JP2006521376A5 - - Google Patents
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(関連出願)
本出願は、その各々の内容を、ここに引用して本開示に一体化させる、2003年2月6日に出願された米国仮出願第60/446,051号、2003年2月21日に出願された米国仮出願第60/449,153号、2003年7月24日に出願された米国仮出願第60/490,089号、2003年10月15日に出願された米国仮出願第60/511,869号、2004年2月2日に出願された「Listeria Attenuated for Entry into Non−Phagocytic Cells,Vaccines comprising the Listeria,and Methods of Use Thereof」なる発明の名称の米国仮出願に対する優先権の利益を主張する。
本出願は、その各々の内容を、ここに引用して本開示に一体化させる、2003年2月6日に出願された米国仮出願第60/446,051号、2003年2月21日に出願された米国仮出願第60/449,153号、2003年7月24日に出願された米国仮出願第60/490,089号、2003年10月15日に出願された米国仮出願第60/511,869号、2004年2月2日に出願された「Listeria Attenuated for Entry into Non−Phagocytic Cells,Vaccines comprising the Listeria,and Methods of Use Thereof」なる発明の名称の米国仮出願に対する優先権の利益を主張する。
(発明の分野)
本発明は、一般に、ワクチン組成物および免疫療法に関する。特に、本発明は、個体に特定の抗原を送達するのに用いることができる改変された自由生活微生物の集団を含むワクチン組成物に関する。そのような組成物において、ワクチンは、微生物それ自体、または微生物に取り込まれた異種抗原に対して向けられる。また、本発明は、樹状細胞のような抗原提示細胞の活性化および成熟を負荷し、誘導するための改変された微生物の使用に関する。
本発明は、一般に、ワクチン組成物および免疫療法に関する。特に、本発明は、個体に特定の抗原を送達するのに用いることができる改変された自由生活微生物の集団を含むワクチン組成物に関する。そのような組成物において、ワクチンは、微生物それ自体、または微生物に取り込まれた異種抗原に対して向けられる。また、本発明は、樹状細胞のような抗原提示細胞の活性化および成熟を負荷し、誘導するための改変された微生物の使用に関する。
(発明の背景)
主に、ウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる感染症の予防を標的とする、臨床的使用のために種々のワクチンが開発されてきた。ワクチンは、生きた弱毒化された微生物、不活化された(死滅した)微生物、または微生物それ自体の成分から調製することができる。生きた弱毒化された微生物は、よりビルレントではない微生物に由来する、ビルレンス因子の欠失のような遺伝的改変を含む。不活化ワクチンでは、微生物は化学的にまたは物理的に不活化することができる。理想的には、そのようなワクチンは感染を引き起こすことはできないが、依然として、所望の免疫応答を刺激することができる。不活化されたワクチンの例はポリオおよびインフルエンザウイルス、およびコレラおよび破傷風に対する細菌ワクチンを含むが、生きた弱毒化ワクチンはポリオ、インフルエンザおよびコレラでは同様に任意である。所望の免疫応答を惹起するためには、不活化微生物は不活化に先立って適当な抗原を含むことが重要である。ある場合には、感染性微生物によるデ・ノボ遺伝子発現が最適な免疫応答を刺激するのに必要な故に、微生物の不活化は有意に低下した免疫応答をもたらすことが観察されている。これは、細胞内細菌で特に重要である。細菌を不活化するのに用いられてきた方法は、アセトン、アルコール、ホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはフェノール、加熱、または紫外線照射の使用を含む[Paceら、Vaccine 16(16):1563(1998)]。
主に、ウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる感染症の予防を標的とする、臨床的使用のために種々のワクチンが開発されてきた。ワクチンは、生きた弱毒化された微生物、不活化された(死滅した)微生物、または微生物それ自体の成分から調製することができる。生きた弱毒化された微生物は、よりビルレントではない微生物に由来する、ビルレンス因子の欠失のような遺伝的改変を含む。不活化ワクチンでは、微生物は化学的にまたは物理的に不活化することができる。理想的には、そのようなワクチンは感染を引き起こすことはできないが、依然として、所望の免疫応答を刺激することができる。不活化されたワクチンの例はポリオおよびインフルエンザウイルス、およびコレラおよび破傷風に対する細菌ワクチンを含むが、生きた弱毒化ワクチンはポリオ、インフルエンザおよびコレラでは同様に任意である。所望の免疫応答を惹起するためには、不活化微生物は不活化に先立って適当な抗原を含むことが重要である。ある場合には、感染性微生物によるデ・ノボ遺伝子発現が最適な免疫応答を刺激するのに必要な故に、微生物の不活化は有意に低下した免疫応答をもたらすことが観察されている。これは、細胞内細菌で特に重要である。細菌を不活化するのに用いられてきた方法は、アセトン、アルコール、ホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはフェノール、加熱、または紫外線照射の使用を含む[Paceら、Vaccine 16(16):1563(1998)]。
微生物それ自体によって引き起こされる感染症を予防するための微生物ワクチンの使用に加えて、微生物は、ある種のタンパク質または抗原をコードする異種核酸配列を含むように改変することができる。そのような組換え微生物は送達ビヒクルとして用いられ、異種抗原に対する免疫応答を誘導するためにワクチンとして用いることができる。これらの組換えワクチンは、動物モデルにおいて効果的であることが示されている。Plasmodium bergheiサーカムスポロザイト抗原を発現するように改変された生きた弱毒化Salmonellaの経口ワクチンは、マウスをマラリアに対して保護することが示されている[Aggarwalら、J Ex Med 172(4):1083(1990)]。同様に、米国特許第6,051,237号は、癌ワクチンとして用いられる、腫瘍−特異的抗原を増殖させ、拡大させ、発現するListeria monocytogenesの生きた組換え体形態を記載する。そのような組換えワクチンは効果的であり得るが、各微生物株はワクチンを供するためには遺伝子的に改変されなければならない。従って、微生物が組換え抗原を含むか否かに関わらず、いずれかの微生物に適用することができる安全かつ効果的な微生物ワクチンを生産する方法を開発することが望ましいであろう。樹状細胞(DC)ベースの免疫療法は、広い範囲の腫瘍タイプの処置のための臨床的利益を提供するために広く調べられ、証明されてきた。オートロガス樹状細胞(DC)を単離し、作り出し、引き続いて、患者へのワクチン接種に先立ってエキソビボにてそれに抗原またはペプチドを負荷するために、種々の戦略が現在開発されつつある。免疫メカニズムの理解における最近の進歩は、効果的な抗原負荷に加えて、癌免疫療法の効果に対するワクチン接種で用いられるDCの活性化および成熟状態の重要性を強調している。未成熟DCは抗原の摂取および加工でより効果的であるが、活性化された/成熟DCはその能力を失うが、MHC分子の意味ではナイーブなTリンパ球に対して抗原を提示するにおいて依然としてより優れている。事実、成熟したDCは、初代Tリンパ球応答を誘導し、末梢T細胞寛容を克服し、抗−腫瘍免疫性を増強させるのに優れた抗原提示細胞(APC)であることが判明している。有望な臨床的データに導いたDCの活性化および成熟を負荷し、それを刺激するための種々の方法の開発にもかかわらず、DC活性化および成熟化を負荷する抗原と組み合わせるための標準的な効果的かつコスト的に有利な方法は依然としてない。
(発明の要旨)
本発明は自由生活微生物を含み、ここで、該微生物の増殖は、十分な微生物の遺伝子発現を維持しつつ減弱され、ここで、該減弱は用量依存的に制御することができる。本発明は、自由生活微生物のこの減弱のための方法を含む。本発明は、これらの減弱化された微生物を含むワクチン組成物を含む。また、本発明は、特に、インビトロまたはエキソビボにおいて、樹状細胞のような、抗原提示細胞の活性化および成熟を負荷し、誘導するための、改変された微生物および減弱化されたListeriaの新規な使用を提供する。得られた抗原提示細胞はワクチンおよび免疫療法で有用である。特別な具体例において、提供されたワクチンおよび免疫療法は癌に対して向けられる。
本発明は自由生活微生物を含み、ここで、該微生物の増殖は、十分な微生物の遺伝子発現を維持しつつ減弱され、ここで、該減弱は用量依存的に制御することができる。本発明は、自由生活微生物のこの減弱のための方法を含む。本発明は、これらの減弱化された微生物を含むワクチン組成物を含む。また、本発明は、特に、インビトロまたはエキソビボにおいて、樹状細胞のような、抗原提示細胞の活性化および成熟を負荷し、誘導するための、改変された微生物および減弱化されたListeriaの新規な使用を提供する。得られた抗原提示細胞はワクチンおよび免疫療法で有用である。特別な具体例において、提供されたワクチンおよび免疫療法は癌に対して向けられる。
1つの態様において、本発明は自由生活微生物を含むワクチンを提供し、ここで、微生物の核酸(例えば、ゲノム核酸)は、微生物が増殖について減弱されるように改変される。いくつかの具体例においては、微生物の増殖の減弱は用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例においては、微生物における微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物(あるいは、核酸「標的化」化合物ともいう)との反応によって改変されている。1つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物は、UVA照射によって活性化されたソラレン化合物(例えば、ここでは「S−59」ともいう4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレン)である。いくつかの具体例においては、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を改変する微生物の能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例においては、微生物はBacillus anthracisまたはListeria monocytogenesのような細菌である。いくつかの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの具体例において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアおよび/またはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含み、ここで、微生物が抗原を発現する、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供する。
もう1つの態様において、本発明は、少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物(例えば、細菌)を含むワクチンを提供する。いくつかの具体例において、自由生活微生物は、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子、またはphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例においては、微生物は、uvrAおよびuvrB双方において(または微生物の属および種に応じて、uvrAおよびuvrB双方の機能的等価物における)遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物はRecA(または微生物の属および種に応じてRecAの機能的等価物)に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物は抗原(例えば、癌抗原、または微生物に対して外来性の感染症抗原)をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの具体例において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含み、ここで、微生物が抗原を発現する、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供する。
もう1つの態様において、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体Listeria monocytogenes株のような単離された突然変異体Listeria株を提供する。いくつかの具体例においては、突然変異体Listeria株は、(UvrAおよび/またはUvrBのような)少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体Listeria株は、uvrA遺伝子および/またはuvrB遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は、American Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、受託番号PTA−5563によって確認されるListeria monocytogenes actA−/uvrAB−株である。他の具体例においては、該株はAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、受託番号PTA−5563によって確認されるListeria monocytogenes actA−/uvrAB−株の突然変異体であり、ここで、寄託された株の突然変異体はUvrA、UvrB、およびActAに関して欠損がある。本発明は、さらに、突然変異体Listeria株を含むワクチンおよびプロフェッショナル抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防または処置するために改変されたListeria株を用いる方法も提供される。
もう1つの態様において、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む単離された突然変異体Bacillus anthracis株を提供する。いくつかの具体例においては、該突然変異体株は(UvrAおよび/またはUvrBのような)少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例においては、突然変異体株はuvrA遺伝子および/またはuvrB遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株はRecAに関して減弱されている。いくつかの具体例において、突然変異体株はrecA遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は株の毒性を減少させるlef遺伝子、cya遺伝子、または双方の遺伝子における1以上の突然変異を含む。本発明は、さらに、該突然変異体株を含むワクチンおよびプロフェッショナル抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防または処置するための改変されたBacillus anthracis株を用いる方法も提供される。
1つの具体例において、本発明はソラレン化合物およびUVA光と反応した細菌を含むワクチンを含み、ここで、細菌の増殖は減弱されている。1つの具体例において、細菌の発現は、ソラレン減弱化細菌が継続してタンパク質抗原を発現できるように、ソラレン改変後に十分に活性であり、ここで、細菌は個体に投与されると、抗原に対する免疫応答が誘導される。1つの具体例において、所望の免疫応答は細菌それ自体に対するものである。1つの具体例において、細菌は異種タンパク質抗原を発現する組換え株であり、ここで、細菌が個体に投与されると、異種抗原に対する免疫応答が誘導される。異種抗原を含むそのようなワクチンは、感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病を含めた種々の疾患を処置または予防するように設計することができる。
感染症の処置または予防には、疾患を引き起こす剤は、ワクチンとして用いられるために本発明の方法に従って調製することができる。1つの具体例において、ワクチンは、ウイルス、細菌または寄生虫のような疾患を引き起こす剤からの異種抗原を含む本発明の微生物から調製することができる。そのようなワクチンは、細菌ベクターを受領する健康の危険性が、感染剤による可能な感染に関連する危険よりも有意に少ない場合に利益のレベルを提供することができる。本発明の方法によって減弱される感染症の処置または予防のための異種ワクチンは同様に他の利点を有することができる。まず、感染剤それ自体から直接的に弱毒化生ワクチンまたは死菌ワクチンを調製することができる。第二に、もし生ワクチンが必要であれば、感染剤を弱毒化し、依然として適当な免疫応答を維持することができないであろう。
もう1つの可能性は、細菌ベクターに挿入された抗原が、細菌ベクターによって誘導された先天的免疫応答の不存在下で、個体における免疫応答を刺激しないことである。例えば、オートロガス細胞が不適切に増殖する疾患は、典型的には免疫応答を刺激しない抗原を含み得る。オートロガス抗原に対するそのような免疫応答を刺激する方法を見出すことによってそのような疾患と戦うのは有用であろう。1つの具体例において、増殖する細胞は、免疫応答が増殖する細胞に対して大いに特異的なように、正常な細胞に対するよりも高いレベルで抗原を発現し、または過剰発現する。そのようなワクチンで処置することができる疾患は、限定されるものではないが、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性細胞病を含む。もう1つの具体例において、ワクチンは、疾患の産物、または疾患となった細胞それ自体よりもむしろ疾患関連標的を標的化することができる。例えば、腫瘍は、腫瘍細胞を育てるのに必要な新しい血管の生成に必須であるワクチン標的化血管内皮増殖因子(VEGF)で処置することができる。VEGFは腫瘍細胞それ自体に対しては末梢であるが、腫瘍増殖の領域で支配的であり、腫瘍細胞の増殖を潜在的に制限し得る生きたワクチン標的である。もう1つの例は、アルツハイマー病またはクロイツフェルト−ヤコープ病に特徴的なアミロイドプラークを引き起こすタンパク質のような疾患関連タンパク質に対する応答を誘導する抗原を含むワクチンである。同様に、ワクチンは自己免疫またはアレルギー反応に関与する標的タンパク質であり得る。ワクチンは、自己免疫またはアレルギー反応を引き起こす、B−細胞またはT細胞のような、特異的抗体または細胞に対する応答を誘導することができるイディオタイプ抗原を含むことができる。
1つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が減弱されるように改変された自由生活微生物集団を含むワクチン組成物を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。1つの具体例において、微生物遺伝子発現は、抗原が、個体への微生物集団の投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルで発現されるように、実質的に影響されない。1つの具体例において、微生物集団の増殖は、少なくとも約0.3log、また少なくとも約1log、約2log、約3log、約4log、約6log、または少なくとも約8logだけ減弱される。もう1つの具体例において、微生物集団の増殖は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、約0.3ないし6log、約0.3ないし5log、約1ないし5log、または約2ないし5logだけ減弱される。1つの具体例において、微生物集団による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物集団による該抗原の発現の少なくとも約10%、約25%、約50%、約75%、または少なくとも約90%である。1つの具体例において、発現された抗原は、微生物それ自体からの抗原である。1つの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。1つの具体例において、抗原は疾患関連抗原である。1つの具体例において、抗原は、感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病よりなる群から選択される疾患に関連する。1つの具体例において、抗原は、腫瘍関連抗原である。1つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。1つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Sp17、gp100、EphA2、PR3、PAGE−4、TARP、およびSPAS−1よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物核酸は、微生物の放射線への暴露、および微生物核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と微生物との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい具体例においては、微生物核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と微生物集団とを反応させることによって改変される。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される態様によって核酸に標的化される。1つの具体例において、核酸標的化化合物は核酸アルキル化剤を含む。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである。1つの具体例において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはUVA照射によって化合物の活性化に際して反応する。1つの具体例において、UVA照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2―オキサ)ブチル−4,5’、8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、核酸の改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、照射による、好ましくはUVA照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、微生物は遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱をもたらす。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される遺伝子、またはそれらの機能的同等遺伝子におけるものである。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される遺伝子、またはその機能的同等遺伝子の1を超えるにおけるものである。突然変異がrecA遺伝子である具体例において、単独であるか、あるいは1以上の他の突然変異と組み合わせられるかを問わず、recA突然変異は条件突然変異である。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrDおよびRecAよりなる群から選択されるDNA修復酵素の少なくとも1つの活性における減弱をもたらす。1つの具体例において、RecAの活性における減弱は条件的である。更なる具体例において、これらの突然変異を含む微生物は、UVA照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物は細菌である。1つの具体例において、細菌はマイコバクテリアである。1つの具体例において、マイコバクテリアはMycobacterium tuerculosisである。1つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。1つの具体例において、細胞内細菌はBacillus anthracisである。1つの具体例において、細胞内細菌はYersinia
pestisである。好ましい具体例において、細菌はListeria、好ましくはListeria monocytogenesである。1つの具体例において、Listeriaは、貪食細胞によるListeriaの摂取に有意に影響すること無く非−貪食細胞に侵入するListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。1つの具体例においてListeria突然変異はinlA、inlB、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子である。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはinlAおよびinlB遺伝子双方における遺伝子突然子を含む。1つの具体例において、Listeriaは、感染細胞のファゴリソソームを逃げ出すListeriaの能力も減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例においてListeria突然変異はhly遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeriaは、Listeriaによるアクチンの重合の減弱化をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesは1を超える突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria突然変異はactAおよびinlB遺伝子双方におけるもの、好ましくは、actAおよびinlB遺伝子双方における欠失突然変異である。
pestisである。好ましい具体例において、細菌はListeria、好ましくはListeria monocytogenesである。1つの具体例において、Listeriaは、貪食細胞によるListeriaの摂取に有意に影響すること無く非−貪食細胞に侵入するListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。1つの具体例においてListeria突然変異はinlA、inlB、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子である。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはinlAおよびinlB遺伝子双方における遺伝子突然子を含む。1つの具体例において、Listeriaは、感染細胞のファゴリソソームを逃げ出すListeriaの能力も減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例においてListeria突然変異はhly遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeriaは、Listeriaによるアクチンの重合の減弱化をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesは1を超える突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria突然変異はactAおよびinlB遺伝子双方におけるもの、好ましくは、actAおよびinlB遺伝子双方における欠失突然変異である。
1つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が減弱化されるように核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている微生物集団を含むワクチンを含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されておらず、およびここで、該集団の微生物は腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む。1つの具体例において、微生物遺伝子発現は、腫瘍抗原が、個体への微生物の投与に際して免疫応答を誘導するのに十分なレベルで発現されるように実質的に影響されない。1つの具体例において、微生物集団の増殖は少なくとも約0.3log、また少なくとも約1log、約2log、約3log、約4log、約6log、または少なくとも約8logだけ減弱化される。もう1つの具体例において、微生物集団の増殖は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、約0.3ないし6log、約0.3ないし5log、約1ないし5log、または約2ないし5logだけ減弱化される。1つの具体例において、微生物集団による腫瘍抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物集団による腫瘍抗原の発現の少なくとも約10%、約25%、約50%、約75%、または少なくとも約90%である。1つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。1つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Spl7、gp100、EphA2、PR3、PAGE−4、TARP、およびSPAS−1よりなる群から選択される。1つの具体例において、核酸標的化化合物はアルキル化剤を含む。1つの具体例において、アルキル化剤は、マスタード、マスタード中間体およびマスタード等価物よりなる群から選択される。1つの具体例において、核酸標的化化合物はインターカレーター、小溝バインダー、大溝バインダー、静電バインダー、および配列−特異的バインダーよりなる群から選択される核酸標的化群を含む。1つの具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである。1つの具体例において、核酸標的化化合物は化合物の活性化に際して核酸と直接的に反応する。1つの具体例において、化合物の活性化は照射によるものである。1つの具体例において、照射はUVA照射である。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はUVA照射によって活性化されたソラレン化合物である。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、該集団の微生物は遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱化をもたらす。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の1以上におけるものである。突然変異がrecA遺伝子におけるものである具体例において、単独であるか、あるいは1以上の他の突然変異と組み合わされているかを問わず、recA突然変異は条件突然変異である。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrDおよびRecAよりなる群から選択されるDNA修復酵素の少なくとも1つの活性における減弱化をもたらす。1つの具体例において、RecAの活性における減弱化は条件的である。さらなる具体例において、これらの突然変異を含む微生物は、UVA照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌類よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物は細菌である。1つの具体例において、細菌は細胞内細菌である、好ましい具体例において、細菌はListeria、好ましくはListeria monocytogenesである。1つの具体例において、Listeriaは、貪食細胞によるListeriaの接種に有意に影響すること無く非−貪食細胞に侵入するListeriaの能力の減弱化をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria突然変異はinlA、inlB、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはinlAおよびinlB遺伝子双方における遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、Listeriaは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すListeriaの能力の減弱化をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はhly遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeriaは、Listeriaによるアクチンの重合の減弱化をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesは1を超える突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria突然変異はactAおよびinlB遺伝子双方におけるものであり、好ましくは、actAおよびinlB遺伝子双方における欠失突然変異である。好ましい具体例において、Listeria monocytogenes actA/inlB欠失突然変異体は、さらに、uvrAB遺伝子における欠失突然変異を含む。
1つの具体例において、本発明は、リステリア核酸が、リステリア集団の増殖が減弱化されるように、UVA照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変されたListeria monocytogenes集団を含むワクチンを含み、ここで、リステリア遺伝子発現は実質的に影響されず、ここで、Listeria monocytogenesは腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、リステリア遺伝子発現は、腫瘍抗原が、個体へのListeriaの投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルにて発現されるように実質的に影響されない。1つの具体例において、リステリア集団の増殖は少なくとも約0.3log、また少なくとも約1log、約2log、約3log、約4log、約6log、または少なくとも約8logだけ減弱化される。もう1つの具体例において、リステリア集団の増殖は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、約0.3ないし6log、約0.3ないし5log、約1ないし5log、または約2ないし5logだけ減弱化される。1つの具体例において、リステリア集団による腫瘍抗原の発現は、リステリア核酸が改変されていないリステリア集団による腫瘍抗原の発現の少なくとも約10%、約25%、約50%、約75%、または少なくとも約90%である。1つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。1つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Sp17、gp100、EphA2、PR3、PAGE−4、TARPおよびSPAS−1よりなる群から選択される。1つの具体例において、Listeria monocytogenesは遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、改変されている核酸を修復するListeria monocytogenesの能力の減弱化をもたらす。1つの具体例において、遺伝子突然変異はphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、遺伝子突然変異はphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される遺伝子の1を超えるものにおけるものである。突然変異がrecA遺伝子におけるものである具体例において、単独であるか、あるいは1以上の他の突然変異と組み合わされたかを問わず、recA突然変異は条件突然変異である。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrDおよびRecAよりなる群から選択されるDNA修復酵素の少なくとも1つの活性における減弱化をもたらす。1つの具体例において、RecAの活性における減弱化は条件的である。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、貪食細胞によるListeria monocytogenesの接種に有意に影響すること無く非−貪食細胞に進入するListeria monocytogenesの能力の減弱化をもたらす。1つの具体例において、遺伝子突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria突然変異はinlA、inlB、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはinlAおよびinlB遺伝子双方における遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、Listeriaは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すListeriaの能力の減弱化をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はhly遺伝子におけるものである。1つの具体例において、遺伝子突然変異はListeriaによるアクチンの重合の減弱化をもたらす。1つの具体例において、Listeria突然変異はactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesは1を超える突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria突然変異はactAおよびinlB遺伝子双方におけるものであり、好ましくは、actAおよびinlB遺伝子双方における欠失突然変異である。好ましい具体例において、Listeria monocytogenes actA/nalB欠失突然変異体は、さらに、uvrAB遺伝子における欠失突然変異を含む。
もう1つの態様において、本発明は自由生活微生物を含むプロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物の増殖の減弱化は、用量依存的に制御することができる。いくつかの具体例において、微生物における微生物遺伝子発現は微生物の増殖の減弱化によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体における抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。1つの具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物はUVA照射によって活性化されたソラレン化合物(例えば、本明細書中では「S−59」とも言われる4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレン)である。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物は細菌である。いくつかの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。また、本発明は抗原提示細胞を含むワクチンも提供する。本発明は、さらに、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明が、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は該抗原を発現する。本発明は、さらに、ナイーブなT−細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロフェッショナル抗原提示細胞とナイーブなT細胞とを接触させることを特徴とする、ナイーブなT細胞をエキソビボおよび/またはインビトロ(相互に排除しない)で活性化させる方法を提供する。
もう1つの態様において、本発明は、少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物(例えば、細菌)を含む単離されたプロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を提供する。いくつかの具体例において、微生物は、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子、またはphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。例えば、微生物は、(微生物の属および種に応じて)uvrAおよびuvrB双方、またはuvrAおよびuvrB双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含むことができる。いくつかの具体例において、抗原提示細胞はRecA、またはRecAの機能的等価物に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含み、ここで、微生物が抗原を発現する、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法のように、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む宿主において疾患の予防または処置する方法も提供される。
もう1つの態様において、本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と、プロフェッショナル抗原提示細胞とを(インビトロまたはインビボ)にて接触させることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている)。
さらにもう1つの態様において、本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と、プロフェッショナル抗原提示細胞とを(インビトロまたはインビボ)にて接触させることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化および/または成熟させる方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている)。
なおもう1つの態様において、本発明は以下の工程(a)抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されており;次いで、(b)負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。いくつかの具体例において、微生物は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。
さらにもう1つの態様において、本発明は、抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原を発現する改変された微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボと接触させることを含む、樹上細胞のような該細胞に抗原を負荷する方法を提供する。いくつかの具体例において、微生物の増殖は減弱化される。いくつかの具体例において、微生物は該細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は減弱化される。抗原提示はMHCクラスI提示またはMHCクラスII提示であり得る。
もう1つの態様において、本発明は、樹状細胞を活性化し、および/または抗原提示細胞を成熟させるのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、改変された微生物と抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボで接触させることを含む、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を活性化および/または成熟化させる方法を提供する。1つの具体例において、微生物の増殖は減弱化される。もう1つの具体例において、微生物は該細胞の活性化および/または成熟化を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は減弱化される。
さらにもう1つの態様において、本発明は、抗原を提示する(樹状細胞のような)抗原提示細胞を含む有効量の免疫原生組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含む。1つの具体例において、微生物の増殖は減弱化されている。もう1つの具体例において、微生物は該細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖が減弱される。1つの具体例において、免疫応答はCD8+T−細胞応答である。もう1つの具体例において、免疫応答はCD4+T−細胞応答である。
なおもう1つの態様において、本発明は以下の工程(a)抗原提示細胞に抗原を負荷し、および抗原提示細胞の活性化および/または成熟化を行うのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原を発現するListeriaと(樹状細胞のような)抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボで接触させ;次いで、(b)有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。1つの具体例において、微生物の増殖は減弱化される。もう1つの具体例において、抗原提示細胞と接触される微生物は、抗原提示細胞への抗原の提示、および抗原提示細胞の活性化および/または成熟化の双方を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は減弱化される。1つの具体例において、免疫応答はCD8+T−細胞応答である。もう1つの具体例において、免疫応答はCD4+T−細胞応答である。
もう1つの具体例において、本発明は改変された微生物を含むエキソビボまたはインビトロプロフェッショナル抗原―提示細胞を提供し、ここで、微生物の増殖は減弱化される。もう1つの具体例において、改変された微生物は樹状細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は減弱化される。もう1つの具体例において、抗原提示細胞は樹状細胞である。
なおもう1つの態様において、本発明は(樹状細胞のような)抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含む。1つの具体例において、微生物はListeriaである。1つの具体例において、Listeriaの増殖は減弱化されている。もう1つの具体例において、Listeriaは、該細胞への抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、Listeriaの増殖は減弱化される。
なおさらなる態様において、本発明は(樹状細胞のような)抗原提示細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供し、ここで、抗原―提示細胞は改変されたListeriaを含む。1つの具体例において、Listeriaの増殖は減弱化されている。もう1つの具体例において、Listeriaは該細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、Listeriaの増殖は減弱化される。
前記態様の各々のいくつかの具体例において、改変された微生物は改変されたListeriaである。前記態様の各々のさらなる具体例においては、ListeriaはListeria monocytogenesである。なおさらなる具体例において、ListeriaはphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD、およびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子における突然変異を含む。例えば、前記態様のいずれかにおいて、Listeriaは所望によりuvrABにおける突然変異を含む。別の具体例において、Listeriaは、所望により、uvrABおよびactAにおける双方の突然変異を含む。
前記態様の各々の他の具体例において、Listeriaの減弱化は架橋剤へのListeriaの暴露によって行われたものである。前記態様の各々のいくつかの具体例において、架橋剤はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである。前記態様の各々の他の具体例において、架橋剤はソラレン誘導体であって、ListeriaはUVA光に暴露される。前記態様の各々のいくつかの具体例において、架橋剤は(ここでは「S−59」ともいわれる)4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。
(発明の詳細な記載)
本発明は改変された自由生活微生物、およびワクチン組成物における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。また、本発明は、抗原負荷のための改変された微生物の使用およびインビトロまたはエキソビボでの抗原提示細胞(APC)の活性化/成熟化の誘導を含む。抗原は改変された微生物によって天然に生産される抗原であってもよく、あるいは組換え微生物によって発現された異種抗原であってもよい。得られた抗原提示細胞はワクチン組成物における使用、および免疫療法で適当である。得られたワクチン組成物の投与によって刺激された免疫応答はCD4+またはCD8+免疫応答であり得る。
本発明は改変された自由生活微生物、およびワクチン組成物における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。また、本発明は、抗原負荷のための改変された微生物の使用およびインビトロまたはエキソビボでの抗原提示細胞(APC)の活性化/成熟化の誘導を含む。抗原は改変された微生物によって天然に生産される抗原であってもよく、あるいは組換え微生物によって発現された異種抗原であってもよい。得られた抗原提示細胞はワクチン組成物における使用、および免疫療法で適当である。得られたワクチン組成物の投与によって刺激された免疫応答はCD4+またはCD8+免疫応答であり得る。
1つのそのような改変された微生物はListeria monocytogenesである。本発明者らは、Listeriaが、それが活力が無いように、ソラレン、紫外線A(UVA)光での照射の後に細菌のゲノム中で不可逆的架橋を形成する化合物の群によって不活化に対して特に感受性となるように作成した(後記実施例3参照)。モデル抗原の発現を維持しつつ、野生型および改変されたListeriaの増殖の減弱化が今回示された(後記実施例1ないし2および11参照)。また、改変されたListeriaは抗−腫瘍応答を供し(後記実施例4および14ないし16)、抗原特異的T−細胞応答(実施例5)およびインビボ細胞傷害性応答(実施例20)を誘導することも示される。ListeriaはDCによって迅速に貪食され、ファゴリソソーム区画に輸送される。この遭遇の結果、DCの表現型が成熟し、IFN−γ、IL−12、およびTNF−αを含めた免疫刺激性サイトカインの広いプロフィールが引き続いて分泌される。本発明者らは、今回、組換えListeriaでの未成熟DCの感染の結果、コードされた異種抗原のMHCクラスI−制限提示と共に、迅速なDC活性化/成熟化がもたらされることを示した。加えて、ファゴリソソーム内でのListeriaワクチンの劣化の結果、MHCクラスII経路を介してコードされた抗原が提示される(後記実施例参照)。
もう1つのそのような改変された微生物はBacillus anthracisである。また、本発明者らは、ソラレンによる不活化に対して特に感受性であるBacillus anthracisの減弱化された株も作成した(後記実施例21参照)。
加えて、本発明は、自由生活微生物を含むワクチンを提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物も増殖の減弱化は用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例において、微生物における微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱化によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの接種に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。1つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物はUVA照射によって活性化されたソラレン化合物(例えば、本明細書中では「S−59」とも言う4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレン)である。いくつかの具体例においては、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例においては、微生物はBacillus anthracisまたはListeria monocytogenesのような細菌である。いくつかの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの具体例において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアおよび/またはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は抗原を発現する。
また、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱化させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体Listeria monocytogenes株のような単離された突然変異体Listeria株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体Listeria株は(UvrAおよび/またはUvrBのような)少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体Listeria株は、uvrA遺伝子および/またはuvrB遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は、American Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、受託番号PTA−5563によって確認されるListeria monocytogenes ΔactA/ΔuvrAB株である。他の具体例において、該株はAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、受託番号PTA−5563によって確認されるListeria monocytogenes ΔactA/ΔuvrAB株の突然変異体であり、ここで、寄託された株の突然変異体はUvrA、UvrBおよび、ActAに関して欠損がある。本発明は、さらに、突然変異体Listeria株を含むワクチンおよびプロフェッショナル抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防し、または処置するための改変されたListeria株の使用方法も提供される。
本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む単離された突然変異体Bacillus anthracis株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体株は(UvrAおよび/またはUvrBのような)少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体株はuvrA遺伝子および/またはuvrB遺伝子において遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異株はRecAに関して減弱化されている。いくつかの具体例において、突然変異体株はrecA遺伝子において遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は、該株の毒性を減少させるlef遺伝子、cya遺伝子、または双方の遺伝子において1以上の突然変異を含む。本発明は、さらに、突然変異体株を含むワクチンおよびプロフェッショナル抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防しまたは処置するための改変されたBucillus anthracis株の使用方法も提供される。
加えて、本発明は、自由生活微生物を含むプロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物の増殖の減弱化は、用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例において、微生物中での微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。1つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物はUVA照射によって活性化されたソラレン化合物である。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物は細菌である。いくつかの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。また、本発明は、抗原提示細胞を含むワクチンを提供する。本発明は、さらに、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含み、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は抗原を発現する。本発明は、さらに、ナイーブなT−細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロフェッショナル抗原提示細胞とナイーブなT細胞とを接触させることを含む、ナイーブなT細胞をエキソビボまたはインビトロにて活性化する方法を提供する。
本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることを含むプロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。
また、本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることを含む、プロフェッショナル自己−提示細胞を活性化しおよび/または成熟化する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。
本発明は、さらに、以下の工程(a)抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され、次いで、(b)負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。
本発明は、抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、それに十分な時間の間、抗原を発現する改変された微生物と抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボで接触させることを含み、樹状細胞のような抗原提示細胞に抗原を負荷する方法も提供する。
本発明は、樹状細胞の活性化および/または成熟化を行い、および/または抗原提示細胞を成熟させるのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、改変された微生物と抗原―提示細胞とインビトロとエキソビボで接触させることを含む抗原提示細胞を活性化し、および/または成熟化する方法を提供する。
本発明は、抗原を提示する抗原提示細胞を含む有効量の免疫原性組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含む。
加えて、本発明は、以下の工程(a)抗原提示細胞に抗原を負荷し、および抗原提示細胞の活性化および/または成熟化を行うのに適した条件下で、かつそれに十分な時間の間、抗原を発現するListeriaと抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボで接触させ;次いで、(b)有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。1つの具体例において、微生物の増殖は減弱化される。
また、本発明は、改変された微生物を含むエキソビボまたはインビトロプロフェッショナル抗原提示細胞を提供し、ここで、微生物の増殖は減弱化される。
加えて、本発明は、抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含み、また、抗原提示細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供し、ここで、抗原提示細胞は、Listeriaを含む。
(微生物ベースのワクチン)
本発明は、改変された自由生活微生物、および改変された自由生活微生物のワクチン組成物における使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。
本発明は、改変された自由生活微生物、および改変された自由生活微生物のワクチン組成物における使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。
死滅した微生物ワクチンは、しばしば、生きた弱毒化微生物ワクチンよりも劣ることが観察されている[Lauvauら、Science 294:1735−1739(2001)]。完全に死滅した微生物においては、デ・ノボ微生物遺伝子発現は実質的に排除される。従って、微生物遺伝子発現の十分なレベルを維持しつつ、増殖が減弱されるような、微生物核酸の適当なレベルへの改変は、死滅した微生物ワクチンよりも効果的であり得、ワクチンが微生物ベクターによって引き起こされる感染症の予防を標的化するか、あるいはベクターが異種抗原を送達するのに用いられるかを問わず、いずれかの微生物ベクターに適用することができるワクチン製剤に対するアプローチを提供する。用語微生物の使用は、それが本発明の全ての具体例に関連するので、自由生活微生物を意味することを意図し、ウイルスを含むことを意図しないことは理解されるべきであろう。そのような微生物ベースのワクチンは、特異的抗原を個体に送達するのに用いることができる。1つの具体例において、ワクチンは1を超える抗原を送達する。そのようなワクチンは1以上の抗原に対する免疫応答を刺激するように設計され、その結果、抗原または複数抗原に対して免疫化された個体がもたらされる。生じる免疫応答は抗体媒介応答、細胞媒介応答、またはその双方いずれかであり得る。用語ワクチンは予防ワクチン、すなわち、もし個体が引き続いて天然で抗原に暴露されるならば、予め形成された免疫応答が、剤または抗原を運ぶ細胞と戦う個体の能力を増加させるように、免疫応答を誘導するために与えられるものを含むことを意図する。用語ワクチンは、治療ワクチン、すなわち、ワクチン抗原に関連する疾患をすでに有する個体に与えられるものを含むことを意図し、ここで、ワクチンは免疫応答を誘導し、または個体の存在する抗原に対する免疫応答を増強して、剤または抗原を運ぶ細胞と戦う増大した能力を供することができる。これは、癌細胞のような疾患の細胞に対する免疫応答、ならびにプリオンのような疾患関連タンパク質に対する免疫応答を含む。1つの具体例において、自由生活微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。1つの具体例において、自由生活微生物はグラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内細菌およびマイコバクテリアよりなる群から選択される細菌である。
本発明は、微生物の核酸の種々のレベルの改変を含む。微生物核酸の代謝はいくつかの方法で起こると理解される。微生物の複製は、微生物を複製するために全微生物ゲノムのDNAをコピーし、引き続いて、DNA分子を別々の細胞に分けることを含み、すなわち、細胞が分裂した結果、微生物ゲノムのDNAの完全なコピーと共に有する細胞が得られる。微生物核酸代謝は、DNAのRNAへの転写、およびRNAのタンパク質を生産するための翻訳の組合せを含む。微生物ゲノムの転写は、微生物ゲノムのDNAの一部を、RNA(メッセンジャーまたはトランスファーRNAいずれか)へのコピーを含む。メッセンジャーRNAの翻訳は、RNAを読んで、特異的なタンパク質またはタンパク質の一部を生産することを含む。本発明においては、微生物の集団の核酸は、微生物の性質およびその意図した使用に基づいて所望の程度まで改変される。いくつかの具体例においては、改変の所望の程度は、微生物のゲノムの複製が、タンパク質の生産が十分に活性なままである(すなわち、微生物が代謝的に活性である)ように有意に減弱化されるようなものである。改変の性質が何であれ、改変のレベルは、微生物ゲノムの塩基対当たりに平均した改変の数で表すことができることが理解されるべきである。例えば、もし改変が核酸への化合物の共有結合によるものであれば(アダクト)、改変はアダクトの間の塩基対の平均数で表すことができる。本発明の微生物は、104ないし108塩基対当たり約1つの改変、104ないし107当たり約1つの改変また105ないし107当たり約1つの改変、または105ないし106塩基対当たり約1つの改変のレベルまで改変することができる。1つの具体例において、個体遺伝子の転写および翻訳の十分な活性を維持して(すなわち、いくつかの代謝活性を維持して)、安全かつ効果的なワクチンを達成しつつ、集団が観察可能な増殖を示さないように、改変のレベルを微生物集団においてDNA複製をブロックするのに必要な最小量に調整する。
1つの態様において、本発明は自由生活微生物を含むワクチンを提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱されるように改変される。いくつかの具体例において微生物の増殖の減弱化は用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例において、微生物中での微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱化によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。1つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物は、UVA照射によって活性化されたソラレン化合物(例えば、本明細書中では「S−59」とも言う4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレン)である。いくつかの具体例においては、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物はBacillus anthracisまたはListeria monocytogenesのような細菌である。いくつかの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの具体例において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアおよび/またはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物が抗原を発現する。
本発明は、さらに、突然変異体Listeria monocytogenes株または突然変異体Bacillus anthracis株を含むワクチンを提供し、ここで、突然変異体Listeria monocytogenes株または突然変異体Bacillus anthracis株はその核酸を修復するその能力を減弱化させる遺伝子突然変異を含む。
(抗原提示細胞ワクチン)
本発明は自由生活微生物、抗原提示細胞に基づくワクチン組成物の調製における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱化されるように改変されるいくつかの具体例において、改変された微生物の微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。
本発明は自由生活微生物、抗原提示細胞に基づくワクチン組成物の調製における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱化されるように改変されるいくつかの具体例において、改変された微生物の微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。
本発明の1つの具体例において、ワクチンで用いられる抗原提示細胞はプロフェッショナル抗原提示細胞である。プロフェッショナル抗原提示細胞はマクロファージ、樹状細胞およびB細胞を含む。他のプロフェッショナル抗原提示細胞は単球、辺縁層クッパー細胞、小グリア細胞、ランゲルハンス細胞、指状突起樹状細胞、小胞樹状細胞、およびT細胞を含む。1つの具体例において、プロフェッショナル抗原提示細胞は樹状細胞である。もう1つの具体例において、プロフェッショナル抗原提示細胞はマクロファージまたは樹状細胞(DC)である。1つの具体例において、抗原提示細胞はヒト細胞である。
1つの具体例において、DCのような未成熟抗原提示細胞は患者から単離され、抗原を発現する改変された微生物で感染される。次いで、得られた負荷された抗原提示細胞をオートロガスAPCワクチンとして患者に戻して導入し、それにより、CD4+またはCD8+免疫応答いずれかを誘導する。
したがって、本発明の抗原提示細胞ワクチンを調製し、使用する方法の1つの例は以下の通りである:未成熟DCを結腸癌患者から単離し、S−59/UVA―不活化され、活力の無い代謝的に活性な組換えListeria−CEAワクチンで感染させる。ListeriaでのDC感染の結果、MHCクラスIおよびII経路へのCEA腫瘍抗原の効果的な負荷がもたらされる。Listeria感染はDCを刺激し、インビボにおける初代T細胞応答を誘導することができる優れたAPCとなるためにDCで非常に重要な迅速な活性化および成熟化を受ける。成熟DCはCD83、CD80、CD86のような共刺激性分子、ならびにMHC分子の発現をアップレギュレートする。Listeriaワクチン−負荷DCを洗浄し、オートロガスDCワクチンとして患者に戻して、CEA−特異的T細胞応答を刺激する。
特別な具体例は後にリストする具体的実施例で例示される。しかしながら、本明細書中に記載された一般的な方法および技術は広く種々の改変された微生物、抗原および疾患により広く適用することができる。当業者であれば、本明細書中に記載された教示に容易に適合させることができよう。
別の具体例においては、DCのような未成熟抗原提示細胞を、抗原を発現する改変された微生物でインビトロで感染させる。次いで、得られた負荷された抗原提示細胞を用いてT−細胞集団をプライムし、次いで、これを患者に導入し、それにより、抗原に対するCD4+またはCD8+免疫応答いずれかを誘導する。
もう1つの態様において、本発明は自由生活微生物を含むプロフェッショナル抗原−提示細胞(例えば、樹状細胞)を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物の増殖の減弱化は用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例において、微生物中の微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱化によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、ワクチンの個体への投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルにて抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。1つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物はUVA照射によって活性化されたソラレン化合物である。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化させる遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物は細菌である。いくつかの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。また、本発明は抗原提示細胞を含むワクチンを提供する。本発明は、さらに、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含み、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含み、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は抗原を発現する。本発明は、さらに、ナイーブなT−細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロフェッショナル抗原提示細胞とナイーブなT細胞とを接触させることを含む、エキソビボまたはインビトロでナイーブなT細胞を活性化する方法を提供する。
(微生物複製の減弱化)
本発明は、微生物の複製を減弱化するための微生物核酸の改変を含む。複製におけるこの減弱化を用いて、微生物の個体への投与に際して安全性のレベルを増加させることができる。微生物の増殖する能力は、正常な増殖を供する条件下で微生物の集団を培養することによって測定することができる。微生物の集団の正常な増殖は、微生物の核酸に対する改変を有しない微生物の増殖であると考えられる。微生物ゲノムの改変の結果、微生物が正常な増殖を受けないようなある程度の減弱化がもたらされるであろう。幾つかの微生物は、固化された増殖培地上でカウントすることができるコロニーを形成する。かくして、微生物の複製の減弱化は、コロニー形成単位(CFU)の数の低下として測定することができる。微生物コロニーのストック溶液は、コロニー形成単位の数が容易に測定できるまで(例えば、50ないし500CFU)系列的に希釈される。典型的には、希釈は10倍であり、1以上の希釈されたサンプルでカウントされたコロニーの数を用いて、サンプルのlog力価を見積もる。例えば、希釈された微生物ストックのアリコットを増殖培地で平板培養し、得られたコロニーをカウントする。希釈のmL当たりのコロニー形成単位(CFU/mL)を計算し、(力価として知られた)元のストックのmL当たりのコロニー形成単位を希釈から計算する。log数はlog力価として知られている。例として、1×105希釈の0.2mLアリコットを平板培養する24コロニー形成単位は1.2×107力価、または7.08log力価ストックを与える。減弱化は、微生物核酸の改変後におけるそれに対する微生物核酸の改変に先立っての微生物力価の比較として測定することができる。改変後における微生物の力価に対する未改変微生物の力価の比率のlogは、log減弱化を表す(または単に2つのlog力価の差を表す)。例えば、もし未改変微生物力価が1,2×107と測定され、改変された微生物力価が4.3×102と測定されれば減弱化の得られたレベルは4.45logである。この方法を用いて、病原体または非−病原体であるかを問わず、いずれかの微生物の減弱化を評価することができる。いくつかの微生物では、直接的に微生物の増殖を測定するよりはむしろ、感染された細胞を殺すその能力によって微生物を測定するプラークアッセイを用いることができる。例えば、ある細胞内細菌は、それが感染できる哺乳動物細胞の群上で増殖させることができる。適当なインキュベーション条件後に該群をプラーク(死滅した細胞を表す細胞層における明瞭な領域)につき観察することができる。前記計算は、プラーク形成単位の数が、微生物の核酸の改変によりプラーク形成単位数の減弱化を評価するためにコロニー形成単位につき置き換えられている場合に同様である。本発明の具体例では、減弱化の所望の量は、安全性の所望のレベルおよび微生物の意図した適用に依存して、実質的に増殖が観察されないレベルを含めた、2倍低下からかなり大きなレベルの減弱化までの範囲とすることができる。複製における2倍減弱化は、もし与えられた希釈につき、微生物の未改変集団にある(約0.3log減弱化)ものとして核酸が改変される場合に、微生物の集団に半分のコロニー(またはプラーク)があれば観察されるであろう。幾つかの具体例において、減弱化は少なくとも約0.3log、約1log、約2log、約3log、約4log、約5log、約6log、または少なくとも約8logである。いくつかの具体例において、減弱化は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、また約0.3ないし7log、また約0.3ないし6log、また約0.3ないし5log、また約0.3ないし4log、また約0.3ないし3log、また約0.3ないし2log、また約0.3ないし1logの範囲にある。いくつかの具体例においては、減弱化は約1ないし>10log、1ないし8log、1ないし6log、また約2ないし6log、また約2ないし5log、また約3ないし5logの範囲にある。本発明の1つの具体例において、減弱化の結果、実質的に完全な不活化がもたらされる(例えば、コロニーまたはプラークが検出限界まで観察されない場合)、ここで、微生物遺伝子発現は十分に活性である。そのような微生物の集団は、微生物核酸を改変して、コロニーまたはプラークが検出の限界で観察されない最低濃度を見出すのに用いられる剤の濃度を滴定することによって達成することができる。
本発明は、微生物の複製を減弱化するための微生物核酸の改変を含む。複製におけるこの減弱化を用いて、微生物の個体への投与に際して安全性のレベルを増加させることができる。微生物の増殖する能力は、正常な増殖を供する条件下で微生物の集団を培養することによって測定することができる。微生物の集団の正常な増殖は、微生物の核酸に対する改変を有しない微生物の増殖であると考えられる。微生物ゲノムの改変の結果、微生物が正常な増殖を受けないようなある程度の減弱化がもたらされるであろう。幾つかの微生物は、固化された増殖培地上でカウントすることができるコロニーを形成する。かくして、微生物の複製の減弱化は、コロニー形成単位(CFU)の数の低下として測定することができる。微生物コロニーのストック溶液は、コロニー形成単位の数が容易に測定できるまで(例えば、50ないし500CFU)系列的に希釈される。典型的には、希釈は10倍であり、1以上の希釈されたサンプルでカウントされたコロニーの数を用いて、サンプルのlog力価を見積もる。例えば、希釈された微生物ストックのアリコットを増殖培地で平板培養し、得られたコロニーをカウントする。希釈のmL当たりのコロニー形成単位(CFU/mL)を計算し、(力価として知られた)元のストックのmL当たりのコロニー形成単位を希釈から計算する。log数はlog力価として知られている。例として、1×105希釈の0.2mLアリコットを平板培養する24コロニー形成単位は1.2×107力価、または7.08log力価ストックを与える。減弱化は、微生物核酸の改変後におけるそれに対する微生物核酸の改変に先立っての微生物力価の比較として測定することができる。改変後における微生物の力価に対する未改変微生物の力価の比率のlogは、log減弱化を表す(または単に2つのlog力価の差を表す)。例えば、もし未改変微生物力価が1,2×107と測定され、改変された微生物力価が4.3×102と測定されれば減弱化の得られたレベルは4.45logである。この方法を用いて、病原体または非−病原体であるかを問わず、いずれかの微生物の減弱化を評価することができる。いくつかの微生物では、直接的に微生物の増殖を測定するよりはむしろ、感染された細胞を殺すその能力によって微生物を測定するプラークアッセイを用いることができる。例えば、ある細胞内細菌は、それが感染できる哺乳動物細胞の群上で増殖させることができる。適当なインキュベーション条件後に該群をプラーク(死滅した細胞を表す細胞層における明瞭な領域)につき観察することができる。前記計算は、プラーク形成単位の数が、微生物の核酸の改変によりプラーク形成単位数の減弱化を評価するためにコロニー形成単位につき置き換えられている場合に同様である。本発明の具体例では、減弱化の所望の量は、安全性の所望のレベルおよび微生物の意図した適用に依存して、実質的に増殖が観察されないレベルを含めた、2倍低下からかなり大きなレベルの減弱化までの範囲とすることができる。複製における2倍減弱化は、もし与えられた希釈につき、微生物の未改変集団にある(約0.3log減弱化)ものとして核酸が改変される場合に、微生物の集団に半分のコロニー(またはプラーク)があれば観察されるであろう。幾つかの具体例において、減弱化は少なくとも約0.3log、約1log、約2log、約3log、約4log、約5log、約6log、または少なくとも約8logである。いくつかの具体例において、減弱化は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、また約0.3ないし7log、また約0.3ないし6log、また約0.3ないし5log、また約0.3ないし4log、また約0.3ないし3log、また約0.3ないし2log、また約0.3ないし1logの範囲にある。いくつかの具体例においては、減弱化は約1ないし>10log、1ないし8log、1ないし6log、また約2ないし6log、また約2ないし5log、また約3ないし5logの範囲にある。本発明の1つの具体例において、減弱化の結果、実質的に完全な不活化がもたらされる(例えば、コロニーまたはプラークが検出限界まで観察されない場合)、ここで、微生物遺伝子発現は十分に活性である。そのような微生物の集団は、微生物核酸を改変して、コロニーまたはプラークが検出の限界で観察されない最低濃度を見出すのに用いられる剤の濃度を滴定することによって達成することができる。
病原体微生物の場合には、微生物の生物学的効果の項目で減弱化を評価することも可能である。例えば、微生物の病原性は、マウスまたは他の脊椎動物においてメジアン致死率(LD50)の測定によって評価することができる。LD50は、脊椎動物の集団の半分の死亡がもたらされる脊椎動物に注入された微生物の量(例えば、CFU)である。LD50値は、減弱化の量の尺度として改変および未改変微生物につき比較することができる。例えば、もし未改変の微生物の集団が103微生物のLD50を有し、核酸が改変されている微生物の集団が105微生物のLD50を有すれば、微生物はそのLD50が100倍増加する、または2logだけ増加するように減弱化されている。いくつかの具体例において、LD50は2倍ないし1000倍高い。いくつかの具体例において、すでに比較的高いLD50を有する減弱化株を用いる。そのような場合には、LD50の改変された微生物での増加は、どのように多くの材料が危害を引き起こすこと無く注入できるかによって制限される。例えば、加熱死滅化生物のLD50は、単に、マウスへの生物学的材料の負荷および/または細菌壁成分への炎症性反応のため、約1ないし5×109よりもかなり高いであろう。また、減弱化の程度は、組織病理学の程度または血清肝臓酵素レベルのような他の生物学的効果によって定量的に測定することもできる。典型的には、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アルブミンおよびビリルビンレベルは、本発明の微生物を注入したマウスにつき臨床実験室で測定される。マウスまたは他の脊椎動物におけるこれらの効果の比較は、微生物の減弱化を評価する方法として、未改変および改変微生物につきなされるであろう。組織に対する微生物の効果の測定に加えて、時間の関数としての、肝臓または脾臓のような感染組織から回収することができる生きた微生物の量もまた、未改変−対−改変微生物を注入したマウスにおいてこれらの値を比較することによって減弱化の尺度として用いることもできる。
(本発明の微生物によるタンパク質の発現)
微生物の増殖の減弱化に加えて、微生物の核酸の改変は、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないように制御される。実質的に影響されないためには、微生物遺伝子発現は、核酸の改変に際して完全に活性である必要はない。複製を減弱化するように核酸が改変される微生物の集団において、微生物遺伝子発現は、微生物による所望のタンパク質の適切なレベルの発現を供するのに十分に活性であることのみが必要である。適切なレベルの発現は、ある程度、微生物の意図した使用に依存する。例えば、もし微生物がワクチンとして使用されるべき特定の抗原を含むならば、適切な発現は、ワクチンに対する効果的な保護または治療免疫応答を供する発現の最小レベルとして決定されるであろう。微生物遺伝子発現は、そのようなワクチンが効果的な免疫応答を供するか否かを評価するためにインビトロおよびインビボの双方において評価することができる。一般に、核酸が改変されている微生物の集団は、特定の抗原に関して微生物の未改変集団と比較することができる。
微生物の増殖の減弱化に加えて、微生物の核酸の改変は、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないように制御される。実質的に影響されないためには、微生物遺伝子発現は、核酸の改変に際して完全に活性である必要はない。複製を減弱化するように核酸が改変される微生物の集団において、微生物遺伝子発現は、微生物による所望のタンパク質の適切なレベルの発現を供するのに十分に活性であることのみが必要である。適切なレベルの発現は、ある程度、微生物の意図した使用に依存する。例えば、もし微生物がワクチンとして使用されるべき特定の抗原を含むならば、適切な発現は、ワクチンに対する効果的な保護または治療免疫応答を供する発現の最小レベルとして決定されるであろう。微生物遺伝子発現は、そのようなワクチンが効果的な免疫応答を供するか否かを評価するためにインビトロおよびインビボの双方において評価することができる。一般に、核酸が改変されている微生物の集団は、特定の抗原に関して微生物の未改変集団と比較することができる。
1つの可能性は、微生物の集団と混合された抗原提示細胞による注目する抗原の提示を測定することである。微生物は適当な抗原提示細胞または細胞系、例えば、樹状細胞と混合することができ、抗原を認識するT細胞への樹状細胞による抗原の提示が測定されることができる。もし微生物が十分なレベルで抗原を発現しつつあるならば、それは、樹状細胞によってペプチド断片に加工され、各々、MHCクラスIまたはクラスIIの意味で、CD8+またはCD4+T細胞に提示される。提示された抗原を検出する目的で、特定の抗原に対して応答するT細胞クローンまたはT細胞系を用いることができる。T細胞が癌細胞系との融合によって不滅化される場合には、T細胞はT細胞ハイブリドーマであってもよい。そのようなT細胞ハイブリドーマ、T細胞クローン、またはT細胞系はCD8+またはCD4+T細胞いずれかを含むことができる。抗原提示細胞は、抗原がそれにより加工される経路に応じて、CD8+またはCD4+T細胞いずれかに提示することができる。CD8+T細胞はMHCクラスIの意味で抗原を認識し、他方、CD4+T細胞はMHCクラスIIの意味で抗原を認識する。T細胞は、そのT細胞受容体による特異的認識を介して提示された抗原によって刺激され、その結果、IL−2またはインターフェロン−γ(IFN−γ)のようなある種のタンパク質の生産がもたらされ、これは、(例えば、ELISAアッセイを用いて)定量的に測定することができる。別法として、ハイブリドーマは、提示された抗原によって、T細胞ハイブリドーマの刺激に際して活性化されるβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を含むように設計することができる。β−ガラクトシダーゼの生産の増加は、クロロフェノールレッド−β−D−ガラクトピラノシドのような基材上のその活性によって容易に測定することができ、その結果容易に色が変化させることができる。色の変化は、特異的抗原提示のインジケーターとして直接的に測定することができる(実施例1、2および11)。本発明の微生物ワクチンの抗原発現を評価するためのさらなるインビトロおよびインビボ方法は実施例5に見出すことができる。また、本発明の微生物によって特定のタンパク質の発現を直接的に測定することも可能である。例えば、放射性標識アミノ酸を細胞集団に加えることができ、特定のタンパク質に取り込まれた放射能の量を決定することができる。細胞集団によって合成されたタンパク質は、例えば、ゲル電気泳動または毛細管電気泳動によって単離し、例えば、タンパク質に対して特異的な抗体との結合によって注目するタンパク質として同定することができ、放射能の量を定量的に測定して、特定のタンパク質の発現レベルを評価することができる。別法として、タンパク質は放射能無くして発現させ、ELISAアッセイのような種々の方法によって、または酵素結合抗体または蛍光標識抗体を用いる検出でのゲル電気泳動およびウェスタンブロットによって検出することができる。
微生物核酸の改変は、未改変微生物と比較してタンパク質発現のレベルを低下させる可能性があるが、これは依然として効果的なワクチンを提供することができることを認識すべきである。本発明のいくつかの具体例で重要なのは、増殖の減弱と適切なタンパク質発現との組合せである。ワクチンの効率は、一般に、微生物によって送達することができる抗原の用量に関係しており、いくつかの場合には、微生物による活性遺伝子発現のあるレベルが重要である。微生物の複製の減弱は数logであり得るが、他方、微生物遺伝子発現は依然として十分に維持される。もし減弱化微生物の同一用量を未改変微生物のそれと比較すれば、減弱化微生物集団における(前記した方法によって評価された)得られた抗原発現は、未改変微生物集団における抗原発現の少なくとも約1%、約5%、約10%、約25%、約50%、約75%、または少なくとも約90%である。複製において数log減弱があり得るので、改変された微生物の用量は数logまでは安全に増加させることができ、その結果、ワクチン接種に際して未改変微生物に対する減弱化微生物によって提示された抗原と同等またはそれよりも大きな量がもたらされる。
いくつかの具体例において、タンパク質をコードする異種核酸配列は、タンパク質を発現する細菌宿主のコドン優先性にマッチするようコドンを最適化させることができる。加えて、発現されたタンパク質に融合されたシグナルペプチドをコードする配列も細菌宿主のコドン優先性にマッチするようコドンを最適化することもできる。好ましい具体例においては、細菌宿主はListeriaであり、異種タンパク質をコードする配列およびシグナルペプチドをコードする配列いずれかまたはその双方をコドンを最適化することができる。Listeriaにおける抗原およびシグナル配列のコドン最適化のさらなる情報については、ここに引用して援用する米国出願第60/532,598号を参照のこと。
(微生物核酸改変)
微生物の集団の核酸は、種々の方法によって改変することができる。微生物の核酸は物理的手段、例えば、紫外線または電離放射線の放射によって改変することができる。X−線またはγ−線のような電離放射線を用いて、核酸中で一本鎖または二本鎖の破壊を引き起こすことができる、紫外線放射を用いて、核酸中にピリミジンダイマーを生じさせることができる。適切な量の放射線は、前記にて詳細に説明した複製およびタンパク質発現に対する放射線の効果を評価することによって決定される。
微生物の集団の核酸は、種々の方法によって改変することができる。微生物の核酸は物理的手段、例えば、紫外線または電離放射線の放射によって改変することができる。X−線またはγ−線のような電離放射線を用いて、核酸中で一本鎖または二本鎖の破壊を引き起こすことができる、紫外線放射を用いて、核酸中にピリミジンダイマーを生じさせることができる。適切な量の放射線は、前記にて詳細に説明した複製およびタンパク質発現に対する放射線の効果を評価することによって決定される。
微生物の核酸は化学的手段によって、例えば、核酸標的化化合物との反応によって改変することもできる。1つの具体例において、微生物の増殖が減弱されるように、核酸を改変することができる核酸標的化化合物で微生物を処理し、ここで、微生物の集団は、依然として、所望のタンパク質抗原の免疫応答を誘導するのに十分な程度発現させることができる。核酸標的化化合物は、核酸を改変する特定のメカニズムに限定されない。そのような化合物は、核酸と直接的に反応させることによって(すなわち、化合物の全てまたはある割合が核酸に共有結合する)、あるいは(例えば、シングレット酸素または酸素ラジカルの発生を介して酸素ダメージを引き起こすことによってダメージを引き起こす化合物ラジカルを発生させることによってまたは核酸の還元または酸化の他のメカニズムによって)核酸の改変を間接的に引き起こすことによって、核酸を改変する。エンジインは、DNA二本鎖の切断をもたらすラジカル種を形成する化合物のクラスの例である[Nicolaouら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5881−5888(1993)]。核酸と直接的に反応する化合物は、化合物の活性化に際して、例えば、化合物の照射に際して反応することができる。間接的に反応して核酸の改変を引き起こす化合物は、化合物のいずれかの活性化された種を生じさせ、あるいはいくつかの他の活性な種を生じさせるために同様な活性化を必要とする。核酸標的化化合物の活性化のための手段に限定されないが、本発明の1つの具体例は、核酸と直接的に反応する、あるいは次いで核酸と反応する反応性酸素種(例えば、シングレット酸素)のような反応性種を生じさせる光活性化化合物の使用を含む。
核酸標的化化合物は、生物学的サンプルの他の構成要素を有意に改変すること無く核酸を優先的に改変する。そのような化合物は、細胞膜、タンパク質および脂質を有意に改変または損傷すること無く、核酸の適切な改変を提供する。そのような化合物は、これらの他の細胞構成要素を有意ではない程度まで改変することができる。もしそれらの生物学的機能が十分に維持されるならば、細胞膜、タンパク質および脂質のようなこれらの細胞構成要素は有意には改変されない。核酸標的化化合物で微生物を処理する場合、核酸の改変は、微生物の細胞膜、タンパク質および脂質は、微生物遺伝子発現が活性であり(例えば、これに必要な酵素は有意には影響されない)、微生物の表面は、化合物で処理されなかった微生物と同一の抗原性を本質的に維持するように、本質的には影響されずして、微生物の複製が減弱化されるようなものである。その結果、そのような化合物は、ワクチンとして有用である十分な抗原性または免疫原性を維持しつつ、微生物の増殖が十分に減弱されるので、ワクチンとして用いられる不活化微生物を調製するのに有用である。化合物は核酸を特異的に改変するので、タンパク質発現の十分なレベルを維持しつつ複製が減弱化されるように、改変を所望のレベルまで制御することができる。改変は、化合物濃度、反応媒体のような反応のパラメーターを変化させ、光量またはpHのような化合物活性化因子を制御し、あるいは(例えば、脱気することによって物理的に、または酸素スカベンジャーの使用によって化学的に)酸素濃度を制御することにより酸素損傷を引き起こす化合物を制御することによって制御することができる。核酸標的化化合物は、核酸に優先的に結合する傾向を有する、すなわち、核酸に対する測定可能な親和性を有するいずれかの化合物である。そのような化合物は、生物学的サンプルのほとんどの他の構成要素、特にタンパク質、酵素、脂質および膜のような成分に対するよりも核酸に対してより強い親和性を有する。核酸標的化は、遺伝子転写およびタンパク質翻訳についてのマシーナリーのような生物学的サンプルの他の構成要素に有意に影響すること無く、核酸の改変に対する特異性を提供する。
化合物は多数の態様で核酸に標的化することができる。以下の態様のいずれか、またはその組合せによって結合する化合物は、核酸標的化化合物と考えられる。インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合(例えば、リン酸骨格結合)、および(小または大溝における配列認識を介する)配列−特異的結合は、全て、核酸への結合の非−共有結合態様である。結合のこれらの態様の1以上を含む化合物は核酸に対して高い親和性を有するであろう。本発明は以下の化合物に限定されないが、核酸への結合のこれらの態様を有数化合物のいくつかの例は以下の通りである:インターカレーターは、アクリジン、アクリドン、プロフラビン、アクリフラビン、アクチノマイシン、アントラサイクリノン、ベータ−ロドマイシンA、ダウノマイシン、チアキサンテノン、ミラシルD,アントラマイシン、マイトマイシン、エキノマイシン、キノマイシン、トリオスチン、ジアクリジン、エリプティセン(ダイマー、トリマーおよびアナログを含む)、ノルフィリンA、フルオレンおよびフルオレノン、フルオレノジアミン、キナクリン、ベンズアクリジン、フェナジン、フェナントラジン、フェネチアジン、クロルプロマジン、フェノキサジン、ベンゾチアゾール、キサンテン、およびチオキサンテン、アントラキノン、アントラピラゾール、ベンゾチオピラノインドール、3,4−ベンズピレン、ベンゾピレンジオールエポキシド、1−ピレニルオキシラン、ベンズアントラセン−5,6−オキシド、ベンゾジピロン、ベンゾチアゾール、キノロン、クロロキノン、キニン、フェニルキノリンカルボキシアミド、フロクマリン(例えば、ソラレン、イソソラレンおよびその硫黄アナログ)、エチジウム塩、プロピジウム、コラリン、エリプティシンカチオンおよび誘導体、多環炭化水素およびそのオキシラン誘導体、およびエキニマイシンが例示され;小溝バインダーはジスタマイシン、マイトマイシン、ネトロプシン、他のレキシトロプロシン、Hoechst 33258および他のHoechst染料、DAPI(4,6’−ジアミジン−2−フェニルインドール)、ベレニル、およびトリアニールメタン染料が例示され;大溝バインダーはアフラトキシンが例示され;静電バインダーはスペルミン、スペリミジンおよび他のポリアミンが例示され;および配列−特異的バインダーは三重らせん形成、D−ループ形成、および一本鎖への直接的塩基対合のような配列−特異的相互作用によって結合する核酸またはアナログが例示される。他の配列−特異的結合化合物はポリピロール化合物、ポリピロールイミダゾール化合物、シクロプロピルピロロインドール化合物および関連する小溝結合化合物を含む[Wemmer,Nature Structural Biology,5(3):169−171(1998),Wurtzら、Chemistry & Biology 7(3):153−161(2000),Anthoneyら、Am.J.Pharmacogenomics 1(1):67−81(2001)]。
核酸を標的化することに加え、化合物は、核酸と反応することもでき、その結果、核酸への共有結合がもたらされる。核酸アルキル化剤は核酸と共有結合により反応することができる化合物のクラスであり、限定されるものではないが、マスタード(例えば、モノまたはビスハロエチルアミン基、およびモノハロエチルスルフィド基)、マスタード同等物(例えば、エポキシド、アルファ−ハロケトン)およびマスタード中間体(例えば、アジリジン、アジリジンニウムおよびその硫黄アナログ)、メタンスルホネートエステル、およびニトロソ尿素を含む。核酸アルキル化剤は、典型的には、核酸上の求核性基と反応する。核酸と特異的に共有結合により反応する能力をそれに与え、本発明で用いられる微生物の核酸の所望の改変を供するのは、これらの化合物の核酸アルキル化活性および核酸標的化能力の組合せである。これらの化合物の特異性は微生物に入らないクエンチャーの使用によってさらに増強させることができる。そのようなクエンチャーは、依然として、核酸標的化化合物を微生物核酸と反応させつつ、微生物の表面との反応を鎮めるであろう。そのようなクエンティングの議論は、ここに引用してその開示を援用する米国特許第6,270,952号に見出すことができる。微生物核酸の改変は、化合物の濃度および反応の条件を調整することによって制御することができる。適当な濃度および反応条件は、前記にて詳細に記載した複製およびタンパク質発現に対するその効果を評価することによって決定される。本発明で用いる化合物は約10pMないし10mM、また約100pMないし1mM、また約1nMないし10μM、また約1ないし500nM、また約1ないし200nMまたは約1ないし100nMの濃度で効果的である。標的化された核酸、核酸、特に、微生物核酸との特異的反応についての核酸反応性化合物、の議論は、ここに引用してその開示を援用する米国特許第6,143,490号および第6,093,725号に見出すことができる。
核酸は、核酸改変を引き起こすのに放射線での活性化を必要とする核酸標的化化合物を用いることによって改変することができる。そのような化合物は前記したように核酸に標的化される。これらの化合物は、限定されるものではないが、アクリジン、アクリドン、アンスリル誘導体、アロキサジン(例えば、リボフラビン)、ベンゾトリアゾール誘導体、平面状芳香族ジアゾ誘導体、平面状芳香族シアノ誘導体、トルイジン、フラビン、フェノチアジン(例えば、メチレンブルー)、フロクマリン、アンゲリシン、ソラレン、ソラレンの硫黄アナログ、キノロン、キノリン、キノキサリン、ナフチリジン、フルオロキノロン、アントラキノン、およびアントラセンを含む。これらの化合物の多くはDNA光切断剤として用いられる[Da Rosら、Current Pharmaceutical Design 7:1781(2001)]。本発明は核酸標的化化合物の活性化方法に限定されないが、典型的には、化合物は特定の波長の光で活性化することができる。光の効果的な波長は化合物の性質に依存し、ほぼ200ないし1200nmのどこかの範囲とすることができる。これらの化合物のあるものでは、例えば、核酸の近傍に反応性酸素種を生じさせることによって、活性化は、核酸への化合物の直接的結合無くして、核酸の改変を引き起こす。化合物のあるものでは、活性化の結果、核酸への化合物の直接的結合がもたらされる(すなわち、化合物は共有結合する)。これらの化合物のあるものは核酸と反応して、ストランド間架橋を形成することができる。ソラレンは、核酸を架橋させる化合物のクラスの例である。これらの化合物は、典型的には、UVA光(320ないし400nm)で活性化される。本発明で用いられるソラレン化合物は、ここに引用してその開示を援用する米国特許第6,133,460号および第5,593,823号に例示されている。再度、核酸との特異的反応性を供するのは、核酸標的化、および活性化に際して核酸を改変する能力の組合せである。微生物核酸の改変は、化合物濃度、反応条件および光量を調整することによって制御することができる。適当な濃度および光量は、前記にて詳細に記載した複製およびタンパク質発現に対するその効果を評価することによって決定される。化合物濃度および光暴露のレベルに加えて、反応は、サンプルをUVA光で照射する条件によって影響される。例えば、緩衝化媒体における微生物の集団を照射するための必要な全濃度は、増殖培地(例えば、BHI、トリプターゼ・ソイ・ブロス)中で培養される集団から変化しつつある。光反応は増殖培地の内容物によって影響され得、これはソラレンと相互作用でき、それにより、ソラレンのより高い全濃度を必要とする。加えて、微生物の効果的な用量は、生物の成長層、および成長層の間における化合物の存在または不存在に依存するであろう。1つの具体例において、微生物の集団はソラレンUVA処理の間に増殖培地を含む。1つの具体例において、ソラレンを微生物の集団に加え、集団を培養して、ソラレンおよび増殖培地の存在下で微生物を増殖させ、微生物の成長層でのある地点でUVA処理を行う。1つの具体例において、適当な量のUVA光の照射に先立って、ソラレンの存在下で集団を0.5ないし1のOD(1×107ないし1×109CFU/mL)まで増殖させる。ソラレン化合物は約10pMないし10mM、また約100pMないし1mM、また約1nMないし10μM、また約1ないし500nM、また約1ないし200nMまたは約1ないし100nMの濃度で効果的であり、UVA光の量は約0.1ないし100J/cm2、また約0.1ないし20J/cm2、または約0.5ないし10J/cm2、0.5ないし6J/cm2または約2ないし6J/cm2の範囲である。1つの具体例において、微生物は約10pMないし10mM、また約1ないし5000nM、また約1ないし500nM、また約5ないし500nM、または約10ないし400nMのソラレン濃度にて増殖培地の存在下で処理される。1つの具体例において、増殖培地の存在下で処理された微生物は、約10pMないし10mM、また約1ないし5000nM、また約1ないし500nM、また約5ないし500nM、また約10ないし400nMの濃度のソラレンの存在下で0.5ないし1のODまで増殖させる。0.5ないし1のODまでの増殖に続き、微生物集団には約0.1ないし100J/cm2、また約0.1ないし20J/cm2、または約0.5ないし10J/cm2、0.5ないし6J/cm2、または約2ないし6J/cm2の範囲の量のUVA光を照射する。
(異種核酸配列を含む微生物)
微生物は、微生物によって発現され得る異種核酸配列を含む様に改変することができる。異種配列は少なくとも1つの特異的タンパク質抗原をコードことができる。微生物は、当業者に知られた方法によって改変することができる[SambrookおよびRussell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Eddition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2000)]。微生物は、1以上の抗原をコードする1以上の配列を含むように改変することができる。特異的抗原をコードする異種核酸配列は、正確な核酸配列に限定されるものではなく、個体に投与されると、所望の免疫応答を誘導するであろう抗原の発現を供するのに十分な配列である。異種配列は、特定の疾患に関連する抗原として発現され得る。そのような抗原を発現する微生物はワクチンとしてもちいることができ、ここで、該ワクチンは予防的処置または治療的処置として用いることができる。そのようなワクチンによって処理することができる疾患は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌および他の過剰増殖性病を含む。
微生物は、微生物によって発現され得る異種核酸配列を含む様に改変することができる。異種配列は少なくとも1つの特異的タンパク質抗原をコードことができる。微生物は、当業者に知られた方法によって改変することができる[SambrookおよびRussell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Eddition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2000)]。微生物は、1以上の抗原をコードする1以上の配列を含むように改変することができる。特異的抗原をコードする異種核酸配列は、正確な核酸配列に限定されるものではなく、個体に投与されると、所望の免疫応答を誘導するであろう抗原の発現を供するのに十分な配列である。異種配列は、特定の疾患に関連する抗原として発現され得る。そのような抗原を発現する微生物はワクチンとしてもちいることができ、ここで、該ワクチンは予防的処置または治療的処置として用いることができる。そのようなワクチンによって処理することができる疾患は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌および他の過剰増殖性病を含む。
本発明の微生物は、特定の腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む様に改変することができる。T細胞によって認識される非常に多数の腫瘍特異的抗原が同定されている[Renkvistら、Cancer Immunol Innumother 50:3−15(2001)]。腫瘍抗原は分化抗原(例えば、PSMA、チロシナーゼ、gp100)、組織−特異的抗原(例えば、PAP、PSA)、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原(例えば、HPV 16E7)、癌−精巣抗原(例えば)、MAGE、BAGE、NY−ESO−1、胚抗原(例えば、CEA、アルファ−フェトプロテイン)、癌タンパク質抗原(例えば、Ras、p53)、過剰に発現されたタンパク質抗原(例えば、ErbB2(Her2/Neu)、MUC1)、または突然変異したタンパク質抗原であり得る。異種核酸配列によってコードされ得る腫瘍抗原は、限定されるものではないが、707−AP、アネキシンII、AFP、ART−4、BAGE、β−カテニン/m、BCL−2、bcr−abl、bcr−abl p190、bcr−abl p210、BRCA−1、BRCA−2、CAMEL、CAP−1、CASP−8、CDC27/m、CDK−4/m、CEA、CT9、CT10、Cyp−B、Dek−cain、DAM−6(MAGE−B2)、DAM−10(MAGE−B1)、ELF2M、EphA2、ETV6−AML1、G250、GAGE−1、GAGE−2、GAGE−3、GAGE−4、GAGE−5、GAGE−6、GAGE−7B、GAGE−8、GnT−V、gp100、HAGE、HER2/neu、HAL−A*0201−R170I、HPV−E7、HSP70−2M、HST−2、hTERT、hTRT、iCE、アポトーシスの阻害剤(例えば、サービビン)、KIAA0205、LAGE、LAGE−1、LDLR/FUT、MAGE−1、MAGE−2、MAGE−3、MAGE−6、MAGE−A1、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A10、MAGE−A12、MAGE−B5、MAGE−B6、MAGE−C2、MAGE−C3、MAGE−D、MART−1、MART−1/Melan−A、MC1R、MDM−2、メソセリン、ミオシン/m、MUC1、MUC2、MUM−1、MUM−2、MUM−3、ネオーポリA ポリメラーゼ、NA88−A、NY−ESO−1、NY−ESO−1a(CAG−3)、PAGE−4、PAP、プロテイナーゼ3(PR3)、P15、p190、Pm1/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RAS、RCAS1、RU1、RU2、SAGE、SART−1、SART−2、SART−3、SP17、SPAS−1、TEL/AML1、TPI/m、チロシナーゼ、TARP、TRP−1(gp75)、TRP−2、TRP−2/INT2、WT−1、および、別法として、翻訳されたNY−ESO−ORF2およびCAMELタンパク質(NY−ESO−1およびLAGE−1遺伝子由来)を含む。本発明の微生物は、未だ同定されていない抗原を含めた、腫瘍―特異的免疫応答を誘導することができるいずれかの腫瘍抗原を含む。微生物は、1を超える腫瘍抗原をコードする1を超える異種配列を含むように改変することができる。好ましい抗原はメソテリン[Arganisら、Clin Cancer Res.7(12):3862−8(2001)]、Sp17[Limら、Blood.97(5):1508−10(2001)]、gp100[Kawakamiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6458(1994)]、PAGE−4[Brinkmannら、Cancer Res.59(7):1445−8(1999)]、TARP[Wolfgangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(17):9437−42(2000)]、EphA2[Tatsumiら、Cancer Res.63(15):4481−9(2003)]、PR3[Muller−Beratら、Clin.Immunol.Immunopath.70(1):51−9(1994)]およびSPAS−1[米国特許出願公開番号20020150588]を含む。
本発明の1つの具体例において、改変された微生物によって発現された異種タンパク質はCEAである。CEAは、結腸直腸、胃および膵臓の90%、非−小細胞肺癌の70%、および乳癌の50%を含めた、ヒト腫瘍のかなりの割合で過剰発現される180kDA膜細胞内接着糖タンパク質である(Hammmarstrom,Semin,Cancer Biol.,9:67−81)。抗−イディオタイプモノクローナル抗体ミミッキングCEA(Foonら、Clin.Cancer Res.,87:982−90(1995)、またはCEAを発現する組換えワクシニアウイルスを用いるワクチン接種(Tsangら、J.Natl.Cancer Inst,87:982−90(1995))のような種々の免疫療法が調べられてきたが、あいにくと、成功は限られている。それにもかかわらず、研究者らは、ワクチン接種した患者から生じたヒトT細胞系によって認識されるHLA*0201−制限エピトープ、CAP−1(CEA605−613)を同定した。このエピトープでパルスしたDCを持つ患者のワクチン接種は、臨床的応答を誘導しなかった(Morseら、Clin.Cancer Res.,5:1331−8(1999))。最近、CEA605−613ペプチドアゴニストが、位置610における異常なアスパルテートからアスパラギンへの置換を持つものとして同定された(CAP1−6D)。このアミノ酸置換はこのペプチドのMHC結合親和性を改変しなかったが、改変されたペプチドリガンド(APL)の使用の結果、インビトロにて、CEA−特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の生成が改良された。CAP1−6D−特異的CTLは、天然CEAを発現する腫瘍細胞を認識し、それを溶解するその能力を維持した(Zarembaら、Cancer Res.,57:4570−7(1997);Salazarら、Int.J.Cancer,85:829−38(2000))。Fongらは、このAPLと共にインキュベートされたFlt3−リガンド拡大DCでワクチン接種された結腸癌を持つ患者におけるCEA−特異的免疫の誘導を示した。勇気付けられることには、12人の患者のうち2人は、ワクチン接種の後、ペプチド−MHCテトラマー+T細胞の誘導と相関する劇的な腫瘍退行を経験した(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001))。一緒に考えると、この研究は、結腸直腸癌に対するCEA−標的化免疫療法に対する有利な確認を提供する。
もう1つの具体例において、改変された微生物によって発現された異種抗原はプロテイナーゼ−3であるか、あるいはプロテイナーゼ−3に由来する。例えば、1つの具体例において、抗原はHLA−A2.1−制限ペプチドPR1を含む(aa169−177;VLQELNVTV(配列番号:50))。プロテイナーゼ−3および/またはPR1エピトープについての情報は以下の文献で公に入手可能である:米国特許第5,180,819号、Molldremら、Blood,90:2529−2534(1997);Molldremら、Cancer Reaserch,59:2675−2681(1999);Molldremら、Nature Medicine,6:1018−1023(2000);およびMolldremら、Oncogene,21:8668−8673(2002)。
従って、いくつかの具体例においては、改変された微生物はメソテリン、SPAS−1、プロテイナーゼ−3、EphA2、SP−17、gp100、PAGE−4、TARP、Her−2/neu、WT−1、NY−ESO−1、PSMA、K−ras、またはCEAのような抗原、あるいはそれらのタンパク質の1つの由来する抗原をコードする核酸分子を含む。いくつかの具体例においては、改変された微生物はメソテリン、SPAS−1、プロテイナーゼ−3、SP−17、gp100、PAGE−4、TARP、WT−1、NY−ESO−1またはCEAのような抗原、またはそれらのタンパク質の1つに由来する抗原をコードする核酸分子を含む。いくつかの具体例において、改変された微生物はヒトメソテリン、あるいはヒトメソテリンに由来する抗原をコードする核酸分子を含む。他の具体例において、改変された微生物はヒトEphA2をコードする核酸分子を含むか、あるいはヒトEphA2に由来する。
本発明の微生物は、特異的感染症抗原をコードする異種核酸配列を含むように改変することができる。1つの具体例において、抗原はヒトまたは動物病原体に由来する。該病原体は、所望により、ウイルス、細菌、真菌または原生動物である。例えば、抗原はウイルスまたは真菌または細菌抗原であり得る。
例えば、抗原は(gp120、gp160、gp41、p24gagおよびp55gagのようなgag抗原ならびにHIVのpol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpuおよびLTR領域に由来するタンパク質のような)ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、またはヒトまたは動物ヘルペスウイルスに由来することができる。1つの具体例において、抗原は(gD、gB、gH、ICP27のような即時型タンパク質のような)単純疱疹ウイルス(HSV)タイプ1および2、(gBおよびgHのような)サイトメガロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エプスタインーバールウイルスまたは(gpI、IIまたはIIIのような)バリセラゾスタウイルスに由来する(例えば、Cheeら(1990) Cytomegaloviruses (J.K.McDougall編、Springer Verlag,pp.125−169);McGeochら(1998)J.Gen.Virol.69:1531−1574;米国特許第5,171,568号;Baerら(1984) Nature 310:207−211; およびDavisonら(1986) J.Gen.Virol.67:1759−1816参照)。
もう1つの具体例において、抗原はB型肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎表面抗原)A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、またはG型肝炎ウイルスのような肝炎ウイルスに由来する。例えば、WO 89/04669; WO 96/11089; およびWO 90/14436参照。HCVゲノムはE1およびE2を含めたいくつかのウイルスタンパク質をコードする。例えば、Houghtonら、Hepatology 14:381−388(1991)参照。
ウイルス抗原である抗原は、所望により、Picornaviridae科(例えば、ポリオウイルス、リノウイルス等);Caliciviridae;Togaviridae(例えば、ルベラウイルス、デングウイルス等);Flaviviridae;Coronaviridae;Reoviridae(例えば、ロタウイルス等);Birnaviridae;Rhabodoviridae(例えば、ラビエスウイルス等);Orthomyxoviridae(例えば、インフルエンザA、BおよびC型等);Filoviridae ;Paramyxoviridae(例えば、流行性下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器系シンシチウムウイルス、パラインフルエンザウイルス等);Bunyaviridae;Arenaviridae;Retroviradae(例えば、限定されるものではないが、単離体HIVI11b、HIVSF2、HTVLAV、HIVLAI、HIVMNからの抗原を含めた)HTLV−1;HTLV−11;(HTLV−111、LAV、ARV、hTLR等としても知られた)HIV−1;HIV−1CM235、HIV−1;HIV−2、とりわけ;シミアン免疫不全ウイルス(SIV);パピローマウイルス、ダニで生じる脳炎ウイルス等のいずれか1つからのウイルスに由来する。これらのおよび他のウイルスの記載については、例えば、Virology,3rd Eddition (W.K.Joklik ed.1988;Fundamental Virology,2.sup.nd Eddition (B.N.FieldsおよびD.M.Knipe,eds.1991)参照。
いくつかの別の具体例において、抗原はMycobacterium、Bacillus、Yersinia、Salmonella、Neisseria、Borrelia(例えば、OspAまたはOspBまたはその融合体)、Chlamydia、またはBordetella(例えば、P.69、PTおよびFHA)のような細菌性病原体に由来し、あるいはプラスモジウムまたはトキソプラズマのような寄生虫に由来する。1つの具体例において、抗原はMycobacterium tuberculosis (例えば、ESAT−6、85A、85B、72F)、Bacillus anthracis(例えば、PA)、またはYersinia pestis(例えば、F1,V)に由来する。加えて、本発明で用いるのに適した抗原は、限定されるものではないが、ジフテリア(Diptheria)、百日咳(Pertussis)、破傷風(Tetanus)、結核(Tuberculosis)、細菌または真菌肺炎(BacterialまたはFungal Pneumonia)、中耳炎(Otitis Media)、淋病(Gonorrhea)、コレラ(Cholera)、チフス(Typhoid)、髄膜炎(Meningitis)、単核細胞症(Mononucleosis)、ペスト(Plague)、細菌性赤痢(Shigellosis)またはサルモネラ症(Salmonellosis)、在郷軍人病(Legionaire’s Disease)、ライム病(Lyme Disease)、らい病(Leprosy)、マラリア(Malaria)、血線虫(Hookworm)、オンコセルカ症(Onchocerciasis)、充血住吸虫症(Schistosomiasis)、トリパノソーマ症(Trypanosomiasis)、リシュマニア症(Leishmaniasis)、ジアルジア属(Giardia)、アメーバ症(Amoebiasis)、フィラリア症(Filariasis)、ボレリア症(Borelia)および旋毛虫症(Trichinosis)を含めた疾患の原因である公知の病原体から得ることができるか、またはそれに由来することができる。
本発明の微生物は、自己免疫疾患−特異的抗原をコードする異種核酸配列を含むように改変することができる。T細胞媒介自己免疫疾患においては、自己抗原に対するT細胞応答の結果、自己免疫疾患が起こる。本発明のワクチンで自己免疫疾患を処置するのに用いられる抗原のタイプは、自己免疫応答を担う特異的T細胞を標的とするであろう。例えば、抗原は自己免疫応答を引き起こすそれらのT細胞に特異的なT細胞受容体の一部、イディオタイプとすることができ、ここで、本発明のワクチンに取り込まれた抗原は、自己免疫応答を引き起こすそれらのT細胞に特異的な免疫応答を誘導するであろう。それらのT細胞を排除することは、自己免疫疾患の軽減に対する治療的メカニズムであろう。もう1つの可能性は、自己免疫疾患における自己抗原に対して生成する抗体を標的とする、または抗体を分泌する特異的B細胞クローンを標的とする免疫応答をもたらすであろう抗原を取り込むことである。例えば、そのようなB細胞に対する抗−イディオタイプ免疫応答および/または自己免疫疾患における自己抗原と反応する抗体をもたらす微生物にイディオタイプ抗原を取り込むことができる。本発明のワクチン微生物で処置可能な自己免疫疾患は、限定されるものではないが、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、ろう瘡、重症筋無力症、白斑、強皮症、乾癬、尋常性天疱瘡、線維菌痛、結腸炎および糖尿病を含む。アレルギー反応を処置するのに同様なアプローチを取ることができ、ここで、ワクチン微生物に取り込まれた抗原は、アレルギー反応を変調するのに効果的なT細胞、B細胞または抗体いずれかを標的とする。乾癬のようないくつかの自己免疫疾患において、疾患の結果、同様に標的とすることができる抗原の発現を伴う過剰増殖性細胞増殖がもたらされる。過剰増殖細胞に対する免疫応答をもたらすそのような抗原が考えられる。
疾患の機能不全細胞を標的とするよりはむしろ、本発明の微生物は、ユニークな疾患関連タンパク質の構造を標的とする抗原を含む。これの1つの例は、前記したイディオタイプ抗原を用いる抗体、B細胞またはT細胞の標的化である。もう1つの可能性は、特定の疾患に由来するユニークなタンパク質構造を標的とすることである。これの例は、アルツハイマー病、クロイツェルフェルト−ヤコープ病(CJD)およびウシ海綿状脳障害(BSE)のような疾患で観察されるアミロイドプラークを引き起こすタンパク質に対する免疫応答を生じる抗原を取り込むことであろう。このアプローチはプラーク形成の減少を供するに過ぎないかもしれないが、CJDのような疾患の場合における治癒ワクチンを提供することが可能であろう。この疾患はプリオンタンパク質の感染性形態によって引き起こされる。ワクチンは、該ワクチンによって生じる免疫応答がCJDを引き起こす感染性タンパク質を排除し、減少させまたは制御できるように、プリオンタンパク質の感染性形態に対する抗原を取り込む。
(突然変異を含む微生物)
1つの具体例において、本発明は微生物を含むワクチンを含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変されており、微生物集団は、依然として、免疫応答を誘導するのに十分な程度まで所望の抗原を発現することができ、かつ微生物は、さらに、少なくとも1つの遺伝子突然変異によって減弱される。微生物における突然変異は、微生物の種々の特徴に影響し得る。いくつかの場合において、突然変異は、ある種の細胞に侵入する微生物の能力に影響する。例えば、ある種の細胞内細菌は、細菌に存在する受容体に応じて種々の細胞型を侵入することができる。突然変異は、細菌がある細胞型によって取り込まれるが、他の細胞型によっては取り込まれないように、ある受容体の発現を改変することができる。これの例として、Listeriaは、典型的には、貪食細胞によって取り込まれ、非−貪食細胞(例えば、肝臓細胞)に活動的に侵入する。非−貪食細胞の侵入が、貪食細胞による摂取が十分に活性でありつつ有意に低下または排除されるListeriaの突然変異を用いることができる。そのような突然変異は良好な免疫応答を提供することができる。というのは、ワクチンは貪食細胞によって優先的に取り込まれ、これは、免疫系に対して細菌抗原を提示するにおいて重要だからである。突然変異は、ある細胞型に侵入する微生物の能力の減弱をもたらすいずれの遺伝子に対するものでもあり得、これはListeriaにおけるインターナリン遺伝子(例えば、inlA、inlB)に対する突然変異が例示される。同様な遺伝子が他の細菌に存在でき(例えば、Salmonella、Bacillus anthracisおよびYersiniaのインベーシン遺伝子)、これらの遺伝子における突然変異は本発明に含まれる。突然変異は、ビルレンス因子、または増殖および拡大を可能とする遺伝子のような微生物の他の特徴にインパクトを与え、それにより、微生物のビルレンスを低下させる。例えば、ListeriaのactA遺伝子における突然変異は宿主細胞アクチンの重合において欠損を引き起こし、これは、他の細胞まで拡大するListeriaの能力を阻害する。Listeriaのhly遺伝子における突然変異(リステリオリシン(LLO)タンパク質)は、感染細胞のファゴリソソームから逃げるListeriaの能力にインパクトを与える。ListeriaのplcAまたはplcB遺伝子いずれかにおける突然変異は、細胞間を拡大するListeriaの能力にインパクトを与える。Yersiniaのyop遺伝子における突然変異は、マクロファージによる貪食を妨げるYersiniaの能力に影響する。もう1つの具体例において、遺伝子突然変異はある種の抗原、例えば、通常、微生物それ自体に対する免疫応答をもたらすであろう抗原の発現を減弱させる。もし微生物を、異種抗原を含むワクチンとして用いて、非−突然変異微生物と比較して、送達微生物に対して免疫応答が低下することを除き、異種抗原に対する強力な免疫応答を刺激すれば、そのような突然変異は有用であろう。1つの具体例において、微生物は、1を超える遺伝子における突然変異によって減弱される。1つの具体例において、突然変異の1つは、Listeriaのインターナリン遺伝子、または他の細菌における同様な遺伝子におけるものである。1つの具体例において、突然変異は、Listeriaのインターナリン遺伝子または他の細菌における同様な遺伝子の1以上におけるものである。1つの具体例において、突然変異の1つはactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、微生物は、actA遺伝子および1以上のインターナリン遺伝子において突然変異を持つListeria monocytogenesを含む。好ましい具体例において、Listeria monocytogenesは、actA遺伝子およびinlB遺伝子における突然変異を含み、好ましくはListeria monocytogenesは、(別法として、本明細書中では、ΔactAΔinlBまたはactA−inlB−という)actA/inlB欠失突然変異体を含む。本明細書中に記載されたものを含めた種々のListeria遺伝子の配列はGenbank受託番号NC 003210に見出すことができる。
1つの具体例において、本発明は微生物を含むワクチンを含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変されており、微生物集団は、依然として、免疫応答を誘導するのに十分な程度まで所望の抗原を発現することができ、かつ微生物は、さらに、少なくとも1つの遺伝子突然変異によって減弱される。微生物における突然変異は、微生物の種々の特徴に影響し得る。いくつかの場合において、突然変異は、ある種の細胞に侵入する微生物の能力に影響する。例えば、ある種の細胞内細菌は、細菌に存在する受容体に応じて種々の細胞型を侵入することができる。突然変異は、細菌がある細胞型によって取り込まれるが、他の細胞型によっては取り込まれないように、ある受容体の発現を改変することができる。これの例として、Listeriaは、典型的には、貪食細胞によって取り込まれ、非−貪食細胞(例えば、肝臓細胞)に活動的に侵入する。非−貪食細胞の侵入が、貪食細胞による摂取が十分に活性でありつつ有意に低下または排除されるListeriaの突然変異を用いることができる。そのような突然変異は良好な免疫応答を提供することができる。というのは、ワクチンは貪食細胞によって優先的に取り込まれ、これは、免疫系に対して細菌抗原を提示するにおいて重要だからである。突然変異は、ある細胞型に侵入する微生物の能力の減弱をもたらすいずれの遺伝子に対するものでもあり得、これはListeriaにおけるインターナリン遺伝子(例えば、inlA、inlB)に対する突然変異が例示される。同様な遺伝子が他の細菌に存在でき(例えば、Salmonella、Bacillus anthracisおよびYersiniaのインベーシン遺伝子)、これらの遺伝子における突然変異は本発明に含まれる。突然変異は、ビルレンス因子、または増殖および拡大を可能とする遺伝子のような微生物の他の特徴にインパクトを与え、それにより、微生物のビルレンスを低下させる。例えば、ListeriaのactA遺伝子における突然変異は宿主細胞アクチンの重合において欠損を引き起こし、これは、他の細胞まで拡大するListeriaの能力を阻害する。Listeriaのhly遺伝子における突然変異(リステリオリシン(LLO)タンパク質)は、感染細胞のファゴリソソームから逃げるListeriaの能力にインパクトを与える。ListeriaのplcAまたはplcB遺伝子いずれかにおける突然変異は、細胞間を拡大するListeriaの能力にインパクトを与える。Yersiniaのyop遺伝子における突然変異は、マクロファージによる貪食を妨げるYersiniaの能力に影響する。もう1つの具体例において、遺伝子突然変異はある種の抗原、例えば、通常、微生物それ自体に対する免疫応答をもたらすであろう抗原の発現を減弱させる。もし微生物を、異種抗原を含むワクチンとして用いて、非−突然変異微生物と比較して、送達微生物に対して免疫応答が低下することを除き、異種抗原に対する強力な免疫応答を刺激すれば、そのような突然変異は有用であろう。1つの具体例において、微生物は、1を超える遺伝子における突然変異によって減弱される。1つの具体例において、突然変異の1つは、Listeriaのインターナリン遺伝子、または他の細菌における同様な遺伝子におけるものである。1つの具体例において、突然変異は、Listeriaのインターナリン遺伝子または他の細菌における同様な遺伝子の1以上におけるものである。1つの具体例において、突然変異の1つはactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、微生物は、actA遺伝子および1以上のインターナリン遺伝子において突然変異を持つListeria monocytogenesを含む。好ましい具体例において、Listeria monocytogenesは、actA遺伝子およびinlB遺伝子における突然変異を含み、好ましくはListeria monocytogenesは、(別法として、本明細書中では、ΔactAΔinlBまたはactA−inlB−という)actA/inlB欠失突然変異体を含む。本明細書中に記載されたものを含めた種々のListeria遺伝子の配列はGenbank受託番号NC 003210に見出すことができる。
微生物は、その核酸に対する改変を修復する微生物の能力を有意に低下させる突然変異を含むであろう。そのような突然変異は、微生物のDNA修復メカニズムに関与する種々の遺伝子のいずれかにおけるものであろう。[Aravindら、Nucleic Acids Research 27(5):1223−1242(1999)]。その核酸に対する損傷を修復するその能力が欠ける微生物は、本発明の微生物の使用に対して付加されたレベルの安全性および有効性を提供する。適当な修復欠損突然変異体を用い、微生物は核酸改変に対してかなり感受性である。微生物の核酸を程度は低いが改変して、所望の量の増殖の減弱を確認することができる。これは、微生物核酸の発現が所望のタンパク質を生じさせるのに十分なように作動させる効率のより大きなウィンドウを提供する。デ・ノボ抗原発現が必要とされる場合、これは効果的な免疫応答を誘導するワクチンを提供する。また、それは、付加されたレベルの安全性を提供する。というのは、達成された増幅の減弱のレベルは、改変された核酸の修復によって損なわれないからである。もう1つの具体例において、遺伝子突然変異は、例えば、微生物の化合物に対する浸透性を改変することによって、または微生物核酸に接近し、それに結合する化合物の能力を改変することによって、核酸標的化化合物での処理に対する微生物の感受性を改変する。そのような突然変異は、微生物遺伝子発現を実質的に影響されずして、増殖を減弱させるプロセスの効率にインパクトを与えることもできる。
修復欠損突然変異体を用いる利点を説明すると、微生物増殖の減弱のメカニズムを考えることができる。微生物核酸はストランド破壊またはピリミジンダイマーによって、またはモノアダクトまたは架橋のような化学的改変によって改変される。もしこれらの改変の修復に対するメカニズムが無傷であれば、増殖の十分な減弱を達成するには、ある数の改変が必要であろう。核酸の改変が大きくなれば、タンパク質発現の低下は大きくなる。増殖を減弱するのに必要な改変のレベルはタンパク質発現を停止するのに必要なレベルよりもかなり低いが、タンパク質発現は依然としてある程度まで、恐らくは許容できないレベルまで低下するであろう。修復欠損突然変異体の使用は、より低い改変レベルが増殖の適切な減弱をもたらすように、増殖を減弱するのに必要なレベルを有意に低下させる。核酸改変はかなり低いので、タンパク質の発現はあまり影響されず、注目するタンパク質のより高いレベルの発現を供する。そのような修復欠損突然変異体は、ワクチンの安全性が核酸のわずかな改変によって増加させることができ、十分に高いレベルのタンパク質発現、特に、免疫応答が標的とする抗原を残す場合、微生物それ自体に対するワクチンのようなワクチンの製造で特に有用であろう。1つの具体例において、修復欠損突然変異体は、ピリミジンダイマーを修復するPhrB(フォトリアーゼ)を作成する能力を欠く。例えば、突然変異は、微生物の属および種に応じて、phrB遺伝子、または機能的に同等な遺伝子におけるものであろう。そのような突然変異体は、微生物の紫外線照射(例えば、UVB、UVC)と組み合わせて用いて、微生物核酸においてピリミジンダイマーを生じさせ得る。1つの具体例において、修復欠損突然変異体は、ストランド間架橋を修復することができない。そのような突然変異体は、限定されるものではないが、微生物の属および種に応じて、uvr遺伝子、すなわち、uvrA、uvrB、uvrCおよびuvrD遺伝子、ならびにrecA遺伝子、または機能的に同等な遺伝子における突然変異を含む。突然変異は1以上のこれらの遺伝子におけるものであろう。これらの突然変異は対応する酵素UvrA(ATPアーゼ)、UvrB(ヘリカーゼ)、UvrC(ヌクレアーゼ)、UvrD(ヘリカーゼII)およびRecA(レコンビナーゼ)の活性の減弱をもたらす。これらの突然変異体は、ソラレンのような架橋化合物と組み合わせて用いられるであろう。微生物核酸はいくつかの位置においては架橋され、これらの架橋は修復できないので、微生物は複製することができない。というのは、核酸の元のストランドは分離できないからである。それらは修復できないので、非常に少数の架橋が必要であり、微生物核酸は、大部分は、転写に接近可能であり、タンパク質発現は有意には改変されない。好ましい具体例においては、ストランド間架橋を修復することができない修復欠損微生物突然変異体の集団は、集団中の実質的に各微生物が少なくとも1つの架橋を含み、従って、複製の減弱が実質的に完全であるように、適切に架橋され、ここで、集団の微生物遺伝子発現は十分に活性である。1つの具体例において、recA遺伝子における突然変異は条件突然変異である。そのような突然変異においては、recA遺伝子の突然変異の結果、適当なpHまたは微生物集団の温度のようなある条件(すなわち、非許容条件)下でのみrecAの活性の減弱がもたらされる。条件recA突然変異を含む微生物は許容条件下で培養して、微生物の十分なレベルを増殖させ、次いで、処理に対する非許容条件下において播種し、核酸を改変し、次いで、核酸損傷が適切には修復されないような非許容条件下に貯蔵することができる。この例として、recA温度感受性突然変異体は30℃において増殖され、そこでは、それは良好に増殖し、処理して、42℃において核酸を改変し、この変異体は、ソラレン架橋のような処理に対して非常にそれが感受性であるように、recAに対して非許容性である。処理された微生物を非許容性条件下で貯蔵することができるが、ワクチン接種に際して、条件はrecAの発現を可能とし、いくつかの修復をもたらし、安全性の論点を提示するのが可能である。不活化および/または免疫化工程に先立ち、増殖が望ましい場合、株の増殖がイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)によって誘導できるように、recAをlacリプレッサーの制御下にある微生物を構築することが可能である。次いで、株からさらなるIPTGを控え、および/または株の環境からIPTGを排除することによって、recA発現の可能性を、不活化および/または免疫化工程のために排除することができる。
1つの具体例において、微生物は、修復メカニズムに関連しない少なくとも1つの突然変異と組合せて、その核酸に対する改変を修復する微生物の能力を有意に低下させる少なくとも1つの突然変異を含む。修復メカニズムに関連しない突然変異は、ある細胞に侵入する微生物の能力、増殖および拡大を可能とするビルレンス因子または遺伝子における突然変異、またはある抗原の発現を減弱させる突然変異のような微生物の種々の特徴に影響し得る。そのような突然変異は前記し、限定されるものではないが、インターナリン遺伝子(例えば、inlB)、ListeriaのactA遺伝子、hly遺伝子、plcA遺伝子、またはplcB遺伝子、侵入遺伝子(例えば、Salmonella、Bacillus anthracis、およびYersinia)またはYersiniaのyop遺伝子における突然変異を含む。1つの具体例において、微生物は、actA遺伝子における突然変異を有するListeria monocytogenesを含む。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはactA遺伝子およびインターナリン遺伝子における突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはactA突然変異およびuvrAB突然変異、好ましくは(ΔactAΔuvrABまたはactA−uvrAB−いずれかということができる)actA/uvrAB欠失突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはactA突然変異、inlB突然変異およびuvrAB突然変異、好ましくはactA/inlB/uvrAB欠失突然変異を含む。いくつかの他の具体例において、微生物は欠失のようなuvrAB突然変異を有するBacillus anthracisを含む。
もう1つの具体例において、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体Listeria monocytogenes株のような単離された突然変異体Listeria株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体リステリア株は(UvrAおよび/またはUvrBのような)少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体Listeria株はuvrA遺伝子および/またはuvrB遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株はAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、受託番号PTA−5563によって確認されるListeria monocytogenes ΔactAΔuvrAB株である。他の具体例において、株は、American Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、受託番号PTA−5563によって確認されるListeria monocytogenesΔactAΔuvrAB株の突然変異体であり、ここで、寄託された株の突然変異体はUvrA、UvrB、およびActAに関して欠損がある。
いくつかの具体例において、本発明は、(野生型に対して)少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物を提供する。いくつかの具体例において、少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある微生物は、野生型に対してDNA修復について減弱される。いくつかの具体例において、DNA修復についての微生物の能力は、野生型に対して、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約90%だけ低下する。DNA修復を行う微生物の能力を評価する方法は当業者によく知られている。いくつかの具体例において、微生物は以下の酵素:PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrD、およびRecAの1以上に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物はUvrA、UvrB、または双方の酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物はRecA、またはRecAの機能的等価物に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物は、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物はuvrAおよびuvrB双方、またはuvrAおよびuvrB双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物はrecAにおける遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物は細菌である。例えば、いくつかの具体例においては、微生物はMycobacterium tuberculosis、Listeria monocytogenesまたはBacillus anthracisである。
また、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、単離された突然変異体Listeria monocytogenes株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体株は(UvrAおよび/またはUvrBのような)少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体株はuvrA遺伝子および/またはuvrB遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、uvrA遺伝子、uvrB遺伝子、または双方の遺伝子が欠失される。いくつかの具体例において、突然変異体株はRecAに関して減弱される。いくつかの具体例において、突然変異体株はrecA遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体微生物は、American Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、受託番号PTA−5563によって確認されるListeria monocytogenes actA−/uvrAB−株、またはUvrA、UvrB、およびActAに関して欠損がある寄託された株の突然変異体である。
また、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、単離された突然変異体Bacillus anthracis株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体株は(UvrAおよび/またはUvrBのような)少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体株はuvrA遺伝子および/またはuvrB遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、uvrA遺伝子(配列番号:18)、uvrB遺伝子(配列番号:19)、または双方の遺伝子が欠失される。いくつかの具体例において、突然変異体株はRecAに関して減弱される。いくつかの具体例において、突然変異体株はrecA遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は、recAタンパク質の発現を温度感受性とするrecA遺伝子における突然変異を含む。いくつかの別の具体例において、B.anthracisの突然変異体株が構築され、それは(IPTGによって誘導可能な)lacリプレッサーの制御下にあり、増殖の間にrecAの発現を許容するが、(S−59/UVAを用いて)不活化および/またはポスト免疫化の間にはそうではない。いくつかの具体例において、突然変異体株は、株の毒性を低下させるlef遺伝子、cya遺伝子、または双方の遺伝子における1以上の突然変異を含む。
本発明のいずれの微生物に関しても、ソラレンでの修復欠損(例えば、uvr欠損)細菌のDNAの修復は、化合物の濃度、反応条件および光の量を調整することによって制御することができる。適切な濃度、反応条件および光の量は前記にて詳細に説明した複製およびタンパク質発現に対するその効果を評価することによって決定される。修復欠損突然変異体の使用は、濃度、反応条件および光の量のパラメーターが、微生物の適当な集団を供するための広い範囲の条件にわたって調節することができるように、適切なタンパク質発現を維持しつつ増殖のさらなるレベルの制御を供する。例えば、増殖を、タンパク質発現に有意に影響することなく完全に阻害することができる核酸改変密度のより広い範囲があろう。修復欠損株を完全に阻害するのに必要な改変の最終レベルは、非−修復欠損株についてよりもかなり低い(実施例3、7、11および21参照)。その結果、改変レベルは(完全な不活化を確認する)増殖を停止するのに必要な最小レベルよりもより高くできるが、依然として、タンパク質発現に有害なレベル未満である。かくして、本発明は非−修復欠損株で効果的であるが、uvr欠損株は、ワクチンとして効果的であろう微生物の望ましい集団を調製するにおいてより大きな柔軟性を提供する。プソアレン化合物は約10pMないし10mM、また約100pMないし1mM、また約1nMないし10μM、また約1ないし500nM、また約1ないし200nM、または約1ないし100nMの濃度において効果的であり、UVA光の量は約0.1ないし100J/cm2、また約0.1ないし20J/cm2、また約0.5ないし10J/cm2、または約0.5ないし6J/cm2、または約2ないし6J/cm2の範囲である。1つの具体例において、微生物は約10pMないし10mM、また約1ないし5000nM、また約1ないし500nM、また約5ないし500nM、または約10ないし400nMのソラレン濃度において増殖培地の存在下で処理される。1つの具体例において、増殖培地の存在下で処理された微生物は、約10pMないし10mM、また約1ないし5000nM、また約1ないし500nM、また約5ないし500nM、また約10ないし400nMの濃度のソラレンの存在下で0.5ないし1のODまで増殖される。0.5ないし1のODまでの増殖に続き、微生物集団に約0.1ないし100J/cm2、また約0.1ないし20J/cm2、また約0.5ないし10J/cm2、0.5ないし6J/cm2または約2ないし6J/cm2の範囲の量のUVA光を照射する。
いずれかの微生物、特に、uvr欠損突然変異体細菌においてソラレン架橋を一次的に生成させるためには、まずソラレンおよびUVA光を与えてアダクトを形成させ、これに続き、第二の量のUVA光単独を与えて、モノアダクトのいくらかまたはほとんどを変換して架橋させることができる。ソラレンの光化学は、適当なエネルギーのフォトンの吸収がまずモノアダクトを形成することである。フラン側モノアダクトが適切にDNA二重らせん中に適切に位置すると、さらなるフォトンの吸収はこのモノアダクトを架橋に変換するであろう[Tessmanら、Biochemistry 24:1669−1676(1985)]。サンプルに所望の濃度のソラレンにてより低いUVA量を与えることができ、未反応ソラレンは、例えば、細菌の洗浄、透析または限外濾過によって除去することができる。ソラレンアダクト(モノアダクトおよび架橋)を含む細菌は、UVA光をさらに与えて、細菌に対して有意なさらなるアダクトをもたらさずして、モノアダクトのいくらかまたはほとんどを架橋に変換することができる。これは、最初の光量での低い数のソラレンアダクトの制御された付加を可能とし、次いで、実質的な数のいずれかのモノアダクトを第二の量にて架橋に変換する。これは十分に低いレベルでの微生物ゲノムの改変を可能とし、そこでは、形成されたアダクトの大部分は架橋である。これは、uvr欠損突然変異体で複製をブロックするのに特に効果的である。そのような具体例において、ソラレン化合物は約10pMないし10mM、また約100pMないし1mM、また約1ないし500nM、また約1ないし200nM、または約1ないし100nMの濃度において効果的であり、UVA光の量は約0.1ないし10J/cm2、また約0.1ないし2J/cm2、また約0.5ないし2J/cm2の範囲である。細菌の洗浄、透析または限外濾過による未処理ソラレンのほとんどの除去に続き、細菌には0.1ないし100J/cm2、また約0.1ないし20J/cm2、または約0.5ないし10J/cm2、または約2ないし6J/cm2の範囲のUVA光を与えることができる。
(ワクチン組成物およびインビボでの効力)
本発明のワクチン組成物は、微生物核酸が改変されている微生物を含み、および/または抗原−負荷されており、および/または微生物の増殖が減弱されるように微生物核酸が改変された微生物での感染によって活性化された/成熟化された抗原提示細胞を含み、ここで、前記したように、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。本発明のワクチン組成物を用いて、個体において免疫応答を刺激することができる。処方は、種々の投与経路によって個体に投与することができる。そのようなワクチン組成物の投与方法は当該分野で知られており、経口、鼻孔、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下投与経路を含む。ワクチン組成物は、さらに、アジュバントまたはT細胞共刺激分子のようなワクチンに対する免疫応答を改良することが当該分野で知られたさらなる成分を含むことができる。また、本発明は、本発明の医薬組成物を含む医薬を含む。そのようなワクチンで処置すべき個体はいずれかの脊椎動物、好ましくは家畜動物、スポーツ用動物を含めた哺乳動物、およびヒトを含めた霊長類である。ワクチンは予防剤として投与することができ、そこでは、個体をワクチン接種して、特定の疾患に対して個体を免疫化する。ワクチンは、いくらかの状況では、癌ワクチンと一緒のようにいずれかの個体に与えることができるが、処置された個体は、癌を発生する高い危険性がある個体に限定される。また、ワクチンは治療剤として投与することができ、そこでは、特定の疾患を有する個体をワクチン接種して、疾患、または疾患関連タンパク質に対する免疫応答を改良する。この具体例において、ワクチンは、疾患に関連する物理的症状の軽減をもたらすことができる。例えば、癌ワクチンでは、ワクチン接種の結果、腫瘍の増殖が停止され、好ましくは平均腫瘍容量が減少され、より好ましくはいずれかの腫瘍が排除される。1つの具体例において、平均腫瘍容量は少なくとも約5%、また約10%、また約25%、また約50%、また約75%、また約90%または約100%だけ減少する。同様に、ワクチン接種の結果、腫瘍の転移が停止され、好ましくは腫瘍転移の数の低下がもたらされる。癌ワクチンのさらなる効果は、個体メジアンの生存の延長であろう。ヒトにおいては、メジアン生存は少なくとも約3ヶ月、また少なくとも約6ヶ月、または少なくとも約12ヶ月だけ延長される。
本発明のワクチン組成物は、微生物核酸が改変されている微生物を含み、および/または抗原−負荷されており、および/または微生物の増殖が減弱されるように微生物核酸が改変された微生物での感染によって活性化された/成熟化された抗原提示細胞を含み、ここで、前記したように、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。本発明のワクチン組成物を用いて、個体において免疫応答を刺激することができる。処方は、種々の投与経路によって個体に投与することができる。そのようなワクチン組成物の投与方法は当該分野で知られており、経口、鼻孔、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下投与経路を含む。ワクチン組成物は、さらに、アジュバントまたはT細胞共刺激分子のようなワクチンに対する免疫応答を改良することが当該分野で知られたさらなる成分を含むことができる。また、本発明は、本発明の医薬組成物を含む医薬を含む。そのようなワクチンで処置すべき個体はいずれかの脊椎動物、好ましくは家畜動物、スポーツ用動物を含めた哺乳動物、およびヒトを含めた霊長類である。ワクチンは予防剤として投与することができ、そこでは、個体をワクチン接種して、特定の疾患に対して個体を免疫化する。ワクチンは、いくらかの状況では、癌ワクチンと一緒のようにいずれかの個体に与えることができるが、処置された個体は、癌を発生する高い危険性がある個体に限定される。また、ワクチンは治療剤として投与することができ、そこでは、特定の疾患を有する個体をワクチン接種して、疾患、または疾患関連タンパク質に対する免疫応答を改良する。この具体例において、ワクチンは、疾患に関連する物理的症状の軽減をもたらすことができる。例えば、癌ワクチンでは、ワクチン接種の結果、腫瘍の増殖が停止され、好ましくは平均腫瘍容量が減少され、より好ましくはいずれかの腫瘍が排除される。1つの具体例において、平均腫瘍容量は少なくとも約5%、また約10%、また約25%、また約50%、また約75%、また約90%または約100%だけ減少する。同様に、ワクチン接種の結果、腫瘍の転移が停止され、好ましくは腫瘍転移の数の低下がもたらされる。癌ワクチンのさらなる効果は、個体メジアンの生存の延長であろう。ヒトにおいては、メジアン生存は少なくとも約3ヶ月、また少なくとも約6ヶ月、または少なくとも約12ヶ月だけ延長される。
ワクチン処方は当該分野で知られており、保存剤、安定化剤、アジュバント、抗生物質および他の物質のような多数の添加剤を含む。チメロサールまたは2−フェノキシエタノールのような保存剤を添加して、特に、多重使用または用量を意図したワクチンバイアルで起こり得る不意の汚染に由来する細菌または真菌の増殖を遅らせ、または停止させる。ラクトースまたはグルタミン酸モノナトリウム(MSG)のような安定化剤は、温度変動または凍結乾燥プロセスのような種々の条件に対してワクチン処方を安定化させるのに添加される。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのようなアジュバントは、ワクチンの能力を増加させて、免疫応答をトリガーし、増強しまたは延長するのに添加される。サイトカイン、ケモカイン、CpGのような細菌核酸配列のようなさらなる物質も潜在的ワクチンアジュバントである。ネオマイシンおよびストレプトマイシンのような抗生物質は、微生物の潜在的に有害な増殖を妨げるために添加される。また、ワクチンは滅菌された水または生理食塩水のような懸濁流体を含むことができる。また、ワクチンは細胞または細菌タンパク質、(卵中で生産されるワクチンからの)卵タンパク質、DNAまたはRNA、またはトキソイド化プロセスからのホルムアルデヒドのような、製造プロセスからの少量の残存物質も含むことができる。
ワクチンの効率は個体、例えば、マウスで見積もることができる。マウスモデルは、人における効率のためのモデルとして認識されており、本発明のワクチンを評価し、規定するのに有用である。マウスモデルを用いて、いずれかの個体におけるワクチンの有効性に対する潜在能力を示す。特定の疾患に対する予防的または治療的効果いずれかを供するその能力につきワクチンを評価することができる。例えば、感染症の場合には、マウスの集団を所望の量の本発明の適切なワクチンでワクチン接種することができ、ここで、微生物は感染症関連抗原を発現する。この抗原は送達微生物それ自体からのものであり得、あるいは異種抗原であり得る。マウスは、引き続いて、ワクチン抗原に関連する感染剤で感染させることができ、感染に対する保護につき評価することができる。感染症の進行は、(ビヒクルのみ、または適当な抗原を含まない微生物でワクチン接種した、または接種していない)コントロール集団に対して観察することができる。
癌ワクチンの場合には、腫瘍細胞モデルを利用でき、そこでは、所望の腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞系を、所望の腫瘍抗原を含む本発明の微生物でのワクチン接種の前(治療モデル)または後(予防モデル)いずれかのマウスの集団に注入することができる。腫瘍抗原を含む微生物でのワクチン接種は、ワクチン接種されていない、ビヒクルをワクチン接種された、または無関係な抗原を発現する微生物を接種されたコントロール集団と比較することができる。加えて、本発明のワクチンの相対的有効性は、微生物核酸が改変されていない微生物の集団と比較することができる。そのようなモデルにおけるワクチンの有効性は、腫瘍注入後の時間の関数としての腫瘍容量の項目にて、あるいは腫瘍注入後の時間の関数としての生存集団の項目にて見積もることができる(例えば、実施例4)。1つの具体例において、核酸改変微生物でワクチン接種したマウスにおける腫瘍容量は、ワクチン接種していないか、またはビヒクル、または無関係な抗原を発現する微生物をワクチン接種したマウスにおける腫瘍容量よりも約5%、約10%、約25%、約50%、約75%、約90%または約100%少ない。もう1つの具体例において、腫瘍容量におけるこの差は、マウスへの腫瘍の移植から少なくとも約10日、約17日、約24日後に観察される。1つの具体例において、核酸改変微生物でワクチン接種したマウスにおけるメジアン生存時間は、ワクチン接種されていない、またはビヒクル、または無関係な抗原を発現する微生物でワクチン接種されたマウスにおけるよりも少なくとも約2日、約5日、約7日、または少なくとも約10日長い。本発明のワクチンに対する効果的な免疫応答に加えて、改変された微生物は、より高い用量の微生物が対応する未改変微生物に対して投与できるように、付加されたレベルの安全性を提供する。本発明の1つの具体例において、核酸改変微生物でのワクチン接種は、対応する未改変微生物の用量と同一である微生物の用量でなされる。もう1つの具体例において、核酸改変微生物のワクチン接種は、対応する未改変微生物のワクチン接種用量よりも少なくとも約2倍、約5倍、約10倍、約102倍、約103倍、または少なくとも約104倍高く、ここで、前記した得られた腫瘍容量およびメジアン生存時間は核酸改変微生物で観察される。
(使用方法)
本明細書中に記載された改変された微生物、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる種々の方法が本発明によって提供される。例えば、免疫応答を誘導し、および/または疾患を処置しまたは予防するための、本明細書中に記載された改変された微生物、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる方法が提供される。ワクチンおよび他の組成物を調製するための、改変された微生物および/または突然変異体株の使用方法も提供される。
本明細書中に記載された改変された微生物、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる種々の方法が本発明によって提供される。例えば、免疫応答を誘導し、および/または疾患を処置しまたは予防するための、本明細書中に記載された改変された微生物、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる方法が提供される。ワクチンおよび他の組成物を調製するための、改変された微生物および/または突然変異体株の使用方法も提供される。
例えば、1つの態様において、本発明は、抗原を発現する自由生活微生物を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物を含む組成物はワクチンである。いくつかの具体例において、微生物を含む組成物はプロフェッショナル抗原提示細胞である。抗原は前記した微生物に対して異種またはオートロガスであり得る。いくつかの具体例において、微生物の核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。
また、本発明は、抗原を発現するListeria monocytogenesの突然変異体を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。抗原はリステリアまたは非−リステリア抗原であり得る。いくつかの具体例において、Listeriaの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、S−59/UVA処理による)。
また、本発明は、抗原を発現するBacillus anthracisの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含み、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Bacillusの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、S−59/UVA処置による)。
また、本発明は、自由生活微生物を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている。いくつかの具体例において、微生物を含む組成物はワクチンである。いくつかの具体例において、微生物を含む組成物はプロフェッショナル抗原提示細胞である。
また、本発明は、Listeria monocytogenesの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Listeriaの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、S−59/UVA処置による)。いくつかの具体例において、疾患は感染症である。他の具体例において、疾患は癌である。
また、本発明は、Bacillus anthracisの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Bacillusの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、S−59/UVA処置による)。
また、本発明は医療用途のための自由生活微生物を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化される、および/または微生物がDNA修復酵素に関して欠損があるように改変されている。医療用途は(例えば、ワクチンとして使用するための)治療的および予防的医療適用双方を含むと理解される。いくつかの具体例において、微生物は、微生物が増殖について減弱化されるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの具体例において、微生物はListeria monocytogenesまたはBacillus anthracisである。
また、本発明は、Listeria monocytogenesの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Listeriaの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、S−59/UVA処置による)。いくつかの具体例において、疾患は感染症である。他の具体例において、疾患は癌である。
また、本発明は、Bacillus anthracisの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Bacillusの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、S−59/UVA処置による)。
また、本発明は医療用途のための自由生活微生物を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化される、および/または微生物がDNA修復酵素に関して欠損があるように改変されている。医療用途は(例えば、ワクチンとして使用するための)治療的および予防的医療適用双方を含むと理解される。いくつかの具体例において、微生物は、微生物が増殖について減弱化されるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの具体例において、微生物はListeria monocytogenesまたはBacillus anthracisである。
他の具体例において、本発明は、医療で用いるためのプロフェッショナル抗原提示細胞を提供し、ここで、抗原提示細胞は自由生活微生物を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱される、および/または微生物がDNA修復酵素に関して欠損があるように改変される。いくつかの具体例において、微生物は、微生物が増殖について減弱化されるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの具体例において、微生物はListeria monocytogenesまたはBacillus anthracisである。
また、本発明は、医療で用いられる突然変異体Listeria monocytogenes株を提供し、ここで、突然変異体Listeria monocytogenes株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。
加えて、本発明は、医療で用いられる突然変異体Bacillus anthracis株を提供し、ここで、突然変異体Bacillus anthracis株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。
本発明は、さらに、無関係な、および/または自由生活微生物によって引き起こされない疾患用の医薬の製造のための自由生活微生物の使用を提供し、ここで、核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている。いくつかの具体例において、疾患は癌である。いくつかの具体例において、疾患は自由生活微生物とは無関係な感染症である。
本発明は、さらに、無関係な、および/または微生物によって引き起こされない疾患用の医薬の製造のための自由生活微生物の使用を提供し、ここで、微生物は少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、疾患は癌である。いくつかの具体例において、疾患は微生物とは無関係な感染症である。
加えて、本発明は、無関係な、および/または自由生活微生物によって引き起こされない疾患用の医薬の製造のためのプロフェッショナル抗原提示細胞の使用を提供し、ここで、抗原提示細胞は自由生活微生物を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されており、および/またはここで、微生物は少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、疾患は癌である。いくつかの具体例において、疾患は自由生活微生物とは無関係な感染症である。
本発明は、さらに、無関係な、および/またはListeria monocytogenesによって引き起こされない疾患用の医薬の製造のためのListeria monocytogenesの突然変異体株の使用を提供し、ここで、突然変異体Listeria monocytogenes株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、疾患は癌である。いくつかの具体例において、疾患はListeria monocytogenesとは無関係の感染症である。
もう1つの態様において、本発明は、ナイーブなT細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロフェッショナル抗原提示細胞とナイーブなT細胞とを接触させることを含む、ナイーブなT細胞を活性化する方法を提供し、ここで、抗原提示細胞は自由生活微生物を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。この方法の接触工程はインビトロまたはインビボいずれかで行うことができる。ナイーブなT−細胞を活性化するための適当な条件および十分な時間は当業者に知られているであろう。加えて、そのような条件の例は以下の具体的な実施例で提供される。
また、プロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷する方法も提供される。該方法は、プロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)に負荷するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることを含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化され、および/または微生物が少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損があるように改変される。該方法の接触工程はインビトロ、エキソビボまたはインビボで行うことができる。抗原は微生物にとって異種またはオートロガスであり得る。抗原提示細胞に負荷するのに適当な条件および十分な時間は、一般に、当業者に知られているであろう。加えて、そのような条件の例は以下の具体的な実施例で提供される。
もう1つの態様において、本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化し、および/またはその成熟化をもたらすのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを(インビトロ、エキソビボ、および/またはインビボで)接触させることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化および/または成熟化する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱かされるように改変される。該方法の接触工程はインビトロまたはインビボいずれかで行うことができる。抗原は微生物にとって異種またはオートロガスであり得る。抗原提示細胞を活性化し、および/または抗原提示細胞を成熟化させるための適当な条件および十分な時間は、一般に、当業者に知られているであろう。加えて、そのような条件の例は以下の具体的実施例で提供される。
もう1つの態様において、本発明は、以下の工程(a)抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され;次いで(b)負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。
さらにもう1つの態様において本発明は以下の工程(a)抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され、次いで、(b)負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
(キット)
本発明は、さらに、本発明の改変された微生物および突然変異体株を含むキット(または製品)を提供する。
本発明は、さらに、本発明の改変された微生物および突然変異体株を含むキット(または製品)を提供する。
1つの態様において、本発明は(a)その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Listeria monocytogenes株、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Bacillus anthracis株、または自由生活微生物を含む組成物、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され;および(b)宿主において疾患の予防または処置で組成物を用いるための指示書双方を含むキットを提供する。いくつかの具体例において、指示書はラベル上にある。他の具体例において、指示書はキット内に含まれるインサート上にある。
もう1つの態様において、本発明は、(a)その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Listeria monocytogenes株、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Bacillus anthracis株、または自由生活微生物を含む組成物、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され;および(b)宿主への組成物の投与のための指示書双方を含むキットを提供する。いくつかの具体例において、指示書はラベル上にある。他の具体例において、指示書はキット内に含まれるインサート上にある。
もう1つの態様において、本発明は、(a)その核酸を修復するその能力を減弱化させる遺伝子突然変異を含む突然変異体Listeria monocytogenes株、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Bacillus anthracis株、または自由生活微生物を含む組成物、ここで、微生物の核酸は、微生物がその増殖について減弱化されるように改変され;および(b)組成物が投与される宿主を選択するための指示書双方を含むキットを提供する。いくつかの具体例において、指示書はラベル上にある。他の具体例において、指示書はキット内に含まれるインサートの上にある。
前記態様の各々のいくつかの具体例において、組成物はワクチンである。前記態様の各々のいくつかの具体例において、組成物はプロフェッショナル−抗原提示細胞である。前記態様の各々のいくつかの具体例において、自由生活微生物の核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの具体例において、微生物はS−59/UVA処理されている。いくつかの具体例において、微生物はDNA修復酵素に関して欠損がある。
(本発明のさらなる具体例)
1つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物の増殖が減弱化されるように改変されている自由生活微生物を含む、および/または抗原−負荷されており、および/または微生物核酸が、微生物の増殖が減弱化されるように改変されている自由生活微生物での感染を通じて活性化されたまたは成熟化された抗原提示細胞を含むワクチン組成物を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。1つの具体例において、微生物遺伝子発現は、抗原が、個体への微生物の投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルにて抗原が発現されるように実質的に影響されない。1つの具体例において、微生物の増殖は少なくとも約0.3log、また少なくとも約1log、約2log、約3log、約4log、約6log、または少なくとも約8logによって減弱化される。もう1つの具体例において、微生物の増殖は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、約0.3ないし6log、約0.3ないし5log、約1ないし5log、または約2ないし5logだけ減弱化される。1つの具体例において、微生物による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物による抗原の発現の少なくとも約10%、約25%、約50%、約75%、または少なくとも約90%である。1つの具体例において、発現された抗原は微生物それ自体からの抗原である。1つの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。1つの具体例において、抗原は疾患関連抗原である。1つの具体例において、抗原は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病よりなる群から選択される疾患に関連する。1つの具体例において、抗原は腫瘍関連抗原である。1つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。1つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Sp17、gp100、PR3、PAGE−4、TARP、WT−1、NY−ESO−1およびSPAS−1よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物核酸は、微生物の放射線への暴露、および微生物核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と微生物との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい具体例において、微生物核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と微生物とを反応させることによって改変される。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される態様によって核酸に標的かされる。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、核酸アルキル化剤を含む。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである。1つの具体例において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはUVA照射によって化合物の活性化に際して反応する。1つの具体例において、UVA照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、核酸標的化化合物は核酸の改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはUVA照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、微生物は遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、遺伝子突然変異の結果、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱化がもたらされる。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に依存して、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子にある。1つの具体例において、突然変異はphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の1以上である。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrDおよびRecAよりなる群から選択されるDNA修復酵素の活性の減弱をもたらす。さらなる具体例において、これらの突然変異を含む微生物は、UVA照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物は細菌である。1つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。好ましい具体例において、細菌はListeria、好ましくはListeria monocytogenesである。1つの具体例において、Listeriaは、貪食細胞によるListeriaの摂取に有意に影響すること無く、非−貪食細胞に侵入するListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeriaの突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria突然変異はinlA、inlB、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはinlAおよびinlB遺伝子双方に遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、Listeriaは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はhly遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeriaは、Listeriaによるアクチンの重合の減弱をもたらす突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria突然変異はactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、ListeriaはactA遺伝子および1以上のインターナリン遺伝子に突然変異を含む。好ましい具体例において、ListeriaはactA遺伝子およびinlB遺伝子に突然変異を含み、好ましくは、ListeriaはactA/inlB欠失突然変異体を含む。好ましい具体例において、Listeria monocytogenes actA/inlB欠失突然変異体は、さらに、uvrAB遺伝子に欠失突然変異を含む。
1つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物の増殖が減弱化されるように改変されている自由生活微生物を含む、および/または抗原−負荷されており、および/または微生物核酸が、微生物の増殖が減弱化されるように改変されている自由生活微生物での感染を通じて活性化されたまたは成熟化された抗原提示細胞を含むワクチン組成物を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。1つの具体例において、微生物遺伝子発現は、抗原が、個体への微生物の投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルにて抗原が発現されるように実質的に影響されない。1つの具体例において、微生物の増殖は少なくとも約0.3log、また少なくとも約1log、約2log、約3log、約4log、約6log、または少なくとも約8logによって減弱化される。もう1つの具体例において、微生物の増殖は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、約0.3ないし6log、約0.3ないし5log、約1ないし5log、または約2ないし5logだけ減弱化される。1つの具体例において、微生物による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物による抗原の発現の少なくとも約10%、約25%、約50%、約75%、または少なくとも約90%である。1つの具体例において、発現された抗原は微生物それ自体からの抗原である。1つの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。1つの具体例において、抗原は疾患関連抗原である。1つの具体例において、抗原は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病よりなる群から選択される疾患に関連する。1つの具体例において、抗原は腫瘍関連抗原である。1つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。1つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Sp17、gp100、PR3、PAGE−4、TARP、WT−1、NY−ESO−1およびSPAS−1よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物核酸は、微生物の放射線への暴露、および微生物核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と微生物との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい具体例において、微生物核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と微生物とを反応させることによって改変される。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される態様によって核酸に標的かされる。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、核酸アルキル化剤を含む。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである。1つの具体例において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはUVA照射によって化合物の活性化に際して反応する。1つの具体例において、UVA照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、核酸標的化化合物は核酸の改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはUVA照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、微生物は遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、遺伝子突然変異の結果、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱化がもたらされる。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に依存して、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子にある。1つの具体例において、突然変異はphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の1以上である。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrDおよびRecAよりなる群から選択されるDNA修復酵素の活性の減弱をもたらす。さらなる具体例において、これらの突然変異を含む微生物は、UVA照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物は細菌である。1つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。好ましい具体例において、細菌はListeria、好ましくはListeria monocytogenesである。1つの具体例において、Listeriaは、貪食細胞によるListeriaの摂取に有意に影響すること無く、非−貪食細胞に侵入するListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeriaの突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria突然変異はinlA、inlB、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはinlAおよびinlB遺伝子双方に遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、Listeriaは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はhly遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeriaは、Listeriaによるアクチンの重合の減弱をもたらす突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria突然変異はactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、ListeriaはactA遺伝子および1以上のインターナリン遺伝子に突然変異を含む。好ましい具体例において、ListeriaはactA遺伝子およびinlB遺伝子に突然変異を含み、好ましくは、ListeriaはactA/inlB欠失突然変異体を含む。好ましい具体例において、Listeria monocytogenes actA/inlB欠失突然変異体は、さらに、uvrAB遺伝子に欠失突然変異を含む。
1つの具体例において、本発明は、細菌の増殖が減弱化されるように、細菌核酸が改変された細菌を含むワクチン組成物を含み、ここで、細菌遺伝子発現は実質的に影響されない。1つの具体例において、細菌遺伝子発現は、細菌の個体への投与に際して細菌に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルにて抗原が発現されるように実質的に影響されない。1つの具体例において、細菌の増殖は少なくとも約0.3log、また少なくとも約1log、約2log、約3log、約4log、約6log、または少なくとも約8logだけ減弱される。もう1つの具体例において、微生物の増殖は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、約0.3ないし6log、約0.3ないし5log、約1ないし5log、または約2ないし5logだけ減弱される。1つの具体例において、細菌による抗原の発現は、細菌核酸が改変されていない細菌による抗原の発現の少なくとも約10%、約25%、約50%、約75%または少なくとも約90%である。1つの具体例において、細菌核酸は、細菌の放射線への暴露、および細菌核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と細菌との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい具体例において、細菌核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と細菌とを反応させることによって改変される。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される態様によって核酸に標的化される。1つの具体例において、核酸標的化化合物は核酸アルキル化剤を含む。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエーテルである。1つの具体例において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射による、好ましくはUVA照射による化合物の活性化に際して反応する。1つの具体例において、UVA照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、核酸の改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、核酸標的化化合物は照射による、好ましくはUVA照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、細菌は遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、改変されている細菌核酸を修復する細菌の能力の減弱をもたらす。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、細菌の属および種に応じて、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、突然変異はphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の1以上におけるものである。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrDおよびRecAよりなる群から選択されるDNA修復酵素の活性における減弱をもたらす。好ましい具体例において、これらの突然変異を含む細菌は、UVA照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、細菌はグラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内細菌およびマイコバクテリアよりなる群から選択される。1つの具体例において、細菌はBacillus anthracis、Cholera、Bordetella pertussis、Corynebacterium diphtheriae、E.coli、Borrelia burgdorferi(Lyme)、Streptococcus pneumoniae、Salmonella、Staphylococcus sp.、Mycobacterium tuberculosis、Brucella abortus、Brucella melitensis、Haemophilus influenzae、Neisseria meningitides、Yersinia pestis、Shigella sp.、Francisella tulraensis、およびStreptococcus pyogenesよりなる群から選択される。1つの具体例において、細菌はマイコバクテリアである。1つの具体例において、マイコバクテリアはMycobacterium tuberculosisである。1つの具体例において、Mycobacterium tuberculosisはuvrAB欠失突然変異を含む。1つの具体例において、Mycobacterium tuberculosisは条件recA突然変異を含む。1つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。1つの具体例において、細胞内細菌はBacillus anthracisである。1つの具体例において、Bacillus anthracisはuvrAB欠失突然変異を含む。1つの具体例において、Bacillus anthracisは条件recA突然変異を含む。1つの具体例において、細胞内細菌はYersinia pestisである。1つの具体例において、Yersinia pestisはuvrAB欠失突然変異を含む。1つの具体例において、Yersinia pestisは条件recA突然変異を含む。
本発明は、個体のワクチン接種のような、前記組成物を含む医薬および前記組成物の使用方法を含む。1つの具体例において、本発明は、ワクチンを個体に投与することを含む本発明のワクチンを使用する方法を含む。1つの具体例において、ワクチン接種は、経口、鼻孔内、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下よりなる群から選択される経路によるワクチンの投与によって行われる。1つの具体例において、ワクチンは、それに対してワクチンが標的化される疾患の兆候を有しない個体に対する予防方法を用いて投与される。1つの具体例において、ワクチンは、それに対してワクチンが標的化される疾患の兆候を有する個体に対する治療方法を用いて投与される。1つの具体例において、ワクチンは、癌を標的とする腫瘍抗原を含み、治療的ワクチン接種の結果、癌の兆候が低下する。1つの具体例において、ワクチン接種された個体における平均腫瘍容量は少なくとも約5%、また約10%、また約25%、また約50%、また約75%、また約90%、または約100%だけ減少する。1つの具体例において、ワクチンは予防的または治療的方法いずれかを用いてマウスに投与され、ここで、マウスは、腫瘍細胞を移植してマウスにおいて腫瘍を樹立することができるモデル系であり、ここで、ワクチンは移植された腫瘍の少なくとも1つの抗原を含む。腫瘍は、ワクチンがマウスに投与される後(予防方法)または前(治療方法)いずれかにマウスに移植される。1つの具体例において、予防または治療方法いずれかを用いて接種されたマウスにおける平均腫瘍容量は、ワクチン接種されない、または無関係な抗原を発現する同様なワクチンビヒクルを接種した同様なマウス(コントロールマウス)における腫瘍容量よりも小さい。1つの具体例において、ワクチン接種マウスにおける平均腫瘍容量は、コントロールマウスにおける平均腫瘍容量よりも少なくとも約5%、約10%、約25%、約50%、約75%、約90%または約100%低い。1つの具体例において、予防または治療方法いずれかを用いてワクチン接種されたマウスのメジアン生存時間はコントロールマウスにおけるよりも少なくとも約2日、約5日、約7日または少なくとも約10日長い。
1つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が減弱されるように改変されるように、微生物集団を処理することを含むワクチン組成物の製法を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。もう1つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が減弱されるように改変されるように微生物集団を処理し、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されず、次いで、その微生物集団を用いて 抗原提示細胞に抗原を負荷し、抗原提示細胞の活性化/成熟化を誘導することを含む、ワクチン組成物の製法を含む。1つの具体例において、微生物集団は照射によって処理される。1つの具体例において、微生物集団は、核酸の改変を間接的に引き起こす核酸標的化化合物と反応させることによって処理される。さらなる具体例において、核酸標的化化合物は照射によって活性化され、ここで、化合物の活性化は核酸の間接的改変を引き起こす。さらなる具体例において、核酸標的化化合物の活性化は、核酸を改変する反応性酸素種をもたらす。1つの具体例において、微生物集団は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することによって処理される。1つの具体例において、核酸標的化化合物は約10pMないし10mM、また約100pMないし1mM、また約1ないし500nM、また約1ないし200nMまたは約1ないし100nMの濃度にて反応する。1つの具体例において、核酸標的化化合物はアルキル化剤を含む。1つの具体例において、アルキル化剤は、マスタード、マスタード中間体およびマスタード等価物よりなる群から選択される。1つの具体例において、核酸標的化化合物はインターカレーター、小溝バインダー、大溝バインダー、静電バインダー、および配列−特異的バインダーよりなる群から選択される核酸標的化基を含む。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、化合物の活性化に際して核酸と直接的に反応する。1つの具体例において、化合物の活性化は照射による。1つの具体例において、照射はUVA照射である。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はUVA照射によって活性化されたソラレン化合物である。1つの具体例において、ソラレン化合物は約10pMないし10mM、また約100pMないし1mM、また約1ないし500nM、また約1ないし200nM、または約1ないし100nMの濃度におけるものであり、UVA照射は約0.1ないし100J/cm2、また約0.1ないし20J/cm2、または約0.5ないし5J/cm2または約2ないし4J/cm2の量である。1つの具体例において、微生物集団の増殖は少なくとも約0.3log、また少なくとも1log、約2log、約3log、約4log、約6log、または少なくとも約8logだけ減弱される。もう1つの具体例において、微生物集団の増殖は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、約0.3ないし6log、約0.3ないし5log、約1ないし5log、または約2ないし5logだけ減弱される。1つの具体例において、微生物集団による抗原の発現は、核酸を改変するように処理されていない微生物集団による抗原の発現の少なくとも約10%、約25%、約50%、約75%、または少なくとも約90%である。1つの具体例において、発現された抗原は微生物それ自体からの抗原である。1つの具体例において、微生物はMycobacterium tuberculosisであり、抗原はMycobacterium tuberculosisからのものである。1つの具体例において、微生物はBacillus anthracisであり、抗原はBacillus anthracisからのものである。1つの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。1つの具体例において、抗原は疾患関連抗原である。1つの具体例において、抗原は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖病よりなる群から選択される疾患に関連する。1つの具体例において、抗原は腫瘍関連抗原である。1つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。1つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Sp17、gp100、PR3、PAGE−4、TARP、WT−1、NY−ESO−1およびSPAS−1よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物は遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、遺伝子突然変異の結果、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱がもたらされる。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、phrB、uvrA、uvrB、urvC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、phrB、uvrA、uvrB、urvC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の1以上におけるものである。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrDおよびRecAよりなる群から選択されるDNA修復酵素の活性における減弱をもたらす。さらなる具体例において、これらの突然変異を有する微生物を、UVA照射によって活性化されたソラレンで処理する。1つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物は細菌である。1つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。好ましい具体例において、細菌はListeria、好ましくはListeria monocytogenesである。1つの具体例において、Listeriaは、貪食細胞によるListeriaの摂取に有意に影響すること無く、非−貪食細胞に侵入するListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria突然変異はinlA、inlB、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはinlAおよびinlB遺伝子双方に遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、Listeriaは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はhly遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeriaは、Listeriaによるアクチンの重合の減弱をもたらす突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria突然変異はactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、ListeriaはactA遺伝子および1以上のインターナリン遺伝子に突然変異を含む。好ましい具体例において、ListeriaはactA遺伝子およびinlB遺伝子に突然変異を含み、好ましくは、ListeriaはactA/inlB欠失突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria monocytogenes actA/inlB欠失突然変異体は、さらに、uvrAB遺伝子に欠失突然変異を含む。
(実施例1)
(OVA抗原の発現を維持しつつ増殖の減弱を供するListeria株のソラレン処理)
オボアルブミン、異種ニワトリOVA抗原を発現するように改変されているListeria monocytogenesのいくつかの株を(4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレン(Ben Venue,Cleveland,OHによって3mM溶液として固体から調製されたS−59(Ash−Stevens,Riverview,MI)(米国特許第5,399,719号参照))およびUVA光(320ないし400nm)と反応させた。得られたListeriaをアッセイして、生きたListeriaのlog力価の低下、ならびにListeriaによるOVA抗原の発現を評価した。Listeria株はUniversity of California,BerkeleyのDan Portnoy博士によって供され、実施例8に記載したようにOVA抗原を含むように改変した。これらはDP−L4056(野生型)、DP−L4029(10403S ΔactA、ActA遺伝子におけるファージ治癒欠失突然変異、Skobleら、Journal of Cell Biology,150:527−537(2000)およびLauerら、Journal of Bacteriology 184(15):4177−4186(2002)参照)、DP−L4364(10403S ΔlplA、ホスホリパーゼA遺伝子における欠失突然変異)およびDP−L4017(10403S hlyL461T、ヘモリシン遺伝子における点突然変異、Glomskiら、Journal of Cell Biology 156(6):1029−1038,(2002)参照)であった。株を37℃にて300rpmにおいてBHI培地(ブレイン・ハート・インフュージョン、Fisher Scientific)中で約1×109CFU/mLの濃度まで(600nmにおける0.5の吸光度まで)増殖させた。各株の1.0mLアリコットを二連15mL試験管に移した。各試験管を4℃にて2300×gにおいて20分間遠心し、上清を除去し、S−59の有りおよび無しにて、1%BSAを含む5mLのPBS(リン酸緩衝化生理食塩水、Hyclone)を二連試験管に添加した(1×108CFU/mL)。S−59は100nMの濃度で添加した。サンプルを6ウェル培養プレート中に入れ、ほぼ2J/cm2の量でUVAを照射した(FX1019照射デバイス、Baxter Fenwal,Round Lake,IL)。次いで、各サンプルを15mL試験管に移し、前記したように遠心し、上清を除去した。これらを5mLのPBSで洗浄し、遠心し、上清を除去し、最終細菌ペレットを0.5mLのPBS中に懸濁させた。各々の100μLサンプルを用いて、系列希釈によって細菌の力価を決定した。各希釈をLB(Luria−Bertani,Q−Biogene,Carlsbad,CA)プレート上に平板培養し、37℃で一晩インキュベートし、コロニーをカウントして、細菌の力価を測定した。
(OVA抗原の発現を維持しつつ増殖の減弱を供するListeria株のソラレン処理)
オボアルブミン、異種ニワトリOVA抗原を発現するように改変されているListeria monocytogenesのいくつかの株を(4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレン(Ben Venue,Cleveland,OHによって3mM溶液として固体から調製されたS−59(Ash−Stevens,Riverview,MI)(米国特許第5,399,719号参照))およびUVA光(320ないし400nm)と反応させた。得られたListeriaをアッセイして、生きたListeriaのlog力価の低下、ならびにListeriaによるOVA抗原の発現を評価した。Listeria株はUniversity of California,BerkeleyのDan Portnoy博士によって供され、実施例8に記載したようにOVA抗原を含むように改変した。これらはDP−L4056(野生型)、DP−L4029(10403S ΔactA、ActA遺伝子におけるファージ治癒欠失突然変異、Skobleら、Journal of Cell Biology,150:527−537(2000)およびLauerら、Journal of Bacteriology 184(15):4177−4186(2002)参照)、DP−L4364(10403S ΔlplA、ホスホリパーゼA遺伝子における欠失突然変異)およびDP−L4017(10403S hlyL461T、ヘモリシン遺伝子における点突然変異、Glomskiら、Journal of Cell Biology 156(6):1029−1038,(2002)参照)であった。株を37℃にて300rpmにおいてBHI培地(ブレイン・ハート・インフュージョン、Fisher Scientific)中で約1×109CFU/mLの濃度まで(600nmにおける0.5の吸光度まで)増殖させた。各株の1.0mLアリコットを二連15mL試験管に移した。各試験管を4℃にて2300×gにおいて20分間遠心し、上清を除去し、S−59の有りおよび無しにて、1%BSAを含む5mLのPBS(リン酸緩衝化生理食塩水、Hyclone)を二連試験管に添加した(1×108CFU/mL)。S−59は100nMの濃度で添加した。サンプルを6ウェル培養プレート中に入れ、ほぼ2J/cm2の量でUVAを照射した(FX1019照射デバイス、Baxter Fenwal,Round Lake,IL)。次いで、各サンプルを15mL試験管に移し、前記したように遠心し、上清を除去した。これらを5mLのPBSで洗浄し、遠心し、上清を除去し、最終細菌ペレットを0.5mLのPBS中に懸濁させた。各々の100μLサンプルを用いて、系列希釈によって細菌の力価を決定した。各希釈をLB(Luria−Bertani,Q−Biogene,Carlsbad,CA)プレート上に平板培養し、37℃で一晩インキュベートし、コロニーをカウントして、細菌の力価を測定した。
細菌サンプルの抗原提示はネズミDC2.4細胞系(Dana Farber Cancer Instituteからの樹状細胞、Shenら、J Immunol 158(6):2723−30(1997)参照)および(Shastri博士,University of California,Berkeleyから入手した)B3ZT細胞ハイブリドーマを用いて評価した。B3Zは、MHCクラスI分子の意味でOVA抗原の認識に際してβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するlacZ誘導性CD8+T細胞ハイブリドーマである。CPRG(クロロフェノールレッド−β−D−ガラクトピラノシド,Calbiochem,La Jolla,CA)、β−ガラクトシダーゼに対する基質の代謝を用いて、生産されたβ−ガラクトシダーゼのレベルを評価し、これは、DC2.4細胞によって提示されたOVA抗原の量に直接相関する。DC2.4細胞およびB3Z
T細胞ハイブリッドを、10%FBS(胎児ウシ血清、HyClone)を含むRPMI1640培養基(RPMI,Invitrogen)中に維持した。DC2.4細胞を200μLアリコットにて、96ウェル培養プレートのウェルに移した(ウェル当たり1×105DC2.4)。細菌サンプルを50μLストックにて系列的に、1×105CFU/mLまで低下した450μL PBSまで希釈した(S−59処理サンプルはCFU等価物であり、すなわち、それはS−59処理に先立ってのコロニー形成単位の数である)。各希釈の20μLを、DC2.4細胞を含有するウェルに移して、ほぼ1×104、1×105、1×106、1×107、または1×108CFU/mLを得る。加えて、PBSのみの20μLアリコットを陰性コントロールとして添加した。サンプルを5%CO2中で37℃にて1時間インキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄して、細胞外細菌を除去した。B3Z T細胞(1×105細胞)の200μLアリコットおよび100μg/mLゲンタマイシン(Sigma)を各ウェルに添加した。陽性コントロールとして、100nM SL8 OVA257−264ペプチド(SL8 OVA抗原、SIINFEKL、配列番号:1、Invitrogen、San Diego、CA)を、DC2.4およびB3Z細胞の各々1×105を含有するウェルに添加した。サンプルを5%CO2中で37℃にて一晩インキュベートした。プレートを400×gにて3分間遠心し、各ウェルを250μLのPBSで洗浄した。100μMの2−メルカプトエタノール、9mMのMgCl2、0.125%Igepal CA−630((オクタフェノキシ)ポリエトキシエタノール、Sigma)、および0.15mMのCPRGを含有するPBSの100μLアリコットを各ウェルに添加した。サンプルを37℃にて少なくとも4時間インキュベートした。プレートリーダーを用い、吸光度を655nmにおける参照測定にて595nmにて測定した。細菌力価、および未処理に対するS−59処理の抗原提示についての結果を(DC2.4当たり100細菌)を表1に掲げる。結果は、DC2.4当たり添加された100細菌細胞のレベルでは、抗原提示は未処理サンプルのほぼ55ないし85%であることを示す。細菌力価はほぼ104だけ低下したので、これは、十分な抗原提示がListeriaの増殖のかなりの減弱を伴って維持されることを示す。
T細胞ハイブリッドを、10%FBS(胎児ウシ血清、HyClone)を含むRPMI1640培養基(RPMI,Invitrogen)中に維持した。DC2.4細胞を200μLアリコットにて、96ウェル培養プレートのウェルに移した(ウェル当たり1×105DC2.4)。細菌サンプルを50μLストックにて系列的に、1×105CFU/mLまで低下した450μL PBSまで希釈した(S−59処理サンプルはCFU等価物であり、すなわち、それはS−59処理に先立ってのコロニー形成単位の数である)。各希釈の20μLを、DC2.4細胞を含有するウェルに移して、ほぼ1×104、1×105、1×106、1×107、または1×108CFU/mLを得る。加えて、PBSのみの20μLアリコットを陰性コントロールとして添加した。サンプルを5%CO2中で37℃にて1時間インキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄して、細胞外細菌を除去した。B3Z T細胞(1×105細胞)の200μLアリコットおよび100μg/mLゲンタマイシン(Sigma)を各ウェルに添加した。陽性コントロールとして、100nM SL8 OVA257−264ペプチド(SL8 OVA抗原、SIINFEKL、配列番号:1、Invitrogen、San Diego、CA)を、DC2.4およびB3Z細胞の各々1×105を含有するウェルに添加した。サンプルを5%CO2中で37℃にて一晩インキュベートした。プレートを400×gにて3分間遠心し、各ウェルを250μLのPBSで洗浄した。100μMの2−メルカプトエタノール、9mMのMgCl2、0.125%Igepal CA−630((オクタフェノキシ)ポリエトキシエタノール、Sigma)、および0.15mMのCPRGを含有するPBSの100μLアリコットを各ウェルに添加した。サンプルを37℃にて少なくとも4時間インキュベートした。プレートリーダーを用い、吸光度を655nmにおける参照測定にて595nmにて測定した。細菌力価、および未処理に対するS−59処理の抗原提示についての結果を(DC2.4当たり100細菌)を表1に掲げる。結果は、DC2.4当たり添加された100細菌細胞のレベルでは、抗原提示は未処理サンプルのほぼ55ないし85%であることを示す。細菌力価はほぼ104だけ低下したので、これは、十分な抗原提示がListeriaの増殖のかなりの減弱を伴って維持されることを示す。
(表1 100nMソラレンS−59および2J/cm2UVA光で処理されたOVA抗原を発現するListeria株のlog減弱および抗原提示)
*DC2.4細胞当たり100Listeriaにおいて測定された未処理のパーセント。
DP−L4056野生型を用いて同様の手法を行った。細菌を100、200、400、800または1000nM S−59で処理し、残りの力価を決定し、前記で詳細に説明したように抗原提示を測定した。細菌力価および抗原提示(DC2.4細胞当たり100Listeria)についての結果を表2に示し、図1にプロットする。このデータは、抗原提示が、増殖の完全な阻害(すなわち、検出の限界まで)での抗原の提示を含めた、Listeria増殖の広い範囲の減弱につき有意であることを示す。
(表2 種々の濃度のソラレンS−59および2J/cm2UVA光で処理したOVA抗原を発現するListeria株DP−L4056のlog減弱および抗原提示)
*DC2.4細胞当たり100Listeriaにおいて測定された未処理のパーセント。
(実施例2)
(OVA抗原の発現を維持しつつ増殖の減弱を供するListeria株のDNA標的化アルキル化剤処理)
化合物β−アラニン,((N−アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステル(化合物1、ChemSyn,Harrisonville,MO,米国特許第6,093,725号)のみを用い、手法は実施例1と同様に行った。用いたListeria株はDP−L4056およびDP−L4017であった。化合物1(酸性BBS(血液バンク生理食塩水)中1mM、100mL BBS当たり1.48M H3PO4の135μl)を、0、0.5、1、2、5および10μMの濃度まで、1×108CFU/mLにおける5mLの細菌に添加し、サンプルを室温にて2時間インキュベートした。インキュベーションの後、細菌力価および抗原提示を実施例1におけるように評価した。抗原提示では、Listeria株を1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、または1×107CFU/mLまで希釈した。log力価、log減弱、および化合物1の濃度の関数としての未処理(DC2.4当たり1のListeria)のパーセントとしての抗原提示を表3および図2A、Bに掲げる。結果は、化合物1が、Listeriaの増殖のかなりの減弱でもって、十分な抗原提示を供するにおいて、例えば1μMでやはり効果的である。
(OVA抗原の発現を維持しつつ増殖の減弱を供するListeria株のDNA標的化アルキル化剤処理)
化合物β−アラニン,((N−アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステル(化合物1、ChemSyn,Harrisonville,MO,米国特許第6,093,725号)のみを用い、手法は実施例1と同様に行った。用いたListeria株はDP−L4056およびDP−L4017であった。化合物1(酸性BBS(血液バンク生理食塩水)中1mM、100mL BBS当たり1.48M H3PO4の135μl)を、0、0.5、1、2、5および10μMの濃度まで、1×108CFU/mLにおける5mLの細菌に添加し、サンプルを室温にて2時間インキュベートした。インキュベーションの後、細菌力価および抗原提示を実施例1におけるように評価した。抗原提示では、Listeria株を1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、または1×107CFU/mLまで希釈した。log力価、log減弱、および化合物1の濃度の関数としての未処理(DC2.4当たり1のListeria)のパーセントとしての抗原提示を表3および図2A、Bに掲げる。結果は、化合物1が、Listeriaの増殖のかなりの減弱でもって、十分な抗原提示を供するにおいて、例えば1μMでやはり効果的である。
(表3 種々の濃度の化合物1で処理されたListeria株のlog減弱および抗原提示)
*DC2.4細胞当たり1Listeriaにおいて測定された未処理のパーセント。
(実施例3)
(uvrAB突然変異体−対−野生型Escherichia coliのソラレン処理による増殖の減弱の比較)
核酸損傷を修復する能力に欠損がある突然変異体Escherichia coli(E.coli)株のソラレン処理を野生型株と比較した。E.coli株AB1157(野生型)およびCSR603(Aziz Sancar博士,University of North carolinaから得られたuvrA、recA、phr突然変異体、Harm,Mutation Research 60:263−270(1979)参照)。この実施例は、250rpmのオービタルシェーカーにて37℃で一晩、ストレプトマイシンを含む3mLのLB培地で増殖させたAB1157−対−突然変異体CSR603の減弱を比較する。この2mLアリコットを30℃の100mLのLB培地に添加し、600nmにおける吸光度が0.9OD、ほぼ1×109CFU/mLとなるまでほぼ5時間シェーカー上に置いた。各株では、ほぼ0.5mLの細菌ストックを15mL試験管に加え、2300×gにおいて4℃にて20分間遠心した。上清を除去し、各ペレットを、0、1、10、100および1000nMのソラレンS−59を含有する5mLのPBSに懸濁させた。各サンプルを6ウェル培養プレートに移し、実施例1におけるように照射した。実施例1におけるように、サンプルを系列希釈し、力価を測定した。結果を表4および図3に示す。結果は、uvrABC突然変異体のソラレン処理が、与えられたソラレン濃度では細菌の増殖のより大きな減弱がもたらされる(より低い力価が残存)ことを示す。
(uvrAB突然変異体−対−野生型Escherichia coliのソラレン処理による増殖の減弱の比較)
核酸損傷を修復する能力に欠損がある突然変異体Escherichia coli(E.coli)株のソラレン処理を野生型株と比較した。E.coli株AB1157(野生型)およびCSR603(Aziz Sancar博士,University of North carolinaから得られたuvrA、recA、phr突然変異体、Harm,Mutation Research 60:263−270(1979)参照)。この実施例は、250rpmのオービタルシェーカーにて37℃で一晩、ストレプトマイシンを含む3mLのLB培地で増殖させたAB1157−対−突然変異体CSR603の減弱を比較する。この2mLアリコットを30℃の100mLのLB培地に添加し、600nmにおける吸光度が0.9OD、ほぼ1×109CFU/mLとなるまでほぼ5時間シェーカー上に置いた。各株では、ほぼ0.5mLの細菌ストックを15mL試験管に加え、2300×gにおいて4℃にて20分間遠心した。上清を除去し、各ペレットを、0、1、10、100および1000nMのソラレンS−59を含有する5mLのPBSに懸濁させた。各サンプルを6ウェル培養プレートに移し、実施例1におけるように照射した。実施例1におけるように、サンプルを系列希釈し、力価を測定した。結果を表4および図3に示す。結果は、uvrABC突然変異体のソラレン処理が、与えられたソラレン濃度では細菌の増殖のより大きな減弱がもたらされる(より低い力価が残存)ことを示す。
(表4 ソラレン処理でのE coli野生型−対−uvr−ABC突然変異体の減弱)
(実施例4)
(S−59処理の有りおよび無しでの、Listeria株を用いるマウスの治療的ワクチン接種)
ワクチンとしてのS−59処理Listeriaの有用性を評価するために、C57B1/6マウスメラノーマ腫瘍モデルを用いた。C57B1/6マウス(Charles River,Hollister,CA)の毛を剃り、100μLのHBSS中の2×105B16.F10.Mo520.10細胞(Kenneth Rock博士、University of Massuchesettsから得られたB16−OVA発現メラノーマ細胞、Mandlら、Proc Natl Acad Sci USA 95:8216(1998)参照)で皮下移植した。OVA抗原を含有するListeria monocytogenes株DP−L4056およびDP−L4017をS−59処理(実施例1のような量の20nM S−59UVA)の有りまたは無しにて調製した。加えて、OVA抗原無しの野生型DP−L4056をコントロールとして用いた。S−59処理サンプルのlog力価を測定して、ソラレン処理によるlog減弱を評価した(表6)。ListeriaをHBSS(ハンクスの平衡塩培地、Gibco)に懸濁させ、10ないし12匹のマウスの群を、各株の100μL腹腔内注射で3回ワクチン接種し、ならびにある群をHBSSビヒクルで注射した。種々の株に対するワクチン接種量(ワクチン接種当たりの合計CFU)を表6に示す。量は非S−59処理Listeriaに対する0.1 LD50、およびS−59処理Listeriaに対する最大可能量に対応した。ワクチン接種は腫瘍移植から3、10および17日に行った。マウスを触知可能腫瘍につき観察した。一旦観察されれば、腫瘍の対向直径を一週間に2回測定した。もし腫瘍がいずれかの方向で20mmに測定されれば、マウスを犠牲にした。B16−OVA移植後の日数の関数としての平均腫瘍容量を図4および表5に示す。群当たりのマウスのパーセント生存を図5にプロットし、メジアン生存を表6に掲げる。本実施例は、高い量のS−59処理Listeria株がマウスに安全に投与することができ、良好な抗腫瘍応答をもたらすことを示す。
(S−59処理の有りおよび無しでの、Listeria株を用いるマウスの治療的ワクチン接種)
ワクチンとしてのS−59処理Listeriaの有用性を評価するために、C57B1/6マウスメラノーマ腫瘍モデルを用いた。C57B1/6マウス(Charles River,Hollister,CA)の毛を剃り、100μLのHBSS中の2×105B16.F10.Mo520.10細胞(Kenneth Rock博士、University of Massuchesettsから得られたB16−OVA発現メラノーマ細胞、Mandlら、Proc Natl Acad Sci USA 95:8216(1998)参照)で皮下移植した。OVA抗原を含有するListeria monocytogenes株DP−L4056およびDP−L4017をS−59処理(実施例1のような量の20nM S−59UVA)の有りまたは無しにて調製した。加えて、OVA抗原無しの野生型DP−L4056をコントロールとして用いた。S−59処理サンプルのlog力価を測定して、ソラレン処理によるlog減弱を評価した(表6)。ListeriaをHBSS(ハンクスの平衡塩培地、Gibco)に懸濁させ、10ないし12匹のマウスの群を、各株の100μL腹腔内注射で3回ワクチン接種し、ならびにある群をHBSSビヒクルで注射した。種々の株に対するワクチン接種量(ワクチン接種当たりの合計CFU)を表6に示す。量は非S−59処理Listeriaに対する0.1 LD50、およびS−59処理Listeriaに対する最大可能量に対応した。ワクチン接種は腫瘍移植から3、10および17日に行った。マウスを触知可能腫瘍につき観察した。一旦観察されれば、腫瘍の対向直径を一週間に2回測定した。もし腫瘍がいずれかの方向で20mmに測定されれば、マウスを犠牲にした。B16−OVA移植後の日数の関数としての平均腫瘍容量を図4および表5に示す。群当たりのマウスのパーセント生存を図5にプロットし、メジアン生存を表6に掲げる。本実施例は、高い量のS−59処理Listeria株がマウスに安全に投与することができ、良好な抗腫瘍応答をもたらすことを示す。
(表5 B16−OVAを移植し、かつ同定されたListeria株をワクチン接種したマウスについての移植後日数における腫瘍容量)
(表6 20nM S−59処理(2J/cm2UVA)の有りおよび無しでの、Listeria株についてのワクチン接種量およびメジアン生存)
(実施例5)
(ワクチン接種後における抗原特異的免疫応答の評価)
種々のインビトロおよびインビボ方法を用い、本発明のワクチンを評価することができる。これらの方法をListeriaベースのワクチンを用いて例示するが、これを用いて、本発明のいずれかの微生物ベースのワクチンの優れた効率を見積もることができる。
(ワクチン接種後における抗原特異的免疫応答の評価)
種々のインビトロおよびインビボ方法を用い、本発明のワクチンを評価することができる。これらの方法をListeriaベースのワクチンを用いて例示するが、これを用いて、本発明のいずれかの微生物ベースのワクチンの優れた効率を見積もることができる。
いくつかのアッセイは、ワクチン接種されたマウスの脾臓からの抗原特異的T細胞の分析を含む。C57B1/6マウスを、例えば、Listeria−OVA株でワクチン接種し(例えば、0.1LD50の腹腔内注射)、ここで、Listeriaを処理して増殖を減弱化させることができる(例えば、S−59処理)。ワクチン接種から7日後に、脾臓を氷冷RPMI1640培地に入れ、これから単一細胞懸濁液を調製することによって、マウスの脾臓細胞を収集した(典型的には、群当たり3匹のマウス)。別法として、マウスのリンパ節を同様に収集し、単一細胞懸濁液として調製し、後に記載するアッセイにおいて脾臓細胞を置き換えた。典型的には、脾臓細胞をワクチンの静脈内または腹腔内投与につき評価し、他方、脾臓細胞およびリンパ節からの細胞をワクチンの筋肉内、皮下または皮内投与につき評価する。
特に断りのない限り、本実施例で用いた全ての抗体はPharmingen,San Diego,CAから得ることができる。
(ELISPOTアッセイ)
OVA抗原を有するListeria株を、ELISPOTアッセイを用い、マウスモデルにおいて免疫化に際して生じた抗原特異的T細胞の定量的頻度につき評価する。評価した抗原特異的T細胞はOVA特異的CD8+またはLLO特異的CD8+またはCD4+T細胞である。このOVA抗原モデルはワクチンに挿入された異種腫瘍抗原に対する免疫応答を評価し、注目するいずれかの抗原で置き換えることができよう。LLO抗原はListeriaに対して特異的であり、ワクチンビヒクルとして用いられるいずれかの微生物ベクターのための適当な抗原に代えて置き換えることができよう。特異的T細胞は、特異的抗原の認識に際してサイトカイン放出(例えば、IFN−γ)の検出によって評価される。PVDFベースの96ウェルプレート(BD Biosciences,San
Jose,CA)を抗−ネズミIFN−γモノクローナル抗体(mAb R4;5μg/mL)で4℃にて一晩被覆する。プレートを洗浄し、200μLの完全なRPMIで室温にて2時間ブロックする。ワクチン接種したマウス(または非ワクチン接種コントロールマウスからの脾臓細胞をウェル当たり2×105細胞にて添加し、約0.01ないし10μMの範囲の種々の濃度のペプチドの存在下にて37℃にて20ないし22時間インキュベートする。用いたペプチドはSL8、OVA、LLO190(NEKYAQAYPNVS、配列番号:2、Invitrogen)についてのMHCクラスIエピトープ、リステリオリシンO(Listeria抗原)、またはLLO296(VAYGRQVYL、配列番号:3)についてのMHCクラスIIエピトープ、リステリオリシンOについてのMHCクラスIエピトープいずれかであった。洗浄の後、プレートを、PBS中に0.5μg/mL中に希釈したIFN−γに対して特異的な二次ビオチニル化抗体(XMG1.2)とともにインキュベートする。室温での2時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、1%BSAを含有するPBS中で希釈した1nm金ヤギ抗−ビオチンコンジュゲート(GAB−1; 1:200希釈;Ted Pella,Redding,CA)とともに37℃にて1時間インキュベートする。徹底的な洗浄の後、プレートを、スポット発生のための基質(Silver Enhancing Kit; 30μL/ウェル; Ted Pella)とともに室温にて2ないし10分間インキュベートする。次いで、プレートを蒸留水で濯いで、基質反応を停止させる。プレートを風乾した後、各ウェル中のスポットを、自動ELISPOTプレートリーダー(CTL、Cleveland、OH)を用いてカウントする。サイトカイン応答は、OVA特異的T細胞またはListeria特異的T細胞いずれかにつき、106脾臓細胞当たりのIFN−γスポット−形成細胞(SFC)の数として表す。
OVA抗原を有するListeria株を、ELISPOTアッセイを用い、マウスモデルにおいて免疫化に際して生じた抗原特異的T細胞の定量的頻度につき評価する。評価した抗原特異的T細胞はOVA特異的CD8+またはLLO特異的CD8+またはCD4+T細胞である。このOVA抗原モデルはワクチンに挿入された異種腫瘍抗原に対する免疫応答を評価し、注目するいずれかの抗原で置き換えることができよう。LLO抗原はListeriaに対して特異的であり、ワクチンビヒクルとして用いられるいずれかの微生物ベクターのための適当な抗原に代えて置き換えることができよう。特異的T細胞は、特異的抗原の認識に際してサイトカイン放出(例えば、IFN−γ)の検出によって評価される。PVDFベースの96ウェルプレート(BD Biosciences,San
Jose,CA)を抗−ネズミIFN−γモノクローナル抗体(mAb R4;5μg/mL)で4℃にて一晩被覆する。プレートを洗浄し、200μLの完全なRPMIで室温にて2時間ブロックする。ワクチン接種したマウス(または非ワクチン接種コントロールマウスからの脾臓細胞をウェル当たり2×105細胞にて添加し、約0.01ないし10μMの範囲の種々の濃度のペプチドの存在下にて37℃にて20ないし22時間インキュベートする。用いたペプチドはSL8、OVA、LLO190(NEKYAQAYPNVS、配列番号:2、Invitrogen)についてのMHCクラスIエピトープ、リステリオリシンO(Listeria抗原)、またはLLO296(VAYGRQVYL、配列番号:3)についてのMHCクラスIIエピトープ、リステリオリシンOについてのMHCクラスIエピトープいずれかであった。洗浄の後、プレートを、PBS中に0.5μg/mL中に希釈したIFN−γに対して特異的な二次ビオチニル化抗体(XMG1.2)とともにインキュベートする。室温での2時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、1%BSAを含有するPBS中で希釈した1nm金ヤギ抗−ビオチンコンジュゲート(GAB−1; 1:200希釈;Ted Pella,Redding,CA)とともに37℃にて1時間インキュベートする。徹底的な洗浄の後、プレートを、スポット発生のための基質(Silver Enhancing Kit; 30μL/ウェル; Ted Pella)とともに室温にて2ないし10分間インキュベートする。次いで、プレートを蒸留水で濯いで、基質反応を停止させる。プレートを風乾した後、各ウェル中のスポットを、自動ELISPOTプレートリーダー(CTL、Cleveland、OH)を用いてカウントする。サイトカイン応答は、OVA特異的T細胞またはListeria特異的T細胞いずれかにつき、106脾臓細胞当たりのIFN−γスポット−形成細胞(SFC)の数として表す。
(細胞内サイトカイン染色アッセイ(ICS))
抗原特異的CD8+またはCD4+T細胞の数をさらに評価し、結果をELISPOTアッセイから得られたのと相関付けるために、ICSを行い、フローサイトメトリー分析によって細胞を評価する。マウスのワクチン接種した、およびコントロール群からの脾臓細胞を、ブレフェルジンA(Pharmingen)の存在下で、SL8(OVA特異的CD8+細胞を刺激)またはLLO190(LLO特異的CD4+細胞を刺激)とともに5時間インキュベートする。ブレフェルジンAは、T細胞の刺激に際して生じたサイトカインの分泌を阻害する。無関係なMHCクラスIペプチドとともにインキュベートした脾臓細胞をコントロールとして用いる。PMA(フォルボール−12−ミリステート−13−アセテート,Sigma)20ng/mLおよびイオノマイシン(Sigma)2μg/mL刺激脾臓細胞を、IFN−γおよびTNF−α細胞内サイトカイン染色についての陽性コントロールとして用いる。細胞質サイトカイン発現の検出では、細胞をFITC−抗−CD4 mAb(RM4−5)およびPerCP−抗−CD8 mAb(53−6.7)で染色し、固定し、Cytofix/CytoPerm溶液(Pharmingen)で浸透性化し、氷上で、PE−コンジュゲーテッド抗−TNF−α mAb(MP6−XT22)およびATC−コンジュゲーテッド抗−IFN−γ mAb(XMG1.2)で30分間染色する。細胞内IFN−γおよび/またはTNF−αを発現する細胞のパーセンテージはフローサイトメトリー(FACScalibur,Becton Dickinson,Mountain View,CA)によって決定し、データは、CELLQuestソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry System)を用いて分析する。種々の抗体上の蛍光ラベルは全てFACScaliburによって区別できるので、適当な細胞は、抗−IFN−γまたは抗−TNF−αのいずれかまたは双方で染色されるCD8+およびCD4+につきゲーティングすることによって同定される。また、このモデルを用いて微生物ワクチンの免疫原性を決定することもでき、ここで、樹状細胞集団、またはマクロファージ集団のようなもう1つの抗原提示細胞は微生物ベクターとともにインキュベートされる。得られた抗原提示細胞はマウスの足に注入され、リンパ節からの細胞集団を前記したようにT細胞につき評価される。
抗原特異的CD8+またはCD4+T細胞の数をさらに評価し、結果をELISPOTアッセイから得られたのと相関付けるために、ICSを行い、フローサイトメトリー分析によって細胞を評価する。マウスのワクチン接種した、およびコントロール群からの脾臓細胞を、ブレフェルジンA(Pharmingen)の存在下で、SL8(OVA特異的CD8+細胞を刺激)またはLLO190(LLO特異的CD4+細胞を刺激)とともに5時間インキュベートする。ブレフェルジンAは、T細胞の刺激に際して生じたサイトカインの分泌を阻害する。無関係なMHCクラスIペプチドとともにインキュベートした脾臓細胞をコントロールとして用いる。PMA(フォルボール−12−ミリステート−13−アセテート,Sigma)20ng/mLおよびイオノマイシン(Sigma)2μg/mL刺激脾臓細胞を、IFN−γおよびTNF−α細胞内サイトカイン染色についての陽性コントロールとして用いる。細胞質サイトカイン発現の検出では、細胞をFITC−抗−CD4 mAb(RM4−5)およびPerCP−抗−CD8 mAb(53−6.7)で染色し、固定し、Cytofix/CytoPerm溶液(Pharmingen)で浸透性化し、氷上で、PE−コンジュゲーテッド抗−TNF−α mAb(MP6−XT22)およびATC−コンジュゲーテッド抗−IFN−γ mAb(XMG1.2)で30分間染色する。細胞内IFN−γおよび/またはTNF−αを発現する細胞のパーセンテージはフローサイトメトリー(FACScalibur,Becton Dickinson,Mountain View,CA)によって決定し、データは、CELLQuestソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry System)を用いて分析する。種々の抗体上の蛍光ラベルは全てFACScaliburによって区別できるので、適当な細胞は、抗−IFN−γまたは抗−TNF−αのいずれかまたは双方で染色されるCD8+およびCD4+につきゲーティングすることによって同定される。また、このモデルを用いて微生物ワクチンの免疫原性を決定することもでき、ここで、樹状細胞集団、またはマクロファージ集団のようなもう1つの抗原提示細胞は微生物ベクターとともにインキュベートされる。得られた抗原提示細胞はマウスの足に注入され、リンパ節からの細胞集団を前記したようにT細胞につき評価される。
(刺激された脾臓細胞のサイトカイン発現)
マウスの脾臓細胞によるサイトカイン分泌のレベルもまた、コントロールおよびワクチン接種C57B1/6マウスにつき評価することができる。脾臓細胞はSL8またはLLO190で24時間刺激する。無関係なペプチドHSV−gB2(Invitrogen,SSIEF ARL、配列番号:4)での刺激をコントロールとして用いる。刺激された細胞の上清を収集し、Tヘルパー−1およびTヘルパー−2サイトカインのレベルを、ELISAアッセイ(eBiosciences,CO)またはCytometric Bead Arrayキット(Pharmingen)を用いて決定する。
マウスの脾臓細胞によるサイトカイン分泌のレベルもまた、コントロールおよびワクチン接種C57B1/6マウスにつき評価することができる。脾臓細胞はSL8またはLLO190で24時間刺激する。無関係なペプチドHSV−gB2(Invitrogen,SSIEF ARL、配列番号:4)での刺激をコントロールとして用いる。刺激された細胞の上清を収集し、Tヘルパー−1およびTヘルパー−2サイトカインのレベルを、ELISAアッセイ(eBiosciences,CO)またはCytometric Bead Arrayキット(Pharmingen)を用いて決定する。
(細胞傷害性T細胞活性の評価)
インビトロにて、またはインビボでC57B1/6マウスにて直接的に、その細胞傷害性活性を評価することによって、OVA特異的CD8+T細胞をさらに評価することができる。CD8+T細胞は、その各標的細胞を抗原特異的に認識し、溶解させる。インビトロ細胞傷害性は、クロム放出アッセイを用いて決定される。ナイーブおよびListeria−OVA(内部)ワクチン接種マウスの脾臓細胞を、照射されたEG7.OVA細胞(OVAを発現するようにトランスフェクトされたEL−4腫瘍細胞系、ATCC、Manassas,VA)で、または100nM SL8いずれかで10:1比率にて刺激して、脾臓細胞集団中のOVA特異的T細胞を拡大させる。培養から7日後に、エフェクター細胞の細胞傷害性活性を、標的細胞としてのEG7.OVAまたはSL8パルスドEL−4細胞(ATCC,Manassas,VA)および陰性コントロールとしてのEL−4細胞単独を用い、標準的な4時間51Cr−放出アッセイで決定する。YAC−1細胞系(ATCC,Manassas,VA)を標的として用いて、NK細胞活性を測定して、T細胞による活性をNK細胞による活性から区別する。特異的細胞傷害性のパーセンテージは100×(実験的放出−自然発生的放出)/(最大放出−自然発生的放出)として計算される。自然発生的放出は、エフェクター細胞無くして標的細胞のインキュベーションによって決定される。最大放出は、0.1%トリトンX−100で細胞を溶解することによって決定される。実験は、もし自然発生的放出が最大放出の>20%であれば分析につき有効であると考えられる。
インビトロにて、またはインビボでC57B1/6マウスにて直接的に、その細胞傷害性活性を評価することによって、OVA特異的CD8+T細胞をさらに評価することができる。CD8+T細胞は、その各標的細胞を抗原特異的に認識し、溶解させる。インビトロ細胞傷害性は、クロム放出アッセイを用いて決定される。ナイーブおよびListeria−OVA(内部)ワクチン接種マウスの脾臓細胞を、照射されたEG7.OVA細胞(OVAを発現するようにトランスフェクトされたEL−4腫瘍細胞系、ATCC、Manassas,VA)で、または100nM SL8いずれかで10:1比率にて刺激して、脾臓細胞集団中のOVA特異的T細胞を拡大させる。培養から7日後に、エフェクター細胞の細胞傷害性活性を、標的細胞としてのEG7.OVAまたはSL8パルスドEL−4細胞(ATCC,Manassas,VA)および陰性コントロールとしてのEL−4細胞単独を用い、標準的な4時間51Cr−放出アッセイで決定する。YAC−1細胞系(ATCC,Manassas,VA)を標的として用いて、NK細胞活性を測定して、T細胞による活性をNK細胞による活性から区別する。特異的細胞傷害性のパーセンテージは100×(実験的放出−自然発生的放出)/(最大放出−自然発生的放出)として計算される。自然発生的放出は、エフェクター細胞無くして標的細胞のインキュベーションによって決定される。最大放出は、0.1%トリトンX−100で細胞を溶解することによって決定される。実験は、もし自然発生的放出が最大放出の>20%であれば分析につき有効であると考えられる。
インビボでのOVA−特異的CD8+T細胞の細胞傷害性活性の評価では、ナイーブなC57B1/6マウスからの脾臓細胞を2つの同等なアリコットに分割する。各群を37℃にて90分間、0.5μg/mLにおいて、特異的ペプチド、標的(SL8)またはコントロール(HSV−gB2)いずれかでパルスする。次いで、細胞を培地中で3回、およびPBS+0.1%BSA中で2回洗浄した。カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE、Molecular Probes,Eugene,OR)で標識するために、細胞を温PBS+0.1%BSA(10mL以下)にmL当たり1×107にて再懸濁する。標的細胞懸濁液に、1.25μLのCFSEの5mMストックを加え、渦巻かせることによってサンプルを混合する。コントロール細胞懸濁液に、CFSEストックの10倍希釈物を加え、渦巻かせることによってサンプルを混合する。細胞を37℃にて10分間インキュベートする。大容量(>40mL)の氷冷PBSの添加によって染色を停止する。細胞を室温にてPBSで2回洗浄し、次いで、再懸濁し、カウントする。各細胞懸濁液をmL当たり50×106まで希釈し、100μLの各集団を混合し、ナイーブまたはワクチン接種マウスいずれかの尾静脈を介して注射する。12ないし24時間後、脾臓を収集し、フローサイトメトリーによって5×106細胞を分析する。高(標的)および低(コントロール)蛍光ピークを数え、2つの比率を用いて、標的細胞溶解のパーセンテージを確立する。インビボ細胞障害性アッセイは、インビトロ再刺激の必要性なくして抗原特異的T細胞の溶解活性の評価を可能とする。さらに、このアッセイはその天然環境におけるT細胞の機能を評価する。
(実施例6)
(S−59処理の有りおよび無しでの、Listeria DP−L4056でワクチン接種したマウスからの脾臓細胞のELISPOTおよびICS分析)
OVA抗原の有りまたは無しでListeria株DP−L4056をS−59処理の有りまたは無しで調製し、それを用いて、投与が静脈内であったことを除いて実施例4と同様にC57B1/6マウスをワクチン接種した(同様にHBSSコントロール)。ワクチン接種は、表7および8に示した用量にてナイーブなマウスに対して行った。ワクチン接種から12日後に脾臓を収集した。脾臓を、実施例5におけるようにICSおよびESISPOTアッセイによって評価した。加えて、LD50をこれらのListeriaにつき評価した。TNF−αおよびIFN−γ双方につき陽性の細胞のパーセントの項目にて、LLO190特異的CD4+T細胞およびOVA特異的CD8+T細胞双方についてのICSアッセイ結果を表7および図6A、Bに掲げる。2×105脾臓細胞当たりのIFN−γSFCの項目にて、ELISPOTアッセイを表8および図7に掲げる。これらの結果は、OVAを持つS−59処理サンプルは、非S−59処理サンプルの100倍過剰で投与した場合にOVA特異的応答を刺激することを示す。陽性OVA特異的応答はより低い用量では観察されないが、これは、依然として、S−59処理サンプルが4logだけ減弱されるにつれて増大した安全性の余地を提供する。加えて、LD50は未処理サンプルに対してS−59処理につき103倍高く、これは、100倍高いレベルにおける投与でさえ、未処理Listeriaに対して安全性の10倍レベルがあることを示す。
(S−59処理の有りおよび無しでの、Listeria DP−L4056でワクチン接種したマウスからの脾臓細胞のELISPOTおよびICS分析)
OVA抗原の有りまたは無しでListeria株DP−L4056をS−59処理の有りまたは無しで調製し、それを用いて、投与が静脈内であったことを除いて実施例4と同様にC57B1/6マウスをワクチン接種した(同様にHBSSコントロール)。ワクチン接種は、表7および8に示した用量にてナイーブなマウスに対して行った。ワクチン接種から12日後に脾臓を収集した。脾臓を、実施例5におけるようにICSおよびESISPOTアッセイによって評価した。加えて、LD50をこれらのListeriaにつき評価した。TNF−αおよびIFN−γ双方につき陽性の細胞のパーセントの項目にて、LLO190特異的CD4+T細胞およびOVA特異的CD8+T細胞双方についてのICSアッセイ結果を表7および図6A、Bに掲げる。2×105脾臓細胞当たりのIFN−γSFCの項目にて、ELISPOTアッセイを表8および図7に掲げる。これらの結果は、OVAを持つS−59処理サンプルは、非S−59処理サンプルの100倍過剰で投与した場合にOVA特異的応答を刺激することを示す。陽性OVA特異的応答はより低い用量では観察されないが、これは、依然として、S−59処理サンプルが4logだけ減弱されるにつれて増大した安全性の余地を提供する。加えて、LD50は未処理サンプルに対してS−59処理につき103倍高く、これは、100倍高いレベルにおける投与でさえ、未処理Listeriaに対して安全性の10倍レベルがあることを示す。
(表7 S−59処理の有りまたは無しでの、OVAと共にまたはそれなくして、DP−L4056でワクチン接種したマウスに対するTNF−αおよびIFN−γ陽性双方である脾臓細胞のパーセント)
(表8 S−59処理の有りまたは無しにての、OVAと共にまたはそれなくして、DP−L4056でワクチン接種したマウスに対する106脾臓細胞当たりのIFN−γSFC)
(実施例7)
(対立遺伝子交換によるListeriaからのuvrABの欠失についてのpKSV7−dlBsrFI uvrABの構築)
ソラレンおよびUVA光での処理によって誘導されたDNAに対する損傷を修復することができないListeriaの突然変異体株を、Listeriaにおける紫外線抵抗性(uvr)AB遺伝子(UVRAB)を実質的に欠失することによって作り出した。これらの突然変異体はDNA修復突然変異体、あるいはヌクレオチド切出修復(NER)突然変異体として知られている。ListeriaからのuvrABの欠失は対立遺伝子交換によって達成された[Camilliら、Molecular Microbiology 8:143−147(1993)]。uvrABはいずれかのListeria株から欠失することができる例として、表9に示すListeria monocytogenes株からuvrABを欠失させた。
(対立遺伝子交換によるListeriaからのuvrABの欠失についてのpKSV7−dlBsrFI uvrABの構築)
ソラレンおよびUVA光での処理によって誘導されたDNAに対する損傷を修復することができないListeriaの突然変異体株を、Listeriaにおける紫外線抵抗性(uvr)AB遺伝子(UVRAB)を実質的に欠失することによって作り出した。これらの突然変異体はDNA修復突然変異体、あるいはヌクレオチド切出修復(NER)突然変異体として知られている。ListeriaからのuvrABの欠失は対立遺伝子交換によって達成された[Camilliら、Molecular Microbiology 8:143−147(1993)]。uvrABはいずれかのListeria株から欠失することができる例として、表9に示すListeria monocytogenes株からuvrABを欠失させた。
(表9 対立遺伝子交換によるuvrABの欠失で用いる親Listeria monocytogenes株)
uvrAおよびuvrB遺伝子は、Listeria、およびUVおよび他の剤によって与えられたDNA損傷の他の細菌株においてヌクレオチド−切出修復(NER)で必要なABCエクシヌクレアーゼ複合体の3つのタンパク質のうち2つをコードする。uvrAおよびuvrB遺伝子はListeriaゲノム中に同一オペロンを含み、かくして、表9に示すListeria株において一緒に欠失させた。uvrAB遺伝子は、Listeriants、2562547ないし2565461(配列番号:5)からマップされ、およびuvrB遺伝子はListeriants、2565469ないし2567459(配列番号:6)からマップされる[Glaserら,Science 294:849−852‘2001]。対立遺伝子交換によってuvrABを欠失させるために、uvrABの、各々、ほぼ900塩基対(bps)上流および下流である順方向および逆方向プライマーを用い、uvrAB遺伝子をまずPCRによって増幅させた。Listeria uvrABアンプリコンは、PCRプライマーLm−2561677F(配列番号:7)およびLm−2568330R(配列番号:8)および鋳型としてのDP−L4056を用いて作り出し、これは、Listeria nts.2561677−2568330(配列番号:9)を含む6654塩基対長であった。Listeria野生型株DP−L4056をブレイン・ハート・インフュージョン・ブロス・(BHI、Difco)中で30℃にて一晩培養し、(3mlの一晩の培養の遠心、細菌ペレットの5mlのPBS中への再懸濁、再遠心、および続いてのListeriaペレットの1mlのPBS中への最終再懸濁によって調製された)10μLの洗浄された細菌懸濁液を、供給業者の推奨に従い、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液およびMgSO4と共に、各々0.2μMのLm−2561677FおよびLm−2568330Rプライマー、2μLのVent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を含有する100μLの最終用量を有するPCR反応に添加した。成功したPCRは、臭化エチジウムでの染色、およびUV光での照射による可視化に続いて、区別される6654bpバンドの存在によって示されるように、TAE緩衝液中の0.8%アガロースゲル電気泳動によって確認された。アンプリコン生成物は、50μLの最終容量の中のGeneClean(Qbiogene,Carlsbad,CA)を用いてPCR反応から精製された。引き続いて、連結混合物中の5μLの精製されたuvrABアンプリコンを用い、アンプリコンをpCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)に挿入した。制限酵素はNew England Biolabs (Beverly,MA)から購入した。pCR2.1−TOPO−uvrABプラスミドの正しい構築は、BsrFI(New England Biolabs)での消化、引き続いての1%アガロース/TAE電気泳動によって示され、4612、1388、1094、181、886および2424塩基対の断片を生じた。
pCR2.1−TOPO−uvrABプラスミドを引き続いて用いて、対立遺伝子交換用のプラスミドを作成し、そこでは、uvrABのnts2562709ないし2567320(4612bps)が欠失された。組換えプラスミド構築のための全ての制限酵素およびT4 DNAリガーゼはNew England Biolabsから入手した。uvrAB配列の欠失を達成するために、pCR−TOPO/uvrABプラスミドの1つのアリコット(ほぼ2μg)をHindIII、BsrFI、およびBglIIで消化し、1092塩基対断片を1%アガロース/TAEゲル電気泳動およびGeneCleanによって精製した。平行して、第2のアリコット(ほぼ2μg)をXhoI、BsrFI、およびBglII酵素で消化し、1050塩基対断片を1%アガロース/TAEゲル電気泳動およびGeneCleanによって精製した。適合するBsrFI末端を含有する2つの1092bpおよび1050bp断片を一緒に連結し、2142bp連結生成物をGeneCleanを用いて精製した。2142bp連結生成物の1つの部分をPstIで消化し、1486bp断片を1%アガロース/TAEゲル電気泳動およびGeneCleanによって精製した。2142bp連結生成物の第2の部分をKpnIおよびPstIで消化し、622p断片を1%アガロース/TAEゲル電気泳動およびGeneCleanによって精製した。対立遺伝子交換のための親プラスミドベクター、pKSV7[Camilliら、Molecular Microbiology 8:143−147(1993)]をKpnIおよびPstIで消化し、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ(CIAP,New England Biolabs)で処理し、KpnIおよびPstI適合末端を有する622bp断片をpKSV7プラスミドベクターに挿入して、pKSV7−K/P−338に挿入した。引き続いて、PstI適合末端を有する1486bp断片を、PstIで消化し、CIAPで処理したベクター構築体pKSV7−K/P−338に挿入した。正しい向きでの1486bp構築体での挿入は、1253bp、865bp、および6.9kbの断片サイズを生じるKpnIおよびHindIIIでの消化によって決定した。このプラスミド構築体はpKSV7−dlBsrFI uvrABとして知られている。pKSV7組変えプラスミドのListeria dlBsrFI uvrAB部分を配列決定して、Listeria配列の忠実度およびnts.2562709ないし2567320のuvrAB遺伝子における正しい欠失を確認した(uvrコーオーディネートnts.2562547ないし2567459からの欠失)。欠失された領域は配列番号:10であり、残りのアンプリコン配列は配列番号:11である。
Listeria株DP−L4056、DP−L4017、およびDP−L4029のuvrAB遺伝子(表9)は、従前に記載されているようにプラスミドpKSV7−dlBsrFI uvrABを用いる対立遺伝子交換によって欠失した(Camilliら、Molecular Microbiology 8:143−147(1993))。プラスミドpKSV7−dlBsrFI uvrABは、エレクトロポレーションによって、Listeria株DP−L4056、DP−L4017、およびDP−L4029に導入された。まず、37℃にて振盪しつつ、BHI中の単離された細菌コロニーからの10mL一晩培養物を増殖させることによって、エレクトロポレーションに対してコンピテントとした。次いで、各株のlog期培養は、2mLの一晩培養物を250mLフラスコ中の100mL 0.5Mスクロース/BHI(滅菌濾過したもの)中に接種することによって誘導した。培養は、OD600=0.2の細菌密度に達するまで、37℃にて2ないし3時間振盪することによって中期log期まで増殖させた。引き続いて、培養を処理して、スフェロプラストとして知られたペプチドグリカン細胞壁を欠く細菌を作成した。100uLのペニシリンGストック溶液(10mg/mL,滅菌濾過したもの)を中期log期培養に添加し、続いて、37℃にて2時間振盪した。スフェロプラスト培養を100mL遠心瓶中でペレット化し、45mLの氷冷HEPES/スクロースストック溶液(1mM HEPES、pH7.0/0.5Mスクロース、滅菌濾過したもの)で再懸濁し、遠心によって再度ペレット化した。細菌ペレットを20mLのHEPES/スクロースで再懸濁し、40mL遠心管に移し、ペレット化し、10mL HEPES/スクロースに再懸濁した。次いで、100μLの10mg/mLリソソームストックを細菌溶液に加え、徹底的に混合し、振盪することなく培養を37℃にて15分間インキュベートしたが、5分間隔で2回軽く倒立させた。次いで、リソソーム−処理培養を5000rpm(3000×g)において4℃にて10分間遠心し、10mLのHEPES/スクロースに再懸濁させた;各回注意深くかつ徹底的に再懸濁させて、このプロセスを2回反復した。エレクトロコンピテントListeriaを得るための最終工程は、細菌ペレットを500μLのHEPES/スクロースに再懸濁させることであった。
エレクトロポレーションでは、2μgのpKSV7−dlBsrFI uvrABプラスミドDNAを10μLのDP−L4056、DP−L4017、およびDP−L4029エレクトロコンピテントListeriaに加え、溶液を0.1cmのキュベットに加えた。キュベットを、1KV、400オーム、25μFDに設定されたエレクトロポレーションデバイスに入れ、次いで、パルスを与えた。これは、典型的には、約5ミリ秒の時定数をもたらした。細胞を直ちに1mL BHI/スクロース培地に加え、これを30℃まで予め温め、次いで、振盪しつつ30℃にて1時間インキュベートした。インキュベーション時間に続き、細菌をペレット化し、200mlのBHIブロスに再懸濁し、懸濁液を、10μg/mlクロラムフェニコール(BHI/cm10)を含有するBHI−寒天上で平板培養した。次いで、プレートを30℃にて一晩インキュベートし、その後、pKSV7−dlBsrFI uvrABプラスミド形質転換体に対応するコロニーが目に見えた。プアスミドpKSV7は温度−感受性Listeriaレプリコンを含み、次いで、プレートを30℃にてインキュベートして、クロラムフェニコール/抵抗性コロニーを可視化しなければならない。
uvrAB中に4612bp欠失を含むpKSV7−dlBsrFI uvrABプラスミドでのエレクトロポレーションによって形質転換されたListeria株DP−L4056、DP−L4017、およびDP−L4029中での天然uvrAB遺伝子の対立遺伝子交換は、従前に記載されているように、プラスミド取り込み、続いての(天然uvrABを含めた)プラスミド切出および治癒よりなる2工程で達成された[Camilliら、Molecular Microbiology 8:143−147(1993)]。pKSV7−dlBsrFI uvrABプラスミドDNAでエレクトロポレーションしたListeria 株DP−L4056、DP−L4017、およびDP−L4029の各々から得られた2つの単離されたクロラムフェニコール−抵抗性コロニーを選択し、次いで、各々の選択されたコロニーを新鮮なBHI/CM10プレート上で画線培養し、30℃にて一晩インキュベートした。翌日、コロニーを各プレートから選択し、これを用いて、250mLフラスコ中に含有された10mLのBHI/CM10を接種し、次いで、これを振盪しつつ30℃にて一晩インキュベートした。次いで、一晩培養物の各々の10μLを用いて、10mLの新鮮なBHI/CM10 培地(1:1000希釈)を接種し、次いで、培養物が静止期に到達するまで、これを振盪しつつ41℃にて培養した。10μLのサンプリングに続き、プラスミド調製を残りの一晩Listeria培養物で行って、pKSV7−dlBsrFI uvrABプラスミドDNAの存在を確認した。一旦静止期においては、10μLの培養物を用いて、10mLの新鮮なBHI/cm10培地を接種し、これを41℃にて予め加温し、次いで、振盪しつつ41℃にて一晩インキュベートした。次いで、サンプルを各41℃一晩培養物から採取し、これを用いてBHI/cm10プレート上で単離されたコロニーにつき画線培養し、これを41℃にて予め加温した。プラスミドpKSV7は温度−感受性Listeriaレプリコンを含むので、41℃でのインキュベーションは、Listeriaゲノム中の天然uvrAB遺伝子でのpKSV7−DLBsrFI uvrABプラスミドの相同組換えを介する組み込み、および細菌細胞増殖および分裂を介するクロラムフェニコール薬物−抵抗性マーカーの増殖および発現から得られるコロニーにつき選択する。この時点で、Listeria株は、pKSV7−dlBsrFI uvrABプラスミドの相同組換えによる組込から得られる、天然uvrAB遺伝子および4612bp欠失uvrAB遺伝子からなるuvrAB遺伝子につきメロジプロイドである。
切出、およびpKSV7プラスミドでの天然uvrAB遺伝子の治癒のために、前記工程からの41℃にてインキュベートしたBHI/CM10プレートの各々から単一コロニーを選択し、これを用いて、クロラムフェニコールを含まない10mLのBHI培地を接種し、次いで、振盪しつつ30℃にて一晩インキュベートした。次いで、培養を、クロラムフェニコールを含まない10mLの新鮮なBHI培地中に1:1000希釈し、次いで、6時間振盪しつつ30℃にて一晩インキュベートした。この工程を2回反復した。pKSV7プラスミドレプリコンにつき許容性の温度にて薬物−選択圧なくしての数世代のメロジプロイド中間株の継代に際し、組み込まれたpKSV7プラスミドの自然発生切出が起こり、結局は、従前の細菌からプラスミドが治癒される[Camilliら、Molecular Microbiology 8:1 43−147(1993)]。3番目の1:1000希釈および6時間のインキュベーション時間に続き、各培養からのサンプルを採取し、これを用いて、(クロラムフェニコールを含まない)BHIプレート上で単離されたコロニーにつき画線培養し、37℃にて一晩インキュベートした。100の単離されたコロニーを爪楊枝で各BHIプレートから選択し、5mM−長ストリークがBHI/CM10プレート上でまず最初のコロニーで作成され、続いてBHIプレートにて作成された。BHI/CM10およびBHIプレートの各マッチした対が複製であるように、プレートをグリッドを用いてマークした。BHI/CM10およびBHI複製プレートを37℃にて一晩インキュベートした。pKSV7−dlBsrFI uvrABプラスミドDNAでのDP−L4056、DP−L4017、またはDP−L4029のエレクトロポレーションからの2つのクロラムフェニコール−抵抗性コロニーに由来するBHI/CM10およびBHIプレート上で平板培養したコロニーレプリカのほぼ5%は薬物感受性であった(すなわち、BHIプレート上のみで増殖)。これらの薬物−感受性コロニーはuvrABに4612bp欠失を含む候補を表す。薬物−感受性コロニーの各々を、BHI/CM10およびBHIプレート双方上で単離されたコロニーにつき再度画線培養し、37℃にて一晩インキュベートして、候補クローンが純粋かつ薬物感受性であることを確認した。クロラムフェニコール−感受性コロニーを、プライマーLm−2561677FおよびLm−2568330R(ibid)を用いるPCRに付して、uvrAB欠失をやはり含むクローンを同定した。天然uvrAB遺伝子を持つクローンのアンプリコンサイズは6654bpsであり、欠失されたuvrAB遺伝子のアンプリコンサイズは2042bpsであり;クロラムフェニコール−感受性クローンの約50%はやはり欠失されたuvrAB遺伝子を含んだ。DP−L4056、DP−L4017、およびDP−L4029に由来するuvrAB欠失株の2つのクローンを、さらなる特徴付けのために選択した。グリセロールストック(滅菌LB/40%グリセロールで1:1希釈した30℃一晩培養物)を各uvrAB突然変位体株につき作成し、−80℃にて貯蔵した。これらの株は表10に示すように公知である。DP−L4029uvrAB(actA/uvrAB)を2003年10月3日にATCCに寄託し、PTA−5563が割り当てられた。
(表10 対立遺伝子交換によって生じたuvrAB突然変異体Listeria株)uvrAB Mutant Listeria Strain uvrAB突然変異体Listeria株)
S−59ソラレンおよびUVA光での減弱に対する増大した感受性を示すために、正確に実施例1に記載されたように、表10に示されたuvrAB突然変異体Listeria株の1×109CFUの調製物を2、20、100および500nM S−59(L4017/uvrABおよびL4056/uvrABの双方のクローン)または2、10、20および100nM S−59(L4017/uvrABのクローン1およびL4029/uvrABの双方のクローン)いずれかで処理し、6J/cm2(FX1019)の量にてUVA照射し、DHIプレート上での希釈物の平板培養によって生存性につきテストした。この実験の結果を表11AないしB(S−59の量の関数としてのlog減弱)および図8およびAないしB(S−59の量の関数としてのlog残存力価)に示す。結果は、表10に示されたDNA NER修復突然変異体株が、親株と比較して、プロラレンおよびUVA照射での光化学減弱に対して劇的により感受性であることを明らかに示す。このデータは、有意かつ実質的により低いレベルのS−59プロラレンを用いて、その同質遺伝子カウンターパートと比較して、同一程度までuvrAB突然変異体細菌を不活化することができるという明白な証拠を提供する。
(表11A 示されたS−59濃度における照射(6J/cm2UVA)後におけるListeria monocytogenes株のlog減弱)
(表11B 示されたS−59濃度における照射(6J/cm2UVA)後におけるListeria monocytogenes株のlog減弱)
uvrAB突然変異体株は、悪性な疾患または感染症に関連する異種抗原をコードする発現カセットを組み込むために、親株として直接用いることができる。この配置にて、S−59およびUVA光での光化学減弱に続き、細菌はMHCクラスI−制限応答をプログラムするその能力を保持する。なぜならば、そのDNAを複製する能力は架橋によって無くなっているが、その遺伝子相補体を発現する能力は実質的に無傷なままだからである。さらに、uvrAB突然変異体を不活化する有意により少ないDNA架橋の要件の結果として、ワクチン容量を含む細菌ゲノムの集団の意味では、いずれか1つの遺伝子の発現は、その与えられた遺伝子において、発現の実質的中断がもたらされない低いレベルのDNA架橋のため、有意には影響されないであろう。最後に、uvrAB突然変異をいずれかの他の減弱突然変異と組み合わせて、光化学および遺伝子減弱双方を組み合わせる安全かつ効果的なワクチンプラットフォームを駆動することができる。本明細書中に記載した組成物においては、単独またはいずれかの組合せにて、uvrA、uvrB、またはuvrC遺伝子、またはNERに関与するいずれかのListeria遺伝子は、タンパク質の機能的形態が発現されないように突然変異させることができる。これらの組成物は、選択された細菌病原体に由来する安全かつ効果的なワクチンを誘導するためのアプローチとして用いて、ワクチン接種した個体において野生型病原体での攻撃に対して保護することができる。別法として、これらの組成物は、いずれかの選択された感染症または悪性病に関連する異種抗原の発現につき安全かつ効果的な組換えワクチンプラットフォームを誘導するためのアプローチとして用いることができる。
(実施例8)
(対立遺伝子交換による、または部位−特異的組み込みベクターによる選択されたListeria株のゲノムへの抗原発現カセットの挿入)
実施例7に記載された株、いずれかの選択されたListeria株、またはいずれかの細菌株をさらに改変して、悪性病または感染症に関連する異種タンパク質または抗原を発現させることができる。異種タンパク質の発現は、プラスミドが安定に維持されるように、選択された宿主細菌に適合するレプリコンを含むプラスミドを介することができる。別法として、原核生物発現カセットは、実施例7に記載された対立遺伝子交換を含めた種々の方法を用い、あるいは選択されたトランスポゾンまたはバクテリオファージに由来するランダムまたは部位−特異的に組み込まれるベクターにて、宿主細菌のゲノムに安定に組み込むことができる。
(対立遺伝子交換による、または部位−特異的組み込みベクターによる選択されたListeria株のゲノムへの抗原発現カセットの挿入)
実施例7に記載された株、いずれかの選択されたListeria株、またはいずれかの細菌株をさらに改変して、悪性病または感染症に関連する異種タンパク質または抗原を発現させることができる。異種タンパク質の発現は、プラスミドが安定に維持されるように、選択された宿主細菌に適合するレプリコンを含むプラスミドを介することができる。別法として、原核生物発現カセットは、実施例7に記載された対立遺伝子交換を含めた種々の方法を用い、あるいは選択されたトランスポゾンまたはバクテリオファージに由来するランダムまたは部位−特異的に組み込まれるベクターにて、宿主細菌のゲノムに安定に組み込むことができる。
その例として、リステリオファージPSA(ScottAからのファージ)に由来する、pPL2として知られた部位−特異的組込みベクターを利用することによって、実施例7に記載されたuvrABヌクレオチド切出修復(NER)突然変異体株に由来する組換えListeria monocytogenesの誘導をここに記載する[Lauerら、J.Bacteriol.184:4177−4186(2002)]。具体的には、pPL2組込みベクターを作成して、分泌シグナルおよびPEST配列を含む[DecaturおよびPortnoy,Science 290:992−995(2000)]が、ヘモリシン活性を欠く、OVAとイン−フレーム融合した、リステリオリシンO(LLO)タンパク質のアミノ−末端半分を持つ融合パートナーとしてのニワトリオボアルブミン(OVA)モデル抗原を発現させる。切形LLO−OVA融合タンパク質の発現は、LLOを含めたListriaビルレンス遺伝子の発現を駆動するprfA−依存性プロモーターであるhlyプロモーターによって駆動される。このベクターはpPL2/LLOSS−PEST−OVAとして知られる。pPL2ベクターは、tRNA遺伝子の天然配列が成功した組込みに際して保存され、かくして、その天然の発現された機能を無傷に維持するように、ListeriaのtRNAArg遺伝子内に組み込まれる。
pPL2/LLOSS−PEST−OVAの構築における最初の工程は、順方向プライマーKpnI−LLO nts.1257ないし1276(配列番号:12)および逆方向プライマーXhoI−LLO1665R(配列番号:13)のプライマー対を用いるPCRによって、DP−L4056野生型ListeriaゲノムDNAから一緒にhlyプロモーターおよびLLOSS−PEST配列を増幅することである。426bpアンプリコンをGeneCleanで精製し、KpnIおよびXhoIで消化し、KpnIおよびXhoID 消化し、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ(CIAP)での処理によって調製されたpPL2プラスミドに連結し、GeneCleanで精製した。LLOSS−PEST配列を含むコレクトプラスミドは、KpnIおよびXhoIでの消化、および1%アガロース/TAE電気泳動によって確認し、418bpsおよび6112bpsのDNA断片が得られる。この中間プラスミドDNA構築体はpPL2/LLOSS−PESTとして知られている。
順方向プライマーXhoI−NcoI OVA cDNA nts.174ないし186(配列番号:14)および逆方向プライマーXhoI−NotI−HindIII(配列番号:15)のプライマー対を用い、DP−E3616 E.coli[Higginsら、Mol.Molbiol.31:1631−1641(1999)]からのpDP3617プラスミドDNAを含めた、当業者によって用いられるいずれかの数のプラスミドからPCRによってOVA配列を増幅させることができる。
1013bpアンプリコンをGeneCleanで精製し、XhoIおよびNotIで消化し、pPL2/LLOSS−PESTプラスミドに連結し、XhoIおよびNotIでの消化、CIAP−での処理によって調製し、GeneCleanで精製する。LLOSS−PESTおよびOVA配列を含むコレクトプラスミド構築体はKpnI、XhoI、およびNotIでの消化、および1%アガロース/TAE電気泳動によって確認し、994bps、1560bps、および6039bpsのDNA断片を得る。プラスミドpPL2/LLOSS−PEST−OVAのLLOおよびOVA領域の正確な予期された配列は配列決定によって確認される。
正確に、従前に記載された方法に従い[Lauerら、J.Bacteriol.184,4177−4186(2002)]、pPL2/LLOSS−PEST−OVAプラスミドを、実施例7に記載された選択されたListeria uvaAB突然変異体株のゲノム中のtRNAArg遺伝子に組み込む。簡単に述べれば、まず、エレクトロポレーションによって、または化学的手段によって、プラスミドpPL2/LLOSS−PEST−OVAをE.coli宿主株SM10(Simolら、Bio/Technology 1:784−791(1983))に導入する。引き続いて、コンジュゲーションによって、pPL2/LLOSS−PEST−OVAプラスミドを形質転換されたSM10から選択されたListeria株へ移す。記載されたように、ml当たり7.5μgのクロラムフェニコールおよびml当たり200μgのストレプトマイシンを含有する薬物−選択的BHI寒天プレート上でのインキュベーションに続き、選択されたコロニーを、同一組成を持つプレート上で3回継代によって精製する。ファージ付着部位におけるpPL2ベクターの組み込みを確認するために、個々のコロニーを拾い、順方向プライマーNC16(配列番号:16)および逆方向プライマーPL95(配列番号:17)のプライマー対を用い、PCRによってスクリーニングする。選択されたListeria uvurAB突然変異体株のゲノム中のtRNAArg遺伝子に組み込まれたpPL2/LLOSS−PEST−OVAプラスミドを有する選択されたコロニーは、499bpsの診断DNAアンプリコンを生じる。
実施例1に記載されたように、クローン化されたC57B1/6−由来樹状細胞系DC2.4を用い、抗原提示細胞および、引き続いてのMHCクラスI経路を介するOVAのプログラム提示によって取り込まれるべきpPL2/LLOSS−PEST−OVAの安定な組込体を保有する組換えListeria uvrAB突然変異体の能力をテストする。Listeriaの貪食細胞に続くクラスI分子へのDC2.4細胞によるOVAペプチドの提示は、やはり実施例1に記載されているように、B3Z細胞とのインキュベーションの後に測定する。組換えListeria株が機能的であって、ここに含まれる実施例に記載されたようにさらに用いることができることをこれらの手法は証明する。
かくして、本実施例は、uvrAB遺伝子内で欠失を含むDNA修復突然変異体Listeria株へ、選択された感染症および悪性病に関連するいずれかの所望の抗原をコードする原核生物発現カセットを導入するための指示を供する。該組換えListeria株は、実施例1に記載されたソラレンでの処理によって不活化することができ、引き続いて、例えば、感染症および悪性病のための予防および治療ワクチンを含めた種々の適用で用いることができる。
(実施例9)
(ヌクレオチド−切出修復(NER)突然変異体に由来する細菌ワクチン)
本特許に記載された実施例は、感染症および悪性病に関連する抗原をコードする組換え送達プラットホームの光化学処理を介するゲノム不活化を利用するワクチン組成物の効率を説明する。本組成物に従い、ゲノムは不活化され、複製の間に分離することはできないが、転写プロフィールはほとんど無傷のままであり、かくして、ワクチン接種された個体におけるデ・ノボ抗原発現、およびCD8+細胞傷害性T細胞(CTL)を含めた病原体特異的免疫応答の最適な誘導をもたらす。さらに、実施例7に記載されたように、DNAヌクレオチド切出修復(NER)マシーナリーが、作成された遺伝子欠失を含めたいずれかの数の手段によって不活化されているこの組成物におけるワクチンプラットフォームを利用することによって、これらの突然変異体における光化学不活化に対する感度は劇的に増大する。
(ヌクレオチド−切出修復(NER)突然変異体に由来する細菌ワクチン)
本特許に記載された実施例は、感染症および悪性病に関連する抗原をコードする組換え送達プラットホームの光化学処理を介するゲノム不活化を利用するワクチン組成物の効率を説明する。本組成物に従い、ゲノムは不活化され、複製の間に分離することはできないが、転写プロフィールはほとんど無傷のままであり、かくして、ワクチン接種された個体におけるデ・ノボ抗原発現、およびCD8+細胞傷害性T細胞(CTL)を含めた病原体特異的免疫応答の最適な誘導をもたらす。さらに、実施例7に記載されたように、DNAヌクレオチド切出修復(NER)マシーナリーが、作成された遺伝子欠失を含めたいずれかの数の手段によって不活化されているこの組成物におけるワクチンプラットフォームを利用することによって、これらの突然変異体における光化学不活化に対する感度は劇的に増大する。
DNA修復突然変異体を不活化するかなり少数のDNA架橋の要件の結果、ワクチン用量を含む細菌ゲノムの集団の意味で、いずれかの1つの遺伝子の発現は、その与えられた遺伝子において、発現の実施的中断をもたらさない低レベルのDNA架橋のため、有意には影響されないであろう。
かくして、病原体に由来する細菌プラットフォームを利用する遺伝子ベースのワクチンの総じての利用性は、NERに欠損があるベクターと光化学不活化を組み合わせることによって劇的に増加させることができる。不活化されたワクチンは疾患を引き起こすことができないが、それは、ベクター−発現異種抗原に特異的な、T−細胞媒介細胞免疫性を含めた優れた免疫性を誘導するその効果的な能力を依然として保持する。さらに、uvrAB突然変異をいずれかの他の減弱突然変異と組み合わせて、光化学および遺伝子減弱双方を組み合わせる安全かつ効果的なワクチンプラットフォームを誘導することができる。
有意には、これらの組成物は、選択された細菌病原体に由来する安全かつ効果的なワクチンを誘導するためのアプローチとして用いて、ワクチン接種された個体における野生型病原体での挑戦に対して保護することができる。この適用に従い、多くの場合において、病原体の減弱された生きた形態に由来する安全かつ効果的なワクチンを誘導することが可能でない。というのは、ワクチンの受ける個々の固体における反応性および疾患の原因についての可能性は高いままであるからである。選択された細菌病原体に関連するサブユニットまたは不活化ワクチンは安全であろうが、他方、これらのワクチンはしばしば効果的ではない。なぜならば、それらは、該病原体の野生型形態での挑戦に対してワクチン接種された個体を保護することが要求される病原体−特異的免疫応答の幅、深さおよび持続性を効果的には誘導しないからである。かくして、当該分野においては、保護されるワクチン接種された個体において該型の免疫応答を誘導する効果的な能力と安全性とを組み合わせるワクチン組成物に対する明らかな要求が存在することがよく知られている。
それ自体、病原体微生物のヌクレオチド−切出修復(NER)経路における突然変異体は、非−ワクチン接種個体において疾患を引き起こすのに十分な量の該微生物で、免疫化された個体における挑戦に対して保護を誘導する安全かつ効果的なワクチンで用いることができる組成物を提供する。NERは、ABCエクシヌクレアーゼとして知られ、かつ遺伝子uvrA、uvrB、およびuvrCによってコードされる3つのサブユニットで作成されたATP−依存性ヌクレアーゼによって触媒される。3つのuvr遺伝子のうちのいずれかの1つ、または1を超えるものにおける突然変異の結果、ソラレンおよびUVA光を利用する光化学不活化に対して極端に感受性の病原体生物の微生物を含めた細胞がもたらされる。
その例として、Bacillus anthracis(B.anthracis)、Anthraxの病因のuvr遺伝子の突然変異が供される。ヒトで許可されている現在の無細胞anthrexワクチンは、ミョウバン水酸化物に吸着され(U.S.ワクチン)またはミョウバンリン酸塩で沈殿させた(U.K.ワクチン)減弱B.anthracisの滅菌培養上清に基づく。これらのワクチンはむしろ弱く、保護のための少なくとも6回の免疫化、ならびに年次ブースターを必要とすることはよく知られている。
本明細書中に記載された組成物において、単独、あるいはいずれかの組合せにおいて、uvrA、uvrBまたはuvrC遺伝子、またはNERに関与するいずれかのB.anthracis遺伝子は、タンパク質の機能的形態が発現されないように突然変異される。
その例として、uvrA、uvrB、またはuvrC遺伝子、あるいはNERに関与するいずれかのB.anthracis遺伝子における突然変異は、例えば、実施例7に記載されたように、対立遺伝子交換によって行うことができる。B.anthracisのuvr遺伝子は得られた突然変異体株の表現型の標的化欠失および特徴付けを介して同定されていないが、uvr遺伝子は、そのuvr遺伝子が知られている関連生物のゲノムでの相同性サーチを介して同定することができる。例えば、B.anthracisのゲノム、すなわち、主たる染色体および2つのビルレンスプラスミドはBacillus Subtilis (B.Subtilis)、B.anthracisと同一属からの関連細菌と比較することができる。Florida B.anthracis単離体(Readら2002,Science 296,2028−2033)の主な染色体を表すゲノムスカフォールドは、AAAC010000001のGenBank受託番号を有する。B.subtilisはNC 000964のGenBank受託番号を有する。B.subtilis uvrA遺伝子はnts.3609064ないし3611997を含み、B.subtilis uvrB遺伝子はnts.3612005−3613990を含む。 BLASTサーチは、B.anthracis配列に対する配列をコードするB.subtilis uvrAおよびuvrBを用いて行った。この分析は、この生物のuvrAおよびuvrB遺伝子に対応するB.anthracisのゲノムにおいて72%配列同一性の領域を同定した。B.anthracis uvrA遺伝子が226021ないし228783をマップし、B.subtilis uvrA遺伝子に対して72%の配列相同性を保有する(2082/2867同一配列相同性整列)。B.anthracis uvrB遺伝子は228864ないし230771をマップし、B.subtilis uvrB遺伝子に対して72%配列相同性を保有する(1401/1925同一配列相同性整列)。かくして、B.anthracis uvrAB遺伝子はB.anthracisの主な染色体のnts.226021ないし230771を含む。
主な細菌染色体のnts.226021ないし230771を含めたB.anthracis uvrAB遺伝子の欠失は、L.monocytogenesにおけるuvrAB遺伝子の欠失につき実施例7に記載された方法に従って達成することができる。簡単に述べれば、この領域、およびB.anthracisゲノムのほぼ1000bps上流および下流双方をPCRによって増幅し、引き続いて、pKSV7対立遺伝子交換プラスミドベクターにクローン化する。代替法としてBacillus属−特異的またはB.anthracis−特異的温度−感受性(ts)レプリコンは、pKSV7対立遺伝子交換プラスミドベクターに存在するListeria tsレプリコンに代えて置き換えることができる。uvrAB領域内を特異的にマッピングする便宜な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用い、uvrA、uvrBのいずれかの部分、またはuvrAB遺伝子配列の全てを欠失する。最後に、対立遺伝子交換プラスミドをB.anthracisに導入し、実施例7に記載されたようにNER突然変異体を選択する。いずれかの選択されたB.anthracis株は、例えば、以下の株:Ames,Vollum、A1.a/10、A1.b/23、A2/29、A3.a/34、A3.b/57、A4/69、B80、Δsterne、VN41Δ1、Dames、NNR1Δ1、およびDNH1を含めた、NER−欠損ワクチンの誘導用の親株として用いることができる。加えて、他の減弱突然変異を選択されたNER突然変異体B.anthracis株のゲノムに導入して、光化学を遺伝的不活化と組み合せるワクチン組成物を可能とすることができる。そのようなB.anthracisワクチン組成物は、致死因子(LF)、浮腫因子(EF)、および保護抗原(PA)を含めた、anthrax免疫性および保護の公知の関係に対して免疫応答を誘導することができる。加えて、NER突然変異体ワクチン組成物の発現プロフィールが無傷のままでいるという結果として、2つのビルレンスプラスミドpXO1およびpXO2および主な染色体から発現されたものを含めた、anthrax免疫性および保護の他の未知の関係に対する免疫応答も誘導される。
ワクチンの成分としてNER突然変異体を利用する例としてB.anthracisを用い、本明細書中に記載された組成物を、皮下、胃腸および呼吸器系を含めた感染の経路に従い、全ての3つのタイプのanthraxに対する予防または処置免疫化設定いずれかで用いることができる。さらに、安全かつ効果的なワクチンを誘導するためのB.anthracisのNER突然変異体を生じさせるためのアプローチを採用して、NERを利用するいずれかの微生物病原体に対する安全かつ効果的なワクチンを誘導することが認識できる。
(実施例10)
(ヒト癌のインビボ処置のための本発明のワクチンの使用)
ヒト癌の処置または予防の例として、微生物核酸が微生物集団の増殖が減弱されるように改変され、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されない微生物集団を含むワクチンが個体に投与される。微生物は実施例7および8のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットは、例えば、実施例8に記載されたpPL2組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当該分野におけるものに共通したいずれかの方法によって、微生物に取り込まれる。得られた集団は粗製、または好ましくは精製された形態で処方されることができる。それらは、液体懸濁液として調製することができるか、あるいは凍結乾燥し、投与用の適当なキャリアに再懸濁させることができる。加えて、それらは保存剤(例えばチメロサール、フェノキシエタノール)、安定化剤(例えば、ラクトース、グルタミン酸モノナトリウム)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン)、抗生物質(例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン)または他の物質のような添加剤と共に処方することができる。処方は滅菌水、生理食塩水、等張緩衝化生理食塩水(例えば、生理学的pHに緩衝化されたリン酸塩)、または他の適当な希釈剤のような適当な希釈剤に再懸濁または希釈することができる。
(ヒト癌のインビボ処置のための本発明のワクチンの使用)
ヒト癌の処置または予防の例として、微生物核酸が微生物集団の増殖が減弱されるように改変され、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されない微生物集団を含むワクチンが個体に投与される。微生物は実施例7および8のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットは、例えば、実施例8に記載されたpPL2組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当該分野におけるものに共通したいずれかの方法によって、微生物に取り込まれる。得られた集団は粗製、または好ましくは精製された形態で処方されることができる。それらは、液体懸濁液として調製することができるか、あるいは凍結乾燥し、投与用の適当なキャリアに再懸濁させることができる。加えて、それらは保存剤(例えばチメロサール、フェノキシエタノール)、安定化剤(例えば、ラクトース、グルタミン酸モノナトリウム)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン)、抗生物質(例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン)または他の物質のような添加剤と共に処方することができる。処方は滅菌水、生理食塩水、等張緩衝化生理食塩水(例えば、生理学的pHに緩衝化されたリン酸塩)、または他の適当な希釈剤のような適当な希釈剤に再懸濁または希釈することができる。
ワクチンは経口、鼻孔内、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下経路、ならびにいずれかの与えられた悪性病または感染症に関連するいずれかの経路を含めた種々の経路によって投与することができる。有効量のワクチンを処置のために個体に投与することができる。治療的処置では、有効量は、所望の免疫応答をもたらす用量であり、ここで、免疫応答は標的化腫瘍の増殖を遅延させ、腫瘍のサイズを低下させ、あるいは好ましくは完全に腫瘍を排除する。ワクチンの投与は適当な間隔で反復することができ、ワクチン接種した個体における複数の区別される部位に同時に投与することができる。予防的処置では、有効量は、癌を発生する個体の確率が有意に低下するように、保護的免疫応答をもたらす用量である。ワクチン接種方法は単一用量よりなることができるか、あるいは保護的免疫応答が確立されるまで適当な間隔で反復することができる。
個体の治療的処置は、初期処置として癌と診断された個体に対して出発することができ、あるいは他の処置と組み合わせて用いることができる。例えば、腫瘍を外科的に摘出した、あるいは放射線療法で、または化学療法によって処置された個体をワクチンで処置して、個体におけるいずれかの残存する腫瘍を低下または排除することができるか、あるいは癌の再発の危険性を低下させることができる。個体の予防的処置は、環境の条件または遺伝的素因いずれかの他の、ある種の癌を縮小させる増大した危険性を有する個体に対して開始される。
(実施例11)
(S−59ソラレンUVA処置に続く、uvrAB突然変異を持つおよび持たないListeria株DP−L4029の抗原提示)
実施例7のListeria株DP−L4029uvrAB突然変異体クローンを改変して、実施例8の手法を用いてOVA抗原を発現させた。この株およびOVAを発現するように改変されたDP−L4029を、種々の濃度にてソラレンS−59で処理した。Listeria株は37℃にて一晩増殖させ、2mLアリコットを100mLのBHIに希釈し、37℃にてほぼ4時間、0.5のOD600(ほぼ1×109CFU/mL)まで増殖させた。各Listeria株の5mLアリコットを15mL試験管に加え、2300×gにて20分間遠心し、上清を除去し、細菌を5mLのPBSに再懸濁させ、ほぼ1×109CFU/mLが得られた。uvrAB突然変異体株については、3mM S−59ストックを10mL PBSまで33.3μL希釈して、10μM溶液が得られ、これの適当なアリコットを10、20、30、40、50、60、70、80、90および100nMの最終濃度までListeriaに添加し、他方、DP−L4029では、S−59を5mLの最終容量中の100、200、400、800および1000nMの最終濃度まで添加した。これらを6ウェル培養プレートまで移し、0.5J/cm2の用量で照射した(FX1019UVAデバイス)。サンプルを15mL試験管に移し、5mLのPBSを加え、それらを2300×gにて20分間遠心して、未処理ソラレンを洗浄した。上清を除去し、細菌を5mLのPBSに再懸濁させ、新しい6ウェルプレートに移した。これらを5.5J/cm2のUVA量にて照射して、ソラレンモノアダクトを架橋に変換した。また、各Listeria株のサンプルを、72℃にて3時間処理することによって加熱死滅させた。log力価およびOVA抗原提示は実施例1のように評価した。S−59処理サンプルについての結果は表12Aおよび図9Aおよび9Bに見出される(バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、DC2.4細胞当たり1のListeriaにおける抗原提示)。双方の加熱死滅させた株についての結果は、検出限界未満の力価を示し(完全な不活化、加熱死滅させた細菌はB3ZアッセイにおいてOVA抗原を提示しなかった。結果は、uvrAB突然変異体は検出限界まで増殖の減弱でさえ非常に強い抗原提示を示すことを示し、ここで、非uvrAB突然変異体株は(実質的に完全な不活化でのほぼバックグラウンドレベルまでの)増殖の減弱の関数として抗原提示の大きな低下を示す。これは、uvrAB突然変異体がソラレン減弱化Listeriaの意味でMHCクラスI提示を保持し、有効な免疫応答および有意に増大したレベルの安全性を伴ってワクチンを提供するはずであることを示す。
(S−59ソラレンUVA処置に続く、uvrAB突然変異を持つおよび持たないListeria株DP−L4029の抗原提示)
実施例7のListeria株DP−L4029uvrAB突然変異体クローンを改変して、実施例8の手法を用いてOVA抗原を発現させた。この株およびOVAを発現するように改変されたDP−L4029を、種々の濃度にてソラレンS−59で処理した。Listeria株は37℃にて一晩増殖させ、2mLアリコットを100mLのBHIに希釈し、37℃にてほぼ4時間、0.5のOD600(ほぼ1×109CFU/mL)まで増殖させた。各Listeria株の5mLアリコットを15mL試験管に加え、2300×gにて20分間遠心し、上清を除去し、細菌を5mLのPBSに再懸濁させ、ほぼ1×109CFU/mLが得られた。uvrAB突然変異体株については、3mM S−59ストックを10mL PBSまで33.3μL希釈して、10μM溶液が得られ、これの適当なアリコットを10、20、30、40、50、60、70、80、90および100nMの最終濃度までListeriaに添加し、他方、DP−L4029では、S−59を5mLの最終容量中の100、200、400、800および1000nMの最終濃度まで添加した。これらを6ウェル培養プレートまで移し、0.5J/cm2の用量で照射した(FX1019UVAデバイス)。サンプルを15mL試験管に移し、5mLのPBSを加え、それらを2300×gにて20分間遠心して、未処理ソラレンを洗浄した。上清を除去し、細菌を5mLのPBSに再懸濁させ、新しい6ウェルプレートに移した。これらを5.5J/cm2のUVA量にて照射して、ソラレンモノアダクトを架橋に変換した。また、各Listeria株のサンプルを、72℃にて3時間処理することによって加熱死滅させた。log力価およびOVA抗原提示は実施例1のように評価した。S−59処理サンプルについての結果は表12Aおよび図9Aおよび9Bに見出される(バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、DC2.4細胞当たり1のListeriaにおける抗原提示)。双方の加熱死滅させた株についての結果は、検出限界未満の力価を示し(完全な不活化、加熱死滅させた細菌はB3ZアッセイにおいてOVA抗原を提示しなかった。結果は、uvrAB突然変異体は検出限界まで増殖の減弱でさえ非常に強い抗原提示を示すことを示し、ここで、非uvrAB突然変異体株は(実質的に完全な不活化でのほぼバックグラウンドレベルまでの)増殖の減弱の関数として抗原提示の大きな低下を示す。これは、uvrAB突然変異体がソラレン減弱化Listeriaの意味でMHCクラスI提示を保持し、有効な免疫応答および有意に増大したレベルの安全性を伴ってワクチンを提供するはずであることを示す。
(表12A 種々の濃度のソラレンS−59で処理したListeria株UVAのlog減弱およびOVA抗原提示)
*DC2.4細胞当たり1のListeriaにおいて測定された未処理のパーセント
もう1つの実験は同一の株を用いて行った。この実験では、Listeriaを37℃にて一晩BHI中で増殖させた。これらをBHIに1:50希釈し、37℃にて300rpmで0.5のOD600まで増殖させ、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を表12Bに示したレベルまで加えた。これらのサンプルは37℃にて300rpmにおいてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLアリコットを除去して、力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2の量にて照射した(FX1019)。力価後照射を各サンプルにつき決定し、OVA抗原提示を前記したように評価した。結果は表12Bおよび図9Cおよび9Dに見出される(バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、DC2.4細胞当たり10のListeriaにおける抗原提示)。結果は、親株については、抗原提示がバックグラウンドレベルにあり、そこでは、実質的に完全な不活化があり、他方、uvrAB突然変異体では、ほぼ10倍範囲のS−59濃度があり、それを超えて、適切な抗原提示と共に実質的な完全な不活化があることを示す。
もう1つの実験は同一の株を用いて行った。この実験では、Listeriaを37℃にて一晩BHI中で増殖させた。これらをBHIに1:50希釈し、37℃にて300rpmで0.5のOD600まで増殖させ、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を表12Bに示したレベルまで加えた。これらのサンプルは37℃にて300rpmにおいてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLアリコットを除去して、力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2の量にて照射した(FX1019)。力価後照射を各サンプルにつき決定し、OVA抗原提示を前記したように評価した。結果は表12Bおよび図9Cおよび9Dに見出される(バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、DC2.4細胞当たり10のListeriaにおける抗原提示)。結果は、親株については、抗原提示がバックグラウンドレベルにあり、そこでは、実質的に完全な不活化があり、他方、uvrAB突然変異体では、ほぼ10倍範囲のS−59濃度があり、それを超えて、適切な抗原提示と共に実質的な完全な不活化があることを示す。
(表12B 細菌の増殖の間に種々の濃度の存在するフソラレンS−59で処理したListeria株UVAのlog減弱およびOVA抗原提示)
*DC2.4細胞当たり10のListeriaで測定した未処理のパーセント
(実施例12)
(DP−L4029 uvrABと比較したS−59/UVA処理Listeria monocytogenes DP−L4029におけるタンパク質合成)
Listeria monocytogenes DP−L4029およびDP−L4029uvrABを37℃にて一晩BHI中で増殖させた。これらをBHIへ1:50希釈し、37℃にて300rpmにおいて0.5のOD600まで増殖させ、その時点において、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を4029については2500nMのレベルまで、4029uvrAB突然変異体株については200nMのレベルまで加えた。これらのサンプルを37℃にて300rpmにおいてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0)。1mLアリコットを除去して、力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2の量にて照射した(FX1019)。力価後照射を各サンプルについて測定して、不活化のレベルを評価し、その結果、実質的に完全な不活化が得られた。この処置は、双方の株についての検出の限界まで不活化を提供するほぼ最低のS−59量であることが決定された。各株については、OD600−対−力価CFU/mL増殖曲線に基づいて、1×1010細菌を15mL遠心管に移した。サンプルを2300×gにおいて4℃にて20分間遠心し、上清を除去し、ペレットを50mLのPBSで洗浄した。これを合計3回の洗浄のために反復した。最終ペレットをメチオニンまたはシステイン(Gibco)を含まない2mLのDMEMに懸濁させ、30分間振盪しつつ5%CO2インキュベーター中にて37℃でインキュベートした。サンプルを1600rpmにて2分間、2mL遠心管中で遠心し、上清を除去し、メチオニンまたはシステインを含まない2mLのDMEMを加えた。35Sメチオニン−システインの80μCiアリコットを加え(Perkin Elmer Life Sciences)、サンプルを30分間振盪しつつ、5%CO2インキュベーター中で37℃にてインキュベートした。サンプルを前記したように遠心し、上清を除去した。各上清の50μLアリコットをSDS−PAGEゲル(Invitrogen、NuPage4ないし12%ビス−トリスゲル)上へと隣接するレーンに負荷し、100ボルトにてほぼ1.5時間泳動させた。ゲルを10%酢酸および30%エタノールで固定し、次いで、エンハンサー(Enlightning、NEN Life Sciences)に15分間浸漬させた。ゲルを80℃にて3時間乾燥し、X−線フィルムへの暴露によって可視化した。2つの実験についての結果を図10に示し、これは、uvrAB突然変異体株におけるかなりのタンパク質合成を示し、他方、親株は限定されたタンパク質合成を示すことを示す。
(実施例12)
(DP−L4029 uvrABと比較したS−59/UVA処理Listeria monocytogenes DP−L4029におけるタンパク質合成)
Listeria monocytogenes DP−L4029およびDP−L4029uvrABを37℃にて一晩BHI中で増殖させた。これらをBHIへ1:50希釈し、37℃にて300rpmにおいて0.5のOD600まで増殖させ、その時点において、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を4029については2500nMのレベルまで、4029uvrAB突然変異体株については200nMのレベルまで加えた。これらのサンプルを37℃にて300rpmにおいてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0)。1mLアリコットを除去して、力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2の量にて照射した(FX1019)。力価後照射を各サンプルについて測定して、不活化のレベルを評価し、その結果、実質的に完全な不活化が得られた。この処置は、双方の株についての検出の限界まで不活化を提供するほぼ最低のS−59量であることが決定された。各株については、OD600−対−力価CFU/mL増殖曲線に基づいて、1×1010細菌を15mL遠心管に移した。サンプルを2300×gにおいて4℃にて20分間遠心し、上清を除去し、ペレットを50mLのPBSで洗浄した。これを合計3回の洗浄のために反復した。最終ペレットをメチオニンまたはシステイン(Gibco)を含まない2mLのDMEMに懸濁させ、30分間振盪しつつ5%CO2インキュベーター中にて37℃でインキュベートした。サンプルを1600rpmにて2分間、2mL遠心管中で遠心し、上清を除去し、メチオニンまたはシステインを含まない2mLのDMEMを加えた。35Sメチオニン−システインの80μCiアリコットを加え(Perkin Elmer Life Sciences)、サンプルを30分間振盪しつつ、5%CO2インキュベーター中で37℃にてインキュベートした。サンプルを前記したように遠心し、上清を除去した。各上清の50μLアリコットをSDS−PAGEゲル(Invitrogen、NuPage4ないし12%ビス−トリスゲル)上へと隣接するレーンに負荷し、100ボルトにてほぼ1.5時間泳動させた。ゲルを10%酢酸および30%エタノールで固定し、次いで、エンハンサー(Enlightning、NEN Life Sciences)に15分間浸漬させた。ゲルを80℃にて3時間乾燥し、X−線フィルムへの暴露によって可視化した。2つの実験についての結果を図10に示し、これは、uvrAB突然変異体株におけるかなりのタンパク質合成を示し、他方、親株は限定されたタンパク質合成を示すことを示す。
(実施例13)
(Listeriaの増殖の間における存在するS−59の有りまたは無しにてのS−59/UVA不活化の比較)
2つの不活化方法を、Listeria monocytogenes株の不活化に関して比較した。第一の方法においては、Listeriaを300rpmにおいて37℃にて一晩BHI中で増殖し、次いで、BHIへ1:50希釈し、37℃にて300rpmにおいて0.7ないし1.00のOD600まで増殖させた。これらを遠心し、1%BSAを含むBS中へ1×109/mLのレベルまで懸濁させた。S−59を親株については120nMのレベルまで、およびuvrAB突然変異体株については30nMのレベルまで加えた。サンプルを氷上でほぼ60分間インキュベートし、次いで、150mmペトリ皿に移し、6J/cm2の量にて照射した(FX1019)。第2の方法においては、Listeriaを同様に0.5のOD600まで増殖させ、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を親株については2500nMのレベルまで、およびuvrAB突然変異体株については200nMのレベルまで加えた。これらのサンプルを37℃にて300rpmにおいてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLアリコットを取り出して、力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、第一の方法のように照射した。力価後照射を各サンプルにつき決定し、その結果、全てのサンプルについて増殖の実質的に完全な阻害がもたらされた(>8log不活化)。DP−L4029−対−DP−L4029uvrAB、第二の方法によって処理されたほぼ1×1011細菌を含む全サンプルでなされた実験においては、全サンプルを平板培養し、これは、親株についてはほぼ9log死滅、およびuvrAB突然変異体については>10log死滅を示す。Listeriaの4つの異なる調製物についての結果を表13に掲げる。
(Listeriaの増殖の間における存在するS−59の有りまたは無しにてのS−59/UVA不活化の比較)
2つの不活化方法を、Listeria monocytogenes株の不活化に関して比較した。第一の方法においては、Listeriaを300rpmにおいて37℃にて一晩BHI中で増殖し、次いで、BHIへ1:50希釈し、37℃にて300rpmにおいて0.7ないし1.00のOD600まで増殖させた。これらを遠心し、1%BSAを含むBS中へ1×109/mLのレベルまで懸濁させた。S−59を親株については120nMのレベルまで、およびuvrAB突然変異体株については30nMのレベルまで加えた。サンプルを氷上でほぼ60分間インキュベートし、次いで、150mmペトリ皿に移し、6J/cm2の量にて照射した(FX1019)。第2の方法においては、Listeriaを同様に0.5のOD600まで増殖させ、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を親株については2500nMのレベルまで、およびuvrAB突然変異体株については200nMのレベルまで加えた。これらのサンプルを37℃にて300rpmにおいてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLアリコットを取り出して、力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、第一の方法のように照射した。力価後照射を各サンプルにつき決定し、その結果、全てのサンプルについて増殖の実質的に完全な阻害がもたらされた(>8log不活化)。DP−L4029−対−DP−L4029uvrAB、第二の方法によって処理されたほぼ1×1011細菌を含む全サンプルでなされた実験においては、全サンプルを平板培養し、これは、親株についてはほぼ9log死滅、およびuvrAB突然変異体については>10log死滅を示す。Listeriaの4つの異なる調製物についての結果を表13に掲げる。
(表13 S−59/UVAでのListeria monocytogenes actA−およびactA−uvrAB−の不活化、log力価不活化を評価するための全サンプルの測定)
1つの実験では、Listeria monocytogenes DP−L4029−OVAおよびDP−L4029 uvrAB−OVAを用いて2つの方法を比較した。サンプルを前記したように調製し、2300×gにおいて20分間遠心し、上清を除去し、細菌をPBSで1回洗浄した。遠心およびPBS洗浄液を除去した後、最終ペレットをPBS中の8%DMSOに再懸濁し、次いで、液体窒素またはドライアイスいずれかを用いて低温−バイアル中で凍結させ、−80℃にて貯蔵した。3つのマウス(C57B1/6)の組を200μl中の1×108Listeriaを静脈内注射した(HBSSにほぼ1:40希釈した凍結ストック)。S−59/UVA処理株に加えて、生きたおよび加熱死滅させたDP−L4029uvrAB−OVA、ならびにHBSSコントロールで注射をなした。2つのS−59方法の比較のために、マウスを0日に注射した。第2の方法によって調製されたサンプルでは、さらなる組のマウスに第2日および3日または第2日、3日、4日および5日のいずれかに再度注射した。全てのマウスをワクチン接種から7日後に犠牲にし、分析のために脾臓を摘出した。脾臓細胞を実施例5に記載されたELISPOTアッセイによってOVA特異的免疫応答につき評価し、SL8(OVA特異的)で細胞集団を刺激した。結果を図11Aに示し、これは、親株およびuvrAB突然変異体双方につき、第2の方法によって調製されたListeriaの結果、第一の方法によって調製された株についてよりも優れたOVA特異的免疫応答をもたらす。ELISPOTアッセイを、また、LLOクラスII抗原LLO190、またはクラスI抗原LLO296を用いる刺激によって行った。全ての3つの抗原を比較するELISPOT結果を図11Bに示し、これは、LLO特異的CD4+応答がOVA特異的応答と同様であることを示す。また、脾臓細胞を実施例5に記載されたようにICSによって評価し、SL8、LLO190、またはLLO296いずれかで刺激した。結果を図12AないしCに示し、これは、第2の方法におけるOVAおよびLLO双方についてのより強力な免疫応答を示す。また、データは、親株よりも優れたuvrAB株についての改良された応答を示す。双方の株において、連続日でのさらなるワクチン接種の結果、OVAおよびLLO抗原双方に対する改良された応答がもたらされる(1日−対−3日)
もう1つの実験において、DP−L4029およびDP−L4029 uvrAB株を、マウスにおける野生型挑戦に対して保護的免疫性を供するその能力につき評価する。Balb/cマウスをHBSS、DP−L4056野生型(+/−加熱死滅)、BP−L4027(LLO欠失)、DP−L4029 S−59/UVA処理(前記した第一および第二の方法)、DP−L4029uvrAB S−59/UVA処理(前記した第一および第二の方法)にて、表14に記載された群にてワクチン接種した。ワクチン接種から27日後、群当たり3匹のマウスに2×LD50を挑戦させ、群当たり6匹のマウスに、100×LD50の野生型Listeria monocytogenesを挑戦させた。挑戦から3日後に、2×LD50を挑戦させたマウスを犠牲にし、脾臓および肝臓を摘出し、Listeriaの増殖のために培養した。各マウスからの脾臓または肝臓を、0.5%トリトンX−100(Sigma)を含む滅菌蒸留水中でホモゲナイズした。系列10倍希釈をストレプトマイシン(50μg/mL)を含有するBHI寒天プレート上で平板培養し、37℃において一晩インキュベートした。脾臓または肝臓当たりのコロニー形成単位の数を、野生型挑戦に対する免疫性のサンプルとして測定した。図13A、Bは、S−59/UVA処理サンプルがHBSS(非−ワクチン接種)コントロールと比較した器官当たりCFU中ほぼ3log低下を与えることを示し、サンプルは第二の方法によって調製されたのであり、これは、第一の方法で調製されたCFUのより大きな低下を示す。加えて、処理されたuvrAB突然変異体株は、処理された親株よりもわずかに良好なCFU低下を示す。CFU低下は野生型でのワクチン接種と同程度に良好ではないが、S−59/uva処理株はCFUの低下につきいくらか効果を示し、これは、保護的免疫性と大いに相関する。100×LD50で挑戦された6匹のマウスを10日間生存につきモニターし、野生型Listeriaでワクチン接種したマウスのみが生存した。
もう1つの実験において、DP−L4029およびDP−L4029 uvrAB株を、マウスにおける野生型挑戦に対して保護的免疫性を供するその能力につき評価する。Balb/cマウスをHBSS、DP−L4056野生型(+/−加熱死滅)、BP−L4027(LLO欠失)、DP−L4029 S−59/UVA処理(前記した第一および第二の方法)、DP−L4029uvrAB S−59/UVA処理(前記した第一および第二の方法)にて、表14に記載された群にてワクチン接種した。ワクチン接種から27日後、群当たり3匹のマウスに2×LD50を挑戦させ、群当たり6匹のマウスに、100×LD50の野生型Listeria monocytogenesを挑戦させた。挑戦から3日後に、2×LD50を挑戦させたマウスを犠牲にし、脾臓および肝臓を摘出し、Listeriaの増殖のために培養した。各マウスからの脾臓または肝臓を、0.5%トリトンX−100(Sigma)を含む滅菌蒸留水中でホモゲナイズした。系列10倍希釈をストレプトマイシン(50μg/mL)を含有するBHI寒天プレート上で平板培養し、37℃において一晩インキュベートした。脾臓または肝臓当たりのコロニー形成単位の数を、野生型挑戦に対する免疫性のサンプルとして測定した。図13A、Bは、S−59/UVA処理サンプルがHBSS(非−ワクチン接種)コントロールと比較した器官当たりCFU中ほぼ3log低下を与えることを示し、サンプルは第二の方法によって調製されたのであり、これは、第一の方法で調製されたCFUのより大きな低下を示す。加えて、処理されたuvrAB突然変異体株は、処理された親株よりもわずかに良好なCFU低下を示す。CFU低下は野生型でのワクチン接種と同程度に良好ではないが、S−59/uva処理株はCFUの低下につきいくらか効果を示し、これは、保護的免疫性と大いに相関する。100×LD50で挑戦された6匹のマウスを10日間生存につきモニターし、野生型Listeriaでワクチン接種したマウスのみが生存した。
(表14 2つのS−59/UVA方法を比較する保護的免疫性の評価についてのBalb/cマウスの投与)
さらなる実験は、HBSS、DP−L4056野生型(+/−加熱死滅)、DP−L4027(LLO欠失)、DP−L4406actA(actA/inlB欠失二重突然変異体、2003年10月3日に寄託、ATCC番号PTA−5562)、DP−L4029+S−59/UVA(第二の方法)、DP−L4029uvrAB+/−S−59/UVA処理(第二の方法のみ)または+加熱死滅を用いてBalb/cマウスにおいて行い、ここで、ワクチン接種はS−59および加熱死滅株では毎日、1日、3日または5日間行った。投与は表15にまとめる。最初のワクチン接種から29日後に、各群からの3匹のマウスを20×LD50で調製し、各群からの6匹に100×LD50の野生型Listeria monocytogenesにて挑戦した。これらのマウスを生存につき10日間モニターした。最初のワクチン接種から32日後、各群からの3匹のマウスに2×LD50の野生型で挑戦し、3日後に犠牲にし、脾臓および肝臓を摘出し、Listeriaの増殖につき培養した。加えて、マウス血清の抗−Listeria抗体力価を、ELISAアッセイを行うことによって評価した。炭酸水素ナトリウム緩衝液中の凍結された粉砕Listeriaを平板培養し、系列希釈にてワクチン接種したマウスからの血清と共にインキュベートし、次いで、HRPにコンジュゲートしたヤギ抗−マウス抗体で結合した抗体を検出した。HRP基質を添加し、色変化を定量的に測定することによって抗体のレベルを測定した。これらをナイーブなマウスと比較してListeria特異的抗体を評価し、そこでは、もしナイーブ血清サンプルの測定を1標準偏差上回るとサンプルをListeriaにつき陽性と考えた。脾臓または肝臓当たりのCFUの結果を図14A、Bに示し、抗−Listeria抗体力価を図15に示し、生存の結果を図16に示す。この実験は、3または5ワクチン接種でのS−59処理uvrAB株の良好なCFU低下および保護免疫性を示し、未処理uvrAB株のそれに近づき、野生型株とほとんど同程度に効果的である。
(表15 S−59/uva処理株での保護的免疫性、多重ワクチン接種の評価のためのBalb/cマウスの投与)
(実施例14)
(マウスモデルにおいてS−59/UVA処理株を用いる免疫寛容の破壊の証明)
実施例13の第二の方法に従い、Gp−70−AH1A5およびOVAを発現するDP−L4029およびDP−L4029 uvrAB株をS−59/uva処理した。Gp−70はCT−26腫瘍細胞によって発現されるオートロガスマウス抗原である。AH1A5は、生きた株において発現されると免疫応答を誘導することが示されている天然配列の単一塩基突然変異である(AH1ペプチドはSPSYVYHQF(配列番号:20)、AH1H5ペプチドはSPSYAYHQF(配列番号:21))である。予防免疫化実験では、表16に従い、Balb/cマウスを8匹のマウスの群にて静脈内ワクチン接種した(100μL)(ワクチン接種の最初の組から7日後に、群当たり3匹のマウスを犠牲にし、脾臓を収集した)。最初のワクチン接種から21日後に、群当たり残りの5匹のマウスを1×105CT−26結腸上皮腫瘍細胞(ATCC)で静脈内注射し、生存につきモニターした。
(マウスモデルにおいてS−59/UVA処理株を用いる免疫寛容の破壊の証明)
実施例13の第二の方法に従い、Gp−70−AH1A5およびOVAを発現するDP−L4029およびDP−L4029 uvrAB株をS−59/uva処理した。Gp−70はCT−26腫瘍細胞によって発現されるオートロガスマウス抗原である。AH1A5は、生きた株において発現されると免疫応答を誘導することが示されている天然配列の単一塩基突然変異である(AH1ペプチドはSPSYVYHQF(配列番号:20)、AH1H5ペプチドはSPSYAYHQF(配列番号:21))である。予防免疫化実験では、表16に従い、Balb/cマウスを8匹のマウスの群にて静脈内ワクチン接種した(100μL)(ワクチン接種の最初の組から7日後に、群当たり3匹のマウスを犠牲にし、脾臓を収集した)。最初のワクチン接種から21日後に、群当たり残りの5匹のマウスを1×105CT−26結腸上皮腫瘍細胞(ATCC)で静脈内注射し、生存につきモニターした。
(表16 ワクチン株および処理方法)
収集された脾臓細胞のT細胞集団を、細胞を刺激するためにLLO91、AH1、AH1/A5ペプチドまたはP815およびCT26細胞(150mM S−59および3J/cm2UVAで完全に不活化)を用い、実施例5に従い、ICSによって評価した。P815細胞をCT26全細胞刺激についての陰性コントロールとして供する。というのは、P815はgp70抗原を発現しないからである。結果を図17に示し、これは、処理されたuvrABと突然変異体が、さらなるワクチン接種で改良することができるAH1A5またはAH1特異的応答をもたらすことを示す。また、実施例5に従い、細胞をELISPOTアッセイによって評価した。細胞をAH1A5またはAH1ペプチドいずれかで刺激した。結果を図18A、Bに示し、これはuvrAB突然変異体株でのAH1A5およびAH1双方に対する免疫応答を示す。
(実施例15)
(uvrAB欠失を持つソラレン減弱化Listeria株を用いるマウスの治療的ワクチン接種)
C57B1/6マウスを用い、B16.F10,MO5.10.H3(OVA+、これはOVA発現に対して増大した均一性を有する実施例4で用いた細胞のサブクローンである)メラノーマ腫瘍細胞をマウスに注射して(100μLのHBSS IV中1×106)、肺転移を確立した。Listeria monocytogenes株DP−L4029−OVA、DP−L4027−OVA、DP−L4038−OVA(actA/461T二重突然変異体)、およびDP−L4029uvrAB−OVAを10匹のマウスのワクチン接種群で用いた。DP−L4029uvrAB−OVA株をS−59処理の有り、無しにて用い(実施例13の最初の方法により>8log死滅)、加熱死滅させたDP−L4029−OVAをHBSSのみと共にコントロールで用いた。マウスを、表16で与えられた用量での腫瘍移植から3日後にワクチン接種した(HBSS中100μLIV)。腫瘍移植から30日後に、群当たり5匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残り5匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移の数およびメジアン生存日数を表17に示す。actA−、actA−OVA、およびactA−uvrAB−OVA S−59/UVA処理および加熱死滅についての肺を図19Aに示し、肺転移の数を図19Bにプロットし、生存を図19Cにプロットする。このデータは、S−59/UVA処理uvrAB突然変異体が治療ワクチンとして投与でき、それにより、非−ワクチン接種加熱死滅コントロール、またはOVAなくしてのDP−L4029と比較して有意に低下した肺転移および拡大された生存をもたらすことを示す。
(uvrAB欠失を持つソラレン減弱化Listeria株を用いるマウスの治療的ワクチン接種)
C57B1/6マウスを用い、B16.F10,MO5.10.H3(OVA+、これはOVA発現に対して増大した均一性を有する実施例4で用いた細胞のサブクローンである)メラノーマ腫瘍細胞をマウスに注射して(100μLのHBSS IV中1×106)、肺転移を確立した。Listeria monocytogenes株DP−L4029−OVA、DP−L4027−OVA、DP−L4038−OVA(actA/461T二重突然変異体)、およびDP−L4029uvrAB−OVAを10匹のマウスのワクチン接種群で用いた。DP−L4029uvrAB−OVA株をS−59処理の有り、無しにて用い(実施例13の最初の方法により>8log死滅)、加熱死滅させたDP−L4029−OVAをHBSSのみと共にコントロールで用いた。マウスを、表16で与えられた用量での腫瘍移植から3日後にワクチン接種した(HBSS中100μLIV)。腫瘍移植から30日後に、群当たり5匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残り5匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移の数およびメジアン生存日数を表17に示す。actA−、actA−OVA、およびactA−uvrAB−OVA S−59/UVA処理および加熱死滅についての肺を図19Aに示し、肺転移の数を図19Bにプロットし、生存を図19Cにプロットする。このデータは、S−59/UVA処理uvrAB突然変異体が治療ワクチンとして投与でき、それにより、非−ワクチン接種加熱死滅コントロール、またはOVAなくしてのDP−L4029と比較して有意に低下した肺転移および拡大された生存をもたらすことを示す。
(表17 OVA肺腫瘍モデルにおけるマウスの治療的ワクチン接種)
(実施例16)
(gp70マウス抗原を発現するS−59不活化Listeria株での治療的ワクチン接種)
Balb/cマウスを用い、ヒト抗原(該ヒト抗原は本実験とは無関係である)を発現するように改変された(AH1を発現する)CT26腫瘍細胞をマウスに注射して(HBSS中100μL IVに2×105)、肺転移を確立した。Listeria monocytogenes株DP−L4029、DP−L4029−AH1A5、DP−L4029uvrAB−AH1A5、およびDP−L4406actA−AH1A5 (actA/inlB二重突然変異体)を、13匹のマウスのワクチン接種群で用いた。AH1A5株もまたOVA抗原を発現する。DP−L4029uvrAB−AH1A5株を処理、加熱死滅またはS−59処理なくして用いた(実施例13の第二の方法による)。マウスをワクチン接種し(100μL HBSS IV)、表18に従って腫瘍移植後4日に始めた。腫瘍移植から19日後に、群当たり3匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残りの10匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移についての結果を図20A(肺の絵)および20B(プロットした肺転移の数)に示し、生存を表18および図20C(ΔactAサンプル)および20D(ΔactAΔuvrABサンプル)に示す。AH1A5抗原は、いずれかの免疫化効果がマウスにおいて免疫寛容を破壊するであろうように、マウスに対して内因性である。結果は、S−59処理uvrAB突然変異体株がマウスにおいて寛容を破壊でき、その結果、有意に低下された肺転移および延長された生存をもたらすことを示す。単一ワクチン接種と比較して3日間にわたってワクチンを投与した場合に、治療的効果が改良される(3日間にわたって送達された合計用量は単一日に等しい)。
(gp70マウス抗原を発現するS−59不活化Listeria株での治療的ワクチン接種)
Balb/cマウスを用い、ヒト抗原(該ヒト抗原は本実験とは無関係である)を発現するように改変された(AH1を発現する)CT26腫瘍細胞をマウスに注射して(HBSS中100μL IVに2×105)、肺転移を確立した。Listeria monocytogenes株DP−L4029、DP−L4029−AH1A5、DP−L4029uvrAB−AH1A5、およびDP−L4406actA−AH1A5 (actA/inlB二重突然変異体)を、13匹のマウスのワクチン接種群で用いた。AH1A5株もまたOVA抗原を発現する。DP−L4029uvrAB−AH1A5株を処理、加熱死滅またはS−59処理なくして用いた(実施例13の第二の方法による)。マウスをワクチン接種し(100μL HBSS IV)、表18に従って腫瘍移植後4日に始めた。腫瘍移植から19日後に、群当たり3匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残りの10匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移についての結果を図20A(肺の絵)および20B(プロットした肺転移の数)に示し、生存を表18および図20C(ΔactAサンプル)および20D(ΔactAΔuvrABサンプル)に示す。AH1A5抗原は、いずれかの免疫化効果がマウスにおいて免疫寛容を破壊するであろうように、マウスに対して内因性である。結果は、S−59処理uvrAB突然変異体株がマウスにおいて寛容を破壊でき、その結果、有意に低下された肺転移および延長された生存をもたらすことを示す。単一ワクチン接種と比較して3日間にわたってワクチンを投与した場合に、治療的効果が改良される(3日間にわたって送達された合計用量は単一日に等しい)。
(表18 AH1A5を発現するように改変されたListeriaを用いるマウスの治療的ワクチン接種)
(実施例17)
(蛍光顕微鏡を用いる樹状細胞におけるS−59/uva処理Listeria monocytogenes局所化の評価)
抗原提示細胞内のListeria monocytogenesの接種および分布は、蛍光顕微鏡によって評価した。樹状細胞系DC2.4は、10%FBS(Hyclone)、1×非−必須アミノ酸(Cellgro)、5×104I.U.ペニシリン/5×104μgストレプトマイシン(Irvine Scientific)、2mM L−グルタミン(Irvine Scientific)および1nMピルビン酸ナトリウム(Sigma)を補足した完全なRPMI培地、RPMI−1640(Gibco)中にて、皿当たり5×105細胞にてペトリ皿中でカバーグラス上で培養し、37℃にて一晩インキュベートした(これは他の細胞系、例えば、マクロファージJ774で同様に行うことができた)。Listeria 株(DP−L4056、DP−L4027(LLO−)およびDP−L4056uvrAB)の静止相培養物は、3mLのBHI培地に細菌コロニーを接種し、30℃にて一晩増殖させることによって調製した。
(蛍光顕微鏡を用いる樹状細胞におけるS−59/uva処理Listeria monocytogenes局所化の評価)
抗原提示細胞内のListeria monocytogenesの接種および分布は、蛍光顕微鏡によって評価した。樹状細胞系DC2.4は、10%FBS(Hyclone)、1×非−必須アミノ酸(Cellgro)、5×104I.U.ペニシリン/5×104μgストレプトマイシン(Irvine Scientific)、2mM L−グルタミン(Irvine Scientific)および1nMピルビン酸ナトリウム(Sigma)を補足した完全なRPMI培地、RPMI−1640(Gibco)中にて、皿当たり5×105細胞にてペトリ皿中でカバーグラス上で培養し、37℃にて一晩インキュベートした(これは他の細胞系、例えば、マクロファージJ774で同様に行うことができた)。Listeria 株(DP−L4056、DP−L4027(LLO−)およびDP−L4056uvrAB)の静止相培養物は、3mLのBHI培地に細菌コロニーを接種し、30℃にて一晩増殖させることによって調製した。
Listeriaの一晩培養物を新鮮なBHI培地中に1:20希釈し、30℃における静止相培養物を0.5ないし0.6のOD600まで増殖させた。DP−L4056およびDP−L4056uvrAB株についての一晩培養物のほぼ1mLも72℃にて3ないし4時間加熱死滅させた。実施例13の第二の方法に従って調製された、ソラレン不活化DP−L4056およびDP−L4056uvrAB Listeriaの凍結ストックを解凍し、37℃にて1時間、静止相で回収した。感染に先立ち、全てのListeria調製物のOD600読みが得られ、カバーグラス当たりのDC2.4細胞の数をカウントし、各株についての感染の多重度(MOI,DC2.4細胞当たりの細菌の数)を計算した。新鮮なlog相培養物を用いて、5のMOIにて細胞を感染させ、加熱−死滅させた培養物を20のMOIで用い、S−59/UVA処理株を10のMOIで用いた。
カバーグラスを24ウェル皿に移し、Pen/Strepを欠くRPMIで3回洗浄し、所望のMOIを与えるListeria株の適当な希釈物を、37℃にて30分間、Pen/Strepフリー培地中で細胞と共にインキュベートした。次いで、カバーグラスをPen/Strepフリー培地で3回洗浄し、37℃にてさらに30分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、カバーグラスを洗浄し、37℃にて4時間、50μg/mlゲンタマイシンと共に培地中でインキュベートした。次いで、カバーグラスをPBS中で洗浄し、室温にて15分間に、3.5%ホルムアルデヒド/PBS中に固定した。固定の後、カバーグラスをTBS−Tx緩衝液(25mMトリス−HCl pH8.0、150mM NaCl、0.1%トリトンX−100)で洗浄/浸透化し、室温にて15分間、1%BSA/TBS−Tx中でブロックした。カバーグラスを、室温にて30分間、ウサギ抗−Listeria O抗原 抗−血清(Difco)で染色し、TBS−Tx緩衝液中で洗浄した。次いで、サンプルをフルオレセイン標識抗−ウサギ二次抗体(Vector Laboratories)で染色し、アクチンをローダミン−ファロイジン(Molecular Probes)で染色した。カバーグラスをTBS−Tx中で洗浄し、VectaShield+DAPI−ハードセット(Vector Laboratories)中のスライド上に設置して、細胞核につき染色した。スライドを少なくとも8時間乾燥し、細胞をNikon TE300−U倒立顕微鏡で可視化した。CCD Hamamatsu C4742−95−12NRカメラを用いてイメージを撮影し、Phase 3 Imaging SystemsからのImage−Proソフトウェアを用いて分析した。
3つのイメージを各視野につき撮影した:1つはUV−2E/Cフィルター(CHROMA Technology Corp,DAPI/核を可視化する)を用い、第2のものはHYQ TRITCフィルター(CHRONA Technology Corp,アクチンを可視化)のものであり、第3のものはB−1A(HYQ−FITC)フィルター(CHROMA Technology Corp,Listeriaを可視化)を用いるものであった。次いで、3つのイメージを合体させて、Listeriaについての染色がアクチンについての染色と共局所化するか否かを判断した。ファゴリソソームから逃げることができないListeriaは緑色で出現し、他方、サイトゾルから逃げることができるものはアクチンを核形成できるものであり、従って、アクチン(赤色)およびListeria(緑色)の共局所化のため黄色に出現した。リソソームから逃げることができるListeriaのパーセンテージを定量するために、視野中のListeriaの合計数をカウントし、黄色に出現したListeriaの数を、黄色細菌をカウントすることによって、あるいはローダミンイメージからのアクチンの存在を確認することによって決定した(図21A参照)。ファゴリソソームを逃げるListeriaの数は、カウントしたListeriaの合計数で割り、ファゴリソソーム逃避のパーセンテージを、表19に報告し、図21Bに表すように計算した。結果は、加熱死滅株およびS−59/UVA処理野生型株はLLO−株のように振る舞い、すなわち、ファゴリソソームから逃避することができず、他方、S−59/UVA処理したuvrAB突然変異体はファゴリソソームから逃避する実質的能力を示すことを示す。
(表19 DP−L4056(+/−S−59/UVA、加熱死滅)、DP−L4027、およびDP−L4056uvrAB(+/−S−59/UVA、加熱死滅)についてのファゴリソソームから逃げるListeriaのパーセンテージ)
(実施例18)
(グラム染色を用いるS−59UVA処理Listeria monocytogenes uviAB−株の可視化)
Listeria monocytogenesの野生型およびuvrAB−株を0.5のOD600まで増殖させ、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を野生型株については2500nMのレベルまで添加し、uvrAB−突然変異体株については200nMのレベルまで添加した。これらのサンプルを300rpmにおいて37℃にてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLアリコットを取り出して力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2(FX−1019)のUVA量にて照射し、その結果、双方の株について>8log不活化が得られた。処理した株を実施例13に記載したように貯蔵凍結した。これらを解凍し、mL当たりほぼ1ないし2×109の濃度にて15mLの試験管中のBHI培地に1:10希釈した。これらを37℃にて300rpmでインキュベートし、0、2、4、6、8時間および一晩(ほぼ18時間)にてアリコットを取り出した。該アリコットをスライドグラス上に広げ(ほぼ50μL)、風乾した。火炎を3回通すことによってスミヤを加熱固定し、次いで、Fisher Gram Stainキット(カタログ番号282−407)を用いてグラム染色前に冷却した。スライドを顕微鏡で観察し、写真を撮り、ネガイメージを図22に示す。これは、処理された修復欠損株のユニークな性質を示し、これは、遺伝子発現を示す鎖を示すが、細菌が増殖しないように分裂できない。
(グラム染色を用いるS−59UVA処理Listeria monocytogenes uviAB−株の可視化)
Listeria monocytogenesの野生型およびuvrAB−株を0.5のOD600まで増殖させ、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を野生型株については2500nMのレベルまで添加し、uvrAB−突然変異体株については200nMのレベルまで添加した。これらのサンプルを300rpmにおいて37℃にてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLアリコットを取り出して力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2(FX−1019)のUVA量にて照射し、その結果、双方の株について>8log不活化が得られた。処理した株を実施例13に記載したように貯蔵凍結した。これらを解凍し、mL当たりほぼ1ないし2×109の濃度にて15mLの試験管中のBHI培地に1:10希釈した。これらを37℃にて300rpmでインキュベートし、0、2、4、6、8時間および一晩(ほぼ18時間)にてアリコットを取り出した。該アリコットをスライドグラス上に広げ(ほぼ50μL)、風乾した。火炎を3回通すことによってスミヤを加熱固定し、次いで、Fisher Gram Stainキット(カタログ番号282−407)を用いてグラム染色前に冷却した。スライドを顕微鏡で観察し、写真を撮り、ネガイメージを図22に示す。これは、処理された修復欠損株のユニークな性質を示し、これは、遺伝子発現を示す鎖を示すが、細菌が増殖しないように分裂できない。
(実施例19)
(さらなる突然変異体Listeria株の構築)
突然変異体Listeria株の調製。Listeria株は10403S(Bishopら、J.Immunol.139:2005(1987))に由来した。示された遺伝子のイン−フレーム欠失を持つListeria株はSOE−PCRおよび確立された方法での対立遺伝子交換によって生じさせた(Camilliら,Mol.Microbiol.8:143(1993))。突然変異体株LLO L461T(DP−L4017)は、引用してここに一体化させるGlomskiら、J.Cell.Biol.156:1029(2002)に記載されている。actA−突然変異体(DP−L4029)は、そのプロファージで治癒されている、ここに引用してその全体を援用する、Shobleら、J.of Cell Biology,150:527−537(2000)に記載されているDB−L3078株である(プロファージ治癒は(Lauerら、J.Bacteriol.184:4177(2002);米国特許公開番号2003/0203472)に記載されている)。LLO−突然変異体(DB−L4027)(Lauerら、J.of Bacteriology,184:4177−4186(2002))、およびLLO Δ26(DP−L4042)(Decaturら,Science 290:992(2000))もまた従前に記載されている。actA−uvrAB−株の構築は、L4029/uvrAB(例えば、その出願の実施例7参照)として、2003年2月6日に出願された同時係属米国仮出願60/446,051に記載されている。DP−L4029uvrAB(actA−/uvrAB−)は2003年10月3日にATCCに寄託され、PTA−5563の受託番号が与えられた。
(さらなる突然変異体Listeria株の構築)
突然変異体Listeria株の調製。Listeria株は10403S(Bishopら、J.Immunol.139:2005(1987))に由来した。示された遺伝子のイン−フレーム欠失を持つListeria株はSOE−PCRおよび確立された方法での対立遺伝子交換によって生じさせた(Camilliら,Mol.Microbiol.8:143(1993))。突然変異体株LLO L461T(DP−L4017)は、引用してここに一体化させるGlomskiら、J.Cell.Biol.156:1029(2002)に記載されている。actA−突然変異体(DP−L4029)は、そのプロファージで治癒されている、ここに引用してその全体を援用する、Shobleら、J.of Cell Biology,150:527−537(2000)に記載されているDB−L3078株である(プロファージ治癒は(Lauerら、J.Bacteriol.184:4177(2002);米国特許公開番号2003/0203472)に記載されている)。LLO−突然変異体(DB−L4027)(Lauerら、J.of Bacteriology,184:4177−4186(2002))、およびLLO Δ26(DP−L4042)(Decaturら,Science 290:992(2000))もまた従前に記載されている。actA−uvrAB−株の構築は、L4029/uvrAB(例えば、その出願の実施例7参照)として、2003年2月6日に出願された同時係属米国仮出願60/446,051に記載されている。DP−L4029uvrAB(actA−/uvrAB−)は2003年10月3日にATCCに寄託され、PTA−5563の受託番号が与えられた。
対立遺伝子交換によるListeriaからのinlBの欠失に代えてのpKSV7−dl inlBの構築。Listeria DP−L4029からの(または他の選択された突然変異体株からの、または野生型Listeriaからの)inlBの欠失は、Camilliら、Mol.Microbiol.8:143−147(1993)によって記載されているように、対立遺伝子交換によって行うことができる。重複PCRを用いて、対立遺伝子交換手法で用いる構築体を調製することができる。インターナリンB遺伝子の源は、ここに引用してその全体を援用する、Genbank受託番号AL591975(Listeria monocytogenes株EGD、完全なゲノム、セグメント3/12;inlB遺伝子領域:nts、97008−98963)としてリストされた配列および/またはGenebank受託番号NC 003210(Listeria
monocytogenes株EGD,完全なゲノム、inlB遺伝子領域; nts.457008−458963)としてリストされた配列である。
monocytogenes株EGD,完全なゲノム、inlB遺伝子領域; nts.457008−458963)としてリストされた配列である。
一次PCR反応において、各々、Listeria inlB遺伝子の5’および3‘末端から上流および下流の配列のほぼ1000bpsを、以下の鋳型およびプライマーを用いて増幅する:
鋳型:DP−L4056またはDP−L4029ゲノムDNA
プライマー対1(inlBの5’末端から上流の領域の増幅用):
Lm−9603 1F:
鋳型:DP−L4056またはDP−L4029ゲノムDNA
プライマー対1(inlBの5’末端から上流の領域の増幅用):
Lm−9603 1F:
(配列番号:22)(Tm:72℃)
Lm−(3‘inlB−R+)97020R:
Lm−(3‘inlB−R+)97020R:
(配列番号:23)(Tm:114℃)
(InlBカルボキシ末端の下流の領域に相補的な下線を施した配列)
(アンプリコンサイズ(bps):1007)
プライマー対2(inlBの3‘末端から下流の領域の増幅用):
Lm(5‘inlB−F+)98911F:
(InlBカルボキシ末端の下流の領域に相補的な下線を施した配列)
(アンプリコンサイズ(bps):1007)
プライマー対2(inlBの3‘末端から下流の領域の増幅用):
Lm(5‘inlB−F+)98911F:
(配列番号:24)(Tm:118℃)(下線を施した配列はInlBアミノ末端の上流の領域に相補的である)
Lm−99970R:
Lm−99970R:
(配列番号:25)(Tm:74℃)
(アンプリコンサイズ(bps):1074)
二次PCR反応において、一次PCRアンプリコンは、対1からの逆方向プライマーおよび対2の順方向プライマーの間の相補性を利用し、重複PCRを介して融合させる。この結果、配列:nts.97021−98910=1889bpsをコードするinlBの正確な欠失がもたらされる。以下の鋳型およびプライマーは二次PCR反応で利用した:
鋳型:清浄された一次PCR反応
プライマー対:
Lm−96043F:
(アンプリコンサイズ(bps):1074)
二次PCR反応において、一次PCRアンプリコンは、対1からの逆方向プライマーおよび対2の順方向プライマーの間の相補性を利用し、重複PCRを介して融合させる。この結果、配列:nts.97021−98910=1889bpsをコードするinlBの正確な欠失がもたらされる。以下の鋳型およびプライマーは二次PCR反応で利用した:
鋳型:清浄された一次PCR反応
プライマー対:
Lm−96043F:
(配列番号:26)(Tm:74℃)
Lm−99964R:
Lm−99964R:
(配列番号:27)(Tm:74℃)
(アムプリコンサイズ(bps):2033)
構築プロセスを完成するためのプロトコルは以下の通りである:
一次PCR反応(3温度サイクル)を、Vent DNAポリメラーゼ(NEB)および10μlの洗浄された30℃ Listeria DP−L4056またはDP−L4029一晩培養物を用いて行う。1%アガロースゲルによるListeriaアンプリコンの予測されるサイズ(1007bpsおよび1074bps)。一次PCR反応をゲル精製し、DNAはGeneClean(BIO101)で溶出する。
(アムプリコンサイズ(bps):2033)
構築プロセスを完成するためのプロトコルは以下の通りである:
一次PCR反応(3温度サイクル)を、Vent DNAポリメラーゼ(NEB)および10μlの洗浄された30℃ Listeria DP−L4056またはDP−L4029一晩培養物を用いて行う。1%アガロースゲルによるListeriaアンプリコンの予測されるサイズ(1007bpsおよび1074bps)。一次PCR反応をゲル精製し、DNAはGeneClean(BIO101)で溶出する。
二次PCR反応は、鋳型として各一次反応物のほぼ等量(約5μl)を利用して行う。二次PCR反応からのListeriaアムプリコンの予測されるサイズは1%アガロースゲル(2033bps)によって証明される。Adenosin残基はTaqポリメラーゼにてListeria dl inlBアンプリコンの3‘に加える。
次いで、Listeria dl inlBアンプリコンをpCR2.1−TOPOベクターに挿入する。pCR2.1−TOPO−dl inlBプラスミドDNAをXhoIおよびKpnIで消化し、2123bp断片をゲル精製する。KpnI/XhoI 2123bp断片を、KpnIおよびXhoIでの消化およびCIAPでの処理によって調製されているpKSV7ベクターに挿入する(pKSV7−Dl inlB)。[正しいか?]。次いで、pSKV7−dlinlBにおけるinlB配列の忠実度を確認する。inlB遺伝子はpKSV7−dl inlBプラスミドでの対立遺伝子交換によって所望のListeria株から欠失される。
抗原−発現株の構築。モデル抗原オボアルブミン(OVA)の切形を発現する突然変異体Listeria株、AH1(SPSYVYHQF;配列番号:20)として知られたマウス結腸直腸癌(CT26)からの免疫優性エピトープ、および改変されたエピトープAH1−A5(SPSYAYHQF;配列番号:21; Slanskyら、Immunity,13:529−538(2000))を調製した。pPL2組込みベクター(Lauerら、J.Bacteriol.184:4177(2002);米国特許公開番号2003:0203472)を用いて、Listeriaゲノムの無毒部位に組み込まれた単一コピーを含むOVAおよびAH1−A5/OVA組換えListeria株を誘導した。
OVA−発現Listeria(DP−L4056)の構築。切形OVAと融合され、かつpPL2組込みベクターに含まれたヘモリシン−欠失LLO(pPL2/LLO−OVA)よりなる抗原発現カセットをまず調製する。Listeria−OVA株は、pPL2/LLO−OVAをファージ−治癒L.monocytogenes株DP−L4056に、PSA(ScottAからのファージ)付着部位tRNAArg−attBBにて導入することによって誘導される。
PCRを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いてヘモリシン−欠失LLOを増幅する:
源:DP−L4056ゲノムDNA
プライマー:
順方向(KpnI−LLO nts.1257ないし1276):
源:DP−L4056ゲノムDNA
プライマー:
順方向(KpnI−LLO nts.1257ないし1276):
(配列番号:28)
(Tm: LLO−spec:52℃、総じて:80℃)
逆方向(BamHI−XhoI−LLO nts.2811−2792):
(Tm: LLO−spec:52℃、総じて:80℃)
逆方向(BamHI−XhoI−LLO nts.2811−2792):
(配列番号:29)
(Tm: LLO−spec:52℃、総じて:102℃)
また、PCRを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いて切形OVAを増幅する:
源:DP−E3616 E.ColiからのpDP3616プラスミドDNA(Higginsら、Mol.Molbiol.31:1631−1641(1999))。
(Tm: LLO−spec:52℃、総じて:102℃)
また、PCRを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いて切形OVAを増幅する:
源:DP−E3616 E.ColiからのpDP3616プラスミドDNA(Higginsら、Mol.Molbiol.31:1631−1641(1999))。
プライマー:
順方向(XhoI−NcoI OVA cDNA nts.174−186):
順方向(XhoI−NcoI OVA cDNA nts.174−186):
(配列番号:30)
(Tm:OVA−spec:60℃、総じて:88℃)
逆方向(XhoI−NotI−HindIII):
(Tm:OVA−spec:60℃、総じて:88℃)
逆方向(XhoI−NotI−HindIII):
(配列番号:31)
(Tm:総じて:82℃)
構築プロセスを完了させるための1つのプロトコルは、まず、LLOアンプリコンをKpnIおよびBamHIで切断し、次いで、KpnI/BamHIベクターをpPL2ベクター(pPL−LLO)に挿入することを含む。次いで、OVAアンプリコンをXhoIおよびNcoIで切断し、XhoI/NotIで切断されているpPL2−LLOに挿入する(注:pPL2ベクターはいずれのXhoI部位も含まず;pDP−3616は、OVA逆方向プライマー設計で開発される1つのXhoI部位を含む)。構築体pPL2/LLO−OVAは、制限分析(KpnI−LLO−XhoI−OVA−NotI)および配列決定によって確認される。正確にLauerらによって記載されているように、プラスミドpPL2/LLO−OVAを形質転換によってE.coliに導入し、続いて、コンジュゲーションによってListeria(DP−L4056)にまたはinlB−突然変異体またはinlB−actA−二重突然変異体のようなListeriaのもう1つの所望の株に)導入し、それに組み込む。
(Tm:総じて:82℃)
構築プロセスを完了させるための1つのプロトコルは、まず、LLOアンプリコンをKpnIおよびBamHIで切断し、次いで、KpnI/BamHIベクターをpPL2ベクター(pPL−LLO)に挿入することを含む。次いで、OVAアンプリコンをXhoIおよびNcoIで切断し、XhoI/NotIで切断されているpPL2−LLOに挿入する(注:pPL2ベクターはいずれのXhoI部位も含まず;pDP−3616は、OVA逆方向プライマー設計で開発される1つのXhoI部位を含む)。構築体pPL2/LLO−OVAは、制限分析(KpnI−LLO−XhoI−OVA−NotI)および配列決定によって確認される。正確にLauerらによって記載されているように、プラスミドpPL2/LLO−OVAを形質転換によってE.coliに導入し、続いて、コンジュゲーションによってListeria(DP−L4056)にまたはinlB−突然変異体またはinlB−actA−二重突然変異体のようなListeriaのもう1つの所望の株に)導入し、それに組み込む。
OVAを発現する抗原発現カセットの挿入の記載は、2003年10月15日に出願された「Free−Living Microbe Based Vaccine Compositios」なる発明の名称の米国仮出願第60/511,869号の実施例8に見出すこともできる。
AH1/OVAまたはAHZ−A5/OVAを発現するListeria株の構築。AH1/OVAまたはAH1−A5/OVA抗原配列いずれかを発現するListeriaを調製するために、抗原を担うインサートをまずオリゴヌクレオチドから調製し、次いで、(前記したように調製された)ベクターpPL2−LLO−OVAに連結する。
以下のオリゴヌクレオチドをAH1またはAH1−A5インサートの調製で用いる:
AH1エピトープインサート(ClaI−PstI適合性末端):
頂部ストランドオリゴ(AH1頂部):
AH1エピトープインサート(ClaI−PstI適合性末端):
頂部ストランドオリゴ(AH1頂部):
(配列番号:32)
底部ストランドオリゴ(AH1底部):
底部ストランドオリゴ(AH1底部):
(配列番号:33)
AH1−A5エピトープインサート(ClaI−AVAII適合性末端):
AH1−A5エピトープの配列はSPSYAYHQF(配列番号:21)である。
AH1−A5エピトープインサート(ClaI−AVAII適合性末端):
AH1−A5エピトープの配列はSPSYAYHQF(配列番号:21)である。
(配列番号:34)
頂部:
頂部:
(配列番号:35)
底部:
底部:
(配列番号:36)
与えられたエピトープのためのオリゴヌクレオチド対を等モル比で一緒に混合し、95℃にて5分間加熱する。次いで、オリゴヌクレオチド混合物をゆっくりと冷却する。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチド対を、関連制限酵素での消化によって調製したpPL2−LLO/OVAプラスミドと200対1モル比で連結する。新しい構築体の同一性は、制限分析および/または配列決定によって確認することができる。
与えられたエピトープのためのオリゴヌクレオチド対を等モル比で一緒に混合し、95℃にて5分間加熱する。次いで、オリゴヌクレオチド混合物をゆっくりと冷却する。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチド対を、関連制限酵素での消化によって調製したpPL2−LLO/OVAプラスミドと200対1モル比で連結する。新しい構築体の同一性は、制限分析および/または配列決定によって確認することができる。
正確にLauerらによって記載されているように、次いで、形質転換によってプラスミドをE.coliに導入し、続いてコンジュゲーションによってListeria(DP−L4056)に(またはinlB−突然変異体またはinlB−actA−二重突然変異体のようなListeriaのもう1つの所望の株)に導入し、それに組み込む。
(実施例20)
(Listeria monocytogenesでワクチン接種したマウスにおけるインビボ細胞傷害性活性の評価)
一連の実験を行って、インビボで抗原特異的標的細胞を溶解させるワクチン接種マウスの能力を評価した。最初の実験において、Balb/cマウスにListeria monocytogenes株DP−L4029(actA−)、AH1/A5を発現するDP−L4029、およびAH1/A5を発現するDP−L4029uvrAB−いずれかで静脈内(IV)でワクチン接種した。また、AH1/A5発現株を、実施例13の第二の方法に従ってSS−59UVAで処理した。また、AH1−A5を発現するListeria構築対もLLOおよびOVAを発現する。ワクチン接種は、表20に示された用量(0.1LD50)にて、全ての群について0日に、加えて、S−59処理株については1日および2日に行った。各株およびコントロールでは、3匹のマウスの2つの群をワクチン接種した。標的細胞集団は、RPMI1640培地中の20のナイーブなBalb/cマウスの脾臓を収集することによって調製した。細胞を解離し、赤血球細胞を溶解させた。白血球細胞をカウントし、4つの等しい集団に分けた。各群に、37℃において90分間、0.5μg/mLにて、特異的ペプチド、標的AHI(SynPep、Dublin、CAからのSPSYVYHQF(配列番号:20))、標的AH1−A5(SPSYAYHQF(配列番号:21)、SynPep)、またはコントロールの2つの集団(β―gal、TPHPARIGL(配列番号:37))いずれかでパルスした。次いで、細胞を培地中で3回、PBS+0.1%BSA中で2回洗浄した。カルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE、Molecular Probes、Eugene、OR)で標識するために、細胞をmL当たり1×107にて、温かいPBS+0.1%BSA(10mL以下)に再懸濁した。細胞懸濁液を標的化するために、1.25μLのCFSEの5mMストックを加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。コントロール細胞懸濁液に、CFSEストックの10倍希釈を加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。細胞を37℃にて10分間インキュベートした。大容量の(>40mL)の氷冷PBSの添加によって染色を停止した。細胞を室温にてPBSで2回洗浄し、次いで、再懸濁し、カウントした。各細胞懸濁液をmL当たり50×106に希釈し、100μLの各集団を混合し、第6日に、ナイーブなまたはワクチン接種したマウスいずれかの尾静脈を解して注射した。各株またはコントロールにつき、3匹のマウスの群にβ−galおよびAH−1またはβ−galおよびAH1−A5を注射した。12ないし24時間後、脾臓を収集し、合計5×106細胞をフローサイトメトリーによって分析した。高い(標的)および低い(コントロール)で蛍光ピークを数え、2つの比率を用いて、HBSSコントロール集団に対する標的細胞溶解のパーセンテージを確立した。結果を表20および図23Aに示す(本実施例における表は3匹のマウスについての平均を示し、他方図面は示されたサンプルについての個々のマウスからの代表的なヒストグラムである(必ずしも同一のマウスではない))。S−59処理株を用いるワクチン接種は、uvrA−突然変異体についてのAH1に対するわずかに良好な応答、およびS−59処理actA−株に対するuvrAB−突然変異体についてのAH1−A5に対する有意により高い応答を示す。
(Listeria monocytogenesでワクチン接種したマウスにおけるインビボ細胞傷害性活性の評価)
一連の実験を行って、インビボで抗原特異的標的細胞を溶解させるワクチン接種マウスの能力を評価した。最初の実験において、Balb/cマウスにListeria monocytogenes株DP−L4029(actA−)、AH1/A5を発現するDP−L4029、およびAH1/A5を発現するDP−L4029uvrAB−いずれかで静脈内(IV)でワクチン接種した。また、AH1/A5発現株を、実施例13の第二の方法に従ってSS−59UVAで処理した。また、AH1−A5を発現するListeria構築対もLLOおよびOVAを発現する。ワクチン接種は、表20に示された用量(0.1LD50)にて、全ての群について0日に、加えて、S−59処理株については1日および2日に行った。各株およびコントロールでは、3匹のマウスの2つの群をワクチン接種した。標的細胞集団は、RPMI1640培地中の20のナイーブなBalb/cマウスの脾臓を収集することによって調製した。細胞を解離し、赤血球細胞を溶解させた。白血球細胞をカウントし、4つの等しい集団に分けた。各群に、37℃において90分間、0.5μg/mLにて、特異的ペプチド、標的AHI(SynPep、Dublin、CAからのSPSYVYHQF(配列番号:20))、標的AH1−A5(SPSYAYHQF(配列番号:21)、SynPep)、またはコントロールの2つの集団(β―gal、TPHPARIGL(配列番号:37))いずれかでパルスした。次いで、細胞を培地中で3回、PBS+0.1%BSA中で2回洗浄した。カルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE、Molecular Probes、Eugene、OR)で標識するために、細胞をmL当たり1×107にて、温かいPBS+0.1%BSA(10mL以下)に再懸濁した。細胞懸濁液を標的化するために、1.25μLのCFSEの5mMストックを加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。コントロール細胞懸濁液に、CFSEストックの10倍希釈を加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。細胞を37℃にて10分間インキュベートした。大容量の(>40mL)の氷冷PBSの添加によって染色を停止した。細胞を室温にてPBSで2回洗浄し、次いで、再懸濁し、カウントした。各細胞懸濁液をmL当たり50×106に希釈し、100μLの各集団を混合し、第6日に、ナイーブなまたはワクチン接種したマウスいずれかの尾静脈を解して注射した。各株またはコントロールにつき、3匹のマウスの群にβ−galおよびAH−1またはβ−galおよびAH1−A5を注射した。12ないし24時間後、脾臓を収集し、合計5×106細胞をフローサイトメトリーによって分析した。高い(標的)および低い(コントロール)で蛍光ピークを数え、2つの比率を用いて、HBSSコントロール集団に対する標的細胞溶解のパーセンテージを確立した。結果を表20および図23Aに示す(本実施例における表は3匹のマウスについての平均を示し、他方図面は示されたサンプルについての個々のマウスからの代表的なヒストグラムである(必ずしも同一のマウスではない))。S−59処理株を用いるワクチン接種は、uvrA−突然変異体についてのAH1に対するわずかに良好な応答、およびS−59処理actA−株に対するuvrAB−突然変異体についてのAH1−A5に対する有意により高い応答を示す。
(表20 0日における、またS−59処理株については2日および3日に示されたワクチン接種されたBalb/cマウスのインビボ細胞傷害性)
この実験は、全ての群について14日に、加えて、S−59処理株については15日および16日に、さらなるワクチン接種を反復した。標識した標的細胞を20日に注射した。結果を表21および図23Bに示す。S−59処理uvrAB−突然変異体に対する応答は、追加免疫ワクチン接種で有意に改良することができ、これはS−59処理actA−株には当てはまらない。
(表21 0および14日、またS−59処理については2、3、15および16日に示されたワクチン接種されたBalb/cマウスのインビボ細胞傷害性)
OVA発現株についてはS−59処理の有りおよび無しを含めた、同様の実験をactA−、OVAを発現するactA−、およびOVAを発現するactA−uvrAB−を行った。この実験ではC57B1/6マウスを用いた。6匹のマウスの群を0日(S−59処理については1および2日にも)ワクチン接種し、各群の3匹には6日に標識した標的細胞を注射した。残りのマウスには14日に(S−59処理については15および16日に)ワクチン接種し、20日に標識した標的細胞を注射した。この実験においては、ナイーブな標的脾臓細胞をβ−gal(低いCFSE)またはSL8(高いCFSE)でパルスした。結果を表22および図23Cに示す。再度、S−59処理uvrAB−突然変異体に対する応答は、追加免疫ワクチン接種で有意に増強される。
(表22 示されたようにワクチン接種されたBalb/cマウスのインビボ細胞傷害性)
(実施例21)
(uvrAB欠失の有りおよび無しにての、Bacillus anthracisのS−59/UVA処理)
実施例7ないし9、およびCamilliら、Molecular Micro.,8.143−147(1993)に詳細に記載された対立遺伝子交換方法を用いて、Bacillus anthracis Sterne株を改変した。この株のビルレンスを減弱化する(pXO1+、pXO2−)。
(uvrAB欠失の有りおよび無しにての、Bacillus anthracisのS−59/UVA処理)
実施例7ないし9、およびCamilliら、Molecular Micro.,8.143−147(1993)に詳細に記載された対立遺伝子交換方法を用いて、Bacillus anthracis Sterne株を改変した。この株のビルレンスを減弱化する(pXO1+、pXO2−)。
Bacillus anthracisからのuvrAB遺伝子を同定し(Genbank受託番号AE017040、Bacillus anthracis Ames株、完全なゲノムのセクション17または18、配列:nts.212613−217471をコードするuvrAB遺伝子)、uvrAB遺伝子欠失を持つpKSV7に基づくプラスミドを、Splice Overlap Extension (スプライス重複延長)(SOE)PCRおよび以下に記載する工程を用いて構築した(pKSV7−dl uvrAB):
一次PCR反応:各々、B.anthracis uvrAB遺伝子5’および3’末端から上流および下流のほぼ1000bpsを増幅した。
一次PCR反応:各々、B.anthracis uvrAB遺伝子5’および3’末端から上流および下流のほぼ1000bpsを増幅した。
鋳型:B.anthracis sterneゲノムDNA
プライマー対1: uvrB.の5’末端から1000bp上流の領域の増幅
(アンプリコンサイズ(bps):1029)
Ba−225099F:
プライマー対1: uvrB.の5’末端から1000bp上流の領域の増幅
(アンプリコンサイズ(bps):1029)
Ba−225099F:
(配列番号:38)(Tm:74℃)
Ba−(3’uvrA−R+)226109R:
Ba−(3’uvrA−R+)226109R:
(配列番号:39)(Tm:120℃)(下線を施した配列はuvrAカルボキシ末端の下流の領域に相補的である)またはBa−226109R:
(配列番号:40)(Tm:72℃)
プライマー対2:uvrAの3’末端から下流の領域の増幅
(アンプリコンサイズ(bps):990)
Ba−(3‘uvrA−R+)230779F:
プライマー対2:uvrAの3’末端から下流の領域の増幅
(アンプリコンサイズ(bps):990)
Ba−(3‘uvrA−R+)230779F:
(配列番号:41)(Tm:126℃)(下線を施した配列はuvrBアミノ末端の上流の領域に対して相補的である)またはBa−230779F:
(配列番号:42)(Tm:70℃)
Ba−231769R:
Ba−231769R:
(配列番号:43)(Tm:76℃)
二次PCR反応:対1の逆方向プライマーおよび対2の順方向プライマーの間の相補性を利用する、SOE PCRを介する一次PCRアンプリコンの融合。配列:nts.226110−230779=4670bpsをコードするuvrABの正確な欠失における結果。
二次PCR反応:対1の逆方向プライマーおよび対2の順方向プライマーの間の相補性を利用する、SOE PCRを介する一次PCRアンプリコンの融合。配列:nts.226110−230779=4670bpsをコードするuvrABの正確な欠失における結果。
鋳型:清浄化された一次PCR反応
プライマー対:(アンプリコンサイズ(bps:1973)
Ba−225118F:
プライマー対:(アンプリコンサイズ(bps:1973)
Ba−225118F:
(配列番号:44)(Tm:78℃)
Ba−231761R:
Ba−231761R:
(配列番号:45)(Tm:74℃)
構築:一次PCR反応(3温度サイクル)を、Vent DNAポリメラーゼ(NEB)およびSterne株ゲノムDNAを用いて行う。4つの一次PCR反応は、スプライス重複延長(SOE)で用いるプライマーの有りおよび無し双方にて行う(もしBa−(3’uvrA―R+)226109RまたはBa−(3’uvrA−R+)226109Rプライマーを含む反応が有意なアンプリコン産物を生じなかったならば、Ba−225099F/Ba−226109RまたはBa−230779F/Ba−231769Rプライマー対との反応からのアンプリコンに対するこれらのプライマーを用いた)。1%アガロースゲルによるanthracis一次アンプリコンの予測されるサイズ(1029bpsおよび990bps)が確認された。反応物はS6カラム(BioRad)またはGeneClean(BIO 101)で洗浄した。
構築:一次PCR反応(3温度サイクル)を、Vent DNAポリメラーゼ(NEB)およびSterne株ゲノムDNAを用いて行う。4つの一次PCR反応は、スプライス重複延長(SOE)で用いるプライマーの有りおよび無し双方にて行う(もしBa−(3’uvrA―R+)226109RまたはBa−(3’uvrA−R+)226109Rプライマーを含む反応が有意なアンプリコン産物を生じなかったならば、Ba−225099F/Ba−226109RまたはBa−230779F/Ba−231769Rプライマー対との反応からのアンプリコンに対するこれらのプライマーを用いた)。1%アガロースゲルによるanthracis一次アンプリコンの予測されるサイズ(1029bpsおよび990bps)が確認された。反応物はS6カラム(BioRad)またはGeneClean(BIO 101)で洗浄した。
鋳型として各一次反応物のほぼ等量(約5μl)を利用し、二次PCR反応を行った。1%アガロースゲルによる二次PCR反応からのListeriaアンプリコンの予測されるサイズ(1973bps)を確認した。
anthracis dl uvrABアンプリコンをpCR2.1−Blunt II−TOPOベクターに挿入した。プラスミドBcr2.1−TOPO−dl uvrABプラスミドDNAをKpnIおよびPstIで消化し、2033bp断片をゲル−精製した。KpnI/PstI2033bp断片を、KpnIおよびPstIでの消化、およびCIAPでの処理によって調製されているpKSV7ベクターに挿入した(pKSV7−dl uvrAB)。pKSV7−dl uvrABにおけるdl urvAB配列の忠実度を確認した。
pKSV7−dl uvrABプラスミドでの対立遺伝子交換によって、uvrAB遺伝子をB.anthracis Sterneから欠失した。エレクトロポレーションによってプラスミドpKSV7−dl uvrABをB.anthracis Sterne株に導入し、クロラムフェニコール抵抗性につき選択した。エレクトロポレーションの頻度を有意に増大させる凍結工程を用い、エレクトロポレーションを行った。B.anthracis培養を37℃にて振盪しつつ、3mlのBHI0.5%グリセロールチュでO/N増殖させた。0.5ml培養物を、500mlのE−フラスコ中の50ml BHI0.5%グリセロール(OD600=0.1)に移した。サンプルを200rpmおよび37℃にてインキュベートした(または250mlフラスコ中の0.1ないし0.2mlから25mlのBHI0.5%グリセロール)。OD600=0.6ないし0.8において(ほぼ1時間45分)、微生物を500mlのディスポーサブル滅菌フィルター装置に集めた。微生物を各々冷エレクトロポレーション緩衝液(1mM HEPES 10%グリセロール pH7.4)で3×25ml洗浄した。細胞を1/20の元の容量(50ml培養用の2.45mlのe−ポレーション緩衝液)に再懸濁し、氷上に保持した。0.2cmギャップe―ポレーションキュベット中の0.2ml細胞に対して1μg(1ないし5ulのミニプレプ)の「非常に清浄な」未メチル化プラスミドDNA(コントロール=DNA無し)。次いで、サンプルを15分間氷上に保持した。次いで、細胞を25μFD、200Ω、2.5kVでパルスした(別法として、0.4ml細胞を400Ωにおいて0.4cmキュベット中でパルスした)。時定数はほぼ4ないし5m秒であった。パルスの直後、1mlのBGGM(10%グリセロール、0.4%グルコースおよび10mM MgCl2を含有するBHI)を加えた。細胞を滅菌したポリプロピレンチューブに移し、振盪しつつ、37℃にて1時間30分インキュベートした。細胞をペレット化し、200μlのBGGMに再懸濁し、選択培地上で平板培養した。
pKSV7−dl uvrABを41℃にてB.anthracis染色体に組み込んだ。pKSV7−dl uvrABを切り出し、許容される温度にて治癒し、その結果、クロラムフェニコール感受性コロニーが得られた。PCRプライマーは、染色体上での欠失を検出するように設計した。20%のクロラムフェニコール感受性コロニーは、B.anthracis染色体中に欠失を保有した。uvrAB−株のPCR分析は、pXO1ビルレンスプラスミドの保持を示した。
37℃において300rpmにてBHIを0.3のOD600まで増殖させることによって、親株と共に、2つのUVRAB−クローン(クローン8およびクローン32A)をS−59−処理し、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を表23に示した濃度まで加えた。これらのサンプルをほぼ1時間激しく振盪しつつ37℃において300rpmにてインキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLのアリコットを取り出して力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2のUVA量で照射し(FX−1019)、その結果、以下の表23および図24に示すように、親株と比較して6log低下がもたらされた。これは、Listeria monocytogenes uvrAB−株につき観察されたのと同様なB.anthracisにおけるソラレン処理に対する感度を示す。
(表23 ソラレンS−59/UVA処理でのBacillus anthracis Sterne株−対−uvrAB−突然変異体の減弱化)
(実施例22)
(ヒト癌のインビボ処置のための本発明のワクチンの使用)
ヒト癌の処置または予防の例として、負荷され、かつ微生物の増殖が減弱化されるように改変された微生物による感染によって活性化された抗原提示細胞を含むワクチンであって、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないワクチンを個体に投与する。微生物は実施例4および5のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットを、例えば、実施例8に記載されたpPL2組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当業者に常識であるいずれかの方法によって微生物に取り込ませる。次いで、抗原提示細胞(APC)を負荷し、本明細書中に概説したもののような方法を用いて改変された微生物で活性化させる。
(ヒト癌のインビボ処置のための本発明のワクチンの使用)
ヒト癌の処置または予防の例として、負荷され、かつ微生物の増殖が減弱化されるように改変された微生物による感染によって活性化された抗原提示細胞を含むワクチンであって、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないワクチンを個体に投与する。微生物は実施例4および5のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットを、例えば、実施例8に記載されたpPL2組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当業者に常識であるいずれかの方法によって微生物に取り込ませる。次いで、抗原提示細胞(APC)を負荷し、本明細書中に概説したもののような方法を用いて改変された微生物で活性化させる。
得られたAPCワクチンを粗製、または好ましくは精製された形態で処方することができる。ワクチン組成物は液体懸濁液として調製することができる。加えて、それらは保存剤(例えば、チメロサール、2−フェノキシエタノール)、安定化剤(例えば、ラクトース、グルタミン酸モノナトリウム)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン)、抗生物質(例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン)、または他の物質のような添加剤とで処方することができる。処方は、滅菌水、生理食塩水、等張緩衝化生理食塩水、(例えば、生理学的pHに緩衝化されたリン酸塩)、または他の適当な希釈剤のような適当な希釈剤に再懸濁または希釈することができる。
ワクチンは、経口、鼻孔内、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下経路を含めた種々の経路によって、ならびにいずれかの与えられた悪性病または感染症に関係のあるいずれかの経路によって投与することができる。有効量のワクチンが処置のために個体に投与されるであろう。治療的処置では、有効量は所望の免疫応答をもたらすであろう用量であり、ここで、免疫応答は標的化腫瘍の増殖を遅らせ、腫瘍のサイズを低下させ、あるいは好ましくは腫瘍を完全に排除するのいずれかである。ワクチンの投与は適切な間隔で反復することができ、かつワクチン接種された個体において複数の区別される部位に同時に投与することができる。予防的処置では、有効量は、癌を発生する個体の確立が有意に低下するような保護的免疫応答をもたらす用量である。ワクチン接種方法は単一用量よりなることができるか、あるいは保護的免疫応答が確立されるまで適当な間隔で反復することができる。
個体の治療的処置は、初期処置として癌と診断された個体で開始することができるか、あるいは他の処置と組み合わせて用いることができる。例えば、外科的に腫瘍が除去された、あるいは放射線療法で、または化学療法によって処置された個体をワクチンで処置して、個体におけるいずれかの残存する腫瘍を減少または排除し、あるいは癌の再発の危険性を低下させることができる。個体の予防的処置は、環境条件または遺伝的素因のためある癌に罹患する増大した危険性を有する個体で開始されるであろう。
(実施例23)
(Listeriaの減弱化株に基づく組換え腫瘍Ag分泌ワクチンの生成)
抗原分泌およびMHCクラスIプロセッシングを容易とするためにリステリオシリン(Listeriolysin)O(LLO)の切形された形態と融合させたニワトリオボアルブミン(OVA)を、選択された減弱化Listeria株の免疫原性を評価するための実験においてモデル抗原として用いた。腫瘍抗原発現カセットを、独占的pPL2組込みベクターで減弱化されたListeria株のパネルの染色体上の無毒部位に部位−特異的に組み込んだ。組換えLisetria株は、ウェスタンブロット分析によって測定されるように予測された改変LLO−OVA融合タンパク質を発現し、分泌した(データは示さず)。液体ブロス培養ならびに細胞内増殖動態学におけるこれらの組換え体の各々の増殖もその親から区別することができた。さらに、組換えOVA発現株は、未改変親株の2のファクター内にあるIV LD50を有することが示された(表24)。
(Listeriaの減弱化株に基づく組換え腫瘍Ag分泌ワクチンの生成)
抗原分泌およびMHCクラスIプロセッシングを容易とするためにリステリオシリン(Listeriolysin)O(LLO)の切形された形態と融合させたニワトリオボアルブミン(OVA)を、選択された減弱化Listeria株の免疫原性を評価するための実験においてモデル抗原として用いた。腫瘍抗原発現カセットを、独占的pPL2組込みベクターで減弱化されたListeria株のパネルの染色体上の無毒部位に部位−特異的に組み込んだ。組換えLisetria株は、ウェスタンブロット分析によって測定されるように予測された改変LLO−OVA融合タンパク質を発現し、分泌した(データは示さず)。液体ブロス培養ならびに細胞内増殖動態学におけるこれらの組換え体の各々の増殖もその親から区別することができた。さらに、組換えOVA発現株は、未改変親株の2のファクター内にあるIV LD50を有することが示された(表24)。
(表24 Listeria monocytogenesの選択された株)
組込みベクターは、複数組換えListeriaワクチン候補の迅速な誘導を促進する。単一構築体を、平行して、いずれかの数のユニークな遺伝子バックグラウンドと接合させて、同質遺伝子株を迅速に作成することができる。
(実施例24)
(生きていないが、代謝的には活性なListeriaを生産するためのソラレン−誘導DNA架橋)
Listeriaベースのエキソビボ抗原送達プラットホームに対する安全性を確認するために、遺伝子的に減弱されたListeriaを用いることに加えて、本発明者らは、ソラレンでの処理を通じて十分に不活化することができるが、代謝的には活性であり、細胞に感染し、ファゴリソソームから逃避し、かつクラスI経路を介してコードされた抗原の提示を促進するその能力をかくして保有するListeria株を作成した。作成されたListeria株は、ソラレン、それらが増殖できないように、UVA光照射後に細菌のゲノムにおいて不可逆的な架橋を形成する化合物の群での不活化に対して非常に感受性である。ソラレンー媒介DNA損傷を修復することができないListeriaの突然変異体株は、Listeriaおよび他の細菌におけるヌクレオチド−切出修復に必要な、紫外線光抵抗性(uvr)AB遺伝子(uvrAB)を欠失することによって創製された(Sancarら、Ann.Rev.Biochem.,57:29−67(1988))。ソラレンS−59はHelinxとして知られたDNA架橋技術で用いられるCerus化合物のメンバーの1つである(Lin,N.,Psoralen photochemical treatment of plateletes,Science and Medicine (1998); Hei,ら、Transfusion,39:239−48(1999))。検出の限界までListeria uvrAB欠失突然変異体を不活化するソラレン濃度において、無傷DNA修復メカニズムを有する親非−突然変異体株はUVA光不活化に対して4log以上感受性が低い(図25B)。S−59/UVA不活化Listeria uvrABは、MTTアッセイにおいて測定されたようにそのミトコンドリア活性を維持し、35S−メチオニン−標識パルス−チェイス実験によって測定されたように、そのゲノムレパートリーを発現するその能力を保持した(図26および図10)。不活化親株はそうではなかったが、S−59/UVA不活化Listeria uvrABは、その遺伝子レパートリーの継続した発現を示した。不活化親株の発現レベルは有意に減少し、これは、十分な不活化に必要なS−59濃度におけるS−59/UVA処理が、同様にコードされた腫瘍抗原の発現を含めた、Listeria遺伝子産物の発現を有意に減少させることを示す。
(生きていないが、代謝的には活性なListeriaを生産するためのソラレン−誘導DNA架橋)
Listeriaベースのエキソビボ抗原送達プラットホームに対する安全性を確認するために、遺伝子的に減弱されたListeriaを用いることに加えて、本発明者らは、ソラレンでの処理を通じて十分に不活化することができるが、代謝的には活性であり、細胞に感染し、ファゴリソソームから逃避し、かつクラスI経路を介してコードされた抗原の提示を促進するその能力をかくして保有するListeria株を作成した。作成されたListeria株は、ソラレン、それらが増殖できないように、UVA光照射後に細菌のゲノムにおいて不可逆的な架橋を形成する化合物の群での不活化に対して非常に感受性である。ソラレンー媒介DNA損傷を修復することができないListeriaの突然変異体株は、Listeriaおよび他の細菌におけるヌクレオチド−切出修復に必要な、紫外線光抵抗性(uvr)AB遺伝子(uvrAB)を欠失することによって創製された(Sancarら、Ann.Rev.Biochem.,57:29−67(1988))。ソラレンS−59はHelinxとして知られたDNA架橋技術で用いられるCerus化合物のメンバーの1つである(Lin,N.,Psoralen photochemical treatment of plateletes,Science and Medicine (1998); Hei,ら、Transfusion,39:239−48(1999))。検出の限界までListeria uvrAB欠失突然変異体を不活化するソラレン濃度において、無傷DNA修復メカニズムを有する親非−突然変異体株はUVA光不活化に対して4log以上感受性が低い(図25B)。S−59/UVA不活化Listeria uvrABは、MTTアッセイにおいて測定されたようにそのミトコンドリア活性を維持し、35S−メチオニン−標識パルス−チェイス実験によって測定されたように、そのゲノムレパートリーを発現するその能力を保持した(図26および図10)。不活化親株はそうではなかったが、S−59/UVA不活化Listeria uvrABは、その遺伝子レパートリーの継続した発現を示した。不活化親株の発現レベルは有意に減少し、これは、十分な不活化に必要なS−59濃度におけるS−59/UVA処理が、同様にコードされた腫瘍抗原の発現を含めた、Listeria遺伝子産物の発現を有意に減少させることを示す。
(実施例25)
(生きていないListeria uvrAB株はDCに感染し、ファゴリソソームから逃避する能力を保有する)
代謝活性を維持するに加え、樹状細胞(DC)の感染に際して、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB株によるMHCクラスI経路への効果的な抗原負荷を示すのは重要である。本発明者らは、今回、LLOをコードするhly遺伝子の欠失によりファゴリソソームから逃避することができないListeria突然変異体(DP−L4027)でのDCの感染は、MHCクラスIの意味において、抗原の提示を排除することを示した。
(生きていないListeria uvrAB株はDCに感染し、ファゴリソソームから逃避する能力を保有する)
代謝活性を維持するに加え、樹状細胞(DC)の感染に際して、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB株によるMHCクラスI経路への効果的な抗原負荷を示すのは重要である。本発明者らは、今回、LLOをコードするhly遺伝子の欠失によりファゴリソソームから逃避することができないListeria突然変異体(DP−L4027)でのDCの感染は、MHCクラスIの意味において、抗原の提示を排除することを示した。
Listeria uvrAB感染DCのファゴリソソームからの逃避を示すために、本発明者らは、蛍光顕微鏡測定によって可視化することができる宿主−細胞アクチンフィラメント、いわゆる「アクチンクラウズ」によって細胞質Listeriaが囲まれるという事実を利用する。Listeria表面でのアクチンの重合は、細菌ActAタンパク質および他の宿主細胞因子によって媒介される。ネズミDC細胞系DC2.4を、37℃にて30分間、Listeria wt、S−59/UVA不活化Listeria uvrABおよびListeria ΔLLO(DP−L4027)で、1の感染多重度(MOI)にて感染させた。細胞外細菌を何回かの洗浄によって注意深く除去し、ゲンタマイシンの存在下でDCを37℃にてさらに5時間インキュベートして、細胞外細菌の成長を妨げた。野生型Listeriaまたは十分に不活化されたListeria uvrABで感染されたDC2.4は、Listeriaの細胞質局所化に典型的な、典型的なアクチンクラウズまたはアクチンコメットテイルを示した(図27)。しかしながら、Listeria LLOヌル突然変異体で感染させたDC2.4細胞において、アクチンおよびListeriaの共局所化は観察されず、これは、細菌がファゴリソソームから逃避することができなかったことを示す。この結果は、これらのDNA修復突然変異体が、ファゴリソソームから逃避し、感染した細胞のサイトゾルに入る能力を保有することを示し、そこで、抗原は分泌することができ、これは、MHCクラスI経路を介する直接的提示のための必要な工程である。また、前記実施例17および図21を参照されたし。
(実施例26)
(生きていないListeria uvrABは、感染された樹状細胞(DC)のMHCクラスI経路に抗原を効果的に負荷する)
感染した細胞内のファゴリソソームを逃避するS−59ソラレン不活化Listeria uvrABのユニークな能力のため、サイトゾルListeriaによって分泌された遺伝子産物はプロセッシングされ、MHCクラスI経路を介して提示される。DCのMHCクラスI経路へ抗原を負荷するS−59/UVA不活化Listeria uvrABの能力をテストするため、DC2.4細胞を、異なる濃度のS−59で不活化された、OVA−発現Listeria株、L4029 uvrAB OVAで1の感染多重度(MOI)にて感染させた。親ListeriaOVAおよび加熱−死滅Listeria uvrAB OVAはコントロールとして供した。Listeriaの貪食作用に続くクラスI分子へのDC2.4によるOVAペプチドの提示は、B3Z細胞とのインキュベーションの後に測定した。B3Zは、ネズミKbクラスI分子上に提示されたOVA257−264(SL8)エピトープに特異的なLacZ−誘導性CD8+T−細胞ハイブリドーマである(Sanderson,Int.Immunol.,6:369−76(1994))。B3Z細胞へのSL8のクラスI−制限提示の結果、B3Zによるβーgal合成の誘導がもたらされる。生じたβ−galの量は発色性基質GPRGの加水分解によって測定することができ、APCの表面に提示されたSL8/Kb複合体の量の指標である。図9Aおよび9Bに示されたように、同族親株はそうでなかったが、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVA株は、増殖するその能力とは独立してMHCクラスI経路へ抗原を負荷するその能力を維持した(これは、実施例11に記載されたのと同一のデータである)。70ないし100nMのS−59濃度を用いる十分な不活化においてさえ、90%を超えるB3Z活性化が維持された。対照的に、無傷DNA修復を持つ親Listeria OVA株は、より高い濃度のS−59を不活化で用いる場合、B3Z T−細胞ハイブリドーマを活性化するその能力を喪失した。Listeria uvrAB OVA株とは対照的に、B3Z活性化、およびBHI寒天プレート上でコロニーを形成する親Listeria OVA株の能力は密接に関連し、これは、生きたListeria OVAのみがDC2.4細胞を感染でき、かつMHCクラスI経路へ抗原を負荷できることを示唆する。さらに、加熱−死滅化Listeria uvrAB OVAはB3Z活性化をもたらさなかった。この結果は、MHCクラスI経路へ抗原を負荷するListeriaの能力は、ソラレン−媒介DNA損傷を修復するその能力を妨げるように改変された、S−59/UVA不活化Listeriaを用いる増殖ようの要件とはリンクできないことを示す。
(生きていないListeria uvrABは、感染された樹状細胞(DC)のMHCクラスI経路に抗原を効果的に負荷する)
感染した細胞内のファゴリソソームを逃避するS−59ソラレン不活化Listeria uvrABのユニークな能力のため、サイトゾルListeriaによって分泌された遺伝子産物はプロセッシングされ、MHCクラスI経路を介して提示される。DCのMHCクラスI経路へ抗原を負荷するS−59/UVA不活化Listeria uvrABの能力をテストするため、DC2.4細胞を、異なる濃度のS−59で不活化された、OVA−発現Listeria株、L4029 uvrAB OVAで1の感染多重度(MOI)にて感染させた。親ListeriaOVAおよび加熱−死滅Listeria uvrAB OVAはコントロールとして供した。Listeriaの貪食作用に続くクラスI分子へのDC2.4によるOVAペプチドの提示は、B3Z細胞とのインキュベーションの後に測定した。B3Zは、ネズミKbクラスI分子上に提示されたOVA257−264(SL8)エピトープに特異的なLacZ−誘導性CD8+T−細胞ハイブリドーマである(Sanderson,Int.Immunol.,6:369−76(1994))。B3Z細胞へのSL8のクラスI−制限提示の結果、B3Zによるβーgal合成の誘導がもたらされる。生じたβ−galの量は発色性基質GPRGの加水分解によって測定することができ、APCの表面に提示されたSL8/Kb複合体の量の指標である。図9Aおよび9Bに示されたように、同族親株はそうでなかったが、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVA株は、増殖するその能力とは独立してMHCクラスI経路へ抗原を負荷するその能力を維持した(これは、実施例11に記載されたのと同一のデータである)。70ないし100nMのS−59濃度を用いる十分な不活化においてさえ、90%を超えるB3Z活性化が維持された。対照的に、無傷DNA修復を持つ親Listeria OVA株は、より高い濃度のS−59を不活化で用いる場合、B3Z T−細胞ハイブリドーマを活性化するその能力を喪失した。Listeria uvrAB OVA株とは対照的に、B3Z活性化、およびBHI寒天プレート上でコロニーを形成する親Listeria OVA株の能力は密接に関連し、これは、生きたListeria OVAのみがDC2.4細胞を感染でき、かつMHCクラスI経路へ抗原を負荷できることを示唆する。さらに、加熱−死滅化Listeria uvrAB OVAはB3Z活性化をもたらさなかった。この結果は、MHCクラスI経路へ抗原を負荷するListeriaの能力は、ソラレン−媒介DNA損傷を修復するその能力を妨げるように改変された、S−59/UVA不活化Listeriaを用いる増殖ようの要件とはリンクできないことを示す。
一次DCのMHCクラスI経路へ抗原を負荷するListeria uvrAB OVAの能力をテストするために、未成熟ネズミBM−DCを、十分に不活化されたS−59UVA処理Listeria uvrAB OVAで感染させた。生きたListeria uvrAB OVA、親株およびL4027をコントロールとして供した。図28に示すように、OVA−発現株で感染させたBM−DCはインビトロでB3Z細胞を刺激したが、親株は刺激しなかった。生きたおよび生きていないS−59/UVA処理Listeria uvrAB UVA突然変異体株(L5029 uvrAB OVA)の間に有意な差は観察されず、これは、一次DCのMHCクラスI分子に、Listeria uvrABの増殖する無能力にもかかわらず、ファゴリソソームからサイトゾルへの細菌の逃避に続いて、Listeria−由来ペプチドが効果的に負荷されることを示唆する。重要なことには、加熱−死滅化によって不活化されたListeria actA OVAは、MHCクラスI経路においてOVAペプチドのいずれかの有意な提示をもたらさず、これは、加熱−死滅化細菌とのDCのインキュベーションの結果、MHCクラスI分子のいずれかの有意な抗原負荷をもたらされないことを示唆する。
(実施例27)
(ListeriaはヒトDCを直接的に感染し、活性化させる)
優れた抗原送達プラットホームの開発のためには、MHCクラスI経路へ抗原を効果的に送達することに加え、DCの活性化/成熟化が必要であると広く考えられる。イン・サイチュでは、未成熟DCは末梢組織に存在し、そこで、それは継続的に抗原を取り込み、それを加工するが、それは、活性化/成熟化プロセスを開始するいずれの細菌が提供するかのような活性化刺激の遭遇であり、ケモカイン受容体の変調、およびリンパ節を排出するT細胞領域へのDCのT細胞領域への移動に至る。我々は、ヒト単球−由来BCの表現型成熟化およびサイトカイン生産を誘導する野生型Listeria(L−4056)の能力を評価した。図29に示すように、ヒト未成熟DCとListeriaとの遭遇は、活性化マーカー、CD86およびHLA−DR(図29A)、ならびに成熟化マーカー、CD83(図29B)のアップーレギュレーションに導いた。さらに、Listeriaへのヒト未成熟DCの暴露は、IL−12p70およびTNF−αのような高レベルのプロ−炎症性サイトカインを分泌するその能力によって示されるように、その免疫―刺激能力を増加させた(図29C)。
(ListeriaはヒトDCを直接的に感染し、活性化させる)
優れた抗原送達プラットホームの開発のためには、MHCクラスI経路へ抗原を効果的に送達することに加え、DCの活性化/成熟化が必要であると広く考えられる。イン・サイチュでは、未成熟DCは末梢組織に存在し、そこで、それは継続的に抗原を取り込み、それを加工するが、それは、活性化/成熟化プロセスを開始するいずれの細菌が提供するかのような活性化刺激の遭遇であり、ケモカイン受容体の変調、およびリンパ節を排出するT細胞領域へのDCのT細胞領域への移動に至る。我々は、ヒト単球−由来BCの表現型成熟化およびサイトカイン生産を誘導する野生型Listeria(L−4056)の能力を評価した。図29に示すように、ヒト未成熟DCとListeriaとの遭遇は、活性化マーカー、CD86およびHLA−DR(図29A)、ならびに成熟化マーカー、CD83(図29B)のアップーレギュレーションに導いた。さらに、Listeriaへのヒト未成熟DCの暴露は、IL−12p70およびTNF−αのような高レベルのプロ−炎症性サイトカインを分泌するその能力によって示されるように、その免疫―刺激能力を増加させた(図29C)。
(実施例28)
(S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAはインビトロにてOVA−特異的免疫性を誘導する)
我々は、インビボにてOVA−特異的免疫性を誘導するS−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAワクチンの能力を評価した。雌C57BL/6マウスを、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAの1×108粒子で静脈内ワクチン接種した。OVA−特異的免疫性の誘導はワクチン接種から7日後に評価した。顕著には、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAは、図30に示すように、有意なOVA−特異的CD8+T細胞応答を示したが、親Listeria OVA株はそうでなかった。さらに、加熱―死滅化Listeria uvrAB
OVAでのマウスのワクチン接種は、OVA−特異的免疫性の誘導をもたらさなかった。
(S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAはインビトロにてOVA−特異的免疫性を誘導する)
我々は、インビボにてOVA−特異的免疫性を誘導するS−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAワクチンの能力を評価した。雌C57BL/6マウスを、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAの1×108粒子で静脈内ワクチン接種した。OVA−特異的免疫性の誘導はワクチン接種から7日後に評価した。顕著には、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAは、図30に示すように、有意なOVA−特異的CD8+T細胞応答を示したが、親Listeria OVA株はそうでなかった。さらに、加熱―死滅化Listeria uvrAB
OVAでのマウスのワクチン接種は、OVA−特異的免疫性の誘導をもたらさなかった。
(実施例29)
(天然(CAP1)または増強されたアゴニスト細胞障害性Tリンパ球エピトープ(CAP−1−6D)いずれかを含む全長CEAを発現する2つの組換え減弱化Listeria actA/uvrAB株の構築)
CEAは、皮内で誘導された消化系上皮および胎児結腸の腺癌で見出される180kDaの大きなタンパク質である。CEAはGPI−アンカーによって細胞の膜に付着される。該タンパク質は7つの免疫グロブリン−様ドメインを含み、C−末端は、非特異的交差反応タンパク質、NCA、癌性胚抗原遺伝子ファミリーのメンバーと相同性を示す。我々は、HLA*A0201−制限CEA天然T細胞エピトープCAP1(YLSGANLNL)(配列番号:51)または癌患者においてCEA−特異的免疫性を誘導するのにより優れていることが示されたエンハンサーアゴニスト細胞傷害性Tリンパ球ペプチドCAP1−6D(YLSGADLNL)(配列番号:52)(Zarembaら、Cancer Res.,57:4570−7(1997))いずれかを含む全長CEAを構築することを提案する(表25)(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001))。
(天然(CAP1)または増強されたアゴニスト細胞障害性Tリンパ球エピトープ(CAP−1−6D)いずれかを含む全長CEAを発現する2つの組換え減弱化Listeria actA/uvrAB株の構築)
CEAは、皮内で誘導された消化系上皮および胎児結腸の腺癌で見出される180kDaの大きなタンパク質である。CEAはGPI−アンカーによって細胞の膜に付着される。該タンパク質は7つの免疫グロブリン−様ドメインを含み、C−末端は、非特異的交差反応タンパク質、NCA、癌性胚抗原遺伝子ファミリーのメンバーと相同性を示す。我々は、HLA*A0201−制限CEA天然T細胞エピトープCAP1(YLSGANLNL)(配列番号:51)または癌患者においてCEA−特異的免疫性を誘導するのにより優れていることが示されたエンハンサーアゴニスト細胞傷害性Tリンパ球ペプチドCAP1−6D(YLSGADLNL)(配列番号:52)(Zarembaら、Cancer Res.,57:4570−7(1997))いずれかを含む全長CEAを構築することを提案する(表25)(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001))。
(表25)
CEA腫瘍抗原発現プラスミドをpPL2骨格、Listeriaゲノムに部位−特異的に組み込まれるベクター(Lauerら、J.Bacteriol.,184:4177−86(2002))上に構築する。2つのプラスミドは、Listeria LLOに由来する分泌シグナルおよびPESTエレメントが全長CEA cDNAと遺伝子的に融合されるように構築されるであろう。遺伝子構築体の5’末端から出発し、融合タンパク質は、CEAに融合した細菌分泌を促進するためのLLOの末端領域よりなる。ドメインの正確な連結は、重複PCRによって達成されるであろう。全てのプラスミド構築対の忠実度は、DNA配列決定によって確認されるであろう。
(実施例30)
(Listeria株L4029 uvrABに組み込まれたpPL2 CEAwtおよびpPL2 CEA−610Dを含む2つの減弱化組換えListeria株の誘導、およびCEA抗原の発現および分泌の確認)
tRNAArg遺伝子に隣接するpPL2−CEA構築体の、Listeria株L4029 uvrABのゲノムへの組込みは、Lauerら、J.Bacteriol.,184:4177−86(2002)によって従前に記載されたように達成される。簡単に述べれば、まず、形質転換によってプラスミドをE.coli株SM10に導入し、次いで、コンジュゲーションによってListeriaの所望の株に導入する。Listeriaトランス−コンジュガントはクロラムフェニコール(pPL2)およびストレプトマイシン(Listeria株)選択培地によって選択され;このプロセスの効率はほぼ1×10−4である。トランス−コンジュガントの純度を確認し、細菌染色体へのpPL2骨格の組込みを確認するために、限定された数の候補コロニーを、新鮮な選択培地への画線培養によって3回継代する。ListeriaゲノムへのCEA構築体への正確な取込みはコロニー−PCRによって確認される。
(Listeria株L4029 uvrABに組み込まれたpPL2 CEAwtおよびpPL2 CEA−610Dを含む2つの減弱化組換えListeria株の誘導、およびCEA抗原の発現および分泌の確認)
tRNAArg遺伝子に隣接するpPL2−CEA構築体の、Listeria株L4029 uvrABのゲノムへの組込みは、Lauerら、J.Bacteriol.,184:4177−86(2002)によって従前に記載されたように達成される。簡単に述べれば、まず、形質転換によってプラスミドをE.coli株SM10に導入し、次いで、コンジュゲーションによってListeriaの所望の株に導入する。Listeriaトランス−コンジュガントはクロラムフェニコール(pPL2)およびストレプトマイシン(Listeria株)選択培地によって選択され;このプロセスの効率はほぼ1×10−4である。トランス−コンジュガントの純度を確認し、細菌染色体へのpPL2骨格の組込みを確認するために、限定された数の候補コロニーを、新鮮な選択培地への画線培養によって3回継代する。ListeriaゲノムへのCEA構築体への正確な取込みはコロニー−PCRによって確認される。
抗原発現およびLLO−CEA融合タンパク質の分泌は、全細胞溶解物、およびTCA沈殿細菌培養流体のウエスタンブロッティングによって測定される。LLO−特異的ウサギポリクローナル抗体およびCEA−特異的モノクローナル抗体を用いて、組換えListeriaからのLLO−CEA融合タンパク質の発現および分泌を確認する。CEAを発現する組換えListeria株の生物学的特性をその各親株と比較することができる。新鮮な培地への静止相培養物の1:100希釈による接種に続いてのブレイン・ハート−・インフージョン(BHI)ブロスにおける増殖動態学が測定される。過去に、我々は、Listeriaにおいて同様なまたはより大きなサイズのタンパク質を発現させた。しかしながら、細菌における哺乳動物遺伝子産物の組換えタンパク質発現は、各個々のタンパク質に依存した挑戦を主張する。もしListeriaにおけるCEA発現が問題を持ち出すならば、CEAの断片またはT細胞ミニ−エピトープいずれかを発現するListeria株を構築することができる。HLA*A0201−制限CEA天然T細胞エピトープCAP1(YLSGANLNL)(配列番号:51)またはエンハンサーアゴニスト細胞傷害性Tリンパ球ペプチドCAP1−6D(YLSGADLNL)(配列番号:52)、我々の現存する発現構築体のオボアルブミン(OVA)内にイン−フレームにて埋め込まれ、それにより、Listeria LLOに由来する分泌シグナルおよびPESTエレメントは遺伝子的にOVAに融合される。T細胞ミニ−エピトープの発現および免疫原性は、gp70T細胞ミニ−エピトープ、AH1およびAH1−A5およびB16Trp1、Trp2、およびgp100で以前に示されているように保存されている(データは示さず)。
(実施例31)
(S−59/UVA処理によってListeria actAuvrAB CEA株を十分に不活化するが、最適な代謝活性、腫瘍抗原発現、抗原提示細胞の感染およびファゴリソソーム逃避を保持する条件の確率)
遺伝子発現の結果としての代謝活性は、最小数の架橋で最良に維持される。Listeria actA/uvrAB CEAワクチンを十分に不活化し、抗原発現レベルを無傷のまま残す最小量のS−59/UVA処理のための条件は容易に確立することができる。不活化条件の例は、OD600=0.5のlog−相培養における200nMまでのS−59ソラレンの付加、続いての、培養が1の光学密度に到達した場合の6J/m2のUVA光での不活化である。不活化条件は、S−59の濃度、UVA用量、UVA処理に先立ってのS−59暴露の時間を変化させることによって、ならびにListeria
actA/uvrAB CEA株の細菌増殖の間における処理の時間を変化させることによって最適化される。親Listeria株はコントロールとして用いられる。Listeriaの不活化(log−死滅)は、BHI(ブレイン・ハート・インフージョン)寒天プレート上でコロニーを形成する細菌の無能力によって測定される。加えて、35S−パルス−チェイス実験を用いてS−59/UVA不活化ListeriaのLLOおよびp60のようなCEAの発現およびビルレンス因子を確認して、S−59/UVA不活化後に新しく発現されたタンパク質の合成および分泌を測定することができる。35S−代謝標識を用いるLLOおよびp60の発現はルーチン的に測定することができる。S−59/UVA不活化Listeria actA/uvrAB CEAは35S−メチオニンの存在下で1時間インキュベートされる。抗原発現、およびLLO−CEA融合タンパク質、内因性LLO、およびp60の分泌は全細胞溶解物、および細菌培養流体のTEA沈殿双方で測定されるであろう。LLO−、p60−およびCEA−特異的モノクローナル抗体を免疫沈澱で用いて、不活化後に、組換えListeriaからの継続した発現および分泌を確認する。S−59/UVA不活化Listeria actA/uvrAB CEAの発現レベルは、優れた抗原特異的T細胞応答の誘導をもたらす我々の現在のListeria−OVAワクチン株と比較されるであろう。評価された遺伝子産物の発現レベルに対する限定的影響を持つ再現可能な十分な不活化に導くS−59/UVA条件を選択することができる。
(S−59/UVA処理によってListeria actAuvrAB CEA株を十分に不活化するが、最適な代謝活性、腫瘍抗原発現、抗原提示細胞の感染およびファゴリソソーム逃避を保持する条件の確率)
遺伝子発現の結果としての代謝活性は、最小数の架橋で最良に維持される。Listeria actA/uvrAB CEAワクチンを十分に不活化し、抗原発現レベルを無傷のまま残す最小量のS−59/UVA処理のための条件は容易に確立することができる。不活化条件の例は、OD600=0.5のlog−相培養における200nMまでのS−59ソラレンの付加、続いての、培養が1の光学密度に到達した場合の6J/m2のUVA光での不活化である。不活化条件は、S−59の濃度、UVA用量、UVA処理に先立ってのS−59暴露の時間を変化させることによって、ならびにListeria
actA/uvrAB CEA株の細菌増殖の間における処理の時間を変化させることによって最適化される。親Listeria株はコントロールとして用いられる。Listeriaの不活化(log−死滅)は、BHI(ブレイン・ハート・インフージョン)寒天プレート上でコロニーを形成する細菌の無能力によって測定される。加えて、35S−パルス−チェイス実験を用いてS−59/UVA不活化ListeriaのLLOおよびp60のようなCEAの発現およびビルレンス因子を確認して、S−59/UVA不活化後に新しく発現されたタンパク質の合成および分泌を測定することができる。35S−代謝標識を用いるLLOおよびp60の発現はルーチン的に測定することができる。S−59/UVA不活化Listeria actA/uvrAB CEAは35S−メチオニンの存在下で1時間インキュベートされる。抗原発現、およびLLO−CEA融合タンパク質、内因性LLO、およびp60の分泌は全細胞溶解物、および細菌培養流体のTEA沈殿双方で測定されるであろう。LLO−、p60−およびCEA−特異的モノクローナル抗体を免疫沈澱で用いて、不活化後に、組換えListeriaからの継続した発現および分泌を確認する。S−59/UVA不活化Listeria actA/uvrAB CEAの発現レベルは、優れた抗原特異的T細胞応答の誘導をもたらす我々の現在のListeria−OVAワクチン株と比較されるであろう。評価された遺伝子産物の発現レベルに対する限定的影響を持つ再現可能な十分な不活化に導くS−59/UVA条件を選択することができる。
(実施例32)
(MHCクラスIの意味でCEAの効果的な提示をもたらす、不活化(S−59/UVA)Listeria actA/UVR AB CEAワクチンでのヒト未成熟樹状細胞(DC)の感染のためのプロトコルおよびワクチン株の確立)
DCのエキソビボ感染のための最適条件は3つの独立したアッセイ:(1)感染に際してのヒト未成熟DCの表現型およびサイトカインプロフィールの変化、(2)同種異系Tリンパ球応答を誘導するListeria−感染DCの能力、および(3)インビトロでCEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞系を刺激するListeria actA/uvrAB CEA感染DCの能力の結果に基づいて決定される。
(MHCクラスIの意味でCEAの効果的な提示をもたらす、不活化(S−59/UVA)Listeria actA/UVR AB CEAワクチンでのヒト未成熟樹状細胞(DC)の感染のためのプロトコルおよびワクチン株の確立)
DCのエキソビボ感染のための最適条件は3つの独立したアッセイ:(1)感染に際してのヒト未成熟DCの表現型およびサイトカインプロフィールの変化、(2)同種異系Tリンパ球応答を誘導するListeria−感染DCの能力、および(3)インビトロでCEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞系を刺激するListeria actA/uvrAB CEA感染DCの能力の結果に基づいて決定される。
(1.生きたおよび十分に不活化されたListeria−CEA株で感染されたヒト未成熟DCの表現型およびサイトカイン分泌プロフィールの測定および比較。LPS、TNF−α、およびα−CD40のような通常に使用される活性化シグナルとListeria−感染ヒトDCの活性化との比較)
一次ヒトDCを感染し、それを活性化する、S−59/UVA不活化Listeria
actA/UVR AB CEA株の効率を特徴付け、それを最適化することができる。ヒトDCを、従前に記載されているように(Fongら、J.Virol.,76:11033−41(2002))、不動化末梢血液から豊富化する。簡単に述べれば、従前に記載されているように(Mayordomoら、Nat.Med.,1:1297−302(1995))、PBMCをFicoll−Hypaque(Pharmacia,Uppsala,スウェーデン国)上での遠心によって得、次いで、Percoll(Pharmacia)を通す密度遠心によって単球枯渇させる。単球−枯渇PBMCを、外因性サイトカインを添加しない、10%のプールしたヒトAB血清を補足したRPMI 1640(BioWhittaker,Walkersville,MD)中でインキュベートする。37℃における10%CO2を含む湿潤化インキュベーター中での24時間の培養の後、15%(w/v)メトリザミドグラジエント(Sigma,St.Louis,MO)を通す遠心によってDCをさらにリンパ球から豊富化する。豊富化されたDC集団の表現型はフローサイトメトリー(HLA−DA発現、およびCD3、CD14、CD19、およびCD56発現の欠如)およびデキストラン接種によって確認される。DCのListeriaでの感染性を評価するために、DCを、S−59/UVA不活化Listeria actA/uvrAB CEA株と共に異なるMOIにて1時間インキュベートする。生きたListeriaは比較として用いる。いずれの細胞外Listeriaも除去するための広範な洗浄の後、感染したDCを50μg/mLゲンタマイシンの存在下でさらにインキュベートして、細胞外細菌を死滅させる。DCのListeria ΔactAΔuvrAB CEA株での感染に際しての表現型変化を、感染後の異なる時点でフローサイトメトリーを用い、CD80、CD83、CD86、およびMHCクラスIIの細胞表面発現を測定することによって評価する。Tヘルパー−1およびTヘルパー−2タイプサイトカインの発現は、Cytometric Bead Array Kit(Pharmingen)を用いて、感染したDC培養の上澄みから測定する。感染および活性化条件は、LPS、TNF−α、およびα−CD40のような通常に使用される刺激体と比較する。インビトロでヒトDCの優れたかつ一定した刺激および活性化、ならびに親生Listeria株と最も似ているサイトカインの分泌をもたらす感染条件を選択する。もしサイトカインを用いることのない末梢血液から単離されたDCの総じての感染性が低ければ、密度勾配遠心に先立ってのDCの感染を評価する。さらに、単球−由来DCのようなDCのさらなる源は、生きていないおよび生きたListeriaに対するその感染性を評価する。簡単に述べれば、陰性選択を用いてヒト単球を豊富化し、1000U/mLのGM−CSFおよび1000U/mLのIL−4を補足した、1×106細胞/mLの培地(RPMI−1640+10%FCS)に懸濁させる。培養の6ないし7日後に、インビトロ培養したDC集団の表現型を、フローサイトメトリーおよびデキストラン摂取によって確認する。表現型の変化、ならびにListeria感染に際しての単球−由来DCのサイトカイン分泌パターンを従前に記載されているように評価する。
一次ヒトDCを感染し、それを活性化する、S−59/UVA不活化Listeria
actA/UVR AB CEA株の効率を特徴付け、それを最適化することができる。ヒトDCを、従前に記載されているように(Fongら、J.Virol.,76:11033−41(2002))、不動化末梢血液から豊富化する。簡単に述べれば、従前に記載されているように(Mayordomoら、Nat.Med.,1:1297−302(1995))、PBMCをFicoll−Hypaque(Pharmacia,Uppsala,スウェーデン国)上での遠心によって得、次いで、Percoll(Pharmacia)を通す密度遠心によって単球枯渇させる。単球−枯渇PBMCを、外因性サイトカインを添加しない、10%のプールしたヒトAB血清を補足したRPMI 1640(BioWhittaker,Walkersville,MD)中でインキュベートする。37℃における10%CO2を含む湿潤化インキュベーター中での24時間の培養の後、15%(w/v)メトリザミドグラジエント(Sigma,St.Louis,MO)を通す遠心によってDCをさらにリンパ球から豊富化する。豊富化されたDC集団の表現型はフローサイトメトリー(HLA−DA発現、およびCD3、CD14、CD19、およびCD56発現の欠如)およびデキストラン接種によって確認される。DCのListeriaでの感染性を評価するために、DCを、S−59/UVA不活化Listeria actA/uvrAB CEA株と共に異なるMOIにて1時間インキュベートする。生きたListeriaは比較として用いる。いずれの細胞外Listeriaも除去するための広範な洗浄の後、感染したDCを50μg/mLゲンタマイシンの存在下でさらにインキュベートして、細胞外細菌を死滅させる。DCのListeria ΔactAΔuvrAB CEA株での感染に際しての表現型変化を、感染後の異なる時点でフローサイトメトリーを用い、CD80、CD83、CD86、およびMHCクラスIIの細胞表面発現を測定することによって評価する。Tヘルパー−1およびTヘルパー−2タイプサイトカインの発現は、Cytometric Bead Array Kit(Pharmingen)を用いて、感染したDC培養の上澄みから測定する。感染および活性化条件は、LPS、TNF−α、およびα−CD40のような通常に使用される刺激体と比較する。インビトロでヒトDCの優れたかつ一定した刺激および活性化、ならびに親生Listeria株と最も似ているサイトカインの分泌をもたらす感染条件を選択する。もしサイトカインを用いることのない末梢血液から単離されたDCの総じての感染性が低ければ、密度勾配遠心に先立ってのDCの感染を評価する。さらに、単球−由来DCのようなDCのさらなる源は、生きていないおよび生きたListeriaに対するその感染性を評価する。簡単に述べれば、陰性選択を用いてヒト単球を豊富化し、1000U/mLのGM−CSFおよび1000U/mLのIL−4を補足した、1×106細胞/mLの培地(RPMI−1640+10%FCS)に懸濁させる。培養の6ないし7日後に、インビトロ培養したDC集団の表現型を、フローサイトメトリーおよびデキストラン摂取によって確認する。表現型の変化、ならびにListeria感染に際しての単球−由来DCのサイトカイン分泌パターンを従前に記載されているように評価する。
(2.インビトロで同種異系T細胞を活性化する、生きたまたは十分に不活化されたListeria−CEA株で感染させたヒト未成熟DCの刺激能力の測定および比較)
Listeria−感染DC集団の刺激能力に取り組むために、混合白血球反応(MLR)において一次アロー−反応性T細胞を刺激するその能力を測定することができる。その活性化/成熟化状態に依存する、インビボで免疫応答を誘導するAPCの相対的能力は、インビトロで同種異系T細胞応答を刺激するその能力によって反映されると広く信じられている(Jungら、Immunity,17:211(2002))。簡単に述べれば、DCを単離し、十分に不活化されたListeria actA/uvrAB CEAで感染させる。感染された細胞集団の表現型はフローサイトメトリーによって確認される。種々の数の照射された(3000rad)DCを、96−ウェルU−底部プレート中で5×104同種異系レスポンダーと共に培養する(Costar,Cambridge,MA)。ランダムドナーからのPBMCをレスポンダーとして用いる。6日後、培養を1μCiの[3H]チミジンで18時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、[3H]チミジンの取込を、シンチレーションカウンターで放射能を測定することによって決定する。生きていないListeriaで感染させたDCの刺激能力を、生きたListeriaで感染させたDC、ならびにLPS、TNF−α、およびα−CD40のような刺激体を用いて活性化されたDCと比較する。
Listeria−感染DC集団の刺激能力に取り組むために、混合白血球反応(MLR)において一次アロー−反応性T細胞を刺激するその能力を測定することができる。その活性化/成熟化状態に依存する、インビボで免疫応答を誘導するAPCの相対的能力は、インビトロで同種異系T細胞応答を刺激するその能力によって反映されると広く信じられている(Jungら、Immunity,17:211(2002))。簡単に述べれば、DCを単離し、十分に不活化されたListeria actA/uvrAB CEAで感染させる。感染された細胞集団の表現型はフローサイトメトリーによって確認される。種々の数の照射された(3000rad)DCを、96−ウェルU−底部プレート中で5×104同種異系レスポンダーと共に培養する(Costar,Cambridge,MA)。ランダムドナーからのPBMCをレスポンダーとして用いる。6日後、培養を1μCiの[3H]チミジンで18時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、[3H]チミジンの取込を、シンチレーションカウンターで放射能を測定することによって決定する。生きていないListeriaで感染させたDCの刺激能力を、生きたListeriaで感染させたDC、ならびにLPS、TNF−α、およびα−CD40のような刺激体を用いて活性化されたDCと比較する。
(3.インビトロでCEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞系を活性化するListeria−感染ヒトDC能力の評価。生きたまたは十分に不活化されたListeriaいずれかで感染された未成熟ヒトDCと、ペプチド−パルスドDCとの比較)
表現型の変化、サイトカイン分泌のプロフィール、ならびにDCのアロー−刺激能力は、インビボで抗原特異的T細胞応答を刺激するDCの能力についての間接的尺度を表す。十分に不活化されたListeria actA/uvrAB CEA株によって発現された組換え腫瘍抗原を発現するDCの能力は、L.Fongによって創製されたCEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞系の活性化に基づいて評価される(未公表データ)。簡単に述べれば、Milestone 3−1に記載されているように、HLA*A0201陽性ドナーの末梢血液からDCを単離する。最適条件下で感染させた種々の数の照射(3000rad)DCを、5×104CEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞と共に96−ウェルU−底プレート(Costar,Cambridge,MA)中で共培養した。24時間後、細胞上清を収集する。T細胞活性化を、IFN−γ、GM−CSF、またはIL−2分泌に基づいて測定する。分泌されたサイトカインを、商業的に入手可能なCytometric Bead Arrayキット(Pharmingen)を用いて測定する。生きていないListeriaで感染させたDCの刺激能力を生きたListeriaで感染させたDC、ならびにLPS、TNF−α、およびα−CD40のような刺激体を用いて活性化したDCと比較する。
表現型の変化、サイトカイン分泌のプロフィール、ならびにDCのアロー−刺激能力は、インビボで抗原特異的T細胞応答を刺激するDCの能力についての間接的尺度を表す。十分に不活化されたListeria actA/uvrAB CEA株によって発現された組換え腫瘍抗原を発現するDCの能力は、L.Fongによって創製されたCEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞系の活性化に基づいて評価される(未公表データ)。簡単に述べれば、Milestone 3−1に記載されているように、HLA*A0201陽性ドナーの末梢血液からDCを単離する。最適条件下で感染させた種々の数の照射(3000rad)DCを、5×104CEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞と共に96−ウェルU−底プレート(Costar,Cambridge,MA)中で共培養した。24時間後、細胞上清を収集する。T細胞活性化を、IFN−γ、GM−CSF、またはIL−2分泌に基づいて測定する。分泌されたサイトカインを、商業的に入手可能なCytometric Bead Arrayキット(Pharmingen)を用いて測定する。生きていないListeriaで感染させたDCの刺激能力を生きたListeriaで感染させたDC、ならびにLPS、TNF−α、およびα−CD40のような刺激体を用いて活性化したDCと比較する。
(実施例33)
(インビトロでCEA−特異的免疫性をプライムし、リードListeria株を選択する、Listeria−負荷一次ヒトDCの能力のさらなる開発のための確認)
S−59/UVA不活化Listeria−感染DCが、インビトロでナイーブなCEA−特異的CD8+T細胞応答をプライミングできることを確認するために、Listeria actA/uvrAB CEAで確立された最適条件下で感染させたヒト未成熟DCを用いて、インビトロでナイーブなT細胞を刺激する。天然または改変されたT細胞エピトープいずれかを含むリードListeria actA/uvrAB CEA株は、3つの独立したアッセイ:(1)DC−プライムしたT細胞培養の[3H]チミジン取込;(2)51Cr放出アッセイで測定された、プライムしたCEA−特異的T細胞培養の細胞傷害性活性;および(3)ペプチド:MHCテトラマー染色によって測定されたCEA−特異的T細胞の頻度によって測定して、ナイーブなCEA−特異的T細胞応答を誘導するその能力に基づいて選択される。最適感染をDCの表現型変化によって確認し、フローサイトメトリーを用いてCD80、CD83、CD86、およびMHCクラスIIの細胞表面発現、ならびに感染したDCによって分泌されたサイトカインプロフィールを測定することによって評価する。一次T細胞応答の誘導のために、一定数のCD45RA+Tリンパ球(2×105/ウェル)を種々の数の照射された(3,000R)Listeria−負荷DCとともに、96−ウェルの丸底マイクロタイタープレート中で7日間共インキュベートする。6日後、培養を1μCiの[3H]チミジンで18時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、[3H]チミジンの取込を、シンチレーションカウンター(Wallac,Turku,フィンランド国)で放射能を測定することによって決定する。さらに、CEA−特異的T細胞の誘導を細胞傷害性T細胞アッセイで評価する。簡単に述べれば、5×106CD45RA+Tリンパ球を平行して、5×106細胞/1.5ml培地にて、24−ウェルプレート(Costar)中で、10:1の比率で、照射された(3,000R)Listeria−負荷DCと共に培養する。T細胞の細胞傷害性活性は、7日後に、標準的な4時間51Cr−放出アッセイで評価する。簡単に述べれば、標的細胞系SW403、SW1417、A375、およびT2を250μCiの[51Cr]中で2時間インキュベートする。この標識工程の間に、T2細胞もまたHLA*0201−制限標的ペプチドCAP1およびCAP1−6D無くして、またはそれと共にインキュベートする。標的細胞系をRPMIで3回洗浄し、96−ウェルU−底プレート(Costar)中で少なくとも5,000標的/ウェルと共に三連で平板培養する。エフェクター細胞を記載されたエフェクター/標的比にて51Cr−標識標的細胞と共にインキュベートする。4時間の培養の後、上清を収集し、Microbetaカウンター(Wallac,Turku,フィンランド国)でカウントする。パーセント特異的溶解は、式:100%×(実験的放出−自然放出)/(最大放出−自然放出)によって計算される。最大放出は、0.5%トリトンX−100(Sigma)を含有するPBS中での標的細胞の溶解によって測定される。最後に、従前に記載されているように(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001)、CAP1またはCAP1−6Dを提示するMHC/テトラマーを用い、インビトロプライミングの後のCEA−特異的T細胞の頻度を測定することができる。インビトロプライミング前に得られた低温保存CD45RA+T細胞を、平行して、インビトロプライムした培養T細胞培養物で分析する。合計1×106細胞が、室温にて30分間で、対応するHLA*A0201フィコエリスリン−標識MHC/テトラマーで染色されるであろう。(陽性ゲートで用いられる)CD8、およびCD4、CD14、CD19、およびCD56(陰性「ダンプ」ゲート)に対する抗体を推奨される濃度で加え、4℃にて30分間インキュベートする。染色に続き、サンプルを2回洗浄し、4−色フローサイトメトリーで分析する。我々は、テトラマー染色のために以前バックグラウンドを確立した。20人のボランティア血液提供者を同一方法で評価し、彼らは、各々、CEA605−613および610Dテトラマーに対して0.30%±0.18%および0.27%±0.14%を有した(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001))。
(インビトロでCEA−特異的免疫性をプライムし、リードListeria株を選択する、Listeria−負荷一次ヒトDCの能力のさらなる開発のための確認)
S−59/UVA不活化Listeria−感染DCが、インビトロでナイーブなCEA−特異的CD8+T細胞応答をプライミングできることを確認するために、Listeria actA/uvrAB CEAで確立された最適条件下で感染させたヒト未成熟DCを用いて、インビトロでナイーブなT細胞を刺激する。天然または改変されたT細胞エピトープいずれかを含むリードListeria actA/uvrAB CEA株は、3つの独立したアッセイ:(1)DC−プライムしたT細胞培養の[3H]チミジン取込;(2)51Cr放出アッセイで測定された、プライムしたCEA−特異的T細胞培養の細胞傷害性活性;および(3)ペプチド:MHCテトラマー染色によって測定されたCEA−特異的T細胞の頻度によって測定して、ナイーブなCEA−特異的T細胞応答を誘導するその能力に基づいて選択される。最適感染をDCの表現型変化によって確認し、フローサイトメトリーを用いてCD80、CD83、CD86、およびMHCクラスIIの細胞表面発現、ならびに感染したDCによって分泌されたサイトカインプロフィールを測定することによって評価する。一次T細胞応答の誘導のために、一定数のCD45RA+Tリンパ球(2×105/ウェル)を種々の数の照射された(3,000R)Listeria−負荷DCとともに、96−ウェルの丸底マイクロタイタープレート中で7日間共インキュベートする。6日後、培養を1μCiの[3H]チミジンで18時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、[3H]チミジンの取込を、シンチレーションカウンター(Wallac,Turku,フィンランド国)で放射能を測定することによって決定する。さらに、CEA−特異的T細胞の誘導を細胞傷害性T細胞アッセイで評価する。簡単に述べれば、5×106CD45RA+Tリンパ球を平行して、5×106細胞/1.5ml培地にて、24−ウェルプレート(Costar)中で、10:1の比率で、照射された(3,000R)Listeria−負荷DCと共に培養する。T細胞の細胞傷害性活性は、7日後に、標準的な4時間51Cr−放出アッセイで評価する。簡単に述べれば、標的細胞系SW403、SW1417、A375、およびT2を250μCiの[51Cr]中で2時間インキュベートする。この標識工程の間に、T2細胞もまたHLA*0201−制限標的ペプチドCAP1およびCAP1−6D無くして、またはそれと共にインキュベートする。標的細胞系をRPMIで3回洗浄し、96−ウェルU−底プレート(Costar)中で少なくとも5,000標的/ウェルと共に三連で平板培養する。エフェクター細胞を記載されたエフェクター/標的比にて51Cr−標識標的細胞と共にインキュベートする。4時間の培養の後、上清を収集し、Microbetaカウンター(Wallac,Turku,フィンランド国)でカウントする。パーセント特異的溶解は、式:100%×(実験的放出−自然放出)/(最大放出−自然放出)によって計算される。最大放出は、0.5%トリトンX−100(Sigma)を含有するPBS中での標的細胞の溶解によって測定される。最後に、従前に記載されているように(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001)、CAP1またはCAP1−6Dを提示するMHC/テトラマーを用い、インビトロプライミングの後のCEA−特異的T細胞の頻度を測定することができる。インビトロプライミング前に得られた低温保存CD45RA+T細胞を、平行して、インビトロプライムした培養T細胞培養物で分析する。合計1×106細胞が、室温にて30分間で、対応するHLA*A0201フィコエリスリン−標識MHC/テトラマーで染色されるであろう。(陽性ゲートで用いられる)CD8、およびCD4、CD14、CD19、およびCD56(陰性「ダンプ」ゲート)に対する抗体を推奨される濃度で加え、4℃にて30分間インキュベートする。染色に続き、サンプルを2回洗浄し、4−色フローサイトメトリーで分析する。我々は、テトラマー染色のために以前バックグラウンドを確立した。20人のボランティア血液提供者を同一方法で評価し、彼らは、各々、CEA605−613および610Dテトラマーに対して0.30%±0.18%および0.27%±0.14%を有した(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001))。
(実施例34)
(異種抗原としてのプロテイナーゼ3またはPR1の使用)
前記した具体的な実施例で概説した手法のいくつかは、改変されたListeriaによって発現される抗原としてのCEA抗原の使用を記載するが、当業者であれば、同様な手法を用いて、プロテイナーゼ−3またはプロテイナーゼ−3由来抗原のような異なる抗原を発現する改変されたListeriaを調製して、インビトロまたはエキソビボで樹状細胞を感染させ、負荷および活性化/成熟化を行うことができるのは容易に認識するであろう。当業者であれば、次いで、得られたDCワクチンを動物または患者に投与して、プロテイナーゼ−3および/またはPR1に対する免疫応答を誘導することができるのも認識するであろう。
(異種抗原としてのプロテイナーゼ3またはPR1の使用)
前記した具体的な実施例で概説した手法のいくつかは、改変されたListeriaによって発現される抗原としてのCEA抗原の使用を記載するが、当業者であれば、同様な手法を用いて、プロテイナーゼ−3またはプロテイナーゼ−3由来抗原のような異なる抗原を発現する改変されたListeriaを調製して、インビトロまたはエキソビボで樹状細胞を感染させ、負荷および活性化/成熟化を行うことができるのは容易に認識するであろう。当業者であれば、次いで、得られたDCワクチンを動物または患者に投与して、プロテイナーゼ−3および/またはPR1に対する免疫応答を誘導することができるのも認識するであろう。
例えば、前記実施例に記載されたL4029−uvrAB Listeria株は、プロテイナーゼ−3遺伝子および/またはPR1エピトープをコードするpPL2ベクター骨格などを含むベクターで改変して、Listeriaのゲノムに抗原−発現配列を取り込むことができる。1つの例において、PR1抗原は、PR1エピトープが埋め込まれている、OVAに融合された切形LLO配列を含むLLO−OVA/PR1融合タンパク質のような融合タンパク質の一部として発現させることができる。改変されたListeriaによって発現され得る抗原性タンパク質(LLO−OVA/PR3)のような配列を図31に示す。
(実施例35)
(ファゴリソソームから逃避し、クラスI抗原提示を促進する突然変異体Listeriaの能力の測定)
抗原提示細胞のファゴリソソームを逃避し、該細胞によるクラスI抗原提示を促進する特定の候補突然変異体Listeriaの能力を評価するための例示的プロトコルは以下の通りである:まず、DC2.4細胞をカバーグラス上で増殖させる。次いで、細胞を所望のListeria株で感染させる(MOI=100)。0.5hpiにおいて、細胞を濯いで遊離Listeriaを洗浄除去する。1hpiにおいて、ゲンタマイシンを50μg/mLで加える。5hpiにおいて、カバーグラスを洗浄し、3.5%ホルムアルデヒド中で固定する。カバーグラスをブロックし、ウサギ−抗−Listeria抗体(Difco)で染色し、ヤギ−抗−ウサギFITC二次(Vector Labs)で検出する。アクチンをファロイジン−ローダミン(Molecular Probes)で検出する。カバーグラスをVectamount+DAPI(Vector Labs)で設置し、調査する。前記した実施例17および実施例25も参照されたし。
(ファゴリソソームから逃避し、クラスI抗原提示を促進する突然変異体Listeriaの能力の測定)
抗原提示細胞のファゴリソソームを逃避し、該細胞によるクラスI抗原提示を促進する特定の候補突然変異体Listeriaの能力を評価するための例示的プロトコルは以下の通りである:まず、DC2.4細胞をカバーグラス上で増殖させる。次いで、細胞を所望のListeria株で感染させる(MOI=100)。0.5hpiにおいて、細胞を濯いで遊離Listeriaを洗浄除去する。1hpiにおいて、ゲンタマイシンを50μg/mLで加える。5hpiにおいて、カバーグラスを洗浄し、3.5%ホルムアルデヒド中で固定する。カバーグラスをブロックし、ウサギ−抗−Listeria抗体(Difco)で染色し、ヤギ−抗−ウサギFITC二次(Vector Labs)で検出する。アクチンをファロイジン−ローダミン(Molecular Probes)で検出する。カバーグラスをVectamount+DAPI(Vector Labs)で設置し、調査する。前記した実施例17および実施例25も参照されたし。
(実施例36)
(ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびListeriaワクチンでの感染)
ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびListeriaワクチンでの感染のための例示的プロトコルの概略を以下に掲げる。
(ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびListeriaワクチンでの感染)
ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびListeriaワクチンでの感染のための例示的プロトコルの概略を以下に掲げる。
材料:ヒト末梢血液(血液提供者からのバフィコートが好ましい);Ficoll−Hypaque(Amersham);dPBSw/o Ca、Mg(MediaTech);RPMI−1640 w/L−グルタミン(MediaTech);胎児ウシ血清、明確化、加熱不活化(HyClone);ヒトGM−CSF(R&D Systems)−500U/μLで作成し、−20℃で貯蔵されたストック溶液;200U/μLで作成され、−20℃で貯蔵されたストック溶液;Costar 24−ウェルプレート(Fisher)。
単球単離培地(MIM):溶液1(Isosmotic Percoll)を作成するために、50mLのNaCl溶液(500mL dH2O、43.84gのNaCl(1.5M))を450mLのPercollに加え、混合する。溶液2(PBS/クエン酸塩)は、100mLのdH2O、205.6mgのNaH2PO4*2H2O(1.49mM)、1.30gのNa2HPO4(9.15mM))、8.18gのNaCl(139.97mM)、および3.82gのC6H5Na3O7*2H2O(13mM)を混合し、pHを7.2とすることによって調製される。次いで、250mLのisosmotic percollを250mLのPBS/クエン酸塩と混合する。溶液を滅菌濾過し、4℃で貯蔵する。
培養培地:RPMI−1640w.GlutaMax(Gibco)+10%胎児子牛血清(HyCloneからの明確化された加熱不活化FCSを用いる)。
方法:FicollおよびMIMを室温まで温める。20mLのFicollを250mL円錐試験管の各々に入れる。血液をdPBSで二倍希釈し、十分に混合する。25mLの血液を各試験管中のFicollの頂部に重ねる。試験管を18ないし20℃にて30分間、400×gにおいて遠心する。
単核界面中核をグラジエントから注意深く収集し、清浄な50mL試験管に入れる。試験管の残りをdPBSで満たす。試験管を100×gにて15分間遠心する。これはリンパ球および単球をペレット化するが、血小板を浮遊したままとする。上清を吸引する。試験管の残りにdPBSを満たし、遠心し、吸引する工程を、合計3回の洗浄の間に、さらに2回反復する。
ペレットを20mLのdPBSに再懸濁させる。懸濁液を20mLのMIMに重ねる。サンプルを室温にて35分間、400×gで遠心する。単球を界面から収集し、培養基を含有する清浄な試験管に移す。もし細菌と共に用いるためにDCを培養するならば、抗生物質を用いてはならない。
サンプルを400×gにて10分間遠心し、上清を吸引する。ペレットをdPBS中で4回洗浄する。最後の洗浄後、細胞ペレットをRPMI−1640+10%FCSに再懸濁する。次いで、トリパンブルーを用い、または自動カウンターを用いてヘマサイトメーターでサンプルをカウントする。細胞懸濁液をmL当たり1×106細胞まで希釈する。細胞懸濁液の各mLについて、500U GM−CSFおよび200U IL−4を加える(もしストックが前記したように作成されれば、各々のmL当たり1μL)。ウェル当たり1mLをCostar24−ウェルプレートに平板培養する。プレートを37℃、5%CO2、100%湿度に48時間置く。
2日目に、樹状細胞用のフィーディング培地を作成する。これは500U/mL GM−CSFおよび200U/Ml IL−4と共に、培養されたウェル当たり0.5mL培養基(用いる前に37℃まで加温)よりなり、各ウェルの頂部からの0.5mLを吸引し、0.5mLの新鮮なフィーディング培地と置き換える。プレートを37℃、5%CO2、100%湿度にさらに48時間置く。フィーディングを4日に反復する。5日に、細胞は用いる準備ができている。細胞は、常に、GM−CSFおよびIL−4含有培地中に維持しなければならず、あるいはそれをマクロファージに戻す。樹状細胞を、HLA−DR、CD1a、CD83、およびCD86を見るサイトメーターで表現型により調べる。
ヒトDCのListeria感染:
第5日樹状細胞(DC)をペレット化し、mL当たり2×106細胞にて、GM−CSFおよびIL−4を含む新鮮な培地に再懸濁させる。500μLの懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルに小分けする。成熟化刺激体または細菌を500μL中に加える。1μgのLPSを成熟化制御のために用いる(1000UのIFN−γまたは1μgのsCD40Lを加えて、この応答を高めることができる)。Listeria感染では、DC当たり10ないし100Listeriaの間を用いる。細胞を1時間感染し、次いで、細胞外細菌を洗浄して除去し、細胞を、50μg/mLゲンタマイシンを含有する培地に再懸濁させる。sCD40Lを加えて、DCの生存を増強させ、より大きなIL−12p70の放出を促進する。1000U/mLのIFN−γを加えて、成熟化およびIL−12p70分泌を高める。DCを、HLA−DR、CD1a、CD83、およびCD86を見るサイトメーターで表現型により調べる。
第5日樹状細胞(DC)をペレット化し、mL当たり2×106細胞にて、GM−CSFおよびIL−4を含む新鮮な培地に再懸濁させる。500μLの懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルに小分けする。成熟化刺激体または細菌を500μL中に加える。1μgのLPSを成熟化制御のために用いる(1000UのIFN−γまたは1μgのsCD40Lを加えて、この応答を高めることができる)。Listeria感染では、DC当たり10ないし100Listeriaの間を用いる。細胞を1時間感染し、次いで、細胞外細菌を洗浄して除去し、細胞を、50μg/mLゲンタマイシンを含有する培地に再懸濁させる。sCD40Lを加えて、DCの生存を増強させ、より大きなIL−12p70の放出を促進する。1000U/mLのIFN−γを加えて、成熟化およびIL−12p70分泌を高める。DCを、HLA−DR、CD1a、CD83、およびCD86を見るサイトメーターで表現型により調べる。
(実施例37)
(無胞子B.anthracisワクチン株)
spoIIEイン−フレーム欠失。B.anthracisのspoIIE領域は、B.subtilis中の同一遺伝子に対する相同性によって同定される。B.anthracis Spoiieのイン−フレーム欠失を単離するために、spoIIE遺伝子をまずPCRによって増幅し、それをpcr−Blunt II−TOPO(Invitrogen)にクローン化する。次に、spoIIE遺伝子のほとんどは、重複延長(SOE)による遺伝子スプライシングの技術を用いて欠失される(Hortonら、Biotechniques 8:528−35(1990))。このイン‐フレーム欠失spoIIE遺伝子を、クロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を担い、42℃では複製することができないシャトルベクターpKSV7にクローン化する(Smithら、Biochimie,74:705−11(1992)):次いで、欠失されたspoIIE遺伝子を含むpKSV7をB.anthracisにエレクトロポレーションし、細胞をクロラムフェニコールの存在下で42℃で増殖させて、プラスミドが相同組換えによってspoIIE遺伝子に組み込まれた株を選択する。クロラムフェニコール選択無しの30℃におけるさらなる増殖により、プラスミドが切り出され、喪失する。クロラムフェニコール−感受性株は少なくとも1%見出され、その約半分は欠失されたspoIIE対立遺伝子を含むはずである(Camilliら、(1993))。欠失の存在はPCRおよびサザーンブロット分析によって確認される。
(無胞子B.anthracisワクチン株)
spoIIEイン−フレーム欠失。B.anthracisのspoIIE領域は、B.subtilis中の同一遺伝子に対する相同性によって同定される。B.anthracis Spoiieのイン−フレーム欠失を単離するために、spoIIE遺伝子をまずPCRによって増幅し、それをpcr−Blunt II−TOPO(Invitrogen)にクローン化する。次に、spoIIE遺伝子のほとんどは、重複延長(SOE)による遺伝子スプライシングの技術を用いて欠失される(Hortonら、Biotechniques 8:528−35(1990))。このイン‐フレーム欠失spoIIE遺伝子を、クロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を担い、42℃では複製することができないシャトルベクターpKSV7にクローン化する(Smithら、Biochimie,74:705−11(1992)):次いで、欠失されたspoIIE遺伝子を含むpKSV7をB.anthracisにエレクトロポレーションし、細胞をクロラムフェニコールの存在下で42℃で増殖させて、プラスミドが相同組換えによってspoIIE遺伝子に組み込まれた株を選択する。クロラムフェニコール選択無しの30℃におけるさらなる増殖により、プラスミドが切り出され、喪失する。クロラムフェニコール−感受性株は少なくとも1%見出され、その約半分は欠失されたspoIIE対立遺伝子を含むはずである(Camilliら、(1993))。欠失の存在はPCRおよびサザーンブロット分析によって確認される。
spoIIE/uvrAB二重欠失株。spoIIE欠失株で開始し、uvrAおよびuvrB遺伝子のイン−フレーム欠失を行う。もう一度、注目する遺伝子を増幅し、pCR−Blunt II−TOPOにクローン化する。次いで、SOE技術によってuvrAおよびuvrB遺伝子のほとんどを欠失させるべきである。このイン−フレーム欠失uvrAB領域をpKSV7にクローン化し、構築体をB.anthracis spoIIE欠失株にエレクトロポレーションする。クロラムフェニコール−抵抗性を42℃で選択して、プラスミドのuvrAB領域への組込みにつき選択する。薬物選択無しの30℃における増殖を行って、プラスミドを喪失した分離体の増殖を促進する。クロラムフェニコール−感受性コロニーを拾い、PCRによってuvrAB領域の喪失につきテストし、その喪失はサザーンブロット分析によって確認されるであろう。
(実施例38)
(B.anthracisの温度感受性recA突然変異体)
30Cでよく増殖し、42Cでソラレンに対して非常に感受性であるB.anthracisの温度感受性recA突然変異体を作り出すために、E.coliの温度感受性recA突然変異体、recA44(Kawashimaら、193:288−92(1984))のV246M突然変異に類似した突然変異をB.anthracisで行う。B.anthracis突然変異体を作成するために、E.coliおよびB.anthracisの間で保存される配列245KVVKNK250(配列番号:46)を突然変異させる。V246M突然変異を、Stratagene Quick Changeキットを用い、ミスマッチしたオリゴヌクレオチド突然変異誘発によってクローン化B.anthracis recA遺伝子に導入する。突然変異は配列分析によって確認し、それを対立遺伝子交換によってB.anthracis spoIIE uvrABの染色体に導入することができるように、突然変異した遺伝子をpKSV7に導入する。別法として、B.anthracis株からのrecA遺伝子を欠失させ、E.coliのrecA44(ts)対立遺伝子で置き換える(B.anthracis recAはE.coli中で機能することが知られている(Koら、J.Bacteriol 184:3917−22(2002)))。
(B.anthracisの温度感受性recA突然変異体)
30Cでよく増殖し、42Cでソラレンに対して非常に感受性であるB.anthracisの温度感受性recA突然変異体を作り出すために、E.coliの温度感受性recA突然変異体、recA44(Kawashimaら、193:288−92(1984))のV246M突然変異に類似した突然変異をB.anthracisで行う。B.anthracis突然変異体を作成するために、E.coliおよびB.anthracisの間で保存される配列245KVVKNK250(配列番号:46)を突然変異させる。V246M突然変異を、Stratagene Quick Changeキットを用い、ミスマッチしたオリゴヌクレオチド突然変異誘発によってクローン化B.anthracis recA遺伝子に導入する。突然変異は配列分析によって確認し、それを対立遺伝子交換によってB.anthracis spoIIE uvrABの染色体に導入することができるように、突然変異した遺伝子をpKSV7に導入する。別法として、B.anthracis株からのrecA遺伝子を欠失させ、E.coliのrecA44(ts)対立遺伝子で置き換える(B.anthracis recAはE.coli中で機能することが知られている(Koら、J.Bacteriol 184:3917−22(2002)))。
(実施例39)
(B.anthracis抗原の活性部位への突然変異の導入)
致死因子突然変異H686Aはそのプロテアーゼ活性を不活化し、浮腫因子突然変異K346QおよびK353Qが(一緒になって)そのアデニルシクラーゼ活性を不活化する(Brossierら、Infect.Immun.,68:1781−6(2000))。これらの突然変異をB.anthracis株に導入して、spoIIE uvrABおよびspoIIE uvrAB recAts株のような、ワクチンで用いる。lef(致死因子)およびcya(浮腫因子、アデニルシクラーゼ)遺伝子をクローン化し、Quick Changeキット(Stratagene)で突然変異誘発して、突然変異体遺伝子を創製する。次いで、突然変異体遺伝子をpKSV7に移し、最終的に、対立遺伝子交換によって宿主pXO1プラスミドに導入する。
(B.anthracis抗原の活性部位への突然変異の導入)
致死因子突然変異H686Aはそのプロテアーゼ活性を不活化し、浮腫因子突然変異K346QおよびK353Qが(一緒になって)そのアデニルシクラーゼ活性を不活化する(Brossierら、Infect.Immun.,68:1781−6(2000))。これらの突然変異をB.anthracis株に導入して、spoIIE uvrABおよびspoIIE uvrAB recAts株のような、ワクチンで用いる。lef(致死因子)およびcya(浮腫因子、アデニルシクラーゼ)遺伝子をクローン化し、Quick Changeキット(Stratagene)で突然変異誘発して、突然変異体遺伝子を創製する。次いで、突然変異体遺伝子をpKSV7に移し、最終的に、対立遺伝子交換によって宿主pXO1プラスミドに導入する。
(実施例40)
(高レベルで保護抗原を発現するためのSOS調節配列の使用)
Cheoら(Cheoら、J.Bacteriol.,175:5907−15(1993))は、コンセンサス配列GAACN4GTTC(配列番号:47)が、B.subtilisのSOS応答において遺伝子のためのLexAレプレッサー部位を規定することを示している。SOSレギュロンの一部であるB.anthracis recAおよびuvrAB遺伝子のためのプロモーターの上流の同様なコンセンサス配列を位置させる。高レベルで保護抗原を発現するB.anthracis株を作成するために、保護抗原遺伝子をSOS調節配列の制御下に置き、ソラレンでの処置が高レベルの保護抗原を作るように、それをB.anthracis spoIIE uvrAB株に導入する。この人工遺伝子をB.anthracis染色体に挿入するために、pPL2のような組込みベクターを用いる(Lauerら、J.Bacteriol.,184:4177−86(2002))。注目する遺伝子、この場合には、プロモーターの制御下にある保護抗原遺伝子をマルチクローニング部位に挿入する。プラスミドはE.coliからB.anthracis株に接合させる。それはグラム−陽性菌では複製できないので、それは、染色体への組込みによって維持できるに過ぎない。現在のpPL2ベクターはL.monocytogenesからのファージインテグラーゼおよびファージ付着部位を含み、従って、L.monocytogenesファージインテグラーゼ遺伝子およびファージ付着部位を除去し、それらをガンマファージ(Brownら、J.Infect Dis.,96:34−9(1955))のようなB.anthracisのファージからの同様なエレメントで置き換えることによって改変されなければならない。また、pPL2ベクターは、典型的には、選択のためのクロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を含む。薬物抵抗性遺伝子は、ワクチンの働きでは望ましくないので、それは除去される。薬物抵抗性遺伝子の1つは、D−アラニンを合成し、D−アラニン栄養要求性突然変異体をD−アラニンの添加無くして豊富な培地で増殖させるD−アラニンラセマーゼについての遺伝子によって置き換えられている。他の薬物抵抗性遺伝子は、グルタミンを合成し、グルタミンを含まない豊富な培地でグルタミンシンテターゼ突然変異体細菌の増殖を可能とするグルタミンシンテターゼについての遺伝子によって置き換えられる。
(高レベルで保護抗原を発現するためのSOS調節配列の使用)
Cheoら(Cheoら、J.Bacteriol.,175:5907−15(1993))は、コンセンサス配列GAACN4GTTC(配列番号:47)が、B.subtilisのSOS応答において遺伝子のためのLexAレプレッサー部位を規定することを示している。SOSレギュロンの一部であるB.anthracis recAおよびuvrAB遺伝子のためのプロモーターの上流の同様なコンセンサス配列を位置させる。高レベルで保護抗原を発現するB.anthracis株を作成するために、保護抗原遺伝子をSOS調節配列の制御下に置き、ソラレンでの処置が高レベルの保護抗原を作るように、それをB.anthracis spoIIE uvrAB株に導入する。この人工遺伝子をB.anthracis染色体に挿入するために、pPL2のような組込みベクターを用いる(Lauerら、J.Bacteriol.,184:4177−86(2002))。注目する遺伝子、この場合には、プロモーターの制御下にある保護抗原遺伝子をマルチクローニング部位に挿入する。プラスミドはE.coliからB.anthracis株に接合させる。それはグラム−陽性菌では複製できないので、それは、染色体への組込みによって維持できるに過ぎない。現在のpPL2ベクターはL.monocytogenesからのファージインテグラーゼおよびファージ付着部位を含み、従って、L.monocytogenesファージインテグラーゼ遺伝子およびファージ付着部位を除去し、それらをガンマファージ(Brownら、J.Infect Dis.,96:34−9(1955))のようなB.anthracisのファージからの同様なエレメントで置き換えることによって改変されなければならない。また、pPL2ベクターは、典型的には、選択のためのクロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を含む。薬物抵抗性遺伝子は、ワクチンの働きでは望ましくないので、それは除去される。薬物抵抗性遺伝子の1つは、D−アラニンを合成し、D−アラニン栄養要求性突然変異体をD−アラニンの添加無くして豊富な培地で増殖させるD−アラニンラセマーゼについての遺伝子によって置き換えられている。他の薬物抵抗性遺伝子は、グルタミンを合成し、グルタミンを含まない豊富な培地でグルタミンシンテターゼ突然変異体細菌の増殖を可能とするグルタミンシンテターゼについての遺伝子によって置き換えられる。
(実施例41)
(例示的突然変異体B.anthracis株)
前記実施例に記載された方法の組合せを用い、種々の異なる突然変異体B.anthracis株を調製する。ワクチン組成物で用いるべき例示的突然変異体B.anthracis株を表26にリストする。
(例示的突然変異体B.anthracis株)
前記実施例に記載された方法の組合せを用い、種々の異なる突然変異体B.anthracis株を調製する。ワクチン組成物で用いるべき例示的突然変異体B.anthracis株を表26にリストする。
(表26 B.anthracis株および候補ワクチン)
1NER、ヌクレオチド切出修復
3lacI抑制可能プロモーターの制御下にある条件recA株も誘導される。
4HR、相同組換え
(実施例42)
(ソラレン−不活化B.anthracis株における、保護抗原およびカプセルを含めた、タンパク質発現レベルの特徴付け)
不活化B.anthracis株が依然として代謝することができるのを示すために、細胞を炭酸水素塩を含む最小培地中でインキュベートする(Thorneら、J.Gen.Microbiol.,17:505−16(1957))。そのようなインキュベーションの後、細胞を遠心によって除去し、上清を保存する。上清をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。クーマシーブルーでの染色の後、保護抗原が目立ち、その存在はウェスタンブロット分析(Brossierら、Infect.Immun.68:5731−4(2000))によって、および質量分析によって確認される。加えて、質量分析を用いて、Lenzら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,100:12432−12437(2003)に記載された方法を用い、これらの条件下で分泌される他のタンパク質を同定する。ポリグリタメートカプセルがこれらの条件下で作成されるかを評価するために、カプセル合成のための遺伝子をコードするpXO2を形質導入によって株に導入する(Greenら、Infect.Immun.,49:291−7(1985))。カプセルはロケット免疫電気泳動によって測定される(Uchidaら、Mol.Microbiol,23:1229−40(1997))。
3lacI抑制可能プロモーターの制御下にある条件recA株も誘導される。
4HR、相同組換え
(実施例42)
(ソラレン−不活化B.anthracis株における、保護抗原およびカプセルを含めた、タンパク質発現レベルの特徴付け)
不活化B.anthracis株が依然として代謝することができるのを示すために、細胞を炭酸水素塩を含む最小培地中でインキュベートする(Thorneら、J.Gen.Microbiol.,17:505−16(1957))。そのようなインキュベーションの後、細胞を遠心によって除去し、上清を保存する。上清をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。クーマシーブルーでの染色の後、保護抗原が目立ち、その存在はウェスタンブロット分析(Brossierら、Infect.Immun.68:5731−4(2000))によって、および質量分析によって確認される。加えて、質量分析を用いて、Lenzら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,100:12432−12437(2003)に記載された方法を用い、これらの条件下で分泌される他のタンパク質を同定する。ポリグリタメートカプセルがこれらの条件下で作成されるかを評価するために、カプセル合成のための遺伝子をコードするpXO2を形質導入によって株に導入する(Greenら、Infect.Immun.,49:291−7(1985))。カプセルはロケット免疫電気泳動によって測定される(Uchidaら、Mol.Microbiol,23:1229−40(1997))。
(実施例43)
(減弱化B.anthracis株で免疫化したSwiss WebsterおよびA/Jマウスにおける液性および粘膜応答の特徴付け)
マウス免疫化。マウスに筋肉内(IM)または皮下(SC)経路によってS−59/UVAワクチンを注射して、いずれの経路の免疫化が最良の細菌−特異的液性および細胞性応答をもたらすかを判断する。また、マウスの鼻孔内(IN)免疫化をテストして、候補ワクチンによって誘導された粘膜応答を評価する。5μlの設計されたワクチン製剤の、軽く麻酔したマウスの各鼻孔へのIN免疫化を従前に記載されているように行う(Boyakaら、J.Immunol.,170:5636−43(2003))。マウスを0.1 LD50用量の候補ワクチンで免疫化する。メジアン致死レベルが観察されない8つのS−59/UVA不活化ワクチン候補のいずれかを108粒子の初期用量で与える。1を超える経路によって免疫化されたマウスを、0.1 LD50用量を超えるか、あるいは108粒子よりも大きな組合せ用量で注射しない。複数免疫化を与えられたマウスは、全ての注射での終始一貫したワクチン用量を受け取る。S−59/UVA不活化Listeria uvrABでの3連続日での免疫化の結果、単一免疫化と比べて増大した液性および細胞性免疫がもたらされるので、同一戦略をB.anthracis株ワクチンで用いる。また、マウスには、一次免疫化後14日および28日にブースター免疫化を与える。
(減弱化B.anthracis株で免疫化したSwiss WebsterおよびA/Jマウスにおける液性および粘膜応答の特徴付け)
マウス免疫化。マウスに筋肉内(IM)または皮下(SC)経路によってS−59/UVAワクチンを注射して、いずれの経路の免疫化が最良の細菌−特異的液性および細胞性応答をもたらすかを判断する。また、マウスの鼻孔内(IN)免疫化をテストして、候補ワクチンによって誘導された粘膜応答を評価する。5μlの設計されたワクチン製剤の、軽く麻酔したマウスの各鼻孔へのIN免疫化を従前に記載されているように行う(Boyakaら、J.Immunol.,170:5636−43(2003))。マウスを0.1 LD50用量の候補ワクチンで免疫化する。メジアン致死レベルが観察されない8つのS−59/UVA不活化ワクチン候補のいずれかを108粒子の初期用量で与える。1を超える経路によって免疫化されたマウスを、0.1 LD50用量を超えるか、あるいは108粒子よりも大きな組合せ用量で注射しない。複数免疫化を与えられたマウスは、全ての注射での終始一貫したワクチン用量を受け取る。S−59/UVA不活化Listeria uvrABでの3連続日での免疫化の結果、単一免疫化と比べて増大した液性および細胞性免疫がもたらされるので、同一戦略をB.anthracis株ワクチンで用いる。また、マウスには、一次免疫化後14日および28日にブースター免疫化を与える。
PA、LF、EF、カプセルおよび全細菌に対する抗体の定量。種々のワクチン候補で免疫化したマウスにおける粘膜および抗体応答を特徴付ける。免疫化に先立って、ならびに免疫化から1週間後に、血清を眼窩後叢から採取する(我々は、週当たり1を超えず、交互の目から取るように、血液サンプリングに関してマウス当たりの最大5つの眼窩後叢手法のためのIACUUC認可を有する)。IgAレベルの測定のための唾液および鼻洗浄を最終免疫化から1週間後に犠牲時に行う。また、最終免疫化から45日後に候補ワクチンによって誘導された液性および粘膜免疫性の持続も特徴付ける。PA、カプセル、および栄養細菌(Sterne株)に対する液性および粘膜応答を、従前に公表されているように(Ballardら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:12531−4(1996);Rhieら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,100:10925−30(2003))、酵素結合イムノソルベント検定(ELISA)によって測定する。簡単に述べれば、Immulon96−ウェルMaxisorpプレート(Nalge Nunc)を、まず、従前に記載されているように(Rhieら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,100:10925−30(2003))、調製されたポリ−γ−グルタミン酸(PGA)カプセルと、または4℃にて16時間、50mM炭酸塩緩衝液(pH9.6)中で乳鉢および乳棒を用いて液体窒素下で粉砕し、TSTA緩衝液(50mMトリス[pH7.6]、142mM NaCl、0.05%アジ化ナトリウム、0.05%Tween20、2%ウシ血清アルブミン)でブロックしたS−59ソラレン/UVA不活化細菌と結合した5μg精製PA、LF、EF、BSAによって被覆する。マウス血漿または粘膜分泌物の系列二倍希釈を、各々、PA、PGA−BSA、またはSterneで被覆した96−ウェルプレートに添加する。固定化抗原へのAbsの結合は、Southern Biotechnology associates (Birmingham,AL)からのイソタイプ−特異的ペルオキシダーゼ・ヤギ抗−マウスμ、γまたはαH鎖−特異的抗体とのインキュベーションによって測定する。ビオチニル化ラット抗−マウスγ1(クローンG1−7.3)、γ2a(クローンR19−15)、γ2b(クローンR12−3)、またはγ3(クローンR40−82)H鎖−特異的mAbs(BD PharMingen,San Diego,CA)およびストレプトアビジン−結合ペルオキシダーゼをIgG Abサブクラス分析で用いる(Cole,J.Bacteriol.,107:846−52(1971);Coleら、Basic Life Sci.,5B:487−95(1975))。比色反応は、ABTS基質(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)の添加によって発色させる。終点力価は、log2希釈の逆数として表し、コントロールの非−免疫化マウスで得られたものを2標準偏差を超えるOD415を与える。
Ig−分泌細胞の検出のための酵素−結合イムノスポット(ELISPOT)アッセイ。PA−特異的Ig−分泌リンパ球の頻度はELISPOT分析によって測定される(Boyakaら、J.Immunol.,170:5636−43(2003))。簡単に述べれば、ワクチン接種およびコントロールマウスの脾臓または頸部リンパ節を迅速に切開し、氷冷RPMI 1640培地に入れ、単一細胞懸濁液を調製する。96−ウェルPVDF−系プレート(BD Biosciences,San Jose)を2.5μg/mlの精製されたPA(List Biological Laboratories,Campbell,CA)で一晩被覆する。プレートを洗浄し、37℃にて200μlの完全RPMIで2時間ブロックし、細胞懸濁液の系列希釈を96−ウェルプレートに加える。細胞を37℃にて5%CO2中で6時間平板培養する。抗原特異的抗体形成性細胞(AFC)を、イソタイプ−特異的ビオチン−標識抗−マウスμ、γまたはαH鎖−特異的抗体(Southern Biotechnology Associates)で検出する。2時間の室温でのインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ヤギ抗−ビオチン:1nm Goldコンジュゲート(GAB1;Ted Pella)を室温にて1時間加える。広範な洗浄の後、30μlの銀基質(Silver Enhancing Kit; Ted Pella)を各ウェルに加え、スポットの発生をモニターする。各ウェルにおけるスポットを、自動ELISPOTプレートリーダー(CTL,Cleveland)を用いてカウントする。液性応答は、106脾臓またはリンパ節細胞当たりの抗体形成性細胞の数として表される。
トキシン中和アッセイ。ワクチン候補で免疫化されたマウスで誘導された中和抗体を、致死トキシン(PA+LF)からJ774マクロファージ細胞系を保護する能力につき評価する(Mockら、Annu.Rev.Microbiol.,55:647−71(2001);Boyakaら(2003);Rhieら(2003))。簡単に述べると、J774細胞(ATCC,Manassus,VA)を5×104細胞/ウェルにて96−ウェル平坦−底プレート(Nunc)に加え、5%CO2中で37℃にて12時間インキュベートする。テスト血清または粘膜分泌物をTSTA緩衝液に系列的に二倍希釈する。PAおよびLF(400ng/mlのPAおよび40ng/mlのLF)を抗血清希釈物に加える。1時間のインキュベーションの後、抗血清/致死トキシン複合体混合物を細胞懸濁液に加え、さらに5時間インキュベートする。細胞生存性はMTTアッセイによってモニターする(540nmで測定された吸光度)。アッセイは各プレートに含まれた陰性コントロール(清浄な血清)および陽性コントロール(MAbs、14B7および1G3)(Mikesellら、Infect Immun.,39:371−6(1983);Starnbachら、Nature 9(2003))で三連にて行う。各三連サンプル希釈物の平均および標準偏差を計算する。終点は、清浄なコントロール血清と比較して、anthraxトキシンの50%中和を呈する最大血清希釈として表される。
(実施例44)
(改変されたB.anthracisでワクチン接種されたA/JマウスにおけるPA−、LF−、およびEF−特異的CD4+T細胞−媒介応答の特徴付け)
T細胞増殖。CD4+T細胞増殖は、ワクチン接種したおよびナイーブなA/JマウスのPBMC、脾臓およびリンパ節細胞から測定する。脾臓および頸部リンパ節を分散させて、従前に記載されたように単一細胞懸濁液を得る(Boyakaら、J.Immunol.,162:122−8(1999);Lillardら、J.Immunol.,166:162−169(2001);Littleら、Infect.Immuno.,65:5171−5(1997))。CD4+T細胞は、Miltenyi Biotec(Auburn,CA)からのマウスCD4+T細胞単離キットを用いて陰性選択によって単離する。プールされたリンパ節またはPBMCからの個々のマウス脾臓からの精製されたCD4+T細胞を4×106細胞/mlで培養し、完全RPMI(10%FBS、10mM Hepes、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、23.8mM炭酸水素ナトリウム、5×105−5Mのμ−メルカプトエタノール、100U/mlペニシリンおよび100Ug/mlストレプトマイシンを補足したRPMI)中のT−細胞−枯渇非−分裂同系間ナイーブ脾臓フィーダー細胞(8×106細胞/ml)の存在下で種々の濃度のPA、LFまたはEFで刺激する。脾臓フィーダー細胞の複製は、S−59ソラレンでの軽い光化学処理によって阻止される。最終18ないし20時間の0.5μCiのトリチウム化チミジン([3H]TdR)の添加に先立って、培養物を37℃および5%CO2において4日間インキュベートする。細胞をガラス繊維シートに収集し、取り込まれたチミジンの量を、シンチレーションカウンター(Wallac,Turku,フィンランド国)にて放射能を測定することによって決定する。
(改変されたB.anthracisでワクチン接種されたA/JマウスにおけるPA−、LF−、およびEF−特異的CD4+T細胞−媒介応答の特徴付け)
T細胞増殖。CD4+T細胞増殖は、ワクチン接種したおよびナイーブなA/JマウスのPBMC、脾臓およびリンパ節細胞から測定する。脾臓および頸部リンパ節を分散させて、従前に記載されたように単一細胞懸濁液を得る(Boyakaら、J.Immunol.,162:122−8(1999);Lillardら、J.Immunol.,166:162−169(2001);Littleら、Infect.Immuno.,65:5171−5(1997))。CD4+T細胞は、Miltenyi Biotec(Auburn,CA)からのマウスCD4+T細胞単離キットを用いて陰性選択によって単離する。プールされたリンパ節またはPBMCからの個々のマウス脾臓からの精製されたCD4+T細胞を4×106細胞/mlで培養し、完全RPMI(10%FBS、10mM Hepes、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、23.8mM炭酸水素ナトリウム、5×105−5Mのμ−メルカプトエタノール、100U/mlペニシリンおよび100Ug/mlストレプトマイシンを補足したRPMI)中のT−細胞−枯渇非−分裂同系間ナイーブ脾臓フィーダー細胞(8×106細胞/ml)の存在下で種々の濃度のPA、LFまたはEFで刺激する。脾臓フィーダー細胞の複製は、S−59ソラレンでの軽い光化学処理によって阻止される。最終18ないし20時間の0.5μCiのトリチウム化チミジン([3H]TdR)の添加に先立って、培養物を37℃および5%CO2において4日間インキュベートする。細胞をガラス繊維シートに収集し、取り込まれたチミジンの量を、シンチレーションカウンター(Wallac,Turku,フィンランド国)にて放射能を測定することによって決定する。
PA−、EF−またはLF−誘導サイトカイン応答の分析。CD4+T細胞を、Miltenyi Biotec (Auburn,CA)からのマウスCD4+T細胞単離キットを用いて陰性選択によって単離する。個々のマウスの脾臓またはリンパ節からの精製されたCD4+T細胞を、1×105細胞/ウェルにて、丸底96−ウェルプレート中で培養し、完全RPMI中、T細胞−枯渇、非−分裂同系間ナイーブ脾臓フィーダー細胞(1×105細胞/ウェル)の存在下で種々の濃度のPA、LFまたはEFで刺激する。T細胞−枯渇脾臓フィーダー細胞を、S−59での軽い光化学処理によって阻止する。T細胞培養は37℃および5%CO2において2日間インキュベートする。Tヘルパー−1およびTヘルパー−2サイトカインの発現は、Th1/Th2 Cytometric Bead Arrayキット(BD Pharmingen,San Diego,CA)を用い、抗原−刺激CD4+T細胞の上清から側定する。
(実施例44)
(改変されたB.anthracisワクチンでの最後の免疫化用量から45日後におけるSwiss WebsterおよびA/Jマウスにおける胞子および致死トキシン挑戦に対する保護の程度の特徴付け)
致死トキシン挑戦に対するマウスの保護。選択された候補ワクチンで免疫化されたマウスを、従前に記載されているごとく(Priceら、Infect.Immun.,69:4509−15(2001);Rhieら(2003))、致死トキシンでの尾静脈注射によって挑戦する。致死トキシンは、記載されているごとく(Rhieら(2003))、組換えPAおよびNF組換えタンパク質(List Biological Laboratories,Campbell,CA)を混合することによって調製される。マウス当たりの致死トキシンIV LD50は6μgのLFと混合したほぼ12μgのPAである。新たに調製された致死トキシンのマウスにおけるメジアン致死性は、公表された値の0.1ないし10のLD50用量範囲にわたる尾静脈注射によって測定される。保護実験は、同様に、LD50用量の5ないし10倍の範囲にわたる致死トキシン挑戦を含む。このモデルにおいては、未保護マウスは24時間以内に死亡する。最初に、anthraxによる死亡は、トリプシンソイ寒天上で血液を平板培養し、37℃にて一晩インキュベートすることによって選択されたマウスで確認される。平板を、2ないし3mmの典型的なanthracis−様「すりガラス」外観を持つコロニーにつき観察する。致死トキシンで処理した全てのマウスは毎日モニターし、2週間後に実験を停止し、全ての保護マウスを犠牲にする。
(改変されたB.anthracisワクチンでの最後の免疫化用量から45日後におけるSwiss WebsterおよびA/Jマウスにおける胞子および致死トキシン挑戦に対する保護の程度の特徴付け)
致死トキシン挑戦に対するマウスの保護。選択された候補ワクチンで免疫化されたマウスを、従前に記載されているごとく(Priceら、Infect.Immun.,69:4509−15(2001);Rhieら(2003))、致死トキシンでの尾静脈注射によって挑戦する。致死トキシンは、記載されているごとく(Rhieら(2003))、組換えPAおよびNF組換えタンパク質(List Biological Laboratories,Campbell,CA)を混合することによって調製される。マウス当たりの致死トキシンIV LD50は6μgのLFと混合したほぼ12μgのPAである。新たに調製された致死トキシンのマウスにおけるメジアン致死性は、公表された値の0.1ないし10のLD50用量範囲にわたる尾静脈注射によって測定される。保護実験は、同様に、LD50用量の5ないし10倍の範囲にわたる致死トキシン挑戦を含む。このモデルにおいては、未保護マウスは24時間以内に死亡する。最初に、anthraxによる死亡は、トリプシンソイ寒天上で血液を平板培養し、37℃にて一晩インキュベートすることによって選択されたマウスで確認される。平板を、2ないし3mmの典型的なanthracis−様「すりガラス」外観を持つコロニーにつき観察する。致死トキシンで処理した全てのマウスは毎日モニターし、2週間後に実験を停止し、全ての保護マウスを犠牲にする。
胞子調製。Sterne株胞子を記載されているように調製する(Barnard and Friedlander,1999)。簡単に述べると、100ml瓶に含有され、37℃にて5時間振盪された5mlのFA培地(3.3%トリプトン、2%酵母エキス[水に対して一晩透析]、0.2%L−ヒスチジン、0.8%Na2HPO4、0.4%KH2PO4、0.74%NaCl)に単一コロニーを接種する。1/10ミリリットルのアリコットをL寒天プレート上に広げ、37℃にてインキュベートする。菌叢をプレートから掻き取り、滅菌水で十分に洗浄し、60℃にて30分間加熱ショックを与え、水で洗浄し、従前に記載されているように(Paluckaら、Nature Medicine 5:868−870(1999))、水中の58%Renografin−76(Bristol−Myers Squibb,Princeton,N.J.)上で精製し、次いで、水でもう1回洗浄する。次いで、胞子を10,000×gにてペレットに沈積させ、水中の1%フェノールに再懸濁させる。このプロセスのこの収率はプレート当たり0.5×109ないし5.0×109胞子の範囲であると公表されている。
致死胞子挑戦に対するマウスの保護。筋肉内(IM)注射によって与えられる加熱−ショックSterne株胞子のLD50値は、103ないし108胞子の用量範囲にわたって決定する。吸入anthraxに対するワクチン接種マウスにおける保護を評価するために、従前に記載されているように(Brookら、J.Med.Microbiol.,50:702−11(2001))、気管内(IT)胞子投与によって挑戦実験を行う。簡単に述べれば、固定化し麻酔したマウスの舌をピンセットで外方向かつ横方向に軽く引き、先端からほぼ1インチわずかな角度だけ曲げた平滑1.5インチ22−ゲージ針を嵌合させたシリンジを用いてワクチンを送達する。我々は、IMまたはIT経路によって投与されたSterne株LD50値はA/Jマウスにおいてほぼ103であり、Swiss Websterマウスにおいては10倍高いまでであると予測する。保護実験は100LD50用量胞子挑戦までを含む。胞子で処理した全てのマウスを毎日モニターし、実験は2週間後に停止し、全ての保護されたマウスを犠牲にする。全ての挑戦実験において、死亡までの平均時間は非−生存群において決定する。
(実施例45)
(マウスにおけるOVAモデル抗原を発現するワクシニアでの挑戦に対するListeriaワクチンの保護免疫)
本発明のワクチンは、Listeria挑戦に対して保護的免疫化を示す。病原体に対して免疫化し、保護する能力をさらに説明するために、OVA抗原を含むまたは含まない、およびS−59UVA処理(前記実施例13の第二の方法)の有りおよび無しにてのListeriaワクチンの方法を用いて、もう1つの微生物、例えば、OVA抗原を発現するワクシニアウイルス(VV−OVA)に対して免疫化する。これは、他の微生物に対する抗原特異的免疫化がListeriaワクチンで達成できることを示す。
(マウスにおけるOVAモデル抗原を発現するワクシニアでの挑戦に対するListeriaワクチンの保護免疫)
本発明のワクチンは、Listeria挑戦に対して保護的免疫化を示す。病原体に対して免疫化し、保護する能力をさらに説明するために、OVA抗原を含むまたは含まない、およびS−59UVA処理(前記実施例13の第二の方法)の有りおよび無しにてのListeriaワクチンの方法を用いて、もう1つの微生物、例えば、OVA抗原を発現するワクシニアウイルス(VV−OVA)に対して免疫化する。これは、他の微生物に対する抗原特異的免疫化がListeriaワクチンで達成できることを示す。
OVAを発現するワクシニアウイルス(WR株)はLa Jolla Research Instituteから入手し、Opticellチャンバー(BioCrystal,OH)を用いてVero細胞中で調製する。Opticellチャンバーを、L−グルタミン、P/S(ペニシリン/ストレプトマイシン)、NEAA(非−必須アミノ酸)、NaHCO3、および10%FBSを補足したイーグルの最小必須培地中のVero細胞で接種する。細胞がほぼ75%密集となれば、増殖培地を取り出し、1×105PFU/mLのVV−OVAを含有する新鮮な培地で置き換える。単層が>50%細胞病理効果を示せば、細胞および上清を収集し、3凍結−解凍サイクルに付し、清澄化し、−80℃にて貯蔵する。力価はVero−76細胞でのプラークアッセイによって測定する。ワクチンによるオボアルブミン発現は、マウスへの注射に先立ってウェスタンブロット分析によって確認する。
C57B1/6マウス(群当たり3)を表27に従ってIVワクチン接種し、1×107PFUのVV−OVAのIP注射で7日に挑戦する。12日に、マウスを安楽死させ、卵巣を収集し、肉眼での病理学につき観察する。また、卵巣をワクシニアプラーク形成単位につきアッセイする。個々のマウスからの対となった卵巣を1mLの緩衝液中でホモゲナイズし、凍結(液体窒素)し、各サイクルの間は渦巻かせつつ、3サイクルだけ解凍(37℃)し、次いで、−80℃にて貯蔵する。アッセイをするために、サンプルを解凍し、4℃にて遠心してデブリスを除去し、Vero細胞への適用のために系列希釈する。Vero−76細胞を6−ウェル組織培養プレート中で平板培養する。細胞単層が約70ないし85%の密集に到達すると、培地を各ウェルから吸引し、細胞を、卵巣ホモゲネート調製物の適当な希釈1mLを接種する。少なくとも1時間後、培地を吸引し、3mLの1:1 2×増殖培地:1.5%アガロースで置き換える。プラークを培養から3ないし4日後に数える。
(表27 OVAを発現し、かつOVAを発現するワクシニアで攻撃したListeria monocytogenesでのマウスのワクチン接種)
*初期用量、1日および2日用量は10倍より低い。全ての用量100μL HBSS。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および(ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列双方を含めた)受託番号は、全ての目的で、ここに引用して、その全体を、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個々に引用により一体化されるように示されるのと同程度援用される。
Claims (103)
- 自由生活微生物を含むワクチンであって、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、ワクチン。
- 前記核酸標的化化合物が、核酸アルキル化剤である、請求項1に記載のワクチン。
- 前記核酸アルキル化剤が、β−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである、請求項2に記載のワクチン。
- 前記核酸標的化化合物が照射によって活性化される、請求項1に記載のワクチン。
- 前記核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されたソラレン化合物である、請求項4に記載のワクチン。
- 前記核酸標的化化合物が、4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである、請求項5に記載のワクチン。
- 前記微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含む、請求項1に記載のワクチン。
- 前記微生物が、DNA修復酵素に関して欠損がある、請求項7に記載のワクチン。
- 前記遺伝的突然変異が、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子内にあるか、またはphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子の機能的等価物内にある、請求項8に記載のワクチン。
- 前記微生物が、uvrAおよびuvrBの双方における遺伝的突然変異か、またはuvrAおよびuvrB双方の機能的等価物における遺伝的突然変異を含む、請求項9に記載のワクチン。
- RecA、またはRecAの機能的等価物に関して欠損がある、請求項8に記載のワクチン。
- 前記微生物が細菌である、請求項1に記載のワクチン。
- 前記微生物が、Mycobacterium tuberculosisである、請求項12に記載のワクチン。
- 前記微生物が、Bacillus anthracisである、請求項12に記載のワクチン。
- 前記微生物が、Listeria monocytogenesである、請求項12に記載のワクチン。
- 前記微生物が、uvrAおよびuvrB双方における少なくとも1つの突然変異を含む、請求項15に記載のワクチン。
- 前記微生物が、さらに、actA遺伝子、inlB遺伝子、または双方の遺伝子における突然変異を含む、請求項16に記載のワクチン。
- 前記微生物が、抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項1に記載のワクチン。
- 前記ワクチンが、さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む、請求項1に記載のワクチン。
- 宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項1に記載のワクチンを含む、組成物。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項1に記載のワクチンを含み、ここで前記微生物が該抗原を発現する、組成物。
- 自由生活微生物を含む単離されたプロフェッショナル抗原提示細胞であって、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、細胞。
- 樹状細胞である、請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記核酸標的化化合物が、核酸アルキル化剤である、請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記核酸アルキル化剤が、β−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである、請求項24に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記核酸標的化化合物が、照射によって活性化される、請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されたソラレン化合物である、請求項26に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記核酸標的化化合物が、4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである、請求項27に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、改変されているその核酸を修復する該微生物の能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、DNA修復酵素に関して欠損がある、請求項29に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記遺伝子突然変異が、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子内にあるか、またはphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子の機能的等価物内にある、請求項30に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、uvrAおよびuvrB双方における遺伝的突然変異か、またはuvrAおよびuvrB双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む、請求項31に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、RecA、またはRecAの機能的等価物に関して欠損がある、請求項31に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が細菌である、請求項23に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、Mycobacterium tuberculosisである、請求項34に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、Listeria monocytogenesである、請求項34に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、uvrAおよびuvrB双方における少なくとも1つの突然変異を含む、請求項32に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、ワクチン。
- 宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、組成物。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含み、ここで、前記微生物が該抗原をコードする核酸配列を含む、組成物。
- インビトロにおいてナイーブなT細胞を活性化する方法であって、該ナイーブなT細胞を活性化するのに適当な条件下で、かつそれに十分な時間の間、該ナイーブなT細胞と請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させる工程を包含する、方法。
- プロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷する方法であって、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下で、かつそれに十分な時間の間、インビトロにおいて該プロフェッショナル抗原提示細胞と該抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させる工程を包含し、ここで、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、方法。
- プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化および/または成熟させる方法であって、
プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化させ、および/または成熟させるのに適当な条件下で、かつそれに十分な時間の間、インビトロにおいて該プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させる工程を包含し、ここで、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、方法。 - 宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含み、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、組成物。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、プロフェッショナル抗原提示細胞と該抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含み、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、組成物。
- 単離された突然変異体Listeria monocytogenes株であって、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体株。
- 少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある、請求項47に記載の突然変異体株。
- UvrA、UvrB、またはUvrAおよびUvrB双方に関して減弱されている、請求項47に記載の突然変異体株。
- uvrA遺伝子、uvrB遺伝子、またはuvrA遺伝子およびuvrB遺伝子双方における遺伝子突然変異体を含む、請求項49に記載の突然変異体株。
- 前記株の細菌の核酸が、該細菌が増殖について減弱されるように改変されている、請求項47に記載の突然変異体株。
- American Type Culture Collection (ATCC)に寄託され、受託番号PTA−5563によって同定されるListeria monocytogenes actA−/uvrAB−株、またはUvrA、UvrB、およびActAに関して欠損がある、該寄託された株の突然変異体よりなる群から選択される、請求項47に記載の突然変異体株。
- American Type Culture Collection (ATCC)に寄託され、受託番号PTA−5562によって同定されるListeria monocytogenes actA−/inlB−株である、請求項52に記載の突然変異体株。
- ワクチンであって、(a)請求項47に記載の突然変異体株、および(b)薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む、ワクチン。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、請求項47に記載の株の有効量を含み、ここで、該株が該抗原をコードする核酸分子を含む、組成物。
- 宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、請求項47に記載の株の有効量を含む、組成物。
- 請求項47に記載の株を含む、プロフェッショナル抗原提示細胞。
- 単離された突然変異体Bacillus anthracis株であって、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体株。
- 少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある、請求項58に記載の突然変異体株。
- UvrA、UvrB、またはUvrAおよびUvrB双方に関して減弱されている、請求項59に記載の突然変異体株。
- uvrA遺伝子、uvrB遺伝子、またはuvrA遺伝子およびuvrB遺伝子双方における遺伝子突然変異を含む、請求項60に記載の突然変異体株。
- 前記株の毒性を低下させるlef遺伝子、cya遺伝子、または双方の遺伝子における1以上の突然変異を含む、請求項58に記載の突然変異体株。
- 前記株の細菌の核酸が、該細菌が増殖について減弱されるように改変されている、請求項58に記載の突然変異体株。
- 宿主においてBacillus anthracis抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、請求項58に記載の突然変異体株の有効量を含む、組成物。
- 宿主においてBacillus anthracis感染を予防または処置するための組成物であって、請求項58に記載の突然変異体株の有効量を含む、組成物。
- ワクチンであって、少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物を含む、ワクチン。
- 前記微生物が、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子内における遺伝子突然変異か、またはphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子の機能的等価物内における遺伝子突然変異を含む、請求項66に記載のワクチン。
- 前記微生物が、uvrAおよびuvrB双方における遺伝子突然変異か、またはuvrAおよびuvrB双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む、請求項67に記載のワクチン。
- RecA、またはRecAの機能的等価物に関して欠損がある、請求項66に記載のワクチン。
- 前記微生物が細菌である、請求項66に記載のワクチン。
- 前記微生物が、抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項66に記載のワクチン。
- 前記ワクチンが、さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む、請求項66に記載のワクチン。
- 宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項66に記載のワクチンを含む、組成物。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項66に記載のワクチンを含み、ここで、該微生物が該抗原を発現する、組成物。
- 少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物を含む、単離されたプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子内においてか、またはphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecAよりなる群から選択される1以上の遺伝子の機能的等価物内において遺伝子突然変異を含む、請求項75に記載の抗原提示細胞。
- 前記微生物が、uvrAおよびuvrB双方における遺伝子突然変異か、またはuvrAおよびuvrB双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む、請求項76に記載の抗原提示細胞。
- RecA、またはRecAの機能的等価物に関して欠損がある、請求項75に記載の抗原提示細胞。
- 前記微生物が細菌である、請求項75に記載の抗原提示細胞。
- 前記微生物が、抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項75に記載の抗原提示細胞。
- 宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項75に記載の抗原提示細胞を含む、組成物。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項75に記載の抗原提示細胞を含み、ここで、該微生物が該抗原を発現する、組成物。
- 医療用途のための自由生活微生物であって、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、微生物。
- 医療用途のための抗原提示細胞であって、該抗原提示細胞が、自由生活微生物を含み、ここで、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、抗原提示細胞。
- 医療用途のための突然変異体Listeria monocytogenes株であって、該突然変異体Listeria monocytogenes株が、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体株。
- 医療用途のための自由生活微生物であって、該微生物が、少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある、微生物。
- Bacillus anthracisまたはListeria monocytogenesである、請求項86に記載の微生物。
- 医療用途のための抗原提示細胞であって、該抗原提示細胞が、自由生活微生物を含み、ここで、該微生物が、少なくとも1つのDNA修復酵素に関して欠損がある、抗原提示細胞。
- キットであって、以下:(a)請求項47に記載の突然変異体Listeria monocytogenes株、請求項58に記載の突然変異体Bacillus anthracis株または自由生活微生物を含む組成物であって、ここで、該自由生活微生物の核酸が、核酸標的化化合物との反応によって改変されている、組成物;および(b)宿主における疾患の予防または処置における該組成物の使用のための指示書、の両方を含む、キット。
- 宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項1に記載のワクチンの有効量の使用。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項1に記載のワクチンの有効量の使用。
- 宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞の有効量の使用。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項22に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞の有効量の使用であって、ここで、微生物が該抗原をコードする核酸配列を含む、使用。
- 宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞の使用であって、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、使用。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞の使用であって、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、使用。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項47に記載の株の有効量の使用であって、ここで、該株は該抗原をコードする核酸配列を含む、使用。
- 宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項47に記載の株の有効量の使用。
- 宿主においてBacillus anthracis抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項58に記載の突然変異体株の有効量の使用。
- 宿主においてBacillus anthracis感染を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項58に記載の突然変異体株の有効量の使用。
- 宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項66に記載のワクチンの有効量の使用。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項66に記載のワクチンの有効量の使用であって、ここで、微生物が該抗原を発現する、使用。
- 宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項75に記載の抗原提示細胞の有効量の使用。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項75に記載の抗原提示細胞の有効量の使用であって、ここで、微生物が該抗原を発現する、使用。
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US20070207171A1 (en) * | 2006-03-01 | 2007-09-06 | Cerus Corporation | Engineered listeria and methods of use thereof |
EP1991263B8 (en) | 2006-03-01 | 2015-02-25 | Aduro Biotech | Engineered listeria and methods of use thereof |
US7935804B2 (en) | 2006-03-01 | 2011-05-03 | Aduro Biotech | Engineered Listeria and methods of use thereof |
CA2645766A1 (en) | 2006-04-10 | 2007-10-25 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Immunogenic wt-1 peptides and methods of use thereof |
CA2651962A1 (en) * | 2006-05-12 | 2007-12-21 | Oklahoma Medical Research Foundation | Anthrax compositions and methods of use and production |
US8926993B2 (en) * | 2006-07-17 | 2015-01-06 | Aduro Biotech | Methods and compositions using Listeria for enhancing immunogenicity by prime boost |
ES2603418T3 (es) * | 2006-10-04 | 2017-02-27 | Janssen Pharmaceutica Nv | Preparación de células presentadoras de antígeno artificial inactivado y su uso en terapias celulares |
US8452541B2 (en) * | 2007-06-18 | 2013-05-28 | Microsoft Corporation | Vaccine design methodology |
CA2694457A1 (en) * | 2007-07-24 | 2009-01-29 | Ingrid Jolanda Monique De Vries | Compositions and methods for generating an immune response in a subject |
JP2011523553A (ja) | 2008-05-19 | 2011-08-18 | アデュロ バイオテック | PrfA*変異株リステリアを含む組成物およびその使用法 |
JP5977737B2 (ja) | 2010-05-23 | 2016-08-24 | アデュロ バイオテック | 癌の補助薬物療法でリステリアを使用する方法および組成物 |
US20130101614A1 (en) | 2010-06-15 | 2013-04-25 | The Regents Of The University Of California | Novel live recombinant booster vaccine against tuberculosis |
WO2012033714A2 (en) * | 2010-09-07 | 2012-03-15 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Cells for chromatin immunoprecipitation and methods for making |
DK2640842T3 (en) | 2010-11-17 | 2018-08-13 | Aduro Biotech Inc | Methods and compositions for inducing an immune response to EGFRVIII |
EP2683400A4 (en) | 2011-03-11 | 2014-09-17 | Advaxis | ADJUVANZIA ON LISTERIA BASE |
EP2802347B1 (en) | 2012-01-13 | 2019-01-09 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Immunogenic wt-1 peptides and methods of use thereof |
SG11201405605VA (en) | 2012-03-12 | 2014-10-30 | Advaxis Inc | SUPPRESSOR CELL FUNCTION INHIBITION FOLLOWING <i>LISTERIA</i> VACCINE TREATMENT |
US10815273B2 (en) | 2013-01-15 | 2020-10-27 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof |
US9919037B2 (en) | 2013-01-15 | 2018-03-20 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof |
CN107250366A (zh) | 2014-10-14 | 2017-10-13 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 重组李斯特菌疫苗菌株及其用于癌症免疫疗法的方法 |
WO2016073381A1 (en) | 2014-11-03 | 2016-05-12 | Cerus Corporation | Compositions and methods for improved car-t cell therapies |
BR112017022076A2 (pt) | 2015-04-13 | 2018-08-14 | Aduro Biotech, Inc. | fusões de mesotelina-variante iii de receptor de fator de crescimento epidérmico e métodos de uso das mesmas |
AU2016247894A1 (en) | 2015-04-13 | 2017-10-26 | Aduro Biotech, Inc. | Immunogenic fusion proteins for the treatment of cancer |
US11096963B2 (en) | 2015-06-26 | 2021-08-24 | Cerus Corporation | Cryoprecipitate compositions and methods of preparation thereof |
ES2972443T3 (es) | 2015-10-23 | 2024-06-12 | Cerus Corp | Plasma pobre en crioprecipitado inactivado para patógenos y métodos de uso del mismo |
AU2016369519B2 (en) | 2015-12-16 | 2023-04-20 | Gritstone Bio, Inc. | Neoantigen identification, manufacture, and use |
EP3589297A1 (en) | 2017-03-03 | 2020-01-08 | Cerus Corporation | Kits and methods for preparing pathogen-inactivated platelet compositions |
AU2018283402A1 (en) * | 2017-06-16 | 2020-01-30 | Nantbio, Inc. | Bacterial vaccine |
AU2018348165A1 (en) | 2017-10-10 | 2020-05-21 | Gritstone Bio, Inc. | Neoantigen identification using hotspots |
CA3083097A1 (en) | 2017-11-22 | 2019-05-31 | Gritstone Oncology, Inc. | Reducing junction epitope presentation for neoantigens |
WO2019133929A1 (en) | 2017-12-29 | 2019-07-04 | Cerus Corporation | Systems and methods for treating biological fluids |
CN110408634B (zh) | 2018-04-27 | 2021-08-03 | 苏州若泰医药科技有限公司 | 一种非整合李斯特菌疫苗及抗肿瘤免疫应答方法 |
WO2020028794A1 (en) * | 2018-08-02 | 2020-02-06 | The Johns Hopkins University | Compositions comprising annexin v and hpv tumor antigen fusion polypeptides |
WO2020024982A1 (zh) * | 2018-08-02 | 2020-02-06 | 苏州若泰医药科技有限公司 | 一种基于减毒李斯特菌激活的抗原提呈细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用 |
US12011510B2 (en) | 2019-06-22 | 2024-06-18 | Cerus Corporation | Biological fluid treatment systems |
JP2022539154A (ja) | 2019-06-28 | 2022-09-07 | シーラス コーポレイション | 生物学的流体処理デバイスを実装するためのシステム及び方法 |
WO2021181210A1 (en) * | 2020-03-11 | 2021-09-16 | White Dog Labs, Inc. | Microbial compositions and uses thereof |
US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
US20240197852A1 (en) * | 2021-04-23 | 2024-06-20 | Wake Forest University Health Sciences | Psoralen-inactivated neisseria gonorrhoeae vaccines and methods thereof |
Family Cites Families (84)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US136738A (en) * | 1873-03-11 | Improvement in combined oil-cans and torches | ||
US77263A (en) * | 1868-04-28 | Henry w | ||
US9194A (en) * | 1852-08-17 | Pile-cutting machineby | ||
US5106619A (en) * | 1983-12-20 | 1992-04-21 | Diamond Scientific Co. | Preparation of inactivated viral vaccines |
US4693981A (en) * | 1983-12-20 | 1987-09-15 | Advanced Genetics Research Institute | Preparation of inactivated viral vaccines |
US4545987A (en) * | 1983-12-20 | 1985-10-08 | Advanced Genetics Research Institute | Psoralen inactivated double-stranded RNA viral vaccines |
US4556556A (en) * | 1984-03-23 | 1985-12-03 | Advanced Genetics Research Institute | Vaccine for the prevention of vesicular stomatitis virus infection |
US5171568A (en) * | 1984-04-06 | 1992-12-15 | Chiron Corporation | Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine |
US4791062A (en) * | 1985-02-28 | 1988-12-13 | Diamond Scientific Co. | FVR vaccine |
IE62868B1 (en) | 1987-11-18 | 1995-03-08 | Chiron Corp | Hepatitis C virus |
DK189788D0 (da) | 1988-04-07 | 1988-04-07 | Wolf Watz Hans | Vaccine |
IL92996A (en) * | 1989-01-10 | 1996-06-18 | Bisaccia Emil | Photovoltaic compounds as drugs for the treatment of viral infections and a method for the production of vaccines |
UA50829C2 (uk) | 1989-03-17 | 2002-11-15 | Чірон Корпорейшн | Очищений поліпептид, що містить антиген вірусу гепатиту с, полінуклеотид, вектор, клітини, система експресії, моноклональне антитіло, препарат поліклональних антитіл, нуклеотидна проба, аналітичні набори, спосіб виявлення нуклеїнових кислот, способи імуноаналізу, вакцина, спосіб одержання антитіл |
RO113059B1 (ro) | 1989-05-18 | 1998-03-30 | Chiron Corp | Polinucleotida capabila de hibridizare pe o secventa hcv, metoda pentru detectarea unei secvente hcv si procedeu de eliminare a hcv din sange |
US5180819A (en) * | 1989-12-22 | 1993-01-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Purified myeloblastin, nucleic acid molecule encoding same, and uses thereof |
US6346611B1 (en) * | 1990-06-11 | 2002-02-12 | Gilead Sciences, Inc. | High affinity TGfβ nucleic acid ligands and inhibitors |
US5830702A (en) * | 1990-10-31 | 1998-11-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Live, recombinant listeria monocytogenes and production of cytotoxic T-cell response |
FR2686896B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-01-06 | Pasteur Institut | Mutant attenue de listeria monocytogenes; souche recombinante de listeria monocytogenes, utilisation comme vecteurs heterologues d'antigenes vaccinal et utilisation comme vaccin ou composition diagnostique. |
US5399719A (en) * | 1993-06-28 | 1995-03-21 | Steritech, Inc. | Compounds for the photodecontamination of pathogens in blood |
US5593823A (en) * | 1993-06-28 | 1997-01-14 | Cerus Corporation | Method for inactivating pathogens in blood using photoactivation of 4'-primary amino-substituted psoralens |
US6051237A (en) * | 1994-11-08 | 2000-04-18 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Specific immunotherapy of cancer using a live recombinant bacterial vaccine vector |
US5691132A (en) * | 1994-11-14 | 1997-11-25 | Cerus Corporation | Method for inactivating pathogens in red cell compositions using quinacrine mustard |
US6682729B1 (en) * | 1995-05-03 | 2004-01-27 | University Of Maryland, Baltimore | Method for introducing and expressing genes in animal cells, and live invasive bacterial vectors for use in the same |
US5877159A (en) * | 1995-05-03 | 1999-03-02 | University Of Maryland At Baltimore | Method for introducing and expressing genes in animal cells and live invasive bacterial vectors for use in the same |
US6150170A (en) * | 1998-05-03 | 2000-11-21 | University Of Maryland At Baltimore | Method for introducing and expressing genes in animal cells, and live invasive bacterial vectors for use in the same |
US6177441B1 (en) * | 1995-06-05 | 2001-01-23 | Cerus Corporation | Treating red blood cell solutions with anti-viral agents |
AU722811B2 (en) | 1995-06-07 | 2000-08-10 | Cerus Corporation | Treating red blood cell solutions with anti-viral agents |
GB9521568D0 (en) * | 1995-10-20 | 1995-12-20 | Lynxvale Ltd | Delivery of biologically active polypeptides |
AU1152397A (en) | 1995-12-20 | 1997-07-14 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for in vivo t cell activation by antigen-pulsed dendritic cells |
CA2241604C (en) * | 1996-01-05 | 2010-03-30 | Ira Pastan | Mesothelium antigen and methods and kits for targeting it |
US5843459A (en) * | 1996-01-19 | 1998-12-01 | Human Gene Therapy Research Institute | Differential inactivation of nucleic acids by chemical modification |
BR9708387A (pt) * | 1996-03-28 | 2000-01-04 | Genitrix Llc | Processo para vacinação de um mamìfero a um antìgeno selecionado, células patogênica e hospedeira, composição de vacina, ácido nucleico, e, opsonina engenheirada. |
EP0808897A1 (en) * | 1996-05-21 | 1997-11-26 | I.D.M. Immuno-Designed Molecules | New antigen presenting cells, a process for preparing the same and their use as cellular vaccines |
AU705647B2 (en) * | 1996-07-10 | 1999-05-27 | Immunex Corporation | Method of activating dendritic cells |
GB9615022D0 (en) | 1996-07-17 | 1996-09-04 | Mini Agriculture & Fisheries | Vaccine preparations |
WO1998005795A1 (en) * | 1996-08-02 | 1998-02-12 | The Center For Blood Research, Inc. | Enrichment of dendritic cells from blood |
US7273753B2 (en) * | 1996-08-02 | 2007-09-25 | Center Of Blood Research | Purification and uses of dendritic cells and monocytes |
DE19635676A1 (de) | 1996-09-03 | 1998-03-05 | Basf Ag | Feste geschäumte Wirkstoffzubereitungen |
US6093725A (en) * | 1997-01-06 | 2000-07-25 | Cerus Corporation | Frangible compounds for pathogen inactivation |
JP4551502B2 (ja) * | 1997-01-06 | 2010-09-29 | セラス コーポレーション | 病原体不活化のための脆い化合物 |
US6514987B1 (en) * | 1997-01-06 | 2003-02-04 | Cerus Corporation | Frangible compounds for pathogen inactivation |
GB9700939D0 (en) | 1997-01-17 | 1997-03-05 | Microbial Technics Limited | Therapy |
AU6050398A (en) | 1997-01-31 | 1998-08-25 | Vanderbilt University | Method of delivering antigens for vaccination with a live vector |
WO1999003976A2 (en) | 1997-07-21 | 1999-01-28 | Cerus Corporation | Method of treating leukocytes, leukocyte compositions and methods of use thereof |
US6099848A (en) * | 1997-11-18 | 2000-08-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Immunogenic compositions comprising DAL/DAT double-mutant, auxotrophic, attenuated strains of Listeria and their methods of use |
AU747842B2 (en) * | 1997-11-20 | 2002-05-23 | Cerus Corporation | New psoralens for pathogen inactivation |
DE19754938B4 (de) | 1997-12-11 | 2006-04-20 | Christoph von Dr. Eichel-Streiber | TGC-Verfahren zur Induktion einer zielgerichteten, somatischen Transgenität |
US6143551A (en) * | 1997-12-29 | 2000-11-07 | Schering Aktiengesellschaft | Delivery of polypeptide-encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated listeria suicide bacteria |
CA2317603A1 (en) | 1998-01-06 | 1999-07-15 | Cerus Corporation | Methods for quenching pathogen inactivators in biological materials |
EP1064357A1 (en) | 1998-03-20 | 2001-01-03 | Ludwig Institute For Cancer Research | Processes for improved presentation of antigens by dendritic cells |
CA2347067C (en) * | 1998-03-31 | 2013-09-17 | Geron Corporation | Dendritic cell vaccine containing telomerase reverse transcriptase for the treatment of cancer |
US20020155108A1 (en) * | 1998-05-04 | 2002-10-24 | Biocrystal, Ltd. | Method for ex vivo loading of antigen presenting cells with antigen, and a vaccine comprising the loaded cells |
US6254863B1 (en) | 1998-08-12 | 2001-07-03 | Loma Linda University | Non-virulent Porphyromonas gingivalis mutant |
US6004815A (en) * | 1998-08-13 | 1999-12-21 | The Regents Of The University Of California | Bacteria expressing nonsecreted cytolysin as intracellular microbial delivery vehicles to eukaryotic cells |
GB9918283D0 (en) | 1999-08-03 | 1999-10-06 | Int Centre Genetic Eng & Bio | Hsv vaccines |
AU7856100A (en) | 1999-10-04 | 2001-05-10 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating solid tumors with irradiation and bacteria |
DE19949594A1 (de) | 1999-10-14 | 2001-04-26 | Deutsches Krebsforsch | Rekombinante attenuierte Listerien zur Immuntherapie |
US20030077263A1 (en) | 1999-10-29 | 2003-04-24 | Immunex Corporation | Method of activating dendritic cells |
US6855320B2 (en) * | 2000-03-29 | 2005-02-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Fusion of non-hemolytic, truncated form of listeriolysin O to antigens to enhance immunogenicity |
AU2001255196A1 (en) | 2000-03-29 | 2001-10-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for enhancing immunogenicity of antigens |
WO2001082788A2 (en) * | 2000-05-04 | 2001-11-08 | President And Fellows Of Harvard College | Compounds and methods for the treatment and prevention of bacterial infection |
WO2002024739A2 (en) * | 2000-09-21 | 2002-03-28 | The Regents Of The University Of California | Spas-1 cancer antigen |
ES2234928T3 (es) * | 2000-11-14 | 2005-07-01 | Universite Libre De Bruxelles | Generacion y uso de celulas dendriticas. |
DE60136563D1 (de) * | 2000-11-16 | 2008-12-24 | Intervet Int Bv | Salmonella vakzine |
EP1365750A2 (en) * | 2000-12-21 | 2003-12-03 | Cerus Corporation | Methods for inactivation of pathogens in biological materials |
US6783765B2 (en) | 2001-03-23 | 2004-08-31 | Council Of Scientific And Industrial Research | Process for the preparation of a vaccine for the treatment of tuberculosis and other intracellular infections diseases and the vaccine produced by the process |
US20020141977A1 (en) * | 2001-04-02 | 2002-10-03 | Collins John Kevin | Immunotherapy based on dendritic cells |
US7566568B2 (en) * | 2001-04-27 | 2009-07-28 | Istituto Superiore Di Sanita | Method for generating highly active human dendritic cells from peripheral blood mononuclear cells |
US20040022761A1 (en) * | 2001-05-11 | 2004-02-05 | Banchereau Jacques F | Compositions and methods for producing antigen-presenting cells |
WO2003012085A1 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Antigen presenting cells, method for their preparation and their use for cancer vaccines |
US7413869B2 (en) * | 2002-04-05 | 2008-08-19 | Dendreon Corporation | Method for determining potency of antigenic presenting cell based vaccines |
US7425449B2 (en) * | 2002-04-30 | 2008-09-16 | The Regents Of The University Of California | Site specific Listeria integration vectors and methods for using the same |
EP1513924A4 (en) * | 2002-05-29 | 2008-05-21 | Univ California | ATTENUATED LISTERIA SPP. AND METHOD OF USE THEREOF |
US20040009194A1 (en) | 2002-06-21 | 2004-01-15 | Jean-Marie Andrieu | Methods, and compositions for a therapeutic antigen presenting cell vaccine for treatment of immunodeficiency virus |
AU2002950473A0 (en) | 2002-07-26 | 2002-09-12 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Expression system |
US7695725B2 (en) | 2003-02-06 | 2010-04-13 | Aduro Biotech | Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof |
JP4545151B2 (ja) * | 2003-02-06 | 2010-09-15 | シーラス コーポレイション | 非食細胞中への侵入について減弱化されているリステリア、そのリステリアを含むワクチン、およびそれらの使用法 |
KR20060130038A (ko) * | 2003-10-15 | 2006-12-18 | 메디뮨 인코포레이티드 | 리스테리아에 의거한 EphA2 백신 |
US20050175630A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-08-11 | Eyal Raz | Immunogenic compositions and methods of use thereof |
WO2005071088A2 (en) | 2003-12-24 | 2005-08-04 | Cerus Corporation | Recombinant nucleic acid molecules encoding fusion proteins comprising antigens and bacterial secretory signal polypeptides, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof |
WO2005067460A2 (en) | 2003-12-24 | 2005-07-28 | Medimmune, Inc. | Epha2 vaccines |
US7842289B2 (en) * | 2003-12-24 | 2010-11-30 | Aduro Biotech | Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof |
WO2005092372A2 (en) | 2004-02-06 | 2005-10-06 | Cerus Corporation | Modified bacillus anthracis vaccine compositions and methods of use thereof |
US20070031457A1 (en) * | 2004-02-06 | 2007-02-08 | Dubensky Thomas W Jr | Modified Bacillus anthracis, vaccine compositions and methods of use thereof |
-
2004
- 2004-02-06 AU AU2004224425A patent/AU2004224425B2/en not_active Ceased
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-
2007
- 2007-02-05 JP JP2007026192A patent/JP2007131639A/ja active Pending
-
2010
- 2010-06-10 AU AU2010202434A patent/AU2010202434A1/en not_active Abandoned
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---|---|---|
JP4839209B2 (ja) | 改変された自由生活微生物、ワクチン組成物、およびそれらの使用方法 | |
US7927606B2 (en) | Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof | |
JP2006521376A5 (ja) | ||
US7691393B2 (en) | Listeria attenuated for entry into non-phagocytic cells, vaccines comprising the Listeria, and methods of use thereof | |
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