JP2004505627A - 前駆細胞並びにそれに関連した方法及び利用 - Google Patents

前駆細胞並びにそれに関連した方法及び利用 Download PDF

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Abstract

本発明は、実質的に純粋な生存力のある膵臓前駆細胞の集団、及びかかる細胞の分離方法に関する。本発明は、更に、かかる前駆細胞及びそれらの子孫のある種の治療用途に関する。

Description

【０００１】
発明の背景
分化多能性幹細胞は、生物医学界において、多大な関心を生んできた。幹細胞が多くの成体組織から分離されうるという実感により、比較的純粋な幹細胞の培養が、広範な病気の治療における利用のために、イン・ビトロで維持されうるという希望が生じた。イン・ビトロでの自律的再生能力及び分化した細胞型を生成する能力を有する幹細胞は、殆ど如何なる臓器系においても老化し又は衰えていく細胞の機能を置き換えるのに有用でありうる。幾つかの見積もりによれば、一億人を超えるアメリカ人が、幹細胞を利用する移植技術により緩和されうる病気を患っている（Ｐｅｒｒｙ（２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１４２３）。かかる病気には、例えば、心臓血管病、自己免疫疾患、糖尿病、骨粗鬆症、癌及び火傷が含まれる。
【０００２】
インシュリン依存性の真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、幹細胞の利用によって治癒され又は緩和されうる病気のよい例である。インシュリン依存型糖尿病は、上昇した血中ブドウ糖及びホルモンのインシュリンが存在しないことを特徴とする疾患である。上昇した糖レベルの原因は、ホルモンであるインシュリンの膵臓による不十分な分泌である。このホルモンの非存在下では、体細胞は、血流から糖を正常な様式で吸収することができず、過剰の糖が血中に蓄積する。慢性的に上昇した血中ブドウ糖は、組織及び臓器に損傷を与える。ＩＤＤＭは、インシュリン注射により治療される。インシュリン注射の規模及びタイミングは、血糖の測定値により左右される。
【０００３】
今日、世界には、４億人の糖尿病患者がいる。糖尿病は、米国において最も一般的な慢性病の一つであり、主要な死亡原因である。１９９３年の国民健康調査（ＮＨＩＳ）に基づく見積もりは、糖尿病が、４５歳未満の米国人の１％で、４５〜６４歳の６．２％で、及び６５歳以上の１０．４％で診断されたことを示している。言い換えると、１９９３年には、米国で７８００万人がこの慢性病を有することが報告された。加えて、糖尿病の年間罹患率に基づいて、毎年、５９５，０００症例の非インシュリン依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）と３０，０００症例のインシュリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む約６２５，０００人の新たな糖尿病患者が診断されていることが見積もられる。米国における糖尿病の全出費は、医療用品の支出、入院及び仕事のできないことの対価を含めて、年９，２００万ドルと見積もられている。社会及び市民の両方に対する実質的な費用は、糖尿病の医療の直接的出費だけでなく、糖尿病関連の病的状態及び早死ににより失われる生産力を含む間接的出費も背負っている。糖尿病を有する個人は、糖尿病性ケトアシドーシス、末期の腎臓病、糖尿病性網膜症及び手足の切断を含む主要な合併症の危険にある。直接的関連性の一層低い多くの病気例えば高血圧症、熱病、末梢血管の病気及び感染症もあり、糖尿病を有する個人は、これらに対する実質的に増大した危険にある。
【０００４】
薬物療法例えば注射可能なインシュリン及び経口の血糖降下薬は、糖尿病患者を長生きさせるが、糖尿病は、心臓病及び癌に続く第３位の主要な死亡原因のままである。糖尿病は又、非常に不能状態となる病気でもある。何故なら、薬物療法は、血糖レベルを、高及び低血糖レベル間で動揺するのを阻止するだけ十分には制御せず、腎臓、眼及び血管に損傷を生じるからである。
【０００５】
機能的なブドウ糖の送り出し、インシュリン分泌をする膵臓のベータ細胞の小島移植による補充は、長年にわたる治療の標的であった。このアプローチにおける制限因子は、安全で、再現性があって豊富な小島源の入手可能性である。現行の方法論は、死体材料又はブタの小島を移植用基材として利用している（Ｋｏｒｂｕｔｔ等、１９９７）。しかしながら、克服すべき有意の問題は、ドナー組織の低い利用可能性、分離により得られる小島の利用可能性及び低収率、並びに分離プロセスの結果として生じ得る酵素的及び物理的損傷である（Ｓｅｃｃｈｉ等、１９９７；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等、１９９８により総説されている）。加えて、免疫拒絶の問題及びブタの小島を用いる現行の異種移植に伴う懸念がある（Ｗｅｉｒ及びＢｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ， １９９７により総説されている）。
【０００６】
更なる例として、血液細胞を生成することのできる幹細胞も又、幾つかの病気の治療のために多いに有用であろう。多くの病気が、不適当なレベルの又は不十分な機能の血小板から生じる。例えば、「血小板減少症」は、循環血液中の異常に少数の血小板の結果である。血小板減少症は、抗体媒介の血小板破壊、多量の輸血、心肺バイパス又は悪性浸潤、再生不良性貧血又は化学療法による骨髄破損のためでありうる。他方、「血小板増加症」は、高い血小板数の結果である。最後に、「血小板病的」血液疾患は、血小板数が正常であるにもかかわらず、異常に低い又は高い血小板機能を特徴とする。血小板は、正常な止血の維持に必要とされる。血小板は、血餅形成を開始し、傷の治癒過程を促進し並びに潜在的に他の機能をも果たす成長因子を放出する。血小板は、出血の防止及び血液凝固に非常に重要である循環する細胞である。巨核球は、血小板の細胞性起源であり、すべての造血細胞系列のもとである共通骨髄前駆細胞から生じる。幹細胞を利用して、イン・ビトロで細胞を生成することができ、又は移植して血小板を生成することのできる安定な細胞起源を与えることができよう。
【０００７】
加えて、多くの癌を治療するために、広範囲の放射線療法が利用される。その照射は、患者の内因性骨髄幹細胞に対して致死的なものである。現在、それらは、合併症を伴う手順において、移植により置換される。豊富な造血幹細胞の供給は、涸渇した内因性細胞を補充する反復治療に利用することができよう。
【０００８】
多くの神経疾患は、神経細胞の死を特徴とする。成体の神経細胞は殆ど再生せず、神経死は、しばしば、認識及び感覚運動機能に回復不能なダメージを引き起こす。神経死により引き起こされた病気の、胎児の神経組織の移植による治療における幾つかの成功があった。胎児組織は、成体の脳に定住して適当な細胞型に分化する一層大きな能力を有している。しかしながら、十分な胎児組織を得ることは困難であり、多くの道徳的問題を生じる。神経幹細胞は、神経系の多くの細胞型に分化することができる。顕著に、幾つかの神経幹細胞は、脳内を移動して神経細胞死領域内に定着することができる。かかる細胞は、その後、新たな神経過程を生じて、内因性神経ネットワークに組み込まれうる。神経幹細胞は、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、虚血、外傷、脊髄損傷、感染症によるダメージなどの病気を治療するために利用することができるということが期待される。
【０００９】
事実上任意の種類の組織から幹細胞を分離して増殖させる簡単な方法を提供することは、本発明の目的である。かかる幹細胞は、次いで、例えば、直接的移植に利用し又は移植用にイン・ビトロで分化した細胞を生成するために利用することができる。従って、この発明は、例えば、膵臓又は肝臓の幹細胞を提供し、それは、多くの他の一層分化した細胞型例えば膵臓ベータ細胞の起源として役立ちうる。利点は、様々な用途のための分化した細胞を得るために組織を物理的に分離する必要性を回避すること並びにこの過程の一層大きな再現性及び制御の潜在能力にある。膵臓細胞に関して、上首尾の成功には、拡張可能な前駆細胞集団からのグルコース感受性の、インシュリン分泌性のベータ細胞の分化及び成熟を要する。
【００１０】
発明の要約
本発明は、動物の幹細胞又は前駆細胞の実質的に純粋な集団を得るための材料及び方法に関係する。この発明は、更に、動物の幹細胞又は前駆細胞の集団及びそれらの誘導体並びにそれらの細胞集団の利用方法を提供する。
【００１１】
好適具体例において、この発明は、少なくとも約５０％の、一層好ましくは約６０％、７０％、８０％以上の、最も好ましくは約９０％の純度の、実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団の製造方法を提供する。ある具体例においては、この前駆細胞集団は、動物組織から（好ましくは、哺乳動物の臓器）又は他の哺乳動物組織（少なくとも一種の前駆細胞を含む細胞集団を生じるように機械的又は酵素的手段により粉砕されたもの）から得られる。好適具体例において、この組織は、ヒトの組織である。この動物組織は、膵臓組織、肝臓組織、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨髄組織、骨海綿状組織、軟骨組織、肝臓組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、扁桃組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、上皮組織、真皮組織、皮下組織、心臓組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎臓組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、腸間膜組織、胎児組織及び臍帯組織を含む（これらに限らない）任意の成体又は胎児組織であってよい。
【００１２】
ある具体例において、この組織は、脳又は中枢神経系組織を含まない非神経性動物組織である。好ましくは、この組織から得られた元の細胞懸濁液からの幹／前駆細胞の富化は、少なくとも約１００倍であり、一層好ましくは少なくとも約１０００倍である。
【００１３】
ある好適具体例において、この動物組織に由来する細胞懸濁液を、次いで、成長因子調製物で処理し、該調製物は、上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、白血病阻止因子、インシュリン様成長因子及び血小板由来成長因子を含む多くの異なる成長因子の何れをも含むことができる。
【００１４】
この動物細胞懸濁液内の前駆細胞集団を、次いで、成長因子集団の存在下で増殖させて、非接着性の浮遊性に基づいて採取する。ある場合には、この前駆細胞集団は、同型細胞球（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅ）を形成する。この前駆細胞集団の表現型は、この細胞集団が幹／前駆細胞集団において富化したという両方の指示を与え、並びに、これらの幹／前駆細胞につき富化させるのに利用しうるある物理的特徴を与える。
【００１５】
この発明は、更に、幹／前駆細胞集団を同定し及び／又は富化させるための、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ及びネスチンを含むある種のマーカーを与える。この発明は、尚更に、適当な条件下で得ることのできるこれらの幹／前駆細胞集団の誘導体を与える。これらの幹／前駆細胞誘導体は、マーカー例えばＰｄｘ−１、グルカゴン又はインシュリンを発現することができる。
【００１６】
本発明は、更に、生存力のある膵臓細胞前駆細胞の実質的に純粋な調製物、及び本質的に任意の組織、特に肝臓、筋肉及び膵臓組織からかかる細胞を単離する方法に関係する。本発明は、更に、かかる前駆細胞及びそれらの子孫のある種の利用に関係する。
【００１７】
一般に、この発明は、細胞性成分として、培養培地中で増殖することのできる生存力のある膵臓細胞前駆細胞の実質的に純粋な集団を含む細胞性組成物を特徴とする。好適具体例において、この細胞性組成物は、約２０％より少ない、一層好ましくは約１０％より少ない、最も好ましくは約５％より少ない系統の決定された細胞を有する。
【００１８】
一具体例において、本発明の前駆細胞は、培養培地における自己再生と膵臓細胞系統への分化の能力を特徴とする。好適具体例において、これらの前駆細胞は、膵島細胞例えばβ小島細胞、α小島細胞、δ小島細胞又はφ小島細胞への分化誘導可能である。かかる膵臓細胞前駆細胞は、ある環境において、ホメオドメイン型転写因子例えばＳＴＦ−１；ＰＡＸ遺伝子例えばＰＡＸ６；ＰＴＦ−１；ｈＸＢＰ−１；ＨＮＦ遺伝子；ビリン；チロシンヒドロキシラーゼ；インシュリン；グルカゴン；及び／又はニューロペプチドＹの少なくとも１つの発現を特徴とし得る。本発明の膵臓細胞前駆細胞は又、レクチン好ましくは植物レクチン一層好ましくはピーナッツ凝集素への結合をも特徴とし得る。ある好適具体例において、これらの前駆細胞は、例えばＦＡＣＳソーティングによりＰＤＸ１ｍＲＮＡ及びタンパク質を発現し、ブドウ糖応答性のインシュリン分泌細胞への分化が可能である。ある好適具体例において、これらの前駆細胞は、ＰＤＸ１及びＧｌｕｔ２ｍＲＮＡ及びタンパク質を発現する。ある好適具体例において、これらの前駆細胞は、ＰＤＸ１、Ｇｌｕｔ２を発現し且つＰＮＡで染色される。
【００１９】
この発明は、膵臓前駆細胞を得るための複数の方法を提供する。一具体例において、これらの細胞は、非接着性培養における増殖により得られる。
【００２０】
ある好適具体例において、主題の膵臓細胞前駆細胞は、次の特徴の少なくとも１つを有する：（ｉ）２〜５パーセントウシ胎児血清中で生育でき；（ｉｉ）プラスチック上で生育でき、例えばマトリゲルを用いることを必要とせず；（ｉｉｉ）３０ｐｇ／ｍｌ以下の濃度のＴＧＦβ５（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号Ｐ１６１７６）で処理した場合に統計的に有意な細胞の増殖又は分化を誘導しない。
【００２１】
更に別の具体例において、この発明は、細胞成分として、培養培地中で増殖することのできる生存力のある膵臓細胞前駆細胞の実質的に純粋な集団を含む医薬組成物を特徴とする。
【００２２】
一般に、好適な前駆細胞は、哺乳動物起源のものであり、例えば霊長類（例えば、ヒト）から、ミニブタから、又はトランスジェニック哺乳動物から単離された細胞であり、又はかかる細胞の細胞培養子孫である。一具体例において、膵臓の腺管組織を患者から単離して、膵臓細胞前駆細胞（又は、それらから得られる分化した細胞）の培養を与えるための本発明の方法にかける。遺伝子置換その他の遺伝子治療を、エキス・ビボで行い、それらの単離された細胞を最初のドナー患者に移植するか又は第２の宿主患者に移植する。
【００２３】
他の面において、この発明は、細胞集団として、少なくとも５０％（一層好ましくは、少なくとも７５、９０又は９５％）の前駆細胞を含み且つ培養培地において自己再生可能な細胞性組成物を特徴とする。
【００２４】
更に別の面において、この発明は、本質的に、細胞集団としての、培養培地中で自己再生することができ且つ膵臓細胞系統への分化が可能である生存力のある膵臓細胞前駆細胞よりなる細胞性組成物を特徴とする。例えば、ある具体例においては、これらの前駆細胞は、膵臓小葉内管外植片から単離され、例えばバイオプシーにより単離され、又はかかる細胞の子孫である。
【００２５】
この発明の幾つかの面は、膵臓細胞前駆細胞を膵管の試料から単離する方法を特徴とする。一般に、この方法は、「ステムドネス」並びに内分泌及び外分泌細胞へ分化する能力を保持しながらの膵臓腺管上皮の再現可能な拡張を可能にする培養系を提供する。一具体例において、膵管組織を、消化酵素で処理して、細胞懸濁液を生成する。この細胞懸濁液を非接着性培養器にて、様々な成長因子の存在下で培養する。ある具体例において、増殖する細胞は、広範な細胞型に分化することのできる細胞の球を生じさせる。他の場合には、膵臓腺管上皮は、例えば外植片又は酵素消化により得られ、集密になるまで培養される。この集密な細胞集団を、培養集団において前駆細胞の分化を引き起こす因子例えば栄養因子例えば成長因子と接触させる。その後、この因子に応答して増殖する外植片に由来する前駆細胞を、その外植片の残部から新たに出現した芽を直接機械的に分離することにより又はその外植片の全部又は一部分を溶解させてから前駆細胞集団を単離すること等により単離する。
【００２６】
ある具体例においては、この培養物をｃＡＭＰ上昇剤例えば８−（４−クロロフェニルチオ）−アデノシン−３’：５’−サイクリック−モノホスフェート（ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）（例えば、Ｋｏｉｋｅ Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏ−Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．ａｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．１６ ９５−１０６（１９９２）参照）、ＣＴＰ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、Ｎａ−ブチレート、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及びコレラ毒素（Ｍａｒｔｉｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２３ １２０５−１２２０（１９９２）参照）及び８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ及びジオクタノイル−ｃＡＭＰ（例えば、Ｒｙｄｅｌ等、ＰＮＡＳ ８５：１２５７（１９８８）参照）と接触させる。
【００２７】
ある具体例においては、この培養物を、成長因子例えば有糸分裂促進性成長因子と接触させ、例えば、この成長因子を、ＩＧＦ、ＴＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ヘッジホッグ又はＶＥＧＦよりなる群から選択する。他の具体例においては、この成長因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの好ましくはＤＶＲ（ｄｐｐ ａｎｄ ｖｇ１ ｒｅｌａｔｅｄ）のメンバー例えばＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ７である。
【００２８】
ある具体例においては、この培養物を、ステロイド又はコルチコステロイド例えばヒドロコーチゾン、デオキシヒドロコーチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン及びパラメタゾンと接触させる。一般に、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，第１５版、１２３９−１２６７及び２４９７−２５０６頁、Ｂｅｒｋｏｗ等編、Ｒａｈａｙ， Ｎ．Ｊ．， １９８７を参照されたい）。
【００２９】
好適具体例において、これらの培養物を、ｃＡＭＰ上昇因子、成長因子及びステロイド又はコルチコステロイド例えばここに記載のＤＣＥカクテルと接触させる。
【００３０】
他の面において、この発明は、化合物を、主題の方法により得られた前駆細胞の生育、増殖及び／又は分化の１つを調節する能力についてスクリーニングする方法であって、（ｉ）膵臓細胞前駆細胞の単離された集団を確立し；（ｉｉ）その細胞集団を試験化合物と接触させ；そして（ｉｉｉ）その集団における前駆細胞の生育、増殖及び／又は分化の１つを検出することを含み、試験化合物の存在下での生育、増殖及び／又は分化の１つの程度における、試験化合物の非存在下での生育、増殖及び／又は分化の１つの程度と比較しての統計的に有意の変化が、その試験化合物の生育、増殖及び／又は分化の１つを調節する能力を示す当該方法を特徴とする。
【００３１】
他の面において、この発明は、患者における不十分なインシュリン活性を特徴とする病気を治療する方法であって、その患者に、主題の方法により得られた膵臓細胞前駆細胞又はそれらから得られた分化した細胞及び製薬上許容し得るキャリアーを含む医薬組成物を導入することを含む当該方法を特徴とする。好適具体例において、これらの前駆細胞は、ドナー起源（移植患者であってもよい）に由来し、少なくとも移植前の規模に拡張させる。図４０に示したように、主題の細胞性組成物を用いて、糖尿病のマウスを救うことができる。
【００３２】
好適具体例において、この患者は、哺乳動物例えば霊長類例えばヒトである。
【００３３】
他の好適具体例において、この病気は、インシュリン依存型の糖尿病例えばＩ型糖尿病である。
【００３４】
他の面において、この発明は、前駆細胞の分化した膵臓細胞型への分化を促進するための分化用培地を提供する。一具体例において、この発明には、ｃＡＭＰ上昇剤、ＰＹＹ及びウシ胎児血清を含む膵臓分化用培地が含まれる。好適具体例において、この培地は、フォルスコリンを含む。特に好適な膵臓分化用培地は、少なくとも２５ｍＭのフォルスコリン、少なくとも１５０ｎｇ／ｍｌのＰＹＹ及び少なくとも３％のウシ胎児血清を含む。
【００３５】
更なる面において、この発明は、分化した膵臓細胞型を得るための方法を提供する。一具体例において、この分化した膵臓細胞型を得るための方法は、細胞懸濁液を動物組織から得ること、この細胞懸濁液を成長因子集団で処理すること、非接着性細胞を増殖させること及び該増殖した非接着性細胞を分化用培地及び接着用マトリクスと接触させることを含む。かかる条件下で、非接着性細胞は、このマトリクスに接着して、少なくとも一種の分化した膵臓細胞型を所持させる。好適具体例において、前駆細胞は、出生後ヒト組織から得られる。好適具体例において、この成長因子調製物は、次の内の少なくとも一つを含む：上皮成長因子、塩基性繊維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子α、インシュリン様成長因子Ｉ及びインシュリン様成長因子ＩＩ。この発明の方法は、外分泌及び内分泌細胞型の両方の形成を可能にする。外分泌細胞型は、好ましくは、カルボキシペプチダーゼＡを発現する。内分泌細胞型には、グルカゴン発現細胞、インシュリン発現細胞及びソマトスタチン発現細胞が含まれうる。この方法の接着性マトリクスは、好ましくは、癌性細胞株（好ましくは、肉腫又は膀胱癌）に由来するマトリクスである。特に、この発明の方法は、グルコースで調節される様式でインシュリンを生成することのできるインシュリン産生細胞の形成を可能にする。
【００３６】
更なる具体例において、この発明は、グルカゴンを発現する細胞を得る方法であって、前駆細胞を１５％ ＫＯＳＲの存在下で増殖させること；及びその細胞を接着性マトリクス及び分化用培地と接触させることにより分化させることを含む、当該方法を提供する。かかる条件下で、この前駆細胞は、グルカゴンを発現する細胞を生じさせる。
【００３７】
更に別の具体例において、この発明は、ソマトスタチンを発現する細胞を得る方法であって、前駆細胞をＬＩＦの存在下で増殖させ、この細胞を接着性マトリクス及び分化用培地と接触させることにより分化させることを含む当該方法を提供する。
【００３８】
更に別の具体例においては、これらの膵臓細胞前駆細胞を、膵島細胞例えばβ小島細胞、α小島細胞、δ小島細胞又はφ小島細胞への分化を誘導してから、患者に導入する。
【００３９】
本発明の実施は、別途指示しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジーン生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の慣用の技術を用いる（これらは、当業者の範囲内にある）。かかる技術は、文献に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： １９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ等、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；学術論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ．Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， 第１５４及び１５５巻（Ｗｕ等、編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）を参照されたい。
この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
【００４０】
図面の詳細な説明
図１．
膵管の分離。この略画は、研究下の管を得た方法を説明している。２〜３週齢のラット由来の膵臓組織をコラゲナーゼ溶液中で分離し、腺管物質を手摘みにより得た。清浄な管をプラスチック上の培地中に置いた。３〜５日以内に、単層が得られ、それから、誘導培地にさらした際に非接着性細胞（ＮＡＣ）が生成された。様々なステージの管の分離及び純度を示す一連の写真をこの略画の下に示す。第１のパネルは、第一次の消化を示し、第２のパネルは、第一回目の手摘みの結果を示している。未だ外分泌組織を含むものがあることに注意されたい。第二回の選択後に、これらの管は、小島及び外分泌組織の両方を有していない。
図２．
膵管の培養及びインシュリン染色。描かれているのは、単一の管の培養における時間０のプレーティング（Ｔ０）から５日目（Ｔ５）までの時系列である。上段のパネルは、インシュリンについてＣｙ３標識した免疫細胞化学染色の例を示しており、下段のパネルは、結合した明視野及び蛍光イメージを示している。Ｔ０においては、インシュリン発現細胞はない。培養の２４時間以内に、この管は、広がり且つ崩壊し始め、細胞は、周辺に向かって移動する。細胞の増殖は、主として、間充織細胞の外へ成長する単層中に存在するが、腺管上皮細胞も又、ＢｒｄＵを取り込む（データは示してない）。インシュリン陽性細胞は、培養期間にわたってこの管から自発的に現れたが、それらの全体的複製速度は遅い（データは示してない）。Ｔ５によれば、幾つかの単層は、インシュリン陽性細胞のかなり大きな集落を含み；典型的には、それらは、２０細胞以下を含んだ。
図３．
この管の単層は、複数の前駆細胞マーカーを発現する。単層を、インシュリン（Ａ）及びアミラーゼ（Ｂ）の両者について染色した。パネルＣは、幾つかの細胞がインシュリンとアミラーゼの両方を発現することを示す混合物である。２つの形態的に異なる細胞型（接着性で平らなものと、半接着性で丸い細胞）が存在している。矢印は、インシュリンとアミラーゼの両方を同時発現することのできる丸い半接着性細胞を示している。パネルＤ及びＥは、それぞれ、グルカゴンとＰＹＹについての染色を示しており、パネルＦは、グルカゴン明細胞の一つがＰＹＹをも発現することを示す混合物である。パネルＧは、核ＰＤＸ−１（Ｃｙ３）と細胞質インシュリン（ＦＩＴＣ）染色の混合物を示している。矢印は、ＰＤＸ−１を発現するがインシュリンを発現しない細胞（又は、その逆）を示している。
図４．
因子の添加は、非接着性細胞（ＮＡＣ）型の出現に影響を及ぼす。様々な因子で処理した培養物のホフマン調節コントラスト写真を撮った。培養物を、５％ＦＢＳ中で、集密単層が得られるまで５日間生育させ；次いで、更なる４８時間にわたって因子を加えて、これらの培養物の写真を撮った。ＮＡＣは、すべての条件下で認められた。パネルＡは、ＦＢＳ中で生育させた対照用培養物を示しており；パネルＢは、ＤＣＥ（１μＭデキサメタゾン、１００ｎｇ／ｍｌコレラ毒素、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ）で処理した培養物を示し；パネルＣは、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した培養物を示し、そしてパネルＤは、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した培養物を示している。パネルＡ中の矢印１は、接着性の集密単層を示し、矢印２は、一対の丸い緩く接着し又は接着しない細胞を指している。ＨＧＦ及びＴＧＦβ１処理した培養物も又、半接着細胞及び非接着細胞を含んだ。しかしながら、薬理学的カクテルＤＣＥは、他の試みたすべての条件より、平均で、少なくとも８倍多くＮＡＣを誘導した。ＢｒｄＵパルス実験は、強力な増殖及び集密単層をＤＣＥ曝露の４８時間後でさえも示し、これは、おそらく、単純な細胞接着性の喪失ではなく、非対照性分裂を示している。パネルＢ中のはめ込み写真は、ＮＡＣの形態及び顆粒状態を示している。
図５．
複数のホルモン含有細胞型が、ＮＡＣ集団において検出される。ＮＡＣをＤＣＥ刺激した単層培養物から集めて、内分泌マーカー発現について免疫細胞化学的に分析した。インシュリン（Ａ、Ｃ）、ＰＤＸ−１（Ｄ）、グルカゴン（Ｅ）、ソマトスタチン（Ｆ）及び膵臓ポリペプチド（Ｇ）を発現する細胞は、すべて、ＮＡＣ集団中に存在した。マーカーを、ＦＩＴＣ又はＣｙ３免疫蛍光を用いて可視化して、核をＤＡＰＩ（Ｃ−Ｇ）を用いて対比染色した。パネルＡは、インシュリン染色の１０倍の倍率の対物鏡視野を示している。異質のシグナル強度が認められた（明るく染色された一つの細胞及び陰性細胞を伴う薄暗く染色された多くの細胞がここに示されている）。パネルＢは、正常な免疫前の血清を用いた染色を示している。Ａ内の薄暗い細胞は、バックグラウンドよりは有意に明るく、観察された明るい細胞よりずっと少ないインシュリンを尚も含んでいるということに注意されたい。パネルＣは、薄暗い細胞及び陰性細胞を示す他のインシュリン染色（Ｃｙ３）を一層高倍率（２０×対物レンズ）で示している。これらの視野の中で、細胞の約４０〜５０％の試験結果は、インシュリン陽性である。パネルＤ、Ｅ、Ｆ及びＧは、それぞれ、ＰＤＸ−１、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチド染色を示している（６０×対物レンズ）。矢印は、ＤＡＰＩ染色された、ホルモン陰性の細胞を示している。
図６．
ＮＡＣにおけるＰＤＸ−１、インシュリン及びグルカゴン発現の単一細胞ＰＣＲ（ＳＣ−ＰＣＲ）分析。４０の細胞を、ＮＡＣのランダムな集団から選択して、方法の節に記載したようにしてｃＤＮＡ用に処理した。これらのｃＤＮＡを、ついで、インシュリン（Ｂ）、グルカゴン（Ｃ）及びＰＤＸ−１（Ｄ）メッセージについて分析した。パネルＡは、１．２％アガロースゲル上でのｃＤＮＡのエチジウムブロミド染色を示している。大部分のｃＤＮＡ産物は、標的の５００〜１０００ｂｐの範囲内に入った。パネルＢは、細胞当たりのインシュリンメッセージの量に変動があり、幾つかの細胞は他のものよりずっと強いシグナルを与えることを示している。これらの細胞の１５／４０（３７％）の試験結果は、インシュリンｍＲＮＡについて陽性であった。これらの内の一つは、グルカゴンについても陽性であったが、両メッセージは、インシュリンのみを発現した他の細胞と比較して相対的に弱かった。パネルＣは、これらの細胞の２／４０（５％）がグルカゴンメッセージを含んでいたこと（免疫細胞化学データとよく相関する結果）を示している。パネルＤは、これらの摘んだ細胞の多くがＰＤＸ−１ｍＲＮＡを含んでいたことを示している。細胞の有意の画分がＰＤＸ−１ｍＲＮＡのみを発現しインシュリン又はグルカゴンを発現しないということに注意されたい。
図７．
培養した管のインシュリン含量及びグルコース応答。新たに分離した管（Ｔ＝０）、１週間培養した管（Ｔ＝７）、及びＤＣＥ誘導された管培養物から採集したＮＡＣを、すべて、グルコース刺激インシュリン分泌（ＧＳＩＳ）について試験し、総インシュリン含量のために抽出もした。時間０の管は、ＲＩＡにより検出可能なインシュリンを含まなかった。対照的に、培養した管は、インシュリン含量の識別可能な増加を有したが、グルコース応答は示さなかった。この典型的実験において、分離されたＮＡＣは、細胞当たりのレベルに標準化した際に、ＤＣＥ処理した単層の１８倍高いインシュリン含量を示した。加えて、これらのＮＡＣは、強い３倍のＧＳＩＳ応答（生体の小島で認められる生理的範囲の３〜５倍以内）を示した。ＭＬ＝単層、ｎ．ｄ．＝検出不能。
図８．
ＮＡＣにおけるグルコース誘導されたカルシウムの流れ。グルコースは、ＮＡＣ集団において、内側へ向かうカルシウムの流れを誘導する。単一細胞における細胞内カルシウムの変化を、Ｆｌｕｏ−３及び共焦点顕微鏡を用いてモニターした。Ａ、この典型的実験において（ｎ＞１０）、この集団の約１／３が、グルコース投与に応答して確固としたカルシウム流入を開始し、５８％の細胞は、グルコースに対して応答を示さなかった。各実験において、約６〜１０％の細胞が、時間と共に増大する高い細胞内カルシウム含量を始め；これらは、死につつある細胞であると判断された。８０細胞を、この実験で分析した。Ｂ、誘導されたカルシウムの流れの可逆性を示している。この典型的実験において（ｎ＞６）、グルコース刺激によるカルシウムの流れは、クレブス−リンゲルホスフェート（ＫＲＰ）溶液を用いて洗い流すことができた。次いで、第２のカルシウム流れを、１７ｍＭのグルコースの再投与により刺激することができた。グルコースの洗浄とその後のトルブタミド刺激、ＳＵＲ結合されたカリウムチャンネルブロッカーも又、予想通り、カルシウム流れを刺激した。矢印は、投与の時間を示している。１２３細胞のすべてを、この実験で分析した。これらの細胞の７〜１３％が、これらの刺激に応答してカルシウム流れを生じた（赤で表示）が、４５〜６５％の細胞は、如何なる刺激に対しても何の応答も示さなかった（青で表示）。残りの３５％の細胞は、コラーゲンに応答して変化する振幅及び速度論を示し、これは、複雑な集団を示している。
図９．
ＤＣＥによる分化の誘導を示すグラフである。
図１０．
フォルスコリン、ジブチルｃＡＭＰ及びＮａ−ブチレートの分化誘導に対する効果を示すグラフである。
図１１及び１２．
セクレチンの浮遊前駆細胞の誘導に対する効果を説明するグラフである。
図１３．
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）も又、管単層から浮遊前駆細胞の出現を誘導することをことを示すグラフである。
図１４．
インシュリンが、セクレチン誘導される分化を減少させることを示すグラフである。
図１５〜１７．
ＰＮＡ染色に基づいてソートした後に２週間培養した細胞の表現型を例示する顕微鏡写真である。
図１８及び１９．
成体及び胎児の膵臓におけるＰＮＡ染色の特異性を例示する顕微鏡写真である。
図２０．
典型的な単一細胞ｍＲＮＡＰＣＲ増幅反応の結果を示す電気泳動ゲルの写真である。
図２１．
膵臓の発生中の遺伝子発現の変化を説明する表である。
図２２．
べータ細胞及びそれらの前駆細胞を検出するためのマーカーの配列の一具体例を例示する図表である。
図２３．
成体及び胎児の膵臓組織及び心臓における遺伝子発現の概要を描写するオートラジオグラフである。
図２４．
遺伝子発現の定量的分析が、細胞の遺伝子発現の概要の測定の部分として、如何に行われ得るかを例示するグラフである。
図２５．
異なるステージにおける及び異なる刺激後の、胎児の膵臓組織における遺伝子発現の概要を描写するオートラジオグラフである。
図２６．
オートラジオグラフの定量的分析を例示するグラフである。
図２７．
いわゆる浮遊前駆細胞における遺伝子発現の概要を描写するオートラジオグラフである。
図２８．
図２７のオートラジオグラフの定量的分析を例示するグラフである。
図２９．
成体の小島間での、膵臓発生中における、ある遺伝子の発現の相対的レベルを示す表である。
図３０〜３１．
ある種のレクチンの成体ラットの膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
図３２〜３９．
ある種のレクチンの成人の膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
図４０．
膵管由来の培養物に由来する移植された細胞は、一時的に、糖尿病状態を救済する。分化した膵管単層の非接着性部分に由来する機能的べータ細胞を含む異質集団を、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理した糖尿病マウスに移植した。ＳＴＺを注射したＳＣＩＤマウスは、４８時間以内に糖尿病性となった。次いで、インシュリン含有ペレットを皮下に移植して、血中グルコースを安定化させて細胞移植のための一層安定な環境を造った。このインシュリンペレットは、移植の７日後にＴ＝１１日（Ｔ１１）で放出するようにデザインした。ペレット移植の４８時間以内に、これらの動物の空腹時血中グルコースは、２８０〜３８０ｍｇ／ｄｌ血中グルコースの範囲から５０ｍｇ／ｄｌ未満に低下した。試験グループにおいて、次いで、細胞又は成体小島（陽性対照）を、副腎の下に移植した。１週間後に（Ｔ１３）、空腹時血中グルコースを測定し、１６、２１及び２８日目に再び測定した。黒い正方形は、偽薬のグループ（ｎ＝５マウス）を表し、予想されるように、インシュリンの非存在下では、血中グルコースは、時間をかけて３００ｍｇ／ｄｌより上までゆっくり上昇した。インシュリンペレットのみを移植されて細胞移植物を移植されなかった動物（ｎ＝５）も又、予想されたように挙動し、一時的救済に続いて、インシュリン放出用の錠剤が終了した後に糖尿病のリバウンドが生じている（赤い菱形）。小島を受容した動物（青い三角形、ｎ＝５、４００小島／動物）は、完全な長期間の救済を示し、空腹時血中グルコースは、約１００ｍｇ／ｄｌに維持された。管由来の細胞を受容した単一の生存動物（緑の円、ｎ＝１（７の内の））は、糖尿病状態の一時的な救済を示した。この単一の動物は、４〜５日の＞１５０ｍｇ／ｄｌ血中グルコースの低下を示した後、移植前の血中グルコースレベルに戻った。
図４１．
拡張用培地（試験用培地３）での成長における、非接着性球及び付着した細胞を示す顕微鏡写真。
図４２．
試験用培地１、試験用培地２又は試験用培地３での成長における、非接着性球を示す顕微鏡写真。
図４３．
非接着性前駆細胞から分化した細胞におけるｇｌｕｔ２及びネスチンタンパク質発現を示す顕微鏡写真。細胞を、ＨＴＢ９マトリクス上に、ＰＹＹ及びフォルスコリンの存在下でプレートし、次いで、固定して抗Ｇｌｕｔ２及び／又は抗ネスチン抗体で染色した。
図４４．
非接着性前駆細胞から分化した細胞におけるＰＤＸ−１及びグルカゴンタンパク質発現を示す顕微鏡写真。細胞を、ＨＴＢ９マトリクス上に、ＰＹＹ及びフォルスコリンの存在下でプレートし、次いで、固定して抗ＰＤＸ−１及び／又は抗グルカゴン抗体で染色した。
図４５．
非接着性前駆細胞から分化した細胞におけるＰＤＸ−１及びインシュリンタンパク質発現を示す顕微鏡写真。細胞を、ＨＴＢ９マトリクス上に、ＰＹＹ及びフォルスコリンの存在下でプレートし、次いで、固定して抗ＰＤＸ−１及び／又は抗インシュリン抗体で染色した。
図４６Ａ．
生育状態の及び分化中の導管球を、細胞マーカーにつきアッセイした。インシュリン陽性細胞は、分化中に劇的に増大した。
図４６Ｂ．
生育状態の及び分化中の導管球を、細胞マーカーにつきアッセイした。インシュリン陽性細胞は、分化中に劇的に増大した。Ｇｌｕｔ２陽性細胞は、非接着性細胞の増殖前には稀であったが、導管球中には豊富であり、分化中豊富なままであった。
図４７．
未分化の非接着性前駆細胞におけるネスチンタンパク質発現を示す顕微鏡写真。球を、分離し、固定して、抗ネスチン抗体で染色した。凡そ５０％の細胞がネスチン陽性である。
図４８．
半球培養＃１における非接着性細胞クラスターを示す顕微鏡写真。
図４９．
半球培養＃１における非接着性細胞クラスターを示す顕微鏡写真。
図５０．
半球培養＃２における非接着性細胞クラスターを示す顕微鏡写真。
図５１．
半球培養＃１のための出発材料のＦＡＣＳ分析。
図５２．
半球培養＃１のための出発材料の、Ｌｉｎ＋涸渇後のＦＡＣＳ分析。
図５３．
１４日間の培養後の、半球培養＃１のＦＡＣＳ分析。
図５４．
２０日間の培養後の、半球培養＃１のＦＡＣＳ分析。
図５５．
半球培養＃２のための出発材料のＦＡＣＳ分析。
図５６．
半球培養＃２のための出発材料の、Ｌｉｎ＋涸渇後のＦＡＣＳ分析。
図５７．
７日間の培養後の、半球培養＃２のＦＡＣＳ分析。
図５８．
１１日間の培養後の、半球培養＃２のＦＡＣＳ分析。
図５９．
２０日目の半球培養＃１（左側パネル）及び１３日目の＃２（右側パネル）からの細胞を、スライドガラス上にサイトスピンさせ、メイ−グリュンバルトギムザ染色した。
図６０．
４日間分化した一次球が、インシュリン及びｐｄｘ−１タンパク質の両方を発現する多量の細胞を生じさせることを示す顕微鏡写真。
図６１．
一層長期の８日間の分化後の、インシュリン及びＰｄｘ−１タンパク質発現を示す顕微鏡写真。５０％を超える細胞がインシュリン及びｐｄｘ−１の両方で陽性である。
図６２．
８日間の分化後の、インシュリン及びＧｌｕｔ２タンパク質発現を示す顕微鏡写真。興味深いことに、すべてのインシュリン陽性細胞がｇｌｕｔ−２を同時発現している訳ではない。
図６３．
３つの異なるステージ（新たに分離されたＴ＝０の管細胞、分化前の成長中の球、及び分化後８日目の球）における、３つのマーカー、インシュリン、Ｐｄｘ−１及びＧｌｕｔ−２のタンパク質発現及びそれらの相対的レベルを示すプロット。Ｔ＝０においては、インシュリン陽性細胞は３％と少なく、分化前のインシュリン陽性細胞は、約６％であるが、分化後８日目では、インシュリン陽性細胞は、５６％にまで達した。
図６４．
グルカゴン及びＰｄｘ−１タンパク質発現を示す顕微鏡写真。培地に６種類の成長因子に加えて、１５％のＫＯＳＲを含有させた場合には、分化後１２日目に、多量のグルカゴン細胞発現があった。殆どのグルカゴン発現細胞は、ｐｄｘ−１を発現しておらず、これは、島の成熟細胞の典型的な表現型である。
図６５．
図６４に記載したのと同じ成長因子条件について、ｐｄｘ−１をも発現するかなりの量のインシュリン発現細胞もある。
図６６．
ＬＩＦの存在下で１２日間分化させて、ソマトスタチン及びＰｄｘ−１タンパク質発現につき染色した球の顕微鏡写真。殆どのソマトスタチン発現細胞は、ｐｄｘ−１を発現しないが、ｐｄｘ−１を同時発現する少数のソマトスタチン発現細胞があり、これは、それらが、成熟ソマトスタチン細胞及びＰＰ細胞の前駆細胞であることを示唆している。
図６７．
分化した細胞によるグルコースで刺激されたインシュリン放出のグラフ。
図６８．
４５日間の培養後にインシュリン及びｐｄｘ−１を同時発現する細胞を示している。
図６９．
分化条件での４５日間の培養後の細胞におけるグルカゴン及びＰｄｘ−１の発現。殆どのグルカゴン発現細胞はｐｄｘ−１を発現しないが、ｐｄｘ−１を同時発現する少数のグルカゴン発現細胞もあり、これは、成熟β細胞及びα細胞の初期の前駆細胞の可能性を示唆している。
図７０．
図６９に示した培養に由来する細胞でのソマトスタチン発現。
図７１．
上記の培養に由来する細胞が外分泌マーカー、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）を発現することを示している。更に、これらのＣＰＡ発現細胞は、インシュリンをも発現する細胞の同じクラスター内に現れたが、これらの２種のタンパク質は、同時発現されなかった。これは、これらの内分泌及び外分泌細胞の両方共が、同じ前駆細胞に由来することを強く示唆した。
図７２
Ａ．新たに分離されたヒト膵管。Ｂ．１日間の培養における管細胞は、小さい凝集を形成し始める。Ｃ．３日間の培養において管細胞は、球を形成し、それらは、サイズが大きくなりつつある。
図７３．
生育培地中のヒトの導管球。−導管球は、上記のように、無血清生育培地において生育し、これらの細胞を、平均５日毎に継代した。この培養条件下で、経時的に、管上皮マーカー、ＣＫ−７の富化があった。
図７４．
４日間分化用培地中にあるヒトの導管球。導管球を、ＨＴＢ−９マトリクスで被覆した９６ウェルプレート中に、２５ｍＭ グルコースを含むイスコブ改変ダルベッコ培地中に５％ ＦＢＳ、３０μＭ フォルスコリン及び２００ｎｇ／ｍｌ ＰＹＹを含む分化用培地に播種して４日間おいた。これらの細胞を、１％ ＰＦＡで固定して、抗インシュリン及び抗ｐｄｘ−１抗体で同時染色した。
図７５．
１１日間分化用培地中にあるヒトの導管球。一層インシュリン陽性の細胞が、分化用培地でのＨＴＢ−９マトリクス上での培養（上記と同じ分化条件）の１１日後に現れた。
図７６．
１１日間分化用培地中にあるヒトの導管球。ｐｄｘ−１及びソマトスタチン抗体で同時染色した細胞は、特徴的なソマトスタチンを発現し且つｐｄｘ−１を発現する細胞を示している。これらの２つのマーカーを発現する細胞は、同じ細胞クラスター内にあるが、同じ細胞ではない。これは、これらの２つの細胞型が同じ前駆細胞に由来しうることを示唆している。
図７７．
１１日間にわたるヒト導管球のイン・ビトロでの分化。細胞を、Ｇｌｕｔ２及びビメンチン抗体で同時染色した（後者は、繊維芽細胞のマーカーである）。この図は、Ｇｌｕｔ２発現細胞がクラスター内に位置していること及び該細胞がビメンチン陽性細胞から排除されることを説明している。
【００４１】
発明の最良の実施様式
（ｉ）概観
本発明のある面は、後に別々の細胞系統に分化することのできる前駆細胞の単離された集団、かかる細胞の分離方法及びかかる細胞の治療用途に関係する。幹細胞は、殆どの成体及び胎児組織に存在すると考えられるが、それらは、稀であり富化させるのが困難である。この発明は、部分的に、多くの異なる組織型に由来する幹細胞がすべて、何らの基材への付着（直接又は間接）もなしで増殖する共通の能力を共有するらしいという驚くべき発見に基づいている。この特性は、幹細胞の富化に利用することができる。殆どの細胞型は、生存及び／又は成長のために基材を必要とする。その結果、組織から得られた混合細胞懸濁液を、接着面なしで培養することができ、その結果、幹細胞は増殖して懸濁液中に「球」を形成するが、他の細胞は、死ぬか少なくとも成長できない。これらの幹細胞の連続する選択的成長は、かかる非接着性細胞の実質的富化を生じる。かかる方法を用いて、心筋組織、肺組織、腎臓組織、骨格筋組織及び膵臓組織を含む（これらに限定されない）任意の組織から幹細胞の精製された集団を分離することができる。
【００４２】
一つの面において、この発明は、部分的に、幹細胞をそれらの接着面なしで増殖する能力を利用することによって得るための新規な方法を提供する。他の面において、この発明は、非接着性細胞を生じさせることのできる単層系を利用して膵臓前駆細胞を分離する他の新規な方法を提供する。この発明の様々な方法により得られた幹細胞は、多くの目的のために利用することができる。
【００４３】
内分泌小島を生じ得る前駆細胞の成体膵臓内の存在が、ずっと以前に提案された（例えば、Ｂｅｎｓｌｅｙ， １９１１）。幾つかの再生モデルが、初期に、成体臓器における小島新生のイン・ビボの証拠を提供している（Ｓｈａｗ及びＬａｔｉｍｅｒ， １９２５， Ｗａｒｅｎ及びＲｏｏｔ， １９２５）。歴史的研究は、新たに形成された小島と仮定されたものと腺管ネットワークとの間の物理的付着を示した。これら及びもっと最近の仕事（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ等、１９９３；Ｇｕ等、１９９４；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ等、１９９７）から、小島前駆細胞が膵管上皮のサブポピュレーションに由来するという現在広く支持されている考えが発達した。
【００４４】
この膵管ネットワークは、成体膵臓の３つの機能的構成要素の１つであり（他の２つは、外分泌腺房及び内分泌小島である）、液体分泌及び消化酵素の小腸への送達の担い手である。膵管の容積の見積もりは、ラットで平均１１％である。消化酵素を生成する外分泌腺房は、成体膵臓の最大の部分をなし、組織塊全体の約７７〜８９％を占める。これらの小島は、インシュリン分泌性のべータ細胞を含み、グルコース代謝のホルモン調節の担い手であり；臓器全体の５％未満を占める（Ｇｉｔｈｅｎｓ， １９８８により総説されている）。
【００４５】
９０％の膵臓切除（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ等、１９９３、Ｌａｍｐｅｔｅｒ等、１９９５）、管連結（Ｗａｎｇ等、１９９５、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ １９９５）、及びトランスジェニックマウス（Ｇｕ及びＳａｒｖｅｔｎｉｃｋ） 等の膵臓再生モデルは、すべて、小島組織が、管に結合した膵臓細胞前駆細胞からデ・ノボで生じるという更なるイン・ビボの証拠を提供している。これらの創傷モデルの各々における共通の観察は、実験による傷害後の増殖中の腺管上皮における内分泌細胞の迅速な出現及びその後の数週間の過程にわたるおそらく新たに形成された小島の管周囲空間における出現である。加えて、インシュリンとアミラーゼの両方を発現するらしい細胞（それぞれ、内分泌細胞及び外分泌細胞を示す）が、再生プロセスにおいて認められており、これらの細胞は活性化された前駆細胞に相当すると考えられている（Ｍｅｌｍｅｄ， １９７９；Ｃｏｓｓｅｌ， １９８４；Ｇｕ等、１９９４）。これらの活性化された細胞の正確な起源（管、腺房又はその他の何れか）、及びそれらの前駆細胞からの又は選択的脱分化による活性化の機構は、未決定のままである。これらの不確実性にもかかわらず、これらの研究は、成熟膵臓の潜在的な小島新生能力を強調している。
【００４６】
膵臓の発生中に、ＰＤＸ−１（インシュリン及び他のべータ細胞成分の発現を調節する転写因子）の初期発現が、外分泌及び内分泌区画を生じることのできる前駆細胞を示すということが提案されている（Ｏｈｌｓｓｏｎ等、１９９３；Ｏｆｆｉｅｌｄ等、１９９６；Ａｈｌｇｒｅｎ等、１９９６及びＭａｄｓｅｎ等、１９９６及びＥｄｌｕｎｄ， １９９８により総説されている）。発生の機構は、成体のべータ細胞の新生における役割も演じているであろう。実際、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ等（１９９７）は、ＰＤＸ−１発現細胞の成体膵管におけるストレプトゾトシン傷害後の出現を記載している。他の胎児性産物は、ホルモンＰＹＹであり、これの発現も又、決定された内分泌細胞前駆細胞を示すと仮定されている（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ等、１９９４）。これらの細胞型の両方は、小島中並びに膵臓発生の初期に見出され、それらが小島形成に直接寄与しているかどうかは、未だ明らかでない。しかしながら、それらは、初期のマーカーを与え、それらに対して、再生系を分析することができる。
【００４７】
（ｉｉ）定義
便宜のために、明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いている幾つかの用語をここに集めてある。
【００４８】
用語「接着性マトリクス」は、培養細胞の接着を促進する任意のマトリクス（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン）をいう。好ましくは、このマトリクスは、癌様細胞株の細胞外マトリクスに由来する。典型的なマトリクスには、マトリゲル（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＨＴＢ９マトリクスが含まれる。マトリゲルは、マウス肉腫細胞株に由来する。
【００４９】
ここで用いる場合、用語「動物」は、哺乳動物、好ましくは、ヒト等の哺乳動物をいう。同様に、この発明の方法により治療される「患者」は、ヒト又は非ヒト動物を意味することができる。
【００５０】
ここで用いる場合、用語「細胞性組成物」は、細胞の調製物をいい、該調製物は、細胞に加えて、非細胞性成分例えば細胞培養培地、例えばタンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、補酵素、抗酸化剤、金属等を含むことができる。更に、この細胞性組成物は、細胞性要素の生育又は生存力に影響を与えないが、それらの細胞を特定の形式で与える成分例えばカプセル封入又は医薬製剤のためのポリマーマトリクスを有することができる。
【００５１】
用語「培養培地」は、当分野で認められており、一般に、生細胞の培養に用いられる任意の物質又は調製物をいう。従って、「組織培養」は、組織例えば器官原基又は成体器官の外植片の、構造及び機能を保存するためのイン・ビトロでの維持又は生育をいう。「細胞培養」は、細胞のイン・ビトロでの生育をいい；それらの細胞が増殖しても、それ自体、組織に編成はされない。
【００５２】
主題の微小器官外植片及び増幅させた前駆細胞集団の組織及び細胞培養調製物は、様々な形式を取り得る。例えば、「懸濁培養」は、細胞が適当な培地中に懸濁されながら増殖する培養をいう。同様に、「連続流培養」は、細胞又は外植片の、細胞の生育例えば生存力を維持する新鮮な培地の連続流中での培養をいう。用語「順化培養液」は、その培養液が、細胞により生成されて培養液中に分泌されるある種のパラ分泌及び／又は自己分泌因子を含有するように変化するように、培養細胞と一定期間接触させた後の上清（例えば、培養細胞／組織を含まないもの）をいう。
【００５３】
本発明の関連において「分化」は、一層特殊化された細胞と結びついていることの知られているマーカーを発現し及び更なる分割又は分化のできない最終分化した細胞に一層近い細胞の形成を意味する。例えば、膵臓の関連では、分化は、増大した量のインシュリンを産生するベータ上皮細胞の増大した集団を含む小島様細胞クラスターの生成において見ることが出来る。
【００５４】
用語「ＥＤ５０」は、ある薬物の最大の応答又は効果の５０％を生じる投与量を意味する。
【００５５】
主題の方法に関して、例えばｃＡＭＰレギュレーターの「有効量」は、患者の膵臓細胞培養物に加えたときに、細胞増殖速度及び／又は細胞の分化状態の変化を引き起こすｃＡＭＰ上昇剤の量をいう。
【００５６】
用語「外植片」は、身体から採取されて人工的培地中で生育されている器官の一部分をいう。
【００５７】
「エキス・ビボ」とは、身体から採取され、イン・ビトロで一時的に培養されて、身体に戻された細胞を意味する。
【００５８】
「造血幹細胞」（ＨＳＣ）は、ここで用いる場合、同等の潜在能力の娘細胞を生成することに加えて、主要造血細胞系統の少なくとも一つの細胞を生じさせることのできる幹細胞である。血液細胞の３つの主要な細胞系統には、リンパ細胞系統（例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞）、骨髄細胞系統（例えば、単球、顆粒球及びマクロファージ）及び赤血球細胞系統（例えば、赤血球細胞）が含まれる。あるＨＳＣは、脳細胞を含む多くの他の細胞型を生じさせることができる。「多能性」又は「分化多能性」ＨＳＣは、少なくとも３つの主要造血細胞系統を生じさせることのできるＨＳＣである。
【００５９】
用語「系統決定された細胞」は、特定の細胞型例えば膵臓細胞への分化を誘導された前駆細胞をいう。
【００６０】
用語「肝臓」は、腹部右側上部の、横隔膜の直下の、大きい、暗赤色の腺をいう。その多種多様な機能には、血液の貯蔵及び濾過、糖のグリコーゲンへの変換及び多くの他の代謝活性が含まれる。それは又、腸に胆汁を供給する。成体の脊椎動物において、この機能は、主要な機能ではなく、肝臓は、元々、一層低級な脊索動物において消化腺として出現したものである。肝臓中において、小さい管のネットワークが、胆汁−塩、ビリルビン（赤血球細胞からのヘモグロビンが肝臓で壊されたときにできる）及び脂肪酸の溶液を集める。胆汁は、胆嚢に蓄積され、それは、管によって小腸に移される。胆汁は、腸において、２つの機能を有している。第１に、それは、洗剤として作用して、脂肪を、消化酵素の攻撃を受けうる小さい小滴に分解する。第２に、一層重要なことであるが、胆汁酸塩は、脂質の腸からの吸収を助ける。胆嚢の切除は、ときとして、脂質の吸収を困難にする。
【００６１】
用語「器官」は、２つ以上の隣接する組織の層をいい、この組織の層は、ある種の形態の細胞−細胞相互作用及び／又は細胞−マトリクス相互作用を維持して微細構造を形成する。
【００６２】
用語「一次培養」は、組織から分離された多くの異なる細胞型の相互作用を可能にする細胞の混合細胞集団を意味する。用語「一次」は、組織培養の分野での通常の意味を有する。例えば、膵管細胞の一次培養は、間充織細胞と上皮細胞の間の相互作用を可能にすることができる。
【００６３】
用語「前駆細胞」は、「幹細胞」と同義に用いられる。両用語は、増殖して、多数の母細胞（これらは、更に、分化した又は分化しうる娘細胞を生じさせることができる）を生成する能力を有する一層の前駆細胞を生じさせることのできる未分化細胞をいう。好適具体例において、用語前駆細胞又は幹細胞は、子孫が、しばしば、分化によって、例えば完全に独自の性質を得ることにより、異なる方向に特殊化する一般化された母細胞をいい、該分化は、胎児の細胞及び組織の進行性の多様化において現れる。細胞の分化は、複雑な過程であり、典型的には、多くの細胞分裂において生じる。分化した細胞は、多能性細胞（それ自身が、多能性細胞に由来する）などから導くことができる。これらの多能性細胞の各々は幹細胞と考えることができるが、各々が生じさせることのできる細胞型の範囲は、かなり変化しうる。幾つかの分化した細胞型は又、一層大きい発生能力を有する細胞を生じさせる能力をも有している。かかる能力は自然であってもよいし、又は種々の因子での処理により人工的に誘導することもできる。
【００６４】
「増殖」は、細胞数の増加を指す。
【００６５】
用語「組織」は、ある特定の機能を一緒に行う、同様に特殊化された細胞の群又は層をいう。
【００６６】
用語「膵臓」は、当分野で認められており、一般に、胃の後ろに、脾臓と十二指腸の間に横向きに位置された、大きな、細長い、総状の腺をいう。膵臓の外分泌機能例えば外部への分泌は、消化酵素の起源を与える。実際、「パンクレアチン」は、消化補助に用いられる酵素（主として、アミラーゼ、プロテアーゼ及びリパーゼ）を含む膵臓に由来する物質をいう。外分泌部分は、内腔を囲む幾つかの漿液細胞よりなる。これらの細胞は、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ及びアミラーゼ等の消化酵素を合成して分泌する。
【００６７】
膵臓の内分泌部分は、ランゲルハンス小島よりなる。これらのランゲルハンス小島は、外分泌する膵臓の中に埋め込まれた細胞の丸い集落のように見える。４つの異なる型であるα、β、δ及びφ細胞が、これらの小島において同定されている。α細胞は、膵臓の小島で見出される細胞の約２０％を構成して、ホルモンのグルカゴンを生成している。グルカゴンは、幾つかの組織に作用して、食間に利用可能なエネルギーを作る。肝臓においては、グルカゴンは、グリコーゲンの分解を引き起こし、アミノ酸前駆体からの糖新生を促進する。δ細胞は、膵臓でグルカゴン放出を阻止して膵臓の外分泌を低下させるように作用するソマトスタチンを生成する。ホルモンの膵臓ポリペプチド（ＰＰ）は、φ細胞で生成される。このホルモンは、膵臓の重炭酸塩及び酵素の外分泌を阻止し、胆嚢の弛緩を引き起こして、胆汁の分泌を低下させる。この小島で最も豊富な細胞は、６０〜８０％を構成し、インシュリンを産生するβ細胞である。インシュリンは、食事中又はその少し後で上昇する過剰の栄養素の蓄積を引き起こすことが知られている。インシュリンの主要な標的器官は、肝臓、筋肉及びエネルギーの貯蔵のために特殊化された脂肪臓器である。
【００６８】
用語「膵管」には、副膵管、背側膵管、主膵管及び腹側膵管が含まれる。漿腺は、隣接する分泌細胞間の内腔の拡張を有し、これらは、細胞間小管と呼ばれる。用語「小葉間導管」は、膵臓内の分泌ユニットの小葉内に見出される介在導管及び線条部導管をいう。「介在導管」は、分泌性細葉又は細管から排液させる第１の管セグメントをいう。介在導管は、しばしば、炭酸脱水酵素活性を有し、それにより、重炭酸イオンがこれらの分泌物にこのレベルで加えられる。「線条部導管」は、最大の小葉内管要素であり、分泌物のイオン蘇生を調節することができる。
【００６９】
用語「膵臓細胞前駆細胞」は、膵臓細胞系統の細胞に分化することのできる細胞例えば通常膵臓細胞により産生されるホルモン又は酵素を産生することのできる細胞をいう。例えば、膵臓細胞前駆細胞は、少なくとも部分的に、α、β、δ若しくはφ細胞又は外分泌する運命の細胞への分化を引き起こされ得る。この発明の膵臓細胞前駆細胞は又、患者に投与する前に、細胞増殖及び細胞分化を促進する条件下で培養することもできる。これらの条件は、これらの細胞をイン・ビトロで培養して増殖させ、集密にすることを含み、その時点で、それらの細胞に擬似小島様凝集又は集落を形成させて、インシュリン、グルカゴン及びソマトスタチンを分泌させることができる。
【００７０】
用語「実質的に純粋な」は、前駆細胞に関して、少なくとも約７５％の、好ましくは少なくとも約８５％の、一層好ましくは少なくとも約９０％の、最も好ましくは少なくとも約９５％の純度の前駆細胞の集団をいう（全細胞集団を作る前駆細胞に関して）。書き直すと、用語「実質的に純粋な」は、本発明の前駆細胞の集団であって、培養及び増幅の前に、最初の未増幅の単離された集団において約２０％未満の、好ましくは約１０％未満の、最も好ましくは約５％未満の細胞系統の決定された細胞を含む当該集団をいう。
【００７１】
（ｉｉｉ） 典型的具体例
いくつかの用語を上に説明したが、本発明の一つの面は、ある範囲の組織型に由来する幹細胞（及びその分化した子孫）を富化させる方法を特徴とすることを注記する。非接着性の特性を利用して、幹細胞を、次の組織型を含む（これらに限定されない）本質的に任意の組織から分離することができるということが予想される：平滑筋、横紋筋、心筋、骨（骨髄及び海綿状骨を含む）、軟骨、肝臓、膵臓（管組織を含む）、脾臓、胸腺、扁桃、バイエル腺叢、リンパ節、甲状腺、上皮、真皮、皮下組織、心臓、肺、血管組織（平滑筋及び内皮を含む）、血液細胞、膀胱、腎臓、消化管（食道、胃、小腸、大腸を含む）、脂肪組織、子宮、精巣、卵巣、前立腺、結合組織、内分泌組織、腸間膜組織、胎児組織、臍帯組織。
【００７２】
組織から細胞（分化した細胞及び未分化細胞の両方）の懸濁液を得るのに種々の技法を採用してよい。好適な分離手順は、細胞死をできるだけ少なくするものである。例えば、これらの細胞を外植片サンプルから機械的手段によって除く、例えばピペットによって機械的に分けることができる。その他の例では、外植片全体又はそれの細分部分（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎ）から前駆細胞を、例えば外植片を酵素消化した後に、特異的細胞マーカーに基づいて、例えばアフィニティー分離技術又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して活性化された前駆細胞集団を分離することによって解離することが可能になる。液体試料（例えば、血液）から、遠心分離によって細胞を得ることができる。
【００７３】
該組織は、切り出した組織を穏やかに細片にすることにより又は切り出した組織をコラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＡ）によって消化することによるような任意の適した方法を使用して、例示すると、管の中を潅流させることにより又は例えば、細片にされた組織を適したｐＨ及び緊張強さのコラゲナーゼ含有緩衝剤中で簡単にインキュベートすることによって調製するのが普通である。調製した組織を、次いで随意に、濃縮（及び部分精製）するためにフィコル勾配によって遠心分離するような、適した方法及び物質を使用して濃縮してよい。濃縮された組織を、次いで組織培養ガラス製品又はプラスチック製品のような任意の適した容器中に再懸濁させる。ある実施態様では、該組織に、集密単層培養であって、それからＮＡＣ（非接着性細胞）が形成されるものを形成させる。他の好適な具体例においては、この細胞懸濁液を非接着培養器内に置き、前駆細胞の非接着性の球が形成される。
【００７４】
主題の方法の一つの顕著な特徴は、出発原料を成体又は胎児の組織又は任意の発生段階の組織にすることができることである。その上に、その方法は、比較的少ない量の出発原料で実施することができる。よって、ドナーからの組織の小さなサンプルは、ドナーを犠牲にしたり又はひどく損傷しないで得ることができる。本発明の前駆細胞は、組織試料から増幅させ、続いて分離することができる。
【００７５】
所定の実施態様では、培養に、成長因子（又は、成長因子を含む組成物）例えば有糸分裂促進性成長因子を接触させることができ、例えば成長因子をＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＬＩＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ヘッジホグ又はＶＥＧＦからなる群より選ぶ。その他の実施態様では、成長因子は、ＴＧＦβ上科、好ましくはＤＶＲ（ｄｐｐ及びｖｇｌに関連する）系統のメンバー、例えばＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ７である。
【００７６】
所定の実施態様では、培養に、８−（４−クロロフェニルチオ）−アデノシン−３’：５’−サイクリック−モノホスフェート（ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）（例えば、コイケ　Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏ−Ｐｓｙｃｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．ａｎｄ　Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．１６　９５−１０６（１９９２）を参照）、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、Ｎａ−Ｂｕｔｙｒａｔｅ、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及びコレラトキシン（Ｍａｒｔｉｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２３　１２０５−１２２０（１９９２）を参照）並びに８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ及びジオクタノイル−ｃＡＭＰ（例えば、Ｒｙｄｅｌ等、ＰＮＡＳ　８５：１２５７（１９８８）を参照）のようなｃＡＭＰ増大剤を接触させる。
【００７７】
所定の実施態様では、培養に、ステロイド又はコルチコステロイド、例えばヒドロコルチゾン、デオキシヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、ブレドニゾロン、メチルブレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン及びパラメタゾンのようなものを接触させる。一般的に、ニュージャージー、ラヘイ、１９８７年、Ｂｅｒｋｏｗ等編、Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、１２３９−１２６７頁及び２４９７〜２５０６頁を参照。
【００７８】
好適な実施態様では、培養に、ｃＡＭＰ増大剤、成長因子及びステロイド又はコルチコステロイド、例えば本明細書中に記載するＤＣＥカクテルを接触させる。
【００７９】
代わりに又は加えて、ｃＡＭＰ調節剤による処理を上記した通りにして用いて分化を誘導させることができる。そのような方法の細胞生成物は、インシュリン産生細胞を含み、一層好ましくはグルコース応答性インシュリン産生細胞を含むことができる。
【００８０】
動物から組織を培養するために存在する組織培地は、多数存在する。これらの内のいくつかは複雑であり、いくつかは簡単である。管上皮外植片は、複雑な培地で増殖し得ることが予想されるが、外植片を、外植片中の所定の膵臓集団を活性化することについて一層正確な制御を実施するために、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉａ（ＤＭＥＭ）のような簡単な培地中に保つことが一般に好適になる。好適な実施態様では、膵管上皮をＦＢＳ５％を有するＩｓｏｃａｖｅ改質ＭＥＭ細胞培地中で培養する。その上に、外植片を血清の不存在において長期間保つことができる。発明の好適な実施態様では、成長因子又はその他の分裂促進剤を、培養をインビトロに保つための一次培地中に入れないが、引き続き使用して前駆細胞の別個の集団の増殖を引き起こす。添付例を参照。
【００８１】
好適具体例において、幹細胞は、培養表面に直接又は間接に接着しないで成長するそれらの能力の故に富化される。換言すれば、この発明の一つの面は、これらの幹細胞が、該幹細胞が自由に浮遊していて培養器の表面に固定又は半固定されて接触しておらず又は接触している細胞若しくは材料と固定又は半固定されていない培養から得られることを必要とする。
【００８２】
別の具体例においては、前駆細胞は、膵管から単層中間段階を用いて分離することができる。膵管全体を、膵管は、その構成要素の上皮及び間充織を含めて、内分泌性前駆細胞活性を含む基礎的生物学的単位であると考えられるので、幹細胞源として選択した。発生中の生存及び生育のための膵臓上皮のその周囲の間充織に対する依存性は、最初、Ｇｏｌｏｓｌｏｗ及びＧｒｏｂｓｔｅｉｎ（１９６２）及び他者（Ｗｅｓｓｅｌｓ及びＣｏｈｅｎ， １９６７）の初期の仕事により示された。遺伝子ノックアウト技術を用いるもっと最近の仕事は、背側膵臓間充織の喪失が発生中の膵臓上皮の喪失（Ａｈｌｇｒｅｎ等、１９９７）と相関し、その結果、背側芽からの膵臓形成の不在と相関するということを示した。ソニックヘッジホッグタンパク質による膵臓間充織の正体の平滑筋への再同定も又、混乱した膵臓上皮の伸出を生じた（Ａｐｅｌｑｖｉｓｔ等、１９９７）。発生中の膵臓におけるこれらの結果から、間充織と上皮の間の相関関係が、成体膵臓において、特に小島の新生及び再生に関して、機能的に重要であり続けるという仮説が立てられた。
【００８３】
新たに単離された管断片は、間充織間質に囲まれた単一の上皮層からなり、あるにしても少しの分化した内分泌細胞を含む。これらの管が培養において成長した後に、我々は、複数の内分泌細胞型の存在を認め、分化したべータ細胞の形成に寄与し得るインシュリン及びアミラーゼ等のマーカーを同時発現する潜在的な前駆細胞の存在をも認めた。加えて、我々は、膵臓細胞培養中に、以前に記載さてない非接着性細胞型の出現を認めた。この新規な細胞型の数及び特性は、様々な因子の添加により影響を受け、その一つの組合せは、再現可能に、機能的なグルコース応答性べータ様細胞へと導く。従って、我々のデータは、この管培養系における膵臓前駆細胞活性の存在及び誘導を示唆しており、該培養系は、今や、べータ細胞の新生のイン・ビトロでの研究を可能にし、インシュリン依存型糖尿病の治療のためにべータ細胞を生成するプロセスの第１のステップをも与える。
【００８４】
これは、最初に、機能的なべータ様細胞がイン・ビトロ管培養により得られることを示すものであり、膵管由来の前駆細胞の存在及び活性化を示唆し、そしてそれらの細胞の分離及び操作のための系を提供する。一の好適具体例において、主題の方法を用いて、高いパーセンテージのインシュリン産生の増大したβ−上皮細胞を含む小島様細胞クラスター（「ＩＣＣ」）を生成することができる。
【００８５】
その上、書き添えた実施例に示したように、主題の細胞性組成物を用いて、糖尿病のマウスを救済することができる。
【００８６】
従って、
一具体例において、この発明は、膵臓細胞前駆細胞を分離する方法を提供する。一般に、この方法は、膵管細胞を得るステップ；適当な栄養培地中でそれらの膵臓細胞を培養するステップ；該培養に由来する前駆細胞の集団を分離するステップを含む。好適具体例において、腺管上皮細胞を、小葉内管から得る。例えば、膵臓腺管上皮細胞を、腺管断片の酵素消化又は他の機械的分離により得ることができる。これらの膵臓腺管細胞を集密になるまで、例えば、好ましくは、単層で生育させる。生存力のある非接着性の細胞を、培養物から、適宜それを接着性上皮細胞から膵臓細胞前駆細胞の増殖／分化を誘導する薬剤で処理した後で分離することができる。下記のように、この非接着性細胞集団は、膵臓細胞前駆細胞につき富化される。
【００８７】
本発明の他の面は、ｃＡＭＰ上昇剤を用いて、膵臓細胞前駆細胞の増殖及び分化を促進させることができるという我々の発見に関係する。この点において、この発明は、膵臓細胞の増殖及び分化を、それらの糖尿病患者への移植の前に、エキソ・ビボで誘導するためのｃＡＭＰ上昇剤の利用に関係する。更に別の具体例において、この発明は、膵臓組織を移植された患者への並びに改善された膵臓性能を必要とし又は臓器の機能特にグルコース依存性のインシュリン分泌の障害を生じる危険にある患者への、ｃＡＭＰアゴニストのイン・ビボ投与を企図し、例えば、主題の方法は、予防的に用いることができる。
【００８８】
主題の方法の所定の実施態様の別の顕著な特徴は、離散した膵臓細胞前駆細胞集団を分離しかつ増殖させるために規定した培養条件を使用することに関する。
【００８９】
例えば、下記に記載する通りに、前駆細胞源管組織外植片を消化する又はその他の方法で細片にし、それにより精製された管特性をもたらし、立ち代わってそれらを培地に入れて増殖させる。膵管調剤を、培養中に膨張させて細胞の単層、例えば管上皮を形成させる。好適な実施態様では、細胞の大部分（例えば、＞２５パーセント、一層好ましくは＞１０％）は、ビメンチン陽性、非内分泌性及び増殖性である。生存可能な非接着性細胞（ＮＡＣ）をそれと違って接着性の膵細胞の培養から分離することができる。上記した通りに、これらのＮＡＣ調剤を、膵臓細胞前駆細胞について富化させる。
【００９０】
本発明者等は、また、主題の培養の管細胞、及び培養において生じるをＮＡＣを、レクチンへの結合に基づいて精製することができることも見出した。例えば、蛍光標識したレクチンを用いて、例えばＦＡＣＳ又はその他の細胞選別を容易にすることができる。その他の実施態様では、レクチンを固定する、例えばフィルター又はビーズのような固体表面上に固定するために変性しかつ細胞を親和精製するために使用することができる。これらの目的用の代表的なレクチンは、蛍光レクチン、ペルオキシダーゼ結合レクチン及びカリフォルニア、バーリンゲームのＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．により販売されるビオチニル化レクチンを含む。好適な実施態様では、レクチンは、植物レクチンであり、ピーナッツ凝集素への植物レクチンであるのが好ましい。その他の実施態様では、レクチンは、下記からなる群より選ぶ：Ａｌｅｕｒｉａ　Ａｕｒａｎｔｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＡＡＬ）；Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ　Ｃａｕｄａｔｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＡＣＬ、ＡＣＡ）；Ｂａｕｈｉｎｉａ　Ｐｕｒｐｕｒｅａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＢＰＬ、ＢＰＡ）；Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ（Ｃｏｎ　Ａ）；Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ（Ｃｏｎ　Ａ）；Ｄａｔｕｒａ　Ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＤＳＬ）；Ｄｏｌｉｃｈｏｓ　Ｂｉｆｌｏｒｕｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＢＡ）；Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ　Ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＥＣＬ、ＥＣＡ）；Ｅｕｏｎｙｍｕｓ　Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＥＥＬ）；Ｇａｌａｎｔｈｕｓ　Ｎｉｖａｌｉｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＧＮＬ）；Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）　Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｉ（ＧＳＬ　Ｉ、ＢＳＬ　Ｉ）；Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ−Ｂ４；Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）　Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ　ＩＩ（ＧＳＬ　ＩＩ、ＢＳＬ　ＩＩ）；Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＨＨＬ、ＡＬ）；Ｌｅｎｓ　Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＣＡ、ＬｃＨ）；Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＴＬ）；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｔｏｍａｔｏ）　Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＥＬ、ＴＬ）；Ｍａａｃｋｉａ　Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｉ（ＭＡＬ　Ｉ）；Ｍａａｃｋｉａ　Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　Ｌｅｃｔｉｎ　ＩＩ（ＭＡＬ　ＩＩ）；Ｍａｃｌｕｒａ　Ｐｏｍｉｆｅｒａ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｉ（ＭＰＬ）；Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ　Ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＮＰＬ、ＮＰＡ、ＤＬ）；Ｐｅａｎｕｔ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＮＡ）；Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　Ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ）；Ｐｉｓｕｍ　Ｓａｔｉｖｕｍ（ＰＳＡ）；Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｉ（ＰＴＬ　Ｉ、ＷＢＡ　Ｉ）；Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ　ＩＩ（ＰＴＬ　ＩＩ、ＷＢＡ　ＩＩ）；Ｒｉｃｉｎｕｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　Ｉ（ＲＣＡ　Ｉ、ＲＣＡ１２０）；Ｒｉｃｉｎｕｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　ＩＩ（ＲＣＡ　ＩＩ、ＲＣＡ６０、リシン）；Ｓａｍｂｕｃｕｓ　Ｎｉｇｒａ（ＥＢＬ、ＳＮＡ）；Ｓｏｌａｎｕｍ　Ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（Ｐｏｔａｔｏ）Ｌｅｃｔｉｎ（ＳＴＬ、ＰＬ）；Ｓｏｐｈｏｒａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＪＡ）；Ｓｏｙｂｅａｎ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＢＡ）；Ｕｌｅｘ　Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　Ｉ（ＵＥＡ　Ｉ）；Ｕｌｅｘ　Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ　Ａｇｇｌｕｕｔｉｎｉｎ　ＩＩ（ＵＥＡ　ＩＩ）；Ｖｉｃｉａ　Ｖｉｌｌｏｓａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＶＶＡ、ＶＶＬ）；Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）；Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；及びＷｉｓｔｅｒｉａ　Ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＷＦＡ、ＷＦＬ）。
【００９１】
所定の実施態様では、管外植片に由来する解離された単層を、Ａ２Ｂ５エピトープ、例えばＡ２Ｂ５モノクロナール抗体によって結合される能力（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ等（１９７９）ＰＮＡＳ　７６：４９１３）、又はＧＭ３もしくはＧＤ３のようなガングリオキシドのような、神経膠星状細胞上に存在するその他の糖脂質の存在によって選別することができる。
【００９２】
その上に、本発明者等は、予期されないことに、単層のような細胞を増殖させることを、そのような培養をｃＡＭＰ増大剤で処理することと組み合わせると、ＮＡＣ、例えば膵臓細胞前駆細胞の誘導の増大を生成することを見出した。よって、管細胞が増殖して集合になった（細胞が培養板の表面を覆う）時に、細胞を、培養中の所定の細胞の分化を引き起こして非接着性前駆細胞にし、引き続きインシュリン産生又はその他の内分泌細胞もしくは外分泌細胞にするために、ｃＡＭＰ増大剤で処理することができる。よって、注意深く規定した条件を培養において、組織外植片中の細胞の離散した集団を選択的に活性化するように、獲得することができる。本発明の前駆細胞及び分化された細胞を増幅させ、引き続き培養から分離することができる。
【００９３】
そのような拡大された培養手順では、商業サイズのバイオリアクター、ＯＰＴＩＣＡＬ　ＴＭ培養システム、Ｍｏｄｅｌ　５３００Ｅ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｓ．：マサチューセッツ、ウイルミントン）、又はＣＥＬＬＭＡＸ　ＴＭ　ＱＵＡＤ細胞培養システム（Ｃｅｌｌｃｏ，Ｉｎｃ．：メリーランド、ジャーマンタウン）のようなバイオリアクターに、ヒト膵細胞の一次培養を播種する。バイオリアクターを、適当に有効な濃度のマイトジェン及び適宜にｃＡＭＰ増大剤を補足した適した完全な増殖培地をまき散らす。次いで、β−上皮細胞含有島様クラスターを収穫することができる。細胞を、例えばＢｅａｔｔｉｅ等、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｉｏｎ５６：１３４０（１９９３）によって記載される通りにして低温保存した後に使用してよい。
【００９４】
培養を、１２又は２４ウェルマイクロプレートのような任意の適した培養容器中に保ってよく、かつ同じ動物から分離した細胞について典型的な培養条件下、例えば５％ＣＯ２中３７℃のような条件下に保ってよい。培養を、曝気を改善するために振盪してよく、振盪速度は、例えば１２ｒｐｍにする。
【００９５】
管培養から前駆細胞を分離するために、外植片に、外植片中の前駆細胞の内の１つ又はそれ以上の集団の増殖を引き起こす剤を接触させるのが望ましくなるのが普通である。例えば、マイトジェン、例えば有糸分裂及び細胞形質転換を誘導する物質を使用して外植片中の前駆細胞集団を検出し、かつ所望の場合には、その集団の増幅を引き起こすことができる。例示すると、成長因子の精製された又は半精製された調剤を培養に適用することができる。適用された成長因子に応答する前駆細胞の誘導は、前駆細胞の増殖によって検出することができる。しかし、下記に記載する通りに、集団の増幅は、応答性集団を分離する所定の技術を使用するために、大きい程度に起きる必要がない。
【００９６】
なお他の実施態様では、管外植片及び／又は増幅された前駆細胞を供給細胞層、例えば誘導因子を分泌する供給細胞の層又は誘導因子を含有するポリマー層上で培養することができる。例えば、添付例に記載する通りに、マトリゲル層を使用して造血前駆細胞膨張を誘導することができる。マトリゲル（マサチューセッツ、ベドフォード在Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）は、マトリックスとハツカネズミ基底膜タンパク質のエキストラクトして誘導される付随される物質との複合混合物であり、主にラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、及びニドジェンからなり、エンタクチンは、Ｋｌｅｉｎｍａｎ等、「Ｂａｓｅｍｅｎｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５巻（１９８６）、３１２〜３１８頁に記載される通りに、ＥＨＳ腫瘍から調製された。同様に、天然の細胞及び組換え処理された細胞を、本培養に供給細胞層として供することができる。
【００９７】
下記に更に詳細に記載する通りに、主題の方法は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アゴニストを使用して実施して内分泌表現型又は外分泌表現型の培養細胞の分化を誘導することができることを意図する。なお他の実施態様では、発明は、ｃＡＭＰアゴニストを、膵臓組織を移植された患者に、並びに膵性能、特にグルコース依存性インシュリン分泌を改善する必要性を有する患者にインビボ投与することを意図する。
【００９８】
本開示に鑑みて、種々の異なる小さい分子を、例えば、ｃＡＭＰ依存活性を正しく調節する日常薬物スクリーニングアッセイによって容易に識別することができることは、当業者にとって明らかであると思う。例えば、主題の方法は、アデニレートシクラーゼを活性化し得る、フォルスコリン（ＦＫ）、コレラトキシン（ＣＴ）、百日咳トキシン（ＰＴ）、プロスタグランジン（例えば、ＰＧＥ−１及びＰＧＥ−２）、コルフォルシン及びβ−アドレナリン作用レセプターアゴニストを含む化合物を使用して実施することができる。β−アドレナリン作用レセプターアゴニスト（本明細書中時には「β−アドレナリン作用アゴニスト」と呼ぶ）は、下記を含む：アルブテロール、バンブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキシエテドリン（ｄｉｏｘｅｔｈｅｄｒｉｎｅ）、ドペキサミン、エフェドリン、エピネフリン、エタフェドリン、エチルノルエピネフリン、フェノテロール、ホルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プレナルテロール、プロカテロール、プロトキロール、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール、サルメテロール、テルブタリン、トレトキノール、ツルブテロール、及びキサモテロール。
【００９９】
ｃＡＭＰホスホジエステラーゼを抑制し、それによりｃＡＭＰの半減期を増大させ得る化合物もまた主題の方法において有用である。そのような化合物は、下記を含む：アムリノン、ミルリリノン、キサンチン、メチルキサンチン、アナグレリド、シロスタミド、メドリノン、インドリダン、ロリプラム、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ケレリトリン、シロスタゾール、グルココルチコイド、グリセオン酸（ｇｒｉｓｅｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）、エタゾレート、カフェイン、インドメタシン、テオフィリン、パプベリン、メチルイソブチルキサンチン（ＭＩＸ）、及びフェノキサミン。
【０１００】
ｃＡＭＰの所定の類似体、例えばｃＡＭＰのアゴニストであるものも使用することができる。本方法において有用になり得る代表的なｃＡＭＰ類似体は、下記を含む：ジブチリル−ｃＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＰ）、（８−（４）−クロロフェニルチオ）−ｃＡＭＰ（ｃｐｔ−ｃＡＭＰ）、８−［（４−ブロモ−２，３−ジオキソブチル）チオ］−ｃＡＭＰ、２−［（４−ブロモ−２，３−ジオキソブチル）チオ］−ｃＡＭＰ、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジオクタノニル−ｃＡＭＰ、Ｓｐ−アデノシン３’：５’−サイクリックホスホロチオエート、８−ピペリジノ−ｃＡＭＰ、Ｎ６−フェニル−ｃＡＭＰ、８−メチルアミノ−ｃＡＭＰ、８−（６−アミノヘキシル）アミノ−ｃＡＭＰ、２’−デオキシ−ｃＡＭＰ、Ｎ６，２’−Ｏ−ジブトリル−ｃＡＭＰ、Ｎ６，２’−Ｏ−ジスクシニル−ｃＡＭＰ、Ｎ６−モノブチリル−ｃＡＭＰ、２’−Ｏ−モノブチリル−ｃＡＭＰ、２’−Ｏ−モノブトリル−８−ブロモ−ｃＡＭＰ、Ｎ６−モノブトリル−２’−デオキシ−ｃＡＭＰ、及び２’−Ｏ−モノスクシニル−ｃＡＭＰ。
【０１０１】
主題の方法において有用な上に列挙した化合物を、化合物の生物学的利用能、活性、又はその他の薬理学的に関連のある性質を増大させるために改質してよい。例えば、フォルスコリンは、下記式を有する：
【化１】
Figure 2004505627
【０１０２】
フォルスコリンの親水性を、所望する生物学的活性をひどく減じないで増大させることが分かったフォルスコリンの改質は、Ｃ６及び／又はＣ７におけるヒドロキシルを（アセチル基を除いた後に）親水性アシル基によってアシル化することを含む。Ｃ６を親水性アシル基によってアシル化した化合物では、Ｃ７は随意に脱アセチル化されてよい。適した親水性アシル基は、構造−（ＣＯ）（ＣＨ２）ｎＸを有する基を含み、構造中、ＸはＯＨ又はＮＲ２であり；Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、或はＲは、一緒になって原子３〜８、好ましくは原子５〜７を含む環を形成し、ヘテロ原子を含んでよく（例えば、ピペラジン又はモルホリン環）；ｎは１〜６、好ましくは１〜４、更に一層好ましくは１〜２の整数である。その他の適した親水性アシル基は、親水性アミノ酸又はそれらの誘導体、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、等のようなものを含み、複素環式側鎖を有するアミノ酸を含む。フォルスコリン又は上に列挙したその他の化合物、それらを当業者に知られているその他の可能な親水性アシル側鎖によって改質したものは、本方法において容易に合成しかつ活性をテストしてよい。
【０１０３】
同様に、上に列挙した化合物の内のいずれかの変種又は誘導体は、主題の方法においてｃＡＭＰアゴニストとして有効になり得る。当業者ならば、そのような誘導体を容易に合成しかつ適した活性をテストすることができると思う。
【０１０４】
所定の実施態様では、主題のｃＡＭＰアゴニストは、ｃＡＭＰ活性化についてのそれらの選択性に基づいて選ぶことができる。
【０１０５】
所定の実施態様では、上記のｃＡＭＰアゴニスト、好ましくは異なるタイプのｃＡＭＰアゴニストの内の二種又はそれ以上を投与するのが有利になり得る。例えば、アデニレートシクラーゼアゴニストをｃＡＭＰホスホジエステラーゼアゴニストと共に使用すると、有利な又は相乗効果を有し得る。
【０１０６】
所定の好適な実施態様では、主題の剤は、有効なｃＡＭＰレベルをＥＤ５０１ｍＭ又はそれ以下、一層好ましくは１μＭ又はそれ以下、更に一層好ましくは１ｎＭ又はそれ以下で上げる。
【０１０７】
主題の方法の所定の実施態様では、培養中の細胞の成長状態、例えば細胞増殖、分化及び／又は細胞死をモニターするのが望ましいであろう。細胞増殖を測定する方法は、当分野で良く知られており、細胞の複製を特徴とするＤＮＡ合成を求めることを含むのが最も一般的である。ＤＮＡ合成を測定する方法は、当分野に多数存在し、それらの内の任意のものを発明に従って用いてよい。発明の実施態様では、ＤＮＡ合成は、免疫螢光法によって検出するために放射性標識（３Ｈ−チミジン）又は標識ヌクレオチド類似体（ＢｒｄＵ）を使用して求めた。
【０１０８】
しかし、ＤＮＡ合成を測定するのに加えて、応答性前駆細胞集団を分離するための基準として、形態学的変化に基づくことができ、形態学的変化に基づくことになるのが好ましい。例えば、添付例に記載する通りに、本発明者等は、所定の成長因子が、管外植片において前駆細胞の増幅を引き起こし、それで肉眼又は鏡検法によって容易に検出することができる構造を形成するようにすることを観測した。典型的な実施態様では、増殖し、引き続き外植片、例えば芽又はブレブから外殖を形成することによって成長因子に応答するそれらの前駆細胞を容易に検出することができる。別の例示の実施態様では、その他の構造上の変化、例えば増殖細胞の光学密度の変化をコントラスト鏡検法によって検出することができる。
【０１０９】
更に例示すると、ＩＣＣをブロモデオキシウリジン（「ＢｒｄＵ」）と共にインキュベートし、ホルムアルデヒド中に固定化し、パラフィン中に埋め込み、切断することができる。セクションを、例えばＥｒｂｅｒ等、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．８８：４３（１９８７）によって記載されるイムノアルカリホスファターゼ技術を用い、ポリクローナルモルモット抗−ブタ（ａｎｔｉ−ｐｏｒｃｉｎｅ）インシュリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；カリフォルニア、エルセクンド）を一次抗体として使用してインシュリンについて染色することができる。
【０１１０】
ＤＮＡ合成の間にＢｒｄＵを組み込んだ細胞核を、マウスモノクローナル抗−ＢｒｄＵ（Ｄａｋｏ；カリフォルニア、カーピンタリア）を使用して識別し、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ等、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）のイムノ−ペルオキシド技術によって検出した後に、ヘマトキシリン対比染色することができる。
【０１１１】
上皮細胞を、分離したセクション上でマウスモノクローナル抗−上皮抗原抗体（Ｂｅｒ−ＥＰ４、Ｄａｋｏ、上記）を一次抗体として使用して識別することができる。
【０１１２】
インシュリン陽性の上皮細胞の表面積を、全ＩＣＣ領域のパーセントとして計算し、これらをコンピュータ化されたイメージ分析計（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｎｏｖｉｓｉｏｎ；カリフォルニア、サンジェゴ）によって定量化することができる。同じ方法を、ＢｒｄＵ標識指数を求めるために使用することができる。インシュリン及びＢｒｄＵの両方について陽性な細胞もまた、２つの抗原を二重に染色した後に、同じサンプルの分離したセクションにおいて記録してよい。
【０１１３】
平均の細胞サイズは、全ＩＣＣ領域対核の数の比によって計算することができる。
【０１１４】
平均のベータ−細胞サイズは、個々のインシュリン陽性細胞の表面積を測定することによって推定することができる。
【０１１５】
サンプルの生物学的及び実験的変動性の補正を行なうために、各々のサンプルについて十分な数のＩＣＣセクション（少なくとも１５）及び核（少なくとも１０００）を分析すべきである。
【０１１６】
更に例示すると、下記の例は、管外植片が成長因子応答性前駆細胞タイプを含有することを立証する。更に、異なる成長因子が管組織外植片内の前駆細胞の別個の集団を誘導／増幅して増殖させることができることを立証する。これは、別個の前駆細胞集団の表面上に特異的成長因子が存在することを示す。これは、これらのレセプターの発現が興味のある前駆細胞集団にマークを付けることから重要である。モノクローナル抗体は、特定の細胞系列及び／又は分化の段階に関係するマーカー（表面膜タンパク質、例えばレセプター）を識別するために特に有用である。主題の前駆細胞を分離する手段は、抗体被覆磁気ビーズ、アフィニティークロマトグラフィー、及び固体マトリックス、例えば板に結合された抗体による「パニング」又はその他の簡便な技術を使用した、磁気分離を含み得る。精確な分離をもたらす技術は、蛍光活性化細胞選別を含み、これは、変化する度合いの複雑化、例えば複数の色チャンネル、低角度及び鈍い光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル、等を有することができる。
【０１１７】
簡便には、抗体に、直接分離を可能にする磁気ビーズ、支持材に結合されたアビジン又はストレプトアビジンによって除くことができるビオチン、蛍光活性化細胞選別機によって使用することができる蛍光色素、等のようなマーカーを結合して特定の細胞タイプの分離の容易を可能にしてよい。細胞の成育可能性に過度に不利にならない任意の技術を採用してよい。
【０１１８】
例示の実施態様では、主題の前駆細胞上に存在する成長因子レセプターについての抗体の内のいくつかは市販されており（例えば、ＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター及び／又はＴＧＦレセプターについての抗体）、その他の成長因子レセプターについては、抗体は、当業者に良く知られた技術によって造ることができる。当業者は、関心のある前駆細胞を分離するために抗体を使用するのに加えて、また、例えば細胞を標識して「パンニング」プロセスを可能にするのに成長因子それら自体を使用することもできる。
【０１１９】
本発明の前駆細胞は、分離する際に、更に下記の方法で特性表示することができる：成長因子への応答性、特異的遺伝子発現、そのような細胞の表面上の抗原マーカー及び／又は基礎的形態学。
【０１２０】
例えば、成長因子応答性の程度、例えばそれらが応答することになる成長因子の濃度範囲、最大及び最小応答、並びにその他のどんな成長因子及び条件にそれらが応答し得るかを使用して主題の前駆細胞を特性表示することができる。
【０１２１】
その上に、分離された前駆細胞は、膵臓について発育している（すなわち、幹又は前駆）細胞にマークを付けることが知られている遺伝子の発現によって特性表示することができる。
【０１２２】
主題の前駆細胞は、一旦分離しかつ特性表示したら、更に分化して特異的細胞系列にさせることができる条件下で培養することができる。これは、展開することができる誘導のパラダイムによって達成することができる。例えば、主題の前駆細胞は、対応する胚組織と再び組み合わせて胚組織が成細胞を指示して共発育（ｃｏｄｅｖｅｌｏｐ）及び共分化（ｃｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）させることができるかどうかを見ることができる。代わりに、前駆細胞を一種又はそれ以上の成長因子又は分化因子に接触させ、細胞の分化を誘導することができる。例えば、細胞を、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、Ｄｉ−ｂｕｔｙｒｌ、ｃＡＭＰ、Ｎａ−Ｂｕｔｙｒａｔｅ、デキサメタゾン又はコレラトキシンのような作用薬、或はＤＶＲ亜科メンバーのようなＴＧＦβのような成長因子によって処理することができる。ｃＡＭＰ上昇剤及びＰＹＹを含む培地は、様々な膵臓細胞型への分化を促進することが認められてきた。好適な培地は、少なくとも１％、２％、３％、４％の又は少なくとも５％の濃度のウシ胎児血清を含む。接着性マトリクスは又、分化の促進にも助成することができる。好適な接着性マトリクスには、膀胱癌細胞株に由来するＨＴＢ９及びマウス肉腫に由来するマトリゲルが含まれる。
【０１２３】
更なる具体例において、この発明は、増殖中の前駆細胞の種々の成長因子での処理が、それらの細胞に、分化濃度にさらした後に種々の分化した細胞型を生じさせるという観察を提供する。例えば、成長培地に投与されたＬＩＦは、分化に際して、ソマトスタチンを発現する細胞の形成を促進する。他の例として、成長培地に投与されたＫＯ−ＳＲは、グルカゴンを発現する細胞の形成を促進する。ＫＯ−ＳＲは、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから供給されているノックアウト（商標）血清代替品である。ＫＯ−ＳＲは、ＦＢＳの代りとなるようにデザインされており、Ｇｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍ．， Ｔｉｌｋｉｎｓ，Ｍ．Ｌ．， Ｐｒｉｃｅ，Ｐ．， Ｌｏｂｏ−Ａｌｆｏｎｓｏ，Ｊ．， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．， Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｍ．， Ｍｅｎｅｓｅｓ，Ｊ．， Ｐｅｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．， Ｋｏｌｌｅｒ，Ｂ．及びＬａｔｏｕｒ，Ａ．（１９９８） Ｆｏｃｕｓ（登録商標）２０，８に更に説明されている限定された成分の混合物である。
【０１２４】
例示の実施態様では、肝細胞核因子（ＨＮＦ）転写因子系統、例えばＨＮＦ１−４は、膵臓発育の間種々の細胞タイプにおいて種々の時に発現されることが知られている。例えば、前駆細胞は、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ３γ、及び／又はＨＮＦ４のような一種又はそれ以上のＨＮＦタンパク質を発現し得る。グルコーストランスポータＧｌｕｔ２もまた両方の初期の膵細胞についてのマーカーである。ｆｋｈ−１等のような「フォークヘッド」転写因子の内のいくつかは、初期の腸管組織におけるマーカーになると理解される。
【０１２５】
別の例示の実施態様では、ＳＴＦ−１（ＩＰＦ−１、ＩＤＸ−１又はＰＤＸとしても知られている）のようなホメオドメインタイプ転写因子は、最近になって、発育中の膵臓の異なる集団にマークを付けることが示された。いくつかのＬＩＭ遺伝子もまたインシュリン遺伝子発現を調節することが示されてきており、またプロト分化されたβ膵島細胞についてのマーカーになろう。同様に、ＰＡＸ６遺伝子のようなＰＡＸ遺伝子の内のいくつかは、膵臓形成の間に発現され、所定の膵臓細胞前駆細胞集団を特性表示するのに使用され得る。膵臓細胞前駆細胞のその他のマーカーは、膵特異的転写因子ＰＴＦ−１、ｈＸＢＰ−１、等を含む。その上に、ＨＮＦタンパク質の内のいくつかは、初期の膵臓発達の間に発現され、膵臓細胞前駆細胞用マーカーとして使用され得る。
【０１２６】
膵細胞を生じる前駆細胞は、また、ビリン及び／又はチロシンヒドロキシラーゼのようなマーカーを発現し、並びにインシュリン、グルカゴン及び／又は神経ペプチドＹのような因子を分泌し得る。
【０１２７】
ＮＡＣにおいて記録されることができるその他のマーカーは、下記を含む：Ｒａｂ３Ａ（Ｚａｈｒａｏｕｉ等（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１２：３９４；Ｂａｌｄｉｎｉ等（１９９５）ＰＮＡＳ　９２：４２８４）；ベシクル関連膜タンパク質２（ＶＡＭＰ２、フジターヨシガキ等（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１３１３０；及びＮｉｅｌｓｅｎ等（１９９５）Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　９６：１８３４）；アミリン、及び／又はＡ２Ｂ５（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ等（１９７９）ＰＮＡＳ　７６：４９１３）。
【０１２８】
その他の実施態様では、管上皮細胞、並びにおそらくそれらから生じる膵前駆細の主題の培養は、レクチン、好ましくは植物レクチン、一層好ましくはピーナッツ凝集素に結合することを特徴とする。好適な実施態様では、ピーナッツ凝集素である。その他の実施態様では、レクチンは、下記からなる群より選ぶ：Ａｌｅｕｒｉａ　Ａｕｒａｎｔｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＡＡＬ）；Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ　Ｃａｕｄａｔｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＡＣＬ、ＡＣＡ）；Ｂａｕｈｉｎｉａ　Ｐｕｒｐｕｒｅａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＢＰＬ、ＢＰＡ）；Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ（Ｃｏｎ　Ａ）；Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ（Ｃｏｎ　Ａ）；Ｄａｔｕｒａ　Ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＤＳＬ）；Ｄｏｌｉｃｈｏｓ　Ｂｉｆｌｏｒｕｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＢＡ）；Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ　Ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＥＣＬ、ＥＣＡ）；Ｅｕｏｎｙｍｕｓ　Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＥＥＬ）；Ｇａｌａｎｔｈｕｓ　Ｎｉｖａｌｉｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＧＮＬ）；Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）　Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｉ（ＧＳＬ　Ｉ、ＢＳＬ　Ｉ）；Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ−Ｂ４；；Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）　Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ　ＩＩ（ＧＳＬ　ＩＩ、ＢＳＬ　ＩＩ）；Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＨＨＬ、ＡＬ）；Ｌｅｎｓ　Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＣＡ、ＬｃＨ）；Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＴＬ）；　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｔｏｍａｔｏ）　Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＥＬ、ＴＬ）；Ｍａａｃｋｉａ　Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｉ（ＭＡＬ　Ｉ）；Ｍａａｃｋｉａ　Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　Ｌｅｃｔｉｎ　ＩＩ（ＭＡＬ　ＩＩ）；Ｍａｃｌｕｒａ　Ｐｏｍｉｆｅｒａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＭＰＬ）；Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ　Ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＮＰＬ、ＮＰＡ、ＤＬ）；Ｐｅａｎｕｔ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＮＡ）；Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　Ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ）；Ｐｉｓｕｍ　Ｓａｔｉｖｕｍ（ＰＳＡ）；Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｉ（ＰＴＬ　Ｉ、ＷＢＡ　Ｉ）；Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ　ＩＩ（ＰＴＬ　ＩＩ、ＷＢＡ　ＩＩ）；Ｒｉｃｉｎｕｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　Ｉ（ＲＣＡ　Ｉ、ＲＣＡ１２０）；Ｒｉｃｉｎｕｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　ＩＩ（ＲＣＡ　ＩＩ、ＲＣＡ６０、リシン）；Ｓａｍｂｕｃｕｓ　Ｎｉｇｒａ（ＥＢＬ、ＳＮＡ）；Ｓｏｌａｎｕｍ　Ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（Ｐｏｔａｔｏ）Ｌｅｃｔｉｎ（ＳＴＬ、ＰＬ）；Ｓｏｐｈｏｒａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＪＡ）；Ｓｏｙｂｅａｎ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＢＡ）；Ｕｌｅｘ　Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　Ｉ（ＵＥＡ　Ｉ）；Ｕｌｅｘ　Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ　Ａｇｇｌｕｕｔｉｎｉｎ　ＩＩ（ＵＥＡ　ＩＩ）；Ｖｉｃｉａ　Ｖｉｌｌｏｓａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＶＶＡ、ＶＶＬ）；Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　（ＷＧＡ）；Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；及びＷｉｓｔｅｒｉａ　Ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＷＦＡ、ＷＦＬ）。
【０１２９】
例えば、添付図に示す通りに、ヒトの膵臓の種々の成分を異なるレクチンによってマークを付けることができる。ＤＳＬは、小葉間導管及び小葉内管にマークを付ける。ＬＣＡは、間葉にマークを付けるようである。ＥＣＬは、一層大きな管にマークを付けないで、小葉内管にマークを付ける。Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎは、主管細胞のサブセットにマークを付け、ＷＧＡに比べて極めて制限される。
【０１３０】
他の例において、哺乳動物の血液細胞は、ここに与えた方法により幹細胞を得るために利用することができる。血液に由来する幹細胞は、非常に多様な細胞型を与えることができる。血液細胞の３つの主要な細胞系統には、リンパ細胞系統（例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞）、骨髄細胞系統（例えば、単球、顆粒球及び巨核球）及び赤血球細胞系統（例えば、赤血球細胞）が含まれる。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、同等の多能性の娘細胞を生成することに加えて、上記の細胞系統の内の少なくとも２種の細胞を生じさせることのできる細胞である。好適具体例において、ＨＳＣは、３つの主要な血液細胞系統を生じさせることができる。
【０１３１】
ＨＳＣは、様々な組織型の懸濁液から分離することができる。骨髄細胞は、ＨＳＣの優れた源である。骨髄細胞は、骨髄の源例えば腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎骨の棘突起、又は他の骨の窩洞から得ることができる。他のヒト造血幹細胞の源には、胚の卵黄嚢、胎児肝及び成体脾臓、血液（成体末梢血及び臍帯血を含む）が含まれる。
【０１３２】
ＨＳＣは、それらが生じさせる細胞型及び様々な細胞学的マーカーの両方によって同定することができる。ＨＳＣは、しばしば、ある種の色素例えばＨｏｅｃｈｓｔ ３３３２４及びローダミン１２３（Ｂｈａｔｉａ等（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：１０３８）を押し出す。かかる色素染色特性は、循環系の他の細胞の中でＨＳＣを同定するのに利用することができる。ある種の細胞マーカーと反応する抗体も又、ＨＳＣを同定して精製するのに利用することができる。例えば、ｍＡｂ ＡＣ１３３は、ＨＳＣに特異的に結合すると考えられている（Ｍｉｒａｇｌｉａ等（１９９７） Ｂｌｏｏｄ ９０：５０１３）。Ｔｈｙ−１分子は、ラット、マウス及びヒトの脳及び造血系に存在する高度に保存されたタンパク質である。このＴｈｙ−１分子は、ラット、マウス及びヒトのＨＳＣにおいて同定されており、ＨＳＣの同定に有用でありうる（米国特許第５，９１４，１０８号）。多くのＨＳＣは、ＣＤ３４＋及び／又はＣＤ３８＋でもある（米国特許第５，８４０，５８０号）。ＨＳＣ集団は、しばしば、細胞表面マーカーに幾つかの変化を有し、陽性の同定は、少なくとも２つの上記の細胞学的マーカーの存在に基づいて行なわれる。
【０１３３】
ＨＳＣは又、他の一層分化した細胞型から、ある種のマーカーの非存在によって区別することができる。ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３は、すべて典型的にはＨＳＣに存在しない。上記のマーカーの幾つかの非存在は、ＨＳＣの同定に信頼性を追加する。形態も又、上記のようなＨＳＣの区別を助ける。
【０１３４】
ＨＳＣが、複数の特性例えば形態、ある種のマーカーの存在及び他のマーカーの非存在の集合によって同定することができるということは理解される。陽性の同定は、典型的には、上記のマーカーのすべての検出を必要としない。
【０１３５】
分化した幹細胞を生じさせるＨＳＣの培養は、多くの方法において達成することができる。例えば、細胞は、限定され、富化された培地例えばイスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（一般に、塩、アミノ酸、ビタミン、抗生物質及びウシ胎児血清よりなる）中で培養することができる。ヒドロコルチゾンを補った培養は、骨髄細胞を生じさせる傾向があるが、コルチゾンを欠く培養は、Ｂリンパ球を生じさせる傾向がある。ＨＳＣが赤血球細胞系統の細胞において発生することができるということを示すために、様々な慣用の方法を利用することができる。例えば、メチルセルロース培養での培養は、赤血球細胞の形成を刺激する。（米国特許第５，８４０，５８０及び５，９１４，１０８号；Ｍｅｔｃａｌｆ（１９７７） Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ， ｐ１−２２７）。
【０１３６】
更なる例において、幹細胞は、肝臓組織から分離することができる。かかる細胞は、ある種のマーカーによって同定することができる。かかる細胞は、典型的には、Ｓｃａ−１及びｃ−ｋｉｔを発現するが、Ｌｉｎは発現しない。
【０１３７】
別の好適な実施態様では、主題の前駆細胞は、当分野で使用される多数の再生モードの内の一つ、例えば宿主動物の部分膵臓切除又はストレプトゾシン治療又は骨髄細胞を殺す照射を受けた宿主動物中に移植することができる。
【０１３８】
よって、本発明の別の態様は、主題の前駆細胞の子孫、例えば初期の外植片培養の細胞に由来したそれらの細胞に関係する。そのような子孫は、前駆細胞の後世代、並びに主題の前駆細胞を外植片から分離した後に分化を誘導することによって発生される系列が決定された細胞、例えばインビトロで誘導された細胞を含むことができる。
【０１３９】
この発明の他の面は、前駆細胞又はその子孫について富化された細胞性組成物に関係する。ある具体例においては、これらの細胞は、医薬調製物の、例えば、無菌の、望ましくないウイルス、細菌及び他の（ヒトの）病原体を含まず並びに発熱物質を含まない医薬調製物の部分として与えられる。即ち、ヒトへの投与のために、これらの主題の細胞調製物は、ＦＡＤ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄにより求められる無菌、発熱性、一般的安全性及び純度標準を満たすべきである。
【０１４０】
ある具体例において、かかる細胞性組成物を、動物への、好ましくは哺乳動物への、一層好ましくはヒトへの移植のために利用することができる。これらの細胞は、移植の宿主に関して、自家の、同種異系の又は異種のものであってよい。一の面において、本発明は、１型糖尿病を治療するための胎児膵臓細胞又は成熟膵臓細胞の移植に関係する。
【０１４１】
本発明のなお別の態様は、主題の前駆細胞、又はそれらの子孫の実質的に純粋な調剤を細胞成分として含む細胞組成物に関係する。本発明の細胞組成物は、前駆細胞の実質的に純粋な集団を含むばかりでなく、また細胞培養成分、例えばアミノ酸、金属、コエンザイム因子、並びに非前駆細胞の小さな集団、例えばそれらの内のいくつかは、発明の分離された前駆細胞を引き続き分化することによって生じ得るものを含む培地も含むことができる。その上に、その他の非細胞成分は、細胞成分を特定の環境、例えば移植、例えば連続培養下で支持体用に適したものにするものを含む。
【０１４２】
本発明の前駆細胞を被験者、特にヒト被験者に投与する一般的な方法を、本明細書中に詳細に記載し、該方法は、細胞を被験者内の標的部位に注入又は移植することを含むので、発明の細胞を、細胞を被験者の中に注入又は移植することによって導入を助成する送達装置の中に入れることができる。そのような送達装置は、細胞及び流体を受容被験者の体内に注入するためのチューブ、例えばカテーテルを含む。好適な実施態様では、チューブは、加えて針、例えば注射器であって、それを通して発明の細胞を被験者の所望の場所に導入することができるものを有する。発明の前駆細胞は、異なる形態でそのような送達装置、例えば注射器の中に入れることができる。例えば、細胞は、そのような送達装置に入れる時に、溶液に懸濁させ又は支持体マトリックスに埋め込むことができる。本明細書中で用いる通りの「溶液」なる用語は、製薬上許容し得るキャリヤー又は希釈剤であって、その中で発明の細胞が生存可能なままであるものを含む。製薬上許容し得るキャリヤー及び希釈剤は、食塩水、緩衝水溶液、溶媒及び／又は分散媒体を含む。そのようなキャリヤー及び希釈剤の使用は、当分野で良く知られている。溶液は、滅菌しておりかつ容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるのが好ましい。溶液は、製造及び貯蔵の条件下で安定性でありかつ例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等を使用することによってバクテリアやカビのような微生物の汚染作用に対して保護するのが好ましい。発明の溶液は、本明細書中に記載する通りの前駆細胞及び必要とする通りに、上に列挙したその他の成分を製薬上許容し得るキャリヤー又は希釈剤中に組み込んだ後に、ろ過滅菌することによって調製することができる。
【０１４３】
前駆細胞を組み込む又は埋め込むことができる支持体マトリックスは、受容体適合性でありかつ分解して受容体に有害でない生成物になるマトリックスを含む。天然の及び／又は合成の生分解性マトリックスは、そのようなマトリックスの例である。天然の生分解性マトリックスは、血漿凝塊、例えば哺乳動物に由来するもの及びコラーゲンマトリックスを含む。合成の生分解性マトリックスは、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸のような合成ポリマーを含む。合成ポリマー及び細胞をこれらのマトリックス中に組み込む又は埋め込む方法のその他の例は、当分野で知られている。例えば、米国特許第４，２９８，００２号及び同第５，３０８，７０１号を参照。これらのマトリックスは、インビボで脆弱な前駆細胞についての支持体及び保護となり、従って、前駆細胞を受容被験者中に導入する好適な形態である。
【０１４４】
本発明は、また、膵臓の不十分な機能に伴う種々の障害を治療するために治療上使用することができる実質的に純粋な前駆細胞も提供する。
【０１４５】
例示すると、主題の前駆細胞は、外分泌及び内分泌の両方の種々の膵臓障害を治療又は予防する際に使用することができる。例えば、前駆細胞を使用して分化された膵細胞の集団を部分膵切除、例えば膵臓の一部を除去した後に修復するために産生することができる。同様に、そのような細胞集団は、膵臓組織崩壊、例えば膵炎、例えば酵素が物質の中に逃避することによって引き起こされる膵臓組織の自己分解による症状のような膵臓組織の破壊による膵臓組織損失を再生する又は膵臓組織損失に代えるのに使用することができる。
【０１４６】
代表的な実施態様では、主題の前駆細胞は、任意のインシュリン欠乏障害に悩む患者のために提供することができる。例えば、毎年７２８，０００を超える糖尿病の新しいケースが診断され、１５０，０００のアメリカ人が糖尿病及びその合併症で死亡し；合衆国における年の全コストは、２００億ドルを超える（Ｌａｎｇｅｒ等（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６０：９２０−９２６）。糖尿病は、膵島が破壊し又は機能障害になりグルコース制御の損失に至ることを特徴とする。真性糖尿病は、慢性的に高いレベルの血糖（高血糖）が存在することによって定義される代謝障害である。インシュリン依存性（タイプ１）真性糖尿病（「ＩＤＤＭ」）は、膵β−細胞の自己免疫媒介破壊から生じ、その結果インシュリン産生を失って高血糖を生じる。タイプ１糖尿病は、生存を確実にするのにインシュリン代償療法を要する。非インシュリン依存性（タイプ２）真性糖尿病（「ＮＩＤＤＭ」）は、初めに、正常よりも高いレベルの血漿インシュリン（高インシュリン血症）の存在における高血糖を特徴とする。タイプ２糖尿病では、炭化水素代謝を制御する組織プロセスは、インシュリンへの感応性が低下したと考えられる。タイプ２糖尿病状態の進行は、血糖の濃度増大に関係しかつグルコース誘導インシュリン分泌速度の相対的低下に結び付けられる。
【０１４７】
両方の形態の真性糖尿病における治療の主目的は、同じである、すなわち血糖レベルをできるだけ正常近くに下げることである。タイプ１糖尿病の治療は、代償量のインシュリンを投与することを伴う。対照して、タイプ２糖尿病の治療は、インシュリンを投与することを要しない。例えば、タイプ２初期治療法は、ダイエット及びスルホニル尿素のような経口低血糖症剤による療法によって増強されるライフスタイル変化に基づき得る。しかし、特に糖尿病の後者の段階では、島消耗から生じ得る糖尿病の合併症を最少にしようと試みて高血糖の制御を生じるのに、インシュリン治療法を要し得る。
【０１４８】
一層最近になって、治療への組織工学的アプローチは、健康な膵島を、通常免疫拒絶を回避するために膜に被包して移植することに焦点を合わせてきた。３つの一般的なアプローチが、動物モデルにおいてテストされた。初めに、管状膜を、島を収容したハウジング内で螺旋状に巻く。膜をポリマーグラフに接続し、これは、立ち代わって装置を血管につなげる。グルコース及びインシュリンを膜を前後に通して自由に拡散させることを可能にし、更に抗体及びリンパ球の通過をブロックするように、膜透過度を操作することによって、この装置で処置した膵切除された動物において正常血糖が保たれた（Ｓｕｌｌｉｖａｎ等（１９９１）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：７１８）。
【０１４９】
第二のアプローチでは、島細胞を含有する中空ファイバーを多糖アルギネート中に固定化させた。装置を糖尿病動物の腹腔内に入れた時に、血糖レベルが低下され、良好な組織適合性が観測された（Ｌａｃｅｙ等（１９９１）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：１７８２）。
【０１５０】
最後に、細胞をアルギネート又はポリアクリレートで構成されるマイクロカプセルに入れた。これらのマイクロカプセルで治療された動物は、２年を超えて正常血糖を保つ場合がいくつかあった（Ｌｉｍ等（１９８０）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１０：９０８；Ｏ’Ｓｈｅａ等（１９８４）　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｃｈｙｓ．Ａｃｔａ．８４０：１３３；スガモリ等（１９８９）　Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ　３５：７９１；Ｌｅｖｅｓｑｕｅ等（１９９２）　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３０：６４４；及びＬｉｍ等（１９９２）　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　５３：１１８０）。しかし、これらの移植戦略のすべては、ドナー島の大きな信頼し得る源を必要とする。
【０１５１】
発明の前駆細胞は、分化して膵系列の細胞、例えばβ島細胞になる能力を有することから、糖尿病を治療するために使用することができる。発明の前駆細胞は、更にこれらの細胞を成熟した膵細胞に分化させることができる条件下でインビトロ培養することができ、又はそれらは、一度被験者に導入された分化をインビボで受けることができる。細胞を被包する方法は多数当分野で知られている。例えば、インシュリンを産生するβ島細胞の源が移植可能な中空ファイバー中に被包される。そのようなファイバーは、予備紡糸され、次いでβ島細胞が添加されることができ（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ等の米国特許第４，８９２，５３８号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ等の米国特許第５，１０６，６２７号；Ｈｏｆｆｍａｎ等（１９９０）　Ｅｘｐｔ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１０：３９−４４；Ｊａｅｇｅｒ等（１９９０）　Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．８２：４１−４６；及びＡｅｂｉｓｃｈｅｒ等（１９９１）　Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ．１１３：１７８−１８３）、又はβ島細胞の回りにポリマーコートを形成するように作用するポリマーと共に同時押し出しされることができる（Ｌｉｍ等の米国特許第４，３９１，９０９号；Ｓｅｆｔｏｎの米国特許第４，３５３，８８８号；スガモリ等（１９８９）　Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ　３５：７９１−７９９；Ｓｅｆｔｏｎ等（１９８７）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２９：１１３５−１１４３；及びＡｅｂｉｓｃｈｅｒ等（１９９１）　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１２：５０−５５）。
【０１５２】
ある具体例において、この発明のこれらの細胞は、例えば肝臓の病気又は血液細胞の不十分な生成の病気例えば血小板減少症、貧血症の治療又は放射線療法の患者への移植のためにも利用することができる。
【０１５３】
ある具体例において、この発明のこれらの細胞は又、例えば心臓発作又はウイルス感染後の心筋のダメージの治療にも利用することができる。
【０１５４】
ある具体例において、この発明のこれらの細胞は又、骨格筋の退行又はダメージの病気例えば筋ジストロフィーの治療にも利用することができる。
【０１５５】
その上に、移植可能な源を前駆細胞集団か又はそれの分化された子孫のいずれかの形態で提供するのに加えて、主題の細胞は、膵細胞の培養を分泌された因子を産生しかつ精製するために製造するのに使用することができる。例えば、培養された細胞をインシュリンの源として提供することができる。同様に、外分泌培養をパンクレアチン用源として提供することができる。
【０１５６】
本発明のなお別の態様は、種々の化合物を、膵管上皮培養からの別個の膵細胞集団の成長、増殖又は分化を調節するそれらの能力についてスクリーンする方法を提供する。例示の実施態様では、主題の前駆細胞、及びそれらの子孫は、種々の化合物又は天然生成物をスクリーンするのに使用することができる。そのような外植片を最少培地中に長い期間（例えば、７〜２１又はもっと長い間）保つことができ、そのような外植片に任意の化合物、例えば小さい分子又は天然生成物、例えば成長因子を接触させてそのような化合物が外植片における前駆細胞の細胞成長、増殖又は分化の内の一つに与える作用を求めることができる。所定の化合物に応答するこれらの細胞の成長、増殖又は分化の検出及び定量化は、所定の管外植片における成長、増殖又は分化の内の一つを誘導する点での化合物の効能を求める手段となる。細胞増殖を測定する方法は、当分野で良く知られており、細胞複製を特徴とするＤＮＡ合成を求めることを含むのが最も一般的である。ＤＮＡ合成を測定する方法は、当分野に多数存在し、それらの内の任意のものを発明に従って用いてよい。発明の実施態様では、ＤＮＡ合成は、ＤＮＡ合成は、免疫蛍光検査によって検出するために放射線標識（３Ｈ−チミジン）又は標識ヌクレオチド類似体（ＢｒｄＵ）を使用して求めた。化合物の効能は、種々の濃度の化合物を使用して得られたデータから投与量応答カーブを発生することによって評価することができる。また、対照アッセイを実施して比較のための基線を供することもできる。所定のテスト剤に応答して増幅される前駆細胞集団の識別を、上記したような表現化に従って実施することができる。
【０１５７】
（ｉｖ）例証
今、発明を一般的に記載し、発明は、下記に例を参照することによって一層容易に理解されるものと思う。下記の例は、単に本発明の所定の態様及び実施態様を例示するために含むもので、発明を制限することを意図しない。
【０１５８】
例１：膵臓細胞前駆細胞の分離
方法
管分離及び培養
２リットルの２週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの子から膵臓を分離し、１０ｍｌの（ＤＭＥＭ中１Ｕ／ｍｌ）Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ａ（セントルイス、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中に入れ、振盪水浴中で１５０−１７５ｒｐｍで３７℃において４０分間消化した。その消化物を短時間旋回させ、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋の存在しないＨＢＳＳ（ニューヨーク、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）で一度洗浄した。ペレットをＨＢＳＳ中に再懸濁させ、５００μｍメッシュ（マサチューセッツ、ケンブリッジ、Ｃｏｓｔａｒ　Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通してろ過し、再び洗浄した。ペレットを再懸濁させてＨＢＳＳ中５０ｍｌにし；１０ｍｌを１０ｃｍ培養板（Ｃｏｓｔａｒ　Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移して解剖スコープ下に置いた。個々の管断片をマイクロピペットで吸引することによって選定し、血清を有する培地を収容する板に移した。この板から断片を再び選定し、培地及び血清のフレッシュチューブに移し、洗浄した後に平板固定した。断片を、プスチック上でＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）５％、グルタミン及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）１％を含有するＩｓｃｏｖｅｉｓ改質ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で培養した。個々の管断片を研究するために、管を８ウェル室スライド（イリノイ、ナパービル、Ｌａｂ−Ｔｅｋ）上で増殖させた。単層又はＮＡＣを発生させるために、管断片を調剤当たり４つの４−ウェル板（Ｎｕｎｃ）に平板固定した。ＮＡＣの誘導は、ＦＢＳ５％、グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ及びＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）、Ｃｈｏｌｅｒａ　Ｔｏｘｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）並びにＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）に合流した後（通常培養において５日）に培地変化によって達成された。４８時間後に、ＮＡＣが収穫された。
【０１５９】
免疫細胞化学
培養、管及び非接着性細胞を、１％パラホルムアルデヒド中に固定させ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳＴ）０．３％を含有するＰＢＳ中に透過可能化した（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）。ＰＢＳＴ中正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）５％及びＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）１％からなるブロッキング緩衝剤中で予備インキュベートすることによって非特異的結合部位をブロックした。すべての抗体をブロッキング緩衝剤中に希釈した。一次抗体によるインキュベーションを加湿された室で４℃において一晩実施した。使用した一次抗体は、下記であった：モルモット抗−インシュリン（Ｌｉｎｃｏ、１：２０００）：マウス抗−インシュリン／プロインシュリン（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍからの標識キットを使用して直接ビオチンに結合された）；モルモット抗−グルカゴン（Ｌｉｎｃｏ、１：２５００）、マウス抗ソマトスタンチン（Ｂｉｏｍｅｄａ、１：５０）；ラビット抗−膵ポリペプチド（Ｚｙｍｅｄ、１：５０）；ラビット抗−アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ、１：１５００）、及びラビット抗−ＰＤＸ−１（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　Ｗｒｉｇｈｔ，Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔのギフト、１：２０００）。二次抗体及び三次試薬は、下記であった：ＦＩＴＣ結合されたロバ抗−モルモットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：２００）；Ｃｙ３結合されたロバ抗−モルモット、ラビット又はマウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１：１０００）；ビオチン結合されたロバ抗−ラビット又はマウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１：５００）；ＡｖｉｄｉｎＤ−ＦＩＴＣ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、１：１０００）；ストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ、１：１０００）。細胞を、Ｎｉｋｏｎ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｅ８００エピフルオレセント（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）又はＮｉｋｏｎ　Ｄｉａｐｈｏｔ　３００倒立蛍光／相微鏡写真機で数えた。
【０１６０】
単細胞ｃＤＮＡ増幅及びＰＣＲ分析
単細胞からのｃＤＮＡを、Ｂｒａｄｙ等（１９９３）及びＤｕｌａｃ及びＡｘｅｌ（１９９５）に従って増幅した。単一ＮＡＣをランダムに選び、氷冷細胞溶解緩衝剤を収容するＰＣＲチューブ中に移した。第一鎖ｃＤＮＡ合成及び引き続くＰＣＲ増幅を記載される（Ｄｕｌａｃ及びＡｘｅｌ、１９９５）通りに実施したが、ＰＣＲ反応を全容積１００μｌの代わりに５０μｌで実施した。増幅されたｃＤＮＡを１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、ＤＮＡ断片のサイズは、予期される通りに０．５〜１ｋｂの範囲であった。次いで、個々のｃＤＮＡのアリコートを、特異的ＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲによってマーカー遺伝子について分析した。ＰＣＲ反応を３５サイクルについて各々９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で２分間ランした。アンプライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）配列は、下記であった：
【化２】
Figure 2004505627
【０１６１】
インシュリン放出アッセイ
インシュリン放出をＮＡＣ、分離された管、単層細胞、又は島１０のバッチを使用して静的インキュベーション条件下で測定した。細胞又は島を、３ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）及びＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）０．２％を含有するＫｒｅｂｓ　Ｒｉｎｇｅｒ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝剤（ＫＲＰ）中で３７℃において３０分間予備インキュベートした。上澄み液を捕集し、細胞を一度洗浄した後に、更に１７ｍＭグルコース中で３７℃において１時間インキュベートした。次いで、この上澄み液を捕集し、すべてのサンプルを、Ｌｉｎｃｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ミズーリ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ）からのラットＣ−ペプチド用ＲＩＡキットを使用してインシュリン特異的放射性同位元素標識免疫アッセイを行うまで、−２０℃に保った。インシュリン含量測定については、細胞を酸−エタノール中で抽出し、超音波で処理した後にアッセイした。
【０１６２】
カルシウム映像
ＮＡＣをＨａｎｋｓ緩衝剤（ＧＩＢＣＯ）中の０．７％低融点アガロース中で固定化し、プルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）０．１％及びジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）１％を加えて含有する標準Ｋｒｅｂｓ　Ｒｉｎｇｅｒ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＫＲＰ）緩衝剤中で５μＭフルオ−３アセトキシ−メチル（ＡＭ）エステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）によって室温で１時間の間染料添加した。次いで、細胞を洗浄して過剰の染料を除き、加熱された顕微鏡ステージ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に置いて３２℃に保った。フルオ−３蛍光強度を細胞内カルシウム濃度のインジケーターとして使用し、同焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって測定した。励起波長を４８８ｎｍ（アルゴンイオンレーザー）に設定し、４０Ｘ水レンズを使用した。同焦点開口及びレーザー強度を含む、レーザー走査についての同じパラメーターを各々の実験について設定した。細胞内カルシウムのグルコース誘導変化を分解するために、レーザー走査をＸＲＴシリーズとして、各々の走査の間の間隔１０秒を用いて行った。映像ファイルを保存し、続いてＦＬＵＯＶＩＥＷソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって分析した。関心のある細胞を丸で囲み、丸で囲んだ領域の平均強度を経時的にプロットした。
【０１６３】
結果
膵管の分離、特性表示、及び培養
規定したインビトロ培養システムを確立するために、小葉間導管の集団を分離し、特性表示した。記載する培養システムを確立するのに、初め１〜２月齢動物からの成組織を使用したが、終局的に一層一貫しておりかつ一層大きな収量のクリーンな管をもたらす２〜３週齢ラットからの組織に代えた。膵臓組織を収穫し、コラゲナーゼ消化を施した（Ｇｉｔｈｅｎｓ　＆　Ｗｈｅｌａｎ，１９８３；Ｇｉｔｈｅｎｓ等，１９８９）。次いで、消化された組織を、管の純粋な集団が得られるまで、複数回反復して手でつかんだ（図１）。典型的な実験は、動物２０匹当たりかなり均一な管２００〜３００までをもたらした。チューブリンベータＩＩＩ及びアセチル化−ＬＤＬ−ＤｉＩについての染色は、選定した管集団に神経細胞及び血管が存在しないことを示した（図示せず）。
【０１６４】
出発原料の特性表示は、インシュリン、ＰＤＸ−１、ＰＹＹ、及びアミラーゼタンパク質を発現するために単一管を分析することによって行った。表１は、時間ゼロにおける手でつかんだ管の大部分に、これらの内分泌マーカー及び外分泌マーカーが存在しなかったことを示す。培養の開始においてインシュリン−免疫陽性細胞を含有しない管は、すべての管の内の９２％よりも多く、すべての管の内の同様の割合が免疫組織化学的に検出可能なＰＤＸ−１を有しなかった。テストして陽性だったそれらの管の内で、ほとんどすべては、インシュリン−免疫陽性な細胞を１〜２個有するだけであった。解離された管の分析もまた、インシュリン及びＰＤＸ−１タンパク質について免疫陽性な時間ゼロ管細胞が０．０５％よりも少ないことも示した（図示せず）。同様に、ＰＹＹ発現細胞は、極めて少なく、カウントした細胞の内の０．０１５％以下を構成した。アミラーゼ陽性細胞は、初期集団の内の０．０２％を構成し、おそらくそれらは極めて少ないクラスターにおいて生じるので、外分泌キャリオーバーを表した。ＰＤＸ−１か又は内分泌マーカーインシュリンか又はＰＹＹのいずれかを発現する細胞の数は、総計で細胞の０．１％よりもずっと少ない量になり（表１）、これらの細胞が成熟した管において極めて少ない（データを示さず）という成膵臓のセクションに関する免疫組織化学的観測を確証した。平均の管断片は、３４５０±１８６０の細胞を含有し（ｎ＝１０測定）、かつ平均の管収量は、２２５断片であったので、培養の開始におけるインシュリン−陽性細胞の初期数は、細胞およそ８００，０００当たり８０〜４００の範囲であった（表１）。
【０１６５】
培養は、単一管断片を１ｃｍ２ウェル内に入れ（図２）又は複数の断片を４−ウェル板の中に入れる（１．９ｃｍ２／ウェル）ことによって行った。種々の基質をテストした（Ｍｔｒｉｇｅｌ、コラーゲン、ヒドロゲル）が、最も清浄かつ最も関心のある結果は、簡単にチャージされたプラスチックに平板固定することによって得られた。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）５％を含有するＩｓｃｏｖｅｉｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉａ（ＩＭＤＭ）を各々のウェルに加え、管を５日にわたって培養した。図２中の上部パネルは、インシュリン染色を培養された管の時系列で示し、下部パネルは、対応する明るい場映像を示す。単一管集団の分析は、時間ゼロにおいて、管断片の８％がインシュリンについて陽性であった（表１）のに対し、２４時間程の短い時間で、インシュリン−陽性細胞を含有する管の数は、１３％に増大しており、２日までに１７％に増大していたことを示した。これらの陽性は、最も頻繁に単細胞又は２〜４の細胞の小さい焦点として現れた（図２）。個々の培養の５日までに、ウェルの２３〜２５％は、単層上にインシュリン−陽性細胞を含有し、その後に変化はほとんど無かった（７日を通して、４６／１８５単一管培養）。これらの結果の含意の一つは、非インシュリン陽性管が、培養を通してインシュリン陽性になることである。
【０１６６】
ウェル当たりの管断片の数を増大させると、一般に５日以内で単層の一層急速な外植及び合流を生じており、交差摂取がいくらか起きることを示唆する。本発明者等は、本発明者等の管調製当たり１６ウェル（１．９ｃｍ２）に平板固定することを時間と細胞収量との間のバランスとして標準化した。ＦＢＳ中で培養して７日（Ｔ７）に、単層は、出発原料の５倍の最大膨張についてウェル当たり平均２５±２０（範囲０〜５１）のインシュリン陽性細胞を含有する。このシステムでは、細胞の大部分は、ビメンチン陽性、非内分泌性及び増殖性であり（ＢｒｄＵ摂取によって示される通り）、おそらく管細胞の上皮層を囲むストローマ細胞から生じる。インシュリン免疫反応性細胞は、ＢｒｄＵ摂取が可能であるが、これは、めったに行われない（図示せず）。ＢｒｄＵ摂取のバルクは、ビメンチン陽性繊維芽細胞による。単層上に早期に出現するインシュリン陽性細胞ののろい成長速度は、ベータ細胞がインビトロ及びインビボで複製するのが極めてまれであることを立証する他の研究者からの観測報告（１９９６年にＳｊｏｈｏｌｍ；１９９９年にＮｉｅｌｓｅｎによって検討された）と一致する。７日を超えるそれ以上の培養は、インシュリン陽性細胞を収容するウェルの数か又はインシュリン陽性細胞の数のいずれも有意には増大させなかった。
【０１６７】
本発明者等は、インシュリンを発現する細胞の数の増大に加えて、また、ＦＢＳ培養におけるいくつかのウェルが、多数のアミラーゼ陽性細胞を収容し、しばしばこれらのアミラーゼ陽性細胞がインシュリンを共発現する（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ）ことも観察した（図３Ａ〜Ｃ）。インシュリン及びアミラーゼの両方を発現する細胞が、膵臓再生の間に出現することが実証され、活性化された膵細胞であると思われる（Ｍｅｌｍｅｄ，１９７９，Ｇｕ等、１９９４）。加えて、これらの培養は、丸くかつ半接着性の細胞タイプであって、それの多くは、インシュリンがわずかであるとはいえ、両方のマーカーを発現するようであるものを収容するものであった。
【０１６８】
ＰＹＹ及び／又はグルカゴゲンを発現する細胞が、本発明者等の管培養において観察される（図３Ｄ〜Ｆ）。早期の膵臓発達の間のＰＹＹ及びグルカゴゲンの共発現は、内分泌前駆細胞進行にマークを付けると仮定された（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ等、１９９４）。インシュリンと対照して、ＰＹＹ免疫陽性細胞の数は、培養の間変化しなかった（表２）。単層上でインシュリン陽性な細胞の内の、ほとんどがＰＤＸ−１を共発現したが、すべてがＰＤＸ−１を共発現したわけではない。ＰＤＸ−１を発現し、しかもなおインシュリンを発現しなかった、及び逆の細胞もまた培養中に観察された（図３Ｇ、矢印）。これより、分化の種々の段階及び異なる発達系列を表わす細胞が、本発明者等の培養において出現する。
【０１６９】
非接着性細胞タイプの出現
インシュリン発現細胞の数は、５日を超える培養によって有意に増大しなかった、それは、それらの複製速度が遅いこと、おそらく細胞死による。因子をＴ５培養に加えてインシュリン−陽性細胞の数の増大を誘導することができるかどうかを求めた。上皮細胞か又は膵臓発達のいずれかに影響を与える多数の因子をテストした：デキサメタゾン、コレラトキシン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＰＤＧＦα、ＨＧＦ、ＴＧＦβ１、ＩＬ−１α、ＧＬＰ−１、グルカゴン、ガストリン、ＧＩＰ、ＰＹＹ、ＮＰＹ、及びＰＰをＴ５培養に、更に２日の培養の間加えた。単独でテストした時に、因子のほとんどは、観察されたインシュリン陽性細胞の数を有意には増大させなかった（図示せず）。しかし、ＤＣＥ、デキサメタゾン、コレラトキシン及びＥＧＦのカクテルは、単層上のインシュリン−発現細胞の数を有意に増大させた（ｎ＝８実験にわたり平均２〜３倍の増大、表１）。加えて、ＤＣＥの存在は、４８時間の経過にわたって非接着性細胞（ＮＡＣ）集団の出現を有意に増進させた（図４）。ＮＡＣは、対照培養（図４Ａ）においてさえ並びに成長因子処理された培養（図４Ｃ、Ｄ）において観察されたが、これらの状態の内で、ＤＣＥによって見られる誘導のレベルに至ったものは無かった。示した例では、ＨＧＦ及びＴＧＦβ１を、単層に与える影響についてテストした。ＨＧＦは、胎児島の成長を刺激するのが示され（Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ等、１９９４）、ＴＧＦβ１は、インビトロ膵培養において内分泌細胞の出現を抑制するするのが示された（Ｓａｎｖｉｔｏ等、１９９４）。本発明者等のシステムでは、ＨＧＦ及びＴＧＦβ１は、培養表現型又はＮＡＣ産生に対してほんのわずかな影響を有していただけであった。
【０１７０】
ＮＡＣは、全面単層培養において自然発生的に出現する。ＮＡＣの出現の数及び速度の両方が、ＤＣＥカクテルを加えることによって有意に増大される（しばしば＞８倍）（図４Ｂ）。これらの細胞は、特徴的に相が明るく、高い粒状度を有する分泌外観を保有し、かつ通常サイズが２０〜５０μｍの範囲である（図４挿入部）。真のＮＡＣは、単層の表面において自由に動き回る大きな丸い細胞として出現するのが最もしばしばである。他の多数は、緩く結合され、見かけ上出現の進行中であるのがしばしばである。ＮＡＣの増大は、ＤＣＥ添加後２４時間までに見られることができるが、４８時間で最大になるようである。ＤＣＥを培養中に反復して与えると、ＮＡＣ形成の逐次波を生じるが、数は逐次に小さくなる（図示せず）。
【０１７１】
ＤＣＥは、以前に、一次精製された膵臓上皮集落の生育と機能を促進することが示された（Ｇｉｔｈｅｎｓ等、１９８７， １９８９）が、ＮＡＣＳ又は内分泌細胞型は報告されなかった。おそらく、ＤＣＥの効果は、間接的であり；我々の混合細胞培養系の間質成分において働いてベータその他の小島細胞型の分化を誘導する。続く我々の培養における試験は、デキサメタゾンもＥＧＦも単独では、ＮＡＣ生成に対して対照と比較して有意の効果を有しないが、活性の大部分は、コレラ毒素のｃＡＭＰ上昇効果と関係しているということを示した。事実、多くのｃＡＭＰアゴニストも、この効果を有した（データは示してない；他所で説明）。デキサメタゾンとＥＧＦの存在は、ＣＴの効果を増大させるらしかった。ＮＡＣ集団内のこれらの細胞の大きさと顆粒状態は、著しく変化したが、生きた状態での染料染色は、ＮＡＣの９９％より多くが生存可能であることを示した。
【０１７２】
ＤＣＥに応答性の導管の数に関して、ＤＣＥ処理したウェル（ｎ＞１０実験、ウェル当たり単一の導管）の９５％より多くが、対照用のウェルを超えるＮＡＣの少なくとも２倍増を生じた。正常の培養における各処理したウェル（ウェル当たり８〜１６導管）は、ＤＣＥにおいて（ｎ＝９実験）４８時間後に、３，０００〜１８，０００ＮＡＣを生じ、平均収率は、約７０００／ウェルか又は約１×１０５ＮＡＣ細胞／調製物であった。ＢｒｄＵ取り込み実験は、ＤＣＥの効果の１つが細胞分裂を刺激することであることを示した。４８時間の最後でのパルス標識は、ＤＣＥ処理単層において、対照より４倍多いＢｒｄＵ陽性細胞を示し、これは、長期間続く増殖刺激を示している（示さない）。ＤＣＥ添加の開始時にパルス標識した場合には、４８時間で回収したＮＡＣの１０％がＢｒｄＵ陽性であり、これは、これらの細胞がＤＣＥ応答性の循環細胞から得られることを示している。ＤＣＥは、単純に細胞接着の喪失を刺激するのではないらしい。
【０１７３】
ＮＡＣにおけるホルモンの発現
単層の分析は、ＦＢＳ培養における細胞の約０．０２％がインシュリンタンパク質を発現し、ＤＣＥの添加がその数を２〜３倍に増加させて平均５９±５２（５〜１９６の範囲）／ウェルのインシュリン陽性細胞を与えることを示した。単層の分析に加えて、ＮＡＣを、インシュリン及び他の内分泌マーカーの発現について分析した。ＮＡＣは、培養液中に自由に浮遊しているので、それらを、外観が最大になったときに、ＤＣＥ添加の４８時間後に吸引により集めた。小島の４つの内分泌細胞の型のすべてを、この集団において、免疫細胞化学的に検出することができた。図５は、ＮＡＣのインシュリン、ＰＤＸ−１、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドについての免疫染色を示している。図５Ａに示したように、インシュリンの標識は、一貫して明るい約４〜５％の細胞を有する蛍光強度の連続体（範囲２．５〜１３％、ｎ＝６測定）を示し、陽性細胞の大部分（全細胞集団の３０〜４０％以上）は、低レベルの免疫蛍光を示している（Ａ、Ｃ）が、これらは、バックグラウンド（Ｂ）よりは依然高かった。この低インシュリン発現細胞の数は、ＦＡＣＳ分析により確認した（データは、他所に記載）。ＰＤＸ−１、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドを発現する細胞も又、この集団中に存在し（それぞれ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ）、グルカゴン陽性細胞が次に最も高頻度（６％）であり、その次がソマトスタチン（３％）であり、そして膵臓ポリペプチド陽性細胞（２％）が最も希であった。従って、ＮＡＣ集団は、小島の内分泌細胞型の全セットの培養単層からの富化を構成している。
【０１７４】
転写のプロフィル
ＮＡＣ集団中のインシュリンを発現する細胞の数の更なる測定として、我々は又、半定量的単一細胞ＰＣＲ（Ｂｒａｄｙ等、Ｄｕｌａｃ及びＡｘｅｌ， １９９５）をも行って、インシュリンのｍＲＮＡをランダムに選択した個々のＮＡＣ細胞中で検出した。図６は、分析した細胞４０の内の１５即ち＞３５％がインシュリンｍＲＮＡを含んでいたことを示している。パネルＡは、ｃＤＮＡが各単一細胞試料から増幅されたことを示している。パネルＢは、インシュリンメッセージの強度が陽性細胞間で変化したことを示している。このシグナル強度の変化は、免疫細胞化学により観察されたものと似ており、ハイブリダイゼーション分析によっても認められて確認された（データは示さない）。４０の選択した細胞の内の２つが、グルカゴンメッセージを含んでいた（パネルＣ）が、それらの１つはインシュリンとＰＤＸ−１のメッセージをも含んでいた。パネルＤは、分析した細胞の８０％より多くの細胞（３５／５０）がＰＤＸ−１のメッセージを含んでいたことを示している。インシュリン陽性細胞の内の１つだけがＰＤＸ１を発現しなかったが、ＰＤＸ−１陽性であって検出可能なインシュリン又はグルカゴンメッセージを有しない多くの細胞があった。インシュリン及びグルカゴン発現細胞の絶対的及び相対的数は、免疫細胞化学により観察されたものとよく一致し、インシュリンの場合はフロー分析ともよく一致する。興味深いことには、これらの３つのマーカーの何れをも発現しない幾つかのＮＡＣ細胞があった。これらの細胞の正体は、現在不明である。リボソームコンポーネントＳ６（ＲＰＳ６）に対する標識されたプローブを用いる４０のｃＤＮＡのアレイハイブリダイゼーションは、すべての試料におけるその存在を示した（示さない）。転写のプロフィルは、多くのＮＡＣがＰＤＸ−１を発現すること、これらの細胞の約４０％がインシュリンのｍＲＮＡとタンパク質の両方で陽性であること（たとえ、レベルが変動しても）、及びＮＡＣの大部分がベータ細胞の表現型を有するらしいという免疫細胞化学の結果を確認した。加えて、ＰＤＸ−１陽性であるがインシュリン陰性の有意の細胞画分があり、これは、前駆細胞状態を示しているのであろう。単層細胞のＳＣ−ＰＣＲは、２３／２３のアクチン陽性、０／２３のインシュリン陽性細胞を示し（示さない）、これは、ＮＡＣ集団中に内分泌表現型が比較的豊富であることを示している。
【０１７５】
インシュリン含有量及びグルコース刺激によるインシュリン分泌
機能的ベータ細胞の顕著な特徴は、上昇したグルコースレベルに応答してインシュリンを分泌するそれらの能力である。機能的ベータ細胞が管培養物中にあるかどうかを測定するために、我々は、静的インシュリン放出アッセイを単層とＮＡＣ集団の両方について行って、それらのグルコース変化に対する応答を測定した。我々は又、培養によるインシュリン発現の相対的増加を測定するために全インシュリン含有量をＲＩＡにより測定した。図７は、時間ゼロの単離された導管、ＤＣＥ培養された単層、及び収穫されたＮＡＣにおけるグルコースにより誘導されたインシュリン放出を示している。このＮＡＣ集団は、上昇したグルコースに応答して分泌されるインシュリンの３倍増を示した。対照的に、単層に含まれる細胞は、僅かのグルコース応答しか示さず、高又は低グルコース条件に何れにおいても遙かに少量のインシュリンを分泌した。時刻ゼロでの導管（ｎ＝３）の分析は、グルコース刺激されたインシュリンの分泌を示さず、これらの導管の酸−エタノール抽出は、ＲＩＡの感度（約１００ｐｇ／ｍｌ）のレベル内で検出可能なインシュリンを示さなかった。全インシュリンの抽出は、単層上の５０，０００細胞当たり１．３４ｎｇの、及び５０，０００ＮＡＣ細胞当たり２５．０ｎｇのインシュリン含有量を示した。比較において、約１０００細胞の正常なラットの小島は、典型的には、約２０ｎｇのインシュリンを含有している（データは示さない）。その上、ＤＣＥに２４、４８又は７２時間さらされた培養物から回収したＮＡＣを比較した場合には、４８時間培養物からのＮＡＣだけが信頼できるグルコース刺激によるインシュリン応答を示した。従って、このデータは、導管培養中に生成されたインシュリン量の大幅な増大及びそのインシュリンがグルコースに応答して生産的に放出され得ることを示しており、これは、機能的ベータ細胞の存在を示している。現在の研究は、増大した細胞数、インシュリンの含有量及び／又は機能へと導く変数の更なる理解に焦点を集中している。
【０１７６】
グルコース刺激による可逆的なカルシウム流の実証
扱うべき鍵となる問題は、どれだけ多くの培養物中に生成されたインシュリン含有細胞が機能的グルコース応答を有するかということである。これを測定する１つの方法は、グルコース投与に応答して中へ向かうカルシウム流を生成することのできる細胞の数を測定することである。インシュリン分泌は、グルコース代謝にリンクして中へ向かうカルシウム流により媒介されることが知られている（Ｋａｌｋｈｏｆｆ及びＳｉｅｇｅｓｍｕｎｄ， １９８１， Ｗａｎｇ及びＭｃＤａｎｉｅｌ， １９９０）。培養物内の機能的ベータ細胞の存在及び数を評価するために、我々は、グルコースに応答しての細胞質ゾル流入を、カルシウム依存性蛍光染料Ｆｌｕｏ−３を用いて測定した。ＮＡＣを用いる典型的実験（ｎ＞１０）の結果を、図８に示す。この例において、試料細胞の３３％が、上昇したグルコースに応答してのカルシウム流誘導の強い振幅及び速度論を示した。単層に未だ付着している細胞の測定は、細胞内カルシウムのグルコース誘導された変化を検出できなかった。
【０１７７】
我々が我々の導管培養物由来のベータ細胞において観察したグルコース誘導されるカルシウム流の振幅及び速度論は、小島由来のベータ細胞についての文献に記載されたもの（Ａｓａｄａ等、１９９８；Ｓｃｈｕｉｔ， １９９６）と似ている。グルコース誘導されるカルシウム流の振幅及び速度論の細胞間の変動は、ベータ細胞の生理の不均一性の証拠と解釈されてきた。分離されて研究された単一ベータ細胞は、無傷の小島と比較して変化したインシュリン分泌速度及びグルコース感度を有すること（Ｈａｌｂａｎ等、１９８２；Ｂｏｓｃｏ等、１９８９）、及び個々のベータ細胞は、著しく異なるインシュリン合成速度を有すること（Ｍｏｉｔｏｓｏ ｄｅ Ｖａｒｇａｓ等、１９９７）が示されてきており、これらのすべては、我々の培養において認められる。このカルシウム流の振幅の変動も又、Ｆｌｕｏ−３染料充填における差異によって説明することができよう。
【０１７８】
この特徴的なカルシウム流のプロフィルは、２−デオキシグルコース、代謝されないグルコース類似体によっては誘導されなかった（Ｎｉｋｉ等、１９７４， １９９３；Ｍａｌａｉｓｓｅ， １９７９）。それは、ジアゾキシド、ＳＵＲリンクしたカリウムチャンネルの高親和性のインヒビターによって完全に阻止され（Ｔｈｏｍａｓ等、１９９６）［カルシウム誘導されるインシュリン分泌に必要（Ｈｅｎｑｕｉｎ等、１９８２；Ｔｒｕｂｅ等、１９８６）］、それは又、ＥＧＴＡによっても阻止された（Ｗｏｌｌｈｅｉｍ及びＳｈａｒｐ １９８１；Ｗａｎｇ及びＭｃＤａｎｉｅｌ， １９９０）［該剤は、細胞外カルシウムを封鎖する（示さない）］。しかしながら、それは、トルブタミド、ＳＵＲリンクしたカリウムチャンネルの高親和性のアクチベーターにより活性化することができた［該剤は、糖尿病患者においてインシュリン分泌を特異的に刺激するのに用いられる（Ｓａｔｏ等、１９９９；Ｍｅｌａｎｄｅｒ， １９９８）］。この刺激されたカルシウム流の可逆性は、図８Ｂに示されている。これらの実験（ｎ＝３）において、１０％の細胞が、可逆的にグルコースに応答し、最終的に、インシュリン分泌促進剤トルブタミドによって刺激され得た。これらの細胞の５５パーセントは、何れの刺激にも応答せず、残りの３５％の細胞は、グルコースに応答するがトルブタミドには応答しないか又はトルブタミドに応答するがグルコースに応答せず、これは、不均一で複雑な集団を示している。我々は、不均一なインシュリン発現レベルにもかかわらず、ＮＡＣの１０〜４０％はグルコースに応答し、従って、機能的ベータ細胞の様に挙動し得たと結論する。
【０１７９】
検討
我々は、ここで、精製した膵管集団から機能的ベータ細胞形成の研究を可能にするイン・ビトロ培養系を説明する。かかる導管の培養は、インシュリン陽性細胞の経時的増加及びインシュリン陽性となる導管断片の総数の増加の両方を生じた。この後者の結果は、インシュリンを発現することのできる細胞が培養中に活性化され得ることを示している。これらの結果に加えて、我々は、培養中に出現する非接着性細胞の関心ある集団の外観を説明するが、その数及び出現は、因子及び薬剤の添加によって直接調節することができる。
【０１８０】
これらの我々がＮＡＣと呼んでいる非接着性細胞は、大きさ及び顆粒状態及びマーカー発現が不均一である。免疫細胞化学分析は、４つの小島内分泌マーカーのすべてがこの集団内で検出され得ることを示している。我々の分析も又、これらの細胞が、成体の膵島におけるそれらの比と類似の比で現れることを示している（インシュリンを発現する細胞が一番多く、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチド発現細胞が続く）。それらのヒトの病気に関係するために、これらのインシュリン発現細胞の数及び機能を評価することは、我々の主要な焦点であった。
【０１８１】
手摘みの導管材料は、培養開始時点では、非常に僅かのインシュリン陽性細胞を含んでいた。培養の開始時点と終了時点でのインシュリン陽性細胞の数の分析は、主として新しい非接着性細胞集団における５００倍の増加を示した。培養の初期に認められたインシュリン陽性細胞はＢｒｄＵを取り込んだので、我々は、観察されたベータ様細胞の大部分がこの導管内の拡大する前駆細胞から生じたということを提議する。
【０１８２】
インシュリン発現及びＮＡＣ形成のＤＣＥ刺激の機構は、未知である。その成分の１つのデキサメタゾンは、胎児性小島の分化の刺激（Ｋｏｒｓｇｒｅｎ等、１９９３）、膵臓腫瘍細胞の増殖の刺激（Ｂｒｏｎｓ等、１９８４）及び外分泌マーカー発現のアップレギュレーション（Ｒａｌｌ等、１９７７；Ｖａｎ Ｎｅｓｔ等、１９８３）を含む膵臓に対する複数の効果を有することが知られた糖質コルチコイド類似体であるが、驚くべきことに、成熟マウスの小島ではインシュリン発現を抑制もする（Ｌａｍｂｉｌｌｏｔｔｅ等、１９９７）。糖質コルチコイドは又、幾つかの細胞型例えば肝細胞におけるＥＧＦレセプターの発現をアップレギュレートすることも示されている（Ｇｌａｄｈａｕｇ等、１９８９）。ＥＧＦは、胃及び膵臓上皮の重要な有糸分裂促進物質であり、レギュレーターであって（Ｍｅｉｔｔｉｎｅｎ １９９７）、事実、培養膵管において上皮様伸出を刺激することが示されている（Ｈｅｉｍａｎｎ及びＧｉｔｈｅｎｓ １９９１）。細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させるコレラ毒素等の薬剤は、上皮細胞の特性を刺激することが示されており（Ｒｉｎｄｌｅｒ等、１９７９）、ＥＧＦと組み合わせたコレラ毒素は、膵管における嚢胞形成及び小島クラスターを誘導することが示されている（Ｈｅｉｍａｎｎ及びＧｉｔｈｅｎｓ， １９９１；Ｙｕａｎ等、１９９６）。興味深いことには、Ｈｅｉｍａｎｎ及びＧｉｔｈｅｎｓ（１９９１）は、このＤＣＥの組合せを用いて、腺管上皮を同定して、繊維芽細胞から、コラーゲン又はアガロースに埋められたクラスターにおける嚢胞形成の刺激によって精製した。我々の思いのままに、ＤＣＥ中の導管の連続培養も又、単層形成へと導くが、ＮＡＣ形成を除く。培養構成の選択（包埋か平板単層か）及び因子添加のタイミングは、これらの分化に対する責任を負うものであり、これらは現在研究されている。
【０１８３】
おそらく生成される細胞の初期のそしておそらく未成熟の性質のために、又はそれらの細胞が完全な小島機能のために必要な電気的接触を未だ形成していないという事実の故に、個々の単層又はＮＡＣ細胞内に見出されるホルモン発現のレベルは、成体のベータ細胞におけるよりもずっと低かった。我々のインシュリン抽出研究は、平均的ＮＡＣ細胞が匹敵するラットのベータ細胞より２０〜５０倍少ないインシュリンを含むことを示した。単に、インシュリンブライト細胞（高度にインシュリンを発現する）がグルコース応答を有し且つディム細胞（低レベルのインシュリンを発現する）が一層未成熟な非グルコース応答性のプレベータ細胞に相当するのであろう。それにもかかわらず、ずっと大きい細胞集団が、ＮＡＣ集団において、ランダムに選択した単層細胞集団よりグルコース刺激によるインシュリン分泌応答を有することが示され得た。従って、ここで同定されたＮＡＣ集団は、内分泌表現型を有する細胞の富化集団を表している。我々の培養系が細胞−細胞接触、完全なホルモン発現及び完全なベータ細胞の成熟を刺激するために必要な栄養作用を逸しているということは、ありそうなことである。多くの因子が、胎児のベータ細胞のインシュリン発現を増大させ且つインシュリン分泌を促進することが示され（Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ等、１９９３， １９９４；Ｈｕｏｔａｒｉ等、１９９８；Ｓｏｒｅｎｓｏｎ及びＢｒｅｌｊｅ， １９９７）、これらは、現在、我々の系で試験している。
【０１８４】
我々がここで記載する系は、今までイン・ビボでしか記載されなかった再生及び新生の事象のイン・ビトロでの研究を初めて可能にするものである。我々は、この系を操作して細胞の正体の範囲を与えることができること、インシュリン陽性細胞の有意の増加を得ることができること及びこの細胞集団内にベータ細胞様機能を検出することができるということを示す。我々の研究は、イン・ビボ操作によって膵管系に帰せられた多くの再生及び幹細胞活性がイン・ビトロ培養によって再現され得るということを示す。この系は、今や、これらの活性の原因の細胞の系統的研究並びにそれらの数、ホルモン含有量及び機能に影響を及ぼす因子の同定を可能にする。加えて、この系は、インシュリン依存型糖尿病の治療のための治療経路としての、天然の、細胞処理しない方法によって、機能的ベータ細胞を造る制御され且つ限定された方法のゴールを達成することに向けられた最初のステップを構成する。
【０１８５】
実施例２：膵臓細胞前駆細胞分化の誘導
単層をＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で生育させて、生育を増進させることができる。分化の誘導は、ｃＡＭＰに依存していると考えられている。細胞内ｃＡＭＰレベルの増加を誘導する薬剤は、分化を誘導すると予想されている。
【０１８６】
カクテルＤＣＥ（１μＭ　デキサメタゾン、１００ｎｇ／ｍｌ　コレラ毒素、１０ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ）は、培養導管単層におけるインシュリン陽性細胞の数の増加を誘導する。図９は、ＤＣＥ＋５％ＦＣＳで処理した単層と５％ＦＣＳだけで処理した単層との比較を示している。導管を５日間培養してから、更に４８時間にわたって処理した。ＤＣＥ処理に応答して培養中のインシュリン陽性細胞の総細胞数が約５倍増加しているということに注意されたい。培養中の総細胞数も又、約２０％増加している。バーは、四連のウェルの平均値を表している。
【０１８７】
デキサメタゾン、コレラ毒素、フォルスコリン、ジブチルｃＡＭＰ及びＮａ−ブチレートは、すべて試験して分化を誘導することが見出された。図１０は、フォルスコリン、ジブチルｃＡＭＰ及びＮａ−ブチレートが、浮遊前駆細胞の出現の誘導において、ＤＣＥの代用となり得ることを示している。簡単にいえば、腺管断片の単層が、５日間の培養の後に、ｃＡＭＰアゴニストのフォルスコリン及びジブチリルｃＡＭＰ並びに胎児小島分化剤のナトリウムブチレートによって誘導された。低濃度及び高濃度の各因子を導管単層に加えた。４８時間後に、生成したＮＡＣを集めて計数した。処理をｘ軸上に示し、浮遊前駆細胞の数をｙ軸上に示してある。各バーは、二連のウェルの合計である。
【０１８８】
我々は、セクレチンが単層の分化及び膵臓前駆細胞上での出現を誘導することができることも観察した。図１１において、培養の５日後にセクレチンを単層に１〜１００ｎＭの投与量で加えた。浮遊性の非接着性前駆細胞数を、処理の４８時間後に測定した。各バーは、１．９ｃｍ２の２つのウェルの合計を表している。
【０１８９】
図１２で用いている導管培養物を、上記のように培養した。セクレチン投与量を変えて、４８時間後に、単層上のインシュリン発現細胞の数と浮遊前駆細胞の総数を計数して評価した。インシュリンの評価は、免疫細胞化学により行った。投与量依存性の浮遊前駆細胞数の増加があるということに注意されたい。単層中のインシュリン陽性細胞数もセクレチン投与量と共に増加し、投与量５０ｎｍでのインシュリン陽性細胞の見かけの減少は、異常である。各点は、二連のウェルの平均値を表している。左側のｙ軸は、得られた浮遊前駆細胞の総数を示し、右側のｙ軸は、ウェル当たりのインシュリン陽性細胞の数を示している。セクレチン投与量をｘ軸に示してある。
【０１９０】
図１３は、血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）も、浮遊前駆細胞の出現を誘導することにより導管単層を分化させることを示している。培養において、５日後に、ＶＩＰをこれらの培養物に加え、誘導された浮遊前駆細胞数を、処理の４８時間後に測定した。Ｃ＝対照であり、これは、５％ＦＣＳである。この実験における最適投薬量は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＩＰであり、これは、浮遊前駆細胞数の対照の３倍を超える増加を誘導した。ｙ軸は、かかる細胞の数（×１００）を示している。各バーは、２つのプールしたウェルの合計である。
【０１９１】
我々は又、インシュリンの存在がセクレチン誘導される分化を減少させることをも観察した。図１４参照。浮遊前駆細胞が、セクレチン（１００ｎＭ）により誘導された。インシュリン（１０ｎｇ／ｍｌ）とセクレチンの同時添加は、浮遊前駆細胞の全体としての誘導を減少させた。各バーは、２つのプールした二連のウェルの合計を表しており、その数をｙ軸に細胞数（×１００）として表してある。
【０１９２】
実施例３：レクチン細胞表面マーカーを用いる膵臓前駆細胞の分離
我々は又、膵臓細胞前駆細胞を分離／精製するために利用することのできる細胞型特異的マーカーの同定、又はかかる前駆細胞を生じさせる膵臓／腺管上皮の同定をも企てる。我々が試験した様々な候補の試薬の内で、我々は、ある種のレクチンが、最終的に膵臓細胞前駆細胞を生成することのできる導管上皮細胞に優先的に結合し、それ故、その分離を容易にするということを発見した。
【０１９３】
Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（南京豆凝集素、ＰＮＡ）は、細胞表面の特異的な炭水化物基に結合する植物レクチンである。ＰＮＡは、ガラクトシル（β−１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミンに結合する。それは、最初、ベータ細胞マーカーとして研究用に選択された（Ｈｅａｌｄ ＫＡ， Ｈａｉｌ ＣＡ， Ｈｕｒｓｔ ＲＰ， Ｋａｎｅ Ｎ， Ｄｏｗｎｉｎｇ Ｒ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ １９９１ Ｍａｙ；１７（１）：１−６， Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｅｃｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ参照）が、我々の思いのままに、ＰＮＡは、ラットの小島細胞を標識せず、導管上皮細胞を標識した。
【０１９４】
ＰＮＡ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ，南京豆凝集素）を、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手して［ＦＩＴＣ結合体（カタログ番号ＦＬ−１０７１）］、１：２５０〜５００希釈で用いた。
【０１９５】
成人の膵臓のパラフィン切片を、Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙから入手した。
【０１９６】
組織化学のプロトコール：　成人の膵臓、成体ラットの膵臓、胎児ラットの膵臓のパラフィン切片又は成体マウスの膵臓の冷凍切片を用いた。別法として、時間０の導管又は２週齢のラットの膵臓からの培養導管調製物をパラホルムアルデヒド固定を用いて又は用いないで試験した。ＰＮＡ−ＦＩＴＣを、通常、ＰＢＳ又はＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ培地中での１：２５０希釈で用い、４℃で、１時間〜一晩にわたってインキュベートしてから洗浄して、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄマウンティング媒質の下でマウントした。前固定なしで染色した細胞を、マウティング媒質の添加前に後固定した。
【０１９７】
ＦＡＣＳのプロトコール：　ＰＮＡ−ＦＩＴＣを、無菌の洗浄緩衝液（１％ＦＢＳを含み、Ｃａ＋＋Ｍｇ＋＋を含まないＰＢＳ）中で１：２５０に希釈した。分散させた生細胞（約２×１０６細胞）を遠心で沈めて、１００μｌのレクチン中に再懸濁し、４℃で３０〜４５分間インキュベートした。次いで、細胞を、無菌洗浄緩衝液で２回洗い、５％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭグルタミンを含む２ｍｌのＩｓｃｏｖｅｉ改変ＤＭＥＭに再懸濁して、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅで流すまで氷上に保持した。標準的ＦＡＣＳ手順を用いた。
【０１９８】
ＦＡＣＳでソートした細胞を、管内に集めて、完全Ｉｓｃｏｖｅｉｓ培地（上記参照）を含むマルチウェル培養プレートに直接送達した。播種時の細胞密度、表面基質及び培養時間は、変化させた。幾つかの培養物を、ＦＡＣＳにより再分析し、幾つかを、組織化学により分析した。
Figure 2004505627
【０１９９】
ＰＮＡを用いて、我々は、下記の観察を行った：
（ｉ）上皮細胞のマーカーとしてのＰＮＡ。ＰＮＡは、膵管中の上皮細胞の単層を示す。それは、ブタの小島においてベータ細胞を示すという文献の報告と対照的に、ラットでは島細胞を示さない。それは、血管又は間質細胞を免疫組織化学によって示さない。ＰＮＡは、成体動物における膵管上皮細胞並びに胚発生における上皮性のシートを示す（ラットのステージｅ１５、ｅ１６及びｅ１８で）。
（ｉｉ）ＰＮＡは、細胞表面を標識する。
（ｉｉｉ）ＰＮＡは、生きている、未固定の、透過性にされてない細胞を標識する。
（ｉｖ）ＰＮＡは、主膵管（総胆管、ＣＢＤ）を示さない。ＰＮＡは、主として、中位の大きさの小葉間導管及び多くの一層大きい小葉内導管を示す。
（ｖ）ＰＮＡは、蛍光活性化セルソーティングに適した試薬である。ＰＮＡは、生存力のある細胞のＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）によるソーティング及び回収を可能にし；ＰＮＡ陽性細胞を直接マルチウェルプレートにソートすることができる。我々は、ＰＮＡ標識をＲＩＮ、島細胞、Ｔ０導管及び培養導管単層に適用した。約５〜１５％のＴ０導管調製物は、ＦＡＣＳ分析によりＰＮＡ陽性である。このパーセンテージは、培養中（ＦＢＳ中で４日間）に非常に変化するようには見えない。ＰＮＡ陽性のソートした細胞は、ソートの選択制（液滴当たりの事象、ソート選択モード等）に依って、再分析時に７６〜９４＋％の純度である。ＰＮＡ陰性集団は、９９＋％陰性である。
（ｖｉ）ＰＮＡソートした細胞は、有利な生育特性を有する。細胞は、生存力を有しているが、ソート後には非接着性である。分散した導管細胞は、最短の７日で基質に接着するようになり生育を開始する。対照的に、完全な単一の導管は、そのままであり、２４時間後に広がり始める。細胞の生存力は、培養添加物のない場合には、プレート密度に依存する。細胞の未ソート集団は、容易に増殖し；ＰＮＡ陽性ソートは、最も遅い。この含意は、ＰＮＡ陽性細胞以外の他の細胞型が健全な伸出を維持するために並びにある種の細胞特性（下記）に必要であるということである。培養中のＰＮＡ陽性細胞は、ＰＮＡ陽性のままでいない（ＰＮＡ−ＦＩＴＣで再染色される）。
【０２００】
立方内皮様細胞の別の集団が、著しいが；一層平たく、一層大きく、一層繊維芽細胞的な細胞も存在する。前者は、ＤｉＩ結合したアセチル化ＬＤＬの取り込み、内皮細胞の特徴を示すが、一層大きい一層平たい細胞は示さない。
【０２０１】
未ソートで且つＰＮＡ陰性の集団は、非常に混ざった表現型と形態の培養物に生育する。これらの培養物中の非常に少しのパーセンテージの細胞が、ｄｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ−陽性（即ち、内皮様）である。
【０２０２】
培養中のＰＮＡ陽性細胞は、インシュリン陽性又はＰＤＸ−１陽性でない。混合予備ソート集団中の多くの細胞は、これらのベータ細胞のマーカーの両方について陽性である。概して、強いＰＤＸ陽性細胞は、ＰＮＡは弱いか又は陰性である。強くＰＮＡ陽性の細胞は、ＰＤＸ陽性でない。これは、一の細胞型から他へ進むことを示唆している。
【０２０３】
ＰＮＡ陰性細胞培養中の少数の細胞は、インシュリン及びＰＤＸ−１について陽性である。これは、多分、ＰＮＡ陽性の前駆細胞の小さいキャリーオーバーから、少数のＰＤＸ＋細胞（ＰＮＡ陰性であった）が回収されたこと又は他の細胞型の存在がＰＤＸ−１発現を活性化したことを示唆している。
【０２０４】
ＰＤＸ−１発現は、これらの培養導管調製物において、インシュリン発現よりずっと高い（一層多く且つ相対的に一層明るい）。ＰＤＸ−１タンパク質はインシュリン発現のレギュレーターであるので、この発見は、ＰＤＸ−１陽性からインシュリン陽性への進行をも示唆している。
【０２０５】
グルカゴン陽性細胞は、ＰＹＹ陽性細胞に数で勝っているが、もっとも、両方とも全ソート画分中では希な細胞である。以前の仕事は、ＰＹＹ陽性細胞がグルカゴン細胞に先行することを示しており；従って、これらの結果は、前駆細胞が既にこの時点を超えて進行していたことを示唆する。
【０２０６】
これらの発見に基づいて、我々は、ＰＮＡの膵管上皮細胞を選択的に検出する能力は、島の前駆細胞型を含む細胞集団の回収を可能にし得るということを結論する。これらの細胞は、それら自体では、生存して分化するには不十分なようであり；即ち、他の細胞又は因子が、増殖及び分化を増強することができる。それにもかかわらず、ＰＮＡ選択は、組換え実験を実施して膵島の成長に必要な成分を同定することを可能にする大きなステップに相当する。
【０２０７】
図１５〜１７は、ＰＮＡ染色に基づいたソート後、２週間培養した細胞の表現型を説明している。
図１８及び１９は、成体及び胎児の膵臓におけるＰＮＡの特異性を説明している。
図３０及び３１は、他のレクチンの成体ラット膵臓への結合を説明している。
図３２〜３９は、レクチンの成人の膵臓への結合の特異性を説明している。
【０２０８】
実施例４：膵臓細胞前駆細胞の遺伝子型の同定
膵臓細胞前駆細胞を分離するための我々の技術を改良するために、我々は、膵臓ベータ細胞又はその前駆細胞の正体を、その遺伝子発現プロフィルにより、決定するためのプロトコールをデザインした。
【０２０９】
一般に、この方法は、単一細胞ｃＤＮＡ増幅を遺伝子発現分析に適用する。かかる様式で、発生の特定のステージの細胞についての遺伝子発現「フィンガープリント」を、アレイにしたハイブリダイゼーションにより得ることができる。
【０２１０】
簡単にいえば、単一細胞を例えば膵臓組織から分離し、各細胞からのｃＤＮＡを、Ｂｒａｉｌ等（１９９９）Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４０６：４５−５４により開発された単一細胞ＰＣＲにより増幅し、Ｐ３２で標識する。次いで、これらのｃＤＮＡを特定のメッセージ例えばインシュリン及びＰＤＸ１の存在につき選択する。
【０２１１】
公知の膵臓マーカーのｃＤＮＡをＰＣＲにより生成し、ナイロン膜上に並べる。その結果生成したアレイを用いて、標識した単一細胞ｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。このアレイのオートラジオグラフイメージを用いて、個々の細胞の遺伝子発現プロフィルを限定し、同定することができる。
【０２１２】
図２０〜２９は、このプロトコールを更に説明している。図２０は、典型的な単一細胞ｍＲＮＡＰＣＲ増幅反応の結果を示している。図２１は、膵臓の発生中の遺伝子発現の変化を説明している（主題の方法により測定）。図２２は、ベータ細胞及びその前駆細胞を検出するためのマーカーのアレイの一具体例を説明している。
【０２１３】
図２３は、成体及び胎児の膵臓組織及び心臓における遺伝子発現の概要を描く典型的なオートラジオグラフを示している。図２４は、遺伝子発現の定量的分析が、細胞の遺伝子発現プロフィルの測定の部分として、如何に行われ得るのかを示している。同様に、図２５は、胎児の膵臓組織の種々のステージにおける及び種々の刺激の後での遺伝子発現の概要を描くオートラジオグラフを示しており；図２６は、オートラジオグラフの定量的分析を説明している。
【０２１４】
図２７は、上記の例で記載したいわゆる浮遊前駆細胞における遺伝子発現の概要を描くオートラジオグラフを示しており；図２８は、図２７のオートラジオグラフの定量的分析を説明している。我々は、主題の方法を用いて、我々の膵臓細胞前駆細胞が、最初に分離した時点で、ＰＮＡ ｍＲＮＡを発現するがＰＤＸ１ ｍＲＮは発現しないことを示した。これらの細胞がインシュリン分泌細胞（インシュリン＋）に分化するにつれて、それらは、ＰＮＡ＋でＰＤＸ１＋になる。一層初期の前駆細胞は、ＰＮＡ＋でＰＤＸ１−であることに加えて、インシュリン−、ＰＹＹ−、グルカゴン−及びサイトケラチン＋でもある。
【０２１５】
図２９は、成体小島と膵臓発生中のある種の遺伝子の発現の相対的レベルを示している。
【０２１６】
実施例５：膵管由来の培養物から移植された細胞は、一時的に、糖尿病状態を救済する。
ＳＣＩＤ／ｉｃｒｌマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃから得た。マウスの平均体重は、２５ｇであった。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）をＳｉｇｍａ社から購入して、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中の３０ｍｇ／ｍｌ溶液とした。各動物にＳＴＺを２００ｍｇ／ｋｇの投与量で与え、注射後の３日目の朝の空腹時血糖の前では食餌を自由に摂らせた（前日の夕方に餌を片付けた）。糖尿病の動物は、２００ｍｇ／ｄｌを超える血中グルコースを有することが見出されたものであった（平均は、３００ｍｇ／ｄｌの付近に集まった）。次いで、１日当たり１．２Ｕのブタのインシュリンを７日間放出するインシュリンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を、套管針により肩甲骨の上に皮下移植した。糖尿病状態からの回復（血中グルコース＝１００ｍｇ／ｄｌ）をモニターした後で、膵管培養物に由来する細胞又は単離した成体膵臓を、標準的外科手順を用いて副腎の下に移植した。５００，０００又は１０６の細胞（導管培養物の非接着性細胞（ＮＡＣ）画分）をマウスに移植した。偽薬、小島及びインシュリンペレットのみのグループ内のすべての手術したマウスは生存した。６／７の細胞移植されたマウスは、移植後４８〜７２時間で死亡した。すべてのグループについて、空腹時血糖を、尾からの採血により、標準的間隔で測定した。
【０２１７】
図４０に示したように、分化した膵管単層の非接着性部分に由来する機能的ベータ細胞を含む不均一集団を、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理した糖尿病マウスに移植した。ＳＴＺを注射されたＳＣＩＤマウスは、４８時間以内に糖尿病的になった。次いで、インシュリン含有ペレットを皮下に移植して血中グルコースを安定させて、細胞移植のための一層安定な環境を造った。このインシュリンペレットは、移植の７日後に、Ｔ＝１１日（Ｔ１１）で終了するようにデザインされた。ペレット移植の４８時間以内に、これらの動物の空腹時血糖は、２８０〜３８０ｍｇ／ｄｌの血中グルコースから５０ｍｇ／ｄｌ未満まで低下した。試験グループにおいては、次いで、陽性対照としての細胞又は成体小島を副腎下に移植した。１週間後（Ｔ１３）に、空腹時血糖を測定し、１６、２１及び２８日目にも測定した。黒い正方形は、偽薬のグループ（ｎ＝５マウス）を表し、予想されるように、インシュリンの非存在下で、血中グルコースは、時間をかけて３００ｍｇ／ｄｌより上までゆっくり上昇した。インシュリンペレットだけを移植されて細胞移植物を移植されなかった動物（ｎ＝５）も又、予想されたように挙動し、一時的救済に続いて、インシュリン放出用の錠剤が終了した後に糖尿病のリバウンドが生じている（赤い菱形）。小島を受容した動物（青い三角形、ｎ＝５、４００小島／動物）は、完全な長期間の救済を示し、空腹時血中グルコースは、約１００ｍｇ／ｄｌに維持された。導管由来の細胞を受容した単一の生存動物（緑の円、ｎ＝１（７の内の））は、糖尿病状態の一時的な救済を示した。この単一の動物は、４〜５日の＞１５０ｍｇ／ｄｌの血中グルコースの低下を示した後、移植前の血中グルコースレベルに戻った。
【０２１８】
実施例６：膵導管球培養
方法：
膵管の分離
Ｐ１４ラットの膵臓を集めて、激しく浸透している３７℃の水浴中で、４０分間、コラゲナーゼＡ型（１Ｕ／ｍｌ）で消化した。消化された組織を、ＨＢＳＳで洗い、５００ミクロンメッシュ（Ｃｏ−Ｓｔａｒ Ｎｅｔｗｅｌｌ）を通して濾過して、ＨＢＳＳ中に取った。これらの組織懸濁液を、次いで、４５％ Ｐｅｒｃｏｌｌ 勾配上の３５％ Ｐｅｒｃｏｌｌに重ねて（容積比１：１：１）、１９７０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。これらの導管を、上層とＰｅｒｃｏｌｌ勾配の界面で集めて、２％ ＢＳＡを含むＨＢＳＳで洗った。これらの島を、この導管懸濁液から解剖顕微鏡下で注意深く取り出した。
【０２１９】
導管細胞の分離
このＨＢＳＳ中の導管懸濁液を、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その導管ペレットを、１．３３ｍｇ／ｍｌ トリプシン、０．７ｍｇ．ｍｌ ヒアルロニダーゼ、０．２ｍｇ／ｍｌ キネレン酸（ｋｙｎｅｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ）及び２００Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含むＨＢＳＳ中）を含む分離用酵素カクテルに取って、３７℃で４分間インキュベートし、その後、室温で３分間インキュベートした。これらの消化を、１／４容の４％ ＢＳＡ（ＨＢＳＳ中）の添加により停止させた。分離された導管細胞を、７０ミクロンのナイロンメッシュを通して濾過して、１４５０ｒｍｐで５分間遠心分離した。これらの細胞ペレットを、再び、４％ ＢＳＡ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含むＨＢＳＳ中）で洗った。これらの分離された単一導管細胞を、培養培地に再懸濁して、トリパンブルーを用いて生存細胞を計数した。
【０２２０】
拡張のための導管球培養
これらの分離された導管細胞を、６百万細胞／Ｐ１００ペトリ皿の密度で、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ、８ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦα、３０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ、２％ Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、８ｍＭ ＨＥＭＥＳ、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中）を含む培養培地に播種した。これらの成長因子を、この培地に、これらの細胞を最初にプレートしてから４８時間ごとに加えた。この球を、懸濁液中に球を得ること及びそれらの球を０．０１６％ トリプシン（３７℃、３分間）を用いて分離することによって継代し、消化を、１／４容の４％ ＢＳＡにより停止した。上記の培地は、最適の成長用培地である。他の培地を試験したところ、効果が変化した。試験培地１は、１５％ ＫＯ−ＳＲを含み、ＴＧＦα、ＨＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩを加えたＫＯ−基礎培地である。試験培地２は、１５％ ＫＯ−ＳＲを含み、ＴＧＦα、ＨＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩを加えた肝臓基礎培地である。試験培地３は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦを含むＮ−２ベースのＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地である。試験培地２において、細胞は、急速に成長することができるが、一層健康でないようである。試験培地３において、細胞は、一層ゆっくりと成長するが、一層健康であるようであった（図４２参照）。
【０２２１】
導管球の部分的イン・ビトロ分化
これらの球を、培養培地から穏やかに集めて１５ｍｌの管に入れて、重力によって沈降させた。次いで、これらの球を、３０マイクロモルのフォルスコリン、１００ｎｇ／ｍｌ ＰＹＹ、５％ ＦＢＳ（２５ｍＭ グルコースを含むイスコブ改変ダルベッコ培地中）を含む分化用培地中のＨＴＢ９マトリクスを含む９６ウェルプレートに播種した。これらの細胞は、このマトリクス上に単層を形成して、４〜７日間分化してから、ＰＢＳで洗って１％ ＰＦＡで固定することにより分化を停止した。
【０２２２】
結果：
非組織培養（非接着性）プレートにおいて、成長因子例えばＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦを含む培地中で培養した導管細胞は、最初の播種後２日の期間で球を形成した。少数の細胞は、このプレートの底に付着するようになったが、これらの球は、懸濁液中に見出されて、プレート又はプレートに接着する他の細胞に接着しなかった（図４１）。これらの球を、平均５日ごとに継代することにより、２４日間増殖させた。非接着性細胞だけが継代された。
【０２２３】
ＨＴＢ９マトリクス上に細胞をプレートした後に、殆どの細胞は、これらの球から外へ移動して、プレートしてから２４時間以内に単層を形成した。これらの細胞を１％ ＰＦＡにより固定して、抗Ｇｌｕｔ２及び抗ネスチン抗体で同時染色した。Ｇｌｕｔ２発現細胞は、クラスター中にあって、それらは、ネスチン発現細胞から排除されており、これは、ネスチン細胞がこの集団中の未分化細胞であることを示唆している。ネスチンは、典型的には、比較的未分化の細胞のマーカーである。Ｇｌｕｔ２は、膵臓のβ細胞になる傾向のある細胞のマーカーである。９６ウェルプレート中に、約２６のＧｌｕｔ２クラスターがあった（図４３）。
【０２２４】
これらの球から分化した細胞は又、Ｐｄｘ−１タンパク質及びグルカゴンタンパク質をも発現した。これらのプレート上には、多くのＰｄｘ−１発現細胞のコロニーがあり、これらのコロニー中にはグルカゴン発現細胞が散在した。これらのグルカゴン陽性細胞は、Ｐｄｘ−１陽性ではなかった。このプレート上の細胞コロニーがおそらくは共通の前駆細胞のセットから生じたとすると、前駆細胞の単一のグループが、グルカゴン発現細胞及びＰｄｘ−１発現細胞の両方を生じさせることができるらしい。９６ウェルプレート当たり約２４〜２６のＰｄｘ−１陽性コロニーがあり、各コロニーは、平均で１５〜２０細胞を含んだ。
【０２２５】
Ｐｄｘ−１タンパク質及びインシュリンタンパク質の同時染色は、上記のように、多数のＰｄｘ−１発現コロニーを示した。インシュリン発現細胞は、Ｐｄｘ−１発現コロニーときつく結合した。Ｐｄｘ−１陽性細胞の約１６％は又、インシュリン陽性でもあったが、幾つかのインシュリン陽性細胞は、Ｐｄｘ−１を発現しなかった。これは、Ｐｄｘ−１及びインシュリン陽性細胞が同じ前駆細胞のセットに由来したことを強く示唆している（図４５）。
【０２２６】
成長状態（未分化）の導管球を、細胞マーカーの発現につきアッセイした。球を分離してサイトスピンスライド上に置いた。これらの細胞を、抗ネスチン抗体で染色した。５０％の細胞が、ネスチンタンパク質を発現し、これは、分化後のネスチン陽性細胞の割合より遥かに多い。これは、ネスチン陽性細胞が未分化であるということを再び示唆する。未分化球からの細胞は、更に、Ｐｄｘ−１／インシュリン又はＧｌｕｔ−２／ネスチンにより同時染色された。陽性細胞を、蛍光顕微鏡下で計数した。Ｐｄｘ−１発現細胞があっても、陽性細胞／全細胞集団比は、分化後の球の細胞（約５〜８％）よりも成長状態の球で一層低かった（約２％）。（図４６Ａ、４６Ｂ、４７及び表３）。
【０２２７】
実施例７：造血細胞球（「ヘム球」）の培養
Ａ．Ｌｉｎ−胎児肝細胞の分離
Ｅ１３．０マウス胚に由来する胎児肝を分離し、滴定して単一細胞懸濁液を得た。細胞を、次の造血細胞系統マーカーに特異的なビオチン結合体化抗体のカクテルとインキュベートした：Ｔｅｒ−１１９、Ｍａｃ−１、Ｇｒ−１、Ｂ２２０、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ．２。ストレプトアビジン−ＭＡＣＳ磁気ミクロビーズとのインキュベーション後に、標識細胞をＭＡＣＳ涸渇カラムを通過させた。その通過画分は、Ｌｉｎ−細胞集団を含んだ。すべての細胞画分を、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ及びＬｉｎマーカーの存在につき分離時にＦＡＣＳ分析した（下記参照）。
【０２２８】
Ｂ．Ｌｉｎ−Ｅ１３．０胎児肝細胞の培養
４〜８×１０６のＬｉｎ−胎児肝細胞を１０ｍｌの半球培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、８ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝剤、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン、１：５０希釈のＢ−２７、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ）に再懸濁した。２つの別個の培養条件を確立した；半球培養＃１には、１００ｎｇ／ｍｌ ｍＳＣＦを補い、半球培養＃２には１００ｎｇ／ｍｌ ｍＳＣＦ、１０００Ｕ／ｍｌ ｍＬＩＦ、５０ｎｇ／ｍｌ ｍＦｌｔ３リガンドを補った。これらの細胞をそれらの各培地（１０ｃｍ非接着性プラスチックペトリ皿上）にプレートした。細胞を、１週間インキュベートした（その間、細胞は、培地中で凝集し又はクラスターが出現した）。これらの培養において、細胞死も出現した。１週間後、これらの細胞をトリプシン処理して単一細胞にし、新鮮な培地に再播種した。この培養物をトリプシン処理により継代するたびに、新たな細胞クラスターが形成された。両培養条件において、これらの細胞クラスターは、健康な、生存力のある細胞のみを含んだ。
【０２２９】
Ｃ．培養についての所見
ヘム球培養＃１ （ ＳＣＦ添加）：これらの細胞クラスターは、健康な、生存力のある細胞のみを含んだ。これらの培養において明らかな単一細胞の２つの集団があった（健康な、生存力のある細胞及び死んだ細胞）。これらの細胞クラスターは、懸濁液中でゆるい凝集物として成長した（図４８及び４９参照）。これらのクラスターは、非常に大きくなりえたが、それらの中の細胞は、健康なままであった。
【０２３０】
ヘム球培養＃２ （ ＳＣＦ、ＬＩＦ、Ｆｌｅｔ３−リガンド添加 ）：これらの細胞培養は、健康な、生存力のある細胞を含んだ。これらの培養において明らかな単一細胞の３つの集団があった（少数の健康な、生存力のある細胞、多くの不規則な形状の細胞及び多くの死んだ細胞）（図５０）。これらの培養は、培養＃１よりもずっと速い細胞増殖速度を示した。細胞クラスターは、培養＃１ほど大きな凝集物にならなかった。
【０２３１】
培養のＦＡＣＳ分析
これらの細胞表面抗原プロファイルＳｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−のマウス造血細胞は、以前に、胎児肝及び骨髄の両方からの幹細胞の再定着において高度に富化されていることが示されている（参考文献１、Ｒｅｉｅｗ）。
【０２３２】
ヘム球培養＃１
Ｌｉｎ涸渇前には、分離されたＥ１３．０胎児肝の出発集団中のＳｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−細胞の集団は、０．０６％であった（幹細胞富化ゲート、Ｒ２）（図５１、右上、ゲートＧ５）。Ｌｉｎ涸渇後に、それは、０．３９％に増大した（図５２、右下、ゲートＧ５）。１％未満のＬｉｎ＋細胞が、ＬｉｎＬ−集団中に残った（示してない）。培養１４日後に、これらの細胞の９０％がＬｉｎ−のままであった。それらのＬｉｎ−細胞の内で、７９％は、Ｓｃａ＋且つｃ−ｋｉｔ＋でもある（左上ドットプロット、図５３）。この細胞集団は、非常に均質であって、ＦＳＣ及びＳＳＣプロットにより示したように少数の死んだ細胞を含んでいた（図５３、右パネル）。培養２０日後に、この細胞集団は、均質なままであった。このＳｃａ＋、ｃ−ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−集団は、この培養中の生存力のある細胞の６７％を構成した（図５４）。
【０２３３】
ヘム球培養＃２
分離されたＥ１３．０胎児肝の出発集団中のＳｃａ＋、ｃ−ｋｉｔ、Ｌｉｎ−細胞集団は、Ｌｉｎ涸渇前には、０．２７％であった（幹細胞富化ゲート、Ｒ２）（図５５、右下、ゲートＧ５）。Ｌｉｎ涸渇後に、それは、１．９９％まで増大した（図５６、右下、ゲートＧ５）。約１〜２％のＬｉｎ＋細胞が、Ｌｉｎ−集団中に残った（示してない）。培養７日後に、それらの細胞の７．３５％が、Ｌｉｎ−のままであった。これらのＬｉｎ−細胞の内で、１０．７８％は、Ｓｃａ＋及びｃ−ｋｉｔ＋でもあった（図５７）。この低いパーセンテージは、大部分のＬｉｎ−集団がＳｃａ−１及びｃ−ｋｉｔを発現しないからである。又、全集団中のこれらの細胞の大部分は、沃化プロピジウム染色により判断すると、死んでいた（示してない）。これらの死んだ細胞は、ＦＳＣ及びＳＳＣプロットにおいてＲ１ゲートの外に位置する細胞の大きな対角線集団に局在化しいている（図５７、右パネル）。培養１１日後に、Ｓｃａ＋、ｃ−ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−集団は、培養物中のすべての生存力のある細胞の２８．２８％を構成した（図５８、右下、ゲートＧ５）。事実上、すべての生存力のある細胞は、今や、Ｓｃａ−１を発現していた。ＦＣＳ及びＳＳＣプロットにより示されるように、依然として、多くの死細胞が培養物中にあった。
【０２３４】
ヘム球培養中の細胞の組織学的分析
各ヘム球培養由来の細胞をスライドガラス上にサイトスピンして、メイ−グリュンバルトギムザ染色した（図５９）。ヘム球培養＃１由来の細胞（２０日間培養）を左パネルに示してある。ヘム球培養＃２由来の細胞（１３日間培養）を右パネルに示してある。両培養由来の細胞培養物は、大部分が核で、僅かの細胞質を有する細胞を示している。これは、未成熟細胞型と一致する。多くの顆粒及び液胞も見られる。このクラスター（培養＃１中）の周辺の細胞は、一層マクロファージ様に見える。これらの細胞の未成熟な表現型及び顆粒を有する外観は、イン・ビトロＡＧＭ培養（参考文献２）から得られたもの及び ＡＧＭ由来の内皮細胞株上で成長した胎児肝細胞（参考文献３）から得られたものと類似している。
【０２３５】
実施例８：ラット膵導管球の培養及び分化
１部 ． 第一次球（分離した導管から培養する）は、島の内分泌細胞分化のための非常に強力な幹細胞又は前駆細胞である。
【０２３６】
導管を、１．３３ｍｇ／ｍｌ トリプシン、０．７ｍｇ／ｍｌ ヒアルロニダーゼ、０．２ｍｇ／ｍｌ キネレン酸及び２００Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼを含む分離用酵素カクテルによって単一細胞に分離して、球培養培地（１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、４０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ、８ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦα、３０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ、２％ Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、８ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンをＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中に含む培養培地）中にプレートする。培養２日後に、第一次球を、分化用培地（２００ｎｇ／ｍｌ ＰＹＹ及び３０μＭ フォルスコリンを含むイスコブ培地中の５％ ＦＢＳ）中のＨＴＢ−９マトリクス上に取って、４日間分化させた。これらの細胞を１％ ＰＦＡにより固定してから、ＩＨＣ分析を行なう。
【０２３７】
４日間分化した一次球は、インシュリンとｐｄｘ−１タンパク質の両方を発現する多量の細胞を生じさせた。全細胞集団中のインシュリン発現細胞のパーセンテージは、分離してない導管から出発する以前の球培養法のそれよりもずっと高い（図６０）。
【０２３８】
一層長い分化時点は、一層良好なイン・ビトロ分化結果を示す。未分化球が８日間分化条件にあると、インシュリン発現レベルが、４日間だけ分化した球と比べて大いに増大した（免疫組織化学により検出）。図６１は、５０％を超える細胞がインシュリンとｐｄｘ−１の両方を発現することを示している。（図６１）
【０２３９】
インシュリン発現細胞に加えて、多くのｇｌｕｔ−２発現細胞もある。Ｇｌｕｔ−２は、成熟島β細胞で発現されるグルコース輸送体であり、β細胞前駆細胞のマーカーでもありうる。興味深いことに、すべてのインシュリン発現細胞がｇｌｕｔ−２タンパク質を同時発現する訳ではない。それは、これらのｇｌｕｔ−２陰性でインシュリン陽性の細胞が前駆細胞から新たに誘導されたβ細胞であって、完全に成熟したβ細胞ではないという可能性を示唆しうる（図６２）。
【０２４０】
３つのマーカーインシュリン、ｐｄｘ−１及びｇｌｕｔ−２の発現及び３つの異なるステージ（Ｔ＝０で新たに分離した導管細胞、分化前の成長中の球及び８日の分化後の球）におけるそれらの相対的レベルを示す半定量的プロット。Ｔ＝０では、３％未満のインシュリン発現細胞があり、分化前には、約６％のインシュリン発現細胞があるが、８日の分化後には、インシュリン発現細胞は、５６％にまで達した（図６３）。
【０２４１】
２部 ． 成長用培地における種々の成長因子は、細胞に同じ分化条件を与えても、分化により得られる内分泌細胞系統に影響を及ぼす。
これらの６種類の成長因子に加えて、１５％ ＫＯＳＲをこの成長培地に含有させた場合には、１２日の分化の後に多くのグルカゴン発現細胞があった。殆どのグルカゴン細胞は、ｐｄｘ−１を発現せず、これは、島内の成熟α細胞に典型的な表現型である（図６４）。
【０２４２】
図６４に記載したものと同じ成長因子条件に対しては、かなりの数のｐｄｘ−１をも発現するインシュリン発現細胞もある（図６５）。
【０２４３】
他の６種類の成長因子に加えて、ＬＩＦを成長培養培地（分化用培地と反する）に含有させた場合には、分化に際して一層少なくインシュリンを発現する多くの細胞があったが；ソマトスタチン発現細胞の相対的な数は、多いに増大した。殆どのソマトスタチン発現細胞は、ｐｄｘ−１を発現しない（δ細胞の典型）が、少数のソマトスタチン発現細胞は、ｐｄｘ−１を同時発現し、これは、それらが、成熟ソマトスタチン細胞及びＰＰ細胞（φ細胞）の前駆細胞でありうることを示唆している（幾つかの内分泌細胞系統モデルによる）（図６６）。
【０２４４】
３部 ． 導管由来の、インシュリン陽性細胞は、グルコース反応性である。
グルコースは、図６４及び６６に記載した球におけるインシュリン放出を刺激した（図６７）。これは、分化したインシュリン陽性細胞が、内因性の膵臓β細胞のグルコース調節活性を実施することができることを示している。
【０２４５】
４部 ． 球培養条件における導管細胞は、培養４５日後に、内分泌及び外分泌細胞系統の両方について多能性を維持する。
培養４５日後でさえも、インシュリンとｐｄｘ−１は、多くの細胞において、同時発現され、これは、殆どの細胞が未分化のままであることを示唆している（図６８）。
【０２４６】
図６９は、細胞におけるグルカゴン発現を示しており；殆どのグルカゴン細胞はｐｄｘ−１を発現しないが、少数のグルカゴンとｐｄｘ−１を同時発現する細胞があり、これは、成熟β細胞及びα細胞の初期前駆細胞の可能性を示唆している。興味深いことに、ｐｄｘ−１陽性細胞の殆ど９０％である大きいクラスターがあった。長期の球培養中にこれらの細胞を一層ｐｄｘ−１陽性にする相乗的事象がありうるということが強く示唆される。図７０は、同培養に由来する細胞におけるソマトスタチン発現を示している。
【０２４７】
図７１は、上記の培養に由来する細胞が外分泌マーカー、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）を発現することを示している。その上、これらのＣＰＡ細胞は、インシュリンを発現する細胞と同じクラスター内に現れたが、ＣＰＡとインシュリンの両方を発現する細胞はなかった。これは、これらの内分泌及び外分泌細胞が同じ前駆細胞に由来することを強く示唆している。それ故、これらの細胞は、外分泌細胞から内分泌細胞に及び多くの異なる内分泌細胞型を含む広範囲の発生能力を有している。
【０２４８】
実施例９：ヒトの膵導管球培養
方法：
１．ヒトの膵管の分離
ヒトの膵臓組織（ドナーの年齢：５〜６０歳）を、国立糖尿病研究所（ＮＤＲＩ）から得た。この膵臓を、ＵＷ培地で浸出して、ＲＰＭＩ培地液中で氷冷して輸送した。組織を、ドナーから取り出してから２０時間以内に分離した。到着時に、膵臓を、氷冷ＨＢＳＳ中に置き、遊離の脂肪、リンパ組織、小腸及び脾臓を切り取った。この膵臓を、小片（約０．５ｃｍ３）に切って、氷冷した１×ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない）中に集めた。この膵臓組織を、次いで、１５００ｒｐｍで遠心分離して、ペレットを氷冷リベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）中に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。この組織を、次いで、激しく震盪している３７℃の水浴中に置いた。この膵臓組織消化に由来する上清を、１０分ごとに集めて、組織の完全な消化が起きるまで新鮮なリベラーゼを残存組織に加えた。各集めた上清画分を、直ちに、等容積の氷冷１０％ ＢＳＡ／１×ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない）中に希釈し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その上清を取り出し、細胞ペレットを、１×ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない）に再懸濁して、氷上に保持した。これらの消化した組織画分を、一緒にプールして、ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない）で３回洗った。この組織懸濁液を、次いで、調製した二層（上層は、３５％のパーコールを含み、下層は、４５％のパーコールを含む）よりなるパーコール勾配の上に１：１：１の容積比で重ねた。この勾配を、１９７０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上部の水層と３５％パーコール層の間で採取した導管画分を、１×ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない）で３回洗って如何なる残留パーコールをも除去した。
【０２４９】
２．集めた導管の分離
最終的に分離した導管組織を１５００ｒｐｍでの遠心分離により集めて、１×ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含む）に再懸濁させた。この懸濁液を、次いで、１５００ｒｐｍで遠心分離した。この細胞ペレットを、１×ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含む）中に１．３３ｍｇ／ｍｌ トリプシン、０．７ｍｇ／ｍｌ ヒアルロニダーゼ、０．２ｍｇ／ｍｌ キネレン酸及び２００Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼを含む酵素カクテル中に再懸濁させて、３７℃で６分間インキュベートしてから、４分間室温でインキュベートした。この消化を、１／４容の１×ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含む）中の１０％ ＢＳＡの添加により停止させた。これらの細胞を、次いで、５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離して、その細胞ペレットを、１０％ ＢＳＡ／１×ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含む）中に再懸濁させた。この細胞懸濁液を、再び１５００ｒｐｍで遠心分離して、その細胞ペレットを、ＤＮアーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）を補った１×ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウムを含む）に再懸濁させて３７℃に１０分間置いた。分離された単一の導管細胞を、１５００ｒｐｍで遠心分離して、その細胞ペレットを培養培地中に再懸濁させてプレートした。
【０２５０】
３．細胞の継代及び培養
これらの分離したヒト導管細胞を、Ｔ−７５Ｎｕｎｃフラスコ中に又は１５％ ノックアウト血清リプレースメント（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、４０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ、８ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−α、３０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ、２％ Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、８ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地中（非組織培養処理したペトリ皿上）に播種した。これらの細胞フラスコ又は非組織培養ペトリ皿を、３％ 酸素、５％ ＣＯ２を含む組織培養インキュベーター内に３７℃で維持した。補足の成長因子を、この培地に、最初に細胞をプレートした後、４８時間ごとに添加した。その結果生成した細胞凝集物を、細胞ペレットをトリチウム化して新鮮な培養培地に再懸濁させることにより又はこれらの細胞をコラゲナーゼＩにより完全に分離することによって連続的に継代した。
【０２５１】
ヒトの膵管をリベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）により分離してパーコール勾配により精製した。これらの導管を、次いで、単一細胞に分離し、球培養のために、非接着性のＴ−７５Ｎｕｎｃフラスコ内に、１５％ ノックアウト血清リプレースメント（ＫＯ−ＳＲ）及び６種類の成長因子（即ち、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦα、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地中にプレートした。これらの球は、時間と共に成長する（図７２）。
【０２５２】
導管球を、上記の無血清培地中で成長させ、それらの細胞を、平均５日ごとに継代した。この条件下で経時的にＣＫ−７（導管上皮のマーカー）の富化があった。図は、継代１において、約５０％の細胞が、ＣＫ−７につき陽性に染色されたことを示している。対照的に、この培養の前には、約６％のＣＫ−７陽性細胞があった。（図７３）。
【０２５３】
導管球を、ＨＴＢ−９マトリクスで被覆した９６ウェルプレートに、５％ ＦＢＳ、３０μＭ フォルスコリン及び２００ｎｇ／ｍｌ ＰＹＹを含む分化用培地（２５ｍＭ グルコースを含むイスコブ改変ダルベッコ培地中）に４日間播種した。これらの細胞を、１％ ＰＦＡで固定して、抗インシュリン及び抗ｐｄｘ−１抗体により同時染色した。図は、殆どの細胞質インシュリン発現細胞がｐｄｘ−１をも発現し；ｐｄｘ−１を発現しないインシュリン発現細胞は少ないことを示している。これらの２つの種類のインシュリン陽性細胞は、島におけるβ細胞のマーカーとして十分に文献に記載されている。（図７４）。
【０２５４】
一層多くのインシュリン発現細胞が、ＨＴＢ−９マトリクス上の分化用培地上での、上記と同じ培養条件での１１日間の培養後に出現した。図７５は、図７４に示したものと比べて一層大きいインシュリン陽性細胞のクラスターを示している。約１０％のインシュリン陽性細胞が各ウェル中にある。
【０２５５】
幾つかの細胞は、ｐｄｘ−１とソマトスタチンを同時発現した。他の重要な島細胞型（δ細胞）である特徴的なソマトスタチン陽性細胞もある。それらのソマトスタチン発現細胞は、ｐｄｘ−１発現クラスター中に現れたが、これら２種類のマーカーは、同じ細胞内で発現されず、これは、これらの２種の細胞型が、同じ前駆細胞に由来しうることを示唆している。（図７６）。
【０２５６】
ビメンチンは、繊維芽細胞のマーカーである。図７７は、Ｇｌｕｔ２タンパク質発現細胞がクラスター内にあって、ビメンチンタンパク質発現細胞から排除されていることを示している。９６ウェル中に約５０％のＧｌｕｔ２−クラスターがあった。この集団中に約１０％のインシュリン発現細胞しかなかったという事実から、多数のｇｌｕｔ−２発現細胞は、前駆細胞を示しえた。
【０２５７】
表１：導管培養物の免疫染色
単離した導管におけるマーカー発現及び導管培養物におけるインシュリン。導管断片当たりの平均細胞数は、３４５０±１８６０（ｎ＝１０）であり、間充織／間質細胞に囲まれた上皮細胞の単層を含んだ。全ての分離した導管（ｎ＝６０〜９０）上の陽性免疫染色は、次の通りであった：インシュリン７／９０導管、３２陽性細胞；ＰＤＸ−１　４／７５導管、１５陽性細胞；ＰＹＹ　５／６０導管、３１細胞；アミラーゼ１０／６９導管、４９細胞。ＰＤＸ−１、ＰＹＹ、アミラーゼについての分離ｎ＝２；インシュリンについての分離ｎ＝４。ＮＡＣの収量は、８０，０００〜１３０，０００細胞／調製物に及び；最大値は、観察された細胞密度に基づく理論的最大値は３００，０００細胞／調製物（１０，０００ＮＡＣ／ｃｍ２）であるが、１６０，０００であった。
【表１】
Figure 2004505627
【０２５８】
表２：導管培養物におけるＰＤＸ−１、ＰＹＹ及びアミラーゼの免疫染色
培養物中のインシュリン陽性細胞の９６〜１００％は、ＰＤＸ−１陽性細胞でもあった。加えて、ＰＤＸ−１陽性、インシュリン陰性細胞は、培養のすべての状態で出現しているが；ＤＣＥ活性化単層においては、これらの細胞数が増加し（２０〜５０％多い）、一層多くの細胞質ＰＤＸ−１細胞がある。単層中のＰＹＹの見かけの変化は、殆ど又は全くないが、ＰＹＹは、現れつつあるＮＡＣに存在するようである。
【表２】
Figure 2004505627
【０２５９】
表３：サイトスピンスライド上の球（２４日間培養した未分化細胞）におけるマーカー染色
【表３】
Figure 2004505627
【０２６０】
Figure 2004505627
Figure 2004505627
Figure 2004505627
Figure 2004505627
Figure 2004505627
Figure 2004505627
【０２６１】
同等物
当業者は、この発明のここに記載した特定の具体例に対する多くの同等物を認識し又は日常的実験を利用して確かめることができるであろう。かかる同等物は、後記の請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
膵管の分離。この略画は、研究下の導管を得た方法を説明している図である。
【図２】
膵管の培養及びインシュリン染色を示す図である。
【図３】
導管の単層が、複数の前駆細胞マーカーを発現することを示す図である。
【図４】
因子の添加が、非接着性細胞（ＮＡＣ）型の出現に影響を及ぼすことを示す図である。
【図５】
複数のホルモン含有細胞型が、ＮＡＣ集団において検出されることを示す図である。
【図６】
ＮＡＣにおけるＰＤＸ−１、インシュリン及びグルカゴン発現の単一細胞ＰＣＲ（ＳＣ−ＰＣＲ）分析を示す図である。
【図７】
培養した導管のインシュリン含量及びグルコース応答を示す図である。
【図８】
ＮＡＣにおけるグルコース誘導されたカルシウムの流れを示す図である。
【図９】
ＤＣＥによる分化の誘導を示すグラフである。
【図１０】
フォルスコリン、ジブチルｃＡＭＰ及びＮａ−ブチレートの分化誘導に対する効果を示すグラフである。
【図１１】
セクレチンの浮遊前駆細胞の誘導に対する効果を説明するグラフである。
【図１２】
セクレチンの浮遊前駆細胞の誘導に対する効果を説明するグラフである。
【図１３】
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）も又、導管単層から浮遊前駆細胞の出現を誘導することをことを示すグラフである。
【図１４】
インシュリンが、セクレチン誘導される分化を減少させることを示すグラフである。
【図１５】
ＰＮＡ染色に基づいてソートした後に２週間培養した細胞の表現型を例示する顕微鏡写真である。
【図１６】
ＰＮＡ染色に基づいてソートした後に２週間培養した細胞の表現型を例示する顕微鏡写真である。
【図１７】
ＰＮＡ染色に基づいてソートした後に２週間培養した細胞の表現型を例示する顕微鏡写真である。
【図１８】
成体及び胎児の膵臓におけるＰＮＡ染色の特異性を例示する顕微鏡写真である。
【図１９】
成体及び胎児の膵臓におけるＰＮＡ染色の特異性を例示する顕微鏡写真である。
【図２０】
典型的な単一細胞ｍＲＮＡＰＣＲ増幅反応の結果を示す電気泳動ゲルの写真である。
【図２１】
膵臓の発生中の遺伝子発現の変化を説明する表である。
【図２２】
べータ細胞及びそれらの前駆細胞を検出するためのマーカーの配列の一具体例を例示する図表である。
【図２３】
成体及び胎児の膵臓組織及び心臓における遺伝子発現の概要を描写するオートラジオグラフである。
【図２４】
遺伝子発現の定量的分析が、細胞の遺伝子発現の概要の測定の部分として、如何に行われ得るかを例示するグラフである。
【図２５】
異なるステージにおける及び異なる刺激後の、胎児の膵臓組織における遺伝子発現の概要を描写するオートラジオグラフである。
【図２６】
オートラジオグラフの定量的分析を例示するグラフである。
【図２７】
いわゆる浮遊前駆細胞における遺伝子発現の概要を描写するオートラジオグラフである。
【図２８】
図２７のオートラジオグラフの定量的分析を例示するグラフである。
【図２９】
成体の小島間での、膵臓発生中における、ある遺伝子の発現の相対的レベルを示す表である。
【図３０】
ある種のレクチンの成体ラットの膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図３１】
ある種のレクチンの成体ラットの膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図３２】
ある種のレクチンの成人の膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図３３】
ある種のレクチンの成人の膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図３４】
ある種のレクチンの成人の膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図３５】
ある種のレクチンの成人の膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図３６】
ある種のレクチンの成人の膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図３７】
ある種のレクチンの成人の膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図３８】
ある種のレクチンの成人の膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図３９】
ある種のレクチンの成人の膵臓に対する結合を例示する顕微鏡写真である。
【図４０】
膵管由来の培養物に由来する移植された細胞が、一時的に、糖尿病状態を救済することを示す図である。
【図４１】
拡張用培地（試験用培地３）での成長における、非接着性球及び付着した細胞を示す顕微鏡写真である。
【図４２】
試験用培地１、試験用培地２又は試験用培地３での成長における、非接着性球を示す顕微鏡写真である。
【図４３】
非接着性前駆細胞から分化した細胞におけるｇｌｕｔ２及びネスチンタンパク質発現を示す顕微鏡写真である。
【図４４】
非接着性前駆細胞から分化した細胞におけるＰＤＸ−１及びグルカゴンタンパク質発現を示す顕微鏡写真である。
【図４５】
非接着性前駆細胞から分化した細胞におけるＰＤＸ−１及びインシュリンタンパク質発現を示す顕微鏡写真である。
【図４６Ａ】
生育状態の及び分化中の導管球を、細胞マーカーにつきアッセイしたときに、インシュリン陽性細胞が、分化中に劇的に増大したことを示す図である。
【図４６Ｂ】
生育状態の及び分化中の導管球を、細胞マーカーにつきアッセイしたときに、インシュリン陽性細胞が、分化中に劇的に増大したことを示す図である。
【図４７】
未分化の非接着性前駆細胞におけるネスチンタンパク質発現を示す顕微鏡写真である。
【図４８】
半球培養＃１における非接着性細胞クラスターを示す顕微鏡写真である。
【図４９】
半球培養＃１における非接着性細胞クラスターを示す顕微鏡写真である。
【図５０】
半球培養＃２における非接着性細胞クラスターを示す顕微鏡写真である。
【図５１】
半球培養＃１のための出発材料のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５２】
半球培養＃１のための出発材料の、Ｌｉｎ＋涸渇後のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５３】
１４日間の培養後の、半球培養＃１のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５４】
２０日間の培養後の、半球培養＃１のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５５】
半球培養＃２のための出発材料のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５６】
半球培養＃２のための出発材料の、Ｌｉｎ＋涸渇後のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５７】
７日間の培養後の、半球培養＃２のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５８】
１１日間の培養後の、半球培養＃２のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５９】
２０日目の半球培養＃１（左側パネル）及び１３日目の＃２（右側パネル）からの細胞を、スライドガラス上にサイトスピンさせ、メイ−グリュンバルトギムザ染色したものを示す図である。
【図６０】
４日間分化した一次球が、インシュリン及びｐｄｘ−１タンパク質の両方を発現する多量の細胞を生じさせることを示す顕微鏡写真である。
【図６１】
一層長期の８日間の分化後の、インシュリン及びＰｄｘ−１タンパク質発現を示す顕微鏡写真である。
【図６２】
８日間の分化後の、インシュリン及びＧｌｕｔ２タンパク質発現を示す顕微鏡写真である。
【図６３】
３つの異なるステージ（新たに分離されたＴ＝０の導管細胞、分化前の成長中の球、及び分化後８日目の球）における、３つのマーカー、インシュリン、Ｐｄｘ−１及びＧｌｕｔ−２のタンパク質発現及びそれらの相対的レベルを示すプロットを示す図である。
【図６４】
グルカゴン及びＰｄｘ−１タンパク質発現を示す顕微鏡写真である。
【図６５】
図６４に記載したのと同じ成長因子条件について、ｐｄｘ−１をも発現するかなりの量のインシュリン発現細胞もあることを示す図である。
【図６６】
ＬＩＦの存在下で１２日間分化させて、ソマトスタチン及びＰｄｘ−１タンパク質発現につき染色した球の顕微鏡写真である。
【図６７】
分化した細胞によるグルコースで刺激されたインシュリン放出のグラフである。
【図６８】
４５日間の培養後にインシュリン及びｐｄｘ−１を同時発現する細胞を示している図である。
【図６９】
分化条件での４５日間の培養後の細胞におけるグルカゴン及びＰｄｘ−１の発現を示す図である。
【図７０】
図６９に示した培養に由来する細胞でのソマトスタチン発現を示す図である。
【図７１】
上記の培養に由来する細胞が外分泌マーカー、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）を発現することを示している図である。
【図７２】
Ａ．新たに分離されたヒト膵管、Ｂ．１日間の培養における導管細胞、Ｃ．３日間の培養における導管細胞を示す図である。
【図７３】
生育培地中のヒトの導管球を示す図である。
【図７４】
４日間分化用培地中にあるヒトの導管球を示す図である。
【図７５】
１１日間分化用培地中にあるヒトの導管球を示す図である。
【図７６】
１１日間分化用培地中にあるヒトの導管球を示す図である。
【図７７】
１１日間にわたるヒト導管球のイン・ビトロでの分化を示す図である。

Claims (50)

  1. 前駆細胞の実質的に純粋な非接着性集団を調製する方法であって、下記を含む当該方法：
    少なくとも一種の前駆細胞を含む細胞懸濁液を動物組織から得；
    その細胞懸濁液を成長因子調製物で処理し；そして
    該少なくとも一種の前駆細胞を、実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団が得られるように増殖させ、
    それにより、実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団を得る。
  2. 前記の前駆細胞の非接着性集団が、少なくとも約５０％純粋である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記の動物組織が、哺乳動物臓器から得られる、請求項１に記載の方法。
  4. 前記の動物組織を、膵臓組織、肝臓組織、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨髄組織、骨海綿状組織、軟骨組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、扁桃組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、上皮組織、真皮組織、皮下組織、心臓組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎臓組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、腸間膜組織、胎児組織及び臍帯組織よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記の組織を、出生直後の動物から得る、請求項４に記載の方法。
  6. 前記の組織を、出生前の動物から得る、請求項４に記載の方法。
  7. 前記の組織が、出生直後のヒトの組織である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記の細胞懸濁液を、前記の動物組織の機械的破砕により得る、請求項１に記載の方法。
  9. 前記の細胞懸濁液を、前記の動物組織の酵素的破砕により得る、請求項１に記載の方法。
  10. 前記の成長因子調製物が、上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、白血病阻止因子、インシュリン様成長因子及び血小板由来成長因子の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記の成長因子調製物が、上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子α、肝細胞成長因子、塩基性繊維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子Ｉ及びインシュリン様成長因子ＩＩ、請求項１に記載の方法。
  12. 前記の実質的に純粋な非接着性前駆細胞が、浮遊細胞である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記の実質的に純粋な非接着性前駆細胞が、非接着性細胞である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記の実質的に純粋な非接着性前駆細胞が、同型細胞球を形成する、請求項１に記載の方法。
  15. 前駆細胞の実質的に純粋な非接着性集団を調製する方法であって、下記を含む当該方法：
    動物組織を用意し；
    該動物組織を、少なくとも一種の非接着性の前駆細胞を含む細胞懸濁液を得るように破砕し；
    該少なくとも一種の前駆細胞を、実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団が得られるように増殖させ、
    それにより、実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団を得る。
  16. 前記の動物組織を、膵臓組織、肝臓組織、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨髄組織、骨海綿状組織、軟骨組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、扁桃組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、上皮組織、真皮組織、皮下組織、心臓組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎臓組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、腸間膜組織、胎児組織及び臍帯組織よりなる群から選択する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記の非接着性前駆細胞集団が、ネスチンを発現する、請求項１〜１５に記載の方法。
  18. 前記の非接着性前駆細胞集団が、ｃ−ｋｉｔ及びＳｃａの少なくとも一つを発現する、請求項１〜１５に記載の方法。
  19. 前記の非接着性前駆細胞集団が、適当な条件下で、Ｐｄｘ−１、グルカゴン、ｇｌｕｔ−２、ソマトスタチン及びインシュリンよりなる群から選択するマーカーを発現する細胞を生じさせることのできる、請求項１〜１５に記載の方法。
  20. 前記の非接着性前駆細胞集団が、適当な条件下で、ｐｄｘ−１、ｇｌｕｔ−２、ソマトスタチン及びインシュリン遺伝子の各々を、単独で又は組み合せて発現する細胞を生じさせることのできる、請求項１〜１５に記載の方法。
  21. 請求項１〜１５に記載の方法により得られた実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団を含む組成物。
  22. 実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団が、ネスチン、ｃ−ｋｉｔ及びＳｃａよりなる群から選択するマーカーを発現する、請求項２１に記載の組成物。
  23. 実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団が、適当な条件下で、Ｐｄｘ−１、グルカゴン及びインシュリンを含む群から選択するマーカーを発現する細胞を生じさせることのできる、請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記の実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団が、前記の動物細胞懸濁液から、少なくとも約１０００倍富化されている、請求項１〜１５に記載の方法。
  25. 前記の実質的に純粋な非接着性前駆細胞集団が、前記の動物細胞懸濁液から、少なくとも約１００倍富化されている、請求項１〜１５に記載の方法。
  26. 分化した膵臓細胞型を得るための方法であって：
    細胞懸濁液を動物組織から得；
    その細胞懸濁液を成長因子調製物で処理し；
    非接着性細胞として増殖する前駆細胞を増殖させ；そして
    該増殖した前駆細胞を分化用培地及び接着性マトリクスと接触させる
    ことを含み、
    ここに、該前駆細胞は、該マトリクスと接着性であって、少なくとも一種の分化した膵臓細胞型を生じさせる、上記の方法。
  27. 前記の動物組織が、膵管組織である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記の動物組織が、出生直後のヒトの組織である、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記の成長因子調製物が、上皮成長因子、塩基性繊維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子α、インシュリン様成長因子Ｉ及びインシュリン様成長因子ＩＩの内の少なくとも１つを含む、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記の分化した膵臓細胞型が、外分泌細胞型である、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記の外分泌細胞型が、カルボキシペプチダーゼＡを発現する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記の分化した膵臓細胞型が、内分泌細胞型である、請求項２６に記載の方法。
  33. 前記の内分泌細胞型を、グルカゴン発現細胞、インシュリン発現細胞及びソマトスタチン発現細胞よりなる群から選択する、請求項２６に記載の方法。
  34. 前記の分化用培地が、ｃＡＭＰ上昇剤及びＰＹＹポリペプチドを含む、請求項２６に記載の方法。
  35. 前記の膵臓分化用調製物が、フォルスコリン及びＰＹＹを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記の接着性マトリクスが、癌性細胞株に由来する、請求項２６に記載の方法。
  37. 前記の接着性マトリクスが、肉腫又は膀胱癌に由来する、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記のインシュリン発現細胞が、グルコース調節された様式でインシュリンを生成する、請求項３３に記載の方法。
  39. 分化した膵臓細胞型を得る方法であって、膵臓前駆細胞を接着性マトリクス並びにｃＡＭＰ上昇剤及びＰＹＹポリペプチドを含む分化用培地と接触させることを含み、ここに、該前駆細胞が、少なくとも一種の分化した膵臓細胞型を生じさせる、当該方法。
  40. 前記の膵臓前駆細胞が、非接着性細胞として得られる、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記の分化用培地が、フォルスコリン及びＰＹＹを含む、請求項３９に記載の方法。
  42. ｃＡＭＰ上昇剤、ＰＹＹ及びウシ胎児血清を含む膵臓分化用培地。
  43. 前記のｃＡＭＰ上昇剤が、フォルスコリンである、請求項４２に記載の培地。
  44. 少なくとも２５ｍＭのフォルスコリン、少なくとも１５０ｎｇ／ｍｌのＰＹＹ及び少なくとも３％のウシ胎児血清を含む、請求項４３に記載の培地。
  45. グルカゴン発現細胞を得る方法であって：
    前駆細胞を、１５％ ＫＯ−ＳＲの存在下で増殖させ；そして
    該細胞を、接着性マトリクス及び分化用培地と接触させることにより分化させることを含み；
    ここに、該前駆細胞が、グルカゴン発現細胞を生じさせる、上記の方法。
  46. 前記の前駆細胞が、基材に接着することなく増殖する、請求項４５に記載の方法。
  47. ソマトスタチン発現細胞を得る方法であって：
    前駆細胞をＬＩＦの存在下で増殖させ；そして
    該細胞を接着性マトリクス及び分化用培地と接触させることにより分化させることを含み、
    ここに、該前駆細胞が、ソマトスタチン発現細胞を生じさせる、上記の方法。
  48. 自己再生することができ、インシュリン発現細胞を生じさせることができ、ソマトスタチン発現細胞を生じさせることができ、そして３０％未満の細胞系統決定された細胞を含むヒトの膵臓前駆細胞球。
  49. 前記の細胞が、非接着性培養における増殖により得られる、請求項４８に記載の前駆細胞。
  50. 前記の細胞が、膵管細胞懸濁液の非接着性増殖により得られる、請求項４８に記載の前駆細胞。
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