ES2293353T3 - Productos sanguineos procedentes de celulas madre mesenquimales. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir productos sanguíneos in vitro, en el que: a) se aíslan células madre mesenquimales no transformadas con SV-40, que son negativas para CD34, y que son negativas para CD45 y positivas para CD105, CD59, CD90, CD13 y MHC I después de al menos un paso en el cultivo; y b) dichas células madre mesenquimales no transformadas con SV-40 aisladas son cultivadas con los siguientes factores de crecimiento añadidos individualmente o en sus combinaciones: factor de célula madre (SCF), trombopoyetina (TPO), ligando flt-3 (FL), interleuquinas, incluyendo interleuquina-3 (IL-3) e interleuquina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), eritropoyetina (Epo), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento del tipo insulina (IGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF) e hidrocortisona (HC), durante un tiempo suficiente pra producir al menos un tipo de productos sanguíneos.
Description
Productos sanguíneos procedentes de células
madre mesenquimales.
La presente invención se refiere a productos
sanguíneos y métodos para producir productos sanguíneos a partir de
células madre mesenquimales.
Las células madre hematopoyéticas (HSC) y las
células madre mesenquimales (MesSC) son poblaciones de células
fácilmente distinguibles a partir de marcadores de la superficie
celular. Se pensaba antes que las HSC y las MesSC daban lugar a
distintas poblaciones de células y tejidos.
Se sabe que las HSC forman células sanguíneas,
tales como eritrocitos, mielocitos, plaquetas, células dendríticas
y linfocitos. Las HSC también se conocen como células madre de la
médula ósea (BMSC) y células madre medulares (MSC). Las HSC se han
derivado de la médula ósea y son identificadas como células
CD34-positivas y CD38-negativas
no-adherentes. Además, las HSC se han identificado
como células Lin-negativas y HLA DR-
positivas.
positivas.
Las MesSC forman tejidos no hematopoyéticos
tales como células óseas, condrocitos, del tendón, lipocitos,
músculares y nerviosas. Las MesSC son células progenitoras
oligopotentes localizadas en la médula ósea, la sangre, y otros
tejidos que se pueden diferenciar en una variedad de tejidos no
hematopoyéticos incluyendo hueso, cartílago, tendón, grasa,
músculo, y los progenitores iniciales de las células nerviosas. Las
MesSC se diferencian en diferentes tipos de células dependiendo de
la interacción de una variedad de influencias ambientales en las
células, incluyendo los factores de crecimiento y el ambiente
físico.
Las MesSC se diferencian de las HSC porque las
MesSC se identifican como células CD34-negativas.
Las MesSC también pueden ser identificadas como negativas para CD45
y positivas para CD105, CD59, CD90, CD13, y MHC I después de al
menos un paso en el cultivo.
Los ejemplos de la diferenciación de MesSC en
tejidos no hematopoyéticos incluyen la diferenciación de MesSC en
el mesodermo (grasa, cartílago, hueso, tendón, músculo cardíaco y
músculo esquelético; Pittinger, MF et al., 1999,
Science, 248: 385-389; Jaiswal, N
et al., 1997, J. Cell Biochem., 64 (2):
295-312; Shakibaei, M et al., 1997, Cell
Biol. Int, 21 (2): 115-25.; Fukuda, K,
2001, Artif. Organs. 25 (3):187-93.) y
en el ectodermo (células neuronales, Deng et al. 2001,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 282 (1):
148-52.; Woodbury et al., 2000, J.
Neurosci. Res., 61 (4): 364-70.). Después
del trasplante de las MesSC en el miocardio infarctado de ratas,
las células trasplantadas se diferenciaron en músculo cardíaco y
fueron detectadas semanas más tarde en la regeneración del tejido
cardiaco, como se detecta por un gen marcador (Toma, C et
al., 2002, Circulation, 105 (1):
93-8.). En otros modelos con animales, fue
demostrado que las MesSC se diferenciaban en cerebro y médula
espinal en animales dañados o transgénicos, conduciendo a una
mejora o curándose de los tejidos nerviosos dañados. (Hofstetter
et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
99 (4): 2199-204.).
El documento WO 99/61588 describe un método para
producir megacariocitos in vitro que comprende
co-cultivar células madre mesenquimales humanas con
células CD34+ para inducir que las células CD34+ se diferencien en
megacariocitos.
Algunos estudios han sugerido que las MesSC
pueden ser beneficiosas para potenciar a las células
hematopoyéticas, tal como en el trasplante de médula ósea, la
inmunoregulación y en la facilitación de injertos. Sin embargo, no
se han cultivado MesSCs in vitro para formar células
sanguíneas.
Las ventajas del uso de las MesSC para formar
productos sanguíneos incluyen la capacidad de aumentar enormemente
las MesSC en el cultivo después del aislamiento. A diferencia de las
HSC que no se propagan bien en cultivos, las MesSC pueden ser
enormemente aumentadas en cultivo y seguir conservando la capacidad
de diferenciarse en una pluralidad de productos sanguíneos. Por
ejemplo, una pequeña cantidad de aspirado de médula ósea puede
proporcionar las suficientes MesSC para su diferenciación en un gran
número de células que forman los productos sanguíneos de la
presente invención.
Así, son deseables métodos para proporcionar
productos sanguíneos a partir de MesSC.
En consecuencia, un objeto de la invención es
proporcionar un método para producir productos sanguíneos in
vitro y para diferenciar células mesenquimales no transformadas
con SV-40 in vitro, en el que:
- a)
- se aíslan células madre mesenquimales no transformadas con SV-40, que son CD34-negativo, y que son negativas para CD45 y positivas para CD105, CD59, CD90, CD13 y MHC I después de al menos un paso en el cultivo; y
- b)
- dichas células madre mesenquimales no transformadas con SV-40 aisladas se cultivan con los siguientes factores de crecimiento añadidos individualmente o en sus combinaciones:
- factor de célula madre (SCF), trombopoyetina (TPO), ligando flt-3 (FL), interleuquinas, incluyendo interleuquina-3 (IL-3) e interleuquina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), eritropoyetina (Epo), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento del tipo insulina (IGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF), e hidrocortisona (HC),
durante un tiempo suficiente para producir al
menos un tipo de productos sanguíneos.
Otro objeto de la invención es usar los
productos sanguíneos obtenidos por el método de la invención para
preparar una composición farmacéutica para tratar a un paciente en
necesidad del mismo, así como un método para preparar una
composición farmacéutica que comprende el método de la invención
para proporcionar dicho producto sanguíneo.
La Figura 1 es un diagrama de diferenciación de
células madre mesenquimales que forman los diversos productos
sanguíneos de la presente invención;
La Figura 2 es una gráfica que muestra el
crecimiento y las características de duplicación de las células
madre mesenquimales aisladas de la presente invención;
La Figura 3 es una gráfica que muestra los
recuentos de células sanguíneas después del trasplante en ratones
con MesSC de la presente invención; y
La Figura 4 es un diagrama que muestra la
subpoblación de células sanguíneas en ratones trasplantados.
La presente invención utiliza células madre
mesenquimales (MesSC) cultivadas y aisladas para producir productos
sanguíneos en forma de células. Los productos sanguíneos producidos
con este método incluyen los formados de manera convencional a
partir de células madre hematopoyéticas. Las expresiones
"productos sanguíneos" o "tipo de productos sanguíneos",
según se usan en este documento, se refieren a todas las células
encontradas en la sangre periférica, incluyendo las células madre,
las poblaciones de célula inmaduras y maduras. De modo ilustrativo,
los productos sanguíneos incluyen, pero no están limitados, a
células madre hematopoyéticas formadas a partir de MesSC
cultivadas, células madre mieloides, células endoteliales, células
madre linfoides, células que presentan antígenos, células
eritroides y megacariocitos y poblaciones de células derivadas a
partir de éstas. La Figura 1 representa las principales etapas del
desarrollo en la formación de células sanguíneas. El procedimiento
de formación de las células sanguíneas es un continuo de
proliferación y diferenciación a partir de células madre en células
maduras encontradas en la sangre circulante. La Figura 1 ilustra
como ejemplo los productos sanguíneos que pueden formarse a partir
de las MesSC cultivadas. Por ejemplo, los eritrocitos, macrófagos y
células dendríticas pueden ser derivados todos a partir de células
madre mieloides.
Las MesSC conforme a la presente invención
pueden ser identificadas con marcadores de expresión de la
superficie de las células. Las MesSC adecuadas tienen la mayoría de
los marcadores superficiales expresados, como se muestran en la
Tabla I. Conforme a la presente invención, se aislan MesSC no
transformadas con SV-40, las que son negativas para
CD-34, y las que son negativas para CD45 y positivas
para CD105, CD59, CD90, CD13 y MHCI después de al menos un paso en
el cultivo.
En una realización de la presente invención,
descrita en este documento, las MesSC usadas para producir productos
sanguíneos pueden ser derivadas a partir de la médula ósea o la
sangre, preferiblemente pueden ser aspiradas a partir de la médula
ósea. Sin embargo, las MesSC pueden ser derivadas a partir de
cualquier fuente de células conocidas para cualquier experto en la
técnica, incluyendo, pero no limitado a la médula ósea, la sangre,
la dermis y el periostio. El término cultivo según se usa en este
documento incluye el crecimiento de MesSC, la expansión de MesSC y
la diferenciación de MesSC para formar productos sanguíneos. La
expresión "transformadas con SV-40" según se
usa en este documento se refiere a la transformación de células
in vitro en una línea celular que sea capaz de crecer con
duplicaciones sin restricción, teniendo una vida útil infinita
usando un antígeno de T SV-40 grande para
transformar células que tienen un número limitado de duplicaciones
de población en una línea celular, teniendo infinitas duplicaciones
demográficas. Las células no transformadas con SV-40
no han sido transformadas con el antígeno T SV-40
grande. La expresión "célula madre", según se usa en este
documento, se refiere a una célula inmadura que es capaz de dar
lugar a otros tipos de células.
En una realización preferida de la presente
invención, las MesSC se aíslan a partir de aspirados de médula ósea
usando un gradiente Percoll®, como se describe más abajo. Se
muestran las características de crecimiento de los aislados de
MesSC en la Figura 2.
Después del aislamiento con el gradiente
Percoll®, las MesSC pueden ser cultivadas y expandidas in
vitro. Después del paso en el cultivo, las MesSC pueden ser
cultivadas en presencia de medio de diferenciación y factores de
crecimiento para producir productos sanguíneos, es decir dichas
MesSC no transformadas con SV-40 aisladas se
cultivan con los factores de crecimiento siguientes añadidos
individualmente o en sus combinaciones: factor de células madre
(SCF), trombopoyetina (TPO), ligando flt-3 (FL),
interleuquinas, incluyendo interleuquina-3
(IL-3) e interleuquina-6
(IL-6), factor estimulante de colonias de
granulocitos (G-CSF), factor estimulante de
colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF),
eritropoyetina (Epo), factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor
de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento del tipo
insulina (IGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor
inhibitorio de la leucemia (LIF) e hidrocortisona (HC). De forma
alternativa, las MesSC pueden ser cultivadas en presencia de medio
de diferenciación y factores de crecimiento sin pasar las MesSC
antes de la diferenciación. Los productos de células sanguíneas
formados in vitro a partir de las MesSC dependerán de las
condiciones del cultivo seleccionadas para la diferenciación y son
descritas más detalladamente más abajo.
Las células aisladas a partir de la médula ósea
pueden ser usadas inmediatamente, o de forma alternativa, las
células pueden ser almacenadas para su extensión posterior y/o
diferenciación. Por ejemplo, las células de la médula ósea recién
aisladas pueden ser almacenadas, preferiblemente
crio-conservadas, como se hace rutinariamente en el
campo de los trasplantes de médula ósea. La médula ósea recién
aislada comprende una mezcla de células, incluyendo MesSC y HSC.
Las células de médula ósea almacenadas pueden separarse en un
gradiente Percoll®, aislarse, cultivarse y diferenciarse en un
tiempo posterior sin pérdida sustancial de capacidad proliferativa
o de diferenciación. El aislado de MesSC también puede ser
almacenado, preferiblemente crio-conservado, después
del centrifugado con Percoll® y antes de cultivar in vitro.
Las MesSC cultivadas también pueden ser almacenadas,
preferiblemente crio-conservadas, en el paso inicial
después de ponerlas en placas sobre plástico en el cultivo celular,
tal como P0 o P1 sin ninguna pérdida sustancial de su capacidad
proliferativa o de diferenciación. Potencialmente todos los
productos sanguíneos, en cualquier etapa del proceso, desde la
médula ósea cultivada a los productos sanguíneos diferenciados,
pueden ser almacenados durante un periodo de tiempo, antes de la
administración al paciente. El almacenaje de los productos
sanguíneos puede ser cualquier tipo de almacenaje conocido para
cualquier experto en la técnica. El almacenaje de productos
sanguíneos puede ser ventajoso por muchos motivos, incluyendo, pero
no limitado a, administraciones repetidas dadas a una paciente,
donación autóloga para su uso posterior, caracterización de
poblaciones de células y su uso posterior y otros.
En una realización preferida, las MesSC se
aíslan a partir de aspirados de médula ósea. La médula ósea es
obtenida a partir de donantes autólogos o alogénicos de acuerdo con
procedimientos conocidos para cualquier experto en la técnica. Una
vez que la médula ósea es obtenida a partir del donante, las MesSC
se aislan a partir del aspirado de médula ósea usando un gradiente
Percoll®.
En una realización preferida, se prepara un
gradiente discontinuo. La preparación del gradiente y la separación
de las MesSC ha sido descrita en el documento DE 103 36 152
(Solicitud de Patente Alemana Nº. de serie 103 36 152.9, presentada
el 6 de Agosto de 2003) y la Solicitud de Patente Internacional Nº.
PCT/EP2004/008865, presentada el 6 de Agosto de 2004 (siendo
tituladas ambas solicitudes "Purification procedure for
mesenchymal stem cells").
En una realización preferida, la solución
Percoll® con una densidad de 1,124 g/ml (Fa. Biochrom, Berlín,
Alemania) se usa para preparar un gradiente de densidad
discontinua. Las diluciones de la solución básica se preparan con
PBS (solución salina tamponada de fosfato sin Ca^{++} ni
Mg^{++}, Gibco, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con la
fórmula:
V [%] =
\frac{(D'-D%) x
10^{2}}{D''-D%}
en la
que:
- D'
- densidad final deseada (g/ml)
- D''
- densidad básica alta (g/ml)
- D%
- densidad del diluyente iso-osmolal (g/ml)
- V%
- tanto por ciento del volumen de la solución básica con alta densidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Las soluciones de separación que se usan en este
método pueden prepararse usando una variedad de densidades,
preferiblemente con las densidades siguientes: 1,050, 1,063, 1,068,
1,077, 1,088 y 1,100 g/ml.
Los aspirados de médula ósea son diluidos 1:1
con PBS y segmentados en capas en gradientes Percoll® y
centrifugados durante 20 minutos con 800 x g a temperatura ambiente
(TA). Las células de baja densidad son aisladas a partir de
glóbulos rojos de densidad más alta y células hematopoyéticas
mononucleares como se describe más abajo en el Ejemplo 1. Las
células de baja densidad son seleccionadas por su alto potencial
proliferativo, basado en la caracterización en los posteriores
ensayos de crecimiento, fenotípicos y de diferenciación. De forma
alternativa, las MesSC pueden ser aisladas por cualquier método
conocido para cualquier experto en la técnica.
Las células de baja densidad que comprenden
MesSC son recogidas, lavadas dos veces en PBS, resuspendidas en
medio de crecimiento que comprende DMEM/baja en glucosa (Gibco)
suplementado con suero de becerro fetal (FCS) del 10%
preseleccionado (BioWhittaker, Apen, Alemania) y 1% de
penicilina/estreptomicina (Gibco). El FCS fue preseleccionado
comparando las características de crecimiento para las MesSC
cultivadas en DMEM/LG + 10% de FCS. Las MesSC fueron analizadas en
el paso P4 para el fenotipo de MesSC en el análisis FACS y en los
ensayos de diferenciación, incluyendo el potencial adipo-, osteo- y
condro-génico. El FCS fue seleccionado por promover
la diferenciación y por la mayor extensión de las MesSC del ensayo.
Las células aisladas que comprenden MesSC son contadas en una
cámara de Neubauer. Para el sembrado inicial, 1 x 10^{7} células
se siembran en matraces de cultivo de tejido con 25 cm^{2} de
superficie de crecimiento y se cultivan en una incubadora con 5% de
CO_{2} y una humedad del 97% hasta la confluencia de
aproximadamente el 90%. Las células aisladas que comprenden MesSC
son células preferiblemente CD34-negativas,
adherentes al plástico, del tipo fibroblasto. Las MesSC aisladas
crecen a través de 4 a 10 pasos, dependiendo de la calidad del
material del donante, con una velocidad de duplicación
aproximadamente constante, como se muestra en la Figura 2.
Eventualmente, el potencial de proliferación decrece y las MesSC
dejan de crecer. Durante la fase de proliferación activa, las MesSCs
aisladas muestran marcadores de la superficie celular específicos
para MesSC, incluyendo CD 105, CD 59, CD 90, CD 13 y MHC I. Las
MesSC dan negativo para los marcadores hematopoyéticos, incluyendo
CD 34 y CD 45. Para la diferenciación de las MesSC en la pluralidad
de productos sanguíneos, pueden ser usados varios medios de
diferenciación y factores de crecimiento. Por ejemplo, una
población de leucocitos que expresen el marcador de leucocitos pan,
CD 45, puede ser obtenida aproximadamente dos semanas antes del
cultivo. Las MesSC aisladas, que son negativas para CD34 y CD45 y
al menos positivas para cD90 y CD105, pueden ser cultivadas en un
medio de diferenciación para producir una población de productos
sanguíneos que comprendan leucocitos, que expresen CD45. El medio
de diferenciación para obtener las células CD45 positivas incluye
IMDM como medio básico, suplementado con 10% de FCS y suero de
caballo del 10% (HS), 1 x 10^{-6} M de HC mezclado 1:1 con
metilcelulosa Nº. 4535 (CellSystems Biotech, que contiene las
citoquinas que aumentan la proliferación SCF, IL-3,
IL-6, G-CSF, GM-CSF.
Epo también es añadido al cultivo. Los productos sanguíneos que
comprenden células positivas para CD45 son obtenidos 2 semanas
antes de la incubación. El medio para las MesSC cultivadas se cambia
cada dos días.
Para obtener productos sanguíneos que comprendan
células madre mieloides, las MesSC primero se cultivan en StemSpan
(CellSystems Biotech) como medio básico sin suero suplementado con
SCF, TPO, GM-CSF y FL durante dos semanas para
preestimular las MesSC. El medio para las MesSC cultivadas se cambia
cada dos días. A partir de entonces, las MesSC se cultivan,
resuspendidas en suero sin metilcelulosa Nº. 4436 (CellSystems
Biotech, que contiene las citoquinas que aumentan la proliferación
SCF, IL-3, IL-6,
G-CSF, GMCSF y Epo) y se incuba durante 2 semanas
adicionales. Los productos sanguíneos formados pueden incluir
monocitos/macrófagos, indicado por una tinción con CD 14 positiva y
granulocitos, incluyendo neutrófilos, eosinófilos y basófilos,
indicado por una tinción con CD 16 positiva. Además, pueden ser
formadas estructuras BFU-E (unidades formadoras de
colonias de eritroides en ramillete) a partir de condiciones de
cultivo mieloides y pueden ser identificadas por la morfología y
por tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo frente a
glicoforina A.
Para productos sanguíneos que comprendan células
endoteliales, las MesSC fueron sembradas en Chamber Slides® en
StemSpan (StemCell Tech) como medio básico sin suero suplementado
con VEGF, bFGF y HGF y HC 10^{-6} M. Las MesSC fueron incubadas
durante 3 semanas con cambios de medio cada dos días. De forma
alternativa, las MesSC fueron preestimuladas durante dos semanas en
StemSpan suplementado con SCF, TPO, FL seguido por la diferenciación
durante dos semanas en StemSpan suplementado con VEGF, bFGF y IGF.
Los productos sanguíneos que comprendían células endoteliales
fueron identificados con tinción inmunohistoquímica para CD 31, CD
34, vWF (Factor de von Willebrand), y KDR (también conocido como
VEGFR2, Receptor del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular
2).
Después de la diferenciación, los productos
sanguíneos formados pueden ser opcionalmente teñidos
citoquímicamente para confirmar el(los) tipo(s) de
célula(s) presente(s) en el cultivo. Preferiblemente,
será confirmado el tipo de célula del producto sanguíneo usando
inmunocitoquímica, más preferiblemente, será confirmado el tipo de
célula usando la expresión del marcador de la superficie celular de
los epítopos del Grupo de Diferenciación
(GD).
(GD).
Dentro de cada linaje y entre cada linaje del
producto sanguíneo formado, los antígenos, tales como antígenos de
GD, son expresados diferencialmente en la superficie y en el
citoplasma de las células en un linaje dado. La expresión de uno o
varios antígenos y/o la intensidad de la expresión puede ser usada
para distinguir entre las etapas de maduración dentro de un linaje
y entre linajes. Los productos sanguíneos formados a partir de las
células diferenciadas entonces pueden ser administrados a un
paciente.
Como se describe anteriormente, los productos
sanguíneos derivados a partir de las MesSCs y las MesSC son teñidos
para la expresión del marcador de la superficie celular para
identificar los productos sanguíneos formados. En una realización
de la presente invención, los productos sanguíneos son cultivados,
lavados en PBS y centrifugados en portaobjetos para las
preparaciones de citospina. De forma alternativa, pueden ser
cultivados productos sanguíneos adherentes, tales como células
endoteliales, directamente en Chamber Slides® para una tinción
subsecuente. Las portaobjetos son secados al aire, fijados durante
10 minutos en acetona helada. La células fijadas con acetona pueden
ser almacenadas a -20ºC hasta su tinción.
Para la tinción, los portaobjetos se calientan a
TA y se bloquean con suero de cabra normal del 5% en PBS durante 10
minutos. Después de la eliminación de la solución de bloqueo, las
preparaciones de citospina o las preparaciones del Chamber Slide®
son incubadas con cantidades tituladas de anticuerpos primarios
durante 30 minutos a TA en una cámara humedecida. La tinción es
seguida de 2 lavados en PBS durante 10 minutos cada uno a TA y la
incubación con cantidades tituladas de anticuerpos secundarios
marcados con fluorocromo durante 30 minutos en una cámara
humedecida. Los portaobjetos se lavan dos veces con PBS y se tiñen
durante 1 minuto con DAPI para visualizar el núcleo de la célula,
seguido de 2 lavados con PBS durante 10 minutos. Un lavado corto de
los portaobjetos con agua dest. es seguido por la fijación durante 5
minutos en etanol absoluto y luego por secado al aire. Los
portaobjetos son revestidos con Fluoromount® (Southern Biotech,
Eching, Alemania) y la cubierta de vidrio se desliza y almacenan
hasta su análisis a 4ºC. Se conocen métodos alternativos para la
tinción por los expertos en la técnica o se harán evidentes a partir
de la descripción de la presente invención.
El análisis de los productos sanguíneos teñidos
es llevado a cabo usando una luz de alta potencia y el microscopio
de fluorescencia. Como se describe anteriormente, la siguiente
tinción, usando los marcadores identificados solos o en sus
combinaciones, ha sido observada para los productos sanguíneos
identificados:
a) células madre mieloides positivas para CD34,
CD133, CD14, CD16, CD45;
b) células eritroides positivas para Glicoforina
A;
c) células megacariocíticas positivas para
CD41;
d) células endoteliales positivas para vWF,
CD31, CD34, KDR;
e) células linfoides positivas para CD3 y
- i)
- Células T positivas para CD4, CD8;
- ii)
- Células NK positivas para CD56;
- iii)
- Células NK-T positivas para CD3, NK1.1;
- iv)
- Células B positivas para CD10; CD19; CD20;
f) células dendríticas positivas para CD80,
CD86, MHC I, MHC II, CD1a, CD40.
\vskip1.000000\baselineskip
La administración de las células madre
mesenquimales diferenciadas puede hacerse por inyección, infusión o
instilación de productos sanguíneos en el paciente. Los productos
sanguíneos pueden ser inyectados, infundidos, o instilados
directamente en un órgano objetivo deseado o, de forma alternativa,
los productos sanguíneos pueden ser inyectados intravenosamente,
intraarterialmente o intraperitoneal. Cualquier método de
administración para células, comúnmente conocido en la técnica,
puede ser usado para la administración de los productos sanguíneos
formados a partir de MesSC.
Los productos sanguíneos formados a partir de
las MesSC cultivadas de acuerdo con el método de la invención
pueden ser usados para tratar a pacientes en necesidad de un
producto sanguíneo. En ciertas realizaciones, una dosis
terapéuticamente eficaz de productos sanguíneos es suminstrada al
paciente. Una dosis eficaz para el tratamiento será determinada por
el peso del cuerpo del paciente que recibe el tratamiento. Una dosis
terapéutica puede ser una o varias administraciones de la terapia.
Por ejemplo, cuando se ha alcanzado la recuperación de los números
de células sanguíneas a aproximadamente las 2 semanas, puede ser
suficiente para el tratamiento una infusión de MesSC. Sin embargo,
las numerosas aplicaciones de los productos sanguíneos de MesSC no
son perjudiciales para los pacientes y pueden proporcionar ventajas
en una sola administración. Una dosis ilustrativa del producto
sanguíneo puede ser aproximadamente 1-50 x 10^{6}
por kilogramo de peso corporal.
Los productos sanguíneos usados para el
tratamiento pueden ser derivados a partir de MesSC autólogas del
donante o MesSC alogénicas del donante. El uso de MesSC autólogas
elimina las preocupaciones en cuanto a reacciones inmunes
provocadas por las células alogénicas. Además, son posibles
administraciones repetitivas de MesSC autólogas. Las MesSC
alogénicas serán proporcionadas al paciente usando los
correspondientes criterios para el trasplante de órganos comúnmente
conocidos para cualquier experto en la técnica. Las MesSC alogénicas
derivadas de un donante compatible también pueden ser ventajosas
para producir productos sanguíneos para la administración a un
paciente. Los productos sanguíneos alogénicos pueden ser
administrados, por ejemplo, cuando la médula ósea en un paciente,
que está en necesidad de productos sanguíneos, puede ser una fuente
pobre de números adecuados de células madre utilizables porque el
paciente puede haber recibido fármacos tóxicos para la médula ósea
o radiación o puede tener leucemia o metástasis de médula ósea,
cuando un paciente puede rechazar o no puede ser capaz de aceptar
la recolección de sus propias células de la médula ósea, y cuando
las células madre derivadas de la médula ósea a partir de un
donante familiar vivo compatible o cuando un donante no familiar
pueda ser de calidad superior y de mayor cantidad comparado con las
propias células madre del receptor.
Los ejemplos de pacientes que pueden recibir
productos sanguíneos autólogos incluyen pacientes con
cancer/leu-
cemia en necesidad de un trasplante de médula ósea y para el que ningún donante compatible está disponible, pacientes con cáncer/leucemia que sufren quimioterapia, y pacientes que desarrollan trombocitopenia después del trasplante de médula ósea o de la quimioterapia. Además, los pacientes quiénes, después de que el trasplante de médula ósea o la quimioterapia, tienen recuentos de eritrocitos bajos o de granulocitos pueden recibir los productos sanguíneos derivados de MesSC autólogas. El tratamiento del producto sanguíneo autólogo puede ser ventajoso para pacientes con reacciones alérgicas y autoinmunes.
cemia en necesidad de un trasplante de médula ósea y para el que ningún donante compatible está disponible, pacientes con cáncer/leucemia que sufren quimioterapia, y pacientes que desarrollan trombocitopenia después del trasplante de médula ósea o de la quimioterapia. Además, los pacientes quiénes, después de que el trasplante de médula ósea o la quimioterapia, tienen recuentos de eritrocitos bajos o de granulocitos pueden recibir los productos sanguíneos derivados de MesSC autólogas. El tratamiento del producto sanguíneo autólogo puede ser ventajoso para pacientes con reacciones alérgicas y autoinmunes.
Los ejemplos de pacientes que pueden recibir
productos sanguíneos alogénicos incluyen los mismos pacientes
ejemplificados para receptores del producto sanguíneo autólogo
mencionados anteriormente. Las preparaciones de células alogénicas
de MesSC pueden ser ventajosas porque pueden ser generadas,
seleccionadas y almacenadas poblaciones de tipos de células
específicas. Así, proporcionando un grupo de productos sanguíneos
especializados incluyendo plaquetas, eritrocitos, leucocitos o sus
células especializadas, linfocitos, y células dendríticas son
seleccionadas previamente a la administración al paciente y
certificadas de que, por ejemplo, están libres de enfermedad.
Un objeto más de la invención es el uso de al
menos un tipo de productos sanguíneos obtenidos por el método de la
invención para cultivar células madre mesenquimales no transformadas
con SV-40 aisladas in vitro con factores de
crecimiento durante un tiempo suficiente para producir al menos un
tipo de productos sanguíneos para preparar una composición
farmacéutica para tratar a pacientes que padecen leucemia,
trombocitopenia, leucopenia, granulocitopenia, linfocitopenia
(tales como pacientes del VIH), anemia aplásica, y/o enfermedad
autoinmune con o sin la implicación de la médula ósea, pacientes que
han recibido quimioterapia (incluyendo la quimioterapia a dosis
alta), la irradiación de todo el cuerpo o la irradiación de solo
partes del cuerpo (incluyendo la irradiación de huesos y órganos)
así como pacientes con enfermedad vascular, isquémica (incluyendo
la isquemia cardíaca), y/o maligna. En particular, un objeto más de
la invención es el uso de al menos un tipo de productos sanguíneos
obtenibles por el cultivo de células madre mesenquimales no
transformadas con SV-40 aisladas in vitro
con factores de crecimiento durante un tiempo suficiente para
producir al menos un tipo de productos sanguíneos para preparar una
composición farmacéutica para tratar a pacientes que padecen anemia
debido a una leucemia aguda, debido a una leucemia crónica, debido a
una oosteomielofibrosis, debido a una anemia aplásica, debido a una
talasemia, debido a una anemia falciforme, debido a una pérdida de
sangre, por ejemplo después de un accidente, debido a
quimioterapia, debido a fármacos médicos distintos a los de la
quimioterapia, debido a radiación, y/o debido a un abuso de
compuestos tóxicos, y para tratar a pacientes que padecen
leucopenia debido a una leucemia aguda, debido a una leucemia
crónica, debido a una osteomielofibrosis, debido a una anemia
aplásica, debido a una talasemia, debido a una anemia falciforme,
debido a pérdida de sangre, por ejemplo después de un accidente,
debido a quimioterapia, debido a fármacos médicos distintos a los
de la quimioterapia, debido a radiación, y/o debido a un abuso de
compuestos tóxicos, y para tratar a pacientes que padecen
trombocitopenia debido a una leucemia aguda, debido a una leucemia
crónica, debido a osteomielofibrosis, debido a una anemia aplásica,
debido a una talasemia, debido a una anemia falciforme, debido a
pérdida de sangre, por ejemplo después de un accidente, debido a
quimioterapia, debido a fármacos médicos distintos a los de la
quimioterapia, debido a radiación, y/o debido a un abuso de
compuestos tóxicos, y para tratar a pacientes que padecen
enfermedades vasculares, tales como la vasculitis autoinmune,
trastornos arteriales oclusivos, enfermedad venosa oclusiva, y/o
arterosclerosis, y para tratar a pacientes que padecen enfermedades
isquémicas, tales como enfermedad coronaria, apoplejía,
insuficiencia renal aguda, y/o circulación periférica
deficiente.
Un objeto más de la invención es el uso de al
menos un tipo de productos sanguíneos obtenidos por el método de la
invención para el cultivo de células madre mesenquimales no
transformadas con SV-40 aisladas in vitro
con factores de crecimiento durante un tiempo suficiente para
producir al menos un tipo de productos sanguíneos para preparar una
composición farmacéutica para el diagnóstico de cánceres y
metástasis, en el que al menos dicho tipo de productos sanguíneos
es marcado con compuestos radiactivos. Cuando se diagnostican
cánceres y metástasis, el tipo de productos sanguíneos (o células,
respectivamente) se infunden y detectan en el cuerpo del paciente
por medios y métodos conocidos para el experto en la técnica.
Preferiblemente, en conexión con el uso
anteriormente mencionado, al menos dicho producto sanguíneo
comprende células seleccionadas a partir del grupo que consiste en
células madre mieloides, células endoteliales, células madre
linfoides, células dendríticas, células eritroides y
megacariocitos.
La invención se describe además y se ilustra con
los Ejemplos siguientes.
5 ml de cada densidad 1,050, 1,063, 1,068,
1,077, 1,088 y 1,100 g/ml de Percoll® (descrito anteriormente)
fueron segmentados en capas cuidadosamente sobre cada uno en un tubo
de 50 ml. 10 ml de médula ósea fueron diluidos con 10 ml de PBS y
fueron segmentados en capas cuidadosamente sobre el gradiente de
densidades. En paralelo, como controles a) 1 ml de médula ósea
diluida con 1 ml de PBS fue segmentado en capas sobre 3 ml de
Ficoll con una densidad de 1,077 g/ml en un tubo de 15 ml (designado
como células madre SC; método convencional para separar células
mononucleares así como MesSC) y b) cada 1 ml de médula ósea separada
diluida con 1 ml de PBS fue distribuido en capas sobre 3 ml de
Percoll con una densidad de 1,068 g/ml (designado como LD = de baja
densidad) o 1,077 g/ml (designado como MNC = células mononucleares)
en un tubo de 15 ml separado.
Todos los tubos fueron centrifugados durante 20
minutos a temperatura ambiente con 800 g sin rotura. El plasma
mezclado con PBS fue eliminado de los tubos y cada fracción fue
recogida en un tubo separado. Después del lavado de las células dos
veces con PBS durante 10 minutos con 400 g, los eritrocitos
contenidos en las fracciones F4-F6 (F1 = densidad
más baja 1,050 g/ml, F6 = densidad más alta 1,100 g/ml) fueron
lisados con tampón de hemólisis, las células fueron lavadas de
nuevo en PBS, fueron resuspendidas en medio de cultivo DMEM/LG
(Medio Eagle modificado de Dulbecco/bajo en glucosa, Gibco) + 1% de
penicilina/estreptomicina + 10% de suero de becerro fetal
preseleccionado y se contaron con azul de tripano en una cámara de
Neubauer. Para un área de crecimiento de 25 cm^{2}, fueron
sembradas 1 x 10^{7} células en 5 ml de medio. Después de 3 días,
las células no adherentes fueron lavadas con PBS. Las células
fueron alimentadas cada 3 días con medio recién preparado y fueron
incubadas hasta una confluencia alcanzable de aproximadamente el
80-90% evaluado con microscopía de contraste de
fase. En este punto de tiempo el cultivo fue designado como P0.
Para demostrar la CFU-F
(unidades formadoras de colonias de fibroblastos; como prueba para
la actividad proliferante de las fracciones separadas de MesSC)
10^{6} células de cada fracción así como células LD y control de
MNC fueron sembradas en un pocillo de placas de 6 pocillos en 3 ml
de medio. Las células fueron incubadas en una incubadora a 37ºC y
5% de CO_{2}. Después de 3 días, las células no adherentes fueron
lavadas con PBS. Las células fueron alimentadas cada 3 días con
medio recien preparado. Las CFU-F fueron lavadas con
PBS después de un período de incubación de 14 días y fueron teñidas
con violeta de cristal del 1%.
Para el paso de las células, el medio fue
eliminado, las placas fueron lavadas una vez con PBS, incubadas
durante 5 minutos con tripsina-EDTA del 0,25% y las
células fueron resuspendidas en el medio y fueron contadas en una
cámara de Neubauer. Fueron sembradas 500 células/cm^{2} en un
nuevo frasco de cultivo de tejido y fue designado como P1.
La médula ósea aspirada fue diluida 1:1 con PBS
(Gibco, Karlsruhe, Alemania), fue segmentada en capas en una
solución de Percoll® (Biochrom, Berlín, Alemania) con una densidad
de 1,068 g/ml y fue centrifugada durante 20 minutos con 800 g a TA.
Las células de baja densidad fueron recogidas, lavadas dos veces en
PBS, resuspendidas en medio de crecimiento DMEM/bajo en glucosa
(Gibco) fue suplementado con FCS del 10% preseleccionado
(BioWhittaker, Apen, Alemania) y 1% de penicilina/estreptomicina
(Gibco) y fueron contadas en una cámara de Neubauer. Para el
sembrado inicial, fueron puestas en matraces de cultivo de tejido 1
x 10^{7} células con una superficie de crecimiento de 25 cm^{2}
y fueron cultivadas en una incubadora con 5% de CO^{2} y una
humedad del 97% hasta la confluencia de aproximadamente el 90%. El
paso fue llevado a cabo eliminando el medio de cultivo, lavando la
superficie de crecimiento con PBS e incubando con tripsina/EDTA
(Gibco) durante 5 minutos. Las células fueron resuspendidas en el
medio de crecimiento, fueron contadas y fueron sembradas 500
células/cm^{2} en nuevos matraces de cultivo.
Para la diferenciación hematopoyética fueron
usadas MesSC cultivadas in vitro del 2º al 4º paso.
Para la diferenciación en leucocitos, fueron
sembradas 1 x 10^{5} células en un área de 0,8 cm^{2} en
Chamber Slides® y fueron alimentadas 3 veces por semana con medio de
diferenciación. Este medio contenía un medio básico IMDM (Gibco)
más 10% de FCS más 10% de HS (suero de caballo, ambos de CellSystems
Biotech, San Katharinen, Alemania) e hidrocortisona 10^{-6} M
(Sigma, Deisenhofen, Alemania) y se mezcló 1:1 con metilcelulosa
Nº. 4535 (CellSys-
tems Biotech, conteniendo las citoquinas que aumentan la proliferación SCF, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF) y Epo.
tems Biotech, conteniendo las citoquinas que aumentan la proliferación SCF, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF) y Epo.
La formación de células redondas fue notada tan
pronto como el día 5 en varios de estos cultivos, en el día 10 son
producidas colonias de aproximadamente 100 células. Las colonias
fueron escogidas y centrifugadas, los Chamber Slides® fueron
lavados una vez con PBS, todos los portaobjetos fueron secados al
aire, fijados durante 10 minutos en acetona helada y almacenados a
-20ºC hasta su tinción. De forma alternativa, las células
cultivadas en Chamber Slides® pueden ser tratadas con tripsina para
el análisis FACS. Las células tratadas con tripsina fueron
incubadas con un anticuerpo anti-CD34 o la
inmunoglobulina respectiva emparejada por isotipo y fueron
analizadas en un Becton Dickinson FACScan.
Para la tinción, los portaobjetos fueron
adaptados a la temperatura ambiente (TA) durante algunos minutos y
fueron bloqueados con suero de cabra normal del 5% en PBS durante 10
minutos. Después de la eliminación de la solución de bloqueo, las
células centrifugadas fueron incubadas con cantidades tituladas de
anticuerpos primarios durante 30 minutos a TA en una cámara
humedecida. Para la detección de las células mieloides,
megacariocíticas y eritroides fueron incluidos anticuerpos
dirigidos contra CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Alemania), CD34, CD14, CD16, CD45, CD41 y Glicoforina A (todos los
anticuerpos: Dako). Para cada anticuerpo, el control del isotipo
apropiado fue llevado a cabo de modo idéntico a la tinción para
anticuerpos.
La tinción fue seguida de 2 lavados en PBS
durante 10 minutos cada uno a TA y una incubación con cantidades
tituladas del anticuerpo secundario marcado con fluorocromo Alexa
594 (Molecular Probes, Göttingen, Alemania) durante 30 minutos en
una cámara humedecida. Las portaobjetos fueron lavados 2x con PBS y
fueron teñidos durante 1 minuto con DAPI (Sigma) para visualizar el
núcleo, seguido de 2 lavados con PBS durante 10 minutos. Un lavado
corto con agua dest. fue seguido de la fijación durante 5 minutos en
etanol absoluto y secado al aire. Los portaobjetos fueron
revestidos con fluoromount® y el cubre-objetos fue
deslizado y fueron almacenados hasta su análisis a 4ºC.
El análisis fue llevado a cabo con luz de alta
potencia y un microscopio de fluorescencia. Usando este enfoque,
fueron detectadas células positivas con cD45, CD133 y CD34 en los
grupos descritos anteriormente.
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Para obtener la diferenciación de MesSC en
células mieloides y eritroides, fueron sembradas 1 x 10^{5}
células del 2º al 4º paso en un área de cultivo de 2 cm^{2} y
fueron preestimuladas durante 2 semanas con medio de diferenciación
sin suero que consiste en medio básico StemSpan (CellSystems)
suplementado con las citoquinas SCF (100 ng/ml), TPO (10 ng/ml),
GM-CSF (10 ng/ml) y FL (50 ng/ml) (todas de Tebu,
Offenbach, Alemania). Las células fueron alimentadas 3 veces por
semana.
El día 14, las células son sacadas mediante
pipeteo pesado o tripsinización y fueron cultivadas en metilcelulosa
sin suero (CellSystems Nº. 4435, conteniendo las citoquinas que
aumentan la proliferación SCF, IL-3,
IL-6, G-CSF, GM-CSF
y eritropoyetina). A los 14 días después del cultivo las colonias
solas y las células diferenciadas fueron sacadas y examinadas
después de su centrifugado por su morfología y la inmunoquímica con
anticuerpos contra los antígenos superficiales de características
mieloides y eritroides como se describe en el Ejemplo 2.
Usando este enfoque, fueron detectadas las
células positivas para CD34, CD133, CD14, CD16, CD45, CD41 y
Glicoforina A.
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Para obtener la diferenciación de MesSC en
células endoteliales, fueron sembradas 1 x 10^{5} células del 2º
al 4º paso en un área de cultivo de 0,8 cm^{2} y fueron
estimuladas durante 3 semanas con medio de diferenciación sin suero
incluyendo el medio básico StemSpan (CellSystems) suplementado con
las citoquinas SCF (100 ng/ml), VEGF (50 ng/ml), bFGF (10 ng/ml),
HGF (50 ng/ml) (todos de Tebu) y HC 10^{-6} M. De forma
alternativa, fueron preestimuladas las MesSC durante dos semanas en
medio sin suero suplementado con SCF (100 ng/ml), TPO (10 ng/ml) y
FL (50 ng/ml), seguido de la diferenciación en el medio más VEGF (50
ng/ml), bFGF (10 ng/ml), y IGF (10 ng/ml) durante dos semanas. Las
células fueron alimentadas 3 veces por semana. Después de acabar la
diferenciación, los portaobjetos fueron secados al aire, fijados
durante 10 minutos en acetona helada y almacenados a -20ºC hasta su
tinción.
Las células fueron teñidas de acuerdo con el
procedimiento descrito anteriormente con anticuerpos dirigidos
contra vWF, CD31, CD34 y KDR. La tinción de células positivas fue
detectada para CD34 y vWF o CD31 y KDR.
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Fueron trasplantadas MesSC en ratones sin
células madre para demostrar el potencial pluripotente de las MesSC
de la presente invención.
Las MesSC para el trasplante fueron generadas a
partir de ratones macho adultos C57BI/6J del fenotipo Ly 5.2.
Células del fémur y de la tibia fueron sembradas en medio DMEM/Ham's
F12 (generalmente considerado como el medio que ayuda al
crecimiento insuficiente de las células madre hematopoyéticas)
suplementado con FCS del 20%, penicilina/estreptomicina del 1% y
glutamina del 1%. El FCS fue seleccionado por el rápido crecimiento
de células que crecen en adherente plástico y por la falta de
soporte para el crecimiento de células hematopoyéticas. Las células
no adherentes fueron eliminadas después de 3 días y los cultivos
fueron alimentados dos veces por semana hasta la confluencia.
Durante los pasos iniciales, hasta P5, las células fueron sembradas
con 1 x 10^{5} células/cm^{2}. Los pasos últimos fueron
sembrados con 1000 células/cm^{2}. Las células fueron pasadas en
el cultivo hasta 9 veces en un período de aproximadamente 6 meses.
Las células en P8 fueron determinadas que eran negativas para CD45
y CD34, positivas para Sca-1, CD90 y CD59 y
positivas bajos para CD117 (c-kit).
Para el trasplante de MesSC, los ratones
receptores C57BI/6J del fenotipo Ly 5.1 fueron irradiados
mortalmente con una dosis de Gy 9,5 de irradiación gamma y fueron
trasplantados con 1 x 10^{6} MesSC cultivadas como se describe
anteriormente. Los recuentos de células sanguíneas y los análisis
intermedios de reconstitución con células de donante fueron
realizados a partir de la sangre periférica tomada
retroorbitalmente. Se muestran los recuentos de células sanguíneas
en la Figura 3 y fueron realizados usando un contador de células
sanguíneas Coulter®. El análisis de reconstitución fue realizado
usando células marcadas por anticuerpos conjugados por fluorocromo
contra un antígeno de donante CD45.2 (Ly 5.2) y fueron analizados en
un FACSCAN de Becton Dickinson para distinguir las células del
receptor y del donante. Los resultados del análisis de
reconstitución son citados más abajo en la Tabla 2 en la que el
tanto por ciento refleja el tanto por ciento de las células totales
que eran de origen del donante.
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Los resultados muestran que los ratones pueden
ser reconstituidos con las MesSC de la presente invención lo que
conduce a recuentos de glóbulos blancos normales después de
aproximadamente 6 semanas y de una zona de peligro con riesgo agudo
de infección después de aproximadamente 3 semanas.
Se muestra el análisis de la composición de
células de los tejidos individuales de ratones trasplantados con
MesSC para la médula ósea, el timo y la sangre periférica en la
Tablas 3, 4 y 5, respectivamente. En general, los ratones
trasplantados mostraron un quimerismo de donante bajo en la médula
ósea y el timo y hasta del 35% en la sangre periférica (Figura 4).
El análisis de población revela que las células de donante
reconstituyeron principalmente el compartimento mieloide y en parte
las células linfoides.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Análisis de la médula
ósea
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Abreviaturas:
- Dt
- células del donante tipo CD45.2 (Ly 5.2)
- CD45
- marcador de pan-leucocito para todos los glóbulos blancos
- c-kit
- marcador de células madre precoces (pluripotentes, reconstituyentes)
- B220
- marcador para células B de todas las etapas de maduración
- Ter119
- marcador para todas las etapas eritrocíticas (glóbulos rojos)
- CD3
- marcador para todos los linfocitos T incluyendo células positivas para CD4 y CD8
- GR1
- marcador para granulocitos
- CD11b
- comúnmente usado como marcador mieloide (glóbulos blancos) pero también detectado en células linfoides.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron cultivadas hMesSCs como se describe
anteriormente para la diferenciación en HSC y células endoteliales.
Las células fueron cultivadas para la inmunofluorescencia como se
describe anteriormente y para RT-PCR.
Para la RT-PCR, fue extraído ARN
usando el minikit Invisorb Spin Cell-RNA® (Invitek,
Berlín, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El ARN fue almacenado a -80ºC. La transcripción inversa (RT) del
ARN extraído fue realizada usando un kit de síntesis de cADN
First-strand (Amersham, Friburgo, Alemania). El
cDNA fue almacenado a -20ºC. Para la reacción de la PCR fueron
mezclados 5 \mul de cDNA-plantilla con 2,5 \mul
de 10 x PCR-tampón, 0,5 \mul de dNTP 10 mM, 0,5
\mul de cada cebador (50 ng/\mul), y 0,5 \mul de polimerasa
(Ampli-Taq., Gibco) en un volumen total de 25 \mul
para cada sonda. La PCR fue llevada a cabo en un Biometra
Uno-Thermobloc programable (Biometra, Gttingen,
Alemania) usando los cebadores mostrados en la Tabla 6. Fueron
realizados controles negativos para cada grupo de cebadores
incluyendo agua en vez de cDNA. Las muestras fueron analizadas en
geles de agarosa del 2%. El tamaño de los fragmentos de la PCR fue
estimado usando el marcador VIII de ADN estándar (Gibco). Los
cebadores fueron sintetizados con MWG Biotech (Ebersberg,
Alemania) de acuerdo con las secuencias en la Tabla 6.
Los resultados de la RT-PCR
mostraron la expresión génica detectada usando cebadores para CD41B,
Notch-1, GATA2, GATA3, Runx1, SCL, y CD117
(c-kit) que codifica los factores de transcripción
hematopoyéticos restringidos de linaje. SCL, GATA-1
y GATA-2 son expresados en progenitores
multipotentes antes del compromiso de linaje, pero son desregulados
durante la diferenciación de granulocitos/monocitos. Los resultados
de RT-PCR para células hasta 2 pasos también
mostraron bandas débiles para CD14 y CD34 que no fueron detectadas
en células en los pasos posteriores.
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<110> Universitatsklinikum
Hamburg-Eppendorf
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<120> PRODUCTOS SANGUÍNEOS A PARTIR DE
CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES
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<130> P 66936
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<150> US 60/510.980
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<151>
14-10-2003
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<160> 48
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgcagtcc ctttcgac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaactggtg aacggtaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacttctca gaaggcaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggagacgca tagccattgt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcaactca gttccagag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtgcaca ggtaaaag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagcaaaca cagttggat
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcatcagag actgtgctt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagatctgt gagaataggc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatacatttc agcaggtgcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacttgtcca tcgtcatgga tccag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtaacaga tgagatgctc caagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacagactc agagagaac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttaacctg ggcagagc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggagagga tgttcctgt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttgaagtt gaccgggt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgtatata atcctcacca a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcatctgc aggcactg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgtatcat ggaccacct
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttccatgg ctcatcct
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagtttcca gaaatcataa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaatggcaa ttatctgcaa
\hfill20
Claims (36)
1. Un método para producir productos sanguíneos
in vitro, en el que:
- a)
- se aíslan células madre mesenquimales no transformadas con SV-40, que son negativas para CD34, y que son negativas para CD45 y positivas para CD105, CD59, CD90, CD13 y MHC I después de al menos un paso en el cultivo; y
- b)
- dichas células madre mesenquimales no transformadas con SV-40 aisladas son cultivadas con los siguientes factores de crecimiento añadidos individualmente o en sus combinaciones:
- factor de célula madre (SCF), trombopoyetina (TPO), ligando flt-3 (FL), interleuquinas, incluyendo interleuquina-3 (IL-3) e interleuquina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), eritropoyetina (Epo), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento del tipo insulina (IGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF) e hidrocortisona (HC),
- durante un tiempo suficiente pra producir al menos un tipo de productos sanguíneos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células madre
mieloides.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
endoteliales.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células madre
linfoides.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
dendríticas.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
eritroides.
7. El método de la reivindicación 1, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende
megacariocitos.
8. El uso de un producto sanguíneo obtenido de
acuerdo con un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7
para preparar una composición farmacéutica para tratar a un paciente
en necesidad de un producto sanguíneo.
9. El uso de la reivindicación 8, en el que al
menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células madre
mieloides.
10. El uso de la reivindicación 8, en el que al
menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
endoteliales.
11. El uso de la reivindicación 8, en el que al
menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células madre
linfoides.
12. El uso de la reivindicación 8, en el que al
menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
dendríticas.
13. El uso de la reivindicación 8, en el que al
menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
eritroides.
14. El uso de la reivindicación 8, en el que al
menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende
megacariocitos.
15. El uso de la reivindicación 8, en el que la
composición farmacéutica es para tratar a pacientes que padecen
leucemia, trombocitopenia, leucopenia, granulocitopenia,
linfocitopenia, anemia aplásica y/o enfermedad autoinmune con o sin
la implicación de la médula ósea, pacientes del VIH, pacientes que
han recibido quimioterapia, irradiación de todo el cuerpo o la
irradiación de partes simples del cuerpo, pacientes con enfermedad
vascular, isquémica y/o maligna, o pacientes con isquemia
cardíaca.
16. El uso de la reivindicación 8, en el que la
composición farmacéutica es para tratar a pacientes que padecen
anemia, leucopenia, trombocitopenia y enfermedades vasculares.
17. El uso de la reivindicación 16, en el que la
anemia es debida a una leucemia aguda, debido a una leucemia
crónica, debido a una osteomielofibrosis, debido a una anemia
aplásica, debido a una talasemia, debido a una anemia falciforme,
debido a la pérdida de sangre, debido a la quimioterapia, debido a
fármacos médicos diferentes a los de la quimioterapia, debido a la
radiación, y/o debido al abuso de compuestos tóxicos, en el que la
leucopenia es debida a una leucemia aguda, debido a una leucemia
crónica, debido a una osteomielofibrosis, debido a una anemia
aplásica, debido a una talasemia, debido a una anemia falciforme,
debido a la pérdida de sangre, por ejemplo después de un accidente,
debido a la quimioterapia, debido a fármacos médicos diferentes a
los de la quimioterapia, debido a la radiación, y/o debido al abuso
de compuestos tóxicos, en el que la trombocitopenia es debida a una
leucemia aguda, debido a una leucemia crónica, debido a una
osteomielofibrosis, debido a una anemia aplásica, debido a una
talasemia, debido a una anemia falciforme, debido a la pérdida de
sangre, por ejemplo, después de un accidente, debido a
quimioterapia, debido a fármacos médicos distintos a los de la
quimioterapia, debido a radiación, y/o debido a un abuso de
compuestos tóxicos.
18. El uso de la reivindicación 16, en el que la
enfermedad vascular es una vasculitis autoinmune, trastornos
arteriales oclusivos, enfermedad venosa oclusiva, y/o
arterosclerosis, y para tratar a pacientes que padecen enfermedades
isquémicas, tales como enfermedad cardíaca coronaria, apoplejía,
insuficiencia renal aguda y/o circulación periférica
deficiente.
19. Un método para diferenciar células
mesenquimalesno transformadas con SV-40 in
vitro, en el que:
- a)
- se aíslan células madre mesenquimalesno transformadas con SV-40, que son negativas para CD34, y que son negativas para CD45 y positivas para CD105, CD59, CD90, CD13 y MHC I después de al menos un paso en el cultivo; y
- b)
- dichas células madre mesenquimales no transformadas con SV-40 aisladas se cultivan con los siguientes factores de crecimiento añadidos individualmente o en sus combinaciones:
- factor de célula madre (SCF), trombopoyetina (TPO), ligando flt-3 (FL), interleuquinas, incluyendo interleuquina-3 (IL-3) e interleuquina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), eritropoyetina (Epo), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento del tipo insulina (IGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF) e hidrocortisona (HC),
- durante un tiempo suficiente pra producir al menos un tipo de productos sanguíneos.
20. El método de la reivindicación 19, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células madre
mieloides.
21. El método de la reivindicación 19, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
endoteliales.
22. El método de la reivindicación 19, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células madre
linfoides.
23. El método de la reivindicación 19, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
dendríticas.
24. El método de la reivindicación 19, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
eritroides.
25. El método de la reivindicación 19, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende
megacariocitos.
26. El método para preparar una composición
farmacéutica que comprende un producto sanguíneo para tratar a un
paciente en necesidad de dicho producto sanguíneo, en el que dicho
método comprende el método de cualquiera de las reivindicaciones 1
a 7 para proporcionar dicho producto sanguíneo.
27. El método de la reivindicación 26, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células madre
mieloides.
28. El método de la reivindicación 26, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
endoteliales.
29. El método de la reivindicación 26, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células madre
linfoides.
\newpage
30. El método de la reivindicación 26, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
dendríticas.
31. El método de la reivindicación 26, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende células
eritroides.
32. El método de la reivindicación 26, en el que
al menos dicho tipo de productos sanguíneos comprende
megacariocitos.
33. El método de la reivindicación 26, en el que
la composición farmacéutica es para tratar a pacientes que padecen
leucemia, trombocitopenia, leucopenia, granulocitopenia,
linfocitopenia, anemia aplásica y/o enfermedad autoinmune con o sin
la implicación de la médula ósea, pacientes con el VIH, pacientes
que han recibido quimioterapia, irradiación de todo el cuerpo o
irradiación de partes simples del cuerpo, pacientes con enfermedad
vascular, isquémica y/o maligna, o pacientes con isquemia
cardíaca.
34. El método de la reivindicación 26, en el que
la composición farmacéutica es para tratar a pacientes que padecen
anemia, leucopenia, trombocitopenia y enfermedades vasculares.
35. El método de la reivindicación 34, en el que
la anemia es debida a una leucemia aguda, debido a una leucemia
crónica, debido a una osteomielofibrosis, debido a una anemia
aplásica, debido a una talasemia, debido a una anemia falciforme,
debido a la pérdida de sangre, debido a la quimioterapia, debido a
fármacos médicos diferentes a los de la quimioterapia, debido a la
radiación, y/o debido al abuso de compuestos tóxicos, en el que la
leucopenia es debida a una leucemia aguda, debido a una leucemia
crónica, debido a una osteomielofibrosis, debido a una anemia
aplásica, debido a una talasemia, debido a una anemia falciforme,
debido a la pérdida de sangre, por ejemplo después de un accidente,
debido a la quimioterapia, debido a fármacos médicos diferentes a
los de la quimioterapia, debido a la radiación, y/o debido al abuso
de compuestos tóxicos, en el que la trombocitopenia es debida a una
leucemia aguda, debido a una leucemia crónica, debido a una
osteomielofibrosis, debido a una anemia aplásica, debido a una
talasemia, debido a una anemia falciforme, debido a la pérdida de
sangre, por ejemplo, después de un accidente, debido a la
quimioterapia, debido a fármacos médicos distintos a los de la
quimioterapia, debido a radiación, y/o debido a un abuso de
compuestos tóxicos.
36. El método de la reivindicación 16, en el que
la enfermedad vascular es vasculitis autoinmune, trastornos
arteriales oclusivos, enfermedad venosa oclusiva y/o
arterosclerosis, y para tratar a pacientes que padecen enfermedades
isquémicas, tales como enfermedad cardíaca coronaria, apoplejía,
insuficiencia renal aguda y/o circulación periférica
deficiente.
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