JP2005518806A - 原核宿主における組換えグリコシル化タンパク質産生のためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組換えヒトおよび/または動物および/または植物および/または原核生物および/または真菌糖タンパク質の産生のための発現システムおよび方法に関する。かかる糖タンパク質は、上記のような生物において通常産生される糖タンパク質と同一の構造を有するためにヒトまたは動物または植物のための栄養または医薬として役立つ。
グリコシル化は真核細胞におけるすべての翻訳後タンパク質修飾のなかでもっとも重要なものの1つを構成し、特定のタンパク質の機能、構造、物理的性質および標的化に対して様々な作用を有する。一般に、炭水化物部分はタンパク質の構造と物理化学的特性の両方に重要な作用を有すると考えられており、その酵素活性、抗原性または熱安定性に影響を及ぼす。糖はアスパラギンのε−アミン基を介して(N−グリコシド結合)またはセリンまたはスレオニン残基のヒドロキシル基を介して(O−グリコシド結合)結合できる。
様々な異種発現システムでのヒトタンパク質の産生は研究目的および医薬用途の組換えタンパク質を作成するための重要な技術となっている。一般に、産生に利用できる普遍的な発現システムは存在しないと考えられている。さらに異種タンパク質の発現のための細胞型の選択は多くの因子に依存する。かかる因子には多くの基準が含まれ、例えば細胞増殖特性、発現レベル、細胞内または細胞外発現、および目的タンパク質の生物活性ならびにその使用意図が挙げられる。しかしもっとも重要な基準の1つはあるタンパク質がその施用のためにグリコシル化を必要とするか否かであると考えられる。多くのヒト治療薬は糖タンパク質であり、ポリペプチドの所定のオリゴ糖による翻訳後修飾の重要性が、その多くの生理現象への関与によって考察されている。
組換え糖タンパク質における高度に規定されたオリゴ糖構造の重要性にもかかわらず、現在用いられている糖タンパク質産生のバイオテクノロジーによる方法ではそれを達成することができない。これはタンパク質に結合するオリゴ糖の構造が用いられる細胞型によって直接決まってしまい、すべての真核生物産生システムがこの特異性を示すという事実による。所望のオリゴ糖構造が産生されるように真核生物産生細胞系を遺伝子操作することができる可能性もある。しかし、真核生物のゴルジ体区画において活性なグリコシルトランスフェラーゼが非常に多いためかかるアプローチは非常に困難である。真核生物発現システムの使用にともなうさらなる問題には以下のものがある:一般に、哺乳類の発現システムはウシ血清を含む培地の使用による欠点を有する。これによって牛海綿状脳症(BSE)の汚染の可能性により生体安全性に関する問題が生じる。さらに、ヒト細胞系培養は無菌に維持するのが非常に困難であり、これら細胞は増殖が遅く、高価な工程制御を必要とする。前述のように、合成された特定の糖タンパク質は直接、用いた細胞系または細胞型に依存する。言い換えると、組換え糖タンパク質は、異種システムがそのタンパク質の起源におけるN−グリコシル化経路の酵素と同じ酵素を発現している場合にのみその起源のN−グリカンにより修飾されうる。そうでない場合は宿主細胞をゴルジ体におけるグリコシル化経路の遺伝子操作によって改変しなければならず(図1B)、これは組換え糖タンパク質の発現におけるヒト細胞系の主な欠点である。
大腸菌における組換え糖タンパク質の産生の問題を克服するために、タンパク質をグリコシル化することができる代謝機構をこの細菌に導入する。それゆえ本発明の目的は、組換えタンパク質、特にN−グリコシル化タンパク質が産生できる発現システムを提供することである。
大腸菌は操作および培養が容易でその遺伝学は非常によく知られているので、ヒト、ヒト様、動物、または植物、または真菌、または細菌糖タンパク質の大腸菌における産生はバイオテクノロジーにおけるブレークスルーである。
従来から知られている技術の問題および本発明による方法を模式図に参照してより詳細に説明する。これらの図は本発明の例示的態様であり、本発明の保護範囲を狭めるものではない。図において、
図1は真核生物における組換え糖タンパク質の発現であり、ここで、
図1Aは標的糖タンパク質の発現を示し、そして、
図1Bはゴルジ体における既存のグリコシル化経路の遺伝子操作を示す。
図2は、本発明による組換え標的タンパク質を発現し、特定のグリコシル化経路を導入された大腸菌発現システムである。
図3は、図1および図2における糖タンパク質のオリゴ糖残基の個々の要素を表す符号の説明である。
図1は真核生物発現システムにおける組換え糖タンパク質の発現を示す。図1Aは標的糖タンパク質の発現を示し、ここで脂質結合オリゴ糖(LLO;工程I)の集合およびオリゴ糖のOTaseによるタンパク質への転移(工程II)は小胞体(ER)における高度に保存されたプロセスである。対照的にゴルジ体における修飾は細胞型特異的である(工程III)。
a)脂質キャリア上でのオリゴ糖の集合のための特定のグリコシルトランスフェラーゼ、および、
b)このオリゴ糖を所望のタンパク質の特定の残基に共有結合させるOTase。
Claims (13)
- 組換えN−グリコシル化標的タンパク質の産生のためのシステムであって、標的タンパク質に要求されるN−グリコシル化を行うことができる代謝装置をコードする遺伝情報が導入された原核生物を含み、該原核生物が1または複数の組換え標的タンパク質の発現に必要な遺伝情報を含むものであるシステム。
- 代謝装置が脂質キャリア上へのオリゴ糖の集合のための特定のグリコシルトランスフェラーゼおよびこのオリゴ糖を所望の標的タンパク質の特定の残基へと共有結合させるOTaseを含む請求項1のシステム。
- 原核生物が大腸菌である請求項1または2のシステム。
- 原核生物が特定のグリコシルトランスフェラーゼのタイプによって規定される特定の構造を有するN−グリカンを産生する請求項2または3のシステム。
- 組換えN−グリコシル化標的タンパク質の産生方法であって、標的タンパク質に要求されるN−グリコシル化を行うことができる代謝装置をコードする遺伝情報を原核生物に導入することを含み、該原核生物には1または複数の組換え標的タンパク質の発現に必要な遺伝情報もまた導入される方法。
- 代謝装置が脂質キャリア上へのオリゴ糖の集合のための特定のグリコシルトランスフェラーゼおよびこのオリゴ糖を所望の標的タンパク質の特定の残基へと共有結合させるOTaseを含む請求項5の方法。
- 原核生物が大腸菌である請求項5または6の方法。
- 特定のグリコシルトランスフェラーゼの選択によって、原核生物が特定のグリコシルトランスフェラーゼのタイプによって規定される特定の構造を有するN−グリカンを産生する請求項6または7の方法。
- ヒトまたは動物または植物の治療のための薬物の開発または薬物の製造のための標的タンパク質の産生のための請求項1〜4のいずれかのシステムまたは請求項5〜8のいずれかの方法の利用。
- 請求項1〜4のいずれかのシステムまたは請求項5〜8のいずれかの方法によって産生される栄養用途および/または医薬用途のタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれかのシステムまたは請求項5〜8のいずれかの方法によって産生されるヒトまたは動物または植物のためのワクチン、サイトカインなどの薬物。
- 請求項1〜4のいずれかのシステムまたは請求項5〜8のいずれかの方法によって産生されるタンパク質を含む工業用酵素、機能性食品、化粧品、包装材料または繊維製品。
- 請求項1〜4のいずれかのシステムまたは請求項5〜8のいずれかの方法によって産生される薬物のヒトまたは動物または植物の疾患の治療のための利用。
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