ES2844596T3 - Vacunas de bioconjugados de bacterias grampositivas capsulares - Google Patents

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Abstract

Un organismo procariota huésped gramnegativo que es E. coli, que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una bacteria Grampositiva, que es S. aureus; una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una bacteria Gramnegativa, que es P. aeruginosa; una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacaril transferasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas de bioconjugados de bacterias grampositivas capsulares
Antecedentes de la invención
Las vacunas han sido uno de los grandes inventos de salud pública de la medicina moderna y han salvado millones de vidas. Se ha demostrado que las inmunizaciones son un medio ideal para prevenir y controlar las infecciones. Cada año, las vacunas previenen hasta 3 millones de muertes y 750.000 niños se salvan de la discapacidad. (Global Alliance for Vaccines and Immunization - Press Releases (March 11, 2006) en www.gavialliance.org/media_centre/press_releases/2006_03_09_en_pr_queenrania_delhi.php). En 1999, los CDC declararon a las inmunizaciones el logro número uno en salud pública del siglo XX (Ten great public health achievements-United States, 1900-1999. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 48: 241-3 (2 de abril de 1999)). Algunas bacterias como las que causan el tétanos o la difteria producen una toxina que es en gran parte responsable de la enfermedad. Esta toxina puede usarse en forma destoxificada como vacuna. Sin embargo, para la mayoría de las bacterias no existe una única toxina que pueda usarse para desarrollar una vacuna.
Entre las vacunas más exitosas están los polisacáridos de superficie de patógenos bacterianos como Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae conjugados con proteínas transportadoras. Estas bacterias están rodeadas por una cápsula, que promueve la virulencia microbiana y la resistencia a la muerte por fagocitosis, además de evitar su desecación.
Los polisacáridos bacterianos pueden provocar una respuesta inmune de larga duración en seres humanos si están acoplados a un portador proteico que contiene epítopos de linfocitos T. Este concepto se elaboró hace 80 años (Avery, O. T., y W. F. Goebel. 1929. Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins. II Immunological specificity of synthetic sugarproteins. J. Exp. Med. 50:521-533) y se demostró más tarde para el polisacárido de Haemophilus influenza tipo B (HIB) acoplado a la toxina diftérica portadora de proteína (Anderson, P. 1983. Antibody responses to Haemophilus influenzae type b and diphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type b capsule with the nontoxic protein CRM197. Infect Immun 39:233-8; Schneerson, R., O. Barrera, A. Sutton y J. B. Robbins. 1980. Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharideprotein conjugates. J Exp Med 152:361-76). Este glucoconjugado también fue la primera vacuna conjugada autorizada en los EE. UU. En 1987 e introducida en el programa de inmunización infantil de los EE. UU. Además de HIB, las vacunas conjugadas se usaron con éxito contra los patógenos humanos encapsulados N. meningitidis y S. pneumoniae. El uso rutinario de estas vacunas ha dado lugar a una disminución de la colonización nasofaríngea, así como de la infección. Actualmente, aproximadamente el ~25 % del mercado mundial de vacunas comprende vacunas conjugadas.
Las bacterias grampositivas tienen una membrana celular que está rodeada por polisacáridos capsulares. Staphylococcus es una de esas bacterias grampositivas.
Staphylococcus aureus causa infección. S. aureus es un patógeno bacteriano oportunista responsable de un espectro diverso de enfermedades humanas. A pesar de que S. aureus puede colonizar las superficies de la mucosa de seres humanos normales, también es una causa importante de infecciones de heridas y tiene el potencial invasivo de inducir infecciones graves, que incluyen osteomielitis, endocarditis y bacteriemia con complicaciones metastásicas (Lowy, F. D. 1998. Staphylococcus aureus infections. New Engl J Med 339:520-32). S. aureus es uno de los agentes más comunes implicados en la neumonía asociada a respiradores, y es una causa importante y emergente de neumonía adquirida en la comunidad, que afecta a adultos previamente sanos y niños que carecen de factores de riesgo predisponentes (Kollef, M. H., A. Shorr, Y. P. Tabak, V. Gupta, L. Z. Liu y R. S. Johannes. 2005. Epidemiology and outcomes of health-care-associated pneumonia: results from a large US database of culturepositive pneumonia. Chest 128:3854-62; Shorr, A. F. 2007. Epidemiology and economic impact of meticillin-resistant Staphylococcus aureus: review and analysis of the literature. Pharmacoeconomics 25:751-68).
S. aureus es la segunda causa más frecuente de bacteriemia nosocomial y las cepas de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) representan más del 50 % de todas las infecciones en unidades de cuidados intensivos en los EE. UU. Las infecciones por S. aureus intrahospitalarias y en la comunidad son cada vez más frecuentes. Las cepas de MRSA se aislaron del 2 % de las infecciones estafilocócicas en 1974 y del 63 % de las infecciones estafilocócicas en 2004. Muchas de las cepas de MRSA nosocomiales son resistentes a múltiples fármacos, e incluso las cepas sensibles a la meticilina pueden ser mortales. Un informe reciente que utiliza hallazgos de casos activos basados en la población reveló que se produjeron 94.360 infecciones invasivas por MRSA en los EE. UU. En 2005 y que la mayoría de estos (58 %) se produjo fuera del hospital (Klevens, R. M., M. A. Morrison, J. Nadle, S. Petit, K. Gershman, S. Ray, L. H. Harrison, R. Lynfield, G. Dumyati, J. M. Townes, A. S. Craig, E. R. Zell, G. E. Fosheim, L. K. McDougal, R. B. Carey y S. K. Fridkin. 2007. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA 298:1763-71). En este análisis, más americanos murieron de MRSA (>18.000 muertes) en 2005 que de SIDA.
S. aureus USA100, también conocido como el clon de Nueva York/Japón, es una cepa de MRSA que representa la cepa MRSA predominante adquirida en el hospital de los EE. UU. (McDougal, L. K., C. D. Steward, G. E. Killgore, J. M. Chaitram, S. K. McAllister y F. C. Tenover. 2003. Pulsed-field gel electrophoresis typing of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from the United States: establishing a national database. J Clin Microbiol 41:5113-20).
Los análisis epidemiológicos indican que S. aureus causa aproximadamente 2 millones de infecciones clínicas cada año solo en los EE. UU. (Fridkin, S. K., J. C. Hageman, M. Morrison, L. T. Sanza, K. Como-Sabetti, J. A. Jernigan, K. Harriman, L. H. Harrison, R. Lynfield y M. M. Farley. 2005. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease in three communities. N Engl J Med 352:1436-44; King, M. D., B. J. Humphrey, Y. F. Wang, E. V. Kourbatova, S. M. Ray y H. M. Blumberg. 2006. Emergence of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA 300 clone as the predominant cause of skin and soft-tissue infections. Ann Intern Med 144:309-17; Klevens, R. M., M. A. Morrison, J. Nadle, S. Petit, K. Gershman, S. Ray, L. H. Harrison, R. Lynfield, G. Dumyati, J. M. Townes, A. S. Craig, E. R. Zell, G. E. Fosheim, L. K. McDougal, R. B. Carey, S. K. Fridkin y M. I. para el Active Bacterial Core surveillance. 2007. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA 298:1763-1771). No solo aumentan las infecciones por S. aureus en número, sino que la resistencia de S. aureus a los antibióticos también va en aumento. El MRSA representa el 40 %-60 % de las infecciones por S. aureus nosocomiales en los EE. UU. y muchas de estas cepas son resistentes a múltiples fármacos. Notoria como una fuente importante de infecciones nosocomiales, S. aureus ha asumido recientemente un nuevo papel al causar un aumento en la cantidad de infecciones adquiridas en la comunidad en personas no hospitalizas sin factores de riesgo predisponentes. Las cepas MRSA virulentas asociadas a la comunidad (CA-MRSA) son cada vez más frecuentes en los Estados Unidos y Europa y su diseminación se ha observado globalmente (Baggett, H. C., T. W. Hennessy, K. Rudolph, D. Bruden, A. Reasonover, A. Parkinson, R. Sparks, R. M. Donlan, P. Martinez, K. Mongkolrattanothai y J. C. Butler. 2004. Community-onset methicillin-resistant Staphylococcus aureus associated with antibiotic use and the cytotoxin Panton-Valentine leukocidin during a furunculosis outbreak in rural Alaska. J Infect Dis 189:1565-73; Gilbert, M., J. MacDonald, D. Gregson, J. Siushansian, K. Zhang, S. Elsayed, K. Laupland, T. Louie, K. Hope, M. Mulvey, J. Gillespie, D. Nielsen, V. Wheeler, M. Louie, A. Honish, G. Keays y J. Conly. 2006. Outbreak in Alberta of community-acquired (USA300) methicillin-resistant Staphylococcus aureus in people with a history of drug use, homelessness or incarceration. Canad Med Assoc J 175:149-54; Kazakova, S. V., J. C. Hageman, M. Matava, A. Srinivasan, L. Phelan, B. Garfinkel, T. Boo, S. McAllister, J. Anderson, B. Jensen, D. Dodson, D. Lonsway, L. K. McDougal, M. Arduino, V. J. Fraser, G. Killgore, F. C. Tenover, S. Cody y D. B. Jernigan. 2005. A clone of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among professional football players. N Engl J Med 352:468-75).
No solo es cada vez más frecuente la resistencia de S. aureus a la meticilina, pero se ha informado de numerosos aislados con susceptibilidad reducida a vancomicina. Se han aislado siete aislados clínicos de S. aureus que portan vanA y son completamente resistentes a la vancomicina en los EE. UU. Estos aislados también son resistentes a meticilina (Chang, S., D. M. Sievert, J. C. Hageman, M. L. Boulton, F. C. Tenover, F. P. Downes, S. Shah, J. T. Rudrik, G. R. Pupp, W. J. Brown, D. Cardo y S. K. Fridkin. 2003. Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene. New Engl J Med 348:1342-7). Dado que S. aureus no siempre se puede controlar con antibióticos y los aislados de MRSA son cada vez más prevalentes en la comunidad, se necesitan con urgencia estrategias de control adicionales, como una vacuna.
Los polisacáridos capsulares de S. aureus están involucrados en la infección. Muchos factores de virulencia contribuyen a la patogenia de las infecciones estafilocócicas, incluidas las adherencias asociadas a la superficie, exoproteínas y toxinas secretadas y factores de evasión inmunológica (Foster, T. J. 2005. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology 3:948-58). Como muchos patógenos bacterianos invasivos, S. aureus produce un polisacárido capsular (CP) (figura 4) que mejora su resistencia al aclaramiento por las defensas inmunes innatas del huésped. La mayoría de los aislados clínicos de S. aureus están encapsulados y predominan las cepas de serotipo 5 y 8 (Arbeit, R. D., W. W. Karakawa, W. F. Vann y J. B. Robbins. 1984. Predominance of two newly described capsular polysaccharide types among clinical isolates of Staphylococcus aureus. Diagn Microbiol Infect Dis 2:85-91). Los polisacáridos capsulares de tipo 5 (CP5) y tipo 8 (CP8) tienen unidades repetitivas de trisacáridos similares compuestos de ácido /V-acetil manosaminurónico (ManNAcA), N-acetil L-fucosamina (L-FucNAc) y N-acetil D-fucosamina (D-FucNAc) (Jones, C. 2005. Revised structures for the capsular polysaccharides from Staphylococcus aureus types 5 and 8, components of novel glycoconjugate vaccines. Carbohydr Res 340:1097-106). CP5 y CP8 son serológicamente distintos y esto puede atribuirse a diferencias en los enlaces entre los azúcares y en los sitios de O-acetilación (figura 4).
Estudios previos han correlacionado producción de cápsulas de S. aureus con resistencia a la captación y destrucción fagocítica in vitro (Fattom, A., R. Schneerson, S. C. Szu, W. F. Vann, J. Shiloach, W. W. Karakawa y J. B. Robbins.
1990. Synthesis and immunologic properties in mice of vaccines composed of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides conjugated to Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infect Immun 58:2367-74; Thakker, M., J.-S. Park, V. Carey y J. C. Lee. 1998. Staphylococcus aureus serotype 5 capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model. Infect Immun 66:5183-5189; Watts, A., D. Ke, Q. Wang, A. Pillay, A. Nicholson-Weller y J. C. Lee. 2005. Staphylococcus aureus strains that express serotype 5 or serotype 8 capsular polysaccharides differ in virulence. Infect Immun 73:3502-11). Los neutrófilos de seres humanos fagocitan mutantes negativos en cápsulas en presencia de suero no inmune con actividad del complemento, mientras que los aislados encapsulados requieren tanto anticuerpos específicos de cápsula como complemento para la muerte opsonofagocítica óptima (Bhasin, N., A. Albus, F. Michon, P. J. Livolsi, J.-S. Park y J. C. Lee. 1998. Identification of a gene essential for O-acetylation of the Staphylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide. Mol Microbiol 27:9-21; Thakker, M., J.-S. Park, V. Carey y J. C. Lee. 1998. Staphylococcus aureus serotype 5 capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model. Infect Immun 66:5183-5189; Watts, A., D. Ke, Q. Wang, A. Pillay, A. Nicholson-Weller, and J. C. Lee. 2005. Staphylococcus aureus strains that express serotype 5 or serotype 8 capsular polysaccharides differ in virulence. Infect Immun 73:3502-11). Nilsson y col., (Nilsson, I.-M., J. C. Lee, T. Bremell, C. Ryden y A. Tarkowski. 1997. The role of staphylococcal polysaccharide microcapsule expression in septicemia and septic arthritis. Infect Immun 65:4216-4221) informaron de que los macrófagos peritoneales de ratones fagocitaban un número significativamente mayor de un mutante CP5 negativo en comparación con la cepa parental Reynolds. Una vez fagocitados, la cepa positiva para CP5 sobrevivió intracelularmente en mayor medida que la cepa mutante. Cunnion y col., (Cunnion, K. M., J. C. Lee y M. M. Frank. 2001. Capsule production and growth phase influence binding of complement to Staphylococcus aureus. Infect Immun 69:6796-6803) compararon opsonización de cepas de S. aureus isogénicas y demostraron que la cepa positiva para CP5 se unía a un 42 % menos de complemento sérico (C') que el mutante acapsular.
El desarrollo de vacunas de S. aureus convencionalmente ha involucrado a la cápsula como un objetivo. El diseño de la vacuna para la protección contra la enfermedad estafilocócica se complica por las manifestaciones proteicas y la complejidad clínica de las infecciones de S. aureus en seres humanos. Muchos candidatos a vacuna de S. aureus se han investigado en modelos animales de infección, pero se ha informado de que solo dos regímenes de inmunización han completado ensayos clínicos de fase III (Schaffer, A. C. y J. C. Lee. 2008. Vaccination and passive immunisation against Staphylococcus aureus. Int J Antimicrob Agents 32 Suppl 1:S71-8). La primera vacuna se basa en los dos polisacáridos capsulares (PC) (Figura 4) que son más prevalentes entre las cepas clínicas de S. aureus. Fattom y col., (Fattom, A.R. Schneerson, S. C. Szu, W. F.Vann, J. Shiloach, W. W. Karakawa y J. B. Robbins. 1990. Synthesis and immunologic properties in mice of vaccines composed of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides conjugated to Pseudomonas aeruginosa exotoxin. Infect Immun 58: 2367-74) conjugaron los polisacáridos del serotipo 5 (CP5) y el serotipo 8 (CP8) con exoproteína A recombinante, no tóxica, de P. aeruginosa (rEPA). Las vacunas conjugadas fueron inmunogénicas en ratones y seres humanos, e indujeron anticuerpos opsónicos que mostraron eficacia para proteger a los roedores de la letalidad y de la infección estafilocócica no letal (Fattom, A.R. Schneerson, S. C. Szu, W. F.Vann, J. Shiloach, W. W. Karakawa y J. B. Robbins. 1990. Synthesis and immunologic properties in mice of vaccines composed of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides conjugated to Pseudomonas aeruginosa exotoxin. Infect Immun 58: 2367-74; Fattom, A., R. Schneerson, D. C. Watson, W. W. Karakawa, D. Fitzgerald, I. Pastan, X. Li, J. Shiloach, D. A. Bryla y J. B. Robbins.
1993. Laboratory and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of S. aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides bound to Pseudomonas aeruginosa recombinant exoprotein A. Infect Immun 61:1023-32; Fattom, A. I., J. Sarwar, A. Ortiz y R. Naso. 1996. A Staphylococcus aureus capsular polysaccharide (CP) vaccine and CP-specific antibodies protect mice against bacterial challenge. Infect Immun 64:1659-65; Lee, J. C., J. S. Park, S. E. Shepherd, V. Carey y A. Fattom. 1997. Protective efficacy of antibodies to the Staphylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide in a modified model of endocarditis in rats. Infect Immun 65:4146-51). Los estudios de inmunización pasiva han indicado que los anticuerpos específicos contra CP5 y CP8 reducen significativamente la infección en un modelo murino de mastitis por S. aureus (Tuchscherr, L. P., F. R. Buzzola, L. P. Alvarez, J. C. Lee y D. O. Sordelli.
2008. Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitis and the emergence of unencapsulated and small-colony variants of Staphylococcus aureus in mice. Infect Immun 76:5738-44). Se demostró que la vacuna combinada de conjugado de CP5 y CP8 era segura en seres humanos y provocaba anticuerpos que mostraron actividad opsonofagocítica.
El desarrollo de vacunas de S. aureus también ha involucrado a las proteínas de superficie como un objetivo. El segundo ensayo clínico de vacuna de S. aureus se basó en la eficacia protectora de los anticuerpos contra las adherencias estafilocócicas para prevenir las infecciones por estafilococos. El factor de aglutinación A de S. aureus es una proteína anclada a la pared celular que se expresa en la superficie, media en la adherencia estafilocócica al fibrinógeno (Foster, T. J. y M. Hook. 1998. Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus. Trends Microbiol 6:484-8) y estimula la unión de S. aureus a superficies de biomateriales (Vaudaux, P. E., P. Francois, R. A. Proctor, D. McDevitt, T. J. Foster, R. M. Albrecht, D. P. Lew, H. Wabers y S. L. Cooper. 1995. Use of adhesion-defective mutants of Staphylococcus aureus to define the role of specific plasma proteins in promoting bacterial adhesion to canine arteriovenous shunts. Infection & Immunity 63:585-90), coágulos de sangre y superficies endoteliales dañadas (Moreillon, P., J. M. Entenza, P. Francioli, D. McDevitt, T. J. Foster, P. Francois y P. Vaudaux. 1995. Role of Staphylococcus aureus coagulase and clumping factor in pathogenesis of experimental endocarditis. Infection & Immunity 63:4738-43). El dominio de unión a fibrinógeno de ClfA se encuentra dentro de la región A de la proteína de longitud completa (McDevitt, D., P. Francois, P. Vaudaux y T. J. Foster. 1995. Identification of the ligand-binding domain of the surface-located fibrinogen receptor (clumping factor) of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology 16:895-907). ClfA desempeña un papel importante en la unión de S. aureus a las plaquetas, una interacción que es crítica en modelos animales de endocarditis por estafilococos inducida por catéter (Sullam, P. M., A. S. Bayer, W. M. Foss y A. L. Cheung. 1996. Diminished platelet binding in vitro by Staphylococcus aureus is associated with reduced virulence in a rabbit model of infective endocarditis. Infection & Immunity 64:4915-21).
Nanra y col., informaron de que los anticuerpos contra ClfA inducían la muerte opsonofagocítica de S. aureus in vitro (Nanra, J. S., Y. Timofeyeva, S. M. Buitrago, B. R. Sellman, D. A. Dilts, P. Fink, L. Nunez, M. Hagen, Y. V. Matsuka, T. Mininni, D. Zhu, V. Pavliak, B. A. Green, K. U. Jansen y A. S. Anderson. 2009. Heterogeneous in vivo expression of clumping factor A and capsular polysaccharide by Staphylococcus aureus: Implications for vaccine design. Vaccine 27:3276-80). Adicionalmente, los ratones inmunizados con una forma recombinante de la región A de unión de ClfA mostraron reducciones en la artritis y la letalidad inducida por S. aureus (Josefsson, E., O. Hartford, L. O'Brien, J. M.
Patti y T. Foster. 2001. Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with dumping factor A, a novel virulence determinad. Journal of Infectious Diseases 184:1572-80). Se realizaron experimentos de inmunización pasiva en conejos que recibieron una preparación de inmunoglobulina policlonal humana que contenía niveles elevados de anticuerpos específicos para ClfA (Vernachio, J., A. S. Bayer, T. Le, Y. L. Chai, B. Prater, A. Schneider, B. Ames, P. Syribeys, J. Robbins, J. M. Patti, J. Vernachio, A. S. Bayer, T. Le, Y.-L. Chai, B. Prater, A. Schneider, B. Ames, P. Syribeys, J. Robbins y J. M. Patti. 2003. Antidumping factor A immunoglobulin reduces the duration of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia in an experimental model of infective endocarditis. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 47:3400-6). La terapia de combinación dio como resultado un mejor aclaramiento bacteriano de la sangre de conejos con endocarditis por S. aureus inducida por catéter que el tratamiento con vancomicina solo. Además, la transferencia pasiva de anticuerpos específicos de ClfA redujo significativamente la infección en un modelo murino de mastitis por S. aureus (Tuchscherr, L. P., F. R. Buzzola, L. P. Alvarez, J. C. Lee y D. O.Sordelli. 2008. Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitis and the emergence of unencapsulated and small-colony variants of Staphylococcus aureus in mice. Infect Immun 76: 5738-44).
Se informó de que un ensayo clínico de fase III se había diseñado para proteger contra la septicemia de inicio tardío en neonatos prematuros de bajo peso al nacer en 2000. Los bebés recibieron hasta cuatro administraciones de Veronate, una preparación de inmunoglobulina humana reunida de donantes con títulos elevados de anticuerpos contra ClfA y SdrG. A pesar de los resultados prometedores de un ensayo clínico de fase II similar, esta terapia profiláctica no produjo una reducción en la frecuencia de infecciones estafilocócicas en los neonatos (DeJonge, M., D. Burchfield, B. Bloom, M. Duenas, W. Walker, M. Polak, E. Jung, D. Millard, R. Schelonka, F. Eyal, A. Morris, B. Kapik, D. Roberson, K. Kesler, J. Patti y S. Hetherington. 2007. Clinical trial of safety and efficacy of INH-A21 for the prevention of nosocomial staphylococcal bloodstream infection in premature infants. J Pediatr 151:260-5).
Se ha demostrado que se produce glucosilación de proteínas, pero rara vez lo hace de forma natural, en organismos procariotas. Por otro lado, la glucosilación de la proteína unida a N es un proceso esencial y conservado que se produce en el retículo endoplasmático de organismos eucariotas. Es importante para el plegamiento de proteínas, oligomerización, estabilidad, control de calidad, clasificación y transporte de proteínas secretoras y de membrana (Helenius, A. y Aebi, M. (2004). Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 73, 1019­ 1049). La glucosilación de proteínas tiene una influencia profundamente favorable sobre la antigenicidad, la estabilidad y la semivida de una proteína. Además, la glucosilación puede ayudar a la purificación de proteínas mediante cromatografía, por ejemplo, cromatografía de afinidad con ligandos de lectina unidos a una fase sólida que interacciona con restos glucosilados de la proteína. Por lo tanto, es práctica establecida producir muchas proteínas glucosiladas de forma recombinante en células eucariotas para proporcionar patrones de glucosilación biológica y farmacéuticamente útiles.
Las vacunas conjugadas se han utilizado con éxito para proteger contra infecciones bacterianas. La conjugación de un polisacárido antigénico con un portador proteico es necesaria para la respuesta de memoria protectora, ya que los polisacáridos son antígenos independientes de linfocitos T. Los polisacáridos se han conjugado con portadores proteicos mediante diferentes procedimientos químicos, usando grupos reactivos de activación en el polisacárido, así como en el portador proteico. (Qian, F., Y. Wu, O. Muratova, H. Zhou, G. Dobrescu, P. Duggan, L. Lynn, G. Song, Y. Zhang, K. Reiter, N. MacDonald, D. L. Narum, C. A. Long, L. H. Miller, A. Saul y G. E. Mullen. 2007. Conjugating recombinant proteins to Pseudomonas aeruginosa ExoProtein A: a strategy for enhancing immunogenicity of malaria vaccine candidates. Vaccine 25:3923-3933; Pawlowski, A., G. Kallenius y S. B. Svenson. 2000. Preparation of pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugates vaccines utilizing new fragmentation and conjugation technologies. Vaccine 18:1873-1885; Robbins, J. B., J. Kubler-Kielb, E. Vinogradov, C. Mocca, V. Pozsgay, J. Shiloach y R. Schneerson. 2009. Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosaccharide-core-protein conjugates. Proc Natl Acad Sci U S A 106:7974-7978).
Las vacunas conjugadas se pueden administrar a los niños para protegerles contra las infecciones bacterianas y pueden proporcionar una respuesta inmune de larga duración a los adultos. Se ha encontrado que las construcciones de la invención generan una respuesta de IgG en animales. Se cree que el polisacárido (es decir, resto de azúcar) desencadena una respuesta inmune a corto plazo que es específica del azúcar. De hecho, el sistema inmune humano genera una respuesta fuerte a estructuras superficiales de polisacáridos específicas de bacterias, tales como antígenos O y polisacáridos capsulares. Sin embargo, como la respuesta inmune a los polisacáridos depende de la IgM, el sistema inmune no desarrolla memoria. El portador de proteínas que porta el polisacárido, sin embargo, desencadena una respuesta de IgG que depende de los linfocitos T y que proporciona una protección duradera ya que el sistema inmune desarrolla memoria. Por esta razón, en el desarrollo de una vacuna, es ventajoso desarrollarla como un conjugado de portador proteico-polisacárido.
Los organismos procariotas rara vez producen proteínas glucosiladas. Sin embargo, se ha demostrado que una bacteria, el patógeno transmitido por los alimentos Campylobacterjejuni, puede glucosilar sus proteínas (Szymanski, y col., (1999). Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Mol. Microbiol. 32, 1022­ 1030). La maquinaria requerida para la glucosilación está codificada por 12 genes que están agrupados en el locus pgl. La interrupción de la glucosilación afecta a la invasión y la patogenia de C. je juni pero no es letal como en la mayoría de los organismos eucarióticos (Burda P. y M. Aebi, (1999). The dolichol pathway of N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta 1426(2):239-57). Se ha demostrado que el locus pgl es responsable de la glucosilación de proteínas ligada a N en Campylobacter y que es posible reconstituir la N-glucosilación de proteínas de C. jejuni mediante la expresión recombinante del locus pgl y glucoproteína aceptora en E. coli al mismo tiempo (Wacker, M., D. Linton, P. G. Hitchen, M. Nita-Lazar, S. M. Haslam, S. J. North, M. Panico, H. R. Morris, A. Dell, B. W. Wren y M. Aebi.
2002. N-linked glycosylation in C. jejuni and its functional transfer into E. coli. Science 298:1790-3).
La ruta biosintética de glucosilación de proteínas ligada a N de Campylobacter tiene similitudes significativas con la ruta de biosíntesis de polisacáridos en bacterias (Bugg, T. D. y P. E. Brandish. 1994. From peptidoglycan to glycoproteins: common features of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis. FEMS Microbiol Lett 119:255-62). Según el conocimiento de que los polisacáridos antigénicos de las bacterias y los oligosacáridos de Campylobacter se sintetizan ambos en el lípido transportador, undecaprenil pirofosfato (UndPP), las dos rutas se combinaron en E. coli (Feldman, M. F., M. Wacker, M. Hernandez, P. G. Hitchen, C. L. Marolda, M. Kowarik, H. R. Morris, A. Dell, M. A. Valvano y M. Aebi. 2005. Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 102:3016-21). Se demostró que PglB no tiene una especificidad estricta para el sustrato de azúcar ligado a lípidos. Los polisacáridos antigénicos ensamblados en UndPP son capturados por PglB en el periplasma y transferidos a un transportador proteico (Feldman, M. F., M. Wacker, M. Hernandez, P. G. Hitchen, C. L. Marolda, M. Kowarik, H. R. Morris, A. Dell, M. A. Valvano y M. Aebi. 2005. Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 102:3016-21; Wacker, M., M. F. Feldman, N. Callewaert, M. Kowarik, B. R. Clarke, N. L. Pohl, M. Hernandez, E. D. Vines, M. A. Valvano, C. Whitfield y M. Aebi. 2006. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase (OTase) suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proc Natl Acad Sci U S A 103:7088-93). Se demostró que PglB de Campylobacter transfiere una amplia gama de oligosacáridos unidos a UndPP si contienen una hexosamina N-acetilada en el extremo reductor (Wacker y col., (2006)), lo que permite la conjugación de un polisacárido antigénico con una proteína de elección a través de un enlace N-glucosídico. Si bien esto puede proporcionar una base teórica para la producción de vacunas conjugadas in vivo, se deben superar muchos retos difíciles para realizar esta posibilidad teórica.
Basado en este descubrimiento previo de que C. je juni contiene un sistema de glucosilación de proteínas ligadas a N, E. coli había sido modificada para incluir la maquinaria de glucosilación de proteínas ligadas a N de C. jejuni. De este modo, se produjeron formas glucosiladas de las proteínas nativas de C. jejuni en un huésped E. coli. Se ha demostrado además que este proceso podría usarse para producir proteínas glucosiladas de diferentes orígenes en huésped E. coli modificado para su uso como productos de vacuna (documento WO 06/119987 y "GlycoVaxyn and Harvard University affiliated hospital receive USD 3.4 million NIH grant for Staphylococcus aureus vaccine development ". URL:http://www.glycovaxyn.com/content/news/releases/10%2005%2004.pdf). La producción por E. coli es ventajosa porque se pueden producir cultivos grandes de dichos huéspedes de E. coli modificados que producen grandes cantidades de vacuna útil.
Usando este proceso para producir una proteína glucosilada en un huésped de E. coli modificado para su uso como producto de vacuna para S. aureus encuentra problemas que se han percibido como insuperables. Primero, E. coli es una bacteria gramnegativa y sus rutas de biosíntesis de sacáridos difieren en gran medida de las de una bacteria grampositiva, tal como S. aureus, después de la etapa de polimerización. Además, no hubiera sido factible realizar ingeniería genética en E. coli para producir el polisacárido capsular de S. aureus directamente compatible con tecnologías anteriores. Por ejemplo, S. aureus es un organismo grampositivo y la síntesis de su cápsula se asocia con la estructura de la envoltura celular y la construcción del casco celular. La maquinaria biosintética que produce la cápsula está diseñada específicamente para organizar el polisacárido capsular (PS) en el exterior de la célula y su pared celular. Habría sido extremadamente difícil, al menos por la razón de que requeriría muchos recursos, producir esta cápsula en un organismo de E. coli modificado, porque la envoltura celular de E. coli está construida de una manera fundamentalmente diferente. La maquinaria biosintética para el ensamblaje de la cápsula del precursor de PS no sería funcional debido a los diferentes entornos. Mientras que la cápsula de S. aureus la cápsula debe transitar por una sola membrana, en E. coli hay una membrana adicional que debe cruzarse para llegar a la ubicación definitiva de una auténtica cápsula. Adicionalmente, dado que la cápsula de S. aureus es muy grande, se cree que es inviable fabricar una cápsula grande como la cápsula de S. aureus entre las dos membranas de E. coli.
El principio de que las enzimas de diferentes organismos pueden funcionar juntas se ha demostrado anteriormente (por ejemplo, Rubires, X., F. Saigi, N. Pique, N. Climent, S. Merino, S. Alberti, J. M. Tomas y M. Regue. 1997. A gene (wbbL) from Serratia marcescens N28b (O4) complements the rfb-50 mutation of Escherichia coli K-12 derivatives. J. Bacteriol 179 (23): 7581-6). Sin embargo, se cree que no se ha producido previamente ningún polisacárido de LPS modificado de un organismo grampositivo en un organismo gramnegativo.
Breve sumario de la invención
Ahora, sorprendentemente, se ha descubierto una nueva vacuna de bioconjugado de S. aureus. Esta nueva vacuna de S. aureus se basa en el nuevo e inesperado descubrimiento de que un oligo o polisacárido de un procariota que tiene una cepa Gram puede glucosilar una proteína en un huésped procariota con una cepa Gram diferente. En consecuencia, se proporciona un organismo procariota huésped bacteriano gramnegativo que es E. coli, que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una bacteria Grampositiva, que es S. aureus; una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una bacteria Gramnegativa, que es P. aeruginosa; una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacaril transferasa.
Otras características novedosas e inesperadas de la divulgación incluyen, sin limitación, las realizaciones expuestas a continuación.
De forma más general, la presente divulgación se refiere a una vacuna de bioconjugado, tal como una vacuna Grampositiva, que comprende un transportador proteico que comprende una secuencia consenso de ácido nucleico insertada; al menos un oligo o polisacárido de una bacteria, tal como una bacteria Grampositiva unida a la secuencia consenso y, opcionalmente, un adyuvante. Además, la divulgación se refiere a una vacuna de bacterias grampositivas, tal como una vacuna de S. aureus u otras vacunas de bacterias, hecha mediante un sistema de glucosilación usando una ruta biosintética de LPS modificada, que comprende la producción de un polisacárido capsular modificado o LPS.
La presente divulgación se refiere adicionalmente a una proteína N-glucosilada recombinante que comprende una proteína que comprende al menos una secuencia consenso insertada D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; y al menos un oligo o polisacárido de una bacteria, tal como una bacteria grampositiva, unido a dicha secuencia consenso.
La presente divulgación se refiere además a una combinación de un polisacárido capsular modificado de S. aureus con un antígeno de proteína del mismo organismo por enlace W-glucosídico.
La invención se refiere además a un organismo procariota huésped gramnegativo, en el que dicho organismo procariota huésped es E. coli, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una bacteria Grampositiva, en la que dicha bacteria Grampositiva es Staphylococcus aureus; una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una bacteria Gramnegativa, en la que dicha bacteria Gramnegativa es Pseudomonas aeruginosa;; una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacaril transferasa. La divulgación se refiere adicionalmente a un organismo procariota huésped modificado por ingeniería que comprende una secuencia de nucleótidos introducida que codifica glucosiltransferasas nativas solo para un organismo procariota Grampositivo; una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa.
La invención se refiere además a procedimientos para producir una vacuna bioconjugada en un organismo procariota huésped bacteriano gramnegativo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de un primer organismo procariota, que es una bacteria grampositiva S. aureus; una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una segunda especie procariota, que es el grupo de O-antígeno de una bacteria gramnegativa de P. aeruginosa, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína transportadora, en la que dicha proteína transportadora comprende la secuencia consenso de aminoácidos D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; y una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacaril transferasa; que comprende a) una etapa de producción de un polisacárido capsular modificado en undecaprenol (Und) en dichas bacterias gramnegativas y b) una etapa de ligar el antígeno de polisacárido capsular a un vehículo proteico.
Además, la presente divulgación se refiere a la producción de vacunas bioconjugadas produciendo en bacterias gramnegativas polisacáridos capsulares modificados, que pueden transferirse a un núcleo de lípido A mediante WaaL y/o unirse a un vehículo de elección mediante la OTasa.
La divulgación se refiere además a procedimientos para producir proteínas glucosiladas en un organismo procariota huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica glucosiltransferasas nativas de un primer organismo procariota y que también codifica glucosiltransferasas nativas de un segundo organismo procariota que es diferente del primer organismo procariota. La presente divulgación se refiere adicionalmente a la producción de proteínas N-glucosiladas con polisacáridos capsulares de bacterias grampositivas, que se sintetizan mediante una combinación de diferentes glucosiltransferasas de diferentes organismos. La divulgación se refiere además a la producción de proteínas glucosiladas en un organismo procariota huésped que comprende una secuencia de nucleótidos introducida que codifica glucosiltransferasas nativas solo para un organismo procariota Grampositivo.
La presente divulgación se refiere además a plásmidos, tales como, plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. La divulgación también incluye plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 6; SEQ. ID NO: 7; SEQ. ID NO: 8 y SEQ. ID NO: 16. La divulgación también se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 10; SEQ. ID NO: 11; y SEQ. ID NO: 12. Además, la divulgación se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 13; SEQ. ID NO: 15; SEQ. ID NO: 15; SEQ. ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ. ID NO: 19; SEQ. ID NO: 20; SEQ. ID NO: 21 y SEQ. ID NO: 27.
La divulgación se refiere además a células bacterianas transformadas, tales como, por ejemplo, células bacterianas transformadas con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO. 2; SEQ. ID NO: 3; SEQ. ID NO: 4; SEQ. ID NO: 17; SEQ. ID NO: 18; SEQ. ID NO: 19 y SEQ. ID NO: 20; SEQ. ID NO: 21; y SEQ. ID NO: 27. La presente divulgación se refiere además a una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO: 5; SEQ. ID NO: 8; SEQ. ID NO: 9; SEQ. ID NO: 10; SEQ. ID NO: 11; SEQ. ID NO: 12; SEQ. ID NO: 13; SEQ. ID NO: 14; SEQ. ID NO: 15 y SEQ. ID NO: 16.
La presente divulgación se refiere además a un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra una infección causada por bacterias grampositivas y otras bacterias en un mamífero. En una realización, el procedimiento comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de una composición farmacéutica, que comprende: una proteína que comprende al menos una secuencia consenso insertada D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; y uno o más oligosacáridos o polisacáridos, siendo el uno o más oligosacáridos o polisacáridos iguales o diferentes a otro de uno o más oligosacáridos o polisacáridos, de una bacteria Grampositiva unida a dicha secuencia consenso.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para identificar un polisacárido diana para su uso en la glucosilación de una proteína con dicho polisacárido diana, en su totalidad o en parte. Dicha proteína glucosilada que comprende el polisacárido diana puede usarse, por ejemplo, en composiciones de vacuna. En una realización, el procedimiento para identificar un polisacárido diana incluye: identificar una bacteria Grampositiva, tal como S. aureus, como diana; identificar una primera unidad de repetición de un polisacárido producido por dicha bacteria grampositiva que comprende al menos tres monómeros; identificar un polisacárido producido por una bacteria de una especie gramnegativa que comprende una segunda unidad de repetición que comprende dos de los mismos monómeros que dicha primera unidad de repetición.
La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para modificar una bacteria de una primera especie bacteriana, tal como una especie gramnegativa. En una realización, el procedimiento incluye: identificar una primera unidad de repetición de un polisacárido de una especie grampositiva, tal como S. aureus, que comprende tres monómeros; identificar un polisacárido producido por una bacteria de una segunda especie gramnegativa que comprende otra unidad de repetición que comprende dos de los mismos monómeros que la primera unidad de repetición; insertar en dicha bacteria de una primera especie gramnegativa una o más secuencias de nucleótidos que codifican glucosiltransferasas que ensamblan un trisacárido que comprende: a) dicha segunda unidad de repetición; y b) un monómero de dicha primera unidad de repetición no presente en dicha segunda unidad de repetición; insertar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; e insertar una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa una ruta para la biosíntesis de antígeno O dependiente de wzx/wzy, ilustrada por la biosíntesis de antígeno O O11 de P. aeruginosa. Los nombres de proteínas supuestamente responsables de las reacciones presentadas se indican arriba o debajo de las flechas, incluyendo uridina difosfato (UDP) y uridina monofosfato (UMP).
La figura 2 representa una ruta propuesta para la biosíntesis del polisacárido capsular de serotipo 5 (CP5) de S. aureus modificado genéticamente en E. coli. Las enzimas proporcionadas por el grupo de antígeno O de P. aeruginosa O11 están indicadas como en la figura 1. Las enzimas de CP5 de S. aureus se indican como Cap5 (compárese con la figura 6). WecB y WecC son enzimas de E. coli requeridas para la producción de UDP-ManNAcA. Otras proteínas y enzimas representadas incluyen uridina difosfato (UDP), uridina monofosfato (UMP) y coenzima A (CoA).
La figura 3 representa una ruta propuesta para la biosíntesis del polisacárido capsular de serotipo 8 (CP8) de S. aureus modificado genéticamente. Los nombres genéticos se indican con flechas (compárense con las figuras 1, 2 y 6). UDP, UMP: difosfato de uridina, monofosfato de uridina. CoA: coenzima A.
La figura 4 representa la superposición estructural de la unidad de repetición (RU) de antígeno O de S. aureus capsular y de P. aeruginosa.
La figura 5A representa el análisis SDS-PAGE de la elongación de la RU (unidad de repetición) del antígeno O O11 incompleto por enzimas de S. aureus.
La figura 5B representa la inmunodetección de la elongación de la RU del antígeno O O11 incompleto por enzimas de S. aureus.
La figura 6 representa una estrategia en una realización de la invención para la construcción de los grupos de genes quiméricos O11/CPS y O11/CP8.
La figura 7A representa un CP5 LPS polimerizado de una realización de la invención detectada en extractos de lípidos de E. coli.
La figura 7B representa CP8 LPS polimerizado de una realización de la invención detectada en extractos de lípidos de E. coli.
La figura 8A representa la producción de LPS CP5 recombinante de una realización de la invención analizada por SDS-PAGE y teñida con plata en función del gen de resistencia a antibióticos en el plásmido pLAFR que contiene el grupo quimérico en células W3110 AwecA.
La figura 8B representa la producción de CP5 LPS recombinante de una realización de la invención analizada por SDS PAGE, teñida con plata e inmunodetección en función del gen de resistencia a antibióticos en el plásmido pLAFR que contiene el grupo quimérico en células W3110 AwecA.
La figura 9 representa la producción de LPS CP5 recombinante de una realización analizada mediante SDS PAGE y mediante inmunodetección en función del promotor frente al grupo quimérico en células W3110 AwecA.
La figura 10A muestra los resultados del análisis por HPLC de una realización de RU recombinante de CP5 de la presente invención producida usando el grupo de CP5 quimérico (SEQ ID: 2).
La figura 10B muestra los resultados del análisis por HPLC de una realización de RU recombinante de CP8 de la presente invención producida usando un grupo de CP8 quimérico que carece de la cap8/polimerasa.
La figura 11A muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP5 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 37 minutos que se ve en la figura 10A.
La figura 11B muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP5 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 40 minutos que se ve en la figura 10A.
La figura 11C muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP8 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 32 minutos que se ve en la figura 10B.
La figura 11D muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP8 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 38 minutos que se ve en la figura 10B.
La figura 11E muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP8 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 45 minutos que se ve en la figura 10B.
La figura 11F muestra los resultados del análisis por HPLC de una realización de la optimización de la estructura de glucanos.
La figura 11G presenta los resultados del análisis por HPLC del repertorio completo de glucanos CP5 presente en UndPP en células de E. coli en una realización de la presente invención.
La figura 11H presenta los resultados del análisis por HPLC de glucanos CP5 desacetilados y homogeneidad de RU en una realización de la invención.
La figura 11I proporciona los resultados del análisis por HPLC del repertorio de glucanos CP8 presente en UndPP en células de E. coli en una realización de la presente invención.
La figura 11J muestra los resultados de HPLC, en una realización de la presente invención, de desacetilación de glucanos CP8 y homogeneidad de RU.
La figura 11K presenta resultados de HPLC que muestran la reducción en la polimerización de RU y el aumento en LLO inducida por la coexpresión de wzzO7 con el grupo quimérico CP8 en una realización de la presente invención.
La figura 12 muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de cromatografía de afinidad con Ni2+ del bioconjugado EPA-CP5 purificado a partir de células en realizaciones de la presente invención sin y con el gen de la flipasa de S. aureus cap5K (SEQ ID NO: 2 y 3).
La figura 13A presenta el análisis del bioconjugado CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención purificado con cromatografía de afinidad de Ni2+ y cromatografía de intercambio aniónico.
La figura 13B representa las masas M/Z encontradas para el sitio de glucosilación en el péptido tripsinizado DNNNSTPTVISHR unido glucosídicamente a través de N a la masa de RU O-acetilada (m/z = 2O88 ([M H]+)) de acuerdo con una realización de la presente invención. El recuadro ilustra la estructura de RU unida al péptido. La figura 13C representa las masas de M/Z encontradas para el sitio de glucosilación en el péptido tripsinizado DQNR unido a N glucosídicamente a la masa de RU O-acetilada (m/z = 1165 ([M H]+)) de acuerdo con una realización de la presente invención. El recuadro ilustra la estructura de RU unida al péptido.
La figura 13D representa un análisis de cromatografía de afinidad de Ni2+ y cromatografía de intercambio aniónico bioconjugado de CP8-EPA purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 13E representa el bioconjugado de CP5-EPA purificado a partir de células que contienen 3 (izquierda) o 2 plásmidos (calle derecha) para la producción de glucoconjugados de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 13F representa el análisis de cromatografía de afinidad de Ni2+ del bioconjugado CP8-EPA purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 14A presenta un análisis de MALDI de alta masa de un bioconjugado de CP5-EPA purificado de una realización de la invención producida utilizando el sistema de 3 plásmidos de la figura 13A.
La figura 14B muestra la caracterización por cromatografía de exclusión por tamaño del bioconjugado de CP5-EPA de una realización de la invención producida usando el sistema de 3 plásmidos de la figura 13A.
La figura 14C muestra el análisis de SDS PAGE e inmunodetección del bioconjugado de CP5-Hla purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 14D presenta los resultados del bioconjugado de CP5-AcrA purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 14E presenta los resultados del bioconjugado de CP5-ClfA purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 15A representa los anticuerpos específicos anti-CP5 generados en ratones mediante bioconjugado de CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 15B representa los anticuerpos específicos anti-CP5 producidos en conejo por bioconjugado de CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 16A ilustra la actividad opsonofagocítica in vitro (en S. aureus Reynolds) de anticuerpos específicos de CP5 generados por inmunización de conejos con CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 16B ilustra la actividad opsonofagocítica in vitro (en S. aureus USA 100) de anticuerpos específicos de CP5 generados por inmunización de conejos con CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 17A representa los resultados de la inmunización pasiva usando anticuerpos anti-CP5-EPA, de acuerdo con una realización de la presente invención, en ratones a los que se ha inyectado i.p. ~3,6.107 UFC de la cepa Reynolds de S. aureus.
La figura 17B representa los resultados de la inmunización pasiva usando anticuerpos anti-CP5-EPA, de acuerdo con una realización de la invención, en ratones a los que se ha inyectado 2 mg de CP5-EPA IgG.
La figura 17C representa los resultados de la inmunización pasiva usando anticuerpos anti-CP5-EPA, de acuerdo con una realización de la invención, en ratones a los que se ha inyectado 300 |jg de CP5-EPA IgG
La figura 18 representa los resultados de un ensayo de inmunización activa usando diferentes dosis de CP5-EPA como vacuna de acuerdo con una realización de la presente invención y el modelo de bacteriemia de ratón para la exposición.
Descripción detallada de la invención
De acuerdo con la presente divulgación, ahora se ha demostrado que un polisacárido de LPS de un organismo Grampositivo se produce en un organismo gramnegativo. Se cree que este es un resultado novedoso que representa una desviación importante y significativa de la técnica anterior.
Los ácidos nucleicos dentro del alcance de la divulgación se ilustran por los ácidos nucleicos de la descripción contenida en el listado de secuencias. Cualquier ácido nucleico que codifique un componente inmunogénico, o una porción del mismo, que sea capaz de expresarse en una célula huésped, se puede usar en la presente divulgación. Las siguientes descripciones de secuencia se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados a lo largo de la solicitud y no deben interpretarse como realizaciones limitantes de la invención.
SEQ ID NO: 1 representa pLAFRI (referencia de GeneBank AY532632.1) que contiene la secuencia O11 de antígeno O de P. aeruginosa PAO103 en el sitio EcoRI, cadena complementaria (parcialmente de la referencia de Gen Bank AF236052).
SEQ ID NO: 2 representa pLAFRI que contiene el grupo quimérico CP5, que corresponde a pLAFR1-O11 con los genes cap5HIJ reemplazando wbjA-wzy por recombinación homóloga. La secuencia insertada también contiene un casete cat para la selección de clones recombinados homólogos.
SEQ ID NO: 3 representa pLAFRI que contiene el grupo quimérico CP5 con el gen de la flipasa cap5K, que corresponde al pLAFR1-O11 con los genes cap5HIJ reemplazando wbjA-wzy por recombinación homóloga y el cap5K clonado entre cap5J y el casete cat.
SEQ ID NO: 4 representa pLAFRI que contiene el grupo quimérico CP8 incluyendo un gen de flipasa, que corresponde a pLAFR1-O11 con los genes cap8KHIJ reemplazando wbjA-wzy. La secuencia insertada también contiene un casete cat para la selección de clones recombinados homólogos.
SEQ ID NO: 5 representa un plásmido de expresión para la producción de Hla H35L. El ORF que codifica Hla H35L se clona en NdeI/SacI en pEC415.
SEQ ID NO. 6 representa el plásmido de expresión para la producción del sitio Hla-H35L 202. El ORF codifica un péptido señal DsbA N-terminal de E. coli, un sitio glucado alrededor de la posición de aminoácido 202 y un marcador HIS en C-terminal. Esta construcción se clona en NheI/SalI en pEC415.
SEQ ID NO: 7 representa el plásmido de expresión para la producción del sitio Hla-H35L 238. El ORF codifica un péptido señal DsbA N-terminal de E. coli, un sitio glucado alrededor de la posición de aminoácido 238 y un marcador HIS en C-terminal. La construcción mencionada anteriormente se clona en NheI/SalI en pEC415. SEQ ID NO: 8 representa el plásmido de expresión para la producción del sitio Hla-H35L 272. El ORF codifica un péptido señal DsbA N-terminal de E. coli, un sitio glucado alrededor de la posición de aminoácido 272 y un marcador HIS en C-terminal. La construcción mencionada anteriormente se clona en NheI/SalI en pEC415. SEQ ID NO: 9 representa un plásmido de expresión para la producción de ClfA. El gen se sintetizó químicamente y se clonó en el Ndel/SacI en el vector de expresión pEC415.
SEQ ID NO: 10 representa el plásmido de expresión para la producción del sitio ClfA 290. El ORF codifica un péptido señal DsbA N-terminal de E. coli, un sitio glucado alrededor de la posición de aminoácido 290 y un marcador HIS en C-terminal. La construcción mencionada anteriormente se clona en NheI/SalI en pEC415. SEQ ID NO: 11 representa el plásmido de expresión para la producción del sitio ClfA 327. El ORF codifica un péptido señal DsbA N-terminal de E. coli, un sitio glucado alrededor de la posición de aminoácido 327 y un marcador HIS en C-terminal. La construcción mencionada anteriormente se clona en NheI/SalI en pEC415. SEQ ID NO: 12 representa el plásmido de expresión para la producción del sitio 532 de ClfA. El ORF codifica un péptido señal DsbA N-terminal de E. coli, un sitio glucado alrededor de la posición de aminoácido 532 y un marcador HIS en C-terminal. La construcción mencionada anteriormente se clona en NheI/SalI en pEC415. SEQ ID NO: 13 representa la secuencia de aminoácidos de EPA destoxificada genéticamente, recombinante, con una secuencia señal y dos sitios de glucosilación en las posiciones 260 y 402.
SEQ ID NO: 14 representa la secuencia de aminoácidos de EPA destoxificada genéticamente, recombinante, sin una secuencia señal y dos sitios de glucosilación en las posiciones 241 y 383.
SEQ ID NO: 15 representa el ORF que codifica AcrA clonado mediante NheI/SalI en pEC415.
SEQ ID NO: 16 representa el plásmido de expresión para la producción del sitio Hla-H35L 130. El ORF codifica un péptido señal DsbA N-terminal de E. coli, un sitio glucado alrededor de la posición de aminoácido 130 y un marcador HIS en C-terminal. La construcción mencionada anteriormente se clona NheI/SalI en pEC415.
SEQ ID NO: 17 representa el grupo génico productor de CP5 con cap5K flipasa, seguido de un casete de expresión de pglB que consiste en la secuencia de ADN intergénica entre galF y wbqA del serotipo 0121 de E. coli y el ORF de pglB. El inserto se clona en el sitio de EcoRI de pLAFR1.
SEQ ID NO: 18 representa el grupo génico productor de CP8 con cap8K flipasa, seguido de un casete de expresión de pglB que consiste en la secuencia de ADN intergénica entre galF y wbqA del serotipo 0121 de E. coli y el ORF de pglB. El inserto se clona en el sitio de EcoRI de pLAFR1.
SEQ ID NO: 19 representa el grupo génico productor de CP8 con cap8K flipasa, seguido de un casete de expresión de pglB que consiste en la secuencia de ADN intergénica entre galF y wbqA del serotipo 0121 de E. coli y el ORF de pglB, además, esta secuencia tiene el gen para wzz de la serovariedad O7 de E. coli clonada en SfaAI/BspTI, es decir, entre wzx de Pseudomonas aeruginosa O11 y cap8H. El inserto se clona en el sitio EcoRI de pLAFR1. SEQ ID NO: 20 representa un plásmido de expresión para EPA y wzz. La estructura es pACT3 en la que se reemplazó el casete de resistencia (cloranfenicol por kanamicina)
SEQ ID NO: 21 representa wzz del serotipo O7 de E. coli clonado en Eco/Sal de pext2l.
SEQ ID NO: 22 representa una secuencia peptídica expuesta en los Ejemplos.
SEQ ID NO: 23 representa una secuencia peptídica expuesta en los Ejemplos.
SEQ ID NO: 24 representa una secuencia consenso de proteína, D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina.
SEQ ID NO: 25 representa un sitio de glucosilación.
SEQ ID NO: 26 representa un sitio de glucosilación.
SEQ ID NO: 27 representa un plásmido de expresión que contiene el ORF de pglB clonado en los sitios EcoRI/BamHI.
Las descripciones de términos y abreviaturas aparecen a continuación tal como se usan en la memoria descriptiva y son consistentes con los usos conocidos por los expertos en la materia. Las descripciones se proporcionan para facilitar la comprensión de dichos términos y abreviaturas y no deben interpretarse como realizaciones limitantes de la invención.
AcrA se refiere a una glucoproteína de C. jejuni.
La inmunización activa se refiere a la inducción de inmunidad (anticuerpos) después de la exposición a un antígeno. APC se refiere a células presentadoras de antígeno.
Amp se refiere a ampicilina.
Bacteriemia se refiere a la presencia de bacterias viables en la sangre circulante.
C' se refiere al complemento.
CapA es una enzima propuesta para ser un determinante de la longitud de cadena en CP5 de S. aureus.
CapB es una enzima propuesta para ser un regulador de la longitud de la cadena de polisacáridos en CP5 de S. aureus.
CapC es una enzima propuesta para codificar una proteína transportadora en CP5 de S. aureus.
CapD una enzima que tiene una actividad de 4,6 deshidratasa, que convierte el precursor UDPGlcNAc en UDP-2-acetamido-2,6 didesoxi-D-xilo-4-hexulosa en CP5 de S. aureus.
CapE es una 4,6-deshidratasa 3,5-epimerasa que cataliza la epimerización de UDP-D-GlcNac a UDP-2-acetamido-2, 6-didesoxi-D-l/'xo-4-hexulosa en CP5 de S. aureus.
CapF es una reductasa, cataliza la forma de reducción UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-D-l/'xo-4-hexulosa a UDP-L-6dTalNAc en CP5 de S. aureus.
CapG es una 2-epimerasa, cataliza la forma de epimerización UDP-L-6dTalNAc a UDP-LFucNAc en CP5 de S. aureus. CapH en CP5 de S. aureus es una O-acetiltransferasa.
CapH en CP8 es una transferasa similar a capI de CP5 de S. aureus.
CapI en CP5 de S. aureus es una glucosiltransferasa que cataliza la transferencia de UDP-ManNAcA en el transportador lipídico-D-FucNAc-L-FucNAc produciendo el transportador lipídico-D-FucNAc-L-FucNAc-ManNAcA. CapI en CP8 es una polimerasa que es similar a CapJ en CP5 de S. aureus.
CapJ en CP5 de S. aureus es una polimerasa.
CapJ en CP8 es una O-acetiltransferasa similar a CapH en CP5 de S. aureus.
CapK en CP5 de S. aureus es una flipasa en
CapK en CP8 de S. aureus es una flipasa similar a CapK en CP5.
CapL es una transferasa que cataliza la transferencia de UDP-L-FucNAc en D-FucNAc-L-FucNAc-transportador lipídico que produce transportador lipídico-D-FucNAc-L-FucNAc en CP5 de S. aureus.
CapM es una transferasa que cataliza la transferencia de UDP-D-FucNAc en el transportador lipídico productor de transportador lipídico-D-FucNAc en CP5 de S. aureus.
CapN es una 4-reductasa que cataliza la reducción de UDP-2-acetamido-2, 6-didesoxi-D-xilo-4-hexulosa a UDP-D-FucNAc en CP5 de S. aureus.
CapO es una deshidrogenasa que cataliza la conversión de UDP-D-ManNAc en UDP-ManNAcA en CP5 de S. aureus. CapP es una 2-epimerasa que cataliza la epimerización de UDP-D-GlcNAc a UDP-D-ManNAc en CP5 de S. aureus. UFC se refiere a unidades formadoras de colonias.
ClfA se refiere al factor de aglutinación A de S. aureus, una proteína anclada en la pared celular.
La vacuna conjugada se refiere a una vacuna creada mediante la unión covalente de un antígeno polisacárido a una proteína transportadora. La vacuna conjugada provoca respuestas inmunitarias antibacterianas y memoria inmunológica. En bebés y personas mayores se puede inducir una respuesta inmune protectora contra antígenos de polisacáridos si estos antígenos se conjugan con proteínas que inducen una respuesta dependiente de linfocitos T. La secuencia consenso se refiere a una secuencia de aminoácidos, -D/E - X - N - Z - S/T-, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina, dentro de la cual se encuentra el sitio de unión de carbohidratos a glucoproteínas ligadas a N.
El polisacárido capsular se refiere a una capa gruesa de tipo mucosa de polisacárido. Los polisacáridos capsulares son solubles en agua; habitualmente ácidos que consisten en unidades que se repiten regularmente de uno a varios monosacáridos/monómeros.
CP5 se refiere a polisacárido capsular de tipo 5 de Staphylococcus aureus o polisacárido capsular de serotipo 5. CP8 se refiere a polisacárido capsular de tipo 8 de Staphylococcus aureus o polisacárido capsular de serotipo 8. D-FucNAc se refiere a N-acetil D-fucosamina.
ECA se refiere al antígeno común enterobacteriano.
ELISA se refiere a ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas, una técnica bioquímica utilizada principalmente en inmunología para detectar la presencia de un anticuerpo o un antígeno en una muestra.
EPA o EPAr se refieren a la exoproteína A de P. aeruginosa recombinante no tóxica
La vacuna glucoconjugada se refiere a una vacuna que consiste en un transportador proteico unido a un oligosacárido antigénico.
Glucosiltransferasa se refiere a enzimas que actúan como un catalizador para la transferencia de una unidad monosacárida desde un azúcar de nucleótido activado a una molécula aceptora de glucosilo.
La cepa grampositiva se refiere a una cepa bacteriana que se tiñe de púrpura con tinción de Gram (una valiosa herramienta de diagnóstico). Las bacterias grampositivas tienen una pared celular similar a una malla gruesa hecha de peptidoglucano (50-90 % de la pared celular).
La cepa gramnegativa se refiere a una cepa bacteriana que tiene una capa más fina (10 % de la pared celular) que se tiñe de rosa. Las bacterias gramnegativas también tienen una membrana externa adicional que contiene lípidos y está separada de la pared celular por el espacio periplásmico.
Hla (alfa toxina) se refiere a alfa-hemolisina, que es una toxina formadora de poros secretada y un antígeno de factor de virulencia esencial de S. aureus.
Hla H35L se refiere a una forma mutante de la alfa-toxina no tóxica HIa mutante de S. aureus.
El marcador de histidina o marcador de polihistidina es un motivo de aminoácidos en las proteínas que consiste en al menos cinco restos de histidina (His), a menudo en el extremo N o C de la proteína utilizada para purificar de una manera muy simple y rápida mediante unión específica a una columna de afinidad de níquel.
IV se refiere a vía intravenosa.
kDa se refiere a kilo Daltons, es una unidad de masa atómica.
L-FucNAc se refiere a N-acetil L-fucosamina.
LPS se refiere a lipopolisacárido. Los lipopolisacáridos (LPS), también conocidos como lipoglucanos, son moléculas grandes que consisten en un lípido y un polisacárido unidos por un enlace covalente; se encuentran en la membrana externa de las bacterias gramnegativas, actúan como endotoxinas y provocan respuestas inmunes fuertes en los animales.
ManNAcA se refiere al ácido N-acetil manosaminurónico.
Las cepas de S. aureus resistente meticilina (MRSA) se refiere a cepa de S. aureus resistente a meticilina asociada a una estancia hospitalaria más prolongada y a más infecciones en unidades de cuidados intensivos, que lleva a una mayor administración de antibióticos.
Los N-glucanos u oligosacáridos unidos a N se refieren a monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos de composiciones variables que están unidas a un nitrógeno £-amida de un resto de asparagina en una proteína a través de un enlace N-glucosídico.
La glucosilación de proteína unida a N se refiere a un proceso o ruta para unir covalentemente "glucanos" (monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos) a un nitrógeno de la cadena lateral de asparagina (N) en una proteína diana.
Los antígenos O se refieren a un polímero de glucano repetitivo contenido dentro de un LPS, también llamado O-polisacárido. El antígeno O está unido al oligosacárido central y comprende el dominio más externo de la molécula de LPS.
Oligosacáridos o polisacáridos se refiere a homopolímero o heteropolímero formado por carbohidratos unidos covalentemente (monosacáridos) que consisten en unidades repetitivas (monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, etc.) unidos entre sí por enlaces glucosídicos.
La actividad opsonofagocítica se refiere a la fagocitosis de un patógeno en presencia del complemento y anticuerpos específicos. Se cree que las actividades opsonofagocíticas in vitro (OPA) de los anticuerpos séricos representan las actividades funcionales de los anticuerpos in vivo y, por lo tanto, se correlacionan con la inmunidad protectora. OTasa u OST se refiere a oligosacaril transferasa que cataliza una transferencia de oligosacárido o polisacárido (glucosilación) mecánicamente única y selectiva al resto de asparagina (N) en la secuencia consenso de proteínas nacientes o plegadas.
Inmunización pasiva es la transferencia de la inmunidad humoral activa en forma de anticuerpos ya fabricados, de un individuo a otro.
Espacio periplásmico se refiere al espacio entre la membrana citoplásmica interna y la membrana exterior externa de las bacterias gramnegativas.
PMN se refiere a neutrófilos polimorfonucleares, que son los glóbulos blancos más abundantes en la sangre periférica de los seres humanos, y muchos (aunque no todos) los mamíferos.
El portador proteico se refiere a una proteína que comprende la secuencia consenso en la que se une el oligo-"poli"-sacárido.
RU se refiere a la unidad de repetición, que está compuesta de heteropolisacáridos específicos sintetizados mediante el ensamblaje de monosacáridos individuales en un oligosacárido en un vehículo de undecaprenil fosfato (Und-P) seguido de polimerización en un oligosacárido.
La secuencia señal se refiere a un péptido corto (por ejemplo, de aproximadamente 3-60 aminoácidos de longitud) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige la proteína a diferentes lugares.
UDP-D-ManNAc es UDP-N-acetil-D-manosamina
UDP-D-ManNAcA es ácido UDP-N-acetil-D-manosoaminurónico
UDP-D-QuiNAc es UDP-N-acetil-D-quinovosamina
UDP-L-FucNAc es UDP-N-acetil-L-fucosamina
UDP-L-6dTalNAc es UDPN-acetil-L-pneumosamina.
Und se refiere a un lípido undecaprenilo o undecaprenol compuesto por once unidades prenol.
UndP se refiere a undecaprenil fosfato, que es un transportador lipídico universal (derivado de Und) de intermedios biosintéticos de glucanos para polímeros de carbohidratos que se exportan a la envoltura de células bacterianas. UndPP se refiere al undecaprenil pirofosfato, que es una versión fosforilada de UndP.
wbjA es una glucosiltransferasa en O11 de P. aeruginosa
wbjB es una supuesta epimerasa similar a las enzimas requeridas para la biosíntesis de cápsulas de CP5 y CP8 en S. aureus.
wbjC es una supuesta epimerasa en O11 de P. aeruginosa.
wbjD es una supuesta epimerasa en O11 de P. aeruginosa.
wbjE es una supuesta epimerasa en O11 de P. aeruginosa.
wbjF es una glucosiltransferasa en O11 de P. aeruginosa.
wbpL glucosiltransferasa, participa en la biosíntesis de LPS en O11 de P. aeruginosa.
wbpM glucosiltransferasa, participa en la biosíntesis de LPS en O11 de P. aeruginosa.
Las realizaciones de la invención se basan al menos parcialmente en el descubrimiento de que C. je jun i contiene un sistema general de glucosilación de proteínas unidas a N, una característica inusual para organismos procariotas. Se ha demostrado que varias proteínas de C. je juni están modificadas por un heptasacárido. Este heptasacárido se ensambla en UndPP, el lípido transportador, en el lado citoplásmico de la membrana interna mediante la adición por etapas de monosacáridos activados por nucleótidos catalizados por glucosiltransferasas específicas. El oligosacárido unido a lípidos se voltea luego (es decir, se difunde transversalmente) al espacio periplásmico mediante una flipasa, por ejemplo, PglK. En la etapa final de la glucosilación de proteínas unidas a N, la OTasa (por ejemplo, PglB) cataliza la transferencia del oligosacárido del lípido transportador a restos de Asn dentro de la secuencia consenso Asp/Glu-Xaa-Asn-Zaa-Ser/Thr (es decir, D/E - X - N - Z - S/T), en la que Xaa y Zaa pueden ser cualquier aminoácido excepto Pro. Los inventores han transferido con éxito el grupo de glucosilación para el heptasacárido a E. coli y fueron capaces de producir glucoproteínas unidas a N de Campylobacter.
Un procedimiento novedoso e inventivo para modificar una bacteria huésped gramnegativa, como E. coli, se ha desarrollado para producir proteínas glucosiladas para su uso como productos de vacuna contra una bacteria grampositiva como S. aureus. El desarrollo de este procedimiento requirió superar problemas significativos y, en muchos aspectos, inesperados, y apartarse sustancialmente de la sabiduría convencional y la técnica anterior.
En este procedimiento novedoso e inventivo, se identificó otra bacteria gramnegativa que produce un polisacárido que tiene similitud estructural con el polisacárido de interés del organismo diana, por ejemplo S. aureus. Para los fines de la presente invención, la similitud estructural se manifiesta como unidades de repetición en el polisacárido de la diana (por ejemplo, S. aureus) que son parcialmente idénticas a las unidades que se repiten en el polisacárido de la otra bacteria gramnegativa identificada. Debido a que esta última bacteria es gramnegativa, como es el huésped, por ejemplo, organismo E. coli, inicialmente se planteó la hipótesis (y luego se verificó mediante el experimento como se trata a continuación) de que el uso de sus vías de biosíntesis en un organismo de E. coli modificado permitiría la biosíntesis del antígeno RU construido y su paso del citoplasma al periplasma del organismo de E. coli modificado. Además, se planteó la hipótesis (y luego se verificó mediante el experimento como se trata a continuación) de que el tamaño del polisacárido producido a través de esta ruta de biosíntesis sería mucho menor que el polisacárido producido por la ruta de biosíntesis de S. aureus grampositivo.
Como resultado, y como se verá más adelante, el novedoso e innovador procedimiento que desarrollamos resolvió los problemas difíciles antes mencionados.
Adicionalmente, se encontró sorprendentemente que aspectos de la ruta de LPS en un organismo gramnegativo podrían usarse para producir polisacáridos que contienen algunas de las mismas unidades repetitivas que los polisacáridos capsulares nativos de bacterias grampositivas, tales como, por ejemplo, S. aureus, como se detalla a continuación.
Por lo tanto, al hacer la sección de polisacáridos de la vacuna de proteína glucosilada para S. aureus, una solución sorprendente es construir la sección de polisacáridos al menos parcialmente basada en un polisacárido nativo de una bacteria gramnegativa como E. coli. Además se descubrió que, al hacer esto, aparentemente es importante encontrar una bacteria que produzca un polisacárido que sea lo más similar posible al polisacárido de interés producido por S. aureus. P. aeruginosa es tal bacteria.
La figura 1 proporciona una descripción paso a paso de una realización de la preparación de monosacáridos activados por nucleótidos en el citoplasma, ya sea por enzimas proporcionadas en el grupo de antígenos O o por enzimas de mantenimiento de la célula huésped gramnegativa, como sería evidente para un experto en la técnica a la luz de esta memoria descriptiva. Las etapas del procedimiento proceden de izquierda a derecha en la representación de la figura 1 En la realización representada en la figura 1, una glucosilfosfato transferasa (WbpL) agrega fosfato de D-FucNAc a UndP, formando UndPP-FucNAc. Las glucosiltransferasas específicas alargan luego la molécula de UndPP-D-FucNAc añadiendo monosacáridos formando el oligosacárido de la unidad de repetición (RU) (WbjE, WbjA). El RU se voltea al espacio periplásmico mediante la proteína Wzx. La enzima Wzy polimeriza las RU periplásmicas para formar el polisacárido de antígeno O. La longitud del polímero está controlada por la proteína Wzz. Muchos oligosacáridos y polisacáridos bacterianos se ensamblan en UndPP y, a continuación, se transfieren a otras moléculas. En otras palabras, UndPP es una plataforma de construcción general para azúcares en bacterias. En E. coli y, se cree que, en la mayoría de otras bacterias gramnegativas, el antígeno O se transfiere de UndPP al núcleo de lípido A por la enzima de E. coli WaaL para formar lipopolisacárido (LPS).
La figura 2 representa una realización de la preparación de monosacáridos activados por nucleótidos en el citoplasma mediante enzimas proporcionadas en el grupo de antígeno O de P. aeruginosa O11, mediante enzimas constitutivas de la célula huésped gramnegativa y mediante enzimas de S. aureus y/o E. coli que se sabe que son necesarias para la biosíntesis de UDP-ManNAcA (Cap5OP y/o WecBC), como sería evidente para un experto en la técnica a la luz de esta memoria descriptiva. En la representación de la figura 2, las etapas del proceso proceden de izquierda a derecha. Como en la biosíntesis de O11, WbpL y WbjE sintetizan el disacárido central. A continuación, la glucosiltransferasa de S. aureus Cap5I agrega D-ManNAcA. Cap5H agrega un grupo acetilo al segundo resto FucNAc. La acetilación puede ser la etapa final de la síntesis de RU como se muestra en la figura 2. El volteo es posible por una o todas las proteínas Wzx en el sistema, que son Wzx de P. aeruginosa o Cap5K expresadas de forma recombinante, o enzimas de tipo Wzx expresadas endógenamente, por ejemplo, del grupo de ECA codificado en el cromosoma de E. coli. La polimerización es una actividad exclusiva de la polimerasa Cap5J que forma el polisacárido CP5 en UndPP. Como otros polisacáridos unidos por UndPP, el azúcar CP5 se transfiere al núcleo de lípido A por la enzima de E. coli WaaL para formar LPS recombinante (cápsula de LPS).
La figura 3 representa la preparación de monosacáridos activados por nucleótidos en el citoplasma mediante enzimas proporcionadas en el grupo de antígeno O de P. aeruginosa O11, mediante enzimas constitutivas de la célula huésped gramnegativa y mediante enzimas de S. aureus y/o E. coli que se sabe que son necesarias para la biosíntesis de UDP-ManNAcA (Cap8OP y/o WecBC), como sería evidente para un experto en la técnica a la luz de esta memoria descriptiva. En la representación de la figura 3, las etapas del proceso proceden de izquierda a derecha. Como en la biosíntesis de O11, WbpL y WbjE sintetizan el disacárido central. A continuación, la glucosiltransferasa de S. aureus Cap8H agrega D-ManNAcA. Cap8J agrega un grupo acetilo al segundo resto FucNAc. No se sabe si ocurre acetilación se produce en el azúcar activado o en la RU unida a lípidos. El volteo es posible por una o todas las proteínas Wzx en el sistema, que son Wzx de P. aeruginosa o Cap8K expresadas de forma recombinante, o enzimas de tipo Wzx expresadas endógenamente, por ejemplo, del grupo de e Ca codificado en el cromosoma de E. coli. La polimerización es una actividad exclusiva de la polimerasa Cap8I que forma el polisacárido CP8 en UndPP. El azúcar de CP8 se transfiere luego al núcleo de lípido A en E. coli por la enzima WaaL.
La figura 4 ilustra las diferentes estructuras de los polisacáridos O11, CP5 y CP8. Se muestra en la figura 4 que las RU comparten la estructura idéntica del vástago que consiste en UndPP y el disacárido a-D-FucNAc-(1,3)-L-FucNAc. Las RU de S. aureus están parcialmente decoradas con un único grupo O-acetilo, ya sea en el medio L-FucNAc o en el resto ManNAcA, que es característico de las RU de S. aureus. La conectividad del segundo y tercer azúcar en las RU de S. aureus es diferente entre ellos, así como la conectividad entre las RU polimerizadas. A la derecha, las estructuras de azúcar se muestran en una representación diferente. El número por las flechas traseras (CP5 y CP8) indica la posición del carbono modificado con un grupo O-acetilo. Una representación alternativa de las estructuras RU se muestra en la parte inferior izquierda. Como se muestra en la figura 4, existe una gran superposición entre la RU en el antígeno O11 que es parte de un polisacárido nativo de P. aeruginosa y los de las cápsulas CP5 y CP8 de las respectivas cepas de Staphylococcus. En particular, tal y como se muestra en la figura 4, la porción L-FucNAc -> D-FucNAc en la RU es idéntica en ambos.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para identificar un polisacárido diana para su uso en la glucosilación de una proteína con dicho polisacárido diana, en su totalidad o en parte. Dicha proteína glucosilada que comprende el polisacárido diana puede usarse, por ejemplo, en composiciones de vacuna. El procedimiento para identificar un polisacárido diana incluye: identificar una bacteria Grampositiva, tal como S. aureus, como diana; identificar una primera unidad de repetición de un polisacárido producido por dicha bacteria grampositiva que comprende al menos tres monómeros; identificar un polisacárido producido por una bacteria de una especie gramnegativa que comprende una segunda unidad de repetición que comprende al menos dos de los mismos monómeros que dicha primera unidad de repetición.
Por consiguiente, en una realización de la divulgación, un procedimiento para modificar una bacteria de una primera especie gramnegativa incluye: identificar una bacteria Grampositiva, tal como S. aureus, como diana; identificar una primera unidad de repetición de un polisacárido producido por dicha bacteria grampositiva que comprende al menos tres monómeros; identificar un polisacárido producido por una bacteria de una especie gramnegativa que comprende una segunda unidad de repetición que comprende al menos dos de los mismos monómeros que dicha primera unidad de repetición; insertar en dicha bacteria de una primera especie gramnegativa una o más secuencias de nucleótidos que codifican glucosiltransferasas que ensamblan un trisacárido que contiene: a) dicha segunda unidad de repetición; y b) un monómero de dicha primera unidad de repetición no presente en dicha segunda unidad de repetición; insertar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, tal como una proteína que comprende al menos una secuencia consenso insertada D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; e insertar una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa.
En una realización de la divulgación, el procedimiento comprende además insertar en una bacteria gramnegativa huésped una o más secuencias de nucleótidos que codifican glucosiltransferasas que ensamblan un trisacárido que contiene un monómero de una primera unidad de repetición no presente en una segunda unidad de repetición y que ensamblan la segunda unidad de repetición. Una realización adicional de la divulgación implica insertar una o más glucosiltransferasas de una bacteria gramnegativa que ensamblan al menos una unidad monomérica de una primera unidad de repetición y una o más glucosiltransferasas de una bacteria Grampositiva, tal como S. aureus, que ensamblan al menos dos monómeros de una segunda unidad de repetición. El procedimiento comprende adicionalmente insertar en la inserción en una bacteria huésped gramnegativa una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína y una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa.
En al menos una realización de la divulgación, se genera una cepa de E. coli huésped con los ácidos nucleicos correspondientes que codifican las enzimas requeridas de las cepas CP5 y CP8 de S. aureus, que acumulará, volteará y polimerizará las unidades repetitivas construidas. En una realización, las glucosiltransferasas específicas necesarias corresponden a las que forman la RU L-FucNAc -> D-FucNAc que son nativas de P. aeruginosa, y a glucosiltransferasas correspondientes a las que añaden el monosacárido D-ManNAcA al total de RU que son nativas de cada una de las cepas CP5 y CP8 de S. aureus. Tal realización puede incluir además el uso de un plásmido para inyectar los ácidos nucleicos en la célula huésped. Una realización adicional implica usar, en un plásmido, ácidos nucleicos que codifican las glucosiltransferasas correspondientes a L-FucNAc -> D-FucNAc, y, en un plásmido diferente, ácidos nucleicos que codifican las glucosiltransferasas correspondientes a D-ManNAcA. Un beneficio de tales realizaciones, sorprendente a la luz de la técnica anterior, es que la vía de biosíntesis de LPS modificada de P. aeruginosa que ahora es responsable de producir el polímero RU construido del S. aureus la cápsula produce una estructura mucho más pequeña que la cápsula de S. aureus.
La presente divulgación se refiere adicionalmente a una N-proteína glucosilada recombinante que comprende al menos una secuencia consenso insertada D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; y al menos un oligo o polisacárido de una bacteria Grampositiva unida a dicha secuencia consenso. En otra realización, la proteína N-glucosilada recombinante comprende dos o más de dichas secuencias de consenso insertadas. En una realización adicional, la proteína N-glucosilada recombinante comprende dos o más de dichos polisacáridos u oligosacáridos de S. aureus. Aún en una realización adicional, la proteína N-glucosilada recombinante comprende dos o más de dichas secuencias de consenso insertadas y oligosacáridos o polisacáridos de diferentes cepas de S. aureus, por ejemplo, de la cepa 5 de polisacárido capsular de S. aureus y la cepa de polisacárido capsular 8.
La presente divulgación está dirigida además a una combinación de un polisacárido capsular modificado de S. aureus con un antígeno de proteína del mismo organismo por enlace N-glucosídico.
Las realizaciones de la presente divulgación incluyen una proteína que está glucosilada en la naturaleza. Tales proteínas naturalmente glucosiladas (por ejemplo, proteínas de C. jejuni) contienen secuencias consenso naturales, pero no comprenden ninguna secuencia de consenso optimizada adicional (es decir, introducida). Las proteínas naturalmente glucosiladas incluyen proteínas procariotas y eucariotas. Las realizaciones de la presente descripción incluyen una proteína que está N-glucosilada recombinante, que comprende una o más de las siguientes secuencia(s) de aminoácidos parciales N-glucosiladas: D/E - X - N - Z - S/T, (secuencia consenso optimizada) en el que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto Pro, y en el que se introduce al menos una de dichas secuencia(s) de aminoácidos parciales N-glucosiladas. La introducción de secuencia(s) de aminoácidos parciales específicas (secuencia(s) consenso(s) optimizada(s)) en proteínas conduce a proteínas que son N-glucosiladas de manera eficiente mediante una OTasa, tales como, por ejemplo, una OTasa de Campylobacter spp., tales como, por ejemplo, un OTasa de C. je jun i, en las posiciones de introducción.
El término "secuencia(s) de aminoácidos parcial" tal como se usa en el contexto de la presente invención también se denominará "secuencia(s) consenso(s) optimizada(s)" o "secuencia(s) consenso(s)". La secuencia consenso optimizada es N-glucosilada por una OTasa, tales como, por ejemplo, una OTasa de Campylobacter spp., tales como, por ejemplo, un OTasa de C. jejuni.
De acuerdo con el código de una letra internacionalmente aceptado para aminoácidos, las abreviaturas D, E, N, S y T denotan ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, serina y treonina, respectivamente.
La introducción de la secuencia consenso optimizada se puede lograr mediante la adición, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos. La adición, deleción y/o sustitución de uno o más aminoácidos con el fin de introducir la secuencia consenso optimizada se puede lograr mediante estrategias de síntesis química bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como la síntesis de péptidos químicos asistidos en fase sólida. Alternativamente, y preferido para polipéptidos más grandes, las proteínas de la presente invención se pueden preparar mediante técnicas recombinantes estándar añadiendo ácidos nucleicos que codifican una o más secuencias de consenso optimizadas en la secuencia de ácido nucleico de una proteína de partida, que puede ser una proteína que está glucosilada naturalmente o puede ser una proteína que no está glucosilada naturalmente.
En una realización preferida, las proteínas de la presente invención pueden tener una o más, preferentemente al menos dos o al menos tres y, más preferentemente, al menos cinco de dichas secuencias de aminoácidos optimizadas N-glucosiladas.
La presencia de una o más secuencia(s) de aminoácidos optimizadas N-glucosiladas en las proteínas de la presente invención puede ser una ventaja para aumentar su antigenicidad, aumentar su estabilidad, afectar a su actividad biológica, prolongar su semivida biológica y/o simplificar su purificación.
La secuencia consenso optimizada puede incluir cualquier aminoácido excepto prolina en posición(es) X y Z. El término "cualquier aminoácido" pretende abarcar aminoácidos naturales comunes y raros, así como derivados de aminoácidos sintéticos y análogos que todavía permitirán que la secuencia consenso optimizada sea N-glucosilada por la OTasa.
Los aminoácidos comunes y raros que ocurren naturalmente son preferidos para X y Z. X y Z pueden ser iguales o diferentes.
Se observa que X y Z pueden diferir para cada secuencia consenso optimizada en una proteína de acuerdo con la presente invención.
El N-glucano unido a la secuencia consenso optimizada estará determinado por las glucosiltransferasas específicas y su interacción cuando se ensambla el oligosacárido en un transportador lipídico para su transferencia por la OTasa. Los expertos en la materia pueden diseñar N-glucano variando el tipo(s) y la cantidad de las glucosiltransferasas específicas presentes en la célula huésped deseada. (Raetz y Whitfield, Lipopolysaccharide Endotoxins, NIH-PA Author Manuscript 1-57, 19-25 (publicado en forma final editada como: Annual Rev. Biochem., 71 635-700 (2002)); Reeves y col., Bacterial Polysaccharide Synthesis and Gene Nomenclature, Trends in Microbio. 4(3): 495-503, 497-98 (Dic. 1996); y Whitfield, C. e I. S. Roberts. 1999. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol 31 (5): 1307-19).
Los "polisacáridos" como se usan en este documento incluyen sacáridos que comprenden al menos dos monosacáridos. Los polisacáridos incluyen oligosacáridos, trisacáridos, unidades repetitivas que comprenden uno o más monosacáridos (o monómeros) y otros sacáridos reconocidos como polisacáridos por un experto en la técnica. Los N-glucanos se definen aquí como monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos de composiciones variables que están unidas a un nitrógeno £-amida de un resto de asparagina en una proteína a través de un enlace N-glucosídico.
Los polisacáridos incluyen, sin limitación, polisacáridos de S. aureus tales como CP5 y CP8. La realización de la invención incluye además polisacáridos de S. aureus que se dirigen a una bacteria, tal como un polisacárido que se dirige a una cepa de S. aureus resistente a la meticilina. Donde se menciona aquí que los polisacáridos se dirigen a una cepa bacteriana, tales polisacáridos incluyen polisacáridos que son de la bacteria contra los cuales se desea una respuesta inmune e incluyen polisacáridos que son iguales que, basados en, derivados de, nativos o diseñados a partir de la bacteria contra la que se desea una respuesta inmune.
No hay limitación en el origen de la proteína recombinante. En una realización, dicha proteína se deriva de proteínas de mamíferos, bacterias, virus, hongos o plantas. En una realización adicional, la proteína deriva de mamíferos, más preferiblemente proteínas humanas. Para preparar proteínas recombinantes antigénicas de acuerdo con la invención, preferiblemente para uso como componentes activos en vacunas, se prefiere que la proteína recombinante se derive de una proteína bacteriana, viral o fúngica. La glucosilación de proteínas de diversos orígenes es conocida por los expertos en la técnica. Kowarik y col., "Definition of the bacterial N-glycosylation site consensus sequence" e Mb O J. (2006) 1-10.
En un ejemplo en una realización, la exotoxina de P. aeruginosa (EPA) destoxificada genéticamente es un portador de proteína adecuado. Para producir una versión de EPA que puede estar glucosilada, los ácidos nucleicos que codifican EPA deben modificarse mediante la inserción de sitios de glucosilación como se discutió anteriormente.
Los portadores proteicos destinados para su uso en realizaciones de la invención preferiblemente deben tener ciertas características inmunológicas y farmacológicas. Desde una perspectiva inmunológica, preferentemente, un portador de proteína debería: (1) tener epítopes de linfocitos T; (2) ser capaz de administrar un antígeno a células presentadoras de antígeno (APC) en el sistema inmune; (3) ser potente y duradero; y (4) ser capaz de generar una respuesta de IgG sistémica específica de antígeno. Desde una perspectiva farmacológica, un portador de proteína debería, preferentemente: (1) no ser tóxico; y (2) ser capaz de liberar antígenos de manera eficiente a través de las barreras epiteliales intactas. Más preferentemente, además de estas características inmunológicas y farmacológicas, un portador de proteína considerado para uso en la producción de un bioconjugado bacteriano debe: (1) secretarse fácilmente en el espacio periplásmico; y (2) ser capaz de tener epítopos de antígeno fácilmente introducidos como bucles o secuencias lineales en él. Informado por esta divulgación y conocimiento de un experto en la materia, un experto en la técnica puede considerar e identificar rutinariamente portadores de proteínas adecuados que pueden usarse.
En la presente divulgación, la proteína AcrA de Campylobacter es un portador de proteína.
Según la presente divulgación, la exotoxina de P. aeruginosa (EPA) desintoxicada genéticamente es un portador de proteína en el cual el organismo objetivo para el cual se desea una vacuna es S. aureus. A diferencia de AcrA que contiene sitios de glucosilación naturales, EPA no contiene tales sitios de glucosilación natural y necesita ser modificado por inserción de sitios de glucosilación (por ejemplo, inserción de ácidos nucleicos que codifican la secuencia consenso optimizada como se discutió anteriormente en la secuencia de ácido nucleico que codifica EPA). En una realización adicional, EPA se modifica para introducir dos sitios de glucosilación que permitirán la glucosilación con el antígeno de S. aureus. Aún en una realización adicional, se introducen dos secuencias de consenso como se discute en el Ejemplo 10 del documento WO 2009/104074.
La secuencia de aminoácidos de EPA, como se modificó en una realización de esta invención para contener dos sitios de glucosilación, se proporciona como la SEQ ID NO: 13 (con secuencia señal) y la SEQ ID NO.: 14 (sin secuencia señal). Los sitios de glucosilación en la SEQ ID NO: 13 son DNNNS y DQNRT en las posiciones 260DNNNS y 402DQNRT. Los sitios de glucosilación en la SEQ ID NO: 14 son DNNNS y DQNRT en las posiciones 241DNNNS y 383DQNRT.
Una proteína transportadora tal como EPA es una proteína sobre la que pueden añadirse sitios de N-glucosilación en la producción de un bioconjugado bacteriano. Los sitios de N-glucosilación requieren la introducción de las secuencias consenso discutidas previamente, a saber, inserción de secuones D/E-X-N-Z-S/T, en los que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina. Hemos encontrado que dichas secuencias consenso preferiblemente se introducen en bucles de superficie, mediante inserción en lugar de mutación y mediante el uso de restos flanqueantes insertados adicionalmente y mediante la mutación de restos flanqueantes para optimizar el funcionamiento del sitio de N-glucosilación.
Algunos antígenos de subunidades proteicas bien caracterizados de S. aureus son la hemolisina alfa (toxina alfa, Hla), factor de aglutinación alfa (ClfA), IsdB y leucocidina de Panton-Valentine (PVL).
Hla es una toxina formadora de poros secretada y un factor de virulencia esencial de MRSA en un modelo de ratón de neumonía por S. aureus. El nivel de expresión de Hla por cepas de S. aureus independientes se correlaciona directamente con su virulencia. Inmunización activa con una forma mutante de Hla (Hla h 35L, SEQ ID NO: 5), que no puede formar poros (Menzies, B. E., y D. S. Kernodle. 1996. Passive immunization with antiserum to a nontoxic alphatoxin mutant from Staphylococcus aureus is protective in a murine model. Infect Immun 64: 1839-41; Jursch, R., A. Hildebrand, G. Hobom, J. Tranum-Jensen, R. Ward, M. Kehoe y S. Bhakdi. 1994. Histidine residues near the N terminus of staphylococcal alpha-toxin as reporters of regions that are critical for oligomerization and pore formation. Infect Immun 62 (6): 2249-56), se demostró que genera respuestas de inmunoglobulina G específicas de antígeno y para proporcionar protección contra la neumonía por estafilococos. La transferencia de anticuerpos específicos de HLA protege a los animales ingenuos contra exposición a S. aureus y previene la lesión de las células epiteliales de los pulmones humanos durante la infección (Bubeck Wardenburg, J., A. M. Palazzolo-Ballance, M. Otto, O. Schneewind y F. R. DeLeo. 2008. Panton-Valentine leukocidin is not a virulence determinant in murine models of community-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus disease. J Infect Dis 198:1166-70). Para usarse como vacuna, se requiere la mutación H35L en Hla para eliminar la toxicidad de la proteína (Menzies, B. E., y D. S. Kernodle. 1994. Site-directed mutagenesis of the alpha-toxin gene of Staphylococcus aureus: role of histidines in toxin activity in vitro and in a murine model. Infect Immun 62:1843-7). ClfA contiene un dominio resistente a la proteasa que se usa para la inmunización. La inmunización pasiva de ratones con anticuerpos anti-ClfA y anti-CP5 efectivamente esterilizó las glándulas mamarias en el modelo de infección de la glándula mamaria (Tuchscherr, L. P., F. R. Buzzola, L. P. Alvarez, J. C. Lee y D. O.Sordelli. 2008. Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitis and the emergence of unencapsulated and small-colony variants of Staphylococcus aureus in mice. Infect Immun 76: 5738-44).
Una realización adicional de la invención incluye glucosilación de proteínas nativas de S. aureus, por ejemplo, Hla y ClfA. En realizaciones de ejemplo adicionales de la invención, el portador de proteína usado puede seleccionarse para ser la proteína Hla, por ejemplo Hla H35L (por ejemplo, SEQ ID NO: 6, Se Q ID NO: 7, Se Q ID NO: 8 o SEQ ID NO: 16). En otra realización de ejemplo adicional de la invención, el portador de proteína es la proteína ClfA (por ejemplo, la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12).
La divulgación se dirige adicionalmente a organismos procariotas huéspedes recombinantes que comprenden: una secuencia de nucleótidos que codifica una o más glucosiltransferasas de una primera especie procariota, tal como una especie grampositiva; una o más glucosiltransferasas de una especie procariota diferente, tal como una especie gramnegativa; una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa. La divulgación se refiere adicionalmente a un organismo procariota huésped recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos introducida que codifica glucosiltransferasas nativas solo para un organismo procariota grampositivo; una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa. La divulgación se refiere además a un organismo procariota huésped recombinante o modificado que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica una glucosiltransferasa nativa de una primera especie procariota, que es, por ejemplo, diferente del organismo procariota huésped; una secuencia de nucleótidos que codifica una glucosiltransferasa nativa de una segunda especie procariota diferente de la especie de dicho primer organismo procariota y, por ejemplo, diferente de dicho huésped. El organismo procariota diseñado también puede, por ejemplo, comprende una primera especie procariota que es una especie grampositiva. El organismo procariota diseñado también puede, por ejemplo, comprender una segunda especie procariota que es una especie gramnegativa. La divulgación incluye además un organismo procariota huésped gramnegativo recombinante o modificado mediante ingeniería que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica una glucosiltransferasa nativa de una especie procariota gramnegativa que es, por ejemplo, diferente de dicho organismo procariota huésped; una secuencia de nucleótidos que codifica una glucosiltransferasa nativa de S. aureus; una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa. La invención incluye además un huésped de E. coli recombinante o modificado mediante ingeniería que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica una glucosiltransferasa nativa de P. aeruginosa; una secuencia de nucleótidos que codifica una o más glucosiltransferasas nativas de la cepa de S. aureus CP5 y/o de la cepa de S. aureus CP8; una secuencia de nucleótidos que codifica EPA de P. aeruginosa, hemolisina alfa de S. aureus, o portador de proteína del factor A de aglutinación de S. aureus; y una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa, por ejemplo, y OTasa nativa de C. jejuni.
Además de usar la ruta de biosíntesis del otro organismo gramnegativo en el organismo de E. coli huésped modificado, en una realización adicional, también están incluidos dentro del organismo de E. coli huésped los ácidos nucleicos que codifican (i) glucosiltransferasas para la construcción de la estructura de las unidades repetitivas del polisacárido del otro organismo gramnegativo (que son idénticas a las unidades repetitivas del polisacárido de interés del organismo S. aureus grampositivo diana), y (ii) glucosiltransferasas para la construcción de las unidades del polisacárido de interés del organismo S. aureus grampositivo diana que no se encuentran en el polisacárido relevante del otro organismo gramnegativo, y (iii) enzimas para voltear y polimerizar la RU construida de interés del el organismo S. aureus grampositivo diana para formar un polisacárido como una cápsula de S. aureus. En particular, en esta realización, los ácidos nucleicos que codifican (i) se originaron con la otra bacteria gramnegativa, mientras que los ácidos nucleicos que codifican (ii) y (iii) se originaron con el organismo grampositivo de S. aureus.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a: un organismo procariota huésped modificado por ingeniería que comprende: i) una secuencia de nucleótidos que codifica glucosiltransferasas nativas de una especie procariota grampositiva; ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa, en el que se eliminan las secuencias que codifican los genes transportadores de dichas especies procariotas grampositivas. Tal realización implica una construcción de ácido nucleico introducida que codifica solo glucosiltransferasas grampositivas.
Con respecto a los otros ácidos nucleicos que se insertarían en el huésped en una u más realizaciones adicionales, ácidos nucleicos que codifican una proteína, tales como AcrA, Hla, ClfA o EPA (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14), y la oligosacariltransferasa de C. je juni (SEQ ID NO: 27), que son parte de la maquinaria de glucosilación de ese organismo, se inyectan en el huésped además de los ácidos nucleicos que codifican las glucosiltransferasas de cada uno de P. aeruginosa y S. aureus. Como resultado, el organismo E. coli modificado puede glucosilar la proteína AcrA con el polisacárido producido en ese organismo por acción de las glucosiltransferasas de S. aureus y la otra bacteria gramnegativa.
Una realización de la divulgación implica un organismo procariota huésped diseñado por ingeniería que comprende: i) una secuencia de nucleótidos que codifica una glucosiltransferasa nativa de una primera especie procariota diferente del organismo procariota huésped; ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una glucosiltransferasa nativa de una segunda especie procariota, por ejemplo, una especie procariótica grampositiva, diferente del organismo procariota huésped; iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y iv) una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa. En realizaciones de la invención, la primera especie procariota que es una especie gramnegativa, por ejemplo, P. aeruginosa.
En el contexto de la presente divulgación, las células huésped se refieren a cualquier célula huésped, por ejemplo, una célula huésped eucariota o procariota. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula huésped procariota, por ejemplo, Escherichia ssp., Campylobacter ssp., Salmonella ssp., Shigella ssp., Helicobacter ssp., Pseudomonas ssp. o Bacillus ssp. En aún otras realizaciones, la célula huésped es Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, etc.
La divulgación se refiere además a procedimientos para producir una vacuna bioconjugada que comprende introducir en un organismo procariota huésped ácidos nucleicos que codifican una o más glucosiltransferasas de S. aureus; una o más glucosiltransferasas de una segunda especie procariota, una proteína; y una OTasa. Además, la presente divulgación se refiere a la producción de vacunas bioconjugadas produciendo en polisacáridos capsulares modificados con bacterias gramnegativas sobre undecaprenol (Und), y uniendo estos antígenos de polisacáridos a un vehículo de proteína de elección.
La divulgación se refiere además a procedimientos para producir proteínas glucosiladas en un organismo procariota huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica glucosiltransferasas nativas de un primer organismo procariota y que también codifica glucosiltransferasas nativas de un segundo organismo procariota que es diferente del primer organismo procariota. La presente divulgación se refiere adicionalmente a la producción de proteínas N-glucosiladas con polisacáridos capsulares de bacterias grampositivas, que se sintetizan mediante una combinación de diferentes glucosiltransferasas de diferentes organismos. La divulgación se refiere además a la producción de proteínas glucosiladas en un organismo procariota huésped que comprende una secuencia de nucleótidos introducida que codifica glucosiltransferasas nativas solo para un organismo procariota Grampositivo.
Como se sabe en la materia, la biosíntesis de diferentes polisacáridos se conserva en células bacterianas. Los polisacáridos se ensamblan en lípidos transportadores a partir de precursores comunes (nucleótidos de azúcar activado) en la membrana citoplásmica mediante diferentes glucosiltransferasas con especificidad definida. (Whitfield, C., e I. S. Roberts. 1999. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol 31: 1307-19). Se conserva la ruta biosintética para la producción de polisacáridos de antígeno O en gramnegativos y para el polisacárido capsular de tipo I en grampositivos. El proceso usa el mismo transportador de lípidos, es decir, UndP, para el ensamblaje de polisacáridos. Comienza con la adición de un monosacárido-1-fosfato al lípido transportador UndP en el lado citoplásmico de la membrana. El antígeno se construye mediante la adición secuencial de monosacáridos a partir de nucleótidos de azúcar activados por diferentes glucosiltransferasas. El oligosacárido ligado a lípidos o RU luego se voltea a través de la membrana mediante la flipasa. Las RU son polimerizadas por la enzima Wzy en el espacio periplásmico, formando el llamado antígeno O en bacterias gramnegativas o polisacáridos capsulares en bacterias grampositivas. Las bacterias gramnegativas usan la enzima Wzz para regular la longitud del polímero, que luego se transfiere a un núcleo de lípido A que forma LPS. El LPS se transloca adicionalmente a la membrana externa exponiendo el antígeno O al exterior (como se representa, por ejemplo, en la figura 1). Las bacterias grampositivas, por el contrario, forman la cápsula de este precursor unido a los lípidos mediante un transporte posterior utilizando una maquinaria enzimática diferente y especializada. Las vías biosintéticas de estos polisacáridos permiten la producción de bioconjugados in vivo capturando los polisacáridos en el periplasma en un portador de proteína.
El proceso de construcción de polisacáridos difiere para los polisacáridos capsulares en que el polisacárido capsular se libera del lípido transportador después de la polimerización y se exporta a la superficie. En bacterias grampositivas como S. aureus que no contienen un compartimento periplásmico, la polimerización del antígeno tiene lugar en el lado exterior de la membrana. Además, la regulación de longitud en S. aureus está incluida en la maquinaria de tres enzimas responsables del ensamblaje de la cápsula. En este ensamblaje, el polisacárido se libera del lípido transportador y se exporta a la superficie mediante un proceso enzimático.
Los elementos genéticos encontrados en el grupo de genes requerido para la expresión de la cápsula funcional en S. aureus se asemejan a la maquinaria genética que se encuentra en los grupos de síntesis de antígeno O dependientes de wzy. (Dean, C. R., C. V. Franklund, J. D. Retief, M. J. Coyne, Jr., K. Hatano, D. J. Evans, G. B. Pier y J. B. Goldberg.
1999. Characterization of the serogroup O11 O-antigen locus of Pseudomonas aeruginosa PA103. J Bacteriol 181:4275-4284).
A pesar de estas diferencias entre la construcción de polisacáridos en bacterias grampositivas y gramnegativas, se descubrió sorprendentemente y se verificó que aspectos de la ruta de LPS en un organismo gramnegativo podrían usarse para producir polisacáridos que contienen algunas de las mismas unidades repetitivas que los polisacáridos capsulares nativos de bacterias grampositivas, tales como, por ejemplo, S. aureus. Como tales, los polisacáridos se producen por los mecanismos de la vía LPS en el huésped gramnegativo, la estructura de tales polisacáridos es la misma que en los precursores de polisacáridos LPS. Tales polisacáridos producidos en sistemas gramnegativos de la presente invención se pueden caracterizar, por lo tanto, como "polisacáridos capsulares modificados" o "cápsulas LPS" para los fines de esta solicitud. Adicionalmente, este nuevo sistema de expresión sintetizado y la ruta biosintética, que combina las rutas biosintéticas capsulares y LPS, pueden caracterizarse como una "ruta biosintética de LPS modificada" para los fines de esta solicitud.
Un polisacárido modificado producido por una ruta biosintética de LPS modificado comprende:
Figure imgf000021_0001
En una realización adicional de la presente invención, un polisacárido modificado producido por una ruta biosintética de LPS modificado comprende:
Figure imgf000021_0002
Usando la tecnología de la invención, se pueden producir bioconjugados bacterianos que son inmunogénicos. Se pueden hacer modificaciones genéticas permitiendo conjugación in vivo de polisacáridos bacterianos en las proteínas deseadas y en las posiciones deseadas.
Otro aspecto de la divulgación implica la producción de cápsulas de LPS o LPS modificados conjugados con un portador proteico usando la ruta biosintética de LPS modificada como se discutió anteriormente.
Una realización adicional de la divulgación incluye una construcción de secuencia de nucleótidos que codifica el grupo de biosíntesis de polisacáridos completo Cap5 y Cap8, en la que los genes transportadores eliminados son capA, capB y capC de S. aureus (véase la figura 6).
La presente divulgación incluye la integración del grupo quimérico CP5/O11 (SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 17) o el grupo quimérico CP8/O11 (SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 18 o Se Q ID NO. 19) en el genoma de una célula huésped. Una realización adicional de la invención implica la integración en el genoma de una célula huésped: (a) el grupo quimérico CP5/O11 (SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 17) o el grupo quimérico CP8/O11. (SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 18 o SEQ ID NO. 19); (b) ácidos nucleicos que codifican la OTasa; y (c) ácidos nucleicos que codifican una proteína con o sin una secuencia consenso introducida.
Otra realización de la presente divulgación se refiere a plásmidos, tales como, por ejemplo, plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 2; SEQ. ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ. ID NO: 17; SEQ. ID NO: 18 y SEQ. ID NO: 19. La invención también incluye plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 13; SEQ. ID NO: 14 y SEQ. ID NO: 15. La invención también se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ ID NO: 16; SEQ. ID NO: 6; SEQ. ID NO: 7 y SEQ. ID NO: 8. La invención también se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ ID NO: 10; SEQ. ID NO: 11 y SEQ. ID NO: 12. Además, la invención se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 20; SEQ. ID NO: 21 y SEQ. ID NO: 27.
Las realizaciones de la presente divulgación se refieren además a células bacterianas transformadas, tales como, por ejemplo, incluidas células bacterianas transformadas con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO. 2; SEQ. ID NO. 3; SEQ. ID NO: 4; SEQ. ID NO: 17; SEQ. ID NO: 18; SEQ. ID NO: 19; SEQ. ID NO: 20; SEQ. ID NO: 21 y SEQ. ID NO: 27. Se incluye adicionalmente en la invención una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20. Se incluye adicionalmente una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21. La presente invención se refiere adicionalmente a una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO: 16, SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. La divulgación se refiere además a células bacterianas transformadas, tales como, por ejemplo, incluidas células bacterianas transformadas con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO. 3; SEQ. ID NO: 4; SEQ. ID NO: 17; SEQ. ID NO: 18; y SEQ. ID NO: 19, y en el que dicha célula bacteriana expresa una glucosiltransferasa nativa de P. aeruginosa y una glucosiltransferasa nativa de S. aureus CP5 y/o CP8. Además, se incluye en la divulgación una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO: 17; SEQ ID NO: 18 y SEQ. ID NO: 19 en el que dicha célula bacteriana expresa una glucosiltransferasa nativa de P. aeruginosa, una glucosiltransferasa nativa de S. aureus CP5 y/o CP8 y PglB. Todavía adicionalmente se incluye en la presente divulgación (a) una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende la SEQ. ID NO. 19, en el que dicha célula bacteriana expresa una glucosiltransferasa nativa de P. aeruginosa, una glucosiltransferasa nativa de S. aureus CP8, Wzz de E. coli serovar O7 y PglB; (b) una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO. 19 y SEQ. ID NO. 20, en el que dicha célula bacteriana expresa una glucosiltransferasa nativa de P. aeruginosa, una glucosiltransferasa nativa de S. aureus CP8, Wzz (regulador de longitud), EPA y PglB; y (c) una célula bacteriana que comprende una o más de SEQ. ID NO. 16; SEQ. ID NO: 6; SEQ. ID NO: 7; SEQ. ID NO: 8; SEQ. ID NO. 13; SEQ. ID NO: 14; SEQ. ID NO: 15; SEQ. ID NO: 10; SEQ. ID NO: 11 y SEQ. ID NO: 12.
Realizaciones de la presente divulgación se refieren además a un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra una infección causada por bacterias grampositivas y otras bacterias en un mamífero, tales como, por ejemplo, en seres humanos. En una realización, el procedimiento comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de una composición farmacéutica, que comprende: una proteína que comprende al menos una secuencia consenso insertada D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; y uno o más oligosacáridos o polisacáridos, siendo el uno o más oligosacáridos o polisacáridos iguales o diferentes que otro de uno o más oligosacáridos o polisacáridos, de una bacteria Grampositiva unida a dicha secuencia consenso. Una realización adicional de la presente divulgación incluye un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra una infección causada por S. aureus en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende: una secuencia consenso insertada D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; al menos un oligo o polisacárido de S. aureus, tal como polisacárido CP5; y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Otra realización de la divulgación se dirige a inducir una respuesta inmune contra una infección causada por S. aureus en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende: una proteína que comprende una secuencia consenso insertada D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; al menos un polisacárido de S. aureus CP8; y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Todavía otra realización se refiere a inducir una respuesta inmune contra una infección causada por S. aureus en un mamífero, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una proteína con dos o más secuencias consenso y oligo o polisacáridos de diferentes cepas bacterianas grampositivas. Todavía otra realización se refiere a inducir una respuesta inmune contra una infección causada por S. aureus en un mamífero, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una proteína con dos o más secuencias consenso y polisacáridos que comprenden S. aureus CP5 y S. aureus CP8.
En casos en esta memoria descriptiva donde se observan secuencias de nucleótidos o aminoácidos específicas, se entenderá que la presente invención abarca secuencias homólogas que todavía incorporan la misma funcionalidad que las secuencias indicadas. En una realización de la invención, tales secuencias son al menos 85 % homólogas. En otra realización, tales secuencias son al menos 90 % homólogas. En aún otras realizaciones, tales secuencias son al menos 95 % homólogas. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos es conocida por los expertos en la técnica.
Las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento, como los descritos en las listas de secuencias que acompañan a esta memoria descriptiva, son solo ejemplos, y será evidente para un experto en la técnica que estas secuencias se pueden combinar de diferentes maneras. Las realizaciones adicionales de la invención incluyen variantes de ácidos nucleicos. Una variante de un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico optimizado por codones) puede ser sustancialmente idéntica, es decir, al menos un 70 % idéntica, por ejemplo, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99.5 % idéntica, a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y/o la SEQ ID NO: 27. Variantes de ácido nucleico de una secuencia que contiene SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y/o la SEQ ID NO: 27. Incluyen ácidos nucleicos con una sustitución, variación, modificación, reemplazo, deleción y/o adición de uno o más nucleótidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más nucleótidos) de una secuencia que contiene la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID. NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y/o la SEQ ID NO: 27, o partes de las mismas.
Tales variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas procarióticas y que i) se expresan en una célula huésped, tal como E. coli y ii) son sustancialmente idénticas a la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, Se Q ID NO: 4, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y/o la SEQ ID NO: 19 y/o partes de las mismas.
Los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria incluyen ADN recombinante y ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente). Los ácidos nucleicos pueden ser bicatenarios o monocatenarios. En el caso de ácidos nucleicos monocatenarios, el ácido nucleico puede ser una cadena sentido o cadena antisentido. Los ácidos nucleicos pueden sintetizarse usando análogos o derivados de oligonucleótidos, como sería evidente para un experto en la técnica a la luz de esta memoria descriptiva.
Los plásmidos que incluyen un ácido nucleico descrito en este documento se pueden transformar en células huésped para la expresión. Las técnicas para la transformación son conocidas por los expertos en la técnica a la luz de esta memoria descriptiva.
Una realización adicional de la divulgación implica la producción de vacunas bioconjugadas grampositivas que contienen cápsulas de LPS o LPS modificados conjugados con un vehículo de proteína.
Una realización adicional de la divulgación implica una nueva vacuna bioconjugada. Una realización adicional de la divulgación implica un nuevo enfoque para producir tales vacunas bioconjugadas que usa células bacterianas recombinantes que producen directamente bioconjugados inmunogénicos o antigénicos. En una realización, las vacunas bioconjugadas pueden usarse para tratar o prevenir enfermedades bacterianas, como diarrea, infecciones nosocomiales y meningitis. En realizaciones adicionales, las vacunas bioconjugadas pueden tener potencial terapéutico y/o profiláctico para cáncer u otras enfermedades.
En otra realización de la presente divulgación, se pueden usar complejos de polisacáridos (es decir, restos de azúcar) y proteínas (es decir, portadores proteicos) sintetizados como vacunas conjugadas para proteger contra infecciones tales como infecciones por S. aureus. En una realización, una vacuna bioconjugada, tal como una vacuna Grampositiva, comprende un transportador proteico que comprende una secuencia consenso de ácido nucleico insertada; al menos un oligo o polisacárido de una bacteria Grampositiva unida a la secuencia consenso y, opcionalmente, un adyuvante. La presente divulgación se dirige adicionalmente en otra realización a una vacuna bioconjugativa grampositiva, tal como una vacuna de S. aureus, que comprende un transportador proteico que comprende una secuencia consenso de ácido nucleico insertada; al menos un oligo o polisacárido de una bacteria grampositiva, como el polisacárido capsular o la cápsula LPS, unido la secuencia de consenso, y, opcionalmente, un adyuvante. En otra realización de la invención, la vacuna bioconjugada de S. aureus comprende dos o más de estas secuencias de consenso insertadas. En una realización adicional, la vacuna bioconjugada de S. aureus comprende dos o más de oligo o polisacáridos de S. aureus. Una realización adicional comprende dos o más de dichas secuencias de consenso insertadas y oligosacáridos o polisacáridos de diferentes cepas de S. aureus, por ejemplo, de la cepa de polisacárido capsular 5 (CP5) y la cepa de polisacárido capsular 8 (CP8) de S. aureus.
La presente divulgación implica una vacuna de S. aureus producida por un sistema de glucosilación que usa una ruta modificada de LPS, que comprende la producción de un polisacárido capsular modificado o una cápsula LPS. Otra realización adicional de la presente invención implica una vacuna de S. aureus producida por un sistema de glucosilación que usa una ruta modificada de LPS, que comprende la producción de un polisacárido capsular modificado a partir de ácidos nucleicos introducidos que no codifican glucosiltransferasas de una especie procariota gramnegativa.
La presente divulgación implica una vacuna de S. aureus producida por un sistema de glucosilación que comprende ácidos nucleicos que codifican: i) una o más glucosiltransferasas responsables de producir el L-FucNAc -> D-FucNAc de la RU del antígeno O11 nativo de P. aeruginosa; ii) una o más glucosiltransferasas responsables de producir la RU que contiene D-ManNAcA nativa para las cepas CP5 o CP8 de S. aureus; iii) una o más enzimas responsables de voltear y polimerizar las RU construidas CP5 o CP8, iv) una proteína recombinante que contiene secuencias de consenso introducidas; y v) oligosacariltransferasa de C.jejuni. En esta realización, el organismo huésped puede ser una bacteria Gramnegativa, por ejemplo, E. coli.
La divulgación implica una vacuna de S. aureus producida por un sistema de glucosilación que comprende ácidos nucleicos que codifican: i) glucosiltransferasas responsables de producir L-FucNAc -> D-FucNAc de la RU del antígeno O11 nativo de P. aeruginosa; ii) una glucosiltransferasa responsable de producir la RU que contiene D-ManNAcA nativa para las cepas CP5 o CP8 de S. aureus; iii) proteína AcrA de C.jejuni; y iv) oligosacariltransferasa de C.jejuni. En esta realización, el organismo huésped puede ser la bacteria gramnegativa, E. coli.
Las vacunas tienen utilidades terapéuticas y profilácticas. Se apreciará que la vacuna de la invención puede ser útil en los campos de la medicina humana y la medicina veterinaria. Por lo tanto, el sujeto a inmunizar puede ser un ser humano u otro animal, por ejemplo, animales de granja incluyendo vacas, ovejas, cerdos, caballos, cabras y aves de corral (por ejemplo, pollos, pavos, patos y gansos) y animales de compañía como perros y gatos.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para generar vacunas para inmunizar a un mamífero contra una bacteria tal como una bacteria Grampositiva. El procedimiento incluye: inmunizar a un sujeto con un bioconjugado, tal como un bioconjugado que comprende un polisacárido grampositivo, por ejemplo, un polisacárido de S. aureus y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Esta divulgación también presenta composiciones de vacuna para la protección contra la infección por una bacteria grampositiva tal como S. aureus o para el tratamiento de una infección grampositiva tal como infección por S. aureus. En una realización, las composiciones de vacuna comprenden uno o más componentes inmunogénicos tales como un polisacárido, o un fragmento o porción del mismo, de S. aureus. En una realización adicional, las composiciones de vacuna comprenden uno o más componentes inmunogénicos tales como una proteína o un fragmento o porción de la misma, de una bacteria gramnegativa o grampositiva.
Un aspecto de la divulgación proporciona una composición de vacuna para la protección contra la infección por S. aureus que contiene al menos un componente inmunogénico o fragmento de un polisacárido de S. aureus y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichos componentes o fragmentos inmunogénicos pueden incluir, por ejemplo, un polisacárido de S. aureus de al menos aproximadamente dos monómeros de longitud o al menos aproximadamente tres monómeros de longitud. En un aspecto adicional de la invención, una RU de S. aureus comprende dichos monómeros. Tales unidades repetitivas pueden incluir, por ejemplo, una RU de S. aureus de al menos 1 (uno) de longitud.
Se pueden obtener componentes inmunogénicos o fragmentos de la divulgación, por ejemplo, mediante el cribado de polisacáridos o polipéptidos producidos de forma recombinante o mediante síntesis química, o, por ejemplo, seleccionando el bioconjugado que comprende un polisacárido y una proteína. La selección de componentes inmunogénicos o fragmentos de la divulgación se puede realizar usando uno o más de varios ensayos diferentes. Por ejemplo, los ensayos de selección incluyen ELISA y otros ensayos conocidos por los expertos en la técnica.
Los componentes o fragmentos inmunogénicos se identifican por la capacidad del polisacárido y/o proteína para estimular anticuerpos IgG contra bacterias grampositivas, como los polisacáridos de S. aureus CP5 o CP8, según lo determinado por, por ejemplo, la respuesta inmune obtenida en ratones (figura 15A) y en conejos (figura 15B) midiendo anticuerpos específicos anti-CP5 (cuantificados mediante ELISA) contra el candidato de vacuna de glucoconjugado CP5-EPA y otros medios conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica.
Los componentes o fragmentos inmunogénicos se identifican por la capacidad del polisacárido y/o proteína para estimular la actividad opsónica, como la muerte opsonofagocítica, según lo determinado por, por ejemplo, la muerte de S. aureus (actividad "in vitro") con anticuerpos anti-CP5-EPA de conejo (obtenidos en el ejemplo 7 a continuación, véase la figura 15B) y otros medios conocidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica.
Los componentes o fragmentos inmunogénicos se identifican por la capacidad del polisacárido y/o proteína para estimular la inmunidad humoral y/o mediada por células contra bacterias grampositivas, tal como S. aureus, según lo determinado por, por ejemplo, protección contra infección bacteriana ("desafío") usando inmunización activa en ratones (Figura 18) con CP5-EPA y otros medios conocidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica.
Una composición de vacuna de la invención puede basarse en una glucoproteína que comprende un componente inmunogénico o fragmento de un polisacárido de S. aureus de la invención y opcionalmente además que comprende un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En realizaciones adicionales de la presente invención, una composición de vacuna puede basarse en una glucoproteína que comprende un componente inmunogénico o fragmento de una proteína S. aureus de la invención y que comprende opcionalmente además un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional de la invención, una composición de vacuna puede basarse en una glucoproteína que comprende un componente inmunogénico o fragmento de una proteína de P. aeruginosa de la invención y que comprende opcionalmente además un vehículo y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Es bien conocido por los expertos en la técnica cómo modificar una vacuna para administración a un tipo de mamífero, por ejemplo, ratones, para la administración a otro tipo de mamífero, por ejemplo, seres humanos. Por ejemplo, un experto sabrá fácilmente que la eliminación de la etiqueta de histidina del portador proteico de una glucoproteína utilizada en una composición de vacuna en ratones haría que la glucoproteína fuera adecuada para la administración en una composición de vacuna en seres humanos. Por ejemplo, eliminación del marcador de HISTIDINA (marcador HIS) en portadores de proteínas como, por ejemplo, EPA (SEQ ID NO: 13), ClfA (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12) y Hla (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16) se reconocería por su uso en una glucoproteína para la administración a un ser humano.
Se debe entender que la mejora de cualquiera de los síntomas de una infección grampositiva, por ejemplo, S. aureus, u otra bacteriana o enfermedad es un objetivo clínico deseable, incluida una disminución de la dosificación de la medicación utilizada para la infección o enfermedad causada por un grampositivo, por ejemplo, una infección o enfermedad causada por S. aureus, u otra infección o enfermedad causada por bacterias, o un aumento en la producción de anticuerpos en el suero o la mucosa de los pacientes. Será evidente para los expertos en la técnica que algunas de las composiciones de vacuna de la divulgación son útiles para prevenir una infección grampositiva, por ejemplo, una infección por S. aureus u otra infección bacteriana, algunas son útiles para tratar una infección grampositiva, por ejemplo, una infección por S. aureus u otra infección bacteriana, y algunas son útiles tanto para prevenir como para tratar tales infecciones.
Vacunas y otros agentes farmacéuticos pueden prepararse opcionalmente usando vehículos excipientes, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, como es bien conocido en la técnica y aparente a la luz de esta memoria descriptiva. Un excipiente, diluyente o adyuvante puede ser un material sólido, semisólido o líquido que puede servir como vehículo o medio para el ingrediente activo. A la luz de esta memoria descriptiva, un experto en la técnica en el campo de la preparación de composiciones puede seleccionar fácilmente la forma y el modo de administración apropiados dependiendo de las características particulares del producto seleccionado, la enfermedad o afección que se va a tratar, la etapa de la enfermedad o afección, y otras circunstancias relevantes (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 1990). La proporción y naturaleza del diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptables, se determinan por la solubilidad y las propiedades químicas del compuesto farmacéuticamente activo seleccionado, la ruta de administración elegida y la práctica farmacéutica estándar.
Por consiguiente, las composiciones de vacuna comprenden componentes o fragmentos inmunogénicos, por ejemplo, polisacárido de S. aureus o fragmento del mismo y/o proteína de S. aureus o P. aeruginosa o fragmento de la misma e incluyen opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que no es tóxico. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, y similares, así como combinaciones de los mismos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que mejoran la vida útil o la efectividad del anticuerpo. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, diluyentes líquidos, semisólidos o sólidos que sirven como vehículos, excipientes o medios farmacéuticos. Se puede usar cualquier diluyente conocido en la técnica. Los diluyentes de ejemplo incluyen, aunque no de forma limitativa, monolaurato de polioxietilensorbitano, estearato de magnesio, hidroxibenzoato de metilo y de propilo, talco, alginatos, almidones, lactosa, sacarosa, dextrosa, sorbitol, manitol, goma arábiga, fosfato de calcio, aceite mineral, manteca de cacao y aceite de theobroma.
Además, la composición de vacuna puede incluir opcionalmente un adyuvante o una combinación de adyuvantes, que incluyen, pero no limitado a adyuvantes particulados tales como sales de aluminio (hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de hidroxifosfato de aluminio, etc.); emulsiones como el aceite en agua (MF59, AS03); combinaciones de lípidos y sal como AS04; agua en aceite (Montanide); ISCOMS, liposomas/virosomas; nano y micropartículas, etc.; no particulados, tal como péptidos; saponinas (QS21); MPL A; citocinas; derivados de ADN; toxinas bacterianas; etc. Una realización adicional incluye adyuvantes usados en animales tales como adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, adyuvantes basados en micolato (por ejemplo, trehalosa dimicolato), lipopolisacárido bacteriano (LPS), peptidoglucanos (es decir, mureínas, mucopéptidos, o glucoproteínas tales como N-Opaca, dipéptido de muramilo [MDP], o análogos de MDP), proteoglucanos, preparaciones de estreptococos (por ejemplo, OK432), DEAE-Dextrano, aceites neutros (como migliol), aceites vegetales (tales como aceite de cacahuete), Pluronic, el sistema adyuvante Ribi o interleucinas, particularmente aquellos que estimulan la inmunidad mediada por células. El adyuvante utilizado dependerá, en parte, de la composición y el tipo de la vacuna glucoconjugada. La cantidad de adyuvante a administrar dependerá del tipo y tamaño del mamífero. Las dosificaciones óptimas se pueden determinar fácilmente mediante procedimientos de rutina.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica, que comprende al menos una glucoproteína de acuerdo con la invención. La preparación de medicamentos que comprenden glucoproteínas es bien conocida en la técnica. El esquema de preparación para la composición farmacéutica final y el modo y los detalles de su administración dependerán de la proteína, la célula huésped, el ácido nucleico y/o el vector empleado.
Será evidente para los expertos en la técnica que dependerá de la cantidad terapéuticamente efectiva de polisacárido o glucoproteína dependerá, entre otros, del calendario de administración, la dosis unitaria de anticuerpo administrada, si el polisacárido o glucoproteína se administra en combinación con otros agentes terapéuticos, el estado inmune y la salud del paciente, y la actividad terapéutica del polisacárido o glucoproteína particular.
Las composiciones de vacuna y/o preparaciones farmacéuticas pueden adaptarse para administración oral, uso parenteral o tópico y se pueden administrar al paciente en forma de comprimidos, cápsulas, supositorios, solución, suspensiones o cualquier otro medio adecuado o forma de dosificación. En otros aspectos de la invención, las composiciones de vacuna y/o las preparaciones farmacéuticas se pueden introducir en el sujeto a inmunizar mediante cualquier procedimiento conocido que incluya, por ejemplo, por inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal o subcutánea; o mediante administración oral, sublingual, nasal, anal o vaginal. Los compuestos farmacéuticamente activos de la presente invención, aunque eficaces, pueden formularse y administrarse en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, tales como sales de adición de ácidos o sales de adición de bases, con fines de estabilidad, conveniencia de la cristalización, mayor solubilidad, y similares. Las composiciones de vacuna se pueden administrar por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección, ya sea por vía subcutánea o intramuscular. Los procedimientos para la inmunización intramuscular se describen en Wolff y col., (1990) Science 247: 1465-1468 y por Sedegah y col., (1994) Immunology 91: 9866-9870. Otros modos de administración incluyen oral y transdérmica.
Las vacunas se pueden administrar como un agente profiláctico primario en, por ejemplo, adultos o en niños, como una prevención secundaria, después de la erradicación exitosa de bacterias grampositivas tales como S. aureus en un huésped infectado, o como un agente terapéutico con el objetivo de inducir una respuesta inmune en un huésped para prevenir la infección por una bacteria Grampositiva tal como S. aureus. Las vacunas de la invención se administran en cantidades fácilmente determinadas por los expertos en la técnica. El tratamiento puede consistir en una única dosis o en una pluralidad de dosis durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, se espera que una dosis típica para humanos de una vacuna de la presente invención sea de aproximadamente 1 a 25 |jg del antígeno oligosacárido, que estará ligado a (y no incluye la masa de) el portador de proteína, en realizaciones adicionales de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 10 jg del antígeno polisacárido, y en otras realizaciones adicionales aproximadamente 2 jg del antígeno polisacárido. La relación azúcar/proteína en el glucoconjugado o la vacuna es de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:10. Opcionalmente, una vacuna, tal como una vacuna bioconjugada de la presente invención, puede incluir un adyuvante. Los expertos en la materia reconocerán que la dosis óptima puede ser más o menos dependiendo del peso corporal del paciente, la enfermedad, la vía de administración y otros factores. Los expertos en la materia también reconocerán que pueden obtenerse niveles de dosificación apropiados a base de los resultados con vacunas conocidas. El número de dosis dependerá de la enfermedad, la formulación y los datos de eficacia de los ensayos clínicos.
Las composiciones de vacuna pueden envasarse en formas convenientes para la administración. Se prefieren formas de administración compatibles con la entrada del componente o fragmento inmunogénico en el mamífero receptor.
Una realización de la divulgación generalmente se dirige a producir recombinantemente una vacuna para un organismo grampositivo en un organismo gramnegativo usando una ruta biosintética de LPS modificada. Esto se logra insertando en un huésped que comprende ácidos nucleicos que codifican una oligosacariltransferasa y una proteína y ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas que se originan a partir de al menos dos organismos diferentes. Esta realización se refiere a la ingeniería genética de un organismo basado en un organismo natural en el que se insertan ácidos nucleicos que codifican (i) una proteína; (ii) una oligosacariltransferasa, y (iii) glucosiltransferasas de al menos dos organismos diferentes.
En un ejemplo de tal realización, se produce un producto de proteína glucosilada para usar como una vacuna para Staphylococcus aureus. Los productos de vacuna de la invención se producen en un huésped E. coli genéticamente modificado. S. aureus es una bacteria Grampositiva, y tiene una cápsula de polisacárido. Un producto de vacuna para este organismo podría basarse en una proteína glucosilada cuya sección de azúcar tenía una estructura similar a este polisacárido capsular.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un nuevo enfoque de bioingeniería para producir vacunas conjugadas inmunogénicas que proporcionan ventajas sobre los procedimientos de conjugación química clásicos. En una realización, el enfoque implica la producción in vivo de glucoproteínas en células bacterianas, por ejemplo, células gramnegativas tales como E. coli.
Como saben los expertos en la materia, la producción y purificación de glucoconjugado puede variar dependiendo de la vacuna candidata y la combinación de plásmidos usados. Por ejemplo, se conoce qué procedimiento de purificación elegir en función del portador de proteína, el componente de azúcar del glucoconjugado y el uso previsto de la vacuna candidata purificada, por ejemplo, en animales o seres humanos. Para uso en seres humanos, por ejemplo, se sabe que la etiqueta HIS, que de otro modo facilitaría la purificación, se eliminaría.
Debe entenderse que el término "o", como se usa en el presente documento, denota alternativas que pueden, cuando es adecuado, combinarse; es decir, el término "o" incluye cada alternativa enumerada por separado, así como su combinación. Como se usa en el presente documento, salvo que el contexto indique claramente otra cosa, las referencias al singular, tales como las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" "incluyen el plural, y las referencias al plural incluyen el singular.
Los siguientes ejemplos ilustran las composiciones y procedimientos de la presente invención, así como su utilidad.
Ejemplos
Ejemplo 1: Síntesis de polisacáridos CP5 y CP8 en células de E. coli
Un objetivo de una realización de la invención es producir los polisacáridos antigénicos CP5 y CP8 en E. coli. Como se ha analizado anteriormente, los inventores explotaron de una manera novedosa, sorprendente a la vista de la técnica anterior, el hecho de que las vías de producción de CP y antígeno O se superponen funcionalmente, un hecho que se representa en la estructura de la r U (véanse las figuras 1-4). Los glucanos capsulares de CP5 y CP8 son polímeros que consisten en RU de trisacáridos similares de ácido 2-acetamido-2-desoxi-D-manurónico (D-ManNAcA) y dos restos de 2-acetamido-2,6-didesoxi galactosa con configuraciones D y L (D- y L-FucNAc). Los restos de ManNAcA están vinculados de manera diferente en los dos serotipos; además, el enlace entre las RU en el glucano polimerizado es diferente. Además, hay una modificación inmunodominante de O-acetilo en diferentes posiciones en los dos antígenos (Jones, C. 2005. Revised structures for the capsular polysaccharides from Staphylococcus aureus types 5 and 8, components of novel glycoconjugate vaccines. Carbohydr Res 340:1097-106). El antígeno O11 de LPS de P. aeruginosa es similar en su estructura a CP5 y CP8, ya que el antígeno O11 de LPS de P. aeruginosa contiene [-3)-a-L-FucNAc-(1,3)-p-D-FucNAc-(1,2)-p-D-Glc-(1-] (Figura 4). (Knirel, Y. A., V. V. Dashunin, A. S. Shashkov, N. K. Kochetkov, B. A. Dmitriev e I. L. Hofman. 1988. Somatic antigens of Shigella: structure of the O-specific polysaccharide chain of the Shigella dysenteriae type 7 lipopolysaccharide. Carbohydr Res 179: 51-60). Los trisacáridos-RU difieren solo en que el D-ManNAcA de S. aureus es reemplazado por una unidad de glucosa, no hay modificación de O-acetilo en O11 LPS de P. aeruginosa y la diferencia en el tipo de enlace entre el 2° y 3er monosacárido en la RU (figura 4).
Para generar un sistema genético capaz de sintetizar los glucanos CP5 y CP8 en UndPP, usando el procedimiento de Dean y col., (Dean, C. R., C. V. Franklund, J. D. Retief, M. J. Coyne, Jr., K. Hatano, D. J. Evans, G. B. Pier y J. B. Goldberg. 1999. Characterization of the serogroup O11 O-antigen locus of Pseudomonas aeruginosa PA103. J Bacteriol 181: 4275-4284), los inventores modificaron el grupo del gen del antígeno O de O11 de P. aeruginosa de la cepa PA103. Los genes que codifican la maquinaria biosintética para la síntesis de la estructura del tallo que consiste en UndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc se complementaron con las enzimas de S. aureus requeridas para completar el glucano de S. aureus (Figuras 1-4), que también fue un uso novedoso de este proceso. Por lo tanto, usando el procedimiento de Dean y col., se expresaron todos los elementos genéticos de PA103 de P. aeruginosa requeridos para la biosíntesis de UndPP-FucNAc-FucNAc. El gen que codifica la glucosiltransferasa que agrega el tercer azúcar se eliminó y se reemplazó por los genes correspondientes de los grupos cap5 u 8 forman Mu50 (CP5) y MW2 (CP8) de S. aureus con ligeras modificaciones.
Los genes que codifican las enzimas que sintetizan los restos específicos para el polisacárido capsular de S. aureus se integraron paso a paso en el fondo O11 de acuerdo con las funciones de los genes predichos por Sau y col. (Sau, S., N. Bhasin, E. R. Wann, J. C. Lee, T. J. Foster, y C. Y. Lee. 1997. The S. aureus allelic genetic loci for serotype 5 and 8 capsule expression contain the type-specific genes flanked by common genes. Microbiology 143: 2395-405.; O'Riordan, K. y J. C. Lee. 2004. Staphylococcus aureus capsular polysaccharides. Clin Microbiol Rev 17(1): 218-34). Tales etapas se explican a continuación.
Se predijo que el producto génico cap5llcap8H sería la glucosiltransferasa que agrega el ManNAcA a UndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc de la RU que forma un enlace específico para cada serotipo (Sau, S., N. Bhasin, E. R. Wann, J. C. Lee, T. J. Foster, y C. Y. Lee. 1997. Los loci genéticos alélicos de Staphylococcus aureus para la expresión de la cápsula de serotipo 5 y 8 contienen los genes específicos de tipo flanqueados por genes comunes. Microbiology 143: 2395-405.). Para probar esto, la actividad de Cap5I y Cap8H se analizó en E. coli en presencia de un plásmido que confiere la producción del antígeno O de P. aeruginosa O11. Las células que expresan el grupo O11 sintetizan el antígeno O O11 primero en UndPP, desde donde se transfiere al núcleo del lípido A por la enzima de E. coli WaaL, la ligasa de antígeno O, formando lipopolisacárido específico de O11 (LPS) (Goldberg, J. B., K. Hatano, G. S. Meluleni y G. B. Pier. 1992. Cloning and surface expression of Pseudomonas aeruginosa O antigen in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 89(22): 10716-20). Para sintetizar este lipopolisacárido, el grupo de antígeno O O11 de P. aeruginosa PA103 se clonó en pLAFR1 (SEQ ID NO: 1). Después, el gen wbjA que codifica la glucosiltransferasa, la enzima que agrega el tercer azúcar a la RU de O11, se eliminó mediante mutagénesis de transposón. El grupo mutado (O11 wbjA::Tn50<dhfr-1>) se modificó adicionalmente por recombinación homóloga para eliminar la actividad polimerasa del gen wzy, formando O11 wbjA:: Tn50<dhfr-1> wzy::cat, que indica la SEQ ID NO: 1 mutada, en la que los genes para la glucosiltransferasa wbjA y la polimerasa wzy del grupo de genes O11 se inactivaron. Este grupo modificado se expresó en células W3110 AwecA, los extractos se trataron con proteinasa K y se analizaron mediante SDS PAGE y tinción con plata, de acuerdo con el procedimiento divulgado en Tasi, y col. (Tsai, C. M., y C. E. Frasch. 1982. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. Anal Biochem 119:115-9). Los resultados se proporcionan en la figura 5A, que muestra la tinción con plata de extractos de qW3110 hwecA que expresan el grupo O11 mutado de pLAFR1 como se describe en este documento. La segunda línea indica los genes expresados a partir del plásmido inducible pEXT22. Los asteriscos indican genes sintetizados y optimizados por codones. Diferentes glucoformas relevantes están indicadas con flechas).
El análisis dio como resultado dos bandas principales en los geles (Figura 5A, calle 1). Las señales corresponden al núcleo del lípido A no modificado (figura 5A, banda inferior) y al LPS que consiste en el núcleo del lípido A y dos restos FucNAc como se esperaba en una RU de O11 truncada. Tras la expresión de una copia silvestre de wbjA de un plásmido inducible por IPTG por separado, la banda superior se desplazó a una movilidad electroforética más lenta, que indica la adición de un resto de glucosa al LPS de O11 truncado (Figura 5A, calle 2). Cuando las glucosiltransferasas de S. aureus predichas Cap5I (calle 4) y Cap8H (Figura 5A, calle 3) se expresaron en trans en lugar de WbjA, se observó un cambio similar de la señal del núcleo de lípido glucosilado A, indicativo de la adición de un monosacárido, posiblemente incluso más grande que la glucosa, siendo muy probablemente ManNAcA. Esta información demuestra que las glucosiltransferasas de S. aureus pueden alargar el glucolípido UndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc que se ha sintetizado mediante la actividad de las enzimas de P. aeruginosa.
De esta manera, también se confirmó que un requisito previo para el ensamblaje de RU de S. aureus en E. coli es la provisión de UDP-ManNAcA, porque la maquinaria biosintética está presente en los grupos de S. aureus CP5/8 pero no en el grupo de antígeno O O11 de P. aeruginosa. Todos los demás azúcares activados por nucleótidos requeridos son proporcionados por funciones constitutivas de E. coli y el grupo O11 de antígeno O de P. aeruginosa. Se sabe que E. coli produce UDP-ManNAcA, el sustrato para la glucosiltransferasa ManNAcA, por expresión de wecB y wecC. Esos genes se expresan constitutivamente en el grupo responsable de la biosíntesis del antígeno común de enterobacterias (e Ca ) (Meier-Dieter, U., R. Starman, K. Barr, H. Mayer y P. D. Rick. 1990. Biosynthesis of enterobacterial common antigen in Escherichia coli. J Biol Chem, 265:13490-13497). Se descubrió que el homólogo funcional para la biosíntesis de UDP-ManMAcA que se encuentra en el grupo de CP de S. aureus complementa las actividades de wecBC como se informó anteriormente (Kiser, K. B., N. Bhasin, L. Deng y J. C. Lee. 1999. Staphylococcus aureus cap5P encodes a UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase with functional redundancy. J. Bacteriol 181 (16): 4818-24). Esto muestra que la producción de los antígenos CP en E. coli se basa en la expresión funcional de los genes wecBC en la cepa huésped. Por lo tanto, para proporcionar UDP-ManNAcA como sustrato para Cap5I y Cap8H en un sistema recombinante, se confirmó que WecB y WecC tienen que ser expresados. En tal sistema, se puede usar cualquier cepa procariota que exprese el antígeno común enterobacteriano como la cepa tipo salvaje de E. coli, por ejemplo, tipos de células basados en W3110 con o sin una eliminación de wecA y con o sin eliminación de wzzE adicional.
Se cree que es necesaria una mayor elongación del polisacárido capsular de S. aureus para una actividad inmunológica máxima del glucano. Los genes cap5J/cap8l codifican los homólogos wzy que polimerizan las unidades repetitivas, y cap5K/cap8K codifica la flipasa que transloca el trisacárido unido a UndPP desde el lado citoplasmático al periplasmático de la membrana. Cap5H/cap8J codifica la O-acetiltransferasa que modifica el L-FucNAc en la posición 3' o la ManNAcA en la posición 4' de la RU (Bhasin, N., A. Albus, y col. (1998). "Identification of a gene essential for O-acetylation of the Staphylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide." Mol Microbiol 27 (1): 9-21. La acetilación es un determinante importante que discrimina la reactividad inmunológica del polisacárido (Fattom, A. I., J. Sarwar, L. Basham, S. Ennifar y R. Naso. 1998. Antigenic determinants of S. aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharide vaccines. Infect Immun 66:4588-92). Para mostrar que las RU podrían alargarse y acetilarse, las enzimas de S. aureus responsables de la polimerización y O-acetilación se expresaron a partir de plásmidos separados en presencia del grupo O11 mutado. Los extractos de células W3110 hwecA que expresan el grupo wbjA::Tn50 <dhfr-1> wzy::cat O11 y diferentes genes del grupo CP5 se trataron con proteinasa K y se analizaron mediante SDS PAGE, electrotransferencia seguida de inmunotransferencia usando un azúcar anti-CP5 (obtenido de J. C. Lee en el Departamento de Medicina, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, EE.UU.). La figura 5B muestra los resultados de la inmunodetección de extractos de E. coli tratados con proteinasa K separados por SDS PAGE y electrotransferencia usando el antisuero anti-CP5. Todos los extractos analizados contenían un grupo de P. aeruginosa O11 con eliminaciones de los genes wbjA y parcialmente (indicado por un asterisco) wzy expresados a partir del plásmido pLAFR como se describe en este documento, y dos plásmidos más (pEXT22, pACT3) que expresan diferentes proteínas Cap5 (tal como se indica) que permiten la polimerización de CP5 y la acetilación O en estas células. Se indican los detalles experimentales tales como las concentraciones del inductor y las temperaturas de incubación del cultivo de expresión.
En la figura 5B, los resultados muestran señales similares a una escalera típicas para un polímero de antígeno O en un rango de peso molecular más alto. Las diferentes bandas representan números diferentes de RU polimerizadas linealmente en LPS o en UndPP, ambas de las cuales son estables para la digestión con proteinasa K. Se observaron diferentes intensidades de la estructura tipo escalera en presencia o ausencia de la O-acetiltransferasa. Aunque se detectaron señales fuertes en presencia de cap5H (Figura 5B, calles 1-4), estaban prácticamente ausentes en calles sin cap5H (figura 5B, calles 5, 6). Esto significa que la O-acetilación aumenta el reconocimiento por el antisuero específico, o que mejora la actividad de polimerización al acelerar el volteo o al hacer que la polimerización sea más eficiente o al inducir más producción de RU. El gen cap5H es funcional cuando se expresa a partir de diferentes plásmidos de la cadena principal (Figura 5B, calles 1,2 y 3, 4), aunque la intensidad de la señal es más fuerte cuando cap5H se expresa solo a partir de un plásmido separado (compárese con la calle 1 de la figura 5B hasta la calle 3 y la figura 5B, de la calle 2 a la calle 4). Es sorprendente y notable que cuanto menos IPTG se usó para la inducción de los genes de S. aureus, más fuertes son las señales (compárense la Figura 5B, de la calle 1 a la calle 2, y la figura 5B, de la calle 3 a la calle 4).
Ejemplo 2: Síntesis de polímero CP5 y CP8 en lípidos en células de E. coli
Como la alta expresión de los genes específicos de cap5 conduce a una menor formación de polímero, un sistema de expresión alternativo para los glucanos recombinantes se construyó para abordar este problema. Con detalle, en un nuevo enfoque inesperado a la luz de la técnica anterior, la glucosiltransferasa de P. aeruginosa (wbjA) y la polimerasa (wzy) de o 11 fueron reemplazadas por los genes que codifican los elementos específicos de CP5/8 del grupo de genes capsulares de S. aureus Mu50/MW2 (cap5/8HIJK y partes de ellos) produciendo un único grupo de genes quiméricos compuesto por genes de O11 de P. aeruginosa y CP5 o CP8 de S. aureus (Figura 6). La construcción contenía los genes específicos de S. aureus. Cada uno se marcó para la detección de la expresión y cada uno contenía un sitio de unión al ribosoma introducido, seguido de un casete de resistencia al cloranfenicol (cat) para la selección de clones recombinados que dan como resultado SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, y SEQ ID NO: 4, de acuerdo con el procedimiento de Datsenko, y col. (Datsenko, K. A., y B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using Pc R products. Proc Natl Acad Sci U S A 97:6640-5).
La figura 6 representa una realización de una estrategia de la presente invención para la construcción de agrupamientos de genes quiméricos O11/CP5 y O11/CP8 de la presente invención. Los grupos de S. aureus CP5 y CP8 CP (arriba) y el grupo de P. aeruginosa PA103 rfb (O11, central) se representan como publicados (Dean, C. R., C. V. Franklund, J. D. Retief, M. J. Coyne, Jr., K. Hatano, D. J. Evans, G. B. Pier y J. B. Goldberg. 1999. Characterization of the serogroup O11 O-antigen locus of Pseudomonas aeruginosa PA103. J Bacteriol 181:4275-84; Sau, S., N. Bhasin, E. R. Wann, J. C. Lee, T. J. Foster y C. Y Lee. 1997. Los loci genéticos alélicos de S. aureus para la expresión de la cápsula del serotipo 5 y 8 contienen los genes específicos del tipo flanqueados por genes comunes. Microbiology 143 (Pt 7): 2395-405). Las funciones homólogas de los genes se describen a continuación. Las diagonales avanzadas completas indican los genes responsables de la síntesis del disacárido D-FucNAc-L-FucNAc en UndPP en los dos organismos; los puntos indican los genes de glucosiltransferasa que agregan el tercer monosacárido a la RU. Los genes de flipasa similares a Wzx están indicados por diagonales discontinuas hacia adelante, los genes de la polimerasa RU de tipo wzy están indicados por diagonales discontinuas hacia atrás. El grupo CP5 no contiene un regulador de longitud Wzz (flecha vacía), sino un conjunto de tres genes que componen la maquinaria de exportación para polisacárido capsular que incluye la función del regulador de longitud en S. aureus (flechas vacías). El gen de O acetil transferasa, indicado por diagonales hacia adelante completas, es único para el grupo CP. Los genes requeridos para la biosíntesis de UDP-ManNAcA en S. aureus están indicados en negro. No son necesarios para la producción del antígeno O de P. aeruginosa. Los genes responsables de las diferencias estructurales de los polisacáridos O11, CP5 y CP8 se agrupan al principio (O11: wbjA y wzy) o en medio (CP5/8: cap5/ 8HIJK) de los respectivos grupos de genes. El grupo de CP8 es casi idéntico al grupo de CP5 considerando la longitud y la secuencia de ADN, a excepción de la parte media (cap5/8HIJK) que confiere especificidad estructural. El grupo quimérico se construyó reemplazando los genes wbjA y wzy de un grupo de O11 portado por plásmido con la parte de especificidad del grupo CP5 (o CP8) (cap5/8HIJK) y un casete de cloranfenicol acetiltransferasa representado por la flecha vacía marcada con cat (cat, para selección) mediante recombinación homóloga y clonaciones clásicas, dando como resultado SEQ ID NO: 2, s Eq ID NO: 3, y SEQ ID NO: 4. Los asteriscos en las flechas discontinuas indican secuencias de genes incompletas usadas para la recombinación homóloga. Los dos grupos quiméricos resultantes se muestran en el panel inferior, que representan el ADN de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
Para demostrar que el CP5 y CP8 quimérico de la presente invención ensambla sorprendentemente la RU correcta en UndPP y asegura que las unidades repetitivas se polimerizan, la digestión con proteinasa K de células de E. coli (W3310 AwecA) que contiene los grupos quiméricos de longitud completa se separaron por SDS-PAGE. Específicamente, las células con un plásmido que contiene o que carece del grupo de genes CP5 quimérico (Figura 7A) o el grupo de genes CP8 quimérico (Figura 7B) en el plásmido pLAFR se trataron con Proteinasa K, separados por SDS-PAGE y los lípidos se visualizaron mediante tinción con plata (panel izquierdo en las figuras 7A y 7B) o inmunodetección con antisuero anti-CP5 o CP8 después de electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa (panel derecho en las figuras 7A y B)). Se analizaron las construcciones que carecen (SEQ ID NO: 2) y que contienen (SEQ ID NO: 3) el gen de la flipasa cap5K. Se encontró que el primero era menos activo en la producción de LPS de CP5.
Después de la electrotransferencia y la inmunodetección con suero específico anti-CP5, los extractos que expresan los grupos de CP5 quiméricos muestran una señal de escalera similar a las estructuras de antígeno O endógeno de E. coli sondeado con su suero autólogo (Figura 7A, las últimas dos calles a la derecha). Esto sugiere fuertemente que las unidades repetitivas de CP5 están polimerizadas, que existe una longitud de polímero preferida, y que el antígeno CP5 se transfiere al núcleo de lípido A en estas células. Los mismos extractos se visualizaron mediante tinción con plata después de SDS PAGE (Figura 7A, en el lado izquierdo de la figura, las dos calles a la derecha etiquetadas como: CP5 quimérico (sin cap5K) y CP5 quimérico que muestra que, de hecho, se forma LPS que consiste en el núcleo del lípido A de E. coli decorado con la estructura similar al antígeno O de CP5. Las diferencias de intensidad se obtuvieron a partir de extractos procedentes de células que expresaron el grupo quimérico CP5 con o sin el gen cap5K de flipasa. La comparación de los dos extractos muestra que la expresión de Cap5K aumenta considerablemente la producción de polímero (compárense las calles de en medio y de la derecha en ambos paneles de la Figura 7A).
Como se muestra en la figura 7B, se observaron los mismos resultados con un grupo quimérico CP8. Las células que contienen un plásmido que contiene o que carece del grupo de genes CP8 quimérico en el plásmido pLAFR se trataron con Proteinasa K, separados por SDS PAGE y los lípidos se detectaron mediante tinción con plata (paneles izquierdos) o inmunodetección con antisuero anti-CP8 después de la electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa (panel derecho). La construcción quimérica de CP8 que contiene el gen de flipasa cap8K corresponde a la SEQ ID NO: 4.
Una extensión adicional novedosa y sorprendente de la invención se desarrolló cambiando las cadenas principales del plásmido usadas para el mantenimiento y la expresión del grupo quimérico en E. coli. El casete de resistencia en pLAFRI que contiene el grupo CP5 quimérico se cambió de Tet a Kan. Además, el grupo quimérico CP5 completo que contiene el cap5K se subclonó en el plásmido pDOC-C, de acuerdo con el procedimiento de Lee y col., (Lee, D. J., L. E. Bingle, K. Heurlier, M. J. Pallen, C. W. Penn, S. J. Busby y J. L. Hobman. 2009. Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol 9: 252) y pACYC177 (acceso de GeneBank n.° X06402).
Tal como se muestra en las figuras 8A y 8B, todos estos plásmidos confieren producción de polímero CP5 según se analiza mediante SDS PAGE, electrotransferencia e inmunodetección con antisuero específico anti-CP5. En la figura 8A, los extractos celulares totales de las células que contienen diferentes agrupaciones quiméricas se trataron con proteinasa K y se analizaron mediante SDS PAGE y tinción con plata. Los plásmidos contienen diferentes genes específicos de S. aureus y se indican diferentes genes de resistencia usados para la selección de antibióticos: Tetraciclina (Tet) y HIJ, SEQ ID NO: 2; Tet HIJK, SEQ ID NO: 3, Tet y ningún gen, control de plásmido vacío, los números corresponden a marcadores de peso molecular. Las calles marcadas como Kanamicina (Kan) contienen una variación de SEQ ID NO: 3 en la que el casete de resistencia a tetraciclina se reemplaza por un gen de resistencia a kanamicina.
En la figura 8B, la cepa huésped fue E. coli W3110 AwecA, como en la figura 8A. La calle izquierda en la figura 8B corresponde al marcador de peso molecular como en la figura 8A. En la figura 8B, los extractos celulares totales de células que contienen diferentes agrupaciones quiméricas se trataron con Proteinasa K y se analizaron mediante SDS PAGE y tinción con plata (panel izquierdo) y mediante inmunotransferencia anti-CP5 después de la electrotransferencia (panel derecho). Los plásmidos usados contienen el grupo quimérico de CP5 indicado en la SEQ ID NO: 3 presente en un esqueleto de plásmido pLAFRI modificado que contiene un casete de kanamicina en lugar de tetraciclina (véase la figura 8A) o en pACYC que contiene un casete de resistencia a cloranfenicol.
Además, se probaron diferentes promotores para expresar el LPS quimérico O11-CP5. En estas pruebas, la cepa huésped fue E. coli W3110 hwecA llevando el grupo CP5 quimérico. En esta cepa, el grupo quimérico reemplazó los genes wecAwzzE. Los extractos celulares totales de células que contenían diferentes agrupamientos quiméricos expresados a partir de pLAFRI se trataron con Proteinasa K y se analizaron mediante SDS PAGE e inmunotransferencia anti-CP5 después de la electrotransferencia. Los plásmidos contenían grupos de O11 en los que wbjA y wzy fueron reemplazados por diferentes genes de especificidad de S. aureus (con un casete cat) como se indica debajo de las calles en la figura 9. Además, el ADN delante de los genes de especificidad cap5 se cambió y se analizó el efecto sobre la glucosilación de los lípidos. El efecto de estas diferentes regiones promotoras se analizó como se representa en la figura 9. Wzz/wzx denota los genes originales (véase la figura 6) delante de los genes de cap después de la recombinación homóloga inicial (Figura 9 correspondiente a las dos primeras calles). Estos dos genes se eliminaron (-) (Figura 9 correspondiente a las tres calles en el medio) y se reemplazaron con la región de 0,6 kb (PO121) (Figura 9 correspondiente a las tres últimas calles) presente corriente arriba del grupo de antígeno O de E. coli 0121 que codifica una secuencia promotora fuerte. Las calles indicadas wzz/wzx y HIJ en la figura 9 derivaron de células que expresan SEQ ID NO: 2, calles indicadas wzz/wzx y HIJK derivan de la SEQ ID NO: 3. En la figura 9, los marcadores de peso molecular están indicados a la izquierda del marco del gel.
Como se indica en la figura 9, los resultados mostraron que una actividad promotora relevante reside en el gen wzx (Figura 9 primeras dos calles - wzz/wzx) y que puede ser reemplazado funcionalmente por un promotor constitutivo de E. coli, por ejemplo, el promotor wb de la serovariedad 0121 wb (PO121 últimas tres calles en la figura 9), sin perder producción de LPS. Tomados juntos, estos resultados significan que O11 y los elementos de S. aureus para el antígeno O O11 y la producción de polímero capsular de CP5 como se describe en el presente documento pueden combinarse en muchos sistemas de expresión de E. coli diferentes que dan como resultado la producción de polisacárido de S. aureus recombinante.
Estos resultados mostraron por primera vez la producción en E. coli de una estructura de polisacárido capsular que se origina en un organismo grampositivo. Esto significa que era posible, al contrario que con la técnica anterior y que las expectativas convencionales, combinar las enzimas del grupo O11 y las enzimas del grupo cap de S. aureus para formar un polisacárido quimérico, es decir, que las enzimas trabajan juntas en la misma estructura in vivo.
Ejemplo 3: Confirmación de la estructura molecular de los glucanos recombinantes
Para confirmar la actividad del grupo quimérico CP5/O11 en E. coli a nivel molecular, se desarrolló un nuevo procedimiento que permite el análisis de azúcares unidos a UndPP mediante el uso de marcaje fluorescente del azúcar en el extremo reductor con 2-aminobenzamida (2-AB). Para mejorar la resolución del análisis, se usaron grupos quiméricos que contenían deleciones que aumentaban la cantidad de RU no polimerizadas. Glucolípidos de diferentes células E. coli que expresan el grupo quimérico contenido en el plásmido pLAFR1 y que carecen de la flipasa cap5K (SEQ ID NO: 2) se analizaron como se describe a continuación.
Para extraer los glucanos unidos a UndPP, las células de E. coli se lavaron con NaCl al 0,9 % y se liofilizaron. Las células secas se extrajeron una vez con 30 ml de disolvente orgánico (85 a 95 % de metanol = M). El sedimento celular liofilizado se extrajo adicionalmente dos veces con 5 ml de cloroformo: metanol: agua (C:M:A = 10:10:3; v/v/v). El extracto (M) se convirtió con cloroformo y agua hasta una relación final de 3:48:47 (C:M:A). El extracto 10:10:3 (C:M:A) se convirtió en un sistema Bligh/Dyer bifásico (Bligh, E. G. y W. J. Dyer. 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37(8): 911-7) por adición de agua, que da como resultado una proporción final de 10:10:9 (C:M:A). Las fases se separaron por centrifugación y la fase acuosa superior se mantuvo para procesamiento adicional.
Para purificar los glucolípidos extraídos, la fase acuosa se sometió a un cartucho Sep-PAK tC-is. El cartucho se acondicionó con 10 ml de metanol, seguido de equilibrio con 10 ml de 3:48:47 (C:M:A). Después de cargar la muestra, el cartucho se lavó con 10 ml de 3:48:47 (C: M: A) y se eluyó con 5 ml de metanol y 5 ml de 10: 10: 3 (C: M: A). Las eluciones combinadas se secaron bajo N2. Las muestras de glucolípidos se hidrolizaron disolviendo las muestras secas en 2 ml de n-propanol:ácido trifluoroacético 2 M (1:1), calentando a 50 °C durante 15 minutos, y, a continuación, evaporando a sequedad en N2 (Glover, K. J., E. Weerapana y B. Imperiali. 2005. In vitro assembly of the UndPP-linked heptasaccharide for prokaryotic N-linked glycosylation. Proc Natl Acad Sci U S A 102(40): 14255-9). Las muestras secas se marcaron con 2-AB y la limpieza del glucano se realizó utilizando el procedimiento del disco de papel como se describe (Bigge, J. C., T. P. Patel, J. A. Bruce, P. N. Goulding, S. M. Charles, R. B. Parekh. 1995. Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem 230(2): 229-38; Merry, A. H., D. C. Neville, L. Royle, B. Matthews, D. J. Harvey, R. A. Dwek y P. M. Rudd. 2002. Recovery of intact 2-aminobenzamide-labeled O-glycans released from glycoproteins by hydrazinolysis. Anal Biochem 304(1): 91-9). Los glucanos marcados con 2-AB se separaron mediante HPLC usando una columna de fase normal GlycoSep-N según Royle y col. pero modificado a un sistema de tres disolventes (Royle, L., T. S. Mattu, E. Hart, J. I. Langridge, A. H. Merry, N. Murphy, D. J. Harvey, R. A. Dwek, P. M. Rudd. 2002. An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins. Anal Biochem 304(1): 70-90). El disolvente A fue formiato de amonio 10 mM, pH 4,4 en 80 % de acetonitrilo. El disolvente B fue formiato de amonio 30 mM, pH 4,4 en 40 % de acetonitrilo. El disolvente C fue ácido fórmico al 0,5 %. La temperatura de la columna era de 30 °C y los glucanos marcados con 2-AB se detectaron por fluorescencia (excitación Aex = 330 nm, emisión Aem = 420 nm). Las condiciones del gradiente fueron un gradiente lineal de 100 % de A a 100 % de B durante 160 minutos a un caudal de 0,4 ml/min, seguido de 2 min a 100 % de B a 100 % de C, aumentando el caudal a 1 ml/min. La columna se lavó durante 5 minutos con 100 % de C, volviendo al 100 % de A durante 2 minutos y funcionando durante 15 minutos a 100 % de A con un caudal de 1 ml/min, volviendo después el caudal a 0,4 ml/min durante 5 minutos. Las muestras se inyectaron en agua.
Las fracciones secas se resuspendieron en 5 ul de acetonitrilo (ACN) al 10 %, ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % y se mezclaron a 1:1 con solución de matriz (40 mg/ml de DHB en 50 % de ACN, 0,1 % de TFA) en la placa objetivo. Los datos de MS y MS/MS se adquirieron manualmente en el modo de ion positivo en un espectrómetro de masas Ultraflex-II MALDI-ToF/ToF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Los MS/MS se obtuvieron utilizando el procedimiento LIFT. Se utilizó una mezcla de péptidos estándar (Bruker Daltonik GmbH) para la calibración externa. Los espectros se exportaron utilizando el software Flex Analysis (Bruker Daltonik GmbH) y se analizaron manualmente.
Extractos de metanol de plásmidos que contenían W3110 AwecA (CP5) de E. coli con (línea gruesa) o sin (línea discontinua fina) los grupos quiméricos se purificaron sobre cartuchos tC18 y se analizaron mediante HPLC en fase normal. Las fracciones correspondientes a los picos mostrados en la figura 10a halladas a una elución a 37', 40' y 45' se analizaron mediante MALDI-MS/MS. Las muestras que eluyeron a los 37 y 40 minutos se identificaron como RU CP5 recombinantes con y sin el grupo O-acetilo unido, respectivamente. La muestra que se eluye a los 45 minutos se identificó como una estructura RU no acetilada de S. aureus alargada mediante una desoxi-N-acetilhexosamina (como se muestra en la figura 11E). En el grupo quimérico CP5, cap5HIJ reemplazó los genes wbjA y wzy del grupo O11 en pLAFR. El reemplazo contenía el casete cat, además de los genes cap5HIJ (SEQ ID NO: 2).
Extractos de metanol de plásmidos que contenían W3110 AwecAwzzE de E. coli con (línea gruesa) o sin (línea discontinua fina) el grupo quimérico se purificaron sobre cartuchos tC18 y se analizaron mediante HPLC en fase normal. La figura 10B muestra los resultados del análisis por HPLC de la RU recombinante de CP8 producida usando un grupo quimérico (SEQ ID NO: 4 sin polimerasa). Los picos específicos para las células que expresan el azúcar recombinante se identificaron en 23', 32', 38' y 45 de elución, se recogieron y se analizaron mediante MALDI-MS y MALDI-MS/MS. En el grupo quimérico CP8, cap8HJK reemplazó los genes wbjA y wzy del grupo O11, es decir, una construcción sin la polimerasa para acumular Ru sola para el análisis. El reemplazo contenía el casete cat, además de los genes cap.
La figura 11A muestra los resultados del análisis de MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo de CP5 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 37 minutos. La masa principal m/z = 772 ([M+H]+) se seleccionó y se analizó mediante MS/MS, que muestra un patrón de fragmentación consistente con la estructura RU de CP5 no acetilada que también se esperaba a la luz de la invención divulgada en esta memoria descriptiva. Las especies O-acetiladas se caracterizan por una pérdida específica de 42 más la masa del monosacárido FucNAc (dHexNAc(OAc)) en la posición media de la RU. Los iones de fragmento están indicados según la nomenclatura del consorcio de glucómica funcional, CFG (www.functionalglycomics.org/static/consortium/Nomenclature.shtml). 2-AB, 2-aminobenzamida. La leyenda para los iones fragmentos se da en el recuadro de la figura 11A.
La figura 11B muestra los resultados del análisis de MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo de CP5 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 40 minutos. La masa principal de m/z = 730 ([M+H]+) se seleccionó y se analizó mediante MS/m S, que muestra series de iones de fragmentación consistentes con la estructura RU de CP5 no acetilada que también se esperaba a la luz de la invención divulgada en esta memoria descriptiva. 2-AB, 2-aminobenzamida. La leyenda para los iones fragmentos se da en el recuadro de la figura 11B.
La figura 11C muestra los resultados del análisis de MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo de CP8 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 32 minutos. Una masa principal de m/z = 794 ([M+Na]+) se seleccionó y se analizó mediante MS/MS, que muestra series de iones de fragmentación consistentes con la estructura RU de CP8 acetilada que también se esperaba a la luz de la invención divulgada en esta memoria descriptiva. Las especies O-acetiladas se caracterizan por una pérdida específica de 42 más la masa del monosacárido ManNAcA (HexNAcA(OAc)) en la posición más externa de la RU. Los iones de fragmentos están indicados según la nomenclatura de CFG. 2-AB, 2-aminobenzamida. La leyenda para los iones de fragmentos se proporciona en el recuadro de la figura 11C.
La figura 11D muestra los resultados del análisis de MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo de CP8 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 38 minutos. La masa de m/z = 730 ([M H]+) se seleccionó y se analizó mediante MS/MS, que muestra series de iones de fragmentación consistentes con la estructura de RU de CP8 no acetilada que también se esperaba a la luz de la invención divulgada en esta memoria descriptiva. Un análisis adicional mostró que los picos de elución posteriores (mostrados en la Figura 10A a los 40 min y la Figura 10B a los 38 min) contienen los trisacáridos no O-acetilados de RU de CP5 y 8. Los iones de fragmentos están indicados según la nomenclatura de CFG. 2-AB, 2-aminobenzamida. La leyenda para los iones de fragmentos se proporciona en el recuadro de la figura 11D.
Los resultados de MS mostraron que las masas y la serie de iones de fragmentación están de acuerdo con la estructura molecular del oligosacárido de RU de CP5 con la acetilación O del resto FucNAc medio (es decir, el pico a los 37' en la Figura 10A y en la Figura 11A) o sin la acetilación O del resto FucNAc medio (es decir, el pico a los 40' en la Figura 10A y en 11B). La señal a los 45 minutos en la figura 10A se identificó como un tetrasacárido, que se analiza adicionalmente a continuación. El mismo análisis se repitió con el grupo de CP8 quimérico que carecía del gen de la polimerasa. En dichos extractos, se encontraron señales coherentes con la estructura de RU O-acetilada a la luz de la invención divulgada en esta memoria descriptiva a 23' y 32' de elución, como se muestra en las figuras 10B y 11C. La presencia de dos tiempos de elución diferentes para la misma secuencia de glucano identificada mediante MALDI-MS/MS indica que tiene lugar un evento de migración de O-acetilo durante la preparación de la muestra. Se identificaron RU no acetiladas para extractos de CP5 y CP8 a 40' y 38', tal como se muestra en las figuras 11B y D, respectivamente. Las estructuras RU de CP5 y CP8 estaban presentes en diferentes cepas de E. coli, que incluyen por ejemplo, W3110, W3310 AwecA, W3110 AwecAwzzE y w 3 l10 AwecAwzzE AwaaL.
Ejemplo 4: Mejora de la estructura de la unidad de repetición y su análisis.
El pico de HPLC que se muestra en la figura 10B eluyendo a los 45 minutos, derivado de células de E. coli que expresan el grupo de CP8 quimérico (SEQ ID NO: 4) pero que carece del gen de la wzy polimerasa cap8I, también se analizó mediante MALDI-MS/MS. El ion más intenso en la MS completa fue m/z = 939 ([M H]+) y el análisis de secuencia se realizó mediante MS/MS. Los resultados de este análisis de MS/MS se muestran en la figura 11E y presentan una serie de iones de fragmentación consistente con la RU capsular de S. aureus no acetilada extendida por una masa de una desoxi-N-acetilhexosamina en el extremo no reductor, como se esperaba a la luz de la invención divulgada en esta memoria descriptiva. Los iones de fragmento correspondientes a las estructuras hipotéticas se indican de acuerdo con la nomenclatura del CFG sobre los picos. 2-AB, 2-aminobenzamida. La leyenda para los iones de fragmentos se proporciona en el recuadro de la figura l lE .
El resultado mostrado en la figura 11E sugirió que una glucosiltransferasa de E. coli podía modificar el resto de ManNAcA de la RU de CP8. Dicha RU alterada muy probablemente no sea polimerizada por cap8I. El análisis de las especificidades de glucosiltransferasa en E. coli huésped W3110 indicó que una enzima del grupo de ECA puede interferir con el azúcar recombinante, específicamente el producto del gen wecF, una supuesta 4-N-acetilfucosamina transferasa. WecF agrega naturalmente 4-N-acetilfucosamina en ManNAcA comprendido en ECA, lo más probable es que la enzima también pueda alargar las RU de CP8 y CP5.
Para solucionar este problema, se desarrolló otro enfoque novedoso. Específicamente, se eliminaron los genes del grupo ECA localizado corriente abajo del gen wecC, incluido WecF. Esto se logró usando el procedimiento descrito por Datsenko y col. (Datsenko, K. A. y B. L. Wanner (2000). "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products." Proc Natl Acad Sci USA 97(l2): 6640-6645). Diferentes huéspedes de expresión de E. coli se eliminaron en las regiones génicas waaL y rmlB-wecG y en algunas cepas en wecA-wzzECA también. Los extractos purificados en Sep-PAK (extractos de metanol y 10:10:3) de estas células mutadas que expresan el grupo quimérico CP8 mutante de polimerasa se analizaron mediante HPLC de fase normal como se describió anteriormente.
La figura 11F presenta los resultados de análisis de HPLC de extractos de metanol de células E. coli W3110 AwaaL que expresan la polimerasa mutante de SEQ ID NO: 4 (línea fina discontinua) en comparación con células con una deleción adicional de los genes del grupo ECA rmlB-wecG (W3110) AwaaL ArmlB-wecG::cat) (línea gruesa). Los extractos se purificaron sobre cartuchos tC18 y se analizaron mediante HPLC en fase normal. Como se muestra en la figura 11F, el pico principal que aparece a 45' en la figura 10B estaba ausente, dando como resultado picos específicos para las RU de CP8 acetiladas y no acetiladas (Figura 11F) que indica que una de las ECA glucosiltransferasas, muy probablemente wecF, es responsable del fenotipo de elongación aberrante. Se obtuvieron resultados similares cuando el grupo quimérico CP5 se probó en diferentes cepas. Esto implica que eliminar glucosiltransferasas transportadas en E. coli y enzimas requeridas para la biosíntesis de azúcares activados por nucleótidos es una posible estrategia para optimizar la calidad y cantidad de polisacáridos producidos de manera recombinante en E. coli. Las enzimas objetivo muy probablemente estarían codificadas en el grupo de antígeno O, el grupo ECA y el ácido colánico o grupos de cápsulas.
Se obtuvo evidencia adicional de la calidad del polisacárido recombinante unido a UndPP a partir de un análisis optimizado de HPLC en fase normal de extractos de glucolípidos marcados fluorescentemente purificados con Sep-PAK de huéspedes de expresión optimizados cromosómicamente como se ha descrito anteriormente. Para un rendimiento óptimo de las columnas Sep-PAK para la purificación de los lípidos unidos a oligosacáridos y polisacáridos cargados con CP5 y CP8, se añadió fosfato de terc-butilamonio (TBAP) a los extractos antes de cargar los cartuchos Sep-PAK. Como indican Trent, y col., el catión de esta sal mejora la unión a la columna de los compuestos cargados al proteger cargas negativas con cadenas de butilo hidrófobas (Trent, M. S., A. A. Ribeiro, y col. (2001). "Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm." J Biol Chem 276(46): 43132-43144.). Este procedimiento optimizado se aplicó a las muestras de CP5 y CP8 obtenidas por extracción con metanol de células que expresan grupos quiméricos CP5 o CP8 que contienen una polimerasa.
La figura 11G proporciona los resultados del análisis de HPLC que muestra el repertorio completo de glucanos CP5 presente en UndPP en células E. coli. Extractos de metanol de E. coli W3110 AwaaLAwecAwzzECA ArmlB-wecG::cat que expresan el grupo de CP5 quimérico SEQ 3 (línea continua) o un control de plásmido vacío (línea discontinua) se extrajeron en fase sólida en cartuchos Sep-PAK y se trataron con ácido débil para hidrolizar azúcares de UndPP. El material resultante se hizo reaccionar con 2AB mediante aminación reductora para marcar los extremos reductores de los glucanos y se analizaron mediante HPLC en fase normal. Las señales presentes en la línea continua pero no en la línea discontinua representan material específico de CP5. Las letras mayúsculas indican picos que contienen polímeros de la RU de CP5 acetilada y/o no acetilada identificados por MALDI-MS/MS de las fracciones recogidas. La leyenda de la figura 11G indica las estructuras moleculares propuestas según se deducen del análisis MS/MS. Debe observarse que los polímeros de RU acetilados y no acetilados mostrados para MS/MS confirmaron las estructuras del mismo grupo de grado de polimerización juntas en el cromatograma como se indica mediante barras gruesas. Las letras mayúsculas muestran las siguientes longitudes: A y B: una RU; C, D y E: dos RU; F y G: tres RU; y H: cuatro RU. El pico ancho entre 95' y 125' en la figura 11G muy probablemente represente 5 o más RU polimerizadas no resueltas por la columna.
La figura 11H presenta más resultados de HPLC, que muestra glucanos de CP5 acetilados y homogeneidad de las RU. Para preparar este análisis de HPLC, las muestras de glucano marcadas con 2AB de E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG::cat que expresa el grupo de CP5 quimérico de SEQ ID NO.: 3 (preparado según los procedimientos descritos anteriormente con referencia a la figura 11G) se trataron con NaOH en solución acuosa y se volvieron a marcar. Como se muestra en la figura 11H, las muestras antes (discontinuo) y después (línea continua) del tratamiento alcalino se analizaron por HPLC. Los números en la figura 11H indican los números putativos de RU en los picos correspondientes. Debe entenderse que, en la figura 11H, los picos acetilados mostrados en la figura 11G unifican en la señal del polímero no acetilado, y esa desacetilación resolvió las unidades RU en los tiempos de elución después de 95 minutos.
La figura 11I proporciona los resultados del análisis de HPLC que muestra el repertorio de glucanos de CP8 presente en UndPP en células E. coli. Extractos de metanol de W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG::cat de E. coli que expresan el grupo de CP8 quimérico de SEQ ID NO.: 4 (línea continua) o un control de plásmido vacío (línea discontinua) se extrajeron en fase sólida en cartuchos Sep-PAK y se trataron con ácido débil para hidrolizar azúcares de UndPP. El material resultante se hizo reaccionar con 2AB mediante aminación reductora para marcar los extremos reductores de los glucanos y se analizaron mediante HPLC en fase normal. Las señales presentes en la línea continua pero no en la línea discontinua representan material específico de CP8. Se indican estructuras putativas de RU de CP8 acetiladas y/o no acetiladas identificadas por MALDI-MS/MS de las fracciones recogidas. Obsérvese que, como en los resultados de HPLC con CP5 mostrada en la figura 11G, los polímeros de RU de CP8 acetilados y no acetilados del mismo grado de polimerización se agrupan juntos en el cromatograma de la figura 11H como indican las barras gruesas. El material detectado después de 110' representa polímeros CP8 más largos.
La figura 11J presenta más resultados de HPLC, que muestra la desacetilación de los glucanos de CP8 y la homogeneidad de las RU. Las muestras de glucano marcadas con 2AB de W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG::cat de E. coli que expresan el grupo de CP8 quimérico de SEQ ID NO.: 4 se trataron con NaOH en solución acuosa y se volvieron a marcar. Las muestras antes (discontinuo) y después (línea continua) del tratamiento alcalino se analizaron por HPLC. Los números indican los números putativos de RU en los picos correspondientes. Debe observarse que los picos acetilados desaparecen en gran medida y que las señales del polímero no acetilado aumentan, y que la desacetilación resolvió las unidades RU en los tiempos de elución después de 110 minutos.
Las figuras 11H y 11J muestran resultados de HPLC indicativos del patrón característico de bandeo en bandas de antígenos O cuando se realizó el tratamiento alcalino en estas muestras CP5 y CP8 para eliminar las modificaciones de acetilación de los oligosacáridos y polisacáridos. Los resultados muestran picos agudos discretos con disminución constante de los incrementos de tiempo de elución. Esto implica que dichas cadenas de carbohidratos analizadas son polímeros lineales compuestos de RU idénticas. Estos datos muestran que los azúcares recombinantes CP5 y CP8 producidos en E. coli son regularmente polimerizados y parcialmente acetilados. Los polímeros CP5 y CP8 no acetilados eluyen de manera similar de la columna de HPLC como se esperaba por su similitud en la estructura; sin embargo, la cromatografía de fase normal también revela diferencias: por ejemplo, CP5 se polimeriza en menor medida que CP8 y la acetilación es más frecuente en CP5; en las longitudes de RU por encima de 4, CP5 tiene una clara preferencia por hacer polímeros de 7 RU, mientras que CP8 se polimeriza en un grado más amplio; y como lo indican los resultados de HPLC y MS/MS, CP5 es más eficiente para la producción de glucanos que CP8.
En las vías de polimerización dependientes de wzy, ha sido notificado por Marolda, y col., que una enzima específica (wzz o cld para el determinante de la longitud de la cadena) es responsable de determinar el número promedio de etapas de polimerización de RU realizadas (Marolda, C. L., L. D. Tatar, y col. (2006). "Interplay of the Wzx translocase and the corresponding polymerase and chain length regulator proteins in the translocation and periplasmic assembly of lipopolysaccharide o antigen." J Bacteriol 188(14): 5124-5135.). Las enzimas Wzz causan un promedio de repetición específico, por ejemplo, polímeros de azúcar cortos, largos y muy largos y se sabe que transfieren su especificidad de longitud a las rutas de polisacáridos exógenos. Las longitudes y cantidades de los glucolípidos CP8 se analizaron en la cepa de producción, dando como resultado una cantidad más larga y más baja de este azúcar. Para aumentar la cantidad de moléculas y, por lo tanto, la eficiencia de la transferencia de azúcar para la glucosilación de proteínas, se realizó una regulación negativa de la longitud del azúcar CP8 usando una enzima Wzz específica.
Para demostrar el efecto de una proteína Wzz sobre el tamaño y las cantidades de azúcares CP8 en los lípidos, la coexpresión de Wzz de E. coli wzz O7 se realizó a partir de un plásmido separado (SEQ ID NO: 19). La figura 11K presenta los resultados de esta prueba. Los extractos de metanol de E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG::cat que expresan el grupo de CP8 quimérico SEQ ID NO: 4 y una copia inducible por IPTG portada por el plásmido de wzzO7 (SEQ ID NO: 21, línea continua), o un control de plásmido vacío (línea discontinua) se extrajeron en fase sólida en cartuchos Sep-PAK y se trataron con ácido débil para hidrolizar azúcares de UndPP. Los glucanos marcados con 2AB se analizaron mediante HPLC de fase normal. El tratamiento alcalino de la muestra CP8 mostró que más del 85 % del área entre 95 y 115' representa 7 u 8 polímeros de RU de CP8, lo que indica una amplia variedad de acetilación. Estos resultados también indican que el grupo CP8 quimérico indujo: a) una intensificación en el número de repeticiones del glucano más abundante de 7 a 8, y b) una intensidad global más alta de la señal fluorescente según el área debajo del cromatograma.
El tratamiento alcalino confirmó la acetilación del glucano acortado como en la figura 11I y 11J que indican que la longitud de un polisacárido recombinante puede ser regulada por una enzima Wzz extraña. También es posible regular la longitud del polímero de azúcar capsular mediante una enzima Wzz derivada de antígeno O. Adicionalmente, diferentes promotores frente al grupo quimérico cuando están presentes en un plásmido causan diferentes niveles de expresión y diferentes grados de polimerización.
Ejemplo 5: Glucosilación de proteínas con los glucanos CP5 y CP8 y caracterización del producto
Se probaron diferentes variantes del grupo quimérico para la producción de bioconjugados. Los grupos de genes quiméricos O11/CP5 (SEQ ID NO: 2 y 3), que contienen diferentes variantes de las regiones de especificidad de S. aureus en el grupo O11 de antígeno O en lugar de wbjA y wzy, se expresaron en la cepa huésped E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzE::cat en presencia de PglB (SEQ ID NO: 27?) y EPA (SEQ ID NO: 13). Las células huésped W3110 AwaaL AwecAwzzE::cat expresaron EPA con dos sitios de glucosilación (de SEQ ID NO: 13) y PglB (SEQ ID NO: 27) de plásmidos separados además del plásmido pLAFR1 con el grupo de antígeno O O11 en el que los genes wbjA y wzy se reemplazaron por diferentes conjuntos de genes cap5 (y el casete cat, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3).
Se expresa la proteína EPA que contiene: a) una secuencia de péptido señal en N-terminal para exportar al periplasma, b) dos secuencias consenso de N-glucosilación bacteriana modificadas genéticamente en la secuencia de proteína (SEQ ID NO: 13) como se expone en el ejemplo 10 del documento WO 2009/104074, incorporado por referencia en este documento en su totalidad, y c) un marcador de seis his para purificación. Las células se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 5 l en medio LB. Un cultivo de una noche se diluyó a DO600nm= 0,05. A una DO600nm de aproximadamente 0,5, se indujo la expresión de PglB mediante la adición de IPTG 1 mM y se indujo la expresión de EPA mediante la adición de arabinosa (concentración final del 0,2 %). Las células se cultivaron durante 4 horas, la inducción se repitió y las células se cultivaron durante aproximadamente 16 horas adicionales. Las células se sedimentaron por centrifugación; las células se lavaron y se suspendieron en 0,2 vol de tampón de sacarosa, se sedimentaron y se lisaron por choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. El bioconjugado EPA-CP5 sin y con el gen de flipasa de S. aureus cap5K (SEQ ID NO: 2 y 3) se eluyó con imidazol 0,5 M y los picos eluidos se agruparon y analizaron mediante SDS pAg E y se tiñeron con Coomassie y plata (Figura 12).
La figura 12 presenta los resultados de SDS PAGE. El panel izquierdo muestra la tinción de Coomassie y el panel derecho muestra la tinción de plata. Los números en el medio indican los tamaños del marcador de peso molecular.
Las letras debajo de las calles indican los genes que estaban presentes en el grupo quimérico expresado en las cepas usadas para la producción de bioconjugados. La cepa huésped fue E. coli W3110 AwaaL ÁwecAwzzE::cat. Los resultados muestran que la señal de proteína a 70 kDa (movilidad electroforética) muy probablemente corresponde a EPA no glucosilada y una escalera de bandas por encima (100-170 kDa). La escalera probablemente corresponde a la proteína EPA glucosilada con el glucano recombinante CP5 de S. aureus. Además, los resultados indican que incluir el gen de flipasa en el sistema aumenta el rendimiento de glucoproteína (calles central y derecha).
En un análisis distinto, el bioconjugado CP5-EPA se produjo en E. coli W3110 ÁwaaL ÁwecAwzzE::cat por coexpresión del grupo del gen CP5 quimérico (SEQ ID NO: 3), PglB (SEQ ID NO: 27) del plásmido pEXT21 y EPA (que contiene dos sitios de glucosilación, SEQ ID NO: 13) a partir de plásmidos separados. Para obtener un proceso más controlado para la producción de bioconjugados, las células se cultivaron en un biorreactor de 2 l a una DO600nm = 30 a 37 °C, y se indujo la expresión de PglB y EPA mediante la adición de IPTG 1 mM y arabinosa al 0,2 %. Las células se cultivaron durante 18 h a 37 °C bajo condiciones limitantes de oxígeno. Las células se sedimentaron por centrifugación, se lavaron y se resuspendieron en tampón de sacarosa al 25 % a una DO600 nm = 200, después de 30 min de incubación a 4 °C, la suspensión se sedimentó y se lisó mediante choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas presentes en el sobrenadante se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. La EPA glucosilada y no glucosilada se eluyó de la columna de afinidad mediante imidazol 0,5 M y se cargó en una columna de intercambio aniónico de SourceQ. El EPA glucosilado se separó del EPA no glucosilado aplicando un gradiente de concentración creciente de NaCl.
Como se muestra en la figura 13A, la EPA glucosilada purificada (CP5-EPA) se separó mediante SDS PAGE y se tiñó con Coomassie (calle izquierda) o se transfirió a membranas de nitrocelulosa y se incubó con anticuerpos anti-CP5 (calle central) o anticuerpos anti-EPA (calle derecha). El bioconjugado purificado fue reconocido mediante los anticuerpos específicos de EPA (calle derecha), así como por el antisuero policlonal específico de CP5 (calle central). La flecha indica la posición en el gel del cual se cortó una pieza y se usó para la tripsinización y análisis de glucopéptidos mediante MALDI-MS/MS. La figura 13B presenta la MALDI-MS/MS de masas M/Z encontradas para el sitio de glucosilación en el péptido tripsinizado DNNNSTPTVISHR unido N glucosídicamente a la masa de RU O-acetilada (m/z = 2088 ([M H]+)). El análisis MS/MS de m/z = 2088 muestra una fragmentación parcial del resto de azúcar como se indica. El recuadro ilustra la estructura de la RU unida al péptido derivado de la tripsinización de CP5-EPA purificado de la figura 13A. Las pérdidas secuenciales de ManNAcA (HexNAcA, 217 Da) y FucNAc acetilado (dHexNAc (OAc), 229 Da) soportan la estructura de glucano esperada. La figura 13C presenta la MALDI-MS/MS de masas M/Z encontradas para el sitio de glucosilación en el péptido tripsinizado DQNR unida N-glucosídicamente a la masa O-acetilada de RU (m/z = 1165 ([M H]+)). El análisis de MS/Ms de m/z = 1165 muestra la serie completa de iones de fragmentación de ion Y en consonancia con la estructura de la RU de CP5. El recuadro ilustra la estructura de la RU unida al péptido derivado de la tripsinización de CP5-EPA purificado de la figura 13A. Se muestran las pérdidas secuenciales de ManNAcA (HexNAcA, 217 Da) , FucNAc acetilado (dHexNAc (OAc), 229 Da) y FucNAc (dHexNAc, 187 Da), lo que confirma la estructura de glucano esperada en el péptido DQNR (m/z = 532 Da ([M+H+])).
En la figura 13D el bioconjugado de CP8 en E. coli se produjo utilizando la misma estrategia que la producción del bioconjugado de CP5. El bioconjugado CP8-EPA se produjo en E. coli por coexpresión del grupo del gen CP8 quimérico (SEQ ID NO: 4), PglB (dentro del plásmido pEXT21 (SEQ ID n O: 27)), y EPA que contiene dos sitios de glucosilación (SEQ ID NO: 13). Las células se cultivaron en un biorreactor con un volumen inicial de 7 l en un medio semiduro que contenía glicerol, peptona y extracto de levadura como fuentes de C. Las células se cultivaron a 37 °C en modo discontinuo o discontinuo pulsado a una DO600nm de 30 y se indujo la expresión de PglB y EPA mediante la adición de IPTG 1 mM y arabinosa al 10 %. Tras la inducción, las células se cultivaron adicionalmente en modo de alimentación discontinua durante un período de 15 horas en condiciones de limitación de oxígeno. Las células se sedimentaron por centrifugación; las células se lavaron y se suspendieron en 0,2 vol de tampón de sacarosa, se sedimentaron y se lisaron por choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. La EPA glucosilada y no glucosilada se eluyó de la columna de afinidad mediante imidazol 0,5 M y se cargó en una columna de intercambio aniónico de SourceQ. El EPA glucosilado se separó del EPA no glucosilado aplicando un gradiente de concentración creciente de NaCl.
Como se representa en la figura 13D, la proteína purificada se separó mediante SDS PAGE y se tiñó con Coomassie (calle izquierda) o se transfirió a membranas de nitrocelulosa y se incubó con anticuerpos anti-CP8 (calle derecha) o anticuerpos anti-EPA (calle central).
Se probaron diferentes estrategias para mejorar aún más el sistema de glucosilación. En una estrategia, para reducir el número de plásmidos en el sistema de producción para reducir la carga de un antibiótico adicional y mantener un plásmido adicional, el casete de expresión para pglB se clonó en el plásmido que contenía los grupos quiméricos para CP5 (SEQ ID NO: 17) y CP8 (SEQ ID NO: 18). El casete de expresión se compone de la región intergénica presente entre galFy wbqA del genoma de E. coli 0121 (para una secuencia promotora), y la secuencia de pglB corriente abajo de esto. Este casete de expresión se clonó inmediatamente corriente abajo de los grupos quiméricos CP5 y CP8. Se analizó E. coli W3110 ÁwaaL ÁwecAwzzECA::cat que contenía el grupo quimérico CP5 (s Eq ID NO: 3) y pglB (SEQ ID NO: 27) en plásmidos separados o en el mismo plásmido (SEQ ID NO: 17). Además, EPA (SEQ ID No : 13) se expresó a partir de un plásmido bajo el control de un promotor inducible por arabinosa. Las células se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 5 l en medio LB a 37 °C. Un cultivo de una noche se diluyó a DO600nm= 0,05. A DO600nm se indujo una expresión de aproximadamente 0,5 de PglB mediante la adición de IPTG 1 mM y se indujo la expresión de EPA mediante la adición de arabinosa (concentración final del 0,2 %). Las células se cultivaron durante 4 horas, se repitió la inducción y las células se cultivaron durante aproximadamente 16 horas adicionales. El cultivo se sedimentó por centrifugación; las células se lavaron y se suspendieron en 0,2 vol de tampón de sacarosa, se sedimentaron y se lisaron por choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. El EPA-CP5 se eluyó con imidazol 0,5 M y los picos eluidos se agruparon y se analizaron mediante SDS PAGE y por Coomassie. La figura 13E representa los resultados de SDS PAGE. Se muestran las células que contienen 3 (izquierda) o 2 plásmidos (calle derecha) para la producción de glucoconjugados. Los resultados muestran que se mantuvo la producción de glucolípidos y conjugados para CP5-EPA.
Otra optimización del sistema fue la integración de la secuencia proteica de wzz (regulador de la longitud del polímero) en los plásmidos utilizados para la glucosilación de proteínas. Ilustrado por el sistema que produce CP8-EPA, se integró wzz en el grupo CP8 quimérico transportado por plásmidos (SEQ ID NO: 19) y corriente abajo del gen epa dentro del plásmido de expresión para la proteína transportadora (SEQ ID NO: 20). El bioconjugado CP8-EPA se produjo en E. coliW3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG::cat que comprendía 2 plásmidos: un plásmido contenía además del grupo quimérico del gen CP8, una copia del gen wzz O7 y un casete de ADN para la expresión constitutiva del gen pglB (SEQ ID NO: 19); el segundo plásmido contenía primero el gen para la expresión y secreción de la proteína EPA destoxificada que contiene dos sitios de glucosilación y en segundo lugar una copia de wzzO7 bajo el control del mismo promotor (SEQ ID NO: 20). La cepa resultante, E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzECA ArmlB-wecG::cat, que contenía los plásmidos mencionados se cultivó en un biorreactor con un volumen inicial de 7 l en un medio semidefinido que contenía glicerol, peptona y extracto de levadura como fuentes de C. Las células se cultivaron en modo discontinuo o discontinuo pulsado a una DO600nm de 30 y se indujo la expresión de PglB y EPA. Tras la inducción, las células se cultivaron adicionalmente en modo semicontinuo durante un período de 15 horas en condiciones limitantes de oxígeno y se recogieron por centrifugación. Las células se sedimentaron por centrifugación; las células se lavaron y se suspendieron en 0,2 vol de tampón de sacarosa, se sedimentaron y se lisaron por choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. El EPA glucosilado y no glucosilado se eluyó de la columna de afinidad mediante imidazol 0,5 M. La formación del glucoconjugado CP8-EPA se muestra en la figura 13F mediante Coomassie y transferencia de tipo Western utilizando antisueros anti-his y anti-CP8. La figura 13F muestra los resultados de la separación mediante SDS PAGE de la proteína purificada y el análisis mediante tinción de Coomassie (calle izquierda) o transferida a membranas de nitrocelulosa y sondeada con anticuerpos anti-marcador de his (calle central) o anticuerpos anti-CP8 (calle derecha).
La caracterización del glucoconjugado CP5-EPA se refinó adicionalmente mediante diversos procedimientos analíticos. CovalX (Schlieren, Suiza) realizó un análisis MALDI de alta masa de una muestra purificada de CP5-EPA producida utilizando el sistema de 3 plásmidos como se usa en los análisis representados en la figura 13A en W3110 AwaaL AwecAwzzECA::cat. La figura 14A representa los resultados de MALDI de alta masa. A+ y B+ apuntan hacia las especies proteicas en masa ([M H]+) correspondiente a EPA no glucosilada y EPA glucosilada, respectivamente. Las formas oligoméricas pueden estar presentes a mayor peso molecular y las señales en el área de bajo PM son contaminantes o productos de degradación. Los resultados presentados en la figura 14A muestran que la preparación de proteína anterior contenía una población de proteína en gran medida monomérica que es 4 kDa mayor que la proteína EPA sola, indicativo de una longitud media de azúcar de 5,2 unidades de repetición. Esto está de acuerdo con la longitud de azúcar de 5-7 de la forma principal de glucoconjugado en la preparación analizada por SDS-PAGE, tinción con azul brillante de Coomassie y recuento de las unidades de repetición en la forma conjugada principal (véanse las figuras 7, 8 y 13A).
CP5-EPA se caracterizó adicionalmente por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC). Los inventores usaron el sistema de 3 plásmidos en W3110 AwaaL AwecAwzzECA::cat como se usa en los análisis representados en la figura 13A. La muestra se purificó por cromatografía de intercambio aniónico para eliminar la EPA no glucosilada. El análisis se realizó en una columna Supelco TSK G2000SWXL. La figura 14B muestra los resultados del análisis SEC-HPLC de la muestra de CP5-EPA purificada. Se muestra la traza de UV medida a 280 nm. La línea sólida gruesa deriva del análisis de 3,25 |jg de CP5-EPA purificado, la línea fina se obtuvo a partir de 5 |jg de EPA no glucosilada purificada. Se muestra un pico principal, homogéneo a los 11,5 minutos de elución, mientras que EPA no glucosilada se eluye a los 12,9 minutos (Figura 14B). El cálculo de los radios hidrodinámicos de las dos moléculas dio como resultado un tamaño de 42 kDa para EPA no glucosilado y 166 kDa para EPA glucosilado. Esto indica que la EPA glucosilada aparece como una proteína monomérica alargada en solución como se esperaba debido a la estructura lineal del glucano.
Por lo tanto, nuestros análisis confirmaron que el bioconjugado CP5-EPA consiste en la proteína EPA y la estructura de glucano O-acetilada correcta. Según estos resultados, también podría predecirse que el bioconjugado CP8-EPA consistía en la proteína EPA y la estructura de glucano O-acetilada correcta.
Ejemplo 6: Glucosilación de proteínas de S. aureus y caracterización de productos
Para probar la versatilidad de la glucosilación "in vivo" para generar vacunas candidatas glucoconjugadas se usaron varias proteínas transportadoras como sustrato para glucosilarse con CP5. Para aumentar aún más la respuesta inmune de la vacuna bioconjugada contra S. aureus, la proteína transportadora EPA se intercambia por AcrA forma C. jejuni y dos proteínas de S. aureus: Hla y ClfA. Para usar como proteínas transportadoras, Hla y ClfA se modificaron mediante la inserción de los sitios bacterianos de N-glucosilación. El proceso se realizó como se describe en el documento WO 2006/119987 generando cuatro versiones para Hla H35L: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16 y tres para ClfA: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12.
Para la glucosilación del sitio Hla H35L se usaron 130 células E. coli (W3110 AwaaL AwecAwzzE ArmlB-wecG) que comprenden dos plásmidos de expresión: uno para la producción de Hla H35L (SEQ ID NO: 16), en la que la expresión de Hla H35L que contiene el péptido señal en N-terminal para la secreción periplásmica, un sitio de N-glucosilación y un marcador hexa HIS para la purificación están bajo el control del promotor ParaBAD, y, en segundo lugar uno para la expresión del grupo quimérico CP5 y pglB (SEQ ID NO.: 17). Este sistema corresponde al sistema de expresión de 2 plásmidos previamente optimizado de CP5-EPA con un plásmido de expresión de portador proteico intercambiado. Las células se cultivaron en un biorreactor de 12 l en medio rico a una DO600nm= 30, se indujo la expresión de Hla mediante la adición de arabinosa al 0,2 %. Las células se sedimentaron por centrifugación; las células se lavaron y se suspendieron en 0,2 vol de tampón de sacarosa, se sedimentaron y se lisaron por choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas en el sobrenadante se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. Hla glucosilada (CP5-Hla) y HIa no glucosilada se eluyeron de la columna de afinidad mediante imidazol 0,5 M y se cargaron en una cromatografía de intercambio aniónico. Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de 0 a 0,7 M de NaCl para separar CP5-Hla de Hla. La proteína resultante se separó mediante SDS PAGE y se tiñó con Coomassie, o se transfirió a membranas de nitrocelulosa y se sondeó con antisuero anti-His, anti-Hla o anti-CP5, como se indicó (Figura 14C). Los resultados de la figura 14C muestran la formación de glucoconjugado (CP5-Hla) mediante coomassie (calle izquierda) y transferencia de tipo Western usando antisueros anti-His (calle central izquierda) y anti-Hla (central derecha) y anti-CP5 (derecha).
La identidad de Hla H35L con un sitio de glucosilación de ingeniería 130 se confirmó mediante tripsinización en gel y MALDI-MS/MS.
Para mostrar además que la proteína transportadora es intercambiable para la glucosilación por CP5 y CP8, se usó la proteína AcrA de C. jejuni como un aceptor de la glucosilación (véase la figura 14D). Usando el sistema de 3 plásmidos (SEQ ID NO: 3, Se Q ID NO: 15 y SEQ ID NO: 27), la cepa de producción para este conjugado fue W3110 AwaaL que aloja el grupo quimérico CP5 (SEQ ID NO: 3), la proteína PglB inducida por IPTG (SEQ ID NO: 27) y AcrA (SEQ ID NO: 15) bajo inducción con arabinosa en plásmidos separados. Las células se cultivaron en un biorreactor con un volumen inicial de 7 l en un medio semiduro que contenía glicerol, peptona y extracto de levadura como fuentes de C. Las células se cultivaron en modo discontinuo o discontinuo pulsado a una DO600nm de 30 y se indujo la expresión de PglB y AcrA mediante la adición de IPTG 1 mM y arabinosa al 10 %. Tras la inducción, las células se cultivaron adicionalmente en modo semicontinuo durante un período de 15 horas en condiciones limitantes de oxígeno y se recogieron por centrifugación. Las células se sedimentaron por centrifugación; las células se lavaron y se suspendieron en 0,2 vol de tampón de sacarosa, se sedimentaron y se lisaron por choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. Las glucoproteínas CP5-AcrA se eluyeron de la columna de afinidad mediante 0,5 M de imidazol. La proteína purificada se separó mediante SDS PAGE y se tiñó con Coomassie, o se transfirió a membranas de nitrocelulosa y se sondeó con antisuero anti-AcrA o anti-CP5, como se indica en la figura 14D.
La inserción de los sitios bacterianos de N-glucosilación en ClfA se realizó como se describe en el documento WO 2006/119987, generando la SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12. Las proteínas transportadoras se expresaron en células E. coli de promotores inducibles por arabinosa. Los genes se diseñaron para producir un péptido señal N-terminal para la secreción periplásmica, varios sitios de N-glucosilación y un marcador hexa HIS para purificación. La purificación se inició a partir de extractos periplásmicos de células E. coli.
Para la glucosilación de ClfA 327, se emplearon los sistemas de expresión optimizados previamente de CP5-EPA. Usando el sistema de 2 plásmidos (SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 11), células E. coli (W3110 AwecAwzzE ArmlB-wecG AwaaL) que comprenden el grupo quimérico CP5 y pglB (casete de expresión constitutiva) así como el plásmido de expresión para ClfA 327 (bajo el control del promotor ParaBAD) se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 1 l en medio LB. Un cultivo de una noche se diluyó a una DO600 nm= 0,05. A una DO600nm de aproximadamente 0,5, la expresión de ClfA se indujo mediante la adición de arabinosa (0,2 % de concentración final). Las células se cultivaron durante 20 horas. Las células se sedimentaron por centrifugación; las células se lavaron y se suspendieron en 0,2 vol de tampón de sacarosa, se sedimentaron y se lisaron por choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. ClfA-CP5 se eluyó mediante imidazol 0,5 M, se separó mediante SDS PAGE y se tiñó con Coomassie, o se transfirió a membranas de nitrocelulosa y se sondeó con antisuero anti-His o anti-CP5. La figura 14E muestra los resultados obtenidos usando la variante de ClfA con el sitio de glucosilación insertado alrededor de la posición de aminoácido 327 de la proteína (SEQ ID NO: 11). Muestran la formación de ClfA mediante tinción con Coomassie y transferencia de tipo Western, con anti-His y glucoconjugado (CP5-ClfA) mediante transferencia de tipo Western utilizando antisueros anti-CP5.
Ejemplo 7: Actividad de CP5-EPA como vacuna glucoconjugada
Las células W3110 AwaaL AwecAwzzECA::cat que comprenden el grupo quimérico CP5 (SEQ ID NO: 3) con cap5K en el interior, la proteína PglB (SEQ ID NO: 27) y EPA con 2 sitios de glucosilación de señal en pEC415 (Se Q ID NO: 13) se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 1 l en medio LB. Un cultivo de una noche se diluyó a DO600nm de 0,05. A una DO600nm de aproximadamente 0,5, la expresión de EPA y PglB se indujo mediante la adición de arabinosa (concentración final del 0,2 %) e IPTG 1 mM, respectivamente. Las células se cultivaron durante 20 horas. Las células se sedimentaron por centrifugación; las células se lavaron y se suspendieron en 0,2 vol de tampón de sacarosa, se sedimentaron y se lisaron por choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. La EPA glucosilada y no glucosilada se eluyó de la columna de afinidad mediante imidazol 0,5 M y se cargó en una columna de intercambio aniónico de SourceQ. El EPA glucosilado se separó del EPA no glucosilado aplicando un gradiente de concentración creciente de NaCl. Las cantidades de proteína eluida se determinaron mediante el ensayo de BCA y, basándose en el tamaño de las bandas obtenidas en SDS PAGE teñidas por Coomasie, se calculó la masa teórica del azúcar. Junto con la determinación de proteínas, la cantidad de antígeno polisacárido se estimó en la preparación. Esta cuantificación estimada se confirmó mediante un procedimiento de alta masa de Maldi MS (véase la figura 14A).
Para medir la inmunogenicidad de CP5-EPA en animales vivos, se inyectó 1 |jg del glucoconjugado purificado en ratones por vía IP (intraperitoneal) en presencia de hidróxido de aluminio como adyuvante los días 1 (primera inyección), 21 (segunda inyección) y 56 (tercera inyección). Después de 35 y 61 días, que fueron dos semanas después de la segunda y tercera inyección, respectivamente, la respuesta de IgG fue medido mediante ELISA usando una CP5 modificada con poli-L-lisina para recubrimiento (Gray, B.M. 1979. ELISA methodology for polysaccharide antigens: protein coupling of polysaccharides for adsorption to plastic tubes. J. Immunol. 28:187-192). La sangre de ratones inmunizados con cP5-bioconjugado se analizó para anticuerpos IgG específicos contra el polisacárido capsular CP5. La figura 15A presenta los títulos de IgG provocados por CP5-EPA en ratones. Las placas de ELISA se recubrieron con CP5 modificada con poli-L-lisina, la respuesta de IgG en ratones inmunizados dos veces (segunda barra (vacía) en cada dilución) o tres veces (primera barra (diagonales posteriores) en cada dilución) con CP5-EPA se midió por triplicado. Las señales obtenidas con los sueros preinmunes como control están indicadas por la tercera barra (diagonales hacia atrás) en cada dilución. La respuesta de IgG en ratones se midió con proteína G conjugada con fosfatasa alcalina. Como se muestra en la figura 15a , el bioconjugado CP5-EPA produjo un título de anticuerpos en suero de 6,4 x 103. Los resultados presentados en la figura 15A muestran que CP5-EPA aumenta los anticuerpos específicos de CP5 en ratones. Este experimento muestra que el bioconjugado producido en E. coli es inmunogénico en ratones.
Se realizó un experimento similar en conejos como organismo huésped. Se inyectó CP5-EPA (15 jg de CP5) en conejos intradérmicos en presencia de adyuvante completo de Freund el día 1 y subcutáneamente en presencia de adyuvante incompleto de Freund los días 20, 30 y 40. Después de 61 días, la respuesta de IgG fue medido mediante ELISA usando una CP5 modificada con poli-L-lisina para recubrimiento (Gray, B.M. 1979. ELISA methodology for polysaccharide antigens: protein coupling of polysaccharides for adsorption to plastic tubes. J. Immunol. 28:187-192). La figura 15B presenta títulos de IgG elevados mediante CP5-EPA en conejos. Los resultados presentados en la figura 15B muestran que CP5-EPA aumenta los anticuerpos específicos de CP5 en conejos. La respuesta inmune al bioconjugado CP5-EPA es la segunda barra (diagonales hacia adelante) en cada dilución. Los sueros de control incluyen suero absorbido específico de CP5 producidos para matar S. aureus (extractos de WC, primera barra (puntos) en cada dilución) y suero preinmune (tercera barra (vacía) en cada dilución). El suero de conejos inmunizados con diversos antígenos se analizó en busca de anticuerpos específicos contra CP5 purificado. Las placas se recubrieron con CP5 modificado con poli-L-lisina. Las señales obtenidas con los sueros preinmunes como control están indicadas por la tercera barra (diagonales hacia atrás) en cada dilución. La respuesta de IgG de conejo se midió con proteína G conjugada con fosfatasa alcalina por triplicado. El bioconjugado CP5-EPA provocó un título de 1 x 106, que fue 4 veces más alto que el título de suero de control (preparado por inmunización con S. aureus completa muerta y luego se absorbió con Wood 46 y un mutante acapsular isogénico tripsinizado, de modo que el antisuero se convirtió en específico para CP5). Este experimento muestra que el bioconjugado fue capaz de provocar una respuesta de IgG específica de CP5 de alto título.
Ejemplo 8: Actividades funcionales de anticuerpos de CP5
Actividad in vitro
El antisuero policlonal de conejo cultivado como se describe en el Ejemplo 7 se purificó mediante una columna de afinidad de proteína A para enriquecer los anticuerpos específicos de IgG. Se analizó la IgG de conejos inmunizados con el bioconjugado CP5-EPA de S. aureus para determinar la actividad funcional en un ensayo de destrucción opsonofagocítica in vitro clásico (Thakker, M., J.-S. Park, V. Carey y J. C. Lee. 1998. Staphylococcus aureus serotype 5 capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model. Infect Immun 66:5183-5189). S. aureus se cultivó durante 24 horas en agar Columbia 2 % de NaCl. Las bacterias se suspendieron en medio mínimo esencial BSA al 1 % (MEM-BSA). Los PMN (neutrófilos polimorfonucleares) se aislaron de sangre humana fresca, se lavaron, se contaron y se suspendieron en MEM-BSA. Las preparaciones de IgG purificadas de conejos inmunizados con cualquiera de S. aureus CP5-EPA o como control de preparaciones de IgG purificadas de conejos inmunizados con Shigella O1-EPA que se ha purificado tal como se describe en WO 2009/104074 se añadieron al ensayo en diluciones en serie de 10 veces preparadas en MEM-BSA. Se utilizó suero de cobaya (Pel-Freez) como fuente de C'. Cada ensayo (0,5 ml del volumen total) contenía~5 x 106 PMN, 1 x 106 UFC de S. aureus, 0,5 % a 1 % de suero de cobaya y concentraciones variables de IgG, que van desde 140 jg/m l a 1 jg/ml. Las muestras de control contenían 1) S. aureus incubado con C' y PMN, pero sin anticuerpos; 2) S. aureus incubado con IgG y C', sin PMN; y 3) S. aureus solo. Las muestras se rotaron de extremo a extremo (12 rpm) durante 2 horas a 37 °C. Las diluciones de muestra se agitaron en vórtice en agua estéril, y se estimó la muerte bacteriana sembrando las muestras diluidas por duplicado en TSA. El porcentaje de muerte se definió como la reducción en UFC/ml después de 2 horas en comparación con la del tiempo cero.
En el primer conjunto de experimentos, la muerte opsonofagocítica de la cepa de S. aureus sensible a meticilina (MSSA) Reynolds, se analizó el aislado CP5 prototipo y los resultados se muestran en la figura 16A. La actividad opsónica de anticuerpos frente a CP5-EPA producida en conejos se probó frente a la S. aureus serotipo 5 cepa Reynolds. Los anticuerpos CP5-EPA fueron opsónicos hasta una concentración de 1,4 pg/ml, mientras que los anticuerpos O1-EPA mostraron poca actividad opsónica a 140 pg/ml. Un suero de control positivo producido contra extractos de células enteras de S. aureus (obtenido de J. C. Lee en el Departamento de Medicina, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, EE.UU.) mostró actividad similar a la del suero anti-CP5-EPA (antisuero WC al 1 %).
Como se muestra en la figura 16A, los PMN destruyeron entre 65-75 % de S. aureus Reynolds cuando se incubaron con anticuerpos contra CP5-EPA y 1 % de suero de cobaya con actividad del complemento. El antisuero se usó en un 1 % final en el ensayo, y el 89 % del inóculo de S. aureus fue destruido en estas condiciones. Se observó poca destrucción cuando S. aureus fue opsonizado por C' solo (1 % de suero de cobaya) o anticuerpos y C' sin PMN. Los datos mostrados son la media de 2 a 5 experimentos. Todas las muestras representadas gráficamente incluyeron suero de cobaya C' y no se observó destrucción en ausencia de C'. Ni los anticuerpos solos ni el complemento solos fueron opsónicos, y este elemento es característico de los patógenos bacterianos encapsulados. Por el contrario, los anticuerpos provocados por la vacuna de control (antígeno Shigella O1 acoplado a EPA) no mostraron actividad opsónica, incluso en presencia de C'. Como control positivo en este ensayo, también se analizó el antisuero de conejo específico de CP5 (obtenido de J. C. Lee en el Departamento de Medicina, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, EE.UU.). Estos datos muestran que los anticuerpos producidos para el bioconjugado CP5-EPA mostraron actividad opsónica contra S. aureus encapsulado que es comparable a los anticuerpos CP5 con actividad opsónica documentada (Thakker, M., J.-S. Park, V. Carey y J. C. Lee. 1998. Staphylococcus aureus serotype 5 capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model. Infect Immun 66:5183-5189).
La actividad opsónica de los anticuerpos frente a CP5-EPA se evaluó frente a la cepa MRSA USA100 de CP5-EPA. La figura 16B presenta los resultados de la actividad opsónica de IgG y C' analizada contra la cepa de S. aureus USA100, un aislado CP5+ y se denomina NRS382. Los datos mostrados son la media de 2 a 5 experimentos. Todas las muestras representadas gráficamente incluyeron suero de cobaya C' y no se observó destrucción en ausencia de C'. Como se muestra en la figura 16B, el 60 % del inóculo USA100 se destruyó mediante PMN incubados con un 0,5 % de complemento de cobaya y concentraciones de CP5-EPA IgG que oscilaban entre 100 y 1 pg/ml. Se observó una muerte mínima en ausencia de PMN o cuando se omitió IgG del ensayo. No se logró ninguna destrucción cuando se añadió IgG producida frente a la vacuna conjugada O1-EPA a los PMN+ C' (las bacterias se multiplicaron en esta muestra). Se observó poca destrucción cuando S. aureus se opsonizó con C' solo o con anticuerpos y C' sin PMN. Por lo tanto, los anticuerpos CP5-EPA fueron opsónicos en concentraciones que varían de 100 a 1 pg/ml, mientras que los anticuerpos O1-EPA mostraron poca actividad opsónica a 100 pg/ml. Este experimento muestra que los anticuerpos CP5-EPA exhiben actividad opsónica contra las cepas MSSA y MRSA.
Actividad in vivo
Para determinar si la actividad opsónica de IgG producida frente a la vacuna bioconjugada CP5-EPA predeciría la protección en un modelo murino de infección por estafilococos, se realizaron experimentos de inmunización pasiva. En los estudios iniciales, se inyectó en ratones machos Swiss-Webster (~6 semanas de edad) por vía intravenosa (vena de la cola) de 1,4 a 2 mg de IgG de conejos inmunizados con CP5-EPA o O1-EPA de Shigella. Después de 24 horas, se expuso a los ratones por vía intraperitoneal (i.p.) a ~3,6 x 107 UFC de S. aureus Reynolds. Los niveles de bacteriemia se midieron 2 horas después de la exposición para evaluar el aclaramiento mediado por anticuerpos de la bacteriemia. El límite inferior de detección por cultivo fue de 5 UFC/ml de sangre. La figura 17A muestra los niveles de bacteriemia resultantes. Cada punto representa un hemocultivo cuantitativo realizado por punción de la vena de la cola en un ratón individual 2 horas después de la inoculación bacteriana. Las líneas horizontales representan la mediana de los valores de UFC/ml. Los círculos vacíos son muestras de sangre de ratones que obtuvieron anticuerpos anti-CP5-EPA, los círculos rellenos negros son muestras de animales que recibieron una preparación de anticuerpos de control que se generó contra EPA conjugada con un glucano diferente (O1 de S. dysenteriae). Los resultados de la figura 17A muestran que los ratones que recibieron anticuerpos CP5 mostraron una reducción significativa (P = 0,0006 mediante análisis de Mann-Whitney) en los niveles de bacteriemia en comparación con los ratones que recibieron los anticuerpos específicos de O1. De hecho, la reducción de las UFC/ml de sangre fue del 98 % en ratones inmunizados pasivamente con CP5-EPA frente a ratones a los que se administró IgG de O1-EPA.
En posteriores experimentos de inmunización pasiva, los ratones se expusieron i.p. con un inóculo inferior (~5,5 x 106 UFC /ratón) de S. aureus Reynolds. La inmunización pasiva con anticuerpos frente a CP5-EPA se analizó en ratones expuestos i.p. con 5-6 x 106 UFC de S. aureus Reynolds. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa (i.v.) 2 mg de IgG de CP5-EPA o IgG de O1-EPA 24 horas antes de la exposición a bacterias. La figura 17B muestra los niveles de bacteriemia resultantes. Cada punto representa un hemocultivo cuantitativo realizado por punción de la vena de la cola en un ratón individual 2 horas después de la inoculación bacteriana. Las líneas horizontales representan la mediana de los valores de UFC/ml. Los círculos vacíos son muestras de sangre de ratones que obtuvieron anticuerpos anti-CP5-EPA, los círculos rellenos negros son muestras de animales que recibieron una preparación de anticuerpos de control que se generó contra EPA conjugada con un glucano diferente (O1 de S. dysenteriae). Como se muestra en la figura 17B, los ratones que recibieron 2 mg de IgG frente a CP5-EPA tuvieron niveles de bacteriemia significativamente menores (P <0,0001 según el análisis de Mann-Whitney) que los animales que recibieron 2 mg de IgG O1-EPA. De hecho, 6 de 7 ratones inmunizados pasivamente con anticuerpos frente a CP5-EPA presentaron hemocultivos estériles (límite inferior de detección de 6 a 30 UFC/ml de sangre, dependiendo del volumen de sangre recogido y sembrado de cada ratón). La reducción en los niveles de bacteriemia atribuibles a los anticuerpos CP5 fue del 98 %, en comparación con los ratones de control que recibieron IgG de O1-EPA.
Para determinar si la protección contra la bacteriemia podría ser conferida por un nivel más bajo de IgG, se realizó un experimento posterior en el que los ratones se inmunizaron pasivamente por vía i.v. con 300 |jg de IgG frente a CP5-EPA u O1-EPA. Después de 24 horas, se inoculó a los ratones i.p. con 6 x 106 UFC de S. aureus Reynolds. El límite inferior de detección por cultivo fue 13-67 UFC/ml de sangre. La figura 17B muestra los niveles de bacteriemia resultantes. Cada punto representa un hemocultivo cuantitativo realizado por punción de la vena de la cola en un ratón individual 2 horas después de la inoculación bacteriana. Las líneas horizontales representan la mediana de los valores de UFC/ml. Los círculos vacíos son muestras de sangre de ratones que obtuvieron anticuerpos anti-CP5-EPA, los círculos rellenos negros son muestras de animales que recibieron una preparación de anticuerpos de control que se generó contra EPA conjugada con un glucano diferente (O1 de S. dysenteriae). Como en la figura 17B, los resultados de la figura 17C muestran que la protección mediada por anticuerpos CP5 contra la bacteriemia se logró con esta menor dosis de anticuerpo. Se logró una reducción del 98 % en los niveles de bacteriemia por los anticuerpos provocados por la vacuna bioconjugada de CP5, y 8 de 9 ratones tuvieron hemocultivos estériles en comparación con 0 de 8 ratones que recibieron anticuerpos frente a O1-EPA de Shigella.
Ejemplo 9: Inmunización activa en ratones
Para mostrar que la vacunación de ratones con el bioconjugado CP5-EPA media la protección contra la exposición bacteriana como en el ensayo de inmunización pasiva, se realizaron estudios de inmunización activa.
El bioconjugado CP5-EPA se produjo en E. coli W3110 AwaaL AwecAwzzE::cat mediante coexpresión del grupo de gen CP5 quimérico (SEQ ID NO: 3), PglB (SEQ ID NO: 27) del plásmido pEXT21 y EPA (que contiene dos sitios de glucosilación, SEQ ID NO: 13) a partir de plásmidos separados. Las células se cultivaron en un biorreactor con un volumen inicial de 7 l en un medio semiduro que contenía glicerol, peptona y extracto de levadura como fuentes de C. Las células se cultivaron en modo discontinuo o discontinuo pulsado a una DO600nm de 30 y se indujo la expresión de PglB y EPA mediante la adición de IPTG 1 mM y arabinosa al 10 %. Tras la inducción, las células se cultivaron adicionalmente en modo semicontinuo durante un período de 15 horas en condiciones limitantes de oxígeno y se recogieron por centrifugación. Las células se lavaron y resuspendieron en tampón de sacarosa al 25 % a una DO600 nm = 200, se sedimentaron y se lisaron por choque osmótico. Los esferoplastos se sedimentaron por centrifugación y las proteínas periplásmicas se cargaron en una cromatografía de afinidad de Ni2+. La EPA glucosilada y no glucosilada se eluyó de la columna de afinidad mediante imidazol 0,5 M y se cargó en una columna de intercambio aniónico de SourceQ. El EPA glucosilado se separó del EPA no glucosilado aplicando un gradiente de concentración creciente de NaCl.
Se pretende usar CP5-EPA como una vacuna conjugada para proteger contra cepas de CP5 S. aureus. Para analizar si tal inmunización activa es funcional, se inmunizaron diferentes grupos de ratones Swiss Webster hembra con tres dosis diferentes de CP5-EPA y se analizó la inmunización usando un modelo de bacteriemia. Se inyectaron tres dosis por vía subcutánea los días 0, 14 y 28. Se expuso por vía intraperitoneal a los ratones el día 42 con la cepa JL278 de S. aureus, como se muestra en la figura 18. Se inmunizaron cinco grupos de ratones con tres dosis diferentes de CP5-EPA como se indica debajo del eje x (círculos de puntos; círculos vacíos; y diagonales hacia atrás en círculos). Dos grupos de control recibieron adyuvantes (diagonales hacia adelante en círculos) o PBS (círculos rellenos de negro) solos. Cada punto representa una muestra de sangre de un solo ratón. La dosis más baja de vacuna (0,2 jg ) indujo protección en todos los ratones del grupo. Dos horas después de la prueba, se analizaron muestras de sangre para la formación de ufc y anticuerpos anti-CP5 mediante ELISA usando una CP5 modificada con poli-L-lisina para el revestimiento (Gray y col. (1979)). En todos los grupos inmunizados con CP5-EPA, se observó una reducción media de UFC en sangre. Sin embargo, solo en el grupo que recibió la menor dosis de vacuna, hubo una protección general contra la bacteriemia en los cinco ratones. El análisis de sangre para anticuerpos anti-CP5 dio como resultado una correlación positiva de la protección y los títulos medios en el ELISA en los diferentes grupos de ratones. Los resultados presentados en la figura 18 indican que los anticuerpos indujeron la protección contra la bacteriemia en ratones inmunizados.
Estos estudios indican que la vacuna bioconjugada CP5-EPA indujo anticuerpos que opsonizaron S. aureus para la destrucción fagocítica por PMN humanos y ratones protegidos contra bacteriemia en estudios de inmunización positivos y activos. Estos datos proporcionan una fuerte evidencia de que el bioconjugado presentado protegerá contra la enfermedad provocada por múltiples cepas de S. aureus.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un organismo procariota huésped gramnegativo que es E. coli, que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una bacteria Grampositiva, que es S. aureus; una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una bacteria Gramnegativa, que es P. aeruginosa; una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; y una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacaril transferasa.
2. El organismo procariota huésped de la reivindicación 1, en el que dicho S. aureus es una cepa de polisacárido capsular 5.
3. El organismo procariota huésped de la reivindicación 1, en el que dicho S. aureus es una cepa de polisacárido capsular 8.
4. El organismo procariota huésped de la reivindicación 1-3, en el que dicha proteína es exotoxina de P. aeruginosa, alfa hemolisina de S. aureus o factor de aglutinación A de S. aureus.
5. Un procedimiento de producción de una vacuna bioconjugada en un organismo procariota huésped bacteriano gramnegativo, que comprende:
(i) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de un primer organismo procariota que es una bacteria grampositiva de S. aureus;
(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glucosiltransferasa de una segunda especie procariota que es el grupo de antígeno O de una bacteria gramnegativa de P. aeruginosa;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína transportadora, en la que dicha proteína transportadora comprende la secuencia consenso de aminoácidos D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; y
(iv) una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacaril transferasa; que comprende a) una etapa de producción de un polisacárido capsular modificado en undecaprenol (Und) en dichas bacterias gramnegativas y b) una etapa de unión del antígeno de polisacárido capsular a un transportador proteico.
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