブフラグメント（配列番号：４２）を示す。図５３は、プラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサブフラグメント（配列番号：４３）を示す。図５４は、ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサブフラグメント（配列番号：４４）を示す。図５５は、抗原細菌タンパク質キメラを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの抗原の発現および分泌のウェスタンブロット分析を示す。図５６は、ビシストロニックメッセージからのＥｐｈＡ２の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の発現のウェスタンブロット分析を示す。図５７は、異なる細菌画分：分泌されたタンパク質（図５７Ａ）；細胞壁（図５７Ｂ）；および細胞溶解物（図５７Ｃ）において証明されているように、種々のコドン最適化シグナルペプチドとのＮ−末端融合の関数としてのマウスメソセリンのプラスミドベースの発現および分泌のウェスタンブロット分析を示す。図５７は、異なる細菌画分：分泌されたタンパク質（図５７Ａ）；細胞壁（図５７Ｂ）；および細胞溶解物（図５７Ｃ）において証明されているように、種々のコドン最適化シグナルペプチドとのＮ−末端融合の関数としてのマウスメソセリンのプラスミドベースの発現および分泌のウェスタンブロット分析を示す。図５７は、異なる細菌画分：分泌されたタンパク質（図５７Ａ）；細胞壁（図５７Ｂ）；および細胞溶解物（図５７Ｃ）において証明されているように、種々のコドン最適化シグナルペプチドとのＮ−末端融合の関数としてのマウスメソセリンのプラスミドベースの発現および分泌のウェスタンブロット分析を示す。図５８は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおけるヒトメソセリンの染色体ベースの発現および分泌のウェスタンブロット分析を示す。（メソセリンをコードしない）コントロールＬｉｓｔｅｒｉａおよび示されたシグナル配列から発現されたメソセリンをコードするＬｉｓｔｅｒｉａからの結果と共に、種々の細菌細胞画分におけるメソセリン発現のウェスタンブロット分析が示される。図５９Ａおよび５９Ｂは、ＬｉｓｔｅｒｉａワクチンによるＭＨＣクラスＩ経路への異種抗原（ＡＨ１−Ａ５）の送達を示すグラフである。Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチンはｐ６０−ＡＨ１−Ａ５タンパク質キメラ（ｐ６０に埋められたＡＨ１−Ａ５）（図５９Ａ）またはＬＬＯシグナルペプチドおよびＡＨ１−Ａ５を含む融合タンパク質を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ（図５９Ｂ）よりなるものであった。図６０Ａおよび６０Ｂは、ＭＨＣクラスＩ経路への細菌特異的抗原のＬｉｓｔｅｒｉａワクチン媒介送達を示すグラフであり、ここに、該ワクチンはｐ６０−ＡＨ１−Ａ５タンパク質キメラ（ｐ６０に埋められたＡＨ１−Ａ５）を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ（図６０Ａ）またはＬＬＯシグナルペプチドおよびＡＨ１−Ａ５を含む融合タンパク質を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ（図６０Ｂ）を含むものであり、ここに、細胞ベースのアッセイに加えられたテストペプチドは（未刺激の）テストペプチド（図６０Ａ）ではなく、ＬＬＯ_{９１−９９}（図６０Ａ）であり、テストペプチド（図６０Ｂ）ではなく、またはｐ６０_{２１７−２２５}（図６０Ｂ）であった。図６１は、ワクチン接種した腫瘍担持動物においてヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａの治療効率を示すグラフであり、ここに、腫瘍細胞はヒトメソセリンを発現するように作成されていた。図６２は、ヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａをワクチン接種した腫瘍担持マウスにおける肺腫瘍節レベルの低下を示すグラフであり、ここに、該腫瘍細胞はヒトメソセリンを発現するように作成されていた。図６３は、Ｌｍ−Ｍｅｓｏワクチン接種の抗腫瘍効果がメソセリン特異的であることを示す、ＣＴ．２６親標的細胞、すなわち、ヒトメソセリンを発現されるようには作成されなかった細胞を用いるコントロール実験を示すグラフである。図６４は、コドン最適化ヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａでのワクチン接種が腫瘍容量を低下させることを示すグラフである。図６５は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ−ｈメソセリン株の免疫原性を示すＥＬＩＳＰＯＴ実験の結果を示し、ここに、ｈメソセリンをコードする核酸はＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれていた。

（Ｉ．緒言）
本発明は、Ｌｉｓｔｅｒｉａのような細菌における、異種ポリペプチド（例えば、抗原および／または哺乳動物タンパク質）を含めた、ポリペプチドの発現および／または分泌で有用な組換え核酸分子、発現カセット、および発現ベクターを含めた種々のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、これらのポリヌクレオチドは、細菌におけるポリペプチドの増強された発現および／または分泌で用いることができる。発現カセットのいくつかは、ポリペプチドについておよび／またはシグナルペプチドについてのコドン最適化コード配列を含む。加えて、細菌で用いる発現カセットのいくつかは、他の細菌源から、および／または種々の異なる分泌経路から由来するシグナルペプチド配列を含む。細菌を含有するワクチンのような組成物のような、発現カセットを含む細菌も提供される。宿主細胞において、免疫応答を誘導し、および／または疾患（例えば、癌）のような状態を予防し、または治療するための、該ポリヌクレオチド、細菌および組成物を用いる方法も提供される。
本発明は、部分的には、発現カセットにおけるシグナルペプチド配列のコドン最適化が、シグナルペプチド配列が細菌に対して天然である場合でさえ、（特に、異種ポリペプチドのコドン最適化と組み合わせた）組換え細菌からの（抗原のような）異種ポリペプチドの発現および／または分泌を促進するという発見に基づいている（例えば、以下の実施例１９および２７参照）。加えて、非ｓｅｃＡ１分泌経路からのシグナルペプチド配列および／または非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ細菌源からのシグナルペプチド配列を用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａからの異種ポリペプチドの効果的な発現および／または分泌を行うこともできることが判明した（例えば、以下の実施例１９、２７および３０参照）。また、本発明は、部分的には、異種ポリペプチドのコード配列のコドン最適化がＬｉｓｔｅｒｉａにおける異種ポリペプチドの発現および／または分泌を増強するというさらなる発見に基づいている（例えば、以下の実施例１９参照）。発現カセットの最適化を通じて得られた異種タンパク質の増強された発現および／または分泌は、最適化された発現カセットを含む細菌の増強された免疫原性に導くことも示されている（例えば、以下の実施例２０参照）。加えて、自己溶解素内に埋められた異種抗原を含むタンパク質キメラをコードする発現カセットは、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける異種抗原の効果的な発現および分泌を行うのに有用であることが示されている（例えば、以下の実施例２９参照）。自己溶解素タンパク質キメラは免疫原性であることも示されている（例えば、以下の実施例３１Ａ参照）。加えて、コドン最適化発現カセットおよび／または非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドを含む発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａは、免疫原性であり、腫瘍容量を低下させ、およびマウスモデルにおける生存を増大させることも示されている（例えば、以下の３１ＢないしＥ参照）。

従って、１つの態様において、本発明は、シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌における発現に対してコドン最適化されており、およびポリペプチド（例えば、抗原）をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組み換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは同様に（例えば、第一のポリヌクレオチドと同一の細菌のタイプにおける発現につき）コドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドまたは第一および第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアまたはＥ．ｃｏｌｉにおける発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのようなＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原であり（またはそれを含み）、該抗原は、いくつかの場合において、非細菌抗原であり得る。例えば、該抗原は、いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原であるか、あるいはそのような腫瘍関連抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、該抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡであるか、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡに由来する。例えば、いくつかの実施形態において、該抗原はメソセリン、またはメソセリンの抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの他の実施形態において、該抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１、またはＮＹ−ＥＳＯ−１の抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの実施形態において、該抗原は感染症抗原であり、あるいは感染症抗原に由来する。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドは細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｌまたは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ）のものである。いくつかの実施形態において、コドン最適化された第一のポリヌクレオチドによってコードされるシグナルペプチドは細菌に対して天然である。他の実施形態において、コドン最適化された第一のポリヌクレオチドによってコードされるシグナルペプチドは細菌に対して外来性である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＬＬＯシグナルペプチド、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチドのようなｓｅｃＡ１シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。例えば、該シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドであり得る。加えて、該組換え核酸分子は、所望により、第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、Ｐ６０、またはそのフラグメントをコードする第三のポリヌクレオチド配列を含んでもよく、ここに、第二のポリヌクレオチドは第三のポリヌクレオチド内、または第一および第三のポリヌクレオチドの間に位置する。なおさらなる実施形態において、該シグナルペプチドはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）のようなＴａｔシグナルペプチドである。本発明は、該組換え核酸分子を含み、かつ該組換え核酸分子に（例えば、第一および第二のポリヌクレオチド（およびもし存在すれば第三のポリヌクレオチド）に）作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットも提供する。該細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンのような、該発現カセットを含む発現ベクターおよび組換え細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）もまた提供される。免疫応答を誘導し、および／または疾患のような状態を予防しまたは治療するための、該細菌を用いる方法、または該細菌を含む組成物も提供される。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。

第二の態様において、本発明は（ａ）細菌に対して天然であるシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌における発現に対してコドン最適化去れており、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、それに対してシグナルペプチドが天然である細菌に対して外来性である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、該シグナルペプチドに対して異種であり、該細菌に対して外来性であり、あるいはその双方である。いくつかの実施形態において、それからシグナルペプチドが由来する細菌は細胞内細菌である。いくつかの実施形態において、該細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアおよびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、該細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは細菌における発現に対してコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のポリヌクレオチドのコドン最適化は、（非コドン最適化配列に対して）コードされた融合タンパク質の細菌における発現、および／または該細菌からの分泌を増強する。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原である。いくつかの実施形態において、該抗原は非細菌抗原である。いくつかの実施形態において、該抗原は腫瘍関連抗原であるか、あるいは腫瘍関連抗原に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、該抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択され、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、抗原はメソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは変種であるか、あるいはＮＹ−ＥＳＯ−１、またはその抗原性フラグメントまたは変種である。いくつかの別の実施形態において、抗原は感染症抗原であるか、あるいは感染症抗原に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ１シグナルペプチド（例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＬＬＯシグナルペプチド）である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチド（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチド）である。該組換え核酸分子を含み、かつ該組換え核酸分子の第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットも提供される。該発現カセットを含む発現ベクターも提供される。該組換え核酸分子を含む組換え細菌も提供され、ここに、第一のポリヌクレオチドは組換え細菌における発現に対してコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、組換え細菌は細胞内細菌である。いくつかの実施形態において、組換え細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアおよびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細菌は組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌）である。該組換え細菌を含む免疫原性組成物がさらに提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原である。有効量の該組換え細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原であり（または該抗原を含む）。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは該抗原を含む。

第三の態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌における発現に対してコドン最適化されており、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含み、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、第一および第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットの部分である。換言すれば、いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は組換え核酸分子を含む発現カセットを含み、ここに、該発現カセットは、該組換え核酸分子の第一および第二のポリペプチド双方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、発現カセットはポリシストロニック発現カセットである。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌における発現に対してコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のポリヌクレオチドのコドン最適化は（非コドン最適化配列に対する）コードされた融合タンパク質のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌における発現および／または該細菌からの分泌を増強させる。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である（すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して異種である）。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは抗原（例えば、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌまたは非細菌抗原）を含む。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原であるか、または腫瘍関連抗原に由来する。いくつかの実施形態において、抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択されるか、またはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、該抗原はメソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの実施形態において、該抗原はヒトメソセリンである。いくつかの実施形態において、該抗原はそのシグナルペプチドおよびＧＰＩリンカードメインが欠失されたヒトメソセリンである。いくつかの別の実施形態において、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの別の実施形態において、抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは細菌のものである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である。他の実施形態において、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して天然である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ１シグナルペプチド（例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＬＬＯシグナルペプチド、ＬａｃｔｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、およびＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチド）である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチド（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチド）である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＴａｔシグナルペプチド（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのＰｈｏＤシグナルペプチド）である。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は弱毒化されている。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａは細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖につき弱毒化されている。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌はＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方が欠乏している（例えば、ΔａｃｔａΔｉｎｌＢ二重欠失変異体）。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は機能的ＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方が欠失されている。いくつかの実施形態において、組換え細菌の核酸は核酸標的化化合物（例えば、プソラレン化合物）との反応によって修飾されている。また、本発明は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物、ならびに該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む免疫原性組成物も提供し、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは抗原である。本発明は、該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンも提供する。該組換え細菌を含む組成物の有効量を宿主に投与することを含む抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは抗原である（または抗原を含む）。また、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物の有効量を宿主に投与することを含む宿主において状態（例えば、癌または感染症のような疾患）を予防または治療する方法も提供される。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。

第四の態様において、本発明は、非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、およびポリペプチド（例えば、抗原）をコードする第二のポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、およびここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドおよび／または該第二のポリヌクレオチドは細菌の特別なタイプにおける発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のポリヌクレオチドのコドン最適化は、（非コドン最適化配列に対する）融合タンパク質の細菌における発現、および／または該細菌からの分泌を促進する。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリア、またはＥ．ｃｏｌｉにおける発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのようなＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、コドン最適化された第一のポリヌクレオチドによってコードされるシグナルペプチドは、それに対してそれがコドン最適化されている細菌に対して天然である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドは第二のポリヌクレオチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原であり、これは、いくつかの場合において、非細菌抗原であり得る。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原であり、あるいはそのような腫瘍関連抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡであるか、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡに由来する。例えば、いくつかの実施形態において、抗原はメソセリンであるか、またはメソセリンの抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの他の実施形態において、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１、またはＮＹ−ＥＳＯ−１の抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの実施形態において、抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子の第一のポリヌクレオチドによってコードされるシグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａｌのものである。他の実施形態において、シグナルペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはグラム陽性菌に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは属Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓに属する細菌に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。例えば、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドであり得る。加えて、組換え核酸分子は、所望により、第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、ｐ６０、またはそのフラグメントをコードする第三のポリヌクレオチド配列を含み、ここに、第二のポリヌクレオチドは第三のポリヌクレオチド内、または第一および第三のポリヌクレオチドの間に位置する。なおさらなる実施形態において、シグナルペプチドはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＴａｔシグナルペプチド（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＰｈｏＤシグナルペプチド）のようなＴａｔシグナルペプチドである。本発明は、該組換え核酸分子を含み、かつ該組換え核酸分子の第一および第二のポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターをさらに含む発現カセットも提供する。該発現カセットおよび／または組換え核酸分子を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンのような、発現ベクターおよび細菌も提供される。いくつかの実施形態において、該発現カセットまたは組換え核酸分子を含む組換え細菌は細胞内細菌である。いくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアまたはＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌である。いくつかの実施形態において、該細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのメンバー）である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは細菌に対して外来性（すなわち、細菌に対して異種）である。宿主において、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、該細菌を用いる方法、または該細菌を含む組成物も提供される。いくつかの実施形態において、該状態は癌である。他の実施形態において、該状態は感染症である。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｅｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含み、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチド含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種であるか、または細菌に対して外来性であるか、または双方である。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに属する。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、第一および第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットの一部である。換言すれば、いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は組換え核酸分子を含む発現カセットを含み、ここに、該発現カセットは該組換え核酸分子の第一および第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、該発現カセットはポリシストロニック発現カセットである。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、あるいは第一および第二のポリヌクレオチド双方はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）における発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のポリヌクレオチドのコドン最適化は、（非コドン最適化配列に対して）融合タンパク質の細菌における発現、および／または該細菌からの分泌を増強させる。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリヌクレオチドは相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびシグナルペプチドは相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性（すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して異種）である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原（例えば、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌまたは非細菌抗原）である。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原であるか、または腫瘍関連抗原に由来する。いくつかの実施形態において、抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択されるか、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、抗原はメソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの実施形態において、抗原はヒトメソセリンである。いくつかの実施形態において、抗原はそのシグナルペプチドおよびＧＰＩリンカードメインを欠失したヒトメソセリンである。いくつかの別の実施形態において、抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌである。いくつかの実施形態において、非ｓｅｃＡ１シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドである。他の実施形態において、非ｓｅｃＡ１シグナルペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチド（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチド）である。いくつかの実施形態において、ｓｅｃＡ２シグナルペプチドを含む組換え核酸分子は、さらに、第一および第二のポリペプチドと同一の翻訳リーディングフレームにある、ｓｅｃＡ２自己溶解素（例えば、ｐ６０またはＮ−アセチルムラミダーゼ）、またはそのフラグメント（例えば、触媒的に活性なフラグメント）をコードする第三のポリヌクレオチドを含み、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第三のポリヌクレオチド内、または組換え核酸分子の第一および第三のポリヌクレオチド間に位置する。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは第三のポリヌクレオチド内に位置する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＴａｔシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来Ｔａｔシグナルペプチドである（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのＰｈｏＤシグナルペプチド）。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は弱毒化されている。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａは細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖につき減弱化され得る。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌はＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方が結合している（例えば、ΔａｃｔＡ、ΔｉｎｌＢ二重欠失変異体）である。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は機能的ＡｃｔＡ、インターナリンＢ、ＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方が欠失している。いくつかの実施形態において、組換え細菌の核酸は核酸標的化化合物（例えば、プソアレン化合物）との反応によって修飾されている。本発明は該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物も提供する。本発明は該組換え細菌を含む免疫原性組成物も提供し、ここに、該第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原である。本発明は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むベクターも提供する。有効量の組換え細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原であり（またはそれを含む）。また、有効量の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主において状態（例えば、癌または感染症のような疾患）を予防または治療する方法も提供される。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。

もう１つの態様において、本発明は（癌抗原または非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ細菌抗原のような抗原のごとき）Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドのコドン最適化は（非コドン最適化配列に対する）ポリヌクレオチドのＬｉｓｔｅｒｉａ細菌における発現、および／または該細菌からの分泌を増強させる。いくつかの実施形態において、外来性ポリペプチドは抗原を含む。いくつかの実施形態において、外来性ポリペプチドは抗原である。いくつかの実施形態において、該抗原は非細菌抗原である。例えば、該抗原は、いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原であるか、あるいはそのような腫瘍関連抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡであるか、またはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡに由来する。いくつかの実施形態において、抗原はメソセリン、またはメソセリンの抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの他の実施形態において、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１であるか、またはＮＹ−ＥＳＯ−１の抗原性フラグメントまたは変種である。いくつかの他の実施形態において、抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、組換え核酸分子がシグナルペプチドおよび外来性ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするように、外来性ポリペプチドと同一の翻訳フレームにある、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、（Ｌｉｓｔｅｒｉａに対するものであってもなくてもよい）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。本発明は、さらに、該組換え核酸分子を含み、かつ該組換え核酸分子の第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットを提供する。該組換え核酸分子および／または発現カセットを含むベクター（例えば、発現ベクター）も提供される。本発明は、該組換え核酸分子および／または発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌も提供する。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに属する。該組換えＬｉｓｅｔｒｉａ細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびベクターも提供される。本発明は、さらに、有効量の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここに、該ポリペプチドは抗原であり（または抗原を含む）。加えて、本発明は、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防しまたは治療するための、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を用いる方法を提供する。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、該外来性ポリペプチドは抗原を含む。

もう１つの態様において、本発明は、発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該発現カセットは（癌抗原または非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ細菌抗原のような抗原のごとき）Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここに、該ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されており、および外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに属する。いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドのコドン最適化は（非コドン最適化配列に対して）該ポリペプチドのＬｉｓｔｅｒｉａ細菌における発現、および／または該細菌からのポリペプチドの分泌を増強する。いくつかの実施形態において、外来性ポリペプチドは抗原を含む。いくつかの実施形態において、外来性ポリペプチドは抗原であり、これは、いくつかの例においては、非細菌抗原であってよい。例えば、該抗原は、いくつかの実施形態においては、腫瘍関連抗原であるか、あるいはそのような腫瘍関連抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態においては、該ポリペプチドはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡであるか、またはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡに由来する。いくつかの実施形態において、該抗原はメソセリンであるか、またはメソセレンの抗原フラグメント、抗原性改変体である。いくつかの他の実施形態は、該抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１であるか、またはＮＹ−ＥＳＯ−１の抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの他の実施形態において、該抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、該発現カセットが該シグナルペプチドおよび該外来性ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするように、プロモーターに操作可能に連結したシグナルペプチドをコードし、かつ外来性ポリペプチドと同様の翻訳フレームにあるポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、（Ｌｉｓｔｅｒｉａに対して天然であってもまたは無くてもよい）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。本発明は、さらに、有効量の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導することができる方法を提供する。加えて、本発明は、免疫応答を誘導し、および／または状態（例えば、疾患）を予防または治療するために、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を用いる方法を提供する。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、該外来性ポリペプチドは該抗原を含む。

さらなる態様において、本発明は組換え核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドおよび（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここに、該組換え核酸分子は該非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよび該ペプチドを共に含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、該組換え核酸分子は、さらに、第一および第二のポリヌクレオチド双方に操作可能に連結したプロモーターを含む発現カセット内に位置する。かくして、いくつかの実施形態において、該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は組換え核酸分子を含む発現カセットを含み、ここに、該発現カセットは、さらに、該組換え核酸分子の第一および第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、該発現カセットはポリシストロニック発現カセット（例えば、ビシストロニック発現カセット）である。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチドまたは第一および第二の双方のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）における発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のポリヌクレオチドのコドン最適化は（非コドン最適化配列に対して）該細菌における融合タンパク質の発現、および／または該細菌からの融合タンパク質の分泌を増強させる。いくつかの実施形態において、該第一および第二のポリヌクレオチドは相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリヌクレオチド、および該シグナル配列は相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、外第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性（すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して異種）である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは抗原（例えば、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ抗原）を含む。第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはいくつかの実施形態によって抗原である。いくつかの実施形態において、該抗原は腫瘍関連抗原であるか、または腫瘍関連抗原に由来する。いくつかの実施形態において、該抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択されるか、またはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、該抗原はメソセレン、またはその抗原性フラグメント、または抗原性改変体である。いくつかの実施形態において、該抗原はヒトメソセレンである。いくつかの実施形態において、該抗原はそのシグナルペプチドおよびＧＰＩリンカードメインが欠失されたヒトメソセレンである。いくつかの別の実施形態において、該抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドは細菌のものである。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドは細胞内細菌に由来する。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドはグラム陽性菌に由来する。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドは属Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）に属する細菌からのものである。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドはｓｅｃＡ１シグナルペプチド（例えば、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチド）である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＴａｔシグナルペプチド（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのＰｈｏＤシグナルペプチド）である。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は減弱化されている。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖につき減弱化されている。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌はＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方に関して欠乏している（例えば、ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体）。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は機能的ＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方が欠失している。いくつかの実施形態において、組換え細菌の核酸は核酸標的化化合物（例えば、プソラレン化合物）との反応によって修飾されている。本発明は該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物も提供する。本発明は、さらに、該組換え細菌を含む免疫原性組成物を提供し、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原である。本発明は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンも提供する。有効量の該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドにコードされるポリヌクレオチドは抗原であるか（または抗原を含む）。また、有効量の該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を宿主に投与することを含み、宿主において状態（例えば、癌または感染症のような疾患を予防または治療する方法も提供される）。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。

なおもう１つの態様において、本発明は、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、および第一および第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む（例えば、種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの）組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。該発現カセットは、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、該Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖について弱毒化されている。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、または第一および第二双方のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のポリヌクレオチドのコドン最適化は、（非コドン最適化配列に対して）コードされた融合タンパク質の細菌における発現、および／または該細菌からの分泌を増強させる。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原も含む。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原であり、これは、いくつかの例において、非細菌抗原であってよい。例えば、該抗原は、いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原であるか、またはそのような腫瘍関連抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、該抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡであるか、またはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡに由来する。例えば、いくつかの実施形態において、該抗原はメソセレンであるか、あるいはメソセレンの抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの他の実施形態において、該抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１、またはＮＹ−ＥＳＯ−１の抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの実施形態において、該抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する。好ましい実施形態において、該シグナルペプチドは細菌のものである。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドは属Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓに属する細菌からのものである。例えば、いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのものである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチドのようなｓｅｃＡ１シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。なおさらなる実施形態において、該シグナルペプチドはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）のようなＴａｔシグナルペプチドである。本明細書中に記載された組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンも提供される。加えて、本発明は、免疫応答を誘導する、および／または疾患のような状態を予防しまたは治療するために、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を用いる方法を提供する。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における細菌の使用も提供され、ここに、該第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原も含む。

本発明は、さらに、（ａ）細菌自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種；および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供し、ここに、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同様の翻訳リーディグフレームにある、ここに、該組換え核酸分子は該第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドおよび該自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種を含むタンパク質キメラをコードし、ここに、該タンパク質キメラにおいては、該ポリペプチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種に融合しており、あるいは自己溶解素またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に位置する。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドは細菌自己溶解素をコードする。いくつかの実施形態において、タンパク質キメラは自己溶解素として触媒的に活性である。いくつかの実施形態において、細菌自己溶解素は細胞内細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）からのものである。いくつかの実施形態において、細菌自己溶解素はＬｉｓｔｅｒｉａ自己溶解素である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチド内に位置し、組換え核酸分子は、ポリペプチドが自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に位置するタンパク質キメラをコードする（すわなち、該ポリペプチドは自己溶解素または触媒的に活性なフラグメントまたは変種内に埋められている）。いくつかの別の実施形態において、第二のポリヌクレオチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチドの外部に位置し、および組換え核酸分子は、該ポリペプチドが自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種に融合しているタンパク質キメラをコードする。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは自己溶解素に対して異種である。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドは相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、さらに、（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるシグナルペプチドをコードする第三のポリヌクレオチドを含み、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチド、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種を含むタンパク質キメラをコードする。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは（ｐ６０のような）ｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは天然において自己溶解素と会合するシグナルペプチドである（例えば、シグナルペプチドはｐ６０であって、自己溶解素はｐ６０である）。いくつかの実施形態において、自己溶解素はｓｅｃＡ２依存性自己溶解素である。いくつかの実施形態において、自己溶解素はペプチドグリカンヒドロラーゼ（例えば、Ｎ−アセチルムラミダーゼまたはｐ６０）である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは抗原（例えば、腫瘍関連抗原、腫瘍関連抗原に由来する抗原、感染症抗原、または感染症抗原に由来する抗原）である。いくつかの実施形態において、抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択されるか、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、抗原はメソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの実施形態において、抗原はヒトメソセリンである。いくつかの実施形態において、抗原はそのシグナルペプチドおよびＧＰＩアンカーを欠失したヒトメソセリンである。本発明は、該組換え核酸分子を含み、さらに、該組換え核酸分子の第一および第二のポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターを含む発現カセット、ならびに該発現カセットを含む発現ベクターも提供する。本発明は、さらに、組換え核酸分子を含む組換え細菌を提供する。いくつかの実施形態において、組換え細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のような細胞内細菌である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは組換え細菌に対して外来性である。（ａ）該組換え細菌、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物も提供される。加えて、該組換え細菌を含む免疫原性組成物も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原である。また、該組換え細菌を含むワクチンも提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原である。本発明は、有効量の組換え細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫を誘導する方法も提供し、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原であるか（または抗原を含む）。有効量の該組換え細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む宿主において状態を予防または治療する方法も提供される。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。

なおもう１つの態様において、本発明はポリシストロニック発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該ポリシストロニック発現カセットは少なくとも２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする。例えば、いくつかの実施形態において、該発現カセットは第一の非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、第二の非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、および第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、さらに、第一および第二のポリヌクレオチドの間の遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリシストロニック発現カセットは、２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードするビシストロニック発現カセットである。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は種ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに属する。いくつかの実施形態において、ポリシストロニック発現カセットによってコードされる非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドの少なくとも１つは抗原を含む。いくつかの実施形態において、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドの少なくとも２つは、各々、同一抗原のフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原であるか、または腫瘍関連抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原であるか、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来する。いくつかの実施形態において、抗原はメソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの実施形態において、抗原はヒトメソセリンである。いくつかの実施形態において、抗原はシグナルペプチドおよびＧＰＩアンカーが欠失したヒトメソセリンである。いくつかの実施形態において、抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する。いくつかの実施形態において、ポリシストロニック発現カセットによってコードされる非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドの少なくとも１つはシグナルペプチド（Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドまたは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドいずれか）を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ１シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。他の実施形態において、シグナルペプチドはＴａｔシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、発現カセットはシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここに、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されている。本発明は：（ａ）組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。また、該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む免疫原性組成物も提供される。また、該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンも提供される。有効量の該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法も提供され、ここに、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドの少なくとも１つは抗原を含む。有効量の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む宿主において状態を予防または治療する方法も提供される。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、ポリシストロニック発現カセットによってコードされる非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドの少なくとも１つは抗原を含む。

他の態様において、本発明は、（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、（ｂ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および（ｃ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに対して異種であるポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド、ここに、該第三のポリヌクレオチドは、第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチド、該第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントを含むタンパク質キメラをコードし、およびここに、第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに融合しており、あるいはタンパク質キメラにおいて分泌されたタンパク質、またはそのフラグメント内に位置する。いくつかの実施形態において、分泌されたタンパク質は、天然で分泌されたタンパク質（すなわち、その天然細胞から分泌されたタンパク質）である。いくつかの実施形態において、第三のポリヌクレオチドは組換え核酸分子における第二のポリヌクレオチド内に位置し、第三のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、組換え核酸分子によってコードされたタンパク質キメラにおいて、分泌されたタンパク質、またはそのフラグメント内に位置する。いくつかの実施形態において、第三のポリヌクレオチドは、組換え核酸分子において第二のポリヌクレオチドの外側に位置し、および第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドはタンパク質キメラにおいて分泌されたタンパク質またはそのフラグメントに融合している。該組換え核酸分子を含み、かつ該組換え核酸分子の第一、第二および第三のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットも提供される。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは抗原も含む。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド抗原である。例えば、いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原であるか、または腫瘍関連抗原に由来する（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原であるか、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来する）。いくつかの実施形態において、抗原はメソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。例えば、いくつかの実施形態において、抗原はヒトメソセリンであるか、またはそのシグナルペプチドおよびＧＰＩアンカーが欠失したヒトメソセリンである。別の実施形態において、抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する。発現カセットを含む発現ベクターも提供される。組換え核酸分子を含む組換え細菌も提供される。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）も提供され、いくつかの実施形態において、第三のヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である。また、本発明は、該組換え細菌を含む免疫原性組成物も提供し、ここに、第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原である。また、有効量の該組換え細菌を含む組成物を宿主に投与することを含む抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法も提供され、ここに、第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドは抗原であるか、（または抗原を含む）。宿主において状態を予防しまたは治療するための、該細菌を用いる方法、または外細菌を含む組成物のような、該細菌を含む薬学的組成物またはワクチンも提供される。抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における該細菌の使用も提供され、ここに、第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。

さらなる態様において、本発明は、宿主細菌において異種タンパク質を発現させ、それを分泌する改良された方法を提供する。また、本発明は、細菌における異種タンパク質の発現および分泌を改良する方法も提供する。本発明は、さらに、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、発現ベクターおよび組換え細菌の生産方法を提供する。

本発明は、Ｌｉｓｔｅｒｉａのような細菌において異種ポリヌクレオチドの発現を最適化するのに有用な種々のポリヌクレオチドを提供する。

マーカッシュ群、マーカッシュクレーム、または「またはの用語」によって記載された実施形態は、明示的に、または文脈によって他のことが指令されない限り、各別々の実施形態、別々の実施形態の各々のいずれかの組合せならびに、別々の実施形態の各々の全てよりなる、またはそれを含む発明を含む。

前記した態様および実施形態、ならびに本発明のさらなる実施形態および態様のさらなる記載を以下に掲げる。

（ＩＩ．組換え核酸分子）
本発明は、Ｌｉｓｔｅｒｉａのような細菌における、異種ポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドの発現で有用な種々のポリヌクレオチドを提供する。例えば、異種抗原のようなポリペプチドのコード配列とシグナルペプチド（またはシグナルペプチドを含むポリペプチド）をコードする配列との新規な組合せを含む組換え核酸分子が提供される。コドン最適化されたポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、これらの組換え核酸分子は、それらが、同一核酸分子の部分として相互に組み合わせて天然では見出されないポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド配列）を含む点で異種である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子が単離される。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は発現カセット、発現ベクター、細菌内のプラスミドＤＮＡ、および／または（挿入に続く）細菌のゲノムＤＮＡでさえ配列内に位置する。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、細菌内のポリペプチド（例えば、異種ポリペプチド）の増強された発現または分泌を提供する。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は一本鎖である。他の実施形態において、組換え核酸は二本鎖である。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子は、シグナルペプチド、および該シグナルペプチドに対して異種であるポリペプチドのようなもう１つのポリペプチドを含む融合タンパク質のような融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは細菌シグナルペプチドである。融合タンパク質の引用されたポリペプチド成分は、相互に直接的に融合できるが、必ずしもその必要が無いことが理解される。融合タンパク質のポリペプチド成分は、いくつかの実施形態において、１以上の介入アミノ酸配列によってポリペプチド配列上で分離され得る。いくつかの実施形態において、他のポリペプチドは非細菌、例えば、哺乳動物またはウイルスである。

例えば、１つの態様において、本発明は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌における発現に対してコドン最適化されており；および（ｂ）ポリペプチド（例えば、抗原）をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ペプチドを含む融合タンパク質をコードする。さらなる実施形態において、第二のポリヌクレオチド（抗原のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）もまた細菌において発現につきコドン最適化されている。それにつき第一および／または第二のポリヌクレオチドがコドン最適化された細菌は、該組換え核酸分子を入れることが意図されたタイプの細菌とすべきである。

もう１つの態様において、本発明は（ａ）細菌に対して天然であるシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリペプチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、それに対してシグナルペプチドが天然である細菌に対して異種である（すなわち、該細菌に対して外来性である）。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種であり、該細菌に対して外来性であり、または双方である。いくつかの実施形態において、それからシグナルペプチドが由来する細菌は細胞内細菌である。いくつかの実施形態において細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアおよびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して天然である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに属するＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して天然である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは該細菌において発現につきコドン最適化されている。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌における発現に対してコドン最適化されており、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して天然である。いくつかの他の実施形態において、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である。いくつかの実施形態においてシグナルペプチドは第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して異種である。いくつかの実施形態においてＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓに属する。

また、本発明は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性であるポリペプチド（例えば、癌または非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ感染症抗原）をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供し、ここに、外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌において発現につきコドン最適化されている。

もう１つの態様において、本発明は（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）抗原のようなポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含み、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチドまたはＴａｔシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、非ｓｅｃＡ１シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドは、該組換え核酸分子を入れることが意図されている細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、抗原のようなポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドは、該組換え核酸分子が入れられることが意図される細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、該組換え核酸分子が取り込まれるべき、または取り込まれた細菌に対して外来性である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは該組換え核酸分子が取り込まれるべき、または取り込まれた細菌に対して外来性であり、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドもまたはポリペプチドに対して異種である。

本発明は、さらに、非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ポリペプチド（例えば、異種タンパク質および／または抗原）をコードする第二のポリヌクレオチド、および第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、ＳｅｃＡ２自己溶解素、またはそのフラグメントをコードする第三のポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第三のポリヌクレオチド内、または第一および第三のポリヌクレオチドの間に位置する。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は該シグナルペプチド、該ポリペプチド、および該自己溶解素を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、自己溶解素のフラグメントは自己溶解素として触媒的に活性である。いくつかの実施形態において、自己溶解素は細胞内細菌からのものである。いくつかの実施形態において、自己溶解素はペプチドグリカンヒドラーエである。いくつかの実施形態において、細菌自己溶解素はＬｉｓｔｅｒｉａｌ自己溶解素である。いくつかの実施形態において、自己溶解素はｐ６０である。いくつかの実施形態において、自己溶解素はＮ−アセチルムラミダーゼである。

また、本発明は組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；および（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここに、該組換え核酸分子は該非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよび該ポリペプチドを共に含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、非Ｌｉｓｅｔｅｒｉａｌシグナルペプチドは第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、または第一および第二の双方のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌において発現につきコドン最適化されている。

また、本発明は（ａ）細菌自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドおよび自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種を含むタンパク質キメラをコードし、ここに、タンパク質キメラにおいて、該ポリペプチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種に融合しているか、あるいは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に位置する。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチド内に位置し、該組換え核酸分子は、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが自己溶解素またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に位置するタンパク質キメラをコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは第二のポリヌクレオチドの外部に位置し、該組換え核酸分子は、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたはその触媒的に活性な変種に融合しているタンパク質キメラをコードする。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドは自己溶解素をコードする。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、さらに、（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるシグナルペプチドをコードする第三のポリヌクレオチドを含み、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチド、該第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドおよび該自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメント、触媒的に活性な変種を含むタンパク質キメラをコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは自己溶解素に対して異種である。いくつかの実施形態において、自己溶解素のフラグメントは長さが少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、または少なくとも約１００のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、自己溶解素は細胞内細菌からのものである。いくつかの実施形態において、細菌自己溶解素はＬｉｓｔｅｒｉａｌ自己溶解素である。自己溶解素の触媒的に活性な変種は、１以上の置換、欠失、付加および／または挿入において元の自己溶解素とは異なる。いくつかの実施形態において、自己溶解素はペプチドグリカンヒドロラーゼである。いくつかの実施形態において、自己溶解素はｐ６０である。いくつかの実施形態において、自己溶解素はＮ−アセチルムラミダーゼである。

さらなる自己溶解素は当業者に知られた技術であるチモグラフィーによって同定し特徴付けることができる（例えば、Ｌｅｎｚｅｔａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：１２４３２−１２４３７参照）。チモグラフィーを用いて、自己溶解素の与えられたフラグメントおよび／または変種が自己溶解素として触媒的に活性であるか否かを決定することもできる。該技術を用いて、特定のタンパク質キメラが自己溶解素として活性であるか否かを評価することもできる。

いくつかの実施形態において、自己溶解素の触媒的に活性なフラグメントおよび／または変種は天然自己溶解素の少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の自己溶解素として触媒的に活性である。

いくつかの実施形態において、タンパク質キメラは自己溶解素として触媒的に活性である。いくつかの実施形態において、タンパク質キメラは天然自己溶解素の少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の自己溶解素として触媒的に活性である。

異種タンパク質発現のためのもう１つのオプションは、その中へ異種タンパク質が機能的に「イン−フレーム」にて挿入されるタンパク質「スカフォールド」を利用することである。この組成物においては、全遺伝子、または例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープに対応する遺伝子の成分はスカフォールドタンパク質内に、およびそれを通って挿入される。スカフォールドタンパク質は（ＬＬＯまたはｐ６０のような、Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質のごとき）高度に発現された細菌タンパク質であり得るが、もう１つの実施形態においては、その高い発現、安定性、分泌および／または免疫原性（の欠如）につき選択される異種タンパク質であり得る。スカフォールドタンパク質の代表的な例はニワトリオボアルブミン、あるいはβ−グロビンまたはアルブミンのような他のヒトタンパク質である。

また、本発明は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、（ｂ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および（ｃ）該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに対して異種であるポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド、ここに、該第三のポリヌクレオチドは第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を提供し、ここに、該組換え核酸分子は該シグナルペプチド、該第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および該分泌されたタンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質キメラをコードし、およびここに、該ポリペプチドは該分泌されたタンパク質またはそのフラグメントに融合しているか、またはタンパク質キメラにおいて、分泌されたタンパク質、またはそのフラグメント内に位置する。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは分泌されたタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、分泌されたタンパク質はその天然細胞から分泌されタンパク質である。いくつかの実施形態において、第三のポリヌクレオチドは組換え核酸分子において第二のポリヌクレオチド内に位置し、第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、組換え核酸分子によってコードされたタンパク質キメラにおいて、分泌されたタンパク質、またはそのフラグメント内に位置する。いくつかの実施形態において、第三のポリヌクレオチドは、核酸分子において第二のポリヌクレオチドの外側に位置し、第三のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、タンパク質キメラにおいて、分泌されたタンパク質またはそのフラグメントに融合している。いくつかの実施形態において、分泌されたタンパク質はオボアルブミンである。いくつかの実施形態において、オボアルブミンの切形形態を用いる。いくつかの実施形態において、分泌されたタンパク質はｐ６０である。いくつかの実施形態において、分泌されたタンパク質はＮ−アセチルムラミダーゼである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは通常は分泌されたタンパク質と会合するシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは分泌されたタンパク質に対して異種である。いくつかの実施形態において、分泌されたタンパク質のフラグメントは長さが少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、または少なくとも約１００アミノ酸である。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターは、細菌内で高度に発現されるタンパク質の部分または全コード配列内に埋められた、細菌に対して外来性であるポリペプチドに対するコード配列を含む。いくつかの実施形態において、高度に発現された配列は、該配列をそこで発現させるべき細菌に対して天然である。他の実施形態において、高度に発現された配列は、その中でそれを発現させるべき細菌に対して天然ではないが、さもなければ、十分な発現を提供する。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を提供し、ここに、該核酸分子は少なくとも２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、非ＬｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌において発現につきコドン最適化されている。

前記したものを含めた組換え核酸分子を調製する方法は当業者に良く知られている、例えば、組換え核酸分子は、相互に重複する長いオリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザーで合成し、次いで、延長反応および／またはＰＣＲを行って、所望の量の二本鎖ＤＮＡを生じさせることによって調製することができる。二本鎖ＤＮＡを制限酵素で切断し、所望の発現またはクローニングベクターに挿入することができる。配列決定を行って、正しい配列が得られたことを確認することができる。また、非限定的例ではあるが、別法として、組換え核酸分子の１以上の部分を、外部分を含有するプラスミドから得ることができる。プラスミドの関連部分のＰＣＲおよび／またはプラスミドの関連部分の制限酵素切除を行い、続いて、連結および／またはＰＣＲを行って、関連ポリヌクレオチドを合わせて、所望の組換え核酸分子を生じさせることができる。そのような技術は当該分野で標準的である。標準クローニング技術を用いて、組換え核酸配列をプラスミドに挿入し、細菌のような宿主細胞内で組換え核酸を複製することもできる。次いで、組換え核酸を宿主細胞から単離することができる。

また、本発明は、本明細書中に記載された組換え核酸分子のいずれかを用いて、組換え細菌（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌）を生産する方法も提供する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子を用いて、組換え細菌を作成する方法は、組換え核酸分子を細菌に導入することを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子を細菌のゲノムに組み込む。いくつかの他の実施形態において、組換え核酸分子は細菌内に取り込まれるプラスミド上にある。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子の細菌への取り込みはコンジュゲーションによって起こる。細菌への導入は、当該分野で知られた標準技術のいずれかによって行うことができる。例えば、組換え核酸分子の細菌への取り込みはコンジュゲーション、形質導入（トランスフェクション）または形質転換によって起こり得る。

（ＩＩＩ．シグナルペプチド）
いくつかの実施形態において、本発明の組換え核酸分子、発現カセットおよび／またはベクターは、シグナルペプチドを含み、細菌のような宿主細胞における発現、およびそれからの分泌に適した融合タンパク質またはタンパク質キメラをコードする。かくして、いくつかの実施形態において、本発明の組換え核酸分子、発現カセットおよび／またはベクターはシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

用語「シグナルペプチド」および「シグナル配列」はここでは相互交換的に用いられる。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、当該ポリペプチドが細胞から分泌されるように、シグナルペプチドに融合したポリペプチドの細胞（例えば、細菌細胞）の細胞膜を横切っての輸送を容易とするのを助ける。従って、いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは「分泌性シグナルペプチド」または「分泌性配列」である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは分泌すべきポリペプチドのＮ−末端に位置する。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子または発現カセットにおけるシグナルペプチドをコードする配列は、コードされたシグナルペプチドが、それに対してそれが所望の宿主細胞（例えば、細菌）から融合するポリペプチドの分泌を行うように、組換え核酸分子または発現カセット内に位置する。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子または発現カセットにおいて、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、分泌すべきポリペプチド（例えば、抗原を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドの５’末端において（直接的に、または介入ポリヌクレオチドによって分離されて）イン・フレームにて位置する。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターによってコードされる融合タンパク質および／またはタンパク質キメラの部分であるシグナルペプチドは、融合タンパク質および／またはタンパク質キメラにおいて少なくとも１つの他のポリペプチド配列に対して異種である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターによってコードされるシグナルペプチドは、その中へ組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターが取り込まれるべき、または取り込まれた細菌に対して異種（すなわち、外来性）である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターが取り込まれるべき細菌に対して天然である。

いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは細菌（例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのようなＬｉｓｔｅｒｉａ）において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、特定の細菌につきコドン最適化されたポリヌクレオチドは細菌に対して外来性である。他の実施形態において、特定の細菌につきコドン最適化されたポリヌクレオチドはその細菌に対して天然である。

非常に種々のシグナルペプチドが当該分野で知られている。加えて、シグナルペプチド配列を予測するのに用いることができる「ＳｉｇｎａｌＰ」アルゴリズムのような種々のアルゴリズムおよびソフトウエアプログラムが当該分野で入手可能である。例えば、Ａｎｔｅｌｍａｎｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．，１１：１４８４−５０２（２００１）；Ｍｅｎｎｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６：７４１−２（２０００）；Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，１０：１−６（１９９７）；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．，１３：２８１９−２４（２００４）；Ｂｅｎｄｔｓｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０：７８３−９５（２００４）（ＳｉｇｎａｌＰ３．０に関する；Ｈｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３２：Ｗ３７５−９（２００４）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ４：１５７１−８０（２００４）；Ｃｈｏｕ，Ｃｕｒｒ．ＰｒｏｔｅｉｎＰｅｐｔ．Ｓｃｉ．，３：６１５−２２（２００２）；Ｓｈａｈｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９：１９８５−９６（２００３）；およびＹｕａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１２：１２７８−８３（２００３）参照。

いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは原核生物のものである。いくつかの別の実施形態において、シグナルペプチドは真核生物のものである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｏｌｉにおけるタンパク質の発現のための真核生物シグナルペプチドの使用は、例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２０：２５２−２６４（２０００）に記載されている。

いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは細菌シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはグラム／陽性菌に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは細胞内細菌に由来する。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターで用いるシグナルペプチド（例えば、非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチド）はＬｉｓｔｅｒｉａに由来する。いくつかの実施形態において、このシグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａに由来しないが、その代わり、属Ｌｉｓｔｅｒｉａに属する細菌以外に由来する。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓ細菌に由来する。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓｅｕｂｔｉｌｉｓに由来する。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドは属Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに属する細菌に由来する。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌に由来する。いくつかの実施形態において細菌シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌に由来する。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌からのシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓに由来するシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからのシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において細菌シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｕｓからのシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕからのシグナルペプチドである。

本明細書中に記載されたポリヌクレオチドのいくつかの実施形態において、細菌のような生物に由来するシグナルペプチドは、該生物から得られた天然に生じるシグナルペプチド配列と同一である。他の実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターによってコードされたシグナルペプチド配列は天然に生じるシグナルペプチド配列、すなわち、天然に生じるシグナルペプチド配列のフラグメントおよび／または変種に由来し、ここに、該フラグメントまたは変種はシグナルペプチドとして依然として機能する。変種は、１以上の置換、欠失、付加および／または挿入だけ元の配列とは異なるポリペプチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるシグナルペプチドは１以上の保存的変異を含む。可能な保存的アミノ酸変化は当業者に良く知られている。例えば、保存的アミノ酸変化に関するさらなる情報については、詳細な記載のセクションＩＶを参照されたし。

もう１つのシグナルペプチドに由来するシグナルペプチド（すなわち、他のシグナルペプチドのフラグメントおよび／または変種）は、好ましくは、元のシグナルペプチドと実質的に同等である。例えば、シグナルペプチドとして機能するもう１つのシグナルペプチドに由来するシグナルペプチドの能力は、元のシグナルペプチド配列に対して成された変形（欠失、変異等）によって実質的に影響されるべきではない。いくつかの実施形態において、誘導されたシグナルペプチドは天然シグナルペプチド配列の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％シグナルペプチドとして機能することができる。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは元のシグナルペプチドに対してアミノ酸配列において少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一性を有する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドの配列においてなされた唯一の改変は保存的アミノ酸置換である。シグナルペプチドのフラグメントは、好ましくは、元のシグナルペプチドの少なくとも約８０％または少なくとも約９０％の長さである。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされたシグナルペプチドはｓｅｃＡ１シグナルペプチド、ｓｅｃＡ２シグナルペプチド、またはＴｗｉｎ−アルギニントランスローケーション（Ｔａｔ）シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ１シグナルペプチドシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは非ｓｅｃＡ１シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｔｗｉｎ−アルギニントランスローケーション（Ｔａｔ）シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、これらのｓｅｃＡ１、ｓｅｃＡ２、またはＴａｔシグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａに由来する。いくつかの実施形態において、これらのｓｅｃＡ１、ｓｅｃＡ２、またはＴａｔシグナルペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌである。例えば、いくつかの実施形態において、ｓｅｃＡ１、ｓｅｃＡ２、およびＴａｔシグナルペプチドは以下の属：Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのうちの１つに属する細菌に由来する。

細菌はｓｅｃＡ１、ｓｅｃＡ２、およびＴｗｉｎ−Ａｒｇトランスローケーション（Ｔａｔ）を含めたタンパク質分泌についての多様な経路を利用する。いずれの経路が利用されるかは、プレ−タンパク質のＮ−末端に位置したシグナル配列のタイプによって大いに決定される。分泌されたタンパク質の大部分はＳｅｃ経路を利用し、そこでは、タンパク質は折り畳まれていない立体配座の細菌膜−包埋タンパク質性Ｓｅｃポアを通って移動する。対照的に、Ｔａｔ経路を利用するタンパク質は折り畳まれた立体配座で分泌される。これらのタンパク質分泌経路のいずれかに対応するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、所望の異種タンパク質コード配列に対して遺伝子的にイン・フレームにて融合することができる。シグナルペプチドは、最適には、真正な所望のタンパク質の細胞外環境への放出のためのそれらのカルボキシル末端におけるシグナルペプチダーゼ切断を含む（ＳｈａｒｋｏｖａｎｄＣａｉ．２００２Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：５７９６−５８０３；Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，１９９７ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１０：１−６；およびｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）。

本発明のポリヌクレオチドで用いるシグナルペプチドは多様な分泌経路からのみならず、多様な細菌属から由来することができる。シグナルペプチドは、一般には、荷電Ｎ−末端（Ｎ−ドメイン）、疎水性コア領域（Ｈ−ドメイン）およびより極性のＣ−末端領域（Ｃ−ドメイン）を有する共通の構造的組織化を有するが、それらは配列保存を示さない。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドのＣ−ドメインは、切断部位に対して位置−１および−３においてコンセンサス配列Ａ−Ｘ−Ａを有するタイプＩシグナルペプチダーゼ（ＳＰａｓｅＩ）を運ぶ。ｓｅｃ経路を介して分泌されたタンパク質は平均２８残基のシグナルペプチドを有する。ｓｅｃＡ２タンパク質分泌経路は、最初、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで発見され；ｓｅｃＡ２パラログにおける変異体は寒天培地上での大まかなコロニー表現型、およびマウスにおける減弱化ビルデンス表現型によって特徴付けられる（ＬｅｎｚａｎｄＰｏｒｔｎｏｙ，２００２Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１０４３−１０５６；およびＬｅｎｚｅｔａｌ２００３ＰＮＡＳ１００：１２４３２−１２４３７）。Ｔａｔ経路によって分泌されたタンパク質に関連するシグナルペプチドはＳｅｃシグナルペプチドと同様な三部分組織化を有するが、Ｎ−ドメイン／Ｈ−ドメイン境界に位置したＲＲ−モチーフ（Ｒ−Ｒ−Ｘ−＃−＃、ここに＃は疎水性残基である）を有することによって特徴付けられる。細菌Ｔａｔシグナルペプチドはｓｅｃシグナルペプチドよりも長い平均して１４アミノ酸である。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓセクレトームは、その内１４がＳＰａｓｅＩ切断部位を含むＴａｔ分泌経路を利用する６９と多くの推定タンパク質を含有することができる（Ｊｏｎｇｂｌｏｅｄｅｔａｌ．２００２Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４４０６８−４４０７８；Ｔｈａｌｓｍａｅｔａｌ．，２０００Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６４：５１５−５４７）。

以下の表１に示されるのは、コードされたタンパク質の細菌からの分泌をもたらす、異種ポリペプチドのような選択された他のポリペプチドとの（タンパク質キメラ組成物を含めた）融合組成部で用いることができるシグナルペプチドの非限定的例である。

従って、いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードする配列はｓｅｃＡ１シグナルペプチドをコードする。ｓｅｃＡ１シグナルペプチドの例はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、ＬＬＯシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子または発現カセットは、さらに、ＬＬＯＰＥＳＴ配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本発明で用いるのに適したｓｅｃＡ１シグナルペプチドの他の例はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓにおけるＵｓｐ４５遺伝子からのシグナルペプチド（前記表１、および後記実施例１２参照）およびＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｅｒａｃｉｓからのＰａｇ（保護抗原）遺伝子を含む。かくして、いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチドである。いくつかの他の実施形態においてシグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチド以外のｓｅｃＡ１シグナルペプチドである。ｓｅｃＡ１シグナルペプチドのもう１つの例はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓからのＳｐｓＢシグナルペプチドである（Ｓｈａｒｋｏｖｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７：５７９６−５８０３（２００２））。

いくつかの別の実施形態において、異種コード配列は、ｓｅｃＡ２経路タンパク質分泌複合体によって認識されるシグナルペプチドと遺伝子的に融合される。補助的ＳｅｃＡパラログ（ＳｅｃＡ２）は、ヒトの酷いまたは致死的な感染を引き起こす９つのグラム−陽性菌で同定されている。ＳｅｃＡ２はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの輸出されたプロテオーム（セクレトーム）のサブセットの分泌で必要である（Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：４５３−６４（２００３）；Ｂｅｎｓｉｎｇｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４４：１０８１−９４（２００２）；Ｌｅｎｚｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：１０４３−１０５６（２００２）；およびＢｒａｕｎｓｔｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８３：６９７９−６９９０（２００１））。該ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＳｅｃＡ２は細菌平滑−粗い変形、およびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｓｅｃＡ２低下ビルレンスにおける変異へのその関連を通じて同定された。

例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質ｐ６０はｓｅｃＡ２経路によって分泌されたペプチドグリカン自己溶解素である。例として、ｐ６０からのｓｅｃＡ２シグナルペプチドおよびシグナルペプチダーゼ切断部位は、所望のタンパク質（例えば、抗原）−コーディング遺伝子のアミノ末端に遺伝子的に連結させることができる。１つの実施形態において、ｓｅｃＡ２シグナルペプチドおよびシグナルペプチダーゼ−抗原融合よりなるプレ−タンパク質は細菌内の発現カセットから翻訳され、グラム−陽性細胞壁を通じて輸送され、ここに、真正異種タンパク質は細胞外媒体に放出される。

別法として、異種タンパク質がキメラｐ６０−異種タンパク質の形態で分泌されるように、異種配列はｐ６０内に「イン−フレーム」にて取り込むことができる。異種タンパク質コード配列のｐ６０へのイン−フレームでの挿入は、例えば、シグナルペプチダーゼ切断部位および成熟ｐ６０タンパク質の間の接合にて起こり得る。この実施形態においては、キメラタンパク質は適切なｓｅｃＡ２分泌シグナル、およびその自己溶解素活性も保有し、これは、異種タンパク質がｐ６０の非代謝パッセンジャーとして分泌されることを意味する。異種抗原のｐ６０へのイン・フレーム取り込みは、ｐ６０タンパク質の分泌および自己溶解素の活性を共に保有するｐ６０内のいずれかの地点で作成することができる。所望の抗原または他の異種ポリペプチドコード配列の挿入に適した部分的発現カセットの例は以下の実施例１３に記載される。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子によってコードされた融合タンパク質は、（抗原のような所望の異種タンパク質に加えて）特定の望ましい特性を有する細菌タンパク質を含むキメラである。いくつかの実施形態において、該キメラはヒドロラーゼを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子はエンドペプチダーゼｐ６０、細菌細胞壁を分解するペプチドグリキアンヒドラーゼを含むｐ６０キメラをコードする。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子によってコードされた融合タンパク質は、その双方が、細胞壁を分解するｓｅｃＡ２依存性分泌タンパク質である、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓヒドロラーゼ、例えば、ｐ６０（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ４６４１１０参照）またはＮ−アセチルムラミダーゼ（ＮａｍＡ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ４６６２１３）を含む。そのような特定のタンパク質キメラ組成物は、細菌タンパク質の分泌が必要な分子シャペロンのみならずその分泌を必要とすることができる細菌タンパク質の活性を利用する。異種タンパク質コード配列の、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓヒドロラーゼでの正確な置き換えを含む特定のタンパク質キメラの結果、異種タンパク質の効果的な発現および分泌がもたらされる（例えば、特定の例、以下の実施例２９参照）。従って、いくつかの実施形態において、融合タンパク質の一部としての組換え核酸分子によってコードされたシグナルペプチドはｐ６０シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、融合タンパク質の一部としての組換え核酸分子によってコードされたシグナルペプチドはＮａｍＡシグナルペプチドである。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、ｐ６０シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドおよび他のポリペプチド（例えば、抗原）をコードする第二のポリヌクレオチド双方と同一の翻訳リーディンググレームである、ｐ６０タンパク質、またはそのフラグメントをコードする第三のポリヌクレオチド配列を含む。従って、組換え核酸分子は、シグナルペプチド、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（例えば、抗原）およびｐ６０タンパク質、またはそのフラグメントを含む融合タンパク質をコードする。そのような実施形態において、第二のポリヌクレオチドは、好ましくは、第三のポリヌクレオチド内、または第一および第三のポリヌクレオチドの間いずれかに位置する。

いくつかの実施形態において、ｓｅｃＡ２シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａに由来するｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。例えば、いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドまたはＮ−アセチルムラミダーゼ（ＮａｍＡ）シグナルペプチドのようなｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。加えて、他のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓタンパク質はｓｅｃＡ２の不存在下で分泌されないものとして同定されており（Ｌｅｎｚｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４５：１０４３−１０５６（２００２））、これらのタンパク質からのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドはいくつかの実施形態において用いることができる。加えて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ以外の細菌からのｓｅｃＡ２シグナルペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａまたは他の細菌からの異種タンパク質の発現および分泌で利用することができる。例えば、例示的であるが非限定的には、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓからのｓｅｃＡ２シグナルペプチドは組換え核酸分子および／または発現カセットで用いることができる。他の実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのｓｅｃＡ２シグナルペプチドを用いる。表１参照。他の細菌におけるＳｅｃＡ２経路を介して分泌されたタンパク質も同定されている（例えば、Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８：４５３−６４（２００３）およびＢｅｎｓｉｎｇｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４４：１０８１−９４（２００２）参照）。

ｓｅｃＡ２経路を介して分泌されたさらなるタンパク質を同定することができる。ＳｅｃＡ２ホモログは多数の細菌種で同定されている（例えば、Ｌｅｎｚｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４５：１０４３−１０５６（２００２）およびＢｒａｕｎｓｔｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８３：６９７９−６９９０（２００１）。さらなるｓｅｃＡ２ホモログは、当業者に知られた技術を用いてさらなる配列比較によって同定することができる。一旦ホモログが同定されたならば、ホモログは細菌生物から欠失させて、ΔｓｅｃＡ２変異体を得ることができる。野生型および変異体細菌培養の上清タンパク質は、当該分野で知られたプロテオミックス技術のいずれかによってＴＣＡ−沈殿させ、分析して、いずれのタンパク質がΔｓｅｃＡ２変異体ではなく野生型細菌によって分泌されるかを決定することができる。例えば、分泌されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を介して分析することができる。得られたバンドを比較して、分泌がＳｅｃＡ２の不存在下で起こらなかったタンパク質を同定することができる（例えば、Ｌｅｎｚｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４５：１０４３−１０５６（２００２）参照）。次いで、これらのタンパク質のＮ−末端配列を（例えば、シグナルペプチド切断部位を予測するためのアルゴリズムにて）、分析して、そのタンパク質によって用いられるｓｅｃＡ２シグナルペプチド配列を決定することができる。また、自動エドマン分解によるＮ−末端配列決定を行って、シグナルペプチドの配列を同定することもできる。

別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｔａｔ経路タンパク質分泌複合体によって認識されるシグナルペプチドと遺伝的に融合させる。Ｔａｔ分泌経路は、細菌内で折り畳まれるタンパク質の分泌についての、Ｌｉｓｔｅｒｉａｓｐｐ．を含めた細菌によって利用される。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａタンパク質ＹｗｂＮはそのアミノ末端において推定Ｔａｔモチーフを有し、かくして、分泌のためのＴａｔ経路を用いる（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ４６９７３１［ｇｉ│１６７９９４６３│ｒｅｆ│ＮＰ４６９７３１．１│Ｂ．ｓｃｂｔｉｌｉｓＹｗｂＮタンパク質（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ）と同様な保存された仮定タンパク質］、ここに引用して援用する）。Ｔａｔシグナルペプチドを含有するもう１つのタンパク質はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ（ｅ）からのＹｗｂＮタンパク質である（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ４６３８９７［ｇｉ│１６８０２４１２│ｒｅｆ│ＮＰ４６３８９７．１│Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＹｗｂＮタンパク質（ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＥＧＤ（ｅ））と同様な保存された仮定タンパク質］）。その例として、ＹｗｂＮからのＹｗｂＮシグナルペプチドおよびシグナルペプチダーゼ切断は、所望のタンパク質（例えば、抗原）−コーディング遺伝子のアミノ末端に遺伝子的に連結させることができる。この組成において、Ｔａｔシグナルペプチドおよびシグナルペプチダーゼ−抗原融合よりなるプレ−タンパク質は細菌内の発現カセットから翻訳され、グラム−陽性細胞壁を通って輸送され、ここに、真正異種タンパク質は細胞外媒体に放出される。Ｔａｔ経路を介するＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａから分泌されると予測されるもう１つのタンパク質は３−オキソキアシル−アシルキャリアータンパク質シンターゼである（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ４７１６３６［３（オキソアシル（アシルキャリアータンパク質シンターゼ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ）と同様なｇｉ│１６８０１３６８│ｒｅｆ│ＮＰ４７１６３６．１］）。Ｔａｔ分泌経路を介してＬｉｓｔｅｒｉａから分泌されると予測されるこれらのタンパク質のいずれかからのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドは本明細書中に記載されたポリヌクレオチド、発現カセットおよび／または発現ベクターで用いることができる。

他の細菌からのＴａｔシグナル配列もまたシグナルペプチドとして用いることもでき、限定されるものではないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｐｈｏＤを含む。ｐｈｏＤのようなＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓからのＴａｔシグナルペプチドの例はＪｏｎｇｂｌｏｅｄｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７：４４０６８−４４０７８（２００２）；Ｊｏｎｇｂｌｏｅｄｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５：４１３５０−４１３５７（２０００），Ｐｏｐｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７：３２６８−３２７３（２００２）；ｖａｎＤｉｊｌｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９８：２４３−２５４（２００２）；およびＴｊａｌｓｍａｅｔａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，６４：５１５−５４７（２０００）に記載されており、その全てをここに引用してその全体を援用する。Ｔａｔ経路によって分泌されると予測されていたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて同定された他のタンパク質は以下のＧｅｎｂａｎｋ／Ｅｍｂｌ受託番号を有する配列を含む：その配列が全てここに引用して援用されるＣＡＢ１５０１７［２つの（コンポーネントセンサーヒスチジンキナーゼ（ＹｔｓＡ）（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）と同様なｇｉ│２６３５５２３│ｅｍｂ│ＣＡＢ１５０１７．１│］；ＣＡＢ１２０５６［ｇｉ│２６３２５４８│ｅｍｂ│ＣＡＢ１２０５６．１│ホスホジエステラーゼ／アルカリ性ホスファターゼＤ］（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）］；ＣＡＢ１２０８１［仮定タンパク質（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）と同様なｇｉ│２６３２５７３│ｅｍｂ│ＣＡＢ１２０８１．１│］；ＣＡＢ１３２７８［仮定タンパク質（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）と同様なｇｉ│２６３３７７６│ｅｍｂ│ＣＡＢ１３２７８．１│］；ＣＡＢ１４２７２［ｇｉ│２６３４６７４│ｅｍｂ│ＣＡＢ１４１７２．１│メナキノール：チロクロームｃオキシドレダクターゼ（鉄（硫黄サブユニット）（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）］；ＣＡＢ１５０８９［ｇｉ│２６３５５９５│ｅｍｂ│ＣＡＢ１５０８９．１│ｙｕｂＦ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）］；およびＣＡＢ１５８５２［ｇｉ│２６３６３６１│ｅｍｂ│ＣＡＢ１５８５２．１│別の遺伝子名称：ｉｐａ（仮定タンパク質（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）と同様な２９ｄ］。かくして、いくつかの実施形態において、組換え核酸分子および／または発現カセットにおけるポリヌクレオチドによってコードされたシグナルペプチドはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するＴａｔシグナルペプチドである。ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのＴａｔシグナルペプチドについての情報はＯｃｈｓｎｅｒｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，９９：８３１２−８３１７（２００２）に提供される。また、広く種々の他の細菌からのＴａｔシグナルペプチドは、共に、ここに引用してその全体が援用される、Ｄｉｌｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８５：１４７８−１４８３（２００３）およびＢｅｒｋｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３５：２６０−２７４（２０００）に記載されている。

さらなるＴａｔシグナルペプチドはそれらの「ｔｗｉｎ−アルギニン」コンセンサスモチーフによってＳｅｃ−タイプのシグナルペプチドから同定し、識別することができる。前記したように、Ｔａｔ経路によって分泌されるタンパク質に関連されるシグナルペプチドはＳｅｃシグナルペプチドと同様な三部分組織化を有するが、Ｎ−ドメイン／Ｈ−ドメイン境界に位置したＲＲ−モチーフ（Ｒ−Ｒ−Ｘ−＃−＃、ここに＃は疎水性残基である）を有することによって特徴付けられる。Ｔａｔシグナルペプチドは、一般には、Ｓｅｃ−タイプのシグナルペプチドよりもやはり長くかつ疎水性が低い。例えば、Ｂｅｒｋｓｅｔａｌ．，Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７：１８７−２５４（２００３）およびＢｅｒｋｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｏｉｌ．３５：２６０−７４（２０００）参照。

加えて、ＳｅｃＡ２経路によって分泌された新しいタンパク質およびそれらの対応するＳｅｃＡ２シグナルペプチドを同定するための前記した同様な技術を用いて、Ｔａｔ経路およびそれらのシグナルペプチドを介して分泌された新しいたんぱく質を同定することもできる。文献Ｊｏｎｇｂｌｏｅｄｅｔａｌ．，Ｊ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ．，２７７：４４０６８−４４０７８（２００２）は、ｔｗｉｎ−アルギニントランスローケーション経路を介して分泌されたタンパク質として細菌のタイプによって発現されたタンパク質を同定するのに用いることができる技術の例を提供する。

（ＩＶ．ポリペプチド）
本明細書中で記載された組換え核酸分子、ならびに本明細書中で記載された発現カセットまたは発現ベクターを用いていずれの所望のポリペプチドもコードすることができる。特に、組換え核酸分子、発現カセット、および発現ベクターは細菌において異種ポリペプチドを発現させるのに有用である。

（用いる組換え核酸分子、発現カセットまたは発現ベクターに依存して）いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはシグナルペプチドとの融合タンパク質の一部としてコードされる。他の実施形態において、コードされたポリペプチドは組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターによって区別されるポリペプチドとしてコードされる。さらに他の実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットまたは発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、シグナルペプチドを含まない融合タンパク質の一部としてコードされる。なお他の実施形態において、本発明の組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ポリペプチドがもう１つのポリペプチド配列内に埋もれた（ここではタンパク質キメラともいわれる）融合タンパク質の一部としてコードされる。

かくして、本発明の組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされる本明細書中にて（以下および他の箇所）リストされたポリペプチドの各々は、用いる特定の組換え核酸分子、発現カセットまたは発現ベクターに応じて、組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターによって（シグナルペプチドに、および／または他のポリペプチドに、またはその中に融合した）融合タンパク質として、または区別されるポリペプチドとして発現させることができる。例えば、いくつかの実施形態において、抗原ＣＥＡをコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子はシグナルペプチドとの融合タンパク質としてＣＥＡをコードするであろう。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターによってコードされる融合タンパク質の一部であり、融合タンパク質のシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、それに対してそれが異種であるもう１つのポリペプチド配列（例えば、分泌されたタンパク質、または自己溶解素、またはそのフラグメントまたは変種）内に位置する。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｌまたは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ）である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは細菌ではない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは哺乳動物ポリペプチドである。例えば、ポリペプチドはヒトで見出されたポリペプチド配列に対応することができる（すなわち、ヒトポリペプチド）。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａｌである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターが取り込まれるべき、または取り込まれた細菌に対して天然ではない（すなわち、外来性）である。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは細菌において発現につき十分にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、コドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは細菌に対して外来性である（すなわち、細菌に対して異種）である。

用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」および「タンパク質」と相互交換的に用いられ、そこに含まれるアミノ酸配列の長さまたはサイズに関する制限は意図されない。しかしながら、典型的には、ポリペプチドは少なくとも約６つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは少なくとも約９、少なくとも約１２、少なくとも約２０、少なくとも約３０、または少なくとも約５０アミノ酸を含むであろう。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは少なくとも約１００アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは少なくとも約１００アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはタンパク質の１つの特定のドメインである（例えば、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、触媒ドメインまたは結合ドメイン）。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは全（すなわち、全長）タンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、疾患に対して緩和する治療を提供する抗原またはタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、疾患に対して緩和する治療を提供する抗原またはタンパク質である。いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは治療タンパク質である（または治療タンパク質を含む）。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原（例えば、本明細書中に記載した抗原のいずれか）を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原である。いくつかの実施形態において、該抗原は細菌抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌの細菌抗原である。いくつかの実施形態において、しかしながら、抗原は非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ抗原である。他の実施形態において、抗原は非細菌抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は哺乳動物抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はヒト抗原である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは１以上の免疫原生エピトープを含む抗原である（または該抗原を含む）。いくつかの実施形態において、抗原は１以上のＭＨＣクラスＩエピトープを含む。他の実施形態において、抗原は１以上のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。いくつかの実施形態において、エピトープはＣＤ４＋Ｔ−細胞エピトープである。他の実施形態において、エピトープはＣＤ８＋Ｔ−細胞エピトープである。

抗原をコードするポリヌクレオチドはいずれかの正確な核酸配列（例えば、天然に生じる全長抗原をコードするもの）に限定されないが、本発明の細菌または組成物内で個体に投与する場合に所望の免疫応答を誘導するのに十分なポリペプチドをコードするいずれの配列でもあり得る。本明細書中で用いる用語「抗原」は、フラグメントが抗原性（すなわち、免疫原生）である限りは、より長い抗原タンパク質のフラグメントを含むとも理解される。加えて、いくつかの実施形態において、組換え核酸、発現カセット、または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされる抗原は、天然に生じる抗原配列の変種であってもよい（同様に、他の非抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドについては、個体に応用した場合に、発現される所望のタンパク質が所望の効果（例えば、緩和効果）を供する限り、与えられたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列は変化し得る）。

もう一つの抗原に由来する抗原は、他の抗原の抗原性（すなわち、免疫原生）フラグメント、他の抗原の抗原性改変体、または他の抗原のフラグメントの抗原性改変体である抗原を含む。抗原の変種は、１以上の置換、欠失、付加、および／または挿入において元の抗原とは異なる抗原を含む。

抗原性フラグメントはいずれの長さのものであってもよいが、最も典型的には、少なくとも約６アミノ酸、少なくとも約９アミノ酸、少なくとも約１２アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、または少なくとも約１００アミノ酸である。抗原の抗原性フラグメントは、抗原からの少なくとも１つのエピトープを含む。いくつかの実施形態において、エピトープはＭＨＣクラスＩエピトープである。他の実施形態において、エピトープはＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態において、エピトープはＣＤ４＋Ｔ−細胞エピトープである。他の実施形態において、エピトープはＣＤ８＋Ｔ−細胞エピトープである。

タンパク質内の（エピトープを含めた）抗原性領域を予測するのに有用な種々のアルゴリズムおよびソフトウェアパッケージが当業者に入手可能である。例えば、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子に結合するエピトープをするのに選択するのに用いられるアルゴリズムは公に入手可能である。例えば、公に入手可能な「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ」アルゴリズムは、ＭＨＣ−結合ペプチドを予測するのに用いることができる（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅｅｔａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ５０：２１３−９）。公に入手可能なアルゴリズムの他の例については、以下の文献を参照されたし：Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５２：１６３−７５；ＳｉｎｇｈａｎｄＲａｇｈａｖａ（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：１２３６−１２３７；ＳｉｎｇｈａｎｄＲａｇｈａｖａ（２００３）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１９：１００９−１０１４；Ｍａｌｌｉｏｓ（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：９４２−８；Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２０：１３８８−９７；Ｄｏｎｎｅｓｅｔａｌ．（２００２）ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３：２５；Ｂｈａｓｉｎ、ｅｔａｌ．（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ２２：３１９５−２０４；Ｇｕａｎｅｔａｌ．（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３１：３６２１−４；Ｒｅｃｈｅｅｔａｌ．（２００２）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６３：７０１−９；Ｓｃｈｉｒｌｅｅｔａｌ．（２００１）Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２５７：１−１６；Ｎｕｓｓｂａｕｍｅｔａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００１）５３：８７−９４；Ｌｕｅｔａｌ．（２０００）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６０：５２２３−７。また、例えば、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ、Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）Ｗｅｌｌｉｎｇ、ｅｔａｌ．（１９８５）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．１８８：２１５−２１８、Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：５４２５−５４３２、ＶａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌａｎｄＰｅｌｌｅｑｕｅｒ（１９９４）Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．７：２２４−２２８、ＨｏｐｐａｎｄＷｏｏｄｓ（１９８１）ＰＮＡＳ７８：３８２４−３８２８、およびＨｏｐｐ（１９９３）Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６：１８３−１９０参照。このパラグラフにおいて前記でリストした文献で議論されたアルゴリズムまたはソフトウェアパッケージのいくつかはＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ結合ペプチドまたはエピトープに向けられ、他のものはプロテオソーム切断部位の同定に向けられ、なお他のものは親水性に基づく抗原性の予測に向けられる。

一旦、所望の性質の少なくとも１つのエピトープを含有すると信じられる候補抗原性フラグメントが同定されれば、その配列をコードするポリヌクレオチド配列を発現カセットに組み込み、Ｌｉｓｔｅｒｉａｌワクチンベクターまたは他の細菌ワクチンベクターに導入することができる。次いで、該フラグメントを発現するＬｉｓｔｅｒｉａｌまたは他の細菌によって生じた免疫応答を評価することによって、抗原性フラグメントの免疫原生を確認することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ、細胞傷害性Ｔ−細胞活性アッセイ等のような標準的免疫学的アッセイを用いて、選択された抗原のフラグメントが所望の免疫原生を維持することを確認することができる。これらのタイプのアッセイの例は後の実施例（例えば、実施例２１）に供される。加えて、実施例にて後に記載される方法を用い、Ｌｉｓｔｅｒｉａｌおよび／または細菌ワクチンの抗−腫瘍効果を評価することもできる（例えば、マウスへの、抗原フラグメントを発現するＣＴ２６ネズミ結腸細胞の移植、続いての、候補ワクチンでのマウスのワクチン接種、およびコントロールおよび／または全長抗原に対する、腫瘍のサイズ、転移、生存等に対する効果の観察）。

加えて、抗原性フラグメントを同定するために用いられるエピトープおよび／またはＭＨＣリガンド情報を含む大きなデータベースは公に入手可能である。例えば、Ｂｒｕｓｉｃｅｔａｌ．（１９９８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：３６８−３７１；Ｓｃｈｏｎｂａｃｈｅｔａｌ．（２００２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ３０：２２６−９；およびＢｈａｓｉｎｅｔａｌ．（２００３）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１９：６６５−６６６；およびＲａｍｍｅｎｓｅｅｅｔａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ５０：２１３−９参照。

抗原性改変体のアミノ酸配列は、元の抗原に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％同一性を有する。

いくつかの実施形態において、抗原性改変体は、元の抗原に対して少なくとも約８０％同一性を有する保存的変種であり、抗原性改変体および元の抗原の間の置換は保存的アミノ酸置換である。以下の置換は保存的アミノ酸置換と考えられる：バリン、イソロイシン、またはロイシンはアラニンに代えて置換され；リシン、グルタミン、またはアスパラギンはアルギニンに代えて置換され、グルタミン、ヒスチジン、リシンまたはアルギニンはアスパラギンに代えて置換され；グルタミン酸はアスパラギン酸に代えて置換され、セリンはシステインに代えて置換され；アスパラギンはグルタミンに代えて置換され；アスパラギン酸はグルタミン酸に代えて置換され；プロミンまたはアラニンはグリシンに代えて置換され；アスパラギン、グルタミン、リシンまたはアルギニンはヒスチジンに代えて置換され；ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、またはノルロイシンはイソロイシンに代えて置換され；ノルロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、またはフェニルアラニンはロイシンに代えて置換され；アルギニン、グルタミン、またはアスパラギンはリシンに代えて置換され；ロイシン、フェニルアラニン、またはイソロイシンはメチオニンに代えて置換され；ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン、またはチロシンはフェニルアラニンに代えて置換され；アラニンはプロリンに代えて置換され；スレオニンはセリンに代えて置換され；セリンはスレオニンに代えて置換され；チロシンまたはフェニルアラニンはトリプトファンに代えて置換され；トリプトファン、フェニルアラニン、スレオニン、またはセリンはチロシンに代えて置換され；トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、またはセリンはチロシンに代えて置換され；イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アラニン、またはノルロイシンはバリンに代えて置換される。いくつかの実施形態において、抗原変種は、元の抗原に対して少なくとも約９０％同一性を有する保存的変種である。

いくつかの実施形態において、もう１つの抗原に由来する抗原は他の抗原に対して実質的に同等である。もう１つの抗原に由来する抗原は、もし誘導された抗原が元の抗原に対してアミノ酸配列において少なくとも約７０％同一性を有し、かつ元の抗原の少なくとも約７０％の免疫原生を維持するならば、それからそれが由来する元の抗原と実質的に同等である。いくつかの実施形態において、実質的に同等な抗原が、元の抗原に対してアミノ酸配列において少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％同一性を有する。いくつかの実施形態において、実質的に同等な抗原は元の抗原に対して保存的置換のみを含む。いくつかの実施形態において、実質的に同等な抗原は、元の抗原の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の免疫原生を有する。特別な誘導された抗原の免疫原生を決定し、元の抗原のそれと比較して、誘導抗原が元の抗原と実質的に同等か否かを判断するためには、当業者に知られた多数の免疫原性アッセイのいずれかにおいて誘導されたおよび元の抗原双方をテストすることができる。例えば、元の抗原または誘導された抗原いずれかを発現するＬｉｓｔｅｒｉａを本明細書中に記載されたように調製することができる。免疫応答を生じさせる異なる抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａの能力は、Ｌｉｓｔｅｒｉａでマウスをワクチン接種し、次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ、細胞傷害性Ｔ−活性アッセイ等の標準技術を用いて免疫原生応答を評価することによって測定することができる。これらのタイプのアッセイの例は後に実施例に供する（例えば、実施例２１参照）。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原、腫瘍関連抗原に由来するポリペプチド、感染症抗原、および感染症抗原に由来するポリペプチドからなる群より選択される。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは腫瘍関連抗原を含み、あるいは腫瘍関連抗原に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態において、コードされたポリペプチドは腫瘍関連抗原または腫瘍関連抗原に由来する抗原である１を超える抗原を含む。例えば、いくつかの実施形態において、コードされたポリペプチドはメソセリン（またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体）およびＫ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、またはＰＳＣＡ（またはＫ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、またはＰＳＣＡの抗原性フラグメントまたは抗原性改変体）を共に含む。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされる抗原は腫瘍関連抗原であるか、あるいは腫瘍関連抗原に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原である。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターにおけるポリペプチドは、腫瘍関連抗原とは同一ではないが、むしろ、腫瘍関連抗原に由来する抗原である抗原をコードし（または抗原を含むポリペプチドをコードする）。例えば、いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされる抗原は腫瘍関連抗原のフラグメント、腫瘍関連抗原の変種、または腫瘍関連抗原のフラグメントの変種を含むことができる。いくつかの場合において、腫瘍抗原のような抗原は、アミノ酸配列が宿主に対して内因性であるものとはわずかに異なる場合、ワクチンにおいてより有意な免疫応答を誘導することができる。他の場合には、誘導された抗原は元の抗原よりも有意ではない免疫応答を誘導するが、例えば、より小さなサイズのためＬｉｓｔｅｒｉａｌワクチンベクターにおいて異種発現でより便宜である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原、または腫瘍関連抗原のフラグメントの変種のアミノ酸配列は、１以上のアミノ酸だけ、腫瘍関連抗原、またはその対応するフラグメントのそれとは異なる。腫瘍関連抗原に由来する抗原は、宿主内での抗原をコードするポリヌクレオチドの発現に対して所望の免疫応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープ配列を含むであろう。

従って、いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、またはベクターにおけるポリヌクレオチドは、腫瘍関連抗原に由来する抗原を含むポリペプチドをコードし、ここに、該抗原は腫瘍関連抗原の少なくとも１つの抗原性フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、またはベクターに受けるポリヌクレオチドは腫瘍関連抗原に由来する抗原をコードし、ここに、該抗原が腫瘍関連抗原の少なくとも１つの抗原性フラグメントを含む。抗原性フラグメントは、腫瘍関連抗原の少なくとも１つのエピトープを含む。いくつかの実施形態において、もう１つの抗原に由来する抗原は他の抗原の抗原性（すなわち、免疫原性）フラグメントまたは抗原性改変体である。いくつかの実施形態において、該抗原が他の抗原の抗原性フラグメントである。いくつかの実施形態において、該抗原が他の抗原の抗原性改変体である。

Ｔ細胞によって認識される非常に多数の腫瘍関連抗原が同定されている（Ｒｅｎｋｖｉｓｔｅｔａｌ．、ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｎｎｕｍｏｔｈｅｒ５０：３−１５（２００１））。これらの腫瘍関連抗原が分化抗原（例えば、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ｇｐ１００）、組織特異的抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ）、発生抗原、腫瘍関連ウイルス抗原（例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７）、癌−精巣抗原（例えば、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、胚抗原（例えば、ＣＥＡ、アルファ−フェトプロテイン）、癌タンパク質抗原（例えば、Ｒａｓ、ｐ５３）、過剰発現タンパク質抗原（例えば、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ）、ＭＵＣ１）、または変異したタンパク質抗原であり得る。異種核酸配列によってコードされ得る腫瘍関連抗原は、限定されるものではないが、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、ＢＣＬ−２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｒ−ａｂｌｐ１９０、ｂｃｒ−ａｂｌｐ２１０、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＥＡ（Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，ＥｘｐｅｒＲｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００２）１：４９−６３）、ＣＴ９、ＣＴ１０、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｄｅｋ−ｃａｉｎ、ＤＡＭ−６（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＤＡＭ−１０（ＭＡＧＥ−Ｂ１）、ＥｐｈＡ２（Ｚａｎｔｅｋｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＤｉｆｆｅｒ．（１９９９）１０：６２９−３８；Ｃａｒｌｅｓ−Ｋｉｎｃｈｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（２００２）６２：２８４０−７）、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐｈＡ２（Ｚａｎｔｅｋｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＤｉｆｆｅｒ．（１９９９）１０：６２９−３８；Ｃａｒｌｅｓ−Ｋｉｎｃｈｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（２００２）６２：２８４０−７）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＧｎＴ−Ｖ、ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、アポトーシスの阻害剤（例えば、スルビビン）、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ（コドン１２変異を伴うＫ−Ｒａｓ）、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｄ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ＭＤＭ−２、メソセリン、Ｍｙｏｓｉｎ／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ｎｅｏ−ポリＡポリメラーゼ、ＮＡ８８−Ａ、Ｎ−Ｒａｓ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ（ＣＡＧ−３）、ＰＡＧＥ−４、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）（Ｍｏｌｌｄｒｅｍｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９６）８８：２４５０−７；Ｍｏｌｌｄｒｅｍｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０：２５２９−３４）、Ｐ１５，ｐ１９０、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＡＳ、ＲＣＡＳ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＳＰ１７、ＳＰＡＳ−１、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＷＴ−１、および別法としてＮＹ−ＥＳＯ−１およびＬＡＧＥ−１遺伝子に由来する翻訳されたＮＹ−ＥＳＯ−ＯＲＦ２およびＣＡＭＥＬタンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされる抗原は、いまだ同定すべき抗原を含めた、腫瘍特異的免疫応答を誘導することができるいずれの腫瘍関連抗原も含むことができる。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターにおけるポリヌクレオチドは１を超える腫瘍関連抗原をコードする。

いくつかの実施形態において、抗原はメソセリン（Ａｒｇａｎｉｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７（１２）：３８６２−８（２００１））、Ｓｐ１７（Ｌｉｍｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ９７（５）：１５０８−１０（２００１））、ｇｐ１００（Ｋａｗａｋａｍｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：６４５８（１９９４））、ＰＡＧＥ−４（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５９（７）：１４４５−８（１９９９））、ＴＡＲＰ（Ｗｏｌｆｇａｎｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７（１７）：９４３７−４２（２０００））、ＥｐｈＡ２（Ｔａｔｓｕｍｉｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６３（１５）：４４８１−９（２００３））、ＰＲ３（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｂｅｒａｔｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．７０（１）：５１−９（１９９４））、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９５：１７３５−４０（１９９８）；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０２：３９０−７（２００２））、またはＳＰＡＳ―１（米国特許出願公開番号２００２／０１５０５８８）である。

本発明のいくつかの実施形態において、組換え核酸分子または発現カセットによってコードされた抗原はＣＥＡである。他の実施形態において、抗原はＣＥＡの抗原性フラグメント、および／または抗原性改変体である。ＣＥＡの結直腸、胃および膵臓の９０％、の非小細胞肺癌の７０％、および乳癌の５０％を含めた、優位な割合のヒト腫瘍において過剰発現される１８０−ｋＤＡ膜細胞間接着タンパク質である（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ、ＳｅｍｉｎＣａｎｃｅｒＢｉｏｌ．，９：６７−８１）。ＣＥＡを模倣する抗−イディオタイプモノクローナル抗体（Ｆｏｏｎｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、８７：９８２−９０（１９９５））、またはＣＥＡを発現する組換えワクシニアウイルスを用いるワクチン接種（Ｔｓａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．、８７：９８２−９０（１９９５））のような種々の免疫療法が調べられているが、あいにくと、限定された成功である。それにも拘らず、研究者は、ワクチン接種された患者から生じたヒトＴ細胞系によって認識されるＨＬＡ＊０２０１−制限エピトープ、ＣＡＰ−１（ＣＥＡ６０５−６１３）を同定した。このエピトープをＤＣパルスした患者のワクチン接種は、臨床的応答を誘導しなかった（Ｍｏｒｓｅｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、５：１３３１−８（１９９９））。最近、ＣＥＡ６０５−６１３ペプチドアゴニストが、位置６１０におけるアスパラギンに対するヘテロクリティックアスパルテート置換で同定された（ＣＡＰ１−６Ｄ）。このアミノ酸置換はこのペプチドのＭＨＣ結合親和性を改変しなかったが、改変されたリガンド（ＡＰＬ）の使用の結果、インビトロにてＣＥＡ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の改良された創製がもたらされた。ＣＡＰ１−６Ｄ特異的ＣＴＬは、天然ＣＥＡを発現する腫瘍細胞を認識し、それを溶解させる能力を維持した（Ｚａｒｅｍｂａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、５７：４５７０−７（１９９７）；Ｓａｌａｚａｒｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８５：８２９−３８（２０００））。Ｆｏｎｇｅｔａｌ．は、このＡＰＬと共にインキュベートしたＦｌｔ３−リガンド拡大ＤＣでワクチン接種した結腸癌を持つ患者におけるＣＥＡ特異的免疫の誘導を示した。有望なことには、ワクチン接種後の１２人の患者のうちの２人は、ペプチド−ＭＨＣテトラマー^＋Ｔ細胞の誘導に相関した劇的な腫瘍後退を経験した（Ｆｏｎｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９８：８８０９−１４（２００１））。

もう１つの実施形態において、抗原がプロテイナーゼ−３であるか、あるいはプロテイナーゼ−３に由来する。例えば、１つの実施形態において、抗原はＨＬＡ−Ａ２．１−制限ペプチドＰＲ１（ａａ１６９−１７７；ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号：６３））を含む。プロテイナーゼ−３および／またはＰＲ１エピトープについての情報は以下の文献で入手可能である：米国特許第５，１８０、８１９号、Ｍｏｌｌｄｒｅｍ、ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ、９０：２５２９−２５３４（１９９７）；Ｍｏｌｌｄｒｅｍｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、５９：２６７５−２６８１（１９９９）；Ｍｏｌｌｄｒｅｍ、ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、６：１０１８−１０２３（２０００）；およびＭｏｌｌｄｒｅｍｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１：８６６８−８６７３（２００２）。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原を含み、またはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＣＥＡからなる群より選択される抗原に由来する抗原を含む。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡからなる群より選択される抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＫ−Ｒａｓを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＨ−Ｒａｓを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＮ−Ｒａｓを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＫ−Ｒａｓを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはメソセリン（例えば、ヒトメソセリン）を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＰＳＣＡを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＮＹ−ＥＳＯ−１を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＷＴ−１を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはスルビビンを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはｇｐ１００を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＰＡＰを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはプロテイナーゼ３を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＳＰＡＳ−１を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＳＰ−１７を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＰＡＧＥ−４を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＴＡＲＰを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＣＥＡを含む。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされた抗原はＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡからなる群より選択される抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＫ−Ｒａｓである。いくつかの実施形態において、抗原はＨ−Ｒａｓである。いくつかの実施形態において、抗原はＮ−Ｒａｓである。いくつかの実施形態において、抗原はＫ−Ｒａｓである。いくつかの実施形態において、抗原はメソセリンである。いくつかの実施形態において、抗原はＰＳＣＡである。いくつかの実施形態において、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。いくつかの実施形態において、抗原はＷＴ−１である。いくつかの実施形態において、抗原はスルビビンである。いくつかの実施形態において、抗原はｇｐ１００である。いくつかの実施形態において、抗原はＰＡＰである。いくつかの実施形態において、抗原はプロテイナーゼ３である。いくつかの実施形態において、抗原はＳＰＡＳ−１である。いくつかの実施形態において、抗原はＳＰ−１７である。いくつかの実施形態において、抗原はＰＡＧＥ−４である。いくつかの実施形態において、抗原はＴＡＲＰである。いくつかの実施形態において、抗原はＣＥＡである。いくつかの実施形態において、抗原はヒトメソセリンである。

いくつかの実施形態において、抗原はメソセリン、ＳＰＡＳ−１、プロテイナーゼ−３、ＥｐｈＡ２、ＳＰ−１７、ｇｐ１００、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰまたはＣＥＡであるか、あるいはそれのタンパク質の内の１つに由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はメソセリンであるか、またはメソセリンに由来する。他の実施形態において、抗原はＥｐｈＡ２であるか、またはＥｐｈＡ２に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされた抗原はＥｐｈＡ２（またはＥｐｈＡ２に由来する抗原）ではない。いくつかの実施形態において、抗原はＥｐｈＡ２以外の腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＥｐｈＡ２以外の腫瘍関連抗原に由来する。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはＥｐｈＡ２以外の抗原を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはＥｐｈＡ２またはＥｐｈＡ２に由来する抗原以外の抗原を含む。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターにおけるポリヌクレオチドはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡに由来する抗原を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＫ−Ｒａｓに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＨ−Ｒａｓに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＮ−Ｒａｓに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは１２−Ｋ−Ｒａｓに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはメソセリンに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＰＳＣＡに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＷＴ−１に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはスルビビンに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはｇｐ１００に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＰＡＰに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはプロテイナーゼ３に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＳＰＡＳ−１に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＳＰ−１７に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＰＡＧＥ−４に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＴＡＲＰに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＣＥＡに由来する抗原を含む。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターにおけるポリペプチドはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡに由来する抗原をコードする。いくつかの実施形態において、抗原はＫ−Ｒａｓに由来する。いくつかの実施形態において、抗原はＨ−Ｒａｓに由来する。いくつかの実施形態において、抗原はＮ−Ｒａｓに由来する。いくつかの実施形態において、抗原は１２−Ｋ−Ｒａｓに由来する。いくつかの実施形態において、抗原はメソセリンに由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＰＳＣＡに由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＷＴ−１に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はスルビビンに由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はｇｐ１００に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＰＡＰに由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はプロテイナーゼ３に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＳＰＡＳ−１に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＳＰ−１７に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＰＡＧＥ−４に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＴＡＲＰに由来する抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＣＥＡに由来する抗原である。

いくつかの実施形態において、抗原はメソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。かくして、いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットおよび／またはベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはメソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはメソセリン、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。

いくつかの実施形態において、抗原はメソセリンシグナルペプチド、および／またはＧＰＩ（グリコシルホスファチジルノシトール）アンカーが欠失されたメソセリン（例えば、ヒトメソセリン）である。従って、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、メソセリンシグナルペプチド、および／またはＧＰＩアンカーが欠失されたメソセリンを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、メソセリンシグナルペプチド、および／またはＧＰＩアンカーが欠失されたメソセリンである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、メソセリンシグナルペプチド、および／またはＧＰＩアンカーが欠失されたヒトメソセリンである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、メソセリンシグナルペプチド、および／またはＧＰＩアンカーが共に欠失されたヒトメソセリンである。

いくつかの実施形態において、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である。かくして、いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットまたはベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＮＹ−ＥＳＯ−１、またはその抗原性フラグメントまたは抗原性改変体である抗原である。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットまたはベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、腫瘍関連抗原、例えば、ヒト前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３４９８）、ヒト精巣抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１３２７）、ヒト癌胚性抗原（ＣＥＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２９５４０）、ヒトメソセリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４０４３４）、ヒトスルビビン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７５２８５）、ヒトプロテイナーゼ３（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．Ｘ５５６６８）、ヒトＫ−Ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５４９６９＆Ｐ０１１１６）、ヒトＨ−Ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１１２）、ヒトＮ−Ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１１１）、およびヒト１２−Ｋ−Ｒａｓ（Ｇｌｙ１２Ａｓｐ変異を含むＫ−Ｒａｓ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ００６５４参照）の少なくとも１つの抗原性フラグメントを含む。いくつかの実施形態において組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、少なくとも１つの保存的に置換されたアミノ酸を持つ腫瘍関連抗原の抗原性フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、少なくとも１つの欠失されたアミノ酸残基を持つ抗原性フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターにおけるポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、腫瘍関連抗原の１を超えるタイプに由来する抗原性配列の組合せ、例えば、メソセリンおよびＲａｓ双方に由来する抗原性フラグメントの組合せを含む。

抗原性であると予測される腫瘍抗原の例示的領域は以下の：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３４９８におけるＰＳＣＡアミノ酸配列のアミノ酸２５ないし３５；７０ないし８０；および９０ないし１１８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１３２７のＮＹ−ＥＳＯ−１のアミノ酸４０ないし５５、７５ないし８５、１００ないし１１５、および１２８ないし１４６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２９５４０のＣＥＡアミノ酸配列のアミノ酸７０ないし７５、１５０ないし１５５、２０５ないし２２５、３３０ないし３４０、および５１０ないし５２０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４０４３４のメソセリンポリペプチド配列のアミノ酸９０ないし１１０、１４０ないし１５０、２０５ないし２２５、２８０ないし３１０、３９０ないし４１０、４２０ないし４２５、および５５０ないし５７５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７５２８５のスルビビンポリペプチド配列のアミノ酸１２ないし２０、３０ないし４０、４５ないし５５、６５ないし８２、９０ないし９５、１０２ないし１１５、および１１５ないし１３０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５５６６８で見出されるプロテイナーゼ−３のアミノ酸配列のアミノ酸１０ないし２０、３０ないし３５、６５ないし７５、１１０ないし１２０、および１６０ないし１７０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１１７またはＭ５４９６８（ヒトＫ−Ｒａｓ）のアミノ酸１０ないし２０、３０ないし５０、５５ないし７５、８５ないし１１０、１１５ないし１３５、１４５ないし１５５、および１６０ないし１８５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１１２（ヒトＨ−Ｒａｓ）のアミノ酸１０ないし２０、２５ないし３０、３５ないし４５、５０ないし７０、９０ないし１１０、１１５ないし１３５、および１４５ないし１７５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１１１（ヒトＮ−Ｒａｓ）のアミノ酸１０ないし２０、２５ないし４５、５０ないし７５、８５ないし１１０、１１５ないし１３５、１４０ないし１５５、および１６０ないし１８０；１２−Ｋ−Ｒａｓの最初の２５−アミノ酸（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ００６５４に開示された配列）を含む。これらの抗原性領域はＨｏｐｐ−ＷｏｏｄｓおよびＷｅｌｌｉｎｇ抗原性プロットによって予測された。

いくつかの実施形態において、区別されるポリペプチドとしての、選択せれたシグナルペプチドとの融合タンパク質としての、またはポリペプチドがもう１つのポリペプチドに挿入されたタンパク質キメラとしてのいずれかの、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、ヒトメソセリンの以下のペプチドの１以上を含むポリペプチドである；ＳＬＬＦＬＬＦＳＬ（アミノ酸２０ないし２８；（配列番号：６４））；ＶＬＰＬＴＶＡＥＶ（アミノ酸５３０ないし５３８；（配列番号：６５））；ＥＬＡＶＡＬＡＱＫ（アミノ酸８３ないし９２；（配列番号：６６））；ＡＬＱＧＧＧＰＰＹ（アミノ酸２２５ないし２３４；（配列番号：６７））；ＦＹＰＧＹＬＣＳＬ（アミノ酸４３５ないし４４４；（配列番号：６８））；およびＬＹＰＫＡＲＬＡＦ（アミノ酸４７５ないし４８４；（配列番号：６９））。例えば、いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドによってコードされた抗原はこれらのペプチドの１以上を含むヒトメソセリンの（抗原性）フラグメントである。これらのメソセリンペプチド配列および医療的に関連する免疫応答とのそれらの相関に関するさらなる情報はＰＣＴ公開ＷＯ２００４／００６８３７に見出すことができる。

別法として、組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターにおけるポリヌクレオチドは自己免疫疾患特異的抗原（または自己免疫疾患特異的抗原を含むポリペプチド）をコードすることができる。Ｔ細胞媒介自己免疫疾患においては、自己抗原に対するＴ細胞の応答の結果自己免疫疾患がもたらされる。本発明のワクチンで自己免疫疾患を治療するのに用いる抗原のタイプは、自己免疫応答を担う特異的Ｔ細胞を標的とするであろう。例えば、該抗原は、自己免疫応答を引き起こすＴ細胞に特異的な、Ｔ細胞受容体、イディオタイプの一部であってもよく、ここに、本発明のワクチンに取り込まれた抗原は、自己免疫応答を引き起こすＴ細胞に特異的な免疫応答を誘導するであろう。それらのＴ細胞の排除は、自己免疫疾患の軽減に対する治療的メカニズムであろう。もう１つの可能性は、自己免疫疾患において自己抗原に対して生じる抗体を標的とする、または該抗体を分泌する特異的Ｂ細胞クローンを標的とする免疫応答をもたらすであろう抗原をコードするポリヌクレオチドを組換え核酸分子に組み込むことであろう。例えば、イディオタイプ抗原をコードするポリヌクレオチドは、自己免疫疾患において自己抗原と反応するそのようなＢ細胞、および／または抗体に対する抗−イディオタイプ免疫応答をもたらす組換え核酸分子に取り込むことができる。本発明の発現カセット、および／組換え核酸分子を含む細菌を含むワクチンで治療可能な自己免疫疾患は、限定されるものではないが、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、紅斑、重症筋無力症、白斑、強皮症、乾癬、尋常性天疱瘡、線維筋痛、結腸炎および糖尿病を含む。同様なアプローチはアレルギー性応答を治療するために取ることができ、ここに、ワクチン細菌に取り込まれた抗原は、アレルギー反応を変調するのに効果的なＴ細胞、Ｂ細胞または抗体いずれかを標的とする。乾癬のようないくつかの自己免疫疾患において、該疾患の結果過剰増殖性細胞成長がもたらされ、同様に標的化することができる抗原が発現される。過剰増殖性細胞に対する免疫応答をもたらすであろうそのような抗原が考えられる。

いくつかの実施形態において、該抗原はユニークな疾患関連タンパク質構造を標的とする抗原である。これの１つの例は先に議論したイディオタイプ抗原を用いる抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞の標的化である。もう１つの可能性は、特定の疾患に由来するユニークなタンパク質構造を標的化することである。これの例は、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）およびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のような疾患で観察されるアミロイドプラークを引き起こすタンパク質に対する免疫応答を生じるであろう抗原を取り込むことであろう。このアプローチはプラーク形成の低下を供するに過ぎないが、ＣＪＤのような疾患の場合に治癒ワクチンを供する可能性があろう。この疾患はプリオンタンパク質の感染性形態によって引き起こされる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ワクチンによって生じる免疫応答がＣＪＤを引き起こす感染性タンパク質を排除し、低下させ、または制御し得るように、プリオンタンパク質の感染性形態に対する抗原をコードする。

いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、感染症抗原、または感染症抗原に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは感染症抗原を含む。いくつかの他の実施形態において、ポリペプチドは感染症抗原に由来する抗原を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは感染症抗原であるか、あるいは感染症抗原に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターによってコードされるポリペプチドは感染症抗原である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターによってコードされるポリペプチドは感染症抗原に由来する。

本発明の他の実施形態において、抗原はヒトまたは動物病原体に由来する。病原体は、所望により、ウイルス、細菌、真菌、または原生動物である。例えば、抗原はウイルスまたは真菌または細菌抗原であり得る。１つの実施形態において、該病原体に由来する組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターによってコードされる抗原は、病原体によって生産されるタンパク質であるか、あるいは病原体によって生産されるタンパク質に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターによってコードされるポリペプチドは病原体によって生産されるタンパク質のフラグメントおよび／または変種である。

例えば、いくつかの実施形態において、抗原は（ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇのようなｇａｇ抗原、ならびにＨＩＶのｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびＬＴＲ領域に由来するタンパク質のような）ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、またはヒトまたは動物ヘルペスウイルスに由来する。例えば、いくつかの実施形態において、抗原はｇｐ１２０である。１つの実施形態において、抗原は（ｇＤ、ｇＢ、ｇＨ、ＩＣＰ２７のごとき即時型タンパク質のような）単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）タイプ１および２、（ｇＢおよびｇＨのような）サイトメガロウイルス、メタニューモウイルス、エプスタイン−バールウイルス、または（ｇｐＩ、ＩＩまたはＩＩＩのような）帯状水痘ウイルスに由来する（例えば、Ｃｈｅｅｅｔａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、ｐｐ．１２５−１６９；ＭｃＧｅｏｃｈｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１−１５７４；米国特許第５、１７１、５６８号；Ｂａｅｒｅｔａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３１０：２０７−２１１；およびＤａｖｉｄｓｏｎｅｔａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１７５９−１８１６参照）。

もう１つの実施形態において、抗原はＢ型関連ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、またはＧ型肝炎ウイルスのような肝炎ウイルスに由来する。例えば、ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６参照。該肝炎抗原は表面、コア、または他の関連抗原であり得る。ＨＣＶゲノムはＥ１およびＥ２を含めたいくつかのウイルスタンパク質をコードする。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎｅｔａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１４：３８１−３８８（１９９１）参照。

ウイルス抗原である抗原は、所望により、科Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、リノウイルス等）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ルベラウイルス、デングウイルス等）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ロタウイルス等）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病ウイルス等）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルスタイプＡ、ＢおよびＣ等）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸系シンチシウムウイルス、パラインフルエンザウイルス等）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；限定されるものではないが、単離体ＨＩＶＩ１１ｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＴＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮからの抗原を含めたＲｅｔｒｏｖｉｒｉａｄａｅ（（ＨＴＬＶ−１１１、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲ等としても知られた）ＨＴＬＶ−１；ＨＴＬＶ−１１；ＨＩＶ−１）；ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１；とりわけＨＩＶ−２；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））；Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ、マダニで生じた脳炎ウイルス等のいずれか１つに由来するウイルスに由来する。例えば、これらのおよび他のウイルスの記載については、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．ＫｎｉｐｅａｎｄＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編、１９９６）参照。１つの実施形態において、抗原はＦｌｕ−ＨＡ（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６４３（１９９８））である。

いくつかの別の実施形態において、抗原はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢまたはその誘導体）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、Ｐ．６９、ＰＴおよびＦＨＡ）、のような細菌病原体に由来するか、またはプラスモジウムまたはトキソプラズマのような寄生虫に由来する。１つの実施形態において、抗原はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えば、ＥＳＡＴ−６、８５Ａ、８５Ｂ、８５Ｃ、７２Ｆ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ（例えば、ＰＡ）、またはＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ（例えば、Ｆ１、Ｖ）に由来する。加えて、本発明で用いる適当な抗原は、限定されるものではないが、ジフテリア、百日咳、破傷風、結核、細菌または真菌肺炎、中耳炎、淋病、コレラ、チフス、髄膜炎、単核細胞症、プラーク、細菌性赤痢またはサルモネラ症、レギオナーレ病、ライム病、らい病、マラリア、鉤虫症、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ジアルジア症、アメーバ症、フィラリア症、ボレリア症および旋毛虫症を含めた疾患を担う公知の原因体から得られるか、またはそれに由来し得る。なおさらなる抗原はクール、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、スクラピー、ミンクの伝染性脳症、および慢性るいそう病のような非慣用的病原体、あるいは狂牛病に関連するプリオンのようなタンパク質性感染性粒子から得られることができるか、またはそれに由来し得る。

さらに他の実施形態において、抗原は（アルツハイマー病のような）神経変性病、（Ｉ型糖尿病のような）代謝病、（ニコチン中毒のような）薬物中毒の開始または進行に関与する生物学的剤から得られるかまたはそれに由来する。別法として、組換え核酸分子によってコードされる抗原は疼痛管理で用いられ、抗原は疼痛受容体、または疼痛シグナルの伝播に関与する他の剤である。

いくつかの実施形態において、抗原はヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質に由来する。他の実施形態において、抗原は非ヒトタンパク質であるか、または非ヒトタンパク質（そのフラグメントおよび／または変種）に由来する。いくつかの実施形態において、発現カセットによってコードされる融合タンパク質の抗原部分は非ヒト動物からのタンパク質であるか、あるいは非ヒト動物に由来するタンパク質である。例えば、たとえ抗原がヒトで用いるべきＬｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンで発現させるべきであっても、いくつかの実施形態においては、抗原はネズミメソセリンであり得るか、あるいはネズミメソセリンに由来し得る。

（Ｖ．コドン最適化）
いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクター内のポリヌクレオチドの１以上（すなわち、ポリヌクレオチド配列）は、（天然コード配列に対して）、コドン最適化される。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードする本明細書中に記載された組換え核酸分子（および／または発現カセットおよび／または発現ベクター）におけるポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化される。いくつかの実施形態において、抗原または他の治療タンパク質のような、シグナルペプチド以外のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化される。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該シグナルペプチドに融合したもう１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの双方は細菌において発現につきコドン最適化される。いくつかの実施形態において、スカフォールドとして用いられる分泌されたタンパク質（またはそのフラグメント）をコードするポリヌクレオチド、または自己溶解素（またはそのフラグメントまたは変種）をコードするポリヌクレオチドはコドン最適化される。

コード配列を含むポリヌクレオチドは、もしポリヌクレオチドの天然コード配列の少なくとも１つのコドンが、天然コード配列の元のコドンよりも、コード配列を発現させるべき生物（「標的生物」）によってより頻繁に用いられるコドンで置き換えられたならば、「コドン最適化」されている。例えば、もし天然細菌ポリヌクレオチド配列からのコドンの少なくとも１つが、非細菌抗原を発現させるべき細菌のその特定の種において優先的に発現されるコドンで置き換えられたならば、細菌の特定の種で発現させるべき非細菌抗原をコードするポリヌクレオチドはコドン最適化されている。もう１つの例として、もしポリヌクレオチド配列における少なくとも１つのコドンが、元のヒト配列におけるコドンよりもアミノ酸につきＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによってより頻繁に使用されるコドンに置き換えられていたならば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現カセットの一部となるヒト癌抗原をコードするポリヌクレオチドはコドン最適化されている。同様に、もしシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列における少なくとも１つのコドンが元の（天然）配列におけるコドンよりもそのアミノ酸につきＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによってより頻繁に用いられるコドンで置き換えられているならば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおけるヒト癌抗原を含む融合タンパク質をコードする発現カセットの一部となる（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＬＬＯシグナルペプチドのような）Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して天然であるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドはコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列において置き換えられた少なくとも１つのコドンは、同一アミノ酸をコードする標的生物によって最も頻繁に用いられるコドンで置き換えられている。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの天然コード配列の少なくとも２つのコドンは、天然コード配列の元のコドンよりも、コード配列を発現させるべき生物によってより頻繁に用いられるコドンで置き換えられている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの天然コード配列の少なくとも約５つのコドン、少なくとも約１０のコドン、または少なくとも約２０のコドンは、天然コード配列の元のコドンよりも、コード配列を発現させるべき生物によってより頻繁に用いられるコドンによって置き換えられている。

いくつかの実施形態において、コドン最適化されたポリヌクレオチドにおけるコドンの少なくとも約１０％は（天然の配列の元のコドンよりも）標的生物によってより頻繁に（最も頻繁に）用いられるコドンで置き換えられている。他の実施形態において、コドン最適化されたポリヌクレオチドにおけるコドンの少なくとも約２５％は、標的生物によってより頻繁に（または最も頻繁に）用いられるコドンで置き換えられている。他の実施形態において、コドン最適化されたポリヌクレオチドにおけるコドンの少なくとも約５０％は標的生物によってより頻繁に用いられる（または最も頻繁に用いられる）コドンで置き換えられている。なお他の実施形態において、コドン最適化されたポリヌクレオチドにおけるコドンの少なくとも約７５％は標的生物によってより頻繁に用いられる（または最も頻繁に用いられる）コドンによって置き換えられている。

異なる生物のコドン優先性は当業者によって広く調べられてきた。例えば、Ｓｈａｒｐｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１５：１２８１−９５（１９８７）およびＵｃｈｉｊｉｍａｅｔａｌ．，ＴｈｅＪｏｕｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６１：５５９４−９（１９９８）参照。結果として、コドン用法の表は広く種々の生物について公に入手可能である。例えば、コドン用法の表は広く種々の生物について、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／にてインターネットにおいて、ならびに他の公に利用できるサイトで見出すことができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａｅｔａｌ．（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２８：２９２．参照）。ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／からの例示的コドン用法の表Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓについてのコドン用法の表（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ―ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｌｉｓｔｅｒｉａ＋ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ＋［ｇｂｂｃｔ］）は表２Ａにて便宜のために下に再現する。Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｏｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＢＣＧ、およびＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉについての例示的コドン用法の表は、各々、以下の表２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆに掲げる。

本発明のいくつかの実施形態において、コドン最適化コード配列における少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％は、標的生物で用いるそのアミノ酸についての最も好ましいコドンである。他の実施形態において、コドン最適化コード配列におけるコドンの１００％は標的生物におけるそのアミノ酸についての最も好ましいコドンである（すなわち、該配列は「十分にコドン最適化されている」）。例えば、以下に示す実施例において、コドン最適化されたとして特徴づけられる配列のコドンの全ては標的生物についての最も頻繁に用いられるコドンであった；しかしながら、元の（天然の）配列よりも頻繁に用いられるコドンをもたらすいずれのコドン置換も「コドン最適化された」と考えることができる。以下の表３は、各アミノ酸についてのＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける最適なコドン用法を示す。

いくつかの実施形態において、コドン最適化されたポリヌクレオチドはシグナルペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、それに対して配列がコドン最適化された細菌に対して外来性である。他の実施形態において、シグナルペプチドは、それに対して配列がコドン最適化された細菌に対して天然である。例えば、いくつかの実施形態において、コドン最適化ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのＬＬＯシグナルペプチド、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチド、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＴａｔシグナルペプチドからのＰｈｏＤシグナルペプチドからなる群より選択されるシグナルペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチド以外のシグナルペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。

いくつかの実施形態において、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、それに対してポリヌクレオチド配列がコドン最適化された細菌に対して外来性である（非シグナルペプチド）タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コドン最適化ポリヌクレオチドは抗原を含むポリペプチドをコードする。例えば、いくつかの実施形態において、コドン最適化ポリヌクレオチドは、腫瘍関連抗原である抗原、あるいは腫瘍関連抗原に由来する抗原を含むポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態において、シグナルペプチドおよび／または他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、コドン最適化無しの対応するポリヌクレオチドに対して、細菌におけるシグナルペプチドおよび／または他のポリペプチドを含む（組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターによってコードされる融合タンパク質、タンパク質キメラおよび／または外来性ポリペプチドのような）ポリペプチドの発現を増強させる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのコドン最適化は（コドン最適化無しの対応するポリヌクレオチドに対して）少なくとも約２倍だけ、少なくとも約５倍だけ、少なくとも約１０倍だけ、または少なくとも約２０倍だけ発現を増強させる。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドおよび／または他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、コドン最適化無しの対応するポリヌクレオチドに対して、細菌からのシグナルペプチドおよび／または他のポリペプチドを含む（融合タンパク質、タンパク質キメラおよび／または外来性ポリペプチドのような）ポリペプチドの分泌を増強する。いくつかの実施形態において、コドン最適化は（コドン最適化無しの対応するポリヌクレオチドに対して）少なくとも約２倍だけ、少なくとも約５倍だけ、少なくとも約１０倍だけ、または少なくとも約２０倍だけ分泌を増強させる。いくつかの実施形態において、発現および分泌のレベルの双方が増強される。発現および／または分泌のレベルは、種々の関連細菌培養画分のウェスタンブロットのような当業者に標準的な技術を用いて容易に評価することができる。

（ＶＩ．発現カセット）
また、発現カセットが本発明によって提供される。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載された組換え核酸分子のいずれかを含み、該組換え核酸分子中のコード配列（例えば、シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドおよび他のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド）に作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、単離される。いくつかの他の実施形態において、発現カセットは発現ベクター内に含有され、これは単離することができるか、あるいは細菌内に含有させることができる。なおさらなる実施形態において、発現カセットは細菌の染色体ＤＮＡに位置する。例えば、いくつかの実施形態において、発現カセットは細菌のゲノム内に組み込まれている。いくつかの実施形態において、細菌のゲノム内に組み込まれた発現カセットはゲノムＤＮＡからの１以上のエレメントを含む。例えば、いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、該組換え核酸分子がゲノムＤＮＡに既に存在するプロモーターに操作可能に連結され、それにより、ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた新しい発現カセットを生じるように、（例えば、部位特異的組み込みまたは相同組換えを介して）細菌のゲノムＤＮＡ中の部位に挿入される。いくつかの他の実施形態において、発現カセットは、プロモーターおよび組換え核酸分子を共に含む無傷ユニットとして、（例えば、部位特異的組み込みまたは相同組換えを介して）ゲノムＤＮＡに組み込まれる。

いくつかの実施形態において、発現カセットは、細菌中のポリペプチドの発現のために設計される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、細菌中の異種抗原のような異種ポリペプチドの発現のために設計される。いくつかの実施形態において、発現カセットはポリペプチドの増強された発現および／または分泌を提供する。

一般に、発現カセットは以下の順序のエレメント：（１）プロモーターおよび（２）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは以下のエレメント：（１）プロモーター；（２）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（３）ポリペプチド（例えば、異種タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態において、発現カセットは以下のエレメント：（１）原核生物プロモーター；（２）シャイン−ダルガルノ配列；（３）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（４）（異種タンパク質のような）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、異種ポリペプチドに関連する翻訳停止コドンのＣ−末端から下流に挿入された翻訳停止配列を含むこともできる。例えば、いくつかの実施形態において、翻訳停止配列は細菌染色体内での安定な組み込みのために設計された構築体において用いることができる。必要とされるものではないが、異種遺伝子発現カセットにおける最終の順番のエレメントとしての翻訳停止配列を含めると、リード−スルー転写による隣接遺伝子の発現の調節に対する極性効果を防止することができる。従って、いくつかの実施形態において、ｒｈｏ依存性またはｒｈｏ−非依存性転写停止いずれかを促進する当業者に知られた適当な配列エレメントを異種タンパク質発現カセットに入れることができる。

１つの態様において、本発明は以下の：（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌における発現に対してコドン最適化されており；（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；および（ｃ）発現カセットがシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。

もう１つの態様において、本発明は（ａ）細菌に対して天然であるシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており、（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および（ｃ）発現カセットの第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供し、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、それに対してシグナルペプチドが天然である細菌に対して異種である（すなわち、細菌に対して外来性である）。いくつかの実施形態において、それからシグナルペプチドが由来する細菌は細胞内細菌である。いくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアおよびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されている。

もう１つの態様において、本発明は発現カセットを提供し、ここに、該発現カセットは（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌において発現につきコドン最適化されており、（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および（ｃ）発現カセットの第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、発現カセットはポリシストロニック発現カセットである。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌において発現につき、コード最適化されている。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である（すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して異種である）。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、発現カセットは１を超えるプロモーターを含む。

もう１つの態様において、本発明は（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）当該発現カセットが該シグナルペプチドおよび該ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドおよび／または第二のポリヌクレオチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアまたはＥ．ｃｏｌｉのような細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのようなＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、コドン最適化された第一のポリヌクレオチドによってコードされたシグナルペプチドは、それに対してそれがコドン最適化されている細菌に対して天然である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドは第二のポリヌクレオチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、発現カセットはポリシストロニック発現カセットである。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、または第一および第二の双方のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリヌクレオチドは相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびシグナルペプチドは相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である（すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して異種である）。いくつかの実施形態において、発現カセットは１を超えるプロモーターを含む。

また、本発明は以下の：（ａ）Ｌｉｓｔｅｒｉａに対して外来性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここに、該ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されており；および（ｂ）外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットによってコードされたポリペプチドは抗原である（例えば、前記したいくつかの可能な抗原の記載を参照されたし）。いくつかの実施形態において、発現カセットは、さらに、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットが外来性ポリペプチドおよびシグナルペプチドを共に含む融合タンパク質を発現するようにプロモーターにやはり操作可能に連結されている。発現カセットで用いるのに適したシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、前記したものを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットに含まれるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記したように、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌）のような細菌において発現につきコドン最適化されている。

また、本発明は以下の：（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）第一および第二の双方のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供し、ここに、該発現カセットは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよびポリペプチド双方を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、発現カセットはポリシストロニック発現カセットである。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、または第一および第二の双方のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリヌクレオチドは相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、およびシグナルペプチドは相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である（すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して異種である）。いくつかの実施形態において、発現カセットは１を超えるプロモーターを含む。

本発明は、さらに、発現カセットを提供し、ここに、該発現カセットは（ａ）細菌自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種；および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここに、該発現カセットは第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種を含むタンパク質キメラをコードし、ここに、該タンパク質キメラにおいては、ポリペプチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種に融合しているか、あるいは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に挿入される。いくつかの実施形態において、タンパク質キメラは自己溶解素として触媒的に活性である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは自己溶解素に対して異種である。いくつかの実施形態において、細菌自己溶解素が細胞内細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）からのものである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチド内に挿入され、発現カセットは、ポリペプチドが自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に挿入されたタンパク質キメラをコードする（すなわち、ポリペプチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に埋められている）。別の実施形態において、第二のポリヌクレオチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチドの外側に位置し、発現カセットは、ポリペプチドが自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種に融合したタンパク質キメラをコードする。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは自己溶解素に対して異種である。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドは相互に対して異種である。いくつかの実施形態において、自己溶解素はＳｅｃＡ２依存性自己溶解素である。いくつかの実施形態において、自己溶解素はペプチドグリカンヒドロラーゼ（例えば、Ｎ−アセチルムラミダーゼまたはｐ６０）である。いくつかの実施形態において、発現カセットは、さらに、シグナルペプチド（例えば、自己溶解素と通常は会合したシグナルペプチド、またはシグナルペプチドに対して異種であるシグナルペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、発現カセットは、ｐ６０配列内に埋められた、ｐ６０シグナルペプチド、ｐ６０タンパク質（またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種）、およびｐ６０に対して異種であるポリペプチドを含むタンパク質キメラをコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドである。

もう１つの態様において、本発明は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、（ｂ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、（ｃ）該分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに対して異種であるポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド、ここに、該第三のポリヌクレオチドは第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および（ｄ）第一、第二および第三のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供し、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチド、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、および分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントを含むタンパク質キメラをコードし、ここに、第三のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに融合されているか、あるいはタンパク質キメラにおいて分泌されたタンパク質、またはそのフラグメント内に位置する。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された発現カセット（または本明細書中に記載された組換え核酸分子）中のプロモーターは原核生物プロモーターである。例えば、原核生物プロモーターはＬｉｓｔｅｒｉａｌプロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａｌプロモーターはｈｌｙプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターはｐｒｆＡ依存性プロモーター（例えば、ａｃｔＡプロモーター）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは構成的プロモーター（例えば、ｐ６０プロモーター）である。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子を含む発現カセットは、組換え核酸分子のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたｈｌｙ、ａｃｔＡ、またはｐ６０プロモーターを含む。当業者であれば、発現カセット、および発現カセットを入れる宿主細菌の意図した使用に鑑みて、発現カセットに用いるのに適したさらなる原核生物および／またはＬｉｓｔｅｒｉａｌプロモーターを容易に同定することができるであろう。

例えば、マイコバクテリアおよび他の細菌内で組換え発現カセットにおいて用いるのに適した種々のマイコバクテリアプロモーターが公知である。これらはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＢＣＧプロモーターＨＳＰ６０およびＨＳＰ７０を含み、また、マイコバクチンプロモーター、α−抗原プロモーター、およびＭ．ｔｕｖｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＢＣＧの４５ＫＤａ抗原プロモーター、スーパーオキシドジスムターゼプロモーター、ＭＢＰ−７０、マイコバクテリアａｓｄプロモーター、マイコバクテリア１４ｋＤａおよび１２ｋＤａ抗原プロモーター、Ｂｘｂ１、Ｂｘｂ２、およびＢｘｂ３プロモーターのようなマイコバクテリアファージプロモーター、Ｌ１およびＬ５プロモーター、Ｄ２９プロモーターおよびＴＭ４プロモーターのようなプロモーターを含む（例えば、米国特許第６、５６６、１２１号参照）。Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓで用いるのに適したプロモーターは、限定されるものではないが、ｐａｇＡプロモーター、アルファ−アミダーゼプロモーター（Ｐａｍｙ）、およびＰｎｔｒを含む（例えば、Ｇａｔｅｔａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７１；８０１−１３（２００３）参照）。組換えＳａｌｍｏｎｅｌｌａ発現カセットおよびワクチンで用いるのに適したプロモーターも公知であり、ｎｉｒＢプロモーター、ｏｓｍＣプロモーター、Ｐ（ｐａｇＣ）、およびＰ（ｔａｃ）を含む（例えば、Ｂｕｍａｎｎ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：７４９３−５００（２００１）；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：１−１２（１９９９）；ＭｃＳｏｒｌｅｙｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１７１−８（１９９７）参照）。種々のＥ．ｃｏｌｉプロモーターも当業者に知られている。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された発現カセットで用いるプロモーターは構成的プロモーターである。他の実施形態において、本明細書中で記載された発現カセットで用いるプロモーターは誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、発現カセットがそこで用いられるべき細菌に対して内因性である分子（例えば、タンパク質）によって誘導することができる。別法として、誘導性プロモーターは、そこで発現カセットが用いられるべき細菌に対して異種である分子（例えば、小分子またはタンパク質）によって誘導され得る。種々の誘導性プロモーターが当業者に良く知られている。

発現カセットのいくつかの実施形態において、プロモーターの３’−末端はポリ−プリンシャイン−ダルガルノ配列、異種遺伝子ＲＮＡ転写体に対する（１６ＳｒＲＮＡを介する）３０Ｓリボソーンサブユニットの従事、および翻訳の開始に必要なエレメントである。シャイン−ダルガルノ配列は典型的には以下のコンセンサス配列：

を有する。ポリ−プリンシャイン−ダルガルノ配列の変形がある。注目すべきことには、リステロリシンＯ（ＬＬＯ）をコードするＬｉｓｔｅｒｉａｈｌｙ遺伝子は以下のシャイン−ダルガルノ配列：

を有する（シャイン−ダルガルノ配列には下線を施し、翻訳停止コドンは太文字とする）。

細菌で用いられる発現カセットの構築、および組換え細菌ワクチンで特異的に用いられる発現カセットの構築でさえ当該分野で知られている。例えば、種々の細菌発現カセットおよび／または組換え細菌ワクチンの生産および使用の記載は、ここに引用してその各々をその全体を援用する以下の文献に見出すことができる：Ｈｏｒｗｉｔｚｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：１３８５３−８（２０００）；Ｇａｒｍｏｒｙｅｔａｌ．，Ｊ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ、１１：４７１−９（２００３）；Ｋａｎｇｅｔａｌ．，ＦＥＡＳＩｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３７：９９−１０４（２００３）；Ｇａｒｍｏｒｙｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、２１：３０５１−７（２００３）：Ｋａｎｇｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、１７３９−４９（２００２）；Ｒｕｓｓｍａｎ、ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６７：３５７−６５（２００１）；Ｈａｒｔｈｅｔａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５０：２１４３−５１（２００４）；Ｖａｒａｌｄｏｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７２：３３３６−４３（２００４）；Ｇｏｏｎｅｔｉｌｌｅｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１：１６０２−９（２００３）；Ｕｎｏ−Ｆｕｒｕｔａｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、２１：３１４９−５６（２００３）；Ｂｉｅｔｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７１：２９３３−７（２００３）；Ｂａｏｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７１：１６５６−６１（２００３）；Ｋａｗａｈａｒａｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０５：３２６−３１（２００２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、１８：２１９３−２０２（２０００）；Ｂｕｍａｎｎ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６９：７４９３−５００（２００１）；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：１−１２（１９９９）；ＭｃＳｏｒｌｅｙｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６５：１７１−８（１９９７）；Ｇａｔｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７１：８０１−１３（２００３）；米国特許第５、５０４、００５号；米国特許第５、８３０、７０２号；米国特許第６、０５１、２３７号；米国特許公開番号２００２／００２５３２３；米国特許公開番号２００３／０２０２９８５；ＷＯ０４／０６２５９７；米国特許第６、５６６、１２１号；および米国特許第６、２７０、７７６号。

いくつかの実施形態において、異種コード配列のビシストロニック、（マルチシストロニックとしても知られた）ポリシストロニック発現を利用する発現カセットを構築するのが望ましい。そのような発現カセットは、例えば、２以上の独立したコード配列に操作可能に連結した単一プロモーターを利用することができる。これらのコード配列は、例えば、個々の遺伝子に対応させることができるか、あるいは別法として、全設計された遺伝子の望まれるおよび／または選択されたサブ−フラグメントに対応することができる。この後者の例において、遺伝子は、Ｌｉｓｔｅｒｉａからの効果的な分泌を潜在的に阻害し得る、疎水性膜貫通ドメインをコードする配列を含むであろう。かくして、疎水性ドメインからのこの遺伝子のコード配列を２つのサブ−フラグメントに分離するのが望ましいであろう；この場合、次いで、２つのサブ−フラグメントはビシストロニックメッセージとして発現される。ポリシストロニック発現の利用は、３０ｓリボソームサブユニットが、第一のコード配列の翻訳停止および５０ｓリボソームサブ−ユニットの放出、引き続いての、その間に５０ｓリボソームサブ−ユニットはＲＮＡ−結合３０ｓリボソームサブユニットに結合する次の開始コドンまでのＲＮＡメッセージの「リード−スルー」、および翻訳の再開始に続いてポリシストロニックＲＮＡメッセージにとどまることが必要である。

他の細菌のようにＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはそのゲノムレパートリーのポリシストロニック発現を利用する。その例として、選択されたポリシストロニックメッセージからのＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子間領域の配列を用いて、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ種からの選択された異種タンパク質の発現のためにポリシストロニック発現カセットを構築することができる。例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐｒｆＡ依存性ビューレンス因子のいくつかがポリシストロニックメッセージから発現される。例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＡｃｔＡおよびＰｌｃＢタンパク質はビシストロニックメッセージとして発現される。ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間配列（５’−３’）に対応するＤＮＡ配列は以下に示す：

（ｐｌｃＢの翻訳開始のためのシャイン−ダルガルノ配列を太文字で示す。配列の最初の３つのヌクレオチドはＯｃｈｒｅ停止コドンに対応する）。ビシストロニック発現ベクター、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで用いられるビシストロニックｈＥｐｈＡ２発現ベクターの非限定的例については、以下の実施例２８参照。

別法として、他の公知の遺伝子間または合成配列を用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａまたは他の細菌で用いられるポリシストロニック発現カセットを構築することができる。実質的２次ＲＮＡ構造に導く遺伝子間領域の構築を妨げて、ｒｈｏ−非依存性メカニズムによる望まない転写停止を回避すべきである。

重要なことには、もしポリシストロニックメッセージから発現されたいずれかのまたは全ての翻訳されたタンパク質の分泌が望まれるのであれば、シグナルペプチドは各コーディング領域に機能的に連結されなければならない。いくつかの実施形態において、これらのシグナルペプチドは相互に異なる。

かくして、いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａまたは他の細菌で用いられる本明細書中に記載された発現カセットはポリシストロニック（例えば、ビシストロニック）である。２以上のポリペプチドが、区別されるポリペプチドとしてビシストロニックまたはポリシストロニック発現カセットによってコードされる。いくつかの実施形態において、ビシストロニックまたはポリシストロニック発現カセットは、２つのポリペプチドのコード配列の間に位置した（例えば、ビシストロニックまたはポリシストロニック遺伝子から）遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子間配列は、リボソーム進入および翻訳の開始を促進する配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子間配列はシャイン−ダルガルノ配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子間配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間配列である。典型的には、遺伝子間配列は、第一のポリペプチド（または第一のポリペプチドおよびシグナルペプチドを含む第一の融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列、および第二のポリペプチド（または第二のポリペプチドおよびシグナルペプチドを含む第二の融合タンパク質）の間に位置する。

従って、１つの態様において、本発明は以下の：（ａ）第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド；（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドの間に位置した遺伝子間配列；および（ｆ）第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供し、ここに、該発現カセットは２つの区別されるポリペプチドとしての第一および第二のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリペプチドは（例えば、前記セクションＩＶにおいて）本明細書中に記載されたポリペプチドのいずれかから選択されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリペプチドの少なくとも１つは抗原を含む。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリヌクレオチドは、各々、同一抗原の（異なるまたは同一）フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原であるか、あるいは腫瘍関連抗原に由来する。

本発明の、さらに、以下の：（ａ）第一のシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一の（非シグナル）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドが第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；（ｃ）第二のシグナルペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド；（ｄ）第二の（非シグナル）ポリペプチドをコードする第四のポリヌクレオチド、ここに、該第四のポリヌクレオチドが第三のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；（ｅ）（典型的には、第二のポリヌクレオチドおよび第三のポリヌクレオチドの間に位置した）遺伝子間配列；および（ｆ）当該発現カセットが第一のシグナルペプチドおよび第一のポリペプチドを含む第一の融合タンパク質、および第二のシグナルペプチドおよび第二のポリペプチドを含む第二の融合タンパク質を共にコードするように、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、第三のポリヌクレオチド、および第四のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの１以上は細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第三および／または第四のポリヌクレオチドは（好ましくは、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化に加えて）細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のシグナルペプチドが非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、遺伝子間配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間配列である。いくつかの実施形態において、第二および第三のポリペプチドは、抗原を含むポリペプチドのような（例えば、前記セクションＩＶにおいて）本明細書中において記載されたポリペプチドのいずれかから選択されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリペプチドが（例えば、前記セクションＩＶにおいて）本明細書中において記載されたポリペプチドのいずれかから選択されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第一または第二のポリペプチドの少なくとも１つは抗原を含む。いくつかの実施形態において、第一および第二のポリヌクレオチドは、各々、同一抗原のフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原であるか、あるいは腫瘍関連抗原に由来する。

例えば、本発明はＬｉｓｔｅｒｉａにおける異種ポリペプチドの発現のためのポリシストロニック発現カセットを提供し、ここに、該発現カセットは少なくとも２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ポリシストロニック発現カセットが、２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードするビシストロニック発現カセットである。いくつかの実施形態において、発現カセットは以下の：（ａ）第一の非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第二の非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド；（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドの間に位置した遺伝子間配列；および（ｄ）第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここに、該発現カセットは第一および第二のポリヌクレオチドを２つの区別されるポリペプチドとしてコードする。もし発現カセットが、３つのポリペプチドを区別されるポリペプチドとしてコードするポリシストロニック発現カセットであれば、発現カセットはプロモーターに作動可能に連結された第三のポリヌクレオチド、および第二および第三のポリヌクレオチドの間に位置した第二の遺伝子間配列を含むであろう。いくつかの実施形態において、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドの少なくとも１つは抗原である。いくつかの実施形態において、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドの少なくとも２つは各々、同一抗原のフラグメントを含む。

いくつかの実施形態において、発現カセットは以下の：（ａ）第一のシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一の（非シグナル）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；（ｃ）第二のシグナルペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド；（ｄ）第二の（非シグナル）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする第四のポリヌクレオチド、ここに、該第四のポリヌクレオチドは第三のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；（ｅ）第二のポリヌクレオチドおよび第三のポリヌクレオチドの間に位置した遺伝子間配列；および（ｆ）当該発現カセットが第一のシグナルペプチドおよび第二のポリペプチドを含む第一の融合タンパク質、および第二のシグナルペプチドおよび第二のポリペプチドを含む第二の融合タンパク質を共にコードするように、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、第三のポリヌクレオチド、および第四のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドの少なくとも１つは抗原である。いくつかの実施形態において、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドの少なくとも２つは、各々、同一抗原のフラグメントである。

また、本発明は、組換え細菌（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌）を生産するための本明細書中に記載された発現カセットのいずれかの使用方法も提供する。いくつかの実施形態において、組換え細菌を作成するための本明細書中に記載された発現カセットを用いる方法は、発現カセットを細菌に導入することを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは細菌のゲノムに組み込まれる。いくつかの他の実施形態において、発現カセットは細菌内に取り込まれたプラスミド上にある。いくつかの実施形態において、発現カセットの細菌への取り込みはコンジュゲーションによって起こる。発現カセットの細菌への導入は、当該分野で公知の標準的技術のいずれかによって行うことができる。例えば、発現カセットの細菌への取り込みはコンジュゲーション、形質導入（トランスフェクション）または形質転換によって起こり得る。

（ＶＩＩ．ベクター）
本発明は、さらに、本明細書中に記載された発現カセットおよび／または組換え核酸分子のいずれか１つを含む発現ベクターのようなベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターはプラスミドである。いくつかの実施形態において、ベクターは線状である。いくつかの実施形態において、ベクターは環状である。いくつかの実施形態において、ベクターは組み込みまたは相同組換えベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターはｐＡＭ４０１である。いくつかの実施形態において、ベクターはｐＰＬ２である。いくつかの実施形態において、ベクターは単離される。

前記で示したように、いくつかの実施形態において、本明細書中で記載された発現カセットは発現ベクター内に含まれる。いくつかの実施形態において、ベクターはプラスミドである。他の実施形態において、ベクターは線状である。別の実施形態において、発現カセットは、発現ベクターを用いて細菌のゲノムＤＮＡ内に挿入される（すなわち、組み込まれる）。いくつかの実施形態において、発現ベクターは線状である。他の実施形態において、発現ベクターは環状である。

Ｌｉｓｔｅｒｉａのような細菌で用いるのに適した発現ベクターは当業者に公知である。発現カセットの組立用のプラスミド構築体骨格として用いるのに適した種々の適当なベクターがある。特別なプラスミド構築体骨格は、細菌染色体からの、または染色体外エピソームからのポリヌクレオチド（すなわち、異種抗原をコードするポリヌクレオチド）の発現が望まれるかに基づいて選択される。

いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の細菌染色体への発現カセット（および／または組換え核酸分子）の組み込みは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体へのベクターの配列特異的組み込みを触媒するリステリオファージインテグラーゼ用の発現カセットを含有する組み込みベクターで達成される。例えば、ｐＰＬ１およびｐＰＬ２として公知の組み込みベクターは、細菌ゲノムの無害領域内への異種タンパク質発現カセットの安定な単一−コピー組み込みをプログラムし、これは文献に記載されている（Ｌａｕｅｒｅｔａｌ．２００２Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１７８；米国特許公開番号２００３０２０３４７２）。組み込みベクターはＥ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして安定であり、コンジュゲーションを介して所望のＬｉｓｔｅｒｉａバックグラウンドに導入される。各ベクターはＬｉｓｔｅｒｉａ特異的複製起点を欠き、ベクターが染色体ファージ付着部位への取り込みに際して安定であるようにファージインテグラーゼをコードする。所望のプラスミド構築体で出発し、所望のタンパク質を発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を創製するプロセスはほぼ１週間を要する。ｐＰＬ１およびｐＰＬ２組み込みベクターは、各々、Ｕ１５３およびＰＳＡリステリオファージに基づく。ｐＰＬ１ベクターはｃｏｍＫ遺伝子のオープンリーディングフレーム内に組み込まれ、他方、ｐＰＬ２は、遺伝子の天然配列が成功した組み込みに際して保存され、かくして、その天然の発現された機能を無傷に保つように、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子内に組み込まれる。ｐＰＬ１およびｐＰＬ２組み込みベクターは、組換え核酸分子、または異種タンパク質発現カセットを含むプラスミドの構築を容易とするために、多重クローニング部位配列を含む。ｐＰＬ２組み込みベクターの使用のいくつかの具体的な例は以下の実施例２および実施例３に記載されている。

別法として、Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体への発現カセット（および／または組換え核酸分子）の組み込みは、当業者に公知の対立遺伝子交換方法を通じて達成することができる。特に、抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターを含有する構築体の一部として組み込むのが望まれない組成物、対立遺伝子の交換の方法が望ましい。例えば、ｐＫＳＶ７ベクター（Ｃａｍｉｌｌｉｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９３）８、１４３−１５７）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体に組換えられたｐＫＳＶ７プラスミドを表す非許容性温度において組換えクローンにつき選択するのに利用される温度−感受性Ｌｉｓｔｅｒｉａグラム−陽性複製起点を含有する。ｐＫＳＶ７対立遺伝子交換プラスミドベクターは、タンパク質発現カセット、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するプラスミドの構築を容易とするために、多重クローニング部位配列を含む。Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体への挿入のために、発現カセットは、所望の組み込みの正確な位置に対応するほぼ１ｋｂの染色体ＤＮＡ配列が近接することができる。ｐＫＳＶ７−発現カセットプラスミドは、グラム陽性菌のエレクトロポレーション用の標準的方法に従って、エレクトロポレーションによって所望の細菌株に導入することができる。ｐＳＫＶ７ベクターを用いて対立遺伝子交換を行う方法の非限定的例は以下の実施例１６に供される。

他の実施形態において、安定なプラスミドエピソームからの（ポリペプチドを含む融合タンパク質を含めた）ポリペプチド発現させるのが望まれるであろう。多重創製用の継体を介するプラスミドエピソームの維持は、プラスミド−含有細菌に対して選択的利点を付与するタンパク質の共発現を必要とする。非限定的例として、ポリペプチドと組み合わせたプラスミドから共発現されたタンパク質は抗生物質耐性タンパク質、例えば、クロラモフェニコールであってよく、または選択的利点をやはり付与することができる（野生型細菌における染色体から発現される）細菌タンパク質であってもよい。細菌タンパク質の非限定的例は、（関連アミノ酸または他の必要な前駆体マクロ分子を欠く規定された培地を用いて選択された）プリンまたはアミノ酸生合成で必要な酵素、またはインビトロまたはインビボにて選択的利点を付与する遺伝子の発現に必要な転写因子を含む（Ｇｕｎｎｅｔａｌ．２００１Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：６４７１−６４７９）。非限定的例として、ｐＡＭ４０１は多様なグラム−陽性菌属における選択されたポリペプチドのエピソーム発現に適したプラスミドである（Ｗｉｒｔｈｅｔａｌ．１９８６Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１６５：８３１−８３６）。ｐＡＭ４０１の例示的使用のさらなる記載については、後の実施例３および１３を参照されたし。

Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの細菌染色体への発現カセットの組み込みは、例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体へのベクターの配列特異的組み込みを触媒するファージインテグラーゼ用の発現カセットを含有する組み込みベクターで達成することができる。該インテグラーゼ、およびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓファージの付着部位を用いて、組み込みベクターを駆動して、望まれる抗原発現カセットをワクチン組成物に取り込むことができる。非限定的例として、インテグラーゼ、およびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ鋳型ファージｗ−アルファからの付着部位を用いて、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ特異的組み込みベクターを駆動させる（ＭｃＣｌｏｙ、Ｅ．Ｗ．１９５１．ＳｔｕｄｉｅｓｏｎａｌｙｓｏｇｅｎｉｃＢａｃｉｌｌｕｓｓｔａｉｎ．Ｉ．ＡｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ．Ｊ．Ｈｙｇ．４９：１１４−１２５）。

別法として、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体への抗原発現カセットの組み込みは、当業者に知られた対立遺伝子交換方法を介して達成することができる。例えば、Ｇａｔｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７１：８０１−１３（２００３）参照。特に、発現カセットを含有する構築体の一部として、抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子を取り込まないのが望まれる組成物、対立遺伝子交換の方法が望ましい。例えば、ｐＫＳＶ７ベクター（Ｃａｍｉｌｌｉｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３８、１４３−１５７）は、細菌染色体に組換えられたｐＫＳＶ７プラスミドを表す非許容性温度において組換えクローンにつき選択するのに利用される温度−感受性Ｌｉｓｔｅｒｉａ−由来グラム陽性複製起点を含有する。ｐＫＳＶ７対立遺伝子交換プラスミドベクターは、発現カセット、およびクロラモフェニコール耐性遺伝子を含有するプラスミドの構築を容易とするために、多重クローニング部位配列を含有する。Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体への挿入のためには、発現カセット構築体には、望まれる組み込みの正確な位置に対応する保護１ｋｂの染色体ＤＮＡ配列が近接できる。ｐＫＳＶ７−発現カセットプラスミドは、グラム陽性菌のエレクトロポレーション用の標準的方法に従って、エレクトロポレーションによって望まれる細菌株に導入することができる。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓにおける対立遺伝子交換を行う方法の非限定的例は、ここに引用してその全体を援用する米国特許出願第１０／８８３、５９９号に供される。特に、ｐＫＳＶ７ベクターを用いる対立遺伝子交換をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの株で用いて、細菌染色体のいずれかの所望の位置に望まれる抗原発現カセットを加えることができる。

ｐＫＳＶ７を用いる前記した対立遺伝子交換方法はグラム陽性菌での使用に広く適用できる。加えて、組換え細菌ベクターを含めた細菌で有用な種々の発現ベクターは当業者に知られている。その例は、その各々、ここに引用してその全体を援用する、以下の文献に記載されたベクターを含む：Ｈｏｒｗｉｔｚｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：１３８５３−８（２０００）；Ｇａｒｍｏｒｙｅｔａｌ．，Ｊ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ、１１：４７１−９（２００３）；Ｋａｎｇｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＩｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３７：９９−１０４（２００３）；Ｇａｒｍｏｒｙｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、２１：３０５１−７（２００３）；Ｋａｎｇｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、１７３９−４９（２００２）；Ｒｕｓｓｍａｎ，ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６７：３５７−６５（２００１）；Ｈａｒｔｈｅｔａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５０：２１４３−５１（２００４）；Ｖａｒａｌｄｏｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７２：３３３６−４３（２００４）；Ｇｏｏｎｅｔｉｌｌｅｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１：１６０２−９（２００３）；Ｕｎｏ−Ｆｕｒｕｔａｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、２１：３１４９−５６（２００３）；Ｂｉｅｔｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７１：２９３３−７（２００３）；Ｂａｏｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７１：１６５６−６１（２００３）；Ｋａｗａｈａｒａｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０５：３２６−３１（２００２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、１８：２１９３−２０２（２０００）；Ｂｕｍａｎｎ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６９：７４９３−５００（２００１）；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：１−１２（１９９９）；ＭｃＳｏｒｃｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６５：１７１−８（１９９７）；Ｇａｔｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７１：８０１−１３（２００３）；米国特許第５、５０４、００５号；米国特許第５、８３０、７０２号；米国特許第６、０５１、２３７号；米国特許公開番号２００２／００２５３２３；米国特許公開番号２００３／０２０２９８５；ＷＯ０４／０６２５９７；米国特許第６、５６６、１２１号；および米国特許第６、２７０、７７６号。

本発明は、さらに、以下の：（ａ）第一のシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；（ｃ）遺伝子間配列；（ｄ）第二のシグナルペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド；（ｅ）第二のポリペプチドをコードする第四のポリヌクレオチド、ここに、該第四のポリヌクレオチドは第三のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；および（ｆ）当該発現カセットが第一のシグナルペプチドおよび第一のポリペプチドを含む第一の融合タンパク質、および第二のシグナルペプチドおよび第二のポリペプチドを含む第二の融合タンパク質を共にコードするように、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、第三のポリヌクレオチド、第四のポリヌクレオチド、および遺伝子間配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む発現ベクターを提供する。

本発明は、さらに、組換え細菌（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌）を生産するための本明細書中に記載された発現ベクターのいずれかを用いる方法を提供する。いくつかの実施形態において、組換え細菌を作成するために本明細書中に記載された発現ベクターを用いる方法は細菌へ発現ベクターを導入することを含む。

（ＶＩＩＩ．細菌および他の宿主細胞）
本発明は、さらに、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターを含む宿主細胞を提供する（例えば、前記発明の概要、および詳細な記載のセクションＩ、ＩＩ、ＶＩおよびＶＩＩ、ならびに後の具体的実施例参照）。いくつかの実施形態において、細胞は原核生物である。いくつかの実施形態において、細胞は真核生物である。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、細胞は樹上細胞のような抗原提示細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は単離される。

例えば、本発明は、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターを含む細菌を提供する（例えば、前記した発明の概要、および詳細な記載のセクションＩ、ＩＩ、ＶＩおよびＶＩＩ、ならびに後の具体的実施例参照）。これらのポリヌクレオチドを含む細菌は、別法として、「組換え細菌」といい、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセットまたはベクターを含む細菌は、別法として、「組換え細菌」といわれる。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターを含む細菌は単離される。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターを含む組換え細菌は、そこに含まれた組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターによってコードされるポリペプチドまたは融合タンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、組換え細菌は、そこに含まれる組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターによってコードされるポリペプチドまたは融合タンパク質を分泌する。いくつかの実施形態において、組換え細菌は、細菌（または該細菌を含む組成物）の宿主（例えば、ヒト対象）への投与に際して宿主において免疫応答を生じさせるのに十分な量のポリペプチドおよび／または融合タンパク質を発現し、それを分泌する。

いくつかの実施形態において、細菌はグラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内細菌およびマイコバクテリアからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細菌はグラム陽性菌である。本発明のいくつかの実施形態において、細菌は細胞内細菌（例えば、通性細胞内細菌）である。いくつかの実施形態において、細菌は属Ｌｉｓｔｅｒｉａに属する。他の実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種のメンバーである。他のいくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、またはＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ種のメンバーである。いくつかの実施形態において、細菌は属Ｂａｃｉｌｌｕｓのメンバーである。もう１つの実施形態において、細菌はＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓである。さらにもう１つの実施形態において、細菌はＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓである。本発明の他の実施形態において、細菌は属Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａからのものである。いくつかの実施形態において、細菌はＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである。いくつかの実施形態において、細菌は属Ｓｈｉｇｅｌｌａに属する。例えば、いくつかの実施形態において、細菌はＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉである。いくつかの実施形態において、細菌は属Ｂｒｕｃｅｌｌａのメンバーである。別の実施形態において、細菌はマイコバクテリアである。マイコバクテリアは、所望により、種Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのメンバーである。いくつかの実施形態において、細菌はＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）である。いくつかの実施形態において、細菌はＥ．ｃｏｌｉ、例えば、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）を発現するように修飾されているＥ．ｃｏｌｉである。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターを含む細菌はＬｉｓｅｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、およびマイコバクテリアからなる群より選択される。いくつかの他の実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターを含む細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアおよびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクター（例えば、前記発明の概要、詳細な記載のセクションＩ、ＩＩ、ＶＩおよびＶＩＩ、および後記実施例参照）の挿入を介してポリペプチドを発現し、および少なくともいくつかの実施形態において、ポリペプチドを分泌するように修飾された本発明の細菌は野生型細菌である。例えば、いくつかの実施形態において、組換え細菌は、組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターを含むＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌のような野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌である。しかしながら、本発明のいくつかの実施形態においては、発現カセットおよび／またはベクターを含む細菌は細菌の変異体株である。いくつかの実施形態において、細菌は減弱化されている。いくつかの実施形態において、細菌は細菌の減弱化された変異体株である。遺伝子「ｘｙｚ」が欠失された変異体は、別法として、本明細書中においてはΔｘｙｚまたはｘｙｚ⁻またはｘｙｚ欠失変異体といわれる。例えば、ｕｖｒＡ遺伝子が欠失された細菌株は、別法として、本明細書中においてはｕｖｒＡ変異体、ΔｕｖｒＡまたはｕｖｒＡ⁻といわれる。加えて、「ｘｙｚ」変異体「ｘｙｚ」株としての特定の変異体または株への言及は、時々、ｘｙｚ遺伝子が欠失されている変異体または株をいう。

発現カセットおよび／または発現ベクターを含む変異体細菌における変異はいずれのタイプ変異であってもよい。例えば、変異が点変異、フレーム−シフト変異遺伝子の一部または全ての挿入、欠失を構成し得る。加えて、修飾された株のいくつかの実施形態において、細菌ゲノムの一部が異種ポリヌクレオチドで置換されている。いくつかの実施形態において、変異は天然に生じる。他の実施形態において、変異は人工変異圧の結果である。なお他の実施形態において、細菌ゲノムにおける変異は遺伝子工学の結果である。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセットおよび／またはベクターのいずれか１つを含む細菌は（野生型細菌に対して）細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖につき減弱化されている。細菌は変異によって、または他の修飾によって減弱化することができる。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターのいずれか１つを含む細菌は細胞間拡大につき減弱化されている（例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓａｃｔＡ変異体）。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターのいずれか１つを含む細菌は非食細胞への進入につき減弱化されている（例えば、ｉｎｌＢ欠失変異体のようなＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓインターナリン変異体）。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターのいずれか１つを含む細菌は増殖についての減弱化されている。いくつかの実施形態において、細菌は細胞間拡大および非食細胞への進入の双方につき減弱化されている。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された発現カセットおよび／または発現ベクターを含む細菌が細胞間拡大につき減弱化されている。いくつかの実施形態において、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）は（生物に応じて）（非変異体または野生型細菌に対しる）ＡｃｔＡ、またはその同等体に関して結合している。いくつかの実施形態において、細菌はａｃｔＡにおいて１以上の変異を含む。例えば、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）はａｃｔＡ欠失変異体であり得る。ＡｃｔＡはａｃｔＡ遺伝子によってコードされたアクチンポリメラーゼである（Ｋｏｃｋｓ、ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ、６８：５２１−５３１（１９９２）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ５９１９７４、ｎｔｓ９４５６−１１３８９）。アクチンポリメラーゼタンパク質は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌の１つの極における宿主Ｆ−アクチンの動因および重合に関与する。アクチンの引き続いての重合および溶解の結果、サイトゾルを通じての、および隣接細胞へのＬｉｓｔｅｒｉａ推進がもたらされる。この移動は、細胞外環境へのさらなる暴露なくして細菌が細胞間に直接に拡大し、かくして、抗体発生のような宿主防御から逃げるのを可能とする。いくつかの実施形態において、減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａは、所望により、ｉｎｌＢのようなインターナリン遺伝子におけるおよびａｃｔＡにおける変異を共に含む。本発明のこの実施形態のＬｉｓｔｅｒｉａ株は非食細胞への進入につき減弱化されており、ならびに細胞間拡大につき減弱化されている。

いくつかの実施形態において、細胞間拡大についての減弱化された細菌の能力は、減弱化変異の無い細菌（例えば、野生型細菌）に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％だけ低下する。いくつかの実施形態において、細胞間拡大についての減弱化された細菌お能力は、弱毒化変異無しの細菌に対して少なくとも約２５％だけ低下する。いくつかの実施形態において、細胞間拡大につき減弱化された減弱化細菌の能力は、減弱化変異無しの細菌に対して少なくとも約５０％だけ低下する。

Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌のような細菌が細胞間拡大につき減弱化されているか否かを決定するためのインビトロアッセイは当業者に知られている。例えば、選択された培養細胞単相の感染後に経時的に形成されたプラークの直径を測定することができる。Ｌ２細胞単相内のプラークアッセイは、Ｓｋｏｂｌｅ、Ｊ．、Ｄ．Ａ．Ｐｏｒｔｎｏｙ、ａｎｄＭ．Ｄ．Ｗｅｌｃｈ．２０００、ＴｈｒｅｅｒｅｇｉｏｎｓｗｉｔｈｉｎＡｃｔＡｐｒｏｍｏｔｅＡｒｐ２／３ｃｏｍｐｌｅｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄａｃｔｉｎｎｕｃｌｅａｔｉｏｎａｎｄＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｍｏｂｉｌｉｔｙ．Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５０：５２７−５３８によって記載されているような測定の方法に修飾を施し、Ｓｕｎ，Ａ．、Ａ．Ｃａｍｉｌｌｉ、ａｎｄＤ．Ａ．Ｐｏｒｔｎｏｙ．１９９０、ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｓｍａｌｌ−ｐｌａｑｕｅｍｕｔａｎｔｓｄｅｆｅｃｔｉｖｅｆｏｒｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌｓｐｒｅａｄ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：３７７０−３７７８に以前記載されたように行うことができる。簡単に述べれば、Ｌ２細胞を６−ウェル組織培養皿にて密集するまで増殖させ、次いで、細菌で１時間感染させる。感染後、０．８％アガロース、胎児ウシ血清（例えば、２％）および所望の濃度のゲンタマイシンを含有するＤＭＥよりなる４０℃まで温められた培地と重ねる。該培地中のゲンタマイシンの濃度はプラークのサイズに劇的に影響し、細胞間拡大を行う選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株の能力の尺度である（Ｇｌｏｍｓｋｉ、ＩＪ．Ｍ．Ｍ．Ｇｅｄｄｅ，Ａ．Ｗ．Ｔｓａｎｇ、Ｊ．Ａ．Ｓｗａｎｓｏｎ、ａｎｄＤ．Ａ．Ｐｏｒｔｎｏｙ．２００２．Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５６：１０２９−１０３８）。例えば、単層の感染から３日後に、欠陥がある細胞間拡大の表現型を有するＬｉｓｔｅｒｉａ株のプラークサイズは、５０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンを含有する培地と重ねると、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａと比較して少なくとも５０％だけ低下する。他方、欠陥がある細胞間拡大の表現型を有するＬｉｓｔｅｒｉａ株および野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａの間のプラークの差は、感染された単層を５μｇ／ｍＬゲンタマイシンのみを含有する培地＋アガロースと重ね合わせた場合、同様である。かくして、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａに対する、感染された細胞単層において細胞間拡大を行う選択された株の相対的能力は、アガロースを含有する培地中のゲンタマイシンの濃度を変化させることによって決定させることができる。所望により、プラーク直径の可視化および測定は、感染から４８時間後における、ニュートラルレッド（ＧＩＢＣＯＢＲＬ；ＤＭＥ＋アガロース培地中１：２５０希釈）を含有する培地の重ね合わせへの付加によって促進することができる。加えて、プラークアッセイは、他の１次細胞または連続細胞に由来する単層で行うことができる。例えば、ＨｅｐＧ２細胞、肝細胞−由来細胞系、または一次ヒト肝細胞を用いて、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａと比較した、細胞間拡大を行う選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ変異体の能力を評価することができる。いくつかの実施形態において、細胞間拡大につきＬｉｓｔｅｒｉａを減弱化させる変異または他の修飾を含むＬｉｓｔｅｒｉａは、ゲンタマイシンの高濃度（約５０μｇ／ｍＬ）において「ピンポイント」プラークを生じさせる。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された発現カセットおよび／または発現ベクターを含む細菌は、（減弱化遺伝子変異無しの細菌のような野生型に対して）核酸修復につき減弱化された変異体細菌である。例えば、いくつかの実施形態において、細菌は少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠陥がある（例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｕｖｒＡＢ変異体）。いくつかの実施形態において、細菌は（細菌の属および種に依存して）ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ、および／またはＲｅｃＡまたはその同等体に関して欠陥がある。いくつかの実施形態において、細菌はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、および／またはＵｖｒＣに関して欠陥がある。いくつかの実施形態において、細菌はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、および／またはｒｅｃＡ遺伝子における減弱化変異を含む。いくつかの実施形態において、細菌はｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、および／またはｕｖｒＣ遺伝子において１以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、細菌はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、および／またはＵｖｒＣにおいて機能的に欠失している。いくつかの実施形態において、細菌は機能的ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢにおいて欠失している。いくつかの実施形態において、細菌はｕｖｒＡＢ欠失変異体である。いくつかの実施形態において、細菌はΔｕｖｒＡＢΔａｃｔＡ変異体である。いくつかの実施形態において、核酸修復につき減弱化され、および／または少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠陥がある細菌の核酸を、核酸標的化化合物との反応によって修飾される（後記参照）。ΔｕｖｒＡＢＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ変異体のような核酸修復変異体、および該変異体を作成する方法は米国特許公開番号２００４／０１９７３４３に詳細に記載されている（例えば、米国２００４／０１９７３４３、実施例７参照）。

いくつかの実施形態において、核酸修復に対する減弱化された細菌の能力は、減弱化変異無しの細菌（例えば、野生型細菌）に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％だけ低下する。いくつかの実施形態において、核酸修復に対する減弱化された細菌の能力は、減弱化変異無しの細菌に対して少なくとも約２５％だけ低下する。いくつかの実施形態において、核酸修復につき減弱化された減弱化細菌の能力は、減弱化変異無しの細菌に対して少なくとも約５０％だけ低下する。

特定の変異が細菌株に存在することの確認は、当業者に知られた種々の方法を介して得ることができる。例えば、株のゲノムの関連部分をクローン化し、配列決定することができる。別法として、特異的変異は、欠失または他の変異に隣接する領域をコードする対プライマーを用いてＰＣＲを介して同定することができる。サザンブロットを用いて、細菌ゲノムの変化を検出することもできる。また、ウェスタンブロッティングのような当該分野で標準的な技術を用いて、特定のタンパク質が株によって発現されるか否かを分析することができる。株が望まれる遺伝子において変異を含むことの確認は、先に報告された表現型と株の表現型との比較を介して得ることもできる。例えば、ｕｖｒＡＢの欠失のようなヌクレオチド切出し修復変異の存在は、ヌクレオチド切出し修復（ＮＥＲ）マシーンナリーを用いてその核酸を修復する細菌の能力をテストするアッセイを用い、その能力を野生型細菌と比較することにより評価することができる。例えば、シクロブタンダイマー切除またはＵＶ−誘導（６−４）産物の切出しを測定して、変異体におけるＮＥＲ酵素の欠乏を決定することができる（例えば、Ｆｒａｎｋｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３８２１−３８２４（１９８４）参照）。別法として、生存測定を行って、核酸修復の欠乏を評価することができる。例えば、細菌をプソラレン／ＵＶＡ処理に付し、次いで、野生型と比較して増殖し、および／または生存するそれらの能力につき評価することができる。

いくつかの実施形態において、細菌は（非変異体または野生型細菌に対する）非食細胞への進入につき減弱化される。いくつかの実施形態において、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）は１以上のインターナリン（または同等体）に関して欠乏している。いくつかの実施形態において、細菌はインターナリンＡに関して欠乏している。いくつかの実施形態において、細菌はインターナリンＢに関して欠乏している。いくつかの実施形態において、細菌はｉｎｌＡにおいて変異を含む。いくつかの実施形態において、細菌はｉｎｌＢにおいて変異を含む。いくつかの実施形態において、細菌はａｃｔＡおよびｉｎｌＢ双方において変異を含む。いくつかの実施形態において、細菌は機能的ＡｃｔＡおよびインターナリンＢが欠失している。いくつかの実施形態において、細菌はΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体である。いくつかの実施形態において、細菌はＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方に関して欠乏している。

いくつかの実施形態において、非食細胞への進入に対する減弱化された細胞の能力は、減弱化変異無しの細菌（例えば、野生型細菌）に対して少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％だけ低下する。いくつかの実施形態において、非食細胞への進入に対する減弱化された細菌の能力は、減弱化変異無しの細菌に対して少なくとも約２５％だけ低下する。いくつかの実施形態において、非食細胞への進入に対する減弱化された細菌の能力は、減弱化変異無しの細菌に対して少なくとも約５０％だけ低下する。いくつかの実施形態において、非食細胞への進入に対する減弱化された細菌の能力は、減弱化変異無しの細菌に対して少なくとも約７５％だけ低下する。

いくつかの実施形態において、変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のような減弱化された細菌は、非食細胞の１を超えるタイプへの進入に対して減弱化されない。例えば、減弱化された株は肝細胞への進入に対して減弱化され得るが、上皮細胞への進入に対しては減弱化されない。もう１つの例として、減弱化された株は上皮細胞への進入につき減弱化され得るが、肝細胞への進入についてはそうではない。また、特定の修飾された細菌の非食細胞への進入に対する減弱化は、指名された遺伝子の変異、例えば、特別な細胞受容体と相互作用するインバシンタンパク質をコードする欠失変異の結果、および非食細胞の感染を結果として促進する。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔｉｎｌＢ変異体株は、肝細胞系（例えば、ＨｅｐＧ２）、および一次ヒト肝細胞を含めた肝細胞成長因子受容体（ｃ−ｍｅｔ）を発現する非食細胞への進入につき減弱化されている。

いくつかの実施形態において、細菌（例えば、変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ）は非食細胞への進入につき減弱化されていたとしても、Ｌｉｓｔｅｒｉａは少なくとも樹状細胞および／またはマクロファージのような食細胞によって依然として摂取され得る。１つの実施形態において、食細胞に進入する減弱化された細菌の能力は、インバシンの変異のような、株になされた修飾によって減少しない（食細胞によって摂取される株の測定された能力のほぼ９５％以上は修飾後に維持される）。他の実施形態において、食細胞に進入する減弱化された細菌の能力は、約１０％以下、約２５％以下、約５０％以下、約７５％以下だけ減少する。

本発明のいくつかの実施形態において、非食細胞に進入する細菌（例えばＬｉｓｔｅｒｉａ細菌）の能力の減弱化の量は、２倍低下ないしかなりのレベルの減弱化の範囲である。いくつかの実施形態において、非食細胞に進入する細菌の能力の減弱化は少なくとも約０．３ｌｏｇ、約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約５ｌｏｇ、または少なくとも約６ｌｏｇである。いくつかの実施形態において、減弱化は約０．３ないし＞８ｌｏｇ、約２ないし＞８ｌｏｇ、約４ないし＞８ｌｏｇ、約６ないし＞８ｌｏｇ、約０．３ないし８ｌｏｇ、約０．３ないし７ｌｏｇ、約０．３ないし６ｌｏｇ、約０．３ないし５ｌｏｇ、約０．３ないし４ｌｏｇ、約０．３ないし３ｌｏｇ、約０．３ないし２ｌｏｇ、約０．３ないし１ｌｏｇの範囲である。いくつかの実施形態において、減弱化は約１ないし＞８ｌｏｇ、１ないし７ｌｏｇ、１ないし６ｌｏｇ、約２ないし６ｌｏｇ、約２ないし５ｌｏｇ、約３ないし５ｌｏｇの範囲である。

多数のインターナリンがＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおいて同定されている（Ｂｏｌａｎｄ、ｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ、２００１、１４：５８４−６４０）。これらのインターナリンは、限定されるものではないが、ＩｎｌＡ、ＩｎｌＢ、ＩｎｌＣ、ＩｎｌＣ２、ＩｎｌＤ、ＩｎｌＥ、ＩｎｌＦ、ＩｎｌＧ、およびＩｎｌＨを含む（Ｄｒａｍｓｉ，ｅｔａｌ．、ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ、６５：１６１５−１６２５（１９９７）；Ｒａｆｆｅｌｓｂａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６０：１４４−１５８（１９８８））。これらのタンパク質をコードする遺伝子配列は従前に報告されている。例えば、ｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ双方についての配列はＧａｉｌｌａｒｄｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，６５：１１２７−１１４１（１９９１）にＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６７４７１として報告されている。インターナリン関連タンパク質ファミリーのさらなるメンバーをコードする遺伝子はＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＷｅｂｍａｔｅｒｉａｌｏｆＧｌａｓｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４：８４９−８５２（２００１）、（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／２９４／５５４３／８４９／ＤＣ１）のＷｅｂ表２で同定されており、ｌｍｏ０３２７、ｌｍｏ０３３１、ｌｍｏ０５１４、ｌｍｏ０６１０、ｌｍｏ０７３２、ｌｍｏ１１３６、ｌｍｏ１２８９、ｌｍｏ２３９６、ｌｍｏ０１７１、ｌｍｏ０３３３、ｌｍｏ０８０１、ｌｍｏ１２９０、ｌｍｏ２０２６、およびｌｍｏ２８９１を含む。（インターナリン関連タンパク質ファミリーの各メンバーの配列はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ５９１８２４、および／またはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ−ｅゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００３２１０に見出すことができる。種々のインターナリン関連遺伝子の位置はＧｌａｓｅｒｅｔａｌ．に示されている）。

ｉｎｌＡ（インターナリンＡ）（Ｇａｉｌｌａｒｄｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ、６５：１１２７−１１４１（１９９１）；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ００３２１０）は腸のそれのような上皮細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの取り込みを指令する。

ＩｎｌＢ（インターナリンＢ）（その各々をここに引用してその全体を援用する、Ｇａｉｌｌａｒｄｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，６５：１１２７−１１４１（１９９１）；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＬ５９１９７５（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ，完全なゲノム、セグメント３／１２，ｉｎｌＢ遺伝子領域：ｎｔｓ．９７００８−９８９６３）；およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ００３２１０（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ，完全なゲノム，ｉｎｌＢ遺伝子領域：ｎｔｓ．４５７００８−４５８９６３））は、肝細胞による、あるいは血液脳関門を含む脳微小血管系の血管内皮細胞のような内皮細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの摂取を指令する。（インターナリンＢのさらなる記載については、その全てを個々に引用してその全体を援用する、Ｉｒｅｔｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４：１７０２５−１７０３２（１９９９）；Ｄｒａｍｓｉ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１６：２５１−２６１（１９９５）；Ｍａｎｓｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６：４３５９７−４３６０３（２００１）；およびＢｉｅｒｎｅｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１１５：３３５７−３３６７（２００２）参照）。

いくつかの実施形態において、細菌はＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方に関して欠乏している。いくつかの実施形態において、細菌は機能的ＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢの双方を欠失している。いくつかの実施形態において、細菌は機能的ＡｃｔＡが欠失している。いくつかの実施形態において、細菌は機能的インターナリンＢが欠失している。いくつかの実施形態において、細菌は機能的ＡｃｔＡおよびインターナリンＢが欠失している。

細菌（例えば、変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）が非食細胞への進入につき減弱化されているか否かを判断するためのインビトロアッセイは当業者に知られている。例えば、Ｄｒａｍｓｉｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１６：２５１−２６１（１９９５）およびＧａｉｌｌａｒｄｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６５：１１２７−１１４１（１９９１）は、ある種の細胞系に進入する変異体、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の能力をスクリーニングするためのアッセイを記載する。例えば、特定の修飾を施したＬｉｓｔｅｒｉａ細菌が特定のタイプの非食細胞への進入につき減弱化されているか否かを判断するためには、特定のタイプの非食細胞に進入する減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の能力を測定し、修飾が施されていない同一のＬｉｓｔｅｒｉａ細菌が非食細胞に進入する能力と比較する。同様に、特定の変異を持つＬｉｓｔｅｒｉａ株が特定のタイプの非食細胞への進入につき減弱化されているかを判断するためには特定のタイプの非食細胞へ進入する変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の能力を、変異なしのＬｉｓｔｅｒｉａ株が非食細胞に進入する能力と比較する。加えて、株がインターナリンＢに関して欠陥があるかの確認は、株の表現型を、インターナリンＢ変異体につき以前に報告された表現型との比較を介して得ることもできる。

いくつかの実施形態において、細菌の減弱化は、宿主に対するＬｉｓｔｅｒｉａの生物学的効果の項目において測定することができる。細菌株の病原性は、マウスまたは他の脊椎動物におけるＬＤ_５０によって測定することができる。ＬＤ_５０は、脊椎動物の５０％において死滅を引き起こすのに必要な脊椎動物へ注射されるＬｉｓｔｅｒｉａの量または用量である。ＬＤ_５０値は、減弱化のレベルの尺度として、特定の修飾（例えば、変異）を有する細菌と、特定の修飾を持たない細菌と比較することができる。例えば、もし特定の変異を持たない細菌が１０^３細菌のＬＤ_５０を有し、特定の変異を有する細菌株が１０^５細菌のＬＤ_５０を有するならば、該株は、ＬＤ_５０が１００倍、または２ｌｏｇだけ増加するように減弱化されている。

別法として、非食細胞に感染する細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌）の能力の減弱化の程度は、インビトロにてより直接的に評価することができる。例えば、肝細胞のような非食細胞に感染する修飾されたＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の能力は、食細胞に感染する非修飾Ｌｉｓｔｅｒｉａまたは野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａの能力と比較することができる。そのようなアッセイにおいては、修飾されたおよび非修飾されたＬｉｓｔｅｒｉａを典型的にはインビトロにて非食細胞に限定された時間の間（例えば、１時間）加え、次いで、細胞をゲンタマイシン−含有溶液で洗浄して、いずれの細胞外細菌も殺し、細胞を溶解し、次いで、平板培養して力価を評価する。そのようなアッセイの例は米国特許公開番号２００４／０２２８８７７に見出される。

さらなる例として、減弱化の程度は、組織病理学の程度または血清中肝臓酵素レベルのような他の生物学的効果によって定量的に測定することもできる。血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギンアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルブミンおよびビリルビンレベルを、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（または他の細菌）を注射したマウスについて臨床研究所で測定する。マウスまたは他の脊椎動物におけるこれらの効果の比較は、Ｌｉｓｔｅｒｉａの減弱化を評価する方法として特定の修飾／変異を持つまたは持たないＬｉｓｔｅｒｉａに対してなすことができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａの減弱化はまた、組織病理学より測定できる。肝臓、脾臓および神経系のような、感染した脊椎動物の種々の組織から回収することができるＬｉｓｔｅｒｉａの量は、変異体−対−非変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａを注射した脊椎動物におけるこれらの値を比較することによって、減弱化のレベルの尺度として用いることもできる。例えば、時間の関数としての肝臓または脾臓のような感染した組織から回収することができるＬｉｓｔｅｒｉａの量は、変異体−ｖｓ−非変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａを注射したマウスにおけるこれらの値を比較することによって減弱化の尺度として用いることができる。

したがって、Ｌｉｓｔｅｒｉａの減弱化は、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａによる標的であると知られたマウスにおける特定の選択された器官における細菌負荷の項目で測定することができる。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａの減弱化は、（Ｈ_２Ｏ＋０．２％ＮＰ４０中でホモゲネートした）肝臓または脾臓ホモゲネートの希釈物をＢＨＩ寒天培地上で平板培養することから生起したコロニー（コロニー形成単位：ＣＦＵ）を計算することによって測定することができる。肝臓または脾臓ｃｆｕは、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、および皮下を含めたいずれかの数の経路を介する修飾されたＬｉｓｔｅｒｉａの投与後のタイムコースに渡って測定することができる。加えて、Ｌｉｓｔｅｒｉａを測定し、前記したような競合指標アッセイによる投与後のタイムコースの間にわたる肝臓および脾臓（またはいずれかの他の選択された器官）中での薬物−耐性野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ（またはいずれかの他の選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株）と比較することができる。

非食細胞による減弱化細菌の摂取における減弱化の程度は、安全活効果的なワクチンを提供するためには絶対的な減弱化である必要はない。いくつかの実施形態において、減弱化の程度は、生命を脅かすものではないレベルまで毒性の兆候を妨げる、または低下させるのに十分な毒性の低下を提供するものである。

本発明のいくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターを含む細菌はＬｉｓｔｅｒｉａの変異体株である。さらなる実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの減弱化された変異体株である。減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａの種々の例示的変異体株は（２００３年２月６日に出願された）米国特許出願第６０／４４６，０５１号、（２００３年２月２１日に出願された）第６０／４４９，１５３号、（２００３年１０月１５日に出願された）６０／５１１，７１９号、（２００３年１０月１５日に出願された）６０／５１１，９１９号、（２００３年１０月１５日に出願された）６０／５１１，８６９号、（２００４年２月２日に出願された）６０／５４１，５１５号、（２００４年６月３０日に出願された）１０／８８３，５９９号、ならびに米国特許公開番号２００４／０１９７３４３およびＵＳ２００４／０２２８８７７に記載されており、その各々、ここに引用してその全体を援用するＬｉｓｔｅｒｉａの変異体株は、ここに引用してその全体を援用する、２００４年７月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００４／２３８８１にも記載されている。例えば、発現カセットおよび／またはベクターを含む細菌は、所望により、ＡｃｔＡまたはインターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方が欠乏したＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの変異体株である。いくつかの実施形態において、細菌は、ａｃｔＡ⁻（例えば、ＤＰ−Ｌ４０２９（Ｌａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７（２００２）；米国特許公開番号２００３／０２０３４７２）に記載されたそのプロファージが治癒された、ここに引用してその全体を援用する、Ｓｋｏｂｌｅｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，１５０：５２７−５３７（２０００）に記載されたＤＰ−Ｌ３０７８株）、ａｃｔＡ⁻ｉｎｌＢ⁻（例えば、特許手続きの目的の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定の下に、２００３年１０月３日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａに寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６２が与えられたＤＰ−Ｌ４０２９ｉｎｌＢ）、ａｃｔＡ⁻ｕｖｒＡＢ⁻（例えば、特許手続きの目的の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定の下で、２００３年１０月３日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａに寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３が与えられたＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ）、またはａｃｔＡ⁻ｉｎｌＢ⁻ｕｖｒＡＢ⁻である、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの変異体株である。いくつかの実施形態において、減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌）はΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体である。

細菌変異は変異性化学物質または放射線のような伝統的な変異誘発方法、続いての、変異体の選択を介して達成することができる。細菌の変異は、組換えＤＮＡ技術を介して当業者によって達成することもできる。例えば、Ｃａｍｉｌｌｉｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏ８：１４３−１５７（１９９３）に記載され、細菌ゲノムへの異種発現カセットの導入に関して前記したｐＫＳＶ７ベクターを用いる対立遺伝子交換の方法は、欠失変異体を含めた変異体を創製するのに用いるのに適している（ここに引用してその全体を援用するＣａｍｉｌｌｉｅｔａｌ．，（１９９３））。ｐＫＳＶ７ベクターを用いるＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓインターナリンＢ変異体の生産の１つの例示的な例は後に実施例２４にて供される。別法として、Ｂｉｓｗａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３６２８−３６３５（１９９３）に記載された遺伝子置き換えプロトコルを用いることができる。他の同様な方法が当業者に知られている。

種々の細菌変異体の構築は、その各々、ここに引用してその全体を援用する、米国特許出願第１０／８８３，５９９号、米国特許公開番号２００４／０１９７３４３および米国特許公開番号２００４／０２２８８７７に記載されている。

本発明のいくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターを含む細菌はＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓの変異体株である。いくつかの実施形態において、細菌はＳｔｅｒｎｅ株である。いくつかの実施形態において、細菌はＡｍｅｓ株である。いくつかの実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌はｕｖｒＡＢ変異体である。いくつかの実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ株はｕｖｒＣ変異体である。いくつかの実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ変異体はｒｅｃＡ変異体である。いくつかの実施形態において、細菌はＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓのΔｕｖｒＡＢ変異体（例えば、特許手続きの目的の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定の下で、２００４年２月２０日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａに寄託され、受託番号ＰＴＡ−５８２５が与えられたＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓＳｔｅｒｎｅ ΔｕｖｒＡＢ変異体）である。

Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓのゲノムを改変する方法は当業者に知られている。Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓにおける変異を作り出す１つの方法は、当業者に知られた対立遺伝子交換ベクターを用いる対立遺伝子交換による。例示的な対立遺伝子交換プラスミドはＣａｍｉｌｌｉｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８１４３−１４７（１９９３）に記載されたｐＫＳＶ７である。変異体Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを作り出すにおける最初の工程として，Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓゲノムの上流および下流双方にほぼ１０００ｂｐ欠失させ、またはそうでなければ変異させるべきゲノムの領域をＰＣＲ−増幅し、次いで、ｐＫＳＶ７プラスミドベクター（類似のベクター）にクローン化する。（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属特異的またはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ特異的温度（ｔｓ）レプリコンは、ｐＫＳＶ７対立遺伝子交換プラスミドベクターに存在するＬｉｓｔｅｒｉａｔｓレプリコンに代えて置き換えることができる）。欠失させ、または変異させるべき領域における制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いて、該領域中の標的化遺伝子の望まれる部分を欠失させることができる。別法として、領域内の標的化遺伝子の部分を除去し、所望の変異または他の改変を含む配列で置き換えることができる。増幅させるＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓゲノムの領域は、例えば、対立遺伝子交換プラスミドへクローニングの前にまたは後に、制限酵素、または制限酵素および合成遺伝子の配列の組合せを用いて改変することができる。いくつかの実施形態において、配列をＰＣＲアンプリコンとして改変し、次いで、ｐＫＳＶ７にクローン化することができる。別の実施形態において、アンプリコンをまずもう１つのプラスミドに挿入し、次いで、改変し、引き出し、ｐＫＳＶ７に挿入する。別法として、ＰＣＲアンプリコンがｐＫＳＶ７プラスミドに直接挿入し、次いで、例えば、便宜な制限酵素を用いて改変する。次いで、改変された配列を含有するｐＫＳＶ７プラスミドをＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに導入する。これはエレクトロポレーションを介してなすことができる。次いで、クロラムフェニコールの存在下で許容温度にて培地で細菌を選択する。これに続いて、クロラムフェニコールの存在下で非許容温度で複数世代の間継体することによって、細菌染色体への単一交差組み込みにつき選択する。最後に、抗生物質を含有しない培地中で許容温度にて複数世代の間、コロニーを継体して、プラスミド切り出しおよびキュアリング（二重交差）を達成する。ここに引用してその全体を援用する、米国仮出願代６０／５８４，８８６号、および第６０／５９９，５２２号、および米国特許公開番号２００４／０１９７３４３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ変異体の異なるタイプの構築についてのさらなる記載を提供する。

本発明のいくつかの実施形態において、組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターを含む細菌は、細菌が（非修飾細菌に対して）増殖につき減弱化されるように、修飾されている細菌である。好ましくは、修飾された細菌は、修飾にかかわらず十分なレベルの遺伝子発現を維持する。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子発現レベルは、抗原が、抗原を発現する細菌を宿主に投与するに際して抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで発現されるように、修飾によって実質的に影響されない。いくつかの実施形態において、細菌の核酸は、核酸標的化化合物との反応によって修飾されている。いくつかの実施形態において、修飾された細菌の核酸は、細菌の増殖が減弱化されるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって修飾されている。いくつかの実施形態において、核酸標的化化合物はβ−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのような核酸アルキレーターである。いくつかの実施形態において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射のような照射によって活性化される。いくつかの実施形態において、細菌はプソラレン化合物で処理されている。例えば、いくつかの実施形態において、細菌は４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルプソラレン（「Ｓ−５９」）のようなプソラレン、およびＵＶＡ光での処理によって修飾されている。いくつかの実施形態において、細菌の核酸はプソラレン化合物およびＵＶＡ照射での処理によって修飾されている。核酸標的化化合物を用いて増殖につきそれらを減弱化するための細菌を修飾する方法の記載は、その各々がここに引用してその全体を援用される、以下の米国特許出願または公開：（２００３年２月６日に出願された）第６０／４４６，０５１号、（２００３年２月２１日に出願された）第６０／４４９，１５３号、（２００３年７月２４日に出願された）第６０／４９０，０８９号、（２００３年１０月１５日に出願された）第６０／５１１，８６９号、（２００４年２月２日に出願された）第６０／５４１，５１５号、（２００４年６月３０日に出願された）第１０／８８３，５９９号、およびＵＳ２００４／０１９７３４３の各々に記載されている。修飾された細菌およびそれらの使用は、ここに引用してその全体が援用される、２００４年７月２３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／２３８８１にも記載されている。

例えば、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの処理については、いくつかの実施形態において、（ほぼ）ＯＤ_６００＝０．５のｌｏｇ−相培養においてＳ−５９プソラレンを２００ｎＭまで加え、培養が１の光学密度に到達すると、続いて、６Ｊ／ｍ^２のＵＶＡ光で不活化することができる。不活化条件は、ＵＶＡ処理に先立ってＳ−５９の濃度、ＵＶＡ用量、Ｓ−５９暴露の時間を変化させ、ならびにＬｉｓｔｅｒｉａａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ株の細菌成長の間において処理の時間を変化させることによって最適化される。親Ｌｉｓｔｅｒｉａ株をコントロールとして用いる。Ｌｉｓｔｅｒｉａの不活化（ｌｏｇ−殺傷）は、ＢＨＩ（ブレインハートインヒュージョン）寒天平板上でコロニーを形成する細菌の能力によって決定される。加えて、^３５Ｓ−パルス−チェイス実験を用いてＳ−５９／ＵＶＡ不活化ＬｉｓｔｅｒｉａのＬＬＯおよびｐ６０のような、異種タンパク質およびビルレンス因子の発現を確認して、新しく発現されたタンパク質の合成および分泌をＳ−５９／ＵＶＡ不活化の後に決定することができる。^３５Ｓ−代謝標識を用いるＬＬＯおよびｐ６０の発現はルーチン的に測定することができる。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化ＬｉｓｔｅｒｉａａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢを^３５Ｓ−メチオニンの存在下で１時間インキュベートすることができる。異種タンパク質、内因性ＬＬＯおよびｐ６０の抗原の発現および分泌は全細胞溶解物および細菌培養流体のＴＣＡ沈殿双方で決定することができる。ＬＬＯ−、ｐ６０−および異種タンパク質特異的モノクローナル抗体を免疫沈澱で用いて、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの継続した発現および分泌を不活化後に確認することができる。

いくつかの実施形態において、増殖につき減弱化された細菌は、核酸修復につきやはり減弱化されており、および／または少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠乏している。例えば、いくつかの実施形態において、核酸が（ＵＶＡ処理と組み合わせた）プソラレンのような核酸標的化化合物によって修飾された細菌はｕｖｒＡＢ欠失変異体である。

いくつかの実施形態において、細菌の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、または少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ減弱化される。もう１つの実施形態において、細菌の増殖は約０．３ないし＞１０ｌｏｇ約２ないし＞１０ｌｏｇ、約４ないし＞１０ｌｏｇ、約６ないし＞１０ｌｏｇ、約０．３ないし＞８ｌｏｇ、約０．３ないし６ｌｏｇ、約０．３ないし５ｌｏｇ、約１ないし５ｌｏｇ、または約２ないし５ｌｏｇだけ減弱化される。いくつかの実施形態において、細菌による抗原の発現は、細菌核酸が修飾されていない細菌による抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。

いくつかの実施形態において、細菌の核酸は核酸標的化化合物との反応によって修飾されている。いくつかの実施形態において、組換え細菌は増殖につき減弱化されていない。いくつかの実施形態において、組換え細菌は核酸修復についてのその能力が減弱化されていない。いくつかの実施形態において、組換え細菌は少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠乏していない。

いくつかの実施形態において、組換え細菌内に含まれる組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターにおける第一のポリヌクレオチドによってコードされたシグナルペプチドは組換え細菌に対して天然である。いくつかの実施形態において、組換え細菌に対して天然であるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは十分にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、組換え細菌内に含まれる組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターの第一のポリヌクレオチドによってコードされるシグナルペプチドは宿主組換え細菌に対して外来性であるいくつかの実施形態において、宿主組換え細菌に対して外来性であるシグナルペプチドをコードするポリペプチドが組換え細菌において発現につきコドン最適化されている。

いくつかの実施形態において、組換え細菌内の組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターにおいて第二のポリヌクレオチドは組換え細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドは組換え細菌において発現につき十分にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、組換え細菌内の第一および第二のポリヌクレオチドは共に組換え細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、組換え細菌内の第一および第二のポリヌクレオチドは共に組換え細菌において発現につき十分にコドン最適化されている。

１つの態様において、本発明は発現カセットを含む細菌を提供し、ここに、該発現カセットは（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており；または（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；および（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターに含み、ここに、該発現カセットはシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。例えば、セクションＩＩＩにて記載したように、いくつかの実施形態において、コードされるシグナルペプチドは細菌に由来する。いくつかの実施形態において、発現カセットによってコードされた細菌シグナルペプチドは発現カセットを含む細菌と同一の属および／または種の細菌に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは宿主組換え細菌に対して天然である。他の実施形態において、発現カセットによってコードされる細菌シグナルペプチドは発現カセットを含む細菌と異なる属および／または種の細菌に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは宿主組換え細菌に対して外来性である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ１、ｓｅｃＡ２、またはＴａｔシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは細菌に対して異種（すなわち、外来性）である。

もう１つの態様において、本発明は（ａ）細菌に対して天然であるシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を含む細菌を提供し、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、細菌は細胞内細菌である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、第一および第二の双方のポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターをさらに含む発現カセットの一部である。いくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアおよびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌において発現につきコドン最適化されており、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含み、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、第一および第二の双方のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットの一部である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性である（すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して異種である）。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は減弱化されている。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａは細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖につき減弱化させることができる。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌はＡｃｔＡ、インターリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方に関して欠乏している（例えば、ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体）。いくつかの実施形態において、組換え細菌の核酸は核酸標的化化合物（例えば、プソラレン化合物）との反応によって修飾されている。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を含む細菌を提供し、ここに、該組換え核酸分子は非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、およびポリペプチド（例えば、抗原）をコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここに、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、およびここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはシグナルペプチドに対して異種である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、第一および第二の双方のポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターをさらに含む発現カセットの一部である。いくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｍｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、マイコバクテリアまたはＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される細菌である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは細菌に対して外来性である（すなわち、細菌に対して異種である）。

もう１つの態様において、本発明は発現カセットを含む細菌を提供し、ここに、該発現カセットは（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチド（例えば、細菌に対して異種であるポリペプチド）をコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここに、該発現カセットはシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。例えば、前記セクションＩＩＩにてここに記載されたように、いくつかの実施形態において、非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。いくつかの他の実施形態において、非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドはＴａｔシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、発現カセットによってコードされた細菌シグナルペプチドは発現カセットを含む細菌と同一の属および／または種の細菌に由来する。他の実施形態において、発現カセットによってコードされた細菌シグナルペプチドは発現カセットを含む細菌と異なる属および／または種の細菌に由来する。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該組み替え核酸分子は（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含み、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子は、第一および第二の双方のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットの一部である。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は減弱化されている。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌である。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａは細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖につき減弱化することができる。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌はＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方に関して欠乏している（例えば、ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体）。いくつかの実施形態において、組換え細菌の核酸は核酸標的化化合物（例えば、プソラレン化合物）との反応によって修飾されている。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該組換え核酸分子はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコードし、ここに、ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されている。

さらなる態様において、本発明は発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該発現カセットは以下の：（ａ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌に対して外来性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここに、該ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されており；および（ｂ）外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。再度、いくつかの実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。他の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はＬｉｓｔｅｒｉａｉｖａｎｏｖｉｉ、ＬｉｓｔｅｒｉａｓｅｅｌｉｇｅｒｉまたはＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ種に属する。いくつかの実施形態においてＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は前記したようにＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の減弱化された株である。

さらなる態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；および（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここに、該組換え核酸分子は非Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナルペプチドおよびポリペプチドを共に含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は減弱化されている。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａは細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖につき減弱化させることができる。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌はＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方に関して欠乏している（例えば、ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体）。いくつかの実施形態において、組換え細菌の核酸は核酸標的化化合物（例えば、プソラレン化合物）との反応によって修飾されている。

なおもう１つの態様において、本発明は非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチド（例えば、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチド）をコードする第二のポリヌクレオチド、および第一および第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む（例えば、種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの）組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供する。該発現カセットは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよびポリペプチドを共に含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は細胞間拡大、非食細胞への進入、または増殖につき減弱化される。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はＡｃｔＡ、インターナリンＢ、またはＡｃｔＡおよびインターナリンＢ双方に関して欠乏している。いくつかの実施形態において、組換え細菌の核酸は核酸標的化化合物（例えば、プソラレン化合物）との反応によって修飾されている。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、または第一および第二の双方のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドまたは第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはいくつかの実施形態において、非細菌抗原であり得る抗原である。例えば、ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原または腫瘍関連抗原に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡであるか、あるいはＫ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、１２−Ｋ−Ｒａｓ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、スルビビン、ｇｐ１００、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３、ＳＰＡＳ−１、ＳＰ−１７、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、またはＣＥＡに由来する。例えば、いくつかの実施形態において、ポリペプチドはメソセリンであるか、またはメソセリンのフラグメントまたは変種である。いくつかの他の実施形態において、ポリペプチドはＮＹ−ＥＳＯ−１、またはメソセリンのフラグメントまたは変種である。いくつかの実施形態において、抗原は感染症抗原であるか、または感染症抗原に由来する。好ましい実施形態において、シグナルペプチドは細菌である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは属Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＳｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓに属する細菌からのものである。例えば、いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのものである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチドのようなｓｅｃＡ１シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。なおさらなる実施形態において、シグナルペプチドはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）のようなＴａｔシグナルペプチドである。

本発明は、さらに、組換え核酸分子を含む組換え細菌を提供し、ここに、該組換え核酸分子は：（ａ）細菌自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチド；および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、ここに、該組換え核酸分子は第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、および自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種を含むタンパク質キメラをコードし、ここに、タンパク質キメラにおいて、ポリペプチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種に融合するかあるいは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に位置する。いくつかの実施形態において、組換え細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のような細胞内細菌である。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは組換え細菌に対して外来性である。

さらにもう１つの態様において、本発明はポリシストロニック発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、ポリシストロニック発現カセットは少なくとも２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする。例えば、いくつかの実施形態において、発現カセットは第一の非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、第二の非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、および第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに属する。いくつかの実施形態において、第一および／または第二の非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドは抗原（またはそのフラグメント）を含む。

いくつかの実施形態において、本発明は以下の：（ａ）第一のシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；（ｃ）遺伝子間配列；（ｄ）第二のシグナルペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド；（ｅ）第二のポリペプチドをコードする第四のポリヌクレオチド、ここに、第四のポリヌクレオチドは第三のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；および（ｆ）発現カセットは第一のシグナルペプチドおよび第一のポリペプチドを含む第一の融合タンパク質、および第二のシグナルペプチドおよび第二のポリペプチドを含む第二の融合タンパク質を共にコードするように、第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、第三のポリヌクレオチド、第四のポリヌクレオチド、および遺伝子間配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発言カセットを含む組換え細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）を提供する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの１以上は細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第三および／または第四のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のポリペプチドは組換え細菌に対して異種である（例えば、異種抗原）。いくつかの実施形態において、第一および／または第二のシグナルペプチドは非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドである。第一および／または第二のシグナルペプチドは組換え細菌に対して天然または外来性であり得る。いくつかの実施形態において、組換え細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌であって、第一および／または第二のシグナルペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌである。いくつかの実施形態において、遺伝子間配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間配列である。いくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。

他の実施形態において、本発明は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、（ｂ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および（ｃ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに対して異種であるポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド、ここに、第三のポリヌクレオチドは第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含み、ここに、該組み替え核酸分子はシグナルペプチド、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、および分泌されタンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質キメラをコードし、ここに、該ポリペプチドは分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに融合しているか、またはタンパク質キメラにおいて、分泌したタンパク質、またはそのフラグメント内に位置する。いくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ細菌である。いくつかの実施形態において、細菌がＬｉｓｔｅｒｉａ細菌である場合、第三のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａに対して外来性である。いくつかの実施形態において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。

いくつかの実施形態において、（例えば、前記した態様の各々のいくつかの実施形態において）、細菌内に含まれる発現カセットが細菌のゲノムに組み込まれる。他の実施形態において、細菌内に含まれる発現カセットは細菌内のプラスミド上にある。

一般に、発現カセットで用いられるプロモーターは、選択された特定の細菌宿主での異種発現を行うのに適した発現カセットである。当業者であれば、いずれのプロモーターがいずれの細菌で用いるのに適しているかを容易に知ることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは細菌プロモーターである。さらなる実施形態において、細菌中の発現カセット上のプロモーターは、発現カセットを含有する細菌と同一の属に属する細菌からのプロモーターである。他の実施形態において、細菌中の発現カセット上のプロモーターは、発現カセットを含有する細菌と同一の種に属する細菌からのプロモーターである。例えば、もし発現カセットを含有する細菌が種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに属するならば、発現カセットで用いるプロモーターは、所望により、ｈｌｙのようなＬｉｓｔｅｒｉａｌ遺伝子から由来する。他の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーター（例えば、ｐ６０プロモーター）であるか、ｐｒｆＡ依存性プロモーター（例えば、ａｃｔＡプロモーター）である。再度、前記したように、発現カセットのプロモーターは、いくつかの実施形態において、構成的プロモーターである。他の実施形態において、発現カセットのプロモーターはやはり前記した誘導性プロモーターである。

いくつかの実施形態において、（例えば、前記した態様の各々のいくつかの実施形態において）、ポリペプチドまたは細菌中の発現カセットによってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質は、例えば、前記セクションＩＶにて記載したように、抗原または治療的価値がある他のタンパク質である。いくつかの実施形態において、ポリペプチド、またはポリペプチドを含むタンパク質は細菌から分泌される。いくつかの実施形態において、細菌から発現されるおよび／または分泌されるポリペプチドは細菌に対して異種である。

いくつかの実施形態において、従って、本発明は発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａを提供し、ここに、発現カセットは（ａ）細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｌまたは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここに、第一のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されており；（ｂ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ抗原をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここに、該発現カセットはシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードする。さらなる実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ⁻ｉｎｌＢ⁻株のようなＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの株である。いくつかの実施形態において、発現カセットは組換えＬｉｓｔｅｒｉａのゲノムに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されている。

また、本発明は発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａを提供し、ここに、該発現カセットは（ａ）ｓｅｃＡ２またはＴａｔ細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにアル抗原をコードする第二のポリヌクレオチド、および（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここに、該発現カセットはシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａｌである。他の実施形態において、細菌シグナルペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌである。さらなる実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ⁻ｉｎｌＢ⁻株のようなＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの株である。いくつかの実施形態において、発現カセットは組換えＬｉｓｔｅｒｉａのゲノムに組み込まれている。いくつかの実施形態において、（例えシグナルペプチドがＬｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドであっても）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または抗原をコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されている。

さらなる実施形態において、本発明は発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａを提供し、発現カセットは以下の：（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ抗原をコードするポリヌクレオチド、ここに、該ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されており；および（ｂ）外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、さらに、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきやはりコドン最適化されている細菌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、細菌シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａｌである。もう１つの実施形態において、細菌シグナルペプチドは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌである。いくつかの実施形態において、細菌シグナルペプチドはｓｅｃＡ１シグナルペプチド，ｓｅｃＡ２シグナルペプチド、またはＴａｔシグナルペプチドである。さらなる実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ⁻ｉｎｌＢ⁻株のようなＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの株である。いくつかの実施形態において、発現カセットは組換えＬｉｓｔｅｒｉａのゲノムに組み込まれている。

なおもう１つの実施形態において、本発明は（ａ）細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｌまたは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａおいて発現につきコドン最適化されており、（ｂ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ抗原をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに該第二のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきやはりコドン最適化されており、かつ第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を提供し、ここに、該組換えカセットはシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌は種Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに属する。いくつかの実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのａｃｔＡ⁻ｉｎｌＢ⁻変異体株である。

本発明は、さらに、本明細書中に記載された１を超える発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａのような細菌を提供する。特別な組成物において、ある分子質量の与えられたタンパク質は組換えＬｉｓｔｅｒｉａのような組換え細菌からのその発現を阻害することができる。この問題に取り組み１つのアプローチは、注目するタンパク質をコードする遺伝子を（分子的に）分割し、各分割を、細菌からのその分泌をプログラムする配列（例えば、ｓｅｃＡ１、ｓｅｃＡ２、またはＴａｔエレメント）に機能的に融合させる。１つのアプローチは、異種遺伝子の各分割を発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａを個々に誘導することである。別法として、（分泌用の適当なエレメントもやはり含めた）分子的に分割された遺伝子の個々の成分を、例えば、対立遺伝子交換によって、当該分野で良く確立された方法を用い、細菌染色体を通じて遺伝子間領域に導入することができる。もう１つの例は、単一ポリシストロニックメッセージとして分子的に分割された遺伝子を発現することである。この組成物に従うと、分子的に分割された遺伝子のタンパク質−コード配列の間に置かれるのは、ポリシストロニックメッセージでのタンパク質合成を再開するためのシャイン−ダルカルマリボソーム結合配列であろう。

さらなる態様において、本発明はＬｉｓｔｅｒｉａのような組換え細菌における異種ポリペプチドの発現および／または分泌を改良する方法を提供する。本明細書中に記載されたポリヌクレオチド、発現カセットおよび／または発現ベクターのいずれもこれらの方法で用いることができる。例えば、本発明は、発現カセット上のポリペプチド−コード配列、発現カセットのシグナルペプチド−コード配列、または双方をコドン最適化することを含むＬｉｓｔｅｒｉａにおいてシグナルペプチドに誘導した異種ポリペプチドの発現および／または分泌を改良する方法を提供する。また、本発明は、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ源からの、および／またはｓｅｃＡ１以外の分泌経路からのシグナルペプチドを用いることを含むＬｉｓｔｅｒｉａｌにおいてシグナルペプチドに融合した異種ポリペプチドの発現および／または分泌を改良する方法を提供する。

また、本発明は、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターを細菌に導入して、組換え細菌を生じさせることを含む、組換え細菌（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌）を生産する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、（ａ）細菌に対して天然であるシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、第二のポリヌクレオチドが第一のポリヌクレオチドと同様の翻訳リーディングフレームにあり、組換え核酸分子を細菌に導入して、組換え細菌を生産し、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドをコードする融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組み換え核酸分子は細菌に導入されて、組換え細菌を生じ、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、細菌に導入されて組換え細菌を生じる組換え核酸分子は、（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子であり、ここに、該組換え核酸分子は非Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナルペプチドおよびポリペプチドを共に含む融合タンパク質をコードする。組換え細菌を生じさせるために用いられる組換え核酸分子は、いくつかの実施形態において、（ａ）細菌自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメント、または触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子であり、ここに、該組み替え核酸分子は非Ｌｉｓｔｅｒｉａポリペプチドが自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種に融合しているか、あるいは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に挿入されたタンパク質キメラをコードする。いくつかの他の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌を生産する方法が提供され、これは、ポリシストロニック発現カセットをＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に導入して、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を生じさせることを含み、ここに、該発現カセットは少なくとも２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードする。

（ＩＸ．医薬、免疫原性および／またはワクチン組成物）
薬学的組成物、免疫原性組成物、およびワクチンのような種々の異なる組成物も本発明によって提供される。これらの組成物は本明細書中に記載された組換え細菌のいずれかを含む（例えば、前記した発明の概要、詳細な記載のセクションＩおよびＶＩＩＩ、および後の実施例を含めた明細書の他の箇所参照）。いくつかの実施形態において、組成物は単離される。

例えば、本発明は以下の（ｉ）薬学的に受容可能なキャリア；および（ｉｉ）本明細書中に記載された組換え細菌を含む薬学的組成物を提供する。

例えば、本発明は以下の（ｉ）薬学的に受容可能なキャリア；および（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており、ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および当該発現カセットがシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む組換え細菌を含む薬学的組成物を提供する。

また、本発明は（ｉ）薬学的に受容可能なキャリア；および（ｉｉ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および当該発現カセットがシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む組換え細菌を含む薬学的組成物を提供する。

本発明は、さらに、（ｉ）薬学的に受容可能なキャリア；および（ｉｉ）発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む薬学的組成物を提供し、ここに、該発現カセットは以下の：（ａ）Ｌｉｓｔｅｒｉａに対して外来性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されており；および（ｂ）外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

また、本発明は（ｉ）薬学的に受容可能なキャリア；および（ｉｉ）（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）第一および第二の双方のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む薬学的組成物を提供し、ここに、該発現カセットは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよびポリペプチド双方を含む融合タンパク質をコードする。

本明細書中で用いるように、「キャリア」はいずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、ビークル、コーティング、希釈剤、抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的に受容可能なキャリアは当業者に良く知られており、有効成分と組み合わされた場合に、該成分が生物学的活性を保持するのを可能とし、かつ対象の免疫系と非反応性であるいずれの物質も含む。例えば、薬学的に受容可能なキャリアは、限定されるものではないが、水、緩衝生理食塩水溶液（例えば、０．９％生理食塩水）、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤を含む。可能なキャリアは、限定されるものではないが、油（例えば、鉱油）、デキストロース溶液、グリセロール溶液、チョーク、澱粉、塩、グリセロールおよびゼラチンを含む。

当業者に知られたいずれの適当なキャリアを薬学的組成物で用いることもできるが、キャリアのタイプは投与の態様に応じて変化するであろう。本発明の組成物は、例えば、局所、経口、鼻腔内、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を含めたいずれかの適当な方法の投与のための処方することができる。いくつかの実施形態において、皮下注射のような非経口投与では、キャリアは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムのような前記キャリアまたは固体キャリアのいずれかを経口投与で使用する。

そのようなキャリアを含む組成物は良く知られた慣用的方法によって処方される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ第２０版，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００参照）。

薬学的組成物に加えて、免疫原性組成物が提供される。例えば、本発明は本明細書中に記載された組換え細菌を含む免疫原性組成物を提供する（例えば、前記発明の概要、詳細な記載のセクションＩおよびＶＩＩＩ、および後の実施例を含めた明細書中の他の箇所）。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は組換え細菌を含み、ここに、（用いる組換え核酸分子または発現カセットに応じて）区別されるタンパク質としての、融合タンパク質の一部としての、またはタンパク質キメラに埋もれた、組換え細菌にて発現されるポリペプチドの部分であるポリペプチド配列は抗原であるか、または抗原を含む。換言すれば、いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、抗原を含むポリペプチドをコードする組換え核酸分子または発現カセットを含む組換え細菌を含む。適当な抗原は、限定されるものではないが、本明細書中に（例えば、前記セクションＩＶに）記載されたもののいずれも含む。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物中の組換え細菌は、組成物の宿主（例えば、ヒトのような哺乳動物）への投与に際して抗原に対して免疫応答を誘導するのに十分なレベルにて抗原を含むポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物によって刺激された免疫応答は細胞−媒介免疫応答である。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物によって刺激された免疫応答はヒト免疫応答である。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物によって刺激された免疫応答は液性および細胞−媒介免疫応答を共に含む。

例えば、１つの態様において、本発明は組換え細菌を含む免疫原性組成物を提供し、ここに、該細菌は以下の：（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており；（ｂ）抗原をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；および（ｃ）当該発現カセットがシグナルペプチド抗原を含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。

もう１つの態様において、本発明は組換え細菌を含む免疫原性組成物を提供し、ここに、該細菌は以下の：（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある抗原をコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）当該発現カセットがシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。

なおもう１つの態様において、本発明は組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む免疫原性組成物を提供し、ここに、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は発現カセットを含み、ここに、該発現カセットは以下の：（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ抗原をコードし、かつＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されたポリヌクレオチド；および（ｂ）抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

また、本発明は（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある抗原をコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチド双方に操作可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む免疫原性組成物を提供し、ここに、該発現カセットは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよび抗原を共に含む融合タンパク質をコードする。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換え細菌を含む免疫原性組成物（またはワクチン）を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）細菌に対して天然であるシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており、および（ｂ）抗原を含むポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含み、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。

もう１つの態様において、本発明は組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む免疫原性組成物（ワクチン）を提供し、ここに、該組換え細菌は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されており、および（ｂ）抗原を含むポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を含み、ここに、該組み替え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。

もう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換え細菌を含む免疫原性組成物（またはワクチン）を提供し、ここに、該組換え核酸分子は非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および抗原を含むポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含み、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。

さらにもう１つの態様において、本発明は組換え核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む免疫原性組成物（またはワクチン）を提供し、ここに、該組換え核酸分子は（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）シグナルペプチドに対して異種であるか、または細菌に対して外来性であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含み、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは抗原を含む。

もう１つの態様において、本発明は組換えＬｉｓｅｔｅｒｉａ細菌を含む免疫原性組成物（またはワクチン）を提供し、ここに、該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は組換え核酸分子を含み、ここに、該組換え核酸分子はＬｉｓｔｅｒｉａに対して外来性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここに、外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、外来性ポリペプチドは抗原を含む。

もう１つの態様において、本発明は組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む免疫原性組成物（またはワクチン）を提供し、ここに、組換え細菌は（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）抗原を含むポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を含み、ここに、該組換え核酸分子は非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよびポリペプチドを共に含む融合タンパク質をコードする。

また、本発明は組換え細菌を含む免疫原性組成物（またはワクチン）を提供し、ここに、該組換え細菌は（ａ）細菌自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む核酸分子を含み、ここに、該組換え核酸分子は第二のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメント、または触媒的に活性な変種を含むタンパク質キメラをコードし、ここに、タンパク質キメラにおいては、ポリペプチドは自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種に融合し、またはそれ内に位置する。いくつかの実施形態において、第二のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは抗原を含む。

もう１つの態様において、本発明は組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む免疫原性組成物（またはワクチン）を提供し、ここに、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は組換え核酸分子を含み、ここに、組換え核酸分子は少なくとも２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードし、その少なくとも１つは抗原を含む。

他の態様において、本発明は（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、（ｂ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり、および（ｃ）分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに対して異種であるポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド、ここに、該第三のポリヌクレオチドは第一および第二のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を含む組換え細菌を含む免疫原性タンパク質（またはワクチン）を提供し、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチド、第三のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、および分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントを含むタンパク質キメラをコードし、およびここに、第三のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは分泌されたタンパク質、またはそのフラグメントに融合するか、あるいはタンパク質キメラにおいて、分泌されたタンパク質、またはそのフラグメント内に位置する。いくつかの実施形態において、第三のポリヌクレオチドによってコードされた異種ポリペプチドは抗原を含む。

もし組換え細菌の特定の形態（および／または特定の発現カセット）がインビトロにてまたはモデル系において免疫応答を刺激する組換え細菌の能力をテストすることによって免疫原性組成物において（またはワクチンとして）有用であるかを決定することができる。

これらの免疫細胞応答をインビトロおよびインビボ双方の方法によって測定して、特定の組換え細菌（および／または特定の発現カセット）の免疫応答が効果的であるかを決定することができる。１つの可能性は、組換え細菌の集団と混合された抗原提示細胞による注目するタンパク質または抗原の提示を測定することである。組換え細菌は適当な抗原提示細胞または細胞系、例えば、樹状細胞と混合することができ、タンパク質または抗原を認識するＴ細胞への樹状細胞による抗原提示を測定することができる。もし組換え細菌が十分なレベルにてタンパク質または抗原を発現しているならば、樹状細胞によってそれをペプチドフラグメントに処理し、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの関係でＴ細胞に提示される。提示されたタンパク質または抗原を検出する目的で、特定のタンパク質または抗原に応答性のＴ細胞クローンまたはＴ細胞系を用いることができる。Ｔ細胞はＴ細胞ハイブリドーマであってもよく、ここに、Ｔ細胞は癌細胞系との融合によって不滅化される。そのようなＴ細胞ハイブリドーマ、Ｔ細胞クローン、またはＴ細胞系はＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞いずれかを含むことができる。樹状細胞は、抗原が処理される経路に応じて、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞いずれかへ提示できる。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩの関係で抗原を認識し、他方、ＣＤ４＋はＭＨＣクラスＩＩの関係で抗原を認識する。Ｔ細胞はそのＴ細胞受容体による特異的認識を介して提示された抗原によって刺激され、その結果、（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、または細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を用い）定量的に測定することができるＩＬ−２、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）のようなある種のタンパク質の生産をもたらす。当該分野で良く知られ、実施例にて後にやはり例示する技術がある（例えば、後の実施例２１参照）。

別法として、提示された抗原によるＴ細胞ハイブリドーマの刺激に際して活性化されるβ−ガラクトシダーゼのような、レポーター遺伝子を含むようにハイブリドーマを設計することができる。β−ガラクトシダーゼの生産の増加は、色の変化をもたらす、クロロフェノールレッド−Ｂ−ガラクトシドのような基質に対するその活性によって容易に測定することができる。色の変化は特異的抗原提示のインジケーターとして直接測定することができる。

本発明の組換え細菌ワクチンの抗原発現を評価するためのさらなるインビトロおよびインビボ方法は当業者に知られている。また、組換え細菌による特定の異種抗原の発現を直接的に測定することもできる。例えば、放射性標識されたアミノ酸を細胞集団に加えることができ、特定のタンパク質に取り込まれた放射能の量を測定することができる。細胞集団によって合成されたタンパク質は、例えば、ゲル電気泳動または毛細管電気泳動によって単離することができ、放射能の量を定量的に測定して、特定のタンパク質の発現レベルを評価することができる。別法として、タンパク質を放射能無くして発現させ、酵素結合抗体または蛍光標識抗体を用いる検出での、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはゲル電気泳動およびウェスタンブロットのような種々の方法によって可視化することができる。

以下の実施例２１は、当業者に知られた技術のいくつかがどのようにして免疫原性を評価するのに用いることができるかのいくつかの特異的な例示的例を提供する。例えば、細胞内サイトカイン染色アッセイ（ＩＣＳ）、刺激された脾臓のサイトカイン発現の測定、および細胞傷害性Ｔ細胞活性のインビトロおよびインビボでの評価は、全て、当業者に知られた免疫原性を評価するための技術である。モデル抗原を用いるこれらの技術の例示的な記載は実施例２１に供される。また、例示的アッセイは以下の実施例３１Ａおよび３１Ｅに記載される。

加えて、ワクチン組成物の治療効果は、免疫原性組成物またはワクチンをマウスモデルのような動物モデルに投与し、引き続いて、生存または腫瘍増殖の評価によってより直接的に評価することができる。例えば、生存は（例えば、腫瘍または病原体での）投与および挑戦に続いて測定することができる。例えば、以下の実施例２０および３１ＢないしＤに記載されたアッセイ参照。

特定の抗原を発現する免疫原性組成物またはワクチンの免疫原性をテストするのに有用なマウスモデルは、それが注目する抗原またはモデル抗原を発現するように、まず腫瘍細胞を修飾し、次いで、注目する抗原を発現する腫瘍細胞をマウスに移植することによって生産することができる。（候補組成物の予防効率を測定するための）腫瘍細胞の移植に先立って、または（候補組成物の治療効果をテストするための）マウスにおける腫瘍細胞の移植に続いて、注目する抗原またはモデル抗原を含むポリペプチドを発現する組換え細菌を含む候補免疫原性組成物またはワクチンでマウスをワクチン接種することができる。

例として、ＣＴ２６マウスネズミ結腸癌腫細胞を、当該分野で標準的な技術を用い、所望の抗原またはモデル抗原をコードする発現カセットを含む適当なベクターでトランスフェクトすることができる。次いで、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットのような標準的技術を用いて、免疫原性および／または効果アッセイで用いるのに十分なレベルで抗原またはモデル抗原を発現するクローンを同定するのに用いることができる。

別法として、腫瘍細胞系に対して内因性である抗原（例えば、ＣＴ２６マウスネズミ結腸癌腫細胞に対して内因性であるレトロウイルスｇｐ７０腫瘍抗原ＡＨ１、またはヘテロクリティックエピトープＡＨ１−Ａ５）に対応するか、またはそれに由来する抗原を発現する組換え細菌を含む候補組成物をテストすることができる。そのようなアッセイにおいて、腫瘍細胞は、さらなる抗原を発現するようなさらなる修飾無しの動物モデルに移植することができる。抗原を含む候補ワクチンを次いでテストすることができる。

示されたように、本明細書中に記載された細菌を含むワクチン組成物も提供される。例えば、本発明は本明細書中に記載された組換え細菌を含むワクチンを提供し（例えば、前記発明の概要、詳細な記載のセクションＩおよびＶＩＩＩ、および以下の実施例を含めた明細書中の他の箇所参照）、ここに、（用いる組換え核酸分子または発現カセットに応じて）区別されるタンパク質として、融合タンパク質の一部として、またはタンパク質キメラに埋められた、組換え細菌によって発現されるポリペプチドの一部であるポリペプチド配列は抗原である。適当な抗原は本明細書（例えば、前記セクションＩＶに）記載されたもののいずれも含む。

１つの態様において、本発明は細菌を含むワクチンを提供し、ここに、該細菌は以下の：（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており；（ｂ）抗原をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；（ｃ）発現カセットがシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。

もう１つの態様において、本発明は細菌を含むワクチンを提供し、ここに、該細菌は以下の：（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある抗原をコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）当該発現カセットがシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。

なおもう１つの態様において、本発明は核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンを提供し、ここに、該核酸分子は以下の：（ａ）非Ｌｉｓｅｔｅｒｉａｌ抗原をコードし、かつＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されたポリヌクレオチド；および（ｂ）抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

もう１つの態様において、本発明は：（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある抗原をコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）第一および第二の双方のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンを提供し、ここに、該発現カセットは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよび抗原を共に含む融合タンパク質コードする。

いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、本明細書中に記載された組換え細菌のいずれかで感染させている抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態において、ワクチン（または免疫原性または薬学的組成物）は抗原提示細胞を含まない（すなわち、ワクチンまたは組成物は細菌ベースのワクチンまたは組成物であり、ＡＰＣベースのワクチンまたは組成物ではない）。

ワクチン組成物（および医薬および免疫原性組成物）の投与に適した投与方法は当該分野で知られており、投与の経口、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内、鼻腔内および皮下経路を含む。

ワクチン処方は当該分野で知られており、いくつかの実施形態においては、保存剤（例えば、チメロサール、２−フェニオキシエタノール）、安定化剤、アジュバント、（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン）、抗生物質（例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン）および他の物質のような多数の添加剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、ラクトースまたはグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）のような安定化剤を加えて、温度変動または凍結乾燥プロセスのような種々の条件に対してワクチン処方を安定化させる。いくつかの実施形態において、ワクチン処方は滅菌水、生理食塩水、または等張緩衝生理食塩水（例えば、生理学的ｐＨに対して緩衝化されたホスフェート）のような懸濁化流体または希釈剤を含むこともできる。また、ワクチンは少量の製造プロセスからの残存物質を含むこともできる。

例えば、いくつかの例において、ワクチン組成物は凍結乾燥される。凍結乾燥された製剤は投与に先立って滅菌溶液（例えば、シトレート−炭酸水素塩緩衝液、緩衝水、０．４％生理食塩水など）と組み合わせることができる。

いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、さらに、アジュバントまたは共刺激分子のような、ワクチンに対する免疫応答を改良するための当該分野で知られたさらなる成分を含むことができる。前記リストしたものに加えて、可能なアジュバントはＣｐＧのような、ケモカインおよび細菌核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンはＣＴＬＡ４のような、ワクチンに対する免疫応答を改良する抗体を含む。いくつかの実施形態において、共刺激分子はＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、Ｂ７．１、Ｂ７．２、およびＢ７−ＤＣからなる群より選択される１以上の因子を含み、所望により、本発明のワクチン組成物に含められる。他の共刺激分子は当業者に知られている。

さらなる態様において、本発明は抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａを含むワクチンまたは免疫原性組成物を改良する方法を提供する。本明細書中に記載されたポリヌクレオチド、発現カセットおよび／または発現ベクターのいずれもこれらの方法で用いることができる。例えば、本発明は、発現カセット上のポリペプチド−コード配列、発現カセットのシグナルペプチド−コード配列、または双方のいずれかをコドン最適化することを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンまたは免疫原性組成物を改良する方法を提供し、ここに、該Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はシグナルペプチドに融合した異種抗原を発現する。本発明は、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ源からの、および／またはｓｅｃＡ１以外の分泌経路からのシグナルペプチドを用いることを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンまたは免疫原性組成物を改良する方法を提供し、ここに、該Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌はシグナルペプチドに融合した異種抗原を発現する。

本発明のワクチンを生産する方法も提供される。例えば、１つの実施形態において、組換え細菌（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌）を含むワクチンを生産する方法は、組換え核酸分子を細菌に、本明細書中に記載された発現カセットまたは発現ベクターを細菌に導入することを含み、ここに、該組換え核酸分子、発現カセット、または発現ベクターは抗原をコードする。例えば、いくつかの実施形態において、（ａ）細菌に対して天然であるシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており、および（ｂ）抗原をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子を細菌に導入してワクチンを生じさせ、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）抗原をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子は細菌に導入されて、ワクチンを生じ、ここに、該組換え核酸分子はシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、細菌に導入されてワクチンを生じる組換え核酸分子は、（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）該第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある抗原をコードする第二のポリヌクレオチドであり、ここに、該組換え核酸分子は非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよび抗原を共に含む融合タンパク質をコードする。ワクチンを生じさせるのに用いられる組換え核酸分子は、ある実施形態において、（ａ）細菌自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種をコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；を含む組換え核酸分子であり、ここに、該組換え核酸分子は非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドが自己溶解素、またはその触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種であるか、あるいは自己溶解素、または触媒的に活性なフラグメントまたは触媒的に活性な変種内に挿入されたタンパク質キメラをコードする。いくつかの他の実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含むワクチンを生産する方法が提供され、これはポリシストロニック発現カセットをＬｉｓｔｅｒｉａ細菌に導入して、ワクチンを生じさせることを含み、ここに、該ポリシストロニック発現カセットは少なくとも２つの区別される非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチドをコードし、ここに、ポリペプチドの少なくとも１つは抗原である。

本発明の組換え核酸分子、発現カセット、ベクター、細菌および／または組成物のいずれかを含むキットも提供される。

（Ｘ．使用の方法）
宿主において免疫応答を誘導し、および／または状態を予防しまたは治療するための、本明細書中に記載された組換え細菌または医薬、免疫原性またはワクチン組成物を用いる種々の方法が提供される。いくつかの実施形態において、治療されまたは予防される状態は疾患である。いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態において、疾患は感染症である。加えて、組換え細菌は哺乳動物タンパク質のような異種タンパク質の生産および単離でも有用である。

本明細書中で用いるように、（状態または疾患に関して）「治療」または「治療する」は、好ましくは臨床的結果を含めた、有利なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、疾患に関する有利なまたは所望の結果は、限定されるものではないが、以下の：疾患に関連する状態の改善、疾患の治癒、疾患の重症度の軽減、疾患の進行の遅延、疾患に関連する１以上の兆候の軽減、疾患に罹った者の生活の質の増大、および／または生存の延長の１以上を含む。同様に、本発明の目的では、状態に関して有利なまたは所望の結果は、限定されるものではないが、以下の：状態の改善、状態の治癒、状態の重症度の軽減、状態の進行の遅延、状態に関連する１以上の兆候の軽減、状態に罹った者の生活の質の向上、および／または生存の延長の１以上を含む。例えば、本明細書中に記載された組成物が癌の治療で用いられる実施形態において、有利なまたは所望の結果は、限定されるものではないが、以下の：新形成または癌細胞の増殖の低下（または破壊）、癌で見出された新形成細胞の転移の低下、腫瘍のサイズの縮み、癌に由来する兆候の減少、癌に罹った者の生活の質の向上、疾患を治療するのに必要な他の投薬の用量の減少、癌の進行の遅延、および／または癌を有する患者の生存の遅延の１以上である。

本明細書中で用いるように、用語疾患を「予防する」または疾患からの「宿主の保護」（本明細書中では相互交換的に用いられる）は、限定されるものではないが、以下の：疾患の開始または進行の停止、遅延、邪魔、遅くすること、遅らせることおよび／または遅らせ、疾患の進行の安定化、および／または疾患の発生の遅延の１以上を含む。用語状態を「予防する」または状態から「宿主を保護する」（本明細書中では相互交換的に用いられる）は、限定されるものではないが、以下の：状態の開始または進行の停止、遅延、邪魔、遅くすること、遅らせることおよび／または遅らせ、疾患の進行の安定化、および／または疾患の発生の遅延の１以上を含む。本発明の期間は、疾患または状態の履歴および／または治療すべき個体に依存して、種々の長さの時間であり得る。例えば、病原体によって引き起こされた感染症に対して予防または保護するようにワクチンが設計される場合、用語疾患を「遅延し」または疾患から「宿主を保護する」は、限定されるものではないが、以下の：宿主の病原体による感染、宿主の病原体による感染の進行、または病原体による宿主の感染に関連する疾患の開始または進行の停止、遅延、邪魔、遅くすること、遅らせることおよび／または遅らせ、および／または病原体による宿主の感染に関連する疾患の進行の安定化を含む。また、例として、ワクチンの抗−癌ワクチンである場合、用語疾患を「予防する」または疾患から「宿主を保護する」は、限定されるものではないが、以下の：癌または転移の発生、癌の進行、または癌の再発の停止、遅延、邪魔、遅くすること、遅らせることおよび／または遅らせの１以上を含む。

１つの態様において、本発明は宿主に有効量の本明細書中に記載された組換え細菌を含む組成物（例えば、薬学的組成物、免疫原性組成物またはワクチン）（例えば、前記発明の概要、詳細な記載のセクションＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸ、または以下の実施例参照）を投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供する。いくつかの実施形態において、組換え細菌における組換え核酸、発現カセット、および／または発現ベクターによってコードされるポリペプチドは抗原を含むか、または抗原を含む融合タンパク質またはタンパク質キメラである。

例えば、１つの態様において、本発明は宿主に有効量の組換え細菌を含む組成物を投与することを含む抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここに、該組換え細菌は以下の：（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており；（ｂ）抗原をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；および（ｃ）当該発現カセットはシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。

もう１つの態様において、本発明は、宿主に有効量の発現カセットを含む組換え細菌を含む組成物を投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここに、該発現カセットは以下の：（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある抗原をコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）当該発現カセットがシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

なおもう１つの態様において、本発明は宿主に有効量の核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与することを含む、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここに、該核酸分子は以下の：（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ抗原をコードし、かつＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されているポリヌクレオチド；および（ｂ）抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

もう１つの態様において、本発明は、以下の（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにある抗原をコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）第一および第二のポリヌクレオチド双方に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む組み換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌の有効量を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここに、該発現カセットは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよびポリペプチド双方を含む融合タンパク質をコードする。

本明細書中に記載された免疫応答を誘導する方法のいくつかの実施形態において、細菌は薬学的組成物、免疫原性組成物および／またはワクチン組成物の形態で投与される。

いくつかの実施形態において、免疫応答はＭＨＣクラスＩ免疫応答である。他の実施形態において、免疫応答はＭＨＣクラスＩＩ免疫応答である。なお他の実施形態において、細菌または組成物の投与によって誘導される免疫応答はＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ応答の双方である。従って、いくつかの実施形態において、免疫応答はＣＤ４＋Ｔ−細胞応答を含む。いくつかの実施形態において、免疫応答はＣＤ８＋Ｔ−細胞応答を含む。いくつかの実施形態において、免疫応答はＣＤ４＋Ｔ−細胞応答ＣＤ８＋Ｔ−細胞応答を共に含む。いくつかの実施形態において、免疫応答はＢ−細胞応答および／またはＴ−細胞応答を含む。Ｂ−細胞応答は、当業者に知られた方法を用い、抗原に対して向けられた抗体の力価を決定することによって測定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組成物によって誘導される免疫応答は液性応答である。他の実施形態において、誘導される免疫応答は細胞性免疫応答である。いくつかの実施形態において、免疫応答は細胞性および液性双方の免疫応答を含む。いくつかの実施形態において、免疫応答は抗原特異的である。いくつかの実施形態において、免疫応答は抗原特異的Ｔ−細胞応答である。

免疫応答を誘導する方法の提供に加えて、本発明は宿主（例えば、ヒト患者のような対象）において状態を予防または治療する方法も提供する。いくつかの実施形態において、状態は疾患である。該方法は宿主に有効量の本明細書中に記載された組換え細菌、または本明細書中に記載された組換え細菌を含む組成物（例えば、前記発明の概要、詳細な記載のセクションＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸ、または以下の実施例参照）を投与することを含む。いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態において、疾患は感染症である。

例えば、１つの態様において、本発明は宿主に有効量の細菌を含む組成物を投与することを含む、宿主において疾患（または状態）を予防または治療する方法を提供し、ここに、該細菌は以下の：（ａ）シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、ここに、該第一のポリヌクレオチドは細菌において発現につきコドン最適化されており；（ｂ）ポリペプチド（例えば、抗原および／または治療哺乳動物タンパク質）をコードする第二のポリヌクレオチド、ここに、該第二のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあり；および（ｃ）シグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質を発現カセットがコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。

もう１つの態様において、本発明は宿主に有効量の組換え細菌を含む組成物を投与することを含む、宿主において疾患（状態）を予防または治療する方法を提供し、ここに、該細菌は発現カセットを含み、ここに、該発現カセットは以下の：（ａ）非ｓｅｃＡ１細菌シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチド（例えば、抗原および／または哺乳動物タンパク質）をコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）当該発現カセットがシグナルペプチドおよび抗原を含む融合タンパク質をコードするように、第一および第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

なおもう１つの態様において、本発明は宿主に有効量の核酸分子を含む組み換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物を投与することを含む、宿主において疾患（または状態）を予防または治療する方法を提供し、ここに、該核酸分子は：（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌポリペプチド（例えば、抗原および／または治療哺乳動物タンパク質）をコードし、かつＬｉｓｔｅｒｉａにおいて発現につきコドン最適化されているポリヌクレオチド；および（ｂ）抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

もう１つの態様において、本発明は、（ａ）非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド；（ｂ）第一のポリヌクレオチドと同一の翻訳リーディングフレームにあるポリペプチド、（抗原および／または治療哺乳動物タンパク質）をコードする第二のポリヌクレオチド；および（ｃ）第一および第二の双方のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ細菌を含む組成物の有効量を宿主に投与することを含む、宿主において疾患（または状態）を予防または治療する方法を提供し、ここに、該発現カセットは非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。

いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態において、治療または予防すべき状態が癌である場合、該疾患はメラノーマ、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、結直腸癌、肺癌、脳癌、精巣癌、卵巣癌、扁平細胞癌、胃腸癌、頸部癌、腎臓癌、甲状腺癌または前立腺癌である。いくつかの実施形態において、癌はメラノーマである。いくつかの実施形態において、癌は膵臓癌である。いくつかの実施形態において、癌は結腸癌である。いくつかの実施形態において、癌は前立腺癌である。いくつかの実施形態において、癌は転移性である。

他の実施形態において、疾患は自己免疫疾患である。なお他の実施形態において、疾患は感染症、またはウイルス、細菌、真菌または原生動物のような病原体によって引き起こされたもう１つの疾患である。いくつかの実施形態において、疾患は感染症である。

いくつかの実施形態において、癌の予防または治療における組換え細菌の使用は、存在する、または個体が環境暴露および／または家族的特性のような増大した危険因子を有する癌を予防または治療するための組換え細菌の個体の免疫系の細胞への送達を含む。他の実施形態において、癌の予防または治療における組換え細菌の使用は、腫瘍が除去された、または過去に癌を有した、しかし現在緩解中である個体への組換え細菌の送達を含む。

いくつかの実施形態において、宿主への本明細書中に記載された組換え細菌を含む組成物の投与は宿主においてＣＤ４＋Ｔ−細胞応答を誘導する。いくつかの他の実施形態において、宿主への本明細書中に記載された組換え細菌を含む組成物の投与は、宿主においてＣＤ８＋Ｔ−細胞応答を誘導する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え細菌を含む組成物の投与は、宿主においてＣＤ４＋Ｔ−細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ−細胞応答を共に誘導する。

状態の治療用のワクチンまたは他の組成物の効力は個体、例えば、マウスにおいて評価することができる。マウスモデルはヒトにおける効力に対するモデルとして認識されており、本発明のワクチンを評価し、規定するのに有用である。該マウスモデルを用いて、いずれかの個体におけるワクチンの有効性の潜在能力を示す。ワクチンは、特定の疾患に対する予防的または治療的効果いずれかを供するそれらの能力につき評価することができる。例えば、感染症の場合には、マウスの集団を所望の量の本発明の適当なワクチンでワクチン接種することができ、ここに、組換え細菌は感染症関連抗原を発現する。マウスは引き続いてワクチン抗原に関連する感染剤で感染させ、感染に対する保護につき評価することができる。感染症の進行は、（ワクチン接種していないか、またはビークルのみ、または適当な抗原を含まない細菌でワクチン接種した）コントロール集団に対して観察することができる。

癌ワクチンの場合には、腫瘍細胞モデルが利用でき、そこでは、所望の腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞系を、所望の腫瘍抗原を含有する本発明の細菌を含む組成物でのワクチン接種の前（治療モデル）または後（または予防モデル）いずれかにマウスの集団に注射することができる。腫瘍抗原を含有する組換え細菌でのワクチン接種を、ワクチン接種していない、ビークルをワクチン接種した、または無関係抗原を発現する組換え細菌でワクチン接種したコントロール集団と比較することができる。そのようなモデルにおけるワクチンの有効性は、腫瘍注射後の時間の関数として腫瘍容量の点で、腫瘍注射後の時間の関数として生存集団の点で評価することができる（例えば、実施例３１Ｄ）。１つの実施形態において、組換えワクチンを含む組成物でワクチン接種したマウスにおける腫瘍容量は、ワクチン接種していないか、またはビークル、または無関係抗原を発現する細菌でワクチン接種したマウスにおける腫瘍容量よりも約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％または約１００％低い。もう１つの実施形態において、腫瘍容量におけるこの差は、腫瘍のマウスへのインプラントから少なくとも約１０、約１７、または約２４日に観察される。１つの実施形態において、組換え細菌を含む組成物でワクチン接種したマウスにおけるメジアン生存時間は、ワクチン接種していない、またはビークル、または無関係抗原を発現する細菌でワクチン接種したマウスにおけるよりも少なくとも約２、約５、約７または少なくとも約１０日長い。

本明細書中に記載された方法における宿主（すなわち、対象）はいずれかの脊椎動物、好ましくは哺乳動物であり、家畜動物、スポーツ動物、およびヒトを含めた霊長類である。いくつかの実施形態において、宿主は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、宿主はヒトである。

組換え細菌、または該株を含む組成物の送達は皮内、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、リンパ内、経口または鼻腔内、ならびにいずれかの与えられた悪性または感染症または他の状態に関連するいずれかの経路のようないずれかの適当な方法によることができる。

組換え細菌および免疫刺激剤を含む組成物を同時に、順次にまたは別々に宿主に投与することができる。免疫刺激剤の例は、限定されるものではないが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−１５、Ｂ７．１、Ｂ７．２、およびＢ７−ＤＣおよびＩＬ−１４を含む。刺激剤のさらなる例は前記セクションＩＸに供される。

本明細書中で用いるように、細菌または（薬学的組成物または免疫原性組成物のような）組成物の「有効量」は、有利なまたは所望の結果を実現するのに十分な量である。予防的使用では、有利なまたは所望の結果は、疾患の危険性の排除または低下、重症度の低下、または開始の遅延のような結果を含み、これは、疾患の生化学的、組織学的および／または挙動的兆候、疾患の発生の間に示される合併症および中間的病理学的表現型を含む。治療的使用では、疾患の阻害または抑制、疾患から由来する１以上の兆候の減少（生化学的、組織学的および／または挙動的）のような臨床的結果を含み、これは、疾患の発生の間に示されるその合併症および中間的病理学的表現型、疾患に罹った者の生活の質の増大、疾患を治療するのに必要な他の投薬の容量の減少、もう１つの投薬の効果の増強、疾患の進行の遅延、および／または患者の生存の延長を含む。有効量は１以上の投与で投与することができる。本発明の目的では、有効量の薬物、化合物、または薬学的組成物は予防的または治療的処置を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。臨床的意味で理解されるように、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量は、もう１つの薬物、化合物、または薬学的組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。かくして、有効量は１以上の治療剤を投与する意味で考えることができ、単一の剤は、もし１以上の他の剤と組み合わせて、所望の結果が達成でき、または達成されるならば有効量で与えられると考えることができる。

いくつかの実施形態において、癌の治療的処置では、有効量は所望の免疫応答をもたらす量を含み、ここに、免疫応答は標的化腫瘍の成長を遅らせ、腫瘍のサイズを低下させ、あるいは好ましくは腫瘍を完全に排除する。ワクチンの投与は適切な間隔で反復することができ、ワクチン接種した個体において複数の区別される部位において同時に投与することができる。いくつかの実施形態において、癌の予防的処置では、有効量は、癌を発生する個体の尤度が有意に低下するような、保護的免疫応答をもたらす用量を含む。ワクチン接種計画は単一の用量よりなることができ、あるいは保護的免疫応答が確立されるまで適切な間隔で反復することができる。

いくつかの実施形態において、癌についての個体の治療的処置は初期処置として癌と診断された個体で開始することができるか、あるいは他の処置と組み合わせて用いることができる。例えば、外科的に腫瘍が除去され、または放射線療法で、あるいは化学療法によって処置された個体をワクチンで処理して、個体においていずれの残存する腫瘍も低下させまたは排除し、あるいは癌の再発の危険性を低下させることができる。いくつかの実施形態において、癌についての個体の予防的処置は、環境的条件または遺伝的素因いずれかのため、ある種の癌を招く増大した危険性を有する個体で開始されるであろう。

宿主に与えられた薬学的組成物またはワクチンの用量は宿主の種、宿主のサイズ、および宿主の状態または疾患に応じて変化するであろう。組成物の用量は、組成物の投与の頻度、および投与の経路にも依存するであろう。正確な用量は治療すべき患者を考慮して個々の意思によって選択される。

いくつかの実施形態において、該方法で用いる薬学的組成物、免疫原性組成物、またはワクチンは本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターを含む組換え細菌を含む。いくつかの実施形態において、組換え細菌はその各々がここに引用してその全体が援用される、２００４年６月３０日に出願されたＴｈｏｍａｓＷ．Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．ｅｔａｌ．による「ＭｏｄｉｆｉｅｄＦｒｅｅ−ＬｉｖｉｎｇＭｉｃｒｏｂｅｓ，ＶａｃｃｉｎｅＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｏｆＵｓｅＴｈｅｒｅｏｆ」と題された米国特許出願第１０／８８３，５９９号、米国特許公開番号２００４／０２２８８７７および米国特許公開番号２００４／０１９７３４３に記載されたもののような修飾されたおよび／または変異体細菌である。いくつかの実施形態において、そのような修飾されたおよび／または変異体細菌または本明細書中に記載された他の組換え細菌のいずれかを含む薬学的組成物またはワクチンの単一用量は約１０^２ないし約１０^１２の細菌生物を含む。もう１つの実施形態において、単一用量は約１０^５ないし約１０^１１の細菌生物を含む。もう１つの実施形態において、単一用量は約１０^６ないし約１０^１１の細菌生物を含む。なおもう１つの実施形態において、薬学的組成物またはワクチンの単一用量は約１０^７ないし約１０^１０の細菌生物を含む。なおもう１つの実施形態において、薬学的組成物またはワクチンの単一用量は約１０^７ないし約１０^９の細菌生物を含む。

いくつかの実施形態において、単一用量は少なくとも約１×１０^２細菌生物を含む。いくつかの実施形態において、組成物の単一用量は少なくとも約１×１０^５生物を含む。もう１つの実施形態において、組成物またはワクチンの単一用量は少なくとも約１×１０^６細菌生物を含む。なおもう１つの実施形態において、組成物またはワクチンの単一用量は少なくとも約１×１０^７の細菌生物を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された組換え、修飾されたおよび／または変異体細菌を含む薬学的組成物、免疫原性組成物、またはワクチンの単一用量は約１ＣＦＵ／ｋｇないし約１×１０^１０ＣＦＵ／ｋｇ（ＣＦＵ＝コロニー形成単位）を含む。いくつかの実施形態において、組成物の単一用量は約１０ＣＦＵ／ｋｇないし約１×１０^９ＣＦＵ／ｋｇを含む。もう１つの実施形態において、組成物またはワクチンの単一用量は約１×１０^２ＣＦＵ／ｋｇないし約１×１０^８ＣＦＵ／ｋｇを含む。なおもう１つの実施形態において、組成物またはワクチンの単一用量は約１×１０^３ＣＦＵ／ｋｇないし約１×１０^８ＣＦＵ／ｋｇを含む。なおもう１つの実施形態において、組成物またはワクチンの単一用量は約１×１０^４ＣＦＵ／ｋｇないし約１×１０^７ＣＦＵ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、組成物の単一用量は少なくとも約１ＣＦＵ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、組成物の単一用量は少なくとも約１０ＣＦＵ／ｋｇを含む。もう１つの実施形態において、組成物またはワクチンの単一用量は少なくとも約１×１０^２ＣＦＵ／ｋｇを含む。なおもう１つの実施形態において、組成物またはワクチンの単一用量は少なくとも約１×１０^３ＣＦＵ／ｋｇを含む。なおもう１つの実施形態において、組成物またはワクチンの単一用量は少なくとも約１×１０^４ＣＦＵ／ｋｇを含む。

いくつかの実施形態において、ヒトのような１の宿主についての適切な（すなわち、効果的な）投与量は、当業者に知られた方法を用い、マウスのようなもう１つの宿主についてのＬＤ_５０から外挿することができる。

いくつかの実施形態において、薬学的組成物、免疫原性組成物、またはワクチンは、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセットおよび／または発現ベクターを含む組換え細菌で感染されている、樹状細胞のような抗原提示細胞を含む。いくつかの実施形態において、細菌は修飾されておりおよび／またはその各々をここに引用してその全体を援用する、２００４年６月３０日に出願された米国特許出願第１０／８８３，５９９号、および米国特許公開番号２００４／０２２８８７７およびＵＳ２００４／０１９７３４３に記載されたもののような変異体である。そのような抗原―提示細胞をベースとするワクチンは、例えば、以下の：その各々を、ここに引用してその全体を援用する、２００４年７月２３日に出願されたＴｈｏｍａｓＷ．Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．ｅｔａｌ．による「Ａｎｔｉｇｅｎ−ＰｒｅｓｅｎｔｉｎｇＣｅｌｌＶａｃｃｉｎｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｏｆＵｓｅＴｈｅｒｅｏｆ」なる発明の名称の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／２３８８１；２００４年６月３０日に出願された米国特許出願第１０／８８３，５９９号；米国特許公開番号２００４／０２２８８７７；および米国特許公開番号ＵＳ２００４／０１９７３４３に記載されている。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されたもののような細菌を含む抗原提示細胞をベースとするワクチンの個々の投与量は約１×１０^３ないし約１×１０^１０抗原提示細胞を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンの個々の投与量は約１×１０^５ないし約１×１０^９抗原提示細胞を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンの個々の投与量は約１×１０^７ないし約１×１０^９抗原提示細胞を含む。

いくつかの実施形態において、投与単位の複数投与が、１日において、または週または月または年または数年の間にわたって好ましい。いくつかの実施形態において、投与単位は複数の日の間毎日１回、または複数週の間集に１回投与される。

本発明は、さらに、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するための医薬の製造における本明細書中に記載されたいずれかの組換え細菌（すなわち、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、またはベクターを含むいずれかの細菌）の使用を提供し、ここに、細菌中の組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターによってコードされたポリペプチドは抗原を含む。いくつかの実施形態において、抗原は異種抗原である。本発明は、宿主における状態（例えば、癌または感染症のような疾患）を予防または治療するための医薬の製造における、本明細書中に記載された組換え細菌の使用も提供する。本発明は、さらに、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導するのに用いられる本明細書中に記載された組換え細菌を提供し、ここに、細菌中の組換え核酸分子、発現カセット、および／またはベクターによってコードされたポリペプチドは抗原を含む。本発明は、さらに、宿主における（疾患のような）状態の予防または治療で用いられる本明細書中に記載された組換え細菌を提供する。

また、本発明は、本明細書中に記載された細菌を抗原提示細胞と接触させることを含み、抗原提示細胞へのＭＨＣクラスＩ抗原の提示またはＭＨＣクラスＩＩ抗原の提示を誘導する方法を提供する。

本発明は、さらに、以下の工程：（ａ）適当な条件下にて、抗原提示細胞を負荷するのに十分な時間の間、本明細書中に記載された組換え細菌を宿主からの抗原提示細胞と接触させ；次いで、（ｂ）抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供する。

組換え核酸分子、発現カセット、および細菌の他の可能な使用は当業者によって認識されるであろう。例えば、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、ベクター、および組換え細菌（および他の宿主細胞）は異種ポリペプチドの生産および単離で有用である。従って、別の態様において、本発明は（ａ）本明細書中に記載された発現カセットまたはベクターを（例えば、トランスフェクション、形質転換、またはコンジュゲーションを介して）細菌に導入し；次いで、（ｂ）タンパク質発現に適した条件下で培養中の細菌を成長させることを含む、細菌においてポリペプチドを発現させる方法を提供する。もう１つの別の態様において、本発明は以下の：（ａ）本明細書中に記載された発現カセットまたはベクターを（例えば、トランスフェクション、形質転換、またはコンジュゲーションを介して）細菌に導入し；（ｂ）タンパク質発現に適した条件下で細胞培養中の細菌を成長させ；次いで、（ｃ）細菌細胞培養からタンパク質を単離することを含み、単離されたポリペプチドを生産する方法を提供する。形質転換、トランスフェクション、およびコンジュゲーションの適当な方法は、細菌を培養し、成長させ、次いで、細胞培養から分泌されたまたは分泌されないタンパク質を単離する方法のように、当業者によく知られている。

以下の実施例は、本発明を説明するために掲げるものであり、それを限定するものではない。

（実施例１例示的変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の調製）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は１０４０３Ｓに由来した（Ｂｉｓｈｏｐｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２００５（１９８７））。示された遺伝子のイン−フレーム欠失を持つＬｉｓｔｅｒｉａ株を、確立された方法でのＳＯＥ−ＰＣＲおよび対立遺伝子交換によって作成した（Ｃａｍｉｌｌｉ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３（１９９３））。変異体株ＬＬＯＬ４６１Ｔ（ＤＰ−Ｌ４０１７）は、ここに引用して援用する、Ｇｌｏｍｓｋｉ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５６：１０２９（２００２）に記載されていた。ａｃｔＡ^−１変異体（ＤＰ−Ｌ４０２９）は、そのプロファージがキュアリングされた、ここに引用してその全体が援用される、Ｓｋｏｂｌｅｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，１５０：５２７−５３７（２０００）に記載されたＤＰ−Ｌ３０７８株である。（プロファージキュアリングは（Ｌａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７（２００２）；米国特許公開番号２００３／０２０３４７２）に記載されている）。ａｃｔＡ⁻ｕｖｒＡＢ⁻株の構築は、２００３年２月６日に出願された米国仮出願第６０／４４６，０５１号に、Ｌ４０２９／ｕｖｒＡＢ（例えば、その出願の実施例７参照）、ならびに米国特許公開番号２００４／０１９７３４３に記載されている。ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ（ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓａｃｔＡ⁻／ｕｖｒＡＢ⁻二重欠失変異体）は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定の下で、２００３年１０月３日に、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０−２２０９，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａのＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＰＴＡ−５５６３が与えられた。変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａに関するさらなる記載は、その各々をここに引用してその全体を援用する、以下の出願または刊行物に供される：米国特許公開番号２００４／０２２８８７７；米国特許公開番号ＵＳ２００４／０１９７３４３；２００４年７月２３日に出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／２３８８１；および２００４年６月３０日に出願された米国特許出願第１０／８８３，５９９号。加えて、例示的Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定の下で、２００３年１０月３日に、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０−２２０９，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａのＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＰＴＡ−５５６２が与えられた。

Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおいて遺伝子を欠失して、減弱化された変異体を作成する方法の１つの非限定的例は以下の実施例２４に供される。

（実施例２ＡＨ１／ＯＶＡまたはＡＨ１−Ａ５／ＯＶＡを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の構築）
モデル抗原オボアルブミン（ＯＶＡ）の切形形態、ＡＨ１として知られたマウス結直腸癌（ＣＴ２６）からの免疫優性エピトープ（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号：７２））、および改変されたエピトープＡＨ１−Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号：７３）；Ｓｌａｎｓｋｙｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：５２９−５３８（２０００））を発現する変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を調製した。ｐＰＬ２組込みベクター（Ｌａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７（２００２）；米国特許公開番号２００３／０２０３４７２）を用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムの無害部位に組み込まれた単一コピーを含有するＯＶＡおよびＡＨ１−Ａ５／ＯＶＡ組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を誘導した。

（Ａ．ＯＶＡ−発現Ｌｉｓｔｅｒｉａ（ＤＰ−Ｌ４０５６）の構築）
切形ＯＶＡと融合し、ｐＰＬ２組込みベクター（ｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡ）に含まれたヘモリシン−欠失ＬＬＯよりなる抗原発現カセットをまず調製する。Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡワクチン株は、ｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡをＰＳＡ（ＳｃｏｔｔＡからのファージ）付着部位ｔＲＮＡ^Ａｒｇ−ａｔｔＢＢ’においてファージ−キュアリングされたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６に導入することによって誘導される。

ＰＣＲを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いてヘモリシン−欠失ＬＬＯを増幅させる：
源：ＤＰ−Ｌ４０５６ゲノムＤＮＡ
プライマー：
順方向（ＫｐｎＩ−ＬＬＯｎｔｓ．１２５７−１２７６）：

（Ｔ_ｍ：ＬＬＯ−ｓｐｅｃ．５２℃ 総じて：８０℃）
逆方向（ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−ＬＬＯｎｔｓ．２８１１−２７９２）：

（Ｔ_ｍ：ＬＬＯ−ｓｐｅｃ．：５２℃：総じて：１０２℃）。

また、ＰＣＲを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いて切形されたＯＶＡを増幅する：
源：ＤＰ−Ｅ３６１６Ｅ．ｃｏｌｉからのｐＤＰ３６１６プラスミドＤＮＡ（Ｈｉｇｇｉｎｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｏｌｂｉｏｌ．３１：１６３１−１６４１（１９９９））
プライマー：
順方向（ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩＯＶＡｃＤＮＡｎｔｓ．１７４−１８６）：

Ｔ_ｍ：ＯＶＡ−ｓｐｅｃ：６０℃ 総じて：８８℃）
逆方向（ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）：

（Ｔ_ｍ：総じて：８２℃）
該構築プロセスを完成させるための１つのプロトコルは、まず、ＬＬＯアンプリコンをＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩベクターをｐＰＬ２ベクター（ｐＰＬ２−ＬＬＯ）に挿入することを含む。次いで、ＯＶＡアンプリコンをＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで切断してあるｐＰＬ２−ＬＬＯに挿入する。（注意：ｐＰＬ２ベクターはいずれのＸｈｏＩ部位も含有せず；ｐＤＰ−３６１６は、ＯＶＡ逆方向プライマー設計で利用される１つのＸｈｏＩ部位を含む）。構築体ｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡは制限分析（ＫｐｎＩ−ＬＬＯ−ＸｈｏＩ−ＯＶＡ−ＮｏｔＩ）および配列決定によって確認する。Ｌａｕｅｒｅｔａｌ．によって正確に記載されているように、形質転換、続いてのコンジュゲーションによるＬｉｓｔｅｒｉａ（ＤＰ−Ｌ４０５６）への、（またはｉｎｌＢ⁻変異体またはｉｎｌＢ⁻ａｃｔＡ⁻二重変異体のようなＬｉｓｔｅｒｉａのもう１つの望まれる株への）導入および取り込みによって、プラスミドｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡをＥ．ｃｏｌｉに導入する。

（Ｂ．ＡＨ１／ＯＶＡまたはＡＨ１−Ａ５／ＯＶＡを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の構築）
ＡＨ１／ＯＶＡまたはＡＨ１−Ａ５／ＯＶＡ抗原配列いずれかを発現するＬｉｓｔｅｒｉａを調製するために、抗原を担うインサートを、まず、オリゴヌクレオチドから調製し、次いで、（前記したように調製された）ベクターｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡに連結させる。

以下のオリゴヌクレオチドをＡＨ１またはＡＨ１−Ａ５インサートの調製で用いる：
ＡＨ１エピトープインサート（ＣｌａＩ−ＰｓｔＩ適合末端）：

与えられたエピトープについてのオリゴヌクレオチド対を等モル比率にて一緒に混合し、９５℃にて５分間加熱する。次いで、オリゴヌクレオチド混合物をゆっくりと放冷する。次いで、アニールされたオリゴヌクレオチドを、関連制限酵素での消化によって調製されたｐＰＬ２−ＬＬＯ／ＯＶＡプラスミドと２００／１モラー比で連結させる。新しい構築体の同一性は制限分析および／または配列決定によって確認することができる。

次いで、Ｌａｕｅｒｅｔａｌ．によって正確に記載されているように、形質転換、続いてのコンジュゲーションによるＬｉｓｔｅｒｉａ（ＤＰ−Ｌ４０５６）への、あるいはａｃｔＡ−変異体株（ＤＰ−Ｌ０４２９）、ＬＬＯＬ４６１Ｔ株（ＤＰ−Ｌ４０１７）、またはａｃｔＡ⁻／ｕｖｒＡＢ⁻株（ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ）のようなＬｉｓｔｅｒｉａのもう１つの望まれる株への導入および取り込みによって、プラスミドをＥ．ｃｏｌｉに導入することができる。

（実施例３Ｌｉｓｔｅｒｉａポリヌクレオチドおよび発現カセットエレメントの構築）
（Ａ．クローニングベクター）
選択された異種抗原発現カセット分子構築体をｐＰＬ２（Ｌａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２）、またはｐＡＭ４０１（Ｗｉｒｔｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：８３１−８３６）に挿入し、ｐＰＬ２の多重クローニング配列（ＡａｔＩＩ小フラグメント、１７１ｂｐ）を含むように修飾し、テトラサイクリン耐性遺伝子（ｐＡＭ４０１−ＭＣＳ、図３２）内の、平滑化ＸｂａＩおよびＮｒｕＩ認識部位間に挿入した。一般に、ｈｌｙプロモーターおよび（選択された）シグナルペプチド配列を、ｐＰＬ２またはｐＡＭ４０１−ＭＣＳプラスミドベクター中のユニークなＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。（時々、Ｎ−末端およびＣ−末端エピトープタグを含有するように修飾された；後の記載参照）選択されたＥｐｈＡ２遺伝子を、引き続いて、ユニークなＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ部位の間のこれらの構築体にクローン化した。ｐＡＭ４０１−ＭＣＳプラスミドベクターに基づく分子構築体を、当業者にとって通常の方法を利用し、リソソームでも処理された選択されたＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株にエレクトロポレーションによってエレクトロポレーションによって導入した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ−トランスフェクタント中の予測されるプラスミド構造は、制限酵素分析によって、クロラムフェニコール−含有ＢＨＩ寒天プレート（１０μｇ／ｍＬ）上に形成されたコロニーからＤＮＡを単離することによって確認した。種々のｐＡＭ４０１−ＭＣＳベースの異種タンパク質発現カセット構築体で形質転換された組換えＬｉｓｔｅｒｉａを利用して、後に記載するように、異種タンパク質の発現および分泌を測定した。

従前に記載されている方法に従って［Ｌａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４，４１７７−４１８６（２００２）］、ｐＰＬ２ベースの異種タンパク質発現カセット構築体を、選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノム中のｔＲＮＡ^Ａｒｇ遺伝子に組み込んだ。簡単に述べると、ｐＰＬ２異種タンパク質発現カセット構築体プラスミド、まず、エレクトロポレーションによって、または化学的方法によって、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株ＳＭ１０（Ｓｉｍｏｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１：７８４−７９１（１９８３））へ導入した。引き続いて、コンジュゲーションによって、ｐＰＬ２ベースのプラスミドを、形質転換されたＳＭ１０から選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株に移した。記載されたように、ｍＬ当たり７．５μｇのクロラムフェニコールおよびｍＬ当たり２００μｇのストレプトマイシンを含有する薬物−選択的ＢＨＩ寒天プレートでのインキュベーションに続き、同一組成を持つプレートで３回継代することによって、選択されたコロニーを精製する。ファージ付着部位におけるｐＰＬ２ベクターの取り込みを確認するために、個々のコロニーを拾い、順方向プライマーＮＣ１６

および逆方向プライマーＰＬ９５

のプライマー対を用いるＰＣＲによってスクリーニングする。選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノム中のｔＲＮＡ^Ａｒｇ遺伝子に組み込まれたｐＰＬ２ベースのプラスミドを有する選択されたコロニーにより、４９９ｂｐの診断ＤＮＡアンプリコンを得た。

（Ｂ．プロモーター）
異種タンパク質発現カセットは、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）をコードする遺伝子の転写を駆動し、かつ感染された細胞のミクロ環境内で活性化されるｐｒｆＡ依存性ｈｌｙプロモーターを含有した。ヌクレオチド２０５５８６−２０６０００（４１４ｂｐ）は、後に示すプライマー対を用い、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６からＰＣＲによって増幅した。増幅された領域はｈｌｙプロモーター、また、ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（前記参照）およびＰＥＳＴドメインを含むＬＬＯの最初の２８アミノ酸を含む。Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤについてのこの領域の予測される配列はＧｅｎＢａｎｋ（受託番号：ｇｉ｜１６８０２０４８｜ｒｅｆ｜ＮＣ００３２１０．１｜［１６８０２０４８］）に見出すことができる。ＰＣＲ反応で用いるプライマーは次の通りである：

（制限エンドヌクレアーゼ認識部位に下線を施す）。

製造業者の仕様に従って、４２２ｂｐＰＣＲアンプリコンをプラスミドベクターｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ｈｌｙプロモータープラスミドクローンにおけるＬｉｓｔｅｒｉａ特異的塩基のヌクレオチド配列を決定した。Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６は、ＥＧＤ株と比較して、ｈｌｙプロモーターにおけるｐｒｆＡボックスに近接する８つのヌクレオチド塩基変化を含んだ。ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０５６およびＥＧＤ株についてのｈｌｙプロモーター整列を以下の図１に示す。

当業者に良く知られた慣用的方法に従い、ｈｌｙプロモーターおよびｓｅｃＡ１ＬＬＯシグナルペプチドに対応する４２２ｂｐＤＮＡを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩでの消化によってｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ｈｌｙプロモータープラスミドクローンから遊離させ、ｐＰＬ２プラスミドベクター（Ｌａｕｅｒｅｔａｌ．２００２Ｊ．Ｂａｃｔ．）にクローン化した。このプラスミドはｐＰＬ２−ｈｌｙＰ（天然）として知られている。

（Ｃ．シャイン−ダルガルノ配列）
プロモーターの３’末端には、異種遺伝子ＲＮＡ転写体への（１６ＳｒＲＮＡを介する）３０Ｓリボソームサブユニットの係合、および翻訳の開始に必要なエレメントであるポリ−プリンシャイン−ダルガルノ配列が含まれる。シャイン−ダルガルノ配列は、典型的には、以下のコンセンサス配列：

を有する。ポリ−プリンシャイン−ダルガルノ配列の変形がある。注目すべきは、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）をコードするＬｉｓｔｅｒｉａｈｌｙ遺伝子は以下のシャイン−ダルガルノ配列を有する：

（シャイン−ダルガルノ配列に下線を施し、翻訳開始コドンは太文字とする）。

（実施例４ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯ）およびヒトＥｐｈＡ２を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）
ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯシグナルペプチド）に融合した全長ヒトＥｐｈＡ２抗原をコードする発現カセットの配列、＋ＬＬＯＰＥＳＴ配列を図２に示す。この発現カセットによってコードされる融合タンパク質のアミノ酸配列を図３に示す。

（実施例５ヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメイン（ＥＸ２）のコドン最適化）
ヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメイン（アミノ酸２５ないし５２６）をコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。ヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメインをコードする天然ヌクレオチド配列を図４に示す。Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける最適コドン用法についてのヌクレオチド配列を図５に示す。ヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列を図６に示す。

（実施例６ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯ）およびｈｕＥｐｈＡ２の細胞外ドメイン（ＥＸ２）を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）
（Ａ．コドン最適化無しのポリヌクレオチド）
ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯシグナルペプチド）に融合したヒトＥｐｈＡ２抗原の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの配列、＋ＬＬＯＰＥＳＴ配列を図７に示す。この発現カセットによってコードされた融合タンパク質のアミノ酸配列を図８に示す。

（Ｂ．ヒトＥｐｈＡ２のコドン最適化細胞外ドメインを持つ発現カセット）
ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯシグナルペプチド）に融合したヒトＥｐｈＡ２抗原の細胞外ドメインをコードする発現カセットの配列、＋ＬＬＯＰＥＳＴ配列を図９に示し、そこでは、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインをコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。この発現カセットによってコードされた融合タンパク質のアミノ酸配列を図１０に示す。

（Ｃ．コドン最適化ｓｅｃＡ１シグナルペプチドおよびヒトＥｐｈＡ２のコドン最適化細胞外ドメインを持つ発現カセット）
ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯシグナルペプチド）に融合したヒトＥｐｈＡ２抗原の細胞外ドメインをコードする発現カセットの配列、＋ＬＬＯＰＥＳＴ配列を図１１に示し、そこでは、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメイン、シグナルペプチドおよびＰＥＳＴ配列をコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につき全てコドン最適化されている。この発現カセットによってコードされた融合タンパク質のアミノ酸配列を図１２に示す。

（実施例７Ｔａｔシグナルペプチド（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤ）およびｈｕＥｐｈＡ２の細胞外ドメイン（ＥＸ２）を含む融合タンパク質をコードするコドン最適化発現カセット）
Ｔａｔシグナルペプチド（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤ）に融合したＥｐｈＡ２ドメインの細胞外ドメインをコードする発現カセットの配列を図１３に示し、そこでは、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインおよびシグナルペプチドをコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。この発現カセットによってコードされる融合タンパク質のアミノ酸配列を図１４に示す。

（実施例８ヒトＥｐｈＡ２（ＣＯ）の細胞内ドメインのコドン最適化）
ヒトＥｐｈＡ２の細胞内ドメイン（アミノ酸５５８ないし９７５）をコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。ヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメインをコードする天然ヌクレオチド配列を図１５に示す。Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける最適コドン用法についてのヌクレオチド配列を図１６に示す。ヒトＥｐｈＡ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列を図１７に示す。

（実施例９ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯ）およびｈｕＥｐｈＡ２（ＣＯ）の細胞内ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）
（Ａ．コドン最適化無しのポリヌクレオチド）
ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯ）に融合したヒトＥｐｈＡ２抗原の細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドの配列、＋ＬＬＯＰＥＳＴ配列を図１８に示す。この発現カセットによってコードされる融合タンパク質のアミノ酸配列を図１９に示す。

（Ｂ．ヒトＥｐｈＡ２のコドン最適化細胞内細胞ドメインを持つ発現カセット）
ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯシグナルペプチド）に融合したｈｕＥｐｈＡ２抗原の細胞内ドメインをコードする発現カセットの配列、＋ＬＬＯＰＥＳＴ配列を図２０に示し、そこでは、ＥｐｈＡ２の細胞内ドメインをコードする配列がＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。この発現カセットによってコードされる融合タンパク質のアミノ酸配列を図２１に示す。

（Ｃ．コドン最適化ｓｅｃＡ１シグナルペプチドおよびヒトＥｐｈＡ２のコドン最適化細胞内ドメインを持つ発現カセット）
ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯシグナルペプチド）に融合したＥｐｈＡ２抗原の細胞内ドメインをコードする発現カセットの配列、＋ＬＬＯＰＥＳＴを図２２に示し、そこでは、ＥｐｈＡ２の細胞内ドメイン、シグナルペプチドおよびＰＥＳＴ配列をコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につき全てコドン最適化されている。この発現カセットによってコードされた融合タンパク質のアミノ酸配列を図２３に示す。

（実施例１０Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤシグナルペプチドおよびｈｕＥｐｈＡ２（ＣＯ）の細胞内ドメインを含む融合タンパク質をコードするコドン最適化発現カセット）
Ｔａｔシグナルペプチド（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤ）に融合したＥｐｈＡ２抗原の細胞内ドメインをコードする発現カセットの配列を図２４に示し、ここに、ＥｐｈＡ２の細胞内ドメインおよびシグナルペプチドをコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につき全てコドン最適化されている。この発現カセットによってコードされた融合タンパク質のアミノ酸配列を図２５に示す。

（実施例１１ＬＬＯシグナルペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１を含む融合タンパク質をコードするコドン最適化発現カセット）
発現カセットを、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおけるヒト精巣癌抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００１３２７）の発現に対して設計した。ｓｅｃＡ１シグナルペプチド（ＬＬＯ）に融合したＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする発現カセットの配列、＋ＬＬＯＰＥＳＴ配列を図２６に示す。発現カセット中の該抗原ならびにシグナルペプチドにつきコードする配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されていた。この発現カセットによってコードされる融合タンパク質のアミノ酸配列を図２７に示す。

（実施例１２非ＬｉｓｔｅｒｉａｌｓｅｃＡ１シグナルペプチド（Ｌ．Ｌａｃｔｉｓｕｓｐ４５）に融合した抗原をコードするコドン最適化発現カセット）
発現カセットを、非ＬｉｓｔｅｒｉａｌｓｅｃＡ１シグナルペプチドを用いてＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける異種抗原の発現につき設計した。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ（Ｓｔｅｉｄｌｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：７８５−９（２００３））からのｕｓｐ４５シグナルペプチドのアミノ酸配列、その天然コード配列、およびＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につき最適化されたコード配列を以下に示す。

Ｕｓｐ４５シグナルペプチドをコードするコドン最適化配列に作動可能に連結されたＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｈｌｙプロモーターを含む部分的発現カセットの配列を図２８に示す。この配列は、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドおよび望まれる抗原を含む融合タンパク質の発現についてのコドン最適化または非コドン最適化抗原配列いずれかと組み合わせることができる。

（実施例１３ｓｅｃＡ２シグナルペプチド（ｐ６０）に融合した抗原をコードするコドン最適化発現カセットおよびベクター）
（Ａ．コドン最適化発現カセットの設計）
発現カセットを、ｓｅｃＡ２分泌経路を用いるＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける異種抗原の発現につき設計した。Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドのアミノ酸配列、その天然コード配列、およびＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につき最適化されたコード配列を以下に示す。

ｐ６０シグナルペプチドをコードする天然配列に作動可能に連結されたＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｈｌｙプロモーターを含む部分的発現カセットの配列を図２９に示す。ｐ６０シグナルペプチドをコードするコドン最適化配列に作動可能に連結されたＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｈｌｙプロモーターを含む部分的発現カセットの配列を図３０に示す。

（Ｂ．ｐＰＬ２−ｈｌｙｐｒｏｐ６０の構築）
抗原コード配列がｐ６０遺伝子のコード配列内の１以上の部位にイン・フレームにて挿入された発現カセットを構築することもできる。ｐ６０配列内に抗原配列をイン・フレームに挿入するのに有用な部分的発現カセットの構築の記載を以下に記載する。この部分的発現カセットはｈｌｙプロモーターを含む。

ＰｆｘまたはＶｅｎｔポリメラーゼを用いる個々の一次ＰＣＲ反応は、以下のプライマーおよび第一の鋳型としての（実施例２Ａにて前記したｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡと同一の）ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−ＯＶＡを用いて行う：

得られたアンプリコンのサイズは２８５ｂｐである。

ＰｆｘまたはＶｅｎｔポリメラーゼを用いる個々の一次ＰＣＲ反応もまた以下のプライマーおよび第二の鋳型としてのｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｐ６０を用いて行われる。（ベクターｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｐ６０は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのゲノムｐ６０配列が挿入されているＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｐａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られたｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターから作成される。入手可能なｐ６０コード配列の多くの代替源のいずれの他のものも代わりに鋳型として用いることができよう）。このＰＣＲ反応で用いられるプライマーは以下の通りである：

得られたアンプリコンのサイズは１５１０ｂｐである。次いで、ＰＣＲ反応を５６カラム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で清浄化する。

次いで、鋳型としてほぼ５μＬの各一次ＰＣＲ反応を用い、二次ＰＣＲ反応を行う。二次ＰＣＲ反応は以下のプライマーを用いる：

得られたアンプリコンのサイズは１７１５ｂｐである。すべてのＰＣＲ反応における予測されるアンプリコンのサイズはアガロースゲル分析によって確認する。二次ＰＣＲ反応を清浄化し、ＢａｍＨＩで消化し、再度清浄化し、ＫｐｎＩで消化する。次いで、ｈｌｙＰ−ｐ６０遺伝子フラグメント（ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ）（図３０）を、ｐＰＬ２および修飾されたｐＡＭ４０１（ｐＡＭ４０１−ＭＣＳ；図３２）プラスミド双方のＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位の間に連結する。

次いで、ｐＰＬ２−ｐ６０プラスミドの構築はＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ（１６９７，６０２４ｂｐ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（２１０，４２４，３４６０，３６３４ｂｐ）消化物で確認する。また、ｐＰＬ２−ｐ６０プラスミドにおけるＰｓｔＩ部位はユニークなものとして確認される。（また、ＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ消化物は７３６および６９８５ｂｐのフラグメントを生じるであろう）。ｐＡＭ４０１−ｐ６０プラスミド（ｐ６０領域からのＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ、およびＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメント）の構築はｐＰＬ２構築体のそれと同一である。

次いで、各プラスミドの大きなＰＲＥＰ単離物を、当業者に知られた方法を用いて調製する。

次いで、当業者によく知られた技術を用い、所望の抗原コード配列をｐ６０配列内にｐ６０配列と同一の翻訳フレームにて挿入することができる。典型的には、挿入または複数の挿入はｐ６０のＮ−末端シグナルペプチド配列を無傷のままとするであろう。ｐ６０のＣ−末端自己溶解素配列もまた無傷のままとすべきである。

（実施例１４Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現についてのヒトメソセリン−コード配列のコドン最適化）
ヒトメソセリン、癌抗原をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を図３３に示す。図３２に示される配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。図３３における配列によってコードされたポリペプチド配列は図３４に示す。

（実施例１５Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現についてのネズミメソセリン−コード配列のコドン最適化）
ヒトメソセリン、癌抗原をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を図３５に示す。図３５に示された配列はＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されている。図３５における配列によってコードされるポリペプチド配列は図３６に示される。

（実施例１６対立遺伝子交換を介するＬｉｓｔｅｒｉａ染色体への発現カセットの組込み）
異種遺伝子発現カセットをＬｉｓｔｅｒｉａの染色体に挿入するためにｐＰＬ２のような組込みベクターを用いる１つの可能な代替法として、対立遺伝子交換を用いることができる。

簡単に述べれば、ｐＫＳＶ７−異種タンパク質発現カセットプラスミドでエレクトロポレーションを行った細菌を、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＢＨＩ寒天培地上で平板培養することによって選択し、３０℃の許容される温度でインキュベートする。細菌染色体への単一交差組込みは、クロラムフェニコールを含有する培地中で４１℃の非許容温度にて複数世代の間、数個の個々のコロニーを継代することによって選択される。最後に、クロラムフェニコールを含有しないＢＨＩ培地中で３０℃の許容温度にて複数世代の間、数個の個々のコロニーを継代することによって、プラスミドの切り出しおよびキュアリング（二重交差）が達成される。細菌染色体への異種タンパク質発現カセットの組込みの確認は、ｐＫＳＶ７プラスミドベクター構築体に含まれない細菌染色体標的化配列に対する異種タンパク質発現カセット内から規定された領域を増幅するプライマー対を利用してＰＣＲによって確認される。

（実施例１７選択された組換えＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株における発現のためのクローニング、およびＥｐｈＡ２のｐＰＬ２ベクターへの挿入）
ＥｐｈＡ２膜貫通ラセンに近接するＥｐｈＡ２の外部（ＥＸ２）および細胞質（ＣＯ）ドメインを、種々のｐＰＬ２−シグナルペプチド発現構築体への挿入のために別々にクローン化した。ＥｐｈＡ２ＥＸ２およびＣＯドメインの天然哺乳動物配列、またはそのＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化された配列に対応する遺伝子を用いた。２０アミノ酸の各々についてのＬｉｓｔｅｒｉａにおける最適コドン（前記表３参照）を、コドン最適化ＥｐｈＡ２ＥＸ２およびＥｐｈＡ２ＣＯのために利用した。コドン最適化ＥｐｈＡ２ＥＸ２およびＣＯドメインは、当業者に通常の技術を用い、重複オリゴヌクレオチドの延長によって合成した。全ての合成されたＥｐｈＡ２構築体の予測された配列は、ヌクレオチド配列決定によって確認した。

ＥｐｈＡ２のＥＸ２およびＣＯドメインについての天然およびコドン最適化ヌクレオチド配列と共に、一次アミノ酸配列を図４ないし６（ＥＸ２配列）および図１５ないし１７（ＣＯドメイン配列）に示した。

加えて、ＦＬＡＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）およびｍｙｃエピトープタグを、ＦＬＡＧまたはタンパク質に特異的な抗体を用いるウェスタンブロット分析によって、発現されたおよび分泌されたＥｐｈＡ２の検出のために合成されたＥｐｈＡ２ＥＸ２およびＣＯ遺伝子のアミノおよびカルボキシ末端において、各々、イン−フレーム挿入した。かくして、発現されたタンパク質は以下の純度のエレメント：ＮＨ_２−シグナルペプチド−ＦＬＡＧ−ＥｐｈＡ２−ｍｙｃ−ＣＯ_２を有した。以下に示すのはＦＬＡＧおよびｍｙｃエピトープタグアミノ酸およびコドン最適化ヌクレオチド配列である：

（実施例１８ウェスタンブロット分析による合成されたおよび分泌された異種タンパク質の検出）
ＥｐｈＡ２タンパク質の合成、および種々の選択された組換えＬｉｓｔｅｒｉａ−ＥｐｈＡ２株からの分泌は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿細菌培養流体のウェスタンブロット分析によって決定した。簡単に述べれば、ＢＨＩ培地中で増殖したＬｉｓｔｅｒｉａの中期−ｌｏｇ相培養を５０ｍＬ円錐遠心管中に集め、細菌をペレット化し、氷冷ＴＣＡを細菌培養上清へ最終［６％］濃度まで加え、氷上で最小限９０分間または一晩インキュベートした。ＴＣＡ−沈殿タンパク質を４℃における２０分間の２４００×ｇでの遠心によって集めた。次いで、１５μｇ／ｍＬフェノールレッドを含有する３００ないし６００μＬの容量のＴＥ、ｐＨ８．０に再懸濁させた。試料溶解は渦巻かせることによって促進した。もし必要であれば色がピンク色となるまでＮＨ_４ＯＨを加えることによって試料ｐＨを調製した。１００μＬの４× ＳＤＳ負荷緩衝液を加え、９０℃にて１０分間インキュベートすることによって、全ての試料を電気泳動のために調製した。次いで、ミクロ−遠心管において試料を１４，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を集め、−２０℃にて貯蔵した。ウェスタンブロット分析では、２０μＬの調製された画分（１ないし４×１０^９細菌からの培養流体の等量）を４ないし１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、電気泳動し、当業者によって用いられる通常の方法に従って、タンパク質をＰＤＤＦ膜に移した。室温にて攪拌しつつＰＢＳ中の５％乾燥乳にて２時間インキュベートすることによって、移された膜を抗体とのインキュベーションのために調製した。抗体をＰＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ）中の以下の希釈下で用いた：（１）１：１０，０００におけるウサギ抗−Ｍｙｃポリクローナル抗体（ＩＣＬＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗｂｅｒｇ，Ｏｒｅｇｏｎ）；（２）１：２，０００におけるネズミ抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）；および（３）ウサギ抗−ＥｐｈＡ２（カルボキシ末端特異的）ポリクローナル抗体（ｓｃ−９２４，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）。タンパク質標的への抗体の特異的結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗−ウサギまたは抗−マウス抗体との二次インキュベーション、およびＥＣＬケミルミネセンスアッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）での検出、およびフィルムへの暴露によって評価した。

（実施例１９ＥｐｈＡ２の種々の形態をコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａによるＥｐｈＡ２タンパク質の選択）
（Ａ．Ｌｉｓｔｅｒｉａ：［株ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ）またはＤＰ−Ｌ４０１７（ＬＬＯＬ４６１Ｔ）］）
発現カセット構築体：ＬＬＯｓｓ−ＰＥＳＴ−ＣＯ−ＥｐｈＡ２ＥｐｈＡ２ＣＯドメインの天然配列を、遺伝子的に、天然ｓｅｃＡ１ＬＬＯ配列に融合させ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｈｌｙプロモーターの制御したにある異種抗原発現カセットを、前記したように、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位の間にてｐＰＬ２プラスミドに挿入した。ｐＰＬ２−ＥｐｈＡ２プラスミド構築体は、前記したように、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ⁻）およびＤＰ−Ｌ４０１７（Ｌ４６１ＴＬＬＯ）へのコンジュゲーションによって導入した。図３７は、４０２９−ＥｐｈＡ２ＣＯおよび４０１７−ＥｐｈＡ２ＣＯのＴＣＡ−沈殿細菌培養流体のウェスタンブロット分析の結果を示す。この分析は、異種タンパク質発現カセットを含有するように作成された組換えＬｉｓｔｅｒｉａが、５２ｋＤａの予測された分子量よりも低いｓｅｃＡ１およびＥｐｈＡ２ＣＯ融合タンパク質分泌多重ＥｐｈＡ２特異的フラグメントに対応する天然配列よりなることを示し、これは発現カセットの修飾の必要性を示す。

（Ｂ．Ｌｉｓｔｅｒｉａ：［ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ⁻）］）
発現カセット構築体：
１．天然ＬＬＯｓｓ−ＰＥＳＴ−ＦＬＡＧ−ＥＸ２ＥｐｈＡ２−ｍｙｃ−ＣｏｄｏｎＯｐ
２．（ＣｏｄｏｎＯｐ）ＬＬＯｓｓ−ＰＥＳＴ−（ｃｏｄｏｎＯｐ）ＦＬＡＧ−ＥＸ２ＥｐｈＡ２−ｍｙｃ
天然ｓｅｃＡ１ＬＬＯシグナルペプチド配列またはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されたｓｅｃＡ１ＬＬＯシグナルペプチド配列を、遺伝子的に、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されたＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメイン配列と融合させ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｈｌｙプロモーターの制御下にある異種抗原発現カセットを、前記したように、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位の間にてｐＰＬ２プラスミドに挿入した。前記したように、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ）へのコンジュゲーションによって、ｐＰＬ２−ＥｐｈＡ２プラスミド構築体を導入した。図３８は、コドン最適化ＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメインと融合した天然またはコドン最適化ｓｅｃＡ１ＬＬＯシグナルペプチドいずれかをコードするＬｉｓｔｅｒｉａａｃｔＡのＴＣＡ−沈殿細菌培養流体のウェスタンブロット分析の結果を示す。この分析は、シグナルペプチド、およびＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける好ましいコドン用法につき最適化された異種タンパク質双方についての配列を利用する組合せの結果、予測された全長ＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメインタンパク質が発現されたことを示した。全長ＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメインタンパク質の発現はＥｐｈＡ２コード配列単独のコドン最適化で乏しかった。異種タンパク質発現（フラグメント化または全長）のレベルは、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されたＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＬＬＯｓｅｃＡ１シグナルペプチドを利用した場合に最大であった。

（Ｃ．Ｌｉｓｔｅｒｉａ：［ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ）］）
発現カセット構築体：
３．天然ＬＬＯｓｓ−ＰＥＳＴ−（ＣｏｄｏｎＯｐ）ＦＬＡＧ−ＥｐｈＡ２ＣＯ−ｍｙｃ
４．ＣｏｄｏｎＯｐＬＬＯｓｓ−ＰＥＳＴ−（ＣｏｄｏｎＯｐ）ＦＬＡＧ−ＥｐｈＡ２ＣＯ−ｍｙｃ
５．ＣｏｄｏｎＯｐＰｈｏＤ−（ＣｏｄｏｎＯｐ）ＦＬＡＧ−ＥｐｈＡ２ＣＯ−ｍｙｃ
天然ｓｅｃＡ１ＬＬＯシグナルペプチド配列、またはＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されたｓｅｃＡ１ＬＬＯシグナルペプチド配列、あるいは別法として、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されたＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓからのｐｈｏＤ遺伝子のＴａｔシグナルペプチドを、遺伝子的に、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されたＥｐｈＡ２ＣＥドメイン配列と融合させ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｈｌｙプロモーターの制御下にある異種抗原発現カセットを、前記したように、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位の間にてｐＡＭ４０１−ＭＣＳプラスミドに挿入した。前記したように、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ）へのエレクトロポレーションによって、ｐＡＭ４０１−ＥｐｈＡ２プラスミド構築体を導入した。図３９は、天然またはコドン最適化ｓｅｃＡ１ＬＬＯシグナルペプチド、またはコドン最適化ＥｐｈＡ２ＣＯドメインと融合したコドン最適化ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤＴａｔシグナルペプチドいずれかをコードするＬｉｓｔｅｒｉａａｃｔＡのＴＣＡ−沈殿細菌培養流体のウェスタンブロット分析の結果を示す。この分析は、シグナルペプチド、およびＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける好ましいコドン用法につき最適化された異種タンパク質双方についての配列を利用する組合せが、予測された全長ＥｐｈＡ２ＣＯドメインタンパク質の発現をもたらすことを再度示した。さらに、予測された全長ＥｐｈＡ２ＣＯドメインタンパク質の発現および分泌は、コドン最適化されたＥｐｈＡ２ＣＯドメインと融合したコドン最適化ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤＴａｔシグナルペプチドをコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａに由来した。この結果は、区別される細菌種からのシグナルペプチドを利用して、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの異種タンパク質の分泌をプログラムすることができるという新規かつ予期せぬ発見を示す。全長ＥｐｈＡ２ＣＯドメインタンパク質の発現は、丁度ＥｐｈＡ２配列のコドン最適化で貧弱であった。異種タンパク質発現のレベルは、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されたシグナルペプチドを利用する場合に最大であった。

（Ｄ．全長ＥｐｈＡ２発現カセット構築体をコードするｐＣＤＮＡ４プラスミドでの２９３細胞のトランスフェクション）
発現カセット構築体：
６．ｐＣＤＮＡ４−ＥｐｈＡ２
天然全長ＥｐｈＡ２遺伝子を真核生物ＣＭＶプロモーターベースの発現プラスミドｐＣＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。図４０は、ｐＣＤＮＡ４−ＥｐｈＡ２プラスミドでトランスフェクトされた２９３細胞から調製された溶解物のウェスタンブロット分析の結果を示し、全長ＥｐｈＡ２タンパク質の哺乳動物細胞における豊富な発現を示す。

（実施例２０コドン最適化ＥｐｈＡ２をコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａで免疫化されたヒトＥｐｈＡ２をコードするＣＴ２６腫瘍を担うＢａｌｂ／Ｃマウスにおける治療効果）
図４１ないし４４で示される以下のデータは以下のことを示した：
ＯＶＡ．ＡＨ１（ＭＭＴＶｇｐ７０免疫優性エピトープ）またはＯＶＡ．ＡＨ１−Ａ５（増強されたＴ−細胞受容体結合についてのヘテロクリティック変化を伴うＭＭＴＶｇｐ７０免疫優性エピトープ）をコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａでのＣＴ２６．２４（ｈｕＥｐｈＡ２＋）肺腫瘍を担うＢａｌｂ／Ｃマウスの免疫化は長期生存を与える（図４１）。

ＥｐｈＡ２ＣＯドメインは強く免疫原性であって、ＣＴ２６．２４（ｈｕＥｐｈＡ２＋）肺腫瘍を担うＢａｌｂ／Ｃマウスの生存におけるかなり長期の増加が、コドン最適化または天然ＥｐｈＡ２ＣＯドメイン配列をコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａで免疫化した場合に観察された（図４３）。

ＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメインは貧弱に免疫原性であり、コドン最適化ＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメイン配列と融合したコドン最適化ｓｅｃＡ１シグナルペプチドをコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａで免疫化した場合のみ、ＣＴ２６．２４（ｈｕＥｐｈＡ２＋）肺腫瘍を担うＢａｌｂ／Ｃマウスの増大した生存が観察された。治療効果は、コドン最適化ＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメイン配列と融合した天然ｓｅｃＡ１シグナルペプチドをコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａで免疫化した場合にマウスで観察されなかった（図４２）。コドン最適化ｓｅｃＡ１シグナルペプチドおよびＥｐｈＡ２ＥＸ２ドメイン配列双方を用いる所望性は、以下の表４に示されるように、統計学的に有意な治療抗−腫瘍効果によって支持された。

有意には、ｐＣＤＮＡ４−ＥｐｈＡ２プラスミドでトランスフェクトされた２９３細胞は非常に高レベルのタンパク質発現を生じたが、ｐＣＤＮＡ４−ＥｐｈＡ２プラスミドでのＣＴ２６．２４（ｈｕＥｐｈＡ２＋）肺腫瘍を担うＢａｌｂ／Ｃマウスの免疫化は、治療抗−腫瘍効果のいずれの観察ももたらさなかった（図４４）。

治療インビボ腫瘍研究では、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、ＥｐｈＡ２を安定に発現する５×１０^５ＣＴ２６細胞をＩＶ移植した。３日後、マウスをランダム化し、ＥｐｈＡ２をコードする種々の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株をＩＶワクチン接種した。（図に示す）いくつかの場合において、マウスを脛側前方筋肉において１００μｇのｐＣＤＮＡ４プラスミドまたはｐＣＤＮＡ４−ＥｐｈＡ２プラスミドでワクチン接種した。陽性コントロールとして、ＯＶＡ．ＡＨＩまたはＯＶＡ．ＡＨ１−Ａ５タンパク質キメラをコードする組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株でマウスをＩＶ接種した。マウスを腫瘍細胞移植後３日および１４日に接種した。ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）緩衝液または未修飾Ｌｉｓｔｅｒｉａを注射したマウスを陰性コントロールとして供した。全ての実験コホートは５匹のマウスを含んだ。生存実験では、マウスがストレスまたは不自然な呼吸のいずれかの兆候を示し始めるとマウスを犠牲にした。

（実施例２１ワクチン接種後における抗原特異的免疫応答の評価）
本発明のワクチンは、種々のインビトロおよびインビボ方法を用いて評価することができる。いくつかのアッセイは、ワクチン接種されたマウスの脾臓からの抗原特異的Ｔ細胞の分析を含む。この実施例において、インビトロおよびインビボ免疫応答を評価する方法の非限定的例を掲げる。アッセイのこれらの例示的記載で引用した抗原はモデル抗原であり、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターを用いて生じた抗原である必要は必ずしもない。当業者であれば、本実施例で記載したアッセイは、本明細書中に記載された組換え核酸分子、発現カセット、および／または発現ベクターを含む細菌のインビトロまたはインビボ免疫応答の評価で用いるのに容易に適用することができるのを容易に認識するであろう。

例えば、Ｃ５７Ｂ１／６またはＢａｌｂ／ｃは、０．１ＬＤ_５０のＯＶＡ（または他の適当な抗原）を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の静脈内注射によって接種した。接種から７日後に、脾臓を氷冷ＲＰＭＩ１６４０培地に入れ、これから単一細胞懸濁液を調製することによって、マウスの脾臓細胞を収穫する（典型的には、群当たり３匹のマウス）。代替法として、マウスのリンパ節を同様に収穫し、単一細胞懸濁液として調製し、後に記載するアッセイにおける脾臓細胞に代えて置き換えることができよう。典型的には、脾臓細胞およびリンパ節からの細胞はワクチンの筋肉内、皮下または皮内投与につき評価するが、脾臓細胞はワクチンの静脈内または腹腔内投与につき評価する。

特記しない限り、これらの実施例で用いた全ての抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから得ることができる。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：例としてＯＶＡ抗原を有するＬｉｓｔｅｒｉａ株を用い、マウスモデルでの免疫化に際して生じた抗原特異的Ｔ細胞の定量的頻度はＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて評価する。評価した抗原特異的Ｔ細胞はＯＶＡ特異的ＣＤ８＋またはＬＬＯ特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。このＯＶＡ抗原モデルは、ワクチンに挿入された異種腫瘍抗原に対する免疫応答を評価し、注目するいずれかの抗原で置き換えることができよう。ＬＬＯ抗原はＬｉｓｔｅｒｉａに対して特異的である。特異的Ｔ細胞は、特異的抗原の認識に際してサイトカイン放出（例えば、ＩＦＮ−γ）の検出によって評価される。ＰＶＤＦベースの９６ウェルプレート（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を抗−ネズミＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂＲ４；５μｇ／ｍＬ）で４℃にて一晩被覆する。プレートを洗浄し、室温にて２００μＬの完全なＲＰＭＩで２時間ブロックする。ワクチン接種したマウス（またはワクチン接種していないコントロールマウス）からの脾臓細胞をウェル当たり２×１０^５細胞で加え、種々の濃度の０．０１ないし１０μＭの範囲のペプチドの存在下で３７℃にて２０ないし２２時間インキュベートする。ＯＶＡおよびＬＬＯで用いるペプチドはＯＶＡではＳＬ８、ＭＨＣクラスＩエピトープ、リステリオリシンＯ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗原）についてはＬＬＯ_１９０（ＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳ（配列番号：１００）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、リステリオリシンＯについてはＬＬＯ_２９６（ＶＡＹＧＲＱＶＹＬ（配列番号：１０１））、ＭＨＣクラスＩエピトープ、またはリステリオリシンＯについてはＬＬＯ_９１（ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ（配列番号：１０２））、ＭＨＣクラスＩエピトープいずれかである。ＬＬＯ_１９０およびＬＬＯ_２９６はＣ５７Ｂ１／６モデルで用いられ、他方、ＬＬＯ_９１はＢａｌｂ／ｃモデルで用いられる。洗浄の後、ＰＢＳ中に０．５μｇ／ｍＬまで希釈したＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）に特異的な二次ビオチニル化抗体と共にインキュベートする。室温での２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈された１ｎｍ金ヤギ抗−ビオチンコンジュゲート（ＧＡＢ−１；１：２００希釈；ＴｅｄＰｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）と共に３７℃にて１時間インキュベートする。徹底的な洗浄の後、スポット展開のために、基質（銀増強キット；３０ｍＬ／ウェル；ＴｅｄＰｅｌｌａ）と共に室温にて２ないし１０分間インキュベートする。次いで、プレートを蒸留水で濯いで、基質の反応を停止させる。プレートを風乾した後、各ウェル中のスポットを自動ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（ＣＴＬ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いてカウントする。サイトカイン応答は、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞またはＬｉｓｔｅｒｉａ特異的Ｔ細胞いずれかについての２×１０^５脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット−形成細胞（ＳＦＣ）の数として表す。

細胞内サイトカイン染色アッセイ（ＩＣＳ）：抗原特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の数をさらに評価し、結果をＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得られたものと相関させるために、ＩＣＳを行い、フローサイトメトリー分析によって細胞を評価する。マウスのワクチン接種およびコントロール群からの脾臓細胞をＳＬ８（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋細胞を刺激）またはＬＬＯ_１９０（ＬＬＯ特異的ＣＤ４＋細胞を刺激）と共にＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で５時間インキュベートする。ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡはＴ細胞の刺激に際して生じたサイトカインの分泌を阻害する。無関係ＭＨＣクラスＩペプチドと共にインキュベートした脾臓細胞をコントロールとして用いる。ＰＭＡ（フォルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート，Ｓｉｇｍａ）２０ｎｇ／ｍＬおよびイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）２μｇ／ｍＬ刺激脾臓細胞を、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α細胞内サイトカイン染色のための陽性コントロールとして用いる。細胞質サイトカイン発現の検出のために、細胞をＦＩＴＣ−抗−ＣＤ４ｍＡｂ（ＲＭ４−５）およびＰｅｒＣＰ−抗−ＣＤ８ｍＡｂ（５３−６．７）で染色し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で固定し、投下させ、氷上でＰＥ−コンジュゲーテッド抗−ＴＮＦ−α ｍＡｂ（ＭＰ６−ＸＴ２２）およびＡＰＣ−コンジュゲーテッド抗−ＩＦＮ−γ ｍＡｂ（ＸＭＧ１．２）で３０分間染色する。細胞内ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αを発現する細胞のパーセンテージはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）によって測定し、データはＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙＳｙｓｔｅｍ）を用いて分析した。種々の抗体に対する蛍光標識は全てＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒによって識別できるため、適当な細胞は、抗−ＩＦＮ−γまたは抗−ＴＮＦ−αのいずれかまたは双方で染色されるＣＤ８＋およびＣＤ４＋につきゲーティングすることによって同定される。

刺激された脾臓細胞のサイトカイン発現：マウスの脾臓細胞によるサイトカイン分泌のレベルはコントロールおよびワクチン接種Ｃ５７Ｂ１／６マウスにつき評価することもできる。脾臓細胞をＳＬ８またはＬＬＯ_１９０で２４時間刺激する。無関係ペプチドＨＳＶ−ｇＢ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳＳＩＥＦＡＲＬ，配列番号：４）での刺激はコントロールとして用いる。刺激された細胞の上清を収集し、Ｔヘルパー−１およびＴヘルパー２サイトカインのレベルはＥＬＩＳＡアッセイ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＯ）またはＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＢｅａｄＡｒｒａｙキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定される。

細胞傷害性Ｔ細胞活性の評価：ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロにて、インビボにてＣ５７Ｂ１／６マウスにおいて間接的にのいずれかで、それらの細胞傷害性活性を評価することによってさらに見積もることができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は抗原特異的にそれらの各標的細胞を認識し、溶解する。インビトロ細胞傷害性はクロム放出アッセイを用いて決定される。ナイーブおよびＬｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡ（内部）ワクチン接種のマウスの脾臓細胞を、照射したＥＧ７．ＯＶＡ細胞（ＯＶＡを発現するようにトランスフェクトされたＥＬ−４腫瘍細胞系，ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で、または１００ｎＭＳＬ８で１０：１の比率で刺激して、脾臓細胞集団におけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞を拡大する。７日間の培養の後、エフェクター細胞の細胞傷害性活性を、標的細胞としてのＥＧ７．ＯＶＡまたはＳＬ８パルスドＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）および陰性コントロールとしてのＥＬ−４細胞単独を用いて標準の４時間５１Ｃｒ−放出アッセイで決定される。ＹＡＣ−１細胞系ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を標的として用いて、ＮＫ細胞活性を決定して、ＮＫ細胞によるそれからＴ細胞による活性を識別する。特異的細胞傷害性のパーセンテージは１００×（実験的放出−自然発生放出）／（最大放出−自然放出）として計算される。自然発生放出は、エフェクター細胞無しの標的細胞のインキュベーションによって決定される。最大放出は０．１％トリトンＸ−１００で細胞を溶解させることによって決定される。実験は、もし自然発生放出が最大放出の＜２０％であれば分析のために有効であると考えられる。

インビボでのＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性の評価では、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスからの脾臓細胞を２つの等しいアリコットに分ける。各群を特異的ペプチド、標的（ＳＬ８）またはコントロール（ＨＳＶ−ｇＢ２）いずれかで、０．５μｇ／ｍＬにおいて３７℃にて９０分間パルスする。次いで、細胞を培地中で３回洗浄し、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中で２回洗浄する。カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）での標識のために、細胞を温かいＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（１０ｍＬ以下）にｍＬあたり１×１０^７にて再懸濁させる。標的細胞懸濁液に、１．２５μＬのＣＦＳＥの５ｍＭストックを加え、試料を渦巻かせることによって混合する。コントロール細胞懸濁液に、ＣＦＳＥストックの１０倍希釈を加え、試料を渦巻かせることによって混合する。細胞を３７℃にて１０分間インキュベートする。大容量（＞４０ｍＬ）の氷冷ＰＢＳを加えることによって染色を停止させる。細胞を室温にてＰＢＳで２回洗浄し、次いで、再懸濁し、カウントする。各細胞懸濁液をｍＬ当たり５０×１０^６まで希釈し、１００μＬの各集団を混合し、ナイーブまたはワクチン接種したマウスいずれかの尾静脈を介して注射する。１２ないし２４時間後、脾臓を収穫し、合計５×１０^６細胞をフローサイトメトリーによって分析する。高（標的）および低（コントロール）蛍光ピークを数え、２つの比率を用いて、標的細胞溶解のパーセンテージを確立する。インビボ細胞傷害性アッセイは、インビトロ再刺激の必要性なくして、抗原特異的Ｐ細胞の溶解活性の評価を可能とする。さらに、このアッセイはそれらの天然環境においてＴ細胞機能を評価する。

（実施例２２ＥｐｈＡ２を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株でのＢａｌｂ／ｃマウスのワクチン接種によって誘導されたヒトＥｐｈＡ２特異的免疫性）
２週間隔てて、ｈＥｐｈＡ２（図４５においてＬｉｓｔｅｒｉａｈＥｐｈＡ２−ＩＣＤ）の細胞内ドメインを発現するＬｉｓｔｅｒｉａＬ４６１Ｔ、またはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおいて発現につきコドン最適化された配列からのｈＥｐｈＡ２（図４５においてＬｉｓｔｅｒｉａｈＥｐｈＡ２−ＥＣＤ）の細胞外ドメインを発現するＬｉｓｔｅｒｉａのΔａｃｔＡ（ａｃｔＡ⁻）株でＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）を免疫化した。（ｈＥｐｈＡ２の細胞内ドメインは、別法として、ｈＥｐｈＡ２−ＩＣＤ，ｈＥｐｈＡ２ＩＣＤ，ＥｐｈＡ２ＣＯ，またはＣＯといわれる。ｈＥｐｈＡ２の細胞ガイドメインは、別法として、ここではｈＥｐｈＡ２−ＥＣＤ，ｈＥｐｈＡ２ＥＣＤ，ＥｐｈＡ２ＥＸ２，またはＥＸ２といわれる）。マウスを安楽死させ、脾臓を収穫し、最後の免疫化から６日後にプールした。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、全長ｈＥｐｈＡ２を発現するＰ８１５細胞、またはこれらの細胞から調製した細胞溶解物で該細胞をインビトロで再度刺激した。親Ｐ８１５細胞または細胞溶解物は陰性コントロールとして供した。また、細胞を組換えｈＥｐｈＡ２Ｆｃ融合タンパク質で刺激した。ＩＦＮ−ガンマ陽性スポット形成コロニー（ＳＦＣ）を９６ウェルスポットリーダーを用いて測定した。図４５に示すように、増大したＩＦＮ−ガンマＳＦＣが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ｈＥｐｈＡ２でワクチン接種したマウスから得られた脾臓細胞で観察された。ｈＥｐｈＡ２発現細胞または細胞溶解物双方での刺激の結果、ＩＦＮ−ガンマＳＦＣが増大し、これは、ＥｐｈＡ２特異的ＣＤ８＋ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示唆する。親Ｌｉｓｔｅｒｉａコントロールでワクチン接種したマウスからの脾臓細胞はＩＦＮ−ガンマＳＦＣの増大を示さなかった。

（実施例２３ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＥｐｈＡ２特異的抗−腫瘍効果で必要である）
０日に、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１０）を２×１０^５ＣＴ２６−ｈＥｐｈＡ２で静脈内接種した。１および３日に、２００μｇの抗−ＣＤ４（ＡＴＣＣハイブリドーマＧＫ１．５）または抗−ＣＤ８（ＡＴＣＣハイブリドーマ２．４−３）を注射することによって、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ−細胞を枯渇させ、これをＦＡＣＳ分析によって確認した（データは示さず）。次いで、４日に、ｈＥｐｈＡ２ＩＣＤを発現する０．１ＬＤ_５０ＬｉｓｔｅｒｉａＬ４６１Ｔでマウスを免疫化し、生存につきモニターした。

図４６に示すように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋枯渇群は共に非Ｔ細胞枯渇動物で観察された抗−腫瘍応答を示さなかった。データを以下の表５にまとめる。

前記データは、腫瘍成長の最適抑制におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞双方についての要件を示す。

（実施例２４対立遺伝子交換によるＬｉｓｔｅｒｉａからのｉｎｌＢの欠失）
本明細書中に記載された組換え核酸分子および発現カセットを含む細菌は、いくつかの実施形態においては、変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａである。例えば、いくつかの実施形態において、組換え核酸分子および発現カセットを含む細菌は、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＢ遺伝子、または双方が欠失去れたＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である。Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて欠失変異体を作り出す１つの例示的な方法を以下に記載する。

ＬｉｓｔｅｒｉａＤＰ−Ｌ４０２９からの（または他の選択された変異体株からの、または野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａからの）インターナリンＢ遺伝子（ｉｎｌＢ）の欠失は、Ｃａｍｉｌｌｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３−１４７（１９９３）によって記載されているように、対立遺伝子交換によって行うことができる。巣プライス重複延長（ＳＯＥ）ＰＣＲを用いて、対立遺伝子交換手法で用いる構築体を調製することができる。インターナリンＢ遺伝子の源は、ここに引用してその全体を援用する、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＬ５９１９７５（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ、完全なゲノム、セグメント３／１２；ｉｎｌＢ遺伝子領域：ｎｔｓ．９７００８−９８９６３）としてリストされた配列、および／またはここに引用してその全体を援用する、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ００３２１０（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ、完全なゲノム、ｉｎｌＢ遺伝子領域：ｎｔｓ．４５７００８−４５８９６３）としてリストされた配列である。

一次ＰＣＲ反応においては、各々、ＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｌＢ遺伝子５’および３’末端から上流および下流のほぼ１０００ｂｐの配列を、以下の鋳型およびプライマーを用いて増幅する：
鋳型：ＤＰ−Ｌ４０５６またはＤＰ−Ｌ４０２９ゲノムＤＮＡ
プライマー対１（ｉｎｌＢの５’末端から上流の領域の増幅用）：

（ＩｎｌＢカルボキシ末端から下流の領域に相補的な下線を施した配列）
アンプリコンのサイズ（ｂｐ）：１００７
プライマー対２（ｉｎｌＢの３’末端から下流の領域の増幅用）：

（ＩｎｌＢアミノ末端の上流の領域に対して相補的な下線を施した配列）

二次ＰＣＲ反応においては、対１からの逆方向プライマーおよび対２の順方向プライマーの間の相補性を利用し、一次ＰＣＲアンプリコンをＳＯＥＰＣＲを通じて融合させる。この結果、ｉｎｌＢコード配列：ｎｔｓ．９７０２１−９８９１０＝１８８９ｂｐの正確な欠失が得られる。以下の鋳型およびプライマーを二次ＰＣＲ反応で利用した：

構築プロセスを完了させるためのプロトコルは以下の通りである：
ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）および１０μＬの洗浄した３０℃のＬｉｓｔｅｒｉａＤＰ−Ｌ４０５６ＯＲＤＰ−Ｌ４０２９の一晩の培養を用い、一次ＰＣＲ反応（３温度サイクル）を行う。１％アガロースゲルによるＬｉｓｔｅｒｉａアンプリコンの予測されたサイズ（１００７ｂｐおよび１０７４ｂｐ）。一次ＰＣＲ反応をゲル精製し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１）でＤＮＡを溶出させる。

ほぼ等しい量の各一字反応を鋳型（約５μＬ）として利用し、二次ＰＣＲ反応を行う。二次ＰＣＲ反応からのＬｉｓｔｅｒｉａアンプリコンの予測されるサイズは、１％アガロースゲルによって確認される（２０３３ｂｐ）。アデノシン残基をＴａｑポリメラーゼでＬｉｓｔｅｒｉａｄｌｉｎｌＢアンプリコンの３’末端に付加する。

次いで、ＬｉｓｔｅｒｉａｄｌｉｎｌＢアンプリコンをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入する。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｄｌｉｎｌＢプラスミドＤＮＡをＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、２１２３ｂｐフラグメントをゲル精製する。ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ２１２３ｂｐフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩでの消化、およびＣＩＡＰ（ｐＫＳＶ７−ｄｌｉｎｌＢ）での処理によって調整されたｐＫＳＶ７ベクターに挿入する。次いで、ｐＫＳＶ７―ｄｌｉｎｌＢ中のｄｌｉｎｌＢ細胞の忠実度を確認する。ｐＫＳＶ７−ｄｌｉｎｌＢプラスミドとの対立遺伝子交換によって、ｉｎｌＢ遺伝子を所望のＬｉｓｔｅｒｉａ株から欠失させる。

（実施例２５組換えＬｉｓｔｅｒｉａの構築のためのコドン最適化シグナルペプチド）
組換えＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現カセットで用いることができるいくつかの例示的コドン最適化シグナルペプチドを以下の表６に掲げる。

^１示した配列はＬＬＯからのＰＥＳＴ配列を含む。

（実施例２６Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原（ＰＡ）シグナルペプチドを含むコドン最適化発現カセット）
非ＬｉｓｔｅｒｉａｌｓｅｃＡ１シグナルペプチドを用いるＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける異種抗原の発現のために発現カセットを設計した。Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ｂａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００７３２２）からの保護抗原（ＰＡ）シグナルペプチドのアミノ酸配列、その天然のコード配列、およびＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につき最適化されたコード配列を以下に示す。

ＢａＰＡシグナルペプチドをコードするコドン最適化配列に作動可能に連結されたＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｈｌｙプロモーターを含む部分的発現カセットの配列を図４７に示す。この配列は、ＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓＰＡシグナルペプチドおよび所望の抗原を含む融合タンパク質の発現のためにコドン−最適かまたは非コドン最適化抗原配列いずれかと組み合わせることができる。

（実施例２７コドン最適化発現カセットを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの抗原の発現および分泌）
シグナルペプチドおよび腫瘍抗原双方のコドン最適化は組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの効果的な発現および分泌を提供する：シグナルペプチド−および異種タンパク質−コーディング遺伝子エレメントのコドン最適化は、疎水性ドメインを含有するヒト腫瘍抗原の組換えＬｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンからの最適な分泌を提供する。サイトゾル細菌からの効果的な抗原分泌は、ＭＨＣクラスＩ経路およびＣＤ８＋Ｔ−細胞プライミングを介する効果的な提示で必要であり、かくして、Ｌｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンの能力に直接連結する。固体腫瘍の中でも、膵臓および卵巣癌（メソセリン）およびメラノーマ（ＮＹ−ＥＳＯ−１）に関連する免疫標的である、２つの悪性細胞膜−欠乏ヒト腫瘍抗原、メソセリンおよびＮＹ−ＥＳＯ−１の組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの分泌は、抗原およびシグナルペプチドコード配列双方の組合せのコドン最適化を通じて最適化されている。

ｓｅｃＡ１に関連するシグナルペプチドをコードする天然またはコドン最適化配列いずれかに連結したｈｌｙプロモーター、または選択されたヒト腫瘍抗原−ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１またはヒトメソセリンとイン・フレームにて融合した、ｓｅｃＡ２およびＴｗｉｎＲＧトランスローケーション（Ｔａｔ）を含めた別の分泌経路を含む種々の発現カセットを構築した。（抗原配列またはシグナルペプチドについては前記した実施例１１ないし１４および２５参照）。ＢＨＩブロス中で増殖させたＬｉｓｔｅｒｉａのＴＣＡ−沈殿培養流体のウェスタンブロット分析を用いて、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの異種タンパク質の合成および分泌を評価した。（前記実施例１８で記載したものと同様な方法をウェスタンブロット分析で用いた）。

これらの実験の結果を図４８ＡないしＣに示す。組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの全長腫瘍抗原の効果的な発現および分泌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来する場合を含めたシグナルペプチドコード配列、および作動可能に連結された外来性抗原コード配列が共にＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおけるコドン用法につき最適化された場合に観察された。図４８Ａは、ＬＬＯおよびメソセリン双方についての天然コドンを用いる、ヒトメソセリンと融合したＬＬＯシグナルペプチドを含む構築体でのΔａｃｔＡＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓによるヒトメソセリンの発現／分泌を示す。ＴＣＡ−沈殿細菌培養流体のウェスタン分析によって、予測される全長メソセリン（６２ｋＤａ）の分泌はこれらの構築体で観察されず、いくつかの小さなフラグメントの分泌のみが観察された（図４８Ａ）。

図４８Ｂは、ヒトメソセリンと融合した種々のシグナルペプチドをコードする構築体を含有するプラスミド（ｐＡＭ４０１）を含むＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ΔａｃｔＡによるヒトメソセリンの発現／分泌のウェスタンブロット分析を示す。各構築体において、メソセリンコード配列をＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ発現につきコドン最適化した。示した場合、用いたシグナルペプチドコード配列はいずれかの天然配列を含有し（「天然」）、あるいはＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ発現につきコドン最適化された（「ＣｏｄＯｐ」）。分泌されたメソセリンは、ＩＦＡと共に選択されたペプチドでのウサギの注射によって調製された、アフィニティー−精製ポリクローナル抗−ヒト／マウス抗体を用いて検出した。

有意には、図４８Ｂのレーン３ないし５、および８ないし９に示すように、全長メソセリン（６２ｋＤａ）の分泌は、シグナルペプチドおよびメソセリンコード配列が共にＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化されている場合にのみ観察された。この観察は、有意には、各々、その双方が頻繁には使用されないコドンを含有する、ｓｅｃＡ１およびｓｅｃＡ２分泌経路に関連する、細菌ＬＬＯおよびｐ６０タンパク質からのＬｉｓｔｅｒｉａ−由来シグナルペプチドも含んだ。（ＬＬＯＰＥＳＴ配列もまたＬＬＯシグナルペプチドに含まれ、そのコード配列はやはりコドン最適化されている）。全長メソセリン（６２ｋＤａ）の効果的な分泌は、コドン最適化ＬｉｓｔｅｒｉａＬＬＯシグナルペプチドがコドン最適化メソセリンと連結された場合に観察された（レーン８、図４８Ｂ）が、ＬｉｓｔｅｒｉａＬＬＯシグナルペプチドの天然コード配列を用いた場合には観察されなかった（レーン７、図４８Ｂ）。さらに、全長メソセリン（６２ｋＤａ）の分泌は、コドン最適化Ｌｉｓｔｅｒｉａｐ６０シグナルペプチドがコドン最適化メソセリンと連結された場合に観察された（レーン３、図４８Ｂ）が、Ｌｉｓｔｅｒｉａｐ６０シグナルペプチドの天然コード配列を用いた場合には観察されなかった（レーン６、図４８Ｂ）。最後に、全長メソセリン（６２ｋＤａ）の分泌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとは異なる細菌種からのコドン最適化シグナルペプチドをコドン最適化メソセリンに操作可能に連結した場合に観察された（図４８Ｂ）。Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原（ＢａＰＡ）からのシグナルペプチド、またはＬａｃｔｏｃｏｃｕｕｓｌａｃｔｉｓＵｓｐ４５タンパク質（ＬｌＵｓｐ４５）からのシグナルペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株からの全長メソセリン（６２ｋＤａ）の効果的な分泌をプログラムした（図４８Ｂ、レーン４および５）。ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤシグナルペプチド（ＢｓｐｈｏＤ）もまたＬｉｓｔｅｒｉａからの全長メソセリンの効果的な分泌をプログラムした（図４８Ｂ、レーン９）。約６２，０００の分子量を持つバンドはメソセリンに対応し、二重バンドの対は、おそらくは、切断されていない＋切断されたメソセリンポリペプチド（すなわち、部分的切断）に対応する。

図４８Ｃは、その双方がＬｉｓｔｅｒｉａにおける発現につきコドン最適化された、ヒトＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする配列と融合したＬＬＯシグナルペプチドをコードする配列を含む構築体でのＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｃｏｙｔｏｇｅｎｅｓ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢからのＮＹ−ＥＳＯ−１の発現／分泌を示す。分泌されたＮｙ−ＥＳＯ−１はＮＹ−ＥＳＯ−１モノクローナル抗体を用いて検出した。

本実施例においては、シグナルペプペプおよび腫瘍抗原ドメインを合成して、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムからのコード配列中の１０００コドン当たりの出現の頻度によって規定される、各アミノ酸についての最も好ましいコドンを利用した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｌｉｓｔｅｒｉａ＋ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ＋［ｇｂｂｃｔ］）。Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび他のグラム−陽性菌属からのｓｅｃＡ１、ｓｅｃＡ２、またはｔｗｉｎ−Ａｒｇトランスローケーション（Ｔａｔ）分泌経路に関連するシグナルペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからのヒト腫瘍抗原の効果的な分泌をプログラムした。驚くべきことに、Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質ＬＬＯおよびｐ６０からのシグナルペプチドは、各々、稀なコドン（１０００コドン当たり＜１０の頻度）を含有し、これらの配列の最適化は組換えＬｉｓｔｅｒｉａからのメソセリンおよびＮＹ−ＥＳＯ−１の効果的な分泌に必要であった（図４８Ｂ）。また、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原（ｐａｇＡ）およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓＵｓｐ４５からのｓｅｃＡ１シグナルペプチド、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのホスホジエステラーゼ／アルカリ性ホスファターゼＤ遺伝子（ＰｈｏＤ）からのＴａｔシグナルペプチドに連結した場合に、メソセリン分泌がやはり観察された。

区別される分泌経路からのシグナルペプチドを用いて、特定の経路が異種タンパク質の最適な分泌に好都合であるか否かを決定した。例えば、Ｔａｔ経路は細菌内で折り畳まれたタンパク質の分泌で利用され、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤタンパク質はこのメカニズムを介して分泌される。それは、ＮＹ−ＥＳＯ−１のような有意な疎水性のドメインを含有する腫瘍抗原の分泌は輸送に先立って折り畳まれることによって促進され得ると元来は仮定されていた。しかしながら、これらの結果は、分泌経路ではなく、シグナルペプチドおよび腫瘍抗原コード配列双方のコドン最適化が、哺乳動物タンパク質の効果的な分泌の一時的要件であることを示した。

重要なことには、腫瘍抗原分泌のためのいずれかの経路を利用する組換えワクチンの表現型は、親Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ株と比較して、有意に影響されなかった。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢの平均致死性（ＬＤ_５０）はＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて１×１０^８ｃｆｕである。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢの染色体上の無害な部位への腫瘍抗原発現カセットの安定な単一コピー部位特異的組込みは、ｐＰＬ２組込みベクターを用いて達成された。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢをコードする腫瘍抗原のＬＤ_５０はＬｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ株の５倍以内であった。

（実施例２８ビシストロニックｈＥｐｈＡ２発現ベクターの構築）
非限定的例として、ｈＥｐｈＡ２の外部（ＥＸ２）および内部（ＣＯ；キナーゼ死滅）ドメインの発現がビシストロニックメッセージから起こる抗原発現カセットの構築が与えられる。ＥＸ２およびＣＯドメインの分泌は、各々、ＢａＰＡおよびＢｓＰｈｏＤシグナルペプチドとＥＸ２およびＣＯドメインとの機能的連結によって達成される。

ｐｈＥｐｈＡ２ＫＤとして知られたコドン最適化ヒトＥｐｈＡ２キナーゼを、ビシストロニックＥｐｈＡ２発現ベクターの構築で用いる。（ＥｐｈＨ２は受容体チロシンキナーゼであるか、キナーゼ活性は該酵素の活性部位におけるＫからＭへの変異によってなくなる）。ｐｈＥｐｈＡ２ＫＤのコード配列は図４９に示される。図４９におけるｐｈＥｐｈＡ２ＫＤ配列は膜貫通ドメインが欠失されたｐＥｐｈＡ２についてのコドン最適化コード配列を含み、機能的抗原発現カセットの構築を容易とするためのユニークな５’および３’ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ制限部位を含有する。ＭｌｕＩ認識配列は図４９において示される配列では太文字で示される。

２つのＭｌｕＩ制限酵素認識配列の間のヒトＥｐｈＡ２（膜貫通ドメインが欠失された、キナーゼ−死滅）のサブ−フラグメントを（当該分野で公知の遺伝子合成方法によって、例えば、オリゴヌクレオチド合成、ＰＣＲ、および／またはクレノウフィル−イン等によって）合成する。合成の間に、天然タンパク質においては疎水性膜貫通ドメインによって分離されている、ＥｐｈＡ２細胞外および細胞内ドメインの間の正確に接合において、ａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間領域を挿入する。ａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間領域を含有するコドン最適化ヒトＥｐｈＡ２のＭｌｕＩサブ−フラグメントの配列を図５０に示す（遺伝子間領域を太線で示す）。加えて、コドン最適化ＢｓＰＨＯＤシグナルペプチドをａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間配列の３’末端に置き、下流ＥｐｈＡ２ＣＯドメインコーディング領域とイン−フレームで融合させる。

機能的ヒトＥｐｈＡ２ビシストロニックカセットは、図４９に示される膜貫通欠失キナーゼ死滅ヒトＥｐｈＡ２配列における対応する領域に代えての、ａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間領域およびＢｓｐｈｏＤシグナルペプチドを含有するＭｌｕＩフラグメントの置換によって組み立てられる。この得られた配列は、各々、その５’および３’末端においてユニークなＢａｍＨｉおよびＳａｃＩ制限酵素認識部位を含有して、ｈｌｙプロモーターおよび初期シグナルペプチド、例えば、ＢａＰＡへの挿入および機能的連結を容易とする。

かくして、ビシストロニックヒトＥｐｈＡ２抗原発現カセットの７つの順序立った機能的エレメントは以下の通りである：ｈｌｙプロモーター−ＢａＰＡシグナルペプチド−ＥＸドメインＥｐｈＡ２−停止コドン−ａｃｔＡ−ｐｌｃＢ遺伝子間領域（シャイン−ダルガルノ配列を含む）−ＢｓＰｈｏＤシグナルペプチド−ＣＯドメインＥｐｈＡ２−停止コドン。全てのＥｐｈＡ２およびシグナルペプチドコード配列は好ましくはコドン最適化されている。

ＥｐｈＡ２ＥＸおよびＣＯドメインを発現し、分泌する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ｐＡＭ４０１、ｐＫＳＶ７、またはｐＰＬ１およびＰｐＬ２組込みベクターを利用し、本出願で説明した方法によって誘導することができる。ＥｐｈＡ２タンパク質の発現および分泌は、本明細書中に記載され、および／または当業者に知られた方法を用い、所望の細菌画分のウェスタン分析によって検出される。

（実施例２９抗原細菌タンパク質キメラを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの抗原の発現および分泌）
本発明のいくつかの実施形態によって、シグナルペプチドおよびその異種タンパク質融合パートナーをコードする配列は共にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、コドン最適化異種タンパク質配列を、その天然形態がＬｉｓｔｅｒｉａから分泌される、タンパク質の規定された領域に入れるのが望ましい。分泌されたタンパク質の組み合わされた分子量に対応するタンパク質キメラが合成され、分泌されるように、異種タンパク質配列は、選択された分泌Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質配列の規定された配列内に機能的に入れられる。異種タンパク質の分泌は、オートゴラス細菌タンパク質の最適な分泌に必要な宿主Ｌｉｓｔｅｒｉａ細菌のマシーナリーを利用することによって容易とすることができる。分子シャペロンは選択された細菌タンパク質の分泌を容易とする。

非限定的例として、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓタンパク質ｐ６０およびヒト腫瘍抗原、メソセリンの間のタンパク質キメラを作成した。タンパク質キメラは、ヒト腫瘍抗原、メソセリンを、アミノ酸７０におけるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓタンパク質ｐ６０へ正確に入れることによって作成した（が、いずれの所望の異種タンパク質コード配列もタンパク質キメラを作成するように選択できることが理解される）。タンパク質キメラは、ｐ６０アミノ酸１ないし７０および全メソセリンコード配列におけるＬｉｓｅｔｅｒｉａにおける発現につき最適なコドンを含有した。さらに、ｐ６０−ヒトメソセリンタンパク質キメラは、ｐＰＬ２ベクターに組み込まれたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｈｌｙプロモーターに機能的に連結され、それは、引き続いて本明細書中に記載されたように用いて、ヒトメソセリンを発現し、分泌する組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓ株を作成した。ｐ６０−ヒトメソセリンタンパク質キメラを最適に発現し、分泌する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を構築するのに用いた実験方法は以下に記載する。

いくつかの実施形態において、選択されたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子および選択された異種タンパク質間のタンパク質キメラの重要な特徴は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ発現タンパク質と細菌シャペロンおよび分泌装置との相互作用との通じたタンパク質キメラの最適な分泌を保持し、ならびにタンパク質キメラの関係におけるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓｉタンパク質の機能的活性を保持するための、選択されたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子内へ選択された異種タンパク質配列を適当に機能的に入れることである。いくつかの実施形態において、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｓｅｃＡ２依存性タンパク質ＮａｍＡおよびｐ６０内へ異種配列を機能的に入れることが、これらの該タンパク質のペプチドグリカン細胞壁活性を保持するために望ましい。（例えば、ＳｅｃＡ２依存性ＮａｍＡおよびｐ６０タンパク質の記載については、２００３ＰＮＡＳ，１００：１２４３２−１２４３７）参照）。いくつかの実施形態において、異種タンパク質コード配列の機能的設置は、シグナル配列（ＳＳ）および細胞壁結合ドメイン（ＬｙＳＭ）、および触媒ドメインＬｙｚ−２（ＮａｍＡ）およびｐ６０−ｄｏｍ（ｐ６０）の間で望ましい（Ｌｅｎｚｅｔａｌ．，（２００３））。

いくつかの実施形態において、抗原または異種タンパク質の発現はｐｒｆＡ−疎水性プロモーターに機能的に連結される。それ自体、異種タンパク質の発現は組換えＬｉｓｔｅｒｉａ感染細胞のミクロ環境内で誘導される。

ｐ６０−メソセリンタンパク質キメラの構築における第一の工程は、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける最適分泌のためのコドンにて、ｐ６０の最初の７０アミノ酸をコードするＤＮＡ配列への機能的に連結したｐｒｆＡ依存性ｈｌｙプロモーターのＤＮＡ合成を含むものであった。（いくつかの実施形態において、コドン用法をさらに修飾して、タンパク質翻訳効率を阻害し得る、過剰のＲＮＡ二次構造の領域を回避することができる）。ｈｌｙプロモーター−７０Ｎ−末端ｐ６０アミノ酸に対応するＤＮＡサブ−フラグメントを合成した。（これは、一般には、当該分野で知られた遺伝子合成方法によって、例えば、オリゴヌクレオチド合成、ＰＣＲ、および／または、クレノウフィル−イン等によってなすことができる）。

Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、株１０４０３Ｓからのｐ６０の最初の７０アミノ酸の配列は以下に示す：

ヌクレオチド配列およびアミノ酸レベル双方において可変性を含み得る、ｐ６０を含めた、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓコーディング遺伝子の複数実験室およびフィールド単離体が存在するが、それにもかかわらず、実質的に同一の遺伝子およびタンパク質であることが当業者に認識できる。さらに、タンパク質キメラはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの（食品で生じたまたは臨床的株を含めた）いずれかの実験室的またはフィールド単離体からの遺伝子を利用して構築することができる。

ｈｌｙプロモーター−７０Ｎ−末端ｐ６０アミノ酸に対応する合成されたＤＮＡ配列を図５１に示す。さらに、ｐ６０アミノ酸残基６９（Ｌ）および７０（Ｑ）をコードするコドンは、ユニークなＰｓｔＩ酵素認識配列を含有して、異種配列の機能的挿入を容易とするように修飾した。さらに、合成されたサブ−フラグメントの５’末端はユニークなＫｐｎＩ酵素認識配列を含有する。

４４７ｂｐＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ消化サブ−フラグメントをｐＰＬ２ベクターの対応するＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ部位に連結し、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ酵素での消化、およびウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）での消化によって処理した。このプラスミドはｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐとして知られている。引き続いて、天然ｐ６０遺伝子の残りは、ユニークなＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位の間にて、ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐプラスミドにクローン化した。プルーフリーディング含有熱安定性ポリメラーゼ、および以下のプラマー対を用いて、ｐ６０遺伝子の残りをＰＣＲによってクローン化した：

１２４１ｂｐアンプリコンをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、精製された１２３５ｂｐをｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐプラスミドに連結し、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＣＩＡＰで処理した。このプラスミドは、アミノ酸１ないし７７に対応する最適コドンを持つ全長Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｐ６０遺伝子、およびアミノ酸７８ないし４７８に対応する天然コドンを含有し、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｈｌｙプロモーターに対して機能的に連結している。このプラスミドはｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）として知られており、ｐ６０コード配列二機能的に連結したｈｌｙＰを含有するＫｐｎＩ−ＰａｎＨＩサブ−フラグメントの配列を図５２に示す。ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）プラスミドの予測された配列は配列決定によって確認した。

構築における次の工程は、Ｎ−末端シグナル配列およびｐ６０の第一のＬｙｓＭ細胞壁結合ドメインの間である、ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）としてのプラスミドのユニークなＰｓｔＩ部位における異種タンパク質コード配列の機能的挿入であり、かくして、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓタンパク質の正常な生物学的機能を保有する。

非限定的例として、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓタンパク質における最適な発現においてコドン最適化されたヒトメソセリンは、ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）としてのプラスミドのユニークなＰｓｔＩ部位に挿入した。具体的には、全長メソセリン、またはシグナルペプチドおよびＧＰＩリンカードメイン（メソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩ）が欠失したメソセリンを、プルーフ−リーディング活性を持つ熱安定性ポリメラーゼ、および以下のプライマー対を用い、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につき最適なコドンを含む、全長ヒトメソセリンを含有する実施例２７に記載されたプラスミドからクローン化した。

１９３２ｂｐ（全長メソセリン）および１６３７ｂｐ（メソセリンΔＳＰ／ΔＧＰ１）のＰＣＲアンプリコンを精製し、ＰｓｔＩで消化し、精製し、プラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）のユニークなＰｓｔＩ部位に連結し、ＰｓｔＩでの消化、およびＣＩＡＰでの処理によって処理した。ｐ６０およびメソセリンドメインの一致したＮ−ＣＯ向きは、制限エンドヌクレアーゼマッピングによって確認した。これらのプラスミドはｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンおよびｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩとして知られ、ここに含まれた実施例を通じて記載されているように、（ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体のような）分泌されたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株に導入した。

ｐ６０−ヒトメソセリンタンパク質キメラコーディング遺伝子に機能的に連結したｈｌｙプロモーターを含有するプラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサブ−フラグメントの配列を図５３に示す。

ｐ６０−ヒトメソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩタンパク質キメラコーディング遺伝子に機能的に連結したｈｌｙプロモーターを含有するプラスミドｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサブ−フラグメントの配列は図５４に示す。
ｐ６０−メソセリンタンパク質キメラの発現および分泌のウェスタン分析：
実施例を通じて議論したように、選択された異種抗原の発現および分泌の結果ＭＨＣクラスＩ−制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の優れたプライミングがもたらされる。本明細書中に記載された方法によって作成された、ｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンまたはｐＰＬ２−ｈｌｙＰ−Ｎｐ６０ＣｏｄＯｐ（１−７７）−メソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩプラスミドのｔＲＮＡ−Ａｒｇ染色体挿入を含有する組換えＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体による培地へのタンパク質キメラの発現および分泌を、メソセリン特異的ポリクローナル抗体を用い、ここに含まれた実施例に記載された方法によってウェスタン分析によってテストした。

レーンのいくつかで示されたタンパク質についてのｈメソセリン（ここではΔＳＳΔＧＰＩ、ΔＳＰ／ΔＧＰＩ、ΔＳＳ／ΔＧＰＩ等ともいわれるΔＳＰΔＧＰＩ）における示された作成欠失は以下の通りであった：欠失されたシグナル配列（ΔＳＰ）はｈメソセリンのＮ−末端３４アミノ酸に対応する（ヒトメソセリンの配列については、例えば、図３４またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ００９２７２参照）。欠失されたＧＰＩ（ΔＧＰＩ）ドメインは、アミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏで開始し、アミノ酸残基Ｔｈｉ−Ｌｅｕ−Ａｌａで終わるＣ−末端４２アミノ酸に対応する（例えば、図３４参照）。

この分析の結果は、（Ｎ−末端シグナル配列および２つのＬｙｓＭ細胞壁結合ドメインの最初の間のｐ６０のアミノ酸７０においてイン・フレームに挿入された）ヒトメソセリンまたはヒトメソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩの正確な挿入をもつｐ６０よりなるタンパク質キメラは組換えＬ．ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓから効果的に発現され分泌されることを示した。図５５参照。（図５５のＹ−軸はかなり左側のレーンで実行されたラダーにおけるタンパク質の分子量（ｋＤａで表す）を示す。具体的には、図５５におけるレーン１ないし４は、ヒトメソセリンまたはヒトメソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩを含有する予測されるタンパク質キメラの発現および分泌を示す。全長メソセリンに対するヒトメソセリンΔＳＰ／ΔＧＰＩの発現および分泌の増大した効率はレーン２および４で明らかである。レーン３および４に示されたタンパク質キメラにおいては、真正Ｎ−末端ｐ６０アミノ酸を用いた。図５５におけるレーン１および２で実行されたキメラにおいては、各々、位置２９および６４におけるアミノ酸ＴおよびＶをコードするヌクレオチドが欠失された。レーン５は（シグナルペプチドおよびメソセリンコード配列がＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化された）ヒトΔＳＰΔＧＰＩ−メソセリンに融合したＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓＰＡシグナルペプチドの発現および分泌を示し、レーン６は（シグナルペプチドおよびメソセリンコード配列が共にＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化された）全長ヒトメソセリンに融合したＬＬＯの発現および分泌を示す。レーン８はＪ２９３、ヒト細胞系タンパク質発現により示し、他方、レーン７は全長ヒトメソセリンをコードするプラスミドを含有するＪ２９３によって発現され分泌されたタンパク質を示す（「Ｊ２９３／全長」）。レーン１０は内因性ｐ６０が欠失したＬｉｓｔｅｒｉａからのタンパク質の発現および分泌を示す。図５５における下方パネルは、ポリクローナルα−ｐ６０抗体を用いるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｐ６０分泌のウェスタン分析を示す。結果は、等量のＬｍ−分泌タンパク質がゲルに負荷されたことを示す。

ｐ６０は分子シャペロンとして用い、異種タンパク質を分泌し、ＭＨＣクラス経路の提示を容易とすることができることを示す。

（実施例３０：組換えＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる抗原の発現および分泌のさらなる例）
（Ａ．非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドを用いるビシストロニック構築体からのＥｐｈＡ２の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の発現）
図５６は、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ、非ｓｅｃＡ１シグナル配列を用いるビシストロニックメッセージからのＥｐｈＡ２の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の発現および分泌のウェスタンブロット分析を示す。

ＥｐｈＡ２は細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）よりなるタンパク質である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢはビシストロニックｍＲＮＡを発現するように作成され、ここに、ビシストロニックｍＲＮＡは区別されるポリペプチドとしてＥｐｈＡ２の細胞外ドメインおよび細胞内ドメインをコードした。構築体で用いたシグナル配列をコードする配列の全て（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤシグナルペプチド、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナルペプチド、およびＬ．ｌａｃｔｉｓＵｓｐ４５シグナルペプチド）はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化されていた。ＥＣＤおよびＩＣＤドメインをコードする配列もまたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの発現につきコドン最適化されていた。ＬＬＯ遺伝子からのＬｉｓｔｅｒｉａｌプロモーターｈｌｙはこれらの構築体におけるプロモーターとして用いた。

ビシストロニックｍＲＮＡをコードする発現カセットは組み込みベクターｐＰＬ２を用いてＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込んだ。標準的技術を用いる種々の細菌画分のウェスタンブロット分析を用いて、蓄積された細胞内ＥｐｈＡ２ドメインを検出し、測定した。結果は、ＥｐｈＡ２細胞内のドメインが、コドン最適化配列によってコードされた非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナルペプチドを用いてビシストロニック構築体から発現され、分泌されたことを示した。

発現構築体は：（１）ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインについてのコード配列と操作可能に（機能的に）連結されたＬ．ｌａｃｔｉｓＵｓｐ４５分泌配列をコードするコドン最適化配列（第一のポリペプチド）およびＥｐｈＡ２の細胞内ドメインと操作可能に連結したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤ分泌シグナルをコードするコドン最適化配列（レーン１）；および（２）ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインについてのコード配列と操作可能に連結したＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原分泌配列をコードするコドン最適化配列（第一のポリペプチド）およびＥｐｈＡ２の細胞内ドメインについてのコード配列に操作可能に連結したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤ分泌配列をコードするコドン最適化配列をコードする（第二のポリペプチド）（レーン２ないし３（２つの異なるクローン）；前期実施例２８におけるこの発現カセットの構築の記載参照）。減弱化された親ＬｉｓｔｅｒｉａΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ株でのコントロール実験（レーン４）は、いくつかのコントロールブロットにおける可変量の検出可能な交差反応性を示した。レーン１ないし３はゆっくり移動するバンドおよび速く移動するバンドを示し、ここに、速く移動するバンドは細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に対応する。構築体（レーン１ないし３）の全てからのＥｐｈＡ２の発現された細胞内ドメインは全ての３つの細菌画分で観察された。レーン４（コントロール）は遅く移動するバンドのみを示す。抗体は細胞外ドメインで利用できなかったため、細胞外ドメインの発現／分泌はアッセイしなかった。

（Ｂ．種々のコドン最適化シグナルペプチドとのＮ−末端融合の関数としてのネズミメソセリンのプラスミドベースの発現および分泌）
図５７は、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナル配列および非ｓｅｃＡ１シグナル配列を含めた、種々のシグナルペプチドを用いるコドン最適化メソセリンコード配列から発現されたネズミメソセリンのプラスミドベースの発現および分泌を示す。ネズミメソセリンのプラスミドベースの発現および分泌は、コドン最適化配列によってコードされた種々のシグナルペプチドとのＮ−末端融合の関数として示される。全ての場合、メソセリン融合タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列はコドン最適化されており、ならびにネズミメソセリンコード配列はＮ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの発現につきコドン最適化されていた。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのネズミメソセリンの発現および分泌を測定し、ここに、ＬｉｓｔｅｒｉａはｐＡＭ４０１プラスミドを保有し、ここに、プラスミドはメソセリンをコードした。種々のプラスミド−構築体をテストし、ここに、シグナル配列を変化させた。ウェスタンブロットを分泌されたタンパク質（Ａ）細胞壁（Ｂ）細胞溶解物（Ｃ）の種々の画分から回収されたタンパク質で行った。各画分につき、レーン１ないし２はＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナル配列との融合として発現されたネズミメソセリンを示し、レーン３ないし４はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓＵｓｐ４５シグナル配列との融合として発現されたネズミメソセリンを示し、レーン５ないし６はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤシグナル配列との融合として発現されたネズミメソセリンを示し、レーン７ないし８はｐ６０シグナル配列との融合として発現されたネズミメソセリンを示し、レーン９ないし１０はＬＬＯシグナル配列との融合として発現されたネズミメソセリンを示し、レーン１１はコントロール宿主Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔａＡΔｉｎｌＢによって発現されたタンパク質を示す。結果は、最大の発現および分泌が見出され、そこでは、シグナル配列はＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナル配列（レーン１ないし２）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤシグナル配列（レーン５ないし６）よりなることを示す。

（Ｃ．Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ染色体ベースの発現およびヒトメソセリンの分泌）
図５８は、種々の細菌細胞画分（すなわち、分泌されたタンパク質、細胞壁、および溶解物）におけるヒトメソセリンのＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ染色体ベースの発現および分泌のウェスタンブロット分析を示す。非ＬｉｓｔｅｒｉａｌｓｅｃＡ１および非ｓｅｃＡ１シグナルペプチドと融合した場合に、ヒトメソセリンの発現および分泌をテストした。テストしたＬｉｓｔｅｒｉａ細菌は全てΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢＬｉｓｔｅｒｉａであり、以下の通りであった：Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（メソセリンを発現するように作成しなかったコントロールＬｉｓｔｅｒｉａ）（レーン１）；ΔＳＳ／ΔＧＰＩｈメソセリンに融合したＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナル配列をコードするＬｉｓｔｅｒｉａ（レーン２ないし３）；ΔＳＳ／ΔＧＰＩｈメソセリンに融合したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤシグナル配列をコードするＬｉｓｔｅｒｉａ（レーン４ないし５）；全長ｈメソセリンと融合したＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナル配列をコードするＬｉｓｔｅｒｉａ（レーン６ないし７）；全長ｈメソセリンに融合したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤシグナル配列をコードするＬｉｓｔｅｒｉａ（レーン８ないし９）。

前記したＬｉｓｔｅｒｉａの全てにおけるメソセリンに融合したシグナル配列をコードする配列をＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの発現につきコドン最適化した。加えて、メソセリンコード配列（ΔＳＳ／ΔＧＰＩおよび全長）を、構築体の各々において、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでの発現につきコドン最適化した。メソセリンを発現する前記Ｌｉｓｔｅｒｉａの各々において、メソセリン発現カセットをｐＰＬ２との組込みを介してＬｉｓｔｅｒｉａ染色体に挿入した。

最高の発現が、ヒトメソセリンをそのシグナル配列を欠失し、疎水性領域（ｇｐｉ領域）を欠失するように作成したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐｈｏＤ分泌配列で起こった（レーン４ないし５）。

（実施例３１組換えＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンの免疫原性および抗−腫瘍効率のさらなる例）
以下の例は、本発明のＬｉｓｔｅｒｉａでのワクチン接種の結果、例えば、サイトカイン発現のワクチン依存性刺激、腫瘍を持つ動物のワクチン依存性生存、腫瘍転移におけるワクチン依存性低下、および腫瘍容量におけるワクチン依存性低下を開示する。

（Ａ．Ｐ−６０モデル抗原キメラを含むＬｉｓｔｅｒｉａワクチンの免疫原性）
図５９ＡおよびＢは、ｐ６０−抗原キメラまたはＬＬＯシグナルペプチド−抗原融合タンパク質いずれかを発現するＬｉｓｔｅｒｉａによるＭＨＣクラスＩ経路への異種タンパク質の送達を示す。この実験で用いた異種抗原はＡＨ１−Ａ５であった。ワクチン接種は、Ｎ−末端ｐ６０シグナルペプチド配列を含めたｐ６０ポリペプチド配列内に挿入された（ＯＶＡＳＬ８ペプチドと融合した）ＡＨ１−Ａ５をコードするｐ６０タンパク質キメラ発現カセットを含むように作成されたＬｉｓｔｅｒｉａ、（「ｐ６０ベースの構築体」）または同一抗原、ＯＶＡ内に埋められたＡＨ１−Ａ５をコードする核酸に連結されたＬＬＯシグナルペプチドをコードするように作成されたＬｉｓｔｅｒｉａ（「ＬＬＯベースの構築体」）を用いた。これらの構築体は共にＬｉｓｔｅｒｉａｌプロモーターｈｌｙを用いた。ｐ６０はｓｅｃＡ２経路によって分泌されるＬｉｓｔｅｒｉａｌペプチドグリカン自己溶解素であり、他方、ＬＬＯはリステリオリシンである。

ｐ６０ベースの構築体を作成するために、ｐ６０をコードする核酸をＰｓｔＩクローニング部位を含むように作成し、ここに、ＰｓｔＩクローニング部位はサイレント変異を表し、すなわち、コードされたアミノ酸配列の変化をもたらさなかった。ＰｓｔＩ部位はＮ−末端シグナル配列、およびｐ６０配列における２つのＬｙｓＭ細胞壁結合ドメインの最初の間に位置した。ＡＨ１−Ａ５エピトープ（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号：７３））およびＳＬ８エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号：１２３））を含む異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＰｓｔＩクローニング部位にイン・フレーム挿入した。これらのエピトープについてのコード配列をユニークなＸｈｏＩ部位によって分離し、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化した。ＰｓｔＩ部位への挿入は、ｐ６０のヌクレオチド塩基番号１９９の同等な箇所で起こった。ｐ６０コード配列の最初の１ないし７０アミノ酸をＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化した。従って、シグナルペプチドに対応する最初の２７アミノ酸はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現についての最適なコドンから発現された。抗原発現カセットは、さらに、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓゲノムのｔＲＮＡ^Ａｒｇ遺伝子に隣接する部位特異的組込みのために、ｐＰＬ２プラスミドのＭＣＳへの挿入用の、各々、ユニークな５’および３’ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位をさらに含んだ。ＬＬＯベースの構築体は（いずれのコドン最適化も用いることなく）ＯＶＡ内のＡＨ１−Ａ５をコードする核酸に操作可能に連結したＬＬＯシグナル配列をコードする配列を含んだ。かくして、本実験においては、シグナルペプチドはＬｉｓｔｅｒｉａＬＬＯから、またはＬｉｓｔｅｒｉａｐ６０からのものであった。

構築体をｐＰＬ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムとの部位特異的組換えを媒介するベクターに入れ、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムに挿入した。

図５９ＡおよびＢは、ｐ６０キメラとしてのｐ６０シグナル配列／自己溶解素と共にＡＨ１−Ａ５抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａのワクチン接種（尾静脈）への免疫応答、およびＬＬＯシグナル配列と連結したＡＨ１−Ａ５抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａのワクチン接種に対する免疫応答を示す。図面のｘ−軸において、「Ｕｎｓｔｉｍ」は、ペプチドはウェルに加えられなかった（すなわち、細胞は刺激しなかった）ことを意味し、他方、「ＡＨ１」はＡＨ１ナノペプチドをウェルに加えたことを意味し、および「ＡＨ１−Ａ５」は、ＡＨ１−Ａ５ナノペプチドをウェルに加えたことを意味する。全ての細菌ワクチンをＡＨ１−Ａ５をコードする組み込まれた核酸を含むように作成した（細菌ワクチンはＡＨ１をコードしなかった）（例えば、Ｓｌａｎｓｋｙ，ｅｔａｌ．，（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：５２９−５３８参照）。ワクチン接種をｐ６０ベースの構築体を含むＬｉｓｔｅｒｉａで行った場合、該株は図面のｘ−軸上に「ｐ６０」として示される。ワクチン接種をＬＬＯベースの構築体を含むＬｉｓｔｅｒｉａで行う場合、該株は図面のｘ−軸上に「ＬＬＯ」として示す。

ｐ６０ベースの構築体を発現するＬｉｓｔｅｒｉａでのワクチン接種についての全プロトコルは以下の通りであった：（１）マウスを組み込まれた核酸を含有するＬｉｓｔｅｒｉａでワクチン接種し（尾静脈（ｉ．ｖ．））、ここに、組み込まれた核酸はｐ６０のヌクレオチド１９９に挿入されたＡＨ１−Ａ５をコードする核酸を含有するｐ６０をコードした。換言すると、ＡＨ１−Ａ５抗原をコードする核酸はｐ６０シグナル配列およびｐ６０自己溶解素とイン・フレームであり、それに操作可能に連結した。ＡＨ１−Ａ５をコードする核酸はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化された；（２）感染から７日後に脾臓を摘出し；（３）脾臓細胞をバラバラにし、ウェルに入れ、脾臓細胞を、ｘ−軸上に示すように、ペプチドを加えずに（図５９ＡおよびＢ）、ＡＨ１を加え（図５９Ａ）、またはＡＨ１−Ａ５を加え（図５９Ｂ）、インキュベートした；（４）ペプチドを加えた後に、細胞を５時間インキュベートし、続いて、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ８^＋Ｔ細胞を発現するＩＦＮガンマのパーセントの評価を行った。類似のプロトコルを、ＬＬＯベースの構築体を発現するＬｉｓｔｅｒｉａでのワクチン接種で用いた。

結果は、ＬｉｓｔｅｒｉａワクチンはＩＦＮガンマのＣＤ８＋Ｔ細胞発現を刺激したことを示し、ここに、加えたペプチドはＡＨ１（図５９Ａ）であり、または加えたペプチドはＡＨ１−Ａ５であった（図５９Ｂ）。組み込まれたＡＨ１−Ａ５をＬＬＯシグナル配列と操作可能に連結した場合、刺激は幾分高く、組み込まれたＡＨ１−Ａ５がｐ６０シグナル配列と操作可能に連結した場合、刺激は幾分低かった（図５９ＡおよびＢ）。

図６０ＡおよびＢは、前記したように、すなわち、図５９ＡおよびＢに示すように、同一の２つのＬｉｓｔｅｒｉａワクチンで行った実験を示す。図６０Ａは、ｐ６０ベースの構築体を含有するように作成したＬｉｓｔｅｒｉａ（「ｐ６０」）、またはＬＬＯベースの構築体を含有するように作成されたＬｉｓｔｅｒｉａ（「ＬＬＯ」）でマウスをワクチン接種した結果を示す。図６０Ａのｘ−軸に示したように、細胞ベースのアッセイはペプチドを補足せず（未刺激；「ｕｎｓｔｉｍ」）またはＬＬＯ_{９１−９９}ペプチドを補足（「ＬＬＯ９１」）；Ｂａｄｏｖｉｎａｃ＆Ｈａｒｔｙ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６４４４−６４５２）。結果は、Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチンがｐ−６０ベースの構築体またはＬＬＯベースの構築体を含有する場合、同様な免疫応答（ＩＦＮガンマ発現）を示した。細胞ベースのアッセイからの結果に反映されるように、図６０Ａにおける刺激された免疫応答は、天然ＬＬＯのＬｉｓｔｅｒｉａ内因性発現によるものである。

図６０Ｂは、ｐ６０ベースの構築体を含むように作成されたＬｉｓｔｅｒｉａでマウスをワクチン接種した場合、ｈｌｙプロモーターおよびシグナルペプチド配列をＡＨ１−Ａ５をコードする核酸と、またはＬＬＯベースの構築体を含有するように作成されたＬｉｓｔｅｒｉａと操作可能に連結した場合、ｈｌｙプロモーターおよびシグナルペプチドをＡＨ１−Ａ５をコードする核酸と操作可能に連結した場合の結果を示す。加えたペプチドは、ｘ−軸上に示すように、ペプチド無し（未刺激；「ｕｎｓｔｉｍ」）またはｐ６０_{２１７−２２５}（「ｐ６０−２１７」；Ｓｉｊｔｓ，ｅｔａｌ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９２６１−１９２６８）いずれかであった。細胞ベースのアッセイからの結果に反映されるように、図６０Ｂにおける刺激された免疫応答は、ＬＬＯベースの構築体についての内因性ｐ６０のＬｉｓｔｅｒｉａ発現、およびｐ６０ベースの構築体についての内因性ｐ６０および発現されたｐ６０タンパク質キメラ配列の組合せによるものである。

（Ｂ．ヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａの治療効果）
図６１に示した結果は、マウスにおける腫瘍細胞がヒトメソセリンを発現するように作成された場合、ヒトメソセリン（ｈｕメソセリン）を発現するＬｉｓｔｅｒｉａでのワクチン接種が腫瘍−担持マウスにおける生存を延長することを明らかにする。腫瘍細胞はヒトメソセリンを発現するＣＴ２６細胞であり、マウスはＢａｌｂ／ｃマウスであった。（本明細書中に記載された全てのＣＴ２６腫瘍実験はＢａｌｂ／ｃマウスを含んだ）。発現カセットの１つにおいて、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナル配列をコードする配列は（そのシグナル配列およびＧＰＩアンカーが欠失した）ヒトメソセリンをコードするコドン最適化配列とイン・フレームにて操作可能に連結した。ヒトメソセリンと融合したシグナルペプチドをコードする発現カセット（ΔＧＰＩΔＳＳ）を、腫瘍に対する免疫応答についての融合タンパク質の効果に関する実験においてＬｉｓｔｅｒｉａワクチンにて腫瘍−担持マウスに投与した。メソセリン融合タンパク質をコードする発現カセットはＬｉｓｔｅｒｉａ染色体に組み込まれていた。０日において、ヒトメソセリンを発現する２×１０^５ＣＴ２６細胞（ＣＴ．２６ｈｕＭｅｓｏ＋）をＢａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射した。マウスのワクチン接種は尾静脈におけるものであった（ｉ．ｖ．）。ｌｅ７コロニー形成タイム（ＣＦＵ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ（ｉ．ｖ．）での接種は３日に起こった。

図６１は、ヒトメソセリンを発現するＣＴ２６腫瘍に対するマウスの（ｙ−軸上に示した）パーセント生存を示し、ここにワクチンはハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（偽ワクチン；「ＨＢＳＳ」）；組み込まれた発現カセットからのＳＦ−ＡＨ１Ａ５を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（陽性コントロールワクチン；「ＳＦ−ＡＨ１Ａ５」）；または（コドン最適化された配列によってコードされた）ｈｕメソセリンと融合された（非コドン最適化配列によってコードされたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナル配列をコードする発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを含み、ここに、ｈｕメソセリンは欠失されたシグナルペプチドおよび疎水性ｇｐｉ−アンカリングペプチドをコードする欠失された領域を有した（「ＢａＰＡ−ｈｕＭｅｓｏΔｇｐｉΔｓｓ」）。ＳＦ−ＡＨ１Ａ５構築体およびＢａＰＡ−ｈｕＭｅｓｏ ΔｇｐｉΔｓｓ構築体を担うＬｉｓｔｅｒｉａは、染色体に組み込まれた構築体としてこれらの構築体を含んだ。ＳＦ−ＡＨ１Ａ５をコードする核酸分子、およびＢａＰＡ−ｈｕＭｅｓｏ ΔｇｐｉΔｓｓ構築体をコードする核酸分子はｐＰＬ２を用いてＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれていた。ＳＦは、ＳＬ８としても知られた、オボアルブミンに由来する８つのアミノ酸ペプチドが不足している（例えば、ＳｈａｓｔｒｉａｎｄＧａｎｚａｌｅｚ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２７２４−２７３６参照）。略語「ＳＦ−ＡＨ１Ａ５」、「ＳＦ−ＡＨ１−Ａ５」および「ＯＶＡ／ＡＨ１−Ａ５」とは、オボアルブミンスカフォールドに連結したＡＨ１−Ａ５をいう。「ＳＦＡＨ１−Ａ５」とは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１０１２（オボアルブミン）のアミノ酸１３８ないし３８６のＮ−末端に融合したＡＨ１−Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号：７３））およびＳＦペプチドをいう。「ＳＦ−ＡＨ１Ａ５」をコードするポリヌクレオチドはこの例においては、ＡＨ１−Ａ５をコードするコドン最適化核酸、およびオボアルブミン由来をコードする非コドン最適化核酸を含むものであった。

結果は、ｈｕメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａでの単一免疫化が、ｈｕメソセリン−発現腫瘍を含有するマウスの生存を延長することを示す。生存パーセンテージは、Δシグナル配列／Δｇｐｉｈｕメソセリンと融合した染色体に組み込まれたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナル配列（ＢａＰＡ−ｈｕＭｅｓｏ ΔｇｐｉΔｓｓ；塗り潰した四角）で最高であった。生存は、「ワクチン接種」がコントロール塩溶液で行った場合に最低であった。

（Ｃ．メソセリン特異的抗−腫瘍効率のためヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａをワクチン接種した腫瘍−担持マウスにおける肺腫瘍節レベルの低下）
図６２におけるデータは、肺腫瘍節のレベルがヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａΔａｃｔＡΔｉｎｌＢでのワクチン接種によって低下することを示し、ここに、腫瘍細胞はヒトメソセリンを発現するように作成されていた。マウス株はＢａｌｂ／ｃであって、肺腫瘍細胞はヒトメソセリンを発現するベクターを保有するＣＴ２６細胞であった。０日において、ヒトメソセリンを発現する２×１０^５ＣＴ２６細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに静脈内投与した。種々のシグナル配列をコードする配列は、発現カセット中のヒトメソセリンをコードするコドン最適化配列にイン・フレームにて操作可能に連結されていた。ヒトメソセリンに融合した種々のシグナルペプチドをコードする発現カセットを、発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａワクチンを介する腫瘍−担持マウスに投与した。３日に、１×１０^７ＣＦＵ／１００μＬのＬｉｓｔｅｒｉａワクチンを腫瘍−担持マウスに静脈内投与した。陰性コントロールワクチン接種はＨＢＳＳまたはＬｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢで行った。陽性コントロールワクチン接種は（ＯＶＡ配列とイン・フレームである）ＡＨ１Ａ５を含むＯＶＡ融合タンパク質を発現するＬｉｓｔｅｒｉａで行った（ＡＨ１Ａ５を発現するＯＶＡ融合タンパク質は非―コドン最適化発現カセットによってコードされた）。１９日に、マウスを犠牲にし、それらの肺を収穫し、肺腫瘍節をカウントした。

Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチンは肺における転移の数を低下させた。ＨＢＢＳまたはＬｉｓｔｅｒｉａΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのみを含むコントロールワクチンの結果、各々、肺当たり一致した２５０転移および肺当たり１３５転移の平均が検出された。ヒトメソセリンに融合したＬＬＯシグナルペプチドをコードするプラスミド（ｐＡＭ４０１）を担うＬｉｓｔｅｒｉａ（「ｐＡＭ−ＬＬＯ−ＨｕＭｅｓｏ」）は、肺当たり約２５の転移を示した。ＬＬＯシグナルペプチドおよびヒトメソセリン配列をコードしたｐＡＭ−ＬＬＯ−ＨｕＭｅｓｏプラスミドのポリヌクレオチド配列は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化された。ｈｕメソセリンと融合したＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナル配列（ＢａＰＡ）をコードする組み込まれた配列（Δｇｐｉ／Δシグナル配列）を担うＬｉｓｔｅｒｉａ（「ＢａＰＡ−ＨｕＭｅｓｏ ΔｇｐｉΔｓｓ」）は、平均して肺当たり平均約２５の転移を示した。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナル配列をコードしたＢａＰＡ−ＨｕＭｅｓｏ ΔｇｐｉΔｓｓにおけるポリヌクレオチドはコドン最適化されず、他方、メソセリンシグナルペプチドおよびＧＰＩアンカーを欠失したヒトメソセリン配列をコードしたポリヌクレオチドはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化された。

図６３は、ＣＴ．２６親標的細胞を用いて生じた肺腫瘍節を含むマウスを用いるコントロール実験の結果を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いたが、ｗｔＣＴ２６はその代わり注射した（０日に２×１０^５細胞（ｉ．ｖ．））。実験は、メソセリン融合タンパク質を発現するＬｉｓｔｅｒｉａワクチンでのワクチン接種の抗−腫瘍効果はメソセリンと特異的であることを示す。種々のシグナル配列をコードする配列は発現カセット中のヒトメソセリンをコードするコドン最適化配列とイン・フレームと操作可能に連結していた。（この実験で用いた構築体は、図６２で示したデータを生じた前記実験で用いたものと同一であった）。ヒトメソセリンと融合した種々のシグナルペプチドをコードする発現カセットは、発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａワクチンを介して腫瘍−担持マウスに投与された。ワクチン接種は尾静脈におけるものであった（３日において１×１０^７ＣＦＵ／１００μＬｉ．ｖ．）。この特定の実験において、腫瘍細胞はヒトメソセリンを発現しなかった。生存が測定された。データが利用できる場合、肺転移の数も測定した。各ワクチン接種群においては合計５匹のマウスがいた。陰性コントロール接種はＨＢＳＳまたはＬｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを含んだ。陽性コントロール接種は、ＡＨ１Ａ５を含むＯＶＡ融合を発現するＬｉｓｔｅｒｉａを含んだ（コドン最適化せず）。

結果を図６３に示す。十字は、生存しなかったことを示し、各ワクチン接種群は５匹のマウスを含んだ。陽性コントロール接種では、マウスは生存し、肺における検出された転移の数は平均して肺当たり約２５であった。腫瘍細胞はヒトメソセリンを発現するように作成しなかったため、ヒトメソセリンと融合したＬＬＯシグナルペプチドを発現するプラスミドを保有するＬｉｓｔｅｒｉａ（「ｐＡＭ−ＬＬＯ−ＨｕＭｅｓｏ」）接種したマウスは生存しなかった。マウスを、ヒトメソセリン（Δｇｐｉ／Δシグナル配列）（「ＢａＰＡ−ＨｕＭｅｓｏ ΔｇｐｉΔｓｓ」）と融合した染色体に組み込まれたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原分泌配列（ＢａＰＡ；非コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる）を担うＬｉｓｔｅｒｉａで接種した場合、いくらかは生存したが、他は生存しなかった。

（Ｄ．コドン最適化ヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａでのワクチン接種は腫瘍容量を低下させる）
図６４は、コドン最適化メソセリンコドン配列を含む発現カセットからのヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ（ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）でのワクチン接種が腫瘍容量を低下させることを示す。

種々のシグナル配列をコードする配列は、発現カセット中のヒトメソセリンをコードするコドン最適化配列とイン・フレームにて操作可能に連結させた。ヒトメソセリンと融合した種々のシグナルペプチドをコードする発現カセットを、発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａワクチンを介する腫瘍−担持マウスに投与した。この実験において腫瘍−担持マウスのワクチン接種で用いたヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａワクチンは以下のものを含む：ヒトメソセリン（「ｐＡＭｏｐｔ．ＬＬＯ−ｏｐｔ．ｈｕＭｅｓｏ」）と融合した（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現につきコドン最適化された配列によってコードされた）ＬＬＯシグナルペプチドを発現し、それを分泌するｐＡＭ４０１プラスミドを担持するＬｉｓｔｅｒｉａ（ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ｈｕメソセリン（「ｐＡＭ非ｏｐｔ．ＢａＰＡ−ｏｐｔ．ｈｕＭｅｓｏ」）と融合した（非コドン最適化発現カセットによってコードされた）Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナル配列を発現するｐＡＭ４０１プラスミドを担うＬｉｓｔｅｒｉａ；およびｈｕメソセリンと融合した非コドン最適化配列によってコードされたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナルペプチドをコードする組み込まれた発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａ、ここに、ｈｕメソセリンは欠失されたシグナルペプチド、および疎水性ｇｐｉ−アンカリングペプチド（「非ｏｐｔ．ＢａＰＡ−ｏｐｔ．ｈｕＭｅｓｏｄｅｌｇｐｉ−ｓｓ」）をコードする欠失された領域を有した。

実験において、ヒトメソセリンを発現するように設計された２×１０^５細胞のＣＴ２６ネズミコドン腫瘍細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに皮下移植した（０日）。５匹のマウスを各ワクチン接種群に含めた。ＣＴ２６細胞の注射後３日に、非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌコントロール、または１×１０^７コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｉｓｔｅｒｉａワクチンをマウスに静脈内接種した。陰性コントロールはＨＢＳＳを含むものであった。陽性コントロール接種は、（コドン最適化された）ＳＦ−ＡＨ１Ａ５を発現するＬｉｓｔｅｒｉａを含んだ。（ＳＦは、ＳＬ８（例えば、ＳｈａｓｔｒｉａｎｄＧａｎｚａｌｅｚ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２７２４−２７３６）参照）としても知られた、オボアルブミンに由来する８つのアミノ酸ペプチドである）。種々の時点において、平均腫瘍容量を決定した。

この実験の結果は図６４に示される。結果は、種々のシグナルペプチドと融合したヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａでのワクチン接種が腫瘍容量を低下させることを示した。ヒトメソセリンと融合したＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナルペプチドを発現するＬｉｓｔｅｒｉａでのワクチン接種は保護的であった（点線を施した塗り潰ぶしていない丸）。ＬＬＯシグナルペプチドを融合したプラスミド−コーデッドヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａとのワクチン接種は保護的であった（塗り潰ぶしていない三角）。ヒトメソセリン（Δｇｐｉ／Δシグナルペプチド）（実線を施した塗り潰していない卵型）と融合したＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原（非コドン最適化核酸）シグナルペプチドをコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａでのワクチン接種もまた保護的であった。陽性コントロールに関しては、染色体に組み込まれたＳＦ−ＡＨ１Ａ５（塗り潰ぶしていない四角）を発現するＬｉｓｔｅｒｉａも保護的であった。最高の腫瘍容量、および腫瘍成長開始の最も早い時間は偽ワクチン（ＨＢＳＳ）を受けたマウスで起こった。

（Ｅ．非Ｌｉｓｔｅｒｉａｌシグナル配列に融合したヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａワクチンの免疫原性）
図６５は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ−ｈメソセリン株の免疫原性を示し、ここに、該ＬｉｓｔｅｒｉａはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓシグナルペプチド（最適化ＢａＰＡｈＭｅｓｏ ΔＧＰＩΔＳＳ）に融合したｈメソセリンをコードする染色体に組み込まれた核酸を含んだ。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、免疫応答を評価し、ここに、アッセイはインターフェロン−ガンマ発現に感受性であった。

実験は以下の工程を含んだ：（１）マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウス）を、（メソセリンシグナル配列および疎水性ｇｐｉ−アンカリング配列が欠失されたコドン最適化配列によってコードされた）ｈｕメソセリンに融合した（非コドン最適化配列によってコードされた）Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ保護抗原シグナルペプチドをコードする組み込まれた発現カセットを含むＬｉｓｔｅｒｉａでワクチン接種した（ｉ．ｖ．）；（２）７日後、脾臓を摘出した；（３）脾臓から摘出した細胞をウェルに分散させた。各ウェルは約２００，０００脾臓細胞を収容した；（４）示したように、３種類の培地のうちの１つをウェルに加えた。Ｂａｌｂ／ｃマウスでの実験からの脾臓細胞は培地のみ（「未刺激」）、メソセリンペプチドプール（「Ｍｅｓｏプール」）、またはＰ６０_{２１７−２２５}（「ｐ６０_２１７」）を受けた。Ｃ５７ＢＬ／６での実験からの脾臓細胞は培地のみ（「未刺激」）、メソセリンペプチドプール（「Ｍｅｓｏプール」）、またはＬＬＯ_{２９６−３０４}（「ＬＬＯ_{２９６−３０４}」）；を受領した；（５）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行って、加えたペプチドに応答する免疫細胞の数を決定した。メソセリンペプチドプールは１５３の異なるペプチドを含み、ここに、これらのペプチドはｈメソセリンの全配列にわたっており、ここに、各ペプチドは１５アミノ酸の長さであり、１１アミノ酸だけ隣接ペプチドと重複していた。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図６５に示す。結果は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓシグナルペプチドと融合したヒトメソセリンを発現するＬｉｓｔｅｒｉａワクチンがＢａｌｂ／ｃマウスにおけるメソセリンに対する免疫応答を誘導できることを示した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ−発現ｈメソセリンに対するより高いＩＧＮ−ガンマ応答が、Ｃ５７ＢＬ／６免疫系よりもＢａｌｂ／ｃマウス免疫系で観察された。ｐ６０またはＬＬＯに対するＥＬＩＳＰＯＴシグナルは、Ｌｉｓｔｅｒｉａの天然に起こるｐ６０およびＬＬＯタンパク質に応答した。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列双方を含めた）受託番号／データベース配列は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトまたは受託番号／データベース配列が引用によりそのように一体化されることを具体的にかつ個々に示されたかと同程度に、全ての目的のために、ここに引用してその全体を援用する。

ＰＴＡ−５５６２
ＰＴＡ−５５６３
ＰＴＡ−５８２５

Claims

明細書中に記載の発明。