JP2009541274A - 可溶性ヘテロ二量体レセプター及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
レセプターのCD94/NKG2ファミリーは、活性化又は阻害可能性を有するヘテロ二量体レセプターメンバーからなる。これらのレセプターは、NK細胞及びCD8+T細胞のサブセットにおいて主として発現され、それらが、感染及び発癌性細胞に対する応答の調節に重要な役割を担っていることが示されている。CD94/NKG2レセプターに対する主要なリガンドはHLA-Eである。Houchinsらの米国特許第6262244号にはヒトNKG2A配列(配列番号1)が記載され、Changら(Eur J Immunol. 1995;25:2433-7)はヒトCD94配列(配列番号2)について報告している。
しかしながら、診断又は治療用途のためのヘテロ二量体レセプター、例えばCD94/NKG2の可溶型、及び安定な可溶性ヘテロ二量体レセプターの効果的な製造方法は、今だ必要とされている。本発明は、当該分野におけるこれら及び他の必要性に取り組むものである。
また本発明は、このような可溶性コンストラクトの種々の作製方法、並びに本発明の可溶性コンストラクトの種々の用途を提供する。例示的な一用途は、生物学的試料中の天然リガンド(例えば、HLA-E)の検出にある。
これら及び他の態様は、以下においてまた図においてさらに詳細に記載する。
「レセプター」なる用語は、生物活性分子(すなわちリガンド)に結合し、細胞におけるリガンドの効果を調節する細胞-会合性タンパク質を示す。膜結合性レセプターは、典型的にはシグナル形質導入に関与する、細胞内エフェクタードメインと細胞外リガンド-結合ドメインを含有する、マルチ-ドメイン構造体により特徴付けられる。レセプターにリガンドが結合することにより、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子(類)との間の相互作用に起因して、レセプターに構造変化が生じる。この相互作用により、細胞の代謝に次々と変化が生じる。レセプター-リガンドの相互作用に関連した代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化が含まれ、環状AMP生成、細胞カルシウムの流通、膜脂質の流通、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解が増加する。ここに記載された例示的レセプターはCD94/NKG2Aレセプターである。
「融合」タンパク質は、例えば組換えプロセスにより生成した、ペプチド結合により結合した2つのポリペプチドセグメントを含有するタンパク質である。
本発明は、ヘテロ二量体レセプターの2つのサブユニットのそれぞれの可溶性部分と、いくつかの態様では、免疫グロブリン分子の少なくとも一のFc-部分を全て含有する、ヘテロ二量体レセプターからの可溶性レセプター-複合体を提供する。
一態様において、各可溶性部分は免疫グロブリンのFc-部分に会合又は共有結合しており、最終的な可溶性-レセプター複合体は、第2のサブユニットの可溶性部分(sS2-Fc)を含むハイブリッド又は融合タンパク質に、第1のサブユニットの可溶性部分(sS1-Fc)を含有するハイブリッド又は融合タンパク質を会合又は共有結合させることによって形成される。種々のセグメントの結合は、化学的架橋結合、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などの共有結合、又はアビジン-ビオチン又はロイシンジッパー技術などの親和相互作用を介してなされ得る。
本発明のヘテロ二量体レセプターの可溶性レセプター-複合体はより安定しており、よって、より長時間保存することができる。さらにヘテロ二量体レセプターからの安定した可溶性レセプター-複合体は、例えば免疫化及び治療用途等、長時間の半減期が必要とされる用途に適している。
1)CD94-Fc/NKG2-Fc:CD94とNKG2タンパク質の細胞外ドメインを含有し、その双方がマウスFcにコンジュゲート又は融合している、安定したFc-融合タンパク質又はハイブリッド-タンパク質コンジュゲート。タンパク質は哺乳動物細胞から生産及び分泌可能で、単一工程のアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。例示的な一実施態様では、この可溶性レセプター複合体は、図1に例証されており、例証されているジスルフィド架橋はCD94/NKG2Aレセプターにおいて自然に生じたものである。
本原則が適用可能な、典型的なヘテロ二量体レセプターには、限定されるものではないが、CD94/NKG2A、CD94/NKG2B、CD94/NKG2C、CD94/NKG2E、及びCD94/NKG2Fレセプターが含まれる。図25に示すように、NKG2ファミリーのレセプターは、高度な配列相同性を有する。本発明のコンストラクトへの使用に適したこれらのレセプターの単量体サブユニットの可溶性部分は、科学文献において公知であるか、又はTMHMM(world-wide web (www) address cbs.dtu.dk/services/TMHMM/から入手可能)等の、公に入手可能なコンピュータベースのアルゴリズムを使用する、アミノ酸配列の標準的なコンピュータ分析を用いて推測することができる。
MAVFKTTLWRLISGTLGIICLSLMATLGILLKNSFTKLSIEPAFTPGPNIELQKDSDCCSCQEKWVGYRCNCYFISSEQKTWNESRHLCASQKSSLLQLQNTDELDFMSSSQQFYWIGLSYSEEHTAWLWENGSALSQYLFPSFETFNTKNCIAYNPNGNALDESCEDKNRYICKQQLI(配列番号2)
を含む。
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL(配列番号:1)
を含む。
上に記載したように、他のNKG2レセプターを、本発明のヘテロ二量体レセプターを構成するために適用してもよい。このようなコンストラクトにおいて、一単量体ユニットは、CD94配列の可溶性セグメントを含有しており、一つの単量体ユニットは、例えばヒトNKG2B(配列番号70)、NKG2E(配列番号4)、又はNKG2F(配列番号5)からのNKG2配列の可溶性セグメントを含有している。
ヒトCD94の非限定的オルソログには、UNIPROT受入番号Q9MZ41(UNIPROT-ID:KLRD1_PANTR(チンパンジ));Q8MHY9(UNIPROT-ID:KLRD1_PONPY(オランウータン));Q9MZK9(UNIPROT-ID:KLRD1_MACMU(アカゲザル));Q68VD4(UNIPROT-ID:Q68VD4_MACFA(カニクイザル));O35778(UNIPROT-ID:O35778_RAT(ラット));O54708(UNIPROT-ID:O54708_MOUSE(マウス));及びQ38HS3(UNIPROT-ID:Q38HS3_CANFA(イヌ))を有するものが含まれる。これらの配列はUniprotウェブサイト(World-wide Web address ebi.uniprot.org/index.shtml)から公に入手可能である。
配列番号20(UniProt IGHG1_HUMAN)又は配列番号24(UniProt IGHG4_HUMAN)をそれぞれ指すヒトIgG1又はIgG4の定常ドメインにおけるアミノ酸置換例。
上に記載したように、種々の野生型又は変異マウスFcドメインも、本発明のヘテロ二量体コンストラクトに使用することができる。図8には、実施例において、コンストラクトを調製するのに使用された、マウスの野生型又は変異Fcドメインのいくつかが記載されている。
もちろん、2つのサブユニットは、任意の相対順序又は方向における直列配列等、上述した部分の任意の組合せを介して会合可能である。
MPLLLLLPLLWAGALAMD(配列番号30)
である。
また核酸は、特に、融合タンパク質において異なるセグメント間の一又は複数の切断部位もコード化してよい。例えば、Tuanら, Connective Tissue Research 1996;34:1-9を参照。
例示的な可溶性CD94/NKG2Aレセプターコンストラクトのアミノ酸配列(Sig=シグナル配列;mFc=マウスFc-タンパク質;GS、GSS等=グリシン(G)、セリン(S)、及びアルギニン(R)をベースにしたリンカー)。Fcドメインの命名は図8の命名を指す。
一態様において、本発明は、NKG2アミノ酸配列の可溶性部分とCD94アミノ酸配列の可溶性部分を含有する、単鎖可溶性CD94/NKG2レセプターを提供する。一態様において、単鎖コンストラクトは、Fcドメインの全て又は一部又はその変異体を含有する免疫グロブリンポリペプチドをさらに含有してよい。よって、本発明は、Fcドメインの全て又は一部又はその変異体を含有する免疫グロブリンポリペプチド、及びNKG2アミノ酸配列の可溶性部分、CD94アミノ酸配列の可溶性部分を含有する、単鎖可溶性CD94/NKG2レセプターを提供する。一実施態様では、単鎖可溶性CD94/NKG2レセプターでは、CD94アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端は、NKG2アミノ酸配列の可溶性部分のN-末端に結合可能であり、NKG2アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端は、免疫グロブリンポリペプチドに結合する。他の実施態様では、単鎖可溶性CD94/NKG2レセプターでは、NKG2アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端は、CD94アミノ酸配列の可溶性部分のN-末端に結合し、CD94アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端は、免疫グロブリンポリペプチドに結合する。単鎖可溶性CD94/NKG2レセプターにおいて、NKG2アミノ酸配列の可溶性部分、CD94アミノ酸配列の可溶性部分、免疫グロブリンポリペプチドを含有する実施態様ではは免疫グロブリンポリペプチドは、例えば共有結合により会合可能である。例えば、NKG2アミノ酸配列の可溶性部分及びCD94アミノ酸配列の可溶性部分は、グリシン及びセリンを含有するペプチドリンカーにより結合可能である。
任意の上述した態様において、NKG2サブユニットはNKG2Cとすることができ、ここでNKG2Cアミノ酸配列は、例えばヒトNKG2C(配列番号3)のものとすることができる。例えば、NKG2Cサブユニットは、配列番号3の残基96-231を含有していてよい。
任意の上述した態様において、CD94アミノ酸配列は配列番号2とすることができる。例えば、CD94サブユニットは、配列番号2の残基35-179を含有していてよい。
任意の上述した態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、シグナル配列に共有結合的に結合可能である。例えば、シグナル配列は配列番号30の配列を含有していてもよい。
付加的な又は代替的な態様において、本発明は、配列番号31及び32;配列番号33及び34;配列番号35及び36;配列番号37;配列番号38、及び配列番号39の配列を含有する可溶性CD94/NKG2Aレセプター、又は配列番号59を含有する可溶性CD94/NKG2Cレセプターを提供する。
他の態様において、本発明は、任意の上述した態様の可溶性CD94/NKG2レセプターを有効量と、製薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有する薬学的組成物を提供する。
他の態様において、本発明は、CD94/NKG2レセプター、例えばCD94/NKG2Aに対する抗体を生成させる方法を提供し、該方法は、任意の上述した態様の可溶性CD94/NKG2レセプターで動物に予防接種し、ここでポリペプチドは、動物において免疫反応を誘発させ、抗体を生成させるものであり、動物から抗体を単離することを含む。
本発明のヘテロ二量体レセプターポリペプチドは、従来からの技術に従い、遺伝子操作された宿主細胞において生成することができる。
適切な宿主細胞は、外来性DNAで形質転換又は形質移入可能で、培養にて成長可能なタイプの細胞であり、細菌、真菌細胞、培養された高等真核細胞が含まれる。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローンされたDNA分子を操作し、種々の宿主細胞に外来性DNAを導入するための技術は、出典明示によりここに援用される:Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,(1989)に開示されている。
培養された哺乳動物細胞は、好ましくは本発明の宿主である。
レセプターの純度は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、及びアミノ末端アミノ酸配列分析を含む、標準的な方法を使用して測定することができる。
本発明の特定の態様は、免疫剤、研究及び選択用ツール、診断用試薬、及び治療剤としての、可溶性ヘテロ二量体レセプターコンストラクトの使用に関する。
一態様において、本発明は、ヘテロ二量体レセプターに対する抗体反応を誘発させるために、本発明の可溶性ヘテロ二量体レセプターで動物を免疫化するための方法を提供する。可溶性断片単独の代わりに、本発明の可溶性ヘテロ二量体レセプターコンストラクトを使用することの例示的利点には、半減期が長くなること、レセプターの3次元折り畳みが正確であること、Fcタグにより容易になるAPC'sへの取込が効率的であることが含まれる(よって、より強固な抗体反応が促進される)。ついで、ヘテロ二量体レセプターに対する抗体は、血液から収集されるか(ポリクローナル抗体の調製)、又はハイブリドーマ技術又はモノクローナル抗体の生成で確立された他の技術を使用し、抗体生成B細胞から調製することもできる。一実施態様では、本発明は:ここに記載した可溶性ヘテロ二量体レセプターで動物を免疫化させ、ポリペプチドが、動物において免疫反応を誘発させ、抗体を生成させるものであり;動物から抗体を単離することを含む、可溶性ヘテロ二量体レセプターに抗体を生成させる方法を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、可溶性CD94/NKG2Aレセプターコンストラクト、及びこのような可溶性CD94/NKG2Aレセプターコンストラクトに対して生じた抗体等の薬剤を提供する。このようなコンストラクト又は抗体が、HLA-EとCD94/NKG2Aとの相互作用を低減又はブロック可能かどうか、よってCD94/NKG2A-制限リンパ球の細胞毒性が増加するかどうかを決定するために、次の試験を実施することができる。
また本発明は、リンパ球、場合によってはHLA-E-発現標的細胞を含有する生物学的試料又は患者において、リンパ球の細胞毒性を検出可能に高めるのに効果的な量で、可溶性ヘテロ二量体レセプター又は抗体(その断片及び誘導体を含む)を任意の適切なビヒクルに含有せしめてなる組成物を提供する。組成物は、製薬的に許容可能な担体又は賦形剤をさらに含有する。このような担体及び賦形剤は当該分野でよく知られており、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995に記載されている。
ここで使用される「生物学的試料」には、限定されるものではないが、体液(例えば、血清、リンパ、又は血液)、細胞試料、又は組織試料(例えば骨髄)が含まれる。
この発明のさらなる態様及び利点は、例示と見なされなければならず、この出願の範囲を限定するものではない以下の実験セクションに開示されるであろう。
この実施例は、HLA-Eとの相互作用をカバーするCD94/NKG2Aセグメントを同定するインシリコ・モデル化について記載する。ここで言及したタンパク質データベース(PDB; Protein Data Bank)は、H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne: The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 28 pp.235-242(2000)に記載されている。PDB識別子は、例えば、しばしば1NKRpdb&1OM3.pdbと称される1NKR&1OM3等の、常に4つの英数字である。
重鎖定常領域の位置番号に対する参照は、ここでは特に、CH1(Uniprot-id:IGHG1_HUMAN(配列番号20)に類似)の最初(N-末端)から出発した野生型定常領域配列の位置を示す。定常軽鎖の位置については、番号付けはUniprot-id:KAC_HUMAN(配列番号10)による。ヒトIgG1におけるイオン相互作用の原因となるアミノ酸は、GM及びKMアロタイプ双方のCH3-CH3ドメイン-ドメイン相互作用に利用可能なX線構造、及びCH1-Cカッパ及びCH1-Cラムダ相互作用に利用可能なX線構造の分析を使用し、同定した。
GM(配列番号8)及びKM(配列番号9)アロタイプの定常ドメインのアラインメントを図5に示す。カッパ(配列番号10)及びラムダ(配列番号11)の定常ドメインのアラインメントを図6に示す。
CH3-CH3 KM:D239-K322、E240-K253、D282-K292
CH3-CH3 GM:E239-K322、E240-K253、D282-K292
Cカッパ-CH1:E15-K96、D14-K101
Cラムダ-CH1:E16−K96、E17-K30
上述した相互作用に関連したアミノ酸残基は、ヘテロ二量体相互作用と、よって好ましいヘテロ二量体相互作用(に必要な)エネルギーを増加させるため、異なる特異性を有する異なる抗体から、2つの軽鎖重鎖対の置換を受けた。同じ原則を、重-軽鎖相互作用と、可溶性ヘテロ二量体レセプターに適用することができる。
CH3−未修飾 <−> CH3−未修飾
D239 <−> K322
E240 <−> K253
K292 <−> D282
K322 <−> D239
K253 <−> E240
D282 <−> K292
D239<−> K322
E240 <−> K253
K292 <−> D282
D322 <−> K239
E253 <−> K240
K282 <−> D292
D239 <−> D322
E240 <−> E253
K292 <−> K282
D322 <−> D239
E253 <−> E240
K282 <−> K292
であり、電荷斥力対のみを有する。
類似のアプローチを、GM、及び重軽鎖相互作用に適用することができる。
重鎖の保存に関し、以下の結論を出すことができる:
・D239又はE239は、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・K322は、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・E240は、ヒト、ラットIgG1、IgG2a、マウスIgG2aに保存されている。
・K253は、ヒト、ラットIgG1、IgG2aに保存されている。
・D282は、マウスIgG1を除く、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・K322は、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・K96は、ヒトIgG3を除く、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・K101又はR101は、マウスIgG2bを除く、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・K30は、ヒトIgG3を除く、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
軽鎖の保存に関し、以下の結論を出すことができる:
・E15は、ヒト及びマウスに保存されている(ラットは調査せず)。
・D14H保存されない。
・E16は、ヒト及びマウスに保存されている(ラットは調査せず)。
・E17は、ヒト及びマウスに保存されている(ラットは調査せず)。
ヒトCD94(hCD94)及びヒトNKG2A(hNKG2A)を、Spring Bioscience(#PHD-138)から購入したヒトNK cDNAライブラリーからクローニングした。受託番号U30610(hCD94)及びAF461812(hNKG2A)を用いてNCBIデータベースからの配列を使用し、プライマーを設計した。hCD94用に使用されたプライマーは:
5’GGATCCTCTTTTACTAAACTGAGTATTGAGCCAGC(順方向;配列番号40)
5’GCGGCCGCAGATCTATTAAATGAGCTGTTGCTTACAGATATAACG(逆方向、配列番号41)
であった。
hNKG2A用に使用されたプライマーは:
5’GGATCCCAGAGGCACAACAATTCTTCCCTG(順方向、配列番号42)
5’GCGGCCGCAGATCTATTAAAGCTTATGCTTACAATG(逆方向、配列番号43)
であった。
順方向プライマーはBamHI制限部位を含み、逆方向プライマーはNotI及びBglII制限部位を含んでいた。産物はタッチ-ダウンPCR法を使用して増幅した。
可溶性hCD94により、pCR4ブラント-Topoにクローニングされた438bp断片が得られ、配列が確認された。可溶性hNKG2A(405bp)はpCR2.1-TOPOにクローニングされ、正確なクローンが配列決定により同定された。
マウスFc(mFc)をIMAGEクローン#2651217からクローンした。使用したプライマーは、
5’GCTAGCATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCCCTGGCTATGGATGTGCCCAGGGATTGTGGTTG(順方向、配列番号44)
5’GGATCCTTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC(逆方向、配列番号45)
であった。
制限部位NheI及びBamHIを使用して、pcDNA3.1又はpcDNA3.1/ヒドロ(Invitrogen)中にmFcを挿入した。BamHI及びNotI(pBF5)を使用し、hCD94をmFcを有するpcDNA3.1中に挿入し、同じ方法(pBF6)で、hNKG2AをpcDNA3.1/ヒドロに挿入した。図9及び10を参照。
1 MPLLLLLPLLWAGALAMDVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLT
51 ITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRS
101 VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIP
151 PPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDG
201 SYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGSQRH
251 NNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKN
301 SSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDS
351 DNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL
1 MPLLLLLPLLWAGALAMDVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLT
51 ITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRS
101 VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIP
151 PPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDG
201 SYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGSSFT
251 KLSIEPAFTPGPNIELQKDSDCCSCQEKWVGYRCNCYFISSEQKTWNESR
301 HLCASQKSSLLQLQNTDELDFMSSSQQFYWIGLSYSEEHTAWLWENGSAL
351 SQYLFPSFETFNTKNCIAYNPNGNALDESCEDKNRYICKQQLI
mPc部における突然変異を、実施例3のコンストラクトに対するクイックチェンジ突然変異誘発を使用して達成した。配列番号14中のT249Y、Y290T[GCAA_MOUSE;IgG2A])に対応する単一変異(配列番号21中のT243Y、Y284T[IGHG1_MOUSE;IgG1]を、Stratagene #200523からのQuikChange II部位特異的突然変異誘発キット及びマニュアルと次の2つのプライマーセットを使用して実施した:
5’GGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGTACTGCATGATAACAGACTTC(配列番号46)
5’GAAGTCTGTTATCATGCAGTACAGACTGACTTTATCCTTGGCC(配列番号47)、及び
5’CAGATGGCTCTTACTTCGTCACCAGCAAGCTCAATGTGCAGAAG(配列番号48)
5’CTTCTGCACATTGAGCTTGCTGGTGACGAAGTAAGAGCCATCTG(配列番号49)。
95℃/30秒での単一の変性工程に、95℃/30秒;55℃/1分;68℃/7分、最後に72℃/10分の15サイクルが続いた。
E239K:CCATTCCACCTCCCAAGAAGCAGATGGCCAAGG(配列番号50)
K292D:GCTCTTACTTCGTCTACAGCGACCTCAATGTGCAGAAGAGCAAC(配列番号51)、及び
D282K:GAACACTCAGCCCATCATGAAGACAGATGGCTCTTACTTCG(配列番号52)
K322E:CCACCATACTGAGGAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGG(配列番号53)
95℃/1分での単一の変性工程に、95℃/1分;55℃/1分;65℃/13.5分の30サイクルが続いた。
NKG2A-2xGGS-CD94を、BamHI/NotI部位(pBF17)においてmFcを有するpcDNA3.1/hygroにクローニングした。図11を参照。
pBF17は次のものをコードする(配列番号39):
1 MPLLLLLPLLWAGALAMDVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLT
51 ITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRS
101 VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIP
151 PPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDG
201 SYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGSQRH
251 NNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKN
301 SSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDS
351 DNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKLGGSGGSRSSFTKLSIEPA
401 FTPGPNIELQKDSDCCSCQEKWVGYRCNCYFISSEQKTWNESRHLCASQK
451 SSLLQLQNTDELDFMSSSQQFYWIGLSYSEEHTAWLWENGSALSQYLFPS
501 FETFNTKNCIAYNPNGNALDESCEDKNRYICKQQLI
実施例2−5の全てのコンストラクトを、形質移入のためにInvitrogenからの293フェクチン#12347-019を使用し、HEK293細胞中で一過性に発現させた。125mlの三角フラスコに5×105細胞/mlを播種した。次の日、細胞を次のようにして形質移入した:30μgのDNAを1mlのOpti-Memで希釈し、40μlの293フェクチンを960μlのOpti-Memで希釈した。室温(RT)で5分後、細胞培養物に添加する前に、2つの混合物を混合し、室温で25分インキュベートした。4−6日後、1500×gで15分遠心分離することにより、培地を収集した。ウエスタンブロット分析により結果を視覚化し、ここで、全てのブロットはヤギ抗マウスIgGを用いて探索した。
ウエスタンブロット分析の例示的な結果を図12A−12Cに示す。全てのブロットはヤギ抗マウスIgGを用いて探索した。mFc-CD94及びmFc-NKG2Aは、HEK293中で個々に発現させた。mFc-NKG2AはmFc-CD94の不在下では発現しなかった。mFc-単鎖-NKG2A-CD94はHEK293中で発現させた。
CD94-mFc及びNKG2A-mFc融合タンパク質の7つの異なる変異体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。融合タンパク質は、CD94-mFcホモ二量体、CD94-2xGGS-NKG2A-mFc、NKG2A-mFc、CD94-mFc(T249Y)NKG2A-mFc(Y290T)、CD94-mFc NKG2A-mFc、CD94-mFc(E239K、K292D)NKG2A-mFc(D282K、K332E)であった。CD94/NKG2A-マウスFc融合タンパク質は、無血清培地を使用して生産した。CD94/NKG2A-マウスFc融合タンパク質は、CHO-DUKX B11細胞から発現させた。
抗体Z199(抗NKG2A、Beckman Coulter, Fullerton, CA)及びHP-3D9(抗CD59、Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)を、Cy-染料タンパク質ラベリングキット(GE-Healthcare, Hillerod, Denmark)を使用し、Cy3及びCy5でラベリングすることにより、ウエスタンブロット用に調製した。ブロット後、膜を5%blotto(Pierce, Rockford, IL)でブロックし、洗浄バッファー中で1:200に希釈した双方の抗体と共にインキュベートした。洗浄後、2つの異なるフルオロフォア用のセッティングを使用し、Ettan Dige Imager又はTyphoon Trio+スキャナー(GE-Healthcare, Hillerod, Denmark)のいずれかで、ブロットをスキャンした。
HEK293細胞からの330−350mlの無血清培養上清から精製したタンパク質は、0.08〜1.17mgのタンパク質を生じた。表3を参照。最も多量のタンパク質は、マウス免疫グロブリン定常領域中に単一の変異を有する2つのプラスミドを発現する細胞から精製した。1-D SDS PAGEにより精製されたタンパク質を分析すると、精製により、明らかな汚染物が存在しない非常に純粋なタンパク質が生じていることが示された。主要なバンドはタンパク質の二量体形成に対応するが、より高分子量の種は四量体形成に対応する。
NKG2を、Trx-hexaHis pET32a中のBamHI-BglII i BamHI+脱リン酸化(仔ウシ腸ホスファターゼを使用)にサブクローニングして、次の配列(配列番号54)(図15)をコードするpISNN415を生産した。
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLN 60
IDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHH 120
HHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSQRHNNSSLNTRTQKA 180
RHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSS 240
WIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL 300
** 302
ヒトNKG2A(配列番号1の残基99−233)細胞外ドメインを大腸菌中で発現させた。NKG2Aをチオレドキシン(Trx)及びhexaHisタグにN-末端で融合させた。予想された分子量は33kDaであった。Trx及びhexaHisは、エンテロキナーゼを使用しタンパク分解的に除去することができる。Trx-NKG2Aが、500mLの研究室規模の培養にて、約10mg/Lで発現された(図16)。
CD94を、BamHI中のBamHI-BglII+脱リン酸化(子ウシの腸のホスファターゼを使用)ヘキサHis-GST XPNNB pET15bにサブクローニングし、次の配列(配列番号55)(図17)をコード化したpISNN427を生成させた。
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLESPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEG 60
DKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGA 120
VLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDA 180
LDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK 240
SDLVPRGSSFTKLSIEPAFTPGPNIELQKDSDCCSCQEKWVGYRCNCYFISSEQKTWNES 300
RHLCASQKSSLLQLQNTDELDFMSSSQQFYWIGLSYSEEHTAWLWENGSALSQYLFPSFE 360
TFNTKNCIAYNPNGNALDESCEDKNRYICKQQLI** 396
ヒトCD94(配列番号2の残基34-179)細胞外ドメインを、大腸菌で発現させた。CD94をヘキサHis及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)に、N-末端で融合させた。予期される分子量は46kDaであった。ヘキサHis-GSTは、トロンビンでの切断により除去することができる。GST-CD94の発現レベルは、500mLの研究室規模の培養にて、約50mg/Lであった。発現を30℃で得た。融合タンパク質を不溶性形態で発現させた。この特定の実験では、種々の溶菌方法がスクリーニングされた(TEN(tris、EDTA、NaCl)を使用する凍結-解糖(fz)サイクル、又はBugBuster(Novagen)もしくはPopCulture(Novagen)を使用する洗浄ベースの溶菌)(図18)。
使用したプライマーは以下の通りである:
2xGGS−アップ:AGCTTGGCGGTAGCGGCGGTAGCA(配列番号56)
2xGGS−ダウン:GATCTGCTACCGCCGCTACCGCCA(配列番号57)
2xGGS−挿入ダウン:GTTGTGCCTCTGGCTACCGCCGCTACCGCCAATGAGCTGTTGC(配列番号58)
NKG2A-2xGGS-CD94。第1に、NKG2Aの3'末端をBluescript-SK(−)に整列させた。親水性リンカーの添加、及び最初のクローンの停止コドンの除去と同時に、アニール化されたオリゴ('2xGGS−アップ'及び'2xGGS−ダウン')を、NKG2A-pBluescript-SK(−)(pISNN425)において、HindIII-BglIIにサブクローニングさせた(図19A)。第2に、CD94を、NKG2A-2xGGSリンカーpBluescript-SK(−)制限BglII-NotI中のBamHI-NotIに挿入した(図19B)。正確なクローンを制限消化により同定し、T7 og T3プライマーを使用して配列決定した。
NKG2A-2xGGS-CD94(NKG2A-2xGGS-CD94-pBluescript-SK(−)))を、BamHI制限及び脱リン酸化(子ウシの腸のホスファターゼを使用)-へキサHis-GST XPNNB pET15b中のBamHI-BglII、又はBamHI-BglII i BamHI+脱リン酸化Trx-ヘキサHis pET32aにサブクローニングさせた(図20)。
コンストラクトはBL21(DE3)で発現する。
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLESPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEG 60
DKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGA 120
VLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDA 180
LDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK 240
SDLVPRGSQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSK 300
NSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAV 360
LQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKLGGSGGSRSSFTKLSIEPAFTPGPNIELQKDSDCCSCQ 420
EKWVGYRCNCYFISSEQKTWNESRHLCASQKSSLLQLQNTDELDFMSSSQQFYWIGLSYS 480
EEHTAWLWENGSALSQYLFPSFETFNTKNCIAYNPNGNALDESCEDKNRYICKQQLI** 539
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLN 60
IDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHH 120
HHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSQRHNNSSLNTRTQKA 180
RHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSS 240
WIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL 300
GGSGGSRSSFTKLSIEPAFTPGPNIELQKDSDCCSCQEKWVGYRCNCYFISSEQKTWNES 360
RHLCASQKSSLLQLQNTDELDFMSSSQQFYWIGLSYSEEHTAWLWENGSALSQYLFPSFE 420
TFNTKNCIAYNPNGNALDESCEDKNRYICKQQLI** 456
gly-gly-ser-gly-gly-serリンカーにより離間したヒトNKG2A(配列番号1の残基99-233)及びヒトCD94(配列番号2の残基34-179)細胞外パートが、大腸菌株BL21(DE3)における単鎖融合体として発現された。それらのN-末端で、それぞれチオレドキシン(Trx)及びヘキサHisタグ、又はヘキサHis及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を担持する、2つの異なるNKG2A-CD94融合コンストラクトが発現された。Trx-ヘキサHis-NKG2A-2xGGS-CD94が、500mLの研究室規模の培養にて、約100mg/L発現した。ヘキサHis-GST-NKG2A-2xGGS-CD94の発現レベルは、500mLの研究室規模の培養にて、約70mg/Lであった。Trx-ヘキサHisはエンテロキナーゼを使用し、タンパク質分解的に除去されてよい。ヘキサHis-GSTは、トロンビンで切断することにより除去することができる。発現は37℃で得られた。融合タンパク質は不溶性のペレットフラクション(p)において高度に発現した(図23)。
250mlの発酵体から単離された細胞を、50mMのTris、pH8、200mMのNaCl、5mMのEDTAで1度洗浄した。得られたペレットを、50mMのTris、pH8、200mMのNaCl、5mMのEDTA、10w/v%のスクロース、5mMのDTT、5mMのベンズアミジンに再懸濁させ、フレンチプレスで溶解させた。不溶性の封入体を遠心分離により収集し、洗浄し、6Mのグアジニウムヒドロクロリド、100mMのTris、pH8、40mMのDTTに溶解させた。
溶解したタンパク質を、20mlのリフォールディングバッファー、50mMのTris、pH8.2、750mMのアルギニン、10mMのNaCl、0.5mMのKCl、0.5g/LのPEG3350、2mMのMgCl2、2mMのCaCl2、4mMのシステイン、1.5mMのDTTで希釈した。リフォールディング混合物を一晩5℃で放置した。
リフォールディングタンパク質を10mMのTris、pH8で5回希釈し、5mlのQセファロース高速流カラムに適用することにより精製した。2Cv 10mMのTris、pH8、50mMのNaClで洗浄した後、タンパク質を10CV以上、10mMまでのTris、pH8、2MのNaClによる直線状勾配により溶出させた。
1Lの発酵体から単離された細胞を、50mMのTris、pH8、200mMのNaCl、5mMのEDTAで1度洗浄した。得られたペレットを、50mMのTris、pH8、200mMのNaCl、5mMのEDTA、10w/v%のスクロース、5mMのDTT、5mMのベンズアミジンに再懸濁させ、フレンチプレスで溶解させた。不溶性の封入体を遠心分離により収集し、洗浄し、6Mのグアジニウムヒドロクロリド、100mMのTris、pH8、40mMのDTTに溶解させた。
溶解したタンパク質を、100mlのリフォールディングバッファー、50mMのTris、pH8.2、750mMのアルギニン、10mMのNaCl、0,5mMのKCl、0.5g/LのPEG3350、2mMのMgCl2、2mMのCaCl2、4mMのシステイン、1.5mMのDTTで希釈した。リフォールディング混合物を一晩5℃で放置した。
リフォールディングタンパク質を10mMのTris、pH8で5回希釈し、5mlのQセファロース高速流カラムに適用することにより精製した。2Cv 10mMのTris、pH8、50mMのNaClで洗浄した後、タンパク質を10CV以上、10mMまでのTris、pH8、2MのNaClによる直線状勾配により溶出させた。
1Lの発酵体から単離された細胞を、50mMのTris、pH8、200mMのNaCl、5mMのEDTAで1度洗浄した。得られたペレットを、50mMのTris、pH8、200mMのNaCl、5mMのEDTA、10w/v%のスクロース、5mMのDTT、5mMのベンズアミジンに再懸濁させ、フレンチプレスで溶解させた。不溶性の封入体を遠心分離により収集し、洗浄し、6Mのグアジニウムヒドロクロリド、100mMのTris、pH8、40mMのDTTに溶解させた。
溶解したタンパク質を、20mlのリフォールディングバッファー、50mMのTris、pH8.2、750mMのアルギニン、10mMのNaCl、0,5mMのKCl、0.5g/LのPEG3350、2mMのMgCl2、2mMのCaCl2、4mMのシステイン、1.5mMのDTTで希釈した。リフォールディング混合物を一晩5℃で放置した。
リフォールディングタンパク質を10mMのTris、pH8で5回希釈し、5mlのQセファロース高速流カラムに適用することにより精製した。2Cv 10mMのTris、pH8、50mMのNaClで洗浄した後、タンパク質を10CV以上、10mMまでのTris、pH8、2MのNaClによる直線状勾配により溶出させた。
次のコンストラクトを固定化抗体、HP-3D9、Z199、及びウサギ-抗マウス(RaM)に対する結合性、続いてHLA-E四量体の結合性について分析した。
CD94-mFc ホモ二量体
CD94-NKG2A-mFc 単鎖
NKG2A-mFc ホモ二量体
CD94-mFc/NKG2A 単一変異を有するヘテロ二量体
CD94-mFc/NKG2A ヘテロ二量体
CD94-mFc/NKG2A 二重変異を有するヘテロ二量体
表面プラズモン共鳴研究を、Biacore3000機器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)において実施した。リガンドの固定化を、製造者により記載された標準的なアミンカップリングキット(Biacore AB)を使用し、センサーチップ(Biacore AB)において実施した。
ランニングバッファーとして、全ての希釈用に、HBS-EPバッファー(10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%のポリドルバート20(v/v))を使用した。センサーチップの再生は、10mMのグリシン-HCl、pH1.8の短パルス(15μl、流速30μl/分)により実施した。
全ての実験を流速10μl/分、25℃で実施した。Biaevaluation 4.1ソフトウェアを使用し、データを分析した。
抗CD94モノクローナル抗体HP-3D9(BD Pharmingen, cat# 555887)、抗CD94/NKG2Aモノクローナル抗体Z199(Immunotech, France)、及びウサギ-抗マウス(RaM)ポリクローナル抗体(Biacore AB)を、CM5センサーチップにおける個々のフローセルに〜5000RUのレベルまで、アミンカップリングすることにより固定した。
全てのコンストラクトを、HBS-EPにおいて1μg/mlに希釈した。HLA-E四量体を5μg/ml濃度で試験した。各サイクルは、付与されたコンストラクトの最初の注入と、続いてのHLA-E四量体の注入からなる。コンストラクト及びHLA-E四量体を3分と、センサーチップ表面の再生前にそれぞれ2.5分の解離相を続けた。
全てのコンストラクトを、4℃及び−20℃で保存して試験した。
NKG2A-mFcホモ二量体を除く全てのコンストラクトが、固定化されたHP-3D9に結合することが示された。HP-3D9に個々のコンストラクトが結合することは、単一変異コンストラクトを有するCD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体を除き、保存条件に影響されない思われ、オンレイト(on-rate)における見かけの減少が、−20℃で保存されたコンストラクトについて検出することができた。しかしながら、コンストラクトは固定化されたHP-3D9に結合しなかった。
二重変異コンストラクトを有するCD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体の見かけオフ-レイト(off-rate)は、見かけ同一の解離パターンを示す他のコンストラクトと比較して高かった。二重変異を有するCD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体を除く全てのコンストラクトが、2.5分の解離相中、安定した結合性を示した。
固定化されたZ199への結合は、保存条件に関係なく、CD94-NKG2A-mFc単鎖、CD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体、及び二重変異コンストラクトを有するCD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体について観察された。また、4℃で保存された、単一変異コンストラクトを有するCD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体の結合は検出されたが、−20℃で保存された同様のコンストラクトでは、結合は示されなかった。CD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体及び単鎖変異コンストラクトを有するCD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体の結合は検出されたが、CD94-NKG2A-mFc単鎖、及び二重変異コンストラクトを有するCD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体のものと比較して、固定化されたZ199へのそれらの会合性は、低下していると思われる。
Z199と複合したコンストラクトへのHLA-E四量体の結合は、CD94-NKG2A-mFc単鎖コンストラクトについて検出された。HLA-E四量体の結合性は、2.5分の解離期間中、安定していると思われた。
RaMと個々のコンストラクトとの複合体へのHLA-E四量体の結合は、NKG2A-mFcホモ二量体を除く全てのコンストラクトについて観察された。結合した相対的に多量のHLA-E四量体は、CD94-NKG2A-mFc単鎖及び二重変異複合体を有するCD94-mFc/NKG2Aヘテロ二量体について観察された。
大腸菌発現したTHX-His-タグ-NKG2a-GSS-GSS-CD94-His-タグ/pET32aを、固定化されたHP-3D9及びZ199モノクローナル抗体への結合性について分析した(実施例18を参照)。それぞれpH6.0、7.0及び8.0で調製された2つの異なる調製物を試験した;一方は250mlの発酵体(B3)から得られたもの、一方は1Lの発酵体からのものである(B12)(実施例15及び16を参照)。
250mlの発酵体からの調製物を、HBS-EPにおいて1:10に希釈して試験し、3分注入し、続いて2.5分解離した。調製物は固定化されたHP-3D9及び固定化されたZ199の双方に結合し、固定化されたHP-3D9には多量結合した(図24)。
1Lの発酵体からの調製物を、10μg/mlまで希釈し、3分注入し、続いて2.5分解離した。この調製物は、固定化されたHP-3D9及びZ199の双方に結合することが示された(図24)。
可溶性ヒトNKG2CをGeneart, Regensburg, Deutschlandから得た。pBF74(NKG2C/CD94-Fc)で得られたpBF17からhNKG2A(配列番号59)を容易に置き換えるために、配列は、5'BamHI制限部位及び3'HindIII制限部位を有する順番であった。
1 MPLLLLLPLL WAGALAMDVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT
51 ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV EVHTAQTKPR EEQFNSTFRS
101 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP
151 PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG
201 SYFVYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGKGSFLE
251 QNNSSPNTRT QKARHCGHCP EEWITYSNSC YYIGKERRTW EESLLACTSK
301 NSSLLSIDNE EEMKFLASIL PSSWIGVFRN SSHHPWVTIN GLAFKHKIKD
351 SDNAELNCAV LQVNRLKSAQ CGSSMIYHCK HKLGGSGGSR SSFTKLSIEP
401 AFTPGPNIEL QKDSDCCSCQ EKWVGYRCNC YFISSEQKTW NESRHLCASQ
451 KSSLLQLQNT DELDFMSSSQ QFYWIGLSYS EEHTAWLWEN GSALSQYLFP
501 SFETFNTKNC IAYNPNGNAL DESCEDKNRY ICKQQLI
コンストラクトは、単一ペプチドCD33(配列番号30)、227Fc-部分(ヒンジ-CH2-CH3)(配列番号21)、リンカー(GS)、hNKG2C(配列番号3)の残基96-231、GGSGGSRSSスペーサー、及びhCD94(配列番号2)の残基34ないし180を含有する。
単鎖コンストラクトに使用されたNKG2A及びNKG2Cの可溶性部分のアミノ酸配列は、図25のアラインメントの番号付けを使用すると、残基99、100、101、106、167、168、170、189及び197のみが異なっている。単鎖コンストラクトに使用された配列が、上述した番号付けスキームに従い、NKG2C(FLEQ……)については位置98、及びNKG2A(QRH……)については99で開始することが記されている。
CD94/NKG2C-単鎖コンストラクトのシリーズは、単鎖コンストラクト(Sig)-(mFc)-GS-(NKG2A)-GGS-GGS-RSS-(CD94)(配列番号39)に基づき開発された。このコンストラクトは、hCD94(配列番号2)の残基34ないし180、hNKG2A(配列番号1)の残基99-233、CD94及びNKG2A部分の間のGGSGGSRSSスペーサー、及び227Fc-部分を含有する。シリーズは以下の表4に列挙された反復変異を用いて調製された。
変異1LEQ−P;順方向(配列番号60)、逆方向(配列番号61)
変異2AS-L;順方向(配列番号62)、逆方向(配列番号63)
変異3I;順方向(配列番号64)、逆方向(配列番号65)
変異4K;順方向(配列番号66)、逆方向(配列番号67)
変異M;順方向(配列番号68)、逆方向(配列番号69)
これらの変異を、QuikChangeII部位特異的突然変異誘発キット、及びStratagene #200523のマニュアルを称して実施した:95℃/30秒での単一変性工程に、95℃/30秒;55℃/1分;68℃/7分、最後に72℃/10分の15サイクルが続いた。
材料及び方法
表面プラズモン共鳴(SPR)測定を、25℃でBiacore T100装置(Biacore GE Healthcare)において実施した。全てのBiacore実験において、ランニングバッファー及びセンサーグラムとして供給されるHBS-EP+バッファー(Biacore GE Healthcare)を、Biaevaluation 4.1及びBiacore T100 Evaluationソフトウェアを用いて分析した。使用した抗体は抗NKG2A(humZ270及びZ199)、抗NKG2C(Immunotech-Beckman Coulter)、及び抗NKG2D(ON72)であった。
組換えタンパク質を、センサーチップCM5(チップ)上のデキストラン層中のカルボキシル基に、共有結合的に固定化させた。チップ表面をEDC/NHS(N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド及びN-ヒドロキシスクシンイミド(Biacore GE Healthcare))で活性化させた。タンパク質をカップリングバッファー(10mMのアセタート、pH5.6)において10μg/mlに希釈し、適切な固定化レベルに達するまで注入した(すなわち、それぞれ2A、2C及び2Dについて700、630及び400RU)。
残存した活性化基の不活性化を、100mMのエタノールアミン、pH8(Biacore GE Healthcare)を使用して実施した。
単一の結合実験において、scCD94/NKG2A、scCD94/NKG2C及びNKG2D-Fc組換えタンパク質チップに、10μl/分の流速で1分間、10μg/mlの一定濃度の抗体を注入した。各サイクル後、流速40μl/分で、500mMのNaCl及び10mMのNaOHバッファーを8秒注入することにより、チップを再生させた。各抗体について、種々のタンパク質チップについて得られたセンサーグラムを重ね合わせ、Y軸について100RUの任意値に対して正規化させた。
動的実験において、0.178〜5ナノMと、一連の希釈された可溶性抗体を、固定化されたscCD94/NKG2A組換えタンパク質を含有するデキストラン層に、一定流速40μl/分で2分注入し、500mMのNaCl及び10mMのNaOHバッファーを8秒注入することによる再生前に、3分解離させることができた。
得られたセンサーグラムを適切なラングミュアモデルを使用し、包括的フィッティングにより分析した。
阻害実験において、固定化されたscCD94/NKG2A組換え標的タンパク質を含有するデキストラン層に、10μg/mlの一定濃度で抗体を注入した。各競合サイクルは、10μl/分の一定流速での2分間の注入工程3回からなる。第1に、抗体を2回注入する。第2に、結合した抗体を除去することなく、8μg/mlでHLA-E四量体を注入し、センサーグラム及びRU値をモニターする。抗体の存在下におけるHLA-E四量体の結合シグナルを、HLA-E四量体が、裸の組換えscCD94/NKG2Aタンパク質に直接注入された場合に得られたものと比較する。次の式:I%=(1-(RU+Ab/RU無し))*100を使用し、注入終了10秒後に得られたRU値から、阻害パーセンテージ(I%)を決定した。RU+Ab及びRU無しは、抗体の存在及び不在下において、それぞれモニターされたHLA-E結合RU値である。HLA-E注入(第3工程)に対応するセンサーグラムを、X及びY軸双方についで、注入出発時をゼロに位置あわせして、重ねた。
各サイクル後、流速40μl/分で、500mMのNaCl及び10mMのNaOHバッファーを8秒注入することにより、チップを再生させた。
組換えNKG2A、NKG2C及びNKG2Dタンパク質に対するhumZ270及びhumZ199抗体の結合性を、SPRにより分析した(図26)。双方の抗体はscCD94/NKG2Aチップには結合したが、scCD94/NKG2Cチップには結合しなかった。負の対照体として、NKG2D-Fcタンパク質を使用した。
scCD94/NKG2Cチップを、NKG2Cチップに1分間、2.5μg/mlで注入された抗NKG2C-PE(FAB138P, R&D Systems)を使用してチェックした。この抗体は、細胞表面で発現した天然NKG2Cによく結合する。scCD94/NKG2Cチップに結合した抗体は、細胞表面状態を模倣した適切な状態に固定化タンパク質が存在することを示す。NKG2D-FcチップをhumON72抗体を使用してチェックした。
HLA-E結合特性を分析するために、scCD94/NKG2AチップへのHLA-E四量体の結合性を、humZ270の不在下及び存在下においてモニターした。humZ270抗体を使用するscCD94/NKG2Aチップの状態で、HLA-E四量体の結合を競合的に阻害した(IZ270=81.8%)。
1.NKG2アミノ酸配列の可溶性部分とCD94アミノ酸配列の可溶性部分を含む単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
2.Fcドメインの全て又は一部を含む免疫グロブリンポリペプチド又はその変異体をさらに含む実施態様1の単鎖コンストラクト。
3.CD94アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端がNKG2アミノ酸配列の可溶性部分のN-末端に結合し、NKG2アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端が免疫グロブリンポリペプチドに結合している実施態様2の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
4.NKG2アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端がCD94アミノ酸配列の可溶性部分のN-末端に結合し、CD94アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端が免疫グロブリンポリペプチドに結合している実施態様2の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
5.NKG2アミノ酸配列の可溶性部分とCD94アミノ酸配列の可溶性部分が、グリシン及びセリンを含むペプチドリンカーにより結合している実施態様3及び4のいずれかの単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
6.上述した実施態様のいずれかの単鎖可溶性CD94/NKG2レセプターの二量体。
7.NKG2アミノ酸配列の可溶性部分を含むNKG2サブユニットと、CD94アミノ酸配列の可溶性部分を含むCD94サブユニットを含み、NKG2サブユニット及びCD94サブユニットの少なくとも一方が、Fcドメインの全て又は一部を含む免疫グロブリンポリペプチド又はその変異体を含む可溶性CD94/NKG2レセプター。
8.免疫グロブリンポリペプチドが、コンストラクトのインビボ半減期を増加させるIgG Fcドメインの一部を含む実施態様7の可溶性CD94/NKG2レセプター。
9.免疫グロブリンポリペプチドが機能的Fcドメインである実施態様7−8のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
10.FcドメインがIgG4抗体由来である実施態様7−9のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
11.FcドメインがIgG1抗体由来である実施態様7−10のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
12.NKG2A及びCD94サブユニットの一方のみが免疫グロブリンポリペプチドを含む実施態様7−11のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
13.免疫グロブリンポリペプチドがサブユニットのC-末端部分に結合している実施態様12の可溶性CD94/NKG2レセプター。
14.NKG2A及びCD94サブユニットがペプチドリンカーを介して結合している実施態様12−13のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
15.ペプチドリンカーが配列GGSGGS(配列番号6)を含む実施態様13の可溶性CD94/NKG2レセプター。
16.NKG2サブユニットが免疫グロブリンポリペプチドに共有結合している実施態様12−15のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
17.CD94サブユニットが免疫グロブリンポリペプチドに共有結合している実施態様12−15のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
18.NKG2及びCD94サブユニットのそれぞれが免疫グロブリンポリペプチドに共有結合している実施態様7の可溶性CD94/NKG2レセプター。
19.NKG2サブユニットのN-末端が第1の免疫グロブリンポリペプチドのC-末端に結合して第1のポリペプチドが形成され、CD94サブユニットのN-末端が第2の免疫グロブリンポリペプチドのC-末端に結合して第2のポリペプチドが形成される実施態様18の可溶性CD94/NKG2レセプター。
20.第1の免疫グロブリンポリペプチドが、ヒトIgG1 Fcドメインにおいて、残基239に対応する残基にリジンを、残基292に対応する残基にアスパラギン酸を含み、第2の免疫グロブリンポリペプチドが、ヒトIgG1 Fcドメインにおいて、残基282に対応する残基にリジンを、残基322に対応する残基にアスパラギン酸を含む実施態様19の可溶性CD94/NKG2レセプター。
21.第1の免疫グロブリンポリペプチドが、ヒトIgG1 Fcドメインにおいて、残基239及び240に対応する残基にリジンを、残基292に対応する残基にアスパラギン酸を含み、第2の免疫グロブリンポリペプチドが、ヒトIgG1 Fcドメインにおいて、残基253に対応する残基にグルタミン酸を、残基282に対応する残基にリジンを、残基322に対応する残基にアスパラギン酸を含む実施態様19及び20のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
22.第1の第2の免疫グロブリンポリペプチドの双方がヒトIgG1 Fcドメインの変異体であり、第1の免疫グロブリンポリペプチドが、K253E、D282K、及びK322Dに対応する置換を含み、第2の免疫グロブリンポリペプチドが、D239K、E240K、及びK292Dに対応する置換を含み、又はその逆である実施態様20及び21のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
23.第1の第2の免疫グロブリンポリペプチドの双方がヒトIgG4 Fcドメインの変異体であり、第1の免疫グロブリンポリペプチドが、K250E、D279K、及びK319Dに対応する置換を含み、第2の免疫グロブリンポリペプチドが、E236K、E237K、R289Dに対応する置換を含み、又はその逆である実施態様20及び21のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
24.CD94/NKG2Aである上記実施態様のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
25.NKG2Aサブユニットが配列番号1の残基99−233を含む実施態様25の可溶性CD94/NKG2Aレセプター。
26.CD94/NKG2Cである実施態様1−23のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
27.NKG2Cサブユニットが配列番号3の残基96−231を含む実施態様26の可溶性CD94/NKG2Cレセプター。
28.CD94アミノ酸配列が配列番号2である上記実施態様のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
29.CD94サブユニットが配列番号2の残基35−179を含む実施態様28の可溶性CD94/NKG2Aレセプター。
30.免疫グロブリンポリペプチドがシグナル配列に共有結合している上記実施態様のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプター。
31.配列番号37−39のいずれかの配列を含む可溶性CD94/NKG2Aレセプター。
32.配列番号59の配列を含む可溶性CD94/NKG2Cレセプター。
33.上記実施態様のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプターをコードする核酸。
34.実施態様33の核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞。
35.原核細胞又は真核細胞である実施態様34の細胞。
36.可溶性CD94/NKG2レセプターの製造方法において、可溶性CD94/NKG2レセプターの発現に適した条件下で実施態様35の細胞を培養することを含む方法。
37.実施態様1から32のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプターの有効量と製薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有する薬学的組成物。
38.CD94/NKG2レセプターに対する抗体の製造方法であって、
a.実施態様1から32のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプターを動物に接種し、ここで該ポリペプチドは動物に免疫反応を誘発させて抗体を生成させるものであり;及び
b.動物から抗体を単離する
ことを含む方法。
39.HLA-E分子の検出方法であって、
a.HLA-E発現細胞を含有する生物学的試料を実施態様1から32のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプターと接触させ;
b.細胞に対する可溶性CD94/NKG2レセプターの結合を検出する
ことを含む方法。
40.抗NKG2抗原結合化合物の製造方法であって、
a.NKG2ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合化合物を提供し;
b.実施態様1から32のいずれかの可溶性CD94/NKG2Aレセプターに対する結合について抗原結合化合物を試験し;
c.抗原結合化合物が可溶性CD94/NKG2Aレセプターに結合することが決定されるならば抗原結合化合物を選択し;
d.場合によっては、所定量の選択された抗原結合化合物を製造する
ことを含む方法。
41.抗NKG2抗原結合化合物の製造方法であって、
a.NKG2ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合化合物を所定量提供し;
b.実施態様1から32のいずれかの可溶性CD94/NKG2Aレセプターに対する結合について該所定量の抗原結合化合物からの試料を試験し;
c.抗原結合化合物が可溶性CD94/NKG2レセプターに結合することが決定されるならば医薬として及び/又は医薬の製造への使用に所定量を選択し;
d.場合によっては、ヒトへ投与するための所定量を調製し、場合によっては製薬的に許容可能な担体と共に所定量の選択された抗原結合化合物を製剤化する
ことを含む方法。
42.抗NKG2抗原結合化合物の製造方法であって、
a.NKG2ポリペプチドに特異的に結合する複数の抗原結合化合物を提供し;
b.実施態様1から32のいずれかの可溶性CD94/NKG2レセプターに対する結合性についてそれぞれの抗原結合化合物を試験し;
c.抗原結合化合物が該可溶性CD94/NKG2レセプターに結合することが決定されるならば抗原結合化合物を選択し;
d.場合によっては、抗原結合化合物をヒトへの投与に適したものにし;及び/又は
e.場合によっては、所定量の選択された抗原結合化合物を製造する
ことを含む方法。
43.抗原結合化合物をヒトへの投与に適したものにすることが、抗原結合化合物をキメラ又はヒト化することを含む実施態様40から42のいずれかに記載の方法。
44.所定量の抗原結合化合物を製造することが、適切な培地中で抗原結合化合物を発現する細胞を培養し、抗原結合化合物を回収することを含む実施態様40−43のいずれか一の方法。
45.抗原結合化合物が抗体又はその抗原結合断片を含む実施態様40−44のいずれかの方法。
46.抗原結合化合物が抗体である実施態様40−45のいずれかの方法。
47.NKG2ポリペプチドがNKG2Aである実施態様40−46のいずれかの方法。
48.NKG2ポリペプチドがNKG2Cである実施態様40−46のいずれかの方法。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、決して本発明を限定するものとは解してはならない。
その全ての可能な変形例における上述の要素の任意の組合せも、他の記載が示されていないか文脈上はっきりと矛盾していない限りは、本発明に包含される。
ここでの値の範囲の記載は、他の記載が示されていない限りは、その範囲に入るそれぞれ別個の値に個々に言及することを省略する方法となるものであることを単に意図しており、それぞれ別個の値は、ここで個々に列挙されているように、明細書に援用される。他の記載がなされない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の因子又は測定に対して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は「約」により修飾される、対応する近似測定値をまた提供すると考えることができる)。
ここで記載される全ての方法は、ここで示され、前後関係ではっきりと矛盾していない限りは、任意の適切な順序で実施することができる。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び/又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
本発明は、適用される法律によって許容される最大の範囲で、ここに提示された態様又は特許請求の範囲に記載された主題事項のあらゆる変形例及び均等物を含む。
Claims (15)
- NKG2アミノ酸配列の可溶性部分とCD94アミノ酸配列の可溶性部分を含む単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
- Fcドメインの全て又は一部を含む免疫グロブリンポリペプチド又はその変異体をさらに含む請求項1に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
- CD94アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端がNKG2アミノ酸配列の可溶性部分のN-末端に結合し、NKG2アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端が免疫グロブリンポリペプチドに結合している請求項2に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
- NKG2アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端がCD94アミノ酸配列の可溶性部分のN-末端に結合し、CD94アミノ酸配列の可溶性部分のC-末端が免疫グロブリンポリペプチドに結合している請求項2に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
- NKG2アミノ酸配列の可溶性部分とCD94アミノ酸配列の可溶性部分が、グリシン及びセリンを含むペプチドリンカーにより結合している請求項3又は4に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
- CD94/NKG2A、CD94/NKG2B、CD94/NKG2C、CD94/NKG2E、又はCD94/NKG2Fレセプターである請求項1から5のいずれか一項に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
- CD94/NKG2Aである請求項6に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
- 配列番号1の残基99−233を含む請求項7に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2Aレセプター。
- CD94/NKG2Cである請求項6に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
- 配列番号3の残基96−231を含む請求項9に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2Cレセプター。
- 配列番号2の残基35−179を含む請求項1から10のいずれか一項に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプター。
- 配列番号37−39のいずれかの配列を含む可溶性CD94/NKG2Aレセプター。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載の単鎖可溶性CD94/NKG2レセプターの二量体。
- 可溶性CD94/NKG2レセプターの発現に適した条件下で、請求項1から13のいずれか一項に記載の可溶性CD94/NKG2レセプターをコードする核酸を含む細胞を培養することを含む可溶性CD94/NKG2レセプターの製造方法。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載の可溶性CD94/NKG2レセプターの有効量と製薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有する薬学的組成物。
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