CN111801348A - 活化性嵌合受体及其在自然杀伤细胞免疫疗法中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码活化性嵌合受体的多核苷酸，所述活化性嵌合受体包含对HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA‑E)/肽复合物具有增强的亲和力的工程改造的自然杀伤细胞组2成员C(NKG2C)或偶联到效应子结构域的NKG2A的胞外受体结构域。本发明还涉及表达这样的构建体的NK细胞以及这些NK细胞诱导细胞毒性的用途。本发明进一步示例了表达编码NKG2C(SIIS)/CD94/DAP12或NKG2C/CD94/4‑1BB/CD3z的多核苷酸的NK细胞显示出针对癌细胞的增强的NK细胞毒性。

Description

活化性嵌合受体及其在自然杀伤细胞免疫疗法中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年2月9日提交的美国临时序列号62/628,788和2018年9月26日提交的美国临时序列号62/736,879的权益。这些申请中的每一个的全部内容通过引用结合在此。
ASCII文本文件中的材料通过引用结合
本申请将包含在以下ASCII文本文件中的序列表通过引用结合，该序列表在此同时提交：
a.文件名称：4459_1147_002_Seq_List.txt；2019年2月6日创建，大小为86.4KB。
背景技术
许多疾病的出现和持续存在的特征是对异常细胞(包括恶性的和病毒感染的细胞)的免疫应答不足。免疫疗法是使用和操纵患者的免疫系统来治疗各种疾病。
发明内容
免疫疗法在疾病的治疗中呈现出新的技术进步，其中免疫细胞被工程改造以表达特定的靶向和/或效应分子，其特异性识别患病的或受损的细胞并与之反应。这代表了有希望的进步，至少部分是由于针对特异性靶向患病的或受损的细胞的潜力，这与更传统的方法(例如化学治疗)相反，所述更传统的方法中所有细胞都受到影响，而期望的结果是足够的健康细胞存活以容许患者生存。一种免疫疗法是在免疫细胞中重组表达活化性嵌合受体，以实现靶向识别和破坏目标异常细胞。
为了解决针对特异性靶向和破坏患病的或感染的细胞、使其失效或以其他方式致其惰性的这种需要，本文提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸、氨基酸和载体，这些嵌合受体赋予细胞(例如自然杀伤细胞)增强的靶向和细胞毒性。还提供了用于产生这些细胞的方法，以及使用这些细胞靶向和破坏患病的或受损的细胞的方法。在几个实施例中，提供了活化性编码嵌合受体的多核苷酸，所述活化性嵌合受体包含胞外受体结构域和含有跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域，其中所述胞外受体结构域包含以高亲和力结合免疫抗原的肽。
例如，在几个实施例中，提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸，所述活化性嵌合受体包含胞外受体结构域，所述胞外受体结构域包含对NKG2C的免疫配体具有更高亲和力的自然杀伤细胞组2成员C(NKG2C)的工程改造的变体。在几个实施例中，所述多核苷酸被设计成赋予所编码的NKG2C变体相对于天然NKG2C增强的对免疫配体如HLA-E/肽复合物的结合亲和力，而非工程改造NKG2C对HLA-E/肽复合物具有较低的结合亲和力。在几个实施例中，在不存在天然的或工程改造的NKG2A变体的情况下使用工程改造的NKG2C变体。在几个实施例中，不使用全长的或其他天然截短形式的NKG2C。
在几个实施例中，提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸，所述活化性嵌合受体包括包含自然杀伤细胞组2成员A(NKG2A)片段的胞外受体结构域，所述片段经工程改造以在免疫配体如HLA-E/肽复合物结合后转导活化信号，而不是抑制信号。在几个实施例中，在不存在天然的或工程改造的NKG2C变体的情况下使用工程改造的NKG2A变体。在几个实施例中，不使用全长的或其他天然截短形式的NKG2A。
在几个实施例中，由多核苷酸编码的活化性嵌合受体包含效应子结构域，所述效应子结构域包含跨膜区和胞内信号传导结构域，这些结构域用于在所述嵌合受体(以增强的亲和力)与免疫抗原(例如HLA-E/肽复合物)结合之后转导活化和/或共刺激信号。在几个实施例中，胞外受体结构域包含与包含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域偶联的工程改造的NKG2C变体。在几个实施例中，工程改造的NKG2C变体胞外结构域与天然NKG2C跨膜区和/或天然NKG2C胞内信号结构域偶联。在几个实施例中，工程改造的NKG2C变体包含SEQ ID NO.58的氨基酸序列。在几个实施例中，工程改造的NKG2C变体由SEQ ID NO:63的核酸序列或其片段编码。在一些实施例中，与SEQ ID NO:63相比，NKG2C变体具有至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％的同源性。
在几个实施例中，活化性嵌合受体包含与包含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域偶联的NKG2A片段。在几个实施例中，NKG2A片段偶联到天然NKG2A跨膜区和/或天然NKG2A胞内信号传导结构域。在几个实施例中，NKG2A片段偶联到天然NKG2C跨膜区和/或天然NKG2C胞内信号传导结构域。在几个实施例中，NKG2A片段具有SEQ ID NO:65的序列。在几个实施例中，与SEQ ID NO:65相比，NKG2A的片段具有至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％的同源性。在一个实施例中，NKG2A片段偶联到CD8a跨膜结构域和包含4-1BB和CD3ζ中的一个或多个的效应子结构域。在几个实施例中，这样的活化性嵌合受体构建体由SEQ ID NO:61的核酸序列编码或包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在几个实施例中，在效应子结构域内使用其他信号传导部分。例如，在几个实施例中，多核苷酸进一步编码DNAX活化蛋白12(DAP12)或DAP10。然而，在几个实施例中，DAP10不包括在活化性受体构建体中和/或不包括在由细胞表达的另一个工程改造的构建体中。同样，在几个实施例中，DAP12不包括在活化性受体构建体中和/或不包括在由细胞表达的另一个工程改造的构建体中。在几个实施例中，多核苷酸编码天然CD94或嵌合CD94。在几个实施例中，嵌合CD94包括包含CD94的片段的胞外受体结构域和包含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域。在另外的实施例中，嵌合CD94受体包含与CD8a跨膜结构域和包含4-1BB和CD3ζ中的一个或多个的效应子结构域偶联的CD94片段。在几个实施例中，嵌合CD94由SEQ ID NO:59的核酸序列编码。在几个实施例中，嵌合CD94包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一些实施例中也使用CD94的变体、片段或截短。例如，在几个实施例中，使用与SEQ IDNO:59或60相比具有至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％同源性的CD94变体。在一个实施例中，CD94片段与SEQ ID NO:67具有至少80％的同源性。在一个实施例中，CD94片段与SEQ ID NO:68具有至少80％的同源性。
在几个实施例中，效应子结构域包含CD16、NCR1、NCR2、NCR3、4-1BB、NKp80、DAP10、CD3ζ，2B4中的一个或多个。根据一些实施例，这些信号传导部分中任何一个的活化性信号传导片段也是有用的。
在几个实施例中，活化性嵌合受体还包含接头和/或铰链区。在几个实施例中，这些区(如果包括的话)可以起到将分子的其他部分隔开的作用，例如减少受体的空间位阻，和/或减少或消除在三级结构形成后可能导致的功能问题。在几个实施例中，活化性嵌合受体包含可任选重复两次或更多次的GS接头。例如，在几个实施例中，GS接头重复3、4、5、6次或更多次。在几个实施例中，铰链区包含具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的甘氨酸-丝氨酸重复基序。重复不需要以“头到尾”的格式连续进行，而是可以彼此间隔开。在几个实施例中，嵌合受体包含铰链区。一些实施例采用由SEQ ID NO:5的核酸序列编码的铰链。另外的实施例采用由SEQ ID NO:5的核酸序列的片段编码的铰链区。在几个实施例中，铰链区包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在几个实施例中，铰链区由SEQ ID NO:34的核酸序列编码。一些实施例使用β-肾上腺素能受体的部分作为铰链区。一些实施例采用由SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:42的核酸序列编码的铰链区。
在几个实施例中，还提供了信号肽。因此，在几个实施例中，胞外受体结构域还包含CD8a信号肽，其中信号肽包含SEQ ID NO.4的核酸序列。
为了促进并在一些实施例中增强通过所公开的嵌合受体活化信号传导，所述效应子结构域被配置为包括一个或多个半ITAM序列。在几个实施例中，半ITAM包含SEQ IDNO.14的氨基酸序列或SEQ ID NO.37的氨基酸序列。在一些实施例中，其中提供了一个以上的半ITAM序列(或其他跨膜或信号传导组分)，由多核苷酸编码的最终构建体可以利用这些序列的混合物(例如，异串联信号传导结构域)。在几个实施例中，效应子结构域包含一个或多个ITSM序列。例如，在几个实施例中，ITSM包含SEQ ID NO.15的氨基酸序列和/或SEQ IDNO.35。
在几个实施例中，所述多核苷酸进一步编码嵌合受体，所述嵌合受体包含结合自然杀伤细胞组2成员D(NKG2D)的天然配体的胞外受体结构域和包含跨膜区域和胞内信号传导结构域的效应子结构域，其用于在结合NKG2D配体后将信号转导到表达所述嵌合受体的细胞。在几个实施例中，嵌合受体不使用全长或野生型NKG2D，而是使用保留结合NKG2D的一种或多种配体的能力的NKG2D片段。在几个实施例中，结合NKG2D的嵌合受体被提供在与编码活化性受体的多核苷酸分开的多核苷酸上(然而最终两者可以在单个细胞中共表达)。
在几个实施例中，多核苷酸还编码特异性抑制天然NKG2A的转录或翻译的短发夹RNA(shRNA)。在这样的实施例中，抑制天然NKG2A的转录或翻译的shRNA导致NKG2A在表达多核苷酸的细胞上的表达减少(如果没有消除的话)。在一些实施例中，这减少了较高亲和力的NKG2A和NKG2C之间对免疫抗原的竞争。因此，相对较低亲和力的NKG2C受体能够结合免疫抗原(例如HLA-E/肽复合物)并将活化信号转导到细胞(例如NK细胞)。在一个实施例中，所述shRNA包含在严格条件下与天然NKG2A基因杂交的核苷酸序列并且包含与NKG2A基因中的靶序列基本相同的有义片段(该靶序列在NKG2A片段中不存在)和反义片段，其中有义片段和反义片段由环片段分开。根据实施例，还可以采用降低天然NKG2A受体表达的其他机制。例如，可以使用包含反义序列的单独载体来破坏天然NKG2A受体的产生(但如本文所公开的保留工程改造的NKG2A片段/构建体的产生)。基因编辑技术也可用于选择性地修剪编码天然NKG2A受体的DNA的一个或多个区。免疫或机械分离技术(亲和固定化)也可用于选择性地耗减表达NKG2A受体的细胞的细胞群体，例如免疫细胞如NK或T细胞。
在几个实施例中，所提供的多核苷酸编码膜结合白细胞介素15(mbIL15)，或与编码膜结合白细胞介素15(mbIL15)的另外构建体共表达。在几个实施例中，膜结合IL15促进表达本文公开的活化性嵌合受体的细胞的扩增。
在一些实施例中，所述多核苷酸是mRNA。在几个实施例中，所述多核苷酸可操作地连接到用于活化性嵌合受体表达的至少一个调节元件。
除了多核苷酸之外，本文还提供了包含所述多核苷酸的载体，所述载体被配置成递送和促进由所述多核苷酸编码的蛋白质在细胞(例如免疫细胞(例如NK细胞))中的表达。在几个实施例中，载体是逆转录病毒，例如慢病毒或HIV。另外的实施例提供了其他载体，例如腺病毒载体、腺相关病毒载体和甚至非病毒载体(例如脂质体)。
本文还提供了基因工程改造的细胞，例如免疫细胞，其包含本文公开的一种或多种多核苷酸并表达一种或多种活化性嵌合受体。根据实施例采用各种免疫细胞。在几个实施例中，使用NK细胞。在一些实施例中，提供了经工程改造以表达活化性嵌合受体的自体细胞(例如，NK细胞)。另外的实施例提供了经工程改造以表达本文公开的活化性嵌合受体的同种异体细胞(例如，NK细胞)。在几个实施例中，富集细胞群体以获得高亲和力活化性嵌合受体。在一个实施例中，富集包括将抑制性NKG2A受体转化为活化性NKG2A受体(例如，通过表达本文公开的多核苷酸)。此外，这种转化可以与工程改造的NKG2C受体的表达偶联，所述工程改造的NKG2C受体具有对配体的增加的亲和力，所述配体导致NKG2C传递活化信号。此外，细胞群体可以被配置为缺乏天然NKG2A的表面表达，这是通过遗传调节编码天然NKG2A的核酸和/或通过选择性耗减来自群体的表达天然NKG2A的细胞。
本文还提供一种基因工程改造的免疫细胞，例如NK细胞，其包含活化性嵌合受体，所述活化性嵌合受体是对抗原具有增加的亲和力的工程改造的NKG2C受体或已经从抑制性受体转化为活化性受体的NKG2A变体。在几个实施例中，这样的细胞还可包括以下中多核苷酸中的一种或多种：编码嵌合受体的多核苷酸，所述嵌合受体被配置为通过胞外受体结构域结合自然杀伤细胞组2成员D(NKG2D)的天然配体(并且所述嵌合受体包括包含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域)；编码膜结合白介素15(mbIL15)的多核苷酸；编码特异性抑制天然NKG2A的转录或翻译的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
本文还提供了通过向哺乳动物施用免疫细胞来增强所述哺乳动物中的免疫细胞的细胞毒性的方法，其中所述免疫细胞表达活化性嵌合受体，所述活化性嵌合受体是对抗原具有增加的亲和力的工程改造的NKG2C受体或已经从抑制性受体转化为活化性受体的NKG2A变体。根据实施例采用各种免疫细胞。在几个实施例中，使用NK细胞。在一些实施例中，提供了经工程改造以表达活化性嵌合受体的自体细胞(例如，NK细胞)。另外的实施例提供了经工程改造以表达本文公开的活化性嵌合受体的同种异体细胞(例如，NK细胞)。在几个实施例中，所述方法还包括耗减要给表达天然NKG2A的细胞的受试者施用的细胞群。在几个实施例中，耗减导致细胞表达天然NKG2A的20％、25％、30％、40％或50％(或更多)减少。在几个实施例中，增强的基于免疫细胞的细胞毒性用于治疗或预防癌症或传染病。
本文还提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸在制备用于增强自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性的基于细胞的药物中的用途。如本文所述，在药物的产生中，活化性嵌合受体可以是对抗原具有增加的亲和力的工程改造的NKG2C受体或已经从抑制性受体转化为活化性受体的NKG2A变体。在几个实施例中，工程改造的NKG2C和NKG2A变体都用于制造用于治疗癌症或传染病的药物。
以上概述并在下面进一步详细阐述的组合物和相关方法描述了专业人员采取的某些行为；但是，应该理解的是，它们还可以包括另一方对这些行为的指示。因此，例如“施用表达活化性嵌合受体的NK细胞群”的行为包括“指示施用表达活化性嵌合受体的NK细胞群”。
附图说明
图1A-1B描绘了根据本文公开几个实施例的工程改造的受体。图1A描绘了根据本文公开的几个实施例的示意图，其显示了工程改造的自然杀伤细胞2组C(NKG2C)变体，所述变体针对以下进行了改造：在与CD94和Dap12二聚体(本文中称为“D12(SIIS)2C94”)的复合物中对HLA-E/肽复合物(165-168SIIS)的高亲和力。图1B描绘了根据本文公开的几个实施例的包含插入到MSCV逆转录病毒载体的NKG2C(165-168SIIS)、Dap12和CD94的构建体的示意图，所述MSCV逆转录病毒载体在内部核糖体进入位点(IRES)之后含有绿色荧光蛋白(GFP)。
图2A-2F描绘了与纯化的NKG2C(+)NKG2A(-)NK细胞中高亲和力活化性D12(SIIS)2C94受体复合物的表达相关的流式细胞术数据。描述了用仅含有GFP的载体转导的NK细胞(图2A-2C)和用含有D12(SIIS)2C94的载体转导的NK细胞(图2D-2F)的D12(SIIS)2C94表达谱。
图3A-3B描绘了含有HLA-G信号肽的HLA-E分子的设计和产生。图3A描绘了用HLA-E(指定为GpHLA-E；携带HLA-G信号肽的HLA-E)的HLA-G信号肽取代HLA-E信号肽。图3B描绘了与实体瘤细胞系HT29、U2OS、ES8和EW8中GpHLA-E的外源性表达相关的流式细胞术数据。
图4A-4C描绘了与以下相关的数据：纯化的用D12(SIIS)2C94转导的NKG2C(+)NKG2A(-)NK细胞针对基因修饰的肿瘤细胞系HT29-GpHLA-E(图4A)、U2OS-GpHLA-E(图4B)和SKBR3-GpHLA-E(图4C)的以指示的E:T比率的4小时细胞毒性测定。
图5A-5B描述了与转导NK细胞表征相关的数据。图5A描述了与NK细胞的NKG2A耗减以产生NKG2A(-)NK细胞群体相关的流式细胞术数据。图5B描绘了与以下相关的数据：模拟的转导的NKG2A(-)NK细胞群体或D12(SIIS)2C94转导的NKG2A(-)NK细胞针对基因修饰的肿瘤细胞系(i)HT29-GpHLA-E和(ii)U2OS-GpHLA-E(有或没有抗NKG2A抗体Z199孵育)的以指示的E:T比率的细胞毒性测定。
图6A-6B描绘了本文公开嵌合受体的实施例的示意图。图6A描绘了根据本文公开的几个实施例的示意图，显示自然杀伤细胞组2成员A(NKG2A)和CD94的截短形式，其中存在跨膜和抑制性胞质结构域的N-末端部分的缺失以及用CD8a跨膜结构域和4-1BB(CD137)与CD3ζ的胞质结构域的替换。根据本文公开的几个实施例，活化性NKG2A受体和嵌合CD94受体形成活化性复合物(本文中称为“2A/94BBz”)。图6B描述了根据本文公开的几个实施例的包含嵌合CD94和活化性NKG2A受体的构建体的示意图，所述嵌合CD94和活化性NKG2A受体插入到MSCV逆转录病毒载体中，所述MSCV逆转录病毒载体在内部核糖体进入位点(IRES)之后含有绿色荧光蛋白(GFP)。
图7A-7C描绘了与在转导的NKG2A耗减的NK细胞(下排)和在模拟的转导的NK细胞群体(上排)中活化性NKG2A/CD94-41BB-CD3z受体的表达相关的流式细胞术数据。
图8A-8B描绘了与以下相关的数据：模拟的转导的NK细胞群体或表达活化性NKG2A/CD94-41BB-CD3z受体的扩增NK细胞针对(a)U2OS-GpHLA-E细胞(图8A)和HT29-GpHLA-E细胞(图8B)的以指示的E:T比率4小时细胞毒性测定。
图9提供了根据本发明的几个实施例的构建体及其部分的非限制性实施例。
图10描绘了根据本文公开的几个实施例的与结直肠腺癌的异种移植模型和NK细胞构建体的抗肿瘤活性相关的数据。
图11描述了根据本文公开的几个实施例的来自施用NK-细胞构建体后的结直肠腺癌异种移植模型的存活数据。
具体实施方式
概述
许多疾病的异常细胞(包括病毒感染的细胞和恶性细胞)的出现和持续是通过对所述异常细胞的免疫应答不足而达到的。免疫疗法的目标是启动或增强患者的免疫系统应答，例如，增强免疫细胞(例如自然杀伤(NK)细胞)破坏、杀伤或以其他方式抑制受损细胞或患病细胞的能力。一种免疫疗法是在免疫细胞中重组用于靶向识别和破坏异常细胞表达活化性嵌合受体。通常，嵌合受体包含识别靶细胞上的配体的胞外受体结构域、锚定跨膜结构域和在配体结合后转导活化信号的效应子结构域。本文公开的一些实施例利用具有该一般结构的嵌合受体，或具有该一般结构的变体的活化性嵌合受体。另外，在几个实施例中，跨膜结构域和效应子结构域是单独的肽，其融合在一起。在几个其他实施例中，跨膜结构域和效应子结构域衍生自相同的肽。在一些这样的实施例中，跨膜结构域和效应子结构域包含单个肽(例如，一个肽，其穿过膜并且还准备启动信号级联)。如下面更详细讨论的，使用截短、突变、额外的连接子/间隔子元件、二聚体等产生活化性嵌合受体构建体，其在免疫细胞(例如，NK细胞)中表现出所需程度的表达，诱导来自NK细胞的细胞毒性活性，与一定程度的靶标亲合力平衡(这避免对非靶细胞的不利影响)。本文披露的活化性嵌合受体在免疫细胞表面上的重组表达可以将免疫细胞的靶向重定向至目标异常细胞，并且在接合后增强免疫活化。
用于免疫疗法的NK细胞
一种免疫疗法包括向患者施用工程改造以表达活化性嵌合受体的T细胞以引发阳性免疫应答。然而，该方法的潜在缺点是其需要使用自体细胞来预防患者中移植物抗宿主病的诱导。如本文披露的几个实施例中所提供，包含工程改造的NK细胞的组合物具有几个优点。例如，自体或供体衍生的同种异体细胞可以与NK细胞方法一起使用。另外，根据几个实施例，如本文提供的工程改造的NK细胞不显著增加针对正常细胞的细胞毒性。此外，NK细胞一旦被活化，就具有显著的细胞毒性作用。鉴于此，出人意料的是，本文提供的工程改造的NK细胞能够进一步提高细胞毒性作用，从而提供选择性杀死患病靶细胞的更有效的手段。因此，在几个实施例中，提供了治疗或预防癌症或传染病的方法，其包括施用治疗有效量的表达本文所述的活化性嵌合受体的NK细胞。在一个实施例中，施用的NK细胞是自体细胞。在进一步的实施例中，施用的NK细胞是供体衍生的(同种异体的)细胞。
在几个实施例中，表达活化性嵌合受体的重组NK细胞的接合和活化(例如，通过结合靶细胞上的配体)导致通过细胞溶解直接杀伤应激细胞和/或异常细胞(例如，肿瘤细胞、病毒感染的细胞等)。因此，在几个实施例中，提供了增强NK细胞细胞毒性的方法，该方法包括施用经工程改造以表达本文所述的活化性嵌合受体的NK细胞。在一个实施例中，施用的NK细胞是自体细胞。在进一步的实施例中，所述NK细胞是供体衍生的(同种异体的)细胞。在几个实施例中，工程改造的NK细胞导致应激细胞和/或异常细胞(例如，肿瘤细胞、病毒感染的细胞等)的间接破坏或抑制。
结合HLA-E/肽复合物的活化性嵌合受体
如上所述，在几个实施例中，NK细胞识别并破坏异常细胞(包括肿瘤细胞和/或病毒感染的细胞)。这些先天免疫细胞的细胞毒活性分别受抑制受体和活化受体(位于细胞表面)的信号传导平衡调节。前者结合健康细胞表面上表达的“自身”分子，而后者结合异常细胞上表达的配体。其基本逻辑是，与“自身”分子相互作用的NK细胞上的抑制性受体不会被活化，从而使携带“自身”分子的细胞免受NK细胞的破坏。相反，当表达活化性受体的NK细胞与“非自身”配体(例如患病细胞上的配体)相互作用时，NK细胞被活化，并随之产生细胞毒性效应。因此，活化性受体相对于抑制受体的接合增加导致NK细胞活化和靶细胞裂解。
自然杀伤细胞2组成员A(NKG2A)和C(NKG2C)是主要表达于NK细胞表面的C型凝集素受体，它们影响着抑制性和活化性信号传导的平衡。NKG2A和NKG2C都能够与例如整合膜糖蛋白CD94形成异源二聚体。此外，NKG2C/CD94和NKG2A/CD94均结合人类非经典MHC I类分子HLA-E/肽复合物。HLA-E在NK细胞识别细胞中具有专门作用，因为HLA-E结合从经典MHC I类分子的信号肽(即HLA-A、B、C、G)衍生的肽的受限子集。因此，NK细胞可以通过NKG2C/CD94和NKG2A/CD94与HLA-E的相互作用间接监测经典MHC I类分子的表达。NKG2C是一种活化性受体，HLA-E/肽复合物结合使NKG2C/CD94与带有ITAM的衔接蛋白DAP12之间相互作用。相反，NKG2A是一种抑制性受体，NKG2A/CD94通过其胞质结构域中的ITIM基序传递抑制性信号。
NK细胞识别和破坏异常细胞(包括肿瘤细胞和/或病毒感染细胞)的能力使其成为免疫治疗方法(包括基于嵌合受体的免疫治疗方法)的潜在有用的组成部分。然而，使NK细胞的使用复杂化的事实是，HLA-E在多个肿瘤中上调，并且肿瘤细胞暴露于IFNγ(其由免疫细胞分泌)增强HLA-E的表达。与NKG2A相比，NKG2C对肽复合物的亲和力较低，因此靶细胞上HLA-E表达的增加可以起到某种“伪装”的作用。这是由于更高亲和力但抑制性的结果，NKG2A能够在与靶肽的结合方面胜过NKG2C，并且因此对NK细胞活性起到总体抑制性作用。
解决这一问题的一种方法是(如在几个实施例中所提供的)编码活化性嵌合受体的多核苷酸，所述活化性嵌合受体以增强的亲和力结合HLA-E/肽复合物。在一些实施例中，活化性嵌合受体包括NKG2C变体，所述NKG2C变体被工程改造用于增强对HLA-E/肽复合物的亲和力(例如，与未修饰的NKG2C的亲和力相比)。在NKG2C变体的一些实施例中，野生型NKG2C的残基165-168被NKG2A(SIIS)的相应残基替代。在几个实施例中，NKG2C变体包含SEQID NO.58(SIIS)的氨基酸序列，其中SIIS是指丝氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-丝氨酸。在这样的实施例中，原始NKG2A受体的亲和力被“移植”，使得先前较低亲和力的NKG2C受体被工程改造以具有增强的亲和力。在几个实施例中，取决于实施例，突变的NKG2C的亲和力(与未突变的NKG2C相比)增加约20％、约30％、约40％、约50％、或更多。
在本文公开的一些实施例中，提供了编码活化性嵌合受体(例如突变的NKG2C)的多核苷酸，其中所述胞外受体结构域是缺乏其天然跨膜和/或胞内结构域的NKG2C变体的片段，在几个实施例中，所述片段赋予所述变体对于HLA-E/肽复合物的进一步增强的亲和力。在几个实施例中，NKG2C变体片段由SEQ ID NO.63编码。在几个实施例中，NKG2C变体的片段与全长野生型NKG2C具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同源性。在几个实施例中，片段可具有来自SEQ ID NO.63的一个或多个另外的突变(例如，插入、缺失和/或保守或非保守取代)，但保留配体结合功能、或在一些实施例中具有增强的配体结合功能。在几个实施例中，NKG2C变体片段以二聚体、三聚体或其他多联体形式提供，这些实施例提供增强的配体结合活性。在几个实施例中，编码NKG2C变体片段的序列任选地完全或部分经密码子优化。
另外，在几个实施例中，使用信号肽。信号肽的种类或序列可随构建体而变化。然而，在几个实施例中，使用衍生自CD8的信号肽。在一个实施例中，信号肽来自CD8a并具有SEQ ID NO.4的序列。在一些实施例中，多核苷酸编码NKG2C变体受体和DAP12。在一些实施例中，多核苷酸编码NKG2C变体受体和CD94。在一些实施例中，多核苷酸编码NKG2C变体受体、CD94和DAP12。在几个实施例中，其中使用NKG2C，进一步工程改造细胞以改变天然NKG2A的表达(例如，减少或消除转录和/或减少或消除翻译)。
在一些实施例中，NKG2A被工程改造成在HLA-E/肽复合物结合后递送活化性信号，与其正常递送抑制性信号相反。如本文所用，“NKG2A”是指NKG2A基因或编码蛋白的任何变体，衍生物或同种型，包括但不限于NKG2B。因此，根据本文公开的几个实施例，提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸，其中胞外受体结构域是NKG2A的片段，所述片段缺乏NKG2A的天然跨膜或胞内结构域，但有利地保持NKG2A结合HLA-E/肽复合物的能力。因此，在几个实施例中，由本文公开的多肽编码的嵌合受体不包含ITIM、ITAM或半ITAM/半ITAM。在几个实施例中，NKG2A片段由SEQ ID NO.65编码。在几个实施例中，NKG2A片段与全长野生型NKG2A具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同源性。在几个实施例中，片段可具有来自SEQ ID NO.65的一个或多个另外的突变(例如，插入、缺失和/或保守或非保守取代)，但保留配体结合功能、或在一些实施例中具有增强的配体结合功能。在几个实施例中，NKG2A片段以二聚体、三聚体或其他多联体形式提供，这些实施例提供增强的配体结合活性。在几个实施例中，编码NKG2A片段的序列任选地完全或部分经密码子优化。另外，在几个实施例中，使用信号肽。信号肽的种类或序列可随构建体而变化。然而，在几个实施例中，使用衍生自CD8的信号肽。在一个实施例中，信号肽来自CD8a并具有SEQ ID NO.4的序列。在一些实施例中，多核苷酸编码活化性NKG2A受体和CD94受体。
在一些实施例中，CD94被工程改造以在HLA-E/肽复合物结合后递送活化性信号。因此，根据本文公开的几个实施例，提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸，其中胞外受体结构域是CD94的片段，所述片段缺乏CD94的天然跨膜或胞内结构域，但有利地保持CD94与NKG2A和NKG2C二聚化的能力。在几个实施例中，CD94片段由SEQ ID NO.67编码。在几个实施例中，CD94片段与全长野生型CD94具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同源性。在几个实施例中，片段可具有来自SEQ ID NO.67的一个或多个另外的突变(例如，插入、缺失和/或保守或非保守取代)，但保留配体结合功能、或在一些实施例中具有增强的配体结合功能。在几个实施例中，CD94片段SEQ ID NO.68的氨基酸序列。在几个实施例中，CD94片段与全长野生型CD94具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同源性。在几个实施例中，片段可具有来自SEQ ID NO.68的一个或多个另外的突变(例如，插入、缺失和/或保守或非保守取代)，但保留配体结合功能、或在一些实施例中具有增强的配体结合功能。在几个实施例中，CD94片段以二聚体、三聚体或其他多联体形式提供，这些实施例提供增强的配体结合活性。在几个实施例中，编码CD94片段的序列任选地完全或部分经密码子优化。另外，在几个实施例中，使用信号肽。信号肽的种类或序列可随构建体而变化。然而，在几个实施例中，使用衍生自CD8的信号肽。在一个实施例中，信号肽来自CD8a并具有SEQ ID NO.4的序列。在一些实施例中，多核苷酸编码嵌合CD94受体和活化性NKG2A受体。在一些实施例中，多核苷酸编码活化性NKG2C变体受体和嵌合CD94受体。
在一些实施例中，编码本文公开的活化性嵌合受体的多核苷酸在NKG2A耗减的细胞群体中表达(例如，耗减、基本耗竭或完全耗竭表达NKG2A的细胞的NK细胞群体-例如，免疫耗竭方法)。
跨膜结构域、信号传导结构域和组合结构域
如上所述，一般的活化性嵌合受体结构包含至少一个跨膜结构域，将配体结合结构域连接至一个或多个信号结构域。然而，在几个实施例中，跨膜结构域还可用于提供信号传导功能。
在几个实施例中，CD94的片段、NKG2A的片段和/或NKG2C变体保留其正常跨膜结构域的至少一部分。在几个实施例中，跨膜结构域包含CD8的至少一部分，CD8是通常在T细胞和NK细胞上表达的跨膜糖蛋白。在几个实施例中，跨膜结构域包含CD8α，而在一些实施例中，使用CD8β。在几个实施例中，CD8α的“铰链”(例如，胞外结构域和胞内结构域之间的部分)具有SEQ ID NO.5的序列。在一些实施例中，CD8α可以被截短或修饰，使得其与具有SEQID NO.5的序列的CD8α具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，CD8β具有SEQ ID NO.6的序列。在一些实施例中，CD8β可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.6的序列的CD8β具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，使用CD8α和CD8β的二聚体、三聚体或重复序列。
在几个实施例中，跨膜结构域包含CD16，其在一些实施例中也用作信号传导结构域。CD16以两种同种型存在，a和b(也分别称为Fcγ受体IIIa和IIIb)。这些受体通常与IgG抗体的Fc部分结合，转而活化NK细胞。因此，在几个实施例中，跨膜结构域包含CD16a，而在一些实施例中，使用CD16b。在几个实施例中，CD16a具有SEQ ID NO.7的序列。在一些实施例中，CD16a被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.7的序列的CD16a具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，CD16b具有SEQID NO.8的序列。在一些实施例中，CD16b被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.8的序列的CD16b具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，使用CD16a和CD16b的二聚体。在几个实施例中，对CD16跨膜结构域的修饰包含额外的核酸残基以增加该结构域的长度。可替代地，可以缩短CD16。对CD16长度的修饰可以有利地促进增强的配体-受体相互作用。
在几个实施例中，本文提供的活化性嵌合受体包含自然杀伤受体2B4结构域(在本文中称为“2B4”，也称为CD244)，其也用作信号传导结构域。2B4在NK细胞上表达，并通过该受体与其靶细胞上的配体之间的相互作用调节非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀伤。在几个实施例中，跨膜结构域包含2B4，而在几个实施例中，2B4结构域用作胞内信号传导结构域。在几个实施例中，2B4具有SEQ ID NO.9的序列。在一些实施例中，2B4可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.9的序列的2B4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，2B4用作构建体中的唯一跨膜/信号传导结构域，然而，在几个实施例中，2B4可与一个或多个其他结构域一起使用。例如，在一些实施例中使用CD16、4-1BB和/或2B4的组合。
在一些实施例中，通过DAP10实现信号传导。在几个实施例中，使用DAP10的二聚体。在几个实施例中，跨膜结构域包含DAP10。在几个实施例中，DAP10具有SEQ ID NO.10的序列。在一些实施例中，DAP10可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.10的序列的DAP10具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。类似地，在一些实施例中，可以使用DAP12，因为它也可以转导这些信号。在几个实施例中，DAP12具有SEQ ID NO.11的序列。在一些实施例中，DAP12可以被截短或修饰，使得其与具有SEQID NO.11的序列的DAP12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，使用DAP10和DAP12的异二聚体。然而，在一些实施例中，在NKG2A、NKG2C或NKG2D构建体中既不使用DAP10也不使用DAP12。
在几个实施例中，通过4-1BB(也称为CD137和肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF 9))提供信号传导。4-1BB是共刺激免疫检查点分子，通常用作活化的免疫细胞的刺激分子(例如，4-1BB的交联增强T细胞增殖和细胞溶解活性)。然而，在几个实施例中，4-1BB的功能有利地与NK细胞结合使用。在几个实施例中，4-1BB具有SEQ ID NO.12的序列。在一些实施例中，4-1BB可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.12的序列的4-1BB具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，4-1BB是唯一的信号传导结构域，但如上所述，在几个实施例中，4-1BB与本文披露的一种或多种其他跨膜结构域/信号传导结构域组合时出人意料地作用良好。例如，在几个实施例中，CD16与4-1BB结合提供协同刺激作用，产生特别有效(例如细胞毒性)的NK细胞。在几个实施例中，DAP10与4-1BB结合提供协同刺激作用，产生特别有效(例如细胞毒性)的NK细胞。在几个实施例中，DAP10与4-1BB和2B4结合提供协同刺激作用，产生特别有效(例如细胞毒性)的NK细胞。
在几个实施例中，信号传导结构域包含CD3 T细胞受体复合物的至少一部分。T细胞受体复合物包含多个亚基，包括ζ、α、β、γ、δ和ε亚基。在几个实施例中，根据本文披露的几个实施例工程改造的NK细胞包含这些亚基中的至少一个(或其片段)。在几个实施例中，信号传导结构域包含CD3ζ亚基。在几个实施例中，CD3ζ具有SEQ ID NO.13的序列。在一些实施例中，CD3ζ可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.13的序列的CD3ζ具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，CD3ζ突变(例如，氨基酸突变、插入或缺失)，使得该结构域不再与基于经典免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM基序一致。因此，在几个实施例中，NK细胞包含不含有ITAM基序的工程改造的受体。在一些实施例中，不使用CD3ζ。在一些实施例中，所得的工程改造的NK细胞对靶细胞表现出特别增强的细胞毒性，同时具有有限的或减少的不良副作用。在几个实施例中，这是由在给定实施例中使用的活化性嵌合受体的各个部分的协同相互作用造成。在几个实施例中，CD3ζ与4-1BB结合提供协同刺激作用，产生特别有效(例如细胞毒性)的NK细胞。在几个实施例中，CD3ζ与2B4结合提供协同刺激作用，产生特别有效(例如细胞毒性)的NK细胞。
在更进一步的实施例中，活化性嵌合受体的信号传导部分包含ITAM的部分，例如半-tam。在几个实施例中，这些部分不构成经典的ITAM序列，但是包含仍然可以传递NK细胞细胞毒性所需信号的部分。在几个实施例中，半-tam具有SEQ ID NO.14的序列(其中X可以是任何残基)。在一些实施例中，半-tam可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.14的序列的半-tam具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在一些实施例中，活化性嵌合受体构建体包含SEQ ID NO.14的半-tam。在几个实施例中，可以使用多个半-tam，例如以头对尾、尾对头、头对头或尾对尾的配置。在一些实施例中，至少一个半-tam的存在使得包含使用至少一个半-tam的活化性嵌合受体的NK细胞的信号传导和细胞毒性增强。如下文更详细讨论的，在几个活化性嵌合受体中包含NKp80，其是半-tam的一个非限制性实例。
在几个实施例中，使用另外的信号传导区域，包括例如衍生自信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族的受体的信号传导区域。这些受体包括但不限于2B4(如上所述)。SLAM家族的受体在其胞质尾部中具有基于酪氨酸的共有基序。该基序是S/TxYxxL/I，其被称为基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)(SEQ ID NO.15)。这些受体通过SLAM相关蛋白(SAP，由基因SH2D1A编码)传递活化信号，SAP募集酪氨酸激酶Fyn。因此，根据几个实施例，信号传导区域包含含有ITSM基序的多肽序列(或编码其的核酸)。在几个实施例中，ITSM基序不需要完全编码，但信号传导区域能够通过SAP(或另一种类似途径)传递活化信号。在几个实施例中，ITSM基序具有SEQ ID NO.15的序列(其中X可以是任何氨基酸残基)。在几个实施例中，ITSM基序可被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.15的序列的ITSM基序具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，ITSM基序包含SEQ ID NO.15的序列。
除了胞外受体结构域、跨膜结构域和信号传导结构域(和组合跨膜/信号传导结构域)的这些变异之外，在一些实施例中，还可以提供另外的共活化性分子。例如，在几个实施例中，NK细胞经工程改造以表达膜结合的白细胞介素15(mbIL15)。在此类实施例中，NK细胞上mbIL15的存在通过协同增强NK细胞的增殖和寿命而进一步增强NK细胞的细胞毒性作用。在几个实施例中，mbIL15具有SEQ ID NO.16的核酸序列。在一些实施例中，mbIL15可以被截短或修饰，使得其与SEQ ID NO.16的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，mbIL15具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列。结合本文公开的活化性嵌合受体，这些实施例提供了特别有效的NK细胞组合物，用于靶向和破坏特定的靶细胞。
嵌合受体构建体
鉴于本文提供的披露，存在多种活化性嵌合受体，其可以在NK细胞中产生和表达，以靶向和破坏特定的靶细胞，例如患病细胞或癌细胞。下文更详细地讨论了此类嵌合受体的非限制性实例。
如上所述，T细胞受体复合物的部分，特别是CD3ζ，充当免疫信号级联的有效活化剂。同样，受体4-1BB(肿瘤坏死因子超家族成员)在配体结合后活化NK细胞。在几个实施例中，这两种信号传导组分在配体与嵌合受体结合后以协同方式起作用活化NK细胞。因此，在几个实施例中，提供了编码NKG2A/CD8a/4-1BB/CD3ζ嵌合受体的多核苷酸，该嵌合受体包含结合HLA-E/肽复合物的NKG2A片段胞外受体结构域、CD8跨膜区和包含4-1BB和CD3ζ的信号传导结构域的效应子结构域。在一个实施例中，嵌合受体由SEQ ID NO:61的核酸序列编码。在另一个实施例中，NKG2A/CD8a/4-1BB/CD3ζ嵌合受体包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在几个实施例中，当NK细胞同时表达mbIL15时，该构建体特别有效，mbIL15对NK细胞的活化和细胞毒性提供进一步的协同效应。在一些实施例中，嵌合受体的序列可以不同于SEQ IDNO.61，但取决于实施例，与SEQ ID NO.61保留至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源。在几个实施例中，嵌合受体可以不同于SEQ ID NO.61，嵌合受体保留NK细胞活化和/或细胞毒性功能或在一些实施例中具有增强的NK细胞活化和/或细胞毒性功能。
此外，在几个实施例中，提供了编码CD94/CD8a/4-1BB/CD3ζ嵌合受体的多核苷酸，所述嵌合受体包含CD94片段胞外受体结构域、CD8跨膜区和包含4-1BB和CD3ζ的信号传导结构域的效应子结构域。在一个实施例中，所述嵌合受体由SEQ ID NO:59的核酸序列编码。在另一个实施例中，CD94/CD8a/4-1BB/CD3ζ嵌合受体包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在几个实施例中，当NK细胞同时表达mbIL15时，该构建体特别有效，mbIL15对NK细胞的长期活化和细胞毒性提供进一步的协同效应(例如，体内持久性)。在一些实施例中，嵌合受体的序列可以不同于SEQ ID NO.59，但取决于实施例，与SEQ ID NO.59保留至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源。在几个实施例中，嵌合受体可以不同于SEQID NO.59，嵌合受体保留NK细胞活化和/或细胞毒性功能或在一些实施例中具有增强的NK细胞活化和/或细胞毒性功能。
受体2B4具有几个种基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)，并具有转导活化信号的潜力。同样，通过受体4-1BB(肿瘤坏死因子超家族成员)的信号传导也在配体结合后活化NK细胞。因此，在一些实施例中，利用这些信号传导分子协同产生出人意料地有效的细胞毒性NK细胞的能力，提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸，所述活化性嵌合受体包含胞外受体结构域，所述胞外受体结构域包含NKG2A、CD94或NKG2C变体的片段，CD8a跨膜区和包含4-1BB和2B4信号传导结构域的效应子结构域。另外，在几个实施例中，该构建体可任选地与mbIL15共表达。
在几个实施例中，2B4与CD3ζ的组合与NK细胞一起使用以产生针对靶细胞的增强的细胞毒性。因此，在几个实施例中，提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸，所述活化性嵌合受体包含胞外受体结构域，所述胞外受体结构域包含NKG2A、CD94或NKG2C变体的片段，CD8a跨膜区，以及含CD3ζ和2B4的信号传导结构域的效应子结构域。另外，在几个实施例中，该构建体可任选地与mbIL15共表达。如上所述，4-1BB与CD3ζ和2B4一样是免疫信号级联的有效活化剂。在几个实施例中，这三种信号传导组分在配体与嵌合受体结合后以协同方式起作用活化NK细胞。
在几个实施例中，提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸，所述活化性嵌合受体包含胞外受体结构域，所述胞外受体结构域包含NKG2A、CD94或NKG2C变体的片段，CD8a跨膜区，以及含4-1BB和DAP10的信号传导结构域的效应子结构域。另外，在几个实施例中，该构建体可任选地与mbIL15共表达。
在几个另外的实施例中，活化性嵌合受体的跨膜和效应子结构域(和相关功能)衍生自相同的肽。CD16是在NK细胞表面上表达的有效活化受体。因此，在几个实施例中，提供了编码NKG2A/CD16嵌合受体、NKG2C变体/CD16嵌合受体或CD94/CD16嵌合受体的多核苷酸，所述NKG2A/CD16嵌合受体、NKG2C变体/CD16嵌合受体或CD94/CD16嵌合受体包含NKG2C变体、CD94或NKG2A的片段以及含跨膜区和胞内效应子结构域两者的CD16肽。另外，在几个实施例中，该构建体可任选地与mbIL15共表达。
在几个另外的实施例中，提供了编码NKG2A/CD16/4-1BB嵌合受体、CD94/CD16/4-1BB嵌合受体或NKG2C变体/CD16/4-1BB嵌合受体的多核苷酸，其中4-1BB的信号传导结构域作为效应子结构域中活化信号的第二传感器。另外，在几个实施例中，该构建体可任选地与mbIL15共表达。
NCR1(NKp46)、NCR2(NKp44)和NCR3(NKp30)是NK细胞上的受体，其在配体结合后转导活化信号。因此，在几个实施例中，提供了编码NKG2A/NCR1嵌合受体、CD94/NCR1嵌合受体或NKG2C变体/NCR1嵌合受体的多核苷酸，所述NKG2A/NCR1嵌合受体、CD94/NCR1嵌合受体或NKG2C变体/NCR1嵌合受体包含NKG2A、CD94或NKG2C变体片段，以及含跨膜区和胞内效应子结构域两者的NCR1肽。
在几个另外的实施例中，提供了编码NKG2A/NCR1/4-1BB嵌合受体、CD94/NCR1/4-1BB嵌合受体或NKG2C变体/NCR1/4-1BB嵌合受体的多核苷酸，其中4-1BB的信号传导结构域作为效应子结构域中活化信号的第二传感器，导致协同增强的NK细胞活化和细胞毒性。在几个另外的实施例中，提供了编码NKG2A/NCR2嵌合受体、CD94/NCR2嵌合受体、NKG2C变体/NCR2嵌合受体的多核苷酸，所述NKG2A/NCR2嵌合受体、CD94/NCR2嵌合受体、NKG2C变体/NCR2嵌合受体包括包含跨膜区和胞内效应子结构域两者的NCR2肽。如具有NCR1一样，在几个实施例中，这些构建体特别适合用于产生表达嵌合受体的NK细胞，因为它们的序列相对较小且简单。然而，在几个实施例中，它们保留了产生高效NK细胞的能力，尽管构建体明显简单。另外，在几个实施例中，这些构建体可任选地与mbIL15共表达。
在几个另外的实施例中，提供了编码NKG2A/NCR3嵌合受体、CD94/NCR3嵌合受体或NKG2C变体/NCR3嵌合受体的多核苷酸，所述NKG2A/NCR3嵌合受体、CD94/NCR3嵌合受体或NKG2C变体/NCR3嵌合受体包括包含跨膜区和胞内效应子结构域两者的NCR3肽。如具有NCR1和/或NCR2一样，在几个实施例中，这些构建体特别适合用于产生表达活化性嵌合受体的NK细胞，因为它们的序列相对较小且简单。然而，在几个实施例中，它们保留了产生高效NK细胞的能力，尽管构建体明显简单。
在几个另外的实施例中，提供了编码NKG2A/NCR2/4-1BB嵌合受体、CD94/NCR2/4-1BB嵌合受体或NKG2C变体/NCR2/4-1BB嵌合受体的多核苷酸，其中4-1BB的信号传导结构域作为效应子结构域中活化信号的第二传感器，从而导致信号传导结构域之间的协同效应，以及出乎意料地有效地细胞毒性NK细胞。另外，在几个实施例中，该构建体可任选地与mbIL15共表达。
在几个另外的实施例中，提供了编码NKG2A/NCR3/4-1BB嵌合受体、CD94/NCR3/4-1BB嵌合受体或NKG2C变体/NCR3/4-1BB嵌合受体的多核苷酸，其中4-1BB的信号传导结构域作为效应子结构域中活化信号的第二传感器，从而导致信号传导结构域之间的协同效应，以及出乎意料地有效地细胞毒性NK细胞。另外，在几个实施例中，该构建体可任选地与mbIL15共表达。
在一些实施例中，本文披露的嵌合受体的表面表达和功效通过间隔区(铰链)的变化而增强，在一些实施例中，间隔区(铰链)位于跨膜结构域和CD94片段、NKG2A片段或NKG2C片段中的任一个之间的胞外结构域中。在一些实施例中，铰链区可以包含在嵌合活化性受体的其他部分之间(例如，在胞内结构域和跨膜结构域之间，或在多个胞内结构域之间)。在一些实施例中，用于本文其他地方披露的某些目的的结构域可以提供额外的功能。例如，在几个实施例中，CD8a被重新目的化以用作铰链区(在几个实施例中，由SEQ ID NO:5的核酸序列编码)。在另一个实施例中，铰链区包含N末端截短形式的CD8a和/或C末端截短形式的CD8a。取决于实施例，这些截短可以与SEQ ID NO.5编码的铰链至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％同源。在几个另外的实施例中，铰链包含甘氨酸和丝氨酸残基的跨度(本文称为“GS接头”)，其中GSn代表序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ IDNO.42)。在一个实施例中，铰链包含CD8a和GS3，并且由SEQ ID NO:32的氨基酸序列编码，例如，其中n＝3。在另外的实施例中，取决于实施例，n的值可以等于1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大。在几个实施例中，铰链也可以构造为GSn/CD8a。或者，GS接头可包含整个铰链区。在一个这样的实施例中，铰链区由SEQ ID NO:33的核酸序列编码。在另一个这样的实施例中，铰链区由SEQID NO:34的核酸序列编码。
在几个实施例中，活化性嵌合受体构建体使用2B4胞内信号传导结构域。在几个实施例中，所述结构域包括SEQ ID NO.35的氨基酸序列。在一些实施例中，2B4结构域由SEQID NO.36的核酸序列编码。在一些实施例中，活化性嵌合受体中使用的2B4胞内结构域的序列可以不同于SEQ ID NO.36，但取决于实施例，与SEQ ID NO.36保留至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源。在几个实施例中，虽然活化性嵌合受体的信号传导结构域可以不同于SEQ ID NO.36，但活化性嵌合受体保留NK细胞活化和/或细胞毒性功能或在一些实施例中具有增强的NK细胞活化和/或细胞毒性功能。同样地，在几个实施例中，在几个实施例中使用NKp80胞内结构域。在一些实施例中，NKp80结构域是唯一的胞内信号传导结构域，而在一些实施例中，该结构域与一个或多个另外的结构域结合使用。在几个实施例中，NKp80由SEQ ID NO.37的氨基酸序列编码。在一些实施例中，NKp80结构域由SEQ ID NO.38的核酸序列编码。在一些实施例中，嵌合受体中使用的NKp80胞内结构域的序列可以不同于SEQ ID NO.38，但取决于实施例，与SEQ ID NO.38保留至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源。在几个实施例中，虽然活化性嵌合受体的信号传导结构域可以不同于SEQ ID NO.38，但嵌合受体保留NK细胞活化和/或细胞毒性功能或在一些实施例中具有增强的NK细胞活化和/或细胞毒性功能。
在一些实施例中，活化性嵌合受体使用β-肾上腺素能受体的一部分作为跨膜结构域。在几个实施例中，该部分包含β-肾上腺素能胞外结构域的一部分。在几个实施例中，该部分是β-肾上腺素能受体跨膜结构域的一部分。在几个实施例中，使用β肾上腺素能受体的胞外结构域和跨膜结构域的组合。根据实施例，所述部分来自β-1和/或β-2肾上腺素能受体。在几个实施例中，使用β-2肾上腺素能受体的N-末端胞外区域的一部分。在几个实施例中，该部分具有SEQ ID NO.39的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外β-2肾上腺素能结构域由SEQ ID NO.40的核酸序列编码。在一些实施例中，嵌合受体中使用的胞外β-2肾上腺素能结构域的序列可以不同于SEQ ID NO.39，但取决于实施例，与SEQ ID NO.39保留至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源。在几个实施例中，使用β-2肾上腺素能受体的第一跨膜螺旋，任选地与胞外β-2肾上腺素能结构域结合。在几个实施例中，β-2肾上腺素能受体的第一跨膜螺旋具有SEQ ID NO.41的氨基酸序列。在一些实施例中，β-2肾上腺素能受体的第一跨膜螺旋由SEQ ID NO.42的核酸序列编码。在一些实施例中，嵌合受体中使用的β-2肾上腺素能受体的第一跨膜螺旋的序列可以不同于SEQ ID NO.41，但取决于实施例，与SEQ ID NO.41保留至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源。
如上所述，在几个实施例中，使用密码子优化的序列。例如，在几个实施例中，对包含CD94、NKG2A或NKG2C变体的片段的胞外受体结构域进行密码子优化(完全或部分)。然而，在几个实施例中，不进行密码子优化。在几个实施例中，嵌合受体构建体具有包含未优化的NKG2A、CD94或NKG2C变体的片段的胞外结构域，CD8a铰链和4-1BB信号传导结构域。在几个实施例中，嵌合受体构建体具有包含未优化的NKG2A、CD94或NKG2C变体的片段的胞外结构域，CD8a铰链和跨膜结构域，以及4-1BB信号传导结构域。
在几个实施例中，活化性嵌合受体构建体具有包含未优化的NKG2A、CD94或NKG2C变体的片段的胞外结构域，CD8a铰链和NKp80信号传导结构域。在几个实施例中，嵌合受体构建体具有包含未优化的NKG2A、CD94或NKG2C变体的片段的胞外结构域，CD8a铰链和跨膜结构域，以及NKp80信号传导结构域。在几个实施例中，GS接头(例如GS3接头)连接4-1BB和NKp80结构域。
在几个实施例中，CD8跨膜结构域与2B4胞内结构域偶联。在几个实施例中，CD8跨膜结构域被跨膜和胞内的2B4结构域替代。在几个实施例中，CD8跨膜结构域被2B4替代，并且4-1BB以近端构型表达。
在几个实施例中，CD16胞内信号传导结构域与CD3ζ或γ亚基偶联，所述CD3ζ或γ亚基相对于本文所述的活化性嵌合受体反式地外源表达。如上所述，此类构建体可导致意外增强的信号转导，并因此导致NK细胞的细胞毒性作用的出人意料地增加。
在几个实施例中，活化性嵌合受体被配置为二聚化，如本文另外详细讨论的。在几个实施例中，包含根据本文公开的几个实施例的CD94、NKG2A或NKG2C变体的片段的受体任选地二聚化。取决于实施例，二聚化可包括同源二聚体或异二聚体。在一些实施例中，二聚化导致活化性嵌合受体(以及因此表达受体的NK细胞)的亲合力转变为在协调平衡减少(或缺乏)不利毒性作用情况下更好的配体识别。在更进一步的实施例中，胞外受体结构域还包含CD8a信号肽。在几个实施例中，活化性嵌合受体使用内部二聚体或一个或多个组分亚基的重复。例如，在几个实施例中，嵌合受体包含与第二NKG2C变体胞外结构域偶联的NKG2C变体胞外结构域，和跨膜/信号传导区(或单独的跨膜区连同单独的信号传导区)。在几个实施例中，胞外结构域中的一个或多个是密码子优化的。在几个实施例中，两个胞外结构域通过接头(例如GSn接头)分开。在一个实施例中，使用GS3接头。在几个实施例中，跨膜结构域包含β-肾上腺素能受体的胞外区域。在一些实施例中，跨膜结构域跨膜结构域包含β-2肾上腺素能受体的胞外区域，并且还包含β-2肾上腺素能受体的第一跨膜结构域。在几个实施例中，信号传导区包含4-1BB。在几个实施例中，信号传导区包含NKp80。在一些实施例中，信号传导区包含CD16跨膜-胞内结构域。在几个实施例中，信号传导区包含4-1BB结合NKp80或CD16跨膜-胞内结构域。
根据本文披露的几个实施例，提供了使用密码子优化的胞外受体结构域的另外的嵌合受体(任选地，这些构建体也可以用非优化的或部分优化的结构域进行重复)。例如，在几个实施例中，密码子优化的胞外结构域与铰链和至少两个结构域(例如跨膜结构域和信号传导结构域)偶联。在几个实施例中，多个信号传导结构域提供NK细胞的增强的细胞毒性功效，因为多个非冗余信号级联在运作。虽然在一些实施例中，这些多个途径可以会聚在单个信号传导分子(例如，IFNγ)上，但由于驱动细胞毒性终点的信号分子的总体量级，总体细胞毒性效应出乎意料地增加。
在另外的实施例中，活化性嵌合受体的某些组分可以被一个或多个另外的亚基替代，这些亚基导致增强的功效(例如，NK细胞的活化或细胞毒性)。例如，在一个实施例中，CD16胞内信号传导结构域可以用DAP10的四重复序列(例如，4xDAP10)替代。在另外的实施例中，CD16胞内信号传导结构域可以用Zap70亚基替代。某些此类实施例导致出人意料地增强的NK细胞细胞毒性。
在几个另外的实施例中，效应子结构域包含一个或多个共有半-ITAM序列，以增强配体结合后活化信号传导的转导。在另外的实施例中，在4-1BB、CD16、NCR1、NCR2和/或NCR3的信号传导结构域之间包含GS接头增强了信号转导。此外，在一些实施例中，CD3ζ和FcRγ中的一者或两者与本文所述的嵌合受体一起(在相同或不同的构建体上)另外表达，这导致出人意料地增强的信号转导，并因此出人意料地增加NK细胞的细胞毒性作用。根据实施例，CD3ζ和FcRγ中的一个或多个的工程改造的表达补充NK细胞对这些分子的内源表达，从而进一步增强NK细胞的信号传导和最终细胞毒性效力。
任选地，取决于实施例，本文披露的任何多核苷酸还可编码活化性嵌合受体的一个或多个组成亚基的截短和/或变体，但仍保留其将NK细胞导向靶细胞的能力，并且在几个实施例中出人意料地增强结合后的细胞毒性。此外，本文披露的任何多核苷酸还可任选地包括编码嵌合受体的各种组成亚基的密码子优化的核苷酸序列。如本文所用，术语“片段”和“截短的”应给出它们的普通含义，并且还应包括蛋白质的N-和C-末端缺失变体。
可以将编码本文所述活化性嵌合受体的多核苷酸插入载体中以在NK细胞中实现重组蛋白表达。在一个实施例中，多核苷酸与至少一个用于表达活化性嵌合受体的调节元件可操作地连接。在具体的实施例中，与本文公开的肽异源的转录调节元件(例如内部核糖体进入位点(IRES)或增强子元件)用于指导活化性嵌合受体的转录。根据实施例，活化性嵌合受体的各种组成部分可以在单个载体中递送至NK细胞，或者可替代地在多个载体中递送。在一些实施例中，活化性嵌合受体构建体在单一载体中递送，而另一种增强活化性嵌合受体功效的因子(例如mbIL15)在分开的载体中递送。在几个实施例中，活化性嵌合受体和增强活化性嵌合受体功效的因子(例如mbIL15)在单一载体中递送。无论使用多少载体，任何多核苷酸可任选地包括标签序列，该标签序列允许鉴定表达该构建体的NK细胞的存在。例如，在几个实施例中，使用FLAG标签(DYKDDDDK，SEQ ID NO.55)。还可用其他标签序列，例如多组氨酸标签(His标签)(HHHHHH，SEQ ID NO.56)，HA标签或myc标签(EQKLISEEDL；SEQID NO:57)。可替代地，使用绿色荧光蛋白或其他荧光部分。还可以使用标签类型的组合来单独识别活化性嵌合受体的亚组分。
在几个实施例中，编码活化性嵌合受体的多核苷酸是可以通过电穿孔引入NK细胞的mRNA。在另一个实施例中，载体是病毒，优选逆转录病毒，其可以通过转导引入NK细胞。在几个实施例中，载体是鼠干细胞病毒(MSCV)。在另外的实施例中，可以使用其他载体，例如可以使用慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。在几个实施例中，使用非HIV衍生的逆转录病毒。选择的载体取决于多种因素，包括但不限于转录调节元件的强度和用于表达蛋白质的细胞。载体可以是质粒、噬菌粒、粘粒、病毒载体、噬菌体、人工染色体等。在另外的实施例中，载体可以是游离载体、非同源地或同源地整合的载体，其可以通过任何合适的方式(转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等)引入适当的细胞中以转化它们。在几个实施例中使用诱导NK细胞中活化性嵌合受体表达的其他方法，包括例如SV40早期启动子区、劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复序列中包含的启动子、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调控序列、腺病毒(ADV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、牛乳头瘤病毒(BPV)启动子、细小病毒B19p6启动子、β-内酰胺酶启动子、tac启动子、胭脂碱合成酶启动子区或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子、核酮糖二磷酸羧化酶启动子、Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、含有修饰MoMuLV LTR的U3区和骨髓增生性肉瘤病毒增强子的合成MND启动子和碱性磷酸酶启动子。
可以改造自然杀伤细胞以表达本文公开的活化性嵌合受体。可以使用本领域技术人员已知的任何技术将活化性嵌合受体表达构建体引入NK细胞中。在一个实施例中，活化性嵌合受体在NK细胞中瞬时表达。在另一个实施例中，活化性嵌合受体在NK细胞中稳定表达。在另一个实施例中，NK细胞是自体细胞。在另一个实施例中，NK细胞是供体来源的(同种异体的)细胞。
本文进一步提供了治疗患有癌症或传染病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含经工程改造以表达如本文披露的活化性嵌合受体的NK细胞的组合物，所述活化性嵌合受体设计成靶向在受损或患病细胞或组织上差异表达(例如，与正常细胞或组织相比表达程度不同)的标志物或配体。如本文所用，术语“进行表达”，“表达的”和“表达”应给出其普通含义，并且应指允许或使基因或多核苷酸序列中的信息得以表现，例如通过活化与相应基因或DNA序列的转录和翻译有关的细胞功能来产生蛋白质。表达产物本身，例如所得蛋白质，也可以说成是由细胞“表达”的。表达产物可以表征为胞内、胞外或跨膜。术语“胞内”应给出其普通含义，并且应指细胞内部。术语“胞外”应给出其普通含义，并且应指细胞外部。术语“跨膜”应给出其普通含义，并且应指多肽的包埋在细胞膜中的至少一部分。术语“胞质”应具有其普通含义，并且应指位于细胞核外、细胞膜内。如本文所用，在对受试者给予治疗的背景下，术语“治疗(treat)”、“进行治疗(treating)”和“治疗(treatment)”应给予其普通含义，并且应指受试者源自治疗的有益效果。在某些实施例中，用本文所述的一种或多种基因工程改造的细胞治疗受试者实现以下效果中的一种、两种、三种、四种或更多种，这些效果包括例如：(i)减少或改善疾病或与其相关的症状的严重程度；(ii)减少与疾病相关的症状的持续时间；(iii)防止疾病或与其相关的症状的进展；(iv)疾病或与其相关的症状的消退；(v)防止与疾病相关的症状的发展或发作；(vi)防止与疾病相关的症状再次发生；(vii)减少受试者的住院治疗；(viii)减少住院治疗时长；(ix)患有疾病的受试者的存活增加；(x)减少与疾病相关的症状的数目；(xi)另一种疗法的一个或多个预防效果或治疗效果的增强、改善、补充、互补或增大。可以通过多种途径给药，包括但不限于静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、肝内、腹膜内和/或局部递送至受影响的组织。对于给定受试者基于他们的体重、疾病类型和状态以及所需的治疗积极性可以容易地确定的NK细胞剂量，但取决于实施例，范围从约105个细胞/kg至约1012个细胞/kg(例如，105-107、107-1010、1010-1012及其中的重叠范围)。在一个实施例中，使用剂量递增方案。在一些实施例中，施用一个范围的NK细胞，例如约1x106个细胞/kg与约1x108个细胞/kg之间。根据实施例，可以治疗各种类型的癌症或传染病。本文提供的各种实施例包括治疗或预防癌症的以下非限制性实例，包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、淋巴瘤、胃肠癌、阑尾癌、中枢神经系统癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(包括但不限于星形细胞瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、髓质上皮瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病病(CML)、慢性骨髓增生性障碍、导管癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、肾细胞癌、白血病、口腔癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、胰腺癌、肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤、眼癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、垂体癌、子宫癌和阴道癌。
此外，本文提供的各种实施例包括治疗或预防传染病的以下非限制性实例，包括但不限于细菌来源的感染，该细菌来源的感染可包括例如来自以下一个或多个属的细菌感染：包特菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁杆菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)和嗜衣原体属(Chlamydophila)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次体属(Rickettsia)、沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)和耶尔森菌属(Yersinia)，以及突变体或其组合。在几个实施例中，提供了用于治疗多种真菌感染的方法，并且诸如真菌来源的感染可包括例如来自以下一个或多个属的真菌的感染：曲霉属、芽生菌属、念珠菌属、球孢子菌属、隐球菌属和组织胞浆菌属，以及其突变体或组合。在一些实施例中，提供了治疗多种病毒感染的方法，这些病毒感染是例如由一种或多种病毒引起的病毒感染，该一种或多种病毒是例如腺病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疮疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、埃博拉病毒、人疱疹病毒8型、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒和水痘-带状疱疹病毒。
在一些实施例中，本文还提供了核酸和氨基酸序列，该核酸和氨基酸序列与SEQID NO.1-68的对应核酸或氨基酸序列相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％(及其中的范围)的同源性并且与对应的SEQ ID NO.1-68相比还表现出一种或多种功能：包括但不限于，(i)增强的增殖，(ii)增强的活化，(iii)中的呈递配体的细胞的增强的细胞毒性活性，该配体与携带由这些核酸和氨基酸序列编码的受体的NK细胞结合，(iv)增强的归巢至肿瘤或感染部位，(v)减少的脱靶细胞毒性作用，(vi)增强的免疫刺激细胞因子和趋化因子(包括但不限于IFNg、TNFa、IL-22、CCL3、CCL4和CCL5)的分泌，(vii)增强的刺激进一步先天性和适应性免疫应答的能力，和(viii)其组合。
另外，在几个实施例中，提供了对应于本文披露的任何核酸的氨基酸序列，同时考虑了核酸编码的简并性。此外，与本文明确披露的那些不同但具有功能相似性或等同性的那些序列(无论是核酸还是氨基酸)也涵盖在本披露的范围内。前述包括突变体、截短、取代或其他类型的修饰。
根据几个实施例，本文提供了编码活化性嵌合受体的多核苷酸，这些嵌合受体包含胞外受体结构域，其中所述胞外受体结构域包含：CD94、NKG2A或NKG2C变体的片段，含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域。在几个实施例中，多核苷酸编码包含CD16的效应子结构域。在几个实施例中，多核苷酸编码包含NCR1的效应子结构域。在几个实施例中，多核苷酸编码包含NCR2的效应子结构域。在几个实施例中，多核苷酸编码包含NCR3的效应子结构域。在一些实施例中，多核苷酸编码包含4-1BB的另外的效应子结构域部分。在几个实施例中，多核苷酸编码由CD16和CD94、NKG2A或NKG2C变体的片段构成的嵌合受体。在几个实施例中，多核苷酸编码由NCR1和CD94、NKG2A或NKG2C变体的片段构成的嵌合受体。在几个实施例中，多核苷酸编码由NCR2和CD94、NKG2A或NKG2C变体的片段构成的嵌合受体。在另外的实施例中，多核苷酸编码由与CD16和任选的4-1BB偶联的CD94、NKG2A或NKG2C变体的片段构成的嵌合受体。在几个实施例中，取决于实施例，CD16被NCR1替代，并且在一些实施例中，被NCR2或甚至NCR3替代。在几个实施例中，效应子结构域还包含在例如4-1BB与CD16、NCR1、NCR2或NCR3之一之间的GS接头。
在几个实施例中，胞外受体结构域还包含铰链区。在几个实施例中，铰链区包含CD8a。然而，在另外的实施例中，铰链区还包含一个或多个接头，在一些实施例中，这些接头包含GS9、CD8a/GS3、截短的CD8a、GS3等。
在几个实施例中，胞外受体结构域还包含CD8a信号肽。在几个实施例中，效应子结构域包含一个或多个半-ITAM序列。在几个实施例中，嵌合受体不包含DNAX活化蛋白10(DAP10)。在几个实施例中，嵌合受体不包含ITAM基序，而是使用替代的信号传导区，例如ITSM、半tam或其他共刺激区。
在几个实施例中，本文所述的活化性嵌合受体与表达自然杀伤细胞组2成员D的天然配体(NKG2D)的嵌合受体靶向细胞共表达，导致协同增强的NK细胞活化和细胞毒性。因此，在几个实施例中，还提供了编码包含胞外受体结构域的NKGD嵌合受体的多核苷酸，其中所述胞外受体结构域包含结合天然NKG2D的肽，其中结合NKG2D的天然配体的肽是NKG2D的片段、跨膜区和效应子结构域。在几个实施例中，NKG2D片段由包含SEQ ID NO:1序列的片段的多核苷酸编码。在几个实施例中，NKG2D片段包含SEQ ID NO:2的序列，而在另外的实施例中，编码NKG2D的片段是经密码子优化的，并且包含例如SEQ ID NO:3的序列。在几个实施例中，效应子结构域包含CD16、NCR1、NCR2、NCR3、4-1BB、CD28、NKp80、DAP10、CD3ζ和2B4中的一个或多个。在几个实施例中，这些效应子结构域与CD8α偶联。在几个实施例中，NKG2D结构域不是全长或野生型NKG2D，并且在一些这样的实施例中，DAP10不用于嵌合受体构建体中。在另外的实施例中，不使用CD3ζ或ITAM。如本文所讨论的，将跨膜结构域和胞内结构域的组合用于几个实施例中，其提供NKG2D嵌合受体组分之间的协同相互作用并产生增强的细胞毒性作用。在几个实施例中，在NKG2D嵌合受体构建体中提供了接头、铰链或其他“间隔”元件。例如，在几个实施例中，效应子结构域包含接头。在几个实施例中，多核苷酸编码NKG2D嵌合受体构建体的各部分之间(例如4-1BB、CD28、CD16、NCR1、NCR3、CD3ζ、DAP10、2B4或NKp80中的任何之间)的GS接头。在几个实施例中，NKG2D嵌合受体效应子结构域包含接头。在几个实施例中，多核苷酸编码NKG2D嵌合受体构建体的各部分之间(例如4-1BB、CD28、CD16、NCR1、NCR3、2B4或NKp80中的任何之间)的GS接头。在几个实施例中，提供了包含铰链区的嵌合受体。在几个实施例中，NKG2D嵌合受体效应子结构域包含一个或多个半ITAM序列。另外，本文披露的任一嵌合受体也可与膜结合白细胞介素15(mbIL15)共表达。
在几个实施例中，提供的多核苷酸是mRNA。在一些实施例中，多核苷酸与至少一个用于表达活化性嵌合受体的调节元件可操作地连接。如本文所用，术语“核酸”，“核苷酸”和“多核苷酸”应给出它们的普通含义，并且应包括脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核酸、核糖核苷酸和核糖核酸及其聚合形式，并且包括单链形式或双链形式。核酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。核酸类似物包括以下那些，其包括非天然存在的碱基、与天然磷酸二酯键以外的其他核苷酸连接的核苷酸，或包括通过磷酸二酯键以外的连接而附接的碱基。因此，核酸类似物包括，例如但不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硼磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)、锁核酸(LNA)等。如本文所用，术语“可操作地连接”，例如在调节核酸序列与异源核酸序列“可操作地连接”的情况下，应给出其普通含义，并且应表示调节核酸序列是与异源核酸序列处于功能关系。在IRES的情况下，“可操作地连接”是指含有内部核糖体进入位点的核酸序列和在mRNA序列中间的异源编码序列起始位点(其导致异源编码序列的翻译)之间的功能性连接。如本文所用，术语“载体”应给出其普通含义，并且是应指以下载体，其可以将DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入基因工程改造细胞中，从而转化基因工程改造的细胞并促进导入的序列的表达(例如转录和/或翻译)。载体包括病毒、质粒、噬菌体等。本文所用的术语“嵌合受体”应给出其普通含义，并且应指细胞表面受体，所述细胞表面受体包含至少两个不是天然一起存在于单个蛋白质上的多肽结构域，或包含来自不同受体或信号传导分子(例如，另一种亚型或类型的受体)的一个或多个区或部分。如本文所用的术语“嵌合受体复合物”是指第一多肽，其可以包含组合的至少两个不是天然一起存在于单个蛋白质上的多肽结构域，该第一多肽与第二多肽(例如衔接子多肽、信号分子或刺激分子)相关联。本文披露的与嵌合受体的产生和使用有关的另外的术语是本领域普通技术人员容易理解的，并且也可以在国际公开WO 2014/117121和美国专利号7,994,298(在此通过引用将其每一个以其全部内容结合)中找到。
另外，根据几个实施例，提供了包含编码本文提供的任何多核苷酸的多核苷酸的载体，其中这些多核苷酸任选地与至少一个用于表达活化性嵌合受体的调节元件可操作地连接。在几个实施例中，载体是逆转录病毒。
本文进一步提供了工程改造的自然杀伤细胞，其包含本文披露的多核苷酸、载体或嵌合活化性受体。在几个实施例中，这些NK细胞适用于治疗或预防疾病，例如癌症和/或传染病。
在几个实施例中，本文公开的多核苷酸进一步编码特异性抑制天然NKG2A的转录或翻译的短发夹RNA(shRNA)，其中所述shRNA包含在严格条件下与天然NKG2A基因杂交的核苷酸序列，其中所述shRNA包含有义片段和反义片段，所述有义片段包含与NKG2A基因中的靶序列基本相同的核苷酸序列，所述靶序列在所述NKG2A片段中不存在，其中所述有义片段和反义片段由环片段分开。在几个实施例中，多核苷酸与另外的编码膜结合白细胞介素15(mbIL15)的构建体共表达。在几个实施例中，多核苷酸是mRNA。在几个实施例中多核苷酸可操作地连接到用于活化性嵌合受体表达的至少一个调节元件。
在几个实施例中，本文还提供了一种载体，在几个实施例中，所述载体包含本公开的多核苷酸，其中所述多核苷酸与至少一个用于表达活化性嵌合受体的调节元件可操作地连接。在几个实施例中，载体是逆转录病毒。
在几个实施例中，提供了治疗或预防有需要的哺乳动物中癌症或传染病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的NK细胞，其中所述NK细胞表达由根据本文所披露的多核苷酸编码的活化性嵌合受体。在几个实施例中，NK细胞是从患有癌症或传染病的患者中分离的自体细胞。在几个实施例中，NK细胞是从供体分离的同种异体细胞。在几个实施例中，NK细胞缺乏天然NKG2A的表面表达。
在几个实施例中，提供了根据本公开的多核苷酸在制造用于治疗或预防有需要的哺乳动物中的癌症或传染病的药物中的用途。在几个实施例中，提供了根据本公开的载体在制造用于增强有需要的哺乳动物中的NK细胞的细胞毒性的药物中的用途。在几个实施例中，所述载体用于制造用于治疗或预防有需要的哺乳动物中的癌症或传染病的药物。
在几个实施例中，提供了根据本公开的分离的基因工程改造的自然杀伤细胞用于增强有需要的哺乳动物中的NK细胞的细胞毒性的用途。在几个实施例中，还提供了根据本公开的分离的基因工程改造的自然杀伤细胞用于治疗或预防有需要的哺乳动物中的癌症或传染病的用途。
在几个实施例中，提供了包含胞外受体结构域、跨膜结构域和胞质结构域的嵌合自然杀伤细胞组2成员C(NKG2C)，其中所述胞外受体结构域包含SEQ ID NO.58。在几个实施例中，提供了包含自然杀伤细胞组2成员A(NKG2A)胞外受体结构域、跨膜区和胞质结构域的嵌合受体。在几个实施例中，跨膜区包含CD8跨膜区。在几个实施例中，胞质结构域包含4-1BB胞质结构域和CD3ζ胞质结构域中的一个或多个。
在几个实施例中，提供了编码嵌合受体的多核苷酸，所述嵌合受体包含胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域，其中所述胞外结构域包含自然杀伤细胞组2成员C(NKG2C)和SEQ ID NO.58。
在几个实施例中，提供了编码嵌合受体的多核苷酸，所述嵌合受体包含自然杀伤细胞组2成员A(NKG2A)胞外受体结构域、跨膜区和胞质结构域。在几个实施例中，跨膜区包含CD8跨膜区。在几个实施例中，胞质结构域包含4-1BB胞质结构域和CD3ζ胞质结构域中的一个或多个。
实施例
方法
以下实验方法和材料用于下面披露的非限制性实验实例中。
细胞系和培养条件
人肿瘤细胞系SKBR3、HT-29、U2-OS购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；罗克维尔(Rockville)，马里兰州)。尤文肉瘤细胞系ES8和EW8来自圣裘德研究医院(St.JudeResearch Hospital)(孟菲斯(Memphis)，田纳西州)的组织储存库。细胞系保持在RPMI-1640(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，沃尔瑟姆(Waltham)，马塞诸塞州)中；培养基中补充10％胎牛血清(FBS；通用医疗集团(GE Healthcare)，芝加哥(Chicago)，伊利诺伊州)和抗生素。用含有绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶的鼠干细胞病毒(MSCV)逆转录病毒载体(来自田纳西州孟菲斯圣裘德研究医院的载体开发和生产共享资源(Vector Development andProduction Shared Resource of St.Jude Children’s Research Hospital))转导细胞系。
人NK细胞的扩增及NK细胞亚群的筛选
外周血样取自新加坡国立大学医院血库(National University Hospital BloodBank)健康成人捐献者血小板捐献的废弃匿名副产物。
通过在Lymphoprep密度步骤(奈科明公司(Nycomed)，奥斯陆，挪威)上离心分离单核细胞，并在RPMI-1640中洗涤两次。为了扩增NK细胞，将单核细胞与基因修饰的K562-mb15-41BBL细胞系共培养。简言之，在6孔组织培养板中在含有10％FBS和40IU/mL人白细胞介素(IL)-2(诺华公司，巴塞尔(Basel)，瑞士)的SCGM培养基(CellGenix公司，弗莱堡(Freiburg)，德国)中将外周血单核细胞(3x106)与2x106个经照射(100Gy)的K562-mb15-41BBL细胞培养。每隔2-3天添加新鲜组织培养基和IL-2。共培养7天后，使用Dynabeads CD3(赛默飞世尔公司)去除残留的T细胞，产生含有>90％CD56+CD3-NK细胞的细胞群体。实验前将扩增的NK细胞维持在具有FBS、抗生素和400IU/mL IL2的SCGM中。
为了清除NKG2A+NK细胞，将扩增的NK细胞用缀合至别藻蓝蛋白(APC)和抗APC微珠的抗NKG2A抗体进行标记，并在LD柱上分离(均来自美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotech))。
DNA质粒、逆转录病毒的产生和NK细胞的转导
用金斯瑞公司(Genescript)(南京，中国)合成了编码所有构建体的质粒。用含有所述构建体的RD114假型MSCV逆转录病毒转导NK细胞。将逆转录病毒载体条件培养基添加到RetroNectin(宝生物公司(Takara)，大津(Otsu)日本)包被的聚丙烯管中；离心并去除上清液后，将扩增的NK细胞(3x105)加入试管中，在37℃下放置12小时；每12h添加新鲜病毒上清液，共添加6次。然后将细胞维持在具有FBS、抗生素和400IU/ml IL-2的RPMI中，直到实验时间。
通过流式细胞术检测活化性受体表达
用抗-NKG2C-藻红蛋白(PE)抗体(美天旎生物技术公司)检测抗-NKG2C的表面表达。用与PE或APC(美天旎生物技术公司)缀合的抗NKG2A抗体检测NKG2A的表达。用抗CD94-APC(BD生物科学公司(BD Biosciences))检测CD94的表达。
细胞毒性测定
用GFP/荧光素酶转导的靶细胞悬浮在含有10％FBS的RPMI-1640中，并镀入96孔平板(科斯塔(Costar)，康宁(Corning)，纽约州)中。在添加NK细胞之前，将板放置在培养箱中至少4小时以允许细胞附着。然后以不同的效应细胞与靶细胞(E:T)比添加悬浮于含10％FBS的RPMI-1640中的表达各种受体或单独表达GFP的经扩增的NK细胞，并与靶细胞共培养4小时。在培养结束时，在将BrightGlo(普洛麦格公司(Promega)，菲茨堡(Fitchburg)，威斯康星州)添加到孔中后，使用Flx 800读板仪(拜尔泰克公司(BioTek)，维努斯基(Winooski)，佛蒙特州)测量活细胞的数量。
实施例1-活化性高亲和力NKG2C受体构建体
如本文所公开的，提供了包含与各种跨膜结构域偶联的胞外受体结构域的各种活化性嵌合受体构建体。本实验旨在评估被工程改造为对HLA-E/肽复合物具有高亲和力的活化性自然杀伤细胞组2成员C(NKG2C)变体的表达和细胞毒性活性。根据上述方法和材料制备和测试活化性NKG2C受体构建体。取决于构建体，可以容易地调整所使用的方法以解释产生、表达和测试构建体所需的变化。
图1A描绘了示意图，其显示了工程改造的NKG2C变体(165-168SIIS)，所述变体针对以下进行了工程改造：在与CD94和Dap12二聚体(本文中称为“D12(SIIS)2C94”)的复合物中对HLA-E/肽复合物的高亲和力。图1B描绘了包含插入到MSCV逆转录病毒载体中的NKG2C(165-168SIIS)、Dap12和CD94的构建体的示意图，所述MSCV逆转录病毒载体在内部核糖体进入位点(IRES)之后含有绿色荧光蛋白(GFP)。
首先评估NK细胞有效表达该构建体的能力。图2描绘了证明高亲和力活化性D12(SIIS)2C94受体复合物在纯化的NKG2C(+)NKG2A(-)NK细胞中相对于用仅含有GFP的载体转导的NK细胞的稳健表达的流式细胞术数据。总之，这些数据表明，根据本文披露的几个实施例，工程改造的活化性嵌合受体构建体可以成功地在NK细胞上表达。
在几个实施例中，可以通过用特定构建体重复转导NK细胞来实现构建体的增强表达。在几个实施例中，构建体的组分可以在单个载体中递送至细胞，或者可替代地使用多个载体递送至细胞。取决于实施例，构建体本身可以导致增强的表达，例如线性构建体或头对尾构建体可以产生增加的表达，因为多亚基构建体需要较低程度的细胞内组装。
NKG2C/CD94和NKG2A/CD94结合人类非经典MHC I类分子HLA-E/肽复合物。HLA-E在NK细胞识别细胞中具有非常专门的作用，并且HLA-E结合从经典MHC I类分子的信号肽(即HLA-A、B、C、G)衍生的肽的受限子集。因此，NK细胞可以通过NKG2C/CD94和NKG2A/CD94与HLA-E/肽复合物的相互作用间接监测经典MHC I类分子的表达。为了评价本文所述的活化性NKG2C受体构建体和活化性NKG2A受体构建体的功效，将癌细胞工程改造以表达含有HLA-G信号肽的HLA-E。图3描绘了含有HLA-G信号肽的HLA-E分子的设计和产生。图3A描绘了用HLA-E(指定为GpHLA-E；携带HLA-G信号肽的HLA-E)的HLA-G信号肽(SEQ ID NO.70)取代HLA-E信号肽(SEQ ID NO.69)。图3B描绘了验证实体瘤细胞系HT29、U2OS、ES8和EW8中GpHLA-E的外源性表达的流式细胞术数据。
为了评价转导的NK细胞群体的效力，使用表达GpHLA-E的癌细胞系进行细胞毒性测定。表达D12(SIIS)2C94的纯化的NKG2C(+)NKG2A(-)NK细胞在所有测试的E:T比下显示出比对照NK细胞明显更高的针对U2OS-GpHLA-E、SKBR3-GpHLA-E和HT29-GpHLA-E细胞的细胞毒性(图4)。这些数据提供证据表明NK细胞不仅可以被工程改造以表达活化性嵌合受体构建体，而且那些表达活化性嵌合受体的细胞能够被活化并成功地产生针对靶细胞的增强的细胞毒性作用。
为了证实NKG2A(+)细胞(其存在可能会混淆这些研究和基于NK细胞的疗法的结果)的耗减，进行了流式细胞术分析。在NKG2A耗减后，我们证实细胞群体由NKG2C(+)NKG2A(-)NK细胞组成。此外，模拟的转导的NK细胞群体或D12(SIIS)2C94-转导的NKG2C(+)NKG2A(-)NK细胞针对基因修饰的肿瘤细胞系的细胞毒性测定证明了后一NK细胞群体的增强的细胞毒性，而不管细胞是否与抗NKG2A抗体Z199孵育(图5)。
实施例2-活化性嵌合NKG2A/CD94受体构建体
如本文所公开的，提供了包含与各种跨膜结构域偶联的胞外受体结构域的各种活化性嵌合受体构建体。进行本实验以评估活化性自然杀伤细胞组2成员A(NKG2A)/CD94受体构建体的表达和细胞毒性活性。根据上述方法和材料制备和测试活化性NKG2A/CD94受体构建体。取决于构建体，可以容易地调整所使用的方法以解释产生、表达和测试构建体所需的变化。
图6A描绘了显示由截短形式的自然杀伤细胞组2成员A(NKG2A)和CD94构成的复合物的示意图，其中存在跨膜和抑制性胞质结构域的N-末端部分的缺失。这些结构域已被CD8a跨膜结构域和4-1BB(CD137)与CD3ζ的胞质结构域所取代。活化性NKG2A受体和嵌合CD94受体形成活化性复合物(本文中称为“2A/94BBz”)。图6B描绘了包含插入到MSCV逆转录病毒载体中的嵌合CD94受体和活化性NKG2A受体的构建体的示意图，所述MSCV逆转录病毒载体在内部核糖体进入位点(IRES)之后含有绿色荧光蛋白(GFP)。
首先评估NK细胞有效表达这些构建体的能力。图7描绘了证明在NKG2A耗减的NK细胞中活化性NKG2A/CD94-41BB-CD3z受体相对于模拟的转导的NK细胞群体的稳健表达的流式细胞术数据。总之，这些数据表明，根据本文披露的几个实施例，工程改造的活化性嵌合受体构建体可以成功地在NK细胞上表达。
为了评价转导的NK细胞群体的效力，使用表达GpHLA-E的癌细胞系进行细胞毒性测定。相对于对照NK细胞的4小时细胞毒性测定中，活化性NKG2A/CD94-41BB-CD3z受体在扩增的NK细胞上的表达显著增加了针对U2OS-GpHLA-E和HT29-GpHLA-E细胞的细胞毒性。这些数据提供证据表明NK细胞不仅可以被工程改造以表达活化性嵌合受体构建体，而且那些表达活化性嵌合受体的细胞能够被活化并成功地产生针对靶细胞的增强的细胞毒性作用。
实施例3-活化性嵌合受体构建体的抗肿瘤活性
为了证明本文公开的活化性NK受体构建体对靶细胞(例如肿瘤细胞)施加细胞毒性效应的能力，使用了结直肠腺癌的异种移植模型。HT-29细胞是一种永生化的结直肠腺癌细胞系。用GpHLA-E和萤光素酶两者转导HT-29细胞，使得HT-29细胞表达HLA-E，HLA-E是被本实施例中使用的工程改造的活化性受体(D12(SIIS)2C/94构建体被针对与HLA-E/肽复合物(165-168SIIS)的高亲和力进行了工程改造)识别的靶的一部分。将转导的HT-29细胞以1x105个细胞/小鼠的剂量腹腔内注射到12只NOD-SCID IL2RGnull小鼠中。随后，在第3、6、10和13天注射NK细胞(1x107个细胞)。仅用GFP(“对照”)或者用D12(SIIS)2C/94构建体转导NK细胞。小鼠通过腹腔内注射接受IL-2(20,000IU)，每周三次。使用Xenogen光谱仪器测量腹侧和背侧生物发光以评估肿瘤负荷(每个符号是腹侧和背侧读数的平均值)。
如图10中的左分图(无NK细胞)所示，随着时间的推移，每个小鼠中的平均生物发光增加，这表明来自注射的HT-29细胞的生长/增殖的肿瘤负担增加。中间分图(注射了表达GFP的NK细胞的小鼠)显示出普遍增加的平均生物发光，尽管程度低于“无NK”组。与此形成鲜明对比的是，在D12(SIIS)2C/94中，平均生物发光显示出非常有限的增加，即使到实验结束时的约75天时间点也是如此。在实验的约40到75天之间，单只小鼠的平均生物发光有适度升高。这些数据表明，即使当与NK细胞(NK细胞本身具有相对稳健的抗肿瘤作用)相比时，表达活化性嵌合受体的工程改造的NK细胞具有显著的抗肿瘤活性。
进一步研究本文公开的工程改造的活化性受体的效果，生成存活曲线以确定不同组中小鼠的存活率。通过对数秩检验分析的普兰-迈耶(Kaplan Meier)存活曲线如图11所示，使用与上述相同的实验组。如所示(虚线)，接受HT-29细胞但没有接受NK细胞的小鼠在约60天达到0％的存活。同样，接受表达GFP(实心灰线)的NK细胞的小鼠也表现出类似的存活模式，在约80天达到0％的存活。对这些组的统计评估显示无NK组和对照组之间没有统计学差异(普兰-迈耶存活曲线，对数秩检验，图11)。与前两组相比(类似于上述平均生物发光数据)，D12(SIIS)2C/94组显示显著增强的存活。不仅四只D12(SIIS)2C/94小鼠中的一只存活了整个实验持续时间，D12(SIIS)2C/94中所有小鼠的存活持续时间都得到了提高。统计评价显示，与无NK组以及接受NK细胞的对照组相比，D12(SIIS)2C/94中的存活显著(图11中描绘的普兰-迈耶存活曲线，对数秩检验，p值)。因此，这些数据表明，即使与NK细胞(其表现出相对高的天然细胞毒性)相比，工程改造以表达活化性嵌合受体的NK细胞对靶细胞的细胞毒性作用也出乎意料地提高。在几个实施例中，活化性嵌合受体在NK细胞上的表达允许以下中的一种或多种：基于NK的癌症免疫疗法方案(例如，例如与使用未被工程改造以表达本文所公开的高亲和力结构域的NK细胞的治疗频率、持续时间等相比)的减少的治疗频率、减少的治疗持续时间、减少的NK细胞所需剂量和总体改善的结果(例如，减少的肿瘤负担和/或增加的存活)。
预期可以进行上面披露的实施例的特定特征和方面的各种组合或子组合，并且仍然落入本发明中的一个或多个中。此外，与实施例相关的任何特定特征、方面、方法、特性、特征性、质量、属性、元件等的披露内容可以用于本文阐述的所有其他实施例中。因此，应该理解的是，所披露的实施例的各种特征和方面可以彼此组合或替换，以便形成所披露的发明的不同模式。因此，意图是本文披露的本发明的范围不应受上述具体披露的实施例的限制。此外，尽管本发明易于进行各种修改和替代形式，但是其具体实施例已在附图中示出并在本文中详细描述。然而，应该理解，本发明不限于所披露的特定形式或方法，相反，本发明将覆盖落入各种实施例描述和所附权利要求的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。本文披露的任何方法不需要按照所述顺序进行。本文披露的方法包括从业者采取的某些行为；但是，他们也可以明确地或暗示地包括这些行为的任何第三方指示。例如，诸如“施用扩增的NK细胞群”的行为包括“指导扩增的NK细胞群的施用”。此外，当本披露的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员应意识到本披露还由此描述马库什组的任何单个个体或亚组个体。
本文披露的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及其组合。诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”、“之间”等语言包括所叙述的数字。在诸如“约”或“大约”之类的术语之后的数字包括所叙述的数字。例如，“10纳米左右”包括“10纳米”。
序列表
<110> 新加坡国立大学（National University of Singapore）
<120> 活化性嵌合受体及其在自然杀伤细胞免疫疗法中的用途
<130> 4459.1147002 (NKT.0018WO)
<150> 62/628788
<151> 2018-02-09
<150> 62/736879
<151> 2018-09-26
<160> 70
<170> PatentIn3.5版
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 全长 NKG2D
<400> 1
gggtggattc gtggtcggag gtctcgacac agctgggaga tgagtgaatt tcataattat 60
aacttggatc tgaagaagag tgatttttca acacgatggc aaaagcaaag atgtccagta 120
gtcaaaagca aatgtagaga aaatgcatct ccattttttt tctgctgctt catcgctgta 180
gccatgggaa tccgtttcat tattatggta acaatatgga gtgctgtatt cctaaactca 240
ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 300
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 360
gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 420
gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 480
acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 540
attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 600
aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 645
<210> 2
<211> 405
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 截短的 NKG2D
<400> 2
ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120
gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180
gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240
acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300
attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360
aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 405
<210> 3
<211> 405
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 密码子优化的截短的 NKG2D
<400> 3
ctgttcaatc aggaagtcca gatccccctg acagagtctt actgcggccc atgtcccaag 60
aactggatct gctacaagaa caattgttat cagttctttg acgagagcaa gaactggtat 120
gagtcccagg cctcttgcat gagccagaat gcctctctgc tgaaggtgta cagcaaggag 180
gaccaggatc tgctgaagct ggtgaagtcc tatcactgga tgggcctggt gcacatccct 240
acaaacggct cttggcagtg ggaggacggc tccatcctgt ctccaaatct gctgaccatc 300
atcgagatgc agaagggcga ttgcgccctg tacgccagct ccttcaaggg ctatatcgag 360
aactgctcca cacccaatac ctacatctgt atgcagagga ccgtg 405
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD8信号传导序列
<400> 4
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
cca 63
<210> 5
<211> 135
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD8α铰链
<400> 5
accacaaccc ctgcaccacg cccccctaca ccagcaccta ccatcgcaag ccagcctctg 60
tccctgcggc cagaggcatg tagaccagca gcaggaggag cagtgcacac aagaggcctg 120
gacttcgcct gcgat 135
<210> 6
<211> 1722
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD8β
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (674)..(773)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (859)..(958)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 6
atctaggtct tgctgcaccc gcacaaccta caaacagcgt cggggccttc tctgcacctc 60
cagttcccag ctcacctccc tcagtgtcac agccggttac ctttccttcc tccctggggg 120
agggcaagac ttggggcttg ctgactccag gcccagccca gcccggggca cccaggagcc 180
cctcaattgc tactcaaaca gacaagaagc ggcccgagtt agtggccagc tccaccatgc 240
actacacatc ctgacctctc tgagcctcta ctgtcactcg gggtcacaac cctttcctga 300
gcacctcccg gggcaggggg cgatgacaca catgcagctg cctgggggag gccggcggtg 360
tcccctcctt tctggaacgc ggagggtcct ggtgggctct ggaaacgcag cccagacctt 420
tgcaatgcta ggaggatgag ggcggagacc tcgcggtccc caacaccaga ctcccgcagc 480
caccgcgccc ggtcccgccc tccccactgc ccccccagct ccccgaccca ggcgccccgc 540
ccggccagct cctcacccac cccagccgcg actgtctccg ccgagccccc ggggccaggt 600
gtcccgggcg cgccacgatg cggccgcggc tgtggctcct cctggccgcg cagctgacag 660
gtaaggcggc ggcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 720
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnttgcttt 780
cctcttccag gccggcggag gagagcccgg cttcgtttca tgaaacagta agtgtataac 840
ctgggtgtgg ccttgggann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 900
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnct 960
tgctgttgtt ttcagatttt acaaatgagc agagaatacg gttttggtgt cctgctacaa 1020
aaagacatcg gtcagtaacg agcacgatgt ggaaaaatga gagaagggac acattcaacc 1080
ctggagagtt caatggctgc tgaagctgcc tgcttttcac tgctgcaagg cctttctgtg 1140
tgtgacgtgc atgggagcaa cttgttcgtg ggtcatcggg aatactaggg agaaggtttc 1200
attgccccca gggcacttca cagagtgtgc tggaggactg agtaagaaat gctgcccatg 1260
ccaccgcttc cggctcctgt gctttccctg aactgggacc tttagtggtg gccatttagc 1320
caccatcttt gcaggttgct ttgccctggt agggcagtaa cattgggtcc tgggtctttc 1380
atggggtgat gctgggctgg ctccctgttg gtcttcccag gctggggctg accttcctcg 1440
cagagaggcc aggtgcaggt tgggaatgag gcttgctgag aggggctgtc cagttcccag 1500
aaggcatatc agtctctgag ggcttccttt ggggccggga acttgcgggt ttgaggatag 1560
gagttcactt catcttctca gctcccattt ctactcttaa gtttctcagc tcccatttct 1620
actctcccat ggcttaatgc ttctttcatt ttctgtttgt tttatacaaa tgtcttagtt 1680
gtaaaaataa agtcccaggt taaagataac aaacgggtcc tg 1722
<210> 7
<211> 2415
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD16α
<400> 7
attcttggtg ctgggtggat ccaaatccag gagatggggc aagcatcctg ggatggctga 60
gggcacactc tggcagattc tgtgtgtgtc ctcagatgct cagccacaga cctttgaggg 120
agtaaagggg gcagacccac ccaccttgcc tccaggctct ttccttcctg gtcctgttct 180
atggtggggc tcccttgcca gacttcagac tgagaagtca gatgaagttt caagaaaagg 240
aaattggtgg gtgacagaga tgggtggagg ggctggggaa aggctgttta cttcctcctg 300
tctagtcggt ttggtccctt tagggctccg gatatctttg gtgacttgtc cactccagtg 360
tggcatcatg tggcagctgc tcctcccaac tgctctgcta cttctagttt cagctggcat 420
gcggactgaa gatctcccaa aggctgtggt gttcctggag cctcaatggt acagggtgct 480
cgagaaggac agtgtgactc tgaagtgcca gggagcctac tcccctgagg acaattccac 540
acagtggttt cacaatgaga gcctcatctc aagccaggcc tcgagctact tcattgacgc 600
tgccacagtc gacgacagtg gagagtacag gtgccagaca aacctctcca ccctcagtga 660
cccggtgcag ctagaagtcc atatcggctg gctgttgctc caggcccctc ggtgggtgtt 720
caaggaggaa gaccctattc acctgaggtg tcacagctgg aagaacactg ctctgcataa 780
ggtcacatat ttacagaatg gcaaaggcag gaagtatttt catcataatt ctgacttcta 840
cattccaaaa gccacactca aagacagcgg ctcctacttc tgcagggggc tttttgggag 900
taaaaatgtg tcttcagaga ctgtgaacat caccatcact caaggtttgg cagtgtcaac 960
catctcatca ttctttccac ctgggtacca agtctctttc tgcttggtga tggtactcct 1020
ttttgcagtg gacacaggac tatatttctc tgtgaagaca aacattcgaa gctcaacaag 1080
agactggaag gaccataaat ttaaatggag aaaggaccct caagacaaat gacccccatc 1140
ccatgggggt aataagagca gtagcagcag catctctgaa catttctctg gatttgcaac 1200
cccatcatcc tcaggcctct ctacaagcag caggaaacat agaactcaga gccagatccc 1260
ttatccaact ctcgactttt ccttggtctc cagtggaagg gaaaagccca tgatcttcaa 1320
gcagggaagc cccagtgagt agctgcattc ctagaaattg aagtttcaga gctacacaaa 1380
cactttttct gtcccaaccg ttccctcaca gcaaagcaac aatacaggct agggatggta 1440
atcctttaaa catacaaaaa ttgctcgtgt tataaattac ccagtttaga ggggaaaaaa 1500
aaacaattat tcctaaataa atggataagt agaattaatg gttgaggcag gaccatacag 1560
agtgtgggaa ctgctgggga tctagggaat tcagtgggac caatgaaagc atggctgaga 1620
aatagcaggt agtccaggat agtctaaggg aggtgttccc atctgagccc agagataagg 1680
gtgtcttcct agaacattag ccgtagtgga attaacagga aatcatgagg gtgacgtaga 1740
attgagtctt ccaggggact ctatcagaac tggaccatct ccaagtatat aacgatgagt 1800
cctcttaatg ctaggagtag aaaatggtcc taggaagggg actgaggatt gcggtggggg 1860
gtggggtgga aaagaaagta cagaacaaac cctgtgtcac tgtcccaagt tgctaagtga 1920
acagaactat ctcagcatca gaatgagaaa gcctgagaag aaagaaccaa ccacaagcac 1980
acaggaagga aagcgcagga ggtgaaaatg ctttcttggc cagggtagta agaattagag 2040
gttaatgcag ggactgtaaa accacctttt ctgcttcaat atctaattcc tgtgtagctt 2100
tgttcattgc atttattaaa caaatgttgt ataaccaata ctaaatgtac tactgagctt 2160
cgctgagtta agttatgaaa ctttcaaatc cttcatcatg tcagttccaa tgaggtgggg 2220
atggagaaga caattgttgc ttatgaaaga aagctttagc tgtctctgtt ttgtaagctt 2280
taagcgcaac atttcttggt tccaataaag cattttacaa gatcttgcat gctactctta 2340
gatagaagat gggaaaacca tggtaataaa atatgaatga taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400
aaaaaaaaaa aaaaa 2415
<210> 8
<211> 2473
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD16β
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (211)..(310)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (537)..(636)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (968)..(1067)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 8
aaagatgggt ggagggactg gggaaaggct gtttactccc tcctgtctag tcggcttggt 60
ccctttaggg gtccggatat ctttggtgac ttgtccactc cagtgtggca tcatgtggca 120
gctgctcctc ccaactgctc tgctacttct aggtaagtag gatctccctg gttgagggag 180
aagtttgaga tgccttgggt tcagcagaga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300
nnnnnnnnnn aagaggcatg aacagtggaa gaccagagag caggtagcaa ggtttccacc 360
agaaacatcc tgattcttgg gaaaattggg ctcctggggc agaggagggc aggggagttt 420
taaactcact ctatgttcta atcactctga tctctgcccc tactcaatat ttgatttact 480
cttttttctt gcagtttcag ctggcatgcg gactggtgag tcagcttcat ggtcttnnnn 540
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 600
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnncact gagagctgag ctcccgggcc 660
tggggtgtct ctgtgtcttt caggctggct gttgctccag gcccctcggt gggtgttcaa 720
ggaggaagac cctattcacc tgaggtgtca cagctggaag aacactgctc tgcataaggt 780
cacatattta cagaatggca aagacaggaa gtattttcat cataattctg acttccacat 840
tccaaaagcc acactcaaag atagcggctc ctacttctgc agggggcttg ttgggagtaa 900
aaatgtgtct tcagagactg tgaacatcac catcactcaa ggtgagacat gtgccaccct 960
ggaatgcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnttt ttcatctctc 1080
cacttctcct aataggtttg gcagtgtcaa ccatctcatc attctctcca cctgggtacc 1140
aagtctcttt ctgcttggtg atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct 1200
ctgtgaagac aaacatttga agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa cttaaatgga 1260
gaaaggaccc tcaagacaaa tgacccccat cccatgggag taataagagc agtggcagca 1320
gcatctctga acatttctct ggatttgcaa ccccatcatc ctcaggcctc tctacaagca 1380
gcaggaaaca tagaactcag agccagatcc tttatccaac tctcgatttt tccttggtct 1440
ccagtggaag ggaaaagccc atgatcttca agcagggaag ccccagtgag tagctgcatt 1500
cctagaaatt gaagtttcag agctacacaa acactttttc tgtcccaacc attccctcac 1560
agtaaaacaa caatacaggc tagggatggt aatcctttaa acatacaaaa attgctcgta 1620
ttataaatta cccagtttag accggaaaaa agaaaataat tattcctaaa caaatggata 1680
agtagaatta atgattgagg caggacccta cagagtgtgg gaactgctgg ggatctagag 1740
aattcagtgg gaccaatgaa agcatggctg agaaatagca gggtagtcca ggagagtcta 1800
agggaggtgt tcccatctga gcccagagat aagggtgtct tcctagaaca ttagccgtag 1860
tggaattaac aggaaatcat gagggtgacg tagaattgag tcttccaggg gactctatca 1920
gaactggacc atttccaagt atataacgat gagccctcta atgctaggag tagcaaatgg 1980
tcctaggaag gggactgagg attggggtgg gggtggggtg gaaaagaaag tacagaacaa 2040
accctgtgtc actgtcccaa gttaagctaa gtgaacagaa ctatctcagc atcagaatga 2100
gaaagcctga gaagaaagaa ccaaccacaa gcacacagga aggaaagcgc aggaggtgaa 2160
aatgctttct tggccagggt agtaagaatt agaggttaat gcagggactg taaaaccacc 2220
ttttctgctt caatgtctag ttcctgtata gctttgttca ttgcatttat taaacaaatg 2280
ttgtataacc aatactaaat gtactactga gcttcactga gttacgctgt gaaactttca 2340
aatccttctt catgtcagtt ccaatgaggt ggggatggag aagacaattg ttgcttatga 2400
aaaaaagctt tagctgtctc tgttttgtaa gctttcagtg caacatttct tggttccaat 2460
aaagcatttt aca 2473
<210> 9
<211> 370
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 2B4
<400> 9
Met Leu Gly Gln Val Val Thr Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Lys Val
1 5 10 15
Tyr Gln Gly Lys Gly Cys Gln Gly Ser Ala Asp His Val Val Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Val Pro Leu Gln Leu Gln Pro Asn Ser Ile Gln Thr Lys Val
35 40 45
Asp Ser Ile Ala Trp Lys Lys Leu Leu Pro Ser Gln Asn Gly Phe His
50 55 60
His Ile Leu Lys Trp Glu Asn Gly Ser Leu Pro Ser Asn Thr Ser Asn
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Phe Ile Val Lys Asn Leu Ser Leu Leu Ile Lys Ala
85 90 95
Ala Gln Gln Gln Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Leu Glu Val Thr Ser Ile
100 105 110
Ser Gly Lys Val Gln Thr Ala Thr Phe Gln Val Phe Val Phe Glu Ser
115 120 125
Leu Leu Pro Asp Lys Val Glu Lys Pro Arg Leu Gln Gly Gln Gly Lys
130 135 140
Ile Leu Asp Arg Gly Arg Cys Gln Val Ala Leu Ser Cys Leu Val Ser
145 150 155 160
Arg Asp Gly Asn Val Ser Tyr Ala Trp Tyr Arg Gly Ser Lys Leu Ile
165 170 175
Gln Thr Ala Gly Asn Leu Thr Tyr Leu Asp Glu Glu Val Asp Ile Asn
180 185 190
Gly Thr His Thr Tyr Thr Cys Asn Val Ser Asn Pro Val Ser Trp Glu
195 200 205
Ser His Thr Leu Asn Leu Thr Gln Asp Cys Gln Asn Ala His Gln Glu
210 215 220
Phe Arg Phe Trp Pro Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu
225 230 235 240
Phe Leu Gly Thr Leu Ala Cys Phe Cys Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys
245 250 255
Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu
260 265 270
Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr
275 280 285
Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser
290 295 300
Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile
305 310 315 320
Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser
325 330 335
Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala
340 345 350
Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val
355 360 365
Tyr Ser
370
<210> 10
<211> 279
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> DAP10
<400> 10
atgatccatc tgggtcacat cctcttcctg cttttgctcc cagtggctgc agctcagacg 60
actccaggag agagatcatc actccctgcc ttttaccctg gcacttcagg ctcttgttcc 120
ggatgtgggt ccctctctct gccgctcctg gcaggcctcg tggctgctga tgcggtggca 180
tcgctgctca tcgtgggggc ggtgttcctg tgcgcacgcc cacgccgcag ccccgcccaa 240
gatggcaaag tctacatcaa catgccaggc aggggctga 279
<210> 11
<211> 575
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> DAP12
<400> 11
agacttcctc cttcacttgc ctggacgctg cgccacatcc caccggccct tacactgtgg 60
tgtccagcag catccggctt catgggggga cttgaaccct gcagcaggct cctgctcctg 120
cctctcctgc tggctgtaag tgattgcagt tgctctacgg tgagcccggg cgtgctggca 180
gggatcgtga tgggagacct ggtgctgaca gtgctcattg ccctggccgt gtacttcctg 240
ggccggctgg tccctcgggg gcgaggggct gcggaggcag cgacccggaa acagcgtatc 300
actgagaccg agtcgcctta tcaggagctc cagggtcaga ggtcggatgt ctacagcgac 360
ctcaacacac agaggccgta ttacaaatga gcccgaatca tgacagtcag caacatgata 420
cctggatcca gccattcctg aagcccaccc tgcacctcat tccaactcct accgcgatac 480
agacccacag agtgccatcc ctgagagacc agaccgctcc ccaatactct cctaaaataa 540
acatgaagca caaaaacaaa aaaaaaaaaa aaaaa 575
<210> 12
<211> 126
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 4-1BB
<400> 12
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 13
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD3-ζ
<400> 13
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 经典的半-tam
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(5)
<223> X = 任何氨基酸
<400> 14
Asp Gly Tyr Xaa Xaa Leu
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> ITSM基序
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> N = S或T
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> x = 任何氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(5)
<223> x = 任何氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> N = L或I
<400> 15
Asn Xaa Tyr Xaa Xaa Asn
1 5
<210> 16
<211> 614
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 膜结合IL15
<400> 16
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 120
catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 180
atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 240
catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300
gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360
ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttctaccac gacgccagcg 420
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 480
gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 540
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggtatca 600
ccctttactg ctaa 614
<210> 17
<211> 204
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 膜结合IL15
<400> 17
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
20 25 30
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
35 40 45
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
50 55 60
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
65 70 75 80
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
85 90 95
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
100 105 110
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
115 120 125
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
130 135 140
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
145 150 155 160
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
165 170 175
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
180 185 190
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
195 200
<210> 18
<211> 1140
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3z
<400> 18
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacatacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780
gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 840
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 900
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 960
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1020
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1080
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 1140
<210> 19
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3z的氨基酸序列
<400> 19
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
225 230 235 240
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
245 250 255
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
260 265 270
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
275 280 285
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
290 295 300
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
305 310 315 320
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
325 330 335
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
340 345 350
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
355 360 365
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375
<210> 20
<211> 46
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NCR1 TM/IC的氨基酸
<400> 20
Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu Val
1 5 10 15
Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg Ala
20 25 30
Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu
35 40 45
<210> 21
<211> 276
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 全长 NCR2
<400> 21
Met Ala Trp Arg Ala Leu His Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Gly Ser Gln Ala Gln Ser Lys Ala Gln Val Leu Gln Ser Val Ala
20 25 30
Gly Gln Thr Leu Thr Val Arg Cys Gln Tyr Pro Pro Thr Gly Ser Leu
35 40 45
Tyr Glu Lys Lys Gly Trp Cys Lys Glu Ala Ser Ala Leu Val Cys Ile
50 55 60
Arg Leu Val Thr Ser Ser Lys Pro Arg Thr Met Ala Trp Thr Ser Arg
65 70 75 80
Phe Thr Ile Trp Asp Asp Pro Asp Ala Gly Phe Phe Thr Val Thr Met
85 90 95
Thr Asp Leu Arg Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Trp Cys Arg Ile Tyr
100 105 110
Arg Pro Ser Asp Asn Ser Val Ser Lys Ser Val Arg Phe Tyr Leu Val
115 120 125
Val Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr Ser Trp Thr Pro Arg Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala
145 150 155 160
Gly Ala Arg Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile Pro Val Pro Ser
165 170 175
Gln Pro Gln Asn Ser Thr Leu Arg Pro Gly Pro Ala Ala Pro Ile Ala
180 185 190
Leu Val Pro Val Phe Cys Gly Leu Leu Val Ala Lys Ser Leu Val Leu
195 200 205
Ser Ala Leu Leu Val Trp Trp Gly Asp Ile Trp Trp Lys Thr Met Met
210 215 220
Glu Leu Arg Ser Leu Asp Thr Gln Lys Ala Thr Cys His Leu Gln Gln
225 230 235 240
Val Thr Asp Leu Pro Trp Thr Ser Val Ser Ser Pro Val Glu Arg Glu
245 250 255
Ile Leu Tyr His Thr Val Ala Arg Thr Lys Ile Ser Asp Asp Asp Asp
260 265 270
Glu His Thr Leu
275
<210> 22
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NCR3 TM/IC 结构域
<400> 22
Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu Arg Ala Gly Phe Tyr Ala Val Ser Phe
1 5 10 15
Leu Ser Val Ala Val Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Gln Gly Lys Cys Leu
20 25 30
Thr Trp Lys Gly Pro Arg Arg Gln Leu Pro Ala Val Val Pro Ala Pro
35 40 45
Leu Pro Pro Pro Cys Gly Ser Ser Ala His Leu Leu Pro Pro Val Pro
50 55 60
Gly Gly
65
<210> 23
<211> 741
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKG2D/CD16
<400> 23
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgcccgc 60
cccctgttca accaggaagt gcagatcccc ctgaccgagt cctattgtgg cccttgccct 120
aagaattgga tttgctataa aaacaactgc taccagttct ttgacgagtc taagaattgg 180
tatgagtccc aggcctcttg tatgagccag aacgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cccacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctcctaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgca gcacacccaa tacctacatc tgtatgcagc ggacagtgac cacaacccca 480
gcacccaggc cccctacacc tgcaccaacc atcgcaagcc agccactgtc cctgaggcct 540
gaggcatgta ggccagcagc aggaggagca gtgcacacac ggggcctgga cttcgcctgc 600
gatgtgagct tttgtctggt catggtgctg ctgttcgccg tggataccgg cctgtatttt 660
tccgtgaaga caaatatccg gtctagcacc agagactgga aggatcacaa gttcaaatgg 720
aggaaggacc cacaggacaa g 741
<210> 24
<211> 247
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKG2D/CD16
<400> 24
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Val Ser Phe Cys Leu Val Met
195 200 205
Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr
210 215 220
Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp
225 230 235 240
Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245
<210> 25
<211> 870
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD8/NKG2DOpt/CD8a/CD16 TM/IC/4-1BB
<400> 25
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
ccactgttca atcaggaagt ccagatcccc ctgacagagt cttactgcgg cccatgtccc 120
aagaactgga tctgctacaa gaacaattgt tatcagttct ttgacgagag caagaactgg 180
tatgagtccc aggcctcttg catgagccag aatgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctccaaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgct ccacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggaccgtgac cacaacccct 480
gcaccacgcc cccctacacc agcacctacc atcgcaagcc agcctctgtc cctgcggcca 540
gaggcatgta gaccagcagc aggaggagca gtgcacacaa gaggcctgga cttcgcctgc 600
gatgtgagct tttgtctggt catggtgctg ctgttcgccg tggataccgg cctgtacttt 660
tccgtgaaga caaatatcag gtctagcacc cgcgactgga aggatcacaa gtttaagtgg 720
cggaaggacc ctcaggataa gaagcggggc agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag 780
cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct 840
gaagaagaag aagggggctg tgaactgtaa 870
<210> 26
<211> 289
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD8/NKG2DOpt/CD8a/CD16 TM/IC/4-1BB
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Val Ser Phe Cys Leu Val Met
195 200 205
Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr
210 215 220
Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp
225 230 235 240
Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
245 250 255
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
260 265 270
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
275 280 285
Leu
<210> 27
<211> 741
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKG2D/NCR1
<400> 27
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgcccgc 60
cctctgttca accaggaagt gcagatccct ctgaccgaaa gctattgcgg accttgccct 120
aagaattgga tttgctataa aaacaactgc taccagttct ttgacgagtc taagaattgg 180
tatgagtctc aggccagctg tatgtcccag aacgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cccacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctctatcc tgagccctaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgca gcacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggacagtgac cacaacccca 480
gcaccccgcc cccctacacc tgcaccaacc atcgcaagcc agccactgtc cctgcggcct 540
gaggcctgca gaccagcagc aggaggagca gtgcacaccc ggggcctgga cttcgcctgt 600
gatatgggcc tggcctttct ggtgctggtg gccctggtgt ggtttctggt ggaggattgg 660
ctgtcccgga agagaacaag ggagagggcc tcccgggcct ctacctggga aggaagaagg 720
agactgaaca cccagacact g 741
<210> 28
<211> 247
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKG2D/NCR1
<400> 28
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Met Gly Leu Ala Phe Leu Val
195 200 205
Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu Val Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys
210 215 220
Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg Ala Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg
225 230 235 240
Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu
245
<210> 29
<211> 801
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKG2D/NCR3
<400> 29
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccaga 60
cccctgttca accaggaggt gcagattccc ctgacagaaa gctattgtgg cccttgccct 120
aaaaattgga tttgctataa aaacaactgc taccagttct ttgacgagtc taagaattgg 180
tatgagtctc aggccagctg tatgtcccag aacgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctctatcc tgagcccaaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgca gcacacccaa tacctacatc tgtatgcagc ggacagtgac cacaacccca 480
gcacccagac cccctacacc tgcaccaacc atcgccagcc agccactgtc cctgaggccc 540
gaggcatgca ggcctgcagc aggaggcgcc gtgcacacaa ggggcctgga ctttgcctgt 600
gatgcaggaa ccgtgctgct gctgagagca ggcttctatg ccgtgtcctt tctgtctgtg 660
gccgtgggct ccacagtgta ctatcagggc aagtgcctga cctggaaggg cccacggaga 720
cagctgcccg ccgtggtgcc cgcccctctg ccaccccctt gtggcagtag cgcccacctg 780
ctgccacccg tgcccggagg a 801
<210> 30
<211> 267
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKG2D/NCR3
<400> 30
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu
195 200 205
Arg Ala Gly Phe Tyr Ala Val Ser Phe Leu Ser Val Ala Val Gly Ser
210 215 220
Thr Val Tyr Tyr Gln Gly Lys Cys Leu Thr Trp Lys Gly Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gln Leu Pro Ala Val Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Pro Cys Gly Ser
245 250 255
Ser Ala His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Gly
260 265
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> N是整数，表示重复的GGGGS的数目
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Asn
1 5
<210> 32
<211> 60
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> GS3/CD8a
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr
1 5 10 15
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
20 25 30
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
35 40 45
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55 60
<210> 33
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> GS9
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> GS3
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 2B4 ICR
<400> 35
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser
35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
85 90 95
Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
100 105 110
Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
115 120
<210> 36
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 2B4 ICR
<400> 36
tggaggagga aaaggaagga gaaacagagc gagacctccc ctaaggagtt cctgaccatc 60
tacgaggacg tgaaggacct gaagaccagg aggaaccacg agcaggaaca gacctttcct 120
ggcggaggca gcaccatcta cagcatgatc cagagccaga gcagcgcccc taccagccaa 180
gagcctgcct acaccctgta cagcctgatc cagcccagca ggaaaagcgg ctccaggaag 240
aggaaccaca gccccagctt caacagcacc atctatgagg tgatcggcaa gagccagccc 300
aaggcccaga accctgccag gctgtccagg aaggagctgg agaacttcga cgtgtacagc 360
<210> 37
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKp80 ICR
<400> 37
Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Met Thr Leu Asn Val Gln Ser Lys Lys
1 5 10 15
Arg Ser Ser Ala Gln Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys Asp Tyr Ser Val
20 25 30
Thr Leu His Trp Tyr Lys
35
<210> 38
<211> 114
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NKp80 ICR
<400> 38
atgcaggatg aggacggcta tatgaccctg aacgtccagt ccaagaagag gtccagcgct 60
cagaccagcc agctgacctt caaggactac tccgtgaccc tgcactggta caag 114
<210> 39
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> B2Ad N-末端ECD
<400> 39
Met Gly Gln Pro Gly Asn Gly Ser Ala Phe Leu Leu Ala Pro Asn Arg
1 5 10 15
Ser His Ala Pro Asp His Asp Val Thr Gln Gln Arg Asp Glu
20 25 30
<210> 40
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> B2 AdR N-末端ECD
<400> 40
atggggcaac ccgggaacgg cagcgccttc ttgctggcac ccaatagaag ccatgcgccg 60
gaccacgacg tcacgcagca aagggacgag 90
<210> 41
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> B2 AdR TM 螺旋
<400> 41
Val Trp Val Val Gly Met Gly Ile Val Met Ser Leu Ile Val Leu Ala
1 5 10 15
Ile Val Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Thr Ala Ile Ala Lys Phe Glu
20 25 30
Arg
<210> 42
<211> 99
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> B2AdR TM 螺旋
<400> 42
gtgtgggtgg tgggcatggg catcgtcatg tctctcatcg tcctggccat cgtgtttggc 60
aatgtgctgg tcatcacagc cattgccaag ttcgagcgt 99
<210> 43
<211> 924
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_1
<400> 43
gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgca ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gccgcacgac cactgttcaa tcaggaagtc cagatccccc tgacagagtc ttactgcggc 120
ccatgtccca agaactggat ctgctacaag aacaattgtt atcagttctt tgacgagagc 180
aagaactggt atgagtccca ggcctcttgc atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg 240
tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag ctggtgaagt cctatcactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ctacaaacgg ctcttggcag tgggaggacg gctccatcct gtctccaaat 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag 420
ggctatatcg agaactgctc cacacccaat acctacatct gtatgcagag gaccgtgggt 480
ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt ggcggcggat ctaccacaac ccctgcacca 540
cgccccccta caccagcacc taccatcgca agccagcctc tgtccctgcg gccagaggca 600
tgtagaccag cagcaggagg agcagtgcac acaagaggcc tggacttcgc ctgcgatgtg 660
agcttttgtc tggtcatggt gctgctgttc gccgtggata ccggcctgta cttttccgtg 720
aagacaaata tcaggtctag cacccgcgac tggaaggatc acaagtttaa gtggcggaag 780
gaccctcagg ataagaagcg gggcagaaag aagctgctgt atatcttcaa gcagcccttc 840
atgcggcccg tgcagacaac ccaggaggaa gacggctgct catgtagatt tcctgaagaa 900
gaagaagggg gctgtgaact gtaa 924
<210> 44
<211> 789
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_2
<400> 44
gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgca ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gccgcacgac cactgttcaa tcaggaagtc cagatccccc tgacagagtc ttactgcggc 120
ccatgtccca agaactggat ctgctacaag aacaattgtt atcagttctt tgacgagagc 180
aagaactggt atgagtccca ggcctcttgc atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg 240
tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag ctggtgaagt cctatcactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ctacaaacgg ctcttggcag tgggaggacg gctccatcct gtctccaaat 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag 420
ggctatatcg agaactgctc cacacccaat acctacatct gtatgcagag gaccgtgggt 480
ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt ggcggcggat ctgtgagctt ttgtctggtc 540
atggtgctgc tgttcgccgt ggataccggc ctgtactttt ccgtgaagac aaatatcagg 600
tctagcaccc gcgactggaa ggatcacaag tttaagtggc ggaaggaccc tcaggataag 660
aagcggggca gaaagaagct gctgtatatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 720
acaacccagg aggaagacgg ctgctcatgt agatttcctg aagaagaaga agggggctgt 780
gaactgtaa 789
<210> 45
<211> 744
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_3
<400> 45
gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgca ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gccgcacgac cactgttcaa tcaggaagtc cagatccccc tgacagagtc ttactgcggc 120
ccatgtccca agaactggat ctgctacaag aacaattgtt atcagttctt tgacgagagc 180
aagaactggt atgagtccca ggcctcttgc atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg 240
tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag ctggtgaagt cctatcactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ctacaaacgg ctcttggcag tgggaggacg gctccatcct gtctccaaat 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag 420
ggctatatcg agaactgctc cacacccaat acctacatct gtatgcagag gaccgtggtg 480
agcttttgtc tggtcatggt gctgctgttc gccgtggata ccggcctgta cttttccgtg 540
aagacaaata tcaggtctag cacccgcgac tggaaggatc acaagtttaa gtggcggaag 600
gaccctcagg ataagaagcg gggcagaaag aagctgctgt atatcttcaa gcagcccttc 660
atgcggcccg tgcagacaac ccaggaggaa gacggctgct catgtagatt tcctgaagaa 720
gaagaagggg gctgtgaact gtaa 744
<210> 46
<211> 1164
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_4
<400> 46
gccgccacca tggccctgcc tgtgacagcc ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gctgccagac ccttattcaa ccaagaagtt caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc 120
ccatgtccta aaaactggat atgttacaaa aataactgct accaattttt tgatgagagt 180
aaaaactggt atgagagcca ggcttcttgt atgtctcaaa atgccagcct tctgaaagta 240
tacagcaaag aggaccagga tttacttaaa ctggtgaagt catatcattg gatgggacta 300
gtacacattc caacaaatgg atcttggcag tgggaagatg gctccattct ctcacccaac 360
ctactaacaa taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcctc gagctttaaa 420
ggctatatag aaaactgttc aactccaaat acgtacatct gcatgcaaag gactgtgacc 480
acaacccccg ctcccagacc tcctacccct gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc 540
ctgagacccg aagcctgtag acctgctgcc ggaggcgctg tgcacacaag aggcctggac 600
ttcgcctgcg atatctatat ctgggcccct ctggctggaa cctgtggcgt gctgctgctg 660
agcctggtga ttaccaagag gggcaggaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcctttc 720
atgaggcccg tgcaaaccac ccaggaggag gacggctgca gctgcagatt ccctgaggag 780
gaggagggcg gatgcgagct gtggaggagg aaaaggaagg agaaacagag cgagacctcc 840
cctaaggagt tcctgaccat ctacgaggac gtgaaggacc tgaagaccag gaggaaccac 900
gagcaggaac agacctttcc tggcggaggc agcaccatct acagcatgat ccagagccag 960
agcagcgccc ctaccagcca agagcctgcc tacaccctgt acagcctgat ccagcccagc 1020
aggaaaagcg gctccaggaa gaggaaccac agccccagct tcaacagcac catctatgag 1080
gtgatcggca agagccagcc caaggcccag aaccctgcca ggctgtccag gaaggagctg 1140
gagaacttcg acgtgtacag ctga 1164
<210> 47
<211> 1155
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_5
<400> 47
gccgccacca tggccctgcc tgtgacagcc ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gctgccagac ccttattcaa ccaagaagtt caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc 120
ccatgtccta aaaactggat atgttacaaa aataactgct accaattttt tgatgagagt 180
aaaaactggt atgagagcca ggcttcttgt atgtctcaaa atgccagcct tctgaaagta 240
tacagcaaag aggaccagga tttacttaaa ctggtgaagt catatcattg gatgggacta 300
gtacacattc caacaaatgg atcttggcag tgggaagatg gctccattct ctcacccaac 360
ctactaacaa taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcctc gagctttaaa 420
ggctatatag aaaactgttc aactccaaat acgtacatct gcatgcaaag gactgtgatg 480
ggacagcctg gaaacggcag cgccttcctg ctggccccta acagaagcca cgcccccgat 540
cacgatgtga cccagcagag ggacgaggtg tgggtggtgg gcatgggcat cgtgatgagc 600
ctgatcgtgc tggctatcgt gttcggcaac gtgctggtga tcaccgccat cgccaagttc 660
gagaggaaga ggggcaggaa aaagctgctc tacatcttca agcagccctt catgaggccc 720
gtgcagacca cccaggaaga ggatggctgc tcctgtaggt ttcccgagga ggaggagggc 780
ggctgtgagc tgtggaggag aaaaaggaag gagaagcaga gcgagaccag ccccaaggag 840
ttcctgacca tctacgagga cgtgaaggac ctgaagacca ggaggaacca cgagcaggaa 900
cagaccttcc ccggcggagg cagcaccatc tacagcatga tccagagcca gtccagcgcc 960
cccacaagcc aggaacccgc ctacacactg tatagcctga tccagccctc caggaagagc 1020
ggcagcagga agaggaacca cagccccagc ttcaacagca ccatttacga ggtgatcgga 1080
aagagccagc ccaaggctca gaaccccgcc aggctgagca ggaaggagct cgaaaacttc 1140
gacgtgtaca gctga 1155
<210> 48
<211> 1349
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_6
<400> 48
ggatccgaat tcgccgccac catggccctg cctgtgacag ccctgctgct gcctctggct 60
ctgctgctgc acgctgccag acccttattc aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa 120
agttactgtg gcccatgtcc taaaaactgg atatgttaca aaaataactg ctaccaattt 180
tttgatgaga gtaaaaactg gtatgagagc caggcttctt gtatgtctca aaatgccagc 240
cttctgaaag tatacagcaa agaggaccag gatttactta aactggtgaa gtcatatcat 300
tggatgggac tagtacacat tccaacaaat ggatcttggc agtgggaaga tggctccatt 360
ctctcaccca acctactaac aataattgaa atgcagaagg gagactgtgc actctatgcc 420
tcgagcttta aaggctatat agaaaactgt tcaactccaa atacgtacat ctgcatgcaa 480
aggactgtga ccacaacccc tgctcccaga cctcccacac ccgcccctac aatcgcctcc 540
cagcctctga gcctgagacc cgaagcctgt agacctgccg ccggcggagc tgtgcataca 600
agaggcctgg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ctctggctgg cacatgcgga 660
gtcctgctgc tgagcctggt gatcaccaag aggggcagga agaagctgct gtacatcttc 720
aagcagccct tcatgaggcc tgtgcagacc acacaggagg aggacggctg ctcctgcagg 780
ttccctgagg aggaggaggg aggctgcgag ctgtggagga ggaagagaaa ggagaagcag 840
tccgagacct cccccaagga gttcctcacc atttacgagg acgtgaagga cctgaagacc 900
aggagaaacc acgagcagga acaaaccttc cccggcggcg gcagcaccat ctacagcatg 960
atccagagcc agtcctccgc ccctacaagc caggagcctg cctacaccct gtacagcctg 1020
atccagccta gcaggaagag cggctccagg aagaggaacc actcccccag cttcaacagc 1080
accatttatg aggtgatcgg caagtcccag cccaaggccc agaaccctgc cagactgtcc 1140
aggaaggagc tggagaactt cgacgtctac tccggcggcg gcggcagcgg cggaggaggc 1200
tccggaggag gcggcagcat gcaggatgag gacggctata tgaccctgaa cgtccagtcc 1260
aagaagaggt ccagcgctca gaccagccag ctgaccttca aggactactc cgtgaccctg 1320
cactggtaca agtgagcggc cgcgtcgac 1349
<210> 49
<211> 989
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_7
<400> 49
ggatccgaat tcgccgccac catggccctg cctgtgacag ccctgctgct gcctctggct 60
ctgctgctgc atgccgccag acccttattc aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa 120
agttactgtg gcccatgtcc taaaaactgg atatgttaca aaaataactg ctaccaattt 180
tttgatgaga gtaaaaactg gtatgagagc caggcttctt gtatgtctca aaatgccagc 240
cttctgaaag tatacagcaa agaggaccag gatttactta aactggtgaa gtcatatcat 300
tggatgggac tagtacacat tccaacaaat ggatcttggc agtgggaaga tggctccatt 360
ctctcaccca acctactaac aataattgaa atgcagaagg gagactgtgc actctatgcc 420
tcgagcttta aaggctatat agaaaactgt tcaactccaa atacgtacat ctgcatgcaa 480
aggactgtga ccaccacccc tgctcccaga ccccctacac ctgcccctac aatcgccagc 540
cagcccctga gcctgagacc tgaggcctgc agacctgctg ctggaggcgc tgtgcacaca 600
aggggcctcg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ctctggccgg cacatgtgga 660
gtgctgctgc tgtccctggt gatcaccaag aggggcagga agaagctgct gtacatcttc 720
aagcagccct tcatgaggcc cgtgcagacc acccaggagg aggacggctg ctcctgcaga 780
ttccccgagg aggaggaggg cggatgtgaa ctgggcggag gaggcagcgg cggcggcggc 840
agcggcggcg gcggcagcat gcaggatgag gacggctaca tgaccctgaa cgtgcagagc 900
aagaagagga gcagcgccca gaccagccag ctgaccttca aggactacag cgtgaccctg 960
cactggtaca agtgagcggc cgcgtcgac 989
<210> 50
<211> 1430
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_8
<400> 50
ggatccgaat tcgccgccac catggccctg cccgtgacag ctctgctgct gcctctggcc 60
ctgctgctgc atgccgctag acccctgttc aaccaggagg tgcagatccc cctgaccgaa 120
agctactgcg gcccctgccc caagaactgg atctgttaca agaacaactg ctatcagttc 180
ttcgacgaga gcaagaactg gtacgagagc caggccagct gtatgagcca gaacgccagc 240
ctgctgaaag tgtatagcaa ggaggaccag gacctgctga agctggtgaa gagctaccac 300
tggatgggcc tggtgcacat ccccaccaac ggaagctggc agtgggagga cggcagcatc 360
ctgagcccca acctgctgac catcatcgag atgcagaagg gcgactgcgc cctgtatgcc 420
agcagcttca agggctacat cgagaactgt agcaccccca acacctacat ctgcatgcag 480
aggaccgtgg gcggcggcgg cagcggcgga ggcggctccg gcggcggcgg cagcttattc 540
aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa agttactgtg gcccatgtcc taaaaactgg 600
atatgttaca aaaataactg ctaccaattt tttgatgaga gtaaaaactg gtatgagagc 660
caggcttctt gtatgtctca aaatgccagc cttctgaaag tatacagcaa agaggaccag 720
gatttactta aactggtgaa gtcatatcat tggatgggac tagtacacat tccaacaaat 780
ggatcttggc agtgggaaga tggctccatt ctctcaccca acctactaac aataattgaa 840
atgcagaagg gagactgtgc actctatgcc tcgagcttta aaggctatat agaaaactgt 900
tcaactccaa atacgtacat ctgcatgcaa aggactgtga tgggccagcc tggcaacggc 960
agcgcctttc tgctggcccc caacaggagc catgcccctg accacgacgt gacccagcag 1020
agggacgagg tgtgggtggt gggcatgggc atcgtgatga gcctgatcgt gctggccatc 1080
gtgttcggca acgtgctggt gatcaccgcc atcgccaagt tcgagaggaa gaggggcagg 1140
aagaagctgc tgtacatctt caagcagccc ttcatgagac ccgtgcaaac cacccaggag 1200
gaggacggct gcagctgcag gtttcccgag gaggaggagg gcggatgcga actgggaggc 1260
ggaggaagcg gaggaggagg atccggagga ggcggaagca tgcaggacga ggacggctac 1320
atgaccctga acgtccagag caagaagagg agcagcgccc agacctccca gctgaccttc 1380
aaggactact ccgtgaccct gcactggtac aagtgagcgg ccgcgtcgac 1430
<210> 51
<211> 1439
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_9
<400> 51
ggatccgaat tcgccgccac catggccctg cccgtgacag ctctgctgct gcctctggcc 60
ctgctgctgc atgccgctag acccctgttc aaccaggagg tgcagatccc cctgaccgaa 120
agctactgcg gcccctgccc caagaactgg atctgttaca agaacaactg ctatcagttc 180
ttcgacgaga gcaagaactg gtacgagagc caggccagct gtatgagcca gaacgccagc 240
ctgctgaaag tgtatagcaa ggaggaccag gacctgctga agctggtgaa gagctaccac 300
tggatgggcc tggtgcacat ccccaccaac ggaagctggc agtgggagga cggcagcatc 360
ctgagcccca acctgctgac catcatcgag atgcagaagg gcgactgcgc cctgtatgcc 420
agcagcttca agggctacat cgagaactgt agcaccccca acacctacat ctgcatgcag 480
aggaccgtgg gcggcggcgg cagcggcgga ggcggctccg gcggcggcgg cagcttattc 540
aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa agttactgtg gcccatgtcc taaaaactgg 600
atatgttaca aaaataactg ctaccaattt tttgatgaga gtaaaaactg gtatgagagc 660
caggcttctt gtatgtctca aaatgccagc cttctgaaag tatacagcaa agaggaccag 720
gatttactta aactggtgaa gtcatatcat tggatgggac tagtacacat tccaacaaat 780
ggatcttggc agtgggaaga tggctccatt ctctcaccca acctactaac aataattgaa 840
atgcagaagg gagactgtgc actctatgcc tcgagcttta aaggctatat agaaaactgt 900
tcaactccaa atacgtacat ctgcatgcaa aggactgtga ccaccacccc tgctcccaga 960
ccccctacac ctgcccctac aatcgccagc cagcccctga gcctgagacc tgaggcctgc 1020
agacctgctg ctggaggcgc tgtgcacaca aggggcctcg acttcgcctg cgacatctac 1080
atctgggccc ctctggccgg cacatgtgga gtgctgctgc tgtccctggt gatcaccaag 1140
aggggcagga agaagctgct gtacatcttc aagcagccct tcatgaggcc cgtgcagacc 1200
acccaggagg aggacggctg ctcctgcaga ttccccgagg aggaggaggg cggatgtgaa 1260
ctgggcggag gaggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcat gcaggatgag 1320
gacggctaca tgaccctgaa cgtgcagagc aagaagagga gcagcgccca gaccagccag 1380
ctgaccttca aggactacag cgtgaccctg cactggtaca agtgagcggc cgcgtcgac 1439
<210> 52
<211> 1329
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_10
<400> 52
gccgccacaa tggccctgcc tgtgacagcc ctgctgctgc ctctggccct gctgctgcat 60
gctgccaggc ctctgttcaa ccaggaggtg cagatccctc tgaccgagag ctactgcggc 120
ccctgcccca agaactggat ctgctacaag aacaactgct accagttctt cgacgagagc 180
aagaactggt acgagagcca ggccagctgc atgtcccaga acgctagcct gctgaaggtg 240
tatagcaagg aggaccagga cctgctgaag ctggtgaaga gctaccactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ccaccaacgg ctcctggcag tgggaggacg gcagcatcct gagccctaac 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaaggga gactgcgccc tgtacgccag ctcctttaag 420
ggctacatcg agaactgcag cacccccaac acctacatct gtatgcagag gaccgtggga 480
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcttattcaa ccaagaagtt 540
caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc ccatgtccta aaaactggat atgttacaaa 600
aataactgct accaattttt tgatgagagt aaaaactggt atgagagcca ggcttcttgt 660
atgtctcaaa atgccagcct tctgaaagta tacagcaaag aggaccagga tttacttaaa 720
ctggtgaagt catatcattg gatgggacta gtacacattc caacaaatgg atcttggcag 780
tgggaagatg gctccattct ctcacccaac ctactaacaa taattgaaat gcagaaggga 840
gactgtgcac tctatgcctc gagctttaaa ggctatatag aaaactgttc aactccaaat 900
acgtacatct gcatgcaaag gactgtgacc accacccctg cccctagacc ccctacacct 960
gcccctacca tcgccagcca gcctctgagc ctgagacccg aggcctgtag acctgctgcc 1020
ggaggagccg tgcacacaag aggcctggac ttcgcctgcg acgtgagctt ctgcctggtg 1080
atggtgctgc tgttcgccgt ggacaccggc ctgtacttca gcgtgaagac caacatcagg 1140
agcagcacca gggactggaa ggaccacaaa ttcaagtgga ggaaggaccc ccaggacaag 1200
aagaggggca ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgag gcctgtgcag 1260
accacccagg aggaggacgg ctgcagctgc aggttccctg aggaggaaga gggcggctgc 1320
gagctgtga 1329
<210> 53
<211> 1239
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_11
<400> 53
gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgca ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gccgcacgac cactgttcaa tcaggaagtc cagatccccc tgacagagtc ttactgcggc 120
ccatgtccca agaactggat ctgctacaag aacaattgtt atcagttctt tgacgagagc 180
aagaactggt atgagtccca ggcctcttgc atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg 240
tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag ctggtgaagt cctatcactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ctacaaacgg ctcttggcag tgggaggacg gctccatcct gtctccaaat 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag 420
ggctatatcg agaactgctc cacacccaat acctacatct gtatgcagag gaccgtgacc 480
acaacccctg caccacgccc ccctacacca gcacctacca tcgcaagcca gcctctgtcc 540
ctgcggccag aggcatgtag accagcagca ggaggagcag tgcacacaag aggcctggac 600
ttcgcctgcg atgtgagctt ttgtctggtc atggtgctgc tgttcgccgt ggataccggc 660
ctgtactttt ccgtgaagac aaatatcagg tctagcaccc gcgactggaa ggatcacaag 720
tttaagtggc ggaaggaccc tcaggataag aagcggggca gaaagaagct gctgtatatc 780
ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag acaacccagg aggaagacgg ctgctcatgt 840
agatttcctg aagaagaaga agggggctgt gaactgtgga ggaggaaaag gaaggagaaa 900
cagagcgaga cctcccctaa ggagttcctg accatctacg aggacgtgaa ggacctgaag 960
accaggagga accacgagca ggaacagacc tttcctggcg gaggcagcac catctacagc 1020
atgatccaga gccagagcag cgcccctacc agccaagagc ctgcctacac cctgtacagc 1080
ctgatccagc ccagcaggaa aagcggctcc aggaagagga accacagccc cagcttcaac 1140
agcaccatct atgaggtgat cggcaagagc cagcccaagg cccagaaccc tgccaggctg 1200
tccaggaagg agctggagaa cttcgacgtg tacagctga 1239
<210> 54
<211> 1064
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NK15_12
<400> 54
ggatccgaat tcgccgccac catggctctg cccgtcaccg cactgctgct gcctctggct 60
ctgctgctgc acgccgcacg accactgttc aatcaggaag tccagatccc cctgacagag 120
tcttactgcg gcccatgtcc caagaactgg atctgctaca agaacaattg ttatcagttc 180
tttgacgaga gcaagaactg gtatgagtcc caggcctctt gcatgagcca gaatgcctct 240
ctgctgaagg tgtacagcaa ggaggaccag gatctgctga agctggtgaa gtcctatcac 300
tggatgggcc tggtgcacat ccctacaaac ggctcttggc agtgggagga cggctccatc 360
ctgtctccaa atctgctgac catcatcgag atgcagaagg gcgattgcgc cctgtacgcc 420
agctccttca agggctatat cgagaactgc tccacaccca atacctacat ctgtatgcag 480
aggaccgtga ccacaacccc tgcaccacgc ccccctacac cagcacctac catcgcaagc 540
cagcctctgt ccctgcggcc agaggcatgt agaccagcag caggaggagc agtgcacaca 600
agaggcctgg acttcgcctg cgatgtgagc ttttgtctgg tcatggtgct gctgttcgcc 660
gtggataccg gcctgtactt ttccgtgaag acaaatatca ggtctagcac ccgcgactgg 720
aaggatcaca agtttaagtg gcggaaggac cctcaggata agaagcgggg cagaaagaag 780
ctgctgtata tcttcaagca gcccttcatg cggcccgtgc agacaaccca ggaggaagac 840
ggctgctcat gtagatttcc tgaagaagaa gaagggggct gtgaactggg cggaggaggc 900
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcatgcagg atgaggacgg ctacatgacc 960
ctgaacgtgc agagcaagaa gaggagcagc gcccagacca gccagctgac cttcaaggac 1020
tacagcgtga ccctgcactg gtacaagtga gcggccgcgt cgac 1064
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> FLAG 标签
<400> 55
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> His 标签
<400> 56
His His His His His His
1 5
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> Myc 标签
<400> 57
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 58
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 氨基酸NKG2C高亲和力修饰
<400> 58
Ser Ile Ile Ser
1
<210> 59
<211> 1137
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> DNA序列嵌合CD94-CD8a TM-4-1BB/CD3ζ
<400> 59
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgccaggac ccaacataga actccagaaa gactctgact gctgttcttg ccaagaaaaa 120
tgggttgggt accggtgcaa ctgttacttc atttccagtg aacagaaaac ttggaacgaa 180
agtcggcatc tctgtgcttc tcagaaatcc agcctgcttc agcttcaaaa cacagatgaa 240
ctggatttta tgagctccag tcaacaattt tactggattg gactctctta cagtgaggag 300
cacaccgcct ggttgtggga gaatggctct gcactctccc agtatctatt tccatcattt 360
gaaactttta atacaaagaa ctgcatagcg tataatccaa atggaaatgc tttagatgaa 420
tcctgtgaag ataaaaatcg ttatatctgt aagcaacagc tcattaccac gacgccagcg 480
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 540
gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 600
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 660
accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 720
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 780
gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 840
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 900
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 960
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1020
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1080
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1137
<210> 60
<211> 378
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 氨基酸序列嵌合 CD94-CD8a TM-4-1BB/CD3ζ
<400> 60
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Pro Asn Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser
20 25 30
Asp Cys Cys Ser Cys Gln Glu Lys Trp Val Gly Tyr Arg Cys Asn Cys
35 40 45
Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Gln Lys Thr Trp Asn Glu Ser Arg His Leu
50 55 60
Cys Ala Ser Gln Lys Ser Ser Leu Leu Gln Leu Gln Asn Thr Asp Glu
65 70 75 80
Leu Asp Phe Met Ser Ser Ser Gln Gln Phe Tyr Trp Ile Gly Leu Ser
85 90 95
Tyr Ser Glu Glu His Thr Ala Trp Leu Trp Glu Asn Gly Ser Ala Leu
100 105 110
Ser Gln Tyr Leu Phe Pro Ser Phe Glu Thr Phe Asn Thr Lys Asn Cys
115 120 125
Ile Ala Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ala Leu Asp Glu Ser Cys Glu Asp
130 135 140
Lys Asn Arg Tyr Ile Cys Lys Gln Gln Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ala
145 150 155 160
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
165 170 175
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
180 185 190
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
195 200 205
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
210 215 220
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
225 230 235 240
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
245 250 255
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
260 265 270
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
275 280 285
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
290 295 300
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
305 310 315 320
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
325 330 335
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
340 345 350
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
355 360 365
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375
<210> 61
<211> 1119
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> DNA序列嵌合NKG2A 受体- CD8a TM-4-1BB/CD3ζ
<400> 61
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgctgaata caagaactca gaaagcacgt cattgtggcc attgtcctga ggagtggatt 120
acatattcca acagttgtta ctacattggt aaggaaagaa gaacttggga agagagtttg 180
ctggcctgta cttcgaagaa ctccagtctg ctttctatag ataatgaaga agaaatgaaa 240
tttctgtcca tcatttcacc atcctcatgg attggtgtgt ttcgtaacag cagtcatcat 300
ccatgggtga caatgaatgg tttggctttc aaacatgaga taaaagactc agataatgct 360
gaacttaact gtgcagtgct acaagtaaat cgacttaaat cagcccagtg tggatcttca 420
ataatatatc attgtaagca taagcttacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 480
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 540
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 600
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 660
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 720
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 780
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 840
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 900
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 960
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 1119
<210> 62
<211> 372
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 氨基酸序列嵌合NKG2A 受体- CD8a
TM-4-1BB/CD3ζ
<400> 62
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys Ala Arg His Cys
20 25 30
Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn Ser Cys Tyr Tyr
35 40 45
Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu Leu Ala Cys Thr
50 55 60
Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu Glu Glu Met Lys
65 70 75 80
Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly Val Phe Arg Asn
85 90 95
Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu Ala Phe Lys His
100 105 110
Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys Ala Val Leu Gln
115 120 125
Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser Ile Ile Tyr His
130 135 140
Cys Lys His Lys Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
165 170 175
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
180 185 190
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
195 200 205
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
225 230 235 240
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
245 250 255
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
260 265 270
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
275 280 285
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
290 295 300
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
305 310 315 320
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
325 330 335
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
340 345 350
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
355 360 365
Leu Pro Pro Arg
370
<210> 63
<211> 690
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> DNA 序列工程改造的NKG2C
<400> 63
aataaacaaa gaggaacctt ctcagaagtg agtctggccc aggacccaaa gcggcagcaa 60
aggaaaccta aaggcaataa aagctccatt tcaggaaccg aacaggaaat attccaagta 120
gaattaaatc ttcaaaatcc ttccctgaat catcaaggga ttgataaaat atatgactgc 180
caaggtttac tgccacctcc agagaagctc actgccgagg tcctaggaat catttgcatt 240
gtcctgatgg ccactgtgtt aaaaacaata gttcttattc ctttcctgga gcagaacaat 300
ttttccccga atacaagaac gcagaaagca cgtcattgtg gccattgtcc tgaggagtgg 360
attacatatt ccaacagttg ttattacatt ggtaaggaaa gaagaacttg ggaagagagt 420
ttgctggcct gtacttcgaa gaactccagt ctgctttcta tagataatga agaagaaatg 480
aaatttctgt ccatcatttc accttcctca tggattggtg tgtttcgtaa cagcagtcat 540
catccatggg tgacaataaa tggtttggct ttcaaacata agataaaaga ctcagataat 600
gctgaactta actgtgcagt gctacaagta aatcgactta aatcagccca gtgtggatct 660
tcaatgatat atcattgtaa gcataagctt 690
<210> 64
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 氨基酸序列工程改造的NKG2C
<400> 64
Met Asn Lys Gln Arg Gly Thr Phe Ser Glu Val Ser Leu Ala Gln Asp
1 5 10 15
Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ser Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Thr Glu Gln Glu Ile Phe Gln Val Glu Leu Asn Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Ser Leu Asn His Gln Gly Ile Asp Lys Ile Tyr Asp Cys Gln Gly Leu
50 55 60
Leu Pro Pro Pro Glu Lys Leu Thr Ala Glu Val Leu Gly Ile Ile Cys
65 70 75 80
Ile Val Leu Met Ala Thr Val Leu Lys Thr Ile Val Leu Ile Pro Phe
85 90 95
Leu Glu Gln Asn Asn Phe Ser Pro Asn Thr Arg Thr Gln Lys Ala Arg
100 105 110
His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn Ser Cys
115 120 125
Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu Leu Ala
130 135 140
Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu Glu Glu
145 150 155 160
Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly Val Phe
165 170 175
Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Ile Asn Gly Leu Ala Phe
180 185 190
Lys His Lys Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys Ala Val
195 200 205
Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser Met Ile
210 215 220
Tyr His Cys Lys His Lys Leu
225 230
<210> 65
<211> 384
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> DNA 序列NKG2A 片段
<400> 65
ctgaatacaa gaactcagaa agcacgtcat tgtggccatt gtcctgagga gtggattaca 60
tattccaaca gttgttacta cattggtaag gaaagaagaa cttgggaaga gagtttgctg 120
gcctgtactt cgaagaactc cagtctgctt tctatagata atgaagaaga aatgaaattt 180
ctgtccatca tttcaccatc ctcatggatt ggtgtgtttc gtaacagcag tcatcatcca 240
tgggtgacaa tgaatggttt ggctttcaaa catgagataa aagactcaga taatgctgaa 300
cttaactgtg cagtgctaca agtaaatcga cttaaatcag cccagtgtgg atcttcaata 360
atatatcatt gtaagcataa gctt 384
<210> 66
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 氨基酸序列 NKG2A 片段
<400> 66
Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu
1 5 10 15
Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg
20 25 30
Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser
35 40 45
Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile
50 55 60
Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro
65 70 75 80
Trp Val Thr Met Asn Gly Leu Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys
100 105 110
Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu
115 120 125
<210> 67
<211> 402
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> DNA 序列CD94 片段
<400> 67
ccaggaccca acatagaact ccagaaagac tctgactgct gttcttgcca agaaaaatgg 60
gttgggtacc ggtgcaactg ttacttcatt tccagtgaac agaaaacttg gaacgaaagt 120
cggcatctct gtgcttctca gaaatccagc ctgcttcagc ttcaaaacac agatgaactg 180
gattttatga gctccagtca acaattttac tggattggac tctcttacag tgaggagcac 240
accgcctggt tgtgggagaa tggctctgca ctctcccagt atctatttcc atcatttgaa 300
acttttaata caaagaactg catagcgtat aatccaaatg gaaatgcttt agatgaatcc 360
tgtgaagata aaaatcgtta tatctgtaag caacagctca tt 402
<210> 68
<211> 134
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 氨基酸序列CD94 片段
<400> 68
Pro Gly Pro Asn Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser Asp Cys Cys Ser Cys
1 5 10 15
Gln Glu Lys Trp Val Gly Tyr Arg Cys Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Ser
20 25 30
Glu Gln Lys Thr Trp Asn Glu Ser Arg His Leu Cys Ala Ser Gln Lys
35 40 45
Ser Ser Leu Leu Gln Leu Gln Asn Thr Asp Glu Leu Asp Phe Met Ser
50 55 60
Ser Ser Gln Gln Phe Tyr Trp Ile Gly Leu Ser Tyr Ser Glu Glu His
65 70 75 80
Thr Ala Trp Leu Trp Glu Asn Gly Ser Ala Leu Ser Gln Tyr Leu Phe
85 90 95
Pro Ser Phe Glu Thr Phe Asn Thr Lys Asn Cys Ile Ala Tyr Asn Pro
100 105 110
Asn Gly Asn Ala Leu Asp Glu Ser Cys Glu Asp Lys Asn Arg Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Gln Gln Leu Ile
130
<210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> HLA-E 信号肽
<400> 69
Met Val Asp Gly Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Glu Ala Leu Ala Leu
1 5 10 15
Thr Gln Thr Trp Ala
20
<210> 70
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> HLA-G 信号肽
<400> 70
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala
20

Claims (48)

1.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码活化性嵌合受体，所述活化性嵌合受体结合HLA I类组织相容性抗原，α链E(HLA-E)/肽复合物，其中所述活化性嵌合受体在结合到所述HLA-E/肽复合物后转导活化和/或共刺激信号，其中所述活化性嵌合受体包含：
a)胞外受体结构域，其中所述胞外受体结构域包含自然杀伤细胞组2成员C(NKG2C)的工程改造的变体，
其中非工程改造的NKG2C对HLA-E/肽复合物具有低结合亲和力，
其中所述工程改造的NKG2C变体相对于天然NKG2C具有增强的对HLA-E/肽复合物的结合亲和力，并且
其中所述工程改造的NKG2C变体包含SEQ ID NO.58的氨基酸序列；或
b)胞外受体结构域，其中所述胞外受体结构域包含自然杀伤细胞组2成员A(NKG2A)的片段，
其中所述NKG2A的片段偶联到包含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域，
其中天然NKG2A结合到HLA-E/肽复合物后转导抑制性信号，并且
其中所述NKG2A的片段在结合到HLA-E/肽复合物后转导活化和/或共刺激信号。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述胞外受体结构域包含与包含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域偶联的工程改造的NKG2C变体。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述胞外受体结构域包含与天然NKG2C跨膜区和天然NKG2C胞内信号传导结构域偶联的工程改造的NKG2C变体。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述工程改造的NKG2C变体由SEQ ID NO:63的核酸序列或其片段编码。
5.如权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸进一步编码DNAX活化蛋白12(DAP12)。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸进一步编码天然CD94或嵌合CD94。
7.如权利要求6所述的多核苷酸，其中所述嵌合CD94包含
(a)胞外受体结构域，
其中所述胞外受体结构域包含CD94的片段；以及
(b)包含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域。
8.如权利要求7所述的多核苷酸，其中所述效应子结构域包含CD16、NCR1、NCR2、NCR3、4-1BB、NKp80、DAP10、CD3ζ、2B4及其片段中的一个或多个。
9.如权利要求7所述的多核苷酸，其中所述嵌合CD94受体包含与CD8a跨膜结构域和包含4-1BB与CD3ζ的效应子结构域偶联的CD94片段。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述嵌合CD94由SEQ ID NO:59的核酸序列编码。
11.如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述嵌合CD94包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
12.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述活化性嵌合受体包含与CD8a跨膜结构域和包含4-1BB与CD3ζ的效应子结构域偶联的NKG2A片段。
13.如权利要求12所述的多核苷酸，其中所述活化性嵌合受体由SEQ ID NO:61的核酸序列编码。
14.如权利要求12所述的多核苷酸，其中所述活化性嵌合受体包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
15.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，其中所述活化性嵌合受体进一步包含GS接头。
16.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，其中所述嵌合受体包含铰链区。
17.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述铰链区由SEQ ID NO:5的核酸序列编码。
18.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述铰链区由SEQ ID NO:5的核酸序列的片段编码。
19.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述铰链区包含具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的甘氨酸-丝氨酸重复基序。
20.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
21.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
22.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述铰链区由SEQ ID NO:34的核酸序列编码。
23.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述铰链区包含β-肾上腺素能受体的一部分。
24.如权利要求23所述的多核苷酸，其中所述铰链区由SEQ ID NO:40的核酸序列编码。
25.如权利要求23所述的多核苷酸，其中所述铰链区由SEQ ID NO:42的核酸序列编码。
26.如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述胞外受体结构域进一步包含CD8a信号肽，其中所述信号肽包含SEQ ID NO.4的核酸序列。
27.如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述效应子结构域包含一个或多个半-ITAM序列。
28.如权利要求27所述的多核苷酸，其中所述半-ITAM包含SEQ ID NO.14的氨基酸序列。
29.如权利要求27所述的多核苷酸，其中所述半-ITAM包含SEQ ID NO.37的氨基酸序列。
30.如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述效应子结构域包含一个或多个ITSM序列。
31.如权利要求30所述的多核苷酸，其中所述ITSM包含SEQ ID NO.15的氨基酸序列。
32.如权利要求30所述的多核苷酸，其中所述ITSM包含SEQ ID NO.35的氨基酸序列。
33.如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述NKG2C变体与SEQ ID NO:63具有至少80％的同源性。
34.如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述NKG2A的片段与SEQ ID NO:65具有至少80％的同源性。
35.如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述CD94的片段与SEQ ID NO:67具有至少80％的同源性。
36.如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步编码嵌合受体，所述嵌合受体包含(a)胞外受体结构域，其中所述胞外受体结构域包含与自然杀伤细胞组2成员D(NKG2D)的天然配体结合的肽；和(b)包含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域。
37.如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步编码特异性抑制天然NKG2A的转录或翻译的短发夹RNA(shRNA)，
其中所述shRNA包含在严格条件下与天然NKG2A基因杂交的核苷酸序列，其中所述shRNA包含有义片段和反义片段，所述有义片段包含与NKG2A基因中的靶序列基本相同的核苷酸序列，所述靶序列在所述NKG2A片段中不存在，其中所述有义片段和反义片段由环片段分开。
38.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与另外的编码膜结合白细胞介素15(mbIL15)的构建体共表达。
39.一种基因工程改造的自然杀伤细胞，其包含如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸。
40.如权利要求39所述的基因工程改造的自然杀伤细胞，其是从患者分离的自体细胞。
41.如权利要求39所述的基因工程改造的自然杀伤细胞，其是从供体分离的同种异体细胞。
42.如权利要求39所述的基因工程改造的自然杀伤细胞，其中所述NK细胞缺乏天然NKG2A的表面表达。
43.一种基因工程改造的自然杀伤细胞，其包含
如权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，以及选自以下的另外多核苷酸：
(i)编码嵌合受体的多核苷酸，所述嵌合受体包含：(a)胞外受体结构域，其中所述胞外受体结构域包含与自然杀伤细胞组2成员D(NKG2D)的天然配体结合的肽；和(b)包含跨膜区和胞内信号传导结构域的效应子结构域；
(ii)编码膜结合白细胞介素15(mbIL15)的多核苷酸；
(iii)编码特异性抑制天然NKG2A的转录或翻译的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸；以及
(iv)(i)、(ii)及(iii)的任何组合。
44.一种在有需要的哺乳动物中增强NK细胞的细胞毒性的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用NK细胞，其中所述NK细胞表达由权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸编码的活化性嵌合受体。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述NK细胞是从患者分离的自体细胞。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述NK细胞是从供体分离的同种异体细胞。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述NK细胞缺乏天然NKG2A的表面表达。
48.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸在制备用于增强有需要的哺乳动物中NK细胞的细胞毒性的药物中的用途。
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