JP2017511796A - 多標的免疫療法を目的とするバイオマーカー - Google Patents
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Abstract
本発明は疾患におけるバイオマーカー発現を評価するための方法および使用するための組成物を提供し、多標的化したリステリアベースの前記疾患に対する免疫療法的なアプローチを提供する。関連する態様では、本発明は被験者内の疾患を処置する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生物サンプルを得る工程、b.前記生物サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程、c.前記被験者に組み換え型リステリア株を含む組成物を投与する工程であって、前記リステリアが少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程を含み、前記融合タンパク質が前記生物サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーPEST含有ポリペプチドが融合され、前記リステリア内の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それにより前記被験者内の前記疾患を処置する。
Description
本発明は、疾患におけるバイオマーカー発現を評価するための方法および組成物を提供し、かつ多標的化したリステリアベースの前記疾患に対する免疫療法的なアプローチを提供する。
バイオマーカーは、何らかの疾患の状態の重篤度もしくは何らかの疾患の存在を反映する、または何らかの疾患と関連付けられ、かつ生物体の特定の疾患の状態または他の何らかの生理学的状態の指標として使用することができる測定可能な特徴である。バイオマーカーは、特定のガンまたは腫瘍などの疾患の状態の存在または進行を識別および/または測定するために使用することができる特異的な細胞、分子、遺伝子、遺伝子産物、酵素、受容体、これらの細胞要素またはホルモンのうちのいずれかの突然変異型とすることができる。さらに、腫瘍およびガンが、腫瘍またはガンの存在を識別する、あるいは腫瘍もしくはガンの進行または治療の効果を測定するために使用される一組の腫瘍バイオマーカーを発現する可能性があることが周知である。
バイオマーカーの豊富な使用にもかかわらず、疾患のある状態の増殖または存在およびこれに続く被験者の総合的な健康状態の悪化と直接的に関連付けられる疾患の診断および疾患の進行のモニターのために、疾患によって発現されたバイオマーカーを具体的に標的化するようにこの情報を使用できるようにする治療的なアプローチを開発する必要性がまだある。
リステリア・モノサイトゲネス(Lm)は、主として抗原提示細胞に感染し、またこれらの細胞の細胞質内に死ぬまで適合する細胞内病原体である。リステリア・モノサイトゲネスおよびこれが生産するタンパク質(リステリオリシンO(LLO)と名付けられる)は、細胞ベースの免疫療法のために使用される大多数のアジュバントとは異なり、対象となる抗原をLLOまたはActAタンパク質などのリステリアによって発現されるアジュバントタンパク質に融合するとき、抗原特異的治療を提供した後で投与することができ、またはそれ自身抗原特異的治療を提供するために使用することができる、強いアジュバント特性を有する。
本発明は、組み合せによる多標的免疫療法的なアプローチを提供することによってこの必要性に対処するものであり、別個の組成物内に存在する対応するリステリアとは異なる疾患関連抗原を発現する組み換え型リステリア株を各々含む個々の組成物が、疾患を有する被験者に別個に投与され、またはこの組成物を組み合わせて単回ボーラス投与として投与される。本発明は、少なくとも1つの免疫原性のリステリアペプチド(N末端LLO、切断LLO、ActAタンパク質断片、またはPESTペプチドなどの)に融合された抗原を含む融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを使用することによって、所定の数の疾患関連抗原またはその断片を提供することにより、この必要性にさらに対処する。かかる組成物の使用は、腫瘍、ガン、または2つ以上のバイオマーカーを発現する疾患細胞の亜集団を有するその他の疾患を含む疾患の順調な治療を可能にする。
一態様では、本発明は、疾患に対する免疫応答を前記疾患を有する被験者内に誘発する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって多標的抗疾患免疫応答を前記被験者内に誘発する。
一態様では、本発明は、疾患に対する免疫応答を前記疾患を有する被験者内に誘発する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.組み換え型リステリア株を各々が含む組成物の混合物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が前記融合タンパク質中に異なるバイオマーカーを含み、それによって多標的抗疾患免疫応答を前記被験者内に誘発する。
関連する態様では、本発明は、被験者内の疾患を治療する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患を治療する。
関連する態様では、本発明は、被験者内の疾患を治療する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.組み換え型リステリア株を各々が含む組成物の混合物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患を治療する。
別の態様では、本発明は、被験者内の疾患の再発を防止する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患の再発を防止する。
別の態様では、本発明は、被験者内の疾患の再発を防止する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.組み換え型リステリア株を各々含む組成物の混合物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患の再発を防止する。
以下の発明を実施するための形態、実施例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が明らかとなるので、この詳細な説明および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示としてのみ与えられることを理解するべきである。
以下の図面は本明細書の一部分を形成し、かつ本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示した具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの1つ以上を参照することによって本発明をよりよく理解することができる。本特許ファイルまたは本特許出願ファイルは、少なくとも1つのカラーで作成された図面を含む。本特許または本特許出願のカラー図面付きの出版物の複製物は、要求に応じ、かつ必要な料金の支払いに応じて米国特許商標局から提供される。
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
一実施形態では、本明細書に提供される発明は、被験者内の疾患と関連付けられるバイオマーカーの発現または存在を評価し、またこれは疾患と関連付けられるバイオマーカーを識別および標的化するために被験者から得られた生体サンプル内で発現され、その結果として被験者内の疾患を治療することを目的とする。別の実施形態では、被験者を治療する方法は、被験者の疾患によって発現される2つ以上のバイオマーカーを標的化する組成物または組成物の混合物を投与することを含む。
一実施形態では、本明細書に提供される組成物は組み換え型リステリア株を含み、前記株は融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、前記融合タンパク質は疾患を有する被験者から得られた生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは前記疾患と関連付けられ、また前記バイオマーカーはPEST含有ポリペプチドに融合される。別の実施形態では、組み換え型リステリアは融合タンパク質を含む組み換え型ポリペプチドをコードする核酸を含む。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは融合タンパク質である。
一実施形態では、単一の組成物(組成物の混合物ではなく、すなわち混合物の組織物の部分として独立して投与される)が疾患を有する被験者に投与されるとき、被験者から得られた生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含む少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組み換え型リステリアをこの組成物が含み、前記バイオマーカーは前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーはPEST含有ポリペプチドに融合される。別の実施形態では、リステリアは、各々が疾患と関連付けられる異なるバイオマーカーを含む1つから3つの、1つから4つの、または1つから6つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、リステリアは、各々が疾患と関連付けられるバイオマーカーを含む融合タンパク質をコードする1つから3つの、1つから4つの、または1つから6つのオープンリーディングフレーム(ORF)を含む核酸配列を含む。別の実施形態では、前記少なくとも1つの融合タンパク質の各々の中の各々のバイオマーカーは、核酸配列の中の異なるオープンリーディングフレームから発現される別の融合タンパク質内に存在する別のバイオマーカーとは異なる。
別の実施形態では、組成物が混合物の部分として被験者へ投与されるとき、混合物内の各々の組成物は組み換え型リステリア株を含み、前記株は融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、前記融合タンパク質は被験者から得られた生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーはPEST含有ポリペプチドに融合され、また各々の組成物の中の各々の組み換え型リステリア株は残りからの異なるバイオマーカーを含む。一実施形態では、混合物はワクチン混合物である。別の実施形態では、混合物は、各々が前記疾患およびPEST含有ポリペプチド内で発現されるバイオマーカーの融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む、所定の数の組成物を含む。別の実施形態では、組成物の混合物は組成物の組合せである。
組成物の混合物中の各々の組成物はすべて単一のボーラス投与量で同時に投与されてもよく、または経時的に分離して投与されてもよく、また疾患によって発現される2つ以上のバイオマーカーを標的化することになることを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、組成物の混合物中の各々の組成物はすべて単一のボーラス投与量で同時に投与されてもよく、また疾患によって同時に発現される2つ以上のバイオマーカーを標的化することになる。別の実施形態では、組成物は、疾患によって発現される2つ以上のバイオマーカーを同時に標的化する少なくとも1つの融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む。一実施形態では、少なくとも1つの融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む組成物の混合物内の所定の数の組成物を、同時にまたは経時的に分離して被験者に投与する。
一実施形態では、疾患を有する被験者に組成物の混合物を投与するとき、混合物内の各々の組成物を1日から2日おいて、1日から3日おいて、1日から5日おいて、1日から10日おいて、または1日から14日おいて投与する場合がある。
一実施形態では、疾患を有する被験者に組成物の混合物を投与するとき、投与を受ける被験者のために最適であるようにそれまでに決定した所定の投与量で各々の組成物を投与してもよい。かかる最適な投与量は、この混合物を投与する前に臨床医または当業者によって実験的に決定されてもよい。別の実施形態では、混合物は、各々がバイオマーカーおよびPEST含有ポリペプチドの融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む、所定の数の組成物を含む。別の実施形態では、組成物の混合物は、各々がPEST含有ポリペプチドに融合したバイオマーカーの単一の融合タンパク質を発現する組み換え型リステリア株を含む、組成物の組合せである。
一態様では、本発明は、疾患に対する免疫応答を前記疾患を有する被験者内に誘発する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記被験者から得た前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって多標的抗疾患免疫応答を前記被験者内に誘発する。
一実施形態では、少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含むリステリア株は、1つから2つの融合タンパク質をコードする。別の実施形態では、核酸配列は、1〜3個の融合タンパク質、1〜4個の融合タンパク質、1〜5個の融合タンパク質、1〜10個の融合タンパク質、2〜3個の融合タンパク質、2〜4個の融合タンパク質、2〜5個の融合タンパク質、または2〜10個の融合タンパク質をコードする。
一態様では、本発明は、疾患に対する免疫応答を前記疾患を有する被験者内に誘発する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.各々が組み換え型リステリア株を含む所定の数の組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記被験者から得た前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が前記融合タンパク質中に異なるバイオマーカーを含み、それによって多標的抗疾患免疫応答を前記被験者内に誘発する。
一実施形態では、本発明は、被験者内の疾患を治療する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患を治療する。
別の実施形態では、本発明は、被験者内の疾患を治療する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.各々が組み換え型リステリア株を含む所定の数の組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル内に識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患を治療する。
別の実施形態では、本発明は、被験者内の疾患の再発を防止する方法に関し、この方法は、a.前記被験者から生体サンプルを得る工程と、b.前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、c.組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患の再発を防止する。
一実施形態では、本明細書で提供される疾患は、ガンまたは腫瘍増殖である。別の実施形態では、本明細書で提供される疾患は、感染性疾患、呼吸器疾患、炎症性疾患、または被験者がTh2持続性プロフィールを有する疾患である。別の実施形態では、疾患は局所性疾患、すなわち、特定の疾患部位に局所化された疾患であるか、または全身性疾患である。
一実施形態では、融合タンパク質は転写融合タンパク質である。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、本明細書に提供されるPEST含有ペプチドに融合されるバイオマーカーを含む融合タンパク質を発現する。別の実施形態では、融合タンパク質は本明細書に提供されるバイオマーカーを発現する。
一実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリアはリステリア・モノサイトゲネスである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・シーリゲリである。各々のタイプのリステリアは本発明の別個の実施形態を表す。
一実施形態では、組成物の混合物が本明細書に提供され、各々の組成物は疾患内に存在する各々の個別のバイオマーカーに対する免疫原性応答を標的化するバイオマーカーを発現する組み換え型リステリア株を含む。別の実施形態では、バイオマーカーは前記疾患と関連付けられた組織の表面上に存在する。別の実施形態では、本明細書に提供される疾患は腫瘍またはガンである。別の実施形態では、バイオマーカーは表面バイオマーカーである。別の実施形態では、バイオマーカーは細胞内バイオマーカーである。別の実施形態では、疾患が腫瘍またはガンである場合、バイオマーカーは腫瘍またはガン血管系と関連付けられた血管新生バイオマーカーである。
一実施形態では、各々がリステリア株を含む所定の数の組成物は、少なくとも1個から約10個の組成物である。別の実施形態では、所定の数の組成物は、少なくとも1個から約20個の組成物である。別の実施形態では、所定の数の組成物は、2〜5個の組成物、3〜6個の組成物、4〜7個の組成物、5〜10個の組成物、6〜11個の組成物、または7〜12個の組成物である。
一実施形態では、所定の数のバイオマーカーは、少なくとも1個から約10個のバイオマーカーである。別の実施形態では、所定の数のバイオマーカーは、少なくとも1個から約20個のバイオマーカー、少なくとも1個から約30個のバイオマーカー、少なくとも1個から約40個のバイオマーカー、少なくとも1個から約50個のバイオマーカー、少なくとも51個から約60個のバイオマーカー、少なくとも71個から約80個のバイオマーカー、少なくとも81個から約90個のバイオマーカー、または少なくとも1個から約100個のバイオマーカーである。
「バイオマーカー」という用語が、異種抗原、腫瘍抗原、血管形成抗原、およびこれに類するものを含む抗原を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。この用語は、ガン、腫瘍、感染性疾患、自己免疫疾患、先天性疾患、およびこれに類するものを含むがこれに限定されない疾患と関連付けられるか、または疾患によって発現されるタンパク質、DNA、RNA、ペプチドも包含する場合がある。かかるバイオマーカーは、疾患を有する被験者では、健康な宿主でのバイオマーカーの発現の正常なレベルと比較して過剰発現する場合があることも理解されるであろう。別の実施形態では、バイオマーカーを発現する疾患がそれに対して適用された適正な免疫応答無しに自由に進行できるように、被験者はバイオマーカーに対して耐性がある。別の実施形態では、「バイオマーカー」という用語は疾患によって発現される抗原を指す。別の実施形態では、バイオマーカーは、異種抗原またはその断片である。一実施形態では、バイオマーカーは、腫瘍抗原またはその断片である。別の実施形態では、本明細書に提供されるバイオマーカーは、宿主内でアレルギー性または炎症性反応を生じるアレルゲンである。
一実施形態では、「腫瘍マーカー」および「腫瘍抗原」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、腫瘍によって発現される抗原を指す。別の実施形態では、腫瘍マーカーは異種腫瘍抗原またはその断片である。一実施形態では、腫瘍マーカーは前記腫瘍の形成または増殖と関連付けられる。別の実施形態では、腫瘍マーカーは前記腫瘍によってまたは前記腫瘍の血管系によって発現される。別の実施形態では、腫瘍マーカーは腫瘍によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に提供される腫瘍マーカーは、ガンの発生または転移とさらに関連付けられる局所組織環境と関連付けられる。別の実施形態では、腫瘍回避またはガンに対する抵抗と腫瘍マーカーが関連付けられるか、または腫瘍マーカーは血管形成抗原である。別の実施形態では、腫瘍マーカーは腫瘍によって腫瘍の表面上に発現される。別の実施形態では、腫瘍マーカーは、腫瘍の内側に存在し、腫瘍細胞の溶解に際して細胞外環境に放出される。
一実施形態では、バイオマーカープロファイルまたはバイオマーカー発現レベルの評価は、生体サンプルを疾患を有する被験者から得ることと、前記サンプル内のバイオマーカーの発現レベルを検出することとを含む。一実施形態では、本明細書に提供されるバイオマーカープロファイルは腫瘍マーカープロファイルである。別の実施形態では、腫瘍マーカープロファイルまたは腫瘍マーカー発現レベルの評価は、生体サンプルを腫瘍を有する被験者から得ることと、前記サンプル内の腫瘍マーカーの発現レベルを得ることとを含む。
バイオマーカーの発現レベルを測定するために有用な当該技術分野で既知の任意のアッセイを使用することによってバイオマーカー発現プロファイルを測定してもよいことを当業者はよく理解するであろう。かかるアッセイとしては、イムノアッセイ(例えば、ELISA)、FACS、免疫組織化学アッセイ、蛍光ベースのアッセイ、PCR、定量HPLC単独もしくは質量分析との組み合わせ、または当該技術分野で既知の任意の他のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、被験者内の疾患(例えば、腫瘍またはガン)を効果的に診断するために、測定される発現プロファイルを健康な被験者からのものなどの対照プロファイルと比較することができる。別の実施形態では、疾患を有する被験者から組み換え型リステリア株を含む組成物を投与する前に得られた生体サンプル内でバイオマーカーが検出可能である。
別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物を投与するのに最適な時期を決定するために、被験者内の疾患の進行をモニターする方法が本明細書に提供され、この方法は、被験者から生体サンプルを得る工程と、生体サンプル内のバイオマーカーの発現プロファイルを測定する工程とを含み、対照サンプルで観察されるもののレベルに対して被験者内のバイオマーカー発現レベルを測定することは、被験者内での疾患の進行をモニターし、治療的な有効性を最大にするであろう所定の時期に本発明の組成物または組成物の混合物を投与することができるようにする。本発明によって包含される疾患としては、ガン、腫瘍増殖、感染性疾患、または被験者がTh2に偏ったプロファイルを有する疾患が挙げられるがこれらに限定されない。これらの疾患は被験者内での疾患の進行に応じてさらに特徴付けまたは病期分類される。本発明の組成物(複数可)を投与する最適な期間を決定するためにかかる情報を使用することができる。
生体サンプルとしては、組織、血液、血清、DNA、RNA、尿、精液、滑液、唾液、または脳脊髄液(CSF)を挙げてもよいがこれに限定されないことが当業者によって理解される。
一実施形態では、「Th2に偏った被験者」はTh2表現型プロファイルを有する被験者としても知られ、これは被験者内の寄生生物による感染症またはガンが挙げられるがこれに限定されない、感染性疾患の結果としてThl免疫応答に欠陥がある、免疫応答を欠いている、または免疫応答が抑制されているものである。別の実施形態では、Th2に偏った被験者は、Th2応答が被験者内に存在するとは限らないが、被験者内でThl応答に対して優位を占める被験者を指す。別の実施形態では、Th2に偏った被験者は、被験者内にTh2応答が独占的に存在し、またThl応答指標(すなわち、サイトカイン、ケモカイン、または他の既知のマーカー)の最低限またはわずかなレベルを有する被験者を指す。
一実施形態では、含む組成物の混合物は各々1〜5個の組成物を含み、各々が単一の融合タンパク質を発現する組み換え型リステリア株を含む。別の実施形態では、混合物は1〜10個の組成物、1〜15個の組成物、5〜10個の組成物、5〜15個の組成物、または5〜20個の組成物を含み、各々がPEST含有ポリペプチドの単一の融合タンパク質およびバイオマーカーを発現する組み換え型リステリア株を含む。別の実施形態では、混合物中の各々の組成物は異なるバイオマーカーを発現するリステリアを含む。
別の実施形態では、もとの組成物または組成物の混合物とは異なるワクチンまたは組成物の代替形態の投与と同時に、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物が投与される。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物の投与とは別個に、ワクチンの代替形態が投与される。ワクチンまたは組成物の代替の形態としては、バイオマーカーおよびPEST含有ペプチドもしくはその断片を含む融合タンパク質をコードするDNAワクチン、前記融合タンパク質を含むウイルスベクター、本明細書に提供されるバイオマーカーを含むウイルスベクター、前記融合タンパク質を含むウイルス様粒子、本明細書に提供されるバイオマーカーを含むウイルス様粒子、前記融合タンパク質を含む組み換え型ペプチドもしくは組み換え型ポリペプチド、本明細書に提供されるバイオマーカーを発現する細胞ベースのワクチン、または本明細書にさらに提供されるように本明細書に提供されるバイオマーカーを単独でもしくは融合タンパク質の形態で含む生組み換え型非リステリア細菌ベクターが挙げられる場合があるがこれらに限定されないことを当業者は理解するであろう。かかる代替の形態は本明細書に提供される組成物または組成物の混合物と組み合わせて使用されてもよいだけでなく、その投与の前に、または後に投与されてもよいことも当業者は理解するであろう。
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドは本明細書に提供される融合タンパク質を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドは本明細書に提供される融合タンパク質である。
別の実施形態では、上述の方法のいずれかで利用される組成物または組成物の組合せは、本発明のワクチンおよび組成物の特徴のいずれかを有する。
「免疫原性組成物」、「組成物」、および「医薬組成物」という用語は交換可能に使用される場合がある。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記述される組み換え型リステリア、およびアジュバントを包含する場合がある。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に提供される組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供されるアジュバントを含む。本明細書にさらに提供されるように、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する、またはTエフェクター細胞に対する調節性T細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
「医薬組成物」という用語は、リステリア株を医薬的に許容される担体または希釈剤とともに含む組成物を含む治療的に有効な量の活性成分(複数可)を包含する場合がある。
「投与する」という用語は被験者に本発明の組成物との接触をもたらすことを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。一実施形態では、投与をインビトロで、すなわち、試験管内で、またはインビボで、すなわち、生体、例えば、ヒトの細胞または組織の中で遂行することができる。一実施形態では、本発明は、本発明のリステリア株およびその組成物を被験者に投与することを包含する。
一実施形態では、細菌ベクターは、細胞内病原体である。別の実施形態では、ベクターは、細胞毒性病原体に由来する。別の実施形態では、ベクターは、細胞内病原体に由来する。別の実施形態では、細胞内病原体は、主として細胞媒介性免疫応答を誘発する。別の実施形態では、ベクターはサルモネラ株である。別の実施形態では、ベクターはBCG株である。別の実施形態では、ベクターは細菌ベクターである。別の実施形態では、本発明のベクターを用いて遺伝子導入した樹状細胞を被験者に投与して、被験者の免疫応答を上方制御してもよく、一実施形態では、これはCTL活性を上方制御することによって遂行される。
別の実施形態では、組み換え型ワクチンベクターは、主としてTh1タイプ免疫応答を誘発する。
別の実施形態では、ベクターはサルモネラ種、シゲラ種、BCG、L.モノサイトゲネス、大腸菌、およびストレプトコッカス・ゴルドニから選択される。別の実施形態では、融合タンパク質は、ファゴリソソーム融合をエスケープし、かつ細胞の細胞質内で生きるように変性した組み換え型細菌ベクターによって送達される。別の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。他の実施形態では、ベクターはワクシニア、アビポックス、アデノウイルス、AAV、ワクシニアウイルスNYVAC、変異ワクシニア株アンカラ(MVA)、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスから選択される。別の実施形態では、ベクターは裸のDNAベクターである。別の実施形態では、ベクターは当該技術分野で既知の任意の他のベクターである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ナノ改変ウイルス様物質、またはワクチンで使用するための当該技術分野で既知の任意のウイルスベクターである。別の実施形態では、ウイルスベクターはワクシニアウイルスベクターである。
細胞ベースのワクチンは生細胞または死細胞を含む場合があり、また自己起源または異種起源の腫瘍細胞も含む場合があることを当業者は理解するであろう。
一実施形態では、バイオマーカー発現プロファイルは本明細書に提供されるいずれかのワクチンの投与の前に得られる。
一実施形態では、ペプチドベースのワクチンは、本明細書に提供される腫瘍マーカーまたは抗原に融合された突然変異または除去したコレステロール結合ドメイン(実施例38〜39参照)を有する解毒LLOを含む。別の実施形態では、ガンを含む疾患の多標的化した免疫療法を提供するうえで使用するために、ペプチドベースのワクチンは、本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物と組み合わされる。
別の実施形態では、本発明の方法は本明細書に提供される免疫療法を受容する被験者にブースター投与を投与する工程をさらに含む。別の実施形態では、ブースター投与量は以下の本明細書に提供される組成物または組成物の混合物の初期投与を投与する。別の実施形態では、方法は、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物の初回の投与の後で前記被験者からバイオマーカープロファイルを得る工程と、ブースター投与を投与する工程とをさらに含む。別の実施形態では、本明細書にさらに提供されるように、投与するブースター投与量は本明細書に提供される組成物およびワクチンの代替形態を含む。別の実施形態では、方法は、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物の前回の投与に続いて第2の、第3の、第4の、第5の、等々のバイオマーカープロファイルを得ることと、前記第3の、第4の、第5の、等々のバイオマーカープロファイルを得ることに続いてブースター投与またはワクチンもしくは組成物の代替形態との組み合わせを投与することとをさらに含む。別の実施形態では、バイオマーカーは腫瘍マーカーであり、またバイオマーカープロファイルは腫瘍マーカープロファイルである。別の実施形態では、ブースター投与量は、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物中の組成物のうちの1つの初期投与量と同一または異なる。
一実施形態では、ブースターワクチン接種が単一のプライミングワクチン接種または投与に次いて行われる。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後に単一のブースターワクチン接種をする。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、2回のブースターワクチン接種をする。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、3回のブースターワクチン接種をする。一実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンとの間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンとの間の期間は1週間であり、別の実施形態では、これは2週間であり、別の実施形態では、これは3週間であり、別の実施形態では、これは4週間であり、別の実施形態では、これは5週間であり、別の実施形態では、これは6〜8週間であり、さらに別の実施形態では、ブーストワクチンをプライムワクチンの8〜10週間後に投与する。
異種「プライムブースト」戦略は免疫応答および多数の病原体に対する保護を強化するために効果的であった。Schneider et al.,Immunol.Rev.170:29−38(1999);Robinson,H. L.,Nat.Rev.Immunol.2:239−50(2002);Gonzalo,R.M.et al.,Vaccine 20:1226−31(2002);Tanghe,A.,Infect.Immun.69:3041−7(2001)。プライム注射とブースト注射において異なる形態で抗原を提供すると、抗原に対する免疫応答を最大化するようである。DNAワクチンプライミングの後にアジュバント中のタンパク質用いたブースティング、または抗原をコードするDNAのウイルスベクター送達が続くのが抗原特異的な抗体およびCD4+ T細胞応答またはCD8+ T細胞応答のそれぞれの改善の最も効果的なやり方であるようである。Shiver J.W.et al.,Nature 415:331−5(2002);Gilbert,S.C.et al.,Vaccine 20:1039−45(2002);Billaut−Mulot,O.et al.,Vaccine 19:95−102(2000);Sin,J.I.et al.,DNA Cell Biol.18:771−9(1999)。サルのワクチン接種の研究からの最近のデータは、サルにHIV gag DNAをプライムでワクチン接種し、HIV gagを発現するアデノウイルスベクター(Ad5−gag)を用いたブーストを後に続けた場合、CRL1005ポロクサマー(12kDa、5% POE)をHIV gag抗原をコードするDNAに加えることがT細胞応答を強化することを示唆している。DNA/ポロクサマーのプライムの後にAd5−gagブーストを続けることに対する細胞免疫応答は、DNA(ポロクサマーを用いない)プライムの後に続くAd5−gagブーストで、またはAd5−gagのみで誘発される応答より大きい。Shiver、J.W.et al.Nature 415:331−5(2002)。米国特許出願 公開第US2002/0165172A1号は、免疫応答が生成されるように、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。このドキュメントは、B型肝炎抗原およびHIV抗原に限られる。さらに、米国特許 第6,500,432号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を目的とする。この特許によると、同時投与は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同一の免疫応答の間の投与を意味し、相互の間が0〜10日間または3〜7日間であるのが好ましい。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎(すべての形態)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫(例えば、プラスモジウム属からの)、および病原性細菌(結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられるがこれに限定されない)のものが挙げられる。すべての上記の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ワクチンと称される場合があり、かつ本明細書に提供される組成物の混合物または組成物の組合せは、ワクチンの組合せと称される場合がある。別の実施形態では、ワクチンの組合せは、本明細書に提供される組成物または組成物の組合せに加えて、ワクチンの代替形態を含む場合がある。
ワクチンの組合せまたは投与は、耐性腫瘍もしくは再発腫瘍で検出された変更または本来の治療または投与に続く時点で集められたデータに基づいて調節される(追加的なまたは新しい腫瘍マーカーを標的化するために)場合があることを当業者はよく理解するであろう。例えば、腫瘍がマーカーA、B、C、およびDを発現する場合、与えられる免疫療法の全体的な投与は、本明細書に提供されるように、各々の個別のマーカーに対する免疫原性応答を標的化する組み換え型リステリア株を含む組成物または組成物の混合物を含むことになる。一実施形態では、組成物の混合物を投与する場合、単一のボーラスを同時に投与し、組成物の混合物中の少なくとも1つの組成物を異なる時点で投与し、すなわち混合物からの特異的なリステリア株を含む1つの組成物がバイオマーカーAおよびBを標的化し、異なる時点で別の組み換え型リステリア株を含む混合物からの別の組成物がバイオマーカーCおよびDを標的化する。
別の実施形態では、10個の組成物混合物のうちの2〜4個の組成物を、混合物中の残りの組成物の前に投与する。別の実施形態では、10個の組成物混合物のうちの2〜6個の組成物を、混合物中の残りの組成物の前に投与する。別の実施形態では、10個の組成物混合物のうちの5〜8個の組成物を、混合物中の残りの組成物の前に投与する。別の実施形態では、10個の組成物混合物のうちのすべての組成物を異なる時点で投与する。別の実施形態では、10個の組成物混合物のすべての組成物を同時に投与する。別の実施形態では、混合物は5〜10個の組成物、11〜15個の組成物、または16〜20個の組成物を含む。
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患を有する被験者内の、または被験者の中の疾患部位内の浸潤性Tリンパ球/抑制因子細胞比を増加する。別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患を有する被験者内の、または被験者の中の疾患部位内のCD8+ T細胞/抑制因子細胞比を増加する。別の実施形態では、浸潤性Tリンパ球/抑制因子細胞比またはCD8+ T細胞/抑制因子細胞比を増加する本明細書に提供される方法は、被験者に本明細書に提供されるワクチンまたは組成物を含む組成物を投与する工程を含む。
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患を有する被験者内のまたは被験者の中の疾患部位内の浸潤性Tリンパ球/骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)比を増加する。別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患を有する被験者内の、または被験者の中の疾患部位内のCD8+ T細胞/骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)の比を増加する。別の実施形態では、浸潤性Tリンパ球/骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)比またはCD8+ T細胞/骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)比を増加する方法は、被験者に本明細書に提供されるワクチンまたは組成物を含む組成物を投与する工程を含む。
一実施形態では、浸潤性Tリンパ球は、腫瘍浸潤性Tリンパ球(TIL)である。一実施形態では、本明細書に提供される抑制因子細胞は、調節性T細胞(Treg)である。別の実施形態では、抑制因子細胞は、骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)である。
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患に対して免疫応答を抑制する細胞の量を減少する。別の実施形態では、免疫応答を抑制する細胞は、抑制的細胞である。別の実施形態では、抑制的細胞は、骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)である。別の実施形態では、抑制的細胞は、調節性T細胞(Treg)である。
一実施形態では、腫瘍MDSCは、予想外に抗原特異的なT細胞機能および非特異的なT細胞機能の両方を阻害する可能性があり、一方で脾臓MDSCは抗原特異的なT細胞の機能のみを阻害する可能性がある。下記の実施例で実証されるように(実施例17〜20参照)、本明細書に提供される生きた弱毒化リステリアは、疾患部位(例えば、腫瘍部位)におけるTILの集団と比較して疾患内の抑制因子細胞のパーセントを減少する。
一実施形態では、本明細書に提供されるリステリア・モノサイトゲネス(Lm)ベースのワクチンによって含まれる組み換え型リステリア株は、対応するエフェクターに対する疾患の部位における抑制因子細胞の比のシフトを用いて疾患の部位におけるTregおよびMDSCのパーセンテージを減少する。別の実施形態では、本明細書に提供されるLmベースのワクチンは、被験者内の疾患の特異的な部位におけるTregおよびMDSCのパーセンテージならびにMDSCの絶対数を減少することによって免疫応答を改善するために有用である。かかる部位は、アレルギー、外傷、感染、疾患に起因する炎症性の部位である可能性があり、またはこの部位は腫瘍部位である可能性がある。
別の実施形態では、リステリアで処置したマウスの腫瘍から精製された単球性および顆粒球性の両方のMDSCは、未処置マウスの腫瘍から精製したMDSCよりCD8+ T細胞の分裂をより少ししか抑制することができないが、一方でこれらの同一の腫瘍を持つマウスの脾臓から精製した単球性および顆粒球性のMDSCでは、リステリアを用いたワクチン接種後にそれらの機能に変化がない(本明細書の実施例17〜20を参照)。一実施形態では、脾臓のMDSCは抗原特異的な様式で抑制的なので、この効果が見られる。したがって、リステリアを用いる治療は、TregおよびMDSCなどの腫瘍抑制的な細胞の腫瘍特異的な阻害を可能にする独特の利点を有する。本明細書に提供される方法および生きた組成物弱毒化リステリア株によって提供される別の予想外の利点は、腫瘍内により少ない量のTregがあること、およびT細胞の複製を抑制する能力を持続して失うものがあることである。
別の実施形態では、切断LLO発現するリステリアで処置したマウスの腫瘍から精製した単球性および顆粒球性の両方のMDSCは、未処置マウスの腫瘍から精製したMDSCよりCD8+ T細胞の分裂をより少ししか抑制することができないが、一方でこれらの同一の腫瘍を持つマウスの脾臓から精製した単球性および顆粒球性のMDSCでは、切断LLO発現するリステリアを用いたワクチン接種後にそれらの機能に変化がない(本明細書の実施例21を参照)。一実施形態では、抗原特異的な様式でのみ脾臓のMDSCは抑制的であるためこの効果が見られる。したがって、切断LLOを発現するリステリアを用いた治療は、TregおよびMDSCなどの腫瘍特異的な腫瘍抑制的な細胞の阻害を可能にする独特の利点を有する。切断LLOが発現する生きた弱毒化リステリアによって提供される本明細書に提供される方法および組成物の別の予想外の利点は、腫瘍内により少ない量のTregおよびMDSCがあること、およびT細胞の複製を抑制する能力を持続して失うものがあることであり、またこの効果は異種抗原などのLLO融合パートナーが無い場合でさえも観察される。
別の実施形態では、切断LLOを発現する生きた弱毒化リステリア株を投与することは、Treg媒介性およびMDSC媒介性T細胞抑制を抑制することによって抗腫瘍T細胞応答を強化する(本明細書に実施例21を参照する)。
一実施形態では、被験者内の疾患部位で抑制因子細胞のパーセンテージを減少する方法が本明細書に提供され、この方法は被験者に本明細書に提供される生きた弱毒化リステリア株を含む組成物、または生きた弱毒化リステリアワクチン株を含む組成物の混合物を投与する工程を含む。
別の実施形態では、被験者内の疾患部位で抑制因子細胞のT細胞の複製を抑制する能力を減少する方法が本明細書に提供され、この方法は被験者に本明細書に提供される生きた弱毒化リステリア株を含む組成物、または生きた弱毒化リステリアワクチン株を含む組成物の混合物を投与する工程を含む。
一実施形態では、疾患部位における抑制因子細胞の数の減少が疾患を効果的に治療する。別の実施形態では、疾患部位における抑制因子細胞の数の減少が、疾患部位において疾患を有する被験者内の抗疾患免疫応答を強化する。別の実施形態では、免疫応答は細胞媒介性免疫応答である。別の実施形態では、免疫応答は腫瘍浸潤性Tリンパ球(TIL)免疫応答である。
一実施形態では、本明細書に提供される方法は被験者内の疾患での抑制因子細胞のパーセンテージを減少し、被験者内の疾患に対する治療的な応答を強化する。
別の実施形態では、本明細書に提供される方法は被験者内の疾患での抑制因子細胞のT細胞の複製を抑制する能力を減少し、被験者内の疾患に対する治療的な応答を強化する。
一実施形態では、「パーセンテージを減少する」という用語は、アッセイまたは免疫応答において測定した際に、疾患部位におけるT浸潤性細胞の存在に対するその存在が減退または減少した、TregまたはMDSCのいずれかの抑制因子細胞の量を代表するものである。
別の実施形態では、「数の減少」という用語は、本明細書に提供されるリステリアベースのワクチンによって含まれる生きた弱毒化リステリア株、またはこれも本明細書のいずれかに記述される類似の効果を達成するこのワクチンの代替形態の投与の結果減退または減少したTregまたはMDSCのいずれかの抑制因子細胞の絶対数を指す。
一実施形態では、バイオマーカーまたは腫瘍マーカーが融合されるPEST含有ポリペプチドが本明細書に提供される。別の実施形態では、PEST含有ポリペプチドは、N末端リステリオリシンO(LLO)もしくは切断LLO、PESTアミノ酸配列もしくはPEST配列、またはN末端ActA配列もしくは切断ActAである。
別の実施形態では、本発明は、切断ActA、切断LLO、またはPESTアミノ酸配列をコードする孤立核酸、および腫瘍マーカーまたはその免疫原性の断片をコードする孤立核酸を含み、これはプロモーター/調節配列を含む核酸に動作可能にリンクし、これによって核酸が核酸によってコードされるタンパク質の発現を目的とする能力を有するのが好ましい。本発明はベクターも含み、このベクターは本発明の孤立核酸を含む。したがって、本発明は、細胞内での外来性DNAの同時発現を用いた外来性DNAの細胞の中への導入のための発現ベクターおよび方法を包含する。これは以下の文献(例えば、Sambrook et al.(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)、およびAusubel et al.(1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York)に記述されるようなものである。
別の実施形態では、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は少なくとも2つの塩基−糖−リン酸塩の組合せのストリングを指す。一実施形態では、この用語はDNAおよびRNAを含む。一実施形態では、「ヌクレオチド」は核酸高分子の単量体単位を指す。一実施形態では、RNAは、tRNA(転移RNA)、snRNA(核内低分子RNA)、rRNA(リボソームRNA)、mRNA(メッセンジャーRNA)、アンチセンスRNA、阻害的低分子RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、およびリボザイムの形態をとる。siRNAおよびmiRNAの使用が記述される(Caudy AA et al,Genes & Devel 16:2491−96およびこの中で引用される参考文献)。別の実施形態では、DNAは、プラスミドDNA、ウイルスDNA、線状DNA、もしくは染色体DNAの形態、またはこれらの群の誘導体とすることができる。追加的に、DNAおよびRNAのこれらの形態は、1本鎖、2本鎖、3本鎖、または4本鎖とすることができる。別の実施形態では、この用語は他の種類のバックボーンだが同一の塩基を含有する人工核酸も含む。一実施形態では、この人工核酸はPNA(ペプチド核酸)である。PNAはペプチドバックボーンおよびヌクレオチド塩基を含有し、また一実施形態では、DNAおよびRNA分子に結合することができる。別の実施形態では、このヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは1つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は当該技術分野で既知の未変性の核酸のリン酸バックボーンの任意の他の変異体を含有する。ホスホロチオエート核酸およびPNAの使用は、当業者に既知であり、また例えば、Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9:353−57、およびRaz NK et al Biochem Biophys Res Commun.297:1075−84に記述される。核酸の生産および使用は、当業者には既知であり、また例えば、Molecular Cloning,(2001),Sambrook and Russell, eds.およびMethods in Enzymology:Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G. C. Fareedに記述される。各々の核酸誘導体は、本発明の別個の実施形態を表す。
「孤立核酸」という用語は、配列から分離された自然に生じる状態で側面にある核酸セグメントまたは核酸断片、例えば、通常断片に隣接する配列から除去されたDNA断片、例えば、自然に生じたゲノム内で断片に隣接する配列を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。この用語は、細胞内に自然に添付する、核酸(例えば、RNAもしくはDNA、またはタンパク質)に自然に伴う実質的に他の構成成分から精製した核酸にも適用される。したがって、この用語は、例えば、ベクターの中へと、自己複製プラスミドもしくはウイルスの中へと、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAの中へと組込まれるか、あるいは他の配列とは独立した別個の分子(例えば、PCRまたは制限酵素の消化によって生産されたcDNA、またはゲノムの断片もしくはcDNAの断片)として存在する組み換え型DNAを含む。これは追加的なポリペプチド配列をコードする雑種遺伝子の部分である組み換え型DNAも含む。
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸は、シグナルペプチドまたは配列も含む。一実施形態では、異種抗原は、リステルアシグナル配列(例えば、溶血素シグナル配列またはactAシグナル配列)などのシグナル配列の使用を通して発現される場合がある。代替的には、例えば、融合タンパク質を作り出すことなく外来遺伝子をL.モノサイトゲネスプロモーターから下流で発現することができる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌性(リステリア性または非リステリア性)である。一実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対して内在性である。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対して外来性である。別の実施形態では、シグナルペプチドは、secA1シグナルペプチドなどのリステリア・モノサイトゲネスからのシグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ラクトコッカス・ラクティスからのUsp45シグナルペプチド、またはバチルス・アントラシスからの保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、p60シグナルペプチドなどの、リステリア・モノサイトゲネスからのsecA2シグナルペプチドである。追加的に、組み換え型核酸分子は、任意選択的にp60またはその断片をコードする第3ポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、シグナルペプチドは、バシラスサチリスTatシグナルペプチドなどのTatシグナルペプチド(例えば、PhoD)である。一実施形態では、シグナルペプチドは、組み換え型ポリペプチドをコードする同一の翻訳リーディングフレームである。
別の実施形態では、本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする孤立核酸を本発明は提供する。一実施形態では、孤立核酸は少なくとも65%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも75%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも85%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも90%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも95%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも97%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも99%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。
一実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクターを本発明は提供する。一実施形態では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には20個以下の塩基を有する短い核酸高分子を指す。一実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを本発明は提供する。一実施形態では、「ポリヌクレオチド」という用語は、一実施形態では5個より多い、別の実施形態では10個より多い、別の実施形態では20個より多い、別の実施形態では50個より多い、数多くのヌクレオチドの鎖を指す。一実施形態では、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、または核酸は、原核生物配列、真核生物のmRNA、真核生物のmRNAからのcDNA、真核生物(例えば、哺乳類)のDNAからのゲノムDNA配列、または合成DNA配列を指す場合がある。この用語は既知のDNAおよびRNAの塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。
一実施形態では本発明はリステリアを提供し、一実施形態ではこれは本発明の孤立核酸またはベクターを含むリステリアワクチン株である。
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質は、本明細書に提供されるリステリア株によって発現される。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質は、前記リステリア株の中に存在するプラスミドから発現される。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは、前記リステリアの染色体から発現される。一実施形態では、組み換え型ポリペプチドは本明細書に提供される融合タンパク質を含む。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは本明細書に提供される融合タンパク質である。
別の実施形態では、本明細書に提供される組成物によって含まれる生きた弱毒化zリステリア株は、各々第1および第2のポリペプチドをコードする第1および第2のオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸配列を含み、第1および第2のポリペプチドは各々PEST含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその断片を含む。
一実施形態では、エピソームの組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株が本明細書に提供され、核酸分子は各々が第1および第2のポリペプチドをコードする第1および第2のオープンリーディングフレームを含み、第1および第2のポリペプチドは各々PEST含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその断片を含み、また核酸は代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。一実施形態では、「エピソームの」または「エピソーム」という用語はリステリアなどの宿主細胞の中に存在するプラスミドを指す。
別の実施形態では、リステリア株は、各々がPEST含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその断片をコードする1〜5個のオープンリーディングフレームを含む組み換え型ヌクレオチドを含む。一実施形態では、本明細書に提供される異種抗原またはその断片およびPEST含有ポリペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内で翻訳される。別の実施形態では、本明細書に提供される各々の異種抗原性ポリペプチドおよびPEST含有ポリペプチドは、分離して翻訳された後で融合される。
一実施形態では、各々がPEST含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその断片をコードする組み換え型リステリア株を含む組成物は、1〜5個の組み換え型核酸を含む。
別の実施形態では、PEST含有ポリペプチドは、N末端切断LLOポリペプチド、N末端ActAポリペプチド、もしくはPESTペプチド、またはその断片である。別の実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性の断片である
一実施形態では、本明細書に提供される核酸分子は異種抗原をコードする第1のオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される核酸分子は代謝酵素をコードする第2のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体を欠いている内因性の遺伝子を相補する。別の実施形態では、第2のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はアラニン・ラセマーゼ酵素(dal)である。別の実施形態では、第2のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素(dat)である。一実施形態では、リステリアは追加的な代謝酵素をコードする第3のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、第3のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。別の実施形態では、核酸分子は異種抗原またはその断片をコードする第4のリーディングフレームを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株はゲノムのdal/dat遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株はdal/dat遺伝子を欠いている。別の実施形態では、dal/dat遺伝子は本明細書に提供される組み換え型リステリアで不活性化される。一実施形態では、「欠いている」という用語は、ゲノム病毒性遺伝子に関連するとき、病毒性遺伝子が突然変異した、または別の方法で染色体から機能的に発現されていないことを意味する。かかる用語は、染色体内の病毒性遺伝子の部分的な欠失または遺伝子全体の欠失も包含する場合がある。
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター/調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第1のオープンリーディングフレームは、プロモーター/調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第2のオープンリーディングフレームは、プロモーター/調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、オープンリーディングフレームの各々はプロモーター/調節配列に動作可能にリンクする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。
一実施形態では、弱毒化リステリア株は、Lm dal(−)dat(−)(Lmdd)である。別の実施形態では、弱毒化株は、Lm dal(−)dat(−)ΔactA(LmddA)である。LmddAは、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病毒性遺伝子actAの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または切断LLO発現のためにdal遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。別の実施形態では、弱毒化株はLmDactAである。別の実施形態では、弱毒化株はLmDPrfAである。別の実施形態では、弱毒化株はLmDPlcBである。別の実施形態では、弱毒化株はLmDPlcAである。別の実施形態では、株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株はEGDリステリアバックボーンから構造化される。別の実施形態では、本発明で使用される株は非溶血性LLOを発現するリステリア株である。
別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株は、栄養要求性突然変異体である。別の実施形態では、リステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株はAA代謝酵素が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はD−グルタミン酸酵素遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はdat遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はdal遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はdga遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が欠損している。CysK。別の実施形態では、遺伝子はビタミンB12とは関係のないメチオニンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はtrpAである。別の実施形態では、遺伝子はtrpBである。別の実施形態では、遺伝子はtrpEである。別の実施形態では、遺伝子はasnBである。別の実施形態では、遺伝子はgltDである。別の実施形態では、遺伝子はgltBである。別の実施形態では、遺伝子はleuAである。別の実施形態では、遺伝子はargGである。別の実施形態では、遺伝子はthrCである。別の実施形態では、リステリア株は上述の遺伝子のうちの1つ以上が欠損している。
別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株は、酵素遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子は、AA合成遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、folPである。別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はispDである。別の実施形態では、遺伝子はispFである。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はhisFである。別の実施形態では、遺伝子はhisHである。別の実施形態では、遺伝子はfliIである。別の実施形態では、遺伝子はリボソームの大型サブユニットプソイドウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はispDである。別の実施形態では、遺伝子は二機能性GMPシンターゼ/グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はcobSである。別の実施形態では、遺伝子はcobBである。別の実施形態では、遺伝子はcbiDである。別の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン−IIIC−メチルトランスフェラーゼ/ウロポルフィリノゲン−IIIシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はcobQである。別の実施形態では、遺伝子はuppSである。別の実施形態では、遺伝子はtruBである。別の実施形態では、遺伝子はdxsである。別の実施形態では、遺伝子はmvaSである。別の実施形態では、遺伝子はdapAである。別の実施形態では、遺伝子はispGである。別の実施形態では、遺伝子はfolCである。別の実施形態では、遺伝子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はargJである。別の実施形態では、遺伝子は3−デオキシ−7−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はインドール−3−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ/グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はmenBである。別の実施形態では、遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼIまたはIIである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はcarBである。別の実施形態では、遺伝子はcarAである。別の実施形態では、遺伝子はthyAである。別の実施形態では、遺伝子はmgsAである。別の実施形態では、遺伝子はaroBである。別の実施形態では、遺伝子はhepBである。別の実施形態では、遺伝子はrluBである。別の実施形態では、遺伝子はilvBである。別の実施形態では、遺伝子はilvNである。別の実施形態では、遺伝子はalsSである。別の実施形態では、遺伝子はfabFである。別の実施形態では、遺伝子はfabHである。別の実施形態では、遺伝子はプソイドウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はpyrGである。別の実施形態では、遺伝子はtruAである。別の実施形態では、遺伝子はpabBである。別の実施形態では、遺伝子はatpシンターゼ遺伝子(例えば、atpC、atpD−2、aptG、atpA−2、等々)である。
別の実施形態では、遺伝子はphoPである。別の実施形態では、遺伝子はaroAである。別の実施形態では、遺伝子はaroCである。別の実施形態では、遺伝子はaroDである。別の実施形態では、遺伝子はplcBである。
別の実施形態では、リステリア株はペプチド輸送体が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はABC輸送体/ATP結合/パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドABC輸送体/オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドABC輸送体/パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ABC輸送体/亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は糖ABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はZIP亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はEmrB/QacAファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は蟻酸塩/亜硝酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン/プトレシンABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はNa/Pi共輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミンABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は主要な促進薬ファミリーの輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン/L−プロリンABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はテイコ酸ABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアミノ酸ABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は鉄化合物ABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース/マルトデキストリンABC輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はBcr/CflAファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は上記のタンパク質のうちの1つのサブユニットである。
一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書に提供される。別の実施形態では、リステリアを形質転換するために使用される本明細書に提供される核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれ、非機能性病毒性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリア内で突然変異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内因性の遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態では、病毒性遺伝子は、ActA遺伝子、inlA遺伝子ならびにinlB遺伝子、inlC遺伝子、inlJ遺伝子、plbC遺伝子、bsh遺伝子、またはprfA遺伝子である。病毒性遺伝子は、組み換え型リステリア内で、当該技術分野で既知の病毒性と関連付けられる任意の遺伝子とすることができることが当業者によって理解されるべきである。
さらに別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株は、inlA突然変異体、inlB突然変異体、inlC突然変異体、inlJ突然変異体、prfA突然変異体、ActA突然変異体、prfA突然変異体、plcB欠失突然変異体、またはplcAおよびplcBの両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態では、リステリアはこれらの遺伝子の個別でまたは組合せでの欠失または突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、遺伝子のうちの各々のものを欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、actA、prfA、およびdal/dat遺伝子を含む本明細書に提供される遺伝子のうちの少なくとも1つでかつ最高10個を欠いている。一実施形態では、生きた弱毒化リステリアは、組み換え型リステリアである。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンB(inlB)遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムActA遺伝子およびゲノムインターナリンB遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンC(inlC)遺伝子の突然変異または欠失を含む。一実施形態では、リステリアの隣接するT細胞への転座は、プロセス中に関与するActA遺伝子および/またはinlC遺伝子の欠失によって阻害され、それによって、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。
各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、等々はリステリア株の染色体を欠いている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、等々はリステリア株の染色体および何らかのエピソームの遺伝要素を欠いている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、等々は、病毒性株のゲノムを欠いている。一実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は染色体から欠失される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
一実施形態では、本明細書に提供される代謝酵素または相補する遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で増殖した。別の実施形態では、D−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、D−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、また栄養要求性細菌はD−グルタミン酸無しで増殖することになり、一方でD−グルタミン酸合成のためにプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、増殖しないことになる。別の実施形態では、D−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがD−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする孤立核酸を含む場合、本発明のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときD−アラニン無しで増殖することになる。必要な増殖因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生剤、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、また市販されている(Becton−Dickinson、米国ニュージャージー州Franklin Lakes)。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一旦選択されると、この細菌は適切な培地上で選択的な圧力の存在の中で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の増殖を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドの複製を確保し、したがって継続的にプラスミドが規制する細菌を選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本発明の使用に適合されことを当業者は理解するであろう。
別の実施形態では、本明細書に提供される構築体または核酸分子は相同的組み換えを使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる。相同的組み換えのための技法は周知であり、また例えば以下の文献に記述されている。Baloglu S、Boyle SM、et al.(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein.Vet Microbiol 2005、109(1−2):11−7)、およびJiang LL, Song HH, et al.,(Characterization of a mutant Listeria monocytogenes strain expressing green fluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005、37(1):19−24)。別の実施形態では、相同的組み換えを米国特許第6,855,320号に記述されるように実施した。この場合、E7を発現する組み換え型Lm株は、hlyプロモーターの制御下で、また遺伝子生成物の分泌を確保するためにhlyシグナル配列を含むことによって、E7遺伝子の染色体組込によって作成され、Lm−AZ/E7と称される組み換え型を得る。別の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。各々の技法は本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、また中でも以下のSunらの文献 (Infection and Immunity 1990, 58:3770−3778)にDP−L967の構築について記述されている。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという有利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されるゲノム内の位置が未知であるという不利点を有する。
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる(Lauer P, Chow MY et al,Construction,characterization,and use of two Listeria monocytogenes site−specific phage integration vectors.J Bacteriol 2002;184(15):4177−86)。この方法のある特定の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位(例えば、comKまたはarg tRNA遺伝子のc端)の中へとインサートするために、バクテリオファージ(例えば、U153またはPSAリステリオファージ)のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体または異種遺伝子組込の前に利用された付着部位から回復した。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。組込別の実施形態では、本発明は、臨床用途のためのファージベースの染色体組込系をさらに含み、ここでd−アラニン・ラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素のための栄養要求性である宿主株を使用することができ、例えば、Lmdal(−)dat(−)である。別の実施形態では、「ファージ治癒工程」を避けるためにPSAベースのファージ組込系を使用した。別の実施形態では、これは組込まれた遺伝子を維持するための抗生物質による継続的な選択を要求する。したがって、別の実施形態では、本発明は、抗生物質を用いた選択を要求しないファージベースの染色体組込系の確立を可能にする。別の方法で、栄養要求性宿主株を相補することができる。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、本明細書に提供されるような方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、任意の細胞(原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類の細胞を含む)内で構造的にまたは誘導的に発現する目的の任意のファージベースの組み換え型発現系を指す。ファージ発現ベクターは、典型的には、細菌細胞内で再生すること、および適切な条件下でファージ粒子を生成することの両方を可能にすることができる。この用語は線形または円形の発現系を含み、またエピソームのまま、または宿主細胞ゲノムの中へと組込まれた両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、LLO、PEST、もしくはActA配列またはその断片をコードする内因性の核酸配列を用いてエピソームベクターまたはプラスミドベクターから発現される。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態でプラスミドは組み換え型リステリアワクチン株内で安定して維持される。別の実施形態では、プラスミドは組み換え型リステリア上に抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性の断片である 別の実施形態では、構築体または核酸分子は、各々が第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレームおよび少なくとも第2のオープンリーディングフレームを含み、第1のおよび第2のポリペプチドは各々PEST含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその機能的断片を含む。
一実施形態では、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、潜在的にタンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生命体のゲノムの部分である。別の実施形態では、ORFの開始端および停止端はmRNAの端部と同等でないが、通常のmRNA中に含まれる。一実施形態では、ORFは、遺伝子の開始コード配列(開始コドン)と停止コドン配列(終止コドン)との間に位置する。したがって、一実施形態では、内因性のポリペプチドとともにオープンリーディングフレームとして動作可能にゲノムの中へと組込まれる核酸分子は、内因性のポリペプチドと同一のオープンリーディングフレーム内でゲノムの中へと組込まれた核酸分子である。
「安定して維持される」とは、別の実施形態では、選択(例えば、抗生物質選択)無しで検出可能な損失無しでの、核酸分子またはプラスミドの10世代の間の維持を指す。別の実施形態では、期間は15世代である。別の実施形態では、期間は20世代である。別の実施形態では、期間は25世代である。別の実施形態では、期間は30世代である。別の実施形態では、期間は40世代である。別の実施形態では、期間は50世代である。別の実施形態では、期間は60世代である。別の実施形態では、期間は80世代である。別の実施形態では、期間は100世代である。別の実施形態では、期間は150世代である。別の実施形態では、期間は200世代である。別の実施形態では、期間は300世代である。別の実施形態では、期間は500世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで(例えば、培養液内で)安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、「機能的断片」は、単独でまたは本明細書に提供されるワクチンもしくは組成物内で被験者に投与するときに免疫応答を引き出す能力を有する免疫原性断片である。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、また本明細書にさらに提供されるように、機能的断片は生物活性を有する。
別の実施形態では、本明細書に提供される抗原は以下の疾患のうちの1つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、A型肝炎、B型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、1型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、X連鎖高Igm症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
一実施形態では、本明細書に提供される疾患は感染性疾患である。一実施形態では、感染性疾患は以下の病原体(しかしこれに限定されない)のうちの1つによって生じたものである。BCG/結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、B型肝炎、ヒトパピロマウイルス、季節性インフルエンザ)、汎発性インフルエンザA(H1N1)、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌A+C、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリヌス毒素(ボツリヌス中毒症)、エルシニア・ペスチス(ペスト)、大痘瘡(天然痘)、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス(野兎病)、ウイルス性出血熱、アレナウイルス(LCM、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱)、ブニヤウイルス(ハンタウイルス、リフトバレー熱)、フラビウイルス(デング)、フィロウイルス(エボラ、マールブルグ)、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー(Q熱)、ブルセラ種(ブルセラ症)、バークホルデリア・マレイ(鼻疽)、クラミジア・シタッシ(オウム病)、リシン毒素(リシナス・コンムニス由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンB、発疹チフス(リケッチア・プロワゼキ)、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌(下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラBCG/、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ)、ウイルス(カルシウイルス、A型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、VEE、EEE、WEE、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピロマウイルス(HPV))、原虫(クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ)、真菌類(微胞子虫)、黄熱病、薬剤耐性TBを含む結核、狂犬病、プリオン、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候(SARS−CoV)、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または本明細書に列挙されていない当該技術分野で既知の任意の他の感染性疾患。
別の実施形態では、感染性疾患は、家畜の感染性疾患である。別の実施形態では、家畜の疾患は、人間に伝染する可能性があり、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態では、これらの疾患としては、口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ウシ感染性鼻気管炎(IBR)、仮性狂犬病、ブタコレラ(CSF)、牛の1型ウシヘルペスウイルス(BHV−1)感染によって生じるIBR、および豚の仮性狂犬病(オーエスキー病)、トキソプラズマ症、炭疽病、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト(エルシニア・ペスチス)、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。
別の実施形態では、本明細書に提供される疾患は呼吸器または炎症性疾患である。別の実施形態では、呼吸器疾患または炎症性疾患は慢性閉塞性肺疾患(COPD)である。別の実施形態では、疾患は喘息である。
一実施形態では、生きた弱毒化リステリア株は、抗炎症剤または気管支拡張剤などの他の治療薬を同時投与せずに喘息の症状を軽減する能力を有する。別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、被験者に生きた弱毒化リステリア株および1つ以上の治療薬を同時投与する工程をさらに含む。別の実施形態では、治療薬は抗喘息薬である。別の実施形態では、薬剤は抗炎症剤、非ステロイド抗炎症剤、抗生物質、抗コリン剤、気管支拡張剤、副腎皮質ステロイド、短時間作用型β作動薬、長時間作用型β作動薬、組み合わせ吸入器、抗ヒスタミン剤、またはこれらの組合せである。
一実施形態では、本明細書に提供される疾患はガンまたは腫瘍である。一実施形態では、本発明の方法で治療されるガンは乳ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮頸ガンである。別の実施形態では、このガンはHER2を含有するガンである。別の実施形態では、このガンはメラノーマである。別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、これは多形性膠芽腫である。別の実施形態では、これは中皮腫である。別の実施形態では、このガンは結腸直腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物(例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種)である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞性肺ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。別の実施形態では、このガンは口腔咽頭ガンである。別の実施形態では、このガンは肺ガンである。別の実施形態では、このガンは肛門ガンである。別の実施形態では、このガンは結腸直腸ガンである。別の実施形態では、このガンは食道ガンである。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
一実施形態では、本明細書に提供される腫瘍マーカーは、異種腫瘍抗原であり、これは本明細書に「腫瘍抗原」、「抗原性ポリペプチド」、または「抗原」とも称される。別の実施形態では、抗原は、ヒトパピロマウイルス−E7(HPV−E7)抗原であり、これは一実施形態では、HPV16(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号AAD33253)由来であり、また別の実施形態では、HPV18(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号P06788)由来である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはHPV−E6であり、これは一実施形態では、HPV16(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号AAD33252、AAM51854、AAM51853、またはAAB67615)由来であり、また別の実施形態ではHPV18(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号P06463)由来である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、Her/2−neu抗原である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは前立腺特異的な抗原(PSA)(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号CAD30844、CAD54617、AAA58802、またはNP-001639)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは角質層キモトリプシン様酵素(SCCE)抗原(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号AAK69652、AAK69624、AAG33360、AAF01139、またはAAC37551)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはウィルムス腫瘍抗原1であり、これは別の実施形態では、WT−1テロメラーゼ(遺伝子銀行アクセス 番号P49952、P22561、NP−659032、CAC39220.2、またはEAW68222.1)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはhTERTまたはテロメラーゼ(遺伝子銀行アクセス 番号NM003219(変異体1)、NM198255(変異体2)、NM198253(変異体3)、またはNM198254(変異体4)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはプロテイナーゼ3(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号M29142、M75154、M96839、X55668、NM00277、M96628、またはX56606)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはチロシナーゼ関連タンパク質2(TRP2)(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号NP-001913、ABI73976、AAP33051、またはQ95119)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは高分子量メラノーマ関連抗原(HMW−MAA)(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号NP-001888、AAI28111、またはAAQ62842)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはテスティシン(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号AAF79020、AAF79019、AAG02255、AAK29360、AAD41588、またはNP-659206)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはNY−ESO−1抗原(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号CAA05908、P78358、AAB49693、またはNP-640343)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはPSCA(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号AAH65183、NP-005663、NP-082492、O43653、またはCAB97347)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはインターロイキン(IL)13受容体α(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号NP-000631、NP-001551、NP-032382、NP-598751、NP-001003075、またはNP-999506)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは炭酸脱水酵素IX(CAIX)(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号CAI13455、CAI10985、EAW58359、NP-001207、NP-647466、またはNP-001101426)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはガン胎児抗原(CEA)(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号AAA66186、CAA79884、CAA66955、AAA51966、AAD15250、またはAAA51970.)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはMAGE−A(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号NP-786885、NP-786884、NP-005352、NP-004979、NP-005358、またはNP-005353)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはサバイビン(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号AAC51660、AAY15202、ABF60110、NP-001003019、またはNP-001082350)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはGP100(一実施形態では、遺伝子銀行受入番号AAC60634、YP-655861、またはAAB31176)である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは当該技術分野で既知の任意の他の抗原性ポリペプチドである。別の実施形態では、組成物および本発明の方法の抗原性ペプチドは抗原性ポリペプチドの免疫原性部分を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、本明細書に提供される抗原はHPV−E6である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼ(TERT)である。別の実施形態では、抗原はLMP−1である。別の実施形態では、抗原はp53である。別の実施形態では、抗原はメソテリンである。別の実施形態では、抗原はEGFRVIIIである。別の実施形態では、抗原は炭酸脱水酵素IX(CAIX)である。別の実施形態では、抗原はPSMAである。別の実施形態では、抗原はHMW−MAAである。別の実施形態では、抗原はHIV−1 Gagである。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質2である。別の実施形態では、抗原は、HPV−E7、HPV−E6、Her−2、HIV−1 Gag、LMP−1、p53、PSMA、ガン胎児抗原(CEA)、LMP−1、カリクレイン関連ペプチダーゼ3(KLK3)、KLK9、Muc、チロシナーゼ関連タンパク質2、Muc1、FAP、IL−13Rα2、PSA(前立腺特異的な抗原)、MAGE−1、MAGE−3、gp−100、熱ショックタンパク質70(HSP−70)、β−HCG、EGFR−III、VEGFR2、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、アンジオゲニン、アンジオポエチン−1、Del−1、線維芽細胞増殖因子:酸性(aFGF)もしくは塩基性(bFGF)、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、肝細胞増殖因子(HGF)/分散因子(SF)、インターロイキン−8(IL−8)、レプチン、ミッドカイン、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞成長因子(PD−ECGF)、血小板由来増殖因子−BB(PDGF−BB)、プレイオトロフィン(PTN)、プログラヌリン、プロリフェリン、形質転換増殖因子−α(TGF−α)、形質転換増殖因子−β(TGF−β)、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、血管内皮増殖因子(VEGF)/血管透過性因子(VPF)、VEGFR、VEGFR2(KDR/FLK−1)もしくはその断片、FLK−1もしくはそのエピトープ、FLK−E1、FLK−E2、FLK−I1、エンドグリンもしくはその断片、ニューロピリン1(NRP−1)、アンジオポエチン1(Ang1)、Tie2、血小板由来増殖因子(PDGF)、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)、形質転換増殖因子−β(TGF−β)、エンドグリン、TGF−β受容体、単球走化性タンパク質−1(MCP−1)、VE−カドヘリン、CD31、エフリン、ICAM−1、V−CAM−1、VAP−1、E−セレクチン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−1、一酸化窒素シンターゼ(NOS)、COX−2、AC133、もしくはId1/Id3、アンジオポエチン3、アンジオポエチン4、アンジオポエチン6、CD105、EDG、HHT1、ORW、ORW1もしくはTGFβ共受容体、またはこれらの組合せから選択される。本明細書に提供される抗原の断片の使用も本発明に包含される。
別の実施形態では、本明細書に提供される異種抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、以下の腫瘍抗原のうちの1つである。MAGE(メラノーマ関連抗原E)タンパク質、例えば、MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、チロシナーゼ;突然変異rasタンパク質;突然変異p53タンパク質;進行ガンと関連付けられたp97メラノーマ抗原、rasペプチドもしくはp53ペプチド;子宮頸ガンと関連付けられたHPV16/18抗原、乳ガンと関連付けられたKLH抗原、結腸直腸ガンと関連付けられたCEA(ガン胎児抗原)、メラノーマと関連付けられたMART1抗原、または前立腺ガンと関連付けられたPSA抗原。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、gp−100、チロシナーゼ、HSP−70、β−HCG、またはこれらの組合せである。一実施形態では、抗原は米国特出願公開第2011/0142791号(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記述されるキメラHer2抗原である。
本明細書に記述していないが当該技術分野で既知の任意の異種抗原を、本明細書に提供される方法および組成物で使用するために、当業者が使用することができるであろうということが理解される。
別の実施形態では、抗原は、菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスに由来する。別の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、HIV gp120、HIV gagタンパク質、IgAプロテアーゼ、インシュリンペプチドB、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ−関連抗原(TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、gp−100、チロシナーゼ、MART−1、HSP−70、β−HCG)、タイプHPV−16、−18、−31、−33、−35、または−45からのヒトパピロマウイルス抗原E1およびE2、腫瘍抗原CEA、突然変異したまたはしていないrasタンパク質、突然変異したまたはしていないp53タンパク質、Muc1、メソテリン、EGFRVIII、またはpSAから選択される。
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用するための血管形成因子はVEGFR2である。
一実施形態では、血管内皮増殖因子(VEGF)は、脈管形成(胚循環系の形成)および血管形成(既存の血管系からの血管の増殖)の両方に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。一実施形態では、VEGF活性は、主に脈管内皮の細胞に制限されるが、これは確かに限られた数の他の細胞タイプ(例えば、刺激単球/マクロファージ遊走)に効果を有する。インビトロでは、VEGFは内皮細胞有糸分裂誘発および細胞遊走の刺激を示してきた。VEGFは、微小血管の透過性も強化し、これはしばしば脈管透過性因子と称される。
一実施形態では、VEGFファミリーのすべてのメンバーは、細胞表面上でチロシンキナーゼ受容体(VEGFR)へと結合することによって細胞応答を刺激し、これらを二量体化させ、トランスリン酸化を通して活性化させる。VEGF受容体は、7つの免疫グロブリン様領域、単一の膜貫通領域、および分割したチロシンキナーゼドメインを含有する細胞内部分から構成される細胞外部分を有する。
一実施形態では、VEGF−Aは、VEGFR−2(KDR/Flk−1)リガンド、ならびにVEGFR−1(Flt−1)リガンドである。一実施形態では、VEGFR−は既知のほとんどすべての細胞応答をVEGFに媒介する。VEGFR−1の機能はあまりよく定義されていないが、一実施形態ではVEGFのVEGFR−2結合からの分画を通してVEGFR−2シグナル伝達を調節すると考えられており、一実施形態では、これは胎芽内での脈管形成の間特に重要である。一実施形態では、VEGF−CおよびVEGF−Dは、VEGFR−3受容体のリガンドであり、これは、一実施形態では、リンパ脈管形成を媒介する。
一実施形態では、本発明の組み換え型リステリアはVEGF受容体またはその断片を発現し、これは、一実施形態では、VEGFR−2であり、また別の実施形態では、VEGFR−1であり、さらに別の実施形態では、VEGFR−3である。
一実施形態では、血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)が活性化した内皮細胞(EC)上で高度に発現され、新しい血管の形成に関与している。一実施形態では、VEGFR2はVEGFの5つのアイソフォームすべてを結合する。一実施形態では、VEGFR2を通したEC上のVEGFのシグナル伝達は増殖、遊走および最終的な分化を誘発する。一実施形態では、VEGFR2のマウスホモログは胎児肝臓キナーゼ遺伝子−1(Flk−1)であり、これは強い治療的な標的であり、また腫瘍増殖、浸潤、および転移において重要な役割を有する。一実施形態では、VEGFR2は、キナーゼインサートドメイン受容体(タイプIII受容体チロシンキナーゼ)(KDR)、表面抗原分類309(CD309)、FLK1、Ly73、Krd−1、VEGFR、VEGFR−2、または6130401C07とも称される。
別の実施形態では、本発明の組成物で使用されるVEGFR2タンパク質は以下の配列を有する。
別の実施形態では、VEGFR2は以下の遺伝子銀行エントリのうちの1つに示されるアミノ酸配列を有する。EDL37891.1;CAA61917.1;BAC27532.1;BAE24892.1;AAH20530.1;AAB25043.1;CAA42040.1;またはCAA50192.1。別の実施形態では、VEGFR2は以下の遺伝子銀行エントリのうちの1つに示されるアミノ酸配列を有する。EAX05462.1;EAX05463.1;EAX05464.1;CAA61916.1;BAD93138.1;AAB88005.1;AAC16450.1;BAG57114.1;AAI31823.1;ACF47599.1;AAA59459.1;またはCAA43837.1。別の実施形態では、VEGFR2は以下の遺伝子銀行エントリのうちの1つに示されるアミノ酸配列を有する。EDL89914.1;EDL89915.1;EDL89916.1;AAH87029.1;AAB97508.1;またはAAB97509.1。別の実施形態では、VEGFR2は以下の遺伝子銀行エントリのうちの1つに示されるアミノ酸配列を有する。CAQ13438.1;AAF03237.1;AAN47136.1;AAL16381.1;AAI29159.1;CAM73177.1;AAB18415.1;AAB41042.1;またはAAB62405.1。別の実施形態では、VEGFR2は当該技術分野で既知の任意のVEGFR2アミノ酸配列を有する。別の実施形態では、VEGFR2は上記の遺伝子銀行エントリのうちの1つからの配列の相同体である。別の実施形態では、VEGFR2は上記の遺伝子銀行エントリのうちの1つからの配列の変異体である。別の実施形態では、VEGFR2は上記の遺伝子銀行エントリのうちの1つからの配列のアイソフォームである。別の実施形態では、VEGFR2は上記の遺伝子銀行エントリのうちの1つからの配列の断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、VEGFR2は以下の遺伝子銀行エントリのうちの1つに示される核酸配列を有する。AC124615.11;AC134903.4;AC160723.2;AF061804.1;AF153058.1;CH466524.1;X89777.1;AK031739.1;AK054510.1;AK141938.1;BC020530.1;S53103.1;X59397.1;またはX70842.1。別の実施形態では、VEGFR2は以下の遺伝子銀行エントリのうちの1つに示される核酸配列を有する。AC021220.7;AC111194.4;CH471057.1;EAX05463.1;EAX05464.1;X89776.1;AB209901.1;AF035121.1;AF063658.1;AK293668.1;BC131822.1;BP280621.1;CR606055.1;EU826563.1;L04947.1;またはX61656.1。別の実施形態では、VEGFR2は以下の遺伝子銀行エントリのうちの1つに示される核酸配列を有する。CH473981.1;BC087029.1;U93306.1;またはU93307.1。別の実施形態では、VEGFR2は以下の遺伝子銀行エントリのうちの1つに示される核酸配列を有する。AL935131.7;BX247946.6;CR759732.9;AF180354.1;AF487829.1;AY056466.1;BC129158.1;CU458916.1;U75995.1;U82383.1;U89515.1。別の実施形態では、VEGFR2は当該技術分野で既知の任意のVEGFR2核酸配列を有する。別の実施形態では、VEGFR2は、上記の遺伝子銀行エントリのうちの1つからの配列の相同体である。別の実施形態では、VEGFR2は上記の遺伝子銀行エントリのうちの1つからの配列の変異体である。別の実施形態では、VEGFR2は上記の遺伝子銀行エントリのうちの1つからの配列のアイソフォームである。別の実施形態では、VEGFR2は上記の遺伝子銀行エントリのうちの1つからの配列の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は本発明の組成物および方法で利用される。別の実施形態では、VEGFR2断片は、VEGFR2タンパク質のアミノ酸68〜277を含み、これは、一実施形態では、Flk1−E1と称される。別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は、以下の配列を有する。
RDSEERVLVTECGGGDSIFCKTLTIPRVVGNDTGAYKCSYRDVDIASTVYVYVRDYRSPFIASVSDQHGIVYITENKNKTVVIPCRGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISWDSEIGFTLPSYMISYAGMVFCEAKINDETYQSIMYIVVVVGYRIYDVILSPPHEIELSAGEKLVLNCTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKKIVNR(配列番号:138)。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のVEGFR2 AA配列は配列番号:138に示される配列を含む。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:138の相同体である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:138の変異体である。別の実施形態では、VEGFR2 AA 配列は配列番号:138の断片である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:138のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、VEGFR2断片は、VEGFR2タンパク質のアミノ酸545〜730を含み、これは、一実施形態では、Flk1−E2と称される。別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は、以下の配列を有する。
VIRGPEITVQPAAQPTEQESVSLLCTADRNTFENLTWYKLGSQATSVHMGESLTPVCKNLDALWKLNGTMFSNSTNDILIVAFQNASLQDQGDYVCSAQDKKTKKRHCLVKQLIILERMAPMITGNLENQTTTIGETIEVTCPASGNPTPHITWFKDNETLVEDSGIVLRDGNRNLTIRRVRKEDG(配列番号:139)。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のVEGFR2 AA配列は配列番号:139に示される配列を含む。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:139の相同体である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:139の変異体である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:139の断片である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:139のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、VEGFR2断片は、VEGFR2タンパク質のアミノ酸792〜1081を含み、これは、一実施形態では、Flk1−I1と称される。別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は、以下の配列を有する。
EGELKTGYLSIVMDPDELPLDERCERLPYDASKWEFPRDRLKLGKPLGRGAFGQVIEADAFGIDKTATCKTVAVKMLKEGATHSEHRALMSELKILIHIGHHLNVVNLLGACTKPGGPLMVIVEFCKFGNLSTYLRGKRNEFVPYKSKGARFRQGKDYVGELSVDLKRRLDSITSSQSSASSGFVEEKSLSDVEEEEASEELYKDFLTLEHLICYSFQVAKGMEFLASRKCIHRDLAARNILLSEKNVVKICDFGLARDIYKDPDYVRKGDARLPLKWMAPETIFDRVYT(配列番号:140)。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のVEGFR2 AA配列は配列番号:140に示される配列を含む。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:140の相同体である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:140の変異体である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:140の断片である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:140のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、VEGFR2断片は、VEGFR2タンパク質のアミノ酸1082〜1237を含み、これは、一実施形態では、Flk1−I2と称される。別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は、以下の配列を有する。
IQSDVWSFGVLLWEIFSLGASPYPGVKIDEEFCRRLKEGTRMRAPDYTTPEMYQTMLDCWHEDPNQRPSFSELVEHLGNLLQANAQQDGKDYIVLPMSETLSMEEDSGLSLPTSPVSCMEEEEVCDPKFHYDNTAGISHYLQNSKRKSRPVSVKTF(配列番号:141)。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のVEGFR2 AA配列は配列番号:141に示される配列を含む。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:141の相同体である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:141の変異体である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:141の断片である。別の実施形態では、VEGFR2 AA配列は配列番号:141のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるVEGFR2断片は、T細胞エピトープを含有する領域についてVEGFR2アミノ酸配列を解析することに基づき、一実施形態では、そのいくつかが当該技術分野で既知であるエピトープ予測プログラムを通してVEGFR2配列を実行することによって決定され、また別の実施形態では、予測エピトープマッピングによって決定される。別の実施形態では、VEGFR2断片は、一実施形態では、T細胞エピトープを含むことが既知であるマウスまたはラットである他の種において、VEGFR2配列と相同体であるヒト配列を使用することによって使用される。別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるVEGFR2断片は、T細胞エピトープを含有するVEGFR2の領域に関する当該技術分野での知識に基づく。
一実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトHLA−A0201断片は、VEGFR2タンパク質のアミノ酸766〜774を含む。別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は配列IILVGTAVI(配列番号:142)を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトHLA−A0201断片は、VEGFR2タンパク質のアミノ酸781〜789を含む。別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は配列LLVIILRTV(配列番号:143)を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトHLA−A0201断片は、VEGFR2タンパク質のアミノ酸1034〜1042を含む。別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は配列ILLSEKNVV(配列番号:144)を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトHLA−A0201断片は、VEGFR2タンパク質のアミノ酸1076〜1084を含む。別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は配列TIFDRVYTI(配列番号:145)を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトHLA−A0201断片は、VEGFR2タンパク質のアミノ酸1093〜1101を含む。別の実施形態では、VEGFR2ポリペプチド断片は配列VLLWEIFSL(配列番号:146)を含む。
一実施形態では、エンドグリンタンパク質は以下の配列で示される。
MDRGVLPLPITLLLFEIYSFEPTTGLAERVGCDLQPVDPTRGEVTFTTSQVSEGCVAQAANAVREVHVLFLDFPGMLSHLELTLQASKQNGTETREVFLVLVSNKNVFVKFQAPEIPLHLAYDSSLVIFQGQPRVNITVLPSLTSRKQILDWAATKGAITSIAALDDPQSIVLQLGQDPKAPFLCLPEAHKDMGATLEWQPRAQTPVQSCRLEGVSGHKEAYILRILPGSEAGPRTVTVMMELSCTSGDAILILHGPPYVSWFIDINHSMQILTTGEYSVKIFPGSKVKGVELPDTPQGLIAEARKLNASIVTSFVELPLVSNVSLRASSCGGVFQTTPAPVVTTPPKDTCSPVLLMSLIQPKCGNQVMTLALNKKHVQTLQCTITGLTFWDSSCQAEDTDDHLVLSSAYSSCGMKVTAHVVSNEVIISFPSGSPPLRKKVQCIDMDSLSFQLGLYLSPHFLQASNTIELGQQAFVQVSVSPLTSEVTVQLDSCHLDLGPEGDMVELIQSRTAKGSCVTLLSPSPEGDPRFSFLLRVYMVPTPTAGTLSCNLALRPSTLSQEVYKTVSMRLNVVSPDLSGKGLVLPSVLGITFGAFLIGALLTAALWYIYSHTRGPSKREPVVAVAAPASSESSSTNHSIGSTQSTPCSTSSMA(配列番号:147、図60)。一実施形態では、このエンドグリンは、当該技術分野で入手可能ないずれかのエンドグリンであり、以下の受入番号は挙げられるがこれに限定されない。CAA54917.1、NP_001010968.1、NP_001074356.1、AAC63386.1、CAA50891。別の実施形態では、aa 17〜319は構築体CD105Aに対応する。別の実施形態では、aa 359〜599は構築体CD105Bに対応する。
リステリアベースのワクチンは、生きた弱毒化リステリア株の混合物と同時投与される治療薬との両方を含有してもよい。生きた弱毒化リステリア株および同時投与する治療薬はまた、異なる医薬組成物内にあってもよい。
一実施形態では、薬剤は吸入コルチコステロイド剤を含む、これにはフルチカゾン(Flovent Diskus、Flovent HFA)、ブデソニド(Pulmicort Flexhaler)、モメタゾン(Asmanex)、フルニソリド(Aerobid)、ベクロメタゾン(Qvar)、および他のものが挙げられる。これらは最も一般的に処方されるタイプの長期喘息薬である。経口コルチコステロイド剤と異なり、これらのコルチコステロイド薬は、副作用のリスクが比較的低く、一般的に長期間の使用が安全である。
この薬剤はロイコトリエン修飾薬とすることができる。これらの経口薬としては、モンテルカスト(Singulair)、ザフィルルカスト(Accolate)、およびジレウトン(Zyflo、Zyflo CR)が挙げられる。これらは最高24時間まで喘息症状の防止に役立つ。
さらに、この薬剤を長時間作用型β作動薬(LABA)とすることができる。これらの吸入薬物治療としては、サルメテロール(Serevent Diskus)、およびホルモテロール(Foradil Aerolizer)が挙げられる。LABAは、気道を開き、炎症を減少する。しかしながらこれらは重篤な喘息発作につながっている。LABAは吸入式コルチコステロイドと組み合わせてのみ使用するべきである。
一実施形態では、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物はアジュバントを含む。別の実施形態では、アジュバントは顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントはGM−CSFタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはGM−CSFをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントはGM−CSFをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンQS21である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンQS21を含む。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドAである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリルリピドAを含む。別の実施形態では、アジュバントはSBAS2である。別の実施形態では、アジュバントはSBAS2を含む。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないCpG含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないCpG含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントであるか、またはこれを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
一実施形態では、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物は追加的な活性薬剤を含む。一実施形態では、前記追加的な活性薬剤は腫瘍溶解性ウイルスを含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤はT細胞受容体改変T細胞(受容体改変T細胞)を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤はキメラ抗原受容体改変T細胞(CAR T細胞)を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は、治療的なまたは免疫調節性モノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は標的化チミジンキナーゼ阻害剤(TKI)を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は改変T細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞を含む。別の実施形態では、本発明の追加的な活性薬剤は、弱毒化腫瘍溶解性ウイルス、T細胞受容体改変T細胞(受容体改変T細胞)、キメラ抗原受容体改変T細胞(CAR T細胞)、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的化チミジンキナーゼ阻害剤(TKI)、もしくは改変T細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞、またはこれらの任意の組合せを含む。
別の実施形態では、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物は追加的な活性薬剤を含む。別の実施形態では、活性薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。
一実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、プログラム死1(PD−1)シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、PD−1シグナル伝達経路阻害剤は、PD−1リガンド1(PD−L1)およびPD−1リガンド2(PD−L2)と相互作用する分子閉鎖PD−1受容体である。別の実施形態では、PD−L1はCD274またはB7−H1としても知られている。別の実施形態では、PD−L2もCD273またはB7−DCとして知られている。別の実施形態では、PD−1リガンド1(PD−L1)およびPD−1リガンド2(PD−L2)と相互作用する分子閉鎖PD−1受容体は、PD−1、PD−L1、またはPD−L2と相互作用する分子である。別の実施形態では、PD−1リガンド1(PD−L1)またはPD−1リガンド2(PD−L2)と相互作用する分子閉鎖PD−1受容体は、PD−1、PD−L1、またはPD−L2と相互作用する分子である。「相互作用する」という用語、またはその文法的に等価な用語は、別の分子と結合する、または別の分子と接触することを包含する場合がある。別の実施形態では、分子はPD−1に結合する。別の実施形態では、PD−1シグナル伝達経路阻害剤は、抗PD1抗体である。別の実施形態では、PD−L2と相互作用する分子は、抗PD−L1抗体、またはPD−L1と結合する小分子である。別の実施形態では、PD−L2と相互作用する分子は、抗PD−L2抗体、またはPD−L2と結合する小分子である。
一実施形態では、PD−1と相互作用する分子は、切断PD−L1タンパク質である。別の実施形態では、切断PD−L1タンパク質はPD−L1タンパク質の細胞質ドメインを含む。別の実施形態では、PD−1と相互作用する分子は、切断PD−L2タンパク質である。別の実施形態では、切断PD−L2タンパク質はPD−L2タンパク質の細胞質ドメインを含む。別の実施形態では、PD−1リガンド1(PD−L1)およびPD−1リガンド2(PD−L2)と相互作用する分子閉鎖PD−1受容体は、PD−L1およびPD−L2と相互作用する分子である。別の実施形態では、PD−L1またはPD−L2と相互作用する分子は、切断PD−1タンパク質、PD−1模倣体、またはPD−L1またはPD−L2を結合する小分子である。別の実施形態では、切断PD−L1タンパク質はPD−1タンパク質の細胞質ドメインを含む。
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はCD80/86シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、CD80はB7.1としても知られている。別の実施形態では、CD86はB7.2としても知られている。別の実施形態では、CD80シグナル伝達経路阻害剤は、CD80と相互作用する小分子である。別の実施形態では、CD80阻害剤は抗CD80抗体である。別の実施形態では、CD86シグナル伝達経路阻害剤は、CD86と相互作用する小分子である。別の実施形態では、CD86阻害剤は抗CD86抗体である。
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、CTLA−4シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、CTLA−4はCD152としても知られている。別の実施形態では、CTLA−4シグナル伝達経路阻害剤は、CTLA−4と相互作用する小分子である。別の実施形態では、CTLA−4阻害剤は抗CTLA−4抗体である。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はCD40シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、任意の他の抗原発現細胞であり、当該技術分野で既知のT細胞シグナル伝達経路阻害剤である。
当該技術分野で既知の任意の免疫チェックポイントタンパク質を免疫チェックポイント阻害剤によって標的化することができることを当業者は理解するであろう。免疫チェックポイントタンパク質は、以下のものから選択されてもよいがこれに限定されない。プログラムされた細胞死タンパク質1(PD1)、T細胞膜タンパク質3(TIM3)、アデノシンA2a受容体(A2aR)およびリンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、キラー免疫グロブリン受容体(KIR)、または細胞毒性T−リンパ球抗原−4(CTLA−4)。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤タンパク質は、B7/CD28受容体スーパーファミリーに属するものである。一実施形態では、T細胞刺激薬は抗原提示細胞(APC)/T細胞作動薬である。別の実施形態では、T細胞刺激薬は、CD134またはそのリガンドもしくはその断片、CD−137またはそのリガンドもしくはその断片、あるいは誘導性T細胞共刺激薬(ICOS)またはそのリガンドもしくはその断片である。
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物をインドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(IDO)経路阻害剤と同時投与する工程をさらに含む。本発明で使用するためのIDO経路阻害剤としては、1−メチルトリプトファン(1MT)、1−メチルトリプトファン(1MT)、ネクロスタチン−1、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、5−メチルインドール−3−カルボキサルデヒド、CAY10581、抗IDO抗体、または小分子IDO阻害剤が挙げられるがこれに限定されない当該技術分野で既知の任意のIDO経路阻害剤を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法は、化学療法的もしくは放射線療法的な療法と併せて、その前に、またはそれに続いても使用される。
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物を前記被験者内で抗腫瘍免疫応答を強化する腫瘍キナーゼ阻害剤と同時投与する工程をさらに含む。腫瘍キナーゼ阻害剤(TKI)は、特異的な細胞シグナル伝達経路と干渉するように機能し、したがって選択された悪性腫瘍に対する標的特異的な療法を可能にする。TKIは周知であり、またTKIが以下の表1に示すものおよび抗腫瘍免疫応答を強化することが知られている任意の他のTKIを含むことを当業者は理解するであろう。
別の実施形態では、被験者に投与する本明細書に提供される免疫原性組成物で提示される免疫チェックポイント阻害剤(例えば、PD−1シグナル伝達経路阻害剤)の投与量は、2週間ごとに5〜10mg/kg、3週間ごとに5〜10mg/kg、または3週間ごとに1〜2mg/kgである。別の実施形態では、投与量範囲は毎週1〜10mg/kgである。別の実施形態では、投与量範囲は2週間ごとに1〜10mg/kgである。別の実施形態では、投与量範囲は3週間ごとに1〜10mg/kgである。別の実施形態では、投与量範囲は4週間ごとに1〜10mg/kgである。これらの投与量は例示的であり、限定することを意図しない。
一実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物は、特異的にGITRまたはその部分に結合する抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物は、OX40またはその部分に特異的に結合する抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物は、GITRまたはその部分に特異的に結合する抗体、およびOX40に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物はGITRに特異的に結合するLm株およびその抗体または機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物はOX40に特異的に結合するLm株およびその抗体または機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物は、Lm株およびGITRまたはその部分に特異的に結合する抗体、ならびにOX40またはその部分に特異的に結合する抗体を含む。
同一のまたは異なる組成物に提示する異なる抗体は、同一の形態を有する必要はなく、例えば、1つの抗体はモノクローナル抗体であってもよく、別の抗体はFAb断片であってもよい。各々の可能性は、本発明の異なる実施形態を表す。
「抗体機能的断片」という用語は、特異的に抗原に結合する能力を有する無傷の抗体の部分を指す。抗体断片の実施例としては、Fab、Fab´、F(ab´)2、およびFv断片、線状抗体、scFv抗体、および抗体断片から形成される多選択性抗体が挙げられるがこれに限定されない。
抗体に関して「結合する」または「特異的に結合する」という用語は、特異的な抗原を認識するが、実質的にサンプル内の他の分子を認識もしくは結合しない抗体またはその機能的断片を包含することを当業者は理解するであろう。例えば、1つの種からの抗原に特異的に結合する抗体は、1つ以上の種からその抗原にも結合する場合があるが、かかる異種間の反応性はそれ自体抗体の分類を特異的なものとして変更することはない。別の実施例では、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立形質にも結合する場合がある。しかしながら、かかる交差反応は、それ自体抗体の分類を特異的なものとして変更することはない。いくつかの事例では、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質、またはペプチドの第2の化学種との相互作用に関連して使用することができ、相互作用が化学種の特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は、特異的なアミノ酸配列ではなく、特異的なタンパク質構造を認識および結合する。
一実施形態では、本発明の組成物は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス(Lm)株を含む。別の実施形態では、本明細書に記述されるように、本発明の組成物は抗体またはその機能的断片を含む。
一実施形態では、本明細書に提供される組成物は、単一の組成物の投与の一部、または組成物の混合物の一部のいずれかとして、本明細書に提供されるような抗体またはその機能的断片、および本明細書に提供されるような組み換え型弱毒化リステリアを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物の各々の構成成分を、本明細書に提供される組成物の別の構成成分の前に、別の構成成分と同時に、または別の構成成分の後に投与する。一実施形態では、同時に投与するときでさえも、リステリアベースの組成物と抗体またはその機能的断片とを2つの別個の組成物として投与する場合がある。あるいは、別の実施形態では、リステリアベースの組成物は、抗体またはその機能的断片を含む場合がある。
一実施形態では、本発明の組成物のいずれかはインターフェロンγの強い先天的な刺激を誘発し、これは、一実施形態では抗血管形成特性を有する。一実施形態では、本発明のリステリアは、インターフェロンγの強い先天的な刺激を誘発し、これは、一実施形態では、抗血管形成特性を有する(Dominiecki et al.,Cancer Immunol Immunother.2005 May;54(5):477−88.Epub 2004 Oct 6、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる;Beatty and Paterson, J Immunol.2001 Feb 15;166(4):2276−82、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。一実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、CD4+ T細胞による媒介性である(Beatty and Paterson, 2001)。別の実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、CD8+ T細胞によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのIFN−γ分泌は、NK細胞、NKT細胞、Th1 CD4+ T細胞、TC1 CD8+T細胞、またはこれらの組合せによって媒介される。
別の実施形態では、本発明の組成物のいずれかは1つ以上の抗血管形成タンパク質または因子の生産を誘発する。一実施形態では、抗血管形成タンパク質はIFN−γである。別の実施形態では、抗血管形成タンパク質は、色素上皮由来因子(PEDF)、アンジオスタチン、エンドスタチン、fms様チロシンキナーゼ(sFlt)−1、または可溶性エンドグリン(sEng)である。一実施形態では、本発明のリステリアは、抗血管形成因子の放出に関与し、したがって一実施形態では、抗原を被験者に導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。各々のリステリア株およびそのタイプは、本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明は、エピソームの組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株を提供し、核酸分子は各々が第1および少なくとも第2のポリペプチドをコードする第1および少なくとも第2のオープンリーディングフレームを含み、第1および少なくとも第2のポリペプチドは各々PEST含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその機能的断片を含み、核酸はプラスミド複製対照領域をさらに含む。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第1および少なくとも第2のオープンリーディングフレームからの発現を調節する。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第1のまたは少なくとも第2のオープンリーディングフレームからの異種抗原の発現を抑制する転写リプレッサーをコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第1および少なくとも第2のオープンリーディングフレームから異種抗原発現を誘発する転写インデューサーをコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、核酸分子は、各々が1〜4個の組み換え型ポリペプチドをコードする1〜4個のオープンリーディングフレームを含み、PEST含有ポリペプチドに融合される前記組み換え型ポリペプチドは各々が異種抗原またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第1〜第4のオープンリーディングフレームから異種抗原発現を抑制する。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第1〜第4のオープンリーディングフレームから異種抗原発現を誘発する転写インデューサーをコードするオープンリーディングフレームを含む。
一実施形態では、当該技術分野で既知の異なるタイプの転写調節機構があり、これらは「負の対照」および「正の対照」を含むがこれらに限定されない。負の対照では、調節タンパク質またはリプレッサータンパク質がオペレーターに結合し、RNAポリメラーゼがプロモーター配列に適切に結合するのを防止する。あるいは、この状態ではプロモーターに結合するRNAポリメラーゼを閉鎖することができない不活性形態でリプレッサータンパク質を合成することができ、次いでコリプレッサーの結合によってRNAポリメラーゼがプロモーターに結合するのを防止するためにリプレッサーが活性化される。同化経路(例えば、アルギニン生合成)ではこのタイプの対照が最も頻繁に見られ、コリプレッサーはしばしば同化経路の最終産物である。あるいは、リプレッサータンパク質は、活性形態で合成され、オペレーターに結合し、RNAポリメラーゼがプロモーターに結合するのを防止する。インデューサーがリプレッサーに結合するときリプレッサーは不活性になり、したがってRNAポリメラーゼは転写を自由に開始するようになる。異化経路(例えば、ラクトース異化作用)ではこのタイプの対照が最も頻繁に見られる。インデューサーは、しばしば分解される基質の形態である。正の対照では、活性化タンパク質と呼ばれる調節タンパク質はオペレーターに結合し、活性化分子はプロモーター領域に結合するRNAポリメラーゼを安定化する。これの実施例はアラビノースの異化作用を含む。調節タンパク質(正の調節と負の調節との両方のための)は調節遺伝子によってコードされ、低いレベルで継続的に合成することができる。これらが自己調節されるようにすることができ、これによって高濃度の調節タンパク質(高いプラスミド生産と関連付けられる)がその自身のオペレーターに結合し、RNAポリメラーゼがプロモーター配列と結合するのを抑制する。これは、レベルが下がるまで転写を停止する。これらのタイプの調節のいくつかの実施例としては、ラクトースオペロン、アルギニンオペロン、ジフテリア毒素遺伝子調節系、等々が挙げられる。転写リプレッサーおよびその使用方法は、当該技術分野において直ちに知られ、また本発明での使用が意図される。
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、臨床の場での使用の前に、本明細書に提供される組み換え型リステリア発現多重融合タンパク質での代謝負担を測定する工程を含む。そうすることによって、当業者は、本明細書に提供される異種抗原を含む融合タンパク質の発現のためにどの最適な条件を使用するかを容易に決定することができる。別の実施形態では、代謝負担の測定は、本発明の時点で当該技術分野で既知の任意の手段によって遂行され、この手段としては、ワクチン株の増殖率、光学濃度の読み取り値、コロニー形成単位(CFU)プレーティング、およびこれに類するものの測定が挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態では、細菌細胞上の代謝負担は、細菌細胞の生存能力を測定することによって決定される。細菌生存能力を測定する方法は、当該技術分野において直ちに知られ、かつ利用可能であり、そのいくつかとしては、生存能力計数のための細菌プレーティング、ATPの測定、およびフローサイトメトリーが挙げられるがこれらに限定されない、ATP染色では、検出は、生存細胞からのATPの量を測定するためのルシフェラーゼ反応の使用に基づき、細胞内のATPの量は、細胞の生存能力と相関する。フローサイトメトリーとしては、これも当該技術分野で既知の様々なやり方でこの方法を使用することができ、例えば、生きている細菌細胞によって除外される生存能力染料の使用を採用した後に、これを吸収させるか、または死んだ細菌細胞によって吸収させる。当業者は、細菌の生存能力を測定するためのこれらのおよび当該技術分野で既知の任意の他の方法を本発明で使用することができることを直ちに理解するであろう。本発明の時点で当該技術分野で利用可能な、多重異種抗原またはその機能的断片を発現するリステリア株の代謝負担を決定することができるリステリア株の増殖率またはリステリア株によるマーカー遺伝子の発現を測定するための知識を、当業者が実施することができるであろうことが理解されるであろう。
一実施形態では、「少なくとも第2の核酸分子」という用語は2つ以上の核酸分子を指し、あるいは3つ、4つ、5つなどの核酸分子を指す。別の実施形態では、この用語は、最大10個までの核酸分子、または最大20個までの、もしくは最大30個までの核酸分子を指す。
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は2つ以上の抗原を送達する多価プラスミドを含む。別の実施形態では、プラスミドは、本明細書に記述されるデュアルプラスミドである(図20および実施例40を参照)。別の実施形態では、多価プラスミドをコードするエピソームの組み換え型核酸が本明細書に提供される。別の実施形態では、多価プラスミドは2〜5個の抗原を送達する。別の実施形態では、多価プラスミドは2〜10個の抗原を送達する。別の実施形態では、多価プラスミド内の抗原は、PEST含有アミノ酸配列に融合される。
一実施形態では、本明細書に提供されるプラスミドは、染色体外またはエピソームのままであり、すなわち一旦細菌の中へと形質移入しても宿主の細菌の染色体の中へは組込まれない。別の実施形態では、本明細書に提供されるプラスミドは、一旦細菌の中へと形質移入されると宿主細菌の染色体配列の中へと組み込まれる(特異的にまたは無作為的に)組込プラスミドである。
別の実施形態では、エピソームの組み換え型核酸バックボーンは、配列番号:1を含む配列によってコードされる。別の実施形態では、本明細書に提供されるエピソームの組み換え型核酸は、配列番号:1から構成される配列によってコードされる。別の実施形態では、本明細書に提供されるエピソームの組み換え型核酸は、配列番号:1で示される配列によってコードされる。
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一実施形態では、多価プラスミドバックボーンは、少なくとも2つの抗原をコードする少なくとも2つの核酸配列を含む。別の実施形態では、組み換え型エピソームの核酸はプラスミドバックボーン配列、および少なくとも2つの抗原をコードする。別の実施形態では、抗原はプラスミドを搬送する細菌宿主に対する異種抗原である。別の実施形態では、抗原はプラスミドを搬送するリステリア宿主に対する異種抗原である。別の実施形態では、プラスミドバックボーンおよび少なくとも2つの異種抗原をコードする組み換え型エピソーム核酸配列は配列番号:2を含む。別の実施形態では、プラスミドバックボーンおよび少なくとも2つの異種抗原をコードする組み換え型エピソーム核酸配列は配列番号:2から構成される。
別の実施形態では、配列番号:2の中の配列によってコードされる抗原のうちの1つは、E7(配列番号:2の中の太字)である。別の実施形態では、E7配列は配列番号:3で示される。
Ctcgagcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgatctctactgttatgagcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccataaactagt(配列番号:3)。
一実施形態では、配列番号:2の中の配列によってコードされる抗原のうちの1つは、キメラHer2−neu抗原(配列番号:2の中の斜字)である。別の実施形態では、キメラHer2−neu配列は配列番号:4で示される。
ctagtggtgatggtgatgatggagctcagatctgtctaagaggcagccatagggcataagctgtgtcaccagctgcaccgtggatgtcaggcagatgcccagaaggcgggagacatatggggagcccacaccagccatcacgtatgcttcgtctaagatttctttgttggctttgggggatgtgttttccctcaacactttgatggccactggaattttcacattctccccatcagggatccagatgcccttgtagactgtgccaaaagcgccagatccaagcaccttcaccttcctcagctccgtctctttcaggatccgcatctgcgcctggttgggcatcgctccgctaggtgtcagcggctccaccagctccgtttcctgcagcagtctccgcatcgtgtacttccggatcttctgctgccctcgggcgcacagctggtggcaggccaggccctcgcccacacactcgtcctctggccggttggcagtgtggagcagagcttggtgcgggttccgaaagagctggtcccagggcaccgtgtgcacgaagcagaggtgggtgttatggtggatgagggccagtccactgcccagttccctcagtgagcgcagccccagccagctgatgcccagcccttgcagggtcagcgagtaggcgccattgtgcagaattcgtccccggattacttgcaggttctggaagacgctgaggtcaggcaggctgtccggccatgctgagatgtataggtaacctgtgatctcttccagagtctcaaacacttggagctgctctggctggagcggggcagtgttggaggctgggtccccatcaaagctctccggcagaaatgccaggctcccaaagatcttcttgcagccagcaaactcctggatattcttccacaaaatcgtgtcctggtagcagagctgggggttccgctggatcaagacccctcctttcaagatctctgtgaggcttcgaagctgcagctcccgcaggcctcctggggaggcccctgtgacaggggtggtattgttcagcgggtctccattgtctagcacggccagggcatagttgtcctcaaagagctgggtgcctcgcacaatccgcagcctctgcagtgggacctgcctcacttggttgtgagcgatgagcacgtagccctgcacctcctggatatcctgcaggaaggacaggctggcattggtgggcaggtaggtgagttccaggtttccctgcaccacctggcagccctggtagaggtggcggagcatgtccaggtgggttctagat(配列番号:4)。
別の実施形態では、本明細書に提供される代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリアp60プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、inlA(インターナリンをコードする)プロモーターが使用される。別の実施形態では、hlyプロモーターが使用される。別の実施形態では、actAプロモーターが使用される。本開示および本明細書に提供される方法が装備されたとき、異なる転写プロモーター、停止剤、キャリアベクター、または特異的な遺伝子配列(例えば、市販のクローニングベクター内のもの)を本発明の方法および組成物内で順調に使用することができることを当業者は直ちに理解するであろう。本発明で意図されるように、これらの機能性は、例えば、pUCシリーズとして知られる市販のベクターで提供される。別の実施形態では、非必須DNA配列(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子)は除去される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子は任意の他のグラム陽性プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリア内で機能する任意の他のプロモーターの制御下で発現する。遺伝子の発現を駆動するために他のプロモーターまたはポリシストロニック発現カセットが使用されてもよいことを当業者は理解するであろう。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
一実施形態では、「構造性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと動作可能にリンクしたとき、細胞のほとんどのまたはすべての生理学的条件下でヒトの生細胞内に遺伝子産物を生じるヌクレオチド配列である。
一実施形態では、「誘発性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと動作可能にリンクしたとき、プロモーターに対応する誘導物質が実質的に細胞内に存在するときにのみ生細胞内に生産される遺伝子産物を生じるヌクレオチド配列である。
一実施形態では、「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと動作可能にリンクしたとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみヒトの生細胞内に生産される遺伝子産物を生じるヌクレオチド配列である。
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、動物宿主は非ヒト動物宿主である 別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系の有病率を減少する。別の実施形態では、継代は株を弱毒化し、または別の実施形態では、株の病毒性を少なくする。組み換え型リステリア株を動物宿主を通して継代する方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、米国特許出願番号第10/541,614号に記述されている。一実施形態では、これを通してリステリアが継代される動物は、哺乳類であり、一実施形態では、これはマウスである。本発明は、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラット、およびこれに類するものなどの哺乳類の継代のための使用を意図する。かかる哺乳類は当該技術分野で周知であり、また例えば、Jackson Laboratories(米国メーン州Bar Harbor)などの様々な卸売業者、流通業者、および研究所を通して当業者に対して入手可能である。組み換え型リステリア株を動物宿主を通して継代する方法は当該技術分野で既知であり、また例えば、米国特許出願番号第10/541,614号に記述されている。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
一実施形態では、ヒトの被験者の疾患を防止する、疾患を治療する、およびワクチン接種を行うための方法および組成物が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明は、動物の被験者の疾患を防止する、疾患を治療する、およびワクチン接種を行うための方法および組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物の抗腫瘍免疫応答を強化することを目的とする。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物または本明細書に提供される組成物の混合物を投与することによって被験者内の抗腫瘍応答を強化する方法は、他の既知の抗腫瘍または抗ガン療法と組み合わせることができる。別の実施形態では、本発明の組成物を単独でまたはアジュバントが適切であるいずれかの療法と組合せて使用することができ、これは、化学療法または放射線療法などのようにアジュバントを一般的に使用しない設定において有用性を有する場合がある。
別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、自己抗原である異種抗原に対する耐性を克服または「破る」方法をさらに提供する。かかる抗原は、様々な腫瘍によって異常に発現される場合があり、これらは本発明の範囲の下で本明細書に提供される方法および組成物を使用することによって治療または予防を受ける。
一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物によって誘発される免疫応答は治療的なものである。別の実施形態では、これは予防的な免疫応答である。別の実施形態では、これは、本明細書に提供される症状に悩まされている被験者内に免疫応答を誘発するための、当該技術分野において利用可能な方法に対して強化された免疫応答である。別の実施形態では、免疫応答は本明細書に提供される被験者を悩ましている腫瘍の除去につながる。
一実施形態では、腫瘍は、低酸素固形腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は、本明細書に提供される任意のガン、および当該技術分野で既知の任意のガンと関連付けられる任意の腫瘍である。
一実施形態では、他の治療的なモダリティと組合せられた、組み換え型の弱毒化したリステリア発現する切断リステリオリシンOは、免疫応答を強化するため、ならびにガンまたは固形腫瘍を含む疾患を防止および治療するために有用である。一実施形態では、他の治療的なモダリティと組合せられた、組み換え型の弱毒化したリステリア発現する切断ActAは、免疫応答を強化するため、ならびにガンまたは固形腫瘍を含む疾患を防止および治療するために有用である。一実施形態では、他の治療的なモダリティと組合せられた、組み換え型の弱毒化したリステリア発現するPESTアミノ酸配列は、免疫応答を強化するため、ならびにガンまたは固形腫瘍を含む疾患を防止および治療するために有用である。
別の実施形態では、治療ワクチンの免疫原性を改善する方法が本明細書に提供され、この方法はワクチンと、多重融合タンパク質を発現する単一の組み換え型リステリアを含む組成物、または各々が本発明の融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む組成物の混合物とを被験者に同時投与することを含み、各々の組成物または組成物の混合物はワクチンの免疫原性を強化し、かつ抗原特異的な免疫応答を引き出し、それによってワクチンの免疫原性を改善する。一実施形態では、この方法はワクチンが特異的に対する腫瘍の治療を可能にする。別の実施形態では、ワクチンはドラッグワクチンであり、当該技術分野で既知の化学療法的薬剤、ペプチドワクチン、または任意の他のタイプのワクチンである。
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物で利用されるLLOはリステリアLLOである。一実施形態では、LLOが由来するリステリアは、リステリア・モノサイトゲネス(Lm)である。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・シーリゲリである。
一実施形態では、LLOタンパク質は、(配列番号:5)に示される以下の核酸配列によってコードされる。
atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgag(配列番号:5)。
atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgag(配列番号:5)。
別の実施形態では、LLOタンパク質は配列番号:6の配列を有する。別の実施形態では、LLOタンパク質は配列番号:6に示される配列を含む。
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDL(配列番号:6)
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDL(配列番号:6)
この配列に対応するタンパク質の最初の25個のアミノ酸はシグナル配列であり、また細菌によって分泌されるときにLLOから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性LLOタンパク質は504残基長である。別の実施形態では、LLOタンパク質は、遺伝子銀行受入番号DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452、またはU25452で示される配列を有する。別の実施形態では、LLOタンパク質は、LLOタンパク質の変異体である。別の実施形態では、LLOタンパク質は、LLOタンパク質の相同体である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明の組成物(任意の形態の)を構築するために利用されるLLOタンパク質(別の実施形態では、本明細書に提供される組成物内に組み込まれるLLO断片の供給源として使用される)は、別の実施形態では、以下の配列を有する。 MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(遺伝子銀行受入番号P13128、配列番号:123、核酸配列は遺伝子銀行受入番号X15127で示される)。この配列に対応するタンパク質の最初の25個のAAはシグナル配列であり、また細菌によって分泌されるときにLLOから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性LLOタンパク質は504残基長である。別の実施形態では、LLOタンパク質は配列番号:123の相同体である。別の実施形態では、LLOタンパク質は配列番号:123の変異体である。別の実施形態では、LLOタンパク質は配列番号:123の異性体である。別の実施形態では、LLOタンパク質は配列番号:123の断片である。別の実施形態では、LLOタンパク質は配列番号:123の相同体の断片である。別の実施形態では、LLOタンパク質は配列番号:123の変異体の断片である。別の実施形態では、LLOタンパク質は配列番号:123の異性体の断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、「切断LLO」または「tLLO」はPESTアミノ酸配列ドメインを含むLLOの断片を指す。別の実施形態では、この用語はアミノ末端において活性化ドメインを含有せず、シスチン484を含まないLLO断片を指す。別の実施形態では、LLOタンパク質はctLLOである。別の実施形態では、ctLLOは、全長LLOであり、この中でコレステロール結合ドメイン(CBD)は抗原ペプチドまたはそのエピトープによって置き換えられている。別の実施形態では、「置き換える」は、突然変異の置換、または欠失を介することを意味することができる。別の実施形態では、LLOタンパク質はmutLLOである。別の実施形態では、mutLLOは、その中でCBDが突然変異しているものである。別の実施形態では、mutLLOは、その中でCBD内のアミノ酸が突然変異しているものである。別の実施形態では、突然変異は点突然変異、欠失、反転、置換、またはこれらの組合せである。別の実施形態では、突然変異は、当該技術分野で既知の任意の突然変異である。別の実施形態では、変異型LLOタンパク質はCBD内の欠失、置換、もしくは点突然変異の任意の組合せ、および/またはLLOのシグナル配列の欠失を含む。別の実施形態では、CBDの突然変異がLLOの溶血活性を減少する。別の実施形態では、CBDはワクチンとして使用される既知のHLAクラスI制限エピトープによって置き換えられる。別の実施形態では、変異型LLOは大腸菌発現系から発現および精製される。
別の実施形態では、LLO断片はPEST配列から構成される。別の実施形態では、LLO断片はPEST配列を含む。別の実施形態では、LLO断片は529アミノ酸全長LLOタンパク質のおよそ最初の400〜441アミノ酸から構成される。別の実施形態では、LLO断片はLLOタンパク質の非溶血性の形態である。
別の実施形態では、本発明は、(a)変異型LLOタンパク質と、(b)対象となる異種ペプチドとを含む組み換え型ポリペプチドを提供し、変異型LLOタンパク質は内部欠失を含有し、内部欠失は変異型LLOタンパク質のコレステロール結合ドメインを含む。別の実施形態では、LLOコレステロール結合ドメインの配列は当該技術分野で周知であり、また本明細書に参照により組み込まれる米国特許第8,771,702号に記述される。別の実施形態では、内部欠失は、11〜50アミノ酸内部欠失である。別の実施形態では、内部欠失は、組み換え型タンパク質またはポリペプチドの溶血活性に関して不活性である。別の実施形態では、組み換え型タンパク質またはポリペプチドは野生型LLOに関する溶血活性の減少を呈する。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型タンパク質または組み換え型ポリペプチドを含む組み換え型リステリアが本明細書に提供される。各々の可能性は本発明の別の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明は、(a)変異型LLOタンパク質と、(b)対象となる異種ペプチドとを含む組み換え型タンパク質またはポリペプチドを提供し、変異型LLOタンパク質は内部欠失を含有し、内部欠失は変異型LLOタンパク質のコレステロール結合ドメインの断片を含む。別の実施形態では、内部欠失は、1〜11アミノ酸内部欠失である。別の実施形態では、コレステロール結合ドメインの配列は配列番号:130で示される。別の実施形態では、内部欠失は、組み換え型タンパク質またはポリペプチドの溶血活性に関して不活性である。別の実施形態では、組み換え型タンパク質またはポリペプチドは野生型LLOに関する溶血活性の減少を呈する。各々の可能性は本発明の別の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の突然変異した領域は配列番号:123の残基C484を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は相同LLOタンパク質の対応するシスチン残基を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は配列番号:123の残基W491を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は相同LLOタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は配列番号:123の残基W492を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は配列番号:123の残基C484、W491、およびW492を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は相同LLOタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。相同タンパク質の対応する残基を同定するための方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、配列アライメントを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、突然変異した領域は残基C484およびW491を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は残基C484およびW492を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は残基W491およびW492を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は残基C484、W491およびW492を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明の方法および組成物内に提供されるLLOタンパク質の突然変異した領域は、変異型LLOタンパク質またはその断片のコレステロール結合ドメインを含む。例えば、配列番号:37の残基470〜500、470〜510、または480〜500から構成される突然変異した領域は そのCBD(残基483〜493)を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は変異型LLOタンパク質のCBDの断片、またはその断片である。本明細書に提供されるように、例えば、その各々がCBDの断片である残基C484、W491、およびW492は、アラニン残基に突然変異している(実施例38)。さらに、本明細書に提供されるように、CBDの断片、残基484〜492は、NY−ESO−1からの異種配列で置き換えられる(実施例39)。別の実施形態では、突然変異した領域は変異型LLOタンパク質のCBD、またはその断片に重複する。例えば、配列番号:123の残基470〜490、480〜488、490〜500、または486〜510から構成される突然変異した領域 はそのCBDを含む。別の実施形態では、単一のペプチドは、シグナル配列およびCBDでの突然変異または置換の欠失を有してもよい。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のLLOタンパク質での内部欠失はLLOタンパク質またはその断片のCBDを含む。例えば、配列番号:37の残基470〜500、470〜510、または480〜500から構成される内部欠失は そのCBD(残基483〜493)を含む。別の実施形態では、内部欠失は変異型LLOタンパク質またはその断片のCBDの断片である。例えば、残基484〜492、485〜490、および486〜488はすべて配列番号:123のCBDの断片である。別の実施形態では、内部欠失は変異型LLOタンパク質またはその断片のCBDに重複する。例えば、配列番号:123の残基470〜490、480〜488、490〜500、または486〜510から構成される内部欠失は はそのCBDを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
一実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜25から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜50から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜75から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜100から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜125から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜150から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜175から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜200から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜225から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜250から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜275から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜300から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜325から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜350から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜375から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜400から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜425から構成される。別の実施形態では、LLO断片はおよそ残基1〜441から構成される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、LLO断片は上記のAA範囲のうちの1つに対応する相同LLOタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、例えば、相同LLOタンパク質が本明細書で利用するLLOタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合のように、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はない。
別の実施形態では、ストレプトリジンO、パーフリンゴリジンO、ニューモリシン、等々、またはその断片などの既知のリシンを含む、他の種からのLLOの相同体を本発明で使用してもよい。
一実施形態では、生きた弱毒化リステリア、または本明細書に提供される組み換え型リステリアは、ActAタンパク質もしくはその断片を発現する。本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ActAタンパク質の断片も、本明細書に提供される異種抗原またはその断片に融合される。別の実施形態では、ActAタンパク質の断片は、以下の配列を有する。
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP (配列番号:7)。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のActA AA配列は配列番号:7に示される配列を含む。別の実施形態では、ActA AA配列は、配列番号:7の相同体である。別の実施形態では、ActA AA配列は、配列番号:7の変異体である。別の実施形態では、ActA AA配列は配列番号:7の断片であってもよい。別の実施形態では、ActA AA配列は、配列番号:5のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、ActA断片は、以下の配列を含む組み換え型ヌクレオチドによってコードされる。
ATGCGTGCGATGATGGTGGTTTTCATTACTGCCAATTGCATTACGATTAACCCCGACATAATATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGATTCTAGTCTAAACACAGATGAATGGGAAGAAGAAAAAACAGAAGAGCAACCAAGCGAGGTAAATACGGGACCAAGATACGAAACTGCACGTGAAGTAAGTTCACGTGATATTAAAGAACTAGAAAAATCGAATAAAGTGAGAAATACGAACAAAGCAGACCTAATAGCAATGTTGAAAGAAAAAGCAGAAAAAGGTCCAAATATCAATAATAACAACAGTGAACAAACTGAGAATGCGGCTATAAATGAAGAGGCTTCAGGAGCCGACCGACCAGCTATACAAGTGGAGCGTCGTCATCCAGGATTGCCATCGGATAGCGCAGCGGAAATTAAAAAAAGAAGGAAAGCCATAGCATCATCGGATAGTGAGCTTGAAAGCCTTACTTATCCGGATAAACCAACAAAAGTAAATAAGAAAAAAGTGGCGAAAGAGTCAGTTGCGGATGCTTCTGAAAGTGACTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCAGATGAGTCTTCACCACAACCTTTAAAAGCAAACCAACAACCATTTTTCCCTAAAGTATTTAAAAAAATAAAAGATGCGGGGAAATGGGTACGTGATAAAATCGACGAAAATCCTGAAGTAAAGAAAGCGATTGTTGATAAAAGTGCAGGGTTAATTGACCAATTATTAACCAAAAAGAAAAGTGAAGAGGTAAATGCTTCGGACTTCCCGCCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACACCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCAGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCACCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACGCCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCGGAACCGAGCTCGTTCGAATTTCCACCGCCTCCAACAGAAGATGAACTAGAAATCATCCGGGAAACAGCATCCTCGCTAGATTCTAGTTTTACAAGAGGGGATTTAGCTAGTTTGAGAAATGCTATTAATCGCCATAGTCAAAATTTCTCTGATTTCCCACCAATCCCAACAGAAGAAGAGTTGAA CGGGAGAGGCGGTAGACCA(配列番号:8)。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号:8に示される配列を有する。別の実施形態では、ActAをコードする本発明の方法および組成物のヌクレオチドは配列番号:8に示される配列を含む。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号:8の相同体である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは配列番号:8の変異体である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号:8の断片である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは配列番号:8のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
ATGCGTGCGATGATGGTGGTTTTCATTACTGCCAATTGCATTACGATTAACCCCGACATAATATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGATTCTAGTCTAAACACAGATGAATGGGAAGAAGAAAAAACAGAAGAGCAACCAAGCGAGGTAAATACGGGACCAAGATACGAAACTGCACGTGAAGTAAGTTCACGTGATATTAAAGAACTAGAAAAATCGAATAAAGTGAGAAATACGAACAAAGCAGACCTAATAGCAATGTTGAAAGAAAAAGCAGAAAAAGGTCCAAATATCAATAATAACAACAGTGAACAAACTGAGAATGCGGCTATAAATGAAGAGGCTTCAGGAGCCGACCGACCAGCTATACAAGTGGAGCGTCGTCATCCAGGATTGCCATCGGATAGCGCAGCGGAAATTAAAAAAAGAAGGAAAGCCATAGCATCATCGGATAGTGAGCTTGAAAGCCTTACTTATCCGGATAAACCAACAAAAGTAAATAAGAAAAAAGTGGCGAAAGAGTCAGTTGCGGATGCTTCTGAAAGTGACTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCAGATGAGTCTTCACCACAACCTTTAAAAGCAAACCAACAACCATTTTTCCCTAAAGTATTTAAAAAAATAAAAGATGCGGGGAAATGGGTACGTGATAAAATCGACGAAAATCCTGAAGTAAAGAAAGCGATTGTTGATAAAAGTGCAGGGTTAATTGACCAATTATTAACCAAAAAGAAAAGTGAAGAGGTAAATGCTTCGGACTTCCCGCCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACACCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCAGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCACCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACGCCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCGGAACCGAGCTCGTTCGAATTTCCACCGCCTCCAACAGAAGATGAACTAGAAATCATCCGGGAAACAGCATCCTCGCTAGATTCTAGTTTTACAAGAGGGGATTTAGCTAGTTTGAGAAATGCTATTAATCGCCATAGTCAAAATTTCTCTGATTTCCCACCAATCCCAACAGAAGAAGAGTTGAA CGGGAGAGGCGGTAGACCA(配列番号:8)。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号:8に示される配列を有する。別の実施形態では、ActAをコードする本発明の方法および組成物のヌクレオチドは配列番号:8に示される配列を含む。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号:8の相同体である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは配列番号:8の変異体である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号:8の断片である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは配列番号:8のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、ActA断片は、以下の配列を含む組み換え型ヌクレオチドによってコードされる。
Tttatcacgtacccatttccccgcatcttttatttttttaaatactttagggaaaaatggtttttgatttgcttttaaaggttgtggtgtagactcgtctgctgactgcatgctagaatctaagtcactttcagaagcatccacaactgactctttcgccacttttctcttatttgcttttgttggtttatctggataagtaaggctttcaagctcactatccgacgacgctatggcttttcttctttttttaatttccgctgcgctatccgatgacagacctggatgacgacgctccacttgcagagttggtcggtcgactcctgaagcctcttcatttatagccacatttcctgtttgctcaccgttgttattattgttattcggacctttctctgcttttgctttcaacattgctattaggtctgctttgttcgtatttttcactttattcgatttttctagttcctcaatatcacgtgaacttacttcacgtgcagtttcgtatcttggtcccgtatttacctcgcttggctgctcttctgttttttcttcttcccattcatctgtgtttagactggaatcttcgctatctgtcgctgcaaatattatgtcggggttaatcgtaatgcagttggcagtaatgaaaactaccatcatcgcacgcat(配列番号:9)。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号:9に示される配列を有する。別の実施形態では、ActAをコードする本発明の方法および組成物のヌクレオチドは配列番号:9に示される配列を含む。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号:9の相同体である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは配列番号:9の変異体である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号:9の断片である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは配列番号:9のアイソフォームである。別の実施形態では、配列番号:9は配列番号:2の構築体に到達するために使用され、本明細書にも提供される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ActAタンパク質の断片は異種抗原またはその断片に融合される。別の実施形態では、ActAタンパク質の断片は、遺伝子銀行受入番号AAF04762に示されるように、配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のActA AA配列は遺伝子銀行受入番号AAF04762に示される配列を含む。別の実施形態では、ActA AA配列は、遺伝子銀行受入番号AAF04762の相同体である。別の実施形態では、ActA AA配列は、遺伝子銀行受入番号AAF04762の変異体である。別の実施形態では、ActA AA配列は、遺伝子銀行受入番号AAF04762の断片である。別の実施形態では、ActA AA配列は、遺伝子銀行受入番号AAF04762のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物で利用されるActAタンパク質のN末端断片は、別の実施形態では、配列番号:10で示される配列を有する。
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP。別の実施形態では、ActA断片は配列番号:10に示される配列を含む。別の実施形態では、ActA断片は当該技術分野で既知の任意の他のActA断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP。別の実施形態では、ActA断片は配列番号:10に示される配列を含む。別の実施形態では、ActA断片は当該技術分野で既知の任意の他のActA断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、ActAタンパク質の断片をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号:11に示される配列を含む。
Atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号:11に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ActAタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
Atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号:11に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ActAタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、ActA断片は、遺伝子銀行受入番号AF103807に示される配列を含む組み換え型ヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは遺伝子銀行受入番号AF103807に示される配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のActAをコードするヌクレオチドは遺伝子銀行受入番号AF103807に示される配列を含む。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、遺伝子銀行受入番号AF103807の相同体である 別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、遺伝子銀行受入番号AF103807の変異体である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、遺伝子銀行受入番号AF103807の断片である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、遺伝子銀行受入番号AF103807のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。別の実施形態では、米国特許公開シリアル番号第2014/0186387号に記述されるように、切断ActAは、ActA−N100またはその修正版(ActA−N100*と称される)であり、この中でPESTモチーフは欠失しており、また非保存的なQDNKR置換を含有する。
別の実施形態では、ActA断片は当該技術分野で既知の任意の他のActA断片である。別の実施形態では、本発明の組み換え型ヌクレオチドは、ActAタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは全ActAタンパク質をコードする任意の他の配列を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
一実施形態では、本明細書に提供される生きた弱毒化リステリアまたは組み換え型リステリアはPEST配列ペプチドを発現する。本発明の方法および組成物の別の実施形態では、PEST AA配列は異種抗原またはその断片に融合される。別の実施形態では、PEST AA配列は、KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(配列番号:12)である。別の実施形態では、PEST配列はKENSISSMAPPASPPASPK(配列番号:13)である。別の実施形態では、本明細書に列挙されているPEST AA配列のうちの1つを含む任意のLLO配列への抗原の融合は、抗原に対する細胞媒介性免疫を強化することができる。
別の実施形態では、PEST AA配列はリステリアActAタンパク質からのPEST配列である。別の実施形態では、PEST配列は、KTEEQPSEVNTGPR(配列番号:14)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(配列番号:15)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(配列番号:16)、またはRGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(配列番号:17)である。別の実施形態では、PEST配列は、上記に記述されるPEST配列の変異体であり、一実施形態では、当業者であれば理解するとおり、これはKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLK(配列番号:18)、KSEEVNASDFPPPPTDEELR(配列番号:19)、またはRGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(配列番号:20)である。別の実施形態では、PEST配列は、lso遺伝子によってコードされるリステリア・シーリゲリ細胞溶解素由来である。別の実施形態では、PEST配列は、RSEVTISPAETPESPPATP(配列番号:21)である。別の実施形態では、PEST配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンOタンパク質由来である。別の実施形態では、PEST配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンO、例えば、AA 35〜51においてKQNTASTETTTTNEQPK(配列番号:22)由来である。別の実施形態では、PEST配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンO、例えば、AA 38〜54においてKQNTANTETTTTNEQPK(配列番号:23)由来である。別の実施形態では、PEST配列は配列番号:14〜23から選択される配列を有する。別の実施形態では、PEST配列は、原核生物に由来する別のPEST AA配列である。
PESTアミノ酸配列または「PEST配列」の同定は当該技術分野で周知であり、また例えば、Rogers S et al(Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins:the PEST hypothesis.Science 1986;234(4774):364−8)およびRechsteiner M et al (PEST sequences and regulation by proteolysis.Trends Biochem Sci 1996;21(7):267−71)に記述される。「PEST配列」は、別の実施形態では、プロリン(P)残基、グルタミン酸(E)残基、セリン(S)残基、およびスレオニン(T)残基が豊富な領域を指す。別の実施形態では、PEST配列は、いくつかの正に荷電したアミノ酸を含有する1つ以上のクラスターが脇にある。別の実施形態では、PEST配列はこれを含有するタンパク質の急速な細胞内分解を媒介する。別の実施形態では、PEST配列はRogersらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、PEST配列はRechsteinerらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、PEST配列は1つ以上の内部リン酸化部位を含有し、これらの部位におけるリン酸化はタンパク質の分解を進める。
一実施形態では、原核生物のPEST配列は、例えば、LMについてRechsteinerおよびRogers(1996,Trends Biochem.Sci.21:267−271)によって記述されたものおよびRogers Sら(Science 1986;234(4774):364−8)によって記述されたものなどの方法によって同定される。あるいは、この方法に基づいても原核生物からのPEST AA配列を同定することができる。PEST AA配列を含むことが期待される他の原核生物は、他のリステリア種に限定されない。一実施形態では、PEST配列はRogersらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、PEST配列はRechsteinerらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、PEST−findプログラムを使用してPEST配列が同定される。
別の実施形態では、PESTモチーフの同定は、特異的なタンパク質配列の中の正に荷電したAA R、H、およびKに対する初期のスキャンによって達成される。正に荷電した側の間のすべてのAAが計数され、これらのモチーフのみがさらに考慮され、これらはウィンドウサイズのパラメータと等しいかそれより大きい多数のAAを含有する。別の実施形態では、PEST様配列は、少なくとも1つのP、1つのDまたはE、および少なくとも1つのSまたはTを含有する必要がある。
別の実施形態では、PESTモチーフの質は、重要なAAならびにモチーフの疎水性の局所的な濃縮に基づいてパラメータをスコアリングする手段によって洗練される。D、E、P、S、およびTの濃縮は、質量パーセント(w/w)で表現され、DまたはEと等価な1つに対して、Pと等価な1つに対して、およびSまたはTと等価な1つに対して修正される。別の実施形態では、疎水性の計算は、J.KyteおよびR.F.Doolittle(Kyte,J and Dootlittle,RF.J.Mol.Biol.157、105(1982))の方法に原理的に従う。
別の実施形態では、潜在的なPESTモチーフの疎水性は、各々のAA種に対するモルパーセントおよび疎水性指数の産物にわたる合計として計算される。以下の式で表現される場合、望ましいPESTスコアは局所濃縮項および疎水性項の組合せとして得られる。
PESTスコア=0.55*DEPST−0.5*疎水性指数。
「PESTアミノ酸配列」、「PEST配列」、「PEST様配列」、または「PEST様配列ペプチド」という用語が、上記のアルゴリズムを使用して少なくとも+5のスコアを有するペプチドを包含することができることが理解されるであろう。別の実施形態では、この用語は少なくとも6のスコアを有するペプチドを指す。別の実施形態では、ペプチドは少なくとも7のスコアを有する。別の実施形態では、スコアは少なくとも8である。別の実施形態では、スコアは少なくとも9である。別の実施形態では、スコアは少なくとも10である。別の実施形態では、スコアは少なくとも11である。別の実施形態では、スコアは少なくとも12である。別の実施形態では、スコアは少なくとも13である。別の実施形態では、スコアは少なくとも14である。別の実施形態では、スコアは少なくとも15である。別の実施形態では、スコアは少なくとも16である。別の実施形態では、スコアは少なくとも17である。別の実施形態では、スコアは少なくとも18である。別の実施形態では、スコアは少なくとも19である。別の実施形態では、スコアは少なくとも20である。別の実施形態では、スコアは少なくとも21である。別の実施形態では、スコアは少なくとも22である。別の実施形態では、スコアは少なくとも22である。別の実施形態では、スコアは少なくとも24である。別の実施形態では、スコアは少なくとも24である。別の実施形態では、スコアは少なくとも25である。別の実施形態では、スコアは少なくとも26である。別の実施形態では、スコアは少なくとも27である。別の実施形態では、スコアは少なくとも28である。別の実施形態では、スコアは少なくとも29である。別の実施形態では、スコアは少なくとも30である。別の実施形態では、スコアは少なくとも32である。別の実施形態では、スコアは少なくとも35である。別の実施形態では、スコアは少なくとも38である。別の実施形態では、スコアは少なくとも40である。別の実施形態では、スコアは少なくとも45である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法またはアルゴリズム、例えば、CaSPredictor(Garay−Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE.Bioinformatics.2005 Jun;21 Suppl 1:i169−76)を使用してPEST配列は同定される。別の実施形態では、以下の方法が使用される。
PEST指数は、1の値をAA Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn、またはGlnに割り当てることによって、適切な長さ(例えば、30〜35ストレッチ)の各々のストレッチに対して計算される。PEST残基の各々に対する係数値(CV)は、1であり、また他のAA(非PEST)の各々に対する係数値は0である。
PEST様配列を同定するための各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、PEST配列は、当該技術分野で既知の任意の他のPEST配列である。各々のPEST配列およびそのタイプは本発明の別個の実施形態を表す。
「PEST配列に融合する」という用語がPEST配列を含むタンパク質断片に融合することを包含する場合があることが理解されるであろう。別の実施形態では、この用語は、タンパク質断片がPEST配列以外に周辺配列を含む事例を含む。別の実施形態では、タンパク質断片はPEST配列から構成される。「融合する」という用語が、それらのそれぞれの端部においてまたは他のものの中に埋め込まれて互いにリンクした、2つのペプチドまたはタンパク質断片のいずれかに融合することも包含することも理解されるであろう。
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型の形態を含むワクチンが本明細書に提供される。
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型の形態の培養液が本明細書に提供される。
別の実施形態は、pCR2.1(Invitrogen、米国カリフォルニア州La Jolla)などのプラスミドであり、これは原核生物の複製起点および原核生物内での発現を容易にするプロモーター/調節要素を有する原核生物発現ベクターである。別の実施形態では、外来ヌクレオチド配列は、プラスミドのサイズを減少しかつその中に定置することができるカセットのサイズを増加するために除去される。
かかる方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Sambrook et al.(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York)およびAusubei et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology,Green & Wiley,New York)に記述されている。
抗生物質抵抗性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製で一般的に採用される従来の選択およびクローニングプロセスで使用される。本発明で企図される抗生物質抵抗性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール(CAT)、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシンおよび当該技術分野で周知の他のものに抵抗を与える遺伝子産物が挙げられるがこれらに限定されない。各々の遺伝子は本発明の別個の実施形態を表す。
細菌を形質転換するための方法は当該技術分野で周知であり、またこの方法としては塩化カルシウム適格細胞ベースの方法、電気穿孔法、バクテリオファージ媒介性形質導入、化学的および物理的形質転換技法が挙げられる(de Boer et al,1989,Cell 56:641−649;Miller et al,1995,FASEB J.,9:190−199;Sambrook et al.1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York;Ausubel et al.,1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York;Gerhardt et al.,eds.,1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society for Microbiology,Washington,DC;Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。別の実施形態では、本発明のリステリアワクチン株は電気穿孔によって形質転換される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、遺伝物質および/またはプラスミドを細菌の中へと導入するために結合が使用される。結合のための方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Nikodinovic J et al.(A second generation snp−derived Escherichia coli−Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation.Plasmid.2006 Nov;56(3):223−7)および Auchtung JM et al(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005 Aug 30;102(35):12554−9)に記述される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
「形質転換」という用語を「形質移入」いう用語と同じ意味で使用することができ、プラスミドまたは他の異種DNA分子を取り上げるために細菌細胞を改変することを指すことが理解されるであろう。「形質転換」という用語がプラスミドまたは他の異種DNA分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変することを指すこともできることも理解されるであろう。
一実施形態では、本発明では市販のプラスミドが使用される。かかるプラスミドは、例えば、Invitrogen(米国カリフォルニア州La Jolla)、Stratagene(カリフォルニア州La Jolla)、Clontech(カリフォルニア州Palo Alto)などの様々な供給元から入手可能であり、または当該技術分野で周知の方法を使用して構築することができる。本発明で有用なプラスミドおよび他の発現ベクターは、本明細書のいずれかに記述され、プロモーター/調節配列、グラム陰性およびグラム陽性細菌に対する複製の起点、融合タンパク質をコードする孤立核酸、および分離されたアミノ酸代謝遺伝子をコードする核酸などの特徴を含むことができる。さらに、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする孤立核酸は、かかる孤立核酸の発現を駆動するのに好適なプロモーターを有する。細菌系で発現を駆動するために有用であるプロモーターは当該技術分野で周知であり、またバクテリオファージλ、pBR322のβラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーター、およびpBR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターを含む。原核生物プロモーターのさらなる実施例としては、5つのバクテリオファージλのメジャーライトおよびレフトプロモーター(PLおよびPR)と、大腸菌のtrp、recA、lacZ、lad、およびgalプロモーター、αアミラーゼ(Ulmanen et al、1985.J.Bacteriol.162:176−182)およびS28特異的な枯草菌のプロモーター(Gilman et al,1984 Gene 32:11−20)と、桿菌のバクテリオファージのプロモーター(Gryczan、1982、In:The Molecular Biology of the Bacilli、Academic Press、Inc.、New York)と、ストレプトマイシンプロモーター(Ward et al、1986、Mol.Gen.Genet.203:468−478)と、が挙げられる。本発明で企図される追加的な原核生物のプロモーターは、例えば、Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1:277−282)、Cenatiempo、(1986、Biochimie、68:505−516)、およびGottesman、(1984、Ann.Rev.Genet.18:415−442)で検討される。本発明で企図されるプロモーター/調節要素のさらなる実施例としては、リステリアのprfAプロモーター、リステリアのhlyプロモーター、リステリアのp60プロモーター、およびリステリアのActAプロモーター(遺伝子銀行受入番号NC_003210)、またはその断片が挙げられるがこれらに限定されない。
別の実施形態では、組み換え型DNA法を使用して本発明の組み換え型タンパク質が合成される。一実施形態では、これは、DNA配列を作り出すことと、特定のプロモーター/調節要素の制御下で本発明のプラスミドなどの発現カセット内にDNAを定置することと、タンパク質を発現することと、に関与する。本発明の組み換え型タンパク質(例えば、非溶血性LLO)をコードするDNAは、別の実施形態では、任意の好適な方法によって調製され、この方法としては、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、またはNarangらのホスホトリエステル法 (1979、Meth.Enzymol.68:90−99)、Brownらのホスホジエステル法 (1979、Meth.Enzymol 68:109−151)、Beaucageらのジエチルホスホラミダイト法 (1981、Tetra.Lett.、22:15 1859−1862)、および米国特許 第4,458,066号の固定法などの方法による直接化学合成が挙げられる。
別の実施形態では、一本鎖のオリゴヌクレオチドを生産するために化学合成が使用される。様々な実施形態では、一本鎖をテンプレートとして使用して、相補的な配列を用いたハイブリダイゼーションによって、またはDNAポリメラーゼを用いた重合によって、この一本鎖のオリゴヌクレオチドを二本鎖のDNAへと変換する。DNAの化学合成が約100個の塩基の配列に限られ一方で、より短い配列の連結によってより長い配列を得ることができることを当業者は認識するであろう。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。次いで断片は連結され、望ましいDNA配列が生産される。
別の実施形態では、本発明の組み換え型タンパク質をコードするDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)などのDNA増幅法を使用してクローニングされる。したがって、非溶血性LLOに対する遺伝子は、クローニングを容易にするために、好適な制限部位を含むセンスプライマーと、例えば、同一でない制限部位などの別の制限部位を含むアンチセンスプライマーとを使用して増幅されたPCRである。
別の実施形態では、融合タンパク質をコードする組み換え型遺伝子は、各々の宿主に対して適切な発現対照配列に動作可能にリンクする。プロモーター/調節配列は、本明細書のいずれかに詳細に記述される。別の実施形態では、プラスミドは、追加的なプロモーター調節要素、ならびにリボソーム結合部位および転写終結シグナルをさらに含む。真核生物細胞については、対照配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルス、等々に由来するプロモーターおよびエンハンサー、およびポリアデニレーション配列を含む。別の実施形態では、配列はスプライスドナーおよびアクセプター配列を含む。
一実施形態では、「動作可能にリンクする」という用語は並置を指し、そのように記述される構成成分はそれらの意図される様式で機能することができるような関係にある。コード配列に「動作可能にリンクする」対照配列は、コード配列の発現が対照配列に対応する条件の下で達成されるようなやり方で連結される。
一実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物を投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明のワクチンを投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の免疫療法的な組成物を投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明のリステリアの弱毒化した組み換え型形態を投与する方法が本明細書に提供される。
一実施形態では、本発明の方法および組成物によって引き出される免疫応答は、CD8+ T細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてCD8+ T細胞媒介性応答から構成される。 別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、CD8+ T細胞媒介性応答である。
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって引き出される免疫応答はCD4+ T細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてCD4+ T細胞媒介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、CD4+ T細胞媒介性応答である。
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって引き出される免疫応答は先天的な免疫応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主として先天的な免疫応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、先天的な免疫応答である。先天的な免疫応答の活性化は、M1マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞(DC)などのマクロファージの活性化に関与する場合があることを当業者は理解するであろう。
別の実施形態では、本発明は、ガンまたは感染性疾患またはアレルギーの発生率を減少する方法を提供し、この方法は本発明の組成物を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、ガンまたは感染性疾患またはアレルギーを軽快する方法を提供し、この方法は本発明の組成物を投与することを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
一実施形態では、本発明で使用するための組み換え型リステリア・モノサイトゲネスは異種ペプチドを分泌する。別の実施形態では、本発明で使用するための組み換え型リステリア・モノサイトゲネスは異種ペプチドを発現する。
別の実施形態では、本発明で使用するための組み換え型リステリア・モノサイトゲネスは、本明細書に記述されるようにPEST含有ポリペプチド(例えば、非溶血性LLO)を発現および分泌する。
一実施形態では、本発明の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、本発明のワクチンは、家族性の遺伝子または人々がこれらのタイプの病気にかかりやすくする他の状況の原因で、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、本発明のワクチンは、家族性の遺伝子または人々がこれらのタイプの病気にかかりやすくする他の状況の原因で、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンを有する人々を治療するために使用される。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、本発明のワクチンは、家族性の遺伝子または人々がこれらのタイプの病気にかかりやすくする他の状況の原因で、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンを有する人々の代替的な治療の前または後に使用される。別の実施形態では、かかる治療は、化学療法、外科手術、放射、およびこれに類するものを含む。かかる治療に続いて、本発明のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対するCTL応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、本発明のワクチンは、それまでに定着した腫瘍の増殖に効果を持ち、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
本発明によって投与範囲の様々な実施形態が企図される。一実施形態では、ワクチンベクターの場合は、投与量は0.4LD50/回の範囲である。別の実施形態では、投与量は約0.4〜4.9LD50/回である。別の実施形態では、投与量は約0.5〜0.59LD50/回である。別の実施形態では、投与量は約0.6〜0.69LD50/回である。別の実施形態では、投与量は約0.7〜0.79LD50/回である。別の実施形態では、投与量は約0.8LD50/回である。別の実施形態では、投与量は0.4LD50/回〜0.8のLD50/回である。
別の実施形態では、投与量は細菌数107個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数1.5×107個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数2×107個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数3×107個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数4×107個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数6×107個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数8×107個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数1×108個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数1.5×108個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数2×108個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数3×108個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数4×108個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数6×108個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数8×108個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数1×109個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数1.5×109個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数2×109個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数3×109個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数5×109個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数6×109個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数8×109個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数1×1010個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数1.5×1010個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数2×1010個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数3×1010個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数5×1010個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数6×1010個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数8×1010個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数8×109個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数1×1011個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数1.5×1011個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数2×1011個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数3×1011個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数5×1011個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数6×1011個/回である。別の実施形態では、投与量は細菌数8×1011個/回である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
「相同性」、「相同の」等々という用語は、本明細書に提供される任意のタンパク質またはペプチドに関するとき、一実施形態では、最大パーセントの相同性を達成するため、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮せずに、必要に応じて配列をアラインしギャップを導入した後の対応する未変性ポリペプチドの残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは当該技術分野で周知である。本発明の別の実施形態、方法、および組成物では、本発明の異種抗原またはLLO配列の相同体を利用する。
別の実施形態では、「相同性」という用語は、いずれかの核酸配列を参照するとき、対応する未変性核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを同様に示す。
別の実施形態では、「相同性」という用語は、本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする孤立核酸を指し、これは本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と少なくとも65%の相同性を共有する。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも75%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも85%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも90%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも95%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも97%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも99%の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、相同性の上記の範囲を、本明細書に提供されるシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドのアミノ酸配列のものを用いるシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドのアミノ酸配列間の共有に適用する。別の実施形態では、本明細書に提供されるPEST含有ポリペプチドは組み換え型ポリペプチドである。
一実施形態では、当該技術分野において適切に記述される方法によって、相同性は配列アライメントに対してコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム解析は入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含む場合があり、これらは、例えば、BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST増強アラインメントユーティリティ)、GENPEPT、およびTREMBLパッケージなどである。
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列から選択された配列との同一性が60%より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列から選択された配列との同一性が70%より大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は75%より大きい。別の実施形態では、同一性は78%より大きい。別の実施形態では、同一性は80%より大きい。別の実施形態では、同一性は82%より大きい。別の実施形態では、同一性は83%より大きい。別の実施形態では、同一性は85%より大きい。別の実施形態では、同一性は87%より大きい。別の実施形態では、同一性は88%より大きい。別の実施形態では、同一性は90%より大きい。別の実施形態では、同一性は92%より大きい。別の実施形態では、同一性は93%より大きい。別の実施形態では、同一性は95%より大きい。別の実施形態では、同一性は96%より大きい。別の実施形態では、同一性は97%より大きい。別の実施形態では、同一性は98%より大きい。別の実施形態では、同一性は99%より大きい。別の実施形態では、同一性は100%である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、相同性は候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介して決定され、その方法は当該技術分野において適切に記述される(例えば、“Nucleic Acid Hybridization” Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1985)、Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.、およびAusubel et al.,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Yを参照のこと)。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、未変性カスパーゼペプチドをコードするDNAの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、10〜20%のホルムアミド、5×SSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート液、10%の硫酸デキストラン、および20μg/mLの変性断片化サケ精子DNAを含む溶液中42℃にて一晩のインキュベーションである。
本明細書に列挙された任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および/またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において適切に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかはFASTA、BLAST、MPsrch、またはScanpsパッケージを含んでもよく、また例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および/または解析のための広範囲/局所的もしくはBLOCKSアラインメントを採用してもよい。各々の相同性を決定する方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明は、発明の方法を実施するうえで利用される試薬を含むキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、ツール、または器具を含むキットを提供する。
「接触する」または「投与する」という用語は、本発明の組成物をガン細胞、被験者、腫瘍、または疾患の部位に直接接触することを包含することができることがよく理解されるであろう。別の実施形態では、この用語は、本発明の組成物をガン細胞、腫瘍、または疾患の部位に間接的に接触することを指す。別の実施形態では、本発明の方法は、これによって化合物が体内を循環する当該技術分野で既知の拡散または任意の他の能動輸送もしくは受動輸送プロセスによって、被験者に本発明の組成物を接触し、その後で組成物がガン細胞、腫瘍、または疾患の部位と接触する方法を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
別の実施形態では、「遺伝子」および「組み換え型遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。かかる自然の対立遺伝子変異は、典型的には所与の遺伝子のヌクレオチド配列中に1〜5%の変異を生じる。数多くの異なる個体または生物体の中の対象となる遺伝子を配列決定することによって、代替的な対立遺伝子を同定することができる。これはハイブリダイゼーションプローブを使用して、様々な個体または生物体中の同一の遺伝子座を識別するために、容易に実行することができる。自然の対立遺伝子変異の結果であり、また機能活性を変更しない、ありとあらゆるかかるヌクレオチドの変種および結果として得られるアミノ酸多型もしくは変種が本発明の範囲内であることが意図される。
別の実施形態では、非経口的に、癌近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内になどの当業者に既知の任意の方法によって、本発明の組成物を被験者に投与する。
本明細書に提供される方法および組成物の別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は経口で投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、ゼラチンカプセルを含む。
別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、液状調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
いくつかの実施形態では、抗体またはその機能的断片が組み換え型Lm株を含む組成物から別個に投与されるとき、抗体は、静脈内で、皮下で、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてもよい。一実施形態では、抗体を含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
一実施形態では、「免疫原性組成物」という用語は本明細書に提供される組み換え型リステリア、ならびにアジュバントおよび抗体もしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せを包含する場合がある。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に提供される組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供されるアジュバントを含む。本明細書にさらに提供されるように、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する、またはTエフェクター細胞に対する調節性T細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態が範囲の形式で提示される場合がある。範囲の形式の記述は、単に利便性および簡潔性の目的に過ぎず、また本発明の範囲の融通の利かない制限として解釈するべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記述はすべての可能性のある部分的範囲ならびにその範囲内の個別の数量的な値を具体的に開示されたものと考えるべきである。例えば、1〜6などのような範囲の記述は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6、等々などの具体的に開示された小範囲、ならびにこの範囲内の個別の数、例えば、1、2、3、4、5、および6を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅広さに関わらず適用される。
本明細書に数値的な範囲が示されるときはいつも、示される範囲内のあらゆる引用された数値(部分または全体)を含むことを意味する。第1に示す数と第2に示す数と「の間の範囲」という句、および第1に示す数「から」第2に示す数「までの範囲」という句は、本明細書で交換可能に使用され、また第1に示す数および第2に示す数ならびにそれらの間のすべての分割した数および整数を含むことを意味する。
「治療する」という用語は疾患を治癒すること、疾患を防止する、疾患の発生率を減少すること、疾患の症状を軽快すること、疾患の寛解を誘発すること、疾患の進行を遅らせることを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、「減少する」、「抑制する」、および「阻害する」という用語は、より少なくすることまたは減らすことを指す。
「治療的に有効な投与量」または「治療有効量」という用語は投与されるものに対して望ましい効果を生成する投与量を包含する場合があることを当業者はよく理解するであろう。正確な投与量は既知の技法を使用する当業者によって確認することができるであろう。
「約」という用語は定量的な用語は、プラスもしくはマイナス5%、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス10%、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス15%、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス20%を包含する場合があることを当業者はよく理解するであろう。
「被験者」という用語は、症状もしくはその後遺症に対する療法を必要とする、または症状もしくはその後遺症に敏感なヒトを含む哺乳類を包含する場合があり、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウス、ならびにヒトを含んでもよいことを当業者はよく理解するであろう。この用語が家畜を包含してもよいことも理解されるであろう。「被験者」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
材料および実験方法(実施例1〜2)
<実施例1>
LLO−抗原融合が抗腫瘍免疫性を誘発
細胞株
C57BL/6同系TC−1腫瘍をHPV−16 E6およびE7で不死化し、c−Ha−rasガン遺伝子で形質転換した。T.C.Wu(Johns Hopkins University School of Medicine、米国メリーランド州Baltimore)によって提供されたTC−1は、HPV−16 E6 および E7で低いレベルを発現する腫瘍形成性の高い肺上皮細胞であり、またc−Ha−rasガン遺伝子で形質転換される。TC−1を、RPMI 1640、10%のFCS、2mMのL−グルタミン、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、100μMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、50マイクロモル(mcM)の2−ME、400マイクログラム(mcg)/mLのG418、および10%のナショナルコレクションタイプ培養液−109培地中で、37°で、10%のCO2を用いて増殖させた。C3は、C57BL/6マウスからのマウスの胎芽細胞であり、HPV 16の完全なゲノムで不死化し、pEJ−rasで形質転換された。EL−4/E7は、E7を用いてレトロウイルスによって形質導入した胸腺腫EL−4である。
<実施例1>
LLO−抗原融合が抗腫瘍免疫性を誘発
細胞株
C57BL/6同系TC−1腫瘍をHPV−16 E6およびE7で不死化し、c−Ha−rasガン遺伝子で形質転換した。T.C.Wu(Johns Hopkins University School of Medicine、米国メリーランド州Baltimore)によって提供されたTC−1は、HPV−16 E6 および E7で低いレベルを発現する腫瘍形成性の高い肺上皮細胞であり、またc−Ha−rasガン遺伝子で形質転換される。TC−1を、RPMI 1640、10%のFCS、2mMのL−グルタミン、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、100μMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、50マイクロモル(mcM)の2−ME、400マイクログラム(mcg)/mLのG418、および10%のナショナルコレクションタイプ培養液−109培地中で、37°で、10%のCO2を用いて増殖させた。C3は、C57BL/6マウスからのマウスの胎芽細胞であり、HPV 16の完全なゲノムで不死化し、pEJ−rasで形質転換された。EL−4/E7は、E7を用いてレトロウイルスによって形質導入した胸腺腫EL−4である。
L.モノサイトゲネス株および繁殖
使用されたリステリア株は、Lm−LLO−E7(エピソームの発現系内のhly−E7融合遺伝子、図1A)、Lm−E7(リステリアゲノムへと組込まれる単一コピーE7遺伝子カセット)、Lm−LLO−NP(「DP−L2028」、エピソーム発現系内のhly−NP融合遺伝子)、およびLm−Gag(「ZY−18」、染色体へと組込まれる単一コピーHIV−1Gag遺伝子カセット)である。E7を、プライマー5’−GGCTCGAGCATGGAGATACACC−3’(配列番号:24、XhoI部位は下線付き)および5’−GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA−3’(配列番号:25、SpeI部位は下線付き)を使用してPCRによって増幅し、pCR2.1(Invitrogen米国カリフォルニア州San Diego)へと連結させた。pCR2.1をXhoI/SpeIによって消化してE7を切り離してpGG−55へと連結した。このhly−E7融合遺伝子および多能性の転写因子prfAをマルチコピーシャトルプラスミド(Wirth R et al、J Bacteriol、165:831,1986)であるpAM401へとクローニングし、pGG−55を生成する。hlyプロモーターはhly遺伝子産物(以下に「ΔLLO」と称される溶血性のC末端を欠いている)の最初の441 AAの発現を駆動し、これはXhoI部位によってE7遺伝子に連結され、hly−E7融合遺伝子を生じ、これは転写されてLLO−E7として分泌される。リステリアのprfA陰性株、XFL−7(ペンシルバニア大学のDr.Hao Shenによって提供された)のpGG−55を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された(図1A〜図1B)。hlyプロモーターおよび遺伝子断片は、プライマー5’−GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC−3’(配列番号:26、NheI部位は下線付き)、および5’−CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC−3’(配列番号:27、XhoI部位は下線付き)を用いて作成した。prfA遺伝子は、プライマー5’−GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT−3’(配列番号:28、XbaI部位は下線付き)、および5’−CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG−3’(配列番号:29、SalI部位は下線付き)を用いてPCR増幅した。Lm−E7は、hlyプロモーターとE7の発現および分泌を駆動するシグナル配列とを含有する発現カセットを、LMゲノムのorfZドメインへと導入することによって生成した。E7をプライマー5’−GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC−3’(配列番号:30、BamHI部位は下線付き)および5’−GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG−3’(配列番号:31、XbaI部位は下線付き)を使用してPCR増幅した。次いでE7をpZY−21シャトルベクターの中へと連結させた。LM株10403Sを、LMゲノムのorfX、Y、Zドメインに対応する1.6kb配列の中央に挿入された発現カセットを含む、結果として得られるプラスミドpZY−21−E7を用いて形質転換した。相同性ドメインは相同的組み換えによってE7遺伝子カセットのorfZドメインへの挿入を可能にする。クローンをE7遺伝子カセットのorfZドメインへの組込みについてスクリーニングした。細菌をブレインハートインフュージョン培地中で、クロラムフェニコール(20μg/mL)を用いて(Lm−LLO−E7およびLm−LLO−NP)、または用いないで(Lm−E7およびZY−18)、増殖させた。細菌は、アリコートを−80℃にて凍結させた。ウエスタンブロット法によって発現を検証した(図2)。
使用されたリステリア株は、Lm−LLO−E7(エピソームの発現系内のhly−E7融合遺伝子、図1A)、Lm−E7(リステリアゲノムへと組込まれる単一コピーE7遺伝子カセット)、Lm−LLO−NP(「DP−L2028」、エピソーム発現系内のhly−NP融合遺伝子)、およびLm−Gag(「ZY−18」、染色体へと組込まれる単一コピーHIV−1Gag遺伝子カセット)である。E7を、プライマー5’−GGCTCGAGCATGGAGATACACC−3’(配列番号:24、XhoI部位は下線付き)および5’−GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA−3’(配列番号:25、SpeI部位は下線付き)を使用してPCRによって増幅し、pCR2.1(Invitrogen米国カリフォルニア州San Diego)へと連結させた。pCR2.1をXhoI/SpeIによって消化してE7を切り離してpGG−55へと連結した。このhly−E7融合遺伝子および多能性の転写因子prfAをマルチコピーシャトルプラスミド(Wirth R et al、J Bacteriol、165:831,1986)であるpAM401へとクローニングし、pGG−55を生成する。hlyプロモーターはhly遺伝子産物(以下に「ΔLLO」と称される溶血性のC末端を欠いている)の最初の441 AAの発現を駆動し、これはXhoI部位によってE7遺伝子に連結され、hly−E7融合遺伝子を生じ、これは転写されてLLO−E7として分泌される。リステリアのprfA陰性株、XFL−7(ペンシルバニア大学のDr.Hao Shenによって提供された)のpGG−55を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された(図1A〜図1B)。hlyプロモーターおよび遺伝子断片は、プライマー5’−GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC−3’(配列番号:26、NheI部位は下線付き)、および5’−CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC−3’(配列番号:27、XhoI部位は下線付き)を用いて作成した。prfA遺伝子は、プライマー5’−GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT−3’(配列番号:28、XbaI部位は下線付き)、および5’−CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG−3’(配列番号:29、SalI部位は下線付き)を用いてPCR増幅した。Lm−E7は、hlyプロモーターとE7の発現および分泌を駆動するシグナル配列とを含有する発現カセットを、LMゲノムのorfZドメインへと導入することによって生成した。E7をプライマー5’−GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC−3’(配列番号:30、BamHI部位は下線付き)および5’−GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG−3’(配列番号:31、XbaI部位は下線付き)を使用してPCR増幅した。次いでE7をpZY−21シャトルベクターの中へと連結させた。LM株10403Sを、LMゲノムのorfX、Y、Zドメインに対応する1.6kb配列の中央に挿入された発現カセットを含む、結果として得られるプラスミドpZY−21−E7を用いて形質転換した。相同性ドメインは相同的組み換えによってE7遺伝子カセットのorfZドメインへの挿入を可能にする。クローンをE7遺伝子カセットのorfZドメインへの組込みについてスクリーニングした。細菌をブレインハートインフュージョン培地中で、クロラムフェニコール(20μg/mL)を用いて(Lm−LLO−E7およびLm−LLO−NP)、または用いないで(Lm−E7およびZY−18)、増殖させた。細菌は、アリコートを−80℃にて凍結させた。ウエスタンブロット法によって発現を検証した(図2)。
ウエスタンブロット法
リステリア株をルリア−ベルターニ培地内で37℃にて増殖させ、600nmで測定された同一の光学濃度にて採取した。上清をTCA沈殿させ、0.1NのNaOHで補充した1×サンプルバッファー中で再懸濁した。同一量の各々の細胞ペレットまたは各々のTCA沈殿させた上清を、4〜20%のトリスグリシンSDS−PAGEゲル(NOVEX、米国カリフォルニア州San Diego)上に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデンに移し、抗E7モノクローナル抗体(mAb)(Zymed Laboratories、米国カリフォルニア州South San Francisco)でプローブし、次いでHRP−共役抗マウス二次Ab(Amersham Pharmacia Biotech、英国Little Chalfont)でインキュベートし、Amersham ECL検出試薬で顕色し、Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)を感光させた。
リステリア株をルリア−ベルターニ培地内で37℃にて増殖させ、600nmで測定された同一の光学濃度にて採取した。上清をTCA沈殿させ、0.1NのNaOHで補充した1×サンプルバッファー中で再懸濁した。同一量の各々の細胞ペレットまたは各々のTCA沈殿させた上清を、4〜20%のトリスグリシンSDS−PAGEゲル(NOVEX、米国カリフォルニア州San Diego)上に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデンに移し、抗E7モノクローナル抗体(mAb)(Zymed Laboratories、米国カリフォルニア州South San Francisco)でプローブし、次いでHRP−共役抗マウス二次Ab(Amersham Pharmacia Biotech、英国Little Chalfont)でインキュベートし、Amersham ECL検出試薬で顕色し、Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)を感光させた。
腫瘍増殖の測定
1日おきにカリパスを表面の最短径および最長径にわたして腫瘍を測定した。これら2つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートル単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が20mmに達したとき、マウスを犠牲にした。各々の時点に対する腫瘍の測定値は、生きているマウスに対してのみ示されている。
1日おきにカリパスを表面の最短径および最長径にわたして腫瘍を測定した。これら2つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートル単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が20mmに達したとき、マウスを犠牲にした。各々の時点に対する腫瘍の測定値は、生きているマウスに対してのみ示されている。
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組み換え型の効果
生後6〜8週目のC57BL/6マウス(Charles River)は2×105TC−1細胞を左脇腹の皮下に受けた。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径4〜5mmの触知可能なサイズに達した。次いで8匹のマウスの群が、7日目および14日目に、0.1LD50腹腔内で、Lm−LLO−E7(107CFU)、Lm−E7(106CFU)、Lm−LLO−NP(107CFU)、またはLm−Gag(5×105CFU)で処置された。
生後6〜8週目のC57BL/6マウス(Charles River)は2×105TC−1細胞を左脇腹の皮下に受けた。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径4〜5mmの触知可能なサイズに達した。次いで8匹のマウスの群が、7日目および14日目に、0.1LD50腹腔内で、Lm−LLO−E7(107CFU)、Lm−E7(106CFU)、Lm−LLO−NP(107CFU)、またはLm−Gag(5×105CFU)で処置された。
51Crリリースアッセイ
生後6〜8週間のC57BL/6マウスは腹腔内に0.1LD50Lm−LLO−E7、Lm−E7、Lm−LLO−NP、またはLm−Gagを免疫化した。免疫化の10日後、脾臓を採取した。フィーダー細胞として照射されたTC−1細胞(100:1、脾細胞:TC−1)を用いて、脾細胞を培養液内に定着し、インビトロで5日間刺激し、次いで以下の標的化を使用して標準的な51Crリリースアッセイ内で使用された。EL−4、EL−4/E7、またはEL−4でパルスしたE7 H−2bペプチド(RAHYNIVTF)(配列番号:32)。3倍の回数実施したE:T細胞比は、80:1、40:1、20:1、10:1、5:1、および2.5:1であった。37℃にて4時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、50μlの上清を各々のウェルから取り出した。Wallac 1450シンチレーションカウンター(米国メリーランド州Gaithersburg)を用いてサンプルをアッセイした。パーセント特異的溶解は、[(実験的計数の一分当たりの計数(cpm)−自然発生cpm)/(合計cpm−自然発生cpm)]×100として決定された。
生後6〜8週間のC57BL/6マウスは腹腔内に0.1LD50Lm−LLO−E7、Lm−E7、Lm−LLO−NP、またはLm−Gagを免疫化した。免疫化の10日後、脾臓を採取した。フィーダー細胞として照射されたTC−1細胞(100:1、脾細胞:TC−1)を用いて、脾細胞を培養液内に定着し、インビトロで5日間刺激し、次いで以下の標的化を使用して標準的な51Crリリースアッセイ内で使用された。EL−4、EL−4/E7、またはEL−4でパルスしたE7 H−2bペプチド(RAHYNIVTF)(配列番号:32)。3倍の回数実施したE:T細胞比は、80:1、40:1、20:1、10:1、5:1、および2.5:1であった。37℃にて4時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、50μlの上清を各々のウェルから取り出した。Wallac 1450シンチレーションカウンター(米国メリーランド州Gaithersburg)を用いてサンプルをアッセイした。パーセント特異的溶解は、[(実験的計数の一分当たりの計数(cpm)−自然発生cpm)/(合計cpm−自然発生cpm)]×100として決定された。
TC−1特異的な増殖
C57BL/6マウスに0.1 LD50を用いて免疫化し、20日後に1 LD50Lm−LLO−E7、Lm−E7、Lm−LLO−NP、またはLm−Gagを用いて腹腔内注射によってブーストした。ブースティングの6日後、免疫化マウスおよび無処置マウスから脾臓を採取した。脾細胞を5×105/ウェルで、平底96−ウェルプレート内に、2.5×104、1.25×104、6×103、または3×103の照射したTC−1細胞/ウェルをE7 Ag源として用いて、またはTC−1細胞なし、もしくは10μg/mLのCon A付きで、培養液内に定着した。45時間後に0.5μCi[3H]チミジン/ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはTomtecハーベスター96(米国コネチカット州Orange)を使用して18時間後採取され、Wallac 1450シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。cpmの変化は、実験的なcpm−Agを含まないcpmとして計算された。
C57BL/6マウスに0.1 LD50を用いて免疫化し、20日後に1 LD50Lm−LLO−E7、Lm−E7、Lm−LLO−NP、またはLm−Gagを用いて腹腔内注射によってブーストした。ブースティングの6日後、免疫化マウスおよび無処置マウスから脾臓を採取した。脾細胞を5×105/ウェルで、平底96−ウェルプレート内に、2.5×104、1.25×104、6×103、または3×103の照射したTC−1細胞/ウェルをE7 Ag源として用いて、またはTC−1細胞なし、もしくは10μg/mLのCon A付きで、培養液内に定着した。45時間後に0.5μCi[3H]チミジン/ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはTomtecハーベスター96(米国コネチカット州Orange)を使用して18時間後採取され、Wallac 1450シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。cpmの変化は、実験的なcpm−Agを含まないcpmとして計算された。
フローサイトメトリー解析
C57BL/6マウスに静脈内(i.v.)で、0.1LD50のLm−LLO−E7またはLm−E7を用いて免疫化し、30日後にブーストした。CD8(53−6.7、PE共役)、CD62リガンド(CD62L、MEL−14、APC共役)、およびE7 H−2Db四量体のための3色フローサイトメトリーを、FACSCalibur(登録商標)フローサイトメーターをCellQuest(登録商標)ソフトウェア(Becton Dickinson、米国カリフォルニア州Mountain View、)とともに使用して実施した。ブーストの5日後に採取した脾細胞を、E7ペプチド(RAHYNIVTF)(配列番号:32)または対照(HIV−Gag)ペプチドを負荷したH−2Db四量体を用いて、室温(rt)にて染色した。四量体は1/200に希釈して使用され、これらの四量体は、Dr.Larry R.Pease(Mayo Clinic、米国ミネソタ州Rochester)およびNIAID Tetramer Core FacilityおよびNIH AIDS Researchならびに標準試薬プログラムによって提供された。Tetramer+、CD8+、CD62Llow細胞は解析された。
C57BL/6マウスに静脈内(i.v.)で、0.1LD50のLm−LLO−E7またはLm−E7を用いて免疫化し、30日後にブーストした。CD8(53−6.7、PE共役)、CD62リガンド(CD62L、MEL−14、APC共役)、およびE7 H−2Db四量体のための3色フローサイトメトリーを、FACSCalibur(登録商標)フローサイトメーターをCellQuest(登録商標)ソフトウェア(Becton Dickinson、米国カリフォルニア州Mountain View、)とともに使用して実施した。ブーストの5日後に採取した脾細胞を、E7ペプチド(RAHYNIVTF)(配列番号:32)または対照(HIV−Gag)ペプチドを負荷したH−2Db四量体を用いて、室温(rt)にて染色した。四量体は1/200に希釈して使用され、これらの四量体は、Dr.Larry R.Pease(Mayo Clinic、米国ミネソタ州Rochester)およびNIAID Tetramer Core FacilityおよびNIH AIDS Researchならびに標準試薬プログラムによって提供された。Tetramer+、CD8+、CD62Llow細胞は解析された。
B16F0−Ova実験
24匹のC57BL/6マウスに5×105のB16F0−Ova細胞を接種した。3日目、10日目、および17日目に、0.1LD50Lm−OVA(106cfu)、Lm−LLO−OVA(108cfu)を用いて8匹のマウスの群に免疫化し、8匹の動物は処置しないままにした。
24匹のC57BL/6マウスに5×105のB16F0−Ova細胞を接種した。3日目、10日目、および17日目に、0.1LD50Lm−OVA(106cfu)、Lm−LLO−OVA(108cfu)を用いて8匹のマウスの群に免疫化し、8匹の動物は処置しないままにした。
統計
腫瘍径の比較のために、各々の群に対する腫瘍サイズの平均およびが決定され、スチューデントのt−検定によって統計的有意性が決定された。p≦0.05は有意と考えられる。
結果
腫瘍径の比較のために、各々の群に対する腫瘍サイズの平均およびが決定され、スチューデントのt−検定によって統計的有意性が決定された。p≦0.05は有意と考えられる。
結果
Lm−E7およびLm−LLO−E7がTC−1増殖に影響を与える能力に関して比較された。皮下腫瘍がC57BL/6マウスの左の脇腹に定着した。7日後、腫瘍は触知可能なサイズ(4〜5mm)に達した。7日目および14日目に、0.1 LD50Lm−E7、Lm−LLO−E7、または対照としてのLm−GagおよびLm−LLO−NPをマウスにワクチン接種した。Lm−LLO−E7は、定着したTC−1腫瘍の75%の完全な退行を誘発し、一方でこの群の中の他の2匹のマウスでは腫瘍増殖が制御された(図3)。対照的に、Lm−E7およびLm−Gagを用いた免疫化は、腫瘍退行を誘発しなかった。この実験は複数回繰返され、常にとても類似した結果であった。加えて、Lm−LLO−E7に対しては異なる免疫化プロトコルの下でも類似の結果が達成された。別の実験では、単一の免疫化がマウスの定着した5mmのTC−1腫瘍を治癒することができた。
他の実験では、2つの他のE7を発現する腫瘍細胞株:C3およびEL−4/E7で類似の結果が得られた。Lm−LLO−E7を用いたワクチン接種の有効性を確認するために、腫瘍を除去した動物にTC−1またはEL−4/E7腫瘍細胞をそれぞれ60日目または40日目に再チャレンジさせた。Lm−LLO−E7を用いて免疫化した動物は実験終了まで腫瘍がないままであった(TC−1の場合124日目、EL−4/E7に対しては54日目)。
したがってΔLLOによる抗原の融合タンパク質としての発現は抗原の免疫原性を強化する。
<実施例2>
<実施例2>
LM−LLO−E7治療がTC−1特異的な脾細胞増殖を引き出す
Lm−LLO−E7を有するLm−E7によるT細胞の誘導を測定するために、E7特異的な増殖性の応答、抗原特異的な免疫能の測定が免疫化したマウスで測定された。脾細胞においてE7の供給源として照射したTC−1細胞に曝露したとき、Lm−LLO−E7で免疫化したマウスからの脾細胞を増殖した。TC−1比は20:1、40:1、80:1、および160:1である(図4)。反対に、Lm−E7およびrLm対照免疫化マウスからの脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖しか示さない。
<実施例3>
Lm−LLO−E7を有するLm−E7によるT細胞の誘導を測定するために、E7特異的な増殖性の応答、抗原特異的な免疫能の測定が免疫化したマウスで測定された。脾細胞においてE7の供給源として照射したTC−1細胞に曝露したとき、Lm−LLO−E7で免疫化したマウスからの脾細胞を増殖した。TC−1比は20:1、40:1、80:1、および160:1である(図4)。反対に、Lm−E7およびrLm対照免疫化マウスからの脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖しか示さない。
<実施例3>
ActA−E7およびPEST−E7融合が抗腫瘍免疫性を与える
材料および実験方法
Lm−ActA−E7の構築
Lm−ActA−E7は、actAタンパク質の切断版に融合されるE7タンパク質を発現するプラスミドを含むLMの組み換え型株である。pDP−2028を修正することによって構造化されたプラスミドベクターpDD−1をリステリアの中へと導入することによって、Lm−ActA−E7を生成した。pDD−1は、ActA−E7の発現および分泌を駆動する310bpのhlyプロモーターおよびhlyシグナル配列(ss)のコピーを発現する発現カセットと、4つのPEST配列を含む1170bpのActA遺伝子(配列番号:11)(分子の最初の390AAから構成される切断ActAポリペプチド、配列番号:10)と、300bpのHPV E7遺伝子と、1019bpのprfA遺伝子(病毒性遺伝子の対照発現)と、形質転換された細菌クローンの選択のためのCAT遺伝子(クロラムフェニコール抵抗性遺伝子)(Sewell et al.(2004)、Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.,130:92−97)とを含む。
材料および実験方法
Lm−ActA−E7の構築
Lm−ActA−E7は、actAタンパク質の切断版に融合されるE7タンパク質を発現するプラスミドを含むLMの組み換え型株である。pDP−2028を修正することによって構造化されたプラスミドベクターpDD−1をリステリアの中へと導入することによって、Lm−ActA−E7を生成した。pDD−1は、ActA−E7の発現および分泌を駆動する310bpのhlyプロモーターおよびhlyシグナル配列(ss)のコピーを発現する発現カセットと、4つのPEST配列を含む1170bpのActA遺伝子(配列番号:11)(分子の最初の390AAから構成される切断ActAポリペプチド、配列番号:10)と、300bpのHPV E7遺伝子と、1019bpのprfA遺伝子(病毒性遺伝子の対照発現)と、形質転換された細菌クローンの選択のためのCAT遺伝子(クロラムフェニコール抵抗性遺伝子)(Sewell et al.(2004)、Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.,130:92−97)とを含む。
hlyプロモーター(pHly)および遺伝子断片は、pGG55(実施例1)から以下の2つのプライマーを使用してPCR増幅される。5’−GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC−3’(Xba I部位は下線付き、配列番号:33)およびプライマー5’−ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC−’3(NotI部位は下線付き。最初の18個のヌクレオチドはActA遺伝子重複である、配列番号:34)。actA遺伝子は、LM 10403S野生型ゲノムから、プライマー5’−GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT−3’(NotI部位は下線付き、配列番号:35)およびプライマー5’−TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC−3’(XhoI部位は下線付き、配列番号:36)を使用してPCR増幅された。E7遺伝子は、pGG55(pLLO−E7)から、プライマー5’−GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA−3’(XhoI部位は下線付き、配列番号:37)およびプライマー5’−AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA−3’(XmaI部位は下線付き、配列番号:38)を使用してPCR増幅される。prfA遺伝子は、LM10403S野生型ゲノムから、プライマー5’−TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT−3’(XmaI部位は下線付き、配列番号:39)およびプライマー5’−GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG−3’(SalI部位は下線付き、配列番号:40)を使用してPCR増幅された。hlyプロモーターactA遺伝子融合(pHly−actA)は、精製したpHly DNAおよび精製したactA DNAから、上流pHlyプライマー(配列番号:33)および下流actAプライマー(配列番号:36)を使用してPCR生成されて、PCR増幅された。
prfA遺伝子(E7−prfA)に融合されるE7遺伝子は、精製したE7DNAおよび精製したprfADNAから、上流E7プライマー(配列番号:37)および下流prfA遺伝子プライマー(配列番号:40)を使用したPCR解析を用いてもスクリーニングされた。
E7−prfA融合産物に融合したpHly−ActA融合産物は、精製し融合されたpHly−ActA DNA産物および精製し融合されたE7−prfA DNA産物から、上流pHlyプライマー(配列番号:33)および下流prfA遺伝子プライマー(配列番号:40)を使用してPCR生成およびPCR増幅され、pCRII(Invitrogen、米国カリフォルニア州La Jolla)へと連結される。コンピテント大腸菌(TOP10’F、Invitrogen、米国カリフォルニア州La Jolla)はpCRII−ActAE7で形質転換される。溶解および分離後、プラスミドは、BamHI(予想される断片サイズは770bpおよび6400bp(またはインサートがベクターへと戻されるときは:2500bpおよび4100bp))およびBstXI(予想される断片サイズは2800bpおよび3900bp)を使用して限定解析によってスクリーニングされ、また上流pHlyプライマー(配列番号:33)および下流prfA遺伝子プライマー(配列番号:40)を使用してPCR解析によってスクリーニングした。
pHly−ActA−E7−prfA DNAインサートはXba IおよびSal Iを用いた二重消化によってpCRIIから切り離され、またこれもXba I および Sal Iを用いて消化されたpDP−2028へと連結される。TOP10’Fコンピテント大腸菌(Invitrogen、米国カリフォルニア州La Jolla)を 発現系pActAE7を用いて形質転換した後、クロラムフェニコール耐性クローンを、上流pHlyプライマー配列番号:33)および下流PrfA遺伝子プライマー(配列番号:40)を使用してPCR解析によってスクリーニングした。pActAE7を含むクローンを、ブレインハートインフュージョン培地(クロラムフェニコール(20mcg(マイクログラム)/mL(ミリリットル)入り、Difco、米国ミシガン州Detroit)中で増殖させ、細菌細胞からミディプレップDNA精製システムキット(Promega、米国ウィスコンシン州Madison)を使用してpActAE7を分離した。ペニシリン処置したリステリア(株XFL−7)のprfA陰性株は発現系pActAE7を用いて形質転換され(Ikonomidis et al.(1994、J.Exp.Med.180:2209−2218)に記述されるように)、クローンはプラスミドの保持のためにインビボで選択された。クローンをクロラムフェニコール(20mcg/mL)入りのブレインハートインフュージョン中で37℃にて増殖させた。細菌をアリコートで−80℃にて凍結した。
抗原発現のイムノブロット検証
Lm−ActA−E7がActA−E7を分泌する(約64kD)ことを検証するために、リステリア株をルリア−ベルターニ(LB)培地中で37℃にて増殖させた。トリクロロ酢酸(TCA)を用いて培養上清からタンパク質を沈殿させ、0.1Nの水酸化ナトリウムを用いて1×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一の量の各々のTCA沈殿した上清を4%〜20%のトリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル(NOVEX、米国カリフォルニア州San Diego)に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に導入し、1:2500抗E7モノクローナル抗体(Zymed Laboratories、米国カリフォルニア州South San Francisco)でプローブし、次いで1:5000西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗マウスIgG(Amersham Pharmacia Biotech、英国、Little Chalfont)でプローブした。ブロットはAmersham強化化学発光検出試薬を用いて発色させ、オートラジオグラフィーフィルム(Amersham)に曝露した(図5A)。
Lm−ActA−E7がActA−E7を分泌する(約64kD)ことを検証するために、リステリア株をルリア−ベルターニ(LB)培地中で37℃にて増殖させた。トリクロロ酢酸(TCA)を用いて培養上清からタンパク質を沈殿させ、0.1Nの水酸化ナトリウムを用いて1×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一の量の各々のTCA沈殿した上清を4%〜20%のトリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル(NOVEX、米国カリフォルニア州San Diego)に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に導入し、1:2500抗E7モノクローナル抗体(Zymed Laboratories、米国カリフォルニア州South San Francisco)でプローブし、次いで1:5000西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗マウスIgG(Amersham Pharmacia Biotech、英国、Little Chalfont)でプローブした。ブロットはAmersham強化化学発光検出試薬を用いて発色させ、オートラジオグラフィーフィルム(Amersham)に曝露した(図5A)。
Lm−PEST−E7、Lm−ΔPEST−E7、およびLm−E7epiの構築(図6A)
Lm−PEST−E7は、それがプロモーターおよびhly遺伝子のPEST配列のみ、特にLLOの最初の50個のAAを含有すること以外はLm−LLO−E7と同一である。Lm−PEST−E7を構築するために、SOE(重複延長による遺伝子スプライシング)PCR技法を使用して、hlyプロモーターおよびPEST領域を全長のE7遺伝子に融合した。E7遺伝子およびhly−PEST遺伝子断片をLLOの最初の441個のAAを含有するプラスミドpGG−55から増幅し、従来のPCR技法によって一緒にスプライシングした。最終的なプラスミドpVS16.5を作り出すために、hly−PEST−E7断片およびprfA遺伝子を、インビトロでの選択のためのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドpAM401へとサブクローンし、得られたプラスミドを使用してXFL−7を形質転換した。
Lm−PEST−E7は、それがプロモーターおよびhly遺伝子のPEST配列のみ、特にLLOの最初の50個のAAを含有すること以外はLm−LLO−E7と同一である。Lm−PEST−E7を構築するために、SOE(重複延長による遺伝子スプライシング)PCR技法を使用して、hlyプロモーターおよびPEST領域を全長のE7遺伝子に融合した。E7遺伝子およびhly−PEST遺伝子断片をLLOの最初の441個のAAを含有するプラスミドpGG−55から増幅し、従来のPCR技法によって一緒にスプライシングした。最終的なプラスミドpVS16.5を作り出すために、hly−PEST−E7断片およびprfA遺伝子を、インビトロでの選択のためのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドpAM401へとサブクローンし、得られたプラスミドを使用してXFL−7を形質転換した。
Lm−ΔPEST−E7は、それがPEST配列を欠いていること以外は、Lm−LLO−E7と同一である組み換え型リステリア株である。これは、PEST含有領域(bp333−387)をhly−E7融合遺伝子から除去するために設計されたプライマーを使用してエピソーム発現系を構築した以外は、Lm−PEST−E7について本質的に記載されたように作成された。Lm−E7epiは、PEST領域またはLLOなしでE7を分泌する組み換え型株である。この株を形質転換するのに用いるプラスミドは、hlyプロモーターの遺伝子断片、およびE7遺伝子に融合したシグナル配列を含有する。この構築体は、染色体の中へと組み込まれたE7遺伝子の単一コピーを発現する本来のLm−E7とは異なる。Lm−E7epiは、発現されたE7抗原の形態を除いて、Lm−LLO−E7、Lm−PEST−E7、およびLm−ΔPEST−E7と完全に同系である。
結果
結果
Lm−ActA−E7対Lm−LLO−E7によって誘発した抗腫瘍免疫性を比較するために、2×105TC−1腫瘍細胞をマウス内に皮下移植し、触知可能サイズ(おおよそ5ミリメートル[mm])まで増殖させた。7日目および14日目に、マウスをLm−ActA−E7(5×108CFU)(十字)、Lm−LLO−E7(108CFU)(四角)、またはLm−E7(106CFU)(丸)いずれかの1つのLD50でマウスを腹腔内で免疫化した。26日目までに、Lm−LLO−E7およびLm−ActA−E7でのすべての動物は腫瘍がなく、そのままであったが、一方ですべての無処置の動物(三角)およびLm−E7で免疫化した動物は大きい腫瘍を成長させた(図5B)。したがって、ActA−E7融合でのワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
加えて、Lm−LLO−E7、Lm−PEST−E7、Lm−ΔPEST−E7、およびLm−E7epiを、E7発現腫瘍の退行を生じさせるそれらの能力について比較した。皮下 TC−1腫瘍は40匹のC57BL/6マウスの左脇腹に定着した。腫瘍が4〜5mmに達した後、マウスを8匹のマウスの5つの群に分けた。各々の群を4つの組み換え型LMワクチンのうちの1つで処置し、1つの群は未処置のまま放置した。Lm−LLO−E7およびLm−PEST−E7は、それぞれ5/8および3/8の事例では定着した腫瘍の退行を誘発した。いずれの時点においても、Lm−PEST−E7またはLm−LLO−E7で処置したマウスの平均腫瘍サイズの間に統計的な差はなかった。しかしながら、PEST配列、Lm−ΔPEST−E7、およびLm−E7epiを含まないE7を発現したワクチンは、1つを除いて全てのマウスで腫瘍退行を生じなかった(図6B、上のパネル)。これは2つの実験の代表であり、28日目における平均腫瘍サイズの統計的に有意な差がLm−LLO−E7またはLm−PEST−E7で処置した腫瘍とLm−E7epiまたはLm−ΔPEST−E7で処置した腫瘍との間で観察された(P<0.001、スチューデントのt検定;図6B、下のパネル)。加えて、四量体陽性脾細胞のパーセンテージの増大は、PEST含有ワクチンをワクチン接種したマウスの脾臓における3つの実験にわたって再現性が見られた(図6C)。したがって、PEST−E7融合を用いたワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
<実施例4>
<実施例4>
LLO、ActA、またはPEST様配列へのE7の融合はE7特異的な免疫性を強化し、腫瘍浸潤E7特異的CD8 + 細胞を発生させる
材料および実験方法
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の100mcl(マイクロリットル)の2×105TC−1腫瘍細胞に加えて400mclのMATRIGEL(登録商標)(BD Biosciences、米国ニュージャージー州Franklin Lakes)を含む500mclのMATRIGEL(登録商標)を12匹のC57BL/6マウスの左脇腹に皮下移植した(n=3)。マウスを7日目、14日目、および21日目に腹腔内で免疫化し、脾臓および腫瘍を28日目に採取した。腫瘍MATRIGELをマウスから取り出し、氷上で、2ミリリットル(mL)のRP 10培地を含有する試験管内で4℃にて一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子を用いてミンチし、2mmのブロックへと切断し、3mLの酵素混合物(PBS中の0.2mg/mLコラゲナーゼP、1mg/mLのDNAse−1)とともに37℃にて1時間インキュベートした。組織懸濁液を、ナイロンメッシュを通して濾過し、四量体およびIFN−γ染色のために、PBS中の5%ウシ胎児血清+0.05%のNaN3で洗浄した。
材料および実験方法
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の100mcl(マイクロリットル)の2×105TC−1腫瘍細胞に加えて400mclのMATRIGEL(登録商標)(BD Biosciences、米国ニュージャージー州Franklin Lakes)を含む500mclのMATRIGEL(登録商標)を12匹のC57BL/6マウスの左脇腹に皮下移植した(n=3)。マウスを7日目、14日目、および21日目に腹腔内で免疫化し、脾臓および腫瘍を28日目に採取した。腫瘍MATRIGELをマウスから取り出し、氷上で、2ミリリットル(mL)のRP 10培地を含有する試験管内で4℃にて一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子を用いてミンチし、2mmのブロックへと切断し、3mLの酵素混合物(PBS中の0.2mg/mLコラゲナーゼP、1mg/mLのDNAse−1)とともに37℃にて1時間インキュベートした。組織懸濁液を、ナイロンメッシュを通して濾過し、四量体およびIFN−γ染色のために、PBS中の5%ウシ胎児血清+0.05%のNaN3で洗浄した。
脾細胞および腫瘍細胞を107細胞/mLのブレフェルジンAの存在下で、1マイクロモル(mcm)のE7ペプチドを用いて5時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、50mclの抗マウスFc受容体上清(2.4 G2)中で4℃にて1時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子CD8およびCD62Lについて染色し、浸透させ、浸透キットGolgi−stop(登録商標)またはGolgi−Plug(登録商標)(Pharmingen、米国カリフォルニア州San Diego)を使用して固定し、IFN−γに対して染色した。500,000事象を2レーザーフローサイトメーター、FACSCaliburを使用して獲得し、Cellquest Software(Becton Dickinson、米国ニュージャージー州Franklin Lakes)を使用して分析した。活性化した(CD62Llow)CD8+T細胞内のIFN−γ分泌細胞のパーセンテージを計算した。
四量体染色のために、H−2Db四量体にフィコエリスリン(PE)共役E7ペプチド(RAHYNIVTF、配列番号:32)を負荷し、室温で1時間染色し、抗アロフィコシアニン(APC)共役MEL−14(CD62L)およびFITC−共役CD8bで4℃にて30分間染色した。細胞を、脾臓および腫瘍内の四量体+CD8+CD62Llow細胞を比較して解析した。
結果
結果
抗原特異的免疫性を強化するLm−ActA−E7の能力を解析するために、マウスにTC−1腫瘍細胞を移植し、Lm−LLO−E7(1×107CFU)、Lm−E7(1×106CFU)、またはLm−ActA−E7(2×108CFU)のいずれかで免疫化し、あるいは未処置とした(無処置)。Lm−LLO−E7およびLm−ActA−E7群からのマウスの腫瘍は、Lm−E7または無処置マウスにおけるよりも、より高いパーセンテージのIFN−γ分泌CD8+T細胞(図7A)および四量体特異的なCD8+細胞(図7B)を含有した。
別の実験では、腫瘍を持つマウスにLm−LLO−E7、Lm−PEST−E7、Lm−ΔPEST−E7、またはLm−E7epiを投与し、腫瘍の中のE7特異的なリンパ球のレベルを測定した。0.1のLD50の4つのワクチンを用いて、7日目および14日目にマウスを処置した。腫瘍を21日目に採取し、CD62L、CD8に対する抗体を用いて、およびE7/Db四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセンテージの増大が、Lm−LLO−E7およびLm−PEST−E7を用いてワクチン接種したマウスで見られた(図8A)。この結果は3つの実験にわたって再現性があった(図8B)。
したがって、Lm−LLO−E7、Lm−ActA−E7、およびLm−PEST−E7は、腫瘍浸潤CD8+ T細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。
材料および実験方法(実施例5〜10)
細菌株、形質転換、および選択
大腸菌株MB2159が、標準的なプロトコルを使用して、形質転換のために使用された。細菌細胞は、H2Oを用いた洗浄によって電気穿孔法のために準備された。
細菌株、形質転換、および選択
大腸菌株MB2159が、標準的なプロトコルを使用して、形質転換のために使用された。細菌細胞は、H2Oを用いた洗浄によって電気穿孔法のために準備された。
大腸菌株MB2159(Strych U et al、FEMS Microbiol Lett.2001 Mar 15;196(2):93−8)は、D−アラニン・ラセマーゼを合成することができないalr(−)/dadX(−)欠損突然変異体である。同様に、リステリア株Lm dal(−)/dat(−)(Lmdd)は、dal遺伝子およびdat遺伝子の部分的な欠失に起因してD−アラニン・ラセマーゼを合成することができない。
プラスミド構築
公開されているplcA遺伝子の配列を使用して(Mengaud et al.,Infect.Immun.1989 57、3695−3701)、染色体DNAから遺伝子を増幅するためにPCRが使用される。次いで、増幅された製品はSalIを生成したおよびXbaIを生成したDNA端部を使用してpAM401へと連結され、pDP1462を生成する。
公開されているplcA遺伝子の配列を使用して(Mengaud et al.,Infect.Immun.1989 57、3695−3701)、染色体DNAから遺伝子を増幅するためにPCRが使用される。次いで、増幅された製品はSalIを生成したおよびXbaIを生成したDNA端部を使用してpAM401へと連結され、pDP1462を生成する。
prfAを単独で含有するプラスミドpDP1500は、pDP1462から、plcA遺伝子、塩基429〜1349(Mengaud et al.、同上)を除去することによって、XbaIおよびPstIを用いた制限、それらを鈍らせるためのT4 DNAポリメラーゼを使用したDNA端部の処置、および細胞内連結の後、構造化される。
plcAプロモーターおよびplcAの3’端部の一部を含有するプラスミドpDP1499は、plcA内部断片、塩基428〜882(Mengaud et al.,Infect.Immun.1989 57,3695−3701)を、PstIおよびNsiIを用いた制限ならびに細胞内連結の後pDP1339から除去することによって構造化された。
pDP1526(pKSV7::ΔplcA)は、BAMHIおよびXbaI、468bpのplcAの5’端部を含有するpAM401::plcAからのXbaIおよびNsiIで生成した断片(塩基882〜1351、Mengaud et al.、同上)、および501bpのplcAの3’端部を含有するpAM401::plcA prfAからのPstIおよびBamHIで生成した断片(塩基77〜429、Mengaud et al.、同上)で制限されたpKSV7の単一の3部分からなる連結によって構造化された。
prfAプロモーター、塩基1〜429(Mengaud et al.、同上)は、pDP1462のEcoRIおよびPstI二重消化によって分離され、またこれに続いて断片はEcoRIおよびPstIで制限されたpKSV7へと連結され、pDP1498を生成した。2つのランダムにHindIIIで生成した長さがおよそ3kbである10403S染色体DNA断片は、HindIIIで制限されたpKSV7へと連結され、ランダム組み込み対照プラスミドpDP1519およびpDP1521を生成した。
L.モノサイトゲネス突然変異体株の構築
L.モノサイトゲネス株DP−L1387は、構造化されたSLCC 5764のTn917−LTV3バンクから、減少したレシチナーゼ(PC−PLC)を用いて突然変異体として分離された(前述されているように(Camilli et al.,J.Bacteriol.1990,172,3738−3744))。Tn917−LTV3挿入の部位はトランスポゾン染色体DNA結合をシークエンシングすることによって決定される(前述されているように(Sun et al.,Infect.Immun.1990 58,3770−3778))。L.モノサイトゲネスはプラスミドDNAを用いて形質転換される(前述されているように(Camilli et al.、同上))。L.モノサイトゲネス内のpAM401、pKSV7、およびこれらの誘導体の維持のための選択的な圧力が、培地1mL当たり10μgのクロラムフェニコールの存在下でかけられた。加えて、pKSV7誘導体の維持は、30℃(グラム陽性細菌内でのプラスミド複製のために許容できる温度)における増殖を必要とした。
L.モノサイトゲネス株DP−L1387は、構造化されたSLCC 5764のTn917−LTV3バンクから、減少したレシチナーゼ(PC−PLC)を用いて突然変異体として分離された(前述されているように(Camilli et al.,J.Bacteriol.1990,172,3738−3744))。Tn917−LTV3挿入の部位はトランスポゾン染色体DNA結合をシークエンシングすることによって決定される(前述されているように(Sun et al.,Infect.Immun.1990 58,3770−3778))。L.モノサイトゲネスはプラスミドDNAを用いて形質転換される(前述されているように(Camilli et al.、同上))。L.モノサイトゲネス内のpAM401、pKSV7、およびこれらの誘導体の維持のための選択的な圧力が、培地1mL当たり10μgのクロラムフェニコールの存在下でかけられた。加えて、pKSV7誘導体の維持は、30℃(グラム陽性細菌内でのプラスミド複製のために許容できる温度)における増殖を必要とした。
L.モノサイトゲネス染色体の中へのpKSV7誘導体の組み込みは、プラスミド上のL.モノサイトゲネスDNA配列とこれらの対応する染色体の対立遺伝子との間の相同的組み換えによってによって生じた。組込突然変異体は、培地1mLあたり10μgのクロラムフェニコールを含有するブレインハートインフージョン(BHI)培地中で40℃(pKSV7の複製を許容しない温度)にておよそ30世代の間増殖することによって富化された。これに続いて各々の組込み株を、培地1mLあたり10μgのクロラムフェニコールを含有するBHI寒天培養基上でコロニー精製し、40℃にてインキュベートした。各々の組込み株から分離された染色体DNAのサザンブロット解析は組込まれたプラスミドの存在を確認した。
DP−L1552の構築は、上述のように、部分二倍体中間体を生成するためのpKSV7誘導体pDP1526の組込みによって達成された。組込まれたプラスミドの細胞内の相同的組み換えを通した自然発生的な切り離しが低い頻度で生じる。プラスミドが染色体から切り離された細菌を、BHI培地中で30℃におけるおよそ50世代の間の増殖によって濃縮した。この工程の間の選択圧の特性は、未知であるが、組込まれている温度感応性プラスミドを含有する株のわずかな増殖欠陥に起因しているかもしれない。切り離し事象、すなわち3’の欠失の配列の間の相同的組み換えから結果として得られもののおよそ50%は、結果として染色体上の野生型対立遺伝子に対するΔplcAの対立遺伝子の交換を生じる。
切り離されたプラスミドは細菌をBHI中で40℃にておよそ30世代増殖することによって回復される。染色体上にΔplcA対立遺伝子を保持するプラスミドから回復した細菌は、BHI寒天培養基/2.5%の卵黄/2.5%のリン酸緩衝食塩水(PBS)(BHI/卵黄寒天培養基)の5mLの覆いを含有するBHI寒天培養基プレート上で増殖した後、コロニーを包囲する濁ったゾーンを生成できないことによって識別される。濁りゾーンは、卵黄中のPIのPI−PLC加水分解の結果から生じ、不溶性のジアシルグリセロールの沈殿が得られる。L.モノサイトゲネス染色体上の正しいplcA欠失は、PCRおよび欠失にわたる配列決定を使用して欠失した対立遺伝子を増幅することによって確認される。
したがって、PI−PLC陰性突然変異体(plcA欠失突然変異体)は、本発明により弱毒化L.モノサイトゲネスワクチンを生成するために使用される場合がある。他の突然変異体、すなわち、actA欠失突然変異体、plcB欠失突然変異体、およびplcAとplcBとの両方を欠いている二重変異体が同じ方法を使用して作成され、これらのすべては、弱毒化L.モノサイトゲネスワクチンを生成するためにも本開示により使用されてもよい。本開示が与えられると、当業者は上述のものに加えて他の弱毒化突然変異体を作り出すことができることになる。
Lmddの構築
dal遺伝子は、染色体遺伝子と温度感受性シャトルプラスミドpKSV7(Smith K et al、Biochimie.1992 Jul−Aug;74(7−8):705−11)との間の二重対立遺伝子交換によって当初不活性化され、これはエリスロマイシン耐性遺伝子を、本来の850bpのdal遺伝子PCR産物の5′端部からの450bpの断片とdal遺伝子PCR産物の3′端部からの450bpの断片との間で搬送する。これに続いて、遺伝子の82%をカバーするdal欠失突然変異体は、相同性領域を望ましい欠失を包囲する無傷の遺伝子(遺伝子の上流および下流の配列を含む)の5′および3′端部から搬送するpKSV7を用いた類似の交換反応によって構造化された。PCR解析は、この染色体の欠失の構造を確認するために使用される。
dal遺伝子は、染色体遺伝子と温度感受性シャトルプラスミドpKSV7(Smith K et al、Biochimie.1992 Jul−Aug;74(7−8):705−11)との間の二重対立遺伝子交換によって当初不活性化され、これはエリスロマイシン耐性遺伝子を、本来の850bpのdal遺伝子PCR産物の5′端部からの450bpの断片とdal遺伝子PCR産物の3′端部からの450bpの断片との間で搬送する。これに続いて、遺伝子の82%をカバーするdal欠失突然変異体は、相同性領域を望ましい欠失を包囲する無傷の遺伝子(遺伝子の上流および下流の配列を含む)の5′および3′端部から搬送するpKSV7を用いた類似の交換反応によって構造化された。PCR解析は、この染色体の欠失の構造を確認するために使用される。
染色体のdat遺伝子は、類似の対立遺伝子交換反応によって不活性化される。pKSV7は、無傷のdat遺伝子の5′および3′の両方の端部からPCRに由来する450bpの断片を搬送するように修正される(配列の上流および下流の遺伝子を含む)。これらの2つの断片は適切なPCRによって連結される。この構築体の染色体の中への交換は、結果としてPCR解析によって確認されたdat遺伝子の中心塩基の30%の欠失をもたらす。
細菌培養およびリステリアのインビボ継代
大腸菌は以下の標準的な方法で培養された。リステリアをLB培地(Difco、米国ミシガン州Detroit)+50mg/mLのストレプトマイシンの中で250rpmのシェーキングで37℃にて増殖させ、対数増殖フェーズの間に採取した。Lm−LLOE7については、37mg/mLのクロラムフェニコールが培地に追加された。増殖速度論の決定のために、細菌を10mLのLB+抗生剤中で16時間の間増殖させた。OD600nmが測定され、培養液密度が株の間で標準化された。培養液はLB+の好適な抗生物質および適用可能な場合はD−アラニン中へ1:50に希釈された。
大腸菌は以下の標準的な方法で培養された。リステリアをLB培地(Difco、米国ミシガン州Detroit)+50mg/mLのストレプトマイシンの中で250rpmのシェーキングで37℃にて増殖させ、対数増殖フェーズの間に採取した。Lm−LLOE7については、37mg/mLのクロラムフェニコールが培地に追加された。増殖速度論の決定のために、細菌を10mLのLB+抗生剤中で16時間の間増殖させた。OD600nmが測定され、培養液密度が株の間で標準化された。培養液はLB+の好適な抗生物質および適用可能な場合はD−アラニン中へ1:50に希釈された。
マウス中でのLMの継代
1×108CFUを腹腔内(i.p.)で C57BL/6マウスの中へと注射した。3日目に脾臓を分離し、PBS中で均質化した。脾臓懸濁液のアリコートをLBプレート上に適用可能な抗生物質と共にプレーティングした。いくつかのコロニーが拡張し、混合して注射ストックを定着した。
1×108CFUを腹腔内(i.p.)で C57BL/6マウスの中へと注射した。3日目に脾臓を分離し、PBS中で均質化した。脾臓懸濁液のアリコートをLBプレート上に適用可能な抗生物質と共にプレーティングした。いくつかのコロニーが拡張し、混合して注射ストックを定着した。
抗生物質抵抗性因子を有しないプラスミドpTV3の構築
p60−dalカセットの構築.抗生物質抵抗性遺伝子を有しないベクターの構築での第1の工程は、切断p60プロモーターの融合のdal遺伝子への構築である。LMアラニン・ラセマーゼ(dal)遺伝子(フォワードプライマー:5’−CCA TGG TGA CAG GCT GGC ATC−3’、配列番号:41)(リバースプライマー:5’−GCT AGC CTA ATG GAT GTA TTT TCT AGG−3’、配列番号:42)および最小p60プロモーター配列(フォワードプライマー:5’−TTA ATT AAC AAA TAG TTG GTA TAG TCC−3’、配列番号:43)(リバースプライマー:5’−GAC GAT GCC AGC CTG TCA CCA TGG AAA ACT CCT CTC−3’、配列番号:44)がLM株10403SのゲノムからのPCR増幅によって分離された。プライマーは、重なった延長部の接合(SOE)−PCRによるp60およびdalのこれに続く融合のために、p60配列の上流PacI部位と、dal配列の下流のNheI部位(制限部位を太字で示す)と、p60プロモーターの下流の重なっているdal配列(最初の18bp)とを導入した。切断p60プロモーターの配列は以下のとおりである。CAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTAGCCTTTGGAGTATTATCTCATCATTTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAACTTAGTATTATCAATATAAAATTAATTCTCAAATACTTAATTACGTACTGGGATTTTCTGAAAAAAGAGAGGAGTTTTCC(配列番号:45)(Kohler et al,J Bacteriol 173:4668−74,1991)。SOE−PCRを使用して、p60およびdal PCR産物はクローニングベクターpCR2.1(Invitrogen、米国カリフォルニア州La Jolla)へと融合およびクローニングされる。
p60−dalカセットの構築.抗生物質抵抗性遺伝子を有しないベクターの構築での第1の工程は、切断p60プロモーターの融合のdal遺伝子への構築である。LMアラニン・ラセマーゼ(dal)遺伝子(フォワードプライマー:5’−CCA TGG TGA CAG GCT GGC ATC−3’、配列番号:41)(リバースプライマー:5’−GCT AGC CTA ATG GAT GTA TTT TCT AGG−3’、配列番号:42)および最小p60プロモーター配列(フォワードプライマー:5’−TTA ATT AAC AAA TAG TTG GTA TAG TCC−3’、配列番号:43)(リバースプライマー:5’−GAC GAT GCC AGC CTG TCA CCA TGG AAA ACT CCT CTC−3’、配列番号:44)がLM株10403SのゲノムからのPCR増幅によって分離された。プライマーは、重なった延長部の接合(SOE)−PCRによるp60およびdalのこれに続く融合のために、p60配列の上流PacI部位と、dal配列の下流のNheI部位(制限部位を太字で示す)と、p60プロモーターの下流の重なっているdal配列(最初の18bp)とを導入した。切断p60プロモーターの配列は以下のとおりである。CAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTAGCCTTTGGAGTATTATCTCATCATTTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAACTTAGTATTATCAATATAAAATTAATTCTCAAATACTTAATTACGTACTGGGATTTTCTGAAAAAAGAGAGGAGTTTTCC(配列番号:45)(Kohler et al,J Bacteriol 173:4668−74,1991)。SOE−PCRを使用して、p60およびdal PCR産物はクローニングベクターpCR2.1(Invitrogen、米国カリフォルニア州La Jolla)へと融合およびクローニングされる。
抗生物質抵抗性遺伝子のpGG55からの除去。これに続くpGG55からクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を除去するためおよびp60−dalカセットを導入するためのクローニング戦略は、グラム陽性複製領域(oriRep; Brantl et al,Nucleic Acid Res 18:4783−4790,1990)の間欠的な除去ももたらす。グラム陽性oriRepを再導入するために、配列(GGCGCCACTAACTCAACGCTAGTAG、配列番号:46)の上流にNarI/EheI部位を追加する5’プライマー、および配列(GCTAGCCAGCAAAGAAAAACAAACACG、配列番号:47)の下流にNheI部位を追加した3’−プライマーを使用してpGG55からoriRepをPCR増幅した。PCR産物はクローニングベクターpCR2.1の中へとクローニングされ、配列が検証された。
p60−dal配列をpGG55ベクターの中へと組込むために、p60−dal発現カセットはPacI/NheI二重消化によってpCR−p60dalから切り離された。pGG55内のグラム陽性細菌に対する複製領域は、pCR−oriRepからPCR(プライマー1、5’−GTC GAC GGT CAC CGG CGC CAC TAA CTC AAC GCT AGT AG−3’、配列番号:48);(プライマー2、5’−TTA ATT AAG CTA GCC AGC AAA GAA AAA CAA ACA CG−3’、配列番号:49)によって増幅され、EheIおよびNheIに対して追加的な制限部位を導入する。PCR産物はpCR2.1−TOPO(Invitrogen、米国カリフォルニア州Carlsbad)へと連結され、配列は検証された。複製領域はEheI/NheI消化によって切り離され、ベクターpGG55はEheIおよびNheIで二重消化され、両方のCAT遺伝子をプラスミドから同時に除去する。2つのインサート、p60−dalおよびoriRep、ならびにpGG55断片は一緒に連結され、pTV3を産する(図9)。pTV3はprfA(病原性調節因子A)遺伝子も含有する。この遺伝子はpTV3の機能のためには必要ないが、追加的な選択されたマーカーが必要かまたは望ましい状況では使用することができる。
リアルタイムPCRのためのDNAの準備
総リステリアDNAはMasterpure(登録商標)Total DNA kit(Epicentre、米国ウィスコンシン州Madison)を使用して準備された。リステリアは24時間の間37℃にて培養されてから、25mLのルリア−ベルターニ培地(LB)中で250rpmで振盪された。細菌細胞は遠心分離によってペレット化され、5mg/mLのリゾチームで補足されたPBS中で再懸濁されてから、37℃にて20分の間インキュベートされ、その後DNAが分離された。
総リステリアDNAはMasterpure(登録商標)Total DNA kit(Epicentre、米国ウィスコンシン州Madison)を使用して準備された。リステリアは24時間の間37℃にて培養されてから、25mLのルリア−ベルターニ培地(LB)中で250rpmで振盪された。細菌細胞は遠心分離によってペレット化され、5mg/mLのリゾチームで補足されたPBS中で再懸濁されてから、37℃にて20分の間インキュベートされ、その後DNAが分離された。
リアルタイムPCRに対する標準的な標的DNAを得るために、LLO−E7遺伝子はpGG55(5’−ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTAC−3’(配列番号:50)、5’−GCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGTGGTTTCTG AGAACAGATG−3’(配列番号:51))からPCR増幅され、ベクターpETblue1(Novagen、米国カリフォルニア州San Diego)へとクローニングされる。同様に、plcAアンプリコンはpCR2.1へとクローニングされる。大腸菌はpET−LLOE7およびpCR−plcAでそれぞれ形質転換されてから、精製されたプラスミドDNAはリアルタイムPCRで使用するために準備された。
リアルタイムPCR
Taqmanプライマープローブセット(Applied Biosystems、米国カリフォルニア州Foster City)は、プラスミド標的としてE7を用いてABI PrimerExpressソフトウェア(Applied Biosystems)を使用するように設計され、以下のプライマー、5’−GCAAGTGTGACTCTACGCTTCG−3’(配列番号:52);5’−TGCCCATTAACAGGTCTTCCA−3’(配列番号:53);5’−FAM−TGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTAC−TAMRA−3’(配列番号:54)およびワンコピー遺伝子plcA(TGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAG−3’(配列番号:55)、5’−GCAGCGCTCTCTATACCAGGTAC−3’(配列番号:56);5’−TET−TTAATGTCCATGTTA TGTCTCCGTTATAGCTCATCGTA−TAMRA−3’;配列番号:57)を、リステリアゲノム標的化として使用する。
Taqmanプライマープローブセット(Applied Biosystems、米国カリフォルニア州Foster City)は、プラスミド標的としてE7を用いてABI PrimerExpressソフトウェア(Applied Biosystems)を使用するように設計され、以下のプライマー、5’−GCAAGTGTGACTCTACGCTTCG−3’(配列番号:52);5’−TGCCCATTAACAGGTCTTCCA−3’(配列番号:53);5’−FAM−TGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTAC−TAMRA−3’(配列番号:54)およびワンコピー遺伝子plcA(TGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAG−3’(配列番号:55)、5’−GCAGCGCTCTCTATACCAGGTAC−3’(配列番号:56);5’−TET−TTAATGTCCATGTTA TGTCTCCGTTATAGCTCATCGTA−TAMRA−3’;配列番号:57)を、リステリアゲノム標的化として使用する。
0.4mMのプライマーおよび0.05mMのプローブを、製造業者による推奨に従ってPuRE Taq RTG PCRビーズ(Amersham、米国ニュージャージー州Piscataway)と混合した。各々の標的に対して精製したプラスミドDNA、pET−LLOE7、およびpCR−plcA(内部標準)を用いて標準曲線が準備され、既知のサンプルにおいて遺伝子コピー番号を計算するために使用された。E7コピー/plcAコピーの平均比は、標準曲線に基づいて計算され、Lmdd−TV3およびLm−LLOE7に対する結果をLm−E7(ゲノムの中へと組込まれたE7遺伝子のシングルコピーを有するリステリア株)からの結果で割ることによって較正された。すべてのサンプルを各々のqPCRアッセイ中で3回実行し、これは3回繰り返された。サンプル間の変化を、KyPlotソフトウェアを使用するTwo−Way ANOVAによって解析した。p<0.05の場合、結果は統計的に有意であると見なされた。
増殖の測定
細菌を37℃にて、250rpmのシェーキングで、ルリア−ベルターニ(LB)培地+/−100マイクログラム(mg)/mLのD−アラニンおよび/または37mg/mLのクロラムフェニコール中で増殖させた。開始種材料はOD600nmの測定値に基づいて、すべての株に対して同じとなるように調節された。
細菌を37℃にて、250rpmのシェーキングで、ルリア−ベルターニ(LB)培地+/−100マイクログラム(mg)/mLのD−アラニンおよび/または37mg/mLのクロラムフェニコール中で増殖させた。開始種材料はOD600nmの測定値に基づいて、すべての株に対して同じとなるように調節された。
溶血性溶解アッセイ
4×109CFUのリステリアが解凍され、遠心分離(1分間、14000rpm)によってペレット化され、1Mのシスチンを有する100mLのPBS(pH5.5)中で再懸濁された。細菌は、1:2で段階希釈され、分泌されたLLOを活性化するために37℃にて45分間インキュベートされた。線維素を取り除いたヒツジ全血(Cedarlane、Hornby、Ontario、Canada)を5倍量のPBSで2回洗浄し、上清が透明のままになるまで6倍量のPBS−システインで3〜4回洗浄し、洗浄工程の間に3000×gで8分間細胞をペレット化し、次いで10%(v/v)の最終濃度になるようにPBS−システイン中で再懸濁した。100mlの10%洗浄血液細胞を100mlのリステリア懸濁液と混合し、さらに37℃にて45分間インキュベートした。次いで溶解していない血液細胞を遠心分離(10分間、1000×g)によってペレット化した。100mlの上清を新しいプレートの中へと移し、OD530nmが決定され、サンプル希釈に対してプロットされた。
4×109CFUのリステリアが解凍され、遠心分離(1分間、14000rpm)によってペレット化され、1Mのシスチンを有する100mLのPBS(pH5.5)中で再懸濁された。細菌は、1:2で段階希釈され、分泌されたLLOを活性化するために37℃にて45分間インキュベートされた。線維素を取り除いたヒツジ全血(Cedarlane、Hornby、Ontario、Canada)を5倍量のPBSで2回洗浄し、上清が透明のままになるまで6倍量のPBS−システインで3〜4回洗浄し、洗浄工程の間に3000×gで8分間細胞をペレット化し、次いで10%(v/v)の最終濃度になるようにPBS−システイン中で再懸濁した。100mlの10%洗浄血液細胞を100mlのリステリア懸濁液と混合し、さらに37℃にて45分間インキュベートした。次いで溶解していない血液細胞を遠心分離(10分間、1000×g)によってペレット化した。100mlの上清を新しいプレートの中へと移し、OD530nmが決定され、サンプル希釈に対してプロットされた。
Lmdd−Tv3の治療的有効性
105TC−1(ATCC、米国バージニア州Manassas)をC57BL/6マウス(n=8)の皮下に移植し、約7日間増殖させ、その後腫瘍は触知可能になった。TC−1は、HPV E6およびE7で不死化したC57BL/6上皮細胞株であり、また皮下移植すると腫瘍を形成する活性化したrasを用いて形質転換されている。マウスは、腫瘍細胞の移植後7日目および14日目に0.1LD50の適切なリステリア株で免疫化されている。非免疫化対照群(無処置)も含まれた。腫瘍増殖は電子カリパスを用いて測定された。
105TC−1(ATCC、米国バージニア州Manassas)をC57BL/6マウス(n=8)の皮下に移植し、約7日間増殖させ、その後腫瘍は触知可能になった。TC−1は、HPV E6およびE7で不死化したC57BL/6上皮細胞株であり、また皮下移植すると腫瘍を形成する活性化したrasを用いて形質転換されている。マウスは、腫瘍細胞の移植後7日目および14日目に0.1LD50の適切なリステリア株で免疫化されている。非免疫化対照群(無処置)も含まれた。腫瘍増殖は電子カリパスを用いて測定された。
ActA欠失突然変異体の発生
Lmdal dat(Lmdd)株は、病毒性因子、ActAの不可逆的な欠失によって弱毒化された。actAのLmdaldat(Lmdd)バックグラウンド内でのインフレーム欠失は、下流遺伝子発現上のあらゆる極性効果を避けるように構造化された。Lmdal datDactAは、ActAの591アミノ酸の欠失によるN末端における最初の19アミノ酸およびC末端の28アミノ酸残基を含有する。染色体スポットの中への遺伝子の欠失が、actA欠失領域の外部をアニーリングするプライマーを使用して検証された。これらは、図12に示すように、プライマー3(Adv 305−tgggatggccaagaaattc)(配列番号:58)および4(Adv304−ctaccatgtcttccgttgcttg)(配列番号:59)である。PCR解析をLmddおよびLm−ddDActAから分離された染色体DNA上で実施した。Lm−dd染色体のDNA内のプライマー対1、2および3、4の2つの異なるセットで増幅した後のDNA断片のサイズは、3.0Kbおよび3.4Kbとなると予想された。しかしながら、Lm−ddDactAについては、プライマーの対1、2および3、4を使用するPCRの予想されるサイズは、1.2Kbおよび1.6Kbである。したがって、図12のPCR解析はactAの1.8kb領域は株、Lm−ddDactA内では除去されていることを確認する。DNA配列決定を、株、Lm−ddDactA(図13、配列番号:60)内の領域を含有するactAの欠失を確認するためにPCR産物上でも実施した。
Lmdal dat(Lmdd)株は、病毒性因子、ActAの不可逆的な欠失によって弱毒化された。actAのLmdaldat(Lmdd)バックグラウンド内でのインフレーム欠失は、下流遺伝子発現上のあらゆる極性効果を避けるように構造化された。Lmdal datDactAは、ActAの591アミノ酸の欠失によるN末端における最初の19アミノ酸およびC末端の28アミノ酸残基を含有する。染色体スポットの中への遺伝子の欠失が、actA欠失領域の外部をアニーリングするプライマーを使用して検証された。これらは、図12に示すように、プライマー3(Adv 305−tgggatggccaagaaattc)(配列番号:58)および4(Adv304−ctaccatgtcttccgttgcttg)(配列番号:59)である。PCR解析をLmddおよびLm−ddDActAから分離された染色体DNA上で実施した。Lm−dd染色体のDNA内のプライマー対1、2および3、4の2つの異なるセットで増幅した後のDNA断片のサイズは、3.0Kbおよび3.4Kbとなると予想された。しかしながら、Lm−ddDactAについては、プライマーの対1、2および3、4を使用するPCRの予想されるサイズは、1.2Kbおよび1.6Kbである。したがって、図12のPCR解析はactAの1.8kb領域は株、Lm−ddDactA内では除去されていることを確認する。DNA配列決定を、株、Lm−ddDactA(図13、配列番号:60)内の領域を含有するactAの欠失を確認するためにPCR産物上でも実施した。
炎症性サイトカインの生産:
RAW 264.7などのマクロファージは、LmprfA−(pGG55)、Lmdal dat、Lmdal dat actA、Lmdal dat actAΔinlC、およびLmdal datΔinlCなどの異なるリステリアバックボーンに感染し、様々なサイトカインのレベルを定量するために異なるELISAベースのキットを使用して上清を異なる時点で採取した。定量化されたサイトカインとしてはIFN−γ、TNF−α、およびIL−6が挙げられる。
RAW 264.7などのマクロファージは、LmprfA−(pGG55)、Lmdal dat、Lmdal dat actA、Lmdal dat actAΔinlC、およびLmdal datΔinlCなどの異なるリステリアバックボーンに感染し、様々なサイトカインのレベルを定量するために異なるELISAベースのキットを使用して上清を異なる時点で採取した。定量化されたサイトカインとしてはIFN−γ、TNF−α、およびIL−6が挙げられる。
インビボでのサイトカインの生産:
インビボでのサイトカイン生産および好中球の採用を測定するために、異なる108CFUのLmprfA−(pGG55)、Lmdal dat、Lmdal dat actA、Lmdal dat actAΔinlC、およびLmdal dat ΔinlC、リステリア対照、または等価な体積の生理食塩水をC57BL/6マウスに腹腔内に注射した。12時間後、マウスを屠殺し、2mLのPBSで腹膜腔を洗浄した。プレーティングした後増殖培地上で腹膜洗浄を細菌の負荷について調べ、MIP−1a、KC、MCP等々などの炎症誘発性のサイトカインの解析を行った。フローサイトメトリーを使用して、Gr−1、CD11b、およびF4/80などのマーカーを用いて染色した後に好中球およびマクロファージの数を決定し、さらにCellQuestソフトウェアを使用してこれらの集団を定量化した。
インビボでのサイトカイン生産および好中球の採用を測定するために、異なる108CFUのLmprfA−(pGG55)、Lmdal dat、Lmdal dat actA、Lmdal dat actAΔinlC、およびLmdal dat ΔinlC、リステリア対照、または等価な体積の生理食塩水をC57BL/6マウスに腹腔内に注射した。12時間後、マウスを屠殺し、2mLのPBSで腹膜腔を洗浄した。プレーティングした後増殖培地上で腹膜洗浄を細菌の負荷について調べ、MIP−1a、KC、MCP等々などの炎症誘発性のサイトカインの解析を行った。フローサイトメトリーを使用して、Gr−1、CD11b、およびF4/80などのマーカーを用いて染色した後に好中球およびマクロファージの数を決定し、さらにCellQuestソフトウェアを使用してこれらの集団を定量化した。
トランスウェル遊走アッセイ:
inlC欠失株を用いたマクロファージまたは樹状細胞に由来する骨髄の感染に続く好中球の遊走の増加があるかどうかを決定するためにこのアッセイを行った。骨髄に由来するマクロファージまたは樹状細胞は、C57BL/6などのマウスから分離され、これらはinlC欠失突然変異体または対照リステリアに感染した。Corning Costarトランスウェルプレートを使用して、感染した細胞を使用してトランスウェルアッセイを設定した。アッセイは、当初3、5、または8マイクロメートルポアトランスウェルプレートを使用して標準化された。好中球の遊走を試験するためには、プレートの底部に感染したAPCをプレーティングし、チャンバー内のウェルの上部に好中球をプレーティングした。異なる時点で、底部に遊走した好中球の数を決定するために細胞を計数した。
inlC欠失株を用いたマクロファージまたは樹状細胞に由来する骨髄の感染に続く好中球の遊走の増加があるかどうかを決定するためにこのアッセイを行った。骨髄に由来するマクロファージまたは樹状細胞は、C57BL/6などのマウスから分離され、これらはinlC欠失突然変異体または対照リステリアに感染した。Corning Costarトランスウェルプレートを使用して、感染した細胞を使用してトランスウェルアッセイを設定した。アッセイは、当初3、5、または8マイクロメートルポアトランスウェルプレートを使用して標準化された。好中球の遊走を試験するためには、プレートの底部に感染したAPCをプレーティングし、チャンバー内のウェルの上部に好中球をプレーティングした。異なる時点で、底部に遊走した好中球の数を決定するために細胞を計数した。
Lmdal dat actAΔinlC突然変異体の治療的有効性:
概念の証拠として、inlC突然変異体の治療的な有効性を決定するために、ヒトの前立腺特異的な抗原(PSA)を腫瘍抗原として使用した。バックボーンLmdal dat actA inlCは、プラスミド、pAdv142を用いて形質転換され、これはヒトPSAに対する発現カセットを含有し、結果としてLmddAinlC142が得られる。株LmddAinlC142は、融合タンパク質、tLLO−PSAの発現および分泌のために特徴付けられる。さらに、株LmddAinlC142はマウスの中でインビボで2回継代されたが、インビボで2回の継代の後に得られたコロニーを融合タンパク質、tLLO−PSAの発現および分泌について調べた。ワクチンの通常在庫は第2のインビボ継代の後で得られたコロニーから準備されたが、これは治療的な効果および免疫原性の評価のために使用された。
概念の証拠として、inlC突然変異体の治療的な有効性を決定するために、ヒトの前立腺特異的な抗原(PSA)を腫瘍抗原として使用した。バックボーンLmdal dat actA inlCは、プラスミド、pAdv142を用いて形質転換され、これはヒトPSAに対する発現カセットを含有し、結果としてLmddAinlC142が得られる。株LmddAinlC142は、融合タンパク質、tLLO−PSAの発現および分泌のために特徴付けられる。さらに、株LmddAinlC142はマウスの中でインビボで2回継代されたが、インビボで2回の継代の後に得られたコロニーを融合タンパク質、tLLO−PSAの発現および分泌について調べた。ワクチンの通常在庫は第2のインビボ継代の後で得られたコロニーから準備されたが、これは治療的な効果および免疫原性の評価のために使用された。
腫瘍微小環境への影響:
LmddA、LmddAΔactA、LmddAΔPlcA、LmddAΔPlcB、LmddAΔprfA、LmddAinlC142、LmddA142、および他の対照株が腫瘍微小環境内で免疫細胞の浸潤を生じる能力が決定された。この研究では、マウスに1×106TPSA23腫瘍細胞を0日目に接種し、7日目、14日目、および21日目に108CFUのLmddAinlC142、LmddA142、および他の対照株をワクチン接種した。28日目に腫瘍を採取して、Gr−1、CD11b、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、NK1.1、およびCD62Lなどの異なる細胞表面マーカーを用いてさらに染色のために処置した。これらのマーカーを使用して、調べられる異なる細胞集団としては、マクロファージ(CD11b+)、NK細胞(NK1.1+)、好中球(Gr−1+CD11b+)、骨髄由来抑制細胞(MDSC)(Gr−1+CD11b+)、調節性T細胞(CD4+ CD25+ Foxp3+)およびエフェクターT細胞(CD8+ CD3+ CD62Llow)が挙げられる。さらにエフェクターT細胞は、IFN−γ、TNF−a、およびIL−2などのエフェクターサイトカインを生産するそれらの機能的な能力のために特徴付けられる。腫瘍内の調節性T細胞およびMDSCは、T細胞増殖の抑制を生じるそれらの能力を試験された。
結果
<実施例5>
LmddA、LmddAΔactA、LmddAΔPlcA、LmddAΔPlcB、LmddAΔprfA、LmddAinlC142、LmddA142、および他の対照株が腫瘍微小環境内で免疫細胞の浸潤を生じる能力が決定された。この研究では、マウスに1×106TPSA23腫瘍細胞を0日目に接種し、7日目、14日目、および21日目に108CFUのLmddAinlC142、LmddA142、および他の対照株をワクチン接種した。28日目に腫瘍を採取して、Gr−1、CD11b、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、NK1.1、およびCD62Lなどの異なる細胞表面マーカーを用いてさらに染色のために処置した。これらのマーカーを使用して、調べられる異なる細胞集団としては、マクロファージ(CD11b+)、NK細胞(NK1.1+)、好中球(Gr−1+CD11b+)、骨髄由来抑制細胞(MDSC)(Gr−1+CD11b+)、調節性T細胞(CD4+ CD25+ Foxp3+)およびエフェクターT細胞(CD8+ CD3+ CD62Llow)が挙げられる。さらにエフェクターT細胞は、IFN−γ、TNF−a、およびIL−2などのエフェクターサイトカインを生産するそれらの機能的な能力のために特徴付けられる。腫瘍内の調節性T細胞およびMDSCは、T細胞増殖の抑制を生じるそれらの能力を試験された。
結果
<実施例5>
アミノ酸代謝酵素を含有するプラスミドは、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、大腸菌およびLM内に、インビトロおよびインビボの両方で保持される
D−アラニン・ラセマーゼに基づく栄養要求性相補系が、抗生物質耐性遺伝子を使用せずにLM中へのプラスミド保持を媒介するために利用された。大腸菌株MB2159は、D−アラニン・ラセマーゼを合成することができないalr(−)/dadX(−)欠損突然変異体である。同様に、リステリア株Lm dal(−)/dat(−)(Lmdd)は、dal遺伝子およびdat遺伝子の部分的な欠失に起因してD−アラニン・ラセマーゼを合成することができない。大腸菌−リステリアシャトルベクターpAM401に基づくプラスミドpGG55を、pTV3を生成するためのリステリアp60プロモーターの制御下で、両方のCAT遺伝子を除去し、かつこれらをp60−dal発現カセットで置き換えることによって修正した(図9)。いくつかのコロニーからDNAを精製した。
<実施例6>
D−アラニン・ラセマーゼに基づく栄養要求性相補系が、抗生物質耐性遺伝子を使用せずにLM中へのプラスミド保持を媒介するために利用された。大腸菌株MB2159は、D−アラニン・ラセマーゼを合成することができないalr(−)/dadX(−)欠損突然変異体である。同様に、リステリア株Lm dal(−)/dat(−)(Lmdd)は、dal遺伝子およびdat遺伝子の部分的な欠失に起因してD−アラニン・ラセマーゼを合成することができない。大腸菌−リステリアシャトルベクターpAM401に基づくプラスミドpGG55を、pTV3を生成するためのリステリアp60プロモーターの制御下で、両方のCAT遺伝子を除去し、かつこれらをp60−dal発現カセットで置き換えることによって修正した(図9)。いくつかのコロニーからDNAを精製した。
<実施例6>
代謝酵素を含有するプラスミドは細菌の病毒性を増加しない
病毒性はLLO機能に関連しているので、Lmdd−TV3とLm−LLOE7との間の溶血性溶解活性が比較される。このアッセイは赤血球の溶解によってLLO機能を試験したが、これは培養上清、精製したLLO、または細菌細胞を用いて実施することができる。Lmdd−TV3は、Lm−LLOE7より高い溶血性溶解活性を示した。
病毒性はLLO機能に関連しているので、Lmdd−TV3とLm−LLOE7との間の溶血性溶解活性が比較される。このアッセイは赤血球の溶解によってLLO機能を試験したが、これは培養上清、精製したLLO、または細菌細胞を用いて実施することができる。Lmdd−TV3は、Lm−LLOE7より高い溶血性溶解活性を示した。
インビボでの病毒性はLD50値を決定することによっても測定され、これはより直接的で、したがってより正確な病毒性の測定手段である。Lmdd−TV3のLD50(0.75×109)は、Lm−LLOE7のもの(1×109)に大変近く、これは代謝酵素を含有するプラスミドが細菌の病毒性を増加しないことを示す。
<実施例7>
<実施例7>
代謝酵素を含有するプラスミドによる抗腫瘍免疫性の誘導
代謝酵素含有プラスミドのガンワクチンとしての有効性は腫瘍退行モデルで決定された。TC−1細胞株モデルが使用され、これはHPVワクチン発生のためにうまく特徴付けられ、かつこれはLmdd−TV3またはLm−LLOE7で免疫化した後の類似サイズの定着した腫瘍退行の制御された比較を可能にする。2つの別個の実験では、Lmdd−TV3およびLm−LLOE7を用いたマウスの免疫化は、結果として類似の腫瘍退行(図14)をもたらし、ワクチン接種した群の間には統計的に有意な差異はない(p<0.05)。すべての免疫化マウスは、63日後でも生きていたが、非免疫化マウスはその腫瘍の直径が20mmに達したときに犠牲にしなければならなかった。回復したマウスは実験終了時まで腫瘍を有しないままであった。
代謝酵素含有プラスミドのガンワクチンとしての有効性は腫瘍退行モデルで決定された。TC−1細胞株モデルが使用され、これはHPVワクチン発生のためにうまく特徴付けられ、かつこれはLmdd−TV3またはLm−LLOE7で免疫化した後の類似サイズの定着した腫瘍退行の制御された比較を可能にする。2つの別個の実験では、Lmdd−TV3およびLm−LLOE7を用いたマウスの免疫化は、結果として類似の腫瘍退行(図14)をもたらし、ワクチン接種した群の間には統計的に有意な差異はない(p<0.05)。すべての免疫化マウスは、63日後でも生きていたが、非免疫化マウスはその腫瘍の直径が20mmに達したときに犠牲にしなければならなかった。回復したマウスは実験終了時まで腫瘍を有しないままであった。
したがって、代謝酵素含有プラスミドは治療的なガンワクチンとして有効である。治療的なガンワクチンに対して要求される免疫応答は、予防的なガンワクチンに対して要求される免疫応答より強いので、これらの結果は予防的なガンワクチンに対する有用性も実証する。
<実施例8>
<実施例8>
inlC欠失突然変異体はケモカインおよびサイトカインの著しく高いレベルを生成する。
inlC欠失突然変異体は、著しく高いレベルのケモカイン(MIP−1a、KC(IL−8のマウスホモログ)、MCPなどの)を生成し、結果として感染部位に対する好中球および白血球の浸潤が得られる。したがって、異なるリステリア株が腹腔内に投与されたとき、inlC突然変異体はこれらのサイトカインおよびケモカインの産生の増加を実証し、これは、注射の12時間後に得られた腹水中の好中球およびマクロファージを引き付ける。さらに、inlC欠失突然変異体は対照株と比較したときに著しく高いレベルの炎症性サイトカインを生成した。
<実施例9>
inlC欠失突然変異体は、著しく高いレベルのケモカイン(MIP−1a、KC(IL−8のマウスホモログ)、MCPなどの)を生成し、結果として感染部位に対する好中球および白血球の浸潤が得られる。したがって、異なるリステリア株が腹腔内に投与されたとき、inlC突然変異体はこれらのサイトカインおよびケモカインの産生の増加を実証し、これは、注射の12時間後に得られた腹水中の好中球およびマクロファージを引き付ける。さらに、inlC欠失突然変異体は対照株と比較したときに著しく高いレベルの炎症性サイトカインを生成した。
<実施例9>
inlC欠失突然変異体は好中球の遊走を誘発する
inlC欠失突然変異体に感染したマクロファージは、他の対照株と比較したとき、異なる時点で好中球の遊走の著しい増加を示す。この実験の結果は、感染の間にこの株の好中球などの免疫細胞を引き付ける能力を強く支持する。
<実施例10>
inlC欠失突然変異体に感染したマクロファージは、他の対照株と比較したとき、異なる時点で好中球の遊走の著しい増加を示す。この実験の結果は、感染の間にこの株の好中球などの免疫細胞を引き付ける能力を強く支持する。
<実施例10>
inlC欠失突然変異体は治療的な抗腫瘍応答に影響を与える
LmddA142とLmddAinlC142との両方を使用した抗腫瘍研究の結果は、相互に大変同等であり、また腫瘍の治療的な退行が観察された。さらに、それの先天的な応答および炎症誘発性のサイトカインの分泌の増加を生成する能力のレベルが高いので、LmddAinlC142の2回の投与量は株LmddA142の3回の投与と同等である。
LmddA142とLmddAinlC142との両方を使用した抗腫瘍研究の結果は、相互に大変同等であり、また腫瘍の治療的な退行が観察された。さらに、それの先天的な応答および炎症誘発性のサイトカインの分泌の増加を生成する能力のレベルが高いので、LmddAinlC142の2回の投与量は株LmddA142の3回の投与と同等である。
材料および方法(実施例11〜16)
オリゴヌクレオチドはInvitrogen(米国カリフォルニア州Carlsbad)によって合成され、またDNA配列決定はGenewiz Inc(米国ニュージャージー州South Plainfield)によって行われた。フローサイトメトリー試薬はBecton Dickinson Biosciences(BD、米国カリフォルニア州San Diego)から購入した。細胞培養培地、補助剤および他のすべての試薬は、示されない限りSigma(米国ミズーリ州St. Louise)から入手した。Her2/neu HLA−A2ペプチドはEZbiolabs(米国インディアナ州Westfield)によって合成された。完全なRPMI 1640(C−RPMI)培地は、2mMグルタミン、0.1mM非必須アミノ酸、および1mMのピルビン酸ナトリウム、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、Hepes(25mM)を含有した。多クローン性の抗LLO抗体が前述されており、抗Her2/neu抗体はSigmaから購入した。
オリゴヌクレオチドはInvitrogen(米国カリフォルニア州Carlsbad)によって合成され、またDNA配列決定はGenewiz Inc(米国ニュージャージー州South Plainfield)によって行われた。フローサイトメトリー試薬はBecton Dickinson Biosciences(BD、米国カリフォルニア州San Diego)から購入した。細胞培養培地、補助剤および他のすべての試薬は、示されない限りSigma(米国ミズーリ州St. Louise)から入手した。Her2/neu HLA−A2ペプチドはEZbiolabs(米国インディアナ州Westfield)によって合成された。完全なRPMI 1640(C−RPMI)培地は、2mMグルタミン、0.1mM非必須アミノ酸、および1mMのピルビン酸ナトリウム、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、Hepes(25mM)を含有した。多クローン性の抗LLO抗体が前述されており、抗Her2/neu抗体はSigmaから購入した。
マウスおよび細胞株
すべての動物実験は、University of PennsylvaniaまたはRutgers UniversityにおいてIACUCによって認可されたプロトコルに従って実施した。FVB/NマウスはJackson laboratories(米国メーン州Bar Harbor)から購入した。ラットHer2/neu腫瘍性タンパク質を過剰発現するFVB/N Her2/neuトランスジェニックマウスは、University of Pennsylvaniaの実験動物コア施設で収容および飼育された。NT−2腫瘍細胞株は高いレベルのラットHer2/neuタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述したように増殖した。DHFR−G8(3T3/neu)細胞はATCCから得られ、ATCCの推奨に従って増殖した。EMT6−Luc細胞株は、John Ohlfest博士(University of Minnesota、米国ミネソタ州)からの寛大な供与物であり、また完全なC−RPMI培地中で増殖した。生物発光の作業は、University of Pennsylvania(米国ペンシルバニア州Philadelphia)のSmall Animal Imaging Facility(SAIF)によるガイダンスに従って実行された。
すべての動物実験は、University of PennsylvaniaまたはRutgers UniversityにおいてIACUCによって認可されたプロトコルに従って実施した。FVB/NマウスはJackson laboratories(米国メーン州Bar Harbor)から購入した。ラットHer2/neu腫瘍性タンパク質を過剰発現するFVB/N Her2/neuトランスジェニックマウスは、University of Pennsylvaniaの実験動物コア施設で収容および飼育された。NT−2腫瘍細胞株は高いレベルのラットHer2/neuタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述したように増殖した。DHFR−G8(3T3/neu)細胞はATCCから得られ、ATCCの推奨に従って増殖した。EMT6−Luc細胞株は、John Ohlfest博士(University of Minnesota、米国ミネソタ州)からの寛大な供与物であり、また完全なC−RPMI培地中で増殖した。生物発光の作業は、University of Pennsylvania(米国ペンシルバニア州Philadelphia)のSmall Animal Imaging Facility(SAIF)によるガイダンスに従って実行された。
リステリア構築体および抗原発現
Her2/neu−pGEM7Zは、親切にもUniversity of PennsylvaniaのMark Greene博士によって供与され、これはpGEM7Zプラスミド(Promega、米国ウィスコンシン州Madison)へとクローニングされた全長のヒトHer2/neu(hHer2)遺伝子を含んでいた。このプラスミドは、PCRによってpfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)および表2に示されるオリゴを使用して、hHer−2/neuの3つの区分、すなわちEC1、EC2、およびIC1を増幅するためのテンプレートとして使用された。
(表2:ヒトHer−2−キメラのクローニングのためのプライマー)
Her2/neu−pGEM7Zは、親切にもUniversity of PennsylvaniaのMark Greene博士によって供与され、これはpGEM7Zプラスミド(Promega、米国ウィスコンシン州Madison)へとクローニングされた全長のヒトHer2/neu(hHer2)遺伝子を含んでいた。このプラスミドは、PCRによってpfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)および表2に示されるオリゴを使用して、hHer−2/neuの3つの区分、すなわちEC1、EC2、およびIC1を増幅するためのテンプレートとして使用された。
(表2:ヒトHer−2−キメラのクローニングのためのプライマー)
Her−2/neuキメラ構築体はSOEing PCR法およびテンプレートとしての各々の別個のhHer−2/neu区分による直接融合によって生成された。プライマーを表3に示す。
(表3:異なる区分のヒトHer2領域の増幅のためのプライマーの配列)
(表3:異なる区分のヒトHer2領域の増幅のためのプライマーの配列)
異なる区分のヒトHer2領域の増幅のためのプライマーの配列。
ChHer2遺伝子は、XhoIおよびSpeI制限酵素を使用してpAdv138から切り離され、Lmddシャトルベクター、pAdv134で、LLOの切断非溶血性断片を用いてインフレームでクローニングされた。インサート、LLO、およびhlyプロモーターの配列はDNA配列決定解析によって確認された。このプラスミドは電子コンピテントActA、dal、dat突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、LmddAへと電気穿孔され、ストレプトマイシン(250mg/mL)を含有するブレインハートインフージョン(BHI)寒天培養基プレート上で陽性クローンが選択された。いくつかの実験では、hHer2/neu(Lm−hHer2)断片を発現する類似のリステリア株が比較の目的で使用された。これらは前述した。すべての研究で、無関連リステリア構築体(Lm対照)が、免疫系でリステリアのの抗原と無関係な効果を説明するために含まれる。Lm対照は、ADXS31−164と同一のリステリアプラットフォームに基づくが、HPV16−E7またはNY−ESO−1などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現および分泌が試験された。各々の構築体はインビボで2回継代された。
細胞毒性アッセイ
3〜5匹のFVB/Nマウスの群が、1×108コロニー形成単位(CFU)のLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164、Lm−hHer2 ICI、またはLm対照(無関連抗原を発現する)を用いて一週間間隔で3回免疫化されるか、または無処置のままとされた。NT−2細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り出し、マイトマイシンC(血清を含まないC−RPMI媒体中250mg/mL)で37℃にて45分間処置した。5回洗浄した後、これらを免疫化した動物または無処置の動物から採取した脾細胞を用いて1:5の比(刺激薬:レスポンダー)で 5日間、37℃にて、5%CO2で共インキュベートした。標的として3T3/neu(DHFR−G8)細胞のラベルが付いているユーロピウムを使用して、前述した方法により、標準的な細胞毒性アッセイを実施した。4時間のインキュベーションの後、分光光度計(Perkin Elmer、Victor2)を590nmにて使用して、死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。特異的な溶解のパーセントが(実験群での溶解−自然発生的溶解)/(最大溶解−自然発生的溶解)として定義された。
3〜5匹のFVB/Nマウスの群が、1×108コロニー形成単位(CFU)のLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164、Lm−hHer2 ICI、またはLm対照(無関連抗原を発現する)を用いて一週間間隔で3回免疫化されるか、または無処置のままとされた。NT−2細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り出し、マイトマイシンC(血清を含まないC−RPMI媒体中250mg/mL)で37℃にて45分間処置した。5回洗浄した後、これらを免疫化した動物または無処置の動物から採取した脾細胞を用いて1:5の比(刺激薬:レスポンダー)で 5日間、37℃にて、5%CO2で共インキュベートした。標的として3T3/neu(DHFR−G8)細胞のラベルが付いているユーロピウムを使用して、前述した方法により、標準的な細胞毒性アッセイを実施した。4時間のインキュベーションの後、分光光度計(Perkin Elmer、Victor2)を590nmにて使用して、死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。特異的な溶解のパーセントが(実験群での溶解−自然発生的溶解)/(最大溶解−自然発生的溶解)として定義された。
免疫化マウスからの脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
3〜5匹のFVB/NまたはHLA−A2トランスジェニックマウスの群が、1×108CFUのADXS31−164、陰性リステリア対照(無関連抗原を発現する)を用いて一週間間隔で3回免疫化されるか、または無処置のままとされた。最後の免疫化の一週間後、FVB/Nマウスからの脾細胞が分離され、5×106細胞/ウェルにて24ウェルプレートでマイトマイシンCで処置したNT−2細胞の存在下でC−RPMI培地中で共培養された。HLA−A2トランスジェニックマウスからの脾細胞は、1mMのHLA−A2特異的なペプチドまたは1mg/mLの組み換え型Hisタグ付きChHer2タンパク質(大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された)の存在下でインキュベートされた。上清からのサンプルが24時間または72時間後に得られ、インターフェロン−γ(IFN−γ)の存在について、製造業者の推奨に従ってマウスIFN−γ酵素にリンクした免疫吸着剤アッセイ(ELISA)キットを使用して試験した。
3〜5匹のFVB/NまたはHLA−A2トランスジェニックマウスの群が、1×108CFUのADXS31−164、陰性リステリア対照(無関連抗原を発現する)を用いて一週間間隔で3回免疫化されるか、または無処置のままとされた。最後の免疫化の一週間後、FVB/Nマウスからの脾細胞が分離され、5×106細胞/ウェルにて24ウェルプレートでマイトマイシンCで処置したNT−2細胞の存在下でC−RPMI培地中で共培養された。HLA−A2トランスジェニックマウスからの脾細胞は、1mMのHLA−A2特異的なペプチドまたは1mg/mLの組み換え型Hisタグ付きChHer2タンパク質(大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された)の存在下でインキュベートされた。上清からのサンプルが24時間または72時間後に得られ、インターフェロン−γ(IFN−γ)の存在について、製造業者の推奨に従ってマウスIFN−γ酵素にリンクした免疫吸着剤アッセイ(ELISA)キットを使用して試験した。
Her2トランスジェニック動物での腫瘍研究
生後6週間のFVB/NラットHer2/neuトランスジェニックマウス(9〜14/群)に5×108CFUのLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164、またはLm対照を6回免疫化した。これらを、自然発生的な乳腺腫瘍の出現について週に2回観察し、これらは最高52週間まで電子カリパスを使用して測定された。平均直径が1cm2のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を切り離し、RNAlater内で−20℃にて保存した。これらの腫瘍のエスケープ上のHer2/neuタンパク質内の突然変異の効果を決定するために、ゲノムDNA分離キットを使用してゲノムDNAを抽出し、配列決定した。
生後6週間のFVB/NラットHer2/neuトランスジェニックマウス(9〜14/群)に5×108CFUのLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164、またはLm対照を6回免疫化した。これらを、自然発生的な乳腺腫瘍の出現について週に2回観察し、これらは最高52週間まで電子カリパスを使用して測定された。平均直径が1cm2のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を切り離し、RNAlater内で−20℃にて保存した。これらの腫瘍のエスケープ上のHer2/neuタンパク質内の突然変異の効果を決定するために、ゲノムDNA分離キットを使用してゲノムDNAを抽出し、配列決定した。
脾臓および腫瘍内の調節性T細胞へのADXS31−164の効果
マウスに1×106NT−2細胞を皮下(s.c.)で移植した。7日目、14日目、および21日目に、これらに1×108CFUのADXS31−164、LmddA対照で免疫化、または無処置のままにした。28日目に腫瘍および脾臓を抽出し、FACS解析によってCD3+/CD4+/FoxP3+Tregの存在について試験した。簡潔に述べると、C−RPMI培地中で2枚のガラススライドの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を分離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、PBS中にDNase(12U/mL)およびコラゲナーゼ(2mg/mL)を含有するバッファーを用いて消化した。室温にて撹拌しながら60分間インキュベーションした後で、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をRBC溶解バッファーによって溶解し、続いて10%FBSを含有する完全なRPMI−1640培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通した濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をFACSバッファー(2%FBS/PBS)中で再懸濁し、抗CD3−PerCP−Cy5.5、CD4−FITC、CD25−APC抗体を用いて染色し、続いて抗Foxp3−PEを用いて透過処理および染色した。4色FACSキャリバー(BD)を使用してフローサイトメトリー解析を実施し、cell questソフトウェア(BD)を使用してデータを解析した。
マウスに1×106NT−2細胞を皮下(s.c.)で移植した。7日目、14日目、および21日目に、これらに1×108CFUのADXS31−164、LmddA対照で免疫化、または無処置のままにした。28日目に腫瘍および脾臓を抽出し、FACS解析によってCD3+/CD4+/FoxP3+Tregの存在について試験した。簡潔に述べると、C−RPMI培地中で2枚のガラススライドの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を分離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、PBS中にDNase(12U/mL)およびコラゲナーゼ(2mg/mL)を含有するバッファーを用いて消化した。室温にて撹拌しながら60分間インキュベーションした後で、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をRBC溶解バッファーによって溶解し、続いて10%FBSを含有する完全なRPMI−1640培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通した濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をFACSバッファー(2%FBS/PBS)中で再懸濁し、抗CD3−PerCP−Cy5.5、CD4−FITC、CD25−APC抗体を用いて染色し、続いて抗Foxp3−PEを用いて透過処理および染色した。4色FACSキャリバー(BD)を使用してフローサイトメトリー解析を実施し、cell questソフトウェア(BD)を使用してデータを解析した。
統計的解析
生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用し、CTLおよびELISAアッセイに対してスチューデントのt検定を使用し、これらを3回行った。これらの解析では、0.05未満(*印をつけた)のp値は統計的に有意であると考えられる。Prismソフトウェア、V.4.0a(2006)またはSPSSソフトウェア、V.15.0(2006)のいずれかを用いてすべての統計的な解析が行われた。別段の記載がない限り、すべてのFVB/NラットHer2/neuトランスジェニック研究のために、群あたり8〜14匹のマウスを使用し、すべての野生型FVB/N研究のために、群あたり少なくとも8匹のマウスを使用した。Her2/neuトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍研究を除いて、すべての研究を少なくとも1回は繰り返した。
結果
<実施例11>
生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用し、CTLおよびELISAアッセイに対してスチューデントのt検定を使用し、これらを3回行った。これらの解析では、0.05未満(*印をつけた)のp値は統計的に有意であると考えられる。Prismソフトウェア、V.4.0a(2006)またはSPSSソフトウェア、V.15.0(2006)のいずれかを用いてすべての統計的な解析が行われた。別段の記載がない限り、すべてのFVB/NラットHer2/neuトランスジェニック研究のために、群あたり8〜14匹のマウスを使用し、すべての野生型FVB/N研究のために、群あたり少なくとも8匹のマウスを使用した。Her2/neuトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍研究を除いて、すべての研究を少なくとも1回は繰り返した。
結果
<実施例11>
Her−2断片に融合されたLLO断片を分泌するL.モノサイトゲネス株の発生:ADXS31−164の構築。
キメラHer2/neu遺伝子(ChHer2)の構築については前述した。簡潔に述べると、ChHer2遺伝子は、SOEing PCR法によって、Her2/neuタンパク質の2つの細胞外断片(aa40〜170およびaa359〜433)と1つの細胞内断片(aa678〜808)との直接融合によって生成された。キメラのタンパク質は、タンパク質の既知のヒトMHCクラスIエピトープのほとんどを有する。ChHer2遺伝子は、プラスミド、pAdv138(これは構築体Lm−LLO−ChHer2に使用される)から切り離され、LmddAシャトルプラスミドへとクローニングされ、結果としてプラスミドpAdv164が得られる(図15A)。これらの2つのプラスミドバックボーンの間には2つの大きい違いがある。1)組み換え型細菌のインビトロでの選択のためにpAdv138はクロラムフェニコール耐性マーカー(cat)を使用しているが、pAdv164はバシラスサチリスからのD−アラニン・ラセマーゼ遺伝子(dal)を寄生し、これはdal−dat遺伝子を欠いているLmddA株内でインビトロでの選択のためおよびインビボでのプラスミド保持のために代謝相補経路を使用する。このワクチンプラットフォームは、FDAによる改変リステリアワクチン株の抗生物質抵抗性についての憂慮に対処するために設計および開発された。2)pAdv138とは異なり、これはインビボでのLmdd株の相補に必要ないので、プラスミド(以下の配列および図15Aを参照)中でpAdv164はprfA遺伝子のコピーを有しない。LmddAワクチン株も、actA遺伝子(リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する)を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるLmddに由来するものより病毒性が100倍少ない。LmddAベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのLmddベースのワクチンよりもずっと速く(48時間未満の間に)除去される。この株からの融合タンパク質tLLO−ChHer2の発現および分泌は、インビトロで8時間増殖したTCA沈殿した細胞培養上清の中のLm−LLO−ChHer2のもの(図15B)と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用して〜104KDの帯域として抗LLO抗体によって検出される。負の対照としてtLLOのみを発現するリステリアバックボーン株が使用される。
キメラHer2/neu遺伝子(ChHer2)の構築については前述した。簡潔に述べると、ChHer2遺伝子は、SOEing PCR法によって、Her2/neuタンパク質の2つの細胞外断片(aa40〜170およびaa359〜433)と1つの細胞内断片(aa678〜808)との直接融合によって生成された。キメラのタンパク質は、タンパク質の既知のヒトMHCクラスIエピトープのほとんどを有する。ChHer2遺伝子は、プラスミド、pAdv138(これは構築体Lm−LLO−ChHer2に使用される)から切り離され、LmddAシャトルプラスミドへとクローニングされ、結果としてプラスミドpAdv164が得られる(図15A)。これらの2つのプラスミドバックボーンの間には2つの大きい違いがある。1)組み換え型細菌のインビトロでの選択のためにpAdv138はクロラムフェニコール耐性マーカー(cat)を使用しているが、pAdv164はバシラスサチリスからのD−アラニン・ラセマーゼ遺伝子(dal)を寄生し、これはdal−dat遺伝子を欠いているLmddA株内でインビトロでの選択のためおよびインビボでのプラスミド保持のために代謝相補経路を使用する。このワクチンプラットフォームは、FDAによる改変リステリアワクチン株の抗生物質抵抗性についての憂慮に対処するために設計および開発された。2)pAdv138とは異なり、これはインビボでのLmdd株の相補に必要ないので、プラスミド(以下の配列および図15Aを参照)中でpAdv164はprfA遺伝子のコピーを有しない。LmddAワクチン株も、actA遺伝子(リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する)を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるLmddに由来するものより病毒性が100倍少ない。LmddAベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのLmddベースのワクチンよりもずっと速く(48時間未満の間に)除去される。この株からの融合タンパク質tLLO−ChHer2の発現および分泌は、インビトロで8時間増殖したTCA沈殿した細胞培養上清の中のLm−LLO−ChHer2のもの(図15B)と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用して〜104KDの帯域として抗LLO抗体によって検出される。負の対照としてtLLOのみを発現するリステリアバックボーン株が使用される。
pAdv164配列(7075塩基対)(図15参照):
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<実施例12>
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<実施例12>
ADXS31−164は、LM−LLO−ChHER2と同じく免疫原性である。
抗Her2/neu特異的な細胞毒性T細胞を発生するうえでのADXS31−164の免疫原性の特性が、標準的なCTLアッセイでLm−LLO−ChHer2ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、3T3/neu標的細胞によって発現されるHer2/neu抗原に対して強いが同等の細胞毒性T細胞応答を引き出す。したがって、LLOに対してHer2に融合された細胞内断片のみを発現するリステリアを用いて免疫化されたマウスは、より多くのMHCクラスIエピトープを含有するキメラより低い溶解活性を示す。無処置の動物、または無関連リステリアワクチンを注射したマウス(図16A)ではCTL活性は検出されなかった。ADXS31−164は、野生型FVB/Nマウスからの脾細胞によってIFN−γの分泌を刺激することもできる(図16B)。これはマイトマイシンCで処置されたNT−2細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清の中で検出され、これらは高いレベルのHer2/neu抗原(図19C)を発現する。
抗Her2/neu特異的な細胞毒性T細胞を発生するうえでのADXS31−164の免疫原性の特性が、標準的なCTLアッセイでLm−LLO−ChHer2ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、3T3/neu標的細胞によって発現されるHer2/neu抗原に対して強いが同等の細胞毒性T細胞応答を引き出す。したがって、LLOに対してHer2に融合された細胞内断片のみを発現するリステリアを用いて免疫化されたマウスは、より多くのMHCクラスIエピトープを含有するキメラより低い溶解活性を示す。無処置の動物、または無関連リステリアワクチンを注射したマウス(図16A)ではCTL活性は検出されなかった。ADXS31−164は、野生型FVB/Nマウスからの脾細胞によってIFN−γの分泌を刺激することもできる(図16B)。これはマイトマイシンCで処置されたNT−2細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清の中で検出され、これらは高いレベルのHer2/neu抗原(図19C)を発現する。
ヒトMHCクラスIエピトープのADXS31−164を用いた免疫化後の適切な処置および提示は、HLA−A2マウスで試験された。免疫化したHLA−A2トランスジェニックからの脾細胞は、マッピングしたHLA−A2で制限されたエピトープに対応するペプチドと72時間の間共インキュベートされ、このペプチドはHer2/neu分子の細胞外(HLYQGCQVV配列番号:74もしくはKIFGSLAFL配列番号:75)ドメイン、または細胞内(RLLQETELV配列番号:76)ドメインに位置する(図16C)。組み換え型ChHer2タンパク質は、正の対照、および無関連ペプチド、または負の対照としてペプチドなしで使用された。この実験からのデータは、ADXS31−164が抗Her2/neu特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープへと引き出すことができることを示す。
<実施例13>
<実施例13>
ADXS31−164は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、LM−LLO−ChHER2より有効である。
ADXS31−164の抗腫瘍効果が、Lm−LLO−ChHer2とHer2/neuトランスジェニック動物において比較され、この動物は生後20〜25週間で繁殖の遅い自然発生的な乳腺腫瘍を発生した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、21〜25週の間に乳房の腫瘍を発生し、33週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−Her2/neu組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。45週には、50%を超えるADXS31−164をワクチン接種したマウス(9匹のうち5匹)は、まだ腫瘍がなく、これはLm−LLO−ChHer2を用いて免疫化したマウスの25%と比較される。52週には、ADXS31−164を用いて免疫化した8匹のうち2匹のマウスは、まだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験的な群からのマウスはすべて、すでにこれらの疾患に屈服していた(図17)。これらの結果は、ADXS31−164はより弱毒化しているにもかかわらず、Her2/neuトランスジェニック動物の自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止ではLm−LLO−ChHer2より有効であることを示す。
<実施例14>
ADXS31−164の抗腫瘍効果が、Lm−LLO−ChHer2とHer2/neuトランスジェニック動物において比較され、この動物は生後20〜25週間で繁殖の遅い自然発生的な乳腺腫瘍を発生した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、21〜25週の間に乳房の腫瘍を発生し、33週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−Her2/neu組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。45週には、50%を超えるADXS31−164をワクチン接種したマウス(9匹のうち5匹)は、まだ腫瘍がなく、これはLm−LLO−ChHer2を用いて免疫化したマウスの25%と比較される。52週には、ADXS31−164を用いて免疫化した8匹のうち2匹のマウスは、まだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験的な群からのマウスはすべて、すでにこれらの疾患に屈服していた(図17)。これらの結果は、ADXS31−164はより弱毒化しているにもかかわらず、Her2/neuトランスジェニック動物の自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止ではLm−LLO−ChHer2より有効であることを示す。
<実施例14>
ADXS31−164を用いた免疫化の際のHER2/NEU遺伝子での突然変異。
Her2/neuのMHCクラスIエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ(ハーセプチン)(Her2/neuの細胞外ドメインでエピトープを標的化するモノクローナル抗体)を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のneu遺伝子の対応する断片を配列決定した。いかなるワクチン接種した腫瘍サンプルのHer−2/neu遺伝子の中にも突然変異が観察されなかったことは、代替的なエスケープ機構を示唆するの(データ示さず)。
<実施例15>
Her2/neuのMHCクラスIエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ(ハーセプチン)(Her2/neuの細胞外ドメインでエピトープを標的化するモノクローナル抗体)を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のneu遺伝子の対応する断片を配列決定した。いかなるワクチン接種した腫瘍サンプルのHer−2/neu遺伝子の中にも突然変異が観察されなかったことは、代替的なエスケープ機構を示唆するの(データ示さず)。
<実施例15>
ADXS31−164は、腫瘍内の調節性T細胞の著しい減少を生じる。
脾臓および腫瘍内での調節性T細胞の頻度に対するADXS31−164の効果を解明するために、マウスにNT−2腫瘍細胞を移植した。3回の免疫化の後脾細胞および腫瘍内のリンパ球が分離され、Tregのために染色した。これらは、CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+細胞と定義されたが、別個に解析したとき、FoxP3マーカーまたはCD25マーカーのいずれかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、無関連リステリアワクチンまたは無処置の動物と比較して、ADXS31−164を用いた免疫化は、脾臓内のTregの頻度については効果を有しないことを示した(図18参照)。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のTregの存在は少なからぬ影響を生じた(図19A)。処置されていない腫瘍ではすべてのCD3+ T細胞の平均で19.0%がTregであったが、この頻度は無関連ワクチンについては4.2%に減少し、ADXS31−164ついては3.4%と腫瘍内のTregの頻度が5分の1に減少した(図19B)。いずれかのLmddAワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のTregの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ADXS31−164を用いて免疫化したマウスからの腫瘍(平均直径(mm)±SD:6.71±0.43、n=5)は、処置されていないマウス(8.69±0.98、n=5、p<0.01)、または無関連ワクチン(8.41±1.47、n=5、p=0.04)で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら2つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった(p=0.73)。LmddAワクチンで処置した腫瘍内のTregのより低い頻度は、腫瘍内のCD8/Treg比の増加をもたらし、LmddAワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原HER2/neu(ADXS31−164)を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Tregの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
<実施例16>
脾臓および腫瘍内での調節性T細胞の頻度に対するADXS31−164の効果を解明するために、マウスにNT−2腫瘍細胞を移植した。3回の免疫化の後脾細胞および腫瘍内のリンパ球が分離され、Tregのために染色した。これらは、CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+細胞と定義されたが、別個に解析したとき、FoxP3マーカーまたはCD25マーカーのいずれかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、無関連リステリアワクチンまたは無処置の動物と比較して、ADXS31−164を用いた免疫化は、脾臓内のTregの頻度については効果を有しないことを示した(図18参照)。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のTregの存在は少なからぬ影響を生じた(図19A)。処置されていない腫瘍ではすべてのCD3+ T細胞の平均で19.0%がTregであったが、この頻度は無関連ワクチンについては4.2%に減少し、ADXS31−164ついては3.4%と腫瘍内のTregの頻度が5分の1に減少した(図19B)。いずれかのLmddAワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のTregの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ADXS31−164を用いて免疫化したマウスからの腫瘍(平均直径(mm)±SD:6.71±0.43、n=5)は、処置されていないマウス(8.69±0.98、n=5、p<0.01)、または無関連ワクチン(8.41±1.47、n=5、p=0.04)で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら2つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった(p=0.73)。LmddAワクチンで処置した腫瘍内のTregのより低い頻度は、腫瘍内のCD8/Treg比の増加をもたらし、LmddAワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原HER2/neu(ADXS31−164)を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Tregの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
<実施例16>
2つの異種抗原を同時に送達するデュアルプラスミドの構築
ActAプロモーター領域およびactAのN−末端の1〜233アミノ酸に対応するDNAは、リステリアゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって、以下のプライマーActA−F−5’−atcccgggtgaagcttgggaagcagttggg−3’(XmaI)(配列番号:77)およびActA−R−attctagatttatcacgtacccatttccccgc(XbaI)(配列番号:78)を使用して増幅される。クローニングのために使用される制限部位は下線付きである。XmaI/XbaI区分は、プラスミドpNEB193内でクローニングされ、pNEB193−ActAを作り出す。キメラHer2であるさらなる抗原2は、プライマーCh−Her2−F−5’−attctagaacccacctggacatgctccgccac−3’(XbaI)(配列番号:79)およびCh−Her2−R−5’−gtcgacactagtctagtggtgatggtgatgatggagctcagatctgtctaagaggcagccatagggc−3’(RE部位−SalI−SpeI−SacI−BglII)(配列番号:80)を使用してPCR増幅される。Ch−Her2のXbaIおよびSalI断片はプラスミドpNEB193−ActA中でクローニングされ、pNEB193−ActA−Ch−Her2プラスミドを作り出す。HisタグDNA配列は、SacI制限部位とSpeI制限部位との間Ch−Her2リバースプライマー配列中に含まれる。プラスミドpNEB193−ActA−Ch−Her2から、tActA−Ch−Her2−Hisに対応するXmaI/SpeI断片は、XmaI/SpeIで制限されたpAdv134内でクローニングしてデュアルプラスミドを作り出すために切り離される。
ActAプロモーター領域およびactAのN−末端の1〜233アミノ酸に対応するDNAは、リステリアゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって、以下のプライマーActA−F−5’−atcccgggtgaagcttgggaagcagttggg−3’(XmaI)(配列番号:77)およびActA−R−attctagatttatcacgtacccatttccccgc(XbaI)(配列番号:78)を使用して増幅される。クローニングのために使用される制限部位は下線付きである。XmaI/XbaI区分は、プラスミドpNEB193内でクローニングされ、pNEB193−ActAを作り出す。キメラHer2であるさらなる抗原2は、プライマーCh−Her2−F−5’−attctagaacccacctggacatgctccgccac−3’(XbaI)(配列番号:79)およびCh−Her2−R−5’−gtcgacactagtctagtggtgatggtgatgatggagctcagatctgtctaagaggcagccatagggc−3’(RE部位−SalI−SpeI−SacI−BglII)(配列番号:80)を使用してPCR増幅される。Ch−Her2のXbaIおよびSalI断片はプラスミドpNEB193−ActA中でクローニングされ、pNEB193−ActA−Ch−Her2プラスミドを作り出す。HisタグDNA配列は、SacI制限部位とSpeI制限部位との間Ch−Her2リバースプライマー配列中に含まれる。プラスミドpNEB193−ActA−Ch−Her2から、tActA−Ch−Her2−Hisに対応するXmaI/SpeI断片は、XmaI/SpeIで制限されたpAdv134内でクローニングしてデュアルプラスミドを作り出すために切り離される。
次いで2つの組み換え型抗原を融合タンパク質と同時に送達するリステリアベースのプラスミドを生成した。このプラスミドによって発現される2つの融合タンパク質は、tLLO−抗原1とtActA−抗原2とを含む。抗原1の発現および分泌はhlyプロモーターおよびLLOシグナル配列の制御下であり、またこれはリステリオリシンO(切断LLOまたはtLLO)の非溶血性断片への融合として発現される。抗原2の発現および分泌はactAプロモーターおよびActAシグナル配列の制御下であり、またこれはActA(切断ActAまたはtActA)の1〜233アミノ酸への融合として発現される。抗生剤マーカーを含まないプラスミドpAdv134の構築は前述されており、これはtLLO−抗原1融合タンパク質の発現のための遺伝子カセットを含有する。pAdv134内のtLLO−抗原1の下流を提示するSpeIおよびXmaI制限部位は、actAプロモーター−tActA−抗原2DNA区分のクローニングのために使用される(図20)。制限部位XbaI、SacI、およびBglIIは、XbaI/SacI、またはXbaI/BglIIにおける抗原2インサートのクローニングを容易にするためにカセット内に追加される。HisタグのためのDNA配列コーディングがtActA−抗原2−his融合タンパク質の検出を容易にするためにSacI部位の後に追加された。デュアルプラスミドは2つの異なる抗原を融合タンパク質として同時に発現および分泌することができる。
材料および方法(実施例17〜21)
MDSCおよびTreg機能
腫瘍がマウスに、腫瘍モデルに依存して脇腹または生理学的部位に移植された。次いで7日後に、マウスはワクチン接種され、初期ワクチン接種日は使用する腫瘍モデルに依存する。次いでワクチンが与えられた一週間後に、マウスはブースターワクチンを投与された。
MDSCおよびTreg機能
腫瘍がマウスに、腫瘍モデルに依存して脇腹または生理学的部位に移植された。次いで7日後に、マウスはワクチン接種され、初期ワクチン接種日は使用する腫瘍モデルに依存する。次いでワクチンが与えられた一週間後に、マウスはブースターワクチンを投与された。
次いでブーストの1週間、または浸潤性腫瘍モデルの場合はブーストの3〜4日後にマウスは犠牲にされ、腫瘍および脾臓が採取された。腫瘍を採取する5日前に、レスポンダーT細胞の目的で使用するために、腫瘍を持っていないマウスはワクチン接種された。標準的な方法を使用して脾細胞が準備された。
簡潔に述べると、腫瘍および脾臓の両方の単細胞懸濁液が調製された。脾臓を手作業で潰し、赤血球を溶解した。腫瘍を細かく刻み、コラゲナーゼ/デオキシリボヌクレアーゼを用いてインキュベートした。代替的に、GENTLEMACS(商標)解離器を腫瘍解離キットとともに使用した。
MDSCまたはTregは、Miltenyiキットおよびカラム、またはautoMACsセパレーターを使用して腫瘍および脾臓から精製された。次いで細胞を計数した。
単細胞懸濁液を調製し、赤血球を溶解した。次いでCFSEを用いてレスポンダーT細胞にラベルを付けた。
ウェル当たり1×105のT細胞密度にて、96ウェルプレート内に、レスポンダーT細胞(すべての分裂サイクルうの段階からの)対MDSCまたはTregの比が2:1となるように細胞を一緒にプレーティングした。次いで、適切なペプチド(PSAまたはCA9)を用いて、または非特異的にPMA/イオノマイシンを用いてレスポンダーT細胞を刺激した。37℃にて2日間、5%のCO2を用いて、細胞を遮光下でインキュベートした。2日後、細胞をFACSのために染色し、FACSマシンで解析した。
T細胞応答の解析
ELISAによるサイトカイン解析のために、脾細胞を採取して、ウェル当たり150万細胞にて48ウェルプレートに培地、SEA、またはconA(正の対照として)の存在中にプレーティングした。72時間の間のインキュベーションの後、上清を採取して、ELISA(BD)を用いてサイトカインレベルを解析した。抗原特異的なIFN−γ ELISpotのために、脾細胞を採取して、プレート当たり30万および15万細胞にてIFN−γ ELISpotプレート内に、培地、特異的なCTLペプチド、無関連ペプチド、特異的なヘルパーペプチド、またはconA(正の対照として)の存在中にプレーティングした。20時間のインキュベーション後、ELISpots(BD)を実施し、Immunospot analyzer(C.T.L.)によってスポットを計数した。100万脾細胞当たりのスポットの数をグラフにした。
ELISAによるサイトカイン解析のために、脾細胞を採取して、ウェル当たり150万細胞にて48ウェルプレートに培地、SEA、またはconA(正の対照として)の存在中にプレーティングした。72時間の間のインキュベーションの後、上清を採取して、ELISA(BD)を用いてサイトカインレベルを解析した。抗原特異的なIFN−γ ELISpotのために、脾細胞を採取して、プレート当たり30万および15万細胞にてIFN−γ ELISpotプレート内に、培地、特異的なCTLペプチド、無関連ペプチド、特異的なヘルパーペプチド、またはconA(正の対照として)の存在中にプレーティングした。20時間のインキュベーション後、ELISpots(BD)を実施し、Immunospot analyzer(C.T.L.)によってスポットを計数した。100万脾細胞当たりのスポットの数をグラフにした。
Coulter Counter、 Z1を使用して脾細胞を計数した。gag−CTL、gag−helper、培地、無関連抗原、およびcon A(正の対照)を用いた再刺激後のCD8+ T細胞を生産するIFN−γの頻度が、標準的なIFN−γベースのELISpotアッセイを使用して決定された。
簡潔に述べると、5mg/mLのmAb R46−A2と、最適な希釈で使用される多クローン性のウサギの抗IFN−γ(親切にもPhillip Scott博士、University of Pennsylvania、米国ペンシルバニア州Philadelphiaによって提供された)とを使用してIFN−γを検出した。IFN−γのレベルは、マウスのrIFN−γ(Life Technologies、米国メリーランド州Gaithersburg)を使用した標準曲線との比較によって計算された。プレートはペルオキシダーゼ−共役ヤギ抗ウサギIgG Ab(IFN−γ)を使用して開発された。次いでプレートを405nmで読み取った。アッセイに対する検出の下限値は30pg/mLである。
結果
<実施例17>
結果
<実施例17>
リステリアワクチン処置後の抑制細胞機能
0日目に腫瘍をマウスに移植した。7日目にマウスにLmdda−E7またはLmddA−PSAを用いてワクチン接種した。14日目に腫瘍を採取して、ワクチン接種した群および無処置群に対する浸潤性MDSCおよびTregの数およびパーセンテージを測定した。リステリア処置したマウスの腫瘍で、MDSCとTregとの両方のパーセンテージ、およびMDSCの絶対数の減少が見出されたが、脾臓または排出リンパ節(TLDN)では同じ効果は観察されなかった(図21)。
0日目に腫瘍をマウスに移植した。7日目にマウスにLmdda−E7またはLmddA−PSAを用いてワクチン接種した。14日目に腫瘍を採取して、ワクチン接種した群および無処置群に対する浸潤性MDSCおよびTregの数およびパーセンテージを測定した。リステリア処置したマウスの腫瘍で、MDSCとTregとの両方のパーセンテージ、およびMDSCの絶対数の減少が見出されたが、脾臓または排出リンパ節(TLDN)では同じ効果は観察されなかった(図21)。
腫瘍内でMDSCおよびTreg(両者とも脾臓および腫瘍のMDSCおよびTreg)の存在中でのLm−LLO−E7、Lm−LLO−PSAおよびLm−LLO−CA9、Lm−LLO−Her2(図22〜34)を用いた免疫化の効果を解明するために、上記の実験での腫瘍を持つマウスから分離された脾細胞および抽出された腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を、プールし、CD3およびCD8のために染色した。各々のカラムは特定の細胞分裂段階におけるT細胞集団の%を表し、特定の処置群(無処置、ペプチド−CA9またはPSA処置、MDSC/Tregなし、およびMDSC+PMA/イオノマイシンなし)の下で下位群にグループ分けした(図22〜34参照)。
提示するTregおよびMDSCのパーセンテージについて腫瘍を持つマウスからの血液を解析した。Lmワクチン接種後のマウスの血液ではMDSCとTregとの両方の減少があった。
<実施例18>
<実施例18>
脾臓以外のTPSA23腫瘍からのMDSCは、リステリアワクチン接種後に抑制性が低下する。
非特異的に活性化した無処置マウスの細胞および特異的に活性化した細胞(PSA、CA9、PMA/イオノマイシン)を有するTPSA23腫瘍から分離された単球性および顆粒球性のMDSCを使用して抑制因子アッセイを実行した。結果は、Lmワクチン接種した群からの腫瘍から分離されたMDSCは、無処置マウスの腫瘍からのMDSCと比較して活性化したT細胞の分裂を抑制する能力が減退していることを実証した。(図22および図24のLm−LLO−PSAおよびLm−LLOで処置した群を参照、図中右側のパネルは右側のパネルからのプールした細胞分裂データを表す)。加えて、MDSCが存在せずかつ細胞が刺激されていない/活性化している、未処置マウスからのTレスポンダー細胞は、その親状態(休止状態)のままであるのに対して(図22および図24)、PMAまたはイオノマイシンで刺激されたT細胞は複製しているのが観察された(図22および図24)。さらに、Gr+Ly6G+およびGrdimLy6G−MDSCの両方とも、リステリアワクチンを用いた処置後、抑制がより低くなることが観察された。これは、PSA特異的なT細胞および非特異的な(PMA/イオノマイシンで刺激した)T細胞の両方の分割を抑制するこれらの能力を減少するために適用される。
非特異的に活性化した無処置マウスの細胞および特異的に活性化した細胞(PSA、CA9、PMA/イオノマイシン)を有するTPSA23腫瘍から分離された単球性および顆粒球性のMDSCを使用して抑制因子アッセイを実行した。結果は、Lmワクチン接種した群からの腫瘍から分離されたMDSCは、無処置マウスの腫瘍からのMDSCと比較して活性化したT細胞の分裂を抑制する能力が減退していることを実証した。(図22および図24のLm−LLO−PSAおよびLm−LLOで処置した群を参照、図中右側のパネルは右側のパネルからのプールした細胞分裂データを表す)。加えて、MDSCが存在せずかつ細胞が刺激されていない/活性化している、未処置マウスからのTレスポンダー細胞は、その親状態(休止状態)のままであるのに対して(図22および図24)、PMAまたはイオノマイシンで刺激されたT細胞は複製しているのが観察された(図22および図24)。さらに、Gr+Ly6G+およびGrdimLy6G−MDSCの両方とも、リステリアワクチンを用いた処置後、抑制がより低くなることが観察された。これは、PSA特異的なT細胞および非特異的な(PMA/イオノマイシンで刺激した)T細胞の両方の分割を抑制するこれらの能力を減少するために適用される。
さらに、非特異的に活性化した無処置マウスの細胞を用いてTPSA23腫瘍から分離されたMDSCを使用して実施した抑制因子アッセイは、Lmワクチン接種した群からの腫瘍から分離されたMDSCが、無処置マウスの腫瘍からのMDSCと比較して、活性化したT細胞の分裂を抑制する能力が減退していることを実証した(図22および図24参照)。
加えて、すぐ上で考察した図22および図24に関する観察は、脾臓のMDSCを使用したときには観察されなかった。後者では、無処置群からの脾細胞/T細胞、リステリアで処置した群(PSA、CA9)、およびPMA/イオノマイシンで刺激した群(正の対照)のすべてが同じレベルの複製を実証した(図23および図25)。したがって、これらの結果はリステリア媒介性の腫瘍内の抑制因子細胞の阻害が抗原特異的なおよび非特異的な様式で作用するのに対して、これらは抗原特異的な様式でのみ抑制的なので、リステリアは脾臓の顆粒球性のMDSCには何も効果を有しないことを示す。
<実施例19>
<実施例19>
腫瘍調節性T細胞の抑制の減少
リステリア処置後TPSA23腫瘍から分離されたTregを使用して、抑制因子アッセイを実施した。リステリアを用いた処置後、腫瘍からのTregの抑制能力の減少が観察されたが(図26)、しかしながら脾臓のTregはそれでも抑制的なままであることが見出された(図27)。
リステリア処置後TPSA23腫瘍から分離されたTregを使用して、抑制因子アッセイを実施した。リステリアを用いた処置後、腫瘍からのTregの抑制能力の減少が観察されたが(図26)、しかしながら脾臓のTregはそれでも抑制的なままであることが見出された(図27)。
対照として、MDSCまたはTregの代わりに従来のCD4+T細胞が使用され、細胞分裂には効果を有しないことが見出された(図28)。
<実施例20>
<実施例20>
4T1腫瘍からのMDSCおよびTreg(ただし脾臓ではない)は、リステリアワクチン接種後、より抑制が低下する。
4T1腫瘍を使用して上記と同様に同一の実験を実施したところ、同一の観察を得た。すなわち、リステリアワクチン接種後、MDSCは抑制がより少なくなる(図29および図31)、リステリアは脾臓の単球性MDSCには特異的な効果を有しない(図30および図32)、リステリアワクチン接種の後、4T1腫瘍からのTregの抑制能力の減少がある(図33)、およびリステリアが脾臓のTregの抑制能力に効果を有しない(図34)。
4T1腫瘍を使用して上記と同様に同一の実験を実施したところ、同一の観察を得た。すなわち、リステリアワクチン接種後、MDSCは抑制がより少なくなる(図29および図31)、リステリアは脾臓の単球性MDSCには特異的な効果を有しない(図30および図32)、リステリアワクチン接種の後、4T1腫瘍からのTregの抑制能力の減少がある(図33)、およびリステリアが脾臓のTregの抑制能力に効果を有しない(図34)。
最後にリステリアが脾臓のTregの抑制能力には効果を有しないことが観察された。
<実施例21>
<実施例21>
顆粒球性および単球性MDSCの抑制能力の変化は、tLLOの過剰発現に起因する。
LLOプラスミドは、TAAまたは無関連抗原のいずれかを用いたリステリアワクチンと類似の結果を示す(図35)。これは、顆粒球性のMDSCの抑制能力の変化がtLLOの過剰発現に起因し、融合抗原のパートナリングとは無関係であることを意味する。空のプラスミド構築体単独でもMDSCの抑制能力の変化を導くが、プラスミド上に切断LLOを含有するワクチンのいずれかとは正確に同一のレベルではない。3つの独立した実験の平均は、空のプラスミドとtLLOを有する他のプラスミドと(腫瘍抗原を有するものと有しないものと)の間の抑制の差異が有意であることを示す。抗原特異的な刺激されたレスポンダーT細胞が使用されるか、または抗原に非特異的な刺激されたレスポンダーT細胞が使用されるかという事実に関わらず、MDSC抑制能力の減少は同一である。
LLOプラスミドは、TAAまたは無関連抗原のいずれかを用いたリステリアワクチンと類似の結果を示す(図35)。これは、顆粒球性のMDSCの抑制能力の変化がtLLOの過剰発現に起因し、融合抗原のパートナリングとは無関係であることを意味する。空のプラスミド構築体単独でもMDSCの抑制能力の変化を導くが、プラスミド上に切断LLOを含有するワクチンのいずれかとは正確に同一のレベルではない。3つの独立した実験の平均は、空のプラスミドとtLLOを有する他のプラスミドと(腫瘍抗原を有するものと有しないものと)の間の抑制の差異が有意であることを示す。抗原特異的な刺激されたレスポンダーT細胞が使用されるか、または抗原に非特異的な刺激されたレスポンダーT細胞が使用されるかという事実に関わらず、MDSC抑制能力の減少は同一である。
顆粒球性のMDSCと同様に、3つの独立した実験の平均は、腫瘍から精製した単球性MDSCのLmが空のプラスミドワクチンを用いたワクチン接種後の抑制能力の観察された差異が、他のワクチン構築体と比較して有意であることを示す(図36)。
上記の観察と同様に、脾臓から精製した顆粒球性のMDSCは、Lmワクチン接種後もそれらの抗原特異的なレスポンダーT細胞の分裂を抑制する能力を保持する(図37)。しかしながら非特異的な刺激後、活性化したT細胞(PMA/イオノマイシンを有する)はまだ分裂する能力を有している。これらの結果のいずれもLLOのみまたは空のプラスミドワクチンの使用によって変更されず、これはLmベースのワクチンが脾臓の顆粒球性のMDSCには影響しないことを示す(図37)。
同様に、脾臓から精製した単球性のMDSCは、Lmワクチン接種後もそれらの抗原特異的なレスポンダーT細胞の分裂を抑制する能力を保持する(図37)。しかしながら、非特異的な活性化(PMA/イオノマイシンによって刺激された)後、T細胞は、まだ分裂の能力を有している。これらの結果のいずれもLLOのみまたは空のプラスミドワクチンの使用によって変更されず、これはLmワクチンが脾臓の単球性のMDSCには影響しないことを示す(図38)。
レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化されるか、または非特異的に活性化されるかに関わらず、Lmで処置した群のいずれかの腫瘍から精製したTregは、レスポンダーT細胞の分裂を抑制する能力がわずかに減退している。特に、非特異的に活性化したレスポンダーT細胞については、それでも空のプラスミドを有するワクチンがLLOをプラスミドに含有するすべてのワクチンと同じ結果を示す。この実験を他のものと平均化すると、差異が有意でないことを示す(図39)。
脾臓から精製したTregは、抗原特異的なおよび非特異的な活性化したレスポンダーT細胞の分裂を抑制する能力をまだ有する。脾臓のTregの抑制能力にはLm処置の効果はない(図40)。
Tcon細胞は、レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化したか、または非特異的に活性化したかに関わらず、T細胞の分裂を抑制する能力を有しない。これはこれらの細胞が非抑制的であるという事実と一致している。Lmはこれらの細胞には効果を有さず、細胞が腫瘍から精製されても、またはマウスの脾臓から精製されても違いはなかった(図41〜図42)。
材料および方法(実施例22〜28)
マウス
Charles River LaboratoriesからのメスのBalb/c(生後6〜8週)を4T1腫瘍株の関与するすべての実験に利用した。Jackson LaboratoriesからのメスのFVB/NJマウス(生後6〜8週)をNT2腫瘍株の関与するすべての実験に利用した。FVB/NJバックグラウンドのラットHer2/neuトランスジェニックマウス株を、自然発生的な腫瘍形成が関与する研究および自発性乳腺腫瘍形成の防止研究に利用し、これらは、University of Pennsylvaniaの実験動物コア施設で収容および飼育された。すべてのマウス実験はUniversity of Pennsylvaniaの研究機関動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)の規制に従って実施した。
マウス
Charles River LaboratoriesからのメスのBalb/c(生後6〜8週)を4T1腫瘍株の関与するすべての実験に利用した。Jackson LaboratoriesからのメスのFVB/NJマウス(生後6〜8週)をNT2腫瘍株の関与するすべての実験に利用した。FVB/NJバックグラウンドのラットHer2/neuトランスジェニックマウス株を、自然発生的な腫瘍形成が関与する研究および自発性乳腺腫瘍形成の防止研究に利用し、これらは、University of Pennsylvaniaの実験動物コア施設で収容および飼育された。すべてのマウス実験はUniversity of Pennsylvaniaの研究機関動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)の規制に従って実施した。
リステリア株
弱毒化リステリアベースのISG15ワクチンを構築するために、まず、Balb/cマウスから、マウスのISG15をコードする遺伝子をマウスのISG15 cDNAを含有する構築体から、以下のプライマー:Lm−LLO−ISG15.FOR 5’−TAAT−CTCGAG−ATGGCCTGGGACCTAAA−3’(配列番号:83)、およびLm−LLO−ISG15.REV 5’−ATTA−ACTAGT−TTAGGCACACTGGTCCCC−3’(配列番号:84)を使用して増幅した。フォワードプライマー内の下線付きのXhoI配列およびリバースプライマー内の下線付きのSpeI配列を連結のために利用した。各々の断片アンプリコンは消化され、またリステリア発現プラスミド、pGG34へと連結される制限酵素である。各々の配列は、hlyプロモーターの制御下で、切断リステリオリシンO(tLLO)をコードする配列に下流で遺伝学的に融合される。これに続いて、pGG34−LLO−ISG15は、弱毒化リステリア・モノサイトゲネス(Lm)株、XFL7へと電気穿孔され、コロニーを含有するプラスミドはBHI−クロラムフェニコールプレート上の耐性に対して選択される。Lm−LLO−ISG15の適正な構築を確認するために、弱毒化リステリアベースのワクチンをBHI−クロラムフェニコール選択培地内で増殖し、分泌したタンパク質をトリクロロ酢酸を用いて沈殿させた。SDSサンプルバッファー内で沸騰した後、分泌したタンパク質をSDS−PAGE解析にかけ、PVDF膜へと移送した。抗マウスISG15抗体(Santa Cruz Biotech、米国カリフォルニア州Santa Cruz)を用いて膜上でウェスタン解析を実施し、tLLO−ISG15融合タンパク質、3A11.2モノクローナル抗体を有する抗ニワトリオボアルブミン、およびB3−19モノクローナル抗体を有する野生型LLOの分泌を確認した。ニワトリオボアルブミンに遺伝学的に融合されたtLLOから構成される対照ワクチン、Lm−LLO−OVAが、同様に構造化された。すべてのリステリアベースのワクチンは腹腔内(i.p.)に 2×108または5×108CFUのいずれかの200μlのPBSで投与した。対照ワクチンLm−LLO−OVAおよびLm−LLO−NYESO−1は同様に構造化された。
弱毒化リステリアベースのISG15ワクチンを構築するために、まず、Balb/cマウスから、マウスのISG15をコードする遺伝子をマウスのISG15 cDNAを含有する構築体から、以下のプライマー:Lm−LLO−ISG15.FOR 5’−TAAT−CTCGAG−ATGGCCTGGGACCTAAA−3’(配列番号:83)、およびLm−LLO−ISG15.REV 5’−ATTA−ACTAGT−TTAGGCACACTGGTCCCC−3’(配列番号:84)を使用して増幅した。フォワードプライマー内の下線付きのXhoI配列およびリバースプライマー内の下線付きのSpeI配列を連結のために利用した。各々の断片アンプリコンは消化され、またリステリア発現プラスミド、pGG34へと連結される制限酵素である。各々の配列は、hlyプロモーターの制御下で、切断リステリオリシンO(tLLO)をコードする配列に下流で遺伝学的に融合される。これに続いて、pGG34−LLO−ISG15は、弱毒化リステリア・モノサイトゲネス(Lm)株、XFL7へと電気穿孔され、コロニーを含有するプラスミドはBHI−クロラムフェニコールプレート上の耐性に対して選択される。Lm−LLO−ISG15の適正な構築を確認するために、弱毒化リステリアベースのワクチンをBHI−クロラムフェニコール選択培地内で増殖し、分泌したタンパク質をトリクロロ酢酸を用いて沈殿させた。SDSサンプルバッファー内で沸騰した後、分泌したタンパク質をSDS−PAGE解析にかけ、PVDF膜へと移送した。抗マウスISG15抗体(Santa Cruz Biotech、米国カリフォルニア州Santa Cruz)を用いて膜上でウェスタン解析を実施し、tLLO−ISG15融合タンパク質、3A11.2モノクローナル抗体を有する抗ニワトリオボアルブミン、およびB3−19モノクローナル抗体を有する野生型LLOの分泌を確認した。ニワトリオボアルブミンに遺伝学的に融合されたtLLOから構成される対照ワクチン、Lm−LLO−OVAが、同様に構造化された。すべてのリステリアベースのワクチンは腹腔内(i.p.)に 2×108または5×108CFUのいずれかの200μlのPBSで投与した。対照ワクチンLm−LLO−OVAおよびLm−LLO−NYESO−1は同様に構造化された。
細胞株
転移性の乳ガン腫瘍株4T1をBalb/cマウスでの腫瘍移植研究で利用した。ラットHer2/neuを過剰発現するNT2乳ガン細胞株をFVBマウス内の腫瘍移植研究のために利用した。4T1−Lucを、10%のウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、50U/mLのペニシリン、および50mg/mLのストレプトマイシンを用いて補助したDMEM内で維持した。NT2細胞を、10%のウシ胎児血清、20mg/mLのインシュリン、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、50U/mLのペニシリン、および50mg/mLのストレプトマイシンを用いて補助したRPMI 1640培地内で維持した。形質転換していないNIH−3T3線維芽細胞株をATCCから得た。NIH−3T3細胞を、10%のウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、50U/mLのペニシリン、および50mg/mLのストレプトマイシンを用いて補助したDMEM内で維持した。
転移性の乳ガン腫瘍株4T1をBalb/cマウスでの腫瘍移植研究で利用した。ラットHer2/neuを過剰発現するNT2乳ガン細胞株をFVBマウス内の腫瘍移植研究のために利用した。4T1−Lucを、10%のウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、50U/mLのペニシリン、および50mg/mLのストレプトマイシンを用いて補助したDMEM内で維持した。NT2細胞を、10%のウシ胎児血清、20mg/mLのインシュリン、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、50U/mLのペニシリン、および50mg/mLのストレプトマイシンを用いて補助したRPMI 1640培地内で維持した。形質転換していないNIH−3T3線維芽細胞株をATCCから得た。NIH−3T3細胞を、10%のウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、50U/mLのペニシリン、および50mg/mLのストレプトマイシンを用いて補助したDMEM内で維持した。
マウスの正常な組織および腫瘍組織内のISG15発現
QiagenからのRNeasy RNA抽出キットを使用して組織または細胞からRNAが抽出され、cDNAへと変換された。次いでcDNAは、ISG15に対して特異的なプライマーqISG15.FOR 5’−ATGGCCTGGGACCTAAAG−3’(配列番号:85)、qISG15.REV 5’−TTAGGCACACTGGTCCCC−3’(配列番号:86)、18S rRNA 18SRNA.FOR 5’−CGGCTACCACATCCAAGGAA−3’(配列番号:87)、18SRNA.REV 5’−GCTGGAATTACCGCGGCT−3’(配列番号:88)、b−actin ACTIN.FOR 5’−GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA−3’(配列番号:89)、およびACTIN.REV 5’−CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC−3’(配列番号:90)を用いてqPCR解析に供した。ISG15発現は、18S rRNA(図43Cおよび図43D)またはb−actin(図43A)のいずれかに標準化された。
QiagenからのRNeasy RNA抽出キットを使用して組織または細胞からRNAが抽出され、cDNAへと変換された。次いでcDNAは、ISG15に対して特異的なプライマーqISG15.FOR 5’−ATGGCCTGGGACCTAAAG−3’(配列番号:85)、qISG15.REV 5’−TTAGGCACACTGGTCCCC−3’(配列番号:86)、18S rRNA 18SRNA.FOR 5’−CGGCTACCACATCCAAGGAA−3’(配列番号:87)、18SRNA.REV 5’−GCTGGAATTACCGCGGCT−3’(配列番号:88)、b−actin ACTIN.FOR 5’−GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA−3’(配列番号:89)、およびACTIN.REV 5’−CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC−3’(配列番号:90)を用いてqPCR解析に供した。ISG15発現は、18S rRNA(図43Cおよび図43D)またはb−actin(図43A)のいずれかに標準化された。
乳腺組織溶解物のウエスタンブロット解析
FVB/Nマウス(n=4)からの正常な乳腺組織、およびFVB/NバックグラウンドのHER2/neuトランスジェニックマウス(n=9)からの自発性乳腺腫瘍組織が切り取られ、溶解物の中へと処理された。簡潔に述べると、組織サンプルを液体N2中で急速冷凍し、粉砕し、プロテアーゼ阻害剤カクテルで補助した溶解バッファー(2%のTriton X−100および0.02%サポニンを含むPBS)中で可溶化した。溶解物を4×LDSサンプル負荷バッファーと混合し、SDS−PAGEに供した。分離したタンパク質のPVDF膜への移送後、抗マウスISG15抗体を用いてウエスタンブロット解析を実施した。別個に、同一の溶解物をSDS−PAGEに供し、総タンパク質をタンパク質負荷の測定として可視化するためにゲルをCoomassie stainで染色した。
FVB/Nマウス(n=4)からの正常な乳腺組織、およびFVB/NバックグラウンドのHER2/neuトランスジェニックマウス(n=9)からの自発性乳腺腫瘍組織が切り取られ、溶解物の中へと処理された。簡潔に述べると、組織サンプルを液体N2中で急速冷凍し、粉砕し、プロテアーゼ阻害剤カクテルで補助した溶解バッファー(2%のTriton X−100および0.02%サポニンを含むPBS)中で可溶化した。溶解物を4×LDSサンプル負荷バッファーと混合し、SDS−PAGEに供した。分離したタンパク質のPVDF膜への移送後、抗マウスISG15抗体を用いてウエスタンブロット解析を実施した。別個に、同一の溶解物をSDS−PAGEに供し、総タンパク質をタンパク質負荷の測定として可視化するためにゲルをCoomassie stainで染色した。
ISG15ペプチドを用いた腫瘍免疫療法。
4T1−Luc腫瘍細胞(105)をBalb/cマウスの乳腺組織の中へと移植し、これに続いてマウスに5日目、12日目、および19日目に、対照(HIV−gag H−2KdCTLエピトープペプチド(AMQMLKETI)(配列番号: mm 91)、またはISG15特異的なペプチド(100mg))、pISG15 d1(RGHSNIYEV)(配列番号:92)、およびpISG15 d2(LGPSSTVML)(配列番号:93)と混合した100μlのPBSまたは50μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)のいずれかを100mLのPBS中で、頸部リンパ節の近傍に皮下でワクチン接種した。実験の手順を通して腫瘍体積を垂直カリパス測定によってモニターした。腫瘍体積は、(腫瘍径)3/2として計算した。
4T1−Luc腫瘍細胞(105)をBalb/cマウスの乳腺組織の中へと移植し、これに続いてマウスに5日目、12日目、および19日目に、対照(HIV−gag H−2KdCTLエピトープペプチド(AMQMLKETI)(配列番号: mm 91)、またはISG15特異的なペプチド(100mg))、pISG15 d1(RGHSNIYEV)(配列番号:92)、およびpISG15 d2(LGPSSTVML)(配列番号:93)と混合した100μlのPBSまたは50μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)のいずれかを100mLのPBS中で、頸部リンパ節の近傍に皮下でワクチン接種した。実験の手順を通して腫瘍体積を垂直カリパス測定によってモニターした。腫瘍体積は、(腫瘍径)3/2として計算した。
ISG15ペプチド腫瘍負荷研究
4T1−Luc腫瘍細胞(105)を乳腺組織の中へと移植し、これに続いて4日目、11日目、および18日目にマウスに、100μlのPBS中に50μgのCpGを単独で、または100μlのPBS中にCpG(50μg)を対照もしくはISG15特異的なペプチド(100μg)とともに、のいずれかで頚部リンパ節近傍に皮下でワクチン接種した。32日目の実験終了時、各々のワクチン接種した群の腫瘍質量を測定し、ELISpot解析および肺転移測定で記述されるように、転移性腫瘍研究で記述されるように、ISG15特異的なIFN−γ応答のために腫瘍を解析した。
4T1−Luc腫瘍細胞(105)を乳腺組織の中へと移植し、これに続いて4日目、11日目、および18日目にマウスに、100μlのPBS中に50μgのCpGを単独で、または100μlのPBS中にCpG(50μg)を対照もしくはISG15特異的なペプチド(100μg)とともに、のいずれかで頚部リンパ節近傍に皮下でワクチン接種した。32日目の実験終了時、各々のワクチン接種した群の腫瘍質量を測定し、ELISpot解析および肺転移測定で記述されるように、転移性腫瘍研究で記述されるように、ISG15特異的なIFN−γ応答のために腫瘍を解析した。
転移性腫瘍研究
4T1−Luc腫瘍細胞(105)を乳腺組織の中へと移植し、これに続いて4日目、11日目、および18日目にマウスにペプチドベースのワクチンまたはリステリアベースのワクチンのいずれかをワクチン接種した。次いでマウスは32日目に犠牲にされ、肺を分離し、かつPBSを用いて灌流した。次いで肺表面の転移性の結節をFostec 8375照明器およびリングライトに取り付けられたニコンSMZ1Bズーム実体顕微鏡を用いて肺ごとに計数した。
4T1−Luc腫瘍細胞(105)を乳腺組織の中へと移植し、これに続いて4日目、11日目、および18日目にマウスにペプチドベースのワクチンまたはリステリアベースのワクチンのいずれかをワクチン接種した。次いでマウスは32日目に犠牲にされ、肺を分離し、かつPBSを用いて灌流した。次いで肺表面の転移性の結節をFostec 8375照明器およびリングライトに取り付けられたニコンSMZ1Bズーム実体顕微鏡を用いて肺ごとに計数した。
ELISpot解析
96ウェル濾過プレート(Millipore、米国マサチューセッツ州Bedford)を100μlのPBS中の15μg/mLのラット抗マウスIFN−γ抗体でコーティングした。4℃にて一晩インキュベーションした後、ウェルを10%のウシ胎児血清で補助したDMEMで洗浄し、かつブロックした。図2Cに対して、各々の実験的群からの脾細胞が、HIV−gag H−2KdCTLエピトープペプチド(AMQMLKETI)(配列番号:91)または予想されたISG15特異的なH−2KdCTLエピトープペプチド、ISG15−d1(RGHSNIYEV)(配列番号:92)、およびISG15−d2(LGPSSTVML)(配列番号:93)(5μg/mL)プラスIL−2(5U/mL)とともにウェルに追加された。ISG15特異的なH−2KdCTLエピトープは、http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.htmlから入手できるRANKPEP予測ソフトウェアを使用して、Balb/cマウス内のISG15タンパク質配列から予測された。図47Bに対して、各々の実験的群からの脾細胞が、HIV−gag H−2KdCTLエピトープペプチド(AMQMLKETI)(配列番号:91)またはHer2/neu特異的なH−2KdエピトープペプチドHer2−EC1(PYNYLSTEV)(配列番号:94)、Her2−EC2(LFRNPHQALL)(配列番号:95)、およびHer2−IC1(PYVSRLLGI)(配列番号:96)とともにウェルに追加された。細胞は37℃にて24時間インキュベートされた。プレートを洗浄し、続いて100μlのPBS中の1μg/mLのビオチン化したIFN−γ抗体(クローンR4−6A2、MABTECH、米国オハイオ州Mariemont)を用いて4℃にて一晩インキュベーションした。洗浄後、100μlのPBS中の1:100のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼが添加され、室温にて1時間インキュベートされた。洗浄後に100μlの基質を追加し、室温にて15分間インキュベートすることによってスポットが発色した。顕色はdH2O中で良く洗浄することによって停止し、ELISpotリーダーを用いてスポット形成細胞(SFC)を計数した。
96ウェル濾過プレート(Millipore、米国マサチューセッツ州Bedford)を100μlのPBS中の15μg/mLのラット抗マウスIFN−γ抗体でコーティングした。4℃にて一晩インキュベーションした後、ウェルを10%のウシ胎児血清で補助したDMEMで洗浄し、かつブロックした。図2Cに対して、各々の実験的群からの脾細胞が、HIV−gag H−2KdCTLエピトープペプチド(AMQMLKETI)(配列番号:91)または予想されたISG15特異的なH−2KdCTLエピトープペプチド、ISG15−d1(RGHSNIYEV)(配列番号:92)、およびISG15−d2(LGPSSTVML)(配列番号:93)(5μg/mL)プラスIL−2(5U/mL)とともにウェルに追加された。ISG15特異的なH−2KdCTLエピトープは、http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.htmlから入手できるRANKPEP予測ソフトウェアを使用して、Balb/cマウス内のISG15タンパク質配列から予測された。図47Bに対して、各々の実験的群からの脾細胞が、HIV−gag H−2KdCTLエピトープペプチド(AMQMLKETI)(配列番号:91)またはHer2/neu特異的なH−2KdエピトープペプチドHer2−EC1(PYNYLSTEV)(配列番号:94)、Her2−EC2(LFRNPHQALL)(配列番号:95)、およびHer2−IC1(PYVSRLLGI)(配列番号:96)とともにウェルに追加された。細胞は37℃にて24時間インキュベートされた。プレートを洗浄し、続いて100μlのPBS中の1μg/mLのビオチン化したIFN−γ抗体(クローンR4−6A2、MABTECH、米国オハイオ州Mariemont)を用いて4℃にて一晩インキュベーションした。洗浄後、100μlのPBS中の1:100のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼが添加され、室温にて1時間インキュベートされた。洗浄後に100μlの基質を追加し、室温にて15分間インキュベートすることによってスポットが発色した。顕色はdH2O中で良く洗浄することによって停止し、ELISpotリーダーを用いてスポット形成細胞(SFC)を計数した。
枯渇実験
マウスに0.5mgのa−CD8抗体(モノクローナル抗体クローン2.43)を、腫瘍移植後6日目、7日目、8日目、10日目、12日目、および14日目に注射することによって4T1−Luc腫瘍を持つマウス内でCD8+細胞を枯渇した。マウスの対照群を、同じ条件下でも処置したが、アイソタイプが適合したβ−ガラクトシダーゼに対して特異的な対照抗体を用いた。同時腫瘍負荷研究は、本明細書の方法の項の「Lm−LLO−ISG15を用いた腫瘍免疫療法」に記述される通りに忠実に従った。
マウスに0.5mgのa−CD8抗体(モノクローナル抗体クローン2.43)を、腫瘍移植後6日目、7日目、8日目、10日目、12日目、および14日目に注射することによって4T1−Luc腫瘍を持つマウス内でCD8+細胞を枯渇した。マウスの対照群を、同じ条件下でも処置したが、アイソタイプが適合したβ−ガラクトシダーゼに対して特異的な対照抗体を用いた。同時腫瘍負荷研究は、本明細書の方法の項の「Lm−LLO−ISG15を用いた腫瘍免疫療法」に記述される通りに忠実に従った。
エフェクター細胞のインビボ決定のためのWinnアッセイ。
Winnアッセイを、いくつかの修正を加えて、前述されているように実施した。簡潔に述べると、対照Lmを2回ワクチン接種したまたはLm−LLO−ISG15を2回ワクチン接種したBalb/cマウス(2×107)のいずれかからのCD4を枯渇した脾細胞(CD4+Dynabeadsを用いて枯渇し、FACS解析によって確認した)とを、4T1−Luc腫瘍細胞(2×105)とを、1個の腫瘍細胞に対して100個のCD4−枯渇した脾細胞の比で混合して、乳腺組織内に移植した。次いで、本明細書の方法の項の「Lm−LLO−ISG15を用いた腫瘍免疫療法」に記述されるように腫瘍の発生を測定した。
Winnアッセイを、いくつかの修正を加えて、前述されているように実施した。簡潔に述べると、対照Lmを2回ワクチン接種したまたはLm−LLO−ISG15を2回ワクチン接種したBalb/cマウス(2×107)のいずれかからのCD4を枯渇した脾細胞(CD4+Dynabeadsを用いて枯渇し、FACS解析によって確認した)とを、4T1−Luc腫瘍細胞(2×105)とを、1個の腫瘍細胞に対して100個のCD4−枯渇した脾細胞の比で混合して、乳腺組織内に移植した。次いで、本明細書の方法の項の「Lm−LLO−ISG15を用いた腫瘍免疫療法」に記述されるように腫瘍の発生を測定した。
HER2/neu特異的な腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)の検出
Balb/cマウスに4T1−Luc腫瘍を移植し、対照LmまたはLm−LLO−ISG15を用いて腹腔内で免疫化し、7日後にブーストした。ブースティングの9日後に腫瘍を採取して、単細胞懸濁液の中へと手動で解離した。次いで腫瘍細胞懸濁液をFicollで精製して遠心分離後に密度の低い部分を除外することによって死滅した細胞および細胞のデブリを除去した。次いで、残った腫瘍細胞を、CD8(53-6.7、FITC共役)、CD62リガンド(CD62L;MEL−14、APC共役)、およびHER2/neu−EC2 H−2Dq四量体−PE共役(PDSLRDLSVFに対して特異的、配列番号:97)についてCell Ques ソフトウェアとともにFACSCalibu フローサイトメーターを使用して、3色フローサイトメトリーに供した。四量体が国立アレルギー感染症研究所(米国)の四量体コア施設によって提供され、1/200の希釈で使用された。結果を上記に記述されるように、対照Lmワクチン接種と比較して、Lm−LLO−ISG15の能力を誘発四量体+、CD8+、CD62L−、Her2/neu特異的なTILと比較するために解析した。
Balb/cマウスに4T1−Luc腫瘍を移植し、対照LmまたはLm−LLO−ISG15を用いて腹腔内で免疫化し、7日後にブーストした。ブースティングの9日後に腫瘍を採取して、単細胞懸濁液の中へと手動で解離した。次いで腫瘍細胞懸濁液をFicollで精製して遠心分離後に密度の低い部分を除外することによって死滅した細胞および細胞のデブリを除去した。次いで、残った腫瘍細胞を、CD8(53-6.7、FITC共役)、CD62リガンド(CD62L;MEL−14、APC共役)、およびHER2/neu−EC2 H−2Dq四量体−PE共役(PDSLRDLSVFに対して特異的、配列番号:97)についてCell Ques ソフトウェアとともにFACSCalibu フローサイトメーターを使用して、3色フローサイトメトリーに供した。四量体が国立アレルギー感染症研究所(米国)の四量体コア施設によって提供され、1/200の希釈で使用された。結果を上記に記述されるように、対照Lmワクチン接種と比較して、Lm−LLO−ISG15の能力を誘発四量体+、CD8+、CD62L−、Her2/neu特異的なTILと比較するために解析した。
統計的解析
自発性のHER2/neu乳腺腫瘍を用いて遺伝子発現研究に適用されるウェルチの補正を用いて、すべての最終腫瘍体積、転移性の負荷、および免疫応答研究のためにスチューデントの片側t検定を実施した。自発性のHER2/neu乳腺腫瘍発生研究のためにログランク検定を実施した。Macintosh用のGraphPad Prismバージョン4.0a(www.graphpad.com)を使用して統計的解析を実施した。すべての比較に対する有意なp値を以下のように図に示した。*=p値<0.05、**=p値<0.01、および***=p値<0.001。
結果
<実施例22>
自発性のHER2/neu乳腺腫瘍を用いて遺伝子発現研究に適用されるウェルチの補正を用いて、すべての最終腫瘍体積、転移性の負荷、および免疫応答研究のためにスチューデントの片側t検定を実施した。自発性のHER2/neu乳腺腫瘍発生研究のためにログランク検定を実施した。Macintosh用のGraphPad Prismバージョン4.0a(www.graphpad.com)を使用して統計的解析を実施した。すべての比較に対する有意なp値を以下のように図に示した。*=p値<0.05、**=p値<0.01、および***=p値<0.001。
結果
<実施例22>
マウスの乳房の腫瘍内のISG15の発現亢進
ヒト悪性腫瘍のISG15の発現亢進は多数の腫瘍モデルでうまく特徴付けられた。しかしながら、マウスの腫瘍モデルでの類似のISG15のレベル増加については証拠が不足している。マウスのモデルで乳ガンに対してISG15発現が亢進されたかどうかを決定するために、HER2/neuトランスジェニックマウスからの自発性のマウス乳腺腫瘍、マウス乳腺腫瘍細胞株、および正常でかつ形質転換していない乳腺組織および細胞株のパネルでISG15発現を測定した。ヒトの乳ガンで観察されるように、正常なマウス乳腺組織と比較して、自発性のマウス乳腺腫瘍ではISG15 mRNAの発現は著しく亢進した(図43A)。タンパク質生産の亢進の結果として生じた、ISG15 mRNAの発現の亢進を確認するために、正常なマウスおよびHER2/neu腫瘍マウスの乳腺組織の溶解物を用いて抗ISG15抗体のウエスタンブロット解析を実施した。正常なマウス乳腺組織(図43B、上のパネル、レーン1)と比較して、ISG15タンパク質の共役形態(20kDマーカーの上方のバンド)は、HER2/neu乳腺腫瘍組織では亢進した(図43B、上のパネル、レーン2〜5)。ISG15タンパク質の非共役形態の発現亢進は、マウスの乳腺腫瘍組織(図43B、上のパネル、レーン2および4)でも、正常な乳腺組織(図43B、上のパネル、レーン1)と比較して明らかである。等価なタンパク質負荷は、同じ溶解物を用いてハウスキーピングタンパク質、GAPDHの発現を精査することによって明らかである(図43B、下のパネル、レーン1〜5)。ISG15 mRNA発現は、正常なマウス乳腺組織および形質転換していないマウス細胞株、NIH−3T3と比較して、マウスの乳腺腫瘍細胞株、4T1−Luc、およびNT2で同様に亢進した(図43C)。非悪性組織内でのISG15発現亢進の心配を軽減するために、ISG15 mRNA発現を正常なマウス組織のパネルでHER2/neuマウス乳房腫瘍組織と比較して解析した。乳腺腫瘍組織内のISG15 mRNAの著しい発現亢進が、各々の正常な組織タイプに対して比較したとき同様に観察された(図43D)。この発現解析は、ISG15発現がマウスの乳ガンモデルで著しく亢進していることを確認する。ISG15 mRNAが正常な組織のパネルで名目的に発現されるという所見とともに、このことはISG15が期待できる新規の腫瘍関連抗原(TAA)である可能性があることを示唆する。
<実施例23>
ヒト悪性腫瘍のISG15の発現亢進は多数の腫瘍モデルでうまく特徴付けられた。しかしながら、マウスの腫瘍モデルでの類似のISG15のレベル増加については証拠が不足している。マウスのモデルで乳ガンに対してISG15発現が亢進されたかどうかを決定するために、HER2/neuトランスジェニックマウスからの自発性のマウス乳腺腫瘍、マウス乳腺腫瘍細胞株、および正常でかつ形質転換していない乳腺組織および細胞株のパネルでISG15発現を測定した。ヒトの乳ガンで観察されるように、正常なマウス乳腺組織と比較して、自発性のマウス乳腺腫瘍ではISG15 mRNAの発現は著しく亢進した(図43A)。タンパク質生産の亢進の結果として生じた、ISG15 mRNAの発現の亢進を確認するために、正常なマウスおよびHER2/neu腫瘍マウスの乳腺組織の溶解物を用いて抗ISG15抗体のウエスタンブロット解析を実施した。正常なマウス乳腺組織(図43B、上のパネル、レーン1)と比較して、ISG15タンパク質の共役形態(20kDマーカーの上方のバンド)は、HER2/neu乳腺腫瘍組織では亢進した(図43B、上のパネル、レーン2〜5)。ISG15タンパク質の非共役形態の発現亢進は、マウスの乳腺腫瘍組織(図43B、上のパネル、レーン2および4)でも、正常な乳腺組織(図43B、上のパネル、レーン1)と比較して明らかである。等価なタンパク質負荷は、同じ溶解物を用いてハウスキーピングタンパク質、GAPDHの発現を精査することによって明らかである(図43B、下のパネル、レーン1〜5)。ISG15 mRNA発現は、正常なマウス乳腺組織および形質転換していないマウス細胞株、NIH−3T3と比較して、マウスの乳腺腫瘍細胞株、4T1−Luc、およびNT2で同様に亢進した(図43C)。非悪性組織内でのISG15発現亢進の心配を軽減するために、ISG15 mRNA発現を正常なマウス組織のパネルでHER2/neuマウス乳房腫瘍組織と比較して解析した。乳腺腫瘍組織内のISG15 mRNAの著しい発現亢進が、各々の正常な組織タイプに対して比較したとき同様に観察された(図43D)。この発現解析は、ISG15発現がマウスの乳ガンモデルで著しく亢進していることを確認する。ISG15 mRNAが正常な組織のパネルで名目的に発現されるという所見とともに、このことはISG15が期待できる新規の腫瘍関連抗原(TAA)である可能性があることを示唆する。
<実施例23>
ISG15特異的なCTLワクチンの構築
ISG15に対する新規のTAAとしての可能性を評価するために、亢進したISG15発現を有する腫瘍を標的化するためのリステリアベースのCTLワクチンが開発された。ワクチン、Lm−LLO−ISG15の構築は、Balb/cマウスからのマウスISG15遺伝子を、融合タンパク質の適正な分泌を可能にするためのシグナル配列を含有するリステリア・モノサイトゲネス(Lm)発現ベクターpGG34内にすでに存在する切断形態のリステリオリシンO(tLLO)をコードする遺伝子の下流に遺伝学的に融合することによって遂行された。これに続いてpGG34−LLO−ISG15構築体は、弱毒化コンピテントLm株、XFL7の中へと電気穿孔した(図44A)。tLLO−ISG15融合タンパク質の適正な分泌を、Lm−LLO−ISG15増殖培養液の培地からTCA沈殿したタンパク質に対して抗マウスISG15抗体を用いたウエスタンブロット解析によって確認した(図44B、上のパネル)。ニワトリオボアルブミンに融合されたtLLOの融合タンパク質の類似の生産および分泌は、抗オボアルブミン抗体を用いてプローブしたとき、発明者らの対照Lmから観察された(図44B、中央のパネル)。Lm−LLO−ISG15および対照Lmから分泌されたタンパク質は、同等の分泌されたタンパク質負荷を確認するために野生型LLO抗体でもプローブされた(図44B、下のパネル)。ISG15特異的なCTL応答の発生を、Lm−LLO−ISG15および対照Lmワクチンとの両方をメスのBalb/cマウスに6週目から開始して毎週投与することによって測定した。RANKPEPによって予測された対照エピトープおよび2つのISG15特異的なH2−Kd−制限CD8+ T細胞エピトープに対するIFN−γ応答を調査するために、第3のワクチン接種の1週間後、各々のワクチン接種群からの脾細胞をELISpot解析に供した。対照ペプチドの刺激と比較して、各々の予測されるISG15特異的なCTLエピトープを用いた刺激後のLm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスからの脾細胞においてのみIFN−γを分泌するSFCの著しい増加が観察された(図44C)。これらの結果はISG15に対する弱毒化したLmベースのCTLワクチンによってISG15特異的な適応性の応答を生成することができることを示唆する。
ISG15に対する新規のTAAとしての可能性を評価するために、亢進したISG15発現を有する腫瘍を標的化するためのリステリアベースのCTLワクチンが開発された。ワクチン、Lm−LLO−ISG15の構築は、Balb/cマウスからのマウスISG15遺伝子を、融合タンパク質の適正な分泌を可能にするためのシグナル配列を含有するリステリア・モノサイトゲネス(Lm)発現ベクターpGG34内にすでに存在する切断形態のリステリオリシンO(tLLO)をコードする遺伝子の下流に遺伝学的に融合することによって遂行された。これに続いてpGG34−LLO−ISG15構築体は、弱毒化コンピテントLm株、XFL7の中へと電気穿孔した(図44A)。tLLO−ISG15融合タンパク質の適正な分泌を、Lm−LLO−ISG15増殖培養液の培地からTCA沈殿したタンパク質に対して抗マウスISG15抗体を用いたウエスタンブロット解析によって確認した(図44B、上のパネル)。ニワトリオボアルブミンに融合されたtLLOの融合タンパク質の類似の生産および分泌は、抗オボアルブミン抗体を用いてプローブしたとき、発明者らの対照Lmから観察された(図44B、中央のパネル)。Lm−LLO−ISG15および対照Lmから分泌されたタンパク質は、同等の分泌されたタンパク質負荷を確認するために野生型LLO抗体でもプローブされた(図44B、下のパネル)。ISG15特異的なCTL応答の発生を、Lm−LLO−ISG15および対照Lmワクチンとの両方をメスのBalb/cマウスに6週目から開始して毎週投与することによって測定した。RANKPEPによって予測された対照エピトープおよび2つのISG15特異的なH2−Kd−制限CD8+ T細胞エピトープに対するIFN−γ応答を調査するために、第3のワクチン接種の1週間後、各々のワクチン接種群からの脾細胞をELISpot解析に供した。対照ペプチドの刺激と比較して、各々の予測されるISG15特異的なCTLエピトープを用いた刺激後のLm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスからの脾細胞においてのみIFN−γを分泌するSFCの著しい増加が観察された(図44C)。これらの結果はISG15に対する弱毒化したLmベースのCTLワクチンによってISG15特異的な適応性の応答を生成することができることを示唆する。
一方で、正常な条件の下では、正常な組織内ではISG15発現は低いかまたは検出できないレベルであるが、しかしながら妊娠中に胎盤の移植部位におけるISG15発現亢進に対する証拠がある。ISG15特異的な免疫応答がLm−LLO−ISG15をワクチン接種したメスのマウスの生殖能力に厳しく影響する場合があるかどうかを決定するために、妊娠研究を実施した。対照Lmをワクチン接種したメスのマウスと比較して、Lm−LLO−ISG15をワクチン接種したメスのマウスの生殖能力は、一腹の総数および子の重量によって測定して、著しく損なわれはしなかった(それぞれ図44Dおよび図44E)。明白な悪影響を有しないISG15特異的な適応性免疫応答の生成は、マウスの乳ガンに対するモデルでのその有効性の調査を助長するものである。
<実施例24>
<実施例24>
LM−LLO−ISG15ワクチン接種後のマウスの乳房腫瘍への治療的な影響
当初、Lm−LLO−ISG15によって生成されたISG15特異的な適応性免疫応答の乳ガンに対する治療的な潜在能力を、移植した乳ガンの原発性および転移性のマウスモデルに対して調査した。NT2腫瘍細胞のFVB/Nマウスの後脇腹への皮下移植、およびこれに続くLm−LLO−ISG15を用いたワクチン接種は、結果として対照ワクチン接種と比較して腫瘍体積を著しく減少した(図45A)。同様に、Lm−LLO−ISG15治療的なワクチン接種は、乳腺組織を移植した4T1−Luc原発性腫瘍の増殖を著しく阻害した(図45B)。4T1−Luc腫瘍の乳腺の中に移植した後自然に転移する能力は、乳ガンについてより侵攻性のモデルに対するISG15特異的なCTL応答の有効性へのさらなる調査を可能にする。Lm−LLO−ISG15投与後、対照Lmと比較して、4T1−Luc転移性肺病変の外観の著しい減少が観察された(図45C)。
<実施例25>
当初、Lm−LLO−ISG15によって生成されたISG15特異的な適応性免疫応答の乳ガンに対する治療的な潜在能力を、移植した乳ガンの原発性および転移性のマウスモデルに対して調査した。NT2腫瘍細胞のFVB/Nマウスの後脇腹への皮下移植、およびこれに続くLm−LLO−ISG15を用いたワクチン接種は、結果として対照ワクチン接種と比較して腫瘍体積を著しく減少した(図45A)。同様に、Lm−LLO−ISG15治療的なワクチン接種は、乳腺組織を移植した4T1−Luc原発性腫瘍の増殖を著しく阻害した(図45B)。4T1−Luc腫瘍の乳腺の中に移植した後自然に転移する能力は、乳ガンについてより侵攻性のモデルに対するISG15特異的なCTL応答の有効性へのさらなる調査を可能にする。Lm−LLO−ISG15投与後、対照Lmと比較して、4T1−Luc転移性肺病変の外観の著しい減少が観察された(図45C)。
<実施例25>
Lm−LLO−ISG15によるHER2/NEU+自発性乳腺腫瘍およびエピトープ拡大の進行の遅延
より臨床的に関連するヒト乳房腫瘍発生のモデルでもLm−LLO−ISG15が治療的な有効性を提供することができるかどうかを決定するために、治療的な介入なしに自発性の乳腺腫瘍を発生する生後4か月を過ぎたFVB/N Her2/neuトランスジェニックマウスモデルを利用した。メスのトランスジェニックマウスに生後6週目から21週目まで、3週間ごとにLm−LLO−ISG15または対照Lmをワクチン接種し、これに続いて乳腺腫瘍発生についてモニターした。対照Lmをワクチン接種した群と比較して、Lm−LLO−ISG15を投与したマウスは腫瘍の進行に有意な遅延を実証した(p<0.0001)(図46A)。事実、80パーセントを超えるLm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスが生後49週まででもまだ腫瘍を有しない一方で、すべての対照Lmをワクチン接種したマウスは31週間の進行時間の中間値で、乳腺腫瘍を発生した。Lm−LLO−ISG15ワクチン接種後のISG15特異的なCTLの自発性腫瘍の中への浸潤が、この進行の遅延のために可能性のある機構とすることができるかどうかを決定するために、Lm−LLO−ISG15ワクチン接種後にこれらの腫瘍のTILでIFNγELISpot解析を実施した。自発性腫瘍を形態させた後、腫瘍を持つマウスに対照LmワクチンまたはLm−LLO−ISG15のいずれかを0日目と7日目との2回ワクチン接種した。最後のワクチン接種の一週間後、腫瘍を切り離し、TIL精製し、かつELISpot解析のために処理した。そのISG15エピトープペプチド刺激後にIFNγを分泌する能力によって測定されるように、Lm−LLO−ISG15でワクチン接種したマウスの腫瘍は、予想通り、対照Lmワクチン接種したマウスの腫瘍より有意に多数のISG15特異的なTILを含有する(図46B)。これらの結果は、Lm−LLO−ISG15による自発性乳腺腫瘍の進行の遅延は、ある程度ISG15特異的なCTLの浸潤によって媒介されることを示唆する。
より臨床的に関連するヒト乳房腫瘍発生のモデルでもLm−LLO−ISG15が治療的な有効性を提供することができるかどうかを決定するために、治療的な介入なしに自発性の乳腺腫瘍を発生する生後4か月を過ぎたFVB/N Her2/neuトランスジェニックマウスモデルを利用した。メスのトランスジェニックマウスに生後6週目から21週目まで、3週間ごとにLm−LLO−ISG15または対照Lmをワクチン接種し、これに続いて乳腺腫瘍発生についてモニターした。対照Lmをワクチン接種した群と比較して、Lm−LLO−ISG15を投与したマウスは腫瘍の進行に有意な遅延を実証した(p<0.0001)(図46A)。事実、80パーセントを超えるLm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスが生後49週まででもまだ腫瘍を有しない一方で、すべての対照Lmをワクチン接種したマウスは31週間の進行時間の中間値で、乳腺腫瘍を発生した。Lm−LLO−ISG15ワクチン接種後のISG15特異的なCTLの自発性腫瘍の中への浸潤が、この進行の遅延のために可能性のある機構とすることができるかどうかを決定するために、Lm−LLO−ISG15ワクチン接種後にこれらの腫瘍のTILでIFNγELISpot解析を実施した。自発性腫瘍を形態させた後、腫瘍を持つマウスに対照LmワクチンまたはLm−LLO−ISG15のいずれかを0日目と7日目との2回ワクチン接種した。最後のワクチン接種の一週間後、腫瘍を切り離し、TIL精製し、かつELISpot解析のために処理した。そのISG15エピトープペプチド刺激後にIFNγを分泌する能力によって測定されるように、Lm−LLO−ISG15でワクチン接種したマウスの腫瘍は、予想通り、対照Lmワクチン接種したマウスの腫瘍より有意に多数のISG15特異的なTILを含有する(図46B)。これらの結果は、Lm−LLO−ISG15による自発性乳腺腫瘍の進行の遅延は、ある程度ISG15特異的なCTLの浸潤によって媒介されることを示唆する。
最近の研究は、ガンワクチンの臨床的な有効性がそのクロスプライミングおよび追加的なTAAへのエピトープ拡大を刺激する能力と有意に相関することを実証している。類似の結果がLmベースのガンワクチンを使用して以前に観察され、追加的なTAAへのエピトープ拡大の発生はワクチンの有効性と関連付けられた。Lm−LLO−ISG15ワクチン接種の後にエピトープ拡大が発生するかどうかを評価するために、対照LmまたはLm−LLO−ISG15のいずれかの投与後のNT2腫瘍を持つマウスからの脾細胞を用いてHER2/neu特異的な応答を検出するためのELISpotを実施した。Lm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスの脾細胞は、対照Lmをワクチン接種したマウスと比較して有意により多数の既知のCTLエピトープ特異的なSFCをHER2/neuの中に含有する(図46C)。この結果は、Lm−LLO−ISG15のワクチン接種が結果として追加的なTAAへのエピトープ拡大をもたらすことを示唆する。事実、エピトープ拡大に対する証拠は、Her2/neuを非常に弱く発現する腫瘍細胞株である4T1−Luc腫瘍に対するLm−LLO−ISG15ワクチン接種後でも観察される。Lm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスからの4T1−Luc腫瘍は、対照Lmをワクチン接種したマウスからの4T1−Luc腫瘍より有意に高いパーセンテージのHer2/neu特異的なCD8+62L− TILを含有する(図46D)。HER2/neuへのエピトープ拡大は何らかの治療的な有効性を提供する場合があるが、心毒性の安全性への懸念を保証するためにこの2次応答が十分に確実なものであるかどうかは不明である。まとめると、これらの腫瘍負荷研究は、ISG15に対するワクチン接種が、原発性の移植したマウスの乳腺腫瘍の増殖を阻害し、転移性の拡散を阻害し、自発性乳腺腫瘍の進行を遅延し、追加的なTAAへのエピトープ拡大を生成することができることを実証する。
<実施例26>
<実施例26>
ISG15のワクチン接種の治療的な影響は、CD−8に依存する
確実なIFN−γ応答および有意な治療的な腫瘍の影響の発生は強いCTL応答を示唆するものであるが、一方でISG15特異的なCD8+ T細胞機能のLm−LLO−ISG15有効性への依存性を調査した。4T1−Luc腫瘍を持つマウスでのCD8+細胞の枯渇は、対照抗体を用いた疑似枯渇と比較してLm−LLO−ISG15の抗腫瘍有効性を完全に破棄する(図47A)。ISG15特異的なCTL腫瘍細胞溶解のインビボでの手段として、Lm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスからのCD8+T細胞のために濃縮した脾細胞が4T1−Luc腫瘍形成を直接的に阻害することができるかどうかを評価するためにWinnアッセイを実施した。Lm−LLO−ISG15または対照Lmのいずれかを2回ワクチン接種したマウスからの脾細胞のCD4+細胞を枯渇し、4T1−Luc腫瘍細胞とともに短時間インキュベートした。次いで腫瘍細胞および脾細胞混合物をBalb/cマウスの乳腺組織の中へと移植し、腫瘍進行をモニターした。Lm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスからのCD8+T細胞を濃縮した脾細胞は、対照Lmをワクチン接種したマウスからのものと比較して腫瘍増殖を有意に阻害した(図47B)。さらに、対照Lm脾細胞を受容したマウスはすべて移植後21日目までに腫瘍を発生したが、一方でISG15特異的な脾細胞を受容したマウスの40%は43日目にはまだ腫瘍を有していなかった(図47C)。この結果は、Lm−LLO−ISG15が、結果として腫瘍細胞の直接溶解をもたらすCD8に依存する適応性の免疫応答を誘発し、CD8+T細胞によって媒介される可能性があることを示唆する。
<実施例27>
確実なIFN−γ応答および有意な治療的な腫瘍の影響の発生は強いCTL応答を示唆するものであるが、一方でISG15特異的なCD8+ T細胞機能のLm−LLO−ISG15有効性への依存性を調査した。4T1−Luc腫瘍を持つマウスでのCD8+細胞の枯渇は、対照抗体を用いた疑似枯渇と比較してLm−LLO−ISG15の抗腫瘍有効性を完全に破棄する(図47A)。ISG15特異的なCTL腫瘍細胞溶解のインビボでの手段として、Lm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスからのCD8+T細胞のために濃縮した脾細胞が4T1−Luc腫瘍形成を直接的に阻害することができるかどうかを評価するためにWinnアッセイを実施した。Lm−LLO−ISG15または対照Lmのいずれかを2回ワクチン接種したマウスからの脾細胞のCD4+細胞を枯渇し、4T1−Luc腫瘍細胞とともに短時間インキュベートした。次いで腫瘍細胞および脾細胞混合物をBalb/cマウスの乳腺組織の中へと移植し、腫瘍進行をモニターした。Lm−LLO−ISG15をワクチン接種したマウスからのCD8+T細胞を濃縮した脾細胞は、対照Lmをワクチン接種したマウスからのものと比較して腫瘍増殖を有意に阻害した(図47B)。さらに、対照Lm脾細胞を受容したマウスはすべて移植後21日目までに腫瘍を発生したが、一方でISG15特異的な脾細胞を受容したマウスの40%は43日目にはまだ腫瘍を有していなかった(図47C)。この結果は、Lm−LLO−ISG15が、結果として腫瘍細胞の直接溶解をもたらすCD8に依存する適応性の免疫応答を誘発し、CD8+T細胞によって媒介される可能性があることを示唆する。
<実施例27>
ISG15特異的なCTLクローンのインビボでの増幅が結果として抗腫瘍応答をもたらす
単一のISG15特異的なCD8+T細胞クローンの増幅が結果として抗腫瘍有効性をもたらすかどうかを評価するために、マウスに4T1−Luc腫瘍細胞を移植し、PBS単独もしくはアジュバント、CpG ODN、各々のISG15 H2Kdエピトープペプチドを混合したもの、または対照ペプチドを用いてワクチン接種した。CpG ODNおよびISG15 H2Kdペプチドを用いてワクチン接種したマウスでは、PBS単独および対照ペプチドワクチン接種と比較して4T1−Luc腫瘍体積および腫瘍質量が有意に減少した(それぞれ図48Aおよび図48B)。4T1−Luc腫瘍肺転移も、各々のISG15ペプチドを用いたワクチン接種後、PBS単独または対照ペプチドワクチン接種と比較して著しく減少した(図48C)。さらに、各々のISG15 H2Kdエピトープペプチドを用いた刺激に応答するIFNγ分泌が、それらのそれぞれのISG15 H2Kdエピトープペプチドを用いてワクチン接種したマウスからのTILでのみ観察され、標的となった腫瘍と取引する順調な増幅ISG15特異的なCTLがあることを示唆する(図48Dおよび図48E)。これらのデータは、ISG15特異的なCD8+T細胞の増幅がISG15の発現亢進により腫瘍の増殖を直接的に阻害することを強く示唆する。
単一のISG15特異的なCD8+T細胞クローンの増幅が結果として抗腫瘍有効性をもたらすかどうかを評価するために、マウスに4T1−Luc腫瘍細胞を移植し、PBS単独もしくはアジュバント、CpG ODN、各々のISG15 H2Kdエピトープペプチドを混合したもの、または対照ペプチドを用いてワクチン接種した。CpG ODNおよびISG15 H2Kdペプチドを用いてワクチン接種したマウスでは、PBS単独および対照ペプチドワクチン接種と比較して4T1−Luc腫瘍体積および腫瘍質量が有意に減少した(それぞれ図48Aおよび図48B)。4T1−Luc腫瘍肺転移も、各々のISG15ペプチドを用いたワクチン接種後、PBS単独または対照ペプチドワクチン接種と比較して著しく減少した(図48C)。さらに、各々のISG15 H2Kdエピトープペプチドを用いた刺激に応答するIFNγ分泌が、それらのそれぞれのISG15 H2Kdエピトープペプチドを用いてワクチン接種したマウスからのTILでのみ観察され、標的となった腫瘍と取引する順調な増幅ISG15特異的なCTLがあることを示唆する(図48Dおよび図48E)。これらのデータは、ISG15特異的なCD8+T細胞の増幅がISG15の発現亢進により腫瘍の増殖を直接的に阻害することを強く示唆する。
材料および方法(実施例28〜37)
マウス。
メスのFVB/NマウスをCharles River Laboratoriesから購入した。FVB/N Her−2/neuトランスジェニックマウスは、University of Pennsylvaniaの実験動物コア施設で収容および飼育された。マウスは実験開始時に生後6〜8週間であり、実験はUniversity of Pennsylvaniaの研究機関動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)の規制に従って行われた。
マウス。
メスのFVB/NマウスをCharles River Laboratoriesから購入した。FVB/N Her−2/neuトランスジェニックマウスは、University of Pennsylvaniaの実験動物コア施設で収容および飼育された。マウスは実験開始時に生後6〜8週間であり、実験はUniversity of Pennsylvaniaの研究機関動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)の規制に従って行われた。
ペプチドおよび抗体。
抗マウスCD31、抗マウスCD8a−PE、ラットIgG2a−PEアイソタイプ対照はBD Biosciences(米国カリフォルニア州San Jose)から購入した。ウサギの抗リステリア抗血清多クローン性の抗体、セロタイプ1、4はDifco BD Biosciencesから購入した。ウサギの抗HIF−1aはNovus Biologicals(米国コロラド州Littleton)から購入した。ヤギの抗ウサギAlexa−488二次抗体はInvitrogenから購入した。DAPIはSigma(米国ミズーリ州St. Louis)から購入した。ラット抗マウスIFN−g(クローンAN18)はMABTECH(米国オハイオ州Mariemont)から購入した。ラット抗マウスIFN−g(クローンXMG1.2)はeBioscience(米国カリフォルニア州San Deigo)から購入した。融合タンパク質発現のためにウエスタンブロットで使用する抗体は、LLOタンパク質の最初の13残基(PEST)まで育てた多クローン性のウサギの血清(Sewell et al.,2004, Cancer research.64:8821−8825)、または抗LLOマウス抗体、全長LLO特異的な、ハイブリドーマ上清から生成した、クローン#B5−19(Edelson et al.,2001, Immunity.14:503−512)のいずれかである。すべてのペプチドはEZBiolabs(米国インディアナ州Westfield)から購入した。四量体は米国国立衛生研究所エイズ研究所(National Institutes of Health AIDS Research)のAmy Stout博士および参照試薬プログラム(Reference Reagent Program)から提供された。使用された四量体はすべてPE−共役H−2Dqであり、またHer−2/neu領域のためのペプチド、EC1(ASPETHLDML;配列番号:98)、EC2(PDSLRDLSVF;配列番号:97)、またはIC1(GSGAFGTVYK;配列番号:99)のいずれかを含有する。これらの研究で使用されたペプチドは以下のものである。Flk−E1210−219(TYQSIMYIV;配列番号:100)、Flk−E2613−622(MFSNSTNDI;配列番号:101)、Flk−I1906−915(PGGPLMVIV;配列番号:102)、Flk−I1839−848(GRGAFGQVI;配列番号:103);(Her2−pEC1302−310(PYNYLSTEV;配列番号:94)、Her2−pEC2420−429(PDSLRDLSVF;配列番号:97)、Her2−pIC1732−741(GSGAFGTVYK;配列番号:99)、HIV−pGag(AMQMLKETI;配列番号:91)。
抗マウスCD31、抗マウスCD8a−PE、ラットIgG2a−PEアイソタイプ対照はBD Biosciences(米国カリフォルニア州San Jose)から購入した。ウサギの抗リステリア抗血清多クローン性の抗体、セロタイプ1、4はDifco BD Biosciencesから購入した。ウサギの抗HIF−1aはNovus Biologicals(米国コロラド州Littleton)から購入した。ヤギの抗ウサギAlexa−488二次抗体はInvitrogenから購入した。DAPIはSigma(米国ミズーリ州St. Louis)から購入した。ラット抗マウスIFN−g(クローンAN18)はMABTECH(米国オハイオ州Mariemont)から購入した。ラット抗マウスIFN−g(クローンXMG1.2)はeBioscience(米国カリフォルニア州San Deigo)から購入した。融合タンパク質発現のためにウエスタンブロットで使用する抗体は、LLOタンパク質の最初の13残基(PEST)まで育てた多クローン性のウサギの血清(Sewell et al.,2004, Cancer research.64:8821−8825)、または抗LLOマウス抗体、全長LLO特異的な、ハイブリドーマ上清から生成した、クローン#B5−19(Edelson et al.,2001, Immunity.14:503−512)のいずれかである。すべてのペプチドはEZBiolabs(米国インディアナ州Westfield)から購入した。四量体は米国国立衛生研究所エイズ研究所(National Institutes of Health AIDS Research)のAmy Stout博士および参照試薬プログラム(Reference Reagent Program)から提供された。使用された四量体はすべてPE−共役H−2Dqであり、またHer−2/neu領域のためのペプチド、EC1(ASPETHLDML;配列番号:98)、EC2(PDSLRDLSVF;配列番号:97)、またはIC1(GSGAFGTVYK;配列番号:99)のいずれかを含有する。これらの研究で使用されたペプチドは以下のものである。Flk−E1210−219(TYQSIMYIV;配列番号:100)、Flk−E2613−622(MFSNSTNDI;配列番号:101)、Flk−I1906−915(PGGPLMVIV;配列番号:102)、Flk−I1839−848(GRGAFGQVI;配列番号:103);(Her2−pEC1302−310(PYNYLSTEV;配列番号:94)、Her2−pEC2420−429(PDSLRDLSVF;配列番号:97)、Her2−pIC1732−741(GSGAFGTVYK;配列番号:99)、HIV−pGag(AMQMLKETI;配列番号:91)。
ELISpot
ペプチドの刺激に応答するマウスの脾細胞によるIFN−−gの分泌は、酵素にリンクしたイムノスポット(ELISpot)アッセイによって試験された。頻度の低い、抗原特異的な細胞に対して得ることができる感度のレベル、および抗Her−2/neuおよび抗Flk−1特異的なT細胞のためにインビトロ操作なしに直接エキソビボで試験することができることから、発明者らは他のアッセイよりもELISpotの使用を好んだ。簡潔に述べると、分離された脾細胞を、ウェル当たり1×106細胞でプレーティング、または10mg/mLペプチドおよび5U/mLのIL−2の存在下で7mg/mLのラット抗マウスIFN−g抗体(クローンAN18、MABTECH、米国オハイオ州Mariemont)でコーティングした96ウェルプレートにわたって滴定した。次に、ビオチン化した抗IFN−g抗体(クローンXMG1.2、eBioscience)を各々のウェルに、最終濃度が2mg/mLとなるように添加した。37℃にて一晩インキュベーションした後、プレートをストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(1:1000希釈)、続いて基質TMB(Vector laboratories、ABCキット)を用いて室温で1時間顕色させた。Immunospot C.T.L.スキャナーおよび計数ソフトウェア(CTL、米国オハイオ州Cleveland)を使用してスポットを計数した。
ペプチドの刺激に応答するマウスの脾細胞によるIFN−−gの分泌は、酵素にリンクしたイムノスポット(ELISpot)アッセイによって試験された。頻度の低い、抗原特異的な細胞に対して得ることができる感度のレベル、および抗Her−2/neuおよび抗Flk−1特異的なT細胞のためにインビトロ操作なしに直接エキソビボで試験することができることから、発明者らは他のアッセイよりもELISpotの使用を好んだ。簡潔に述べると、分離された脾細胞を、ウェル当たり1×106細胞でプレーティング、または10mg/mLペプチドおよび5U/mLのIL−2の存在下で7mg/mLのラット抗マウスIFN−g抗体(クローンAN18、MABTECH、米国オハイオ州Mariemont)でコーティングした96ウェルプレートにわたって滴定した。次に、ビオチン化した抗IFN−g抗体(クローンXMG1.2、eBioscience)を各々のウェルに、最終濃度が2mg/mLとなるように添加した。37℃にて一晩インキュベーションした後、プレートをストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(1:1000希釈)、続いて基質TMB(Vector laboratories、ABCキット)を用いて室温で1時間顕色させた。Immunospot C.T.L.スキャナーおよび計数ソフトウェア(CTL、米国オハイオ州Cleveland)を使用してスポットを計数した。
細胞株。
細胞培養培地および補助剤はGibco(Invitrogen)から購入した。NT−2およびJ774A.1細胞は前述されているように維持した。細胞培養はすべて37℃および5CO2に保持した。蛍ルシフェラーゼ遺伝子(4T1−Luc)を安定して発現する4T1および4T1細胞はEllen Pure博士(Wistar Institute)の親切な供与品であり、また細胞培養培地の中で維持した。
細胞培養培地および補助剤はGibco(Invitrogen)から購入した。NT−2およびJ774A.1細胞は前述されているように維持した。細胞培養はすべて37℃および5CO2に保持した。蛍ルシフェラーゼ遺伝子(4T1−Luc)を安定して発現する4T1および4T1細胞はEllen Pure博士(Wistar Institute)の親切な供与品であり、また細胞培養培地の中で維持した。
Lm−LLO−Flk−1ワクチンの構築。
Flk−1遺伝子源はRalph Reisfeld博士(The Scripps Research Institute、米国カリフォルニア州La Jolla)によって寛大にも提供されたDNAワクチンプラスミドであった。残基68〜1081に対応する断片は、以下のプライマーを使用しPCRによって増幅される。Flk−E1(F):5’−GGGCTCGAGCGTGATTCTGAGGAAAGGGTATT−3’(配列番号:104)、Flk−E1(R):5’GGGACTAGTTTACCCGGTTTACAATCTTCTTAT−3’(配列番号:105)、(AA68−277);Flk−E2(F):5’−GGGCTCGAGGTGATCAGGGGTCCTGAAATTA−3’(配列番号:106)、Flk−E2(R):5’−GGGACTAGTTTAGCCTCCATCCTCCTTCCT−3’(配列番号:107)、(AA545−730);Flk−I1(F):5’−GGGCTCGAGGAAGGGGAACTGAAGACAGCC−3’(配列番号:108)、Flk−I1(R):5’−GGGACTAGTTTATGTGTATACTCTGTCAAAAATGGTTTC−3’(配列番号:109)、(AA792−1081)。XhoI配列はフォワード(F)プライマーに対して下線付き、SpeI配列はリバース(R)プライマーに対して下線付き、終止コドンは太字である。PCR産物はpCR2.1−TOPOプラスミド(Invitrogen)へと連結され、配列決定によって確認され、これに続いてXhoIおよびSpeI(New England Biolabs)を用いた二重消化によって切り離される。断片は下流でpGG34ベースのプラスミドへと連結され、その発現がhlyプロモーターによって駆動されるLLOタンパク質の最初の441残基に対してコードする遺伝子に融合される。pGG34プラスミドの構築はいずれかに詳細に記述されている。結果として得られるプラスミドを、Lm株10403Sに由来するPrfA欠損のLm株XFL−7の中へと電気穿孔した。陽性クローンは、34μg/mLのクロラムフェニコールおよび250μg/mLのストレプトマイシンを用いて補助されたブレインハートインフージョン(BHI、Difco)プレート上で選択された。結果として得られた染色剤は、Lm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−E2、およびLm−LLO−Flk−I1と名付けられた
Flk−1遺伝子源はRalph Reisfeld博士(The Scripps Research Institute、米国カリフォルニア州La Jolla)によって寛大にも提供されたDNAワクチンプラスミドであった。残基68〜1081に対応する断片は、以下のプライマーを使用しPCRによって増幅される。Flk−E1(F):5’−GGGCTCGAGCGTGATTCTGAGGAAAGGGTATT−3’(配列番号:104)、Flk−E1(R):5’GGGACTAGTTTACCCGGTTTACAATCTTCTTAT−3’(配列番号:105)、(AA68−277);Flk−E2(F):5’−GGGCTCGAGGTGATCAGGGGTCCTGAAATTA−3’(配列番号:106)、Flk−E2(R):5’−GGGACTAGTTTAGCCTCCATCCTCCTTCCT−3’(配列番号:107)、(AA545−730);Flk−I1(F):5’−GGGCTCGAGGAAGGGGAACTGAAGACAGCC−3’(配列番号:108)、Flk−I1(R):5’−GGGACTAGTTTATGTGTATACTCTGTCAAAAATGGTTTC−3’(配列番号:109)、(AA792−1081)。XhoI配列はフォワード(F)プライマーに対して下線付き、SpeI配列はリバース(R)プライマーに対して下線付き、終止コドンは太字である。PCR産物はpCR2.1−TOPOプラスミド(Invitrogen)へと連結され、配列決定によって確認され、これに続いてXhoIおよびSpeI(New England Biolabs)を用いた二重消化によって切り離される。断片は下流でpGG34ベースのプラスミドへと連結され、その発現がhlyプロモーターによって駆動されるLLOタンパク質の最初の441残基に対してコードする遺伝子に融合される。pGG34プラスミドの構築はいずれかに詳細に記述されている。結果として得られるプラスミドを、Lm株10403Sに由来するPrfA欠損のLm株XFL−7の中へと電気穿孔した。陽性クローンは、34μg/mLのクロラムフェニコールおよび250μg/mLのストレプトマイシンを用いて補助されたブレインハートインフージョン(BHI、Difco)プレート上で選択された。結果として得られた染色剤は、Lm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−E2、およびLm−LLO−Flk−I1と名付けられた
Lmワクチン投与物の増殖および調製
ワクチンストックは−80℃にて10%のグリセロール中で1×PBSの中に保持した。各々のストックをクロラムフェニコール/ストレプトマイシンプレート上に筋状にし、一晩増殖した。選択した抗生物質の下の5mLのBHI培地の培養液で一晩増殖させるために単一のコロニーを使用した。37℃にて撹拌インキュベーター内でこの培養液をさらに4時間延長し、微生物密度が0.4〜0.8OD600に達するまで増殖させ、この時点で微生物を洗浄し、10%のグリセロール内で冷凍滅菌して、使用するまで−80℃にて保持した。生成した各々のロットについてストックを滴定した。1つの連続的な実験のためには単一のロットを使用し、各々の繰返しには異なるロットを使用し、ロット間の変化は観察されなかった。ウエスタンブロットによる融合タンパク質発現について、抗PEST抗体および抗LLO抗体を用いて各々のロットをチェックした。各々の投与のために、1つのバイアルを選択して、希釈して使用する前に、解凍して1×PBS内で2回洗浄し、使用しなかった微生物は破棄した。
ワクチンストックは−80℃にて10%のグリセロール中で1×PBSの中に保持した。各々のストックをクロラムフェニコール/ストレプトマイシンプレート上に筋状にし、一晩増殖した。選択した抗生物質の下の5mLのBHI培地の培養液で一晩増殖させるために単一のコロニーを使用した。37℃にて撹拌インキュベーター内でこの培養液をさらに4時間延長し、微生物密度が0.4〜0.8OD600に達するまで増殖させ、この時点で微生物を洗浄し、10%のグリセロール内で冷凍滅菌して、使用するまで−80℃にて保持した。生成した各々のロットについてストックを滴定した。1つの連続的な実験のためには単一のロットを使用し、各々の繰返しには異なるロットを使用し、ロット間の変化は観察されなかった。ウエスタンブロットによる融合タンパク質発現について、抗PEST抗体および抗LLO抗体を用いて各々のロットをチェックした。各々の投与のために、1つのバイアルを選択して、希釈して使用する前に、解凍して1×PBS内で2回洗浄し、使用しなかった微生物は破棄した。
Lm−LLO−Flk−1ワクチンの腫瘍増殖に及ぼす効果
NT−2腫瘍細胞の1×106を200μlのPBSでFVB/Nマウスの脇腹に皮下で注射した。腫瘍接種後4日目に、5×108CFUの、Lm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−E2、またはLm−LLO−Flk−I1の何れかを用いて、マウスに腹腔内で免疫化した。この投与量は、マウスに悪影響を及ぼすことが観察された最少投与の1/10として決定されたが、これはすべての実験に使用された。免疫化を毎週繰り返し、すべての実験に対してワクチンを合計3回投与した。対照群では、マウスは対照Lmワクチン、Lm−LLO−NY−ESO−1101−156を受容した。LLOまたはリステリアの感染に対する免疫応答を制御するためのLm−LLO−NY−ESO−1101−156は無関連Lmワクチンまたは第三者Lmワクチンとして作用し、発明者らは一般的にこのワクチンを対照として試験ワクチンと同等の濃度で使用する。カリパスを用いて3日ごとに腫瘍を測定し、各々の個別の腫瘍について最短表面径(幅)と最長表面径とを記録した。以下の式を使用して腫瘍体積の計算を実施した。[(幅)2×長さ×0.52]。直径が20mmに達するを開放創または腫瘍をマウスが発生した場合、そのマウスを犠牲にした。腫瘍を有しないで生存しているNT−2にチャレンジしたマウスは、第1の接種の少なくとも10週間後に同じ細胞株を用いて反対側の脇腹で再チャレンジした。
NT−2腫瘍細胞の1×106を200μlのPBSでFVB/Nマウスの脇腹に皮下で注射した。腫瘍接種後4日目に、5×108CFUの、Lm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−E2、またはLm−LLO−Flk−I1の何れかを用いて、マウスに腹腔内で免疫化した。この投与量は、マウスに悪影響を及ぼすことが観察された最少投与の1/10として決定されたが、これはすべての実験に使用された。免疫化を毎週繰り返し、すべての実験に対してワクチンを合計3回投与した。対照群では、マウスは対照Lmワクチン、Lm−LLO−NY−ESO−1101−156を受容した。LLOまたはリステリアの感染に対する免疫応答を制御するためのLm−LLO−NY−ESO−1101−156は無関連Lmワクチンまたは第三者Lmワクチンとして作用し、発明者らは一般的にこのワクチンを対照として試験ワクチンと同等の濃度で使用する。カリパスを用いて3日ごとに腫瘍を測定し、各々の個別の腫瘍について最短表面径(幅)と最長表面径とを記録した。以下の式を使用して腫瘍体積の計算を実施した。[(幅)2×長さ×0.52]。直径が20mmに達するを開放創または腫瘍をマウスが発生した場合、そのマウスを犠牲にした。腫瘍を有しないで生存しているNT−2にチャレンジしたマウスは、第1の接種の少なくとも10週間後に同じ細胞株を用いて反対側の脇腹で再チャレンジした。
腫瘍免疫蛍光
腫瘍接種後64日目に、マウスを犠牲にし、NT−2腫瘍を外科的に切り離し、OCT寒剤中で凍結保存し、凍結切片を作製し8〜10mmの厚さの切片を提供した。免疫蛍光のために、サンプルを解凍し、4%のホルマリンを使用して固定した。ブロッキング(2.4G2コンディショニングした培地/10%のFBS/5%の正常なラットおよびマウス血清)した後、ブロッキング溶液内で一次抗体を用いて加湿チャンバー内で37℃にて1時間切片を染色した。一次染色に対して使用したのと同一の手順に従って、二次抗体を用いてサンプルを染色した。製造業者の取扱説明書によりDAPI(Invitrogen)染色を実施した。HIF−1aに対する細胞内染色をPBS/0.1%のTween/1%のBSA溶液中で行った。退色防止剤入りの封入溶液(Biomeda)を使用してスライドにカバーグラスをかけ、24時間硬化させ、Spot Imageソフトウェア(vs.2006)およびBX51シリーズOlympus蛍光顕微鏡を使用して撮像するまで4℃にて保持した。Spot Imageソフトウェアを使用して画像マージし、Image Proソフトウェア(vs.2006)を使用してROIをゲーティングした後で定量化を実施した。すべての画像は、同じ露出時間に対してキャプチャした3つの異なるチャネルのシリーズをマージした。抗CD31を使用する微小血管密度の定量化のために、発明者らはマウス腫瘍モデル内のMVD測定のために類似の戦略を使用して、解析を既に公表した成果に基づくようにした。
腫瘍接種後64日目に、マウスを犠牲にし、NT−2腫瘍を外科的に切り離し、OCT寒剤中で凍結保存し、凍結切片を作製し8〜10mmの厚さの切片を提供した。免疫蛍光のために、サンプルを解凍し、4%のホルマリンを使用して固定した。ブロッキング(2.4G2コンディショニングした培地/10%のFBS/5%の正常なラットおよびマウス血清)した後、ブロッキング溶液内で一次抗体を用いて加湿チャンバー内で37℃にて1時間切片を染色した。一次染色に対して使用したのと同一の手順に従って、二次抗体を用いてサンプルを染色した。製造業者の取扱説明書によりDAPI(Invitrogen)染色を実施した。HIF−1aに対する細胞内染色をPBS/0.1%のTween/1%のBSA溶液中で行った。退色防止剤入りの封入溶液(Biomeda)を使用してスライドにカバーグラスをかけ、24時間硬化させ、Spot Imageソフトウェア(vs.2006)およびBX51シリーズOlympus蛍光顕微鏡を使用して撮像するまで4℃にて保持した。Spot Imageソフトウェアを使用して画像マージし、Image Proソフトウェア(vs.2006)を使用してROIをゲーティングした後で定量化を実施した。すべての画像は、同じ露出時間に対してキャプチャした3つの異なるチャネルのシリーズをマージした。抗CD31を使用する微小血管密度の定量化のために、発明者らはマウス腫瘍モデル内のMVD測定のために類似の戦略を使用して、解析を既に公表した成果に基づくようにした。
転移研究および生物発光撮像
マウスに合計3回のワクチン接種を行い、最終ワクチン接種の7日後、組込まれたルシフェラーゼレポーター遺伝子(4T1−Luc)を発現する50,000の4T1細胞を静脈内に注射した。撮像の前に対応する基質である200μlのPBS中のD−ルシフェリンを5〜10mg/マウスにて腹腔内に注射した。麻酔に続いてケタミン(80mg/kg)/キシラジン(12mg/kg)(Sigma、米国ミズーリ州St.Louis)腹腔内注射下で、マウスをXenogen IVIS撮像システム(X−100)(Xenogen Corporation、米国カリフォルニア州Alameda)の暗いチャンバー内に定置した。CCDカメラを用いて写真画像および蛍光画像をキャプチャし、XenogenからのLiving Imageソフトウェア(バージョン2.11)を使用して製造業者の取扱説明書に従って蛍光輝度を定量した。長手方向撮像を少なくとも腫瘍接種後4週間まで毎週実施した。すべてのマウスを同じ露出および露光時間で撮像した。画像は標準化した画像を示す。病理学研究のために、肺組織を除いて同一の実験を実施した。肺組織は灌流し、抽出し、ワックス包埋し、腫瘍の計数を行う(手作業で)前にH+Eを用いて染色した。
マウスに合計3回のワクチン接種を行い、最終ワクチン接種の7日後、組込まれたルシフェラーゼレポーター遺伝子(4T1−Luc)を発現する50,000の4T1細胞を静脈内に注射した。撮像の前に対応する基質である200μlのPBS中のD−ルシフェリンを5〜10mg/マウスにて腹腔内に注射した。麻酔に続いてケタミン(80mg/kg)/キシラジン(12mg/kg)(Sigma、米国ミズーリ州St.Louis)腹腔内注射下で、マウスをXenogen IVIS撮像システム(X−100)(Xenogen Corporation、米国カリフォルニア州Alameda)の暗いチャンバー内に定置した。CCDカメラを用いて写真画像および蛍光画像をキャプチャし、XenogenからのLiving Imageソフトウェア(バージョン2.11)を使用して製造業者の取扱説明書に従って蛍光輝度を定量した。長手方向撮像を少なくとも腫瘍接種後4週間まで毎週実施した。すべてのマウスを同じ露出および露光時間で撮像した。画像は標準化した画像を示す。病理学研究のために、肺組織を除いて同一の実験を実施した。肺組織は灌流し、抽出し、ワックス包埋し、腫瘍の計数を行う(手作業で)前にH+Eを用いて染色した。
妊娠および創傷治癒安全性研究。
生後6〜8週のメスのFVB/Nマウスに対照LmワクチンまたはLm−LLO−Flk−1ワクチンの何れかを3週連続して免疫化した。4週目に安全性研究を実施した。妊娠および生殖能力について、1群当たり5匹のマウスを個別に収容していたオスと交尾させた。交尾をモニターし、膣栓の存在によって確認した。懐胎時に、誕生時の子の体重および一腹の総数を測定した。この研究で利用した創傷治癒アッセイを前述した方法に従って行った。簡潔に述べると、マウスに麻酔をかけ、毛を除去し、皮膚を無菌ワイプで洗浄した。滅菌した生検ツール(Acuderm)を使用して2つの円形状の直径3mmの創傷を皮膚から打ち抜いた。創傷は処置されず、感染は見られなかった。創傷閉鎖までの平均時間をモニターし、目に見えるかさぶたを残さずに傷跡が形成されたとき完了したと見なした。
生後6〜8週のメスのFVB/Nマウスに対照LmワクチンまたはLm−LLO−Flk−1ワクチンの何れかを3週連続して免疫化した。4週目に安全性研究を実施した。妊娠および生殖能力について、1群当たり5匹のマウスを個別に収容していたオスと交尾させた。交尾をモニターし、膣栓の存在によって確認した。懐胎時に、誕生時の子の体重および一腹の総数を測定した。この研究で利用した創傷治癒アッセイを前述した方法に従って行った。簡潔に述べると、マウスに麻酔をかけ、毛を除去し、皮膚を無菌ワイプで洗浄した。滅菌した生検ツール(Acuderm)を使用して2つの円形状の直径3mmの創傷を皮膚から打ち抜いた。創傷は処置されず、感染は見られなかった。創傷閉鎖までの平均時間をモニターし、目に見えるかさぶたを残さずに傷跡が形成されたとき完了したと見なした。
統計的解析および定量化の方法。
非パラメトリックなマン・ホイットニー検定を使用してデータを解析した。すべての生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用した。すべての統計的解析はPrismソフトウェアvs.4.0a(2006)を用いて行った。統計的有意性はp<0.05の値に基づいている。発明者らは、すべての非−トランスジェニック研究で1群当たり少なくとも8匹のマウスを含んだ。すべての研究を少なくとも1回繰り返した。
<実施例28>
非パラメトリックなマン・ホイットニー検定を使用してデータを解析した。すべての生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用した。すべての統計的解析はPrismソフトウェアvs.4.0a(2006)を用いて行った。統計的有意性はp<0.05の値に基づいている。発明者らは、すべての非−トランスジェニック研究で1群当たり少なくとも8匹のマウスを含んだ。すべての研究を少なくとも1回繰り返した。
<実施例28>
LLO−FLK−1構築体の構築
各々Flk−1の異なる領域を含有する合計3つの構築体、E1(AA68〜277)、E2(AA545〜730)およびI1(792〜1081)を試験した(図49A)。領域を予測されるエピトープに基づいて選択した。発明者らはこれらのワクチンをFVB/Nベースの乳ガンモデルで試験することに興味があるので、試験に使用されるモデルハプロタイプのために最も適切であることになる断片をクローンすることを決定した(すなわち、FVB/N、H2q)。選択されたE1、E2、およびI1領域はH−2qマウスMHC Iハプロタイプのためにいくつかの潜在的なエピトープを含有していた(図50A)。
各々Flk−1の異なる領域を含有する合計3つの構築体、E1(AA68〜277)、E2(AA545〜730)およびI1(792〜1081)を試験した(図49A)。領域を予測されるエピトープに基づいて選択した。発明者らはこれらのワクチンをFVB/Nベースの乳ガンモデルで試験することに興味があるので、試験に使用されるモデルハプロタイプのために最も適切であることになる断片をクローンすることを決定した(すなわち、FVB/N、H2q)。選択されたE1、E2、およびI1領域はH−2qマウスMHC Iハプロタイプのためにいくつかの潜在的なエピトープを含有していた(図50A)。
各々の断片を切断LLOタンパク質を有する融合タンパク質としてクローニングした(図49A)。LLO−Flk−1融合タンパク質がLm−LLO−Flk−1構築体によって生産および分泌されたかどうかを試験するために、発明者らは培養上清からのタンパク質を 多クローン性の抗PEST抗体(図49B下図)または抗LLO抗体(図49B上図)を使用してウエスタンブロット(図49B)によって解析した。各々の融合構築体のための帯域は、LLO−Flk−E1(〜81kDa)、LLO−Flk−E2(〜78kDa)、およびLLO−Flk−I1(〜89kDa)を検出した。60〜70kDa程度の帯域は内因性のLLOであり、切断融合タンパク質LLOは60〜50kDa程度であることが見出された。発明者らの融合タンパク質がLLO−Flkにリンクしていることを示すために抗LLOブロットが対照として使用される。J774A.1マクロファージでの複製によって証明されるように、3つの構築体すべてがファゴリソソームを感染、増殖、およびエスケープすることができる(図50D)。また、各々のワクチンをマウスのクローニングされたFlk−1領域に対して、IFN−g脾細胞応答によって示されるようにエキソビボで免疫化することもできた(図49C)。これらのFVB/N ELISpot実験で再チャレンジのために使用されたペプチドを、本来は免疫優勢Flk−1エピトープとしてH2dBalb/cマウス内でマッピングした。おそらくH2d分子とH2q分子との高い相同性に起因して、H2dを識別したエピトープはH2qエピトープとして機能することもできるので、発明者らはH2dマッピングしたエピトープをH2qモデルで日常的に使用する。
<実施例29>
<実施例29>
HER−2/NEUを発現する腫瘍モデル内でのLM−LLO−FLK−1ワクチンの治療的な有効性
発明者らのワクチンのHer−2/neu+乳房腫瘍の退行を誘発する能力を試験するために、発明者らは、ラットHer−2/neuを導入遺伝子として過剰発現し、かつ本来FVB/N Her−2/neuトランスジェニックマウス内の自然発生的乳腺腫瘍に由来するNT−2腫瘍モデルを使用した。NT−2細胞株はFlk−1分子を発現せず、したがって発明者らの対象となる抗原は宿主血管系上にのみ位置する。細胞をインビトロで増殖させ、皮下でFVB/Nマウスの脇腹の中へと移植した。4日目に、触知可能な(直径およそ4〜5mm)腫瘍が形成されたときに、マウスにワクチン接種し、次いで合計で3回のワクチン接種を毎週ブーストした。ワクチンFlk−E1およびFlk−I1は退行を誘発することができ、一部のマウスでは移植した腫瘍の完全な撲滅(Flk−E1:2/8、Flk−I1:2/8)を接種後64日目までに誘発することができる(図51A)。しかしながら、Flk−E2は腫瘍増殖を制御することができず、これは対照Lmで処置した群と同様である。完全に退行した腫瘍を有するマウスに腫瘍接種後100日目にNT−2を反対側に用いて再チャレンジし、新しい腫瘍の再増殖は観察されず、寿命の長い抗腫瘍免疫性を示唆する(図52Aおよび図52B)。
発明者らのワクチンのHer−2/neu+乳房腫瘍の退行を誘発する能力を試験するために、発明者らは、ラットHer−2/neuを導入遺伝子として過剰発現し、かつ本来FVB/N Her−2/neuトランスジェニックマウス内の自然発生的乳腺腫瘍に由来するNT−2腫瘍モデルを使用した。NT−2細胞株はFlk−1分子を発現せず、したがって発明者らの対象となる抗原は宿主血管系上にのみ位置する。細胞をインビトロで増殖させ、皮下でFVB/Nマウスの脇腹の中へと移植した。4日目に、触知可能な(直径およそ4〜5mm)腫瘍が形成されたときに、マウスにワクチン接種し、次いで合計で3回のワクチン接種を毎週ブーストした。ワクチンFlk−E1およびFlk−I1は退行を誘発することができ、一部のマウスでは移植した腫瘍の完全な撲滅(Flk−E1:2/8、Flk−I1:2/8)を接種後64日目までに誘発することができる(図51A)。しかしながら、Flk−E2は腫瘍増殖を制御することができず、これは対照Lmで処置した群と同様である。完全に退行した腫瘍を有するマウスに腫瘍接種後100日目にNT−2を反対側に用いて再チャレンジし、新しい腫瘍の再増殖は観察されず、寿命の長い抗腫瘍免疫性を示唆する(図52Aおよび図52B)。
64日目の腫瘍の微小血管密度(MVD)を汎内皮細胞マーカーCD31を用いて染色することによって評価し、また核マーカーDAPIを用いて対比染色した。予想したように、Flk−E2処置群からの腫瘍内のMVDは対照処置されたマウスからのものと似ていた。しかしながら、Flk−I1で処置したマウスでCD31+血管の密度の減少が見られ、Flk−E1ワクチン接種を使用してさらなる減少が観察された(図51C)。CD31+血管のこの減少はFlk−E1およびFlk−I1で処置した群での核低酸素マーカー、低酸素誘導因子−1a(HIF−1a)に対する染色の増加と相関するが、対照群では相関しない(図51D)。腫瘍MVDの減少に加えてこれらのHer−2/neu+腫瘍の退行は、腫瘍血管形成に関与する抗VEGFR2細胞毒性T細胞死滅内皮細胞に起因し、観察された退行の結果として得られる腫瘍損傷または増殖制限につながる可能性があると仮説を立てることができる。これに続いて、貪食された腫瘍の破片が局所の樹状細胞によって排出リンパ節内に交差提示される可能性があり、そのエピトープがFVB/Nマウス内にそれまでにマッピングされた抗Her−2/neu CTLに提示される。この分子間エピトープ拡大が生じると、最大の退行を呈するマウスが抗Her−2/neu CD8+T細胞の高い頻度も有するであろうと期待することになる。この仮説を試験するために、発明者らは64日目のマウスから脾細胞を採取して、Her−2/neuの3つの異なる領域からの3つの既知のエピトープを用いて再チャレンジするIFN−g ELISpotを実施した。発明者らは、以前CTLエピトープをHer−2/neu分子の異なる領域のためにマッピングしたことがあり、インビトロでの刺激および増幅を必要とするいくつかの細胞毒性アッセイとは異なり、ELISpotアッセイは頻度の低い特異的なT細胞を検出するのに十分なだけ敏感なので、抗Her−2/neu応答を測定するためにELISpotアッセイを使用することを決定した。Flk−E1およびFlk−I1が最大のエピトープ拡大を示し、一方でFlk−E2は最低のエピトープ拡大を示し(図51B、*p<0.05)、インビボで見出される腫瘍退行の範囲と強い相関を示すことを発明者らは見出した(図51A)。
<実施例30>
<実施例30>
抗血管形成が誘発する腫瘍退行は内因性の腫瘍抗原へのエピトープ拡大に依存する
Her−2/neuエピトープ拡大の存在は腫瘍退行が抗血管イベントのみに依存するだけでなく、腫瘍抗原Her−2/neuへの免疫応答にも依存する可能性があることを示唆した。この仮説を試験するために、発明者らは2つの最も効能のあるワクチン、Flk−E1およびFlk−I1を使用して同じ実験を繰り返したが、野生型FVB/Nマウスの接種に加えて、その同系の祖先株、FVB/N Her−2/neuトランスジェニックの中へと皮下でNT−2細胞も注射した。これはラットHer−2/neu分子に対する強い耐性を提示する。この場合も、以前示したように、Flk−E1およびFlk−I1は野生型FVB/Nマウスの中でNT−2腫瘍の増殖を減速した(図53A、左パネル)。しかしながら、抗Her−2/neu応答が耐性によって限られているトランスジェニック宿主では、発明者らはすべての腫瘍の結果を観察した(図53A、右のパネル)。Flk−E1ワクチン接種に対して示されるように(図53C)、これらの両方の結果が脾臓内および腫瘍部位において実証された内因性のHer−2/neuタンパク質に対して観察されるエピトープ拡大に影響を与える(図53B)。このことは腫瘍退行のためには抗血管イベントは十分でないが、腫瘍死および最終的な退行のためにはむしろ腫瘍の血管系へと直接腫瘍細胞へとの両方を組み合わせた効果が必要とされることを示唆する。
<実施例31>
Her−2/neuエピトープ拡大の存在は腫瘍退行が抗血管イベントのみに依存するだけでなく、腫瘍抗原Her−2/neuへの免疫応答にも依存する可能性があることを示唆した。この仮説を試験するために、発明者らは2つの最も効能のあるワクチン、Flk−E1およびFlk−I1を使用して同じ実験を繰り返したが、野生型FVB/Nマウスの接種に加えて、その同系の祖先株、FVB/N Her−2/neuトランスジェニックの中へと皮下でNT−2細胞も注射した。これはラットHer−2/neu分子に対する強い耐性を提示する。この場合も、以前示したように、Flk−E1およびFlk−I1は野生型FVB/Nマウスの中でNT−2腫瘍の増殖を減速した(図53A、左パネル)。しかしながら、抗Her−2/neu応答が耐性によって限られているトランスジェニック宿主では、発明者らはすべての腫瘍の結果を観察した(図53A、右のパネル)。Flk−E1ワクチン接種に対して示されるように(図53C)、これらの両方の結果が脾臓内および腫瘍部位において実証された内因性のHer−2/neuタンパク質に対して観察されるエピトープ拡大に影響を与える(図53B)。このことは腫瘍退行のためには抗血管イベントは十分でないが、腫瘍死および最終的な退行のためにはむしろ腫瘍の血管系へと直接腫瘍細胞へとの両方を組み合わせた効果が必要とされることを示唆する。
<実施例31>
LM−LLO−FLK−1ワクチン断片を用いたワクチン接種が実験的転移の増殖を防止する
抗血管形成ワクチンに対する重要な使用目的は乳ガン転移の治療または防止とすることができる。転移する腫瘍細胞は、新しい血管の発生に高度に依存しているが、より小さい腫瘍は新しい血管系に完全に依存してはいない。しかしながら、腫瘍がある特定のサイズを超えて増殖すると、新しい血管の形成に高度に依存するようになり、したがって抗VEGFR2 CTLに対する標的とすることができるようになるという仮説が立てられている。発明者らのワクチンが乳房の腫瘍の解離に対して保護することができるかどうかを試験するために、インビトロで培養された腫瘍細胞のマウスの尾静脈の中への直接接種を含む実験的転移システムを使用して、いくつかの下流器官、特に肺を急速にコロニー化した。NT−2モデルは尾静脈ワクチン接種後肺をうまくコロニー化しなかったので(データ図示せず)、Balb/cマウスからの侵攻性のマウスの乳ガン細胞株である4T1を使用した。Lm−LLO−Flk−E1、もしくはLm−LLO−Flk−I1、または対照Lmワクチンのいずれかを用いてBalb/cマウスに3週間の間に3回免疫化した。次いでマウスに50,000の4T1細胞を静脈内に注射し、同じ動物に皮下でも注射した。皮下部位注射を実施し、これにより原発性腫瘍増殖を測定することができるが、一方で静脈注射は転移を模倣したものである。Flk−1ワクチンで処置したマウスは対照マウスと比較して、腫瘍増殖が長くなり、原発性皮下腫瘍サイズが遅くなり、生存しているものが増加し、罹患率が減少した(図54)。原発性4T1腫瘍に対して見られるような不良な応答とは異なり、シーディング速度および各々の動物の中に見出された転移の総数は、対照マウスと比較して処置した動物では著しく低かった(図55A)。おそらく4T1がマウスHer−2/neuを弱く発現するため、Her−2/neuへのエピトープ拡大の低いレベルが観察された(図55B)。
抗血管形成ワクチンに対する重要な使用目的は乳ガン転移の治療または防止とすることができる。転移する腫瘍細胞は、新しい血管の発生に高度に依存しているが、より小さい腫瘍は新しい血管系に完全に依存してはいない。しかしながら、腫瘍がある特定のサイズを超えて増殖すると、新しい血管の形成に高度に依存するようになり、したがって抗VEGFR2 CTLに対する標的とすることができるようになるという仮説が立てられている。発明者らのワクチンが乳房の腫瘍の解離に対して保護することができるかどうかを試験するために、インビトロで培養された腫瘍細胞のマウスの尾静脈の中への直接接種を含む実験的転移システムを使用して、いくつかの下流器官、特に肺を急速にコロニー化した。NT−2モデルは尾静脈ワクチン接種後肺をうまくコロニー化しなかったので(データ図示せず)、Balb/cマウスからの侵攻性のマウスの乳ガン細胞株である4T1を使用した。Lm−LLO−Flk−E1、もしくはLm−LLO−Flk−I1、または対照Lmワクチンのいずれかを用いてBalb/cマウスに3週間の間に3回免疫化した。次いでマウスに50,000の4T1細胞を静脈内に注射し、同じ動物に皮下でも注射した。皮下部位注射を実施し、これにより原発性腫瘍増殖を測定することができるが、一方で静脈注射は転移を模倣したものである。Flk−1ワクチンで処置したマウスは対照マウスと比較して、腫瘍増殖が長くなり、原発性皮下腫瘍サイズが遅くなり、生存しているものが増加し、罹患率が減少した(図54)。原発性4T1腫瘍に対して見られるような不良な応答とは異なり、シーディング速度および各々の動物の中に見出された転移の総数は、対照マウスと比較して処置した動物では著しく低かった(図55A)。おそらく4T1がマウスHer−2/neuを弱く発現するため、Her−2/neuへのエピトープ拡大の低いレベルが観察された(図55B)。
Flk−1に対する免疫化が実験的転移を用いた肺組織のシーディングを防止することができるという仮説をより厳しく試験するために、非侵襲性撮像を使用して個別の腫瘍細胞および質量を可視化することができる生物発光モデルを使用した。Lm−Flk−E1および−I1ワクチンを用いた数ラウンドのワクチン接種の後、蛍ルシフェラーゼ遺伝子(4T1−Luc)を発現する50,000の4T1細胞をマウスに静脈注射した。毎週、マウスに麻酔をかけ、ルシフェラーゼ基材(D−ルシフェリン)を注射し、かつ撮像した。肺シーディングは11日目までに明らかになり、対照処置したマウスは25日目までに4T1−Luc細胞によって迅速にコロニー化した状態になったが、Lm−LLO−Flk−E1およびLm−LLO−Flk−I1で処置したマウスのいずれも少なくとも32日目まで肺シーディングのいかなる兆候も示さず、この時点で対照で処置したマウスは病気になり、犠牲にされた(図55C)。32日目には、Flk−1でワクチン接種したマウスのうちの25%のみが何らかの肺腫瘍を示した。Lm−Flk−E1処置群については、腫瘍細胞に対するシグナルが25日目には観察されたが、32日目には観察されなかったので、この時点ではこの生物発光法によっては腫瘍質量は検出不可能であった可能性がある。25日目のこの非常に小さいシグナルは1000細胞の閾値より低く、後続の週の間に一部の細胞質量を失ってシステムに対する検出限界より下に下がっている可能性がある。対照Lmを用いて免疫化したマウスは肺腫瘍によって急速に疾病になったが、Flk−E1およびFlk−I1 Lmワクチン接種は腫瘍量、進行する時間(対照で処置したものの25日目に対してFlk−1で処置したものは32日目)、および最終的な疾患(図54に示すような罹患率の減少)を遅延した。
<実施例32>
<実施例32>
FLK−1を用いた免疫化はマウスでは創傷治癒、妊娠、または生殖能力に影響を有しない
Lm−LLO−Flk−1ワクチンが血管形成阻害と関連付けられる毒性を生じるかどうかを評価するために、発明者らは免疫化マウスでの創傷治癒、妊娠、および生殖能力を研究した。マウスに、交尾する前または滅菌創傷パンチを行う前に、Lm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−E2、Lm−LLO−Flk−I1、対照Lm、または生理食塩水単独を用いて3回免疫化した。発明者らは交尾したマウスを交尾から懐胎までの長さの間、平均の子の体重、および一腹の総数を観察した。創傷パンチは滅菌であったが、マウスは一緒にケージに入れていた。前述される方法に従って創傷治癒技法が後に続いた。各々の免疫化群からの5匹のマウスの毛を剃り、1匹の動物当たり2つの滅菌した創傷パンチを行い、次いで経時的に治癒させた。創傷閉鎖の時間を測定した。創傷閉鎖の時にかさぶたが残っておらず、完全な創傷治癒の完了と見なした。Lm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−E2、またはLm−LLO−Flk−I1を用いた免疫化は、生殖能力、懐胎長さ、または誕生時の子の体重には影響を有しない(図56A)。同様に、免疫化は創傷閉鎖に必要な時間に有意な影響を有しない(図56B)。
Lm−LLO−Flk−1ワクチンが血管形成阻害と関連付けられる毒性を生じるかどうかを評価するために、発明者らは免疫化マウスでの創傷治癒、妊娠、および生殖能力を研究した。マウスに、交尾する前または滅菌創傷パンチを行う前に、Lm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−E2、Lm−LLO−Flk−I1、対照Lm、または生理食塩水単独を用いて3回免疫化した。発明者らは交尾したマウスを交尾から懐胎までの長さの間、平均の子の体重、および一腹の総数を観察した。創傷パンチは滅菌であったが、マウスは一緒にケージに入れていた。前述される方法に従って創傷治癒技法が後に続いた。各々の免疫化群からの5匹のマウスの毛を剃り、1匹の動物当たり2つの滅菌した創傷パンチを行い、次いで経時的に治癒させた。創傷閉鎖の時間を測定した。創傷閉鎖の時にかさぶたが残っておらず、完全な創傷治癒の完了と見なした。Lm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−E2、またはLm−LLO−Flk−I1を用いた免疫化は、生殖能力、懐胎長さ、または誕生時の子の体重には影響を有しない(図56A)。同様に、免疫化は創傷閉鎖に必要な時間に有意な影響を有しない(図56B)。
Flk−I1の免疫化の後で観察されたHer−2/neuへの免疫応答がFlk−1とHer−2/neuとの間の共有するエピトープ間の交差反応に起因するかどうかを評価するために、Flk−I1ワクチンを用いて免疫化したFVB/NマウスをFLK−I1839−848への免疫性について評価した。これはラットHer−2/neuエピトープGSGAFGTVYK(配列番号:99)に対して交差反応性である。Lm−LLO−Flk−I1を用いたマウスのワクチン接種は、それまでにマッピングしたFlk−I1エピトープPGGPLMVIV(配列番号:102)に対する優れた応答につながる。しかしながら、マウスFlk−I1839−848エピトープまたは相同性ラットHer−2/neu IC1732−741エピトープのいずれかに対する有意な応答は見られなかった(図57)。したがってFlk−I1の免疫化後に観察されたHer−2/neuへの免疫応答は、エピトープ拡大に起因する可能性が最も高く、共有エピトープ間の交差反応に起因するものではない。
まとめると、Lm−LLO−Flk−1ワクチンは、一部の定着した乳房の腫瘍を撲滅し、残りの腫瘍内の微小血管密度を減少し、腫瘍の再チャレンジおよび実験的転移に対して保護し、腫瘍に関連する抗原Her−2/neuの様々な領域へのエピトープ拡大を誘発することができる。腫瘍撲滅はHer−2/neuへのエピトープ拡大に依存し、腫瘍血管系の減少のみに起因するのではないことが見出された。しかしながら、ワクチン有効性は通常の創傷治癒には影響せず、また妊娠に関する毒性の副作用も有しない。したがって、抗血管形成ワクチンは内因性の腫瘍タンパク質へのエピトープ拡大を駆動する宿主血管系に対する耐性を克服することができ、活性腫瘍の退行を促進する。したがって、単一のワクチンを使用して腫瘍血管系および内因性の腫瘍抗原(Her−2/neu)との両方を標的化する新規の方法を本明細書に提示した。
<実施例33>
<実施例33>
エスケープ突然変異体中に生じる突然変異
マウス
FVB/N Her−2/neuトランスジェニックマウスは、University of Pennsylvaniaの実験動物コア施設で収容および飼育された。マウスは実験開始に際して使用されるとき生後6〜8週間であり、実験はUniversity of Pennsylvaniaの研究機関動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)の規制に従って行われた。
マウス
FVB/N Her−2/neuトランスジェニックマウスは、University of Pennsylvaniaの実験動物コア施設で収容および飼育された。マウスは実験開始に際して使用されるとき生後6〜8週間であり、実験はUniversity of Pennsylvaniaの研究機関動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)の規制に従って行われた。
リステリアワクチン株。
使用された株は、Lm−LLO−Flk−E1およびLm−LLO−Flk−I1である。株Lm−LLO−NYESO1を抗原特異性のための第三者対照ワクチンとして使用した。細菌を34μg/mLのクロラムフェニコールおよび250μg/mLのストレプトマイシンを用いて補助されたブレインハートインフージョン(BHI、Difco)プレート上で選択し、次いで培養液内で増殖し、−80℃にて1mLのアリコートで凍結した。注射のために、投与の前にワクチンを滅菌PBSを用いて2回洗浄した。
使用された株は、Lm−LLO−Flk−E1およびLm−LLO−Flk−I1である。株Lm−LLO−NYESO1を抗原特異性のための第三者対照ワクチンとして使用した。細菌を34μg/mLのクロラムフェニコールおよび250μg/mLのストレプトマイシンを用いて補助されたブレインハートインフージョン(BHI、Difco)プレート上で選択し、次いで培養液内で増殖し、−80℃にて1mLのアリコートで凍結した。注射のために、投与の前にワクチンを滅菌PBSを用いて2回洗浄した。
自発性腫瘍保護。
抗Flk−1リステリアワクチンが自然発生的に生じる腫瘍に影響する能力を試験するために、発明者らはラットHer−2/neu分子を過剰発現して乳腺腫瘍を自然発生するメスのFVB/NラットHer−2/neuトランスジェニックマウスを使用した。これらの長期間保護研究のために、メスのマウス(N=15)に生後6週に開始して合計6回免疫化し、3週間ごとに生後21週まで腹腔内で免疫化した。ワクチンLm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−I1、またはLm−LLO−NYESO−1を0.1LD50でPBS中に懸濁させて注射した。腫瘍量を毎週追跡した。腫瘍のサイズが10mmを超えると、動物を犠牲にして、腫瘍解析のために取り出した。GraphPad Prismソフトウェアを使用するカプラン・マイヤーログランク検定を使用して、各々のワクチン群と対照群との間の腫瘍増殖の発症の時点を比較して、自発性の腫瘍増殖の差異の統計的解析を行った。
抗Flk−1リステリアワクチンが自然発生的に生じる腫瘍に影響する能力を試験するために、発明者らはラットHer−2/neu分子を過剰発現して乳腺腫瘍を自然発生するメスのFVB/NラットHer−2/neuトランスジェニックマウスを使用した。これらの長期間保護研究のために、メスのマウス(N=15)に生後6週に開始して合計6回免疫化し、3週間ごとに生後21週まで腹腔内で免疫化した。ワクチンLm−LLO−Flk−E1、Lm−LLO−Flk−I1、またはLm−LLO−NYESO−1を0.1LD50でPBS中に懸濁させて注射した。腫瘍量を毎週追跡した。腫瘍のサイズが10mmを超えると、動物を犠牲にして、腫瘍解析のために取り出した。GraphPad Prismソフトウェアを使用するカプラン・マイヤーログランク検定を使用して、各々のワクチン群と対照群との間の腫瘍増殖の発症の時点を比較して、自発性の腫瘍増殖の差異の統計的解析を行った。
突然変異の解析およびマッピング。
腫瘍を新鮮なまま切り離し、RNAlater溶液の中へと定置し、4℃にて2週間未満の間保存する。保存された腫瘍からをQiagen mRNAキット(Invitrogen)使用してmRNAを抽出し、次いでPCRを介してcDNAを生成した。他のところ(Singh、2007)に記述されるように、個別のPCRサンプルをさらに分割してHer−2/neuの各々の個別の断片を、各々500〜800bpのストレッチ(EC1、EC2、EC3、IC1、IC2)で配列決定できるようにした。配列決定はChildren’s Hospital of Philadelphia(CHOP)のシークエンシング施設によって行い、次いで4Peaksソフトウェア1.7.2を使用して解析した。4つ以上の個別のPCRおよび配列決定の反応で発生しなかった突然変異は、PCRが誘発した突然変異として破棄した。MacPyMolを使用して分子モデリングを行った。
腫瘍を新鮮なまま切り離し、RNAlater溶液の中へと定置し、4℃にて2週間未満の間保存する。保存された腫瘍からをQiagen mRNAキット(Invitrogen)使用してmRNAを抽出し、次いでPCRを介してcDNAを生成した。他のところ(Singh、2007)に記述されるように、個別のPCRサンプルをさらに分割してHer−2/neuの各々の個別の断片を、各々500〜800bpのストレッチ(EC1、EC2、EC3、IC1、IC2)で配列決定できるようにした。配列決定はChildren’s Hospital of Philadelphia(CHOP)のシークエンシング施設によって行い、次いで4Peaksソフトウェア1.7.2を使用して解析した。4つ以上の個別のPCRおよび配列決定の反応で発生しなかった突然変異は、PCRが誘発した突然変異として破棄した。MacPyMolを使用して分子モデリングを行った。
PCRプライマー配列:
EC1 FP:AGGGCTGTCAGGTAGTGC(配列番号:110)
EC1 RP:TGACCTCTTGGTTATTCG(配列番号:111)
EC2 FP:ACCTGCCCCTACAACTAC(配列番号:112)
EC2 RP:GACGCCCTCTACAGTTGC(配列番号:113)
EC3 FP:GTGGATTGGCTCTGATTC(配列番号:114)
EC3 RP:TGAGTTACAGACCAAGCC(配列番号:115)
IC1 FP:CAAACGAAGGAGACAGAAG(配列番号:116)
IC1 RP:CACCATCAAACACATCGG(配列番号:117)
IC2 FP:CACTGCTGGAAGATGATG(配列番号:118)
IC2 RP:TTTGTGGCGATGGAGACC(配列番号:119)
EC1 FP:AGGGCTGTCAGGTAGTGC(配列番号:110)
EC1 RP:TGACCTCTTGGTTATTCG(配列番号:111)
EC2 FP:ACCTGCCCCTACAACTAC(配列番号:112)
EC2 RP:GACGCCCTCTACAGTTGC(配列番号:113)
EC3 FP:GTGGATTGGCTCTGATTC(配列番号:114)
EC3 RP:TGAGTTACAGACCAAGCC(配列番号:115)
IC1 FP:CAAACGAAGGAGACAGAAG(配列番号:116)
IC1 RP:CACCATCAAACACATCGG(配列番号:117)
IC2 FP:CACTGCTGGAAGATGATG(配列番号:118)
IC2 RP:TTTGTGGCGATGGAGACC(配列番号:119)
ラットHer−2/neuを発現するトランスジェニックFVB/NマウスにFlk−E1、Flk−I1、または対照Lmを生後6週から3週間ごとにワクチン接種し、最終ワクチン接種後、腫瘍を毎週測定した。対照Lm−ワクチン接種と比較して、Flk−E1およびFlk−I1を用いたワクチン接種は腫瘍を有しないマウスのパーセンテージを増加した。35週と40週との間に、Flk−E1およびFlk−I1をワクチン接種したマウスの中に腫瘍を発生した多数のマウスがいた。各々のマウスからの腫瘍を、突然変異したHer−2/neuメッセージについて調べた。メッセージRNAは収集され、cDNAが合成されかつ配列決定された。結果として得られる配列は、野生型配列と並んで対になり、突然変異した残基を決定する。4回以上生じた突然変異のみを真の突然変異と見なした(図58A)。「ホットスポット」または突然変異した残基のストリングの中の突然変異した残基のうちのいくつかは、それまでにマッピングしたCTLエピトープの中にある。1つのかかるエピトープは、エピトープのH2Dq MHC I分子への固定を担当する主要なアミノ酸の突然変異を示す(図58B)。
<実施例34>
<実施例34>
乳房およびメラノーマ脳転移の標的化
上に記述したような方法を使用して実験を実施した。
上に記述したような方法を使用して実験を実施した。
Balb/cマウスに、抗ヒトHer−2/neuまたは対照ワクチン接種NYESO1のいずれかの各々のワクチンを用いて3回免疫化した。安定して蛍ルシフェラーゼ遺伝子(University of MinnesotaのJohn Ohlfest研究室から入手したEMT6−Luc細胞)を発現するマウスの乳ガン細胞をインビトロで増殖させ、次いで麻酔をかけたマウスの脳の中へとマウス当たり5,000細胞で注射した。低いレベルのマウスにHer−2/neu(データ図示せず)細胞を発現するEMT6−Luc細胞を、示される日に撮像する前に増殖させた。NYESO1−ワクチン接種したマウスでは脳転移が明らかに見られたが、一方で抗ヒトHer−2/neuワクチン接種は転移の実験的導入後3日目、8日目、および11日目では脳腫瘍を制御した(図59A)。
C57Bl/6マウスを抗ヒトHMWMAA−Cまたは対照ワクチン接種NYESO1のいずれかの各ワクチンで3回免疫化した。B16F10−Lucマウスメラノーマ細胞(UCSFのJeff Miller研究室から入手)をインビトロで増殖させ、次いで麻酔をかけたマウスの脳の中へとマウス一匹当たり5,000個の細胞を注射した。B16F10親系統はHMWMAA(人的伝達)を発現せず、したがってHMWMAAの唯一の源は周皮細胞およびグリア細胞である。抗ヒトHMW−MAA−Cを用いたマウスのワクチン接種は転移の実験的導入後11日目および15日目で脳腫瘍を減少した(図59B)。したがって、HMW−MAACまたはHer−2/neuのいずれかを用いたワクチン接種は、腫瘍細胞がHMW−MAAを発現しない場合でさえも脳転移に対して保護的である。
<実施例35>
<実施例35>
新規の抗CD105/エンドグリンリステリアベースのワクチン治療の構築
エンドグリンのやや大きい断片(図60)を発現するLm株の構築体は、LLOに融合されると断片を分泌しないので、2つの新規なLm構築体、Lm−LLO−CD105A(aa17〜319)およびLm−LLO−CD105B(359〜588)へと設計し直された。これらはエンドグリン遺伝子のほぼ全体にわたり(図61A)、かつRANKpepを使用して決定され、以前に標的化されていたエンドグリンの領域の外側にある推定CTLエピトープを含む(図60)。より免疫優性エピトープをこれらの新規の構築体の中に潜在的に含むことによって、CTLエピトープのプールの増幅がワクチン有効性を強化するために使用される。さらに、融合タンパク質をより小さくし、かつ構築体から疎水性の高い領域を除去することによって、これらの融合タンパク質をLmによってよりよく分泌させる。これらの断片をコードする遺伝子はCD105pGG−34の中へとクローニングされる(図61B)。Lm−LLO−CD105A(図62)およびLm−LLO−CD105B(図63)の両方は適切なサイズの断片を発現および分泌した。
<実施例36>
エンドグリンのやや大きい断片(図60)を発現するLm株の構築体は、LLOに融合されると断片を分泌しないので、2つの新規なLm構築体、Lm−LLO−CD105A(aa17〜319)およびLm−LLO−CD105B(359〜588)へと設計し直された。これらはエンドグリン遺伝子のほぼ全体にわたり(図61A)、かつRANKpepを使用して決定され、以前に標的化されていたエンドグリンの領域の外側にある推定CTLエピトープを含む(図60)。より免疫優性エピトープをこれらの新規の構築体の中に潜在的に含むことによって、CTLエピトープのプールの増幅がワクチン有効性を強化するために使用される。さらに、融合タンパク質をより小さくし、かつ構築体から疎水性の高い領域を除去することによって、これらの融合タンパク質をLmによってよりよく分泌させる。これらの断片をコードする遺伝子はCD105pGG−34の中へとクローニングされる(図61B)。Lm−LLO−CD105A(図62)およびLm−LLO−CD105B(図63)の両方は適切なサイズの断片を発現および分泌した。
<実施例36>
LM−LLO−CD105AおよびBがBALB/Cマウス内の乳房腫瘍4T1の原発性増殖および転移性増殖に対して影響を及ぼす
BALB/cマウスの4T1乳房腫瘍、乳腺の中へと移植すると急速に転移するので、より悪性である乳房腫瘍モデルを実施例8に示すワクチンの最初の試験として選択した。2×1054T1細胞をBalb/cマウスの乳房脂肪体内に移植した。1日目、8日目、および15日目、または4日目、11日目、および18日目のいずれかに、マウスに2×108cfuの各々のワクチンを用いてワクチン接種した。無処置マウスまたは対照をワクチン接種したマウスと比較すると、両方のワクチン療法は腫瘍増殖の著しい減速を示した(図64)。32日目には、マウスを犠牲にして、その肺を取り出して転移性拡散について調べた。興味深いことに、肺表面の転移でLm−LLO−CD105Bのみが統計的に有意な減少を示した(図65)。
BALB/cマウスの4T1乳房腫瘍、乳腺の中へと移植すると急速に転移するので、より悪性である乳房腫瘍モデルを実施例8に示すワクチンの最初の試験として選択した。2×1054T1細胞をBalb/cマウスの乳房脂肪体内に移植した。1日目、8日目、および15日目、または4日目、11日目、および18日目のいずれかに、マウスに2×108cfuの各々のワクチンを用いてワクチン接種した。無処置マウスまたは対照をワクチン接種したマウスと比較すると、両方のワクチン療法は腫瘍増殖の著しい減速を示した(図64)。32日目には、マウスを犠牲にして、その肺を取り出して転移性拡散について調べた。興味深いことに、肺表面の転移でLm−LLO−CD105Bのみが統計的に有意な減少を示した(図65)。
次に、これらのマウスでCTL応答を調べた。最初の試みとして、CD8+T細胞によって識別することができるエンドグリン分子の免疫原性領域を決定するために、2つの断片をRANKpep(http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/)およびSYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)による解析に供した。これから2つの最も有望なペプチド、CD105Aに対して:AGPRTVTVM(配列番号:120)(Ddbinder)、CD105Bに対して:AYSSCGMKV(配列番号:121)(Kdバインダー)が選択された。エンドグリン配列内でのこれらの位置は、図61Aで下線付きとした。
4日目、11日目、および18日目、最後のワクチン接種に続く4日間にワクチン接種した、図16Bに示すマウスから取った脾細胞を刺激するためにこれら2つのペプチドをELISpot解析に使用した。しかしながら、HIV Gagからの対照のH−2d制限ペプチドと比較して、これらはインターフェロンγを分泌するT細胞を刺激しなかった。このことはこれらがCTLエピトープでないことを示唆する(図55)。4T1によって低いレベルで発現される2つの内因性の腫瘍抗原へのエピトープ拡大も解析した。第1のものは、内因性のエコトロピックマウスの白血病ウイルスからのエンベロープ糖タンパク質、gp70である。gp70由来のLd制限を有するAH1と呼ばれるエピトープ、SPSYVYHQF(配列番号:122)をBalb/cマウスに対してマッピングした。興味深いことに、Lm−LLO−CD105AとBとの両方がこの抗原へのエピトープ拡大を誘発したことが見出された。Her−2/neuへのエピトープ拡大も調査された。Her−2/neu、EC1、およびEC2の細胞外ドメイン内の2つの既知のエピトープ、ならびに細胞内ドメインからのものを使用した。対照ワクチンLm−LLO−NY−ESO−1と比較していずれのエンドグリンワクチンについてもIFN−γ ELISpotsのIC1に対する有意な増加はないことが観察されたが、Lm−LLO−CD105Aワクチンを使用するEC1およびEC2への拡散が見られた(図65)。
マウスからの腫瘍を抗原特異的な浸潤性T細胞について調べ、これからHer−2/neuおよびgp70特異的なT細胞のために脾細胞を採取し、FACSおよび四量体解析を使用した。EC1、EC2、およびAH1特異的な腫瘍内のT細胞の著しい増加が観察され、またLm−LLO−CD105ワクチン接種したマウスからのIC1特異的なT細胞の、Lm−LLO−NY−ESO−1でワクチン接種したものと比較すると控えめな増加も観察された(図66)。
<実施例37>
<実施例37>
FVB HER−2/NEUトランスジェニックマウスに由来するHER−2/NEU陽性の乳房腫瘍NT2の増殖に影響するためのLM−LLO−CD105AおよびBの使用に関する研究
移植可能なHer−2/neu腫瘍NT2を使用してエンドグリンワクチンをFVBマウス内の他の乳房の腫瘍モデルで試験した。さらに、1×106腫瘍細胞をFVBマウスに皮下で移植して、これらに4日目、11日目、および18日目に2×108cfuの各々のワクチンでLm−LLO−CD105AおよびBを用いて免疫化した。対照ワクチンとしてLm−LLO−NY−ESO−1を使用した。両方のワクチンは腫瘍増殖に有意な影響を受け(図67)、60日目には、ワクチン接種していない群またはLm−LLO−NYESO1を用いてワクチン接種した群では腫瘍がないものがいなかったのと比較して、Lm−LLO−CD105Aを用いて免疫化したマウスの50%には腫瘍がなく、Lm−LLO−CD105Bを用いてワクチン接種したマウスの25%には腫瘍がなかった。
<実施例38>
移植可能なHer−2/neu腫瘍NT2を使用してエンドグリンワクチンをFVBマウス内の他の乳房の腫瘍モデルで試験した。さらに、1×106腫瘍細胞をFVBマウスに皮下で移植して、これらに4日目、11日目、および18日目に2×108cfuの各々のワクチンでLm−LLO−CD105AおよびBを用いて免疫化した。対照ワクチンとしてLm−LLO−NY−ESO−1を使用した。両方のワクチンは腫瘍増殖に有意な影響を受け(図67)、60日目には、ワクチン接種していない群またはLm−LLO−NYESO1を用いてワクチン接種した群では腫瘍がないものがいなかったのと比較して、Lm−LLO−CD105Aを用いて免疫化したマウスの50%には腫瘍がなく、Lm−LLO−CD105Bを用いてワクチン接種したマウスの25%には腫瘍がなかった。
<実施例38>
LLOコレステロール結合ドメインの部位特異的突然変異生成
CBD内に不活性化点突然変異を導入するために、以下の戦略を使用して、部位特異的な突然変異誘発をLLOに対して実施した。結果として得られるタンパク質は、「mutLLO」と称される。
CBD内に不活性化点突然変異を導入するために、以下の戦略を使用して、部位特異的な突然変異誘発をLLOに対して実施した。結果として得られるタンパク質は、「mutLLO」と称される。
LLOのpET29bの中へのサブクローニング
野生型LLOのアミノ酸配列は、
である。シグナルペプチドおよびコレステロール結合ドメイン(CBD)は下線付きであり、CBD内の3つの重要な残基(C484、W491、およびW492)は太字の斜字体である。
野生型LLOのアミノ酸配列は、
6×Hisタグ(HHHHHH)を、LLOのC末端領域に追加した。Hisタグ付きLLOのアミノ酸配列は、
であった。
Hisタグ付きLLOタンパク質をコードする遺伝子をNdeI/BamHIを用いて消化して、NdeI/BamHIをNdeI部位とBamHI部位との間の発現ベクターpET29bの中へとサブクローンした。LLOタンパク質をコードする遺伝子の配列は、
である。下線付き配列は、配列の最初から順に、NdeI部位、NheI部位、CBGコードする領域、6×Hisタグ、およびBamHI部位である。次の工程で突然変異するように常在するCBDは太字斜字体である。
重なった延長部による接合(SOE)PCR
重なった延長部による接合(SOE)PCR
工程1:PCR反応#1および#2をpET29b−LLOテンプレート上で実施した。プライマー#1および#2を利用するPCR反応#1は、CBDへの突然変異の導入を含む、NheI部位とCBDとの間の断片を増幅した。プライマー#3および#4を利用するPCR反応#2は、CBDへの同じ突然変異の導入を含む、CBDとBamHI部位との間の断片を増幅した(図69A)。
PCR反応#1サイクル:A)94℃にて2分30秒、B)94℃にて30秒、C)55℃にて30秒、D)72℃にて1分、工程B〜Dを29回繰り返す(合計30サイクル)、E)72℃にて10分。
PCR反応#2サイクル:A)94℃にて2分30秒、B)94℃にて30秒、C)60℃にて30秒、D)72℃にて1分、工程B〜Dを29回繰り返す(合計30サイクル)、E)72℃にて10分。
工程2:PCR反応#1および#2の産物を混合し、アニールさせ(突然変異したCBDをコードする領域において)、プライマー#1および#4を用いてPCRをさらに25サイクル実施した(図8B)。PCR反応サイクル:A)94℃にて2分30秒、B)94℃にて30秒、C)72℃にて1分、工程B〜Cを9回繰り返す(合計10サイクル)、プライマー#1および#4を追加する、D)94℃にて30秒、E)55℃にて30秒、F)72℃にて1分、工程D〜Fを24回繰り返す(合計25サイクル)、G)72℃にて10分。
プライマー配列:
プライマー1:GCTAGCTCATTTCACATCGT(配列番号:126、NheI配列は下線付き)。
プライマー2:
(配列番号:127、CBDコードする配列は下線付き、突然変異したコドンは太字の斜字体)。
プライマー3:
(配列番号:128、CBDコードする配列は下線付き、突然変異したコドンは太字の斜字体)。
プライマー4:GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG(配列番号:129、BamHI配列は下線付き)。
野生型CBD配列は、ECTGLAWEWWR(配列番号:130)である。
突然変異したCBD配列は、EATGLAWEAAR(配列番号:131)である。
プライマー1:GCTAGCTCATTTCACATCGT(配列番号:126、NheI配列は下線付き)。
プライマー2:
プライマー3:
プライマー4:GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG(配列番号:129、BamHI配列は下線付き)。
野生型CBD配列は、ECTGLAWEWWR(配列番号:130)である。
突然変異したCBD配列は、EATGLAWEAAR(配列番号:131)である。
突然変異したNheI−BamHI断片の配列は、
である。
<実施例39>
<実施例39>
LLO CBDのCTLエピトープを用いた部分的な置き換え
部位特異的な突然変異誘発をLLO上で実施し、CBDの9つのアミノ酸(AA)を抗原NY−ESO−1からのCTLエピトープで置き換えた。CBD(配列番号:130)の配列 は、配列ESLLMWITQCR(配列番号:133、突然変異した残基に下線付き)で置き換えられ、これは「ctLLO」と称される」NY−ESO−1からのHLA−A2で制限されたエピトープ157−165を含有する。
部位特異的な突然変異誘発をLLO上で実施し、CBDの9つのアミノ酸(AA)を抗原NY−ESO−1からのCTLエピトープで置き換えた。CBD(配列番号:130)の配列 は、配列ESLLMWITQCR(配列番号:133、突然変異した残基に下線付き)で置き換えられ、これは「ctLLO」と称される」NY−ESO−1からのHLA−A2で制限されたエピトープ157−165を含有する。
使用されるサブクローニング戦略は、前出の実施例と類似である。
使用されるプライマーは、以下のとおりである。
プライマー1:GCTAGCTCATTTCACATCGT(配列番号:126、NheI配列は下線付き)。
プライマー2:
(配列番号:134、CBDコードする配列は下線付き、突然変異した(NY−ESO−1)コドンは太字の斜字体)。
プライマー3:
(配列番号:135、CBDコードする配列は下線付き、突然変異した(NY−ESO−1)コドンは太字の斜字体)。
プライマー4:GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG(配列番号:129、BamHI配列は下線付き)。
プライマー1:GCTAGCTCATTTCACATCGT(配列番号:126、NheI配列は下線付き)。
プライマー2:
プライマー3:
プライマー4:GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG(配列番号:129、BamHI配列は下線付き)。
結果として得られるNheI/BamHI断片の配列は、以下のとおりである。
<実施例40>
BALB/Cマウスの乳腺内に移植した4T1腫瘍の増殖におけるデュアルCHER2−CA9リステリアワクチンの抗腫瘍有効性
実験の詳細:
組み換え型Lm(LmddA−cHer2/CA9)を生成した。このLm株は、標的腫瘍細胞を多重化するために、プラスミドを切断LLO(tLLO)への融合として使用して、キメラHer2(cHer2)タンパク質をゲノムリステリオリシンO(LLO)およびヒト炭酸脱水酵素9(CA9)の断片への融合として染色体に発現および分泌する。
実験の詳細:
組み換え型Lm(LmddA−cHer2/CA9)を生成した。このLm株は、標的腫瘍細胞を多重化するために、プラスミドを切断LLO(tLLO)への融合として使用して、キメラHer2(cHer2)タンパク質をゲノムリステリオリシンO(LLO)およびヒト炭酸脱水酵素9(CA9)の断片への融合として染色体に発現および分泌する。
ワクチン力価:
LmddA−PSA−6.5×108
LmddA−CA9−1.4×1010
LmddA−cHER2−1.05×1010
デュアルcHer2−CA9(LmddA)−1.5×109
LmddA−PSA−6.5×108
LmddA−CA9−1.4×1010
LmddA−cHER2−1.05×1010
デュアルcHer2−CA9(LmddA)−1.5×109
実験プロトコル:
4T1細胞を10%のFBS、2mMのL−Glu、1.5g/Lの重炭酸ナトリウム、4.5g/Lのグルコース、1mMのピルビン酸ナトリウム、および10mMのHEPESを含有するRPMI中で増殖した。注射の日に、細胞をトリプシン処理し、次いでPBS中で2回洗浄した。細胞を計数して、7×103細胞/50mlで再懸濁した。
4T1細胞を10%のFBS、2mMのL−Glu、1.5g/Lの重炭酸ナトリウム、4.5g/Lのグルコース、1mMのピルビン酸ナトリウム、および10mMのHEPESを含有するRPMI中で増殖した。注射の日に、細胞をトリプシン処理し、次いでPBS中で2回洗浄した。細胞を計数して、7×103細胞/50mlで再懸濁した。
腫瘍を各々のマウスの乳腺内に移植した。1群当たり16匹のマウスとした。3日後マウスにワクチン接種した。4日目に、各々の群内の4匹のマウスを安楽死させ、腫瘍増殖について調べた。10日目に、マウスに各々のワクチンのブーストを与えた。11日目に、各々の群内の4匹のマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。18日目に、各々の群内の4〜5匹のマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。21日目に、各々の群内の残りのマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。
結果
結果
4日目に、腫瘍はかろうじて触知可能であったので、測定は行わなかった。
数字は2種混合ワクチン(2つの異種抗原を発現する組み換え型リステリア)が当初(11日目)腫瘍質量に大きい影響を有することを示す(図70)。安楽死させた2匹のマウスには腫瘍がなく、またもう一方は対照より小さく、CA9単独およびcHER2をワクチン接種したマウスのサイズと同程度であった。18日目までに、いくつかの群の数匹のマウスで多発性腫瘍が測定される可能性がある。PBSおよびPSA対照マウスはCA9単独およびcHER2、または2種混合ワクチン群よりずっと大きい腫瘍を有する。2種混合ワクチン群は、腫瘍量が大きい1つの異常値を有し、これを除けばその群に対する平均は最小であることになる。いくつかの群のマウスが重症とみられ、死につつあったため、実験を早期に終了した。しかしながら最後の測定では、2種混合ワクチン群のマウスは腫瘍が最も小さかった(図70)。これは腫瘍増殖の制御のレベルに起因する可能性があり、これは早期に効果が見られた。
結論として、2種混合ワクチンは、単独のワクチンまたは対照を用いて達成されるレベルより高い、2種混合ワクチン群としてのマウスが実験終了時に最も低い腫瘍量を有する、4T1モデルでの腫瘍制御の初期レベルを示す(図70参照)。
先行する実施例は、本発明の実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
<実施例41>
<実施例41>
両方の異種抗原に対する免疫応答を引き出す、LLO−PSAおよびTLLO−HMW−MAA2160−2258融合タンパク質の同時発現および分泌による、抗腫瘍活性を強化した組み換え型L.モノサイトゲネスベクターの開発。
材料および方法:
pADV168プラスミドの構築 HMW−MAA−C断片は、pCR2.1−HMW−MAA2160−2258プラスミドからXhoIおよびXmaI制限エンドヌクレアーゼでの二重消化によって切り離される。この断片はすでにXhoIおよびXmaIを用いて消化されたpADV134プラスミド内でクローニングされてE7遺伝子を切り離す。pADV168プラスミドは、RFLPおよび配列解析のために、dal(−)dat(−)大腸菌株MB2159およびスクリーニング陽性クローンをエレクトロコンピテントへと電気穿孔させる。
材料および方法:
pADV168プラスミドの構築 HMW−MAA−C断片は、pCR2.1−HMW−MAA2160−2258プラスミドからXhoIおよびXmaI制限エンドヌクレアーゼでの二重消化によって切り離される。この断片はすでにXhoIおよびXmaIを用いて消化されたpADV134プラスミド内でクローニングされてE7遺伝子を切り離す。pADV168プラスミドは、RFLPおよび配列解析のために、dal(−)dat(−)大腸菌株MB2159およびスクリーニング陽性クローンをエレクトロコンピテントへと電気穿孔させる。
Lmdd−143/168、LmddA−143/168、ならびに対照株LmddA−168、Lmdd−143/134およびLmddA−143/134の構築。Lmdd、Lmdd−143、およびLmddA−143は、pADV168プラスミドまたはpADV134プラスミドのいずれかで形質転換される。形質転換細胞を、ストレプトマイシン(250μg/mL)で補助し、D−アラニンを含まないブレインハートインフージョン寒天培養基(BHIs培地)プレート上で選択した。個別のクローンをLLO−PSA、tLLO−HMW−MAA2160−2258、およびtLLO−E7分泌のために、細菌培養上清の中でウエスタンブロットによって、抗LLO、抗PSA,または抗E7抗体を使用してスクリーニングした。各々の株から選択されたクローンは、インビトロおよびインビボでの病毒性について評価されることになる。各々の株は最も安定な組み換え型クローンを選択するためにインビボで2回継代される。簡潔に述べると、各々の構築体から選択されたクローンを、増殖し、1×108CFU/マウスで4匹のマウスの群に腹腔内に注射した。1日目および3日目に脾臓を採取し、均質化し、BHI−寒天培養基プレート上にプレーティングした。第1継代後、各々の株から1つのコロニーが選択され、インビボで2回目に継代された。ベクターがその生存能力を損なうレベルまでさらに弱毒化するのを防止するために、独特の弱毒化レベルを有する2つのベクター内の構築体(Lmdd−143/168、LmddA−143/168)を生成した。
2つの抗原を融合タンパク質、LmddA244Gとして発現および分泌するように改変されたリステリア株の構築。抗原Her2キメラはゲノムのリステリオリシンOに遺伝学的に融合され、また第2の抗原HMW−MAA−C(HMC)はプラスミド中の切断リステリオリシンOに融合される(図71A)。融合タンパク質LLO−ChHer2およびtLLO−HMCの分泌が、抗LLOおよび抗FLAG抗体をそれぞれを使用してウエスタンブロットによって検出された(図71B参照)。
溶血性アッセイ。ファゴリソソームのエスケープを生じるゲノムLLOの能力を決定するために、標的細胞として対照野生型10403SおよびLmddA244G−168ならびにヒツジ赤血球の分泌された上清を使用して溶血性アッセイを実施した。
J774細胞でのインビトロの細胞内複製。マウスのマクロファージ様J774細胞株を使用してインビトロでの細胞内増殖アッセイを実施した。簡潔に述べると、単独のワクチン(LmddA164およびLmddA168)または二価免疫療法のいずれか一方を用いて、J774細胞を媒体中で抗生剤なしで1:1のMOIで1時間の間感染させた。感染後1時間の時点で、10mg/mLのゲンタマイシンで細胞を処置して細胞外細菌を殺した。定期的な時間間隔でサンプルを採取して、細胞内のCFUの数を定量するために細胞を水で溶解した。溶解物の10倍の段階希釈をBHIプレート上に二重にプレーティングして、各々のサンプルでコロニー形成単位(CFU)を計数した。
インビボでの病毒性研究。4匹のC57BL/6マウス(生後7週)の群に、(1×108および1×109CFU/回)の2つの異なる、Lmdd−143/168、LmddA−143/168、LmddA−168、Lmdd−143/134、またはLmddA−143/134株の投与量を腹腔内で注射した。マウスを生存性およびLD50推定について2週間の間追跡調査した。1×108より大きいLD50は、他のLmベースのワクチンでのそれまでの経験に基づいて許容可能な値を構造化する。
結果
結果
pADV168プラスミドが順調に構造化されると、正しいHMW−MAA配列の存在のために配列決定される。これらの新しい株の中のこのプラスミドは、各々の構築体に対して特異的なLLO融合タンパク質を発現および分泌する。これらの株を、ActAが不完全な(LmddA)株のために、少なくとも1×108CFUで、おそらく1×109CFUより高いLD50を用いて高度に弱毒化し、これはactA遺伝子を欠いていて、その結果として細胞間の拡散の能力を欠いている。
組み換え型Lm(LmddA−cHer2/HMC)を生成した。このLm株は、プラスミドを切断LLO(tLLO)への融合として使用してゲノムリステリオリシンO(LLO)およびHMW−MAA2160−2258の断片(HMW−MAA CまたはHMCとも名付けられた)への融合として、キメラHer2(cHer2)タンパク質を、LmddA244G−168と同時に称される標的腫瘍細胞および腫瘍血管系へ染色体に発現および分泌する。LmddA244G−168からの融合タンパク質tLLO−HMCおよびLLO−cHer2の両方の発現および分泌が、ウエスタンブロットによって抗FLAGおよび抗LLO特異的な抗体を使用して検出された(図71B)。さらに、ワクチンLmddA244G−168は、LmddA−244Gの病毒性を安定化するためおよびこれが組み換え型融合タンパク質の発現を維持していることを確認するために、マウスの中でインビボで2回継代された(図71B)。ワクチンLmddA244G−168は、2回のインビボでのマウスの継代後、その融合タンパク質tLLO−HMCおよびLLO−cHer2の両方の発現および分泌する能力を保持していた。
株LmddA244G−168は、染色体のLLOを融合タンパク質LLO−cHer2として発現し、これはLLOのファゴリソソームのエスケープを生じる機能的な能力に影響する場合がある。これを決定するために、標的細胞として対照野生型10403SおよびLmddA244G−168、ならびにヒツジ赤血球の分泌された上清を使用して溶血性アッセイを実施した。図72Aに示されるように、LmddA244G−168の溶血性能力には野生型の高度に病毒性のLm株10403Sと比較すると1.5倍の減少がある。
さらに、融合タンパク質LLO−cHer2の発現がLmddA−cHer2/HMCのマクロファージが感染するためおよびその細胞内増殖の能力にいかなる有害な効果も生じないかどうかを調べるために、細胞J774のようなマウスマクロファージを使用して細胞感染アッセイを実施した。図72Bに特定するように、結果はシングル抗原またはデュアル抗原のいずれかを発現する異なるリステリアベースの免疫療法の細胞内増殖挙動が、同様に、2つの抗原の共発現がLmddA244G−168の標的細胞内タンパク質に免疫学的応答を提示する能力にいかなる変化も生じないことを示唆することを示した。
<実施例42>
<実施例42>
Lmdd−244G/168を用いた免疫化に際して引き出される免疫応答および抗腫瘍効果の検出。
Lmdd−244G−168株を用いた免疫化の際のマウスで、これらの抗原に対するIFN−γ産生の検出などの標準的な方法を使用して、cHer2およびHMW−MAAに対する免疫応答を研究した。デュアル発現ベクターの治療的な有効性をNT2乳房腫瘍モデルで試験した。
Lmdd−244G−168株を用いた免疫化の際のマウスで、これらの抗原に対するIFN−γ産生の検出などの標準的な方法を使用して、cHer2およびHMW−MAAに対する免疫応答を研究した。デュアル発現ベクターの治療的な有効性をNT2乳房腫瘍モデルで試験した。
IFN−γ ELISpot。発明者らは、2つの抗原、Her2およびHMW−MAA特異的な免疫応答をFvBマウスの中に生成するための二価免疫療法の能力を評価した。LmddA134(Lm−対照)、LmddA164、およびLmddA244G/168などの異なる免疫療法を用いてマウス(3匹/群)に0日目に免疫化して、14日目にブーストした。Her2/neu特異的な免疫応答を21日目に採取した脾臓内で検出した。キットの取扱説明書に従ってIFN−γ ELISpotアッセイを行い、脾細胞を細胞内領域(RLLQETELV)(配列番号76)に特異的なペプチドエピトープで刺激した。
IFN−γELISA。免疫化マウスの脾細胞内でのHMW−MAA−C特異的な免疫応答の発生は、HMA−MAA−Cタンパク質を用いて2日間細胞を刺激することによって決定された。IFN−γ放出はマウスインターフェロンγ ELISAキットを使用して実施したELISAによって検出された。
抗腫瘍有効性。マウスNT2乳房腫瘍モデルを使用して、抗腫瘍有効性を調べた。FvBマウスに0日目に1×106のNT2細胞を移植して、右の脇腹に定着した腫瘍に6日目から1週間ごとの間隔で異なる免疫療法を用いて3つの免疫化の処置を開始した。研究終了まで、週に2回腫瘍をモニターした。腫瘍径が1.5cmより大きくなった場合、マウスを安楽死させた。
結果
結果
次に、マウスのNT2乳房腫瘍モデルを使用してLmddA244Gの抗腫瘍治療的な有効性を調べた。定着したNT2腫瘍を右の脇腹に持つFvBマウスを、モノ抗原LmddA164(ChHer2)、LmddA168(HMC)、または二価免疫療法LmddA244G−168を発現する異なる免疫療法のいずれかを用いて、一週間間隔で3とおりの免疫化で処置した。一価免疫療法および二価免疫療法の両方を用いた処置は、図73Aおよび図73Cに示すように、NT2腫瘍の減少を生じた。しかしながら、二価免疫療法を用いた処置後、NT2腫瘍増殖の制御へのより強い影響が観察された。各々の群の中の腫瘍の無いマウスのパーセントの追加的な解析は、一価免疫療法で処置した群(40%未満)と比較すると、二価免疫療法を用いた処置が腫瘍を有しないマウスを最も多く(70%)生成したことを確認した。リステリア・モノサイトゲネスを療法のためのベクターとして使用して2つの抗原を同時に標的化することが結果として抗腫瘍有効性の強化をもたらすことを、これらの観察は支持する。
二価免疫療法の能力は、2つの抗原、Her2およびHMW−MAA特異的な免疫応答をFvBマウスの中に生成すると評価された。LmddA134(無関連対照)、LmddA164、およびLmddA244G/168などの異なる免疫療法を用いてマウスに0日目に免疫化して、14日目にブーストした。細胞内領域に対して特異的なペプチドエピトープを使用するELISpotベースのアッセイを使用してHer2/neu特異的な免疫応答を検出した。Her2を発現する一価免疫療法および二価免疫療法の両方は、ELISpotベースのアッセイを使用して検出される同等のレベルの免疫応答を生成した(図74参照)。
免疫化マウスの生成およびその脾細胞内のHMW−MAA−C特異的な免疫応答がELISAを使用して検出された。シングルコピー(一価免疫療法)またはマルチコピー(二価免疫療法)のいずれかをベースとする発現を使用するLmからの腫瘍抗原の発現は、同等のレベルの抗原特異的な免疫応答を生成する(図74参照)。
<実施例43>
<実施例43>
Balb/cマウスの乳腺内に移植した4T1腫瘍の増殖におけるデュアルcHER2−HMW−MAAリステリアワクチンの抗腫瘍有効性。
実験の詳細:
組み換え型Lm(LmddA−cHer2/HMW−MAA)を生成した。このLm株は、標的腫瘍細胞を多重化するために、プラスミドを切断LLO(tLLO)への融合として使用して、キメラHer2(cHer2)タンパク質をゲノムリステリオリシンO(LLO)および高分子量メラノーマ関連抗原(HMW−MAA)への融合として染色体に発現および分泌する。
実験の詳細:
組み換え型Lm(LmddA−cHer2/HMW−MAA)を生成した。このLm株は、標的腫瘍細胞を多重化するために、プラスミドを切断LLO(tLLO)への融合として使用して、キメラHer2(cHer2)タンパク質をゲノムリステリオリシンO(LLO)および高分子量メラノーマ関連抗原(HMW−MAA)への融合として染色体に発現および分泌する。
ワクチン力価:
LmddA−PSA−6.5×108
LmddA−HMW−MMA−1.4×1010
LmddA−cHER2−1.05×1010
デュアルcHer2−HMW−MMA(LmddA)−1.5×109
LmddA−PSA−6.5×108
LmddA−HMW−MMA−1.4×1010
LmddA−cHER2−1.05×1010
デュアルcHer2−HMW−MMA(LmddA)−1.5×109
実験プロトコル:
4T1細胞を10%のFBS、2mMのL−Glu、1.5g/Lの重炭酸ナトリウム、4.5g/Lのグルコース、1mMのピルビン酸ナトリウム、および10mMのHEPESを含有するRPMI中で増殖した。注射の日に、細胞をトリプシン処理し、次いでPBS中で2回洗浄した。細胞を計数して、7×103細胞/50mlで再懸濁した。
腫瘍を各々のマウスの乳腺内に移植した。1群当たり16匹のマウスとした。3日後マウスにワクチン接種した。8日目に、各々の群内の4匹のマウスを安楽死させ、腫瘍増殖について調べた。8日目に、マウスに各々のワクチンのブーストを与えた。15日目に、各々の群内の4匹のマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。15日目に、マウスに各々のワクチンの別のブーストを与えた。15日目、21日目、28日目、および35日目に、各々の群内の4〜5匹のマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。42日目に、各々の群内の残りのマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。
結果
結果
結果を図75に要約した。グラフは2種混合ワクチン(2つの異種抗原を発現する組み換え型リステリア)が腫瘍体積に大きい影響を有することを示す(図75)。二価療法を受けているマウス内の腫瘍の体積は、対照と、モノHMW−MMAおよびcHER2ワクチン接種したマウスとの両方より小さい。PBSおよびPSA対照マウスはモノHMW−MMAおよびcHER2群と体積が同等の腫瘍を有する。
結論として、2種混合ワクチンは、4T1モデルで初期レベルの腫瘍制御を示し、2種混合ワクチン群は実験終了時の腫瘍量が最も小さいので、これはモノワクチンまたは対照マウスを用いて達成されたレベルより高い(図75参照)。
<実施例44>
<実施例44>
NT2乳房腫瘍モデルの増殖でのデュアルおよび連続的CHER2−HMW−MAAリステリアワクチンの抗腫瘍有効性の比較研究
実験の詳細:
マウスのNT2乳房腫瘍モデルを使用して抗腫瘍有効性を調べた。FvBマウスに0日目に1×106のNT2細胞を移植して、右の脇腹に定着した腫瘍に6日目から1週間ごとの間隔で異なる免疫療法を用いて3つの免疫化の処置を開始した。研究終了まで、週に2回腫瘍をモニターした。腫瘍径が1.5cmより大きくなった場合、マウスを安楽死させた。
結果
実験の詳細:
マウスのNT2乳房腫瘍モデルを使用して抗腫瘍有効性を調べた。FvBマウスに0日目に1×106のNT2細胞を移植して、右の脇腹に定着した腫瘍に6日目から1週間ごとの間隔で異なる免疫療法を用いて3つの免疫化の処置を開始した。研究終了まで、週に2回腫瘍をモニターした。腫瘍径が1.5cmより大きくなった場合、マウスを安楽死させた。
マウスのNT2乳房腫瘍モデルを使用して異なるリステリアワクチン組織物の抗腫瘍の治療的な有効性を調べた。1×108の、単独の抗原LmddA164(ChHer2)、LmddA168(HMC)を発現する療法、または同時に投与する両方の抗原を発現する療法の組合せ(二価療法)のいずれかの異なる免疫療法を用いた5つの免疫化を用いて、一週間間隔で、定着したNT2腫瘍を右の脇腹に持つFvBマウスを処置した。加えて、単独の抗原LmddA164(ChHer2)、LmddA168(HMC)を発現する療法、同時に投与する両方の抗原を発現する療法の組合せ(二価療法)、または各々の単独の抗原の連続的な投与の組合せ(cHer2に続いてHMW−MAA)のいずれかの異なる免疫療法を用いて、組合せ療法対連続的療法を実施した。後者では、3回の毎週の投与でLmddA164(ChHer2)を投与して、LmddA168(HMC)の3回の毎週の投与が後に続いた。結果を図76に要約した。図76に示されるように、すべての組織物はNT2腫瘍体積のほぼ均等な減少を生じた。これらの観察は、2つの一価構築体の同時投与または連続的な投与が、腫瘍増殖を制御するうえで二価構築体と少なくとも同等であることを示す(図76)。
添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態を記述してきたが、本発明は厳密に実施形態に限定されず、かつ添付の特許請求の範囲に定義されるように、当業者によって本発明の範囲または趣旨から逸脱することなくこれらに様々な変更および修正がなされてもよいことが理解されるであろう。
Claims (27)
- 被験者における疾患に対して免疫応答を誘発する方法であって、前記方法が、
a)前記被験者から生体サンプルを得る工程と、
b)前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、
c)前記被験者に組み換え型リステリア株を含む組成物を投与する工程であって、前記株が少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、
i)前記融合タンパク質が前記生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含み、
ii)前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、
iii)前記バイオマーカーが、PEST含有ポリペプチドに融合され、
iv)前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者の中に多標的抗疾患免疫応答を誘発する、工程か、または、
d)各々が組み換え型リステリア株を含む所定の数の組成物を、前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程であって、
i)前記融合タンパク質が前記生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含み、
ii)前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、
iii)前記バイオマーカーがPEST含有ポリペプチドに融合され、
iv)各々の組成物の中の各々のリステリア株が前記融合タンパク質中に異なるバイオマーカーを含み、
v)それによって前記被験者の中に前記疾患に対する多標的免疫応答を誘発する工程とを含む、方法。 - 前記疾患が、先天性疾患および感染性疾患、ガン、または腫瘍増殖である、請求項1に記載の方法。
- 前記リステリアベースのワクチンを投与する前の前記被験者から得られた生体サンプル中で前記バイオマーカーが検出される、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体サンプルが、血液、組織、DNA、RNA、精子、脳脊髄液、痰、または血清である、請求項3に記載の方法。
- 前記リステリアベースのワクチンの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に、ワクチンの代替組成物、もしくはワクチンの代替形態を投与する工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ワクチンの代替組成物または代替形態が、前記生体サンプル中で発現されるバイオマーカーを含む融合タンパク質をコードするDNAワクチン、前記融合タンパク質を含むウイルスベクター、前記融合タンパク質を含むウイルス様粒子、または前記融合タンパク質を発現する組み換え型の生きた非リステリア細菌ベクターである、請求項6に記載の方法。
- 追加的な活性薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加的な活性薬剤が、免疫チェックポイント阻害剤、その抗体または断片、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞、またはこれらの組合せである、請求項7に記載の方法。
- 前記組成物または組成物の混合物のブースターを投与する工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ワクチンの代替組成物または代替形態のブースター投与量を投与する工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所定の数のバイオマーカーが、各々がその他のものとは異なる1〜10個のバイオマーカーである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記請求項1のb)に記載の組成物内の前記組み換え型リステリアが、各々がその他のものとは異なるバイオマーカーを含む1〜10個の融合タンパク質を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記請求項1のd)に記載の組み換え型リステリア株を含む前記組成物の混合物が、1〜10個の組成物を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PEST含有ペプチドが、N末端リステリオリシンO(LLO)、PEST配列、またはN末端ActA配列である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リステリア株が、ゲノム突然変異、または前記染色体のdal/dat遺伝子の欠失を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リステリア株が、ゲノム突然変異、または前記染色体のactA遺伝子の欠失を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リステリア株が、ゲノム突然変異、または前記染色体のprfA遺伝子の欠失を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リステリア株中の前記核酸配列が、前記リステリアの中の安定な染色体外プラスミド中に存在する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラスミドが、前記プラスミドの前記リステリア染色体の中への組込をコードする配列を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記プラスミドが、前記リステリア中の前記dal/dat遺伝子、actA遺伝子、または前記prfA遺伝子内で、前記ゲノム突然変異または欠失を相補するタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが腫瘍抗原である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腫瘍抗原が前記腫瘍の形成または増殖と関連付けられる、請求項21に記載の方法。
- 腫瘍またはその血管系によって前記腫瘍抗原が発現される、請求項21に記載の方法。
- 前記方法が、結果的にCD8 T細胞/調節性T細胞抑制因子比の増加をもたらす、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、結果的に前記疾患の再発を防止する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、結果的に前記疾患の治療をもたらす、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患が、ガンまたは腫瘍増殖である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
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