ES2385754T3 - Receptores heterodiméricos solubles y usos de estos - Google Patents

Abstract

Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 comprendiendo una parte soluble de una secuenciade aminoácidos NKG2 y una parte soluble de una secuencia de 5 aminoácidos CD94.

Description

Receptores heterodiméricos solubles y usos de estos

Campo de la invención

[0001] Esta invención se refiere a receptores heterodiméricos solubles para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, y a métodos de diseño y producción de tales receptores heterodiméricos solubles. Composiciones ejemplares de la invención comprenden fragmentos solubles de receptores heterodiméricos al igual que la porción Fc de las inmunoglobulinas.

Antecedentes de la invención

[0002] Receptores solubles, tales como TNFR soluble (Enbrel®), han probado gran valor para aplicaciones terapéuticas. Receptores solubles pueden también ser usados para fines de diagnóstico, también, por ejemplo, para la selección de expresión de ligandos en tejidos enfermos, tales como tejidos tumorales en pacientes con cáncer.

[0003] La familia de receptores CD94/NKG2 está compuesta de elementos receptores heterodiméricos con activación o potencial inhibitorio. Estos receptores se expresan predominantemente en células NK y un subconjunto de células CD8+T, y han mostrado jugar un papel importante en las respuestas de regulación contra células tumorigénicas e infectadas. El ligando principal para el receptor CD94/NKG2 es HLA-E. La patente US n°. 6262244 a Houchins et al. describe la secuencia humana NKG2A (SEC ID nº: 1), y Chang et al.(Eur J Immunol. 1995,25:2433-7) informó de la secuencia CD94 humana (SEC ID nº: 2).

[0004] Versiones solubles de receptores CD94/NKG2 son de interés no solo como herramientas de investigación, sino también como agentes terapéuticos. Ambas aplicaciones diagnóstica y terapéutica, no obstante, requieren receptores solubles estables que se pueden producir eficazmente en un biosistema adecuado. Para muchos receptores heterodiméricos tales como, por ejemplo, CD94/NKG2, esto se ha mostrado, hasta el momento, difícil. Cuestiones potenciales son homo-dimerización de las subunidades individuales, y la estructura más compleja de receptores heterodiméricos los hace más difíciles para diseñar versiones solubles que son suficientemente estables.

[0005] Ciertas construcciones solubles CD94/NKG2A, basadas en la expresión de partes etiquetadas solubles de CD94 y proteínas NKG2A, se han propuesto en la literatura (Brooks et al., J Immunol 1999:162:305-13; Ding et al Scand. J. Immunol. 1999,49:459-465; y Kaiser et al. Journal of Immunology, 2005, 174: 2878-2884). Versiones solubles de otros receptores multiméricos, algunos del cuales fusionados a partes Fc de inmunoglobulina, han sido descritos en, por ejemplo, WO9937772, WO200208272, y WO20023237, en relación a moléculas receptoras multiméricas IL-18; Wu et al. (Protein Sci. 1999;8:482-9), describe formas solubles del receptor IL-2; WO200222153, describe un receptor soluble IL20; WO200212345, en relación a receptores de citocina solubles ZCY-TOR 11, WO2002101006, en relación a proteínas heteromultiméricas tales como receptores de células T, WO9533059, describe un receptor heterodimérico de gp130 y cadena beta receptora de oncostatina M, y US6238890, describe formas solubles de varias glicoproteínas. Versiones solubles de receptores de células T heterodiméricas o subunidades de estas también han sido descritas en, por ejemplo, Clements et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2002; 58:2131-4; Laugel et al., J. Biol. Chem. 2005;280:1882-1892; Kim et al., J Mol Biol. 2000;302:899-916.

[0006] Además, las publicaciones de patentes US nº 20030195338 y 20040072256 describen varios tipos de proteínas de secuencia receptoras Fc enlazadas, la patente US n° 6,018,026 se refiere a proteínas de fusión dimerizadas; la patente US n° 6,033,041 se refiere a métodos para generar heteromultímeros quiméricos; las WO92/06204 y WO03012069 se refieren a, por ejemplo, técnicas para producir bibliotecas de receptores heterodiméricos; la publicación de patente US n° 20040138417 describe adhesinas heteromultiméricas. También, principios para promover formación de heteromultímeros se describen en la publicación de patente US n° 20030078385, y se revisa en Marvin y Zhu, Acta Pharmacol Sino 2005,26(6):649-658 (ver también Kontermann, Acta Pharmacol. Sin. 2005,26:1-9).

[0007] Además, Hayer et al., Nat. lmmun. 1998;16:78, Brooks et al., J Immunol. 1999;162:305-313 y Vales-Gomez et al., Embo. J 1999,18:4250-4260 todos revelan receptores diméricos solubles CD94/NKG2.

[0008] No obstante, permanece una necesidad de versiones solubles monocatenarias de receptores heterodiméricos tales como CD94/NKG2 para diagnóstico o usos terapéuticos, y métodos eficaces para producción de receptores heterodiméricos monocatenarios solubles estables. La presente invención se dirige a estas y otras necesidades en la técnica.

Resumen de la invención

[0009] La presente invención proporciona una proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94. En algunos aspectos, las construcciones, comprenden además un polipéptido de inmunoglobulina

comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este, una o dos porciones Fc de una molécula de inmunoglobulina.

[0010] En un aspecto ejemplar, la proteína de fusión monocatenaria soluble CD94/NKG2, comprende además un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este. En otro aspecto ejemplar, la invención proporciona para una proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 donde el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se une al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 se enlaza al polipéptido de inmunoglobulina.

[0011] En otro aspecto ejemplar, la invención proporciona una proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2, donde el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 se une al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se enlaza al polipéptido de inmunoglobulina.

[0012] En todavía otro aspecto ejemplar, la invención proporciona una proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2, donde la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se unen por un enlazador peptídico comprendiendo glicina y serina.

[0013] En un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2, que es un receptor cD94/NKG2A CD94/NKG2B CD94/NKG2C CD94/NKG2E, o CD94/NKG2F. En todavía otro aspecto ejemplar, la invención proporciona una proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2, que es CD94/NKG2A. En todavía otro aspecto ejemplar, la invención proporciona una proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2A, comprendiendo residuos los 99-233 de SEC ID nº: 1.

[0014] En todavía un aspecto ejemplar, la invención proporciona una proteína de fusión monocatenaria soluble CD94/NKG2, que es CD94/NKG2C. En un aspecto más ilustrativo, la invención proporciona una proteína de fusión monocatenaria soluble CD94/NKG2C, comprendiendo los residuos 96-231 de la SEC ID nº: 3.

[0015] En todavía un aspecto más ilustrativo, la invención proporciona una proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 comprendiendo los residuos 35-179 de la SEC ID nº: 2. En un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión receptora soluble CD94/NKG2A comprendiendo la secuencia de cualquiera de las SEC ID nº: 37

39.

[0016] En todavía otro aspecto ejemplar, la invención proporciona un dímero de proteína de fusión receptor monocatenario soluble CD94/NKG2 según cualquiera de los aspectos ejemplares precedentes.

[0017] En un aspecto más ilustrativo, la invención proporciona un método para producir una proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2, comprendiendo cultivo de una célula comprendiendo un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 de cualquiera de los aspectos ejemplares precedentes bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2. En todavía otro aspecto ejemplar, la invención proporciona una composición farmacéutica comprendiendo una cantidad eficaz de la proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 de cualquiera de los aspectos ejemplares precedentes y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente.

[0018] La invención también proporciona varios métodos de fabricación tales construcciones solubles, al igual que varios usos de las construcciones solubles según la invención. Un uso ejemplar está en la detección del ligando natural (p. ej., HLA-E) en una muestra biológica.

[0019] Estos y otros aspectos son descritos con más detalle a continuación y en los dibujos.

Descripción de los dibujos

[0020] Figura 1: proteína de fusión Fc soluble CD94/NKG2A. Figura 2: proteína de fusión Fc soluble CD94/NKG2A comprendiendo heterodimerización Fc1-Fc2 forzada. Construcciones con mutaciones en los residuos cargados del dominio Fc permite al heterodímero ser formado de cadenas NKG2A-Fc y CD94-Fc independientes. Figuras 3A y B: (A) proteína de fusión monocatenaria ejemplar Fc-NKG2A-CD94 con un enlazador GGSGG del C- terminal de NKG2A al N-terminal de CD94. (B) Cadena ejemplar única Fc-CD94-NKG2A con un enlazador GGSGG (identidad SEC NO:6) del C-terminal de CD94 al N-terminal de NKG2A. Las construcciones permiten el pliegue del CD94/NKG2A en una conformación activa y permiten dimerización de la parte Fc. Figura 4. Modelo in silico de CD94/NKG2A complejo con HLA-E. El modelo muestra que N y C terminales están muy cerca, permitiendo diferentes tipos de construcciones. Figura 5: Etiquetado de la parte constante de la cadena pesada para los alotipos GM (SEC ID nº: 8) y KM (SEC ID nº: 9).

Figura 6: Etiquetado de las regiones constantes Kappa (SEC ID nº: 10) y Lambda (SEC ID nº: 11). Figura 7A-7C: Alineamiento de secuencias de inmunoglobulina humana, de ratón y de rata, referido por el respectivo nombre de introducción UNIPROT. (GC1_RAT: SEC ID NO:12; GC3_MOUSE: SEC ID NO:13; GCAA_MOUSE: SEC ID NO:14; GCAB_MOUSE: SEC ID NO:15; GCA_RAT: SEC ID NO:16; GCB_MOUSE: SEC ID NO:17; GCB_RAT: SEC ID NO:18; GCC_RAT:SEQ ID NO:19; IGHG1-HUMAN: SEC ID NO:20; IGHG1_MOUSE: SEC ID NO:21; IGHG2_HUMAN: SEC ID NO:22; IGHG3_HUMAN: SEC ID NO:23; IGHG4_HUMAN: SEC ID NO:24. Figura 8: Alineamiento de murina de tipo salvaje y de variantes de secuencias de inmunoglobulina. mFc: identidad SEC NO:25 mFc-IGHG1: residuos 98 a 324 de identidad SEC NO:21 mFc dm NKG2A: identidad SEC NO:26 mFc dm CD94: SEC ID NO:27 mFc sm NKG2A: SEC ID NO:28 y mFc sm CD94: SEC ID NO:29. Figura 9: Construcción de plásmido pcDNA3.1 (+)-mFc-hCD94 (ejemplo 4). Figura 10: Construcción de plásmido pcDNA3.1/Hygro(+)-mFc-hNKG2A (ejemplo 4). Figura 11: Construcción de plásmido pcDNA3.1/Hygro(+)-mFc-hNKG2A-GGS-GGS-hCD94 (ejemplo 6). Figuras 12A-C: Análisis de transferencia Western de (A) hCD94-mFc/hNKG2A-mFc bajo condiciones no reducidas, (B) hCD94-mFc/hNKG2A-mFc bajo condiciones de reducción, y (C) mFc-NKG2A-CD94 de cadena simple expresado en HEK293 bajo reducción y condiciones no reducidas (ejemplo 7). Figuras 13A y B: Análisis de transferencia SDS-PAGE/Western de construcciones después de purificación de proteína A usando (A) anticuerpos anti-CD94 (HP-3D9) (Cy3-marcados), o (B) anticuerpos anti-NKG2A (Z199) (Cy5-marcados). Columna 1: marcador PM (no visto); Columna 2: pBF5 CD94-mFc; Columna 3: pBF17 CD94-2xGGS-NKG2A-mFc; Columna 4: pBF6 NKG2A-mFc; Columna 5: pBF19 CD94-T249Y mFc y pBF20 NKG2A-mFc Y290T; Columna 6: pBF5 CD94-mFc y pBF6 NKG2A-mFc; Columna 7: pBF21 CD94-, e239K mFc K292D y pBF22 NKG2A-mFc, d282K K332E (ejemplo 8). Figuras 14A y B: transferencia de SDS-PAGE/Western de fracciones diferentes de purificación de CD-94-2xGGSNKG2A-mFc en la columna de proteína A usando (A) anticuerpo anti-CD94 (HP-3D9) (Cy3-marcado B) y (B) anticuerpos anti-NKG2A (Z199) (Cy5-marcados). Columna 1: marcador PM; Columna 2: aplicación; Columna 3: flujo circulante; Columna 4: fracción A10; Columna 5: fracción A11; Columna 6: fracción A12; Columna 7: fracción B1; Columna 8: fracción B2; Columna 9: fracción B3; Columna 10: fracción B4; Columna 11: fracción B5; Columna 12: fracción B6. Figura 15: Construcción de plásmido Trx-hexaHis pET32a hNKG2A (pISNN415) (ejemplo 9). Figura 16: Análisis de expresión Trx-hexaHis-NKG2A en E. coli (ejemplo 10; p = fracción de granulado; s = fracción soluble). Figura 17: Construcción de plásmido HexaHis-GST XPNNB pET15b hCD94 (pISNN427) (ejemplo 11). Figura 18: Análisis de expresión hexaHis-GST-CD94 en E. coli (ejemplo 12; p = fracción de granulado; s = fracción soluble). Figuras 19A y B: (A) Construcción NKG2A-2xGGS; (B) Construcción NKG2A-2xGGS-CDF94 (ejemplo 13). Figura 20: Dímero monocatenario de construcción de plásmido NKG2A-2xGGS-CD94 GST XPNNB pET15b (ejemplo 13). Figura 21: Dímero monocatenario de construcción NKG2A-2xGGS-CD94. Figura 22: Construcción de plásmido CD94-2xGGS-NKG2A GST XPNNB pET15b (ejemplo 13). Figura 23: Expresión 6His-GST-NKG2A-2xGGS-CD94 y Trx-6His-NKG2A-2xGGS-CD94 en E. coli (ejemplo 14; p = fracción de granulado; s = fracción soluble). Figura 24: Unión de construcción monocatenaria NKG2A/CD94 (mFc-GS-NKG2A-GGSGGS-RSS-CD94) a anticuerpos anti-NKG2A (Z199, gris claro) y anti-CD94 (HP-3D9, gris oscuro) (ejemplo 19). Figura 25: Alineamiento de partes extracelulares de proteínas NKG2. Numeración según la secuencia completa NKG2A (SEC ID nº: 1). Ver las SEC ID nº: 1 (NKG2A), 3 (NKG2C), 4 (NKG2E), 5 (NKG2F), y 70 (NKG2B) para secuencias en toda su longitud. Figura 26: Sensogramas superpuestos que muestran humZ270; humZ199, anti-NKG2C-PE y humON72 unión chip scCD94/NKG2A (línea sólida negra), chip scCD94/NKG2C (línea gris) y chip NKG2D-Fc (línea discontinua). Anticuerpos a 10 µg/ml fueron inyectados durante un minuto a una velocidad de flujo de 10 µl/min.

Definiciones [0021] El término "receptor" denota una proteína asociada a célula que se une a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y media el efecto del ligando en la célula. Receptores unidos a membrana se caracterizan por el hecho de que una estructura multi-dominio comprendiendo un dominio de unión de ligandos extracelular y un dominio efector intracelular que está implicado típicamente en la transducción de señal. Unión de ligando a receptor produce un cambio conformacional en el receptor que causa una interacción entre el dominio del efector y otra molécula(s) en la célula. Esta interacción sucesivamente conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Eventos metabólicos que se unen a interacciones receptor-ligando incluyen transcripción de gen, fosforilación, defosforilación, aumentos en la producción cíclica AMP, movilización de calcio celular, movilización de lípidos de membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. Un receptor ejemplar descrito aquí es el receptor CD94/NKG2A.

[0022] Por "heteromultimérico" o "multimérico" se entiende comprendiendo dos o más subunidades diferentes. Un receptor "heterodimerico" contiene dos subunidades diferentes, aquí denominadas "S1" (subunidad 1) y "S2" (subunidad 2).

[0023] Por receptor multimérico "soluble" se entiende aquí un receptor multimérico, cada uno de cuyas subunidades comprende parte o todo un dominio extracelular de un receptor, pero carece de partes o la totalidad de cualquier 4 5

dominio de transmembrana, y carece de la totalidad de cualquier dominio intracelular. En general, un receptor soluble de la invención es soluble en una solución acuosa. No obstante, bajo ciertas condiciones, el receptor puede estar en forma de un cuerpo de inclusión, que es fácilmente solubilizado por procedimientos estándar. Una "porción soluble de la subunidad 1" puede aquí ser denominada "sS1" mientras que "una porción soluble de la subunidad 2" puede ser denominada "sS2".

[0024] Una proteína "híbrida" es una proteína comprendiendo dos segmentos de polipéptido unidos vía al menos una conexión distinta de un enlace peptídico (p. ej., por acoplamiento químico o una interacción de afinidad tal como vía, por ejemplo, biotina/avidina).

[0025] Una proteína de "fusión" es una proteína comprendiendo dos segmentos de polipéptido unido por un enlace peptídico, producido, por ejemplo, por procesos recombinantes.

[0026] El término "NKG2" incluye polipéptidos en toda su longitud o parcialmente de cualquier y todos los elementos de la familia NKG2, incluyendo, pero no limitado a, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, y NKG2F, también un ortólogos humano y no humano de estos elementos y variantes de estos. Típicamente, la secuencia de aminoácidos de una variante de un polipéptido NKG2 es altamente idéntico o similar a la secuencia de aminoácidos del polipéptido NKG2 de tipo salvaje correspondiente (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico).

[0027] El término "NKG2A" incluye polipéptidos NKG2A en toda su longitud o parcialmente de ambos ortólogos humano y no humano, al igual que variantes de estos. Típicamente, la secuencia de aminoácidos de una variante de un polipéptido NKG2A es altamente idéntica o similar a la secuencia de aminoácido de un polipéptido NKG2A de tipo salvaje (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico).

[0028] El término "NKG2C" incluye polipéptidos NKG2A en toda su longitud o parcialmente de ambos ortólogos humano y no humano, al igual que variantes de estos. Típicamente, la secuencia de aminoácidos de una variante de un polipéptido NKG2A es altamente idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NKG2A de tipo salvaje (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico).

[0029] El término "CD94" incluye polipéptidos CD94 en toda su longitud o parcialmente de ambos ortólogos humano y no humano , al igual que variantes de estos. Típicamente, la secuencia de aminoácidos de una variante de un polipéptido CD94 es altamente idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido CD94 de tipo salvaje

(p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico).

[0030] El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteína obtenido de una especie que es el duplicado funcional de un polipéptido o proteína de una especia diferente. Diferencias de secuencia entre ortólogos son el resultado de especialización.

[0031] Un "dominio Fc" aquí generalmente se refiere a un polipéptido comprendiendo todo o parte del dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Este incluye, pero no está limitado a, polipéptidos comprendiendo los dominios enteros CH1, bisagra, CH2, y/o CH3 al igual que fragmentos de tales péptidos comprendiendo solo, por ejemplo, el dominio de bisagra, CH2, y CH3. El dominio Fc se puede derivar de una inmunoglobulina de cualquier especie y/o cualquier subtipo, incluyendo, pero no limitado a, un anticuerpo humano IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM. Secuencias Fc ejemplares se proveen aquí, por ejemplo, en las Figuras 5-7.

[0032] Como se utiliza en este caso, una "variante" de polipéptido de un progenitor o polipéptido de tipo salvaje contiene una o más sustituciones de aminoácido, deleciones y/o adiciones en comparación con el progenitor o tipo salvaje. Típicamente, tales variantes tienen una identidad de secuencia al progenitor o secuencia de tipo salvaje de al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, 98%, o al menos aproximadamente 99%, y han conservado o mejorado propiedades en comparación con el progenitor o polipéptido de tipo salvaje. Algunos cambios pueden no afectar significativamente al pliegue o actividad de la proteína o polipéptido; sustituciones de aminoácido conservadoras, como se conocen bien en la técnica, cambian un aminoácido a uno con una cadena lateral con propiedades fisicoquímicas similares (aminoácido básico: arginina, lisina e histidina; aminoácidos acídicos: ácido glutámico y ácido aspártico; aminoácidos polares: glutamina y asparagina; aminoácidos hidrofóbicos: leucina, isoleucina, valina; aminoácidos aromáticos: fenilalanina, triptófano, tirosina; aminoácidos pequeños: glicina, alanina, serina, treonina, metionina), deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino-o carboxi-terminales pequeñas, tales como un arnino-terminal residuo de metionina, un pequeño péptido de enlace de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita purificación (una marca de afinidad), tal como un tracto de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO 1985;14:1075 et seq.; Nilsson et al., Methods Enzymol. 1991; 198:3 et seq.), glutationa S-transferasa (Smith and Johnson, Gene 1988; 67:31 et seq.), u otro dominio antigénico:epítope o de unión. Ver, en general Ford et al.,

Protein Expression and Purification 1991;2:95-107. Indentificativos de afinidad de codificación ADN están disponibles de proveedores comerciales.

[0033] Diferencias de secuencia o "identidad", en el contexto de secuencias de aminoácidos, se pueden determinar por cualquier técnica adecuada, tal como (y como una selección adecuada en el contexto de esta invención) utilizando un análisis de alineamiento Needleman-Wunsch (ver Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453), tal como está provisto vía análisis con ALIGN 2.0 usando el matriz de marcado BLOSUM50 con una penalización de espacio inicial de -12 y una penalización de extensión de -2 (ver Myers and Miller, CABIOS (1989) 4:11-17 para discusión de las técnicas de alineamiento globales incorporadas en el ALIGN programa). Un copia del programa ALIGN 2.0 está disponible, por ejemplo, a través de San Diego Supercomputer (SDSC) Biology Workbench. Debido a que el alineamiento de Needleman-Wunsch proporciona una medición total o global de identidad entre dos secuencias, debe reconocerse que secuencias objetivo que pueden ser partes o subsecuencias de secuencias peptídicas más grandes se pueden utilizar en cierto modo análogo para completar secuencias o, alternativamente, valores de alineamiento locales pueden utilizarse para valorar relaciones entre subsecuencias, como determinado por, por ejemplo, un alineamiento de Smith-Waterman (J. Mol. Biol. (1981) 147:195-197), que se puede obtener a través de programas disponibles (otros métodos de alineamiento locales que se pueden adecuar para identidad de análisis incluyen programas que aplican algoritmos de alineamiento heurísticos locales tales como los programas FastA y BLAST). Además, métodos relacionados para evaluar identidad se describen en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 03/048185. El algoritmo de Gotoh, que busca perfeccionar el algoritmo de Needleman-Wunsch, alternativamente se puede usar para alineamientos de secuencia globales. Ver, por ejemplo, Gotoh, J. Mol. Biol. 162:705-708 (1982).

Descripción de la invención

[0034] La presente invención proporciona para complejos de receptores monocatenarios solubles a partir de receptores heterodiméricos, todos comprenden una parte soluble de cada una de las dos subunidades de un receptor heterodimérico, y, en algunos aspectos, al menos una porción Fc de una molécula de inmunoglobulina.

[0035] También se describen receptores donde cada parte soluble se asocia o se une de manera covalente a una porción Fc de una inmunoglobulina, y el complejo receptor soluble final se forma asociando o uniendo de manera covalente el híbrido o proteína de fusión comprendiendo la parte soluble de la primera subunidad (sS1-Fc) al híbrido o proteína de fusión comprendiendo la parte soluble de la segunda subunidad (sS2-Fc). Conexión de los distintos segmentos puede ser obtenida vía, por ejemplo, unión covalente tal como por reticulación química, enlaces peptídicos, puentes disulfuro, etc., o interacciones de afinidad tales como por avidina-biotina o tecnología de cremallera de leucina.

[0036] También se describen receptores donde la molécula Fc de cada proteína de fusión comprende mutaciones específicas diseñadas para producir heterodimerización forzada entre las proteínas de fusión diferentes, dando como resultado un complejo receptor soluble donde proteína de fusión sS1-Fc1 se funde con sS2-Fc2.Fc2.

[0037] El complejo receptor soluble de la presente invención es un complejo de proteína de fusión de receptor-Fc monocatenario soluble, comprendiendo la parte soluble de la primera subunidad (sS1) unida a la parte soluble de la segunda subunidad (sS2). En una forma de realización particular, el C-terminal de uno de sS1 y sS2 es posteriormente unido a una porción Fc. Conexión de los distintos segmentos se obtiene vía unión covalente tal como por enlaces peptídicos. La proteína receptora monocatenaria es una proteína de fusión, es decir, todos los enlaces entre segmentos diferentes en la proteína son vía enlaces peptídicos o vía unión péptido-péptido directa.

[0038] En todavía otro aspecto, dos unidades de la proteína de fusión Fc monocatenaria anteriormente descrita son juntadas o enlazadas, formando así esencialmente un homodímero de un receptor heterodimérico. En una forma de realización ejemplar, el receptor heterodimérico es un receptor CD94/NKG2, y las dos proteínas de fusión Fc monocatenarias están unidas vía un enlace bisulfuro entre residuos de cisteína de origen natural en los segmentos solubles de las subunidades NKG2 y CD94.

[0039] Los complejos de receptor solubles de receptores heterodiméricos según la invención pueden ser más estables y así se pueden almacenar más tiempo. Además, complejos de receptor estables solubles de receptores heterodiméricos se adecuan en aplicaciones donde una vida media más larga es requerida, por ejemplo, para inmunizaciones y aplicaciones terapéuticas.

[0040] Como se describe en los ejemplos, los N y C-terminales de NKG2A y CD94 fueron encontrados estar encerrados en un modelo CD94/NKG2A in silico. Esto confirmó la idoneidad de receptores solubles CD94/NKG2 heterodiméricos según la invención, ya que un C-terminal de una primera subunidad puede después unirse al N-terminal de la segunda subunidad por un enlazador de péptido corto, y debido a homología secuencial alta en las partes solubles de proteínas NKG2 (ver Fig. 25). Así, en formas de realización específicas y separadas, el receptor heterodimérico es uno donde el N-terminal de la primera subunidad está cerca del C-terminal de la segunda subunidad están cerca, o uno donde el N-terminal de la primera subunidad está cerca del C-terminal de la segunda subunidad y el C-terminal de la primera subunidad está cerca del N-terminal de la segunda subunidad. Por ejemplo, en una forma de realización, "cerca" como se utiliza en este caso significa que la distancia entre los alfa-carbonos respectivos está dentro de aproximadamente 4 a aproximadamente 40, aproximadamente 4 a aproximadamente 30, aproximadamente 4 a aproximadamente 20, o 6

aproximadamente 4 a aproximadamente 15, Ångstrom uno del otro. En otra forma de realización, "cerca" significa dentro de aproximadamente 13 a aproximadamente 15 Angstrom el uno del otro.

[0041] Las siguientes construcciones CD94/NKG2 solubles son descritas:

5 1) CD94-Fc/NKG2-Fc: una proteína de fusión Fc estable o proteína híbrida conjugada comprendiendo dominios extracelulares de CD94 y una proteína NKG2 que es ambos conjugada o fundida con murina Fc. La proteína se puede producir y segregar de células mamíferas y purificar por una cromatografía de afinidad monopaso. Este complejo receptor soluble se puede ilustrar en la Figura 1, donde el puente disulfuro ilustrado es uno que ocurre naturalmente en el receptor CD94/NKG2A.

10 2) CD94-Fc1 /NKG2-Fc2: una proteína de fusión Fc estable o proteína conjugada comprendiendo dominios extracelulares de CD94 y una proteína NKG2, cada una de los cuales se funde a un dominio Fc de murina mutada diferentemente. Las mutaciones en el dominio Fc fundido o conjugado al segmento soluble CD94 promueve dimerización con el dominio Fc mutado fundido o conjugado al segmento soluble NKG2, y viceversa, evitando así homodimerización CD94-o NKG2. La proteína se puede producir y segregar de células mamíferas

15 y purificar por una cromatografía de afinidad monopaso. Este complejo receptor soluble se puede ilustrar en la Figura 2, donde el puente disulfuro ilustrado es uno que ocurre naturalmente en el receptor CD94/NKG2A. 3) Monocatenario CD94/NKG2-Fc: Una proteína de fusión Fc estable monocatenaria comprendiendo dominios extracelulares de CD94 y una proteína NKG2 que son, por ejemplo, unidas por un separador de serina-glicina, y/o fundidas o conjugados a una secuencia Fc. La proteína se puede producir y segregar a partir de células

20 mamíferas y purificar por una cromatografía de afinidad monopaso. En una forma de realización ejemplar, una proteína de fusión Fc receptora soluble se puede ilustrar en la Figura 3, donde unión entre los distintos segmentos en la proteína de fusión se obtiene vía enlaces de glicina-serina.

[0042] Como se describe en los ejemplos 18 y 19, receptores solubles CD94/NKG2A unidos a HLA-E soluble, al igual

25 que Mab's específico para CD94 (HP-3D9) y NKG2A (Z199), indicando que ellos fueron debidamente plegados. Los receptores solubles CD94/NKG2A evaluados parecieron estables, ya que ellos, con pocas excepciones, fueron capaces de unir tetrámeros solubles HLA-E, HP3D9 (Anti-CD94) y anti-NKG2A (Z199) después de almacenamiento a 4°C o 20°C en PBS durante, en algunos casos, diferentes semanas. Además, como se describe en los ejemplos 20 y 21, unos receptores solubles CD94/NKG2C fueron preparados y fueron encontrados capaces de unirse a un anticuerpo anti

30 NKG2C-específico.

[0043] Las construcciones receptoras monocatenarias de la invención comprenden partes solubles de cada subunidad monomérica y al menos un polipéptido comprendiendo todo o parte de un dominio de constante de cadena pesada de inmunoglobulina (es decir, un dominio Fc).

35 [0044] Receptores heterodiméricos típicos sobre los que los presentes principios puede ser aplicados incluyen, pero de forma no limitativa, el receptor cD94/NKG2A, CD94/NKG2B, CD94/NKG2C, CD94/NKG2E y CD94/NKG2F. La familia NKG2 de receptores tienen una alta homología secuencial, como se muestra en la Figura 25. Partes adecuadas solubles de las subunidades monoméricas de estos receptores para uso en las construcciones de la presente invención

40 se pueden conocer de la literatura científica, o deducir usando análisis informatizado estándar de algoritmos basados en ordenador públicamente disponibles de secuencia de aminoácidos tal como TMHMM (disponible en la dirección de la world-wide web (www) cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).

[0045] CD94 (Uniprot accesión nº Q13241) comprende 179 aminoácidos en 3 dominios, una región citoplasmática

45 comprendiendo residuos 1-10, una región de transmembrana comprendiendo residuos 11-31 y una región extracelular comprendiendo residuos 32-179, de la siguiente secuencia:

50 [0046] Un receptor ejemplar heterodimérico es el receptor CD94/NKG2A. NKG2A (Uniprot accesión nº P26715) comprende 233 aminoácidos en 3 dominios, con un dominio citoplasmático comprendiendo residuos 1-70, una región de transmembrana comprendiendo residuos 71-93 y una región extracelular comprendiendo residuos 94-233, de la siguiente secuencia:

[0047] Otro receptor ejemplar heterodimérico es el receptor CD94/NKG2C. La secuencia NKG2C (SEC ID nº: 3) comprende 231 aminoácidos en disposición similar como se describe para NKG2A. La Figura 25 muestra un alineamiento entre las partes extracelulares de hNKG2A y hNKG2C.

[0048] Como se ha descrito anteriormente, otros receptores NKG2 pueden también ser aplicados para construir receptores monocatenarios según la invención. En tales construcciones, una unidad de monómero comprende un segmento soluble de una secuencia CD94, y un segmento soluble de una secuencia NKG2 de, por ejemplo, NKG2B (SEC ID nº: 70), NKG2E (SEC ID nº: 4), o NKG2F (SEC ID nº: 5) humano.

[0049] Diferentes ortólogos no humanos a CD94 y NKG2A se conoce que también pueden ser usados en la preparación de receptores solubles CD94/NKG2A. Ortólogos no limitativos de humano NKG2A incluyen aquellos teniendo Uniprot números de accesión Q95M15 (UNIPROT-ID:NKG2A_PANTR (Chimpancé)); Q9MZJ3 (UNIPROT-ID:NKG2A_MACMU (Rhesus macaco)); Q68VD2 (UNIPROT-ID:Q68VD2_MACFA (mono Cynomolgus)); 054872 (UNIPROT-ID:054872 RAT (Rata)); y Q9WU31 (UNIPROT-ID:Q9WU31_MOUSE (Ratón)). Ortólogos no limitativos de CD94 humano incluyen aquellos teniendo Uniprot números de accesión Q9MZ41 (UNIPROT-ID:KLRD1_PANTR (Chimpancé)); Q8MHY9 (UNIPROT-ID: KLRD1_PONPY (Orangután)); Q9MZK9 (UNIPROT-ID:KLRD1_MACMU (Rhesus macaco)); Q68VD4 (UNIPROT-ID: Q68VD4_MACFA (mono Cynomolgus)); 035778 (UNIPROT-ID:035778_RAT(Rata)); 054708 (UNIPROTID: 054708_MOUSE(Ratón)); y Q38HS3 (UNIPROT-ID:Q38HS3_CANFA (Perro)). Estas secuencias están disponibles públicamente en el sitio web de Uniprot (de la dirección de la World-Wide Web ebi.uniprot.org/index.shtml).

[0050] El polipéptido de inmunoglobulina de las construcciones de la invención puede comprender en toda su longitud o fragmento de una porción Fc de inmunoglobulina, o un variante de esta. En un aspecto, la inmunoglobulina es una secuencia de tipo salvaje de un dominio Fc, o un fragmento de este. También se describe una variante diseñada para promover heterodimerización de las dos proteínas de fusión diferentes, dando como resultado un complejo receptor soluble donde proteína de fusión sS1-Fc1 se funde con sS2-Fc2. En otro aspecto, la variante se diseña para promover heterodimerización de dos receptores diferentes monocatenarios como se describe en este caso.

[0051] En aspectos particulares, el dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina deriva de anticuerpos de mamífero humanos o no humanos. En una forma de realización, el dominio constante deriva de un IgG1 humano. En otra forma de realización, el dominio constante deriva de un IgG4 humano. En otros aspectos, el dominio constante deriva de un no-humano (p. ej., una primate o roedor) IgG molécula (o tipo de anticuerpos que es reconocido como siendo sustancialmente similar al IgG humano en cuanto a composición). La frase "derivado de", en este contexto se refiere a un polipéptido idéntico (100%) o altamente similar en términos de composición de secuencia de aminoácidos

(p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico) a un dominio de tipo salvaje o referencia ("progenitor") constante de inmunoglobulina, otro cualquiera de los cambios indicados (p. ej., las sustituciones descritas debajo). La frase "derivado de" no está, en este sentido, destinada a indicar el método por el que tal anticuerpo o fragmento de anticuerpos es generado, que puede ser por cualquier método adecuado, tal como expresión recombinante, síntesis de proteína química, etc.

[0052] En una forma de realización, la parte del dominio Fc es de tamaño suficiente y composición que esto aumenta la vida media in vivo de la construcción (p. ej., debido a espacio más lento de la circulación) en comparación con una construcción que carece del dominio Fc; en todavía otro aspecto particular, la parte del dominio Fc es funcional (es decir, imparte función efectora de anticuerpos al anticuerpo de la construcción).

[0053] Dominios constantes de inmunoglobulina de tipo salvaje ejemplares para uso en los presentes constructos incluyen SEC ID nº: 25, representando una murina Fc (mFc) secuencia (clon #669: IMAGE3491766); residuos Val98 a Lys324 de SEC ID NO:21, representando una secuencia IgG1 de murina; residuos Pro100 a Lys330 de SEC ID nº: 20, representando una secuencia IgG1 Fc humana y residuos Glu99 a Lis327 de SEC ID nº: 24, representando una secuencia IgG4 Fc humana. Polipéptidos de inmunoglobulina correspondientes de otras secuencias de tipo salvaje (p. ej., SEC ID nº: 12-19 y 21-23) pueden hacerse usando métodos establecidos en la técnica.

[0054] En un aspecto, la invención proporciona versiones mutadas de tales dominios constantes de inmunoglobulina de tipo salvaje. Ahora se ha descubierto que pares de aminoácidos en los dominios constantes de monómeros de anticuerpos están implicados significativamente en la multimerización y estabilidad de tales monómeros de anticuerpos (y en conjunto de moléculas de anticuerpos en el caso de moléculas de anticuerpos tales como moléculas IgG) y pueden, por consiguiente, ser modificados por varios métodos, para promover mejor la formación de monómeros de

anticuerpos o moléculas biespecífica. Típicamente, tales pares de aminoácidos se encuentran principalmente en las cadenas pesadas de moléculas de anticuerpos (p. ej., entre determinados residuos de aminoácidos presentes en las regiones CH1 y CH3 constantes de una molécula IgG).

[0055] Por ejemplo, para anticuerpos de inmunoglobulina G humanos, se ha descubierto que fuerzas iónicas, que contribuyen a reticulación de los dos polipéptidos ("HC") de cadena pesada de la molécula de anticuerpo tetramérica, son aportados principalmente por seis aminoácidos presentes en la región CH3 del anticuerpo de la siguiente manera: E240-K253; D282-K292 y K322-D239 (números de posición de secuencia se refieren al inicio del aminoácido desde el principio de CH1 (similar a UNIPROT entrada IGHG1 HUMAN (SEC ID NO:20)).

[0056] Aplicación de este descubrimiento a la actual invención, por substitución de aminoácidos HC de un péptido de inmunoglobulina, conjugado, fundido, o unido a un segmento soluble de una primera subunidad de un antígeno receptor heterodimérico de la siguiente manera. K253E D282K, y K322D, es posible significativamente reducir la homodimerización o "auto-apareamiento" del polipéptido final (que ocurre normalmente en la molécula de anticuerpo tetramérica de tipo salvaje original). De forma similar, modificando la secuencia HC de un segundo polipéptido de inmunoglobulina, conjugado, unido, o fundido a un segmento soluble de una segunda subunidad de un receptor heterodimérico por las sustituciones D239K, E240K y K292D homodimerización de tales polipéptidos es también reducida o anulada.

[0057] Coexpresión de los dos polipéptidos, cada uno con segmento soluble de una subunidad receptora heterodimérica diferente, puede "restaurar" interacciones iónicas estabilizantes (p. ej., E240-K253; D282-K292, y K322-D239) y acoplar los polipéptidos, dando como resultado generación de un receptor heterodimérico soluble. La tabla 1 resume (en forma ejemplar) estas distintas sustituciones. Sitios de mutación correspondientes en otros dominios constantes ejemplares se pueden derivar por alineamiento (véase el ejemplo en la figura 7) con IgG1 humano (SEC ID nº: 20). Por ejemplo, como se muestra en la tabla 1, en números sobre residuo 103, el residuo IgG4 correspondiente a un residuo IgG1 se puede obtener substrayendo 3.

[0058] El dominio Fc de las construcciones de la invención pueden comprender uno, dos o todas las pares de mutación en la tabla 1. Así, en una forma de realización no limitativa, una construcción heterodimérica de la invención comprende un primer dominio Fc variante comprendiendo una lisina (K) en un residuo correspondiente a residuo 239 en la SEC ID nº: 20 y un ácido aspártico (D) en un residuo correspondiente a residuo 292 en la SEC ID nº: 20, y un segundo dominio Fc variante comprendiendo una lisina en un residuo correspondiente a residuo 282 en la SEC ID nº: 20 y un ácido aspártico (D) en un residuo correspondiente a residuo 322 en la SEC ID nº: 20. Este tipo de construcción se puede referir como construcción de "doble mutación" aquí. En otra forma de realización no limitativa, una construcción heterodimérica de la invención comprende un primer dominio Fc variante comprendiendo lisina (K) en residuos correspondientes a residuos 239 y 240 en la SEC ID nº: 20 y un ácido aspártico (D) en un residuo correspondiente a residuo 292 en la SEC ID nº: 20, y un segundo dominio Fc variante comprendiendo a un ácido glutámico (E) en un residuo correspondiente a residuo 253 en la SEC ID NO:20, una lisina en un residuo correspondiente a residuo 282 en la SEC ID nº: 20 y un ácido aspártico (D) en un residuo correspondiente a residuo 322 en la SEC ID nº: 20. Adicionalmente o alternativamente, uno o más pares de mutación se pueden combinar con otros pares de mutación. Una alternativa ejemplar o par de mutación adicional es, T243Y, Y284T, en referencia a posiciones de residuo en SEC ID nº: 21 (IGHG1_MOUSE).

Tabla 1

Sustitución de aminoácido ejemplar en dominios constantes de IgG1 o IgG4 humano, en referencia a SEC ID nº: 20 (UniProt IGHG1_HUMAN) o SEC ID nº: 24 (UniProt IGHG4_HUMAN), respectivamente.

Anticuerpo 1

Anticuerpo 2

Mutaciones CH3

IgG1: K253E D282K K322D

IgG4: K250E D279K K319D IgG1: E240K K292D D239K lgG4: E236K E237K R289D

Mutaciones CH1

K96E

[0059] Como se describe en este documeneto, varios dominios Fc de tipo salvaje o de variante de murina también se pueden usar en las construcciones heterodiméricas según la invención. La Figura 8 describe alguno de los dominios de tipo salvaje de murina o variante Fc usados en preparación de construcciones en los ejemplos.

[0060] También se describen receptores donde segmentos diferentes de un polipéptido se unen usando una variedad de métodos convencionales: una parte soluble de una subunidad de un receptor heterodimérico se une a un polipéptido de inmunoglobulina (p. ej., sS1-enlazador-Fc o sS2-enlazador-Fc), o una parte soluble de una primera subunidad a una parte soluble de una segunda subunidad (p. ej., sS1-enlazador-sS2-Fc, sS2-enlazador-sS1-Fc, sS1-enlazador1-sS2enlazador2-Fc, sS2-enlazador1-sS1-enlazador2-Fc). Segmentos diferentes pueden unirse por, por ejemplo, (1) reticulación química; (2) asociación de afinidad por adición de una fracción, tal como un péptido, a segmentos receptores solubles y/o segmentos de polipéptido de inmunoglobulina, y luego juntando los segmentos vía la fracción anexa o fracciones para formar una proteína híbrida; y (3) conectando segmentos receptores solubles y/o segmentos de polipéptido de inmunoglobulina para formar una única cadena de polipéptido vía un enlazador de polipéptido, es decir, una proteína de fusión.

[0061] En la primera categoría de conexión, cualquier variedad de método convencional puede utilizarse para aparear químicamente (reticulación) dos cadenas de polipéptido. Enlace covalente puede ser conseguida bien por condensación directa de cadenas laterales existentes (p. ej., la formación de enlace bisulfuro entre residuos de cisteína, tal como puede ocurrir naturalmente entre las partes soluble de las subunidades NKG2 y CD94 en determinados receptores CD94/NKG2) o por la incorporación de moléculas de conexión externas. Muchos agentes polivalentes o bivalentes son útiles en los polipéptidos de acoplamiento.

[0062] En general, los agentes de reticulación usados son agentes bifuncionales reactivos, por ejemplo, con grupo de epsilon-amino o grupos tiol. Estos reticuladores se pueden clasificar en dos categorías: reactivos homo-y heterobifuncionales. Reactivos homobifuncionales pueden reaccionar, por ejemplo, con tioles libres (e. g., generados sobre reducción de enlaces de disulfuro), e incluyen, por ejemplo, 5,5'-ditiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DNTB), y ofenilenedimaleimida (O-PDM), que pueden formar un enlace de tioéter entre dos polipéptidos con tales tioles libres. Reactivos heterobifuncionales pueden introducir un grupo reactivo sobre un polipéptido que permite a este reaccionar con un segundo polipéptido. Por ejemplo, N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) puede reaccionar con un grupo amino primario para introducir un grupo tiol libre. Otros agentes de reticulación químicos incluyen, por ejemplo, carbodiimidas, diisocianatos, diazobencenos, hexametileno diaminas, dimaleimida, glutaraldehído, 4succinimidiloxicarbonil-α-metil a(2-piridiltio) tolueno (SMPT) y n-succinimidilo-S-acetil-tioacetato (SATA). Procedimientos para polipéptidos de reticulación con tales agentes son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Pierce ImmunoTechnology Catalog & Handbook (1991) E8-E39; Karpovsky et al., J. Exp. Med. 1984;160:1686 et seq.; Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1985;82:8648 et seq.; and U.S. Pat. 4,676,980.

[0063] Brazos separadores entre los dos grupos reactivos de reticuladores pueden tener varias longitudes y compuestos químicos. Un brazo separador más largo permite una mejor flexibilidad de los polipéptidos conjugados mientras algunos componentes particulares en el puente (p. ej., un grupo benceno) puede prestar estabilidad extra a los grupos reactivos

o una resistencia aumentada de la conexión química para la acción de varios aspectos (p. ej., resistencia de enlace bisulfuro para reactivos reductores). El uso de espaciadores peptídicos tal como los enlaces peptídicos o péptidos enlazadores descritos abajo es también contemplado.

[0064] En la segunda categoría de métodos de conexión, métodos convencionales pueden utilizarse para atar cualquiera de una variedad de fracciones (por ejemplo, péptidos) a partes receptoras solubles y/o polipéptidos de inmunoglobulina, generando así proteínas híbridas o de fusión que luego pueden ser asociadas vía las fracciones anexas.

[0065] También se describen receptores donde fracciones tales como biotina y avidina (estreptavidina) son unidas o complejas a partes receptoras solubles y/o polipéptidos de inmunoglobulina, y estas fracciones interactúan para asociar las dos subunidades.

[0066] También se describen receptores donde las fracciones anexas son ambos péptidos, que pueden denominarse aquí "péptidos de promoción de dimerización" entre la amplia variedad de tales enlaces peptídicos que pueden ser usados están la proteína de fusión GST (glutationa S-transferasa), o un motivo de dimerización de este; un dominio PDZ de dimerización; par de bases FK-506 (proteína de enlace) o un motivo de dimerización de este; un dominio de dimerización de hélice-giro-hélice artificial o natural de p53 y proteína A o su dominio de dimerización, dominio B. En una forma de realización, los péptidos anexos son componentes de una cremallera de leucina. Las fracciones de cremallera de leucina son frecuentemente tomadas de los factores de transcripción humanos c-jun y c-fos.

[0067] El péptido de promoción de dimerización debería proporcionar un grado adecuado de flexibilidad para prevenir que las dos subunidades interfieran con cada actividad de la otra, por ejemplo, por impedimento estérico, y para permitir plegamiento de proteínas apropiado. Por lo tanto, puede ser deseable para modificar un péptido de promoción de dimerización alterando su longitud, composición de aminoácido, y/o conformación, por ejemplo, por adición a esta todavía otras "fracciones de bisagra" o "fracciones enlazadoras secundarias" entre los muchos tipos de fracciones enlazadoras secundarias están, por ejemplo, tractos de pequeños, preferiblemente neutro y no polar o bien polares, aminoácidos tales como, por ejemplo, glicina, serina, treonina o alanina, a varias longitudes y combinaciones; polilisina,

o similar. Alternativamente, múltiples enlazadores y/o fracciones enlazadoras secundarias pueden ser usados. Es a veces deseable usar una región de bisagra flexible, tal como, por ejemplo, la región de bisagra de humano IgG, o poliglicina repite interrumpida por serina o treonina a intervalos determinados.

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[0068] La longitud y composición de un péptido de promoción de dimerización pueden ser fácilmente seleccionado por uno de habilidad en la técnica para optimizar las propiedades deseadas del receptor soluble, por ejemplo, su capacidad para unirse a su ligando. Un ensayo convencional para unión a anticuerpos se describe en los ejemplos.

[0069] Los péptidos pueden ser añadidos a partes receptoras solubles y polipéptidos de inmunoglobulina por una variedad de métodos que serán evidentes a uno experimentado en la materia, por ejemplo, acoplamiento químico como descrito arriba (si necesario, seguido de derivatización de grupos de aminoácidos apropiados); fijación vía interacciones de biotina/avidina; unión covalente de los polipéptidos por métodos reconocidos en la técnica (p. ej., usando enzimas apropiadas); métodos recombinantes; o combinaciones de estos.

[0070] En la tercera categoría de conexión, partes receptoras solubles y/o polipéptidos de inmunoglobulina se unen de manera covalente vía un enlazador peptídico. En esta categoría, técnicas recombinantes se utilizan para unir partes solubles de cada uno de dos segmentos, en marco, para formar una única molécula de polipéptido de cadena. Preferiblemente, las partes receptoras se separan la una de la otra por un péptido de enlace, de cualquier longitud o composición de aminoácido, de forma más preferida una estructura de bucle flexible, que permite a las dos fracciones receptoras estar a una distancia apropiada la una a la otra y en un alineamiento apropiado para interacción óptima. Péptidos enlazadores típicos contienen tractos de aminoácidos pequeños, preferiblemente neutros y no polares o bien polares tales como, por ejemplo, glicina, serina, treonina o alanina, a varias longitudes y combinaciones; polilisina; o similares. El enlazador peptídico puede tener al menos un aminoácido y puede tener 500 o más aminoácidos. Preferiblemente, el enlazador es inferior a aproximadamente 100 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente de 2 a 30, de forma más preferida aproximadamente de 3-10 aminoácidos. Dominios enlazadores flexibles, tales como la región de bisagra de IgG humano, o poliglicina se repite interrumpida por serina o treonina a intervalos determinados, pueden ser usados solo o en combinación con otras fracciones. Enlaces ejemplares son aquellos basados en combinaciones de glicina (G), serina (S) y/o arginina (R), incluyendo, pero no limitado a, GS, GSS, GGSGGS (SEC ID nº: 6) y GGSGGSRSS (SEC ID nº: 7). En una forma de realización, el enlazador que conecta las primeras y segundas subunidades en un receptor monocatenario heterodimérico es GGSGGS (SEC ID nº: 6). En otra forma de realización, el enlazador que conecta las primeras y segundas subunidades en un receptor monocatenario heterodimérico es GGSGGSRSS (SEC ID nº: 7).

[0071] Métodos recombinantes que se pueden usar para generar tales receptores heterodiméricos de cadena lineal única son convencionales. Además, procedimientos de rutina pueden utilizarse para seleccionar péptidos enlazadores y para optimizar parámetros de modo que las dos partes receptoras solubles se alinean a una distancia y en una orientación que permiten función óptima del receptor soluble heterodimérico. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 4,935,233 y 4,751,180.

[0072] Por supuesto, dos subunidades pueden ser asociadas vía cualquier combinación de las fracciones anteriores, por ejemplo, una disposición en serie en cualquier orden relativo u orientación.

[0073] Así, en un aspecto, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido receptor monocatenario soluble heterodimérico; ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido comprendiendo una parte soluble de al menos una subunidad receptora monomérica, y al menos un ácido nucleico que codifica un péptido de inmunoglobulina se describen también. Por ejemplo, un ácido nucleico codifica una subunidad NKG2 (p. ej., un NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, o subunidad NKG2F) y un polipéptido de inmunoglobulina, un ácido nucleico codifica una subunidad CD94 y un polipéptido de inmunoglobulina, y el receptor heterodimérico codificado se une a un anticuerpo contra el receptor correspondiente CD94/NKG2 o un ligando natural del receptor CD94/NKG2. Por ejemplo, un ácido nucleico puede codificar una subunidad NKG2A y un péptido de inmunoglobulina, un ácido nucleico puede codificar un polipéptido CD94 y un péptido de inmunoglobulina, y el receptor heterodimérico codificado pueden unirse con un ligando CD94/NKG2A tal como HLA-E o un anticuerpo contra un receptor CD94/NKG2A, por ejemplo, receptor humano CD94/NKG2A. En otra forma de realización, un único ácido nucleico aislado codifica un receptor monocatenario heterodimérico comprendiendo ambos una subunidad NKG2, una subunidad CD94 y una subunidad de inmunoglobulina, donde el receptor heterodimérico codificado se une a un ligando CD94/NKG2 tal como HLA-E o un anticuerpo contra un receptor CD94/NKG2. Por ejemplo, un único ácido nucleico aislado puede codificar un receptor heterodimérico monocatenario comprendiendo ambos una subunidad NKG2A (o NKG2C), una subunidad CD94, y una subunidad de inmunoglobulina, donde el receptor heterodimérico codificado se enlaza a HLA-E o un anticuerpo contra el receptor CD94/NKG2A (o CD94/NKG2C).

[0074] De los ácidos nucleicos descritos anteriormente, un ácido nucleico puede codificar una parte soluble del receptor NKG2A expuesto en la SEC ID nº: 1, o una variante u ortólogo de este. En una forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad NKG2A comprendiendo los residuos 116-233 de la SEC ID nº: 1. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad NKG2A comprendiendo los residuos 99-233 de la SEC ID nº: 1. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica un fragmento de la subunidad NKG2A que empieza con un residuo seleccionado de los residuos 99-116 y extremos en el residuo 116 de la SEC ID nº: 1. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad NKG2A que consiste en residuos 116-233 de la SEC ID nº: 1. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad NKG2A que consiste en residuos 99-233 de la SEC ID nº: 1.

[0075] En una forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad NKG2C comprendiendo los residuos 114-231 de la SEC ID nº: 3. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad NKG2C comprendiendo los residuos 97-231, por ejemplo, 96-231, de la SEC ID nº: 3. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica un fragmento de la subunidad NKG2C que empieza con un residuo seleccionado de los residuos 96-114 y extremos en el residuo 114 de la SEC ID nº: 3. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad NKG2A que consiste en residuos 114-231 de la SEC ID nº: 3. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad NKG2A que consiste en los residuos 96-231 de la SEC ID nº: 3. Un ácido nucleico puede también o alternativamente codificar una parte soluble del receptor CD94 expuesto en la SEC ID nº: 2. En una forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad CD94 comprendiendo los residuos 58-179 de la SEC ID nº: 2. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad CD94 comprendiendo los residuos 35-179 de la SEC ID nº: 2. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica un fragmento de la subunidad CD94 que empieza con un residuo seleccionado de los residuos 35-58 y extremos en el residuo 179 de la SEC ID nº: 2. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad CD94 que consiste en los residuos 58-179 de la SEC ID nº: 2. En otra forma de realización, el ácido nucleico codifica una parte soluble de la subunidad CD94 que consiste en residuos 35-179 de la SEC ID nº: 2.

[0076] Los ácidos nucleicos de la invención pueden también codificar características adicionales de la construcción de receptores heterodimérica, tales como enlaces peptídicos, dominios de multimerización, indentificativos de afinidad, etc. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden además codificar uno o más enlaces peptídicos que conectan una parte soluble de una subunidad de un receptor heterodimérico a un polipéptido de inmunoglobulina (p. ej., sS1-enlazador-Fc o sS2-enlazador-Fc), o una parte soluble de una primera subunidad a una parte soluble de una segunda subunidad (p. ej., sS1-enlazador-sS2-Fc, sS2-enlazador-sS1-Fc, sS1-enlazador1-sS2-enlazador2-Fc, sS2-enlazador1-sS1-enlazador2Fc). Enlaces ejemplares son aquellos basados en combinaciones de glicina (G), serina (S), y/o arginina (R), incluyendo, pero no limitado a, GS, GSS, GGSGGS (SEC ID nº: 6) y GGSGGSRSS (SEC ID nº: 7). En una forma de realización, el enlazador que conecta las primeras y segundas subunidades en un receptor heterodimérico monocatenario es GGSGGS (SEC ID nº: 6). En otra forma de realización, el enlazador que conecta las primeras y segundas subunidades en un receptor heterodimérico monocatenario es GGSGGSRSS (SEC ID nº: 7).

[0077] En otra forma de realización, los ácidos nucleicos de los vectores de expresión codifican una o más secuencias de señal secretoras, en una forma de realización, la secuencia señal es MPLLLLLPLLWAGALAMD (SEC ID nº: 30).

[0078] Los ácidos nucleicos pueden también codificar uno o más sitios de escisión, particularmente entre segmentos diferentes en una proteína de fusión. Ver, por ejemplo, Tuan et al., Connective Tissue Research 1996;34:1-9.

[0079] En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos catalogada en la tabla 2 con o sin secuencias de señal (Sig), al igual que vectores de expresión y células huésped comprendiendo tales ácidos nucleicos. En otro aspecto, la invención proporciona variantes de las secuencias de aminoácidos en la tabla 2. En una forma de realización preferida, la variante codificada se une un ligando natural del receptor humano CD94/NKG2A, o un anticuerpo dirigido contra el receptor humano CD94/NKG2A. En otra forma de realización preferida, la variante codificada se une un ligando natural del receptor humano CD94/NKG2C, o un anticuerpo dirigido contra el receptor humano CD94/NKG2C

Tabla 2 5

Secuencias de aminoácidos de construcciones de receptores ejemplares solubles CD94/NKG2A (Sig = secuencia señal; mFc = porción Fc de murina; GS, GSS etc. = enlaces basados en glicina (G), serina (S), y arginina (R)). La nomenclatura de dominio Fc se refiere a la designación en la figura 8.

Designación/Descripción

SEQ ID nº:

CD94-mFc/NKG2A heterodímero (Sig)-(mFc)-GSS(CD94) /(Sig)-(mFc)-GS-(NKG2A)

31/32

CD94-mFc/NKG2A heterodímero con mutación única (Sig)-(mFc-sm-CD94)-GSS-(CD94)l(Sig)-(mFc-smNKG2A)-GS-(NKG2A)

33/34

CD94-mFc/NKG2A heterodímero con doble mutación (Sig)-(mFc-dm-CD94)-GSS-(CD94)/(Sig)-(mFc-dmNKG2A)-GS-(NKG2A)

35/36

NKG2A-CD94 monocatenario hexaHis-GST NKG2A2xGGS-CD94

37

NKG2A-CD94 monocatenario Trx-hexaHis-NKG2A2xGGS-CD94

38

CD94-NKG2A-mFc monocatenario (Sig)-(mFc)-GS(NKG2A)-GGS-GGS-RSS-(CD94)

39

CD94-NKG2C-mFc monocatenario (Sig)-(mFc)-GS(NKG2A)-GGS-GGS-RSS-(CD94)

59

[0080] En otro aspecto, se describe lo siguiente: un primer vector de expresión comprendiendo los elementos siguientes operativamente unidos: (a) un promotor de transcripción; un primer ácido nucleico que codifica una primera subunidad de una parte soluble de un receptor heterodimérico fundido a un polipéptido de inmunoglobulina; y un terminador de transcripción; y un segundo vector de expresión comprendiendo los elementos siguientes operativamente unidos: (b) un segundo promotor de transcripción; un segundo ácido nucleico que codifica una segunda subunidad de una parte soluble de un receptor heterodimérico fundido a un polipéptido de inmunoglobulina; y un terminador de transcripción. En otro aspecto, los primeros y segundos ácidos nucleicos están contenidos dentro de un único vector de expresión, opcionalmente dentro del marco de lectura. En otro aspecto, el vector de expresión comprende los siguientes elementos operativamente unidos: (a) un promotor de transcripción; un primer ácido nucleico que codifica un receptor heterodimérico monocatenario soluble; y un terminador de transcripción. En una forma de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el vector de expresión además codifica secuencias enlazadoras, identificativos de afinidad, o secuencia señal secretora operativamente unida a o comprendida en el ácido nucleico. En otra forma de realización de los aspectos precedentes, el receptor heterodimérico es un receptor CD94/NKG2 humano. En otra forma de realización de los aspectos precedentes, el receptor heterodimérico es el receptor humano CD94/NKG2A. En otra forma de realización de los aspectos precedentes, el receptor heterodimérico es el receptor humano CD94/NKG2C.

[0081] También se describe aquí una célula cultivada comprendiendo al menos uno de los vectores de expresión anteriormente descritos, donde la célula expresa los polipéptidos codificados por el vector de expresión. Una única célula puede contener, por ejemplo, un vector de expresión que codifica una única subunidad de un receptor heterodimérico soluble fundido a un polipéptido de inmunoglobulina (codificando, por ejemplo, sS1-Fc o sS2-Fc), un vector de expresión que codifica ambos primeras y segundas subunidades de un heterodimérico receptor soluble, cada una fundido a un polipéptido de inmunoglobulina (codificando, por ejemplo, sS1-Fc y sS2-Fc), o un vector de expresión que codifica un receptor heterodimérico monocatenario comprendiendo primeras y segundas subunidades de un receptor heterodimérico y un polipéptido de inmunoglobulina (p. ej., sS1-sS2-Fc o sS2-sS1-Fc).

[0082] También se describe aquí un método para producir receptores heterodiméricos solubles por transfección de células huésped con tales vectores de expresión, y expresión de uno o más ácidos nucleicos en una célula o cultivo celular. La célula cultivada comprende un vector de expresión como se describe arriba, donde los primeros y segundos ácidos nucleicos se localizan en el mismo vector de expresión, y la célula expresa los polipéptidos codificados por el vector de expresión. En otro aspecto, la célula cultivada comprende vectores de expresión donde los primeros y segundos ácidos nucleicos se localizan en vectores de expresión independientes y se co-transfectan en la célula, y célula expresa los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En otro aspecto, una primera célula huésped se transfecta con un vector de expresión que codifica un primer ácido nucleico por encima, y una segunda célula huésped (del mismo tipo o diferente) se transfecta con un ácido nucleico que codifica un segundo ácido nucleico por encima, y las primeras y segundas células huésped separadamente expresan los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En una forma de realización de la invención, la célula cultivada comprende un vector de expresión como se describe arriba, donde la célula expresa un polipéptido receptor monocatenario multimérico o heterodimérico soluble codificado por el ácido nucleico. En otro aspecto, la célula cultivada segrega una proteína de fusión monomérica de una parte soluble de una subunidad receptora heterodimérica y un péptido de inmunoglobulina, en otro aspecto, la célula cultivada segreta un complejo heterodimérico o multimérico de polipéptido receptor soluble. En otro aspecto, la célula cultivada segrega un receptor soluble CD94/NKG2 que une un ligando CD94/NKG2 o un anticuerpo contra el receptor monocatenario CD94/NKG2. En otro aspecto, la célula cultivada segreta un receptor soluble CD94/NKG2A que une un ligando CD94/NKG2A o un anticuerpo contra CD94/NKG2A. En otra forma de realización, la célula cultivada segrega un receptor soluble CD94/NKG2C que une un ligando CD94/NKG2C o un anticuerpo contra CD94/NKG2C.

[0083] Aquí se describe un método para producir un polipéptido receptor heterodimérico soluble que forma un complejo multimérico o heterodimérico comprendiendo: cultivo de una célula como se describe arriba y aislamiento los polipéptidos receptores solubles producidos por la célula. En otro aspecto, un método para producir un receptor heterodimérico soluble comprendiendo: co-cultivo de una primera célula que expresa una parte soluble de una primera subunidad de un receptor heterodimérico unido a un primer polipéptido de inmunoglobulina y una segunda célula que expresa una parte soluble de una segunda subunidad de un receptor heterodimérico unido a un segundo polipéptido de inmunoglobulina, y aislamiento de polipéptidos heterodiméricos solubles formados en los medios de cultivo, se describen. En otro aspecto, un método para producir un receptor heterodimérico soluble comprendiendo: separadamente cultivo de una primera célula que expresa una parte soluble de una primera subunidad de un receptor heterodimérico unido a un primer polipéptido de inmunoglobulina y una segunda célula que expresa una parte soluble de una segunda subunidad de un receptor heterodimérico unido a un segundo polipéptido de inmunoglobulina,

separadamente purificación de las primeras y segundas proteínas de fusión de subunidad, mezcla de las primeras y segundas proteínas de fusión de subunidad, y aislamiento de polipéptidos heterodiméricos solubles formados, se describe. Los pasos de aislamiento anteriormente descritos pueden comprender uno o más pasos de purificación según métodos conocidos en la técnica.

[0084] En un aspecto, receptores heterodiméricos solubles aislados comprendiendo al menos una proteína híbrida, es decir, una proteína donde dos polipéptidos (típicamente polipéptidos de fusión comprendiendo al menos un receptor y un segmento de inmunoglobulina y/o otro péptido de promoción de dimerización) son unidos vía una interacción distinta a un enlace peptídico (p. ej., enlace bisulfuro, avidina-biotina, cremallera de leucina, etc.), se describen. En este método, los polipéptidos son producidos separadamente por métodos recombinantes, y luego juntados.

[0085] Si se desea, las cantidades relativas de dos proteínas de fusión recombinantes producidas en una única célula o cultivo celular pueden ser reguladas, por ejemplo, por expresión de estas a partir de promotores de diferentes fuerzas. Por ejemplo, si el péptido añadido de una primera subunidad A forma homodímero a una alta frecuencia, mientras que el péptido añadido de una segunda subunidad B forma homodímeros a una baja frecuencia, uno puede conducir la formación de los heterodímeros deseados por niveles mucho más altos de expresión de subunidad B que de A. Las cantidades óptimas relativas se pueden determinar empíricamente por experimentación rutinaria.

[0086] También se describe aquí receptores heterodiméricos solubles aislados codificados por los ácidos nucleicos anteriormente descritos. En un aspecto, el polipéptido receptor heterodimérico soluble aislado comprende dos polipéptidos, el primer comprendiendo una parte soluble de una primera subunidad de un receptor heterodimérico unido a un polipéptido de inmunoglobulina, y la segunda comprendiendo una segunda subunidad de un receptor heterodimérico unido a un polipéptido de inmunoglobulina. Los primeros y segundos polipéptidos son asociados preferiblemente, por ejemplo, vía fuerzas iónicas, enlaces covalentes, o una combinación de estas. En receptores heterodiméricos solubles comprendiendo al menos dos polipéptidos, los polipéptidos se pueden asociar por enlace bisulfuro entre las partes de subunidad receptoras o las partes de inmunoglobulina, y/o interacción forzada vía mutaciones en un segmento de inmunoglobulina, como se describe en este documento. En una forma de realización, un polipéptido comprende una subunidad NKG2 (p. ej. NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, o NKG2F) y un péptido de inmunoglobulina, un polipéptido comprende un polipéptido CD94 y un péptido de inmunoglobulina, y el receptor heterodimérico formado se une a un ligando CD94/NKG2 tal como, por ejemplo, un anticuerpo contra el receptor correspondiente CD94/NKG2, o un ligando natural, por ejemplo, HLA-E en el caso de cD94/NKG2A, CD94/NKG2C, etc. En otra forma de realización, el receptor heterodimérico es un polipéptido monocatenario comprendiendo partes solubles de primeras y segundas subunidades de un receptor heterodimérico y un polipéptido de inmunoglobulina. En el caso de receptores heterodiméricos NKG2, el receptor heterodimérico codificado pueden unir con un anticuerpo contra un receptor CD94/NKG2, por ejemplo, un receptor CD94/NKG2 humano, o un ligando natural, por ejemplo, HLA-E en el caso de nKG2A, NKG2C, etc.

[0087] El receptor heterodimérico puede comprender una parte soluble de la secuencia NKG2A expuesta en la SEC ID nº: 1, o una variante u ortólogo de esta. En una forma de realización, la parte soluble de la subunidad NKG2A comprende residuos 116-233 de la SEC ID nº: 1. En otra forma de realización, la parte soluble de la subunidad NKG2A comprende residuos 99-233 de la SEC ID nº: 1. En otra forma de realización, la parte soluble comprende un fragmento de la subunidad NKG2A que empieza con un residuo seleccionado de los residuos 99-116 y extremos en el residuo 116 de la SEC ID nº: 1. En otra forma de realización, la parte soluble de la subunidad NKG2A consiste en los residuos 116233 de la SEC ID nº: 1.En otra forma de realización, la parte soluble de la subunidad NKG2A consiste en los residuos 99-233 de la SEC ID nº: 1.

[0088] El receptor heterodimérico puede también o alternativamente comprender una parte soluble de la secuencia NKG2C expuesta en la SEC ID nº: 3. En una forma de realización, la subunidad NKG2C comprende los residuos 114231 de la SEC ID nº: 3. En otra forma de realización, la parte soluble de la subunidad NKG2C comprende los residuos 97-231, por ejemplo, 96-231, de la SEC ID nº: 3. En otra forma de realización, la parte soluble comprende un fragmento de la subunidad NKG2C que empieza con un residuo seleccionado de los residuos 96-114 y extremos en el residuo 114 de la SEC ID nº: 3. En otra forma de realización, la parte soluble de la subunidad NKG2A consiste en residuos los 114231 de la SEC ID nº: 3. En otra forma de realización, la parte soluble de la subunidad NKG2A consiste en los residuos 96-231 de la SEC ID nº: 3.

[0089] El receptor heterodimérico puede también o alternativamente comprender una parte soluble de NKG2B, NKG2E, comprendiendo, por ejemplo, el segmento alineado con NKG2A-residuos 99-233.

[0090] El receptor heterodimérico puede comprender una parte soluble del receptor CD94 expuesto en la SEC ID nº: 2,

o una variante u ortólogo de esta. En una forma de realización, la parte soluble de la subunidad CD94 comprende los residuos 58-179 de la SEC ID nº: 2. En otra forma de realización, la parte soluble de la subunidad CD94 comprende los residuos 34-179 o 35-179 de la SEC ID nº: 2. En otra forma de realización, la parte soluble comprende un fragmento de la subunidad CD94 que inicia con un residuo seleccionado de los residuos 34-58 y extremos en el residuo 179 de la SEC ID nº: 2. En otra forma de realización, la parte soluble de la subunidad CD94 consiste en los residuos 58-179 de la SEC ID nº: 2. En otra forma de realización, la parte soluble de la subunidad CD94 consiste en los residuos 35-179 de la SEC ID nº: 2.

14 5

[0091] En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos con secuencias de aminoácidos al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idénticas a una secuencia de aminoácidos catalogada en la tabla 1, al igual que composiciones farmacéuticas comprendiendo tales polipéptidos. En otro aspecto, la invención proporciona receptores heterodiméricos comprendiendo variantes de las secuencias de aminoácidos en la tabla 2. En una forma de realización, la variante se une un ligando natural de un receptor CD94/NKG2 humano tal como HLA-E y/o un anticuerpo dirigido contra un receptor CD94/NKG2A humano. La variante puede diferir del progenitor en, por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservadoras, como se ha descrito anteriormente, sustituciones de aminoácido no conservadoras, adiciones, y/o deleciones. Por ejemplo, aminoácidos esenciales en los polipéptidos receptores de la presente invención se pueden generar e identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de escaneado de alanina (Cunningham and Wells, Science 1989;244:1081-1085; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991,88:4498-4502). En esta técnica, mutaciones de alanina únicas se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se evalúan para actividad biológica (p. ej., unión de ligandos y transducción de señal) para identificar residuos de aminoácidos que son muy importantes para la actividad de la molécula. Sitios de interacción de ligando-receptor pueden también ser determinados por análisis de estructura cristalina como determinado por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcaje por fotoafinidad. Ver, por ejemplo, de Vos et al., Science 1992;255:306-312; Smith et al., J. Mol. Biol. 1992;224:899-904; Wlodaver et al., FEBS Lett. 1992;309:59-64. Las identidades de aminoácidos esenciales puede también ser inferidas de análisis de homologías con receptores relacionados.

[0092] Sustituciones de aminoácido múltiples pueden hacerse y evaluarse usando métodos conocidos de mutagénesis y selección, tales como aquellos descritos por Reidhaar-Olson and Sauer Science 1988;241:53-57 o Bowie and Sauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989,86:2152-2156. Brevemente, estos autores revelan métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando para polipéptido funcional, y luego secuenciación de los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones admisibles en cada posición. Otros métodos que pueden ser usados incluyen exposición en fago, por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 1991;30:10832-10837; Ladner et al., Patente US No. 5,223,409; Huse, Publicación OMPI WO 92/06204 y mutagénes dirigida en la región (Derbyshire et al., Gene 46:145, (1986 ); Ner et al., DNA 7: 127, (1988)). Métodos de mutagénesis como se describe arriba se pueden combinar con métodos de selección de rendimiento alto para detectar actividad de receptores clonados, mutagenizados en células huésped. Ensayos preferidos a este respecto incluyen ensayos de proliferación celular y ensayos de unión de ligandos a base de biosensor, que se describen debajo. Moléculas de ADN mutagenizadas que codifican receptores heterodiméricos activos o partes de estos (p. ej., fragmentos de unión de ligandos) se pueden recuperar de las células huésped y rápidamente ordenar usando equipamiento de módem. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.

[0093] Lo siguiente describe algunos aspectos adicionales ejemplares de la invención:

[0094] En un aspecto, la invención proporciona un receptor monocatenario soluble CD94/NKG2 comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94. La construcción monocatenaria puede, en un aspecto, además comprender un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este. Así, la invención también proporciona un receptor monocatenario soluble CD94/NKG2 comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2, una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este. En una forma de realización, en el receptor monocatenario soluble CD94/NKG2, el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se puede unir al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 se une al polipéptido de inmunoglobulina. En otra forma de realización, en el receptor monocatenario soluble CD94/NKG2, el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 se une al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se une al polipéptido de inmunoglobulina. En el receptor monocatenario soluble CD94/NKG2, la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2, la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y, en formas de realización comprendiendo un polipéptido de inmunoglobulina, el polipéptido de inmunoglobulina, puede ser asociado por, por ejemplo, enlace covalente. Por ejemplo, la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se puede unir por un enlazador peptídico comprendiendo glicina y serina.

[0095] En otro aspecto, la invención proporciona un receptor monocatenario soluble CD94/NKG2A comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2A y una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94. La construcción monocatenaria puede, en un aspecto, además comprender un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este. Así, la invención también proporciona un receptor monocatenario soluble CD94/NKG2A comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2A, una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este. En una forma de realización, en el receptor monocatenario soluble CD94/NKG2A, el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se puede unir al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2A, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2A se une al polipéptido de inmunoglobulina. En otra forma de realización, en el receptor monocatenario soluble

CD94/NKG2A, el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2A se une al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se une al polipéptido de inmunoglobulina. En el receptor monocatenario soluble CD94/NKG2A, la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2A, la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y, en formas de realización comprendiendo un polipéptido de inmunoglobulina, el polipéptido de inmunoglobulina, puede ser asociado por, por ejemplo, enlace covalente. Por ejemplo, la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2A y parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se pueden unir por un enlazador peptídico comprendiendo glicina y serina.

[0096] En otro aspecto, la invención proporciona un receptor monocatenario soluble CD94/NKG2C comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2C y una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94. La construcción monocatenaria puede, en un aspecto, además comprender un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este. Así, la invención también proporciona un receptor monocatenario soluble CD94/NKG2C comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2C, una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este. En una forma de realización, en el receptor monocatenario soluble CD94/NKG2C, el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se puede unir al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2C, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2C se une al polipéptido de inmunoglobulina. En otra forma de realización, en el receptor monocatenario soluble CD94/NKG2C, el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2C se une al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se une al polipéptido de inmunoglobulina. En el receptor monocatenario soluble CD94/NKG2C, la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2C, la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y, en formas de realización comprendiendo un polipéptido de inmunoglobulina, el polipéptido de inmunoglobulina, puede ser asociado por, por ejemplo, enlace covalente. Por ejemplo, la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2C y parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se puede unir por un enlazador peptídico comprendiendo glicina y serina.

[0097] En otro aspecto, la invención proporciona un dímero de cualquier receptor monocatenario soluble CD94/NKG2, CD94/NKG2A o CD94/NKG2C anteriormente descritos.

[0098] En otro aspecto, la invención proporciona un receptor soluble CD94/NKG2 comprendiendo una subunidad NKG2 comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y una subunidad CD94 comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, donde al menos una de la subunidad NKG2 y subunidad CD94 comprende un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este, donde ejemplos no limitativos de subunidades NKG2 son NKG2Cy NKG2A. El polipéptido de inmunoglobulina puede, por ejemplo, comprender una parte de un dominio IgG Fc que aumenta la vida media in vivo de la construcción. En una forma de realización, el polipéptido de inmunoglobulina es un dominio Fc funcional. En otra forma de realización, el dominio Fc es de un anticuerpo lgG4. En otra forma de realización, el dominio Fc es de un anticuerpo IgG1.

[0099] En otro aspecto, solo una de las subunidades CD94 y NKG2 se une a un polipéptido de inmunoglobulina. El polipéptido de inmunoglobulina puede, por ejemplo, ser unido a la parte C-terminal de la subunidad. En una forma de realización, las subunidades CD94 y NKG2 son unidas vía un enlazador peptídico. Por ejemplo, el enlazador peptídico puede comprender la secuencia GGSGGS (SEC ID nº: 6) o GGSGGSRSS (SEC ID nº: 7). En una forma de realización particular, la subunidad NKG2A es unida de manera covalente al polipéptido de inmunoglobulina. En una forma de realización alternativa, la subunidad CD94 es unida de manera covalente al polipéptido de inmunoglobulina.

[0100] En otro aspecto, cada una de las subunidades CD94 y NKG2 es unida de manera covalente a un polipéptido de inmunoglobulina. Por ejemplo, el N-terminal de la subunidad NKG2 se puede enlazar al C-terminal de un primer polipéptido de inmunoglobulina para formar un primer polipéptido, y el N-terminal de la subunidad CD94 se puede unir al C-terminal de un segundo polipéptido de inmunoglobulina para formar un segundo polipéptido. En una forma de realización, los primeros y segundos polipéptidos de inmunoglobulina son variantes de un dominio Fc IgG1 humano, el primer polipéptido de immunolobulina comprendiendo sustituciones, correspondientes a K253E, D282K y K322D, y el segundo polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo sustituciones, correspondientes a D239K, E240K y K292D, o viceversa. En otra forma de realización, los primeros y segundos polipéptidos de inmunoglobulina son variantes de un dominio Fc IgG4 humano, el primer polipéptido de immunolobulina comprendiendo sustituciones correspondientes a K250E, D279K y K319D, y el segundo polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo sustituciones, correspondientes a E236K, E237K, R289D, o viceversa.

[0101] En cualquiera de los aspectos precedentes, la subunidad NKG2 puede ser NKG2A donde la secuencia de aminoácidos NKG2A puede ser, por ejemplo, aquella de NKG2A humano (SEC ID nº: 1). Por ejemplo, la subunidad NKG2A puede comprender los residuos 99-233 de la SEC ID nº: 1.

[0102] En cualquiera de los aspectos precedentes, la subunidad NKG2 puede ser alternativamente NKG2C donde la secuencia de aminoácidos NKG2C puede ser, por ejemplo, aquella de NKG2C humano (SEC ID nº: 3). Por ejemplo, la subunidad NKG2C puede comprender los residuos 96-231 de la SEC ID nº: 3.

[0103] En cualquiera de los aspectos precedentes, la secuencia de aminoácidos CD94 puede ser la SEC ID nº: 2. Por ejemplo, la subunidad CD94 puede comprender los residuos 35-179 de la SEC ID nº: 2.

[0104] En cualquiera de los aspectos precedentes, el polipéptido de inmunoglobulina puede comprender en toda su longitud o fragmento de una secuencia seleccionada de la SEC ID nº: 12-29. Una construcción heterodimérica comprendiendo en toda su longitud o un fragmento de cada uno de la SEC ID nº: 12-29 es una forma de realización específica y separada según la invención.

[0105] En cualquiera de los aspectos precedentes, el polipéptido de inmunoglobulina puede ser unido de manera covalente a una secuencia señal. Por ejemplo, la secuencia señal puede comprender la secuencia de la SEC ID nº: 30.

[0106] En aspectos alternativos o adicionales, la invención proporciona receptor soluble CD94/NKG2A comprendiendo las secuencias de SEC ID nº: 31 y 32, SEC ID nº: 33 y 34, SEC ID nº: 35 y 36, SEC ID nº: 37, SEC ID nº: 38, y SEC ID nº: 39 o un receptor soluble CD94/NKG2C comprendiendo la SEC ID nº: 59.

[0107] En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican el receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de los aspectos precedentes. También se proporciona para una célula transformada con un vector de expresión comprendiendo tales ácidos nucleicos, donde la célula puede ser, por ejemplo, una célula procariota o célula eucariota. También se proporciona para un método para producir un receptor soluble CD94/NKG2, comprendiendo cultivo de dicha célula bajo condiciones adecuadas para la expresión del receptor soluble CD94/NKG2.

[0108] En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica comprendiendo una cantidad eficaz del receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de los aspectos precedentes y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente.

[0109] En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo contra un receptor CD94/NKG2 tal como, por ejemplo, CD94/NKG2A, el método comprendiendo: inoculación de un animal con un receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de los aspectos precedentes, donde el polipéptido suscita una respuesta inmunitaria en el animal para producir el anticuerpos y aislamiento del anticuerpo del animal.

Preparación de receptores heterodiméricos solubles

[0110] Los polipéptidos receptores heterodiméricos de la presente invención se pueden producir en células huésped creadas genéticamente según técnicas convencionales.

[0111] Células huésped adecuadas son aquellos tipos celulares que pueden ser transformados o transfectados con ADN exógeno y crecidos en el cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucariotas cultivadas más altas. Células eucariotas, células particularmente cultivadas de organismos pluricelulares, son preferidas. Técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en una variedad de células huésped se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989).

[0112] En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido receptor soluble heterodimérico es operativamente unido a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, incluyendo generalmente un promotor de transcripción y terminador, dentro de un vector de expresión. El vector también comúnmente contendrá uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque expertos en la técnica reconocen que dentro de marcadores seleccionables de sistemas determinados se pueden proporcionar en vectores separados, y replicación del ADN exógeno se puede proporcionar por integración en el genoma de la célula huésped. Selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un materia de diseño de rutina en el nivel de habilidad común en la técnica. Muchos de estos elementos son descritos en la literatura y están disponibles a través de proveedores comerciales. Componentes múltiples de un complejo receptor soluble se puede co-transfectar en vectores de expresión individuales o ser contenidos en un único vector de expresión. Tales técnicas de componentes múltiples de expresión de complejos de proteína se conocen bien en la técnica.

[0113] Para dirigir un polipéptido receptor heterodimérico en la vía secretora de una célula huésped, una secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia líder, prepro secuencia o pre secuencia) se puede proporcionar en el vector de expresión. La secuencia señal secretora puede ser aquella del receptor, o se puede derivar de otra proteína segregada (por ejemplo; t-PA) o sintetizado de novo. La secuencia señal secretora se une a la secuencia de ADN de polipéptido receptora heterodimérica en el marco de lectura correcto. Secuencias señal secretoras se sitúan comúnmente 5' a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque secuencias de señal determinadas se pueden situar en otro lugar en la secuencia de ADN de interés (ver, por ejemplo, Welch et al., U.S. Patent No. 5,037,743 ; Holland et al., U.S. Patent No. 5,143,830).

[0114] Células mamíferas cultivadas son huéspedes preferidos en la presente invención.

[0115] Métodos para introducir ADN exógeno en las células huésped mamíferas incluyen transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 11978;4:725 et seq.; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 1981;7:603 et seq.: Graham and Van der Eb, Virology 1973;52:456 et seq., electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1982;1:841845), transfección mediada por dextrano DEAE (Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), y transfección mediada por liposoma (Hawley-Nelson et al., Focus 1993;15:73 et seq.; Ciccarone et al., Focus 1993;15:80 et seq.). La producción de polipéptidos recombinantes en células mamíferas cultivadas se describe, por ejemplo, por Levinson et al., patente US n° 4,713,339; Hagen et al., patente US n° 4,784,950; Pahniten et al., patente US n° 4,579,821; y Ringold, patente US n° 4,656,134. Células de mamífero adecuadas cultivadas incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC nº CRL 1650), COS-7 (ATCC nº CRL 1651), BHK (ATCC nº CRL 1632), BHK 570 (ATCC nº CRL 10314), 293 (ATCC nº CRL 1573 Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) y ovario de hámster chino (p. ej. CHO-K1 ATCC nº CCL 61). En una forma de realización, la célula es dependiente de un factor de crecimiento hematopoyético suministrado exógenamente para su proliferación. Líneas celulares preferidas de este tipo son la línea celular TF-1 humana (Número ATCC CRL 2003) y la línea celular AML 193 (Número ATCC CRL-9589), que son líneas celulares leucémicas dependientes GM-CSF y BaF3 (Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1995)) que es una línea celular pre-B dependiente de murina IL-3. Líneas celulares adicionales adecuadas se conocen en la técnica y están disponibles de depositarios públicos tales como la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. En general, promotores de transcripción fuerte son preferidos, tales como promotores de SV-40 o citomegalovirus. Ver, por ejemplo, la patente US n°. 4, 956,288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de genes de metalotioneína (U.S. patente nº 4, 579,821 y 4,601,978) y el promotor tardío de adenovirus importante.

[0116] Selección de medicamento es generalmente usada para seleccionar células mamíferas cultivadas en las que ADN extranjero ha sido insertado. Tales células son comúnmente referidas como "transfectantes". Células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie son referidos como "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es una resistencia de gen que codifica al antibiótico neomicina. Selección se realiza en presencia de un medicamento tipo neornycin, tal como G-418 o similar. Sistemas de selección pueden también ser usados para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso referido como "amplificación".

[0117] Amplificación se realiza por transfectantes de cultivo en presencia de un bajo nivel del agente selectivo y luego aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar células que producen niveles altos de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable preferido amplificable es dihidrofolato-reductasa, que confiere resistencia a metotrexato. Otros genes de resistencia a medicamentos (p. ej. resistencia a higromicina, resistencia a multifármaco, acetiltransferasa de puromicina) también pueden usarse.

[0118] Otras células eucariotas más altas también pueden usarse como huéspedes, incluyendo células de insecto, células vegetales y células aviares. Transformación de células de insecto y producción de polipéptidos extranjeros en estas se describe en Guarino et al., patente US n° 5,162,222; Bang et al., patente US nº 4,775,624; y WIPO publicación WO 94/06463. El uso de Agrobacteriuin rhizogenes como un vector para genes de expresión en células vegetales ha sido reviado por Sinkar et al., J. BioSci. (Bangalore) 11: 47-58; (1987).

[0119] Células fúngicas, incluyendo células de levadura, y particularmente células del género Saccharomyces, también pueden usarse en la presente invención, tal como para producir polipéptidos de fusión. Métodos para transformar células de levadura con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de lo que se describe por, por ejemplo, Kawasaki, patente US n° 4,599,311; Kawasaki et al., patente US n° 4,931,373; Brake, patente US n° 4,870,008; Welch et al., patente US n° 5,037,743; y Murray et al., patente US n° 4,845,075. Células transformadas se seleccionan por fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente resistencia a medicamento o la capacidad para crecer en ausencia de un nutriente particular (p. ej., leucina). Un sistema vector preferido para uso en la levadura es el sistema de vector POT1 descrito por Kawasaki et al. (patente US n° 4,931,373), que permite a células transformadas ser seleccionadas por crecimiento en la glucosa con medio. Promotores adecuados y terminadores para uso en la levadura incluyen aquellos de genes de enzima glicolíticos (ver, por ejemplo, Kawasaki, patente US n° 4,599,311; Kingsman et al., patente US n° 4,615,974; y Bitter, patente US nº 4,977, 092) y genes de alcohol deshidrogenasa. Ver también patentes US nº 4,990,446, 5,063,154, 5,139,936 y 4,661,454. Sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces ponibe, Kluyveroinyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillennondiii y Candida maltosa se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 1986,132:3459-3465 y Cregg, patente US n° 4,882,279. Células de Aspergillus se pueden utilizar según los métodos de McKnight et al., patente US n° 4,935,349. Métodos para transfomación de Acreinonium chrisogenum son descritos por Sumino et al., patente US n° 5,162, 228. Métodos para transfomación de Neurospora se describen por Lainbowitz, patente US n° 4,486,533.

[0120] Células huésped transformadas o transfectadas se cultivan según procedimientos convencionales en un medio de cultivo con nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células huésped elegidas. Una variedad de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, se conocen en la técnica y generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios pueden contener también tales componentes como factores de crecimiento o suero, según sea necesario. El medio de crecimiento generalmente selecciona células con el ADN añadido exógenamente por, por ejemplo,

selección de medicamento o deficiencia de un nutriente esencial que se implementa por el marcador seleccionable soportado en el vector de expresión o co-transfectado en la célula huésped.

[0121] Preferiblemente, un receptor heterodimérico soluble de la invención es "aislado," e.g, está en una forma distinta a la que ocurre en la naturaleza, por ejemplo, en un tampón, en una forma seca esperando reconstitución, como parte de un kit o una composición farmacéutica, etc. El término "polipéptido aislado" se refiere a un receptor heterodimérico soluble de la presente invención que (1) ha sido separado de al menos aproximadamente 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales (es decir, contaminantes) con los cuales es naturalmente asociado. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de cualquier otro polipéptido contaminante u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de investigación.

[0122] Una variedad de métodos convencionales pueden utilizarse para aislar y/o purificar un receptor heterodimérico soluble de la invención, o para aislar y/o purificar sus componentes de polipéptido diferentes antes de juntarlos. Receptores solubles de la invención y/o sus subunidades se pueden recuperar de células bien como proteínas solubles (preferiblemente después de haber sido segregadas en el fluido de cultivo) o como cuerpos de inclusión, donde pueden ser extraídos de forma cuantitativa, por ejemplo, por 8M hidrocloruro de guanidio y diálisis. Métodos de purificación convencionales que se pueden usar incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de fase inversa, y/o filtración de gel. En una forma de realización preferida, cromatografía de afinidad se usa, por ejemplo, con una columna con proteína A o proteína G, que puede unirse con las fracciones Fc presentes en determinados receptores solubles. En otra forma de realización, cada polipéptido es "etiquetado" con una fracción, preferiblemente una divisible, que puede unirse con una columna de afinidad apropiada. Por ejemplo, una o ambas subunidades se pueden etiquetar con poli His (por ejemplo; H'S6) para permitir purificación rápida por cromatografía de metal-quelato; con una marca Strep que se une a estreptavidina y se puede ser eluir con iminobiotina; con proteína de enlace de maltosa (MBP), que se une a aynilose y se puede eluir con maltosa; o con cualquier otra fracción de este tipo que se puede separar por cromatografía de afinidad. Alternativamente, uno puede marcar una o ambas de las subunidades con epítopos a los anticuerpos que están disponibles, tales como el péptido FLAGO, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, CT). Para métodos típicos del uso de etiquetas de afinidad, ver, por ejemplo, Recombinant Protein Protocols: Detection and Isolation, Edited by Rocky S. Tuan, Methods in Molecular Biology, Vol.. 63, Humana Press, 1997 y los ejemplos 5 y

6.

[0123] Combinaciones de cualquiera de los tipos anteriores de métodos de purificación también se pueden usar.

[0124] La pureza de los receptores puede ser determinada usando métodos de estándar incluyendo, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía en columna y análisis de secuencia de aminoácidos aminoterminal.

[0125] Unión de los receptores heterodiméricos solubles a, por ejemplo, un ligando natural del receptor heterodimérico o un anticuerpo contra el receptor heterodimérico nativo puede ser evaluado por métodos convencionales. Un sistema de ensayo preferido que utiliza una construcción receptora de enlace de ligandos usa un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIAcoreTm, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), donde el ligando, un anticuerpo, o un fragmento de este se inmoviliza sobre la superficie de un chip receptor. Uso de este instrumento se describe en Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-240, (1991) y Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-563; (1993). El ligando, anticuerpo, o fragmento es unido de manera covalente, usando química de amino o sulfhidril, a fibras de dextrano que se fijan a película de oro en la célula de flujo. Una muestra para ensayo se pasa a través de la célula. Si la construcción receptora heterodimérica soluble en la muestra se une al ligando o anticuerpo, se unirá con el ligando inmovilizado o anticuerpo, causando un cambio en el índice de refracción del medio, que se detecta como un cambio en la resonancia de plasmón de superficie de la película de oro. Este sistema permite la determinación de tasas de “asociación-disociación” donde afinidad de enlace puede ser calculada, y evaluación de estequiometría de unión.

[0126] Polipéptidos receptores de enlace de ligandos pueden también ser evaluados por otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Tales sistemas incluyen análisis de Scatchard para determinación de afinidad de enlace. Ver, Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 1949,51: 660-672, y ensayos calorimétricos (Cunningham et al., Science 1991;253:545548; Cunningham et al., Science 1991; 254:821-825).

[0127] La estabilidad del receptor se puede evaluar por almacenamiento de este bajo condiciones diferentes (p. ej., temperatura, pH, en diferentes tampones) para varias longitudes de tiempo. Estabilidad funcional es luego evaluada por análisis de la capacidad de enlace. Por ejemplo, CD94/NKG2C o CD94/NKG2A soluble se pueden evaluar para su capacidad para unir su ligando (HLA-E) o anticuerpos anti-CD94/NKG2C o CD94/NKG2A específicos (p. ej. Z199; Z270, HP-3D9, FAB138P) en un BiaCore o ensayo similar después de almacenamiento durante varios periodos de tiempo y bajo condiciones de almacenamiento diferentes. El porcentaje de unión de un CD94/NKG2 almacenado en comparación con una referencia soluble CD94/NKG2 (que puede, por ejemplo, haber sido almacenado bajo condiciones estándar) puede ser una medida de su estabilidad.

Uso de receptores heterodiméricos solubles 19

[0128] Aspectos particulares de la invención se refieren al uso de las construcciones de receptores heterodiméricos solubles como agentes de inmunización, investigación y herramientas de selección, reactivos de diagnóstico y agentes terapéuticos.

[0129] En un aspecto, la invención proporciona un método para inmunización de un animal con un receptor heterodimérico soluble según la invención para suscitar respuesta de un anticuerpo contra el receptor heterodimérico. Ventajas ejemplares del uso de las construcciones de receptores heterodiméricos solubles de la invención en vez de fragmentos solubles solo incluyen vida media más larga, corrección de pliegue tridimensional del receptor y una bobina receptora eficaz en APC facilitado por la marca Fc (promoviendo así una respuesta de anticuerpo más robusta). Anticuerpos contra el receptor heterodimérico pueden luego ser recogidos de la sangre (preparación de anticuerpo policlonal) u obtenidos a partir de producción de anticuerpo B usando técnicas de hibridoma de células o además establecer tecnologías para producción de anticuerpo monoclonal. En una forma de realización, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo a un receptor soluble heterodimérico comprendiendo: inmunización de un animal con un receptor soluble heterodimérico descrito aquí, donde el polipéptido suscita una respuesta inmunitaria en el animal para producir el anticuerpos y aislamiento del anticuerpo del animal.

[0130] En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo producido por el método como se describe arriba, que específicamente se une a un complejo receptor multimérico o heterodimérico soluble comprendiendo un receptor heterodimérico soluble como se describe en este documento. En una forma de realización, el anticuerpo descrito arriba es un anticuerpo monoclonal.

[0131] El paso de inmunización de un mamífero no humano con un antígeno se puede llevar a cabo de cualquier manera bien conocida en la técnica para la estimulación de la producción de anticuerpos en un ratón (ver, por ejemplo,

E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). El receptor soluble heterodimérico, o un fragmento de este, es suspendido o disuelto en un tampón, opcionalmente con un adyuvante, tal como adyuvante de Freund completo. Métodos para determinar la cantidad de inmunógeno, tipos de tapones y cantidades de adyuvante se conocen por los de habilidad en la técnica. Estos parámetros pueden ser diferentes para inmunógenos diferentes, pero se dilucidan fácilmente.

[0132] De forma similar, la ubicación y frecuencia de inmunización suficiente para estimular la producción de anticuerpos son también bien conocidos en la técnica. En un protocolo de inmunización típica, los animales no humanos se inyectan intraperitonealmente con antígeno en el día 1 y nuevamente aproximadamente una semana más tarde. Esto va seguido de retirada de inyecciones del antígeno alrededor del día 20, opcionalmente con adyuvante tal como adyuvante de Freund incompleto. El retiro de inyecciones se realiza por vía intravenosa y se pueden repetir durante diferentes días consecutivos. Este va seguido de una reinyección en el día 40, bien por vía intravenosa o intraperitonealmente, típicamente sin adyuvante. Este protocolo produce la producción de anticuerpo específico de antígeno que produce células B después de aproximadamente 40 días. Otros protocolos pueden también ser utilizados mientras ellos suponen la producción de células B que expresan un anticuerpo dirigido al antígeno usado en inmunización.

[0133] Para preparación de anticuerpo policlonal, suero se obtiene de un animal inmunizado no humano y los anticuerpos presentes en estos aislados por técnicas bien conocidas. El suero puede ser de afinidad purificado usando cualquiera de los inmunógenos expuestos arriba unido a un soporte sólido para obtener anticuerpos que reaccionan con el receptor heterodimérico soluble o células que expresan el receptor heterodimérico nativo.

[0134] Para producción de anticuerpos monoclonales, un mamífero no humano se inmuniza con cualquier receptor heterodimérico soluble descrito aquí, incluyendo cualquier secuencia en toda su longitud, cualquier secuencia extracelular, o cualquier fragmento de esta. Esplenocitos son luego aislados y posteriormente fundidos con un célula inmortalizada para formar un hibridoma que produce anticuerpo. El aislamiento de esplenocitos de un mamífero no humano es bien conocido en la técnica e implica típicamente eliminar el bazo de un mamífero no humano anestesiado, cortándolo en piezas pequeñas y apretando los esplenocitos de la cápsula de esplénico y a través de una malla de nilón de un depurador celular en un tampón apropiado para producir una única suspensión celular. Las células son lavadas, centrifugadas y resuspendidas en un tampón que lisa cualquier glóbulo rojo. La solución es otra vez centrifugada y los linfocitos restantes en el granulado son finalmente resuspendidos en el tampón fresco.

[0135] Una vez aislados y presentes en suspensión de célula única, los linfocitos se funden a una línea celular inmortal. Esto es típicamente una línea celular de mieloma de ratón, aunque muchas otras líneas celulares inmortales útiles para crear hibridomas se conocen en la técnica. Líneas de mieloma de murinas preferidas incluyen, pero de forma no limitativa, aquellas derivadas de MOPC-21 y MPC-11 tumores de ratón disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. E.E.U.U., o X63 Ag8653 y SP-2 células disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland E.E.U.U.. La fusión es efectuada usando el polietileno glicol o similares. Los hibridomas resultantes son luego crecidos en medios selectivos que contienen una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parental no fundidas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina fosforibosil guanina transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluye típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), estas sustancias previenen el crecimiento de células HGPRT deficitarias.

[0136] Los hibridomas son típicamente crecidos en un estrato alimentador de macrófagos. Los macrófagos son preferiblemente de la misma camada del mamífero no humano usado para aislar esplenocitos y son típicamente cebados con adyuvante de Freund incompleto o similares varios días antes de poner en placas los hibridomas. Métodos de fusión se describen en (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

[0137] A las células se les permite crecer en los medios de selección durante tiempo suficiente para formación de colonia y producción de anticuerpos; normalmente entre 7 y 14 días. Las colonias de hibridoma son luego evaluadas para la producción de anticuerpos que se unen el receptor soluble heterodimérico o células que expresan el receptor heterodimérico nativo. El ensayo es típicamente un ensayo colorimétrico tipo ELISA, aunque otros tipos diferentes de ensayos pueden ser empleados, incluyendo inmunoprecipitación, radioinmunoanálisis, ensayos Biacore (ver arriba), o ensayos de proximidad de centelleo (SPA), bien conocidos en la técnica. Los pocillos positivos para la producción de anticuerpo deseada se examinan para determinar si una o más colonias diferentes están presentes. Si más de una colonia está presente, las células se pueden reclonar y crecer para asegurar que solo una única célula ha dado origen a la colonia que produce el anticuerpo deseado. Pocillos positivos con una única colonia aparente son típicamente re-clonados y re-evaluados para asegurar que solo un anticuerpo monoclonal está siendo detectado y producido.

[0138] Hibridomas que se confirma que producen un anticuerpo monoclonal de esta invención son luego crecidos en cantidades más grandes en un medio apropiado, tal como DMEM o RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma puede ser crecidas in vivo como tumores ascites en un animal.

[0139] Después de crecimiento suficiente para producir el anticuerpo monoclonal deseado, los medios de crecimiento con anticuerpo monoclonal (o el fluido ascites) se separa fuera de las células y el anticuerpo monoclonal presente en este es purificado. Purificación es típicamente conseguida por cromatografía usando proteína A o proteína G-sefarosa, o un anti-ratón Ig unido a un soporte sólido tal como agarosa o perlas de sefarosa (todos descritos, por ejemplo, en el Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition AC). El anticuerpo unido es típicamente eluido a partir de columnas de proteínaA/proteína G usando tampones de pH bajo (tampones de glicina o de acetato de pH 3,0 o menos) con neutralización inmediata de fracciones con anticuerpo. Estas fracciones son agrupadas, dializadas y concentradas según se necesite.

[0140] Alternativamente, el ADN que codifica un anticuerpo de la invención es aislado del hibridoma, colocado en un vector de expresión apropiado para transfección en un huésped apropiado. El huésped es luego usado para la producción recombinante del anticuerpo, o variantes de este, tal como una versión humanizada de este anticuerpo monoclonal, fragmentos activos del anticuerpo o anticuerpos quiméricos comprendiendo la parte de reconocimiento de antígeno del anticuerpo.

[0141] En un aspecto alternativo o adicional de la invención, los receptores solubles de la invención tales como, por ejemplo, receptores solubles CD94/NKG2, se pueden usar en métodos para selección de agentes de unión NKG2 y/o CD94 para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Por ejemplo, uno o más receptores monocatenarios solubles CD94/NKG2 se pueden utilizar en tales métodos, tales como, por ejemplo, CD94/NKG2A monocatenario, CD94/NKG2C monocatenario, CD94/NKG2B monocatenario, CD94/NKG2E monocatenario y/o CD94/NKG2F monocatenario. Agentes ejemplares incluyen, pero de forma no limitativa, anticuerpos contra CD94, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, y/o NKG2F al igual que fragmentos de unión del antígeno o derivados de tales anticuerpos. Para fragmentos de anticuerpo ejemplares, ver, por ejemplo, Holliger and Hudson (Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136).

[0142] En una forma de realización, la invención así proporciona un método para producir un compuesto de unión del antígeno anti-NKG2, comprendiendo: (a) proporción de un compuesto de unión del antígeno que específicamente se une a un polipéptido NKG2; (b) prueba del compuesto de unión del antígeno para unión a un receptor soluble CD94/NKG2A descrito aquí; (c) selección del compuesto de unión del antígeno si se determina que el compuesto de unión del antígeno se une al receptor soluble CD94/NKG2A; y (d) opcionalmente, producción de una cantidad del compuesto de unión del antígeno seleccionado.

[0143] En otra forma de realización, la invención proporciona un método para producir un compuesto de unión del antígeno anti-NKG2, el método comprendiendo: (a) producción de una cantidad de un compuesto de unión del antígeno que específicamente se une a un polipéptido NKG2; (b) prueba de una muestra de dicha cantidad de un compuesto de unión del antígeno para unión a un receptor soluble CD94/NKG2 descrito aquí; (c) selección de la cantidad para uso como un medicamento y/o en la producción de un medicamento si se determina que el compuesto de unión del antígeno se une al receptor soluble CD94/NKG2; y (d) opcionalmente, preparación de la cantidad para administración a un humano, opcionalmente, formulación de una cantidad del compuesto de unión seleccionado de antígeno con un portador farmacéuticamente aceptable.

[0144] En otra forma de realización, la invención proporciona un método para producir un compuesto de unión del antígeno anti-NKG2, el método comprendiendo: (a) proporción de una pluralidad de compuestos de unión del antígeno que específicamente se unen con un polipéptido NKG2, (b) prueba de cada uno de los compuestos de unión del antígeno para unión a un receptor soluble CD94/NKG2 descrito aquí; (c) selección de un compuesto de unión del

antígeno si se determina que el compuesto de unión del antígeno se une a dicho receptor soluble CD94/NKG2; y (d) opcionalmente, hacer que el compuesto de unión del antígeno sea adecuado para administración humana; y/o (e) opcionalmente, producción de una cantidad del compuesto de unión del antígeno seleccionado.

[0145] Los métodos anteriores pueden comprender también hacer que el compuesto de unión del antígeno sea adecuado para humano haciendo, por ejemplo, el compuesto de unión del antígeno humanizado o quimérico. Los métodos anteriores pueden comprender también producción de una cantidad de compuesto de unión del antígeno que comprende cultivo de una célula que expresa el compuesto de unión del antígeno en un medio adecuado y recuperación del compuesto de unión del antígeno. En formas de realización específicas, el compuesto de unión del antígeno en los métodos anteriores puede comprender un anticuerpo o un fragmento de unión del antígeno de este. El polipéptido NKG2 puede ser seleccionado de, por ejemplo, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, y/o NKG2F. Por ejemplo, el compuesto de unión del antígeno puede unirse con uno o más de NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, y NKG2F. En una forma de realización específica, la unión del antígeno compuesto se une al menos a NKG2A. En otra forma de realización específica, el compuesto de unión del antígeno se une al menos a NKG2C.

[0146] La invención también se refiere a métodos de detección de moléculas HLA-E (en, por ejemplo, ensayos de diagnóstico o experimentales), comprendiendo prueba A de contacto que puede contener moléculas HLA-E con un receptor heterodimérico soluble según la invención. En una forma de realización, el receptor soluble heterodimérico es una construcción de receptor CD94/NKG2C o CD94/NKG2A monocatenario como se describe en este documento. El receptor heterodimérico soluble se puede marcar con una fracción convencional detectable usada para este tipo de fines, por ejemplo, una entidad fluorescente o radiactiva. Alternativamente, métodos indirectos tales como, por ejemplo, conjugar el receptor heterodimérico soluble para una enzima capaz de conversión de un sustrato no detectable a un producto detectable, o un anticuerpo secundario contra una porción Fc del heterodimérico receptor soluble, pueden ser utilizados. Tales ensayos pueden, por supuesto, ser cuantitativos. En una forma de realización, tal ensayo se utiliza para determinar si una muestra biológica tomada de un paciente contiene células que expresan HLA-E en la superficie celular. En otra forma de realización, tal ensayo se utiliza para determinar si un agente de interés causa un aumento o reducción en una célula de la cantidad de HLA-E que está disponible para unión a CD94/NKG2C o CD94/NKG2A (p. ej., células humanas o de murina; en una probeta, muestra de tejido, en el cultivo, o en un animal) y/o si este modula (inhibe

o realza) la actividad biológica de HLA-E (p. ej., su unión a un receptor soluble). Muestras ejemplares biológicas incluyen, pero de forma no limitativa, muestras tumorales obtenidas por, por ejemplo, biopsia o cirugía; y muestras de sangre.

[0147] En otro aspecto, la invención proporciona un método para específicamente dirigirse a células de expresión de HLA-E o de sobre-expresión de HLA-E en un sujeto administrando un receptor heterodimérico soluble según la invención. La porción Fc del CD94/NKG2C o CD94/NKG2A soluble puede luego funcionar como dominio efector para inducir citólisis de la célula de expresión HLA-E vía una respuesta CDC y/o ADCC.

[0148] En otro aspecto, un receptor soluble heterodimérico se usa para purificación de un ligando receptor o un anticuerpo contra el receptor nativo. El receptor heterodimérico soluble se inmoviliza en un soporte sólido, tal como perlas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas basadas en sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada, o como materiales que son estables bajo las condiciones de uso. El receptor heterodimérico soluble puede también ser unido vía su porción Fc a, por ejemplo, una columna de afinidad de proteína A o proteína G. Métodos para conectar polipéptidos a soportes sólidos se conocen en la técnica, e incluyen química de amina, activación de bromuro cianógeno, activación de N-hidroxisuccinimida, activación epóxida, activación de sulfhidril, y activación de hidracida. Los medios resultantes pueden generalmente ser configurados en forma de una columna, y fluidos con ligando se pasan a través de la columna una o más veces para permitir al ligando unirse al receptor. El ligando es luego eluido usando cambios en la concentración de sal o pH para disgregar unión de ligando-receptor.

Ensayos de citotoxicidad

[0149] En una forma de realización particular, la invención proporciona agentes tales como construcciones de receptores solubles CD94/NKG2A y anticuerpos generados contra tales construcciones de receptores solubles CD94/NKG2A. Para determinar si tales construcciones o anticuerpos pueden reducir o bloquear interacciones de CD94/NKG2A con HLA-E, y así aumentar la citotoxicidad de linfocitos CD94/NKG2A restringidos, las siguientes pruebas puede ser realizadas.

[0150] Actividad celular NK puede ser evaluada usando una célula basada en ensayos de citotoxicidad, por ejemplo, midiendo liberación de cromo u otro parámetro para valorar la capacidad del anticuerpo para estimular células NK a matar células diana tales como células P815, K562, o células tumorales apropiadas como se describen en Sivori et al.,

J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998;188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999;190:15051516. En un ensayo ejemplar, la capacidad de un agente para reducir señalización mediada por CD94/NKG2A se puede evaluar en un ensayo de citotoxicidad in vitro de 4-horas estándar usando, por ejemplo, células NKL que expresan CD94/NKG2A, y células diana que expresan HLA-E. Tales células NKL eficazmente no matan dianas que expresan HLA-E porque CD94/NKG2A reconoce a HLA-E, llevando a iniciación y propagación de señalización inhibitoria que impide citólisis mediada por linfocito. Tal ensayo de citotoxicidad in vitro puede llevarse a cabo por métodos estándar

que se conocen bien en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Las células diana se marcan con 51Cr antes de adición de células NKL, y luego la matanza se estima como proporcional a la liberación de 51Cr de las células al medio, como resultado de la matanza. Adición de un agente que impide CD94/NKG2A de unión a HLA-E produce prevención de la iniciación y propagación de señalización inhibitoria vía CD94/NKG2A. Por lo tanto, adición de tales agentes produce aumentos en la matanza mediada por linfocito de las células diana. Este paso así identifica agentes que previenen señalización inducida por CD94/NKG2A negativa por, por ejemplo, bloqueo de unión de ligandos. En un particular, ensayo de citotoxicidad de liberación 51Cr, células de efector NKL que expresan CD94/NKG2A pueden matar HLA-e-negativo LCL 721.221 células diana, pero menos eficaces que HLA-e-expresión de LCL 721.221-Cw3 células. En cambio, células de efector YTS que carecen de CD94/NKG2A matan ambas líneas de célula eficazmente. Así, células efectoras NKL no pueden matar células HLA-E+ LCL 721.221-Cw3 debido a señalización inducida por HLA-E inhibitoria vía CD94/NKG2A. Cuando células NKL se preincuban con bloqueo de anticuerpos anti-CD94/NKG2A según la presente invención en tal ensayo de citotoxicidad de liberación 51Cr, HLA-eexpresión LCL 721.221-Cw3 células se matan en una forma concentración-anticuerpo-dependiente.

[0151] La actividad inhibidora o potenciadora de un receptor o composición de anticuerpos de esta invención se puede evaluar en cualquier número de otra vías, por ejemplo, por su efecto en el calcio intracelular libre como se describe, por ejemplo, en Sivori et al., J. Exp. Med. 1997,186:1129-1136.

[0152] Actividad celular NK puede también ser dirigida usando un ensayo de liberación de citocina, donde células NK se incuban con la construcción de receptores o anticuerpo para estimular la producción de citocina de las células NK (por ejemplo, producción de TNF y IFN-α). En un protocolo ejemplar, producción de IFN-y de PBMC se evalúa por superficie celular y coloración intracitoplásmica y análisis por citometría de flujo después de 4 días en el cultivo. Brevemente, Brefeldin A (Sigma Aldrich) se añade a una concentración final de 5 µg/ml durante las últimas 4 horas de cultivo. Las células son luego incubadas con anti-CD3 y anti-CD56 mAb previo a permeabilización (IntraPre™; Beckman Coulter) y coloración con PE-anti-IFN-y o PE-IgG1 (Pharmingen). Producción de GM-CSF y IFN-y a partir de células NK policlonales activadas se mide en sobrenadantes usando ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-: OptEIA set, Pharmingen).

[0153] Los compuestos de esta invención, incluyendo construcciones de receptores y anticuerpos, pueden mostrar actividad inhibitoria parcial, por ejemplo, parcialmente reducen la inhibición mediada por CD94/NKG2A de citotoxicidad celular NK. En una forma de realización, preparación de un anticuerpo causa al menos un 10% de aumento en citotoxicidad NK, preferiblemente al menos un 40% o 50% de aumento en citotoxicidad NK, o más preferiblemente al menos un 70% de aumento en citotoxicidad NK. Muchos compuestos preferidos son capaces de inhibir (o estimular, en el caso de receptores activantes) al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, 40% o 50% o más de la actividad de la célula NK, por ejemplo, como medido en un ensayo de toxicidad celular, en comparación con células en ausencia del compuesto. También preferido, el compuesto puede proporcionar un aumento de depleción de células diana por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, o más relativamente al nivel de depleción en ausencia del compuesto. Alternativamente, los compuestos de esta invención son capaces de inducir la lisis de población de células diana autólogas, unidas o compatibles, es decir, población celular que no sería eficazmente lisada por células NK en ausencia de dicho anticuerpo. Por consiguiente, compuestos de esta invención pueden también ser definidos como que facilitan actividad celular NK in vivo.

Composiciones farmacéuticas

[0154] La invención también proporciona composiciones que comprenden un receptor heterodimérico soluble o anticuerpo (incluyendo fragmentos y derivados de estos), en cualquier vehículo adecuado en una cantidad eficaz para potencia detectablemente citotoxicidad de linfocito en un paciente o en una muestra biológica comprendiendo linfocitos y, opcionalmente, células diana que expresan HLA-e. La composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente. Tales portadores y excipientes son bien conocidos en la técnica, y son descritos en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

[0155] El término "muestra biológica", como se utiliza en este caso, incluye, pero no está limitado a, un fluido biológico (por ejemplo suero, linfa, o sangre), muestra celular o muestra de tejido (por ejemplo, médula ósea).

[0156] Además aspectos y ventajas de esta invención se describirán en la siguiente sección experimental, que debería ser considerada como ilustrativo y no limitando el alcance de esta solicitud.

Ejemplos

Ejemplo 1: Modelaje de interacción CD94/NKG2A con HLA-E

[0157] Este ejemplo describe en el modelado in silico identificación de segmentos CD94/NKG2A que cubren la interacción con HLA-E. La base de datos de proteína (PDB; Protein Data Bank) denominada en este caso es descrita en: H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne: The Protein

Data Bank. Nucleic Acids Research, 28 pp. 235-242 (2000). Identificadores PDB son siempre 4 caracteres alfanuméricos, por ejemplo, 1 NKR & 1OM3, algunas veces referido como 1NKR.pdb y 1 OM3.pdb.

[0158] Un modelo de complejo CD94/NKG2A con su ligando HLA-E fue construido in silico. Para esto, un modelo del heterodímero CD94/NKG2A fue construido usando la estructura de rayos X del homodímero CD94 como un modelo de homología (PDB-ID: 1B6E). Además, la estructura cristalina resuelta de HLA-E fue usada (PDB-ID:1MHE). El complejo de HLA-E y CD94/NKG2A fue luego construido in silico, usando la estructura de rayos X del complejo NKG2D-MICA relacionado (PDB-ID:1 HYR). El modelo completo se muestra en la Figura 4.

[0159] El modelo fue consistente con estudios mutacionales que identifican los residuos HLA-E R65; D69; Q72; R75; R79; H155; D162; E166 como los residuos de interacción (H. Wada et al., Eur. J. Immunol. 2004. 34, 81-90). En el alineamiento de CD94, NKG2A y NKG2D, el modelo también identifica un residuo muy importante para acoplarse con CD94: F107 (CD94), F165 (NKG2A). El residuo correspondiendo no está conservado en NKG2D.

[0160] El modelo también identificó que los N-y C-terminales estuvieron muy juntos. En el modelo, mostrado en la figura 4, la distancia fue 13,2 un entre los carbonos alfa del C-terminal CD94 y el N-terminal NKG2A, y 14,7 un entre carbonos alfa del N-terminal CD94 y el C-terminal NKG2A. Por comparación, la longitud de un residuo de aminoácido es aproximadamente 3,75 A, y la longitud de, por ejemplo, un enlazador GGSGG (SEC ID nº: 6) es aproximadamente 22,5

A.

Ejemplo 2 -Identificación de residuos de aminoácidos responsables de interacciones iónicas en inmunoglobulinas

[0161] Referencias para números de posición de región constante de cadena pesada aquí específicamente indican la posición de la secuencia de región constante de tipo salvaje empezando del principio (N-terminal) de CH1 (similar a Uniprot-id:IGHG1_HUMAN (SEQ ID nº: 20). Para posiciones de cadena ligera constantes, la numeración es según Uniprot-id:KAC_HUMAN (SEQ ID nº: 10). Los aminoácidos responsables de las interacciones iónicas en IgG1 s humano fueron identificados usando un análisis de estructuras de rayos X disponible para la interacciones dominio-dominio CH3 -CH3 de los alotipos GM y KM, y estructuras de rayos X disponibles para interacciones CH1 -CKappa y CH1 -CLambda.

[0162] Específicamente, las siguientes estructuras de rayos X KM fueron analizadas: 1 HZH, 1ZA6, 1OQX, 1OQO, 1 L6X; las siguientes estructuras de rayos X GM fueron analizadas: 1T89, 1T83, 1IIX, 1 H3X; las siguientes estructuras de rayos X CH1 -CKappa fueron analizadas: 1TZG, 1 HZH; y la siguiente estructura de rayos X CH1 -CLambda fue analizada: 2RCS.

[0163] Alineamiento de los dominios constantes de alotipos GM (SEC ID NO:8) y KM (SEC ID NO:9) se muestran en la figura 5. Alineamiento de los dominios constantes de Kappa (SEC ID NO:10) y Lambda (SEC ID NO:11) se muestran en la figura 6.

[0164] Usando métodos estándar en los paquetes de modelaje moleculares disponibles, por ejemplo, MOE (Molecular Operating Environment) software disponible de Chemical Computing Group (www.chemcomp.com), interacciones intramoleculares iónicas fueron identificadas. Este análisis específicamente lleva a la identificación deinteracciones iónicas 6 CH3-CH3 GM, interacciones iónicas 6 CH3-CH3 KM, 2 CH1-CKappa y interacciones 2 CH1-CLambda todas catalogadas debajo. CH3-CH3 KM: D239-K322, E240-K253, D282-K292 CH3-CH3 GM: E239-K322, E240-K253, D282-K292 CKappa-CH1: E15-K96, D14-K101 CLambda-CH1: E16-K96, E17-K30

Ejemplo 3: Modificación de aminoácidos en primeros y segundos pares de cadena pesada cadena ligera para promover formación de heterodímero

[0165] Residuos de aminoácidos implicados en las interacciones descritas anteriormente fueron sometidos a sustituciones en dos pares de cadena pesada cadena ligera de distintos anticuerpos con especificidades diferentes en orden para aumentar la energía de (requeridas para) interacciones homodiméricas y así favorecer interacciones heterodiméricas. El mismo principio se puede aplicar a interacciones de cadena pesada-ligera y para receptores heterodiméricos solubles.

CH3-Sin modificar <-> CH3-Sin modificar D239 <-> K322 E240 <-> K253 K292 <-> D282 K322 <-> D239 K253 <-> E240 D282 <-> K292.

[0166] Sugerir las modificaciones, k322D, K253E, D282K en la cadena de A y D239K, E240K, K292D en la cadena B conduce a una interacción CH3-Modificado-A<->CH3-Modificado-B con solo pares coincidentes de la siguiente manera:

D239 <-> K322 E240 <-> K253 K292 <-> D282

D322 <-> K239 E253 <-> K240 K282 <-> D292.

[0167] La interacción CH3-Modificada-A<->CH3-Modificada-A se vuelve:

D239 <-> D322 E240 <-> E253 K292 <-> K282 D322 <-> D239 E253 <-> E240 K282 <-> K292,

con solo pares de repulsión de carga.

[0168] Un método similar se puede aplicar para el GM e interacciones de cadena pesada-ligera.

[0169] Basado en la alta homología de inmunoglobulinas, una homología estructural puede ser predicha, y las interacciones anteriormente descritas tienen equivalentes para otros isotipos humanos (IgG2-4) y lgG de ratón y rata. Para identificar los residuos correspondientes, un alineamiento ha sido realizado y se muestra en la Figura 7.

[0170] Respecto a la conservación de cadena pesada, se puede concluir lo siguiente:

•

D239 o E239 se conserva en todos los subtipos y especies

•

K322 se conserva en los todos subtipos y especies

•

E240 se conserva en humanos, rata IgG1; IgG2a, ratón IgG2a

•

K253 se conserva en humanos, rata IgG1; IgG2a

•

D282 se conserva en todos los subtipos y especies salvo IgG1 de ratón

•

K322 se conserva en todos los subtipos y especies

•

K96 se conserva en todos los subtipos y especies salvo IgG3 humano

•

K101 o R101 se conserva en todos los subtipos y especies salvo IgG2b de ratón

•

K30 se conserva en todos los subtipos y especies salvo IgG3 humano

[0171] Respecto a la conservación de cadena ligera, se puede concluir lo siguiente:

•

E15 se conserva en humano y ratones (rata no investigado)

•

D14 no se conserva

•

E16 se conserva en humano y ratones (rata no investigado)

•

E17 se conserva en humano y ratones (rata no investigado).

Ejemplo 3: Clonación denCD94 humano soluble (hCD94) y NKG2A humano (hNKG2A)

[0172] CD94 humano (hCD94) y NKG2A humano (hNKG2A) fueron clonados de una genoteca de ADNc NK humano comprada de Spring Bioscience (#PHD-138). Cebadores fueron diseñados usando secuencias de la base de datos NCBI con números de registro U30610 (hCD94) y AF461812 (hNKG2A). Cebadores usados para hCD94 fueron

5' GGATCCTCTTTTACTAAACTGAGTATTGAGCCAGC (directo; SEC ID nº: 40), y 5' GCGGCCGCAGATCTATTAAATGAGCTGTTGCTTACAGATATAACG, (inverso SEC ID nº: 41).

[0173] Cebadores usados para hNKG2A fueron

5' GGATCCCAGAGGCACAACAATTCTTCCCTG (directo, SEC ID nº: 42) 5' GCGGCCGCAGATCTATTAAAGCTTATGCTTACAATG, (inverso SEC ID nº: 43).

[0174] Los cebadores directos contuvieron un sitio de restricción de BamHI y los cebadores inversos contuvieron sitios de restricción Notl y BgIII. Los productos fueron amplificados usando un procedimiento de PCR de toma de contacto.

[0175] hCD94 soluble originó un fragmento de 438 pares de bases que fue clonado en pCR4blunt-Topo y secuencia verificada. hNKG2A soluble (405 pares de bases) fue clonada en pCR2.1-TOPO y clones correctos fueron identificados por secuenciación.

Ejemplo 4: Construcciones que expresan mFc-hNKG2A o mFc-hCD94 para células mamíferas

[0176] Murina Fc (mFc) fue clonada a partir de un clon de IMAGE #2651217. Los cebadores usados fueron

10 5'GGATCCTTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC, (inverso SEC ID NO:45)

[0177] El cebador directo contiene un sitio de restricción Nhel seguido de péptido señal CD33 y un residuo met y uno asp. El cebador inverso contiene un sitio de restricción BamHI. PCR se efectuó en 50 µl de reacción usando 300 ng de molde, 200 µM dNTP de mezcla, enzima de clonación Easy-A de alta fidelidad PCR y tampón de Stratagene #600400.

15 Un único paso de desnaturalización a 94 C/2 min fue seguido de 15 ciclos como dado: 94°C/30 seg; 68°C/30 seg; 72°C/90 seg, finalizando con 72°C/10 min. El producto PCR fue separado en un 1 % agarosa con EtBr, purificado con kit GFX de Amersham Biosciences #27-9602-01 y clonado en pCR4-TOPO (Invitrogen) y secuenciado.

[0178] mFc fue insertado en pcDNA3.1 o pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen) usando los sitios de restricción Nhel y BamHI.

20 hCD94 fue insertado en pcDNA3.1 con mFc usando BamHI y NotI (pBF5) y hNKG2A fue insertado en pcDNA3.1/Hygro de la misma manera (pBF6). Ver las figuras 9 e 10.

pBF6 codifica la siguiente (SEC ID NO:31):

25 [0179]

pBF5 codifica la siguiente (SEC ID nº: 32): [0180]

35 Ejemplo 5: Construcciones de porción Fc mutadas para expresión de célula mamífera

[0181] Mutaciones en la parte mFc fueron conseguidas usando mutagénesis Quikchange en las construcciones en el ejemplo 3. La única mutación (hecho como T243Y, Y284T en la SEC ID nº: 21 [IGHG1_MOUSE; IgG1] correspondiente

a T249Y, Y290T en la SEC ID nº: 14 [GCAA_MOUSE; IgG2A]) fue llevado a cabo usando el kit de mutagénesis dirigida QuikChange II y manual de Stratagene #200523 y low siguiente 2 conjuntos de cebadores:

5' GGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGTACTGCATGATAACAGACTTC (SEC ID nº: 46)

5 5' GAAGTCTGTTATCATGCAGTACAGACTGACTTTATCCTTGGCC (SEC ID nº: 47) y 5' CAGATGGCTCTTACTTCGTCACCAGCAAGCTCAATGTGCAGAAG (SEC ID nº: 48) 5' CTTCTGCACATTGAGCTTGCTGGTGACGAAGTAAGAGCCATCTG (SEC ID nº: 49).

10 [0182] Un único paso de desnaturalización a 95°C/30 seg fue seguido de 15 ciclos como dado: 95°C/30 seg; 55°C/1 min; 68°C/7 min., finalizando con 72°C/10 min.

[0183] Las mutaciones dobles (K292D y E239K en un péptido Fc, K332E y D282K en el otro péptido Fc) fueron llevados a cabo usando el kit de mutagénesis dirigida QuickChange y manual (stratagene) #200513 y los conjuntos de cebadores 15 siguientes:

E239K: CCATTCCACCTCCCAAGAAGCAGATGGCCAAGG (SEC ID nº: 50) K292D: GCTCTTACTTCGTCTACAGCGACCTCAATGTGCAGAAGAGCAAC (SEC ID nº: 51), y D282K: GAACACTCAGCCCATCATGAAGACAGATGGCTCTTACTTCG (SEC ID nº: 52)

20 K322E: CCACCATACTGAGGAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGG (SEC ID nº: 53).

[0184] Un único paso de desnaturalización a 95°C/1 min fue seguido de 30 ciclos como dado: 95°C/1 min; 55°C/1 min; 65°C/13.5 min.

25 Ejemplo 6: NKG2A-CD94 monocatenario para la expresión en células mamíferas

[0185] NKG2A-2xGGS-CD94 fue clonado en pcDNA3.1/Hygro con mFc en el sitio de BamHI/NotI (pBF17). Ver la Figura

11.

30 pBF17 codifica la siguiente (SEC ID NO:39):

[0186]

Ejemplo 7: Expresión en células mamíferas

[0187] Todas las construcciones en los ejemplos 2-5 fueron expresadas transitorios en células HEK293 usando 293fectin #12347-019 de Invitrogen para transfección. 5 x 105 células/ml fueron sembradas en un 125 ml matraz Erlen

40 Meyer. El día siguiente, las células fueron modificadas de la siguiente manera: 30 µg de ADN fue diluido en 1 ml de Opti-Mem y 40 µl de 293fectin fue diluido en 960 µl de Opti-Mem. Después de 5 min. a temperatura ambiente (RT), las dos mezclas fueron mezcladas e incubadas 25 min. a RT antes de la adición al cultivo celular. Medios fueron recogidos 4-6 días más tarde por centrifugado a 1500 x g durante 15 min. Los resultados fueron visualizados por análisis de transferencia western, donde todas las manchas fueron evaluadas con cabra-anti-ratón-IgG.

45 [0188] Resultados ejemplares de análisis de transferencia western se muestran en las Figuras 12A-12C. Todas las manchas fueron evaluadas con cabra-anti-ratón-IgG. mFc-CD94 y mFc-NKG2A fueron expresados individualmente en HEK293. MFc-NKG2A no fue expresado en ausencia de mFc-CD94. mFc-monocatenario-NKG2A-CD94 fue expresado en HEK293.

Ejemplo 8: Purificación de heterodímeros CD94-mFc/NKG2A-mFc producidos en líneas celulares mamíferas

[0189] Seis variantes diferentes de proteínas de fusión CD94-mFc y NKG2A-mFc fueron purificadas de sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad de proteína A. Las proteínas de fusión fueron CD94-mFc homodímero, CD94-2xGGS-NKG2A-mFc, NKG2A-mFc, CD94-mFc(T249Y) NKG2A-mFc(Y290T), CD94-mFc NKG2A-mFc, CD94mFc(E239K, K292D) NKG2A-mFc(D282K, K332E). Proteínas de fusión CD94/NKG2A-ratón Fc fueron producidas usando medio sin suero. Proteína de fusión CD94/NKG2A-ratón Fc fue expresada de células CHO-DUKX B11.

[0190] Purificación de proteínas de fusión CD94/NKG2A-ratón Fc fue realizada de la siguiente manera. Sobrenadantes de cultivo celular fueron filtrados estériles y aplicados a 10 ml de columna de sefarosa de proteína A (Sigma, St. Louis, Mo) embalados en una columna XK16 (GE-Healthcare, Hillerød, Dinamarca) usando un sistema FPLC de explorador AKTA (GE-Healthcare, Hillerød, Dinamarca). La columna de proteína A fue equilibrada en 20 mM de Tris pH 7,5 en 6 ml/min. Después de aplicación de muestra, la columna fue lavada hasta que absorbancia UV a 280 nm fue baja. Las proteínas unidas fueron eluidas usando un gradiente de paso de 0 a 100% 50 mM de glicina pH 2,7 y 2 ml de fracciones fueron recogidas. Fracciones con las proteínas de interés fueron agrupadas y valoradas a pH neutro. En algunos casos las proteínas agrupadas fueron concentradas usando un Vivaspin 20, 30.000 MWCO (Sartorius, Roskilde, Dinamarca) y tampón cambiado en tampón PBS. Concentraciones de proteína fueron determinadas por OD280 con un coeficiente de

-

1

extensión de (1,5 g/l)-1cm .

[0191] Las proteínas purificadas fueron analizadas por 1-d SDS-PAGE en 4-12% de geles NuPage (InVitrogen, Carlsbad, CA) ejecutados en tampón MOPS. Geles 1-d fueron manchados usando coloración Gelcode coomassie (Pierce, Rockford, IL) o transferido sobre membranas VDF (InVitrogen, Carlsbad, CA).

[0192] Los anticuerpos Z199 (anti-NKG2A, Beckman Coulter, Fullerton, CA) y HP-3D9 (anti-CD59, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) fueron preparados para transferencia western por etiquetado con Cy3 y Cy5 usando kits de etiquetado de proteína Cy-dye (GE-Healthcare, Hillerød, Dinamarca). Después de transferencia, las membranas fueron bloqueadas en 5% de blotto (Pierce, Rockford, IL) e incubadas con ambos anticuerpos diluidos 1:200 en el tampón de lavado. Después de lavado, las manchas fueron escaneadas en bien un escáner Ettan Dige Imager o un Typhoon Trio+ (GE-Healthcare, Hillerød, Dinamarca) usando los ajustes para los dos fluoróforos diferentes.

Resultados

[0193] Proteínas purificadas de 330-350 ml de sobrenadante del cultivo sin suero de células HEK293 produjeron 0, 8 a 1, 7 mg de proteína. Ver la tabla 3. Las cantidades de proteína más grandes fueron purificadas a partir de células que expresan los dos plásmidos con una única mutación en la región constante de inmunoglobulina de murina. Análisis de las proteínas purificadas por 1-d SDS PAGE mostró que la purificación dio bastante proteínas puras sin contaminantes obvios presentes. La banda principal correspondió a formación de dímero de las proteínas, mientras que unas especies de peso molecular más alto correspondieron a formación de tetrámero.

Tabla 3

Proteínas purificadas de suero sin expresión en células en células “estilo libre” HEK293

Proteína

Construcciones de plásmido Cantidad (mg)

CD94-mFc homodímero

pBF5 0,37

CD94-2xGGS-NKG2A-mFc

pBF17 0,18

NKG2A-mFc

pBF6 0,27

CD94-mFc T249Y NKG2A-mFc Y290T

pBF19 and pBF20 1,7

CD94-mFc NKG2A-mFc

pBF5 and pBF6 0,88

CD94-mFc E239K, K292D NKG2A-mFc D282K, K332E

pBF21 and pBF22 0,08

[0194] Para averiguar que las proteínas purificadas fueron de combinaciones de ambos NKG2A y CD94, una transferencia western se hizo, donde los dos anticuerpos Z199 y HP-3D9 (contra CD94 y NKG2A respectivamente) fueron usados. Los anticuerpos fueron marcados con tintes de fluorescencia, haciendo posible usar ambos anticuerpos en una única transferencia (figuras 13A y B). De las dos detecciones diferentes de la transferencia, fue evidente que la expresión de líneas celulares CD94-mFc solo produjeron esta proteína. Ninguna proteína podría ser observada donde el homodímero NKG2A debería estar, mostrando que esta proteína no produce homodímeros. En todas las otras columnas, bandas podrían ser observadas correspondientes a la presencia de ambos NKG2A y CD94, mostrando que heterodímeros reales han sido producidos.

[0195] Una línea de célula CHO estable (CHO-DUKX B11) expresando las construcciones CD94-2xGGS-NKG2A-mFc monocatenarias fue usada para producir proteína para análisis Biacore. 215 ml de sobrenadante de cultivo celular fue purificado en la columna de proteína A y tampón cambiado en PBS. La proteína resultante fue analizada por 1-D SDS PAGE y transferencia western que usa los dos anticuerpos Z199 y HP-3D9 marcados con tintes de fluorescencia

5 (figuras 14A y B). El gel 1-D al igual que la transferencia western mostró que la proteína monocatenaria apareció como un dímero y respuestas dadas para ambos anticuerpos anti-CD94 y anti-NKG2A.

Ejemplo 9: Construcción de plásmido NKG2A para la expresión en E. coli

10 [0196] NKG2A fue subclonado BamHI bgIII i BamHI + defosforilado (usando fosfatasa de intestino de ternero) en TrxhexaHis pET32a para producir pISNN415, codificando la secuencia siguiente (SEC ID nº: 54) (figura 15):

15 Ejemplo 10: Expresión de dominio extracelular NKG2A en E. coli

[0197] El dominio extracelular NKG2A humano (residuos 99-233 de SEC ID nº: 1) fue expresado en E. coli. NKG2A fue fundido N-terminalmente a tiorredoxina (Trx) y etiqueta hexaHis. El peso molecular previsto fue 33 kDa. Trx y hexaHis pueden quitados proteolíticamente usando enteropeptidasa. Trx-NKG2A fue expresado a aproximadamente 10 mg/L en

20 500 mL de cultivos a escala de laboratorio (Figura 16).

Ejemplo 11: Construcción de plásmido CD94 para la expresión en E. coli

[0198] CD94 fue subclonado BamHI bgIII en el BamHI + defosforilado (usando fosfatasa de intestino de ternero) 25 hexaHis-GST XPNNB pET15b para producir pISNN427, codificando la secuencia siguiente (SEC ID nº: 55) (figura 17):

[0199] El dominio extracelular CD94 humano (residuos 34-179 de SEC ID nº: 2) fue expresado en E. coli. CD94 fue fundido N-terminalmente a hexaHis y glutationa-S-transferasa (GST). El peso molecular previsto fue 46 kDa. HexaHis

35 GST se puede quitar por escisión con trombina. El nivel de expresión de GST-CD94 fue aproximadamente 50 mg/L en 500 mL de cultivos da escala de laboratorio. Expresión se obtuvo a 30°C. Las proteínas de fusión fueron expresadas en una forma insoluble. Varios métodos de lisis fueron seleccionados en este experimento particular (ciclos de congelar-descongelar (fz) usando TEN (tris, EDTA, NaCl), o lisis a base de detergente usando BugBuster (Novagen) o PopCulture (Novagen)) (Figura 18).

40 Ejemplo 13: Clonación de construcciones de expresión NKG2A-CD94 o CD94-NKG2A monocatenarias; dos estrategias

[0200] Los cebadores usados fueron:

45 2 x GGS -arriba: AGCTTGGCGGTAGCGGCGGTAGCA (SEC ID nº: 56) 2 x GGS abajo: GATCTGCTACCGCCGCTACCGCCA (SEC ID nº: 57) 2 x GGS inserción abajo: GTTGTGCCTCTGGCTACCGCCGCTACCGCCAATGAGCTGTTGC (SEC ID nº: 58)

50 [0201] NKG2A-2xGGS-CD94. Primero, el NKG2A 3' final fue alterado en pBluescript-SK(-). Los oligos anillados (' 2xGGS -arriba' y ' 2xGGS abajo') al mismo tiempo se añadió un enlazador hidrofílico y se quitó codones de terminación

del clon original fue clonado HindIII bgIII en NKG2A-pBluescript-SK(-) (pISNN425) (Figura 19A). Segundo, CD94 fue insertado BamHl-Notl en el enlazador NKG2A-2xGGS pBluescript-SK(-) NotI de BglII restringido (Figura 19B). Clones correctos fueron identificados por restricción de digestión y secuenciación usando de T7 og T3 cebadores.

5 [0202] NKG2A-2xGGS-CD94 (NKG2A-2xGGS-CD94-pBluescript-SK(-)) fue subclonado BglII de BamHI en el BamHI restringido y + defosforilado (usando fosfatasa de intestino de ternero) hexaHis-GST XPNNB pET15b o BglII de BamHI i BamHI + defosforilado Trx-hexaHis pET32a (Figura 20).

[0203] CD94-2xGGS-NKG2A. En otro método, CD94 está insertado BamHI-BglII en BamHI restringido y defosforilado

10 NKG2A pBluescript-SK(-) (pISNN425). Un enlazador (2 x GGS inserción abajo) que al mismo tiempo retira un codón de terminación y añade un enlazador hidrofílico se inserta por mutagénesis dirigida. El cebador es 5-fosforilado y el 'kit Quick-change multi site-directed mutagenesis' (comprado de Stratagene) se usa. T7 y T3 cebadores se usan para verificación de secuencia. Heterodímeros CD94-2xGGS-NKG2A son subclonados BamHI-BglII i BamHI + defosforilado hexaHisGST XPNNB pET15b og BglII de BamHI i BamHI + defosforilado Trx-hexaHis pET32a. Ver figuras las 21 y 22.

15 [0204] Las construcciones son expresadas en BL21 (DE3).

[0205] La secuencia de aminoácidos para hexaHis-GST NKG2A-2xGGS-CD94 es (SEC ID nº: 37):

[0206] La secuencia de aminoácidos para x-hexaHis-NKG2A-2xGGS-CD94 es (SEC ID nº: 38):

[0207] Partes extracelulares NKG2A humano (residuos 99-233 de SEC ID NO:1) y CD94 humano (residuos 34-179 de SEC ID NO:2), separadas por un enlazador Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser, fueron expresadas como una fusión 30 monocatenaria en la cepa de E. coli BL21 (DE3). Dos construcciones de fusión NKG2A-CD94 diferentes fueron expresadas llevando respectivamente tiorredoxina (Trx) y etiqueta hexaHis o hexaHis y glutationa-S-transferasa (GST) en sus N-terminales. Trx-hexaHis-NKG2A-2xGGS-CD94 fue expresado a aproximadamente 100 mg/L en 500 mL de cultivos a escala de laboratorio. El nivel de expresión de hexaHis-GST-NKG2A-2xGGS-CD94 fue aproximadamente 70 mg/L en 500 mL de cultivos a escala de laboratorio. Trx-hexaHis puede ser quitado proteolíticamente usando

35 enteropeptidasa, hexaHis-GST se puede quitar por escisión con trombina. Expresión se obtuvo a 37°C. Las proteínas de fusión fueron expresadas altamente en las fracciones de granulado insolubles (p) (Figura 23).

Ejemplo 15: Expresión de construcciones monocatenarias TRX-His-tag-NKG2A-GGSGGS-CD94 en E. coli

40 [0208] Células aisladas de 250 ml de fermentación fueron lavadas una vez con 50 mM de Tris pH 8, 200 mM de NaCl, 5 mM de EDTA. El granulado obtenido fue resuspendido en 50 mM de Tris pH 8, 200 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 10 p/v% de sacarosa, 5 mM de DTT, 5 mM de benzamidina y lisado en una prensa francesa. Los cuerpos de inclusión insolubles fueron recogidos por centrifugado, lavados y disueltos en 6M de guadini-umhidrocloruro, 100 mM de Tris pH 8, 40 mM de DTT.

[0209] La proteína solubilizada fue diluida en 20 ml de tampón de replegamiento 50 mM de Tris pH 8,2, 750 mM de arginina, 10 mM de NaCl, 0,5 mM de KCI, 0,5 g/L de PEG3350, 2mM de MgCl2, 2mM de CaCl2, 4 mM de cistina, 1,5 mM de DTT. La mezcla de replegamiento se dejó a 5°C durante la noche.

5 [0210] La proteína replegada fue diluida 5 veces con 10 mM de Tris pH 8 y purificada por aplicación a un 5 ml columna de flujo rápido de Q sefarosa. Después de lavado con 2 Cv 10 mM de Tris pH 8, 50 mM de NaCl, la proteína fue eluida por un gradiente lineal sobre 10 CV a 10 mM de Tris pH 8, 2 M de NaCl.

Ejemplo 16: TRX-His-tag-NKG2A-GGSGGS-CD94

10 [0211] Las células aisladas de 1 L de fermentación fueron lavadas una vez con 50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA. El granulado obtenido fue resuspendido en 50 mM de Tris pH 8, 200 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 10 p/v% de sacarosa, 5 mM de DTT, 5 mM de benzamidina y lisado en una prensa francesa. Los cuerpos de inclusión insolubles fueron recogidos por centrifugado, lavados y disueltos en 6M de clorhidrato de guanidina, 100 mM de Tris pH 8, 40 mM

15 de DTT.

[0212] La proteína solubilizada fue diluida en 100 ml de tampón de replegamiento 50 mM deTris pH 8,2, 750 mM de arginina, 10 mM de NaCl, 0,5 mM de KCI, 0,5 g/L de PEG3350, 2mM de MgCl2, 2mM de CaCl2, 4 mM de cistina, 1,5 mM de DTT. La mezcla de replegamiento se dejó a 5 ° C durante la noche.

20 [0213] La proteína replegada fue diluida 5 veces con 10 mM de Tris pH 8 y purificada por aplicación a un 5 ml de columna de flujo rápido de Q sefarosa. Después de lavado con 2 Cv 10 mM de Tris pH 8, 50 mM de NaCl, la proteína fue eluida por un gradiente lineal sobre 10 CV a 10 mM de Tris pH 8, 2 M de NaCl.

25 Ejemplo 17: His-tag-GST-NKG2a-GGSGGS-CD94

[0214] Células aisladas de 1 L de fermentación se lavan una vez con 50 mM de Tris pH 8, 200 mM de NaCl, 5 mM de EDTA. El granulado obtenido se resuspende en 50 mM de Tris pH 8, 200 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 10 p/v% de sacarosa, 5 mM de DTT, 5 mM de benzamidina y lisado en una prensa francesa. Los cuerpos de inclusión insolubles

30 son recogidos por centrifugado, lavados y disueltos en 6M de chorhidrato de guanidina, 100 mM de Tris pH 8, 40 mM de DTT.

[0215] La proteína solubilizada se diluye en 20 ml de tampón de replegamiento 50 mM de Tris pH 8,2, 750 de mM arginina, 10 mM de NaCl, 0,5 mM de KCI, 0,5 g/L de PEG3350, 2mM de MgCl2, 2mM de CaCl2, 4 mM de cistina, 1,5 35 mM de DTT. La mezcla de replegamiento se deja a 5°C durante la noche.

[0216] La proteína replegada es diluida 5 veces con 10 mM de Tris pH 8 y se purifica por aplicación a una columna de flujo rápido de Q sefarosa 5 ml. Después de lavado con 2 Cv 10 mM de Tris pH 8, 50 mM de NaCl, la proteína se eluye por un gradiente lineal sobre 10 CV a 10 mM de Tris pH 8, 2 M de NaCl.

Ejemplo 18: Caracterización de construcciones CD94/NKG2A recombinantes por análisis de resonancia de plasmón de superficie

[0217] Las siguientes construcciones fueron analizadas para unión a los anticuerpos inmovilizados HP-3D9; Z199 y anti45 ratón de conejo (RaM), con unión posterior a tetrámero HLA-E:

Homo dímero CD94-mFc Monocatenario CD94-NKG2A-mFc Homo dímero NKG2A-mFc

50 Heterodímero CD94-mFc/NKG2A con mutación única Heterodímero CD94-mFc/NKG2A Heterodímero CD94-mFc/NKG2A con mutación doble.

Materiales

55 [0218] Estudios de resonancia de plasmón de superficie fueron realizados en un instrumento Biacore3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Inmovilización de ligandos fueron realizados en un chip de sensor CM5 (Biacore AB), usando un equipo de acoplamiento de amina estándar como se describe por la producción (Biacore AB).

60 [0219] Tampón HBS-EP (10 mM de HEPES, 150mM de NaCl, 3mM de EDTA, 0,005% d Polisorbato 20 (v/v)) fue usado como tampón de desplazamiento y para todas las diluciones. Regeneración del chip de sensor fue realizado por una pulsación corta (15 ul, flujo 30 ul/min) de 10 mM de glicina-HCl pH 1,8.

[0220] Todos los experimentos fueron realizados a velocidad de flujo 10 ul/min. a 25°C. Los datos fueron analizados 65 usando el software Biaevaluation 4.1.

[0221] Anticuerpo anti-CD94 HP-3D9 monoclonal (BD Pharmingen, cat# 555887), anticuerpo anti-CD94/NKG2A Z199 monoclonal (Immunotech, Francia) y anticuerpo anti-ratón de conejo (RaM) policlonal (Biacore AB), fueron inmovilizados por acoplamiento de amina a un nivel de ∼5000 RU en las células de flujo individuales en un chip de sensor CM5.

5 Unión de construcciones CD94/NKG2A a anticuerpos anti-CD94 y anti-CD94/NKG2A monoclonales y competición en la unión de tetrámero HLA-E

[0222] Todas las construcciones fueron diluidas a 1 ug/ml en HBS-EP. Tetrámero HLA-E fue evaluado en 5 ug/ml conc. Cada ciclo consistió en inyección inicial de una construcción dado, seguido de inyección de tetrámero HLA-E.

10 Construcción y tetrámero HLA-E fueron inyectados durante 3 min., cada uno seguido de una fase de 2.5 min. de disociación, antes de regeneración de la superficie del chip de sensor.

[0223] Todas las construcciones fueron evaluadas mientras se almacenaron a 4°C y a -20°C.

15 [0224] Todas las construcciones, excepto homodímero NKG2A-mFc, demostraron unión a HP-3D9 inmovilizado. Unión de las construcciones individuales a HP-3D9 pareció no ser afectada por las condiciones de almacenamiento, salvo el heterodímero CD94 mFc/NKG2A con construcción de mutación única, donde una reducción aparente en la constante de asociación podría ser detectada para la construcción almacenada a -20°C. No obstante la construcción se unió inmovilizada HP-3D9.

20 [0225] La constante de disociación aparente del heterodímero CD94-mFc/NKG2A con construcción de mutación doble fue más alta en comparación con las otras construcciones que demostraron modelos de disociación idénticos aparentes. Todas las construcciones, excepto el heterodímero CD94-mFc/NKG2A con mutación doble, demostraron unión estable durante la fase de 2,5 min. de disociación.

25 [0226] Ninguna unión de tetrámero HLA-E a cualquiera de las construcciones individuales en el complejo con HP-3D9 fue detectada.

[0227] Unión a Z199 inmovilizado fue observada para el CD94-NKG2A-mFc monocatenario, heterodímero CD94

30 mFc/NKG2A y heterodímero CD94-mFc/NKG2A con construcciones de mutación doble sin tener en cuenta las condiciones de almacenamiento. También, unión del heterodímero CD94-mFc/NKG2A con construcción de mutación única almacenada a 4°C fue detectada, mientras la misma construcción almacenada a -20°C no demostró ninguna unión. Aunque unión del heterodímero CD94-mFc/NKG2A y heterodímero CD94-mFc/NKG2A con construcciones de mutación única fue detectada, su asociación a inmovilizado Z199 pareció reducida en comparación con aquel del CD94

35 NKG2A-mFc monocatenario y heterodímero CD94-mFc/NKG2A con construcciones de mutación doble.

[0228] Mientras la unión del CD94-NKG2A-mFc monocatenario, heterodímero CD94-mFc/NKG2A y heterodímero CD94mFc/NKG2A con mutación única (4°C almacenamiento) parece estable durante la fase de 2,5 min. de disociación, disociación de heterodímero CD94-mFc/NKG2A con mutación doble fue suficientemente rápida.

40 [0229] Unión de tetrámero HLA-E a una construcción en complejo con Z199, fue detectada para la construcción CD94NKG2A-mFc monocatenaria. La unión de tetrámero HLA-E pareció estable durante el periodo de 2,5 min. de disociación.

45 [0230] Todas las construcciones, excepto homo dímero NKG2A-mFc, se unieron con RaM inmovilizado. Nuevamente, la asociación del heterodímero CD94-mFc/NKG2A con construcción de mutación única almacenada a -20°C pareció reducida en comparación con la mismo construcción almacenada a 4°C.

[0231] Unión de tetrámero HLA-E a complejos entre RaM y las construcciones individuales se observó para todas las

50 construcciones, salvo el homodímero NKG2A-mFc. Las cantidades más altas relativas de tetrámero HLA-E unido, fueron detectadas para el CD94-NKG2A-mFc monocatenario y heterodímero CD94-mFc/NKG2A con complejos de mutación doble.

Ejemplo 19: Unión de TRX-His-tag-NKG2a-GSS-GSS-CD94-His-Tag/pET32a a anticuerpos anti-CD94 y anti55 CD94/NKG2A monoclonales

[0232] THX-His-tag-NKG2a-GSS-GSS-CD94-His-Tag/pET32a expresado en E.Coli fue analizado para unión a anticuerpos HP-3D9 y Z199 monoclonales inmovilizados (véase ejemplo 18). Dos preparaciones diferentes preparadas a pH 6,0, 7,0 y 8,0 respectivamente, fueron evaluadas; una obtenida de un 250 ml de fermentación (B3), y un de un 1 L

60 de fermentación (B12) (ver ejemplos 15 y 16).

[0233] Las preparaciones a partir de 250 ml de fermentación fueron evaluadas en dilución 1:10 en HBS-EP, e inyectadas durante 3 min., seguido de 2,5 min. de disociación. Las preparaciones unidas a ambos HP-3D9 inmovilizado y Z199 inmovilizado, con cantidades más altas unidas a HP-3D9 inmovilizado (Figura 24).

[0234] Las preparaciones a partir de 1L de fermentación fueron diluidas a 10 ug/ml e inyectadas durante 3 min., seguido de 2,5 min. de disociación. Esta unión también demostró unión a ambos HP-3D9 y Z199 inmovilizados (Figura 24).

Ejemplo 20: Diseño y producción de construcciones de expresión mFc-hNKG2C-hCD94

[0235] NKG2C soluble humano fue ordenado de Geneart, Regensburg, Alemania. La secuencia fue ordenada con un 5' sitio de restricción de BamHI y un 3' sitio de restricción HindlII para fácilmente reemplazar hNKG2A de pBF17 dando como resultado pBF74 (NKG2C/CD94-Fc) (SEC ID nº: 59):

[0236] La construcción comprende el péptido de señal CD33 (SEC ID nº: 30), una porción Fc 227 (Bisagra-CH2-CH3)

15 (SEC ID nº: 21), enlazador (GS), residuos 96-231 de hNKG2C (SEC ID nº: 3), un separador GGSGGSRS y residuos 34 a 180 de hCD94 (SEC ID nº: 2).

Construcciones de porción NKG2A mutadas para expresión de célula mamífera

20 [0237] Las secuencias de aminoácidos de las partes solubles de NKG2C y NKG2A usadas en las construcciones monocatenarias solo difieren en los residuos 99, 100, 101, 106, 167, 168, 170, 189 y 197, usando la numeración del alineamiento en la figura 25. Note que las secuencias usadas en las construcciones monocatenarias comienza en la posición 98 para NKG2C (FLEQ .......) y a 99 para NKG2A (QRH .......) según el esquema de numeración anterior.

25 [0238] Una serie construcciones CD94/NKG2C monocatenarias fueron desarrolladas basadas en la construcción monocatenaria (Sig)-(mFc)-GS-(NKG2A)-GGS-GGS-RSS-(CD94) (SEC ID nº: 39). Esta construcción comprende residuos 34 a 180 de hCD94 (SEC ID nº: 2), residuos 99-233 de hNKG2A (SEC ID nº:1), un separador GGSGGSRS entre las partes NKG2A y CD94, y una porción Fc 227. La serie fue preparada con mutaciones reiterativas catalogadas en la tabla 4 de debajo:

30 Tabla 4

Mutaciones reiterativas para convertir ssCD94/NKG2A a construcción ssCD94/NKG2C

Mut1

Q99L, R100E, H101Q, L106P

Mut2

S167A, I168S, S170L

Mut3

M189I

Mut4

E197K

Mut5

I225M

35 [0239] Mutaciones en la parte hNKG2A fueron conseguidas usando mutagénesis de quikchange en la construcción pBF17(SEQ identidad NO:39). Los cebadores usados en la mutagénesis quikchange fueron:

Mut1 LEQ-P; directo (SEC ID nº: 60), inverso (SEC ID nº: 61)

Mut2 AS-L; directo (SEC ID nº: 62), inverso (SEC ID nº: 63)

40 Mut3 I; directo (SEC ID nº: 64), inverso (SEC ID nº: 65) Mut4 K; directo (SEC ID nº: 66), inverso (SEC ID nº: 67) Mut5 M; directo (SEC ID nº: 68); inverso (SEC ID nº: 69)

[0240] Estas mutaciones fueron llevadas a cabo usando kit de mutagénesis dirigida Quikchange II y manual de Stratagene #200523: Un único paso de desnaturalización 95°C/30 seg fue seguido de 15 ciclos como dado: 95°C/30 seg; 55°C/1 min; 68°C/7 min., finalizando con 72°C/10 min.

Ejemplo 21: Estudio SPR de unión de anticuerpos anti-NKG2A o -NKG2C a proteínas recombinantes scCD94/NKG2C o scCD94/NKG2A

Materiales y métodos

[0241] Mediciones de resonancia de plasmón de superficie (SPR) fueron realizadas en un aparato Biacore T100 (Biacore GE Healtcare) a 25°C. En todos los experimentos Biacore HBS-EP+ tampón (Biacore GE Healtcare) sirvió como tampón de desplazamiento y sensogramas fueron analizados con softwares de evaluación de Biaevaluation 4.1 y Biacore T100. Los anticuerpos usados fueron anti-NKG2A (humZ270 y Z199), anti-NKG2C (Immunotech-Beckman Coulter), y anti-NKG2D (ON72).

Inmovilización de proteína

[0242] Proteínas recombinantes fueron inmovilizadas de manera covalente a grupos carboxilo en el estrato de dextrano en un Sensor Chip CM5 (chip). La superficie del chip fue activada con EDC/NHS (N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) carbodiimidehidrocloruro y N-hidroxisuccinimida (Biacore GE Healthcare)). Proteínas fueron diluidas a 10 µg/ml en el tampón de acoplamiento (10 mM de acetato, pH 5,6) e inyectadas hasta que el nivel de inmovilización apropiado fue alcanzado (es decir, 700, 630 y 400 RU durante 2A, 2C y 2D respectivamente).

[0243] Desactivación de los grupos activados fue realizada usando 100 mM de etanolamina pH 8 (Biacore GE Healthcare).

Estudio de unión

[0244] Para experimentos de unión simples, anticuerpos fueron inyectados a una concentración constante de 10 µg/ml durante 1 minuto a una velocidad de flujo de 10 µl/min sobre los chips de proteína recombinantes scCD94/NKG2A, scCD94/NKG2C y NKG2D-Fc. Después de cada ciclo, los chips fueron regenerados por una inyección de ocho segundos de tampón 500 mM de NaCl y 10 mM de NaOH a velocidad de flujo de 40 µl/min. Para cada de anticuerpo, los sensogramas obtenidos en los chips de proteína diferentes fueron superpuestos y normalizados a un valor arbitrario de 100 RU para el eje Y.

Medición de afinidad

[0245] Para experimentos cinéticos, diluciones en serie de 0,078 a 5 nanoM de anticuerpos solubles fueron inyectados durante 2 min a una velocidad de flujo constante de 40 µl/min en los estratos de dextrano con proteínas inmovilizadas scCD94/NKG2A recombinantes y se les permitió disociarse durante 3 min antes de regeneración por una inyección de ocho segundos de tampón 500 mM de NaCl y 10 mM de NaOH.

[0246] Los sensogramas resultantes fueron analizados por ajuste global que usa el modelo Langmuir apropiado.

Inhibición de unión de tetrámeros HLA-E

[0247] Para experimentos de inhibición, anticuerpos fueron inyectados a una concentración constante de 10 µg/ml en los estratos de dextrano con proteínas objetivo inmovilizadas scCD94/NKG2A recombinantes. Cada ciclo de competición consistió en tres pasos de inyección de 2 min a una velocidad de flujo constante de 10 µl/min. En primer lugar, el anticuerpo es inyectado dos veces. En segundo lugar, sin eliminación el anticuerpo unido, el tetrámero HLA-E a 8 µg/ml se inyecta y sensogramas y RU valores son monitoreados. Las señales de unión del tetrámero HLA-E en presencia de anticuerpos son en comparación con aquellos obtenidos cuando el tetrámero HLA-E se inyecta directamente en proteínas scCD94/NKG2A desnudas recombinantes. El porcentaje de inhibición (I%) fue determinado de valores RU obtenidos 10 segundos después del final de inyecciones, usando la siguiente fórmula: I% = (1(RU+Ab/RUNuno))*100. RU+Ab y RUNuno son valores RU de unión HLA-E monitoreados respectivamente en presencia y en ausencia de un anticuerpo. Los sensogramas correspondientes a inyección HLA-E (tercer paso) fueron alineados a cero en la inyección salen para ambos eje X e Y y superpuestos.

[0248] Después de cada ciclo, los chips fueron regenerados por una inyección de ocho segundos de tampón 500 mM de NaCl y 10 mM de NaOH a velocidad de flujo de 40 µl/min.

Resultados

[0249] La unión de anticuerpos humZ270 y humZ199 a proteínas NKG2A, NKG2C y NKG2D recombinantes fue analizado por SPR (Figura 26). Ambos anticuerpos unidos al chip scCD94/NKG2A mientras que no se unen al chip scCD94/NKG2C. Proteínas NKG2D-Fc fueron usadas como control negativo.

[0250] El chip scCD94/NKG2C fue controlado usando anti-NKG2C-PE (FAB138P, R&D Systems), inyectado a 2,5 µg/ml durante 1 min sobre el chip NKG2C. Este anticuerpo se une bien a NKG2C nativo expresado en la superficie celular. El anticuerpo unido al chip scCD94/NKG2C, indica la presencia de proteínas inmovilizadas en un estado apropiado que imita la situación de superficie celular. El chip NKG2D-Fc fue controlado usando anticuerpos humON72.

[0251] Para analizar las propiedades aglutinantes de HLA-E, la unión de tetrámeros HLA-E a chips scCD94/NKG2A fue monitoreada en ausencia y en presencia de humZ270. La saturación de chips scCD94/NKG2A usando anticuerpos humZ270 inhibe completamente la unión de tetrámeros HLA-E (IZ270 = 81,8 %).

Aspectos ilustrativos:

[0252]

1.

Un receptor monocatenario soluble CD94/NKG2 comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94.

2.

La construcción monocatenaria de la forma de realización 1, comprendiendo además un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este.

3.

El receptor monocatenario soluble CD94/NKG2 de la forma de realización 2, donde el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se une al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 se une al polipéptido de inmunoglobulina.

4.

El receptor monocatenario soluble CD94/NKG2 de la forma de realización 2, donde el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 se une al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se une al polipéptido de inmunoglobulina.

5.

El receptor monocatenario soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 3 y 4, donde la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se unen por un enlazador peptídico comprendiendo glicina y serina.

6.

Un dímero del receptor monocatenario soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización precedentes.

7.

Un receptor soluble CD94/NKG2 comprendiendo una subunidad NKG2 comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y una subunidad CD94 comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, donde al menos una de la subunidad NKG2 y subunidad CD94 comprende un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de este.

8.

El receptor soluble CD94/NKG2 de la forma de realización 7, donde el polipéptido de inmunoglobulina comprende una parte de un dominio Fc IgG que aumenta la vida media in vivo de la construcción.

9.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de formas de realización 7-8, donde el polipéptido de inmunoglobulina es un dominio Fc funcional.

10.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 7-9, donde el dominio Fc es de un anticuerpo IgG4.

11.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 7-10, donde el dominio Fc es de un anticuerpo IgG1.

12.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 7-11, donde solo una de las subunidades CD94 y NKG2A comprende un polipéptido de inmunoglobulina.

13.

El receptor soluble CD94/NKG2 de la forma de realización 12, donde el polipéptido de inmunoglobulina se une a la parte C-terminal de la subunidad.

14.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 12-13, donde las subunidades CD94 y NKG2A son unidas vía un enlazador peptídico.

15.

El receptor soluble CD94/NKG2 de la forma de realización 13, donde el enlazador peptídico comprende la secuencia GGSGGS (SEC ID NO:6).

16.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 12-15, donde la subunidad NKG2 es unida de manera covalente al polipéptido de inmunoglobulina.

17.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 12-15, donde la subunidad CD94 es unida de manera covalente al polipéptido de inmunoglobulina.

18.

El receptor soluble CD94/NKG2 de la forma de realización 7, donde cada una de las subunidades CD94 y NKG2 es unida de manera covalente a un polipéptido de inmunoglobulina.

19.

El receptor soluble CD94/NKG2 de la forma de realización 18, donde el N-terminal de la subunidad NKG2 se une al C-terminal de un primer polipéptido de inmunoglobulina para formar un primer polipéptido, y el N-terminal de la subunidad CD94 se une al C-terminal de un segundo polipéptido de inmunoglobulina para formar un segundo polipéptido.

20.

El receptor soluble CD94/NKG2 de la forma de realización 19, donde el primer polipéptido de inmunoglobulina comprende una lisina en un residuo correspondiente al residuo 239 y un ácido aspártico en un residuo correspondiente a residuo 292 en un dominio Fc humano IgG1, y el segundo polipéptido de inmunoglobulina comprende una lisina en un residuo correspondiente a residuo 282 y un ácido aspártico en un residuo correspondiente a residuo 322 en un dominio Fc humano IgG1.

21.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 19 y 20, donde el primer polipéptido de inmunoglobulina comprende lisina en residuos correspondientes a los residuos 239 y 240 y un ácido aspártico en un residuo correspondiente al residuo 292 en un dominio Fc humano IgG1, y el segundo polipéptido de inmunoglobulina comprende un ácido glutámico en un residuo correspondiente al residuo 253, una lisina en un residuo correspondiente al residuo 282, y un ácido aspártico en un residuo correspondiente al residuo 322 en un dominio Fc humano IgG1.

22.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 20 y 21, donde los primeros y segundos polipéptidos de inmunoglobulina son variantes de un dominio Fc humano IgG1, el primer polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo sustituciones, correspondientes a K253E, D282K y K322D, y el segundo polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo sustituciones, correspondientes a D239K, E240K y K292D o viceversa.

23.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 20 y 21, donde los primeros y segundos polipéptidos de inmunoglobulina son variantes de un dominio Fc humano IgG4, el primer polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo sustituciones correspondientes a K250E, D279K y K319D, y el segundo polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo sustituciones, correspondientes a E236K, E237K, R289D, o viceversa.

24.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización precedentes, que es CD94/NKG2A.

25.

El receptor soluble CD94/NKG2A de la forma de realización 25, donde la subunidad NKG2A comprende residuos 99-233 de la SEC ID nº: 1.

26.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 1-23, que es CD94/NKG2C.

27.

El receptor soluble CD94/NKG2C de la forma de realización 26, donde la subunidad NKG2C comprende residuos 96-231 de la SEC ID nº: 3.

28.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización precedentes, donde la secuencia de aminoácidos CD94 es la SEC ID nº: 2.

29.

El receptor soluble CD94/NKG2A de la forma de realización 28, donde la subunidad CD94 comprende residuos 35179 de la SEC ID nº: 2.

30.

El receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización precedentes, donde el polipéptido de inmunoglobulina es unido de manera covalente a una secuencia señal.

31.

Un receptor soluble CD94/NKG2A comprendiendo la secuencia de cualquiera de las SEC ID nº: 37-39.

32.

Un receptor soluble CD94/NKG2C comprendiendo la secuencia de la SEC ID nº: 59.

33.

Un ácido nucleico que codifica el receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización precedentes.

34.

Una célula transformada con un vector de expresión comprendiendo el ácido nucleico de la forma de realización 33.

35.

La célula de la forma de realización 34, que es una célula procariota o célula eucariota.

36.

Un método para producir un receptor soluble CD94/NKG2, comprendiendo cultivo la célula de la forma de realización 35 bajo condiciones adecuadas para la expresión del receptor soluble CD94/NKG2.

37.

Una composición farmacéutica comprendiendo una cantidad eficaz del receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 1 a 32 y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente.

38.

Un método para producir un anticuerpo contra un receptor CD94/NKG2, el método comprendiendo:

a.

Inoculación de un animal con un receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 1 a 32, donde el polipéptido suscita una respuesta inmunitaria en el animal para producir el anticuerpos; y

b.

aislamiento del anticuerpo del animal.

39.

Un método para detectar una molécula HLA-E, el método comprendiendo:

a.

contacto de una muestra biológica comprendiendo una célula de expresión HLA-E con un receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 1 a 32 y

b.

detección de unión del receptor soluble CD94/NKG2 a la célula.

40.

Un método para producir un compuesto de unión del antígeno anti-NKG2, el método comprendiendo:

a.

proporción de un compuesto de unión del antígeno que específicamente se une a un polipéptido NKG2;

b.

prueba del compuesto de unión del antígeno para unión a un receptor soluble CD94/NKG2A de cualquiera de las formas de realización 1 a 32;

c.

selección del compuesto de unión del antígeno si se determina que el compuesto de unión del antígeno se une al receptor soluble CD94/NKG2A; y

d.

opcionalmente, producción de una cantidad del compuesto de unión del antígeno seleccionado.

41.

Un método para producir un compuesto de unión del antígeno anti-NKG2, el método comprendiendo:

a.

producción de una cantidad de un compuesto de unión del antígeno que específicamente se une a un polipéptido NKG2;

b.

prueba de una muestra de dicha cantidad de un compuesto de unión del antígeno para unión a un receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 1 a 32;

c.

selección de la cantidad para uso como un medicamento y/o en la producción de un medicamento si se determina que el compuesto de unión del antígeno se une al receptor soluble CD94/NKG2; y

d.

opcionalmente, preparación de la cantidad para administración a un humano, opcionalmente formulación de una cantidad del compuesto de unión del antígeno seleccionado con un portador farmacéuticamente aceptable.

42.

Un método para producir un compuesto de unión del antígeno anti-NKG2, el método comprendiendo:

a.

proporción de una pluralidad de compuestos de unión del antígeno que específicamente se unen con un polipéptido NKG2,

b.

prueba de cada uno de los compuestos de unión del antígeno para unión a un receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las formas de realización 1 a 32;

c.

selección de un compuesto de unión del antígeno si se determina que el compuesto de unión del antígeno se

une a dicho receptor soluble CD94/NKG2; y 36

d.

opcionalmente, hacer que el compuesto de unión del antígeno adecuado para administración humana; y/o

e.

opcionalmente, producción de una cantidad del compuesto de unión del antígeno seleccionado.

43. El método de cualquiera de las formas de realización 40 a 42, donde haciendo el humano de compuesto de unión del antígeno adecuado comprende hacer el compuesto de unión del antígeno humanizado o quimérico.

5 44. El método de cualquiera de las formas de realización 40-43, donde producción de una cantidad de compuesto de unión del antígeno comprende cultivo de una célula que expresa el compuesto de unión del antígeno en un medio adecuado y recuperación el compuesto de unión del antígeno.

45. El método de cualquiera de las formas de realización 40-44, donde el compuesto de unión del antígeno comprende un anticuerpo o un fragmento de unión del antígeno de este.

10 46. El método de cualquiera de las formas de realización 40-45, donde el compuesto de unión del antígeno es un anticuerpo.

47.

El método de cualquiera de las formas de realización 40-46, donde el polipéptido NKG2 es NKG2A.

48.

El método de cualquiera de las formas de realización 40-46, donde el polipéptido NKG2 es NKG2C.

15 LISTADO DE SECUENCIAS

[0253]

<110> Novo Nordisk A/S 20

<120> receptores solubles heterodiméricos y usos de los estos

<130> 7382.000-EP

25 <160> 69

<170> Versión de patentIn 3.3

<210> 1

<211> 233 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 179

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3 10 <211> 231

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3 15

5 <210> 4

<211> 240

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 4

<210> 5

<211> 158

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 6 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> enlazador 15

<400> 6

20 <210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> enlazador

<400> 7

<210> 8

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 105

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 326

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 12

<210> 13

<211> 329

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

<210> 14

<211> 330

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

<210> 15

<211> 335

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

<210> 16

<211> 322

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 16

<210> 17

<211> 336

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

<210> 18

<211> 333

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 18

<210> 19

<211> 329 5 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 19 10

<210> 20

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 324

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 21

<210> 22

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 290

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211>

327 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 227

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 25

<210> 26

<211>

226 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> mutante mFc 10

<400> 26 <210> 27

<211> 227 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> mutante mFc 10

<400> 27 <210> 28

<211> 227 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> mutante mFc 10

<400> 28 <210> 29

<211> 227 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> mutante mFc 10

<400> 29

<210> 30

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia señal

<400> 30

5

<210> 31

<211> 382

<212> PRT

<213> Artificial

10

<220>

<223> proteína de fusión

<400> 31

15

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> proteína de fusión

<400> 32

<210> 33

<211> 393 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> proteína de fusión 10 <400> 33

<210> 34

<211> 382 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> proteína de fusión 10 <400> 34

<210> 35

<211> 393

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> proteína de fusión

<400> 35

<210> 36

<211> 382

5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> proteína de fusión

10

<400> 36

83

<210> 37

<211> 537 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> proteína de fusión 10

<400> 37

<210> 38 5 <211> 454

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> proteína de fusión

<400> 38

<210> 39

<211> 536

<212>

PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> proteína de fusión

<210> 40

<211> 35

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> cebador

<210> 45

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 45 ggatccttta ccaggagagt gggagaggc 29

<210> 46

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 55

<211> 394

<212>

PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> proteína de fusión

<210> 59

<211> 537

<212>

PRT 5 <213> Artificial

10 <400> 39

10 <400> 40

ggatcctctt ttactaaact gagtattgag ccagc

35

5

<210> 41 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 41 gcggccgcag atctattaaa tgagctgttg cttacagata taacg

45

15

<210> 42 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 42 ggatcccaga ggcacaacaa ttcttccctg

30

25

<210> 43 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

35

<400> 43 gcggccgcag atctattaaa gcttatgctt acaatg 36 <210> 44 <211> 80 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

45

<400> 44

<220> <223> cebador

5

<400> 46 ggccaaggat aaagtcagtc tgtactgcat gataacagac ttc 43

<210> 47 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

15

<400> 47 gaagtctgtt atcatgcagt acagactgac tttatccttg gcc 43

<210> 48 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial

25

<220> <223> cebador <400> 48 cagatggctc ttacttcgtc accagcaagc tcaatgtgca gaag 44

<210> 49 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial

35

<220> <223> cebador

<400> 49 cttctgcaca ttgagcttgc tggtgacgaa gtaagagcca tctg

44

<210> 50 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

45

<220> <223> cebador

<400> 50 ccattccacc tcccaagaag cagatggcca agg

33

55

<210> 51 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador

<400> 51 gctcttactt cgtctacagc gacctcaatg tgcagaagag caac

44

65

<210> 52 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

5

<400> 52 gaacactcag cccatcatga agacagatgg ctcttacttc g 41

10

<210> 53 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

15

<400> 53 ccaccatact gaggagagcc tctcccactc tcctgg 36

20

<210> 54 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial

25

<220> <223> proteína de fusión <400> 54

10 <400> 55

5

<210> 56 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

10

<400> 56 agcttggcgg tagcggcggt agca 24

15

<210> 57 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

20

<220> <223> cebador <400> 57 gatctgctac cgccgctacc gcca 24

25

<210> 58 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial

30

<220> <223> cebador

<400> 58 gttgtgcctc tggctaccgc cgctaccgcc aatgagctgt tgc

43

<220>

<223> proteína de fusión

10 <400> 59

5

<210> 60 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial

10

<220> <223> cebador <400> 60 gtaaaggatc cctggagcag aacaattctt cccctaatac aagaactcag 50

15

<210> 61 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial

20

<220> <223> cebador

<400> 61 ctgagttctt gtattagggg aagaattgtt ctgctccagg gatcctttac

50

5

<210> 62 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 62 atgaaatttc tggcttccat tttgccatcc tcatggattg gtgt

44

15

<210> 63 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 63 ccatgaggat ggcaaaatgg aagccagaaa tttcatttct tcttc

45

25

<210> 64 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 64 catcatccat gggtgacaat aaatggtttg gctttcaaac atgag

45

35

<210> 65 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

45

<400> 65 ctcatgtttg aaagccaaac catttattgt cacccatgga tgatg <210> 66 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial

45

<220> <223> cebador

55

<400> 66 ggctttcaaa cataaaataa aagactcaga taatgctgaa cttaactgtg c 51

<210> 67 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

65

<400> 67 ctgagtcttt tattttatgt ttgaaagcca aaccattcat tgtcacccat g 51

5

<210> 68 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

10

<400> 68 gcccagtgtg gatcttcaat gatatatcat tgtaagcata agcttggcgg 50

15

<210> 69 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial

20

<220> <223> cebador <400> 69 ccgccaagct tatgcttaca atgatatatc attgaagatc cacactgggc 50

25

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 comprendiendo una parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y una parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94.

2. 2.

   Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 según la reivindicación 1, comprendiendo además un polipéptido de inmunoglobulina comprendiendo todo o parte de un dominio Fc o variante de éste.

3. 3.

   Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 según la reivindicación 2, donde el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se une al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 se une al polipéptido de inmunoglobulina.

4. 4.

   Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 según la reivindicación 2, donde el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 se une al N-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94, y el C-terminal de la parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se une al polipéptido de inmunoglobulina.

5. 5.

   Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, donde la parte soluble de una secuencia de aminoácidos NKG2 y parte soluble de una secuencia de aminoácidos CD94 se unen por un enlazador peptídico comprendiendo glicina y serina.

6. 6.

   Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un receptor CD94/NKG2A, CD94/NKG2B, CD94/NKG2C, CD94/NKG2E, o CD94/NKG2F.

7. 7.

   Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 según la reivindicación 6, que es CD94/NKG2A.

8. 8.

   Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2A según la reivindicación 7, comprendiendo los residuos 99-233 de la SEC ID nº: 1.

9. 9.

   Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 según la reivindicación 6, que es CD94/NKG2C.

10. 10.

    Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2C según la reivindicación 9, comprendiendo los residuos 96-231 de la SEC ID nº: 3.

11. 11.

    Proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo los residuos 35-179 de la SEC ID nº: 2.

12. 12.

    Proteína de fusión receptora soluble CD94/NKG2A comprendiendo la secuencia de cualquiera de las SEC ID nº: 37

13. 39.

14. 13.

    Dímero de la proteína de fusión receptora monocatenaria soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

15. 14.

    Método para producción de una proteína de fusión receptora soluble CD94/NKG2, comprendiendo cultivo de una célula comprendiendo un ácido nucleico que codifica el receptor soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes bajo condiciones adecuadas para expresión del receptor soluble CD94/NKG2.

16. 15.

    Composición farmacéutica comprendiendo una cantidad eficaz de la proteína de fusión receptora soluble CD94/NKG2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente.