CN116731894A - 一种巨球形菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一种巨球形菌菌株，包含巨球形菌以及其应用。所述应用包括增强免疫系统功能，治疗癌症，缓解癌症免疫疗法带来的免疫相关副反应。

Description

一种巨球形菌菌株及其应用
保藏信息
细菌XA-511于2021年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类命名为巨球形菌，保藏编号为CGMCC No.23400。
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种巨球形菌属细菌及其应用。
背景技术
人体微生物群丰富多样，主要存在于体内和体表。研究表明，人体微生物有巨大的潜力，通过影响人体的代谢功能、抵御病原体、免疫系统等直接或间接参与健康和疾病变化过程。
肠道微生物群是宿主消化和产生营养不可或缺的一部分，它们可以从宿主难以消化的物质中产生营养。微生物分泌的成分不仅可以防止外来病原体的定植，还可以通过促进细胞增殖和分化来支持肠道修复。例如，微生物可以从人体难以消化吸收的膳食纤维中产生和释放短链脂肪酸，作为肠道粘膜的重要能量来源，对于调节肠道免疫反应和肿瘤发生至关重要。微生物群与宿主免疫系统之间的相互作用是复杂、双向的动态过程。越来越多的研究开始关注微生物群对肠道内外免疫稳态的影响，从而探究疾病的发病机制和治疗。
发明内容
本发明提供巨球形菌属细菌，其保藏编号为CGMCC No.23400。
本发明还提供巨球形菌属细菌，其16S rRNA基因包括SEQ ID NO：1所示序列。
本发明还提供药物组合物，包括：前述巨球形菌属细菌的活菌、灭活菌和/或其培养上清液。
在一些实施方案中，还包括：以及药学可接受的载体。
在一些实施方案中，所述药学可接受的载体为口服剂、注射剂、片剂、粉剂或混悬液。
在一些实施方案中，所述药物组合物的给药方式为进入消化系统，进一步优选为口服或灌肠；或所述药物组合物的给药方式为瘤内注射。
在一些实施方案中，还包括：癌症免疫治疗剂。
在一些实施方案中，所述癌症免疫治疗剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，所述癌症为乳腺癌。
本发明还提供增强免疫系统功能的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的前述巨球形菌属细菌或有效量的前述药物组合物。
在一些实施方案中，所述方法通过活化巨噬细胞增强免疫系统功能。
本发明还提供治疗癌症的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的前述巨球形菌属细菌或有效量的前述药物组合物。
在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。
本发明还提供减轻癌症免疫治疗剂所引起的细胞因子风暴的方法，包括给经受所述免疫治疗剂治疗的癌症患者施用前述巨球形菌属细菌或前述药物组合物。
在一些实施方案中，所述癌症为乳腺癌。
本发明还提供产生短链脂肪酸的方法，包括：
培养前述巨球形菌属细菌；以及
从培养上清液中分离所述短链脂肪酸。
在一些实施方案中，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和/或己酸。
在一些实施方案中，使用PYG培养基或含乙酸的培养基培养所述细菌，优选使用ATCC2107培养基培养所述细菌。
在一些实施方案中，用于培养所述细菌的培养基中含有葡萄糖、甘露醇、果糖、麦芽糖、乳糖和/或乳酸作为碳源。
在一些实施方案中，所述方法包括培养所述细菌，并从培养上清液中分离丁酸。
在一些实施方案中，所述方法包括下述任一方案：
i)使用PYG培养基培养所述细菌，并从培养上清液中分离丁酸、异戊酸、戊酸和/或己酸；
ii)使用含有乙酸的培养基培养上述细菌，并从培养上清液中分离丁酸、异戊酸、戊酸和/或己酸，所述含有乙酸的培养基优选ATCC2107培养基；
iii)使用以葡萄糖、甘露醇和/或果糖作为碳源的培养基培养所述细菌，并从培养上清液中分离丁酸。
iv)使用以麦芽糖作为碳源的培养基培养所述细菌，并从培养上清液中分离乙酸、丙酸和/或丁酸；或
v)使用以乳酸作为碳源的培养基培养所述细菌，并从培养上清液中分离乙酸和/或丙酸。
本发明还提供前述巨球形菌属细菌或前述药物组合物在制备用于增强免疫系统功能、治疗癌症或减轻癌症免疫治疗剂所引起的免疫相关副反应的药物中的用途。
在一些实施方案中，其中所述癌症免疫治疗剂所引起的免疫相关副反应是细胞因子风暴，其中所述癌症免疫治疗剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
附图说明
图1显示了XA-511菌株在平板上的生长状况。
图2为扫描电子显微镜下的XA-511形貌图。
图3为XA-511菌株基因岛中基因分布统计图。
图4为XA-511-Chr1全基因组图谱。
图5A显示了XA-511菌株暴露于环境氧中0h、0.5h、2h、8h以及24h后再于适宜厌氧条件下培养48-72h的活菌计数统计结果。图5B为XA-511菌株暴露于环境氧中不同时间条件的菌落生长照片。图中从左到右依次为：0h，10-5稀释液涂板菌落生长照片；0.5h，10-5稀释液涂板菌落生长照片；2h，10-1稀释液涂板菌落生长照片；8h，未稀释原液涂板菌落生长照片；24h，未稀释原液涂板菌落生长照片。
图6显示了XA-511菌株样本与巨噬细胞共培养后的巨噬细胞存活率。N＝3，数据通过One-way ANOVA进行统计分析，p值小于0.05被认为具有统计显著性差异。*p<0.05，**p<0.01,****p<0.0001。
图7显示了XA-511菌株(活菌(LV)、热灭活菌(HK)和无菌上清液(SN))刺激巨噬细胞产生细胞因子以及调节脂多糖诱导的巨噬细胞免疫反应的情况。(A)XA-511活菌(LV)、热灭活菌(HK)和无菌上清液(SN)刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子TNF-α；(B)XA-511活菌(LV)、热灭活菌(HK)和无菌上清液(SN)刺激巨噬细胞产生白细胞介素IL-6；(C)XA-511活菌(LV)、热灭活菌(HK)和无菌上清液(SN)影响LPS诱导巨噬细胞产生TNF-α；(D)XA-511活菌(LV)、热灭活菌(HK)和无菌上清液(SN)影响LPS诱导巨噬细胞产生IL-6；(E)XA-511活菌(LV)、热灭活菌(HK)和无菌上清液(SN)影响LPS诱导巨噬细胞产生IL-10。N＝3，数据通过One-way ANOVA进行统计分析，p值小于0.05被认为具有统计显著性差异。*p<0.05，**p<0.01,****p<0.0001。
图8A显示了XA-511菌株在PYG培养基中产生的各短链脂肪酸含量，其中PYGcontrol代表原PYG培养基中各短链脂肪酸的含量。图8B显示了XA-511菌株在ATCC2107培养基中产生的各短链脂肪酸含量，其中ATCC control代表原ATCC2107培养基中各短链脂肪酸的含量。
图9显示了菌株XA-511在不同碳源的TPY培养基中产生短链脂肪酸的量。
图10显示了小鼠乳腺癌4T1肿瘤生长曲线。N＝10，数据通过One-way ANOVA进行统计分析，p值小于0.05被认为具有统计显著性差异。*p<0.05，**p<0.01。
图11为4T1小鼠乳腺癌在21天时的各组肿瘤照片。
图12为各组肿瘤组织多重免疫荧光染色代表性图片。其中，T细胞(红色CD4、紫红色CD8)、树突状细胞DC(亮蓝色CD11c)，细胞因子INF-γ(黄色)，细胞核(DAPI，蓝色)
图13显示了肿瘤组织中T细胞和树突状细胞(DC)的浸润密度(N＝5)统计结果，数据使用T-test检验分析，*p＜0.05显著差异，**p＜0.01有非常显著差异。
图14显示了乳腺癌小鼠血浆中细胞因子的含量结果(N＝5-8)。数据通过One-wayANOVA进行统计分析，p值小于0.05被认为具有统计显著显著性差异。*p<0.05，
**p<0.01,****p<0.0001。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
本文所用术语“约”表示给定数值的±10％范围内的值。
本文所用术语“包含”、“含有”、“具有”以及类似的表述表示不排除未列举的要素。这些术语也包括仅由所列举的要素组成的情形。
本文使用的术语“序列同一性”指两氨基酸或核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基或碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。常用的序列对比算法或软件包括DANMAN、CLUSTALW、MAFFT、BLAST、MUSCLE等。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/获得)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。
本文使用的术语“短链脂肪酸”，除非另有说明，通常指具有不超过十个碳原子，优选不超过六个碳原子并具有脂肪酸。“脂肪酸”是具有脂族尾(或脂族链)的羧酸，并且可以是饱和的或不饱和的。短链脂肪酸可以包括具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子或更多碳原子的脂肪酸。短链脂肪酸的实例包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸，还可以包含它们的盐或酯。本发明中，如无特别说明，当提及“丁酸”时，表示正丁酸，当提及“戊酸”时，表示“正戊酸”，当提及“己酸”时，表示“正己酸”。
本文所使用的术语“活菌”是指保留其代谢活性和繁殖能力，即在适宜的条件下可以生长和繁殖的细菌。活菌可以经过加工(如干燥)或被配制成制剂，例如口服制剂，但仍保留其生存能力。
本文所使用的术语“灭活菌”是指代谢活性或繁殖能力已经基本不存在的细菌。灭活菌可能经物理或化学方法处理以丧失生长与繁殖能力，但仍然基本上保持菌体的形态，并且保留至少一部分细菌的蛋白质、DNA/RNA和或其它内含物质。制备灭活菌的常用方法包括热灭活(例如使用水浴或金属浴进行)、杀菌剂(例如环氧乙烷、臭氧)灭活、辐射(如紫外线)灭活等。热灭活可以是在80-120℃范围内的温度下处理10-60分钟，例如在100-110℃范围内的温度下处理10-15分钟。在一个具体实例中，以110℃金属浴15min处理培养的细菌以获得热灭活菌。
本文所使用的术语“上清液”、“无菌上清液”或“培养上清液”指从细菌培养物除去菌体后的剩余部分，其中含有细菌产生的各种代谢物(例如实施例中描述的各种短链脂肪酸)。从细胞培养物获得上清液的方法可包括离心和/或无菌过滤。
本文使用的术语“预防”指避免、减少、或延迟受试者中特定疾病或疾病相关症状的出现，并且在相关药物给药前这种疾病或疾病相关症状的还没有出现。“预防”并非需要完全阻止疾病或疾病相关症状的出现，例如，在相关药物给药后可以减小受试者出现特定疾病或疾病相关症状的风险，或者减弱后来出现的相关症状的严重程度，均可认为是“预防”了该疾病的出现或发展。
本文使用的术语“治疗”指缓解、减轻、改善、或抑制(例如，阻止发展)受试者已经表现出的或曾经出现过的疾病。就具体疾病来说，“治疗”可以包括“治愈”该疾病，但大多数情况下并不需要完全消除其所有症状，例如，以相关药物给药导致受试者至少一种症状减弱或消除，则可认为是对受试者进行了治疗。
本文使用的术语“免疫治疗”指通过诱导、增强或抑制细胞、组织或器官中的免疫应答来辅助治疗疾病的过程。术语“免疫治疗剂”是指用于免疫治疗的活性物质，包括但不限于免疫检查点分子调节剂(例如，针对免疫检查点蛋白的抗体，如针对PD-1或PD-L1的抗体)、白介素(例如，IL-2，IL-7，IL-12，IL-15)，细胞因子(例如，干扰素，G-CSF，咪喹莫特)，趋化因子(例如，CCL3，CCL26，CXCL7)、疫苗(例如，肽疫苗，树突细胞(DC)疫苗，EGFRvIII疫苗，间皮素(mesothilin)疫苗，G-VAX，李斯特氏菌疫苗)和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。
本文使用的术语“细胞因子风暴”也可称为“细胞因子级联”或“高细胞因子血症”，是一种通常由细胞因子和免疫细胞之间的未受控正反馈回路引起的潜在致命免疫反应，伴有多种细胞因子水平的高度升高(例如INF-γ、IL-10、IL-6、CCL2等)。
本文使用的术语“受试者”指患有疾病或者具有患该疾病的风险的个体。该术语通常可以和与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。在本发明中，受试者包括动物，例如脊椎动物，特别是哺乳动物，如家禽、猪、猫、狗、马、羊、兔、小鼠、大鼠等。在一些实施方案中，本发明中的受试者可以是人。
本文使用的术语“药物组合”指在一个时间段内(例如同时，或相差几分钟到几小时，或甚至相差几天或几周)向受试者给药的两种或更多种药物的组合。所述两种或更多种药物可以被配制为同一制剂，或者也可以分别被配制成不同的制剂。
本文使用的术语“联合给药”指上述药物组合的施用方式，包括各药物活性成分同时或在一个时间段内(例如同时，或相差几分钟到几小时，或甚至相差几天或几周)先后地向受试者给药。
本文使用的术语“治疗有有效量”或“有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应(例如预防或治疗特定疾病)的活性化合物或细菌的量。具体的“有效量”值可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。
细菌菌株
本发明提供巨球形菌属细菌。巨球形菌(Megasphaera)是革兰氏阴性球菌。本发明中，优选的巨球形菌是Megasphaera indica，更加优选是在本文中被称为Megasphaerasp._XA-511或XA-511，其属于Megasphaera indica，。菌株XA-511由发明人从健康供体的新鲜粪便样本中分离获得，经形态学、培养特性、生理生化特性和16S rRNA分析，鉴定为Megasphaera indica。菌株XA-511于2021年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.23400。菌株XA-511的16SrRNA的基因序列如SEQ ID NO:1所示。优选地，用于本发明的细菌菌株具有如SEQ IDNO:1所示的16S rRNA基因序列。
菌株XA-511具有以下特征：
其形态特征、培养特征和生理生化特征包括：具有如下特征：
-在细菌平板固体培养基上，厌氧培养24-72h后菌落呈淡黄色，圆形，菌落直径为2.0-5.0mm，表面湿润，不透明，边缘整齐；
-在显微镜下观察，菌体呈圆形，直径0.8-1.6μm，单个或多个成线，革兰氏阴性；易聚集，二分裂方式繁殖，扫描电镜下可观察到表面褶皱。
-适合于厌氧条件下生长，暴露于环境氧2h以上，显著影响菌株生长；但当暴露于环境氧中0.5h以内，其生长能力基本不受影响。
-采用ANC卡检测碳源利用和酶活性的生化检测(36项)显示该菌株XA-511ELLMAN反应结果为阳性，其他项目检测结果为阴性。
其耐药性特征包括：对氨苄西林有一定耐药性，对大多数常见抗生素都较为敏感，包括甲硝唑、莫西沙星、克林霉素、哌拉西林、亚胺培南和头孢噻肟等。
其代谢特征包括：可以葡萄糖、甘露醇、果糖、麦芽糖和/或乳酸等为碳源生长，并能代谢产生丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和己酸等短链脂肪酸。
-在PYG培养基中培养可产生丁酸、异戊酸、戊酸和己酸等短链脂肪酸(从培养上清液中检测)；
-在含有乙酸的培养基(例如ATCC2107培养基)中培养可产生大量丁酸、异戊酸、己酸，同时也产生戊酸；
-在以葡萄糖、甘露醇或果糖为碳源的培养基中培养时，菌株XA-511可以代谢产生一定量的丁酸；
-在以麦芽糖为单一碳源的培养基中培养时，菌株XA-511除产生丁酸外，还能产生一定量丙酸和大量乙酸；而将麦芽糖替换成乳酸时，XA-511产生乙酸的量相对减少，同时丙酸的量大幅提升。
其基因组特征包括：
具有如SEQ ID NO:1所示的16S rRNA基因序列；具有环状基因组，基因组总长度约2407426bp，GC含量约53.67％，基因数量约4,566个，基因岛数量7个，前噬菌体数量23个，CRISPR数量为1个，不具有TNSS；具有潜在的耐药基因Ugd、Nocardia和MacB(其功能分别是对肽类、利福霉素以及大环内酯类抗生素的耐药性)。
细菌菌株可以用任何适当的方法进行鉴定。例如，细菌菌株可以通过16S rRNA或23S rRNA测序来鉴定，或者可以通过全基因组测序来鉴定。当需要时，可以通过上述形态特征、培养特征、生理生化特征、代谢特征、基因组特征中的任何一个或更多个特征鉴定细菌菌株。
本发明的细菌菌株还包括其后代，或经过培养的亚克隆菌株，它们可能具有遗传水平上的自然突变，但仍保持原有的生物学活性(例如本发明所述的治疗活性或产短链脂肪酸的活性)。
本发明的细菌菌株可以采用任何适合于巨球形菌的培养基进行培养，所述培养基可以是液体培养基或固体培养基。所述培养基包括但不限于强化梭菌培养基(ATCC 2107)、PYG(Peptone Yeast Extract)培养基、和TPY培养基等。
所述强化梭菌培养基(ATCC 2107)为液体培养基，其每升含：蛋白胨(tryptose)10.0g，牛肉提取物(beefextract)10.0g，右旋葡萄糖(dextrose)5.0g，酵母提取物(yeastextract)3.0g，氯化钠(NaCl)5.0g，半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine HCl)0.5g，可溶性淀粉(Soluble Starch)1.0g，乙酸钠3.0g，琼脂(agar)0.5g，余量为水，调节pH＝7.0±0.1。
所述PYG培养基为液体培养基，其每升含：蛋白胨(tryptose)20.0g，右旋葡萄糖(dextrose)5.0g，酵母提取物(yeast extract)10.0g，氯化钠(NaCl)0.08g，半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine HCl)0.5g，氯化钙(CaCl2)0.008g，硫酸镁(MgSO4)0.008g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.04g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.04g，碳酸氢钠(NaHCO3)0.5g，余量为水，调节pH＝7.0±0.1。
所述TYP培养基为液体培养基，其每升含：乳糖10.0g，牛肉提取物(beefextract)5.0g，酵母提取物(yeast extract),5.0g，酪蛋白胨(casein peptone)10.0g，大豆蛋白胨(soy peptone)5.0g，吐温80(Tween-80)0.25g，水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.1g，磷酸氢二钾(K2HPO4)2.5g，磷酸二氢钾(KH2PO4)2.5g，半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine HCl)0.5g，余量为水，调节pH＝7.0±0.1。
菌株XA-511可以利用多种碳源生长。这些碳源包括但不限于选自葡萄糖、甘露醇、果糖、麦芽糖、乳糖和乳酸的任意一种或其组合。本发明的细菌菌株可以采用含有这些碳源的培养基进行培养，或者还可以对所使用的培养基的成分进行调整，例如用在培养基中添加这些碳源，或者用这些碳源替换培养基中原有的碳源。在一些实施方案中，可以使用添加1％乳糖的PYG培养基。在一些实施方案中，可以使用将TYP培养基中的乳糖替换为葡萄糖、甘露醇、果糖、麦芽糖或乳酸中的任一种或任几种的培养基。
本发明的细菌菌株可以在厌氧条件下培养。
在一个实施方案中，培养方法具体可包括以下步骤：
(1)用无菌接种环从细菌XA-511本身分裂繁殖的单菌落中挑取一个单克隆到5mL强化梭菌培养基(ATCC 2107)培养基中，于厌氧操作台中培养20-24h；
(2)取1mL菌液，提取菌株DNA，用通用引物27F/1492R对菌株基因片段进行PCR扩增，扩增后产物进行切胶纯化，提取回收片段，将目的片段连接到T载体上，然后将连接产物转化到TOP10感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，取阳性重组克隆使用通用引物T7/SP6进行测序，获得16S rRNA序列。利用NCBI的在线Blast工具Blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)，数据库选择“Standard database(Nucleotide collection(nr/nt))”，其它都是默认选择，经过与NCBI数据库比对与Megasphaera indica标准株Megasphaerasp.NMBHI-10的相似性为99.6％，大于98.65％，鉴定结果正确。然后，吸取4mL菌悬液转接入100mL液体强化梭菌培养基(ATCC 2107)中于厌氧台培养24h；
(3)吸取1mL菌液同上进行16S rRNA测序，同上述方法，与NCBI数据库比对鉴定结果正确后，将菌液在8000rpm，4℃条件下离心15min，弃掉上清液，取沉淀菌体用体积比为培养基：无菌甘油＝4：1的混合液重悬，混匀，分装于无菌冻存管中，-80℃冷冻保存。
本发明所提供的巨球形菌属细菌可以是或活菌或灭活菌。本发明还提供所述巨球型菌属细菌的培养上清液，所述培养上清液不含细菌。所述培养上清液可以采用前文所述的任何一种液体培养基培养获得。
将本发明的巨球形菌XA-511的活菌菌株、灭活菌株以及菌株代谢产物(即培养上清液，其包括短链脂肪酸)与巨噬细胞共培养并检测其细胞因子的产生。实验结果表明，可以激活巨噬细胞、可以缓解由LPS引起的过度免疫反应，有治疗与免疫相关的疾病的应用潜力。
本发明的巨球形菌XA-511可以产生短链脂肪酸、激活免疫细胞、还可以联合其他肿瘤治疗手段，预防和治疗肿瘤。其可能的作用机制在于激活受试者的免疫系统，增强免疫力，从而预防或治疗肿瘤。
因此，本发明提供的巨球形菌株细菌可用于生产短链脂肪酸。本发明提供的巨球形菌株细菌或其培养上清液可用于预防或治疗疾病。
短链脂肪酸的产生
菌株XA-511可以在以葡萄糖、甘露醇、果糖、麦芽糖、乳糖和/或乳酸等为碳源的培养基中生长，并能代谢产生丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、己酸等短链脂肪酸，且随碳源的不同以及培养基其它成分的变化，产生的短链脂肪酸的种类和水平有所不同。菌株XA-511对于不同碳源有不同的利用能力，通过代谢将不同碳源转化成不同种类的短链脂肪酸。
例如，菌株XA-511在PYG培养基中培养可产生丁酸、异戊酸、戊酸和己酸等短链脂肪酸(从培养上清液中检测)。菌株XA-511在含有乙酸的培养基(例如ATCC2107培养基)中培养时，可消耗培养基中的乙酸产生大量丁酸，其丁酸产量可达在PYG培养基中培养时的数倍，其异戊酸、己酸的产量也高于在PYG培养基中培养的相应产量，同时也产生戊酸，但戊酸产量与在PYG培养基中培养时相比有所降低。
当培养基中包含单一碳源葡萄糖、甘露醇或果糖时，XA-511可以代谢产生丁酸；当培养基中单一碳源为麦芽糖时，XA-511除产生丁酸外，还能产生丙酸和大量乙酸；而将麦芽糖替换成乳酸时，XA-511产生乙酸的量相对减少，同时丙酸的量大幅提升。
基于上述发现，本文提供了通过培养细菌而产生短链脂肪酸的方法。该方法可包括在适当的培养基中培养本发明的细菌，以及从培养上清液中分离短链脂肪酸。所述短链脂肪酸包括但不限于选自乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和己酸的一种或更多种的组合。
可以采用任何适合于巨球形菌的培养基培养本发明的细菌，例如前文所述的那些。可以采用本领域技术人员熟知的常规培养条件进行培养，例如在厌氧条件下进行培养。培养时间可以在6小时-12天范围内，例如可以在12小时-6天范围内，在24小时-3天范围内，或24小时至48小时范围内。在一些实施方案中，该方法包括采用PYG培养基(Peptone YeastGlucose Broth)培养本发明的细菌，并从培养上清液中分离丁酸、异戊酸、戊酸和/或己酸。
在一些实施方案中，该方法包括采用含有乙酸的培养基培养本发明的细菌，并从培养上清液中分离丁酸、异戊酸、戊酸和/或己酸，尤其是丁酸。在一些实施方案中，该方法包括采用ATCC2107培养基培养本发明的细菌，并从培养上清液中分离丁酸、异戊酸、戊酸和/或己酸，尤其是丁酸。
在一些实施方案中，该方法包括采用以葡萄糖、甘露醇和/或果糖作为碳源的培养基培养本发明的细菌，并从培养上清液中分离丁酸。在一些实施方案中，该方法包括采用以葡萄糖、甘露醇和/或果糖替换PYG培养基中的乳糖作为碳源培养本发明的细菌，并从培养上清液中分离丁酸。
在一些实施方案中，该方法包括采用以麦芽糖作为碳源的培养基培养本发明的细菌，并从培养上清液中分离乙酸、丙酸和/或丁酸。在一些实施方案中，该方法包括采用以麦芽糖替换PYG培养基中的乳糖作为碳源培养本发明的细菌，并从培养上清液中分离乙酸、丙酸和/或丁酸。
在一些实施方案中，该方法包括采用以乳酸作为碳源的培养基培养本发明的细菌，并从培养上清液中分离乙酸和/或丙酸。在一些实施方案中，该方法包括采用以乳酸替换PYG培养基中的乳糖作为碳源培养本发明的细菌，并从培养上清液中分离乙酸和/或丙酸。
预防和治疗用途
免疫激活
根据本发明，XA-511的活菌、灭活菌或其培养上清液刺激巨噬细胞产生多种细胞因子，尤其是TNF-α、IL-6和IL-10。特别地，XA-511的活菌、灭活菌或其培养上清液显著刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子TNF-α，其中活菌尤其显著；XA-511的活菌、灭活菌或其培养上清液显著刺激巨噬细胞产生细胞因子IL-6，其中活菌和灭活菌尤其显著。由此可见，菌株XA-511的活菌、灭活菌或其培养上清液对于免疫系统中的重要成员巨噬细胞有显著的活化效果，可以激活免疫系统，可用于增强免疫系统功能。
根据本发明，在用LPS诱导巨噬细胞产生过度免疫反应的条件下，XA-511的活菌或其培养上清液显著降低LPS诱导的巨噬细胞产生免疫因子TNF-α；XA-511活菌增加LPS诱导的巨噬细胞产生IL-6的量，而灭活菌或其培养上清液能显著降低LPS诱导的巨噬细胞中炎症因子IL-6的产生，显示一定的免疫调节功能；XA-511的培养上清液显著增加LPS诱导的巨噬细胞中抑炎因子IL-10的产生。由此可见菌株XA-511的活菌、灭活菌或其培养上清液显示出调节免疫的潜力。
基于上述发现，本发明的巨球型菌属细菌或其培养上清液，或者本发明的药物组合或药物组合物可以用于活化巨噬细胞或增强免疫系统功能。在一些实施方案中，活化巨噬细胞通过刺激巨噬细胞产生TNF-α和/或IL-6实现。
癌症的预防和治疗
根据本发明，XA-511与抗PD-1抗体联用治疗乳腺癌可以取得明显的协同效果，XA-511可以显著增强抗PD-1抗体的肿瘤抑制效果。XA-511可以通过促进肿瘤中CD8+T细胞和DC细胞的浸润，协同anti-PD-1抗体治疗肿瘤。XA-511还可以缓解由PD-1抗体治疗引起的细胞因子IL-6、IL-27、IL-17A、IL-1β、IL-12p70、IL-23、IL-1α、TNFα和MCP-1的产生，减缓全身性免疫过度反应，从而减少免疫治疗造成的细胞因子风暴等副作用。由此可见，XA-511通过提升肿瘤组织中具有抗肿瘤活性的免疫细胞的浸润，对乳腺癌达到良好的协同anti-PD-1抗体治疗效果，同时减少由免疫治疗造成的细胞因子风暴等副作用。
基于上述发现，本发明的巨球型菌属细菌或其培养上清液或者本发明的药物组合或药物组合物可以用于预防或治疗癌症，特别是乳腺癌。
本发明的巨球型菌属细菌或其培养上清液与癌症免疫治疗剂(例如抗肿瘤抗体，如抗PD-1抗体)的药物组合可用于预防或治疗癌症，尤其是乳腺癌，其在癌症的治疗中显示出协同作用。与单独使用免疫治疗剂相比，与本发明的巨球菌属细菌或其培养上清液联合给药可导致给药量的减少、治疗周期的缩短、较少复发比例或死亡率的效果。
在一些实施方案中，所述免疫治疗剂包括免疫检查点分子调节剂或CAR-T，特别是抗PD-1抗体。在一个具体实例中，与抗PD-1抗体单独给药相比，与本发明的巨球形菌属细菌或其培养上清液联合给药可明显抑制肿瘤生长(通过测量肿瘤体积变化确定)。
本发明的药物组合可以促进肿瘤中CD8+T细胞和DC细胞的浸润，特别是可以通过该促进作用治疗癌症。本发明的药物组合可以减少癌症的免疫治疗(例如使用免疫检查点抑制剂或CAR-T)造成的全身性免疫过度反应，特别是减少免疫治疗导致的细胞因子风暴，尤其是减少免疫治疗导致的细胞因子的产生。在一些实施方案中，所述免疫治疗导致的细胞因子选自IL-6、IL-27、IL-17A、IL-1b、IL-12p70、IL-23、IL-1α、TNFα和MCP-1中的任一种或任意组合。在一些实施方案中，本发明的药物组合可以导致肿瘤大小的减小或肿瘤生长的减少。
药物组合和试剂盒
本文提供的巨球形菌(活菌、灭活菌和/或培养上清液)可以单独使用，或者与其他药物(例如抗PD-1抗体)构成药物组合后联合使用。本文所用的术语“药物组合”指两种或更多种药物活性成分的组合。就包括两种或更多种药物活性成分的药物组合来说，其中的两种或更多种药物活性成分可以共存于同一药物制剂(例如药物组合物)中，其还可以作为分开的药物制剂存在于同一药物试剂盒中，或甚至这两种或更多种药物活性成分可以作为分开的药物制剂存在于不同的药物试剂盒中。药物组合可以通过给药使得其中所包含的两种或更多种药物活性成分能够在某个时间同时存在于受试者体内。在大多数情况下，组合两种或更多种药物活性成分形成药物组合并联合给药，是因为这两种或更多种药物活性成分在受试者体内会产生协同作用。这种协同作用包括联合给药产生的药效优于任何一种药物活性成分单独给药，一种药物活性成分可以降低另一种药物活性成分的副作用，或者两种药物活性成分联合给药产生了新的功效，例如可用于治疗不同于任一药物活性成分的原有适应症。
本发明提供了包含本发明细菌的活菌、灭活菌或其培养上清液的药物组合物，其可用于活化巨噬细胞、增强免疫系统功能和/或治疗癌症。
本发明细菌的活菌、灭活菌或其培养上清液可以是冻干的。
药物活性成分可任选地与药学上可接受的载体一起配制成药物组合物。这里所使用的术语“药学上可接受的载体”指可以安全地进行给药的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂、防腐剂等物质，这些物质适合于对受试者给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。依照给药途径，可以使用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水和/或无热原水等。
本发明的药物组合物可以制成片剂、胶囊、散剂、粉末、栓剂、喷雾剂、凝胶剂、注射剂等临床可接受的剂型。在一些实施方案中，本发明的任一种药物组合物可以制成适用于递送至肠的剂型。特别地，在一些实施方案中，含有本发明的细菌的药物组合物被配制为适用于递送至肠的剂型，例如具有肠溶包衣的口服药物。
在一些实施方案中，免疫治疗剂被制成注射剂。
在一些实施方案中，本发明细菌的活菌、灭活菌或其培养上清液可以单独制成口服药物。
本发明的药物组合或组合物可以在各种包装物(或容器)中保存，以形成试剂盒或药物试剂盒。这些包装物包括但不限于，盒、安瓿瓶、小瓶、管子、袋子或本领域已知的其他的合适形式。这些包装物可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适用于保存药物的其他材料制成。如果需要，与该包装物一起提供的还包括使用说明书。说明书通常可包括关于如何使用这些组合物用于治疗或预防肿瘤(例如乳腺癌)的信息的描述；用于治疗或预防瘤(例如乳腺癌)形成的剂量方案；注意事项；警告；适应症；禁忌症；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考资料。说明书可直接打印在包装物(如果存在的话)上，或作为贴于包装物的标签，或者作为提供于包装物中或与包装物在一起的单独的纸、册、卡或折叠印刷品。
在一些实施方案中，本发明的药物组合或药物组合物在约4℃或约25℃下储存在密闭容器中并且储存于具有50％相对湿度的环境中时，至少80％的细菌菌株(就活菌而言，以菌落形成单位计量)在至少约1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年后仍然存在。
药物的施用
本发明的药物组合或药物组合物可以使用任何适当的途径向受试者施用，例如可通过口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、鼻内、舌下，或经吸入、透皮等途径给药。
在一些实施方案中，将本发明的药物组合或药物组合物可以施用于胃肠道，以便使得本发明的细菌菌株递送至肠道和/或部分或全部定殖于肠道。
本发明的药物组合中所包含的两种或更多种活性成分可以同时给药或顺序给药。当同时给药时，所述两种活性成分可以是以单一制剂的形式给药，或者以多种不同的制剂同时给药。顺序给药时，不同活性成分的给药时间间隔可以根据需要确定，例如可以在约1分钟至约60分钟的范围内，在约1小时至约24小时的范围内，在约1天至约7天的范围内，在约1周至约4周的范围内。
本发明的药物活性成分以治疗有效量施用给受试者。例如，每种活性成分可以约100mg-约1000mg的总剂量施用给受试者，例如总剂量可以是约200mg至约900mg、约300mg至约800mg、约400mg至约700mg、约500mg至约600mg。在某些实施方案中，合适的日剂量是每种活性成分每公斤体重0.01mg至100mg。
对于细菌活性成分，特别是活菌，合适的有效量可为每日约1×103至约1×1012个菌落形成单位(CFU)；例如，约1×104至约1×1011CFU，约1×105至约1×1010CFU，约1×106至约1×109CFU，约1×107至约1×108CFU。
对于细菌成分而言，有效量还可以是每天至少109个细胞，例如每天至少1010个、至少1011个或至少1012个细胞。
以下通过具体实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：菌株的获取
菌株从深圳未知君生物科技有限公司招募的健康供体的新鲜粪便样本中分离获得。分菌样本的选择：
深圳未知君生物科技有限公司招募的大量健康供体，获取新鲜粪便样本，提取宏基因组DNA，检测粪便样本内的细菌菌群和丰度。根据测序的结果，挑选出Megasphaera属丰度较高的供体样本，编号为F14(Megasphaera属丰度：2.10％)，用于目的性筛选Megasphaera菌株。
菌株分离：
在厌氧操作台内，取供体样本的粪便样品1g均匀悬浮于10mL PBS中，梯度稀释至10-6稀释液。吸取100mL的10-6稀释液于强化梭菌培养基(ATCC 2107)琼脂平板中，并用一次性无菌涂布棒进行涂布均匀，37℃条件下厌氧培养3天。
3天后目的性选取表面菌落直径为2.0～5.0mm，微凸起，圆形，表面有光泽，淡淡的浅黄色的克隆，用无菌环挑取单克隆并进行平板划线纯化、培养，得到纯菌株。该菌株记为细菌XA-511。
菌株测序和鉴定：
用无菌接种环从细菌XA-511本身分裂繁殖的单菌落中挑取一个单克隆到5mL所述改良版ATCC2107培养基中，于厌氧操作台中培养20-24h；取1mL菌液，用DNA提取试剂盒从菌液中提取菌株DNA，用通用引物27F/1492R对菌株基因片段进行PCR扩增，扩增后产物进行切胶纯化，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(REF:518131-0100)提取回收片段；用pGM-T克隆试剂盒(Cat#VT302-02)16℃过夜将目的片段连接到T载体上；将连接产物转化到TOP10感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，取阳性重组克隆使用通用引物T7/SP6进行测序。
用于PCR的引物：
50μl反应体系所含有的成分及含量列表：
PCR反应条件如下：
分离到的细菌XA-511的16S核糖体RNA基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
菌株保藏：细菌XA-511于2021年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏编号为CGMCC No.23400。
实施例2：菌株的基因组制备，测序，组装和分析
细菌XA-511采用SDS的方法进行基因组DNA提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性，利用Qubit进行定量。
使用Nanopore平台和Illumina平台进行文库构建，库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量进行Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq PE150测序。数据采用NanoPlot软件选用阈值Q>7进行质控，从而得到有效数据。从各样品质控后的有效数据出发，使用Unicycler软件，采用二代+三代数据进行基因组组装，筛分染色体与质粒序列，并将染色体序列组装成为一个环状基因组(如果是线性基因组即为线性基因组序列)，即最终的0gap完成图序列。
菌株XA-511基因组组装得到基因总长度2407426bp，N50长度11,760bp，GC含量53.67％。使用GeneMarkS(Version 4.17)软件对新测序的基因组进行编码基因预测，基因预测结果统计信息如下表1所示：
表1编码基因预测结果统计表
基于序列组成，采用IslandPath-DIOMB软件(Version 0.2)预测基因岛，其通过检测序列中二核苷酸偏向性(phylogentically bias)和移动性基因(mobility genes，如转座酶或整合酶)以判定基因岛以及潜在的水平基因转移。结果统计见下表2：
表2基因岛预测结果统计
SampleID Glsnumber Glstotallength(bp) Averagelength(bp)
XA-511 7 74817 10688
基因岛中基因分布统计图仅展示基因岛长度小于15kb(图3)。
通过phiSpy软件(Version 2.3)预测样品基因组上的前噬菌体，预测结果见表3。
表3前噬菌体预测结果统计
SampleID Prophagenumber Totallength(bp) Averagelength(bp)
XA-511 23 539422 23453.1
利用CRISPRdigger(Version 1.0)对样品基因组进行CRISPR预测，预测结果统计如下表4所示：
表4 CRISPR预测结果统计
SampleID CRISPRnumber Totallength(bp) Averagelength(bp)
XA-511 1 3671 3671
病原菌通过分泌系统TNSS(type N secretion systems，目前确定的有7种，I型-VII型)将该类蛋白分泌至胞外或是宿主细胞中，通过控制免疫应答反应以及细胞衰亡引起病理反应，而其中革兰氏阴性菌的T3SS通常用来从分子水平研究病原菌，感染机制，毒力作用等，是研究得比较多的分泌系统。对于TNSS系统，通过蛋白序列功能数据库注释结果中，提取分泌系统相关蛋白进行注释。
表5 TNSS统计结果
根据上述表内TNSS统计结果说明，XA-511不具有TNSS、不会分泌可引起宿主病理反应的系统蛋白，显示较好的生物安全性。
将预测的基因序列，使用blast软件比对毒力因子VFDB数据库，结果详见表6。
表6 XA-511潜在毒性基因列表
基因组中潜在的抗生素耐药基因使用prokka(version 1.14.6)软件分析，其中抗生素耐药基因数据库为CARD，比对找到三个耐药基因，分别为Ugd,Nocardia,MacB。其功能分别是对肽类，利福霉素以及大环内酯类抗生素的耐药性，详细比对结果如表7所示。
表7通过对耐药基因数据库CARD比对获得的Megasphaera_XA-511潜在毒性基因
针对组装基因组序列，结合编码基因、非编码基因的预测结果以及基因功能注释的分析，使用Circos软件对样品基因组进行展示，XA-511-Chr1全基因组图谱，详见图4。
实施例3：菌株的氧气耐受度
菌株的氧气的耐受度测试采用的方法是观察菌株完全暴露于氧气中不同时间后，是否还具有在生长琼脂平板上生长的能力。本实验将菌株分别暴露在环境氧中不同时间(0h，0.5h，2h，8h以及24h)后，放置于厌氧台中生长，通过对比菌株于生长琼脂平板上菌落总数来比较菌株对环境氧的相对灵敏度。
具体步骤：
将0.1mL待测菌液加到0.9mL PBS缓冲液中，混匀为10-1稀释液，依次进行十倍梯度稀释至10-5稀释液，取100μL涂于生长平板；按照上述制备方法制备用于检测不同暴露时间的样本共5组，分别为：A组(0h暴露)；B组(0.5h暴露)；C组(2h暴露)；D组(8h暴露)；E组(24h暴露)；
将所有组按照上述设计暴露于无菌环境氧中不同时间后，置于厌氧培养系统(Anoxomat modified atmosphere,MART；0％O2，10％CO2,5％H2,85％N2)中，37℃培养48-72小时；记录平板上菌落总数，并据此推算出具有生长能力的活菌数以此比较菌株对于暴露于超净台环境氧中不同时间的耐受度。
图5A为暴露于环境氧中0h，0.5h，2h，8h以及24h后再于适宜厌氧条件下培养48-72h活菌计数结果。图5B为各组菌落生长情况代表性照片。
实验结果如下：
暴露于环境氧中0.5h条件下，平板上最终生长落数与对照组(暴露环境氧中0h)基本一致，而当暴露时间延长至2h，平板上生长的菌落数显著降低，当暴露时间继续延长8-24h，平板上基本无菌落生长。
由此可知，厌氧菌株XA-511对于环境氧有一定的耐受度，当暴露于环境氧中0.5h以内，其克隆生长能力基本不受影响。这对于菌株的开发提供了有利条件。
实施例4：菌株对碳源的利用和相关酶活性测定
菌株的生理生化特征试验采用ANC ID卡与/>识别系统一起使用，遵循内部例行程序和制造商的说明。所有培养处理均在37℃厌氧操作台中进行，菌株在用/>ANC ID卡鉴定前先于布鲁氏血琼脂上培养48-72小时以获取单克隆。用0.45％NaCl水溶液制备接种悬液，使用校准的Vitek 2Densichek仪器(bioMérieux,Marcy l’etoile，法国)达到2.70-3.30McFarland标准浊度。通过/>ANC ID卡检测碳源利用和酶活性的生化检测共有36项，通过/>COMPACT仪器检测碳源利用和酶活性的生化检测的阳性和阴性结果。鉴定结果及其检测报告见表8。
表8生理生化检测结果
符号说明：“+”，阳性；“-”阴性。
实施例5：菌株的抗生素敏感性
菌株的抗生素敏感性检测采用美国临床和实验室标准协会(CLSI)有关厌氧菌的两种终点确定决定法药敏试验标准中的微量肉汤稀释法以确定菌株的抗生素敏感性。试验所需抗生素种类，浓度，配制方法均按照CLSI标准执行。使用加入添加氯化血红素(5μg/ml)，维生素K1(1μg/ml)和溶解的马血(5％)的强化布氏肉汤培养基作为肉汤溶液，菌株经复苏后接种于布氏血琼脂平板上，采用菌落直接混悬法制备接种物，接种物浊度应达到0.5麦氏浊度。
具体步骤：
1)制备微量肉汤稀释板：制备抗菌药物中间液(10×)，将浓缩的抗菌药物贮存液按标准中的方法进行稀释或者系列倍比稀释。然后在九等分肉汤中加入一等分10×抗菌药物溶液，得到预期终浓度。将抗菌药物/肉汤溶液加注到塑料微量稀释盘中，每孔加入0.1ml
2)微量肉汤稀释盘的接种：在15min内将调整好浊度为0.5麦氏浊度的菌悬液用水或者生理盐水进行1：15稀释，以达到接种后，每管或孔位菌液浓度为1×106CFU/ml。将10μl准备好的接种物接种于微量稀释盘各孔位，同时取100μl涂布于合适的琼脂培养基表面以验证接种物浓度是否达到1×106CFU/ml.。
3)微量肉汤稀释盘的孵育：厌氧条件下37℃孵育46-48h。
结果如下表9所示。
表9抗生素敏感性测试结果
实验结果表明，菌株XA-511仅对氨苄西林有一定耐药性，而对大多数常见抗生素都较为敏感，包括甲硝唑、莫西沙星、克林霉素、哌拉西林、亚胺培南。因此，XA-511是适合作为潜在的活菌药物进行开发的菌株。
实施例6：菌株激活免疫功能，调节免疫反应
巨噬细胞是天然免疫系统中髓样细胞的异质性群体，参与多种生理和病理过程。人白血病单核细胞系THP-1通过phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA，Sigma，P8139)诱导形成巨噬细胞，是被广泛用于研究单核细胞或单核来源的巨噬细胞免疫反应能力的模型。本实验使用该细胞系以研究菌株对免疫巨噬细胞的影响。
XA-511活菌、热灭活菌及上清液的制备：菌株XA-511于厌氧台中，在ATCC2107培养基中培养，直至对数生长末期，调节OD600＝1后，取菌液在4℃条件下5000g离心5min，收集上清液，并使用0.2mm过滤器(Millipore)过滤获得无细胞上清液(XA-511SN)，将上清液按照1mL分装于无菌管中，保存在-80℃备用。离心获得的沉淀用细胞培养基重悬，获得1×108CFU/mL细菌活菌样本(XA-511LV)。取部分活菌样本，在110℃金属浴15min热灭活，获得1×108CFU/mL细菌热灭活样本(XA-511HK)。
THP-1细胞培养和极化处理：THP-1细胞P5代在RPMI-1640+10％FBS培养基中培养，按照3×105cells/mL的密度种于96孔板中(200μL/孔)，加入终浓度为50ηg/mL的PMA处理细胞24h，更换新鲜培养基，静息72h以获得贴壁巨噬细胞。
XA-511活菌、热灭活菌及上清液样本与巨噬细胞共培养：制备的XA-511死菌样本、上清液样本按照MOI＝10、1加入到上述贴壁巨噬细胞中，在5％CO2培养箱中共培养24h；对于活菌样本，按照MOI＝10、1加入到上述贴壁巨噬细胞中，在厌氧台中共培养2h后，使用含有1％庆大霉素的细胞培养基，在5％CO2培养箱中处理1h以杀死活菌，用PBS清洗两次，更换新培养基，在5％CO2培养箱中继续培养22h。收集上述共培养的上清液，通过ProcartaPlex多因子检测试剂盒(Thermo Fischer Scientific,Waltham,MA,USA)检测各细胞因子含量。共培养的细胞通过CCK8实验检测细胞存活率，以获得合适的共培养条件。对于LPS诱导的炎症模型，在上述实验中，共培养过程中加入终浓度为1μg/mL的LPS即可。对于上清液样本，设置细菌培养基对照组。
共培养细胞存活率结果：
CCK8实验结果如图6所示，活菌样本和上清液样本在MOI＝10的共培养条件下，对于巨噬细胞存活率产生影响。因此，XA-511样本与巨噬细胞合适的共培养条件是：活菌样本(MOI＝1)、热灭活样本(MOI＝10、1)、上清液(MOI＝1)。基于此，统一取MOI＝1的共培养条件下的上清液用于细胞因子检测。
上清液细胞因子实验结果显示，菌株XA-511活菌(LV)、热灭活菌(HK)和无菌上清液(SN)显著刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子TNF-α，其中活菌(LV)尤其显著(图7A)。菌株XA-511活菌(LV)、热灭活菌(HK)和无菌上清液(SN)显著刺激巨噬细胞产生细胞因子IL-6，其中活菌和死菌尤其显著(图7B)。
由此可见，菌株XA-511对于免疫系统中的重要成员——巨噬细胞，有显著的活化功能，激活免疫系统。因此，XA-511可用于增强免疫系统功能。
除免疫激活以外，我们进一步探究XA-511对于免疫反应的调控功能。用LPS诱导巨噬细胞产生炎症反应，然后加入XA-511样本，通过检测细胞因子，观察其免疫调节的能力。实验结果表明，活菌和上清液显著降低LPS诱导的巨噬细胞产生TNF-α(图7C)。XA-511活菌增加LPS诱导的巨噬细胞产生IL-6的产量，而热灭活菌和上清液能显著降低LPS诱导的IL-6的产生，显示一定的免疫调节能力(图7D)。IL-10是抑制炎症的细胞因子，在LPS诱导的炎症环境中，XA-511的培养上清液显著增加抑炎因子IL-10的产量，显示一定的调节免疫的潜力(图7E)。
实施例7：菌株代谢产生丁酸、戊酸、异戊酸和己酸等短链脂肪酸
本实施例中采用PYG和强化梭菌培养基(ATCC 2107)两种培养基，以研究菌株XA-511产生短链脂肪酸的能力，以及在不同营养基中产生短链脂肪酸的差异。
两种培养基成分如下：
ATCC2107成分表：
1、上清液制备和收集：菌株XA-511分别在两种培养基中生长，直至对数生长末期，调节OD600＝1后，取菌液在4℃条件下5000g离心5min，收集上清液，并使用0.2mm过滤器(Millipore)过滤获得无细胞上清液，将上清液按照1mL分装于无菌管中，保存在-80℃备用。
2、短链脂肪酸提取和衍生化处理：取200μL上述细菌上清液样品、培养基对照样品或短链脂肪酸标准品(0、25、50、100、200、400、800μM)，与200μL含有20μg/mL的内标同位素己酸溶液按照1:1体积比混合均匀。取100μL混合液用10μL 5M HCl酸化。酸化的上清液样品通过加入100μl无水乙醚(DE，1:1，v/v)提取，涡旋并在冰上孵育5分钟，然后以10,000g离心5分钟。将DE层(含有SCFA)转移到含有无水Na2SO4(以去除残留水)的新微管中。剩余的水层进一步用DE再萃取两次。DE层被合并和混合以进一步衍生化。将160μl DE提取物准确转移到GC样品瓶中的玻璃内插管中，并在加入8μl双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)，涡旋5秒后盖紧。将混合物保存在GC小瓶中并在室温下孵育过夜。衍生化的样品通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行分析。
样品中短链脂肪酸含量检测：通过配置有HP-5ms毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)的气相色谱-质谱仪(8890-7000D，安捷伦)进行短链脂肪酸含量检测。进样器、离子源、四极杆和GC/MS接口温度分别为260、230、150和280℃。氦气载气的流速保持在1mL/min。以3分钟的溶剂延迟时间和10:1的分流比进样1μl衍生样品。初始柱温为40℃并保持2min，以15℃/min的速率升至150℃并保持1min，最后以30℃/min的速率升至300℃，在此温度下保持5分钟。电离在70eV的电子碰撞(EI)模式下进行。MS数据是在全扫描模式下从m/z 40–400以每秒12.8次扫描的采集频率采集的。通过注入纯标准品并比较保留时间和相应的MS谱图来确认化合物的鉴定。在选择离子监测(SIM)模式下使用目标离子对分析物进行定量，并通过确证离子进行确认。乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、4-甲基-戊酸、己酸和庚酸的目标离子(m/z)分别为117、131、145、145、159、159、173、173和189。通过保留时间、目标离子以及峰面积确定和计算样品中各短链脂肪酸的含量。
PYG培养基作为培养基对照(图8A)，通过GC-MS检测结果显示与配料表一致，不含短链脂肪酸。当XA-511在PYG培养基中生长至对数末期，可以产生丁酸(3461mM)、异戊酸(789mM)、戊酸(2924mM)和己酸(3105mM)等短链脂肪酸(图8A)。
图8B结果显示，ATCC2107培养基含有乙酸，不含其他短链脂肪酸(图8B)；当XA-511在ATCC2107培养基中生长至对数末期(图8B)，会将培养基中14807mM的乙酸基本消耗殆尽，仅剩81mM，而同时会产生大量丁酸(14807mM)，几乎是PYG培养基中丁酸产量(3461mM)的4.3倍；而戊酸的产量有所降低(1509mM)，是PYG培养基中产量的1/2，同时，异戊酸的产量获提升了3.7倍达到2910mM，己酸产量提升至7820mM。
由此可知，XA-511在ATCC2107培养基中生长也可以产生丁酸、异戊酸、戊酸和己酸等短链脂肪酸。有趣的是，培养基成分不同，XA-511产生各短链脂肪酸的量不同。特别突出地，当培养基中存在乙酸盐时(如ATCC2107培养基)，XA-511会消耗培养基中的乙酸盐，产生大量丁酸(图8B)。
实施例8：菌株XA-511在含不同碳源的培养基中，产生短链脂肪酸的能力不同。
上述实施例7中发现，菌株在两种不同培养基中产生短链脂肪酸的量不同。进一步地，我们探究了不同碳源对菌株代谢产生短链脂肪酸的影响。
实验方法：
以TPY培养基作为基础培养基，将培养基中的碳源乳糖去掉，依次替换成葡萄糖(glucose)、麦芽糖(maltose)、甘露醇(mannitol)、乳酸(lactate)、果糖(Fructose)，待菌株生长至对数生长末期，收集菌液，调节菌液OD600＝1，8000rpm离心5min收集上清液，通过上述方法测定上清液中短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)的含量。结果如图9所示。
TPY培养基成分表：
实验结果可知，当培养基中不含简单碳源(如单糖、二糖、寡糖等)时，XA-511可产生少量的乙酸(蓝色)，当培养基中的碳源为葡萄糖或甘露醇或果糖时，XA-511可以代谢产生一定量的丁酸(绿色)，当培养基中单一碳源为麦芽糖时，XA-511除产生丁酸外，还能产生一定量丙酸(红色，约20000mM)和大量乙酸(蓝色，约50000mM)，而将麦芽糖替换成乳酸时，XA-511产生乙酸的量相对减少，产量约(20000mM)，同时丙酸的量得到大幅度提升，产量约350000mM)。因此，菌株XA-511对于不同碳源有不同的利用能力，通过代谢将不同碳源转化成不同种类的短链脂肪酸，在诸多疾病领域都有潜在应用价值。
总体来说，菌株XA-511能够利用多种碳源(包括葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳酸、果糖)，代谢产生丁酸。此外，XA-511可以利用麦芽糖产生大量乙酸和丙酸。
实施例9：菌株治疗乳腺癌，并且减少免疫治疗引起的免疫相关副作用
为验证细菌XA-511是否可以用于肿瘤的预防和治疗，我们利用小鼠同源肿瘤模型进行了抑制乳腺癌4T1的生长的实验。本实验通过深圳市拓普生物科技有限公司实验动物管理和使用委员会伦理审查。
模型建立及给药：健康SPF级Balb/c小鼠，总计40只，雌性，鼠龄：4-5周，从珠海百试通生物科技有限公司购入。所有小鼠均在SPF级动物房中分笼适应性饲养1周，室温(24±2)℃，每12h昼夜交替，自由饮水。适应性饲养后，小鼠接种4T1肿瘤细胞。4T1细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，在含5％CO2的37℃的细胞培养箱中连续培养。待细胞长至对数生长期时，收集细胞，并用PBS洗涤细胞两次，最后用PBS重悬细胞计数，调整细胞浓度为1×106Cells/mL，无菌环境中，每只鼠前肢右侧腋下(靠近背部)注射0.1mL细胞液，接种细胞当天定义为Day 0。小鼠随机分为4组，每组10只，设置实验对照组、XA-511菌治疗组、anti-PD-1(InVivoPlus Anti-mouse PD-1，CLONE:RMP1-14,BioXcell)治疗组和XA-511+anti-PD-1治疗组，分组及给药按照表10所示。
表10菌株治疗乳腺癌动物实验分组及给药方式
细胞接种约一周后，D7、D9、D11、D14、D16、D18、D21用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，通过公式：肿瘤体积V＝0.5a×b2(a和b分别表示肿瘤的长和宽)计算肿瘤体积，并称量小鼠体重。按照实验设计进行分组给药。接种后21天结束实验。
EDTA抗凝管采集小鼠全血，3000rpm室温离心10min，取上层血浆样本，0.1mL/管分装至0.2mL的八连管中，-80℃冻存。用LEGENDplex Mouse Inflammation Panel(13-plex)with V-bottom Plate试剂盒(BioLegend)检测血浆中细胞因子和趋化因子的浓度(包括IL-6、IL-27、IL-17A、IL-1b、IL-12p70、IL-23、IL-1a、TNFa和MCP-1)
取肿瘤组织，多聚甲醛固定后进行石蜡包埋和切片。切片进行多重免疫荧光染色。使用的抗小鼠抗体包括CD3(Invitrogen,Cat#MA5-14524)，CD4(Cell Signaling,Cat#25229)，CD8(Cell Signaling,Cat#98941)，CD11c(Cell Signaling,Cat97585)，IFN-γ(Abcam,Cat#ab216642)。使用Vectra多路复用成像系统以20倍放大率扫描所有染色切片。生成整个切片的高分辨率图像，并使用HALOTM软件进行量化分析。计算核或细胞质阳性染色的强度。评估阳性细胞/面积：阳性细胞/面积＝阳性细胞/肿瘤面积。
实验结果：实验对照组(control)小鼠肿瘤生长较快，在接种后21天，组内肿瘤平均体积达到963.36mm3；anti-PD-1抗体治疗组肿瘤生长速度较对照组略慢，在第21天肿瘤平均体积为765.36mm3，但两组之间无显著差异；XA-511+anti-PD-1治疗组肿瘤生长明显减缓，且在治疗第14天，肿瘤体积就开始明显小于对照组和anti-PD-1治疗组，在第21天肿瘤平均体积为502.02mm3，与对照组相比，肿瘤抑制率约48％，表现出良好的肿瘤抑制效果。图10为小鼠乳腺癌4T1肿瘤生长曲线。图11为4T1小鼠乳腺癌在21天时的各组肿瘤照片。
肿瘤组织多重免疫荧光染色结果(图12和图13)显示，XA-511+anti-PD-1治疗组可显著提升肿瘤组织区域中CD8+毒性T淋巴细胞和树突状细胞DC的密度，表明XA-511通过促进肿瘤中CD8+T细胞和DC细胞的浸润，协同anti-PD-1抗体治疗肿瘤。
临床上采用免疫疗法治疗肿瘤，容易产生免疫性疾病，如细胞因子风暴等。通过检测血浆细胞因子和趋化因子发现，XA-511联合治疗可以缓解由PD-1抗体治疗引起的细胞因子IL-27、IL-17A、IL-23的产生，减缓全身性免疫过度反应，从而减少免疫治疗造成的细胞因子风暴等副作用(图14)。
乳腺癌被认为是弱或中等免疫原性的肿瘤，单一的免疫疗法常常对其治疗效果很有限，本实施例中XA-511通过提升肿瘤组织中具有抗肿瘤活性的免疫细胞的浸润，对乳腺癌达到良好的协同anti-PD-1抗体治疗效果(图10和13)，同时减少由免疫治疗造成的细胞因子风暴等副作用。

Claims (13)

1.巨球形菌属细菌(Megasphaeraindica)，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.23400；或者，其具有如SEQ ID NO:1所示的16SrRNA基因序列；或者，其包括与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的16SrDNA序列；或者，其包括与保藏编号为CGMCCNo.23400的巨球形菌属细菌具有至少80％、至少85％、至少90％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的基因组序列。
2.如权利要求1所述的巨球形菌属细菌，其特征在于，能产生短链脂肪酸，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和/或己酸；优选地，能利用乙酸产生丁酸。
3.如权利要求1所述的巨球形菌属细菌，其特征在于，能激活免疫；优选地，能刺激免疫细胞产生细胞因子，所述细胞因子包括但不限于TNF-α、IL-6。
4.如权利要求1所述的巨球形菌属细菌，其特征在于，能下调免疫激活因子的量和/或上调抗炎因子的量，调节免疫细胞功能，所述免疫激活因子由处于炎症状态中过度活化的免疫细胞所产生；所述免疫激活因子包括但不限于TNF-α、IL-6；所述抗炎因子包括但不限于IL-10。
5.药物组合物，其特征在于，包括：如权利要求1所述的巨球形菌属细菌的活菌、灭活菌和/或其培养上清液。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，还包括：药学可接受的载体。
7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药学可接受的载体为口服剂、注射剂、片剂、粉剂或混悬液。
8.如权利要求5～7任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药方式为进入消化系统，进一步优选为口服或灌肠；或所述药物组合物的给药方式为瘤内注射。
9.如权利要求2～5任一项所述的药物组合物，其特征在于，还包括：癌症免疫治疗剂。
10.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症免疫治疗剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
11.如权利要求5～7任一项所述的药物组合物，其特征在于用于治疗癌症，优选地，所述癌症为乳腺癌。
12.如权利要求1～4任一项所述的巨球形菌属细菌、如权利要求5～11任一项所述的药物组合物在制备用于增强免疫系统功能、治疗癌症或减轻癌症免疫治疗剂所引起的免疫相关副反应的药物中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，其中所述癌症免疫治疗剂所引起的免疫相关副反应是细胞因子风暴，其中所述癌症免疫治疗剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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