CN112239741A - 一种Megasphaera属的细菌MNC-992及其培养方法和应用 - Google Patents

一种Megasphaera属的细菌MNC-992及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开一种Megasphaera属的细菌MNC‑992及其培养方法和应用，所述细菌MNC‑992于2020年9月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No.61224。所述细菌MNC‑992的16S核糖体RNA序列如SEQ ID No.1所示。本发明的细菌MNC‑992在pH为3.0的模拟胃液中可以至少正常存活2小时，口服细菌MNC‑992用于预防和治疗肿瘤：能够明显降低结直肠癌的生长速度、明显降低肝癌的生长速度、明显降低结乳腺癌的生长速度。

Description

一种Megasphaera属的细菌MNC-992及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种Megasphaera属的细菌MNC-992及其培养方法和应用。
背景技术
近年来的研究表明，癌症病人肠道微生物组对肿瘤免疫治疗的效果有重要影响，调节和利用肠道微生也成为肿瘤免疫治疗的关键组成部分。肠道微生物和免疫细胞之间直接相互作用的多种机制已得到证实，肠道淋巴组织中的树突状细胞和巨噬细胞是免疫调节微生物的关键靶细胞。特别是在小肠中，由于肠道表面积大，黏液层薄而弥散，使得微生物可以与免疫细胞紧密接触。微生物菌群中的不同的特异菌株能够抑制或激活整个身体的免疫反应。
以活细菌为基础的活体生态药(Live Biotherapeutic Product)的开发在近年来获得了越来越多的关注。细菌在进入消化道后会面临相当恶劣的生存环境，胃部的低pH的胃酸以及肠道中一定浓度的胆盐对许多细菌有着很大的伤害。一个细菌对消化道环境的耐受性对其是否有机会被开发成活体生态药关系重大，这些指标对以该细菌菌株为基础进行活体生态药开发中的剂型选择又至为重要。
因此，亟需开发一种可以口服用于肿瘤的预防和治疗的细菌。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种Megasphaera属的细菌MNC-992及其培养方法和应用。
本发明为实现上述目的，采取以下技术方案予以实现：
一种Megasphaera属的细菌MNC-992，所述细菌MNC-992于2020年9月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No. 61224。
优选地，所述细菌MNC-992的16S核糖体RNA序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，其具备对四环素类抗生素的耐药性。
优选地，其在低至3.0的pH下正常存活的能力。
本发明的另一目的在于公开上述细菌MNC-992的培养方法：利用AC液体培养基培养所述细菌MNC-992；所述AC液体培养基中每升含：蛋白胨20 g、葡萄糖5 g、酵母粉3 g、牛肉膏3 g、维生素C0.2 g；所述AC液体培养基pH为7.0。
优选地，所述培养方法具体包括以下步骤：
（1）用灭菌牙签从细菌MNC-992本身分裂繁殖的众多单菌落中挑取一个单克隆到10 ml的所述AC液体培养基中培养1天；
（2）取1 ml培养物进行16S RNA鉴定，经与NCBI数据库中序列比对鉴定结果正确后，吸取2 ml菌悬液转接入80 ml AC液体培养基中于厌氧操作台培养；培养24小时后，吸取30 ml菌悬液转接入400 ml AC液体培养基中于厌氧操作台培养；培养24小时后，取1 ml菌液进行16S RNA鉴定，经与NCBI数据库中序列比对鉴定结果正确后，将全部菌液转移到I L离心瓶中，在6000 rpm，4 ℃条件下离心30 min；
（3）取沉淀用AC液体培养基和无菌甘油的混合液重悬，即为菌液甘油混合液，其中AC液体培养基和无菌甘油的体积比为4:1；将菌液甘油混合液分装于无菌冻存管中，冷冻于-80℃保存。
本发明的又一目的在于公开上述细菌MNC-992的应用，所述细菌MNC-992用于制备预防和治疗结直肠癌、肝癌或乳腺癌的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明的细菌MNC-992在pH为3.0的模拟胃液中可以至少正常存活2小时，口服细菌MNC-992用于预防和治疗肿瘤：能够明显降低结直肠癌的生长速度、明显降低肝癌的生长速度、明显降低结乳腺癌的生长速度。
附图说明
图1为本发明细菌MNC-992在模拟胃液中以吸光度值为参照的存活曲线；
图2为本发明细菌MNC-992在模拟肠液中以吸光度值为参照的存活曲线；
图3为巨噬细胞和本发明细菌MNC-992在不同MOI（细菌：细胞）为1（MNC-992-1）或10（MNC-992-10）共培养后产生细胞因子IL-6的变化示意图；
图4为巨噬细胞和本发明细菌MNC-992在不同MOI（细菌：细胞）为1（MNC-992-1）或10（MNC-992-10）共培养后产生细胞因子TNF-α的变化示意图；
图5为巨噬细胞和本发明细菌MNC-992在不同MOI（细菌：细胞）为1（MNC-992-1）或10（MNC-992-10）共培养后产生细胞因子CXCL-10的变化示意图；
图6为巨噬细胞和本发明细菌MNC-992在不同MOI（细菌：细胞）为1（MNC-992-1）或10（MNC-992-10）共培养后产生细胞因子IL-8的变化示意图；
图7为M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-1β的情况示意图；
图8为M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-6的情况示意图；
图9为M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-8的情况示意图；
图10为M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-10的情况示意图；
图11为M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生TNF-α的情况示意图；
图12为M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-12A的情况示意图；
图13为M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生NF-kB的情况示意图；
图14为M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生CXCL0的情况示意图；
图15为细菌MNC-992和PD-1抗体联用对结直肠癌（MC-38）的抑制作用示意图；
图16为细菌MNC-992和PD-1抗体联用对肝癌（H22）的抑制作用示意图；
图17为细菌MNC-992和PD-1抗体联用对乳腺癌（JC）的抑制作用示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但需要说明的是，实施例并不对本发明要求保护范围的构成限制。
实施例1：菌株的获取
在生物安全柜中分装生理盐水于无菌的10ml离心管中；提前24 h将厌氧血平板和无菌生理盐水转移入厌氧工作台（H35 Hypoxystation, Whitley）中，将5~7颗无菌的玻璃珠倒入已经凝固的厌氧血平板（江门凯林贸易有限公司，Bio-Caring）中。
慕恩（广州）生物科技有限公司某员工（供体号403051）与公司签订粪便收集的知情同意书后，取其鲜粪便样本1 g于厌氧操作台中使用漩涡振荡器震荡1 min，混匀，吸取1mL样本到9 mL生理盐水中，混匀为10-1稀释液，依次梯度稀释至10-6稀释液，用于涂平板用。
吸取100 μL的10-6稀释液于厌氧血平板中，并用玻璃珠涂布均匀，待平板表面干燥后，倒弃玻璃珠，在该厌氧工作台37 ℃厌氧培养3~5天。
观察分离到的菌株生长状况并用灭菌牙签挑取单菌落进行平板划线纯化、培养，得到纯菌株。该菌株记为细菌MNC-992。分离到的细菌MNC-992的的16S核糖体RNA序列如SEQID No.1所示。
细菌MNC-992于2020年9月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No. 61224。
实施例2：菌株的基因组制备，测序，组装和分析
细菌MNC-992原始菌株的基因组通过超声波法进行序列片段化，片段化长度范围~350bp，然后利用标准DNA建库试剂盒（NEB NEBNext® Ultra™）构建Illumina测序文库。构建好的测序文库利用NovaSeq (Illumina）进行双端150 bp测序。测序得到2.82Gbp数据，其中Q20占比为：97.835%。
基因组原始测序数据使用fastp（版本：0.20.0）进行数据过滤，过滤参数：“-q 15-l 50”。过滤后的原始数据使用SPAdes（版本：v3.13.1）进行基因组组装，组装参数“—isolate --cov-cutoff 10”。基因组组装得到基因总长度2.05 Mbp，N50长度106 kbp， GC含量51.00 %。基因组相似度最高的为：Megasphaera massiliensis NP3， 其中平均核苷酸相似度（ANI）为89.74%，基本可以认定为Megasphaera massiliensis同属不同种的菌株。
基因组基因使用原核分析软件基因组注释流程prokka（版本：1.14.5）进行基因组基因预测分析，参数“—gcode 11 --evalue 1e-09 --coverage 80”。总共预测得到2,224条CDS序列，其中平均CDS序列长度993 bp。
基因组中潜在的抗生素耐药基因使用RGI流程分析（版本：4.2.2），其中抗生素耐药基因数据库为CARD（版本：3.0.0，https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi），仅找到一个tet(W/N/W)耐药基因，其功能主要是增加对四环素类抗生素的耐药性。
基因组中潜在的毒力因子及相关基因的分析采用的是NCBI blastp（版本为：2.9.0）比对毒力因子数据库VFDB（virulence factor database，http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi，更新日期为2·019年9月13日)。比对未找到可产志贺毒素等高致病的毒力基因，详细比对结果见表1。
表 1：通过对毒力因子数据库VFDB比对获得的MNC-992潜在毒性基因列表
Figure 474240DEST_PATH_IMAGE002
实施例3：菌株的抗逆性
体外抗逆性测试所采取的方式是观察细菌在与体内环境相似的模拟液(模拟胃液和模拟肠液)中的存活曲线。为排除菌株在自然情况下的生长/死亡带来的影响，我们以pH=6.8的缓冲溶液作为对照。空腹模拟胃液以浓盐酸稀释法获得pH在1.0（中国药典）或1.2（美国药典）的溶液加入胃蛋白酶制成，考虑到餐前餐后胃液的变化，参考Margareth R.C.Marques等人所发表的文章，我们以pH=3作为餐后的胃液pH，这个酸度也与小鼠的正常胃液pH相似。小肠模拟液则根据美国药典USP26用磷酸二氢钾及氢氧化钠按一定比例配置，pH为6.8。
测试的时长参考人体胃肠道的排空时间，对于耐酸性试验，我们选取2小时作为测试时长，对于胆盐耐受性试验，我们选取6小时为测试时长。
由于测试的取点时间相当密集，涂板的方法操作时间长，受影响因素大，难以保证结果的准确性。因而在本实验中采用MTT（噻唑蓝）染色的方法进行活菌的鉴别。MTT作为一种染料常被当作底物通过检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性来检测细胞的死活。琥珀酸脱氢酶是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子。
琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，形成的甲瓒结晶的量与活细胞数成正比,二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中沉淀的甲瓒，在570 nm波长处测定其光吸收值，可间接测量活细胞的数量。该方法可以免去繁琐的浓度稀释和涂板操作，非常适用于快速进行细菌活率的测定。
一、模拟胃液（ Simulated Gastric Fluid，SGF)
1、称取2.0 g NaCl和2.67 g胃蛋白酶（源叶生物胃蛋白酶，USP级，1:3000)；
2、加入7.0 mL 浓HCl（37%），纯水定容至1000 ml，混匀；
3、调pH分别至pH1.2（模拟人空腹肠液pH）和pH3.0 （模拟人饭后肠液pH及小鼠空腹肠液pH），过滤除菌；
4、将6.8 g 磷酸二氢钾及0.9 g氢氧化钠溶于1000 ml纯水中，调节pH至6.8 ± 0.1，作为实验中使用的缓冲液（缓冲能力18.6 mmol/L/pH）
二、模拟肠液（SIF）- Simulated Intestinal Fluid (SIF)
1、称取6.8 g 磷酸二氢钾以及0.9 g 氢氧化钠到1000 mL 纯水中；
2、加入3 g 胆盐（Sigma-Aldrich, Bile Salts），使溶液胆盐浓度达到0.3%。加入0.1g 胰蛋白酶（源叶生物胰蛋白酶，1:2500），使溶液达到250 U/mL 的酶活力；
3、调节pH至6.8 ± 0.1，过滤除菌。
三、MTT（噻唑蓝）染色剂配置：
称量0.5 g MTT（噻唑蓝 Shanghai Acmec Biochemical Co.ltd, 98%）至100 mL 无菌PBS（磷酸盐缓冲溶液，pH = 7.2）中，完全溶解后过滤除菌，储存于棕色试剂瓶，冷藏于4℃冰箱中。
四、耐酸性测试
1、将待测菌液1 mL加至9 mL的缓冲液中，记为待测菌液混合物；
2、分别准备9 mL缓冲液（对照组）；9 mL pH1.2的模拟胃液（实验组1）；9 mL pH3.0的模拟胃液（实验组2）至离心管中；
3、取步骤1制得的待测菌液混合物1 mL加入步骤一配置的模拟胃液及缓冲液中，摇匀获得样品A（缓冲液组）、样品B（pH1.2模拟胃液组）、样品C(pH3.0模拟胃液组)；
4、在取样时间点取样：在0时时间点对样品A取样（以此为0时数据）；在0.5 h，1 h和2 h时对样品A、B、C取样；
5、取1 mL样品A，B和C加至4 mL 缓冲液中，混匀后取3 mL混悬液加入1 mL MTT（5 mg/mL）染色液，黑暗环境下反应过夜。取3 mL 缓冲液加入1 mL MTT作为空白对照；
6、过夜后，震荡摇匀，取1 mL各反应的样品加入2 mL 二甲基亚砜（DMSO）用于溶解显色物质甲瓒）；
7、在570 nM波长下测量样品的吸光值，并据此推算出活细菌的比例。
五、胆盐耐受性测试（常温条件，超净工作台）
1、将待测菌液2 mL加至含18 mL 的缓冲液的离心管中（缓冲液对照组），将待测菌液2mL加至含18 mL 的模拟肠液的离心管中（模拟肠液组）；
2、取样时间点：0 h（加入菌液混匀后马上取样），0.5 h，1 h，2 h，4 h，6 h；
3、在取样时间点分别取3 mL 对照组和模拟肠液组加入1 mL MTT（5 mg/mL）染色液，黑暗环境下反应过夜；
4、过夜后，震荡摇匀，取1 mL各反应的样品加入4 mL 二甲基亚砜（DMSO）用于溶解显色物质甲瓒）；
5、在570 nM波长下测量样品的吸光值，并据此推算出活细菌的比例。
六、耐酸性测试结果
细菌MNC-992在模拟胃液中以吸光度值为参照的存活曲线见图1。
以对照组的数值为基准，实验组相对于对照组的活菌存活率见表2，结果表明，2小时pH3.0的模拟胃液处理对MNC-992的存活几乎无影响，但该菌株无法抵抗pH1.2的模拟胃液（处理0.5小时后，几乎所有细菌均死亡）。
表2：MNC-992在模拟胃液中的存活率(%)
Figure 922538DEST_PATH_IMAGE004
七、胆盐耐受性测试结果
细菌MNC-992在模拟肠液中以吸光度值为参照的存活曲线见图2。
以对照组的数值为基准，实验组相对于对照组的活菌存活率见表3。结果显示，MNC-992无法抵抗肠液的环境，在处理仅0.5小时后，约80%的细菌即失去活性。
表3：MNC-992在模拟肠液中的存活率(%)
Figure 436696DEST_PATH_IMAGE006
实施例4：细菌MNC-992对巨噬细胞的影响
1、M1及M2型巨噬细胞的诱导形成
近年来的研究表面癌症病人肠道微生物组对肿瘤免疫治疗的效果有重要影响，调节和利用肠道微生也成为肿瘤免疫治疗的关键组成部分。肠道微生物和免疫细胞之间直接相互作用的多种机制已得到证实，肠道淋巴组织中的树突状细胞和巨噬细胞是免疫调节微生物的关键靶细胞，特别是在小肠中，由于肠道表面积大，黏液层薄而弥散，使得微生物可以与免疫细胞紧密接触。微生物菌群中的不同的特异菌株能够抑制或激活整个身体的免疫反应。
巨噬细胞是天然免疫系统中髓样细胞的异质性群体，参与多种生理和病理过程。它们在炎症和感染中特别活跃。在这种情况下，血液单核细胞被招募到组织中，在那里它们分化成巨噬细胞。巨噬细胞具有很高的可塑性，可以根据不同的环境刺激调整其表型。巨噬细胞有两种主要的极化状态，经典活化的1型(M1)和替代活化的2型(M2)。2002年，Mantovani等人将这两种巨噬细胞表型定义为功能状态连续性的极端。M1巨噬细胞是可以产生促炎细胞因子的巨噬细胞，被称为经典型巨噬细胞，常发生在损伤及感染之后。在体外巨噬细胞的经典激活常通过细菌细胞壁（例如LPS）和TNFa或IFNg。M1巨噬细胞的特征在于分泌促炎因子例TNFα, IL-1β, IL-6 和IL-12, IL-8,在炎症早期发挥重要的作用。M2巨噬细胞极化可由不同刺激引起，主要是IL-4和/或IL-13等。被IL-4和IL-13活化的巨噬细胞分泌抗炎细胞因子，如IL-10、CCL18和CCL22，发挥抑制炎症反应及组织修复的作用。
M1巨噬细胞对病原体和肿瘤细胞具有细胞毒性。它们的抗瘤活性与它们分泌活性硝基、活性氧和促炎细胞因子的能力有关。M2巨噬细胞通过分泌许多生长因子例如EGF，TGF-ß 或VEGF等促进肿瘤细胞生长及存活。故通过检测不同菌株诱导巨噬细胞相关促炎因子及抑炎因子表达的检测可以作为判断该菌株是否具有可能得抗肿瘤特征的一个判断指标。
由于巨噬细胞分离过程比较麻烦，常用phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA，Sigma，P8139）诱导THP-1（THP-1是人白血病单核细胞系，由于其与PBMC来源的单核细胞具有相似的反应，故被广泛用于研究单核细胞或单核来源的巨噬细胞免疫反应能力的模型）单核细胞系分化而成的M0巨噬细胞作为研究巨噬细胞功能的体外细胞模型。该巨噬细胞模型，具有以下优点：易于获取，分化及极化，且其经诱导分化的M1及M2巨噬细胞与极化的原始巨噬细胞具有相同的表达类型。
在培养过夜的人单核细胞白血病细胞THP-1（武汉普诺赛生命科技有限公司）中加入PMA至终浓度为12.5 ng/ml，继续培养48 hr后，根据以下两个标准判断M0细胞诱导是否成功：
（1）细胞是否贴壁；
（2）流式检测CD14，CD68 表达确认是否诱导成功(CD14表达下调，CD68表达上调)。
收集诱导成功的M0细胞，加入20 ng/ml IFNg + 10 pg/ml lipopolysaccharide,LPS诱导24 hr诱导M1类型巨噬细胞形成，加入20 ng/ml IL-4 + 20 ng/ml IL-13诱导24hr诱导M2型巨噬细胞形成。
2、细菌MNC-992对巨噬细胞的影响
本实验旨在观察不同浓度的细菌MNC-992诱导M0型巨噬细胞向M1或M2型细胞的分化。实验方案如下：
（1）使用终浓度为5 ng/ml的 PMA处理THP-1 48 hr 使其分化为M0巨噬细胞；
（2）M0巨噬细胞与MNC-992进行共孵育24 hr。按照MOI（活菌数：细胞数）= 10及MOI = 1的比例加入细菌MNC-992，同时设置M1巨噬细胞对照组 (M0细胞经20 ng/ml IFNg + 10pg/ml lipopolysaccharide, LPS诱导24 hr)和M2巨噬细胞对照组（20 ng/ml IL-4 + 20ng/ml IL-13诱导24 hr），厌氧培养1 hr后加入下述表4中所列抗生素组合杀死细菌。
表4：使用抗生素列表
Figure 363064DEST_PATH_IMAGE008
（3）菌株与巨噬共孵育24hr后，收集上清用ELISA方法检测其分泌的细胞因子浓度（图3-6）。
结果表面，和细菌MNC-992共培养后，巨噬细胞明显表现出向M1型巨噬细胞分化的特征，具体来说，其IL-6，IL-8，CXCL-10的分泌都有非常显著的增加，TNFa分泌也有一定程度的增加，但未若其他三个细胞因子增加幅度明显。
实施例5：M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后细胞因子变化的跟踪
天然免疫系统依赖病原体识别受体（pathogen recognition receptors, PRRs）来识别侵入的病原体保守的分子结构PAMPs，比如LPS，启动系统炎症反应，比如致炎或抗炎细胞因子基因表达上调，在革兰氏阴性菌感染引起的宿主反应的起始阶段发挥重要作用。
一些转录因子与炎症相关的细胞因子和炎症相关的酶基因的表达直接或间接相关。NF-κB参与 IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα、iNOS和COX-2的转录调控；AP-1与IL-8和TNFα的转录相关，而AP-1的激活需要c-JUN和c-Fos形成二聚体结合到AP-1的启动子区；转录因子SP-1调控IL-10的转录。
细胞受到攻击发生的免疫反应一般通过检测培养基中的细胞因子，但是这需要暴露较长时间（数小时）才能达到检测的阈值，这又会启动其它信号通路。另外，细胞因子的分泌与细胞因子相关基因和其上游转录因子部分相关，因为在转录和翻译过程中还有复杂的调控。因此，检测炎症相关的细胞因子、酶和转录因子的mRNA水平有重要的价值。
肠道微生物与天然免疫细胞相互作用后会诱导巨噬细胞分泌致炎或抗炎细胞因子，启动适应性免疫。Bertrand Routy等2018年报道，口服Akkermansia muciniphila可以使FMT无应答肿瘤病人粪便的小鼠恢复PD-1抗体的抗肿瘤的效力。这是通过IL-12增加CCR9+CXCR3+CD4+T细胞的肿瘤浸润。IL-12由p35和p40两个亚基组成，属于IL-12细胞因子家族（IL-12、IL-23、IL-27和IL-35），每个成员都由α亚基(IL-12p35，IL-23p19和IL-27p28)和β亚基(IL-12p40，Ebi3)组成。每个亚基分布在独立染色体上，并单独调控。p40分别与p35和p19组合形成炎症相关的细胞因子IL-12和IL-23；Ebi3分别与p35和p28组合形成免疫抑制的细胞因子IL-35和IL-27。IL-12家族细胞因子在调控适应性免疫的起始、强度、持续时间和效果方面具有重要作用。
iNOS也是验证炎症反应的指标之一，除了LPS能诱导iNOS表达外，多种细菌也能诱导iNOS在巨噬细胞中表达。IFNb在肿瘤免疫中发挥着非常重要的免疫调节和抗肿瘤作用，STNG激动剂通过诱导IFNb的表达发挥抗肿瘤作用，在肿瘤中的治疗方面获得了重大突破。细菌可能通过某种途径诱导IFNb的表达来发挥抗肿瘤作用，故IFNb也是本研究的关注指标。
本研究旨在通过qPCR的方法全面观察MNC-992对M0巨噬细胞的影响。方法如下：
1、将THP-1细胞稀释到1.5 X 107细胞/ml后加入到12孔板中（1 ml/孔）。用5 ng/mlPMA诱导48 h成M0；用20 ng/ml IFNγ和100 ng/ml LPS诱导成M1, 20 ng/ml IL-4/IL-13诱导成M2作为对照。
2、以三个不同MOI（细菌：细胞）=1、10、30将MNC-992加入诱导出的M0巨噬细胞中，厌氧工作台培养1 h，共培养结束后在超净台内向共培养物中加入表2所列抗生素，后将12孔板转入37℃，5% CO2的培养箱培养6 h，将上清-80 ℃保存；
3、用RNA提取试剂盒（天根，DP430）提取总RNA，50 μl无RNAse水洗脱后，检测所获RNA浓度，并于-80℃冻存。
4、qPCR（实时定量PCR）反应条件如下：
（1）10 μl MIX（2 μl 10 X Fast RT buffer, 1μl RT enzyme mix, 2μl FQ-RTPrimer Mix, 5μl RNase-Free ddH2O），42 ℃，15 min；95 ℃，3 min置于冰上；
（2）使用实时荧光定量核酸扩增检测系统Q-PCR: Talent qPCR PreMix (SYBR Green)（天根，FP209），20 μl反应体系含有的成分如表5所示：
表5： 20 μl反应体系所含有的成分及含量列表
Figure 974174DEST_PATH_IMAGE010
PCR条件如表6所示：
表6：PCR条件列表
Figure 62216DEST_PATH_IMAGE012
所用引物为如表7所示：
表7：所用引物列表
Figure 125987DEST_PATH_IMAGE014
统计分析方法为：
ΔCt = Ct (target)-Ct (β-actin)
ΔΔCt = ΔCt (sample)- ΔCt (M0)
结果以相对M0靶基因表达的比值 =2^-ΔΔCt表示。
M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-1β的情况如图7所示。
M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-6的情况如图8所示。
M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-8的情况如图9所示。
M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-10的情况如图10所示。
M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生TNF-α的情况如图11所示。
M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生IL-12A的情况如图12所示。
M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生NF-kB的情况如图13所示。
M0巨噬细胞经细菌MNC-992诱导后24 hr内产生CXCL0的情况如图14所示。
实施例6：细菌MNC-992的培养方法
用灭菌牙签从细菌MNC-992本身分裂繁殖的众多单菌落中挑取一个单克隆到10 ml的AC液体培养基（每升含：蛋白胨20 g、葡萄糖5 g、酵母粉3 g、牛肉膏3 g、维生素C0.2 g，pH7.0）中培养1天，取1 ml培养液进行16S RNA鉴定，经与NCBI数据库中序列比对鉴定结果正确后，吸取2 ml菌悬液转接入80 ml AC液体培养基中于厌氧操作台培养。
培养24小时后，吸取30 ml菌悬液转接入400 ml AC液体培养基中于厌氧操作台培养。培养24小时后，取1 ml菌液进行16S RNA鉴定，经与NCBI数据库中序列比对鉴定结果正确后，将全部菌液转移到I L离心瓶中，6000 rpm，4 ℃离心30 min。取沉淀用AC 液体培养基：无菌甘油（体积比为4：1）重悬。
将菌液甘油混合液吸取0.1 ml菌株冻存液加入0.9 ml生理盐水中进行梯度稀释，稀释至10-8梯度，取浓度为10-6，10-7、10-8梯度的稀释液100 μl分别加入厌氧血平板培养基上，加入玻璃珠摇匀，采用平板计数法测定其CFU。
将制作好的菌株冻存液分装于无菌冻存管中，每管分装0.2 ml菌液，每株菌分装10管。冷冻于-80 ℃冷冻保存。待完全冷冻后（24 h），取出一管冻存细菌，融化至室温，并采用稀释涂布法测量其活菌浓度（CFU）。
实施例7：口服细菌MNC-992用于肿瘤治疗结直肠癌
为验证细菌MNC-992是否可以用于肿瘤的预防和治疗，我们利用小鼠同源肿瘤模型进行了抑制结直肠癌的生长的实验。本实验通过了慕恩生物动物伦理委员会伦理审查。
C57B/6小鼠购自南京模式动物中心，小鼠结直肠癌细胞MC38购自ATCC，抗鼠PD-1抗体（克隆号RMP1-14）购自Bio X Cell。
小鼠被通过p.o.方式被喂食MNC-992细菌，MNC-992解冻后放置于室温至其温度达到室温，后按照每只小鼠2×109 CFU （colony formation unit）的剂量喂食，连续七天。
在喂食MNC-992七天后，在小鼠右腿后侧接种MC38，接种量为每只小鼠5 ×105。接种当天收集细胞，细胞经PBS洗涤细胞一次后，用PBS重悬，并对细胞悬液进行计数。 调整细胞浓度至1×107，与已预冷的Matrigel进行1：1混合均匀后注射0.1 mL至小鼠皮下。接种肿瘤日设为D0天。
种瘤后小鼠持续进行喂食MNC-992治疗直至实验结束，喂食方法同上。
在种瘤后第7，10，14，17，21天皮下注射抗鼠PD-1抗体，注射剂量为每次每只小鼠100 μg。
每两天量取种瘤大小，通过公式：
肿瘤体积 = （1/2）×肿瘤长径2×种瘤宽径
计算种瘤体积。
除实验组（MNC-992+PD-1）外，实验同时设置两组对照，分别为仅使用PD-1治疗组（PD-1）和不进行任何治疗的对照组（Control）。
结果显示，非治疗组肿瘤快速生长，在D18达到约3000 mm3，PD-1治疗组的肿瘤生长速度略低于对照组，但两组无显著性差异，MNC-992和PD-1治疗组在第18天肿瘤体积为约1000 mm3，生长速度明显慢于对照组和PD-1治疗组。该实验证明细菌MNC-992可以在PD-1存在的情况下明显降低结直肠癌的生长速度（图15）。
实施例8：口服细菌MNC-992用于治疗肝癌
为验证细菌MNC-992是否可以用于肿瘤的预防和治疗肝癌，我们利用小鼠同源肿瘤模型进行了抑制肝癌的生长的实验。本实验通过了慕恩生物动物伦理委员会伦理审查。
BALB/c小鼠购自南京模式动物中心，小鼠肝癌细胞H22购自ATCC，抗鼠PD-1抗体（克隆号RMP1-14）购自Bio X Cell。
小鼠被通过p.o.方式被喂食MNC-992细菌，MNC-992解冻后放置于室温至其温度达到室温，后按照每只小鼠2×109 CFU （colony formation unit）的剂量喂食，连续七天。
在喂食MNC-992七天后，在小鼠右腿后侧接种H22，接种量为每只小鼠1×105。接种当天收集细胞，细胞经PBS洗涤细胞一次后，用PBS重悬，并对细胞悬液进行计数。 调整细胞浓度至2×106，与已预冷的Matrigel进行1：1混合均匀后注射0.1 mL至小鼠皮下。接种肿瘤日记为D0天。
种瘤后小鼠持续进行喂食MNC-992治疗直至实验结束，喂食方法同上。
在种瘤后第7，10，14，17，21天皮下注射抗鼠PD-1抗体，注射剂量为每次每只小鼠100微克μg。
除实验组（MNC-992+PD-1）外，实验同时设置三组对照，分别为仅使用PD-1治疗组（PD-1），MNC-992组（MNC-992）和不进行任何治疗的对照组（CT）。
每两天量取种瘤大小，通过公式：
肿瘤体积 = （1/2）×肿瘤长径2×种瘤宽径
计算种瘤体积。
结果显示，非治疗组肿瘤快速生长，在D20达到约3000 mm3，MNC-992治疗组的肿瘤生长速度略低于对照组，但两组无显著性差异，PD-1治疗组在D20的平均体积约为2500mm3，MNC-992和PD-1治疗组在第18天肿瘤体积为约1600 mm3，生长速度明显慢于对照组和PD-1治疗组。该实验证明MNC-992可以在PD-1存在的情况下明显降低肝癌的生长速度（图16）。
实施例9：口服细菌MNC-992用于治疗乳腺癌
为验证MNC-992是否可以用于肿瘤的预防和治疗乳腺癌，我们利用小鼠同源肿瘤模型进行了抑制乳腺癌的生长的实验。本实验通过了慕恩生物动物伦理委员会伦理审查。
BALB/c小鼠购自南京模式动物中心，小鼠乳腺癌细胞JC-1购自ATCC，抗鼠PD-1抗体（克隆号RMP1-14）购自Bio X Cell。
小鼠被通过p.o.方式被喂食MNC-992细菌，MNC-992解冻后放置于室温至其温度达到室温，后按照每只小鼠2×109 CFU的剂量喂食，连续七天。
在喂食MNC-992七天后，在小鼠右腿后侧接种JC-1，接种量为每只小鼠8×105。接种当天收集细胞，细胞经PBS洗涤细胞一次后，用PBS重悬，并对细胞悬液进行计数。 调整细胞浓度至1.6×107，与已预冷的Matrigel进行1：1混合均匀后注射0.1 mL至小鼠皮下。接种肿瘤日设为D0天。
种瘤后小鼠持续进行喂食MNC-992治疗直至实验结束，喂食方法同上。
在种瘤后第7，10，14，17，21天皮下注射抗鼠PD-1抗体，注射剂量为每次每只小鼠100 微克μg。
除实验组（MNC-992+PD-1）外，实验同时设置三组对照，分别为仅使用PD-1治疗组（PD-1），MNC-992组（MNC-992）和不进行任何治疗的对照组（CT）。
每两天量取种瘤大小，通过公式：
肿瘤体积 =（1/2）×肿瘤长径2×种瘤宽径
计算种瘤体积。
结果显示，非治疗组肿瘤快速生长，在D18达到约3000 mm3，PD-1治疗组的肿瘤生长速度略低于对照组，但两组无显著性差异，MNC-992和PD-1治疗组在第18天肿瘤体积为约1000 mm3，生长速度明显慢于对照组和PD-1治疗组。该实验证明细菌MNC-992可以在PD-1存在的情况下明显降低乳腺癌的生长速度（图17）。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 慕恩（广州）生物科技有限公司
<120> 一种Megasphaera属的细菌MNC-992及其培养方法和应用
<130> 2020
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> Megasphaera elsdenii
<400> 1
acgagaagag atgagaagct tgcttcttat caattcgagt ggcaaacggg tgagtaacgc 60
gtaagcaacc tgcccttcag atggggacaa cagctggaaa cggctgctaa taccgaatac 120
gttctttccg ccgcatgacg ggatgaagaa agggaggcct tcgggctttc gctggaggag 180
gggcttgcgt ctgattagct agttggaggg gtaacggccc accaaggcga cgatcagtag 240
ccggtctgag aggatgaacg gccacattgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagtg gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgaac 360
gatgacggcc ttcgggttgt aaagttctgt tatatgggac gaacaggata gcggtcaata 420
cccgttatcc ctgacggtac cgtaagagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc gcgcaggcgg 540
catcgcaagt cggtcttaaa agtgcggggc ttaaccccgt gaggggaccg aaactgtgaa 600
gctcgagtgt cggagaggaa agcggaattc ctagtgtagc ggtgaaatgc gtagatatta 660
ggaggaacac cagtggcgaa agcggctttc tggacgacaa ctgacgctga ggcgcgaaag 720
ccaggggagc aaacgggatt agataccccg gtagtcctgg ccgtaaacga tggatactag 780
gtgtaggagg tatcgactcc ttctgtgccg gagttaacgc aataagtatc ccgcctgggg 840
agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagt 900
atgtggttta attcgacgca acgcgaagaa ccttaccaag ccttgacatt gattgctacg 960
gaaagagatt tccggttctt cttcggaaga caagaaaaca ggtggtgcac ggctgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct atcttctgtt 1080
gccagcacta agggtgggga ctcagaagag actgccgcag acaatgcgga ggaaggcggg 1140
gatgacgtca agtcatcatg ccccttatgg cttgggctac acacgtacta caatggctct 1200
taatagaggg aagcgaagga gcgatccgga gcaaacccca aaaacagagt cccagttcgg 1260
attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc aggaatcgct agtaatcgca ggtcagcata 1320
ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg aaagtcattc 1380
acacccgaag ccggtgaggc aacc 1404

Claims (7)

1.一种Megasphaera属的细菌MNC-992，其特征在于，所述细菌MNC-992于2020年9月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No. 61224。
2.根据权利要求1所述的一种Megasphaera属的细菌MNC-992，其特征在于，所述细菌MNC-992的16S核糖体RNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种Megasphaera属的细菌MNC-992，其特征在于，其具备对四环素类抗生素的耐药性。
4.根据权利要求1所述的一种Megasphaera属的细菌MNC-992，其特征在于，其在低至3.0的pH下正常存活的能力。
5.如权利要求1～4任一项所述一种Megasphaera属的细菌MNC-992的培养方法，其特征在于，利用AC液体培养基培养所述细菌MNC-992；所述AC液体培养基中每升含：蛋白胨20 g、葡萄糖5 g、酵母粉3 g、牛肉膏3 g、维生素C0.2 g；所述AC液体培养基pH为7.0。
6.根据权利要求5所述的一种Megasphaera属的细菌MNC-992的培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）用灭菌牙签从细菌MNC-992本身分裂繁殖的众多单菌落中挑取一个单克隆到10 ml的所述AC液体培养基中培养1天；
（2）取1 ml培养物进行16S RNA鉴定，经与NCBI数据库中序列比对鉴定结果正确后，吸取2 ml菌悬液转接入80 ml AC液体培养基中于厌氧操作台培养；培养24小时后，吸取30 ml菌悬液转接入400 ml AC液体培养基中于厌氧操作台培养；培养24小时后，取1 ml菌液进行16S RNA鉴定，经与NCBI数据库中序列比对鉴定结果正确后，将全部菌液转移到I L离心瓶中，在6000 rpm，4 ℃条件下离心30 min；
（3）取沉淀用AC液体培养基和无菌甘油的混合液重悬，即为菌液甘油混合液，其中AC液体培养基和无菌甘油的体积比为4:1；将菌液甘油混合液分装于无菌冻存管中，冷冻于-80℃保存。
7.如权利要求1～4任一项所述一种Megasphaera属的细菌MNC-992的应用，其特征在于，所述细菌MNC-992用于制备预防和治疗结直肠癌、肝癌或乳腺癌的药物。
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