WO2023075346A1 - 항산화 기전 조절을 통한 자연살해세포의 항암 기능 향상 - Google Patents

항산화 기전 조절을 통한 자연살해세포의 항암 기능 향상 Download PDF

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WO2023075346A1
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cancer
cells
medium
cell
composition
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PCT/KR2022/016315
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Inventor
정영태
오병무
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재단법인대구경북과학기술원
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to the improvement of anticancer function of natural killer (NK) cells through regulation of antioxidant mechanisms.
  • Natural killer (NK) cells are the main cells constituting the innate immune system and account for about 5-20% of circulating lymphocytes.
  • NK cells non-specifically recognize and contact abnormal cells, including tumor cells and virus-infected cells, and kill them.
  • the process by which NK cells kill tumor cells involves the release of cytoplasmic granules, including granzyme B and perforin, and the release of interferon- ⁇ and tumor-necrosis factor-alpha. It is achieved by selectively killing tumor cells by secreting cytokines such as ⁇ and TNF- ⁇ ). Due to the characteristics of these NK cells, in order to overcome the limitations of existing anti-cancer treatments, the development of anti-cancer immune cell therapeutics using NK cells is actively progressing.
  • NK cells in order to use NK cells as an effective anti-cancer immune cell therapy, it is necessary to activate NK cells more effectively as well as to secure a large number of NK cells. Since most NK cells in a normal state exist in an inactivated state, a process of in vitro activation of NK cells obtained from normal blood or inactivated patient blood is essential.
  • the Keap1-Nrf2 signaling pathway is a representative antioxidant mechanism in our body, and plays a role in regulating the production of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • Reactive oxygen species are major secondary signaling substances in cells, and the Keap1-Nrf2 signaling pathway that regulates them not only regulates major inflammatory signaling pathways, but also differentiates and activates various immune cells such as hematopoietic stem cells, B cells, and regulatory T cells. has been reported to regulate
  • An object of the present invention is to provide NK cells in which the Keap1 gene has been deleted.
  • Another object of the present invention is to provide a medium composition for activating NK cells containing an antioxidant as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising, as an active ingredient, NK cells from which the Keap1 gene has been removed or NK cells cultured with the medium composition.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving cancer disease, comprising, as an active ingredient, NK cells from which the Keap1 gene has been removed or NK cells cultured with the medium composition.
  • the present invention provides NK cells in which the Keap1 gene has been deleted.
  • the present invention provides a medium composition for activating NK cells comprising an antioxidant as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer disease comprising, as an active ingredient, NK cells in which the Keap1 gene has been removed or NK cells cultured with the medium composition.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving cancer disease comprising, as an active ingredient, NK cells from which the Keap1 gene has been removed or NK cells cultured with the medium composition.
  • a composition for preventing, treating, or improving cancer disease by confirming that NK cells in which the keap1 gene is removed or cultured in a medium containing antioxidants to promote antioxidant activity have improved anticancer activity compared to conventional NK cells can be usefully used as
  • FIG. 1 shows an overview of a system in which the anticancer function of NK cells is improved by removing the keap1 gene or treating with antioxidants.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing the expression changes of the keap1 gene and nrf2 target genes (GCLC and G6PD2) in NK cells in which the keap1 gene was deleted.
  • Figure 3 shows the results of analyzing the cytotoxicity of NK cells from which the keap1 gene was removed (A) and cytotoxicity to cancer cells when co-cultured with cancer cells (B).
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the occurrence of skin cancer when de novo development of skin cancer is induced in a mouse in which the keap1 gene has been removed from NK cells.
  • Figure 6 shows the results of analyzing cytotoxicity to cancer cells when NK cells cultured in a medium containing antioxidants were co-cultured with cancer cells.
  • NAC represents NK cells cultured in an antioxidant medium treated with N-acetylcysteine
  • Tempol represents NK cells cultured in an antioxidant medium treated with Tempol
  • Control represents normal NK cells.
  • the present invention provides NK cells in which the Keap1 gene has been deleted.
  • expression of the keap1 gene may decrease and expression of the GCLC or G6PD2 gene may increase.
  • the NK cells can inhibit cell overmaturation.
  • the NK cells may have increased anticancer activity.
  • NK cell may be at least one selected from the group consisting of immortalized NK cell lines, hematopoietic stem cell-derived NK cells, peripheral blood-derived NK cells, NK cells induced by reprogramming, and animal-derived NK cells, but is limited thereto it is not going to be
  • the present invention provides a medium composition for activating NK cells comprising an antioxidant as an active ingredient.
  • the antioxidants include N-acetylcysteine, TEMPOL (4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl), vitamin A, vitamin C, vitamin E and beta carotene ( ⁇ - It may be one or more selected from the group consisting of carotene), but is not limited thereto.
  • the medium composition contains cytokines, L-glutamine, HEPES, sodium pyruvate, 2-mercaptoethanol, fetal bovine serum (FBS) and an antibiotic-antifungal agent. It may further include one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the medium is RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium 1640), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal essential Medium), Glasgow's Minimal essential Medium (GMEM), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), DMEM/F12, and Advanced DMEM/F12, but is not limited thereto.
  • the antibiotic-antifungal agent may be two or more selected from the group consisting of penicillin, streptomycin, gentamicin, nystatin, and amphotericin, but is not limited thereto.
  • cytokine is a variety of small-sized proteins produced in various cells and used for signal transduction that can regulate the function of other cells, including itself, including Interleukin-2 (IL-2), IL -3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21 or a combination thereof may be further included, but is not limited thereto.
  • IL-2 Interleukin-2
  • IL-3 Interleukin-5
  • IL-6 IL-6
  • IL-7 IL-15
  • IL-21 IL-21
  • antioxidant means a substance that can be introduced into cells to remove intracellular active oxygen
  • activation means to enhance cytotoxicity of NK cells.
  • medium refers to a culture medium that contains components necessary for growth, survival, or differentiation of NK cells in vitro and enables this, and includes a conventional medium suitable for culture and differentiation used in the field of immunology. all inclusive Depending on the type of cell or the technical level in the field, the type of medium and culture conditions can be changed.
  • a medium used for culturing NK cells may be a minimal culture medium generally containing a carbon source, a nitrogen source, and trace element components.
  • the present invention provides NK cells cultured with the medium composition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer disease comprising, as an active ingredient, NK cells in which the Keap1 gene has been removed or NK cells cultured with the medium composition.
  • the cancer is breast cancer, cervical cancer, glioma, brain cancer, melanoma, lung cancer, bladder cancer, prostate cancer, leukemia, kidney cancer, liver cancer, colon cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, lymphoma, osteosarcoma, uterine cancer, oral cancer, It may be one or more selected from the group consisting of bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, skin cancer, blood cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer and ureter cancer, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in a unit dose form or in a multi-dose container by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier according to a method that can be easily performed by those skilled in the art. It can be prepared by incorporating into
  • the pharmaceutically acceptable carrier is one commonly used in formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like, in addition to the above components.
  • the content of the additives included in the pharmaceutical composition is not particularly limited and may be appropriately adjusted within the range of content used in conventional formulations.
  • the pharmaceutical composition may be formulated into an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, or emulsion, a pill, a capsule, a granule, a tablet, a cream, a gel, a patch, a spray, an ointment, a warning agent, a lotion, a liniment agent, a paste agent, and a cataplasma agent. It may be formulated in the form of one or more skin external preparations selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, or emulsion, a pill, a capsule, a granule, a tablet, a cream, a gel, a patch, a spray, an ointment, a warning agent, a lotion, a liniment agent, a paste agent, and a cataplasma agent. It may be formulated in the form of one or more skin external preparations selected from the group consisting of, but is not
  • the pharmaceutical composition of the present invention may additionally contain pharmaceutically acceptable carriers and diluents for formulation.
  • the pharmaceutically acceptable carriers and diluents include excipients such as starch, sugar and mannitol, fillers and extenders such as calcium phosphate, cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose and hydroxypropylcellulose, gelatin, alginates, and polyvinyl pyrrolidone. binders such as talc, calcium stearate, lubricants such as hydrogenated castor oil and polyethylene glycol, disintegrants such as povidone and crospovidone, surfactants such as polysorbates, cetyl alcohol, glycerol and the like, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutically acceptable carrier and diluent may be biologically and physiologically compatible with the subject. Examples of diluents include, but are not limited to, saline, aqueous buffers, solvents and/or dispersion media.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical application) depending on the desired method.
  • parenterally eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical application
  • it may be formulated into tablets, troches, lozenges, aqueous suspensions, oily suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, soft capsules, syrups, elixirs, and the like.
  • parenteral administration it may be formulated as an injection solution, suppository, powder for respiratory inhalation, aerosol for spray, ointment, powder for application, oil, cream, etc.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the patient's condition, weight, age, sex, health condition, dietary constitution specificity, the nature of the preparation, the severity of the disease, the administration time of the composition, the administration method, the administration period or interval, the excretion rate and
  • the range may vary depending on the type of drug, and may be appropriately selected by a person skilled in the art. For example, it may range from about 0.1 to 10,000 mg/kg, but is not limited thereto, and may be divided and administered once or several times a day.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical application) depending on the desired method.
  • the pharmaceutically effective amount and effective dose of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the formulation method, administration method, administration time, administration route, etc. of the pharmaceutical composition, and those skilled in the art can achieve effective treatment for the desired treatment.
  • the dosage can be easily determined and prescribed.
  • Administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered once a day, or may be divided and administered several times.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving cancer disease comprising, as an active ingredient, NK cells from which the Keap1 gene has been removed or NK cells cultured with the medium composition.
  • the present invention can be generally used as a commonly used food.
  • the food composition of the present invention can be used as a health functional food.
  • the above “functional health food” refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body in accordance with the Health Functional Food Act, and “functional” refers to food that is not related to the structure and function of the human body. It refers to intake for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients or physiological functions.
  • the health functional food composition may contain conventional food additives, and the suitability as the “food additive” is determined in accordance with the General Rules of the Food Additive Code and General Test Methods approved by the Ministry of Food and Drug Safety, unless otherwise specified. It is judged according to the specifications and standards for the item.
  • Food Additive Code examples include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid, natural additives such as dark pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, guar gum, and mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid
  • natural additives such as dark pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, guar gum
  • mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
  • the food composition of the present invention can be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills and the like.
  • hard capsules can be prepared by mixing and filling a composition according to the present invention with additives such as excipients in a conventional hard capsule, and soft capsules contain the composition according to the present invention. It can be prepared by mixing with additives such as excipients and filling in a capsule base such as gelatin.
  • the soft capsule may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a coloring agent, a preservative, and the like, if necessary.
  • prevention refers to any activity that inhibits or delays cancer disease by administering the composition according to the present invention.
  • treatment refers to all activities that improve or beneficially change cancer disease by administration of the composition according to the present invention.
  • the term "improvement” refers to all actions that improve the bad condition of cancer disease by administration of the composition according to the present invention.
  • Keap1 WT NCR icre mice and Keap1 wt as controls Keap1 wt ;Ncr1 icre (hereinafter referred to as Keap1 WT ) in which the keap1 gene is normally expressed by crossing mice A mouse was also made.
  • the spleens of the Keap1 WT and Keap1 ⁇ NK mice were removed, washed thoroughly with phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS), and finely ground using a 40 ⁇ m cell strainer (SPL, #93040) in 5 ml of RPMI1640. .
  • PBS phosphate buffered saline
  • SPL 40 ⁇ m cell strainer
  • the finely ground spleen was collected in a 50 ml conical tube, 20 ml of PBS containing fetal bovine serum (hereinafter referred to as FBS) was added, centrifuged for 5 minutes, and the supernatant was removed.
  • FBS fetal bovine serum
  • red blood cell lysis buffer (RBC lysis buffer)
  • RBC lysis buffer 1X red blood cell lysis buffer
  • the cells were incubated for 5 minutes in a cell incubator at 37°C supplied with 5% carbon dioxide.
  • 20 ml of PBS containing 2% FBS was added to the splenocytes from which red blood cells were dissociated, centrifuged for 5 minutes, and the supernatant was removed.
  • the centrifuged splenocytes were suspended using RPMI1640 medium, and the number of cells was measured.
  • NK cells were separated from the splenocytes extracted in Experimental Example 1-1 using a FACSAriaTMIII cell sorter (BD bioxciences). Specifically, the extracted splenocytes were treated with T cell marker CD3, B cell marker CD19, NK cell marker NK1.1 and CD49b antibodies, reacted at 4°C for 30 minutes, and then CD3 negative, using a FACSAriaTMIII cell sorter. CD19 negative, NK1.1 positive and CD49b positive parts were separated.
  • BD bioxciences BD bioxciences
  • NK cell activation medium was prepared as follows. 10% FBS, 1X penicillin/streptomycin, 1X glutamax, 1X HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and 1mM N-acetylcysteine or 0.5mM TEMPOL (4-Hydroxy-2,2,6) in NK cell culture medium mixed with 50ng/ml interleukin-2 (IL-2) ,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl) was mixed.
  • IL-2 interleukin-2
  • GCLC which is a transcription factor that increases protein stability by decreasing keap1 gene and keap1 gene expression, and a target gene of nrf2, and Expression of G6PD2 was analyzed.
  • mRNA was extracted from the NK cells using an RNA purification kit (Monarch total RNA miniprep kit, NEB, #T2010), and cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (High-capacity cDNA reverse transcription kit, Thermo, #4368814) .
  • q-PCR quantitative polymerase chain reaction
  • NK cells are differentiated and matured from hematopoietic stem cells, and the degree of maturity can be distinguished according to the aspect of markers specifically expressed at each stage. Among them, NK cells in the final three stages were 1) CD27 positive and CD11b negative; 2) CD27 positive and CD11b positive; 3) Maturity can be classified in the order of CD27 negative and CD11b positive.
  • the NK cells were co-cultured with the Yac-1 cell line, which is a mouse lymphoma cell.
  • the Yac-1 cell line was placed in RPMI1640 (10% FBS/RPMI1640) medium containing 10% FBS, treated with 5 ⁇ g/ml Calcein AM (Invitrogen, C1430), and incubated in a cell incubator at 37°C and 5% carbon dioxide for 1 hour. During incubation, fluorescence was labeled.
  • the NK cells and fluorescently labeled Yac-1 cells were mixed at ratios of 10:1, 5:1, and 1:1, and were dispensed into a round bottom 96-well plate (SPL, #34096).
  • SPL round bottom 96-well plate
  • fluorescently labeled Yac- 1 cell was seeded. After dividing each cell, it was cultured for 4 hours in a cell incubator at 37° C. and 5% carbon dioxide.
  • Cytotoxicity [(Test fluorescence - minimum fluorescence) / (maximum fluorescence - minimum fluorescence)] ⁇ 100
  • the NK cells were co-cultured with p53 gene and Keap1-deleted mouse (C57b6/B129) lung cancer organoids cultured in a 24-well plate. did After collecting mouse lung cancer organoids cultured in a 24-well plate in a size of 50-100 ⁇ m, some were enzymatically dissociated using trypsin, and the number of cells was measured.
  • Lung cancer organoids whose cell number was measured were mixed with lung cancer organoid culture medium and Matrigel (matrigel, Corning, #356231) at a ratio of 1:1 and placed in a 96-well plate in advance, then dispensed into hardened wells and incubated at 37 ° C and 5 °C. It was cultured for 30 to 60 minutes in a cell incubator under % carbon dioxide conditions. Thereafter, the NK cells were divided at a ratio of 5:1 and cultured for 24 hours in a cell incubator at 37° C. and 5% carbon dioxide. Matrigel was enzymatically dissociated from wells subjected to co-culture using PBS containing 1X dispase (Stem cell, #07913).
  • the cells were placed in a 0.25% trypsin-EDTA (0.25% Trypsin-EDTA; Gibco, # 25200-072) solution and enzymatically dissociated for 5 minutes in a cell incubator at 37° C. and 5% carbon dioxide.
  • trypsin-EDTA 0.25% Trypsin-EDTA
  • Gibco, # 25200-072 0.25% Trypsin-EDTA
  • enzymatically dissociated lung cancer organoids by pipetting, PBS containing 2% FBS was added to neutralize 0.25% trypsin/0.05% EDTA, centrifuged for 5 minutes, and the supernatant was removed.
  • the centrifuged lung cancer organoids were stained using the Zombie NIRTM fixable viability kit (Biolegend, #423105), and then the percentage of dead cells was analyzed by FACS.
  • Keap1 ⁇ NK and 200 ⁇ l of 0.25 mg/ml 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) dissolved in acetone was sprayed on the back of Keap1 WT mice. Thereafter, 200 ⁇ l of 0.02 mg/ml Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) dissolved in acetone was sprayed once a week for 30 to 40 weeks to confirm the appearance of skin cancer.
  • DMBA 7,12-dimethylbenz[a]anthracene
  • Example 5 Contains antioxidants NK cultured in cell activation medium NK Analysis of anticancer activity of cells
  • NK cells isolated from mouse spleen were prepared according to Experimental Example 2 above. It was put into an NK cell activation medium and cultured for 30 to 60 minutes in a cell incubator at 37° C. and 5% carbon dioxide. Thereafter, cytotoxicity was confirmed in the same manner as in Example 3-1.
  • both NK cells (NAC) cultured in an antioxidant medium treated with N-acetylcysteine and NK cells (Tempol) cultured in an antioxidant medium treated with Tempol showed cytotoxicity to normal NK cells ( control) was confirmed to be higher.
  • NAC N-acetylcysteine
  • Tempol NK cells
  • normal NK cells can exhibit anticancer activity similar to that of NK cells in which the Keap1 gene was removed by culturing in an NK cell activation medium containing antioxidants.

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Abstract

본 발명은 항산화 기전 조절을 통한 자연살해(natural killer; NK)세포의 항암 기능 향상에 관한 것으로, keap1 유전자를 제거하거나 항산화 물질을 포함하는 배지에서 배양하여 항산화 활성을 촉진시킨 NK 세포가 기존 NK 세포에 비해 항암 활성이 향상되는 것을 확인함으로써, 암 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

항산화 기전 조절을 통한 자연살해세포의 항암 기능 향상
본 발명은 항산화 기전 조절을 통한 자연살해(natural killer; NK)세포의 항암 기능 향상에 관한 것이다.
자연살해(Natural killer; 이하 NK라 함)세포는 선천면역계를 구성하는 주요 세포로, 순환 림프구 중 약 5~20%의 비율로 존재한다. 일반적으로 NK 세포는 항원에 대해 비특이적으로 종양세포 및 바이러스에 감염된 세포를 포함한 비정상 세포를 인식하여 접촉하고 이를 사멸시킨다. NK 세포가 종양세포를 살해하는 과정은 그랜자임(Granzyme B), 퍼포린(Perforin) 등을 포함하는 세포질 과립 방출과 인터페론-감마(Interferon-γ) 및 종양 괴사인자-알파(Tumor-necrosis factor-α, TNF-α)와 같은 사이토카인 분비에 의해 종양세포를 선택적으로 살해함으로써 이루어진다. 이러한 NK 세포의 특성으로 인해, 기존 항암치료법의 한계를 극복하기 위해서 NK 세포를 이용한 항암면역세포치료제 개발이 활발히 진행되고 있다.
그러나 NK 세포를 효과적인 항암면역세포치료제로 이용하기 위해서는 많은 수의 NK 세포 확보뿐만 아니라 NK 세포를 보다 효과적으로 활성화시킬 수 있어야 한다. 정상 상태의 NK 세포는 대부분 비활성화 상태로 존재하기 때문에 정상혈액 또는 비활성화된 환자 혈액으로부터 확보한 NK 세포를 체외에서 활성화시키는 과정이 필수적이다.
Keap1-Nrf2 신호전달기전은 우리 몸의 대표적인 항산화 기전으로, 활성산소(Reactive oxygen species; ROS)의 생성을 조절하는 역할을 담당한다. 활성산소는 세포 내 주요 2차 신호전달물질로, 이를 조절하는 Keap1-Nrf2 신호전달기전은 주요 염증 신호전달기전을 조절할 뿐만 아니라, 조혈모세포, B 세포, 조절 T 세포 등 다양한 면역세포의 분화 및 활성화를 조절하는 것으로 보고되어 있다.
본 발명의 목적은 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 물질을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 활성화용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포 또는 상기 배지 조성물로 배양한 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포 또는 상기 배지 조성물로 배양한 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화 물질을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 활성화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포 또는 상기 배지 조성물로 배양한 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포 또는 상기 배지 조성물로 배양한 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, keap1 유전자를 제거하거나 항산화 물질을 포함하는 배지에서 배양하여 항산화 활성을 촉진시킨 NK 세포가 기존 NK 세포에 비해 항암 활성이 향상되는 것을 확인함으로써, 암 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 keap1 유전자를 제거하거나 항산화 물질을 처리하여 NK 세포의 항암기능을 향상시킨 시스템 개요를 나타낸다.
도 2는 keap1 유전자가 제거된 NK 세포에서 keap1 유전자 및 nrf2의 표적 유전자(GCLC 및 G6PD2)의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 keap1 유전자가 제거된 NK 세포의 성숙도 변화(A) 및 암세포와 공배양 시, 암세포에 대한 세포독성(B)을 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 keap1 유전자가 제거된 NK 세포와 폐암 오가노이드의 공배양 시, 암세포에 대한 세포독성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 NK 세포에서 keap1 유전자가 제거된 마우스에서 피부암의 de novo 발생 유도 시, 피부암의 발생을 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 항산화 물질을 포함하는 배지에서 배양한 NK 세포를 암세포의 공배양 시, 암세포에 대한 세포독성을 분석한 결과를 나타낸다. NAC는 N-아세틸시스테인을 처리한 항산화 배지에서 배양한 NK 세포, Tempol은 템폴을 처리한 항산화 배지에서 배양한 NK 세포, Control은 정상 NK 세포를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포를 제공한다.
상기 NK 세포는 keap1 유전자 발현이 감소하고, GCLC 또는 G6PD2 유전자 발현이 증가할 수 있다.
또한, 상기 NK 세포는 세포 과잉 성숙을 억제할 수 있다.
또한, 상기 NK 세포는 항암 활성이 증가하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 “NK 세포”는 불멸화 NK 세포주, 조혈줄기세포유래 NK 세포, 말초혈액유래 NK 세포, 리프로그래밍에 의하여 유도된 NK 세포 및 동물유래 NK 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 항산화 물질을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 활성화용 배지 조성물을 제공한다.
상기 항산화 물질은 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), 템폴(TEMPOL; 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl), 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E 및 베타 카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배지 조성물은 사이토카인, L-글루타민(L-glutamine), HEPES, 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 항생-항진균제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배지는 RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute Medium 1640), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), DMEM/F12 및 Advanced DMEM/F12로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항생-항진균제는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin), 니스타틴(nystatin) 및 암포테리신(amphotericin)으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 “사이토카인”이란 여러 세포에서 생산되어 자신을 포함한 다른 세포의 기능을 조절할 수 있는 신호전달에 사용되는 작은 크기의 다양한 단백질로서, 인터루킨-2(Interleukin-2; IL-2), IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 “항산화물질”이란 세포에 도입되어 세포 내 활성산소를 제거할 수 있는 물질을 의미하고, “활성화”란 NK 세포의 세포독성을 향상시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 “배지”란 in vitro에서 NK 세포가 성장, 생존 또는 분화하는데 필요한 구성성분들을 포함하고 있으며, 이를 가능하게 하는 배양액을 의미하며, 면역학 분야에서 사용되는 배양 및 분화에 적절한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 또는 해당분야의 기술적 수준에 따라 배지의 종류와 배양 조건에 변화를 줄 수 있다. NK 세포 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하는 배양 최소 배지일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물로 배양한 NK 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포 또는 상기 배지 조성물로 배양한 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암은 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.
상기 약학 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 피부 외용제 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 전분, 당 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 윤활제, 포비돈 및 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽, 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 약학적 유효량 및 유효 투여량은 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간, 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포 또는 상기 배지 조성물로 배양한 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기“건강기능식품”이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 “식품 첨가물”로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진 하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제 는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강 기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어 “예방”은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 질환을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어 “개선”은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 말한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[실험예 1] Keap1 유전자가 제거된 NK 세포 분리
1-1. keap1 유전자가 제거된 마우스 제작
본 특허에 관련된 동물 실험은 대구경북과학기술원 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: DGIST-IACUC-22100612-0002) 하에 실시하였다. 마우스에서 분리한 NK 세포에서 keap1 유전자를 제거하기 위해, NK 세포에서 cre recombinase를 발현하는 NCRicre 마우스와 keap1flox / flox 마우스를 교배하여 NK 세포에서 특이적으로 keap1 유전자 발현이 감소하는 Keap1flox / flox;Ncr1icre(이하 Keap1ΔNK라 함) 마우스를 제작하였다. 대조군으로 NCRicre 마우스와 Keap1wt 마우스를 교배하여 keap1 유전자가 정상적으로 발현하는 Keap1wt;Ncr1icre(이하 Keap1WT라 함) 마우스도 제작하였다.
1-2. 마우스 비장으로부터 혈구세포 분리
상기 Keap1WT 및 Keap1ΔNK 마우스의 비장을 적출하여 인산염완충생리식염수(phosphate buffered saline; 이하 PBS라 함)로 깨끗이 씻어준 후, RPMI1640 5ml에 40μm cell strainer(SPL, #93040)를 이용하여 잘게 갈아주었다. 잘게 갈린 비장을 50ml 코니컬 튜브(conical tube)에 모으고, 2% 소태아혈청(fetal bovine serum; 이하 FBS라 함)이 포함된 PBS 20ml를 첨가하여 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 원심분리된 비장세포에 1X 적혈구 해리용액(Red blood cell lysis buffer; RBC lysis buffer) 5ml를 넣고 파이펫팅으로 잘 풀어준 후, 37℃의 5% 이산화탄소가 공급되는 세포 배양기에서 5분 동안 배양하였다. 적혈구가 해리된 비장세포에 2% FBS가 포함된 PBS 20ml를 첨가하여 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 원심분리된 비장세포를 RPMI1640 배지를 사용하여 현탁시키고, 세포수를 측정하였다.
1-3. NK 세포 분리
상기 실험예 1-1에서 추출한 비장세포를 FACSAriaTMIII cell sorter(BD bioxciences)를 이용하여 NK 세포를 분리하였다. 구체적으로 상기 추출한 비장세포에 T 세포 마커인 CD3, B 세포 마커인 CD19, NK 세포 마커인 NK1.1 및 CD49b 항체를 처리하여 4℃에서 30분간 반응시킨 후, FACSAriaTMIII cell sorter를 사용하여 CD3 음성, CD19 음성, NK1.1 양성 및 CD49b 양성인 부분을 분리하였다.
[실험예 2] 항산화물질이 포함된 NK 세포 활성화배지 제조
NK 세포 활성화 배지는 하기와 같이 제조하였다. RPMI1640 배지에 10% FBS, 1X 페니실린/스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 1X 글루타맥스(glutamax), 1X HEPES, 0.5mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 50μM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 및 50ng/ml 인터루킨-2(interleukin-2; IL-2)을 혼합한 NK 세포 배양용 배지에 1mM N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 또는 0.5mM 템폴(TEMPOL; 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl)을 혼합하였다.
[실시예 1] keap1 유전자 및 nrf2 표적 유전자 발현 분석
상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포에서 keap1 유전자 발현 감소를 확인하기 위해, keap1 유전자와 keap1 유전자 발현 감소에 의해 단백질 안정성이 증가하는 전사 인자(transcription factor)이면서 nrf2의 표적 유전자(target gene)인 GCLC 및 G6PD2의 발현을 분석하였다. 상기 NK 세포를 RNA 정제 키트(Monarch total RNA miniprep kit, NEB, #T2010)를 이용하여 mRNA를 추출한 후, cDNA 합성 키트(High-capacity cDNA reverse transcription kit, Thermo, #4368814)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후, 합성된 cDNA를 주형으로 하여 q-PCR(quantitative polymerase chain reaction)을 수행하여 keap1, GCLC 및 G6PD2 유전자의 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, keap1 유전자가 제거된 NK 세포에서 keap1 유전자 발현은 감소한 반면, GCLC 및 G6PD2 유전자의 발현은 증가하는 것을 확인하였다.
[실시예 2] 세포 성숙도 분석
NK 세포는 조혈줄기세포로부터 분화 및 성숙되는데, 각 단계에서 특이적으로 발현되는 마커의 양상에 따라 성숙도를 구분할 수 있다. 그 중에서도 최종 3단계의 NK 세포는 1) CD27 양성 및 CD11b 음성; 2) CD27 양성 및 CD11b 양성; 3) CD27 음성 및 CD11b 양성의 순서로 성숙도를 구분할 수 있다.
따라서, 상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포의 성숙도를 확인하기 위해, CD27 및 CD11b 항체를 이용해 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, Keap1 유전자가 제거된 NK 세포에서 과잉 성숙이 억제되는 것을 확인하였다.
[실시예 3] 암세포에 대한 세포독성 분석
3-1. NK 세포 및 Yac-1 세포의 공배양을 통한 세포독성 분석
상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포의 암세포에 대한 세포독성을 확인하기 위해, 상기 NK 세포를 마우스 림프종 세포인 Yac-1 세포주와 공배양을 수행하였다. Yac-1 세포주를 10% FBS가 포함된 RPMI1640(10% FBS/RPMI1640) 배지에 넣고, 5μg/ml Calcein AM(Invitrogen, C1430)을 처리하고, 37℃ 및 5% 이산화탄소 조건의 세포 배양기에서 1시간 동안 배양하여 형광을 표지하였다. 이후 상기 NK 세포 및 형광이 표지된 Yac-1 세포를 10:1, 5:1 및 1:1의 비율로 섞어 round bottom 96 웰 플레이트(SPL, #34096)에 분주하였다. 추가로, 세포독성 비율을 계산하기 위한 최대값(Maximum, 2% 트리톤 X-100이 포함된 10% FBS/RPMI1640)과 최소값(Minimum, 10% FBS/RPMI1640)의 웰에도 형광이 표지된 Yac-1 세포를 분주하였다. 각각의 세포를 분주한 후, 37℃ 및 5% 이산화탄소 조건의 세포 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 후, 배지를 잘 섞고 100×g로 5분간 원심분리하여 상층액을 블랙 플레이트(black plate)(SPL, #30296)로 옮긴 후, 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescence microplate reader)를 사용하여 형광을 측정하였다. 형광 측정 시, 흡광(excitation) 파장 485nm 및 발광(emission) 파장 530nm에서 측정하였고, 세포독성은 하기의 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
세포독성 = [(Test 형광 - minimum 형광)/(maximum 형광- minimum 형광)]×100
그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, Keap1이 제거된 NK 세포의 세포독성이 정상 NK 세포보다 높은 것을 확인하였다.
3-2. NK 세포 및 마우스 폐암 오가노이드 공배양을 통한 세포독성 분석
상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포의 암세포에 대한 세포독성을 확인하기 위해, 상기 NK 세포를 24 웰 플레이트에서 배양한 p53 유전자와 Keap1이 제거된 마우스(C57b6/B129) 폐암 오가노이드와 공배양을 수행하였다. 24 웰 플레이트에서 50~100μm 크기로 배양한 마우스 폐암 오가노이드를 회수한 후, 일부는 트립신(trypsin)을 이용해 효소적으로 해리시킨 후 세포수를 측정하였다. 세포수를 측정한 폐암 오가노이드는 폐암 오가노이드 배양 배지 및 마트리겔(matrigel, Corning, #356231)을 1:1의 비율로 섞어 96 웰 플레이트에 미리 넣어준 후 굳힌 웰에 분주하고 37℃ 및 5% 이산화탄소 조건의 세포 배양기에서 30~60분 동안 배양하였다. 이후, 상기 NK 세포를 5:1의 비율로 분주한 후, 37℃ 및 5% 이산화탄소 조건의 세포 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 공배양을 실시한 웰을 1X 디스파아제(dispase, Stem cell, #07913)가 포함된 PBS를 이용하여 마트리겔을 효소적으로 해리시켰다. 이후 0.25% 트립신-EDTA(0.25% Trypsin-EDTA; Gibco, # 25200-072) 용액에 넣고 37℃ 및 5% 이산화탄소 조건의 세포 배양기에서 5분 동안 효소적으로 해리시켰다. 효소적으로 해리된 폐암 오가노이드를 파이펫팅으로 잘 풀어준 후, 2% FBS가 포함된 PBS를 첨가하여 0.25% 트립신/0.05% EDTA를 중화시킨 후, 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 원심분리된 폐암 오가노이드는 Zombie NIRTM fixable viability kit(Biolegend, #423105)를 사용하여 염색한 후, FACS를 통해 사멸된 세포의 비율을 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Keap1이 제거된 NK 세포의 세포독성이 정상 NK 세포보다 높은 것을 확인하였다.
[실시예 4] 항암 활성 분석
상기 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포의 de novo로 발생한 피부암에 대한 항암 활성을 확인하기 위해, Keap1ΔNK 및 Keap1WT 마우스의 등에 털을 제거하고 아세톤에 용해시킨 0.25mg/ml 7,12-디메틸벤즈안트라센(7,12-Dimethylbenz[a]anthracene, DMBA) 200μl를 뿌려주었다. 이후 30~40주 동안 주 1회 아세톤에 용해시킨 0.02mg/ml 포르볼 12-미리스테이트-13아세테이트(Phorbol 12-myristate 13-acetate, TPA) 200μl를 뿌려주며 피부암의 발생 양상을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, NK 세포에서 Keap1 유전자가 제거된 마우스의 경우, 피부암의 발생이 감소하는 것을 확인하였다. 결론적으로, NK 세포에 특이적으로 Keap1 유전자를 제거하여 항산화 활성을 향상시킬 때 암의 de novo 생성이 억제되는 것을 확인하였다.
[ 실시예 5] 항산화 물질이 포함된 NK 세포 활성화 배지에서 배양한 NK 세포의 항암 활성 분석
항산화 물질이 포함된 NK 세포 활성화 배지에서 배양한 NK 세포가 Keap1 유전자가 제거된 NK 세포와 동일한 항암 활성을 나타낼 수 있는지 확인하기 위해, 마우스 비장에서 분리한 NK 세포를 상기 실험예 2에 따라 제조한 NK 세포 활성화 배지에 넣고, 37℃ 및 5% 이산화탄소 조건의 세포 배양기에서 30~60분 동안 배양하였다. 이후 실시예 3-1과 동일한 방식으로 세포독성을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, N-아세틸시스테인을 처리한 항산화 배지에서 배양한 NK 세포(NAC) 및 템폴을 처리한 항산화 배지에서 배양한 NK 세포(Tempol) 모두 세포독성이 정상 NK 세포(control)보다 높은 것을 확인하였다. 결론적으로, 정상 NK 세포도 항산화 물질이 포함된 NK 세포 활성화 배지에서 배양함으로써, Keap1 유전자가 제거된 NK 세포와 유사한 항암 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (12)

  1. Keap1 유전자가 제거된 NK 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 NK 세포는 keap1 유전자 발현이 감소하고, GCLC 또는 G6PD2 유전자 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 NK 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 NK 세포는 세포 과잉 성숙을 억제하는 것을 특징으로 하는 NK 세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 NK 세포는 항암 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 NK 세포.
  5. 항산화 물질을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 활성화용 배지 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 항산화 물질은 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), 템폴(TEMPOL; 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl), 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E 및 베타 카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 배지 조성물은 사이토카인, L-글루타민(L-glutamine), HEPES, 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 항생-항진균제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 배지는 RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute Medium 1640), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), DMEM/F12 및 Advanced DMEM/F12로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 항생-항진균제는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin), 니스타틴(nystatin) 및 암포테리신(amphotericin)으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  10. 청구항 1의 NK 세포 또는 청구항 5의 배지 조성물로 배양한 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 암은 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 청구항 1의 NK 세포 또는 청구항 5의 배지 조성물로 배양한 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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