KR20100119905A - 원핵 숙주에서의 재조합 글리코실화 단백질 생산 방법 및 생산계 - Google Patents

원핵 숙주에서의 재조합 글리코실화 단백질 생산 방법 및 생산계 Download PDF

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아이드게노쉬쉐 테흐니쉐 호흐슐레 쥬리히
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Abstract

본 발명은 재조합 N-글리코실화 표적 단백질의 생산방법 및 생산계에 관한 것이다. 상기 생산계는 표적 단백질의 요청된 N-글리코실화 수행할 수 있는 대사 기구를 암호화하는 유전 정보가 도입되는, 원핵생물 유기체(예를 들어, Escherichia coli)를 포함한다. 상기 원핵생물 유기체는 또한 하나 이상의 재조합 단백질의 발현에 요구되는 유전 정보를 함유한다. 대사 기구는 바람직하게는 지질 담체 상에서 올리고당의 조립을 위한 특이적 글리코실트랜스퍼라제 및 원하는 단백질의 특이적 잔기에 이 올리고당이 공유결합으로 연결된 OTase를 포함한다.

Description

원핵 숙주에서의 재조합 글리코실화 단백질 생산 방법 및 생산계 {SYSTEM AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT GLYCOSYLATED PROTEIN IN A PROKARYOTIC HOST}
본 발명은 재조합 인간 및/또는 동물 및/또는 식물 및/또는 원핵 및/또는 균류 당단백질의 생산방법 및 발현계에 관한 것이다. 이러한 당단백질은 이들 유기체에서 일반적으로 생산된 당단백질에 대한 그들의 동일한 구조때문에 인간 또는 동물 또는 식물에 대한 영양소 또는 약제로 제공될 수 있다.
글리코실화 반응은 진핵세포에서 모든 번역후 단백질 변형에 가장 중요한 것 중 하나를 이루고, 기능, 구조, 물리적인 특성 및 특이적 단백질의 표적화에 대한 많은 효과를 가질 수 있다. 일반적으로, 탄수화물 모이어티(moiety)는 단백질의 구조 및 물리화학적인 특징 모두에서 현저한 효과를 갖는 것으로 간주되고, 그것의 효소적인 활성, 항원성 또는 열적 안정성에 영향을 줄 수 있다. 당은 아스파라긴(N-배당체 결합)의 ε-아민기 또는 세린 또는 트레오닌(O-배당체 결합) 잔기의 히드록실기를 통하여 연결될 수 있다.
N-연결된 단백질 글리코실화 반응은 진핵세포에서 발견된 가장 일반적인 단백질 변형이다. 복합 글리코실화 반응 과정은 지질 담체 돌리칠피로포스페이트(dolichylpyrophosphate) 상에 올리고당의 조립체(assembly)를 갖는 소포체(endoplasmatic reticulum, ER)의 세포질 면에서 시작한다[Burda, P. and Aebi, M. (1999) The Dolichol pathway of N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta, 1426, 239-257]: 2개의 N-아세틸글루코사민 및 5개의 만노스 잔기는 단계적 방식으로 이 지질에 부착된다. 그 다음, 지질 연결 올리고당(LLO)는 ER의 내강으로 넘겨지고, 여기서 4개의 만노스 및 3개의 글루코스 잔기의 추가로 전체 길이의 LLO가 얻어진다. 상기 과정의 중심 반응에서, 이 올리고당은 새로이 합성된 폴리펩티드의 선별된 아스파라긴 잔기로 이동된다. 이 반응은 ER의 내강에서 올리고사카릴 트랜스퍼라제(OTase)에 의해 촉진된다. OTase는 8개 이상의 서브유니트의 복합체이고 이 효소는 N-배당체 결합 형성의 원인이 된다. 여전히 ER에 있는 동안, 세 개의 글루코스 및 한 개의 만노스 잔기는 당단백질의 올리고당으로부터 빠르게 제거된다. 그 다음, 당단백질은 골지 기구로 운송되고, 여기서, 추가의 트리밍(trimming) 및 당 모이어티의 추가가 그들이 그들의 최종 목적지를 표적화하기 전에 발생한다[Varki, A, Cummings, R., Esko, J., Freeze, H., Hart, G. and Marth, J. (1999) Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]. LLO 합성이 진핵세포에서 고도로 보존된 과정인 반면에, 골지에서의 변형은 종-특이적일 뿐만 아니라 세포 타입-특이적이고, N-연결된 올리고당의 구조에 관해서는 높은 등급의 다양성을 이끈다.
종래 기술
다양한 이종성 발현계에서의 인간 단백질의 생산은 연구 목적뿐만 아니라 약제학적인 응용을 위한 재조합 단백질을 생성하는 데에 중요한 기술이다. 생산에 유용한 통괄적인 발현이 없다는 것이 일반적으로 인식된다. 그러므로, 이종성 단백질의 발현을 위한 세포 타입의 선별은 많은 요인에 의존한다. 이것들은 관심의 단백질의 세포 성장 특성, 발현 수준, 세포내 또는 세포외 발현 및 생물학적인 활성뿐만 아니라 그것의 의도된 용도와 같은 기준을 포함한다. 하지만, 고려되어야 할 가장 중요한 기준 중 하나는 단백질이 그것의 응용을 위하여 글리코실화될 필요가 있는가 없는가이다. 많은 인간 치료제는 당단백질이고, 한정된 올리고당과 폴리펩티드의 번역후 변형의 중요성은 많은 생물학적인 현상에서의 그들의 관련에 의해 잘 기록된다.
포유동물 당단백질에서, 대부분의 N-글리칸은 복합체 타입, 즉 그들은 2개의 N-아세틸글루코사민 및 3개의 만노스 잔기의 5당류 핵심(core)을 구성한다. 이 핵심은 원래는 돌리칠피로포스페이트로부터 단백질로 이동하는 올리고당의 잔류 구조이다. 골지에서, 그것은 추가적인 N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 시알산 및 흔히 푸코스 잔기를 포함하는 안테나(antennae)와 함께 추가로 변형된다. 그것으로 인하여 인상적인 복합 올리고당 구조의 굉장한 다양성이 가능하다. 복합 N-글리칸의 중요성 및 이들 구조의 본질적인 역할은 이들 복합-타입 N-글리칸을 합성할 수 없는 녹-아웃(knock-out) 마우스를 사용하는 실험에서 나타난다. 이들 마우스는 1년안에 죽는다. 최근에는, 글리코실화 반응의 선천적인 장애(CDG)는 인간에서도 기재되고 있고, 이것은 N-글리칸 생성에서의 결합에 의해 특성화된 선천적인 다중-전신의 질병군이다. 이들 장애는 폭넓고 다양한 임상적인 특징, 신경계 성장장애, 정신운동 지연, 이형 특징(dysmorphic feature), 근육긴장저하, 응고장애 및 면역결핍과 같은 특징으로 나타내어진다. 특징들의 광범위한 스펙트럼은 배아성장, 분화, 세포 기능의 유지 중에 N-당단백질의 결정적인 역할을 반영하고, 올바른 올리고당 구조의 중요성을 강조한다.
대부분의 치료학적으로 적절한 단백질이 그들의 천연 타입에서 글리코실화되므로, 그들은 또한 올바른 생물학적인 활성을 갖기 위하여 재조합 단백질로서 글리코실화되어야 할 것이다. 그러므로, 생성물 안정성, 효율성 및 일관성(consistency)을 보증하기 위해서, 재조합 단백질의 속성(quality) 조절에서 글리코실화 반응 패턴을 관측하는 것이 점점 중요해지고 있다. 글리코실화 단백질 발현계가 개발되었다. 가장 일반적으로 사용되는 것은 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포주[Grabenhorst, E., Schlenke, P., Pohl, S., Nimtz, M. and Conradt, H.S. (1999) Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the glycosylation pathway in mammalian host cells. Glycoconjugate Journal, 16, 81-97], 곤충 세포[Altmann, F., Staudacher, E., Wilson, I.B. and Marz, L. (1999) Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins, Glycoconjugate Journal, 16, 109-123] 또는 균류 세포[Malissard, M., Zeng, S. and Berger, E.G. (1999) The yeast expression system for recombinant glycosyltransferases. Glycoconjugate Journal, 16, 125-139. or Maras, M., van Die, I., Contreras, R. and van den Hondel, C.A.(1999) Filamentous fungi as production organisms for glycoproteins of bio-medical interest. Glycoconjugate Journal, 16, 99-107]이다. 이들 세포주는 단백질을 글리코실화하는 모든 능력을 갖지만, 재조합 당단백질의 생산에서 중대한 차이점을 보인다. 상기와 같이, LLO의 합성 및 폴리펩티드로의 올리고당의 이동은 모든 진핵세포에서 고도로 보존된 메카니즘인 반면에, 골지에서의 N-글리칸의 추가 과정 및 트리밍은 세포 타입 및 생물 사이에서 다양하다. 그러므로 재조합 당단백질의 최종 구조는 사용된 생산 세포에 따라 정의된다. CHO 세포는 재조합 당단백질의 발현에 일반적으로 사용되는 포유동물 세포주이다. 그들은 복합 타입 N-글리칸을 합성할 수 있지만, 일부 인간 조직-특이적인 말단 당 잔기는 그들이 적합한 글리코실트랜스퍼라제를 발현하지 않으므로 이들 세포에 의해 합성되지 않는다. 그러므로, 숙주세포주는 이들 글리코실트랜스퍼라제의 도입을 갖는 유전공학으로 향상되어야 한다.
곤충 세포[WO 00/52135 참조] 또한 강력한 바큘로바이러스(baculovirus)-기저 유전자 발현 벡터로 감염되는 경우에 관심 단백질의 많은 양을 합성할 수 있고, 포유동물 세포에 의해 제공된 것들에 유사한 번역후 변형을 제공할 수 있기 때문에 재조합 단백질을 생산하는 데에 폭넓게 사용된다. N-글리코실화 반응 경로는 핵심 5당류의 형성까지의 포유동물 경로와 상응한다. 하지만, 일반적으로 곤충 세포는 골지에서 추가적인 트랜스퍼라제를 발현하지 않으므로, 생산된 N-글리칸은 포유동물 세포에서 발견된 바와 같이 복합 타입 대신에 단축(파우시만노스(paucimannose)의)된다.
균류, 특히 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 진핵세포의 이종성 단백질의 생산에 대하여 적합한 숙주 유기체이다. 이들 생산계는 분자 및 유전학적인 조작을 위한 잘 알려진 기술과 결합하고, 세포는 성장하기 쉽고, 그들은 단백질 글리코실화 반응과 같은 복합 번역후 변형에 대한 능력을 가지고 있다. 동물 세포와 대조적으로, 균류는 골지에서 올리고당을 트리밍하지 않는 것인 대신에 최대 200개의 만노스 유니트로 만난(mannane)의 추가에 의해 직접적으로 그것을 연장한다. 일부 당단백질은 이러한 변경을 벗어나고, 그들의 성숙분열은 더욱 제한되고, 최대 13개의 만노스 잔기를 가진 짧은 코어 타입의 올리고당을 제공한다.
진핵세포에서 N-글리코실화 반응의 이들 세 개의 실시예는 N-글리칸의 구조에서의 차이를 강조한다. 기능에서의 관련성은 구조의 정확한 분석이 핵심적이라는 것을 밝힌다. 탄수화물 구조의 분석에서 현저한 전진은 최근에 이루어지고 있다. 특히 질량 분광법(온-라인 ESI-MS, 나노스프레이 탠덤 질량 분석법(ESI-MS/MS) 및 향상된 MALDI/TOF 기술)에서, 글리코실화 반응 분석에 대한 매우 민감한 기계 사용이 이용가능해지고 있다.
종래 기술의 문제점
재조합 당단백질에서 고도로 한정된 올리고당의 중요성은 당단백질을 생성하기 위하여 현재에 사용되는 생물공학적인 과정의 무력함에 뚜렷하게 대조한다. 이것은 단백질-연결된 올리고당의 구조가 사용된 사용 타입에 의해 직접적으로 결정되고 모든 진핵세포 생산계가 이 특이성을 나타낸다는 사실에 기인한다. 규정된 올리고당이 생산되는 방식으로 진핵세포 생산 세포주를 유전학적으로 공작하는 것이 가능할 것이다. 하지만, 진핵세포의 골지 부분에서 글리코실트랜스퍼라제 활성의 과잉은 이러한 접근이 매우 어렵게 한다. 진핵 세포 발현계의 사용에서의 추가 문제점은 하기와 같다: 일반적으로, 포유동물 발현계는 송아지 혈청을 함유하는 성장 배지의 사용에서 그것의 결점을 가진다. 이것은 소의 해면뇌병증(BSE)과 가능한 오염 때문에 생물안정성에 관한 염려를 일으킨다. 더구나, 인간 세포주 배양은 무균상태를 유지하는 것이 매우 많이 어렵고, 이들 세포는 느리게 성장하고 고비용의 과정 조절을 필요로 한다. 상기와 같이, 합성된 특이적 당단백질은 사용된 세포주 또는 세포 타입에 직접적으로 의존한다. 다시 말하면, 재조합 당단백질은 이종성 생산계가 그것의 기원에서와 같이 N-글리코실화 반응 경로의 동일한 효소를 발현한다면 그것의 기원 N-글리칸으로 변형된다. 그렇지 않으면, 숙주 세포는 골지에서 글리코실화 반응 경로의 유전공학에 의해 적응되어야 하고(도 1b), 이것은 재조합 당단백질의 발현에서의 인간 세포주의 주요 결점을 나타낸다.
바큘로바이러스 발현계의 도움에 의한 곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산의 어려움은 하기와 같다: 바큘로바이러스는 본질적으로 용해성 감염 양식을 가진다, 즉, 생성물이 채취될 때, 숙주세포의 많은 부분은 용해되고 감성된 효소를 방출한다. 추가로, 단백질합성은 감염 세포의 죽음 근처에서 최대이고, 단백질의 전체 공정은 그 때가 차선(suboptimal)일 수 있다. 특히, 원형질 막 또는 분비행으로 예정된 단백질은 분비 경로의 후-번역 기구(machinery)의 구성요소의 고갈에 의해 영향을 받는다. 더구나, 대규모의 곤충 세포 배양은 포유동물 세포에 비하여 세포의 높은 산소 소모 및 높은 절단 민감성으로 인하여 생물공학자에 특이적 도전이 된다. 포유동물에서처럼, N-글리칸의 다른 구조에서 당단백질 잔기의 이종성 발현에서 주요 단점은 상기와 같다. 특히 말단 시알산 잔기의 결핍은 이들 당이 당단백질 생물학에서 중요한 역할을 하기 때문에 해롭다.
요약하면, 3개의 주요 진핵세포 발현계는 원하는 구조의 글리칸을 생산하는 것을 대부분 실패한다. 진핵세포계에 비교하여, 그램-음성적인 박테리아 대장균(Escherichia coli)은 이종성 단백질의 생산에 여러 기술적인 이점을 제공한다. 이것은 가장 오래되고 사용된 가장 생산적인 생산계이다. 하지만, 단백질의 번역후 변형을 진행하는 데에 E. coli 세포의 무능은 인간 단백질의 생산에 적절한 숙주로서 그것의 용도에 대한 가장 강력한 단점을 유지한다.
E. coli에서 재조합 당단백질 생산의 문제점을 극복하기 위하여, 단백질 글리코실화 반응을 얻을 수 있는 대사 기구가 이들 박테리아에 도입된다. 그러므로, 본 발명의 목적은 재조합 단백질, 특히 N-글리코실화 단백질이 생산가능한 발현계를 제공하는 것이다.
첫 번째 관점에 따르면, 본 발명은 재조합 글리코실화 단백질 생산을 위한 숙주 원핵 유기체(host prokaryotic organism) 또는 생산계에 관한 것으로, 생산계는 재조합 인간, 인간-유사, 또는 동물, 또는 식물, 또는 균류, 또는 박테리아의 N-글리코실화 표적 단백질의 생산을 위해 제안되고, 생산계는 표적 단백질의 요청된 N-글리코실화를 실행할 수 있는 대사 기구에 대한 유전 정보 암호화가 도입되는 원핵 유기체(procaryotic organism)를 포함한다. 본 발명에 따른 생산계는 상기 원핵 유기체가 또한 하나 이상의 재조합 표적 단백질의 발현을 위해 요구되는 유전 정보를 포함하는 것을 특징으로 한다.
두 번째 관점에 따르면, 본 발명은 재조합 글리코실화 단백질 생산 방법에 관한 것으로, 여기서 방법은 재조합 인간, 인간-유사, 또는 동물, 또는 식물, 또는 균류, 또는 박테리아의 N-글리코실화 표적 단백질의 생산을 제안하고, 생산계는 표적 단백질의 요청된 N-글리코실화 반응을 실행할 수 있는 대사 기구에 대한 유전 정보 암호화가 도입되는 원핵 유기체를 포함한다. 본 발명에 따른 생산계는 상기 원핵 유기체가 또한 하나 이상의 재조합 표적 단백질의 발현을 위해 요구되는 유전 정보를 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가적인 발명의 특징은 종속항에서 유도된다.
종래 기술을 능가하는 이점
E. coli는 다루기 쉽고 성장시키기 쉽고 그것의 유전적 특징은 매우 잘 알려져 있으므로, E. coli에서의 인간, 인간-유사, 동물 또는 식물 또는 균류 또는 박테리아 당단백질이 생물공학에서 해결책이다.
상기와 같이, 현재까지의 재조합 당단백질은 덜 적합한 진핵세포에서 생산되어야 한다. 하지만, N-당단백질의 합성에서 첫 번째 단계가 모든 유기체에서 고도로 보존될지라도, 추가의 트리밍 및 과정은 진핵세포 사이에서 매우 현저하게 다르다. 그러므로, 재조합 당단백질의 N-글리칸은 사용되는 발현계에서 존재하는 글리코실화 반응 유전자에 의존한다.
이것은 N-글리칸이 원래의 것과 비교하여 구조면에서 다른 재조합 당단백질의 생산을 초래한다.
대조적으로, 일반적으로 단백질을 글리코실화하지 않는 유기체로, 예를 들어, 오페론과 같은, 단백질의 요청된 글리코실화 반응을 수행할 수 있는 대사 기구를 암호화하는 유전 정보의 도입은 특이적인 글리코실트랜스퍼라제를 도입하는 것으로 N-글리칸의 구조를 조작하는 기회를 제공한다.
종전 기술뿐만 아니라 발명에 따른 방법으로부터 알려진 일부 문제점은 본 발명의 전형적인 구현예인 개략적인 도를 인용하여 더욱 상세하게 설명되지만, 본 발명의 범주를 한정하지는 않는다.
도 1은 진핵세포에서 재조합 당단백질의 발현을 나타내는 도면이고, 여기서 도 1a는 표적 당단백질의 발현을 나타내고, 도 1b는 골지에서 존재하는 글리코실화 반응 경로를 유전공학적으로 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 특이적 글리코실화 반응 경로의 도입 및 재조합 표적 단백질의 발현을 갖는 Escherichia coli 발현계를 나타내는 도면이다.
도 3은 도 1 및 도 2에서 당단백질의 올리고당 잔기의 개별 성분을 나타내는 기호의 설명을 나타내는 도면이다.
도 1은 진핵세포 발현계에서 재조합 당단백질의 발현을 나타낸다. 도 1a는 표적 당단백질의 발현을 나타내고, 여기서 지질 연결된 올리고당(LLO; 단계 I)의 조립 및 OTase(단계 Ⅱ)에 의하여 단백질로의 올리고당의 전달은 소포체(ER)에서 고도로 보존된 공정이다. 대조적으로, 골지에서의 변형은 세포 타입 특이적이다(단계 Ⅲ).
도 1b는 다시 표적 당단백질의 발현을 나타내고, 여기서 지질 연결된 올리고당(LLO; 단계 I)의 조립 및 OTase(단계 Ⅱ)에 의해 단백질로의 올리고당의 전달은 ER에서 고도로 보존된 고정이다. 더구나, 골지에서의 존재하는 글리코실화 반응 경로의 유전공학을 수행하는 시도를 나타낸다. 진핵 세포에서 특이적 구조를 갖는 재조합 단백질을 생산하기 위하여, 숙주 세포는 골지에서 이 글리코실화 반응 경로의 유전공학에 의해 적응되어야 한다. "X"-표시는 원하지 않는 경로를 차단하기에 필요한 삭제를 표시한다. "Asn"는 아스파라긴을 나타내고, "PP"는 피로포스페이트, 및 "SO4"는 술페이트기를 나타낸다.
도 1a 및 1b 모두는 재조합 단백질의 발현이 ER 외부에서 수행된(단계 Ib) 다음 이 표적 단백질은 ER으로 들어오게 된다(단계 Ⅱb)는 것을 보여준다. 올리고 당류의 개별적인 성분을 표시하는 기호의 설명은 도 3의 설명으로부터 유도된다.
진핵 세포에서 특이한 올리고당 구조를 가진 재조합 당단백질을 얻는 것은 고도로 복합된, 핵심적인 경로의 재단(tailoring)을 필요로 하고, 이것은 아마도 생산 세포의 생존 능력에 간섭할 것이다. 이것은 E. coli 계에서의 경우가 아니다. 여기서, 재단은 원하는 당단백질을 유도하는 글리코실화 반응 기구의 특이적 구성요소의 도입으로 얻어진다(도 2).
올리고당의 조립에 요구되는 모든 기본적인 구성요소(단당류)가 E. coli 세포에서 존재하므로, 상기 용액은:
a) 지질 담체 상에서 올리고당의 조립을 위한 특이적 글리코실트랜스퍼라제의, 그리고
b) 원하는 단백질의 특이적 잔기에 대한 이 올리고당에 공유결합으로 연결하는 OTase의 도입을 요구한다.
이 용액은 특이적 글리코실트랜스퍼라제의 발현에 의해 올리고당 구조를 디자인할 가능성을 제공하고 생산 세포의 생명기능에 영향을 주지 않는다.
도 2는 재조합 표적 단백질의 발현(단계 Ib)에 이어 당단백질 합성(단계 Ⅱb)에 도입되는, 본 발명에 따른 E. coli 발현계를 나타낸다. E. coli에서 특이적 당단백질을 얻기 위하여, 지질-연결된 올리고당(LLO; 단계 I)의 조립을 위한 특이적 글리코실트랜스퍼라제가 숙주로 도입된다. OTase는 원하는 단백질의 특정 잔기에 이 올리고당을 공유결합으로 연결한다(단계 Ⅱ).
또 다른 시도에서, 도 2에서 기재된 바와 같이 원하는 단백질에 부착되는 올리고당은 생체 외에서 효소 반응에서 기질로서 다른 올리고당을 사용하여 교환될 수 있다. 이것은 아스로박터 프로토포미애(Arthrobacter protophormiae)로부터의 고정된 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제(Endo-A)는 올리고당을 공유결합적으로 연결된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 리보뉴클레아제 B로 이동할 수 있다는 것을 보여준다[Fujita, K., Tanaka, N., Sano, M., Kato, I., Asada, Y. and Takegawa, K. (2000) Synthesis of neoglycoenzymes with homgogenous N-linked oligosaccharides using immobilized endo-β-N-acetylglucosaminidase A. Biochemical and Biophysical Research Communications, 267, 134-138]. 그러므로, 본 발명은 E. coli에서 당단백질을 생산한 다음, 두 번째 단계에서, 생체 외에서 고정된 Endo-A를 가진 한정된 구조의 다른 올리고당으로 그것을 교환하여 단백질에 공유결합적으로 연결된 올리고당을 변형할 가능성을 준다.
본 발명은 글리코실화 당단백질의 생산을 포함한다. 이러한 표적 단백질의 글리코실화 반응으로부터 유래되는 많은 잇점이 있다. 이러한 이점은, 이에 한정하지는 않지만, 단백질의 증가된 생체 내에서의 순환성 반감기; 재조합 단백질의 증가된 수율; 이에 한정되지는 않지만, 효소 활성, 수용체 활성, 결합 능력을 포함하는 단백질의 증가된 생물학적인 활성; 변화된 항원성; 향상된 치료적 특성; 백신 또는 진단도구로서의 증가된 능력 등을 포함한다. 본 발명에서 제공될 수 있고, 인간, 동물 또는 식물의 영양소 또는 약제로서 제공될 수 있는 포유동물 당단백질의 예는, 여기에 한정되지는 않지만, 에리트로포이에틴, 트랜스페린, 인터페론, 면역글로블린, 인터루킨, 플라스미노겐(plasminogen) 및 타이로트로핀(thyrotropin)을 포함한다. 또한, 원핵 및/또는 균류의 당단백질은 본 발명에서 생산될 수 있고, 예를 들어, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni; C. jejuni)가 및 균류로부터의 당단백질과 같은, 인간, 동물 및 식물을 위한 영양소 또는 약제로서 제공될 수 있다. 본 발명에서 생산된 당단백질의 추가 응용은 여기에 한정하지는 않지만 산업 효소, 기능성 식품, 화장품, 포장 재료 및 직물을 포함한다.
실시예
실시예 1
본 발명은 그램-음성적인 박테리아인 C. jejuni가 당단백질을 생산한다는 발견에 기초한 것이다. 알려진 방법을 사용하여, 본 발명자들은 E. coli .로 AcrA, 당단백질을 암호화하는 C. jejuni 유전자를 도입하였다. 이것은 비-글리코실화 AcrA 단백질의 발현을 초래한다(도 2. 단계 Ib 참조). 이어서 다시 공지의 방법을 활용하여, a) 특정 글리코실트랜스퍼라제 및 b) OTase를 암호화하는 C. jejuni의 오페론을 E. coli로 도입하였다. 이것은, 이종성으로 생산된 AcrA 단백질에 고도의 특이적인 렉틴 및 글리코실화 반응 특이적 항체의 결합에 의해 - 항상 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 - 검증된 바와 같이, 본 발명에 따른 특이적으로 글리코실화된 AcrA 단백질의 생산(도 2. 단계 I 및 Ⅱ 참조)을 야기한다[Michael Wacker et al. (2002) N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli (SCIENCE, Vol 298: 1790-1793)]. 더구나, AcrA에 연결된 올리고당의 구조는 질량 분광법으로 증명되었다. 다음은 올리고당이 공통서열(consensus sequence) Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산일 수 있음) 안에서 아스파라긴의 ε-아미노기로만 이동되었다[Gavel, Y. and Von Heijne, G. (1990) Sequence differences between glycosylated and non-glycosylated Asm-X-Ser/Thr/Ser acceptor sites: implications for protein engineering. Protein Eng, 3, 433-442]. 공통서열이 돌연변이화되는 경우, 올리고당은 더 이상 단백질로 이동되지 않는다. 그러므로, C. jejuni의 OTase가 진핵세포 및 원시세균(archaea)의 OTase와 동일한 공통서열을 인식하고, 동일한 제안 메카니즘에 의해 올리고당을 단백질로 이동시킨다는 것이 - 당업자들에게 알려진 방법으로 - 확인되었다[Wacker, M., Linton, D., Hitchen, P.G., Nita-Lazar, M., Haslam, S.M., North, S.J., Panico, M., Morris, H.R., Dell, A., Wren, B.W. and Aebi, M. (2002) N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli . Science, 298: 1790-1793].
E. coli를 유전학적으로 변형하는 데에 활용되는 특이적 글리코실트랜스퍼라제 및 올리고사카릴 트랜스퍼라제는, 글리코실트랜스퍼라제가 도처에 존재하고 올리고사카릴 트랜스퍼라제가 원시세포로부터 알려져 있으므로, 원핵 또는 진핵 기원인 것일 수 있다.

Claims (8)

  1. a) 지질 담체에 올리고당을 조립하는 타입의 글리코실트랜스퍼라제;
    b) 공통서열(consensus sequence) Asn-X-Ser(Thr)을 포함하는 하나 이상의 표적 단백질로서, 상기 X가 Pro 이외의 아미노산일 수 있고, 상기 하나 이상의 표적 단백질이 이의 천연 형태로 글리코실화되는, 하나 이상의 표적 단백질; 및
    c) 상기 하나 이상의 표적 단백질의 공통서열에 올리고당을 연결하는, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 이외의, 원핵 또는 진핵 생물의 올리고사카릴 트랜스퍼라제:
    를 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 글리코실트랜스퍼라제, 하나 이상의 표적 단백질, 또는 올리고사카릴 트랜스퍼라제 중 하나 이상이 숙주 원핵 유기체에 대해 이종성인, 숙주 원핵 유기체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 원핵 유기체가 대장균(Escherichia coli)인, 숙주 원핵 유기체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 숙주 원핵 유기체가 상기 글리코실트랜스퍼라제의 타입에 의해 정해지는 구조를 갖는 N-글리칸을 생산하는, 숙주 원핵 유기체.
  4. 제 1항, 제 2항, 또는 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 숙주 원핵 유기체가 인간, 동물, 또는 식물의 치료용 약제의 생산 또는 약제의 개발을 위한 N-글리코실화 표적 단백질의 생산을 위하여 사용되는 것인, 숙주 원핵 유기체.
  5. 숙주 원핵 유기체로부터 재조합 N-글리코실화 표적 단백질을 생산하는 방법으로서,
    숙주 원핵 유기체에
    a) 지질 담체에 올리고당을 조립하는 타입의 글리코실트랜스퍼라제;
    b) 공통서열 Asn-X-Ser(Thr)을 포함하는 하나 이상의 표적 단백질로서, 상기 X는 Pro을 제외한 아미노산일 수 있고, 상기 하나 이상의 표적 단백질은 천연형으로 글리코실화되는, 하나 이상의 표적 단백질; 및
    c) 상기 하나 이상의 표적 단백질의 공통서열에 올리고당을 연결하는, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 이외의, 원핵 또는 진핵 생물의 올리고사카릴 트랜스퍼라제:
    를 암호화하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하고,
    상기 글리코실트랜스퍼라제, 하나 이상의 표적 단백질, 또는 올리고사카릴 트랜스퍼라제 중 하나 이상이 상기 숙주 원핵 유기체에 대해 이종성인, 생산 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 숙주 원핵 유기체가 대장균(Escherichia coli)인, 생산 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 글리코실트랜스퍼라제의 선별에 의해, 상기 숙주 원핵 유기체가 글리코실트랜스퍼라제의 타입에 의해 정해지는 구조를 갖는 N-글리칸을 생산하는, 생산 방법.
  8. 제 5항, 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 방법이 인간, 동물, 또는 식물의 치료용 약제의 생산 또는 약제의 개발을 위한 N-글리코실화 표적 단백질의 생산을 위하여 사용되는 것인, 생산 방법.
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