JP2017036303A - 莢膜グラム陽性菌のバイオコンジュゲートワクチン - Google Patents

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Abstract

【課題】新規黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲートワクチンの提供。【解決手段】黄色ブドウ球菌ワクチンであって、挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tを含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい前記タンパク質；該コンセンサス配列に結合された少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖；及び任意に医薬として許容し得る担体又はアジュバント：を含有する、黄色ブドウ球菌ワクチン。前記の黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜５型及び／又は８型を含む黄色ブドウ球菌ワクチン。前記黄色ブドウ球菌多糖がメチシリン、耐性黄色ブドウ球菌株を標的化しており、前記タンパク質が、緑濃菌外毒素であり、黄色ブドウ球菌α溶血素である、黄色ブドウ球菌ワクチン。【選択図】図６

Description

(関連出願の相互参照)
本出願は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている、2010年5月6日に出願
された米国特許仮出願第61/332,170号の米国特許法119条(e)項に基づく恩恵を主張するも
のである。
(米国政府が支援する研究に対する陳述)
本発明の態様は、米国立衛生研究所(NIH)により授与された、助成金番号第1R01AI08875
4-2号の二次助成金番号第105699号の助成の下で米国政府の支援により成された。米国政
府は、これらの本発明の態様に一定の権利を有する。
(配列表)
本出願は、EFS-Webを介しASCIIフォーマットで提出された配列表を含み、これはその全
体が引用により本明細書中に組み込まれている。前記ASCIIコピーは、2011年5月2日に作
製され、名称は031229US.txtであり、且つサイズは206,590バイトである。
(発明の背景)
ワクチンは、近代医療における偉大な公衆衛生上の発明のひとつであり、数百万人の生
命を救っている。免疫付与は、感染症を予防し且つ制御するための理想的手段であること
が証明されている。毎年ワクチンは、300万人に達する死亡を防ぎ、且つ小児750,000人を
身体障害から救っている(Global Alliance for Vaccines and Immunization-Press Relea
ses(2006年3月11日)、www.gavialliance. org/media_centre/press_releases/2006_03_09
_en_pr_queenrania_delhi.php)。1999年に、CDCは、免疫付与は、20世紀の第1位の公衆衛
生の業績であると宣言した(米国における10大公衆衛生業績(Ten great public health ac
hievements-United States)、1900-1999.mMWR Morb Mortal Wkly Rep, 48:241-3 (1999年
4月2日))。破傷風又はジフテリアを生じる細菌のような一部の細菌は、疾患の大きな原因
となる毒素を産生する。この毒素は、ワクチンとして解毒した形状で使用することができ
る。しかし、ほとんどの細菌に関して、ワクチンを開発するために使用することができる
単独の毒素は存在しない。
中でも最も成功しているワクチンは、キャリアタンパク質にコンジュゲートされたイン
フルエンザ桿菌(Haemophilus influenzae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、及び肺
炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)などの細菌性病原体の表面多糖である。これらの
細菌は、莢膜により囲まれており、これは微生物の毒力及び食作用性死滅(phagocytic ki
lling)に対する抵抗を促進し、更にはそれらが乾燥するのを防ぐ。
細菌性多糖は、それらがT細胞エピトープを含むタンパク質キャリアに結合された場合
に、ヒトにおいて長期持続性の免疫反応を誘発することができる。この概念は80年前に作
り上げられ(Avery, O. T.及びW. F. Goebelの論文、1929、「コンジュゲートされた炭水
化物−タンパク質に関する化学免疫学的研究：II.合成糖−タンパク質の免疫学的特異性(
Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins. II Immunologica
l specificity of synthetic sugar-proteins)」、J. Exp. Med., 50:521-533)、後にタ
ンパク質キャリアであるジフテリア毒素に結合されたインフルエンザ桿菌タイプB(HIB)の
多糖について証明された(Anderson, P.の論文、1983、「無毒タンパク質とb型莢膜のオリ
ゴ糖のコンジュゲートCRM197により誘導されたインフルエンザ桿菌タイプb及びジフテリ
ア毒素に対する抗体反応(Antibody responses to Haemophilus influenzae type b and d
iphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type b capsule
with the nontoxic protein CRM197)」、Infect Immun, 39:233-8；Schneerson, R.、O.
Barrera、A. Sutton、及びJ. B. Robbinsの論文、1980、「インフルエンザ桿菌タイプb多
糖-タンパク質コンジュゲートの調製、特徴付け、及び免疫原性(Preparation, character
ization, and Immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-prot
ein conjugates)」、J Exp Med, 152:361-76)。またこのグライココンジュゲートは、198
7年に米国において認可された最初のコンジュゲートワクチンであり、その後短期間のう
ちに米国の乳児の予防接種スケジュールに導入された。コンジュゲートワクチンは、HIB
に加え、莢膜に囲まれたヒト病原体である髄膜炎菌及び肺炎連鎖球菌に対してもうまく使
用することができた。これらのワクチンの日常的使用は、感染症に加え、鼻咽頭のコロニ
ー形成の減少をもたらしている。現在、世界中のワクチン市場のおよそ〜25％が、コンジ
ュゲートワクチンで構成されている。
グラム陽性菌は、莢膜多糖により取り囲まれた細胞膜を有する。ブドウ球菌(Staphyloc
occus)は、そのようなグラム陽性菌のひとつである。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、感染症を引き起こす。黄色ブドウ球菌は
、ヒト疾患の多様なスペクトルの原因となる日和見細菌性病原体である。黄色ブドウ球菌
は健常なヒトの粘膜表面にコロニー形成することがあるが、これは創傷感染症の主原因で
もあり、且つ転移性合併症を伴う骨髄炎、心内膜炎及び菌血症を含む重度の感染症を誘発
する侵襲的可能性を有する(Lowy, F. D.の論文、1998、「黄色ブドウ球菌感染症(Staphyl
ococcus aureus infections)」、New Engl J Med, 339:520-32)。黄色ブドウ球菌は、人
工呼吸器関連肺炎に関与した最も一般的な物質のひとつであり、これは、素因となるリス
ク因子を持たないそれまで健常な成人と小児を襲う市中感染性肺炎の重要であり且つ明ら
かになりつつある原因である(Kollef, M. H.、A. Shorr、Y. P. Tabak、V. Gupta、L. Z.
Liu、及びR. S. Johannesの論文、2005、「ヘルスケア関連肺炎の疫学及び転帰：培養陽
性肺炎の大規模米国データベースの結果(Epidemiology and outcomes of health-care-as
sociated pneumonia: results from a large US database of culture-positive pneumon
ia)」、Chest, 128:3854-62；Shorr, A. F.の論文、2007、「メチシリン耐性黄色ブドウ
球菌の疫学及び経済的影響：総説及び文献解析(Epidemiology and economic impact of m
eticillin-resistant Staphylococcus aureus: review and analysis of the literature
)」、Pharmacoeconomics, 25:751-68)。
黄色ブドウ球菌は、院内菌血症の2番目の最も一般的な原因であり、且つメチシリン耐
性黄色ブドウ球菌(MRSA)株は、米国における集中治療室内での全ての感染症の50％以上の
原因である。病院内及び地域社会内で黄色ブドウ球菌感染症は増加している。MRSA株は、
1974年にはブドウ球菌感染症の2％から分離され、2004年にはブドウ球菌感染症の63％か
ら分離された。多くの院内MRSA株は、多剤耐性であり、例えメチシリン-感受性株であっ
ても致命的であり得る。集団ベースの活性症例知見を使用した最近の報告は、米国におい
て2005年には94,360件の侵襲性MRSA感染症が発生したこと、及びこれらの大半(58％)は病
院の外で発生したことを明らかにした(Klevens, R. M.、M. A. Morrison、J. Nadle、S.
Petit、K. Gershman、S. Ray、L. H. Harrison、R. Lynfield、G. Dumyati、J. M. Towne
s、A. S. Craig、E. R. Zell、G. E. Fosheim、L. K. McDougal、R. B. Carey、及びS. K
. Fridkinの論文、2007、「米国における侵襲性メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症(In
vasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United Stat
es)」、JAMA, 298:1763-71)。この分析において、2005年には、AIDSよりもより多くのア
メリカ人がMRSAにより死亡している(18,000例以上の死亡)。
黄色ブドウ球菌USA100は、New York/Japanクローンとしても知られているが、これは優
勢な米国の院内感染MRSA株を表すMRSA株である(McDougal, L. K.、C. D. Steward、G. E.
Killgore、J. M. Chaitram、S. K. McAllister、及びF. C. Tenoverの論文、2003、「米
国でのオキサシリン耐性黄色ブドウ球菌分離株のパルスフィールドゲル電気泳動タイピン
グ：国家的データベースの確立(Pulsed-field gel electrophoresis typing of oxacilli
n-resistant Staphylococcus aureus isolates from the United States: establishing
a national database)」、J Clin Microbiol, 41:5113-20)。
疫学解析は、黄色ブドウ球菌は、毎年米国内のみでも約200万人の臨床感染症を引き起
こしていることを指摘している(Fridkin, S. K.、J. C. Hageman、M. Morrison、L. T. S
anza、K. Como-Sabetti、J. A. Jernigan、K. Harriman、L. H. Harrison、R. Lynfield
、及びM. M. Farleyの論文、2005、「3つの地域共同体内のメチシリン耐性黄色ブドウ球
菌疾患(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease in three communities)
」、N Engl J Med, 352:1436-44；King, M. D.、B. J. Humphrey、Y. F. Wang、E. V. Ko
urbatova、S. M. Ray、及びH. M. Blumbergの論文、2006、「皮膚及び軟組織感染症の支
配的原因としての市中感染メチシリン耐性黄色ブドウ球菌USA300クローンの出現(Emergen
ce of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA 300 clo
ne as the predominant cause of skin and soft-tissue infections)」、Ann Intern Me
d, 144:309-17；Klevens, R. M.、M. A. Morrison、J. Nadle、S. Petit、K. Gershman、
S. Ray、L. H. Harrison、R. Lynfield、G. Dumyati、J. M. Townes、A. S. Craig、E. R
. Zell、G. E. Fosheim、L. K. McDougal、R. B. Carey、S. K. Fridkin、及びM. I. for
the Active Bacterial Core surveillanceの文献、2007、「米国における侵襲性メチシ
リン耐性黄色ブドウ球菌感染症(Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureu
s infections in the United States)」、JAMA, 298:1763-1771)。黄色ブドウ球菌感染症
の数が増加しているのみではなく、抗生物質に対する黄色ブドウ球菌の耐性も増強してい
る。MRSAは、米国における院内黄色ブドウ球菌感染症の40％〜60％を占め、これらの菌株
の多くは多剤耐性である。院内感染症の主原因として悪名高い黄色ブドウ球菌は、最近、
素因となるリスク因子を持たない入院していないヒトの市中感染症の数の激増を引き起こ
すという新たな役割を呈している。猛毒の市中感染型MRSA(CA-MRSA)株は、米国及び欧州
を越えてより蔓延し始めており、それらの広がりは地球規模であることが認められている
(Baggett, H. C、T. W. Hennessy、K. Rudolph、D. Bruden、A. Reasonover、A. Parkins
on、R. Sparks、R. M. Donlan、P. Martinez、K. Mongkolrattanothai、及びJ. C. Butle
rの論文、2004、「アラスカ地方におけるせつ腫症大流行時の抗生物質の使用及び細胞毒
素パントン・バレンタイン型ロイコシジンに関連した市中発生メチシリン耐性黄色ブドウ
球菌(Community-onset methicillin-resistant Staphylococcus aureus associated with
antibiotic use and the cytotoxin Panton-Valentine leukocidin during a furunculo
sis outbreak in rural Alaska)」、J Infect Dis, 189:1565-73；Gilbert, M.、J. MacD
onald、D. Gregson、J. Siushansian、K. Zhang、S. Elsayed、K. Laupland、T. Louie、
K. Hope、M. Mulvey、J. Gillespie、D. Nielsen、V. Wheeler、M. Louie、A. Honish、G
. Keays、及びJ. Conlyの論文、2006、「薬物使用歴者、ホームレス及び受刑者における
市中感染(USA300)メチシリン耐性黄色ブドウ球菌のアルバータ州における大流行(Outbrea
k in Alberta of community-acquired (USA300) methicillin-resistant Staphylococcus
aureus in people with a history of drug use, homelessness or incarceration)」、
Canad Med Assoc J, 175:149-54；Kazakova, S. V.、J. C. Hageman、M. Matava、A. Sri
nivasan、L. Phelan、B. Garfinkel、T. Boo、S. McAllister、J. Anderson、B. Jensen
、D. Dodson、D. Lonsway、L. K. McDougal、M. Arduino、V. J. Fraser、G. Killgore、
F. C. Tenover、S. Cody、及びD. B. Jerniganの論文、2005、「プロフットボール選手間
のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌のクローン(A clone of methicillin-resistant Staphy
lococcus aureus among professional football players)」、N Engl J Med, 352:468-75
)。
メチシリンに対し耐性のある黄色ブドウ球菌がより一般的になり始めるのみではなく、
バンコマイシンに対する感受性が低下した多くの分離株が報告されている。vanAを保持し
且つバンコマイシンに対し完全に耐性がある黄色ブドウ球菌の7種の臨床分離株が、米国
において分離されている。これらの分離株は、メチシリン耐性でもある(Chang, S.、D. M
. Sievert、J. C. Hageman、M. L. Boulton、F. C. Tenover、F. P. Downes、S. Shah、J
. T. Rudrik、G. R. Pupp、W. J. Brown、D. Cardo、及びS. K. Fridkinの論文、2003、
「vanA耐性遺伝子を持つバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌による感染(Infection with
vancomycine -resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene
)」、New Engl J Med, 348:1342-7)。黄色ブドウ球菌は抗生物質により常には制御されず
、且つMRSA分離株は市中において流行が増加し始めているので、ワクチンなどの追加の制
御戦略が非常に必要とされている。
黄色ブドウ球菌莢膜多糖が感染症に関連している。表面に関連した付着、分泌されたエ
キソプロテイン及び毒素、並びに免疫回避因子を含む多くの病原因子が、ブドウ球菌感染
症の病理の原因である(Foster, T. J.の論文、2005、「ブドウ球菌による免疫回避(Immun
e evasion by staphylococci)」、Nature Reviews Microbiology, 3:948-58)。多くの侵
襲性細菌性病原体のように、黄色ブドウ球菌は莢膜多糖(CP)を生成し(図4)、CPは宿主自
然免疫防御によるクリアランスに対するその抵抗性を増強する。ほとんどの黄色ブドウ球
菌の臨床分離株は、莢膜に包まれ、血清型5型及び8型株が優勢である(Arbeit, R. D.、W.
W. Karakawa、W. F. Vann、及びJ. B. Robbinsの論文、1984、「黄色ブドウ球菌臨床分
離株間の2つの新たに説明された莢膜多糖型の優位性(Predominance of two newly descri
bed capsular polysaccharide types among clinical isolates of Staphylococcus aure
us)」、Diagn Microbiol Infect Dis, 2:85-91)。5型(CP5)及び8型(CP8)莢膜多糖は、N-
アセチルマンノサミンウロン酸(ManNAcA)、N-アセチルL-フコサミン(L-FucNAc)、及びN-
アセチルD-フコサミン(D-FucNAc)で構成された類似した三糖反復単位を有する(Jones, C.
の論文、2005、「新規グライココンジュゲートワクチンの成分である黄色ブドウ球菌由来
の莢膜多糖5型及び8型の改変構造(Revised structures for the capsular polysaccharid
es from Staphylococcus aureus types 5 and 8, components of novel glycoconjugate
vaccines)」、Carbohydr Res, 340:1097-106)。CP5及びCP8は、血清学的に異なり、且つ
これは、糖質間の系統及びO-アセチル化部位における差異に起因し得る(図4)。
先の研究は、インビトロにおける食作用性取り込み及び死滅に対する抵抗性を持つ黄色
ブドウ球菌の莢膜生成に関連している(Fattom, A.、R. Schneerson、S. C. Szu、W. F. V
ann、J. Shiloach、W. W. Karakawa、及びJ. B. Robbinsの論文、1990、「緑膿菌外毒素A
にコンジュゲートされた黄色ブドウ球菌5型及び8型莢膜多糖で構成されたワクチンの合成
及びマウスにおける免疫学的特性(Synthesis and immunologic properties in mice of v
accines composed of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysacchar
ides conjugateted to Pseudomonas aeruginosa exotoxin A)」、Infect Immun, 58:2367
-74；Thakker, M.、J.-S. Park、V. Carey、及びJ. C. Leeの論文、1998、「黄色ブドウ
球菌血清型5型莢膜多糖は、食作用阻止性であり、且つマウス菌血症モデルにおいて細菌
毒力を増強する(Staphylococcus aureus serotype 5 capsular polysaccharide is antip
hagocytic and enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model)」、Infe
ct Immun, 66:5183-5189；Watts, A.、D. Ke、Q. Wang、A. Pillay、A. Nicholson-Welle
r、及びJ. C. Leeの論文、2005、「毒力が異なる血清型5型又は血清型8型の莢膜多糖を発
現する黄色ブドウ球菌株(Staphylococcus aureus strains that express serotype 5 or
serotype 8 capsular polysaccharides differ in virulence)、Infect Immun, 73:3502-
11)。ヒト好中球は補体活性のある非免疫血清の存在下で莢膜-陰性変異体を食作用するの
に対し、莢膜に包まれた分離株は、最適なオプソニン食作用性死滅のために、莢膜-特異
的抗体及び補体の両方を必要とする(Bhasin, N.、A. Albus、F. Michon、P. J. Livolsi
、J.-S. Park、及びJ. C. Leeの論文、1998、「黄色ブドウ球菌5型莢膜多糖のO-アセチル
化に必須の遺伝子の同定(Identification of a gene essential for O-acetylation of t
he Staphylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide)」、Mol Microbiol, 27:9-
21；Thakker, M.、J.-S. Park、V. Carey、及びJ. C. Leeの論文、1998、「黄色ブドウ球
菌血清型5莢膜多糖は、食作用阻止性であり、且つマウス菌血症モデルにおいて細菌毒力
を増強する(Staphylococcus aureus serotype 5 capsular polysaccharide is antiphago
cytic and enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model)」、Infect I
mmun, 66:5183-5189；Watts, A.、D. Ke、Q. Wang、A. Pillay、A. Nicholson-Weller、
及びJ. C. Leeの論文、2005、「毒力が異なる血清型5型又は血清型8型莢膜多糖を発現す
る黄色ブドウ球菌株(Staphylococcus aureus strains that express serotype 5 or sero
type 8 capsular polysaccharides differ in virulence)」、Infect Immun, 73:3502-11
)。Nilssonらは、マウス由来の腹膜マクロファージは、親Reynolds株と比べ著しく多い数
のCP5-陰性変異体を貪食したことを報告した(Nilsson, I.-M.、J. C. Lee、T. Bremell、
C. Ryden、及びA. Tarkowskiの論文、1997、「敗血症及び敗血症性関節炎におけるブドウ
球菌多糖のマイクロ莢膜発現の役割(The role of staphylococcal polysaccharide micro
capsule expression in septicemia and septic arthritis)」、Infect Immun, 65:4216-
4221)。一旦貪食されると、CP5-陽性株が、この変異株よりもより大きい程度細胞内で生
存した。Cunnionらは、同質遺伝子型の黄色ブドウ球菌株のオプソニン作用を比較し、CP5
-陽性株は、無莢膜変異株よりも血清補体(C')への結合が42％少ないことを明らかにした(
Cunnion, K. M.、J. C. Lee、及びM. M. Frankの論文、2001、「莢膜生成及び増殖相の黄
色ブドウ球菌への補体結合への影響(Capsule production and growth phase influence b
inding of complement to Staphylococcus aureus)」、Infect Immun, 69:6796-6803)。
黄色ブドウ球菌ワクチン開発には従来、標的として莢膜が関与してきた。ブドウ球菌疾
患に対する防御のためのワクチンのデザインは、ヒトにおける黄色ブドウ球菌感染症の不
定形の症状発現及び臨床上の複雑さにより複雑化されている。多くの黄色ブドウ球菌ワク
チンの候補が、感染症の動物モデルにおいて調べられているが、臨床試験第III相を完了
したことが報告された免疫付与投薬計画は、わずかに2種である(Schaffer, A. C及びJ. C
. Leeの論文、2008、「黄色ブドウ球菌に対するワクチン接種及び受動免疫(Vaccination
and passive immunisation against Staphylococcus aureus)」、Int J Antimicrob Agen
ts, 32 Suppl 1:S71-8)。第一のワクチンは、黄色ブドウ球菌の臨床株の中で最も蔓延し
ている2種の莢膜多糖(CP)を基にしている(図4)。Fattomらは、無毒の組換え緑膿菌エキソ
プロテインA(rEPA)に血清型5型多糖(CP5)及び血清型8型多糖(CP8)をコンジュゲートした(
Fattom, A.R. Schneerson、S. C. Szu、W. F.Vann、J. Shiloach、W. W. Karakawa、及び
J. B. Robbinsの論文、1990、「緑膿菌外毒素にコンジュゲートされた黄色ブドウ球菌5型
及び8型莢膜多糖で構成されたワクチンの合成及びマウスにおける免疫学的特性(Synthesi
s and immunologic properties in mice of vaccines composed of Staphylococcus aure
us type 5 and type 8 capsular polysaccharides conjugateted to Pseudomonas aerugi
nosa exotoxin)、Infect Immun, 58:2367-74)。このコンジュゲートワクチンは、マウス
及びヒトにおいて免疫原性であり、且つこれらは、致命的である及び致命的でないブドウ
球菌感染症から齧歯類を防御する点で有効性を示したオプソニン抗体を誘導した(Fattom,
A.R. Schneerson、S. C. Szu、W. F.Vann、J. Shiloach、W. W. Karakawa、及びJ. B. R
obbinsの論文、1990、緑膿菌外毒素にコンジュゲートされた黄色ブドウ球菌5型及び8型莢
膜多糖で構成されたワクチンの合成及びマウスにおける免疫学的特性(Synthesis and imm
unologic properties in mice of vaccines composed of Staphylococcus aureus type 5
and type 8 capsular polysaccharides conjugated to Pseudomonas aeruginosa exotox
in)、Infect Immun, 58:2367-74；Fattom, A.、R. Schneerson、D. C. Watson、W. W. Ka
rakawa、D. Fitzgerald、I. Pastan、X. Li、J. Shiloach、D. A. Bryla、及びJ. B. Rob
binsの論文、1993、「緑膿菌組換えエキソプロテインAに結合された黄色ブドウ球菌5型及
び8型莢膜多糖で構成されたコンジュゲートワクチンの非臨床及び臨床での評価(Laborato
ry and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of S. aureus type 5 an
d type 8 capsular polysaccharides bound to Pseudomonas aeruginosa recombinant ex
oprotein A)、Infect Immun, 61:1023-32；Fattom, A. I.、J. Sarwar、A. Ortiz、及びR
. Nasoの論文、1996、「細菌チャレンジに対しマウスを防御する黄色ブドウ球菌莢膜多糖
(CP)ワクチン及びCP-特異的抗体(A Staphylococcus aureus capsular polysaccharide (C
P) vaccine and CP-specific antibodies protect mice against bacterial challenge)
」、Infect Immun, 64:1659-65；Lee, J. C、J. S. Park、S. E. Shepherd、V. Carey、
及びA. Fattomの論文、1997、「ラットの心内膜炎改変モデルにおける黄色ブドウ球菌5型
莢膜多糖に対する抗体の防御的有効性(Protective efficacy of antibodies to the Stap
hylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide in a modified model of endocard
itis in rats)」、Infect Immun, 65:4146-51)。受動免疫の研究は、CP5-特異的抗体及び
CP8-特異的抗体は両方共、黄色ブドウ球菌乳腺炎のマウスモデルにおいて感染を有意に低
下したことを指摘した(Tuchscherr, L. P.、F. R. Buzzola、L. P. Alvarez、J. C. Lee
、及びD. O. Sordelliの論文、2008、「莢膜多糖及びクランピング因子Aに対する抗体は
、マウスにおける乳腺炎並びに黄色ブドウ球菌の無莢膜及び小型コロニー変種の出現を防
御する(Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent masti
tis and the emergence of unencapsulated and small-colony variants of Staphylococ
cus aureus in mice)」、Infect Immun, 76:5738-44)。組合せたCP5-及びCP8-コンジュゲ
ートワクチンは、ヒトにおいて安全であり、且つオプソニン食作用活性を示した抗体を誘
発したことが示された。
黄色ブドウ球菌ワクチン開発は、標的としての表面タンパク質も関与している。第二の
黄色ブドウ球菌ワクチンの臨床試験は、ブドウ球菌感染症の防御におけるブドウ球菌付着
に対する抗体の防御的有効性を基にしている。黄色ブドウ球菌クランピング因子Aは、表
面に発現された細胞壁-アンカータンパク質であり、フィブリノゲンへのブドウ球菌付着
を媒介し(Foster, T. J.及びM. Hookの論文、1998、「黄色ブドウ球菌の表面タンパク質
アドヘシン(Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus)」、Trends Microbio
l, 6:484-8)、且つ黄色ブドウ球菌の生体物質表面への結合を促進し(Vaudaux, P. E.、P.
Francois、R. A. Proctor、D. McDevitt、T. J. Foster、R. M. Albrecht、D. P. Lew、
H. Wabers、及びS. L. Cooperの論文、1995、「イヌの動脈シャントへの細菌付着を促進
する特異的血漿タンパク質の役割を規定するための黄色ブドウ球菌の付着欠損変異体の使
用(Use of adhesion-defective mutants of Staphylococcus aureus to define the role
of specific plasma proteins in promoting bacterial adhesion to canine arteriove
nous shunts)」、Infection & Immunity, 63:585-90)、血液を凝固し、及び内皮表面を損
傷する(Moreillon, P.、J. M. Entenza、P. Francioli、D. McDevitt、T. J. Foster、P.
Francois、及びP. Vaudauxの論文、1995、「実験的心内膜炎の病理における黄色ブドウ
球菌のコアグラーゼ及びクランピング因子の役割(Role of Staphylococcus aureus coagu
lase and clumping factor in pathogenesis of experimental endocarditis)」、Infect
ion & Immunity, 63:4738-43)。ClfAのフィブリノゲン-結合ドメインは、完全長タンパク
質の領域A内に位置している(McDevitt, D.、P. Francois、P. Vaudaux、及びT. J. Foste
rの論文、1995、「黄色ブドウ球菌の表面に位置したフィブリノゲン受容体(クランピング
因子)のリガンド結合ドメインの同定(Identification of the ligand-binding domain of
the surface-located fibrinogen receptor (clumping factor) of Staphylococcus aur
eus)、Molecular Microbiology, 16:895-907)。ClfAは、カテーテルで誘導したブドウ球
菌心内膜炎の動物モデルにおいて重大な相互作用である、血小板への黄色ブドウ球菌結合
において、重要な役割を果たす(Sullam, P. M.、A. S. Bayer、W. M. Foss、及びA. L. C
heungの論文、1996、「黄色ブドウ球菌によるインビトロにおける減弱された血小板結合
は、感染性心内膜炎のウサギモデルにおける毒力の低下に関連している(Diminished plat
elet binding in vitro by Staphylococcus aureus is associated with reduced virule
nce in a rabbit model of infective endocarditis)」、Infection & Immunity, 64:491
5-21)。
Nanraらは、ClfAに対する抗体は、黄色ブドウ球菌のインビトロにおけるオプソニン食
作用性死滅を誘導したことを報告した(Nanra, J. S.、Y. Timofeyeva、S. M. Buitrago、
B. R. Sellman、D. A. Dilts、P. Fink、L. Nunez、M. Hagen、Y. V. Matsuka、T. Minin
ni、D. Zhu、V. Pavliak、B. A. Green、K. U. Jansen、及びA. S. Andersonの論文、200
9、「黄色ブドウ球菌によるクランピング因子A及び莢膜多糖の不均一インビボ発現：ワク
チンデザインとの関わり(Heterogeneous in vivo expression of clumping factor A and
capsular polysaccharide by Staphylococcus aureus: Implications for vaccine desi
gn)」、Vaccine, 27:3276-80)。更にClfAの結合領域Aの組換え型により免疫付与したマウ
スは、黄色ブドウ球菌により誘導された関節炎及び致死性の低下を示した(Josefsson, E.
、O. Hartford、L. O'Brien、J. M. Patti、及びT. Fosterの論文、2001、「新規毒力決
定因子であるクランピング因子Aのワクチン接種による実験的黄色ブドウ球菌関節炎に対
する防御(Protection against experimental Staphylococcus aureus arthiritis by vac
cination with clumping factor A, a novel virulence determinant)」、Journal of In
fectious Diseases, 184:1572-80)。受動免疫実験は、高レベルのClfA特異的抗体を含有
するヒトポリクローナル免疫グロブリン調製品を投与されたウサギにおいて実施された(V
ernachio, J.、A. S. Bayer、T. Le、Y. L. Chai、B. Prater、A. Schneider、B. Ames、
P. Syribeys、J. Robbins、J. M. Patti、J. Vernachio、A. S. Bayer、T. Le、Y.-L. Ch
ai、B. Prater、A. Schneider、B. Ames、P. Syribeys、J. Robbins、及びJ. M. Pattiの
論文、2003、「感染性心内膜炎の実験モデルにおいて、抗クランピング因子A免疫グロブ
リンは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌菌血症の期間を短縮する(Anti-clumping factor
A immunoglobulin reduces the duration of methicillin -resistant Staphylococcus a
ureus bacteremia in an experimental model of infective endocarditis)」、Antimicr
obial Agents & Chemotherapy, 47:3400-6)。その併用療法は、バンコマイシン単独治療
よりも、カテーテル-誘導した黄色ブドウ球菌心内膜炎のウサギの血液からより良い細菌
クリアランスを生じた。加えて、ClfA-特異的抗体の受動移入は、黄色ブドウ球菌乳腺炎
のマウスモデルにおける感染症を著しく低下した(Tuchscherr, L. P.、F. R. Buzzola、L
. P. Alvarez、J. C. Lee、及びD. O.Sordelliの論文、2008、「莢膜多糖及びクランピン
グ因子Aに対する抗体は、マウスにおける乳腺炎並びに黄色ブドウ球菌の無莢膜及び小型
コロニー変種の出現を防御する(Antibodies to capsular polysaccharide and clumping
factor A prevent mastitis and the emergence of unencapsulated and small-colony v
ariants of Staphylococcus aureus in mice)」、Infect Immun, 76:5738-44)。
報告によると、第III相臨床試験が、出生時低体重の未熟児2000例における晩発型敗血
症を防御するようデザインされた。これらの新生児は、ClfA及びSdrGに対する抗体力価が
上昇したドナーからプールされたヒト免疫グロブリン調製品であるVeronateの最大4回の
投与を受けた。同様の第II相臨床試験の結果が有望であったにもかかわらず、この予防的
療法は、新生児におけるブドウ球菌感染症の頻度の低下をもたらさなかった(DeJonge, M.
、D. Burchfield、B. Bloom、M. Duenas、W. Walker、M. Polak、E. Jung、D. Millard、
R. Schelonka、F. Eyal、A. Morris、B. Kapik、D. Roberson、K. Kesler、J. Patti、及
びS. Hetheringtonの論文、2007、「未熟児の院内ブドウ球菌血流感染症の予防に対するI
NH-A21の安全性及び有効性の臨床試験(Clinical trial of safety and efficacy of INH-
A21 for the prevention of nosocomial staphylococcal bloodstream infection in pre
mature infants)」、J Pediatr, 151:260-5)。
原核生物において、タンパク質グリコシル化が生じるが、それが天然に起こることは稀
であることが示されている。他方で、N-結合型タンパク質グリコシル化は、真核生物の小
胞体において生じる必須且つ保存されたプロセスである。これは、分泌タンパク質及び膜
タンパク質のタンパク質フォールディング、オリゴマー化、安定性、品質制御、選別及び
輸送に重要である(Helenius, A.及びAebi, M.の論文、(2004)、「小胞体におけるN-結合
型グリカンの役割(Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum)」、Annu
. Rev. Biochem., 73:1019-1049)。タンパク質グリコシル化は、タンパク質の抗原性、安
定性及び半減期に対し大いに好ましい影響を有する。加えてグリコシル化は、例えばタン
パク質のグリコシル化された部分と相互作用する固相に結合したレクチンリガンドを持つ
アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによる、タンパク質の精製
を補助することができる。従ってこれは、生物学的に及び医薬として有用なグリコシル化
パターンを提供するために、真核細胞において多くのグリコシル化されたタンパク質を組
換えにより生成するための確立された実践である。
コンジュゲートワクチンは、細菌感染症に対し防御するためにうまく使用されている。
多糖はT細胞と無関係の抗原であるので、抗原性多糖のタンパク質キャリアへのコンジュ
ゲートが、防御的記憶反応には必要である。多糖に加えタンパク質キャリア内の反応基の
活性化を使用する様々な化学的方法により、多糖は、タンパク質キャリアにコンジュゲー
トされている(Qian, F.、Y. Wu、O. Muratova、H. Zhou、G. Dobrescu、P. Duggan、L. L
ynn、G. Song、Y. Zhang、K. Reiter、N. MacDonald、D. L. Narum、C. A. Long、L. H.
Miller、A. Saul、及びG. E. Mullenの論文、2007、「組換えタンパク質の緑膿菌エキソ
プロテインAへのコンジュゲート：マラリアワクチン候補の免疫原性増強の戦略(Conjugat
ing recombinant proteins to Pseudomonas aeruginosa ExoProtein A: a strategy for
enhancing immunogenicity of malaria vaccine candidates)」、Vaccine, 25:3923-3933
；Pawlowski, A.、G. Kallenius、及びS. B. Svensonの論文、2000、「新たな断片化及び
コンジュゲート技術を利用する肺炎球菌莢膜多糖-タンパク質コンジュゲートワクチンの
調製(Preparation of pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugate vacci
nes utilizing new fragmentation and conjugation technologies)」、Vaccine, 18:187
3-1885；Robbins, J. B.、J. Kubler-Kielb、E. Vinogradov、C. Mocca、V. Pozsgay、J.
Shiloach、及びR. Schneersonの論文、2009、「ソンネ赤痢菌O-特異的オリゴ糖-コア-タ
ンパク質コンジュゲートの合成、特徴付け、及びマウスにおける免疫原性(Synthesis, ch
aracterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosa
ccharide -core-protein conjugates)、Proc Natl Acad Sci USA, 106:7974-7978)。
コンジュゲートワクチンは、細菌感染症に対し小児を防御するために小児に投与するこ
とができ、且つ成人に長期間持続する免疫反応を提供することができる。本発明の構築物
は、動物においてIgG反応を生じることがわかっている。多糖(すなわち、糖残基)は、糖-
特異的である短期間の免疫反応を引き起こすと考えられる。実際、ヒトの免疫系は、O抗
原及び莢膜多糖などの、細菌の特異的多糖表面構造に対し強力な反応を生じる。しかし多
糖に対する免疫反応はIgM依存性であるので、この免疫系は記憶を発生しない。しかし多
糖を保持するタンパク質キャリアは、IgG反応を引き起こし、この反応はT細胞依存性であ
り、且つこの免疫系は記憶を発生するので、長期間持続する防御を提供する。この理由で
、ワクチンの開発において、タンパク質キャリア-多糖コンジュゲートとしてワクチンを
開発することは有利である。
原核生物は、グリコシル化されたタンパク質を生成することは稀である。しかし、細菌
である食物媒介性病原体カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)は、その
タンパク質をグリコシル化することができることが明らかにされている(Szymanskiらの論
文、(1999)、「カンピロバクター・ジェジュニにおける一般的タンパク質グリコシル化シ
ステムの証拠(Evidence for a system of general protein glycosylation in Campyloba
cter jejuni)」、Mol. Microbiol., 32:1022-1030)。グリコシル化に必要な機構は、pgl
遺伝子座にクラスター化されている12の遺伝子によりコードされている。グリコシル化の
破壊は、C.ジェジュニの侵襲及び病原性に影響を及ぼすが、ほとんどの真核生物において
のように致死性ではない(Burda P.及びM. Aebiの論文、(1999)、「N-結合型グリコシル化
のドリコール経路(The dolichol pathway of N-linked glycosylation)」、Biochim Biop
hys Acta, 1426(2):239-57)。pgl遺伝子座は、カンピロバクターにおけるN-結合型タンパ
ク質グリコシル化に責任のあること、並びに大腸菌におけるpgl遺伝子座及びアクセプタ
ー糖タンパク質の同時の組換え発現により、C.ジェジュニタンパク質のN-グリコシル化を
再構成することは可能であることが示されている(Wacker, M.、D. Linton、P. G. Hitche
n、M. Nita-Lazar、S. M. Haslam、S. J. North、M. Panico、H. R. Morris、A. Dell、B
. W. Wren、及びM. Aebiの論文、2002、「C.ジェジュニにおけるN-結合型グリコシル化及
び大腸菌へのその機能転移(N-linked glycosylation in C. jejuni and its functional
transfer into E. coli)」、Science, 298:1790-3)。
カンピロバクターのN-結合型タンパク質グリコシル化生合成経路は、細菌における多糖
生合成経路に極めて類似している(Bugg, T. D.及びP. E. Brandishの論文、1994、「ペプ
チドグリカンから糖タンパク質へ：脂質-結合型オリゴ糖の生合成の一般的特徴(From pep
tidoglycan to glycoproteins: common features of lipid-linked oligosaccharide bio
synthesis)」、FEMS Microbiol Lett, 119:255-62)。細菌の抗原性多糖及びカンピロバク
ターのオリゴ糖は両方共キャリア脂質であるウンデカプレニルピロリン酸(UndPP)上で合
成されるという知識を基に、これら2つの経路が大腸菌において組合せられた(Feldman, M
. F.、M. Wacker、M. Hernandez、P. G. Hitchen、C. L. Marolda、M. Kowarik、H. R. M
orris、A. Dell、M. A. Valvano、及びM. Aebiの論文、2005、「大腸菌における多様なO
抗原リポ多糖構造によるN-結合型タンパク質グリコシル化の操作(Engineering N-linked
protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Es
cherichia coli)」、Proc Natl Acad Sci USA, 102:3016-21)。PglBは、脂質-結合された
糖基質に対し厳密な特異性を有さないことが明らかにされた。UndPP上で集成された抗原
性多糖は、ペリプラズムにおいてPglBにより捕獲され、タンパク質キャリアへ転移される
(Feldman, M. F.、M. Wacker、M. Hernandez、P. G. Hitchen、C. L. Marolda、M. Kowar
ik、H. R. Morris、A. Dell、M. A. Valvano、及びM. Aebiの論文、2005、「大腸菌にお
ける多様なO抗原リポ多糖構造によるN-結合型タンパク質グリコシル化の操作(Engineerin
g N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide struc
tures in Escherichia coli)」、Proc Natl Acad Sci USA, 102:3016-21；Wacker, M.、M
. F. Feldman、N. Callewaert、M. Kowarik、B. R. Clarke、N. L. Pohl、M. Hernandez
、E. D. Vines、M. A. Valvano、C. Whitfield、及びM. Aebiの論文、2006、「細菌オリ
ゴ糖転移酵素(OTase)の基質特異性は、細菌システム及び真核システムの共通の転移機構
を示唆している(Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase (OTa
se) suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic system
s)」、Proc Natl Acad Sci USA, 103:7088-93)。カンピロバクターPglBがN-アセチル化ヘ
キソサミンを還元末端に有する場合、これらは、UndPP結合したオリゴ糖の多様なアレイ
を転移し(Wackerらの論文(2006))、抗原性多糖を、N-グリコシド結合を介して選択された
タンパク質へコンジュゲートすることを可能にすることが示された。これはインビボにお
けるコンジュゲートワクチンの製造に関する理論的基礎を提供することができるが、この
理論的可能性を認めるために多くの難問を克服することが必要とされる。
この先行するC.ジェジュニは一般的N-結合型タンパク質グリコシル化システムを有する
という発見を基に、大腸菌が、C.ジェジュニのN-結合型タンパク質グリコシル化機構を含
むように改変された。この方式で、大腸菌宿主においてC.ジェジュニに固有のタンパク質
のグリコシル化型が生成された。更にこのプロセスを使用し、ワクチン製品として使用す
るために、改変された大腸菌宿主において様々な起源からグリコシル化されたタンパク質
を生成することができることが示されている。そのような改変された大腸菌宿主の大規模
培養を作製することが可能であり、有用なワクチンを大量に製造することができるので、
大腸菌による製造は有利である。
黄色ブドウ球菌用のワクチン製品として使用するために改変された大腸菌宿主において
グリコシル化タンパク質を生成するためのこのプロセスの使用は、克服できないと考えら
れている問題点に遭遇する。第一に、大腸菌はグラム陰性菌であり、重合工程後の、その
糖類生合成経路は、黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性菌のそれとは大きく異なる。加え
て先行する技術と一致して、黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を直接生成するための大腸菌の遺
伝子操作は実行不可能である。例えば、黄色ブドウ球菌はグラム陽性生体であり、且つそ
の莢膜合成は、細胞エンベロープ構造及び細胞外被(cellular hull)の構築に関連してい
る。莢膜生成する生合成機構は、細胞及びその細胞壁の外側上に莢膜多糖(PS)を配置する
ように具体的にデザインされている。大腸菌の細胞エンベロープは根本的に異なる様式で
構築されるので、この莢膜を改変された大腸菌生体において生成することは、少なくとも
高度に資源集約的であるという理由のため極めて困難であろう。PS前駆体からの莢膜集成
に関する生合成機構は、異なる環境のために機能しないであろう。黄色ブドウ球菌莢膜は
、単独の膜を通過しなければならないのに対し、大腸菌においては、真正の莢膜の最終位
置に到達するために横断される必要がある追加の膜が存在する。更に黄色ブドウ球菌莢膜
は非常に大きいので、大腸菌の2つの膜の間に黄色ブドウ球菌莢膜のような大きい莢膜を
作製することは実行不可能と考えられた。
異なる生体由来の酵素は一緒に作用することができるという原則が、先に示されている
(例えば、Rubires, X.、F. Saigi、N. Pique、N. Climent、S. Merino、S. Alberti、J.
M. Tomas及びM. Regueの論文、1997、「大腸菌K-12誘導体のrfb-50変異を代償するセラチ
ア・マルセセンスN28b(04)由来の遺伝子(wbbL)(A gene (wbbL) from Serratia marcescen
s N28b (04) complements the rfb-50 mutation of Escherichia coli K-12 derivatives
)」、J. Bacteriol, 179(23):7581-6)。しかし、グラム陽性生体由来の改変されたLPS多
糖で、これまでグラム陰性生体において生成されたものはないと考えられる。
(簡単な発明の概要)
本発明者らは今回驚くべきことに、新規黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲートワクチン
を発見した。この新規黄色ブドウ球菌ワクチンは、1つのグラム菌株を有する原核生物の
オリゴ糖又は多糖は、異なるグラム菌株を有する宿主原核生物においてタンパク質をグリ
コシル化し得るという新たな予想外の発見を基にしている。更なる本発明の新たな予想外
の特徴は、以下に言及した実施態様を含むが、これらに限定されるものではない。
より一般には本発明は、挿入された核酸コンセンサス配列を含むタンパク質キャリア；
該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌などの細菌由来の少なくとも1種のオリゴ
糖又は多糖、及び任意にアジュバントを含む、グラム陽性ワクチンなどの、バイオコンジ
ュゲートワクチンを指向している。更に本発明は、改変された莢膜多糖又はLPSの生成を
含む、改変されたLPS生合成経路を用いるグリコシル化システムにより製造される、黄色
ブドウ球菌ワクチンなどのグラム陽性菌ワクチン、又は他の細菌ワクチンを指向している
。
本発明は加えて、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tを含むタ
ンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいも
の；及び、該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌などの細菌に由来する少なくと
も1種のオリゴ糖又は多糖：を含む、組換えN-グリコシル化タンパク質を指向している。
本発明は更に、N-グリコシド結合による、黄色ブドウ球菌の改変された莢膜多糖の、同
じ生体由来のタンパク質抗原との組合せを指向している。
本発明は更に、グラム陽性種などの第一の原核生物種の1種以上のグリコシル転移酵素
；グラム陰性種などの異なる原核生物種の1種以上のグリコシル転移酵素：をコードして
いるヌクレオチド配列；タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；並びに、OTase
をコードしているヌクレオチド配列：を含む、宿主原核生物を指向している。加えて本発
明は、グラム陽性原核生物にのみ固有であるグリコシル転移酵素をコードしている導入さ
れたヌクレオチド配列；タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；及び、OTaseを
コードしているヌクレオチド配列：を含む、操作された宿主原核生物を指向している。
本発明は更に、例えば黄色ブドウ球菌などのグラム陽性種のような第一の原核生物種の
1種以上のグリコシル転移酵素；第二の原核生物種の1種以上のグリコシル転移酵素、タン
パク質；並びに、OTase：をコードしている核酸を含む、宿主原核生物におけるバイオコ
ンジュゲートワクチンの製造方法を指向している。加えて本発明は、WaaLによりリピドA
コアに転移されるか及び/又はOTaseにより選択されたキャリアに結合されることができる
、改変された莢膜多糖をグラム陰性菌において生成することによる、バイオコンジュゲー
トワクチンの製造を指向している。
本発明は更に、第一の原核生物に固有のグリコシル転移酵素をコードし、且つ同じく第
一の原核生物とは異なる第二の原核生物に固有のグリコシル転移酵素もコードしているヌ
クレオチド配列を含む宿主原核生物における、グリコシル化されたタンパク質の生成方法
を指向している。本発明は加えて、異なる生体由来の異なるグリコシル転移酵素の組合せ
により合成される、グラム陽性菌の莢膜多糖によりN-グリコシル化されたタンパク質の生
成を指向している。本発明は更に、グラム陽性原核生物にのみ固有のグリコシル転移酵素
をコードしている導入されたヌクレオチド配列を含む宿主原核生物におけるグリコシル化
されたタンパク質の生成を指向している。
本発明は、配列番号:2、配列番号:3及び配列番号:4の1つ以上を含むプラスミドなどの
、プラスミドを更に指向している。また本発明は、配列番号:6；配列番号:7；配列番号:8
及び配列番号:16の1つ以上を含むプラスミドも含む。本発明はまた、配列番号:10；配列
番号:11；及び配列番号:12の1つ以上を含むプラスミドにも関する。更に本発明は、配列
番号:13；配列番号:15；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:18；配列番号:19；配列番
号:20；配列番号:21及び配列番号:27の1つ以上を含むプラスミドを指向している。
加えて本発明は、例えば、配列番号:2；配列番号:3；配列番号:4；配列番号:17；配列
番号:18；配列番号:19及び配列番号:20；配列番号:21；及び配列番号:27の1つ以上を含む
プラスミドにより形質転換された細菌細胞などの、形質転換された細菌細胞を指向してい
る。本発明は更に、配列番号:5；配列番号:8；配列番号:9；配列番号:10；配列番号:11；
配列番号:12；配列番号:13；配列番号:14；配列番号:15及び配列番号:16の1つ以上を含む
プラスミドにより形質転換された細菌細胞を指向している。
本発明は更に、哺乳動物においてグラム陽性菌及び他の細菌により引き起こされた感染
症に対し免疫反応を誘導する方法を指向している。一実施態様において、本方法は、該哺
乳動物へ、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tを含むタンパク質
であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；並び
に、該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の1種以上のオリゴ糖又は多糖で
あって、この1種以上のオリゴ糖又は多糖が、該1種以上のオリゴ糖又は多糖のうちの他の
ものと同じか又は異なる、前記1種以上のオリゴ糖又は多糖：を含有する医薬組成物の有
効量を投与することを含む。
別の態様において、本発明は、全体又は一部を、標的多糖によるタンパク質のグリコシ
ル化において使用するための、該標的多糖を同定する方法を特徴としている。該標的多糖
を含むグリコシル化されたタンパク質は、例えば、ワクチン組成物内で使用することがで
きる。一実施態様において、標的多糖を同定する方法は、黄色ブドウ球菌などのグラム陽
性菌を標的として同定する工程；少なくとも3つのモノマーを含む該グラム陽性菌により
生成された多糖の第一の反復単位を同定する工程；該第一の反復単位と同じモノマーの2
つを含む第二の反復単位を含むグラム陰性種の細菌により生成された多糖を同定する工程
：を含む。
本発明はまた、グラム陰性種などの第一の細菌種の細菌を改変する方法を指向している
。一実施態様において、本方法は、3つのモノマーを含む、黄色ブドウ球菌などのグラム
陽性種の多糖の第一の反復単位を同定する工程；第一の反復単位と同じモノマーを2つ含
む別の反復単位を含む第二のグラム陰性種の細菌により生成された多糖を同定する工程；
該第一のグラム陰性種の細菌に、a)該第二の反復単位；及び、b)該第二の反復単位には存
在しない該第一の反復単位のモノマー：を含む三糖を集成するグリコシル転移酵素をコー
ドしている1種以上のヌクレオチド配列を挿入する工程；タンパク質をコードしているヌ
クレオチド配列を挿入する工程；並びに、OTaseをコードしているヌクレオチド配列を挿
入する工程：を含む。
(図面の簡単な説明)
図1は、緑膿菌O11 O抗原生合成により例示された、wzx/wzy-依存型O抗原生合成の経路を図示している。ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン一リン酸(UMP)を含む、示された反応に責任のある推定タンパク質名は、矢印の上下に示している。
図2は、大腸菌における操作された黄色ブドウ球菌莢膜多糖血清型5型(CP5)の生合成に関する提唱された経路を図示している。緑膿菌O11のO抗原クラスターにより提供された酵素は、図1に示されている。黄色ブドウ球菌CP5由来の酵素は、Cap5として示されている(図6と比較)。WecB及びWecCは、UDP-ManNAcAの生成に必要な大腸菌酵素である。他の図示されたタンパク質及び酵素は、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン一リン酸(UMP)、及びコエンザイムA(CoA)を含む。
図3は、操作された黄色ブドウ球菌莢膜多糖血清型8型(CP8)生合成の提唱された経路を図示している。遺伝子名は、矢印により示している(図1、2及び6と比較)。UDP、UMP：ウリジン二リン酸、ウリジン一リン酸。CoA：コエンザイムA。
図4は、莢膜黄色ブドウ球菌及び緑膿菌O抗原の反復単位(RU)構造の構造上の重複を図示している。
図5Aは、黄色ブドウ球菌酵素による不完全O11 O抗原のRU(反復単位)の伸長のSDS-PAGE分析を図示している。
図5Bは、黄色ブドウ球菌酵素による不完全O11 O抗原のRUの伸長の免疫検出を図示している。
図6は、キメラO11/CP5及びO11/CP8遺伝子クラスターの構築に関する本発明の実施態様における戦略を図示している。
図7Aは、大腸菌脂質抽出物において検出された本発明の実施態様の重合されたCP5 LPSを図示している。
図7Bは、大腸菌脂質抽出物において検出された本発明の実施態様の重合されたCP8 LPSを図示している
図8Aは、W3110ΔwecA細胞におけるキメラクラスターを含むpLAFRプラスミド上の抗生物質耐性遺伝子に依存した、SDS-PAGE分析及び銀染色された本発明の実施態様の組換えCP5 LPS生成を図示している。
図8Bは、W3110ΔwecA細胞におけるキメラクラスターを含むpLAFRプラスミド上の抗生物質耐性遺伝子に依存した、SDS-PAGE分析、銀染色及び免疫検出された本発明の実施態様の組換えCP5 LPS生成を図示している。
図9は、W3110ΔwecA細胞におけるキメラクラスターの前のプロモーターに依存した、SDS-PAGE分析、及び免疫検出された本発明の実施態様の組換え CP5 LPS生成を図示している。
図10Aは、キメラCP5クラスター(配列番号:2)を使用し生成された本発明のCP5の組換えRUの実施態様のHPLC分析の結果を示す。
図10Bは、cap8Iポリメラーゼを欠損しているキメラCP8クラスターを使用し生成された本発明のCP8の組換えRUの実施態様のHPLC分析の結果を示す。
図11Aは、図10Aに示された37分時点で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP5クラスターの実施態様の発現により発生した特異的ピークのMALDI-MS/MS分析の結果を示す。
図11Bは、図10Aに示された40分時点で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP5クラスターの実施態様の発現により発生した特異的ピークのMALDI-MS/MS分析の結果を示す。
図11Cは、図10Bに示された32分時点で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP8クラスターの実施態様の発現により発生した特異的ピークのMALDI-MS/MS分析の結果を示す。
図11Dは、図10Bに示された38分時点で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP8クラスターの実施態様の発現により発生した特異的ピークのMALDI-MS/MS分析の結果を示す。
図11Eは、図10Bに示された45分時点で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP8クラスターの実施態様の発現により発生した特異的ピークのMALDI-MS/MS分析の結果を示す。
図11Fは、グリカン構造最適化の実施態様のHPLC分析の結果を示す。
図11G(図11G-1を含む)は、本発明の実施態様において大腸菌細胞のUndPP上に存在する完全CP5グリカンレパトアのHPLC分析の結果を表している。
図11Hは、本発明の実施態様において脱アセチル化されたCP5グリカン及びRU均一性のHPLC分析の結果を提示している。
図11Iは、本発明の実施態様において大腸菌細胞のUndPP上に存在するCP8グリカンレパトアのHPLC分析の結果を提供している。
図11Jは、本発明の実施態様におけるCP8グリカンの脱アセチル化及びRU均一性のHPLC結果を示している。
図11Kは、本発明の実施態様におけるCP8キメラクラスターとのwzzO7の同時発現により誘導されたRU重合の減少及びLLOの増加を示す、HPLC結果を表している。
図12は、黄色ブドウ球菌フリッパーゼ遺伝子cap5Kを伴わない及び伴う本発明の実施態様における細胞由来のNi2+アフィニティクロマトグラフィーで精製されたEPA-CP5バイオコンジュゲート(配列番号:2及び3)のSDS-PAGE分析の結果を示している。
図13Aは、Ni2+アフィニティクロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製された本発明の実施態様に従うCP5-EPAバイオコンジュゲートの分析を表している。
図13Bは、本発明の実施態様に従うO-アセチル化されたRU質量にN-グリコシド結合されたトリプシン処理されたペプチド
Figure 2017036303
 中のグリコシル化部位に関して認められたM/Z質量(m/z=2088([M+H]+))を図示している。
差込図は、このペプチドに結合されたRU構造を図示している。
図13Cは、本発明の実施態様に従うO-アセチル化されたRU質量にN-グリコシル化により結合されたトリプシン処理されたペプチド
Figure 2017036303
 中のグリコシル化部位に関して認められたM/Z質量(m/z=1165 ([M+H]+))を図示している。
差込図は、このペプチドに結合されたRU構造を図示している。
図13Dは、Ni2+アフィニティクロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーで精製された本発明の実施態様に従うCP8-EPAバイオコンジュゲートの分析を図示している。
図13Eは、本発明の実施態様に従うグライココンジュゲート生成に関する3プラスミド(左側レーン)又は2プラスミド(右側レーン)のいずれかを含む細胞由来の精製されたCP5-EPAバイオコンジュゲートを図示している。
図13Fは、Ni2+アフィニティクロマトグラフィーで精製された本発明の実施態様に従うCP8-EPAバイオコンジュゲートの分析を図示している。
図14Aは、図13Aからの3プラスミドシステムを使用し生成された本発明の実施態様の精製されたCP5-EPAバイオコンジュゲートの高質量(High Mass)MALDI分析を表している。
図14Bは、図13Aからの3プラスミドシステムを使用し生成された本発明の実施態様のCP5-EPAバイオコンジュゲートのサイズ排除クロマトグラフィーによる特徴を示している。
図14Cは、本発明の実施態様に従う精製されたCP5-HlaバイオコンジュゲートのSDS PAGE分析及び免疫検出を示している。
図14Dは、本発明の実施態様に従う精製されたCP5-AcrAバイオコンジュゲートの結果を表している。
図14Eは、本発明の実施態様に従う精製されたCP5-ClfAバイオコンジュゲートの結果を表している。
図15Aは、本発明の実施態様に従うCP5-EPAバイオコンジュゲートによりマウスにおいて生じた特異的抗CP5抗体を図示している。
図15Bは、本発明の実施態様に従うCP5-EPAバイオコンジュゲートによりウサギにおいて生じた特異的抗CP5抗体を図示している。
図16Aは、本発明の実施態様に従うCP5-EPAによるウサギの免疫付与により生じたCP5特異的抗体のインビトロオプソニン食作用活性(黄色ブドウ球菌Reynolds株に対する)を例示している。
図16Bは、本発明の実施態様に従うCP5-EPAによるウサギの免疫付与により生じたCP5特異的抗体のインビトロオプソニン食作用活性(黄色ブドウ球菌USA100株に対する)を例示している。
図17Aは、黄色ブドウ球菌Reynolds株の〜3.6×107 CFUにより腹腔内(i.p.)チャレンジされたマウスにおける、本発明の実施態様に従う、抗CP5-EPA抗体を使用する受動免疫の結果を図示している。
図17Bは、2mg CP5-EPA IgGを注射したマウスにおける、本発明の実施態様に従う、抗CP5-EPA抗体を使用する受動免疫の結果を図示している。
図17Cは、300μg CP5-EPA IgGを注射したマウスにおける、本発明の実施態様に従う、抗CP5-EPA抗体を使用する受動免疫の結果を図示している。
図18は、チャレンジのために本発明の実施態様に従うワクチンとしてのCP5-EPAの様々な投与量及びマウス菌血症モデルを使用する、能動免疫アッセイの結果を図示している。
(発明の詳細な説明)
本発明の実施態様に従い、今回グラム陽性生体由来のLPS多糖は、グラム陰性生体にお
いて生成されることが示された。本発明者らは、これは先行技術からの重要で且つ著しい
逸脱を表す新規の結果であると考えている。
本発明の範囲内の核酸は、「配列表」に含まれた本発明の核酸により例示されている。
宿主細胞における発現が可能である免疫原性成分又はそれらの一部をコードしている核酸
はいずれも、本発明において使用することができる。以下の配列の説明は、本出願を通じ
て使用されるいくつかの用語の理解を促進するために提供されており、且つ本発明の実施
態様を限定するものとして構成されるものではない。
配列番号:1は、EcoRI部位内に緑膿菌PAO103由来のO11 O抗原配列を含む、pLAFR1(Gene
Bank寄託番号AY532632.1)、相補鎖(Gen Bank寄託番号AF236052に一部由来)を示す。
配列番号:2は、相同組換えによりwbjA-wzyと交換するcap5HIJ遺伝子を伴うpLAFR1-O11
に対応するCP5キメラクラスターを含むpLAFR1を示す。挿入された配列は、相同組換えさ
れたクローンの選択のためのcatカセットも含む。
配列番号:3は、相同組換えによりwbjA-wzyと交換するcap5HIJ遺伝子、及びcap5Jとcat
カセット間にクローニングされたcap5Kを伴うpLAFR1-O11に対応する、cap5Kフリッパーゼ
遺伝子を伴うCP5キメラクラスターを含むpLAFR1を示す。
配列番号:4は、wbjA-wzyと交換するcap8KHIJ遺伝子を伴うpLAFR1-O11に対応する、フリ
ッパーゼ遺伝子を含むCP8キメラクラスターを含むpLAFR1を示す。挿入された配列は、相
同組換えされたクローンの選択のためのcatカセットも含む。
配列番号:5は、Hla H35L生成のための発現プラスミドを示している。Hla H35Lをコード
しているORFは、pEC415のNdeI/SacIにクローニングされている。
配列番号:6は、Hla-H35L部位202生成のための発現プラスミドを示している。このORFは
、大腸菌由来のN-末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸202位の周りの糖化部位(glycosit
e)、及びC-末端His-タグをコードしている。この構築体は、pEC415上でNheI/SalIにクロ
ーニングされる。
配列番号:7は、Hla-H35L部位238生成のための発現プラスミドを示している。このORFは
、大腸菌由来のN-末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸238位の周りの糖化部位、及びC-
末端His-タグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheI/SalIにクローニング
される。
配列番号:8は、Hla-H35L部位272生成のための発現プラスミドを示している。このORFは
、大腸菌由来のN-末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸272位の周りの糖化部位、及びC-
末端His-タグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheI/SalIにクローニング
される。
配列番号:9は、ClfA生成のための発現プラスミドを示している。この遺伝子は、化学的
に合成され、且つpEC415発現ベクター内のNdeI/SacIへクローニングされている。
配列番号:10は、ClfA部位290生成のための発現プラスミドを示している。このORFは、
大腸菌由来のN-末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸290位の周りの糖化部位、及びC-末
端His-タグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheI/SalIにクローニングさ
れている。
配列番号:11は、ClfA部位327生成のための発現プラスミドを示している。このORFは、
大腸菌由来のN-末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸327位の周りの糖化部位、及びC-末
端His-タグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheI/SalIにクローニングさ
れている。
配列番号:12は、ClfA部位532生成のための発現プラスミドを示している。このORFは、
大腸菌由来のN-末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸532位の周りの糖化部位、及びC-末
端His-タグをコードしている。前述の構築体は、pEC415上でNheI/SalIにクローニングさ
れている。
配列番号:13は、シグナル配列並びに260位及び402位に2つのグリコシル化部位を有する
、遺伝子的に解毒されたEPA組換え体のアミノ酸配列を示している。
配列番号:14は、シグナル配列を有さず、並びに241位及び383位に2つのグリコシル化部
位を有する、遺伝子的に解毒されたEPA組換え体のアミノ酸配列を示している。
配列番号:15は、NheI/SalIを介しpEC415へクローニングされたAcrAをコードしているOR
Fを示している。
配列番号:16は、Hla-H35L部位130生成のための発現プラスミドを表している。このORF
は、大腸菌由来のN-末端DsbAシグナルペプチド、アミノ酸130位の周りの糖化部位、及びC
-末端His-タグをコードしている。前述の構築体は、NheI/SalIでpEC415へクローニングさ
れている。
配列番号:17は、cap5Kフリッパーゼ、それに続く大腸菌血清型O121のgalFとwbqAの間の
インタージーン(intergene)DNA配列並びにpglB ORFからなるpglB発現カセットを伴う、CP
5産生遺伝子クラスターを示している。この挿入断片は、pLAFR1のEcoRI部位にクローニン
グされる。
配列番号:18は、cap8Kフリッパーゼ、それに続く大腸菌血清型O121のgalFとwbqAの間の
インタージーンDNA配列並びにpglB ORFからなるpglB発現カセットを伴う、CP8産生遺伝子
クラスターを示している。この挿入断片は、pLAFR1のEcoRI部位にクローニングされる。
配列番号:19は、cap8Kフリッパーゼ、それに続く大腸菌血清型O121のgalFとwbqAの間の
インタージーンDNA配列並びにpglB ORFからなるpglB発現カセットを伴う、CP8産生遺伝子
クラスターを示し、加えてこの配列は、SfaAI/BspTIへと、すなわち緑膿菌O11のwzxとcap
8Hの間にクローニングされた大腸菌血清亜型(serovar)O7のwzzの遺伝子を有する。この挿
入断片は、pLAFR1のEcoRI部位にクローニングされる。
配列番号:20は、EPA及びwzzのための発現プラスミドを示している。この骨格は、耐性
カセットが交換されている(クロラムフェニコールとカナマイシンを)pACT3である。
配列番号:21は、pext21 Eco/Salにクローニングされた大腸菌血清型O7のwzzを示してい
る。
配列番号:22は、実施例に示したペプチド配列を示している。
配列番号:23は、実施例に示したペプチド配列を示している。
配列番号:24は、X及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい、タンパ
ク質コンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tを示している。
配列番号:25は、グリコシル化部位を示している。
配列番号:26は、グリコシル化部位を示している。
配列番号:27は、EcoRI/BamHI部位にクローニングされたpglB ORFを含む発現プラスミド
を示している。
用語及び略語の説明は、本明細書において使用されるように以下に記載し、かつ当業者
に公知の用途と一致している。これらの説明は、そのような用語及び略語の理解を促進す
るために提供され、かつ本発明の実施態様を限定するものとして構成されるものではない
。
AcrAとは、C.ジェジュニ由来の糖タンパク質をいう。
能動免疫とは、抗原への曝露後の免疫(抗体)の誘導をいう。
APCとは、抗原提示細胞をいう。
Ampとは、アンピシリンをいう。
菌血症とは、循環血中の生存可能な細菌の存在をいう。
C'とは、補体をいう。
CapAは、黄色ブドウ球菌CP5における鎖長の決定因子であると提唱されている酵素であ
る。
CapBは、黄色ブドウ球菌CP5における多糖鎖の長さの調節因子であると提唱されている
酵素である。
CapCは、黄色ブドウ球菌CP5における輸送タンパク質をコードしていると提唱されてい
る酵素である。
CapDは、4,6デヒドラターゼ活性を有する酵素であり、且つ黄色ブドウ球菌CP5において
、前駆体UDPGlcNAcを、UDP-2-アセトアミド-2,6-ジデオキシ-D-キシロ-4-ヘキスロースへ
転換する。
CapEは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDP-D-GlcNAcのUDP-2-アセトアミド-2,6-ジデオキ
シ-D-リキソ-4-ヘキスロースへのエピマー化を触媒する、4,6-デヒドラターゼ3,5-エピメ
ラーゼである。
CapFは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDP-2-アセトアミド-2,6-ジデオキシ-D-リキソ-4-
ヘキスロースからUDP-L-6dTalNAcへの還元を触媒する、レダクターゼである。
CapGは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDP-L-6dTalNAcからUDP-LFucNAcへのエピマー化を
触媒する、2-エピメラーゼである。
黄色ブドウ球菌CP5中のCapHは、O-アセチル転移酵素である。
CP8中のCapHは、黄色ブドウ球菌CP5由来のCapIに類似した転移酵素である。
黄色ブドウ球菌CP5中のCapIは、UDP-ManNAcAのキャリア脂質-D-FucNAc-L-FucNAcへの転
移を触媒し、キャリア脂質-D-FucNAc-L-FucNAc-ManNAcAを生成するグリコシル転移酵素で
ある。
CP8中のCapIは、黄色ブドウ球菌CP5中のCapJに類似したポリメラーゼである。
黄色ブドウ球菌CP5中のCapJは、ポリメラーゼである。
CP8中のCapJは、黄色ブドウ球菌CP5中のCapHに類似したO-アセチル転移酵素である。
黄色ブドウ球菌CP5中のCapKは、フリッパーゼである。
黄色ブドウ球菌CP8中のCapKは、CP5中のCapKに類似したフリッパーゼである。
CapLは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDP-L-FucNAcのD-FucNAc-キャリア脂質上への転移
を触媒し、キャリア脂質-D-FucNAc-L-FucNAcを生成する転移酵素である。
CapMは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDP-D-FucNAcのキャリア脂質上への転移を触媒し
、キャリア脂質-D-FucNAcを生成する転移酵素である。
CapNは、黄色ブドウ球菌CP5におけるUDP-2-アセトアミド-2,6-ジデオキシ-D-キシロ-4-
ヘキスロースのUDP-D-FucNAcへの還元を触媒する4-レダクターゼである。
CapOは、黄色ブドウ球菌CP5における、UDP-D-ManNAcのUDP-ManNAcAへの転換を触媒する
デヒドロゲナーゼである。
CapPは、黄色ブドウ球菌CP5における、UDP-D-GlcNAcのUDP-D-ManNAcへのエピマー化を
触媒する2-エピメラーゼである。
CFUとは、コロニー形成単位を指す。
ClfAとは、細胞壁にアンカーされたタンパク質である、黄色ブドウ球菌クランピング因
子Aを指す。
コンジュゲートワクチンとは、多糖抗原のキャリアタンパク質への共有的結合により作
製されたワクチンをいう。コンジュゲートワクチンは、抗菌性免疫反応及び免疫記憶を誘
起する。乳児及び高齢者において、多糖抗原に対する防御免疫反応は、これらの抗原が、
T細胞依存性反応を誘導するタンパク質とコンジュゲートされた場合に、誘導され得る。
コンセンサス配列とは、その配列内に、N-結合型糖タンパク質への炭水化物結合部位が
認められる、アミノ酸の配列-D/E-X-N-Z-S/T-をいい、ここでX及びZはプロリン以外の任
意の天然のアミノ酸であってよい。
莢膜多糖は、その天然の形状において、多糖の厚い粘膜様の層をいい、水溶性であり且
つ通常酸性である。天然の莢膜多糖は、1個から数個の単糖/モノマーの規則的反復単位か
らなる。
CP5とは、黄色ブドウ球菌5型莢膜多糖又は血清型5型莢膜多糖を指す。
CP8とは、黄色ブドウ球菌8型莢膜多糖又は血清型8型莢膜多糖を指す。
D-FucNAcとは、N-アセチル D-フコサミンを指す。
ECAとは、腸内細菌共通抗原を指す。
ELISAとは、試料中の抗体又は抗原の存在を検出するために、主に免疫学において使用
される生化学技術である、酵素結合免疫吸着アッセイをいう。
EPA又はEPArとは、無毒の組換え緑膿菌エキソプロテインAをいう。
グライココンジュゲートワクチンとは、抗原性又は免疫原性オリゴ糖に結合されたタン
パク質キャリアを含むワクチンをいう。
グリコシル転移酵素とは、単糖単位の、活性化されたヌクレオチド糖からグリコシルア
クセプター分子への転移に関して触媒として作用する酵素をいう。
グラム陽性菌株とは、グラム染色(有益な診断ツール)により紫色に染まる細菌株をいう
。グラム陽性菌は、ペプチドグリカン(細胞壁のおよそ50〜90％)で生成された厚いメッシ
ュ様の細胞壁を有する。
グラム陰性菌株とは、ピンク色に染まる薄い層(細胞壁のおよそ10％)を有する細菌株を
いう。グラム陰性菌は、脂質を含み、且つ細胞膜周辺腔により細胞壁から隔てられている
、追加の外膜も有する。
Hla(α毒素)とは、黄色ブドウ球菌の分泌型膜孔形成毒素及び必須病原因子抗原である
α溶血素をいう。
Hla H35Lとは、黄色ブドウ球菌由来のHla無毒のα-毒素変異体である変異型をいう。
ヒスチジンタグ、又はポリヒスチジン-タグは、多くはタンパク質のN-又はC-末端にあ
る、少なくとも5個のヒスチジン(His)残基からなるタンパク質内のアミノ酸の一部分であ
り、ニッケルアフィニティカラムへの特異的結合により簡便且つ迅速な様式で精製するた
めに使用される。
IVとは、静脈内を指す。
kDaとは、キロダルトンを指し、これは原子質量単位である。
L-FucNAcとは、N-アセチルL-フコサミンを指す。
LPSとは、リポ多糖を指す。リポ多糖(LPS)は、リポグリカンとしても知られ、共有結合
により結合された脂質と多糖からなる大型分子であり；これらは、グラム陰性菌の外膜中
に認められ、内毒素として作用し、且つ動物において強力な免疫反応を誘発する。
ManNAcAとは、N-アセチルマンノサミンウロン酸を指す。
メチシリン-耐性黄色ブドウ球菌株(MRSA)とは、より長期の入院、及びより多くの抗生
物質投与につながる集中治療室でのより多くの感染症に関連している、メチシリン-耐性
黄色ブドウ球菌株をいう。
N-グリカン又はN-結合型オリゴ糖とは、N-グリコシド結合を介してタンパク質のアスパ
ラギン残基のε-アミド窒素に結合されている、変動し得る組成の単糖、オリゴ糖又は多
糖をいう。
N-結合型タンパク質グリコシル化とは、「グリカン」(単糖、オリゴ糖又は多糖)を、標
的タンパク質のアスパラギン(N)側鎖の窒素へ共有結合するプロセス又は経路をいう。
O抗原又はO多糖とは、LPS内に含まれる反復グリカン重合体をいう。O抗原は、コアオリ
ゴ糖に結合され、且つLPS分子の最も外側ドメインを構成している。
オリゴ糖又は多糖とは、共有結合された炭水化物(単糖)により形成されたホモ重合体又
はヘテロ重合体をいい、且つグリコシド結合により一緒に結合された反復単位(単糖、二
糖、三糖など)を含むが、これらに限定されるものではない。
オプソニン食作用活性とは、補体及び特異的抗体の存在下での病原体の食作用をいう。
血清抗体のインビトロオプソニン食作用活性(OPA)は、インビボにおける抗体の機能活性
を表し、従って防御免疫と相関していると考えられる。
OTase又はOSTとは、新生タンパク質又は折り畳みタンパク質のコンセンサス配列におい
て、オリゴ糖又は多糖のアスパラギン(N)残基への機構的に独自かつ選択的な転移(グリコ
シル化)を触媒する、オリゴ糖転移酵素をいう。
受動免疫とは、一個体から別の個体への、既に産生された抗体の形での活性のある体液
性免疫の移入である。
細胞膜周辺腔とは、グラム陰性菌の内側細胞膜と外側外膜の間の空間をいう。
PMNとは、ヒト及び多くの(全てではない)哺乳動物の末梢血内で最も豊富な白血球細胞
である多形核好中球をいう。
タンパク質キャリアとは、それにオリゴ糖又は多糖が結合されるコンセンサス配列を含
むタンパク質をいう。
RUとは、個々の単糖のオリゴ糖又は多糖への集成により合成された特異的多糖を構成す
る反復単位を指す。
シグナル配列とは、タンパク質を異なる位置へと方向付けるタンパク質のN-末端の、短
い(例えば約3〜60個のアミノ酸長)のペプチドをいう。
UDP-D-ManNAcは、UDP-N-アセチル-D-マンノサミンである。
UDP-D-ManNAcAは、UDP-N-アセチル-D-マンノサミンウロン酸である。
UDP-D-QuiNAcは、UDP-N-アセチル-D-キノボサミンである。
UDP-L-FucNAcは、UDP-N-アセチル-L-フコサミンである。
UDP-L-6dTalNAcは、UDPN-アセチル-L-プノイモサミンである。
Undとは、11個のプレノール単位で構成されたウンデカプレニル又はウンデカプレノー
ル脂質である。
UndPとは、細菌細胞エンベロープへと輸送される炭水化物重合体のための、グリカン生
合成の中間体の普遍的脂質キャリア(Und由来)である、ウンデカプレニルリン酸をいう。
UndPPとは、UndPのリン酸化型である、ウンデカプレニルピロリン酸をいう。
wbjAは、緑膿菌O11のグルコシル転移酵素である。
wbjBは、黄色ブドウ球菌CP5及びCP8の莢膜生合成に必要な酵素に類似した推定エピメラ
ーゼである。
wbjCは、緑膿菌O11の推定エピメラーゼである。
wbjDは、緑膿菌O11の推定エピメラーゼである。
wbjEは、緑膿菌O11の推定エピメラーゼである。
wbjFは、緑膿菌O11のグリコシル転移酵素である。
wbpLは、緑膿菌O11におけるLPS生合成に参加するグリコシル転移酵素である。
wbpMは、緑膿菌O11におけるLPS生合成に参加するグリコシル転移酵素である。
本発明の実施態様は、C.ジェジュニは原核生物では一般的でない特徴である全般的N-結
合型タンパク質グリコシル化システムを持っているという発見を、少なくとも一部基にし
ている。C.ジェジュニの様々なタンパク質は、七糖により改変されることが示されている
。この七糖は、特異的グリコシル転移酵素により触媒されるヌクレオチド活性化された単
糖の段階的付加により、内膜の細胞質側において、キャリア脂質であるUndPP上に集成さ
れる。次に脂質-結合されたオリゴ糖は、例えばPglKなどのフリッパーゼにより細胞膜周
辺腔へとフリッピングされる(すなわち横断的に拡散する)。N-結合型タンパク質グリコシ
ル化の最終段階において、OTase(例えば、PglB)は、オリゴ糖の、キャリア脂質からコン
センサス配列Asp/Glu-Xaa-Asn-Zaa-Ser/Thr(すなわちD/E-X-N-Z-S/T)内のAsn残基への転
移を触媒し、ここでXaa及びZaaは、Pro以外の任意のアミノ酸であることができる。本発
明者らは、七糖のためのグリコシル化クラスターを大腸菌へと巧く転移させることができ
、且つカンピロバクターのN-結合型糖タンパク質を生成することができた。
大腸菌などのグラム陰性宿主細菌を改変するための新規且つ独創的方法は、黄色ブドウ
球菌などのグラム陽性菌に対するワクチン製品として使用されるグリコシル化タンパク質
を生成するために開発された。この方法の開発は、重大で多くの点で予想外の問題点を克
服し、並びに従来の英知及び先行技術から実質的に離れることが必要であった。
この新規且つ独創的方法において、例えば黄色ブドウ球菌などの標的生体の関心対象の
多糖に類似した構造を有する多糖を生成する別のグラム陰性菌が同定された。本発明の目
的に関して、構造類似性は、それ自身、同定された他のグラム陰性菌の多糖における反復
単位と部分的に同一である標的(例えば黄色ブドウ球菌)の多糖における反復単位として現
れる。前者の細菌は、宿主、例えば大腸菌生体のようにグラム陰性であるので、本発明者
らは、改変された大腸菌生体におけるその生合成経路の使用は、構築されたRU抗原の生合
成、及び改変された大腸菌生体の細胞質からペリプラズムへのそのフリッピングを可能に
するであろうということを最初に仮定した(そして後に以下に考察したように実験により
実証した)。更に本発明者らは、この生合成経路を介して生成された多糖のサイズは、グ
ラム陽性黄色ブドウ球菌の生合成経路により生成された多糖よりも、はるかに小さいであ
ろうということを仮定した(そして後に以下に考察したように実験により実証した)。
結果として、そして以下に考察したように、本発明者らが開発した新規且つ独創的な方
法は、前述の困難な問題点を解決した。
更に驚くべきことに、以下に詳述するように、グラム陰性生体におけるLPS経路の態様
を使用し、例えば黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌に固有の莢膜多糖と同じ反復単位を
いくつか含む多糖を生成することができることがわかった。
従って、黄色ブドウ球菌のためのグリコシル化タンパク質ワクチンの多糖セクションの
製造において、ひとつの驚くべき解決法は、少なくとも部分的に大腸菌のようなグラム陰
性菌に固有の多糖を基にした多糖セクションの構築である。本発明者らは更に、それを実
行する過程で、黄色ブドウ球菌により生成される関心対象の多糖に可能な限り類似してい
る多糖を生成する細菌を見つけることは、明らかに重要であることを発見した。そのよう
な細菌は、緑膿菌である。
図1は、本明細書に照らして当業者に明らかであるように、グラム陰性宿主細胞のO抗原
クラスターに提供された酵素によるか、又はハウスキーピング酵素によるかのいずれかの
、細胞質におけるヌクレオチド-活性化された単糖の調製の具体例の段階的描写を提供し
ている。本プロセスの段階は、図1の描写において左から右へと進む。図1に図示された具
体例において、グリコシルリン酸転移酵素(WbpL)は、D-FucNAcリン酸をUndPに付加し、Un
dPP-FucNAcを形成する。次に特異的グリコシル転移酵素は、更に反復単位(RU)オリゴ糖を
形成する単糖の付加(WbjE、WbjA)により、UndPP-D-FucNAc分子を伸長する。次にRUは、Wz
xタンパク質により細胞膜周辺腔へとフリッピングされる。Wzy酵素は、ペリプラズムRUを
重合し、O抗原多糖を形成する。重合体長は、Wzzタンパク質により制御される。多くの細
菌性オリゴ糖及び多糖は、UndPP上で集成され、次に他の分子へ転移される。別の表現を
すると、UndPPは、細菌における糖に関する全般的結合のプラットフォームである。大腸
菌、及び考えられる限りはほとんどの他のグラム陰性菌において、O抗原は、大腸菌酵素W
aaLにより、UndPPからリピドAコアへと転移され、リポ多糖(LPS)を形成する。
図2は、本明細書に照らして当業者に明らかであるように、緑膿菌O11のO抗原クラスタ
ーにおいて提供された酵素による、グラム陰性宿主細胞のハウスキーピング酵素による、
並びにUDP-ManNAcA生合成に必要であることがわかっている黄色ブドウ球菌及び/又は大腸
菌酵素(Cap5OP及び/又はWecBC)による、細胞質におけるヌクレオチド-活性化された単糖
調製の具体例を図示している。本プロセスの段階は、図2の描写において左から右へと進
む。O11生合成のように、WbpL及びWbjEは、コア二糖を合成する。次に黄色ブドウ球菌グ
リコシル転移酵素Cap5Iは、D-ManNAcAを付加する。Cap5Hは、アセチル基を2番目のFucNAc
残基へ付加する。アセチル化は、図2に示されるように、RU合成の最終段階であることが
できる。フリッピングは、緑膿菌の組換え発現されたWzx又はCap5Kであるか、又は例えば
大腸菌染色体においてコードされたECAクラスターなどの内因性に発現されたWzx-様酵素
である、本システムにおけるWzxタンパク質の1つ又は全てにより可能である。重合は、Ca
p5Jポリメラーゼに独占的な活性であり、UndPP上にCP5多糖を形成する。他のUndPP結合さ
れた多糖のように、CP5糖質は、大腸菌酵素WaaLにより、リピドAコアに転移され、組換え
LPS(LPS莢膜)を形成する。
図3は、本明細書に照らして当業者に明らかであるように、緑膿菌O11のO抗原クラスタ
ーにおいて提供された酵素による、グラム陰性宿主細胞のハウスキーピング酵素による、
並びにUDP-ManNAcA生合成に必要であることがわかっている黄色ブドウ球菌及び/又は大腸
菌酵素(Cap8OP及び/又はWecBC)による、細胞質におけるヌクレオチド-活性化された単糖
の調製を図示している。本プロセスの段階は、図3の描写において左から右へと進む。O11
生合成のように、WbpL及びWbjEは、コア二糖を合成する。次に黄色ブドウ球菌グリコシル
転移酵素Cap8Hは、D-ManNAcAを付加する。Cap8Jは、アセチル基を2番目のFucNAc残基へ付
加する。アセチル化が、活性化された糖又はRUへ結合した脂質において生じるかどうかは
不明である。フリッピングは、緑膿菌の組換え発現されたWzx又はCap8Kであるか、又は例
えば大腸菌染色体においてコードされたECAクラスターなどの内因性に発現されたWzx-様
酵素である、本システムにおいてWzxタンパク質の1つ又は全てにより可能である。重合は
、Cap8Iポリメラーゼに独占的な活性であり、UndPP上にCP8多糖を形成する。次にCP8糖質
は、大腸菌において酵素WaaLにより、リピドAコアに転移される。
図4は、O11、CP5及びCP8多糖の異なる構造を図示している。図4において、これらのRU
は、UndPP及び二糖α-D-FucNAc-(1,3)-L-FucNAcからなる同一の基幹構造を共有している
ことが示されている。黄色ブドウ球菌RUは、中央のL-FucNAc残基又はManNAcA残基上のい
ずれかで、1個のO-アセチル基により部分的に修飾され、これは黄色ブドウ球菌RUに特徴
的である。黄色ブドウ球菌RUにおける2番目及び3番目の糖の結合性は、それらの間で異な
り、更には重合されたRU間の結合性も異なる。右側は、異なる表現の糖構造を示している
。後ろ向き矢印の数字(CP5及びCP8)は、O-アセチル基により修飾された炭素の位置を示し
ている。RU構造の別の表現を左下側に示している。図4に示したように、緑膿菌に固有の
多糖の一部であるO11抗原のRUと、ブドウ球菌の各菌株のCP5及びCP8莢膜のRUとの間には
、大きい重複が存在する。特に図4に示すように、RUのL-FucNAc--＞D-FucNAc部分は、両
方において同一である。
別の態様において、本発明は、全体又は一部において、標的多糖によるタンパク質のグ
リコシル化において使用するための該標的多糖を同定する方法を特徴としている。該標的
多糖を含むグリコシル化タンパク質は、例えばワクチン組成物において使用することがで
きる。標的多糖を同定する方法は、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌を標的として同定
する工程；少なくとも3つのモノマーを含む該グラム陽性菌により生成された多糖の第一
の反復単位を同定する工程；該第一の反復モノマー単位と同じモノマーを少なくとも2つ
含む第二の反復単位を含むグラム陰性種の細菌により生成された多糖を同定する工程：を
含む。
従って本発明の一実施態様において、第一のグラム陰性種の細菌を改変する方法は、黄
色ブドウ球菌などのグラム陽性菌を標的として同定する工程；少なくとも3つのモノマー
を含む該グラム陽性菌により生成された多糖の第一の反復単位を同定する工程；該第一の
反復単位と同じモノマーを少なくとも2つ含む第二の反復単位を含む第二のグラム陰性種
の細菌により生成された多糖を同定する工程；a)該第二の反復単位；及び、b)該第二の反
復単位には存在しない該第一の反復単位のモノマー：を含む、三糖を集成するグリコシル
転移酵素をコードしている1種以上のヌクレオチド配列を、該第一のグラム陰性種の細菌
に挿入する工程；少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tを含むタン
パク質であり、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいものな
どのタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程；並びに、OTaseをコ
ードしているヌクレオチド配列を挿入する工程：を含む。
本発明の実施態様において、本方法は、宿主グラム陰性菌へ、第二の反復単位に存在し
ない第一の反復単位のモノマーを含む三糖を集成し且つ第二の反復単位を集成するグリコ
シル転移酵素をコードしている1種以上のヌクレオチド配列を挿入する工程を更に含む。
追加の本発明の実施態様は、第一の反復単位由来の少なくとも1つのモノマー単位を集成
するグラム陰性菌由来の1種以上のグリコシル転移酵素、及び第二の反復単位由来の少な
くとも2つのモノマーを集成する黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌由来の1種以上のグリ
コシル転移酵素を挿入する工程に関わる。本方法は加えて、グラム陰性宿主細菌へ、タン
パク質をコードしているヌクレオチド配列、及びOTaseをコードしているヌクレオチド配
列を挿入する工程を含む。
少なくとも一つの本発明の実施態様において、構築された反復単位を発達させ(build u
p)、フリッピングし、且つ重合する、黄色ブドウ球菌のCP5株及びCP8株由来の必要な酵素
をコードしている対応する核酸を保持しする宿主大腸菌菌株が作製される。実施態様にお
いて、必要とされる特異的グリコシル転移酵素は、緑膿菌に固有であるL-FucNAc--＞D-Fu
cNAc RUを形成するものに対応し、並びに黄色ブドウ球菌のCP5株及びCP8株の各々に固有
であるRUを完成するためにD-ManNAcA単糖を付加するものに対応しているグリコシル転移
酵素に対応していた。そのような実施態様は、核酸を宿主細胞に注入するためのプラスミ
ドの使用を更に含むことができる。追加の実施態様は、1つのプラスミドにおいて、L-Fuc
NAc--＞D-FucNAcに対応するグリコシル転移酵素をコードしている核酸を使用し、並びに
異なるプラスミドにおいて、D-ManNAcAに対応するグリコシル転移酵素をコードしている
核酸を使用することに関与している。そのような実施態様の恩恵の1つは、先行技術を考
慮すると驚くべきことだが、現在黄色ブドウ球菌莢膜の構築されたRU重合体の生成に責任
のある緑膿菌の改変されたLPS生合成経路は、黄色ブドウ球菌の莢膜よりもはるかに小さ
い構造を生じることである。
本発明は加えて、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tであって
、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；及び、該コン
センサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の少なくとも1つのオリゴ糖又は多糖：を含
む、組換えN-グリコシル化タンパク質を指向している。別の実施態様において、この組換
えN-グリコシル化タンパク質は、該挿入されたコンセンサス配列を2種以上含む。更に追
加の実施態様において、組換えN-グリコシル化タンパク質は、該黄色ブドウ球菌のオリゴ
糖又は多糖を2つ以上含む。また更なる実施態様において、組換えN-グリコシル化タンパ
ク質は、2種以上の該挿入されたコンセンサス配列、並びに例えば黄色ブドウ球菌莢膜多
糖5型株及び莢膜多糖8型株など異なる黄色ブドウ球菌株由来のオリゴ糖又は多糖を含む。
本発明は更に、N-グリコシド結合による、黄色ブドウ球菌の改変された莢膜多糖の、同
じ生体由来のタンパク質抗原との組合せを指向している。
本発明の実施態様は、天然にグリコシル化されたタンパク質を含む。そのような天然に
グリコシル化されたタンパク質(例えばC.ジェジュニタンパク質)は、天然のコンセンサス
配列を含むが、任意の追加の(すなわち導入された)最適化されたコンセンサス配列は含ま
ない。天然のグリコシル化されたタンパク質は、原核生物及び真核生物のタンパク質を含
む。本発明の実施態様は、更に以下のN-グリコシル化された部分アミノ酸配列を1種以上
含む組換えN-グリコシル化タンパク質を含む：D/E-X-N-Z-S/T(最適化されたコンセンサス
配列)、ここでX及びZはPro以外の任意の天然のアミノ酸であってよく、且つここで該N-グ
リコシル化された部分アミノ酸配列の少なくとも1種が導入されている。特異的部分アミ
ノ酸配列(最適化されたコンセンサス配列)のタンパク質への導入は、導入部位での、例え
ばカンピロバクター種由来のOTaseなど、例としてC.ジェジュニ由来のOTaseなどのOTase
により効率的にN-グリコシル化されるタンパク質につながる。
同じく本明細書の文脈で使用される用語「部分アミノ酸配列」は、「最適化されたコン
センサス配列」又は「コンセンサス配列」も指すであろう。最適化されたコンセンサス配
列は、例えばカンピロバクター種由来のOTaseなど、例としてC.ジェジュニ由来のOTaseな
どのOTaseによりN-グリコシル化される。
アミノ酸の国際的に承認された1文字コードに従い、略語D、E、N、S及びTは、各々、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、及びトレオニンを意味する。
最適化されたコンセンサス配列の導入は、1つ以上のアミノ酸の付加、欠失及び/又は置
換により実現することができる。最適化されたコンセンサス配列の導入を目的とした1つ
以上のアミノ酸の付加、欠失及び/又は置換は、固相支援化学ペプチド合成などの当業者
に周知の化学合成戦略により実現することができる。あるいは、そして大型ポリペプチド
にとって好ましくは、本発明のタンパク質は、1種以上の最適化されたコンセンサス配列
をコードしている核酸の、天然にグリコシル化されているタンパク質であるか、又は天然
にグリコシル化されていないタンパク質であることができる出発タンパク質の核酸配列へ
の付加による標準の組換え技術により調製することができる。
好ましい実施態様において、本発明のタンパク質は、1種以上の、好ましくは少なくと
も2種又は少なくとも3種の、及びより好ましくは少なくとも5種の該導入されたN-グリコ
シル化され最適化されたアミノ酸配列を含むことができる。
本発明のタンパク質内の1種以上のN-グリコシル化され最適化されたアミノ酸配列の存
在は、それらの抗原性を増大し、それらの安定性を増大し、それらの生物活性に影響を及
ぼし、それらの生物学的半減期を延長し、及び/又はそれらの精製を簡便化するという利
点をもたらし得る。
前述の最適化されたコンセンサス配列は、X位及びZ位にプロリン以外の任意のアミノ酸
を含むことができる。用語「任意のアミノ酸」とは、一般的な及び稀な天然のアミノ酸に
加え、最適化されたコンセンサス配列をOTaseによりN-グリコシル化させることが依然可
能である合成アミノ酸誘導体及び類似体を包含することを意味する。天然の一般的な及び
稀なアミノ酸が、X及びZについて好ましい。X及びZは、同じであっても異なってもよい。
X及びZは、本発明のタンパク質における各々最適化されたコンセンサス配列について異
なることができることに留意されたい。
前述の最適化されたコンセンサス配列に結合されるN-グリカンは、特異的グリコシル転
移酵素、及びOTaseによる転移のために脂質キャリア上にオリゴ糖が集成する際のそれら
の相互作用により決定されるであろう。当業者は、所望の宿主細胞に存在する特異的グリ
コシル転移酵素の種類及び量を変動することにより、N-グリカンをデザインすることがで
きる。(Raetz及びWhitfieldの文献、「リポ多糖内毒素(Lipopolysaccharide Endotoxins)
」、NIH-PA Author Manuscript 1-57, 19-25(Annual Rev. Biochem., 71:635-700 (2002)
に最終版掲載)；Reevesらの論文、「細菌多糖の合成及び遺伝子命名(Bacterial Polysacc
haride Synthesis and Gene Nomenclature)」、Trends in Microbio. 4(3):495-503, 497
-98(1996年12月)；並びに、Whitfield, C.及びI. S. Robertsの論文、1999、「大腸菌に
おける莢膜の構造、集成及び発現調節(Structure, assembly and regulation of express
ion of capsules in Escherichia coli)」、Mol Microbiol 31(5): 1307-19)。
本明細書において使用される「多糖」は、少なくとも2つの単糖を含む糖類を含む。多
糖は、オリゴ糖、三糖、1種以上の単糖(又はモノマー)を含む反復単位、及び当業者によ
り多糖として認められる他の糖類を含む。N-グリカンは、本明細書において、N-グリコシ
ド結合を介してタンパク質内のアスパラギン残基のε-アミド窒素に結合されている様々
な組成の単糖、オリゴ糖、又は多糖として定義される。
本発明の実施態様の多糖は、CP5及びCP8などの黄色ブドウ球菌多糖を含むが、これらに
限定されるものではない。本発明の実施態様は更に、黄色ブドウ球菌のメチシリン-耐性
株を標的とする多糖などの、細菌を標的とする黄色ブドウ球菌多糖を含む。本明細書にお
いて、多糖が細菌株を標的とすることが言及される場合、そのような多糖は、それに対す
る免疫反応又は抗原反応が望まれる細菌に由来する多糖を含み、且つ更にそれに対する免
疫反応又は抗原反応が望ましい細菌と同じ、それを基にした、それに由来する、それに固
有の或いは操作されている多糖を含む。
本発明の組換えタンパク質の起源に制限はない。一実施態様において、該タンパク質は
、哺乳動物、細菌、ウイルス、真菌、又は植物のタンパク質に由来する。更なる実施態様
において、本タンパク質は、哺乳動物に由来し、最も好ましくはヒトタンパク質に由来す
る。本発明の抗原性組換えタンパク質の調製に関して、好ましくはワクチン中の活性成分
として使用するための組換えタンパク質は、細菌、ウイルス、又は真菌のタンパク質に由
来することが好ましい。様々な起源のタンパク質のグリコシル化が、当業者に公知である
。Kowarikらの論文、「細菌のN-グリコシル化部位コンセンサス配列の定義(Definition o
f the bacterial N-glycosylation site consensus sequence)」、EMBO J., 1-10(2006)
。
実施態様の例において、遺伝子的に解毒された緑膿菌外毒素(EPA)は、好適なタンパク
質キャリアである。グリコシル化され得るEPA型の作製のためには、EPAをコードしている
核酸が先に考察されたようにグリコシル化部位の挿入により改変されることを必要とする
。
本発明の実施態様における使用が意図されたタンパク質キャリアは、好ましくはある免
疫学的及び薬学的特徴を有さなければならない。免疫学的観点からは、好ましくはタンパ
ク質キャリアは：(1)T細胞エピトープを有し；(2)免疫系において抗原を抗原提示細胞(AP
C)へ送達することが可能であり；(3)強力且つ耐久性があり；並びに、(4)抗原-特異的な
全身性のIgG反応を生じることが可能でなければならない。薬学的観点からは、タンパク
質キャリアは好ましくは：(1)無毒であり；並びに、(2)抗原を無傷の上皮障壁を越えて効
果的に送達することが可能でなければならない。より好ましくは、これらの免疫学的及び
薬学的特徴に加え、細菌性バイオコンジュゲートの製造に使用されると考えられるタンパ
ク質キャリアは：(1)細胞膜周辺腔へ容易に分泌され；並びに、(2)ループ又は線状配列と
してそれへ容易に導入される抗原エピトープを有することが可能でなければならない。本
開示及び当業者の知識により情報が与えられるように、当該技術分野の実践者は、特に本
発明の実施態様において使用することができる好適なタンパク質キャリアを慣習的に考察
し且つ確定することができる。
本発明の実施態様において、カンピロバクタータンパク質AcrAは、タンパク質キャリア
である。
更なる本発明の実施態様において、遺伝子的に解毒された緑膿菌外毒素(EPA)は、ワク
チンが望まれる標的生体が黄色ブドウ球菌である場合のタンパク質キャリアである。天然
のグリコシル化部位を含むAcrAとは異なり、EPAは、そのような天然のグリコシル化部位
を含まず、グリコシル化部位の挿入により改変されることが必要である(例えば、先に考
察したような最適化されたコンセンサス配列をコードしている核酸のEPAをコードしてい
る核酸配列への挿入)。追加の実施態様において、EPAは、黄色ブドウ球菌抗原によるグリ
コシル化が可能である2つのグリコシル化部位を導入するように改変される。また更なる
実施態様においては、2つのコンセンサス配列が、WO 2009/104074の実施例10において考
察されたように導入される。
EPAのアミノ酸配列は、本発明の実施態様において2つのグリコシル化部位を含む様に改
変された場合、配列番号:13(シグナル配列あり)及び配列番号:14(シグナル配列なし)とし
て提供される。配列番号:13のグリコシル化部位は、
Figure 2017036303
 での
Figure 2017036303
 である。配列番号:14のグリコシル化部位は、
Figure 2017036303
 での
Figure 2017036303
 である。
EPAなどのキャリアタンパク質は、N-グリコシル化部位が細菌性バイオコンジュゲート
の製造において追加され得るタンパク質である。N-グリコシル化部位は、先に考察したコ
ンセンサス配列の導入、すなわちD/E-X-N-Z-S/T配列の挿入を必要とし、ここでX及びZは
プロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい。本発明者らは、そのようなコンセン
サス配列は、突然変異、及び追加的に挿入されたフランキング残基の使用による、及びN-
グリコシル化部位の機能を最適化するためのフランキング残基の突然変異によるよりは、
挿入により表面ループへ導入されることが好ましいことを発見した。
一部の良く特徴付けられた黄色ブドウ球菌のタンパク質サブユニット抗原は、α溶血素
(α毒素、Hla)、クランピング因子α(ClfA)、IsdB、及びパントン・バレンタイン型ロイ
コシジン(PVL)である。
Hlaは、黄色ブドウ球菌肺炎のマウスモデルにおけるMRSAの分泌型膜孔形成毒素及び必
須の病原因子である。独立した黄色ブドウ球菌株によるHla発現のレベルは、それらの毒
力と直接相関する。膜孔を形成することができないHlaの突然変異型(Hla H35L、配列番号
:5)による能動免疫(Menzies, B. E.、及びD. S. Kernodleの論文、1996、「マウスモデル
における黄色ブドウ球菌由来の無毒のα毒素変異体に対する抗血清による受動免疫は防御
的である(Passive immunization with antiserum to a nontoxic alpha-toxin mutant fr
om Staphylococcus aureus is protective in a murine model)」、Infect Immun, 64:1
839-41；Jursch, R.、A. Hildebrand、G. Hobom、J. Tranum-Jensen、R. Ward、M. Kehoe
及びS. Bhakdiの論文、1994、「重合及び膜孔形成に重要であるレポーター領域としての
ブドウ球菌α毒素のN-末端近傍のヒスチジン残基(Histidine residues near the N termi
nus of staphylococcal alpha-toxin as reporters of regions that are critical for
oligomerization and pore formation)」、Infect Immun, 62(6):2249-56)は、抗原-特異
的免疫グロブリンG反応を生じ、且つブドウ球菌肺炎に対する防御をもたらすことが示さ
れた。Hla-特異的抗体の移入は、黄色ブドウ球菌チャレンジに対しナイーブな動物を保護
し、且つ感染症時のヒト肺上皮細胞の損傷を防ぐ(Bubeck Wardenburg, J.、A. M. Palazz
olo-Ballance、M. Otto、O. Schneewind、及びF. R. DeLeoの論文、2008、「市中感染メ
チシリン耐性黄色ブドウ球菌疾患のマウスモデルにおいて毒力決定因子ではないパントン
・バレンタイン型ロイコシジン(Panton-Valentine Leukocidin is not a virulence dete
rminant in murine models of community-associated methicillin-resistant Staphyloc
occus aureus disease)」、J Infect Dis, 198:1166-70)。ワクチンとして使用するため
には、HlaのH35L変異は、そのタンパク質の毒性を除去する必要がある(Menzies, B. E.及
びD. S. Kernodleの論文、1994、「黄色ブドウ球菌α毒素遺伝子の部位特異的変異誘発：
インビトロ及びマウスモデルにおける毒素活性におけるヒスチジンの役割(Site-directed
mutagenesis of the alpha-toxin gene of Staphylococcus aureus: role of histidine
s in toxin activity in vitro and in a murine model)」、Infect Immun, 62:1843-7)
。ClfAは、免疫付与に使用されるプロテアーゼ耐性ドメインを含む。マウスの抗-ClfA抗
体及び抗CP5抗体による受動免疫は、乳腺感染症モデルにおいて乳腺を効果的に無菌化し
た(Tuchscherr, L. P.、F. R. Buzzola、L. P. Alvarez、J. C. Lee、及びD. O.Sordelli
の論文、2008、「マウスにおける乳腺炎及び黄色ブドウ球菌の莢膜で囲まれない小型コロ
ニー変種の出現を防止する莢膜多糖及びクランピング因子Aに対する抗体(Antibodies to
capsular polysaccharide and clamping factor A prevent mastitis and the emergence
of unencapsulated and small-colony variants of Staphylococcus aureus in mice)」
、Infect Immun, 76:5738-44)。
更なる本発明の実施態様は、黄色ブドウ球菌に固有のタンパク質、例えばHla及びClfA
のグリコシル化を含む。本発明の実施態様の追加の実施例において、使用されるタンパク
質キャリアは、Hlaタンパク質、例えばHla H35L(例えば、配列番号:6、配列番号:7、配列
番号:8又は配列番号:16)であるよう選択されることができる。別の本発明の実施態様の追
加の実施例において、タンパク質キャリアは、ClfAタンパク質(例えば、 配列番号:10、
配列番号:11又は配列番号:12)である。
本発明は更に、グラム陽性種などの第一の原核生物種の1種以上のグリコシル転移酵素
；グラム陰性種などの異なる原核生物種の1種以上のグリコシル転移酵素：をコードして
いるヌクレオチド配列；タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；並びに、OTase
をコードしているヌクレオチド配列：を含む、組換え宿主原核生物を指向している。加え
て本発明は、グラム陽性原核生物にのみ固有であるグリコシル転移酵素をコードしている
導入されたヌクレオチド配列；タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；及び、OT
aseをコードしているヌクレオチド配列：を含む、組換え宿主原核生物を指向している。
本発明はまた、例えば宿主原核生物とは異なる第一の原核生物種に固有のグリコシル転移
酵素をコードしているヌクレオチド配列；該第一の原核生物種とは異なり、且つ例えば該
宿主とは異なる、第二の原核生物種に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレ
オチド配列：を含む、組換え又は操作された宿主原核生物も指向している。この操作され
た原核生物はまた、例えば、グラム陽性種である第一の原核生物種も含むことができる。
この操作された原核生物はまた、例えば、グラム陰性種である第二の原核生物種も含むこ
とができる。本発明は更に、例えば該宿主原核生物とは異なるグラム陰性原核生物種に固
有のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列；黄色ブドウ球菌に固有のグ
リコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列；タンパク質をコードしているヌク
レオチド配列；及び、OTaseをコードしているヌクレオチド配列：を含む、組換え又は操
作されたグラム陰性宿主原核生物を含む。本発明は更に、緑膿菌に固有のグリコシル転移
酵素をコードしているヌクレオチド配列；黄色ブドウ球菌CP5株及び/又は黄色ブドウ球菌
CP8株に固有の1種以上のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列；緑膿菌
EPA、黄色ブドウ球菌α溶血素、又は黄色ブドウ球菌クランピング因子Aのタンパク質キャ
リアをコードしているヌクレオチド配列；並びに、OTase、例えばC.ジェジュニに固有のO
Taseをコードしているヌクレオチド配列：を含む、組換え又は操作された大腸菌宿主を含
む。
改変された宿主大腸菌生体における他のグラム陰性生体の生合成経路の使用に加え、更
なる実施態様において、同じく宿主大腸菌生体に含まれるのは、(i)他のグラム陰性生体
の多糖の反復単位構造(標的グラム陽性黄色ブドウ球菌生体の関心対象の多糖の反復単位
と同一である)の構築のためのグリコシル転移酵素、並びに、(ii)他のグラム陰性生体の
関連する多糖において認められない、標的グラム陽性黄色ブドウ球菌生体の関心対象の多
糖の単位の構築のためのグリコシル転移酵素、並びに、(iii)黄色ブドウ球菌莢膜様多糖
を形成するために、標的グラム陽性黄色ブドウ球菌生体の関心対象の構築されたRUのフリ
ッピング及び重合のための酵素：をコードしている核酸である。特に、本実施態様におい
て、(ii)及び(iii)をコードしている核酸は、標的グラム陽性黄色ブドウ球菌生体を起源
とするのに対し、(i)をコードしている核酸は、他のグラム陰性菌を起源とした。
本発明の別の態様は、i)グラム陽性原核生物種に固有のグリコシル転移酵素をコードし
ているヌクレオチド配列；ii)タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；及び、iii
)OTaseをコードしているヌクレオチド配列：を含み、ここで該グラム陽性原核生物種のト
ランスポーター遺伝子をコードしている配列は欠失されている、操作された宿主原核生物
を指向している。そのような実施態様は、グラム陽性グリコシル転移酵素のみをコードし
ている導入された核酸構築体に関与している。
1つ以上の他の実施態様において宿主に挿入される他の核酸に関して、AcrA、Hla、ClfA
又はEPAなどのタンパク質をコードしている核酸(配列番号:15、配列番号:6、配列番号:7
、配列番号:8、配列番号:16；配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12；配列番号:13、
配列番号:14)、及びその生体のグリコシル化機構の一部であるC.ジェジュニのオリゴ糖転
移酵素をコードしている核酸(配列番号:27)が、緑膿菌及び黄色ブドウ球菌の各々に由来
したグリコシル転移酵素をコードしている核酸に加え、宿主に注入される。結果として、
この改変された大腸菌生体は、黄色ブドウ球菌及び他のグラム陰性菌由来のグリコシル転
移酵素の作用により、AcrAタンパク質を、その生体中で生成された多糖によりグリコシル
化することができる。
本発明の一実施態様は、i)宿主原核生物とは異なる第一の原核生物種に固有のグリコシ
ル転移酵素をコードしているヌクレオチド配列；ii)宿主原核生物とは異なる、第二の原
核生物種、例えばグラム陽性原核生物種に固有のグリコシル転移酵素をコードしているヌ
クレオチド配列；iii)タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；及び、iv)OTaseを
コードしているヌクレオチド配列：を含む、操作された宿主原核生物に関与している。本
発明の実施態様において、第一の原核生物種は、グラム陰性種、例えば緑膿菌である。
本発明の状況において、宿主細胞とは、任意の宿主細胞、例えば真核生物又は原核生物
の宿主細胞をいう。他の実施態様において、宿主細胞は、原核生物宿主細胞、例えばエシ
ェリキア種、カンピロバクター種、サルモネラ種、シゲラ種、ヘリコバクター種、シュー
ドモナス種、又はバチルス種である。より更なる実施態様において、宿主細胞は、大腸菌
、カンピロバクター・ジェジュニ、サルモネラ・ティフィムリウムなどである。
本発明は更に、黄色ブドウ球菌の1種以上のグリコシル転移酵素；第二の原核生物種の1
種以上のグリコシル転移酵素、タンパク質；及びOTase：をコードしている核酸を、宿主
原核生物へ導入することを含む、バイオコンジュゲートワクチンの製造方法を指向してい
る。加えて本発明は、グラム陰性菌においてウンデカプレノール(Und)上で改変された莢
膜多糖を生成すること、及び選択されたタンパク質キャリアへこれらの多糖抗原を結合す
ることによる、バイオコンジュゲートワクチンの製造を指向している。
本発明は更に、第一の原核生物に固有のグリコシル転移酵素をコードし、且つ同じく第
一の原核生物とは異なる第二の原核生物に固有のグリコシル転移酵素もコードしているヌ
クレオチド配列を含む宿主原核生物における、グリコシル化タンパク質の製造方法を指向
している。本発明は加えて、異なる生体由来の異なるグリコシル転移酵素の組合せにより
合成される、グラム陽性菌の莢膜多糖によりN-グリコシル化されたタンパク質の生成を指
向している。本発明は更に、グラム陽性原核生物にのみ固有のグリコシル転移酵素をコー
ドしている導入されたヌクレオチド配列を含む宿主原核生物におけるグリコシル化タンパ
ク質の生成を指向している。
当該技術分野において公知であるように、異なる多糖の生合成は、細菌細胞において保
存されている。多糖は、規定された特異性を持つ異なるグリコシル転移酵素により、細胞
膜で、共通の前駆体(活性化された糖ヌクレオチド)からキャリア脂質上に集成される(Whi
tfield, C.及びI. S. Robertsの論文、1999、「大腸菌における莢膜の構造、集成及び発
現の調節(Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escheri
chia coli)」、Mol Microbiol, 31:1307-19)。グラム陰性におけるO抗原多糖生成及びグ
ラム陽性におけるI型莢膜多糖に関する生合成経路は、保存されている。これらのプロセ
スは、多糖集成のために、同じ脂質キャリア、すなわちUndPを使用する。これは、膜の細
胞質側での、単糖-1-リン酸のキャリア脂質UndPへの付加で始まる。この抗原は、異なる
グリコシル転移酵素による、活性化された糖ヌクレオチドからの単糖の逐次付加により発
達される。次に脂質-結合されたオリゴ糖又はRUは、フリッパーゼにより、膜を通じてフ
リッピングされる。RUは、細胞膜周辺腔において酵素Wzyにより重合され、グラム陰性菌
においていわゆるO抗原を、又はグラム陽性菌において莢膜多糖を形成する。グラム陰性
菌は、Wzz酵素を使用し、重合体の長さを調節し、これは次にリピドAコアへ転移され、LP
Sを形成する。LPSは更に、外側にO抗原を露出している外膜に転位される(例えば図1に図
示したように)。対照的にグラム陽性菌は、異なる特定された酵素機構を使用する更なる
輸送により、この脂質-結合された前駆体から莢膜を形成する。これらの多糖の生合成経
路は、タンパク質キャリア上にペリプラズム内の多糖を捕獲することにより、インビボに
おいてバイオコンジュゲートを製造することが可能である。
この多糖構築のプロセスは、莢膜多糖について、莢膜多糖は重合後にキャリア脂質から
放出され、表面へ輸送される点が異なる。ペリプラズムコンパートメントを持たない黄色
ブドウ球菌のようなグラム陽性菌において、抗原の重合は、膜の外側で生じる。加えて黄
色ブドウ球菌における長さの調節は、莢膜集成に責任のある3種の酵素の機構に含まれる
。この集成体において、多糖は、キャリア脂質から放出され、且つ酵素的プロセスにより
表面へと輸送される。
黄色ブドウ球菌における機能的莢膜発現に必要とされる遺伝子クラスターに認められる
遺伝的要素は、wzy依存型O抗原合成クラスターにおいて認められる遺伝子機構に類似して
いる(Dean, C. R.、C. V. Franklund、J. D. Retief、M. J. Coyne, Jr.、K. Hatano、D.
J. Evans、G. B. Pier、及びJ. B. Goldbergの論文、1999、「緑膿菌PA103における血清
型O11 O抗原遺伝子座の特徴付け(Characterization of the serogroup O11 O-antigen lo
cus of Pseudomonas aeruginosa PA103)」、J Bacteriol, 181:4275-4284)。
驚くべきことにグラム陽性菌の多糖構築とグラム陰性菌の多糖構築の間のこれらの差異
にもかかわらず、グラム陰性生体におけるLPS経路の局面を使用し、例えば黄色ブドウ球
菌などのグラム陽性菌に固有の莢膜多糖と同じ反復単位の一部を含む多糖を生成すること
ができることが発見され且つ検証された。そのような多糖は、グラム陰性宿主においてLP
S経路機構により生成されるので、そのような多糖の構造は、LPS多糖前駆体においてと同
じである。従って本発明のグラム陰性システムにおいて生成されたそのような多糖は、本
出願の目的に関して「改変された莢膜多糖」又は「LPS莢膜」として特徴付けることがで
きる。更にこの新たに合成された発現システム及び生合成経路は、LPSと莢膜の生合成経
路を組合せているが、これは本出願の目的に関して「改変されたLPS生合成経路」である
として特徴付けられる。
本発明の一実施態様において、改変されたLPS生合成経路により生成された改変された
多糖は、下記を含む：
Figure 2017036303
更なる本発明の実施態様において、改変されたLPS生合成経路により生成された改変さ
れた多糖は、下記を含む：
Figure 2017036303
本発明の技術を使用し、免疫原性である細菌のバイオコンジュゲートを製造することが
できる。遺伝子修飾は、望ましいタンパク質において且つ望ましい位置で細菌性多糖がイ
ンビボでコンジュゲートできるようにすることができる。
本発明の別の態様は、前述のように改変されたLPS生合成経路を使用し、タンパク質キ
ャリアにコンジュゲートされたLPS-莢膜又は改変されたLPSの生成に関する。
更なる本発明の実施態様は、Cap5及びCap8の完全多糖生合成クラスターをコードしてい
るヌクレオチド配列の構築を含み、ここで欠失されたトランスポーター遺伝子は、黄色ブ
ドウ球菌のcapA、capB及びcapCである(図6参照)。
追加の本発明の実施態様は、CP5/O11キメラクラスター(配列番号:2、配列番号:3若しく
は配列番号:17)又はCP8/O11キメラクラスター(配列番号:4、配列番号:18若しくは配列番
号:19)を、宿主細胞のゲノムへ組込むことを含む。更なる本発明の実施態様は、(a)CP5/O
11キメラクラスター(配列番号:2、配列番号:3若しくは配列番号:17)又はCP8/O11キメラク
ラスター(配列番号:4、配列番号:18若しくは配列番号:19)；(b)OTaseをコードしている核
酸；及び、(c)導入されたコンセンサス配列を含む又は含まないタンパク質をコードして
いる核酸：を、宿主細胞のゲノムへ組込むことに関与している。
本発明の別の実施態様は、例えば、配列番号:2；配列番号:3；配列番号:4；配列番号:1
7；配列番号:18及び配列番号:19の1つ以上を含むプラスミドなどの、プラスミドに関する
。本発明はまた、配列番号:13；配列番号:14及び配列番号:15の1つ以上を含むプラスミド
を含む。本発明はまた、配列番号:16；配列番号:6；配列番号:7及び配列番号:8の1つ以上
を含むプラスミドに関する。本発明はまた、配列番号:10；配列番号:11及び配列番号:12
の1つ以上を含むプラスミドに関する。更に本発明は、配列番号:20；配列番号:21及び配
列番号:27の1つ以上を含むプラスミドに関する。
本発明の実施態様は更に、例えば、配列番号:2；配列番号:3；配列番号:4；配列番号:1
7；配列番号:18；配列番号:19；配列番号:20；配列番号:21及び配列番号:27の1つ以上を
含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞などを含む、形質転換された細菌細胞に関
する。更に本発明に含まれるのは、配列番号:19及び配列番号:20の1つ以上を含むプラス
ミドにより形質転換された細菌細胞である。加えて含まれるのは、配列番号:13、配列番
号:19及び配列番号:21の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞である
。本発明は更に、配列番号:16、配列番号:6；配列番号:7；配列番号:8；配列番号:10；配
列番号:11及び配列番号:12の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞に
関する。本発明は加えて、例えば配列番号:3；配列番号:4；配列番号:17；配列番号:18；
及び配列番号:19の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞であって、並
びにここで該細菌細胞は、緑膿菌に固有のグリコシル転移酵素並びに黄色ブドウ球菌CP5
及び/又はCP8に固有のグリコシル転移酵素を発現する前記細菌細胞を含むものなどの、形
質転換された細菌細胞に関する。更に本発明に含まれるのは、配列番号:17；配列番号:18
及び配列番号:19の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞であって、こ
こで該細菌細胞が、緑膿菌に固有のグリコシル転移酵素、黄色ブドウ球菌CP5及び/又はCP
8に固有のグリコシル転移酵素、並びにPglBを発現するものである。なお更に本発明に含
まれるのは、(a)配列番号:19を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞であり、こ
こで該細菌細胞が、緑膿菌に固有のグリコシル転移酵素、黄色ブドウ球菌CP8に固有のグ
リコシル転移酵素、大腸菌血清亜型O7のWzz及びPglBを発現するもの；(b)配列番号:19及
び配列番号:20の1つ以上を含むプラスミドにより形質転換された細菌細胞であり、ここで
該細菌細胞が、緑膿菌に固有のグリコシル転移酵素、黄色ブドウ球菌CP8に固有のグリコ
シル転移酵素、Wzz(長さ調節因子)、EPA及びPglBを発現するもの；並びに、(c)配列番号:
16；配列番号:6；配列番号:7；配列番号:8；配列番号:13；配列番号:14；配列番号:15；
配列番号:10；配列番号:11及び配列番号:12の1つ以上を含む細菌細胞である。
本発明の実施態様は加えて、例えばヒトなどの哺乳動物においてグラム陽性菌及び他の
細菌により引き起こされた感染症に対し免疫反応を誘導する方法を指向している。一実施
態様において、本方法は、該哺乳動物へ、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D
/E-X-N-Z-S/Tを含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のア
ミノ酸であってよいもの；並びに、該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の
1種以上のオリゴ糖又は多糖であって、この1種以上のオリゴ糖又は多糖が、該1種以上の
オリゴ糖又は多糖のうちの他のものと同じか又は異なる、前記1種以上のオリゴ糖又は多
糖：を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む。更なる本発明の実施態様は、
哺乳動物へ、挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tであって、ここでX及びZがプロ
リン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；CP5多糖などの少なくとも1種の黄色
ブドウ球菌オリゴ糖又は多糖；並びに、医薬として許容し得るアジュバント：を含有する
医薬組成物の有効量を投与することを含む、該哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引
き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導する方法を含む。別の本発明の実施態様は、
哺乳動物へ、挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tを含むタンパク質であって、こ
こでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；少なくとも1種の
黄色ブドウ球菌CP8多糖；並びに、医薬として許容し得るアジュバント：を含有する医薬
組成物の有効量を投与することを含む、該哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起
こされた感染症に対する免疫反応を誘導することを指向している。より更なる実施態様は
、2種以上のコンセンサス配列を伴うタンパク質、並びに異なるグラム陽性菌株由来のオ
リゴ糖又は多糖を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物において
黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導することを指向して
いる。なお更なる実施態様は、2種以上のコンセンサス配列を伴うタンパク質、並びに黄
色ブドウ球菌CP5及び黄色ブドウ球菌CP8を含む多糖を含有する医薬組成物の有効量を投与
することを含む、哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する
免疫反応を誘導することを指向している。
特異的ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が注目されるような本明細書の事例において
、本発明は、注目された配列と同じ機能性をなお具体化している相同配列を包含すること
は理解されるであろう。本発明の実施態様において、そのような配列は、少なくとも85％
相同である。別の実施態様において、そのような配列は、少なくとも90％相同である。ま
た更なる実施態様において、そのような配列は、少なくとも95％相同である。2つのヌク
レオチド配列又はアミノ酸配列の間の同一性の割合の決定は、当業者に公知である。
本明細書に添付された配列表に記載されたものなどの、本明細書に記載された核酸配列
は、単なる例証であり、且つこれらの配列は、様々な方法で組み合わせることができるこ
とは当業者には明らかであろう。本発明の追加の実施態様は、核酸の変種を含む。核酸の
変種(例えば、コドン-最適化された核酸)は、
Figure 2017036303
 と実質的に同一であり、すなわち、これらと少なくとも70％同一、例えば75％、80％、85
％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は99.5％同一であ
ることができる。核酸変種は、
Figure 2017036303
 を含む配列のものである。
Figure 2017036303
 を含む配列、又はそれらの一部から1個以上のヌクレオチド(例えば、2、3、4、5、6、8、
10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350
、400、450、500又はそれ以上のヌクレオチド)の置換、変動、改変、変換、欠失及び/又
は付加を伴う核酸を含む。
そのような変種は、原核生物のグリコシル転移酵素をコードしている核酸、並びにi)大
腸菌などの宿主細胞において発現され、且つii)配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、
配列番号:17、配列番号:18及び/又は配列番号:19、並びに/又はそれらの一部と実質的に
同一である核酸を含む。
本明細書に記載の核酸は、組換えDNA及び合成(例えば化学的に合成された)DNAを含む。
核酸は、二本鎖又は一本鎖であることができる。一本鎖核酸の場合核酸は、センス鎖又は
アンチセンス鎖であることができる。核酸は、本明細書に照らして当業者に公知のように
、オリゴヌクレオチド類似体又は誘導体を使用し合成することができる。
本明細書に記載の核酸を含むプラスミドは、発現のために宿主細胞に形質転換されるこ
とができる。形質転換の技術は、本明細書に照らして当業者に公知である。
追加の本発明の実施態様は、LPS-莢膜又はタンパク質キャリアにコンジュゲートされた
改変されたLPSを含む、グラム陽性バイオコンジュゲートワクチンの製造に関与している
。
更なる本発明の実施態様は、新規バイオコンジュゲートワクチンに関与している。更な
る本発明の実施態様は、免疫原性又は抗原性バイオコンジュゲートを直接生成する組換え
細菌細胞を使用する、そのようなバイオコンジュゲートワクチンを製造するための新規ア
プローチに関与している。一実施態様において、バイオコンジュゲートワクチンは、下痢
、院内感染症及び髄膜炎などの細菌性疾患を治療又は予防するために使用することができ
る。更なる実施態様において、バイオコンジュゲートワクチンは、癌又は他の疾患に対す
る治療的及び/又は予防的潜在力を有し得る。
別の本発明の実施態様において、多糖(すなわち糖残基)及びタンパク質(すなわちタン
パク質キャリア)の合成された複合体は、黄色ブドウ球菌感染症などの感染症に対し防御
するための、コンジュゲートワクチンとして使用することができる。一実施態様において
、グラム陽性ワクチンなどのバイオコンジュゲートワクチンは、挿入された核酸コンセン
サス配列を含むタンパク質キャリア；コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の
少なくとも1種のオリゴ糖又は多糖、及び任意にアジュバント：を含む。本発明は更に別
の実施態様において、挿入された核酸コンセンサス配列を含むタンパク質キャリア；コン
センサス配列に結合された、莢膜多糖又はLPS莢膜などのグラム陽性菌由来の少なくとも1
種のオリゴ糖又は多糖、並びに任意にアジュバントを含む、黄色ブドウ球菌ワクチンなど
の、グラム陽性バイオコンジュゲートワクチンを指向している。別の本発明の実施態様に
おいて、黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲートワクチンは、これらの挿入されたコンセン
サス配列を2種以上含む。更なる実施態様において、黄色ブドウ球菌バイオコンジュゲー
トワクチンは、黄色ブドウ球菌のオリゴ糖又は多糖を2種以上含む。より更なる実施態様
は、2種以上の該挿入されたコンセンサス配列、並びに異なる黄色ブドウ球菌株、例えば
黄色ブドウ球菌莢膜多糖5型株(CP5)及び莢膜多糖8型株(CP8)由来のオリゴ糖又は多糖を含
む。
追加の本発明の実施態様は、改変された莢膜多糖又はLPS莢膜の生成を含む、改変され
たLPS経路を使用するグリコシル化システムにより製造された黄色ブドウ球菌ワクチンに
関する。更なる追加の実施態様は、グラム陰性原核生物種のグリコシル転移酵素をコード
していない導入された核酸からの改変された莢膜多糖の生成を含む、改変されたLPS経路
を使用するグリコシル化システムにより製造された黄色ブドウ球菌ワクチンに関する。
更なる実施態様は、i)緑膿菌に固有のO11抗原のRUのL-FucNAc--＞D-FucNAcの生成に責
任のある1種以上のグリコシル転移酵素；ii)黄色ブドウ球菌のCP5株又はCP8株のいずれか
に固有のRUを含むD-ManNAcAの生成に責任のある1種以上のグリコシル転移酵素；iii)CP5
又はCP8の構築されたRUのフリッピング及び重合に責任のある1種以上の酵素、iv)導入さ
れたコンセンサス配列を含む組換えタンパク質；並びに、v)C.ジェジュニ由来のオリゴ糖
転移酵素：をコードしている核酸を含むグリコシル化システムにより製造された黄色ブド
ウ球菌ワクチンに関する。この実施態様において、宿主生物は、グラム陰性菌、例えば大
腸菌であってよい。
追加の本発明の実施態様は、i)緑膿菌に固有のO11抗原のRUのL-FucNAc--＞D-FucNAcの
生成に責任のあるグリコシル転移酵素；ii)黄色ブドウ球菌のCP5株又はCP8株のいずれか
に固有のRUを含むD-ManNAcAの生成に責任のあるグリコシル転移酵素；iii)C.ジェジュニ
のAcrAタンパク質；並びに、iv)C.ジェジュニ由来のオリゴ糖転移酵素：をコードしてい
る核酸を含むグリコシル化システムにより製造された黄色ブドウ球菌ワクチンに関与して
いる。この実施態様において、宿主生物は、グラム陰性菌、例えば大腸菌であってよい。
本発明のワクチンは、治療的及び予防的有用性を有する。本発明のワクチンは、臨床医
薬品及び獣医用医薬品の分野において有用であることは理解されるであろう。従って免疫
付与される対象は、ヒト、又は例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ及び家禽(例え
ば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、及びガチョウ)を含む家畜、並びにイヌ及びネ
コなどの伴侶動物などの他の動物であってよい。
別の態様において、本発明は、グラム陽性菌などの細菌に対する哺乳動物の免疫付与の
ためのワクチンの製造方法を指向している。この方法は、グラム陽性の多糖、例えば黄色
ブドウ球菌多糖、及び医薬として許容し得る担体を含有するバイオコンジュゲートのよう
なバイオコンジュゲートにより、対象に免疫付与することを含む。
この本発明はまた、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌による感染症に対する防御のた
めの、又は黄色ブドウ球菌感染症などのグラム陽性感染症の治療のためのワクチン組成物
を特徴としている。一実施態様において、本ワクチン組成物は、黄色ブドウ球菌由来の多
糖又はそれらの断片若しくは部分などの、1種以上の免疫原性成分を含有する。更なる実
施態様において、本ワクチン組成物は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌由来のタンパク質
又はそれらの断片若しくは部分などの1種以上の免疫原性成分を含有する。
本発明の一態様は、黄色ブドウ球菌多糖の少なくとも1つの免疫原性成分又は断片並び
に医薬として許容し得る担体を含有する、黄色ブドウ球菌による感染症を防御するための
ワクチン組成物を提供する。そのような免疫原性成分又は断片は、例えば、長さが少なく
とも約2つのモノマー又は長さが少なくとも約3つのモノマーの黄色ブドウ球菌多糖を含む
ことができる。本発明の更なる態様において、黄色ブドウ球菌RUは、該モノマーを含む。
そのような反復単位は、例えば、長さが少なくとも1つの黄色ブドウ球菌RUを含むことが
できる。
本発明の免疫原性成分又は断片は、例えば、組換え的に又は化学合成により生成された
多糖若しくはポリペプチドのスクリーニングによるか、又は例えば、多糖及びタンパク質
を含有するバイオコンジュゲートのスクリーニングにより得ることができる。本発明の免
疫原性成分又は断片のスクリーニングは、1種以上のいくつかの異なるアッセイを使用し
実行することができる。例えば、スクリーニングアッセイは、ELISA及び当業者に公知の
他のアッセイを含む。
一実施態様において、免疫原性成分又は断片は、例えば、グライココンジュゲートワク
チン候補CP5-EPAに対する特異的抗CP5抗体(ELISAにより定量)の測定、並びに当業者に公
知の他の手段で、マウス(図15A)及びウサギ(図15B)において得られた免疫反応により決定
されるような、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8多糖などのグラム陽性菌多糖に対するIgG抗体
を刺激する多糖及び/又はタンパク質の能力により同定される。
一実施態様において、免疫原性成分又は断片は、例えば、ウサギ抗CP5-EPA抗体(下記実
施例7で得られる、図15B参照)による黄色ブドウ球菌死滅(「インビトロ」活性)によるか
、並びに他の当業者に公知の手段により、決定されるような、オプソニン食作用死滅など
のオプソニン活性を刺激する多糖及び/又はタンパク質の能力により同定される。
また更なる実施態様において、免疫原性成分又は断片は、例えば、CP5-EPAによるマウ
ス(図18)における能動免疫を使用する細菌感染(「チャレンジ」)に対する防御によるか、
並びに他の当業者に公知の手段により、決定されるような、黄色ブドウ球菌などのグラム
陽性菌に対する体液性及び/又は細胞性免疫を刺激する多糖及び/又はタンパク質の能力に
より同定される。
本発明の実施態様において、本発明のワクチン組成物は、本発明の黄色ブドウ球菌多糖
の免疫原性成分又は断片を含有し、且つ任意に医薬として許容し得る担体又はアジュバン
トを更に含有する糖タンパク質を基にすることができる。更なる本発明の実施態様におい
て、ワクチン組成物は、本発明の黄色ブドウ球菌タンパク質の免疫原性成分又は断片を含
有し、且つ任意に医薬として許容し得る担体又はアジュバントを更に含有する糖タンパク
質を基にすることができる。また更なる本発明の態様において、ワクチン組成物は、本発
明の緑膿菌タンパク質の免疫原性成分又は断片を含有し、且つ任意に医薬として許容し得
る担体及び/又はアジュバントを更に含有する糖タンパク質を基にすることができる。
当業者は、例えばマウスなどの1つの哺乳動物型へ投与するためのワクチンを、例えば
ヒトなどの別の哺乳動物型へ投与するために、どのように改変するかは良く知っている。
例えば当業者は、マウスにおけるワクチン組成物中で使用される糖タンパク質のタンパク
質キャリアからのヒスチジンタグの欠失は、この糖タンパク質をヒトにおけるワクチン組
成物での投与に適したものとすることを容易に理解するであろう。例えば、例としてEPA(
配列番号:13)、ClfA(配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12)、及びHla(配列番号:6、
配列番号:7、配列番号:8、配列番号:16)などのタンパク質キャリア内のヒスチジンタグ(H
is-タグ)の欠失は、ヒトへの投与のために糖タンパク質中でそれを使用することに関して
認められるであろう。
グラム陽性、例えば黄色ブドウ球菌、又は他の細菌の感染症又は疾患の症状の何らかの
改善は、例えば黄色ブドウ球菌が引き起こした感染症又は疾患、又は他の細菌が引き起こ
した感染症又は疾患などの、グラム陽性が引き起こした感染症又は疾患のために使用され
る薬物療法の用量の減量、或いは患者の血清又は粘膜中の抗体産生の増加を含む、望まし
い臨床の目的であることは理解されなければならない。当業者には、本発明のワクチン組
成物の一部は、グラム陽性感染症、例えば黄色ブドウ球菌感染症、又は他の細菌感染症の
予防に有用であり、一部はグラム陽性感染症、例えば黄色ブドウ球菌感染症、又は他の細
菌感染症の治療に有用であり、且つ一部はそのような感染症の予防及び治療の両方に有用
であることは明らかであろう。
ワクチン及び他の医薬品などの本発明の実施態様は任意に、当該技術分野において周知
であり且つ本明細書に照らして自明であるように、好適で且つ医薬として許容し得る担体
、賦形剤、希釈剤及び/又はアジュバントを使用し調製されてよい。賦形剤、希釈剤又は
アジュバントは、活性成分のビヒクル又は媒体として利用することができる固形、半固形
又は液体の材料であってよい。本明細書に照らして組成物調製分野の業者は、選択された
製品の特定の特徴、治療される疾患又は状態、疾患又は状態の段階、並びに他の関連状況
に応じ、適切な投与の形態及び様式を容易に選択することができる(「レミントン薬科学(
Remington's Pharmaceutical Sciences)」、Mack Publishing Co.、(1990))。医薬として
許容し得る希釈剤、賦形剤又はアジュバントの割合及び性質は、選択された医薬活性化合
物の溶解度及び化学特性、選択された投与経路及び標準の医薬の実践により決定される。
従って本発明の実施態様において、ワクチン組成物は、免疫原性成分又は断片、例えば
黄色ブドウ球菌の多糖又はそれらの断片、及び/又は黄色ブドウ球菌若しくは緑膿菌のタ
ンパク質若しくはそれらの断片を含有し、並びに任意に医薬として許容し得る担体を含む
。用語「医薬として許容し得る担体」とは、無毒である担体をいう。好適な医薬として許
容し得る担体としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリ
セロール、エタノールなどの1種以上に加え、それらの組合せが挙げられる。医薬として
許容し得る担体は更に、抗体の貯蔵寿命又は有効性を増強する、湿潤剤又は乳化剤、保存
剤又は緩衝剤などの少量の補助物質を含んでよい。そのような医薬として許容し得る担体
は、例えば、医薬ビヒクル、賦形剤、又は媒体として利用する液体、半固体、又は固体の
希釈剤を含む。当該技術分野において公知の任意の希釈剤を使用することができる。希釈
剤の例は、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、
ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、タルク、アルギン酸、デンプン、乳糖、ショ糖
、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、アカシアゴム、リン酸カルシウム、鉱
油、カカオバター、及びカカオ脂を含むが、これらに限定されるものではない。
更に本発明の追加の実施態様において、本ワクチン組成物は任意に、アルミニウム塩(
水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウムなど)；
水中油型などの、エマルション(MF59、AS03)；AS04などの脂質と塩の組合せ；油中水型(M
ontanide)；ISCOMS、リポソーム/ウイロソーム；ナノ粒子及びマイクロ粒子など；ペプチ
ドなど粒子でないもの；サポニン(QS21)；MPL A；サイトカイン；DNA誘導体；細菌毒素；
などの特定のアジュバントを含むが、これらに限定されるものではない、アジュバント又
はアジュバントの組合せを含むことができる。更なる実施態様は、フロイント完全アジュ
バント及びフロイント不完全アジュバント、ミコレート-ベースのアジュバント(例えばト
レハロースジミコレート)、細菌リポ多糖(LPS)、ペプチドグリカン(すなわち、ムレイン
、ムコペプチド、又はN-Opacaなどの糖タンパク質、ムラミルジペプチド[MDP]、又はMDP
類似体)、プロテオグリカン、ブドウ球菌調製品(例えばOK432)、DEAE-デキストラン、中
性油(ミグリオールなど)、植物油(落花生油など)、プルロニック、Ribiアジュバントシス
テム又はインターロイキン、特に細胞媒介性免疫を刺激するものなど、動物において使用
されるアジュバントを含む。使用されるアジュバントは、一部、グライココンジュゲート
ワクチンの組成及び種類によって決まるであろう。投与されるアジュバントの量は、哺乳
動物の種類及びサイズによって決まるであろう。至適用量は、慣習的方法により容易に決
定することができる。
本発明の更なる態様は、本発明の糖タンパク質を少なくとも1種含有する医薬組成物に
関する。糖タンパク質を含有する医薬品の調製は、当該技術分野において周知である。最
終の医薬組成物の調製スキーム並びにその投与の様式及び詳細は、使用されるタンパク質
、宿主細胞、核酸及び/又はベクターにより決まるであろう。
当業者には、本発明の多糖又は糖タンパク質の治療的有効量は、とりわけ、投与スケジ
ュール、投与される抗体の単位投与量、多糖又は糖タンパク質が他の治療薬と組合せて投
与されるかどうか、患者の免疫状態及び健康状態、並びに特定の多糖又は糖タンパク質の
治療活性によって決まることは明らかであろう。
本発明のワクチン組成物及び/又は医薬調製品は、経口、非経口又は局所使用に適合さ
れてよく、且つ錠剤、カプセル剤、坐剤、液剤、懸濁剤の形、又は任意の他の好適な手段
若しくは剤形で患者へ投与されてよい。本発明の更なる態様において、ワクチン組成物及
び/又は医薬調製品は、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、若しくは皮下
の注射によるか；又は、経口、舌下、経鼻、経肛門、又は経膣の送達によるなどを含む任
意の公知の方法により、免疫付与されるべき対象に導入されてよい。本発明の医薬活性化
合物は、それら自身有効であるが、安定性、結晶化の簡便性、溶解度の増加などを目的と
して、酸付加塩又は塩基付加塩などの、それらの医薬として許容し得る塩の形状で製剤し
投与することができる。本発明の実施態様におけるワクチン組成物は、例えば、皮下又は
筋肉内のいずれかの注射により、非経口的に投与される。筋肉内免疫付与の方法は、Wolf
fらの論文(Science, 247:1465-1468 (1990))及びSedegahらの論文(Immunology, 91:9866-
9870 (1994))に説明されている。他の投与様式は、経口及び経真皮を含む。
本発明のワクチンは、例えば成人又は小児において一次予防薬として、感染した宿主に
おける黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌の根絶が成功した後の二次防御として、又は黄
色ブドウ球菌などのグラム陽性菌による感染症を予防するため宿主において免疫反応を誘
導する目的で治療薬として投与することができる。本発明のワクチンは、当業者により容
易に決定される量で投与する。治療は、単回投与量又はある期間にわたる反復投与量から
なる。例えばいくつかの実施態様において、本発明のワクチンのヒトに関する典型的用量
は、タンパク質キャリア(その質量は含まない)に結合されたオリゴ糖抗原約1〜25μgであ
り、更なる実施態様において多糖抗原約1μg〜約10μg、並びにまた更なる実施態様にお
いて多糖抗原約2μgであると予想される。追加の実施態様において、グライココンジュゲ
ート又はワクチン内の糖/タンパク質の比は、約1：5〜約1：10である。任意に、本発明の
バイオコンジュゲートワクチンなどのワクチンは、アジュバントを含んでよい。当業者は
、至適用量は、患者の体重、疾患、投与経路、及び他の要因に応じ、増減され得ることを
認めるであろう。当業者は、適量レベルは、公知のワクチンによる結果を基に得ることが
できることも認めるであろう。投与回数は、疾患、製剤、及び臨床試験の有効性データに
より決まるであろう。
本ワクチン組成物は、送達に都合の良い形状で、包装することができる。免疫原性成分
又は断片のレシピエント哺乳動物への進入に適合性がある送達の形状が好ましい。
本発明の一実施態様は概して、改変されたLPS生合成経路を使用することによる、グラ
ム陰性生体におけるグラム陽性生体のためのワクチンの組換え製造を指向している。これ
は、オリゴ糖転移酵素及びタンパク質をコードしている核酸並びに少なくとも2つの異な
る生体に起源があるグリコシル転移酵素をコードしている核酸を含む宿主への挿入により
達成される。この実施態様は、(i)タンパク質；(ii)オリゴ糖転移酵素、及び(iii)少なく
とも2種の異なる生体由来のグリコシル転移酵素：をコードしている核酸が挿入される天
然の生体を基にした生体の遺伝子操作を指向している。
そのような実施態様の一例において、グリコシル化されたタンパク質生成物は、黄色ブ
ドウ球菌のためのワクチンとして使用するために生成される。本発明のワクチン製品は、
遺伝子改変された大腸菌宿主において生成される。黄色ブドウ球菌は、グラム陽性菌であ
り、且つ多糖莢膜を有する。この生体に関するワクチン製品は、その糖セクションがこの
莢膜多糖に類似した構造を有するグリコシル化されたタンパク質を基にすることができる
。
別の態様において、本発明は、古典的化学コンジュゲート法に勝る利点を提供する免疫
原性コンジュゲートワクチンを製造する新規バイオエンジニアリング的アプローチを指向
している。ある実施態様において、本アプローチは、細菌細胞、例えば大腸菌などのグラ
ム陰性細胞における糖タンパク質のインビボ生成に関与している。
当業者に公知のように、グライココンジュゲートの生成及び精製は、ワクチン候補及び
使用されるプラスミドの組合せに応じて変動することができる。例えば、選択されるその
精製手順は、タンパク質キャリア、グライココンジュゲートの糖成分、及び例えば動物又
はヒトにおけるなどの精製されたワクチン候補の意図された用途を基にしていることは知
られている。例えばヒトにおける使用に関して、他の場合には精製を促進するものである
His-タグは除去されることが知られている。
本明細書において言及した全ての刊行物は、それらの全体が引用により本明細書中に組
み込まれている。本明細書において使用される用語「又は」は、適切ならば組合せること
ができる代替を意味し；すなわち、用語「又は」は、個別に各々列記された代替に加え、
それらの組合せを含むことは理解されるべきである。本明細書において使用されるように
、状況を別所で明確に指摘しない限りは、単数形(a, an, the)などの単数はその複数を含
み、複数の言及はその単数を含む。
本発明は更に、本発明の組成物及び方法に加え、その利用性を更に説明する下記実施例
を参照し規定される。本発明の範囲内である組成物及び方法の両方に対する改変を実施す
ることができることは当業者には明らかであろう。
(実施例)
(実施例1：大腸菌細胞におけるCP5及びCP8多糖の合成)
本発明の実施態様の目的は、大腸菌におけるCP5及びCP8抗原性多糖の生成である。前述
のように、本発明者らは、先行技術の観点から驚くべき、CP及びO抗原の生成経路は機能
的に重複しているという事実、RUの構造において表されている事実(図1−4参照)を、新規
方法において活用した。CP5及びCP8の莢膜グリカンは、2-アセトアミド-2-デオキシ-D-マ
ンヌロン酸(D-ManNAcA)並びにD-及びL-立体配置を持つ2つの2-アセトアミド-2,6-ジデオ
キシガラクトース残基(D-及びL-FucNAc)の類似した三糖RUからなる重合体である。ManNAc
A残基は、2つの血清型において異なるように結合され；加えて、重合されたグリカン内の
RU間の結合は異なる。加えて、これら2つの抗原内の異なる位置に免疫優性O-アセチル改
変が存在する(Jones, C.の論文、2005、「新規グライココンジュゲートワクチン成分の黄
色ブドウ球菌5型及び8型由来の莢膜多糖の改変構造(Revised structures for the capsul
ar polysaccharides from Staphyrococcus aureus types 5 and 8, components of novel
glycoconjugate vaccines)」、Carbohydr Res, 340:1097-106)。緑膿菌LPSのO11抗原は
、[-3)-α-L-FucNAc-(1,3)-β-D-FucNAc-(1,2)-β-D-G1c-(1-]を含むので(図4)、緑膿菌L
PSのO11抗原は、その構造がCP5及びCP8に類似している(Knirel, Y. A.、V. V. Dashunin
、A. S. Shashkov、N. K. Kochetkov、B. A. Dmitriev及びI.L. Hofmanの論文、1988、「
赤痢菌の菌体抗原：志賀赤痢菌7型リポ多糖のO-特異的多糖鎖の構造(Somatic antigens o
f Shigella: structure of the O-specific polysaccharide chain of the Shigella dys
enteriae type 7 lipopolysaccharide)」、Carbohydr Res, 179:51-60)。この三糖-RUは
、黄色ブドウ球菌のD-ManNAcAがグルコース単位により交換される点、緑膿菌O11 LPSには
O-アセチル改変が存在しない点のみが異なり、RUにおける2番目と3番目の単糖間の結合型
に違いは存在しない(図4)。
本発明者らは、UndPP上でCP5及びCP8グリカンを合成することができる遺伝子システム
を作製するために、Deanらの方法(Dean, C. R.、C. V. Franklund、J. D. Retief、M. J.
Coyne, Jr.、K. Hatano、D. J. Evans、G. B. Pier、及びJ. B. Goldbergの論文、1999
、「緑膿菌PA103の血清型O11 O抗原遺伝子座の特徴付け(Characterization of the serog
roup O11 O-antigen locus of Pseudomonas aeruginosa PA103)」、J Bacteriol, 181:42
75-4284)を使用し、PA103株から緑膿菌O11 O抗原遺伝子クラスターを改変した。UndPP-D-
FucNAc-L-FuncNAcからなる基幹構造を合成するための生合成機構をコードしている遺伝子
は、黄色ブドウ球菌グリカンの完成のために必要な黄色ブドウ球菌酵素により代償され(
図1−4)、これは本プロセスの新たな用途でもあった。従ってDeanらの方法を使用し、Und
PP-FucNAc-FucNAc生合成に必要とされる緑膿菌PA103由来の全ての遺伝要素を発現した。3
番目の糖を付加するグリコシル転移酵素をコードしている遺伝子を欠失させ、且つわずか
な改変を伴う黄色ブドウ球菌Mu50(CP5)及びMW2(CP8)由来のcap5又は8クラスターの対応す
る遺伝子と交換した。
黄色ブドウ球菌莢膜多糖のための特異的残基を合成する酵素をコードしている遺伝子は
、Sauらにより予想されたこれらの遺伝子の機能に従い、O11のバックグラウンドへ段階的
に組み込んだ(Sau, S.、N. Bhasin、E. R. Wann、J. C. Lee、T. J. Foster、及びC. Y.
Leeの論文、1997、「血清型5及び8莢膜発現のための黄色ブドウ球菌対立遺伝子座は共通
遺伝子により隣接された型特異的遺伝子を含む(The Staphyrococcus aureus allelic gen
etic loci for serotype 5 and 8 capsule expression contain the type-specific gene
s flanked by common genes)」、Microbiology, 143:2395-405；O'Riordan, K.及びJ. C.
Leeの論文、2004、「黄色ブドウ球菌莢膜多糖(Staphyrococcus aureus capsular polysa
ccharide)」、Clin Microbiol Rev, 17(1):218-34)。そのような段階を以下に説明する。
cap5I/cap8H遺伝子産物は、ManNAcAを、RUのUndPP-D-FucNAc-L-FuncNAcへ付加し、各血
清型に特異的な結合を形成するグリコシル転移酵素であると予測した(Sau, S.、N. Bhasi
n、E. R. Wann、J. C. Lee、T. J. Foster、及びC. Y. Leeの論文、1997、「共通遺伝子
により隣接された型特異的遺伝子を含む血清型5型及び8型莢膜発現のための黄色ブドウ球
菌対立遺伝子座(The Staphyrococcus aureus allelic genetic loci for serotype 5 and
8 capsule expression contain the type-specific genes flanked by common genes)」
、Microbiology, 143:2395-405)。このことを証明するために、Cap5I及びCap8Hの活性を
、緑膿菌O11 O抗原の生成をもたらすプラスミドの存在下で、大腸菌において分析した。O
11クラスターを発現している細胞は、最初にUndPP上にO11 O抗原を合成し、そこからこれ
はO抗原リガーゼである大腸菌酵素WaaLによりリピドAコアへ転移され、O11特異的リポ多
糖(LPS)を形成する(Goldberg, J. B.、K. Hatano、G. S. Meluleni及びG. B. Pierの論文
、1992、「大腸菌における緑膿菌O抗原のクローニング及び表面発現(Cloning and surfac
e expression of Pseudomonas aeruginosa O antigen in Escherichia coli)」、Proc Na
tl Acad Sci USA. 89(22):10716-20)。このリポ多糖を合成するために、緑膿菌PA103由来
のO11 O抗原クラスターを、pLAFR1(配列番号:1)へクローニングした。次に3番目の糖をO1
1 RUへ付加する酵素であるグルコシル転移酵素をコードしているwbjA遺伝子を、トランス
ポゾン変異誘発により欠失した。変異されたクラスター(O11 wbjA::Tn50＜dhfr-1＞)を、
相同組換えにより更に改変し、wzy遺伝子のポリメラーゼ活性を除去し、O11 wbjA::Tn50
＜dhfr-1＞wzy::catを形成し、これを変異された配列番号:1と記し、ここではO11遺伝子
クラスターのグリコシル転移酵素wbjA及びwzyポリメラーゼの遺伝子は失活された。この
改変されたクラスターを、W3110ΔwecA細胞において発現させ、抽出物をプロテイナーゼK
で処理し、且つTasiらの論文に明らかにされた方法に従い、SDS PAGE及び銀染色により分
析した(Tsai, C. M.及びC. E. Fraschの論文、1982、「ポリアクリルアミドゲル中のリポ
多糖を検出する高感度銀染色(A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccha
rides in polyacrylamide gels)」、Anal Biochem, 119:115-9)。結果を図5Aに示し、こ
れは本明細書に記載のpLAFR1由来の変異されたO11クラスターを発現しているW3110ΔwecA
抽出物の銀染色を示している。第二のレーンは、誘導性プラスミドpEXT22から発現された
遺伝子を示している。アスタリスクは、合成され且つコドン最適化された遺伝子を示す。
異なる関連グリコフォームは矢印で示している。
分析は、ゲルの2本の大きいバンドを生じた(図5A、レーン1)。シグナルは、未改変のリ
ピドAコア(図5A、下側バンド)、並びに切断型O11 RUにおいて予想されるようなリピドAコ
アと2つのFucNAc残基からなるLPSに対応している。個別のIPTG誘導性プラスミド由来のwb
jA野生型コピーの発現時に、上側バンドは、より遅い電気泳動移動度にシフトし、このこ
とは切断型O11 LPSへのグルコース残基の付加を示している(図5A、レーン2)。予想された
黄色ブドウ球菌グリコシル転移酵素Cap5I(レーン4)及びCap8H(図5A、レーン3)は、WbjAの
代わりにトランスで発現された場合、グリコシル化されたリピドAコアシグナルの同様の
シフトが認められ、これは単糖の、恐らくグルコースより更に大きい、最も可能性のある
のはManNAcAの付加を示している。このデータは、黄色ブドウ球菌グリコシル転移酵素は
、緑膿菌酵素の活性により合成されるUndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc糖脂質を伸長することが
できることを証明している。
この方法で、UDP-ManNAcAの生合成機構は、黄色ブドウ球菌CP5/8クラスターには存在す
るが、緑膿菌のO11 O抗原クラスターには存在しないので、大腸菌における黄色ブドウ球
菌RU集成の必須条件は、UDP-ManNAcAの供給であることも確認した。全ての他の必要とさ
れるヌクレオチド活性化された糖は、大腸菌のハウスキーピング機能及び緑膿菌のO11 O
抗原クラスターのいずれかにより提供される。大腸菌は、wecB及びwecCの発現により、Ma
nNAcAグリコシル転移酵素の基質であるUDP-ManNAcAを生成することがわかっている。これ
らの遺伝子は、腸内細菌共通抗原(ECA)生合成に責任のあるクラスターにおいて構成的に
発現される(Meier-Dieter, U.、R. Starman、K. Barr、H. Mayer、及びP. D. Rickの論文
、1990、「大腸菌における腸内細菌共通抗原の生合成(Biosynthesis of enterobacterial
common antigen in Escherichia coli)」、J Biol Chem, 265:13490-13497)。黄色ブド
ウ球菌のCPクラスターにおいて認められるUDP-ManMAcA生合成の機能的ホモログは、先に
報告されたようにwecBCの活性を代償することがわかった(Kiser, K. B.、N. Bhasin、L.
Deng及びJ. C. Leeの論文、1999、「黄色ブドウ球菌cap5Pは機能縮重によりUDP-N-アセチ
ルグルコサミン2-エピメラーゼをコードしている(Staphylococcus aureus cap5P encodes
a UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase with functional redundancy)」、J. Bacteri
ol, 181(16):4818-24)。これは、大腸菌におけるCP抗原の生成は、宿主株におけるwecBC
遺伝子の機能的発現に頼っていることを示している。従って、組換えシステムにおいてCa
p5I及びCap8Hの基質としてUDP-ManNAcAを提供するためには、WecB及びWecCが発現される
べきであることが確認された。そのようなシステムにおいて、例えばwecA欠失を伴う又は
伴わず且つ追加のwzzE欠失を伴う又は伴わないW3110ベースの細胞型などの、大腸菌野生
型株のように腸内細菌共通抗原を発現する任意の原核生物株を使用することができる。
黄色ブドウ球菌莢膜多糖の更なる伸長は、グリカンの最大の免疫活性に必要であると考
えられる。cap5J/cap8I遺伝子は、反復単位を重合する wzyホモログをコードし、且つcap
5K/cap8Kは、UndPP-結合型三糖を膜の細胞質側からペリプラズム側へと移行するフリッパ
ーゼをコードしている。cap5H/cap8Jは、L-FucNAcをRUの3'位で、又はManNAcAを4'位で修
飾するO-アセチル転移酵素をコードしている(Bhasin, N.、A. Albusらの論文、(1998)、
「黄色ブドウ球菌5型莢膜多糖のO-アセチル化に必須の遺伝子の同定(Identification of
a gene essential for O-acetylation of the Staphylococcus aureus type 5 capsular
polysaccharide)」、Mol Microbiol, 27(1):9-21)。このアセチル化は、多糖の免疫反応
性を識別する重要な決定因子である(Fattom, A. I.、J. Sarwar、L. Basham、S. Ennifar
、及びR. Nasoの論文、1998、「黄色ブドウ球菌5型及び8型莢膜多糖ワクチンの抗原決定
基(Antigenic determinants of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular po
rysaccharide vaccines」、Infect Immun, 66:4588-92)。これらのRUは伸長及びアセチル
化されることができることを示すために、重合及びO-アセチル化に責任のある黄色ブドウ
球菌酵素を、変異されたO11クラスターの存在下で、個別のプラスミドから発現した。O11
wbjA::Tn50＜dhfr-1＞ wzy::catクラスター及びCP5クラスターの異なる遺伝子を発現し
ているW3110ΔwecA細胞からの抽出物を、プロテイナーゼKで処理し、SDS PAGE、電気転写
させ、引き続き抗CP5糖(J. C. Leeから入手(Department of Medicine, Brigham and Wome
n's Hospital, Harvard Medical School、ボストン、MA、米国))を用い免疫ブロッティン
グすることにより分析した。図5Bは、抗CP5抗血清を使用する、SDS PAGE及び電気転写に
より分離した、プロテイナーゼK処理した大腸菌抽出物の免疫検出の結果を示している。
分析した全ての抽出物は、本明細書に記載のpLAFRプラスミドから発現されたwbjA遺伝子
及び部分的に(アスタリスクにより示した)wzy遺伝子の欠失を伴う緑膿菌O11クラスター、
並びにこれらの細胞におけるCP5重合及びOアセチル化を可能にする異なるCap5タンパク質
(記載している)を発現する更に2つのプラスミド(pEXT22、pACT3)を含んだ。誘導因子濃度
及び発現培養インキュベーション温度などの実験の詳細を記している。
図5Bにおいて、結果は、はしご状シグナルが比較的高い分子量範囲においてO抗原重合
体の典型であることを示している。異なるバンドは、両方共プロテイナーゼK消化に対し
安定しているLPS又はUndPP上の異なる数の鎖状重合されたRUを表している。O-アセチル転
移酵素の存在下又は非存在下で、はしご状構造の異なる強度が認められた。cap5Hの存在
下で強力なシグナルが検出された(図5B、レーン1−4)のに対し、これらはcap5Hの存在し
ないレーンにおいては事実上存在しなかった(図5B、レーン5、6)。このことは、O-アセチ
ル化がいずれか特異的抗血清による認識を増大すること、又はこれが、フリッピングの促
進若しくはより効率的な重合形成によるか、又はより多くのRU生成を誘導することのいず
れかにより、重合活性を増強することを意味する。cap5H遺伝子は、異なる骨格のプラス
ミドから発現された場合に機能する(図5B、レーン1、2及び3、4)が、シグナル強度は、ca
p5Hが個別のプラスミドから単独で発現された場合の方がより強力である(図5Bレーン1と
レーン3、図5Bレーン2とレーン4を比較)。黄色ブドウ球菌遺伝子の誘導により少ないIPTG
を使用すると、より強力なシグナルとなる(図5Bレーン1とレーン2、及び図5Bレーン3とレ
ーン4を比較)ことは、驚くべきであり注目に値する。
(実施例2：大腸菌細胞内の脂質上のCP5及びCP8重合体の合成)
cap5特異的遺伝子の高い発現はより少ない重合体形成に繋がるので、この問題に対処す
るために、組換えグリカンの代替発現システムを構築した。詳細には、先行技術を考慮し
予想外の新規アプローチにおいて、緑膿菌グルコシル転移酵素(wbjA)及びO11のポリメラ
ーゼ(wzy)を、黄色ブドウ球菌Mu50/MW2の莢膜遺伝子クラスター由来のCP5/8-特異的要素
をコードしている遺伝子(cap5/8HIJK及びそれらの一部)と交換し、緑膿菌O11及び黄色ブ
ドウ球菌CP5又はCP8遺伝子で構成された単独のキメラ遺伝子クラスターを作製した(図6)
。この構築体は、黄色ブドウ球菌の特異的遺伝子を含んだ。Datsenkoらの方法(Datsenko,
K. A.及びB. L. Wannerの論文、2000、「PCR産物を使用する大腸菌K-12における染色体
遺伝子の一工程不活化(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia c
oli K-12 using PCR products)」、Proc Natl Acad Sci USA, 97:6640-5)に従い、各々に
、発現検出のためにタグを付け、且つ各々は、導入されたリボソーム結合部位を含み、引
き続き組換えクローンの選択のためのクロラムフェニコール耐性カセット(cat)を含み、
配列番号:2、配列番号:3、及び配列番号:4を生じた。
図6は、本発明のキメラO11/CP5及びO11/CP8遺伝子クラスターを構築するための本発明
の戦略の実施態様を示す。黄色ブドウ球菌CP5及びCP8 CPクラスター(上側)及び緑膿菌PA1
03 rfbクラスター(O11、中央)は、文献として示されている(Dean, C. R.、C. V. Franklu
nd、J. D. Retief、M. J. Coyne, Jr.、K. Hatano、D. J. Evans、G. B. Pier、及びJ. B
. Goldbergの論文、1999、「緑膿菌PA103の血清型O11 O抗原の特徴付け(Characterizatio
n of the serogroup O11 O-antigen locus of Pseudomonas aeruginosa PA103)」、J Bac
teriol, 181:4275-84；Sau, S.、N. Bhasin、E. R. Wann、J. C. Lee、T. J. Foster及び
C. Y Leeの論文、1997、「共通遺伝子に隣接された型特異的遺伝子を含む血清型5型及び8
型莢膜発現のための黄色ブドウ球菌対立遺伝子座(The S. aureus allelic genetic loci
for serotype 5 and 8 capsule expression contain the type-specific genes flanked
by common genes)」、Microbiology, 143(Pt7):2395-405)。これらの遺伝子の相同な機能
は、以下に説明されている。右上がり実斜線は、2種の生体においてUndPP上のD-FucNAc-L
-FucNAc二糖の合成に責任のある遺伝子を示し；点付きは、3番目の単糖をRUに付加するグ
リコシル転移酵素の遺伝子を示す。Wzx-様フリッパーゼ遺伝子は、右上がり破斜線により
示され、wzy-様RUポリメラーゼ遺伝子は、右下がり破斜線により示される。CP5クラスタ
ーは、Wzz長さ調節因子(白矢印)を含まないが、3つの遺伝子セットは、黄色ブドウ球菌に
おける長さ調節因子機能を含む莢膜多糖に関するエクスポート機構を構成する(白矢印)。
右上がり実斜線により示されたOアセチル転移酵素遺伝子は、CPクラスターに特有である
。黄色ブドウ球菌におけるUDP-ManNAcA生合成に必要な遺伝子は、黒色で示した。これら
は、緑膿菌O抗原の生成には不要である。O11、CP5及びCP8多糖の構造上の差異の原因とな
る遺伝子は、各々の遺伝子クラスターの始まり(O11:wbjA及びwzy)又は中央(CP5/8:cap5/8
HIJK)において一緒にクラスター化されている。CP8クラスターは、長さ及びDNA配列を考
慮すると、構造特異性を付与する中央部分(cap5/8HIJK)以外は、CP5クラスターとほとん
ど同一である。キメラクラスターは、相同組換え及び古典的クローニングによる、CP5(又
はCP8)クラスターの特異性部分(cap5/8HIJK)及び白矢印で標示されたcat(cat、選択のた
め)により表されたクロラムフェニコールアセチル転移酵素のカセットと、プラスミド媒
介性O11クラスターのwbjA及びwzy遺伝子の交換により構築され、配列番号:2、配列番号:3
、及び配列番号:4を生じた。破線矢印のアスタリスクは、相同組換えに使用した不完全な
遺伝子配列を示している。得られた2つのキメラクラスターは、下側パネルに示し、配列
番号:3及び配列番号:4のDNAを表している。
本発明のキメラCP5及びCP8は驚くべきことにUndPP上に正確なRUを集成し、且つこれら
の反復単位が重合されることを確実にすることを証明するために、この完全長キメラクラ
スターを含む大腸菌細胞(W3310ΔwecA)のプロテイナーゼK消化物を、SDS-PAGEにより分離
した。具体的には、pLAFRプラスミド上にキメラCP5遺伝子クラスター(図7A)又はキメラCP
8遺伝子クラスター(図7B)を含むか又は欠くかのいずれかであるプラスミドを持つ細胞を
、プロテイナーゼKにより処理し、SDS-PAGEにより分離し、脂質を銀染色(図7A及び7Bの左
側パネル)によるか、又はニトロセルロースメンブレンへの電気転写後の抗CP5若しくはCP
8抗血清による免疫検出(図7A及びBの右側パネル)により可視化した。フリッパーゼ遺伝子
cap5Kを欠く構築体(配列番号:2)及び含む構築体(配列番号:3)を試験した。前者は、CP5 L
PS生成において活性が低いことがわかった。
電気転写及び抗CP5特異的血清による免疫検出後、キメラCP5クラスター全体を発現して
いる抽出物は、それらの自家血清によりプロービングされた大腸菌由来の内在性O抗原構
造に類似したはしご状のシグナルを示している(図7A、右側の最後の2本のレーン)。これ
は、CP5反復単位は重合されること、好ましい重合体長が存在すること、及びCP5抗原はこ
れらの細胞内でリピドAコアに転移されたことを強力に示唆している。同じ抽出物を、SDS
-PAGE後、銀染色により可視化し(図7A、左側図)、キメラCP5(w/o cap5K)及びキメラCP5と
標示した右側の2本のレーンは、実際CP5 O抗原-様構造で装飾された大腸菌のリピドAコア
からなるLPSが形成されたことを示している。cap5Kフリッパーゼ遺伝子を持つ又は持たな
いCP5キメラクラスターを発現した細胞を起源とする抽出物から、強度の差が得られた。
これら2つの抽出物の比較は、Cap5K発現はこの重合体生成をかなり増大することを示して
いる(図7Aの両方のパネルの中央レーンと右側レーンを比較)。
図7Bに示されるように、同じ結果が、CP8キメラクラスターで認められた。pLAFRプラス
ミド上にキメラCP8遺伝子クラスターを含むか又は欠くかのいずれかであるプラスミドを
含む細胞を、プロテイナーゼKにより処理し、SDS-PAGEにより分離し、脂質を銀染色(左側
パネル)によるか、又はニトロセルロースメンブレンへの電気転写後の抗CP8抗血清による
免疫検出(右側パネル)のいずれかにより検出した。フリッパーゼ遺伝子cap8Kを含むCP8キ
メラ構築体は、配列番号:4に相当している。
本発明の更に新規且つ驚くべき伸展が、大腸菌におけるキメラクラスターの維持及び発
現のために使用されるプラスミド骨格を変更することにより明らかにされた。キメラCP5
クラスターを含むpLAFR1における耐性カセットを、TetからKanへ変更した。加えてcap5K
を含むCP5キメラクラスター全体を、Leeらの方法(Lee, D. J.、L. E. Bingle、K. Heurli
er、M. J. Pallen、C. W. Penn、S. J. Busby及びJ. L. Hobmanの論文、2009、「遺伝子
変造：実験室及び病原性大腸菌株の組換え法(Gene doctoring: a method for recombinee
ring in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains)」、BMC Microbiol, 9:
252)に従い、プラスミドpDOC-Cへ及びpACYC177(GeneBank寄託番号#X06402)へサブクロー
ニングした。
図8A及び8Bに示されるように、これらのプラスミドは全て、SDS PAGE、電気転写、及び
抗CP5特異的抗血清による免疫検出により分析されたように、CP5重合体生成をもたらした
。図8Aにおいて、異なるキメラクラスターを含む細胞からの総細胞抽出物を、プロテイナ
ーゼKにより処理し、且つSDS PAGE及び銀染色により分析した。これらのプラスミドは、
異なる黄色ブドウ球菌特異性遺伝子及び抗生物質選択に使用される異なる耐性遺伝子を含
み、以下のように示されている：テトラサイクリン(Tet)及びHIJ、配列番号:2；Tet、HIJ
K、配列番号:3；Tet及び遺伝子なし、空のプラスミド対照。数値は分子量マーカーに対応
している。カナマイシン(Kan)と標示したレーンは、テトラサイクリン耐性カセットがカ
ナマイシン耐性遺伝子により交換された配列番号:3の変形を含む。
図8Bにおいて、宿主菌株は、図8Aのように、大腸菌W3110ΔwecAである。図8Bの左側レ
ーンは、図8Aのように分子量マーカーに相当している。図8Bにおいて、異なるキメラクラ
スターを含む細胞からの総細胞抽出物を、プロテイナーゼKにより処理し、且つSDS PAGE
及び銀染色(左側パネル)及び電気転写後の抗CP5免疫ブロッティング(右側パネル)により
分析した。使用したプラスミドは、テトラサイクリンの代わりにカナマイシンカセットを
含む改変されたpLAFR1プラスミド骨格内(図8A参照)、又はクロラムフェニコール耐性カセ
ットを含むpACYC内のいずれかに存在する、配列番号:3で示されたキメラCP5クラスターを
含む。
加えて異なるプロモーターを、キメラO11-CP5 LPSを発現するために試験した。これら
の試験において、宿主菌株は、キメラCP5クラスターを保持する大腸菌W3110ΔwecAであっ
た。この菌株において、キメラクラスターは、wecAwzzE遺伝子を交換した。pLAFR1から発
現された異なるキメラクラスターを含む細胞からの総細胞抽出物を、プロテイナーゼKに
より処理し、且つSDS PAGE及び電気転写後の抗CP5免疫ブロッティングにより分析した。
これらのプラスミドは、図9のレーン下側図に示されたように異なる黄色ブドウ球菌特異
性遺伝子(catカセットを持つ)によりwbjAとwzyが交換されたO11クラスターを含んだ。加
えて、cap5特異性遺伝子の前のDNAを変更し、且つ脂質グリコシル化に対する作用を分析
した。これらの異なるプロモーター領域の作用を、図9に示したように分析した。wzz/wzx
は、最初の相同組換え後のcap遺伝子の前の当初の遺伝子(図6参照)を示す(図9では最初の
2本のレーンに相当)。これら2つの遺伝子を除去し(図9では中央の3本のレーンに相当)、
且つ強力なプロモーター配列をコードしている大腸菌O121 O抗原クラスターの前の0.6kb
領域(PO121)と交換した(図9では最後の3本のレーンに相当)。図9においてwzz/wzx及びHIJ
で示されたレーンは、配列番号:2を発現する細胞に由来し、wzz/wzx及びHIJKで示された
レーンは、配列番号:3に由来する。図9において、分子量マーカーは、ゲルフレームの左
側に示している。
図9に示したように、これらの結果は、関連するプロモーター活性は、wzx遺伝子に備わ
っていること(図9の最初の2本のレーン−wzz/wzx)、及びこれはLPS生成を失うことなく、
大腸菌由来の構成的プロモーター、例えば血清亜型O121 wbプロモーター(PO121、図9の最
後の3本のレーン)により機能的に交換され得ることを示している。これらの結果はまとめ
ると、本明細書に記載のように、O11 O抗原及びCP5莢膜重合体生成のためのO11及び黄色
ブドウ球菌の要素は、多くの異なる大腸菌発現システムにおいて組合せることができ、結
果的に組換え黄色ブドウ球菌多糖を生成することを意味する。
これらの結果は、グラム陽性生体に起源を持つ莢膜多糖構造の大腸菌における生成を最
初に示した。これは、先行技術及び従来の予測とは対照的に、キメラ多糖を発達するため
のO11クラスターの酵素と、黄色ブドウ球菌capクラスターの酵素の組合せは可能であるこ
と、すなわちこの酵素はインビボにおいて同じ構造上で一緒に作用することを意味する。
(実施例3：組換えグリカンの分子構造の確認)
分子レベルでの大腸菌におけるキメラCP5/O11クラスターの活性を確認するために、2-
アミノベンズアミド(2-AB)による還元末端の糖の蛍光標識を使用することによりUndPP結
合された糖の分析を可能にする新規方法を開発した。この分析解像度を増強するために、
重合されないRUの量が増加した欠失を含むキメラクラスターを使用した。pLAFR1プラスミ
ドに含まれ且つcap5Kフリッパーゼを欠いているキメラクラスター(配列番号:2)を発現し
ている異なる大腸菌細胞に由来する糖脂質を、下記のように分析した。
UndPP-結合されたグリカンを抽出するために、大腸菌細胞を、0.9％NaClで洗浄し、且
つ凍結乾燥した。乾燥した細胞を、有機溶媒(85〜95％メタノール＝M)30mlにより一回抽
出した。この凍結乾燥した細胞ペレットを更に、クロロホルム：メタノール：水(C:M:W＝
10:10:3；v/v/v)5mlで2回抽出した。(M)抽出物を、クロロホルム及び水に変え、最終比3:
48:47(C:M:W)とした。10:10:3(C:M:W)抽出物を、水の添加により、2相Bligh/Dyerシステ
ムに変え(Bligh, E. G.及びW. J. Dyerの論文、1959、「総脂質抽出及び精製の迅速法(A
rapid method of total lipid extraction and purification)」、Can J Biochem Physio
l, 37(8):911-7)、最終比10:10:9(C:M:W)を生じた。遠心分離により相を分離し、上側の
水相を更なる処理のために保持した。
抽出された糖脂質を精製するために、水相をtC18 Sep-PAKカートリッジにかけた。この
カートリッジは、メタノール10mlで前処理し、その後3:48:47(C:M:W)の10mlで平衡とした
。試料を装荷した後、カートリッジを、3:48:47(C:M:W)の10mlで洗浄し、メタノール5ml
及び10:10:3(C:M:W)の5mlで溶離した。一緒にした溶離液を、N2下で乾燥した。この乾燥
試料をn-プロパノール:2Mトリフルオロ酢酸(1:1)の2mlに溶解し、50℃で15分間加熱し、
その後N2下で蒸発乾固させることにより、糖脂質試料を加水分解した(Glover, K. J.、E.
Weerapana及びB. Imperialiの論文、2005、「原核生物のN-結合型グリコシル化のための
UndPP-結合された七糖のインビトロ集成(In vitro assembly of the UndPP-linked hepta
saccharide for prokaryotic N-linked glycosylation)」、Proc Natl Acad Sci USA, 10
2(40):14255-9)。これらの乾燥試料を、2-ABにより標識し、既報のようにペーパーディス
ク法を用いグリカンクリーンアップを行った(Bigge, J. C、T. P. Patel、J. A. Bruce、
P. N. Goulding、S. M. Charles、R. B. Parekhの論文、1995、「2-アミノベンズアミド
及びアントラニル酸を使用するグリカンの非選択的かつ効果的蛍光標識(Nonselective an
d efficient fluorescent labeling of glycans using 2-aminobenzamide and anthranil
ic acid)」、Anal Biochem, 230(2):229-38；Merry, A. H.、D. C. Neville、L. Royle、
B. Matthews、D. J. Harvey、R. A. Dwek及びP. M. Ruddの論文、2002、「ヒドラジン分
解による糖タンパク質から放出された無傷の2-アミノベンズアミド標識されたO-グリカン
の回収(Recovery of intact 2-aminobenzamide -labeled O-glycans released from glyc
oproteins by hydrazinolysis)」、Anal Biochem, 304(1):91-9)。2-AB標識されたグリカ
ンは、Royleらの論文に従いGlycoSep-N順相カラムを使用するが、3溶媒システムに改変し
たHPLCにより分離した(Royle, L.、T. S. Mattu、E. Hart、J. I. Langridge、A. H. Mer
ry、N. Murphy、D. J. Harvey、R. A. Dwek、P. M. Ruddの論文、2002、「マイクログラ
ム量の糖タンパク質からのO-グリカンの配列決定のための戦略を提供する分析的及び構造
的データベース(An analytical and structural database provides a strategy for seq
uencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins)」、Anal Biochem, 3
04(1):70-90)。溶媒Aは、80％アセトニトリル中10mMギ酸アンモニウムのpH4.4であった。
溶媒Bは、40％アセトニトリル中30mMギ酸アンモニウムのpH4.4であった。溶媒Cは、0.5％
ギ酸であった。カラム温度は30℃であり、且つ2-AB標識されたグリカンは、蛍光により検
出した(励起λex＝330nm、放出λem＝420nm)。勾配条件は、流量0.4ml/分で160分間かけ
て100％Aから100％Bまで、引き続き流量を1ml/分に増加し100％Bから100％Cまで2分間の
直線勾配であった。カラムは、100％Cにより5分間洗浄し、2分間かけて100％Aに戻し、か
つ100％Aを流量1ml/分で15分間流し、その後5分間流量を0.4ml/分に戻した。水中の試料
を注入した。
乾燥した画分を、10％アセトニトリル(ACN)、0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)5ul中に再懸
濁し、且つ標的プレート上でマトリックス溶液(50％ACN、0.1％TFA中40mg/ml DHB)と1:1
で混合した。MS及びMS/MSデータを、Ultraflex-II MALDI-ToF/ToF質量分析計(Bruker Dal
tonik社、ブレーメン、独国)上で陽イオンモードで手動で得た。MS/MSは、LIFT法を用い
て得た。標準ペプチド混合物(Bruker Daltonik社)を外部較正に使用した。スペクトルは
、Flex Analysisソフトウェア(Bruker Daltonik社)を用いて外挿し、手作業で分析した。
キメラクラスターを伴う(太線)又は伴わない(細破線)プラスミドを含む大腸菌W3110Δw
ecA(CP5)からのメタノール抽出物を、tC18カートリッジ上で精製し、順相HPLCにより分析
した。37分、40分及び45分の溶離に認められる図10Aに示されたピークに対応する画分を
、MALDI-MS/MSにより分析した。37分及び40分に溶離する試料は、各々、結合したO-アセ
チル基を伴う及び伴わない組換えCP5 RUとして同定された。45分に溶離する試料は、1個
のデオキシ-N-アセチルヘキソサミンにより伸長されたアセチル化されない黄色ブドウ球
菌RU構造として同定された(図11Eに示されている)。CP5キメラクラスターにおいて、cap5
HIJは、pLAFR上のO11クラスターのwbjA及びwzy遺伝子と交換した。この交換は、cap5HIJ
遺伝子に加え、catカセット(配列番号:2)を含んだ。
キメラクラスターを伴う(太線)又は伴わない(細破線)プラスミドを含む大腸菌W3110Δw
ecAwzzEからのメタノール抽出物を、tC18カートリッジ上で精製し、順相HPLCにより分析
した。図10Bは、キメラクラスター(ポリメラーゼを伴わない配列番号:4)を用いて生成さ
れたCP8の組換えRUのHPLC分析の結果を示している。この組換え糖を発現している細胞に
特異的なピークは、23分、32分、38分及び45分の溶離により同定され、収集し、MALDI-MS
及びMALDI-MS/MSにより分析した。CP8キメラクラスターにおいて、cap8HJKは、O11クラス
ターのwbjA及びwzy遺伝子と、すなわちポリメラーゼを伴わない構築体を交換し、分析の
ための単独のRUを蓄積した。この交換は、cap遺伝子に加え、catカセットを含んだ。
図11Aは、37分で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP5クラスターの実施態様の発
現により発生した特異的ピークのMALDI-MS/MS分析の結果を示している。主質量(major ma
ss)m/z=772([M+H]+)を選択し、且つMS/MSにより分析し、これは本明細書に開示された本
発明を考慮し予想されたアセチル化されたCP5 RU構造と一致する断片化パターンを示す。
O-アセチル化された種は、RUの中央位置での単糖FucNAc(dHexNAc(OAc))の質量＋42の特異
的喪失により特徴付けられる。断片イオンは、糖鎖機能研究コンソーシアム(CFG)の命名
法(www.functionalglycomics.org/static/consortium/Nomenclature.shtml)に従い示され
ている。2-ABは、2-アミノベンズアミドである。断片イオンの凡例は、図11Aの差込図に
示されている。
図11Bは、40分で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP5クラスターの実施態様の発
現により発生した特異的ピークのMALDI-MS/MS分析の結果を示している。主要質量m/z＝73
0([M+H]+)を選択し、且つMS/MSにより分析し、これは本明細書に開示された本発明を考慮
し予想された非アセチル化CP5 RU構造と一致する一連の断片イオンを示す。2-ABは、2-ア
ミノベンズアミドである。断片イオンの凡例は、図11Bの差込図に示されている。
図11Cは、32分で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP8クラスターの実施態様の発
現により発生した特異的ピークのMALDI-MS/MS分析の結果を示している。主要質量m/z＝79
4([M+Na]+)を選択し、且つMS/MSにより分析し、これは本明細書に開示された本発明を考
慮し予想されたアセチル化されたCP8 RU構造と一致する一連の断片イオンを示す。O-アセ
チル化された種は、RUの最も外側の位置での単糖ManNAcA(HexNAcA(OAc))の質量＋42の特
異的喪失により特徴付けられる。断片イオンは、CFGの命名法に従い示されている。2-AB
は、2-アミノベンズアミドである。断片イオンの凡例は、図11Cの差込図に示されている
。
図11Dは、38分で溶離する大腸菌における本発明のキメラCP8クラスターの実施態様の発
現により発生した特異的ピークのMALDI-MS/MS分析の結果を示している。質量m/z＝730([M
+H]+)を選択し、且つMS/MSにより分析し、これは本明細書に開示された本発明を考慮し予
想された非アセチル化CP8 RU構造と一致する一連の断片イオンを示す。追加の分析は、よ
り遅く溶離するピークは(図10Aにおいて40分で、及び図10Bにおいて38分で示される)、CP
5及び8のRUの非O-アセチル化三糖を含むことを示した。断片イオンは、CFGの命名法に従
い示された。2-ABは、2-アミノベンズアミドである。断片イオンの凡例は、図11Dの差込
図に示されている。
MSの結果は、質量及び一連の断片イオンは、中央FucNAc残基でOアセチル化されたCP5 R
Uオリゴ糖(すなわち、図10A及び図11Aの37分のピーク)又は中央FucNAc残基でO-アセチル
化されなかったCP5 RUオリゴ糖(すなわち、図10A及び11Bの40分のピーク)の分子構造と一
致することを示した。図10Aにおける45分時点のシグナルは、四糖と同定され、これを更
に以下に分析した。同じ分析を、ポリメラーゼ遺伝子を欠いているキメラCP8クラスター
で繰り返した。そのような抽出物において、本明細書に開示された本発明を考慮し予想さ
れたO-アセチル化されたRU構造と一致するシグナルは、図10B及び11Cに示されたように、
23分及び32分の溶離で認められた。MALDI-MS/MSにより同定された同じグリカン配列に関
する2つの異なる溶離時間の存在は、試料調製時に生じるO-アセチル移動事象を指摘して
いる。非アセチル化RUは、図11B及びDにおいて示されたように、40分及び38分で、各々CP
5及びCP8抽出物について同定された。CP5及びCP8 RU構造は、例えば、W3110、W3310Δwec
A、W3110ΔwecAwzzE、及びW3110ΔwecAwzzEΔwaaLを含む、様々な大腸菌株に存在する。
(実施例4：反復単位構造の改善及びその分析)
キメラCP8クラスター(配列番号:4)を発現するが、wzyポリメラーゼ遺伝子cap8Iを欠い
ている大腸菌細胞に由来した、図10Bに示された45分で溶離するHPLCピークも、MALDI-MS/
MSにより分析した。フルスキャンMSにおいて最も強いイオンは、m/z＝939([M+H]+)であり
、且つ配列解析は、MS/MSにより行った。このMS/MS分析の結果は、図11Eに示し、且つ本
明細書に開示された本発明を考慮し予想されるように、非還元末端でデオキシ-N-アセチ
ルヘキソサミンの質量だけ延長された非アセチル化黄色ブドウ球菌莢膜RUと一致する一連
の断片イオンが存在した。仮定される構造に対応する断片イオンは、これらのピークの上
にCFGの命名法に従い示されている。2-ABは、2-アミノベンズアミドである。断片イオン
の凡例は、図11Eの差込図に示されている。
図11Eに示された結果は、大腸菌グリコシル転移酵素は、CP8 RUのManNAcA残基を改変す
ることができることを示唆した。そのような変更されたRUは、恐らくcap8Iにより重合さ
れることはないであろう。大腸菌宿主W3110におけるグリコシル転移酵素特異性の分析は
、ECAクラスター由来の酵素は、この組換え糖と、具体的には推定4-N-アセチルフコサミ
ン転移酵素であるwecF遺伝子産物と相互作用し得ることを指摘した。wecFは天然に、4-N-
アセチルフコサミンを、ECAを構成するManNAcA上に付加し、恐らくはこの酵素は同じくCP
8及びCP5 RUを伸長するであろう。
この問題点を解決するために、別の新規アプローチを開発した。具体的には、wecFを含
むwecC遺伝子の下流に位置したECAクラスターの遺伝子を欠失した。これは、Datsenkoら
により説明された方法を用いて実行した(Datsenko, K. A.及びB. L. Wannerの論文、(200
0)、「PCR産物を使用する大腸菌K-12における染色体遺伝子の一工程不活化(One-step ina
ctivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products)」、P
roc Natl Acad Sci USA、97(12):6640-6645)。様々な大腸菌発現宿主を、waaL及びrmlB-w
ecG遺伝子領域で欠失させ、一部の菌株では更にwecA-wzzECAでも欠失させた。ポリメラー
ゼ変異体CP8キメラクラスターを発現しているこれらの変異細胞からのSep-PAK精製された
抽出物(メタノール及び10:10:3抽出物)を、前述のように順相HPLCにより分析した。
図11Fは、配列番号:4のポリメラーゼ変異体を発現している大腸菌W3110ΔwaaL細胞から
のメタノール抽出物のHPLC分析(細破線)を、ECAクラスター遺伝子rmlB-wecGの追加の欠失
を伴う細胞(W3110ΔwaaLΔrmlB-wecG::cat)からのそれ(太線)と比較した結果を表してい
る。抽出物は、tC18カートリッジ上で精製し、順相HPLCにより分析した。図11Fに示した
ように、図10Bにおいて45分で出現した主要ピークは存在せず、アセチル化及び非アセチ
ル化CP8 RUに特異的ピークを生じ(図11F)、これはECAグリコシル転移酵素のひとつ−最も
可能性があるのはwecF−が、異常な伸長表現型に責任のあることを指摘している。同様の
結果が、このCP5キメラクラスターを異なる菌株で試験した場合に得られた。このことは
、大腸菌媒介性グリコシル転移酵素及びヌクレオチド活性化された糖生合成に必要な酵素
の欠失は、大腸菌において組換え的に生成された多糖の品質及び量を適正化するための可
能性のある戦略であることを暗示している。標的酵素は恐らく、O抗原クラスター、ECAク
ラスター、及びコラン酸又は莢膜クラスターにコードされているであろう。
UndPPに結合された組換え多糖の品質に関する更なる証拠は、前述のように染色体的に
最適化された発現宿主からSep-PAK精製され蛍光標識された糖脂質抽出物の最適化された
順相HPLC分析から得られた。帯電したCP5及びCP8オリゴ糖及び多糖-結合された脂質の精
製のためのSep-PAKカラムの最適性能に関して、tert-ブチルアンモニウムリン酸(TBAP)を
、抽出物へ添加し、その後Sep-PAKカートリッジに装加した。Trentらの論文に報告された
ように、この塩の陽イオンは、疎水性ブチル鎖により負電荷を遮蔽することにより、帯電
した化合物のカラム結合を改善する(Trent, M. S.、A. A. Ribeiroらの論文、(2001)、「
ポリミキシン耐性サルモネラ・ティフィムリウム及び大腸菌におけるポリイソプレン-連
結されたアミノ糖の蓄積：構造決定とペリプラズム内のリピドAへの転移(Accumulation o
f a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimuriu
m and Escherichia coli : structural characterization and transfer to lipid A in
the periplasm)」、J Biol Chem、276(46):43132-43144)。この最適化された方法は、ポ
リメラーゼを含むCP5又はCP8キメラクラスターを発現している細胞からのメタノール抽出
により得られたCP5及びCP8試料に適用された。
図11Gは、大腸菌細胞のUndPP上に存在する完全CP5グリカンレパトアを示すHPLC分析の
結果を提供している。キメラCP5クラスター配列番号:3(実線)又は空のプラスミド対照(破
線)のいずれかを発現している大腸菌W3110ΔwaaLΔwecA wzzECAΔrmlB-wecG::catからの
メタノール抽出物を、Sep-PAKカートリッジ上で固相抽出し、且つ弱酸で処理し、UndPPか
ら糖を加水分解した。得られた物質を、還元的アミノ化により、2ABと反応させ、グリカ
ンの還元末端を標識し、順相HPLCにより分析した。実線には存在するが破線には存在しな
いシグナルは、CP5特異的物質を表している。大文字は、収集された画分のMALDI-MS/MSに
より同定されたアセチル化及び/又は非アセチル化CP5 RUの重合体を含むピークを示して
いる。図11G中の凡例は、MS/MS分析から推定される提唱された分子構造を示している。MS
/MSで示されたアセチル化及び非アセチル化RU重合体は、太棒により示されたクロマトグ
ラムにおいて一緒にされた同じ重合度の群の構造を確認したことは注意されなければなら
ない。大文字は、以下の凡例を示している：A及びB：1つのRU；C、D及びE：2つのRU；F及
びG：3つのRU；並びに、H：4つのRU。図11Gにおける95分と125分の間の幅広ピークは、恐
らく、5つ以上の重合されたRUを表しているであろうが、このカラムによっては分離され
ない。
図11Hは、アセチル化CP5グリカン及びRU均一性を示す、更なるHPLC結果を表している。
このHPLC分析を調製するために、キメラCP5クラスター配列番号:3を発現している大腸菌W
3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlB-wecG::catの2AB標識したグリカン試料(図11Gを参照し前
述の手順に従い調製)を、水溶液中のNaOHで処理し、再標識した。図11Hに示すように、ア
ルカリ処理前の試料(破線)及び後の試料(実線)を、HPLCにより分析した。図11H中の数字
は、対応するピーク内のRUの推定数を示している。図11Hにおいて、図11Gに示されたアセ
チル化されたピークは、非アセチル化重合体からのシグナルと一体化されること、及び脱
アセチル化は95分以降の溶離時間にRU単位を分離したことは認められなければならない。
図11Iは、大腸菌細胞のUndPP上に存在するCP8グリカンレパトアを示すHPLC分析の結果
を提供している。キメラCP8クラスター配列番号:4(実線)又は空のプラスミド対照(破線)
のいずれかを発現している大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECA ΔrmlB-wecG::catからのメタ
ノール抽出物を、Sep-PAKカートリッジ上で固相抽出し、且つ弱酸で処理し、UndPPから糖
を加水分解した。得られた物質を、還元的アミノ化により、2ABと反応させ、グリカンの
還元末端を標識し、順相HPLCにより分析した。実線には存在するが破線には存在しないシ
グナルは、CP8特異的物質を表している。収集された画分のMALDI-MS/MSにより同定された
アセチル化及び/又は非アセチル化CP8 RUの推定構造を示している。図11Gに示されたCP5
のHPLC結果のように、図11Hのクロマトグラムにおいて一緒にされた同じ重合度の群のア
セチル化及び非アセチル化CP8 RU重合体は、太棒により示されていることに注意。110分
以降に検出された物質は、より長いCP8重合体を表している。
図11Jは、CP8グリカンの脱アセチル化及びRU均一性のHPLC結果を更に表わす。キメラCP
8クラスター配列番号:4を発現している大腸菌W3110ΔwaaLΔwecA wzzECAΔrmlB-wecG::ca
t由来の2AB標識したグリカン試料を、水溶液中のNaOHで処理し、再標識した。アルカリ処
理前の試料(破線)及び後の試料(実線)を、HPLCにより分析した。数字は、対応するピーク
内のRUの推定数を示している。アセチル化されたピークは大きく消滅すること、及び非ア
セチル化重合体のシグナルは増大すること、及び脱アセチル化は110分以降の溶離時間にR
U単位を分離したことは注意されなければならない。
図11H及び11Jは、オリゴ糖及び多糖からアセチル化修飾を除去するためにこれらのCP5
及びCP8試料に対しアルカリ処理が実施された場合に、O抗原の特徴的はしご状バンド形成
パターンを指摘するHPLC結果を示している。これらの結果は、溶離時間の増分が一定に減
少するにつれ、離散した鋭利なピークを示している。このことは、そのような分析された
炭水化物鎖は、同じRUで構成される鎖状重合体であることを暗示している。このデータは
、大腸菌により生成された組換えCP5及びCP8糖は、規則的に重合され且つ部分的にアセチ
ル化されることを示している。非アセチル化CP5及びCP8重合体は、それらの構造の類似性
から予想されるように、HPLCカラムから同じように溶離する；しかし、順相クロマトグラ
フィーは、差異も明らかにしている：例えば、CP5は、CP8よりも、より少ない程度重合し
、アセチル化はCP5においてより頻度が高く；4以上のRU長においては、CP5は7 RUの重合
体生成に明確な優先性を有するのに対し、CP8はより広範な程度で重合し；並びに、HPLC
及びMS/MSの結果により示されるように、CP5はCP8よりもグリカン生成に関してより効率
的である。
wzy依存性重合経路において、特異的酵素(鎖長決定因子に関するwzz又はcld)が、実行
されるRU重合段階の平均数の決定に責任があることが、Maroldaらにより報告されている(
Marolda, C. L.、L. D. Tatarらの論文、(2006)、「リポ多糖O抗原の移行及びペリプラズ
ム集成におけるWzxトランスロカーゼ及び対応するポリメラーゼ及び鎖長調節タンパク質
の相互作用(Interplay of the Wzx translocase and the corresponding polymerase and
chain length regulator proteins in the translocation and periplasmic assembly o
f lipopolysccharide o antigen)」、J Bacteriol、188(14):5124-5135)。Wzz酵素は、特
異的反復数の平均の、例えば短い、長い及び非常に長い糖重合体を生じ、且つそれらの長
さ特異性を外因性多糖経路に転移することがわかっている。CP8糖脂質の長さ及び量は、
より長く且つより少ない量のこの糖を生じる生成株において分析された。タンパク質グリ
コシル化に関して分子の量を増加し、それにより糖転移効率を増加するために、特異的Wz
z酵素を使用し、CP8糖の長さのダウンレギュレーションが実行された。
Wzzタンパク質の脂質上のCP8糖のサイズ及び量に対する作用を試験するために、大腸菌
wzz O7由来のWzzの同時発現を、個別のプラスミド(配列番号:19)から行った。図11Kは、
この試験の結果を表している。キメラCP8クラスター配列番号:4及びプラスミド媒介性wzz
O7のIPTG誘導性コピー(配列番号:21、実線)、又は空のプラスミド対照(破線)のいずれか
を発現している大腸菌W3110ΔwaaL ΔwecAwzzECAΔrmlB-wecG::catからのメタノール抽出
物を、Sep-PAKカートリッジ上で固相抽出し、且つ弱酸で処理し、UndPPから糖を加水分解
した。2AB標識したグリカンを、順相HPLCにより分析した。CP8試料のアルカリ処理は、95
分と115分の間の領域の85％以上が、CP8の7又は8のRU重合体を表すことを示し、これは多
種多様なアセチル化を示している。これらの結果は、キメラCP8クラスターは、a)7から8
までの最も豊富なグリカンの反復数の増加、及びb)クロマトグラム下面積から判断される
より高い全体の蛍光シグナル強度：を誘導したことも示している。
アルカリ処理は、図11I及び11Jのように短縮されたグリカンのアセチル化を確認し、こ
れは組換え多糖の長さは、外来性Wzz酵素により調節することができることを示している
。同じく、O抗原由来のWzz酵素により莢膜の糖重合体の長さを調節することも可能である
。更にキメラクラスターの前の異なるプロモーターは、プラスミド上に存在する場合、異
なる発現レベル及び異なる重合度を生じる。
(実施例5：CP5及びCP8グリカンによるタンパク質グリコシル化並びに生成物の特徴付け)
キメラクラスターの様々な変種を、バイオコンジュゲート生成について試験した。キメ
ラO11/CP5遺伝子クラスター(配列番号:2及び3)は、O11 O抗原クラスター内にwbjA及びwzy
の代わりに黄色ブドウ球菌特異性領域の異なる変種を含むが、これらを、宿主株大腸菌W3
110ΔwaaLΔwecAwzzE::catにおいて、PglB(配列番号:27?)及びEPA(配列番号:13)の存在下
で発現した。W3110ΔwaaLΔwecA wzzE::cat宿主細胞は、wbjA及びwzy遺伝子が異なるcap5
遺伝子セットと交換されている(及びcatカセット、配列番号:2及び配列番号:3)O11 O抗原
クラスターを持つpLAFR1プラスミドに加え、個別のプラスミドから、2つのグリコシル化
部位を伴うEPA(配列番号:13由来)及びPglB(配列番号:27)を発現した。
以下を含む、EPAタンパク質が発現される：a)ペリプラズムへ輸送するためのN-末端シ
グナルペプチド配列、b)その全体が引用により本明細書中に組み込まれているWO 2009/10
4074の実施例10に示された、タンパク質配列へ操作される2つの細菌N-グリコシル化コン
センサス配列(配列番号:13)、及びc)精製のためのヘキサヒスチジンタグ。細胞は、5Lの
エレンマイヤーフラスコ内でLB培地において増殖した。一晩培養物を、OD600nm＝0.05ま
で希釈した。OD600nmがおよそ0.5で、PglB発現を、1mM IPTGの添加により誘導し、且つEP
A発現を、アラビノース(最終濃度0.2％)の添加により誘導した。細胞を4時間増殖し、誘
導を繰り返し、且つ細胞を更におよそ16時間増殖した。細胞を遠心分離によりペレットと
し；これらの細胞を洗浄し、且つ0.2容量のショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸
透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、且つペ
リプラズムのタンパク質を、Ni2+アフィニティクロマトグラフィーに装加した。黄色ブド
ウ球菌フリッパーゼ遺伝子cap5Kを含まない又は含むEPA-CP5バイオコンジュゲート(配列
番号:2及び3)を、0.5Mイミダゾールにより溶離し、溶離されたピークをプールし、SDS PA
GEにより分析し、且つクマシー及び銀により染色した(図12)。
図12は、SDS PAGEの結果を表している。左側パネルはクマシー染色を示し、右側パネル
は銀染色を示す。中央の数値は、分子量マーカーのサイズを示す。レーンの下側の文字は
、バイオコンジュゲート生成に使用された菌株において発現されたキメラクラスターに存
在する遺伝子を示している。宿主菌株は、大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzE::catであった。
これらの結果は、恐らくグリコシル化されないEPAに対応する70kDa(電気泳動移動度)にタ
ンパク質シグナル、及びその上にはしご状バンド(100〜170kDa)を示した。このはしごは
、恐らくCP5組換え黄色ブドウ球菌グリカンによりグリコシル化されたEPAタンパク質に対
応している。加えて、これらの結果は、システム中にフリッパーゼ遺伝子を含むことは、
糖タンパク質収量を増やす(中央レーン及び右側レーン)ことを示している。
別の分析において、CP5-EPAバイオコンジュゲートは、キメラCP5遺伝子クラスター(配
列番号:3)、プラスミドpEXT21由来のPglB(配列番号:27)、及び別のプラスミド由来のEPA(
2つのグリコシル化部位を含む、配列番号:13)の同時発現により、大腸菌W3110ΔwaaLΔwe
cAwzzE::catにおいて生成された。バイオコンジュゲート生成のためにより制御されたプ
ロセスを得るために、これらの細胞を、2Lのバイオリアクター内で37℃で、OD600nm＝30
まで増殖し、PglB及びEPAの発現を、1mM IPTG及び0.2％アラビノースの添加により誘導し
た。これらの細胞を、酸素-制限条件下、37℃で18時間増殖した。これらの細胞を、遠心
分離によりペレットとし、洗浄し、25％ショ糖緩衝液中に再懸濁しOD600nm＝200とし、30
分間4℃でインキュベーションした後、この懸濁液をペレットとし、浸透圧ショックによ
り溶解した。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、上清に存在するペリプラ
ズムのタンパク質を、Ni2+アフィニティクロマトグラフィーに装加した。グリコシル化及
び非グリコシル化EPAを、0.5Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離し、Sourc
eQ陰イオン交換カラムに装加した。NaCl濃度を増加する勾配を適用することにより、グリ
コシル化EPAは、非グリコシル化EPAから分離された。
図13Aに示されるように、精製されたグリコシル化EPA(CP5-EPA)は、SDS PAGEにより分
離し、且つクマシーにより染色するか(左側レーン)、又はニトロセルロースメンブレンに
転写し、抗CP5抗体(中央レーン)又は抗EPA抗体(右側レーン)のいずれかと一緒にインキュ
ベーションした。精製されたバイオコンジュゲートは、EPA-特異的抗体(右側レーン)、更
にはCP5-特異的ポリクローナル抗血清(中央レーン)により認識された。矢印は、そこから
切り出され、トリプシン処理され、且つMALDI-MS/MSにより糖ペプチド分析を施した切片
の、ゲルでの位置を示している。図13Bは、O-アセチル化されたRU質量(m/z=2088([M+H]+)
)にN-グリコシド結合されたトリプシン処理されたペプチド
Figure 2017036303
 中のグリコシル化部位に関して認められたM/Z質量のMALDI-MS/MSを表している。m/z=2088
のMS/MS分析は、指摘したような糖部分の部分的断片化を示している。差込図は、図13Aか
らの精製されたCP5-EPAのトリプシン処理から誘導されたペプチドに結合されたRU構造を
図示している。ManNAcA(HexNAcA、217Da)及びアセチル化されたFucNAc(dHexNAc(OAc)、22
9Da)の逐次喪失は、予想されたグリカン構造を裏付けている。図13Cは、O-アセチル化さ
れたRU質量(m/z=1165([M+H]+))にN-グリコシド結合されたトリプシン処理されたペプチド
Figure 2017036303
 中のグリコシル化部位に関して認められたM/Z質量のMALDI-MS/MSを表している。m/z=1165
のMS/MS分析は、CP5 RU構造と一致する完全Y-イオンの一連の断片イオンを示している。
差込図は、図13Aからの精製されたCP5-EPAのトリプシン処理から誘導されたペプチドに結
合されたRU構造を図示している。ManNAcA(HexNAcA、217Da)、アセチル化FucNAc (dHexNAc
(OAc)、229Da)、及びFucNAc(dHexNAc、187Da)の逐次喪失は、ペプチド
Figure 2017036303
 (m/z=532Da([M+H+]))上の予想されたグリカン構造を裏付けている。
図13Dにおいて、大腸菌におけるCP8バイオコンジュゲートを、CP5バイオコンジュゲー
トの生成と同じ戦略を用いて生成した。CP8-EPAバイオコンジュゲートは、キメラCP8遺伝
子クラスター(配列番号:4)、PglB(pEXT21プラスミド内(配列番号:27))、及び2つのグリコ
シル化部位を含むEPA(配列番号:13)の同時発現により、大腸菌において生成される。細胞
は、バイオリアクター内で、グリセロール、ペプトン及びC源として酵母エキスを含有す
る半限定培地において、出発容積7Lにおいて増殖した。細胞を、バッチ又はパルスバッチ
モードで、37℃で、OD600nm＝30まで増殖し、PglB及びEPAの発現を、1mM IPTG及び10％ア
ラビノースの添加により誘導した。誘導後細胞を、流加バッチモードで、酸素-制限条件
下、更に15時間培養した。細胞を、遠心分離によりペレットとし；細胞を洗浄し、0.2容
量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプ
ラストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2+アフィニティ
クロマトグラフィーに装加した。グリコシル化及び非グリコシル化EPAを、0.5Mイミダゾ
ールによりアフィニティカラムから溶離し、SourceQ陰イオン交換カラムに装加した。NaC
l濃度を増加する勾配を適用することにより、グリコシル化EPAは、非グリコシル化EPAか
ら分離された。
図13Dに図示したように、精製されたタンパク質は、SDS PAGEにより分離し、クマシー
により染色するか(左側レーン)、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、抗CP8抗体(
右側レーン)又は抗EPA抗体(中央レーン)のいずれかと一緒にインキュベーションした。
グリコシル化システムの更なる改善のために異なる戦略を試験した。ひとつの戦略にお
いて、追加の抗生物質の負担を減らすために生成システムにおけるプラスミド数を減らし
、加えて余分なプラスミドを維持するために、pglBの発現カセットを、CP5キメラクラス
ター(配列番号:17)及びCP8キメラクラスター(配列番号:18)を含むプラスミドへクローニ
ングした。この発現カセットは、大腸菌O121ゲノムのga1FとwbqAの間に存在するインター
ジーン領域(プロモーター配列のため)、及びその下流のpglB配列で構成された。この発現
カセットを、CP5及びCP8キメラクラスターのすぐ下流でクローニングした。本発明者らは
、個別のプラスミド上又は同じプラスミド(配列番号:17)上のいずれかにキメラCP5クラス
ター(配列番号:3)及びpglB(配列番号:27)を含む大腸菌W3110ΔwaaLΔwecA wzzECA::catを
試験した。加えて、EPA(配列番号:13)を、アラビノース誘導性プロモーターの制御下でプ
ラスミドから発現した。これらの細胞を、5Lのエレンマイヤーフラスコ内でLB培地におい
て、37℃で増殖した。一晩培養物を、OD600nm＝0.05まで希釈した。OD600nmがおよそ0.5
で、PglB発現を、1mM IPTGの添加により誘導し、且つEPA発現を、アラビノース(最終濃度
0.2％)の添加により誘導した。細胞を4時間増殖し、誘導を繰り返し、且つ細胞を更にお
よそ16時間増殖した。この培養物を遠心分離によりペレットとし；これらの細胞を洗浄し
、且つ0.2容量のショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解し
た。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、且つペリプラズムのタンパク質を
、Ni2+アフィニティクロマトグラフィーに装加した。EPA-CP5を、0.5Mイミダゾールによ
り溶離し、溶離されたピークをプールし、SDS PAGE及びクマシーにより分析した。図13E
は、SDS PAGEの結果を示している。グライココンジュゲート生成のために3つ(左側)又は2
つのプラスミド(右側レーン)のいずれかを含む細胞を示している。これらの結果は、糖脂
質及びCP5-EPAのコンジュゲート生成は維持されたことを示している。
このシステムの更なる最適化は、タンパク質グリコシル化に使用したプラスミド中のwz
z(重合体長調節因子)タンパク質配列の組み込みであった。CP8-EPAを生成するシステムに
より例示されたよう、wzzは、プラスミド媒介性キメラCP8クラスター(配列番号:19)へ及
びキャリアタンパク質の発現プラスミド内のepa遺伝子(配列番号:20)の下流に組み込まれ
た。CP8-EPAバイオコンジュゲートは、2つのプラスミドを含む大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAw
zzECAΔrmlB-wecG::catにおいて生成され：1つのプラスミドは、キメラCP8遺伝子クラス
ターに加え、wzz O7遺伝子のコピー及びpglB遺伝子の構成的発現のためのDNAカセットを
含み(配列番号:19)；第二のプラスミドは、最初に2つのグリコシル化部位を含む解毒され
たEPAタンパク質の発現及び分泌のための遺伝子、及び第二に同じプロモーターの制御下
のwzzO7コピーを含む(配列番号:20)。前述のプラスミドを含む得られる菌株である大腸菌
W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlB-wecG::catは、バイオリアクター内で、グリセロール、
ペプトン及びC源として酵母エキスを含有する半限定培地において、出発容積7Lにおいて
増殖した。細胞を、バッチ又はパルスバッチモードで、OD600nm＝30まで増殖し、PglB及
びEPAの発現を誘導した。誘導後、細胞を更に、流加バッチモードで、酸素-制限条件下、
15時間培養し、遠心分離により収集した。細胞を、遠心分離によりペレットとし；細胞を
洗浄し、0.2容量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解し
た。スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni
2+アフィニティクロマトグラフィーに装加した。グリコシル化及び非グリコシル化EPAを
、0.5Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離した。グライココンジュゲートCP
8-EPAの形成は、クマシー並びに抗his及び抗CP8抗血清を使用するウェスタンブロットに
より、図13Fに示された。図13Fは、精製されたタンパク質のSDS PAGE分離の結果、並びに
クマシー染色(左側レーン)又はニトロセルロースメンブレンへの転写及び抗hisタグ抗体(
中央レーン)若しくは抗CP8抗体(右側レーン)のいずれかによるプロービングの分析を示し
ている。
CP5-EPAグライココンジュゲートの特徴を、様々な分析的方法により更に精緻にした。C
ovalX社(シュリーレン、スイス)は、W3110ΔwaaLΔwecAwzzECA::catにおいて、図13Aに図
示された分析において使用した3プラスミドシステムを使用し生成した精製されたCP5-EPA
試料の高質量MALDI分析を行った。図14Aは、高質量MALDI結果を示している。A+及びB+は
、それぞれ、非グリコシル化EPA及びグリコシル化EPAに対応する質量タンパク質種([M+H]
+)を指している。オリゴマー形態は、比較的高い分子量で存在することができ、且つ低MW
領域のシグナルは、夾雑物又は分解産物である。図14Aに示された結果は、前記タンパク
質調製品は、5.2反復単位の中間の糖の長さの指標である、EPAタンパク質のみよりも4kDa
大きい、大きいモノマー性タンパク質の集団を含むことを示している。これは、SDS-PAGE
、クマシーブリリアントブルー染色、及び主要なコンジュゲート型中の反復単位の計測に
より分析されたように、この調製品中の主要なグライココンジュゲート型の5〜7の糖長と
一致する(図7、8及び13A参照)。
CP5-EPAは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)により更に特徴付けした。本発
明者らは、図13Aに図示した分析において使用したW3110ΔwaaLΔwecAwzz ECA::catにおい
て3プラスミドシステムを使用した。この試料は、非グリコシル化EPAを除去するために、
陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。分析は、Supelco TSK G2000SWXLカラ
ムにおいて行った。図14Bは、精製されたCP5-EPA試料のSEC-HPLC分析の結果を示している
。280nmで測定したUVトレースを示している。太実線は、3.25μgの精製されたCP5-EPAの
分析に由来し、細線は、5μgの精製した非グリコシル化EPAから得た。11.5分で溶離した
大きい均質なピークが示されたのに対し、非グリコシル化EPAは、12.9分で溶離した(図14
B)。これら2種の分子の流体力学半径を計算し、非グリコシル化EPAの42kDa及びグリコシ
ル化EPAの166kDaのサイズを得た。これは、グリコシル化EPAは、グリカンの線状構造から
予想されたように、溶液中に伸長されたモノマータンパク質として出現することを指摘し
ている。
従って本発明者らの分析は、CP5-EPAバイオコンジュゲートは、EPAタンパク質及び正確
にO-アセチル化されたグリカン構造からなることを確認した。これらの結果を基に、CP8-
EPAバイオコンジュゲートは、EPAタンパク質及び正確にO-アセチル化されたグリカン構造
からなることが推定された。
(実施例6：黄色ブドウ球菌タンパク質グリコシル化及び生成物の特徴付け)
グライココンジュゲートワクチン候補を製造するための「インビボ」グリコシル化の多
用途性を証明するために、いくつかのキャリアタンパク質をCP5によりグリコシル化され
る基質として使用した。バイオコンジュゲートワクチンの黄色ブドウ球菌に対する免疫反
応を更に増強するために、キャリアタンパク質EPAを、C.ジェジュニ由来のAcrAと、黄色
ブドウ球菌由来の2つのタンパク質Hla及びClfAと交換した。キャリアタンパク質として使
用されるように、Hla及びClfAを、細菌N-グリコシル化部位の挿入により改変した。この
プロセスは、WO 2006/119987に開示されたように実行し、Hla H35Lに関して4型：配列番
号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:16を、及びClfAに関して3型：配列番号:10、
配列番号:11、配列番号:12を作製した。
Hla H35L部位130のグリコシル化に関して、以下の2つの発現プラスミドを含む、大腸菌
細胞(W3110ΔwaaLΔwecAwzzEΔrmlB-wecG)を使用した：1つは、ペリプラズム分泌のため
のN-末端シグナルペプチド、1つのN-グリコシル化部位及び精製のためのヘキサHis-タグ
を含むHla H35Lの発現がParaBADプロモーターの制御下にあるHla H35L生成のためのもの(
配列番号:16)、及び2つ目は、CP5キメラクラスター及びpglBの発現のためのもの(配列番
号:17)。このシステムは、交換されたタンパク質キャリア発現プラスミドを持つ、CP5-EP
Aの既に最適化された2プラスミド発現システムに対応している。細胞は、12Lのバイオリ
アクター内で富栄養培地において、OD600nm＝30となるまで増殖し、Hlaの発現は、0.2％
アラビノースの添加により誘導した。細胞を、遠心分離によりペレットとし；細胞を洗浄
し、0.2容量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。
スフェロプラストを遠心分離によりペレットとし、上清中のペリプラズムのタンパク質を
、Ni2+アフィニティクロマトグラフィーに装加した。グリコシル化Hla(CP5-Hla)及び非グ
リコシル化Hlaを、0.5Mイミダゾールによりアフィニティカラムから溶離し、陰イオン交
換クロマトグラフィーに装加した。CP5-HlaをHlaから分離するために、タンパク質を0Mか
ら0.7MのNaClの直線勾配により溶離した。得られたタンパク質を、SDS PAGEにより分離し
、クマシー染色するか、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、指示されたように抗
His抗血清、抗Hla抗血清、又は抗CP5抗血清のいずれかによりプロービングした(図14C)。
図14Cの結果は、クマシー(左側レーン)、並びに抗His抗血清(中央左側レーン)及び抗Hla
抗血清(中央右側)及び抗CP5抗血清(右側)を使用するウェスタンブロットにより、グライ
ココンジュゲート(CP5-Hla)の形成を示している。
操作されたグリコシル化部位130を持つHla H35Lの同一性は、ゲル内トリプシン処理及
びMALDI-MS/MSにより確認した。
キャリアタンパク質がCP5及びCP8によるグリコシル化のために交換可能であることを更
に示すために、C.ジェジュニAcrAタンパク質を、グリコシル化のアクセプターとして使用
した(図14D参照)。3プラスミドシステム(配列番号:3、配列番号:15、及び配列番号:27)を
使用する、このコンジュゲートの産生株は、個別のプラスミド上にCP5キメラクラスター(
配列番号:3)、IPTGにより誘導されたPglBタンパク質(配列番号:27)及びアラビノース誘導
下のAcrA(配列番号:15)を収容するW3110ΔwaaLであった。細胞は、バイオリアクター内で
、グリセロール、ペプトン及びC源として酵母エキスを含有する半限定培地において、出
発容積7Lにおいて増殖した。細胞を、バッチ又はパルスバッチモードで、OD600nm＝30ま
で増殖し、PglB及びAcrAの発現を、1mM IPTG及び10％アラビノースの添加により誘導した
。誘導後、細胞を更に、流加バッチモードで、酸素-制限条件下、15時間培養し、遠心分
離により収集した。細胞を、遠心分離によりペレットとし；細胞を洗浄し、0.2容量ショ
糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラスト
を遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2+アフィニティクロマ
トグラフィーに装加した。CP5-AcrA糖タンパク質を、0.5Mイミダゾールによりアフィニテ
ィカラムから溶離した。この精製されたタンパク質を、SDS PAGEにより分離し、且つ図14
Dに示されるように、クマシー染色するか、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、
抗AcrA抗血清又は抗CP5抗血清のいずれかによりプロービングした。
ClfA中の細菌N-グリコシル化部位の挿入は、WO 2006/119987に開示されたように実行し
、配列番号:10；配列番号:11；配列番号:12を作製した。これらのキャリアタンパク質は
、アラビノース誘導性プロモーターから大腸菌細胞において発現された。これらの遺伝子
は、ペリプラズム分泌のためのN-末端シグナルペプチド、いくつかのN-グリコシル化部位
及び精製のためのヘキサHis-タグを生成するようにデザインした。精製は、大腸菌細胞の
ペリプラズム抽出物から開始した。
ClfA 327のグリコシル化のために、CP5-EPAの既に最適化された発現システムを使用し
た。2プラスミドシステム(配列番号:17及び配列番号:11)を使用し、CP5キメラクラスター
及びpglB(構成的発現カセット)、更にはClfA 327の発現プラスミド(ParaBADプロモーター
の制御下)を含む大腸菌細胞(W3110ΔwecAwzzE ΔrmlB-wecGΔwaaL)を、1Lのエレンマイヤ
ーフラスコ内でLB培地において増殖した。一晩培養物を、OD600nm＝0.05まで希釈した。O
D600nmがおよそ0.5で、ClfA発現を、アラビノース(最終濃度0.2％)の添加により誘導した
。細胞を20時間増殖した。細胞を、遠心分離によりペレットとし；細胞を洗浄し、0.2容
量ショ糖緩衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプ
ラストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2+アフィニティ
クロマトグラフィーに装加した。ClfA-CP5を、0.5Mイミダゾールにより溶離し、SDS PAGE
により分離し、クマシー染色するか、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、抗His
抗血清又は抗CP5抗血清のいずれかによりプロービングした。図14Eは、タンパク質のアミ
ノ酸327位に挿入されたグリコシル化部位を持つClfA変種(配列番号:11)を用いて得られた
結果を示している。これらは、クマシー染色及び抗HisウェスタンブロットによりClfAの
形成を、並びに抗CP5抗血清を使用するウェスタンブロットによりグライココンジュゲー
ト(CP5-ClfA)の形成を示している。
(実施例7：CP5-EPAのグライココンジュゲートワクチンとしての活性)
内側にcap5Kを持つCP5キメラクラスター(配列番号:3)、PglBタンパク質(配列番号:27)
及びpEC415上の2グリコシル化部位のシグナルを持つEPA(配列番号:13)を含むW3110ΔwaaL
ΔwecAwzzECA::cat細胞を、1Lのエレンマイヤーフラスコ内でLB培地において増殖した。
一晩培養物を、OD600nm＝0.05まで希釈した。OD600nmがおよそ0.5で、EPA及びPglBの発現
を、各々、アラビノース(最終濃度0.2％)及び1mM IPTGの添加により誘導した。細胞を20
時間増殖した。細胞を、遠心分離によりペレットとし；細胞を洗浄し、0.2容量ショ糖緩
衝液中に懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラストを遠
心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2+アフィニティクロマトグ
ラフィーに装加した。グリコシル化及び非グリコシル化EPAを、0.5Mイミダゾールにより
アフィニティカラムから溶離し、SourceQ陰イオン交換カラムに装加した。NaCl濃度を増
加する勾配を適用することにより、グリコシル化EPAは、非グリコシル化EPAから分離され
た。溶離されたタンパク質量を、BCAアッセイにより、及びクマシーにより染色されたSDS
PAGEで得られたバンドのサイズを基にし決定し、この糖の理論的質量を計算した。この
タンパク質の決定と一緒に、多糖抗原の量を、調製物中で概算した。これは、高質量MALD
I MS法により確認した(図14A参照)。
生存動物におけるCP5-EPAの免疫原性を測定するために、精製したグライココンジュゲ
ート1μgを、アジュバントとしての水酸化アルミニウムの存在下で、マウスへIP(腹腔内)
経路で、1日目(初回注射)、21日目(第2回注射)、及び56日目(第3回注射)に注射した。第2
回及び第3回注射の2週間後である各々35日目及び61日目に、IgG反応を、コーティングの
ためにポリ-L-リシン改変されたCP5を使用するELISAにより測定した(Gray, B.M.の論文、
1979、「多糖抗原のELISA法：プラスチックチューブへの吸着のための多糖のタンパク質
カップリング(ELISA methodology for polysaccharide antigens: protein coupling of
polysacccharides for adsorption to plastic tubes)」、J. Immunol., 28:187-192)。C
P5-バイオコンジュゲートを免疫付与したマウスからの血液を、CP5莢膜多糖に対する特異
的IgG抗体について分析した。図15Aは、マウスにおいてCP5-EPAにより生じたIgG力価を示
している。ELISAプレートは、ポリ-L-リシン改変したCP5によりコーティングし、CP5-EPA
により2回免疫付与したマウス(各希釈の2本目のバー(白))又は3回免疫付与したマウス(各
希釈の1本目のバー(右上がり斜線))におけるIgG反応を、3つ組みで測定した。対照として
の免疫前血清で得られたシグナルは、各希釈で3本目のバー(右下がり斜線)により示した
。マウスのIgG反応は、アルカリホスファターゼ-コンジュゲートされたプロテインGによ
り測定した。図15Aに示したように、CP5-EPAバイオコンジュゲートは、血清抗体力価6.4
×103を誘発した。図15Aに示された結果は、CP5-EPAは、マウスにおいてCP5特異的抗体を
生じることを示している。本実験は、大腸菌において生成されたバイオコンジュゲートは
、マウスにおいて免疫原性であることを示している。
同様の実験を、宿主生物としてのウサギにおいて行った。CP5-EPA(15μgのCP5)を、ウ
サギへ、1日目にフロイント完全アジュバントの存在下で皮内注射し、20、30及び40日目
にフロイント不完全アジュバントの存在下で皮下注射した。61日後に、IgG反応を、コー
ティングのためのポリ-L-リシン改変されたCP5を使用するELISAにより測定した(Gray, B.
M.の論文、1979、「多糖抗原のELISA法：プラスチックチューブへの吸着のための多糖の
タンパク質結合(ELISA methodology for polysaccharide antigens: protein coupling o
f polysacccharides for adsorption to plastic tubes)」、J. Immunol., 28:187-192)
。図15Bは、ウサギにおいてCP5-EPAにより生じたIgG力価を示している。図15Bに示された
結果は、CP5-EPAは、ウサギにおいてCP5特異的抗体を生じることを示している。CP5-EPA
バイオコンジュゲートの免疫反応は、各希釈において2本目のバー(右上がり斜線)である
。対照血清は、死滅黄色ブドウ球菌に対し生じたCP5-特異的吸着された血清(WC抽出物、
各希釈の1本目のバー(点付き))及び免疫前血清(各希釈の3本目のバー(白色))を含む。様
々な抗原で免疫付与したウサギ由来の血清を精製したCP5に対する特異的抗体について分
析した。プレートは、ポリ-L-リシン改変したCP5によりコーティングした。対照としての
免疫前血清で得られたシグナルは、各希釈で3本目のバー(右下がり斜線)により示した。
ウサギのIgG反応は、アルカリホスファターゼ-コンジュゲートされたプロテインGにより3
つ組みで測定した。CP5-EPAバイオコンジュゲートは、力価1×106を誘発し、これは対照
血清(完全に死滅させた黄色ブドウ球菌による免疫付与、その後のWood 46による吸着、及
びトリプシン処理した同質遺伝子系統無莢膜変異体により調製し、その結果この抗血清は
CP5-特異性となった)よりも4倍高かった。この実験は、このバイオコンジュゲートは、高
い力価のCP5-特異的IgG反応を誘発することができたことを示している。
(実施例8：CP5抗体の機能活性)
(インビトロ活性)
実施例7に説明されたように生じたウサギポリクローナル抗血清を、IgG特異的抗体を濃
厚化するために、プロテインAアフィニティカラムにより精製した。黄色ブドウ球菌バイ
オコンジュゲートCP5-EPAにより免疫付与したウサギ由来のIgGを、古典的インビトロオプ
ソニン食作用性死滅アッセイにおいて機能活性について試験した(Thakker, M.、J.-S. Pa
rk、V. Carey、及びJ. C. Leeの論文、1998、「食作用阻止性であり且つマウス菌血症モ
デルにおいて細菌病原性を増強する黄色ブドウ球菌5型血清型莢膜多糖(Staphylococcus a
ureus serotype 5 capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacteria
l virulence in a murine bacteremia model)」、Infect Immun, 66:5183-5189)。黄色ブ
ドウ球菌を、Columbia寒天＋2％NaCl上で24時間培養した。細菌を、最小必須培地＋1％BS
A(MEM-BSA)中に懸濁した。PMN(多形核好中球)を、新鮮なヒト血液から分離し、洗浄し、
計数し、MEM-BSA中に懸濁した。黄色ブドウ球菌CP5-EPA又は対照としてのWO 2009/104074
に開示されたように精製した赤痢菌O1-EPAで免疫付与したウサギ由来の精製IgG調製品の
いずれかにより免疫付与したウサギ由来の精製IgG調製品を、MEM-BSA中に10-倍連続希釈
することで調製したアッセイ液に添加した。モルモット血清(Pel-Freez)を、C'給源とし
て使用した。各アッセイ(総容積0.5ml)は、〜5×106個PMN、1×106個CFU黄色ブドウ球菌
、0.5％〜1％モルモット血清、及び140μg/mlから1μg/mlまで変動する濃度のIgGを含ん
だ。対照試料は、1)C'及びPMNを含み、抗体を含まずインキュベーションした黄色ブドウ
球菌；2)IgG及びC'を含むが、PMNを含まずにインキュベーションした黄色ブドウ球菌；並
びに、3)黄色ブドウ球菌単独：を含んだ。試料は、37℃で2時間、転倒回転した(12rpm)。
試料希釈物を、滅菌水中で激しく攪拌し、細菌死滅を、希釈した試料のTSA上に2つ組みで
播種することにより推定した。死滅率は、2時間後の0時点と比べた、CFU/mlの減少と定義
された。
第一の実験セットにおいて、メチシリン-感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)株Reynolds株、
プロトタイプCP5単離株のオプソニン食作用性死滅を試験し、結果を図16Aに示した。ウサ
ギにおいて生じたCP5-EPAに対する抗体のオプソニン活性を、黄色ブドウ球菌5型血清型Re
ynolds株に対して試験した。CP5-EPA抗体は、濃度1.4μg/mlまでオプソニンを低下したの
に対し、O1-EPA抗体は、140μg/mlでオプソニン活性をほとんど示さなかった。黄色ブド
ウ球菌全細胞抽出物(J. C. Leeから入手(Department of Medicine, Brigham and Women's
Hospital, Harvard Medical School、ボストン、MA、米国))に対して生じた陽性対照血
清は、抗CP5-EPA血清(WC抗血清1％)と同様の活性を示した。
図16Aに示されたように、CP5-EPAに対する抗体及び補体活性を持つ1％モルモット血清
と一緒にインキュベーションした場合に、黄色ブドウ球菌Reynoldsの65〜75％は、PMNに
より死滅した。抗血清は、アッセイ中最終的に1％で使用し、黄色ブドウ球菌接種材料の8
9％は、これらの条件下で死滅した。黄色ブドウ球菌をC'単独(1％モルモット血清)又は抗
体とC'でPMNを含まずにオプソニン化した場合に、死滅はほとんど認められなかった。示
されたデータは、2〜5回の実験の平均を示している。グラフに記した全ての試料は、モル
モット血清C'を含有し、C'が存在しない場合には死滅は認められなかった。抗体単独も、
補体単独も、オプソニン性ではなく、この性質は、莢膜に囲まれた細菌性病原体の特徴で
ある。対照的に、対照ワクチン(EPAに結合した赤痢菌O1抗原)により誘発された抗体は、C
'が存在する場合であっても、オプソニン活性を示さなかった。このアッセイにおける陽
性対照として、本発明者らは、CP5-特異的ウサギ抗血清(J. C. Leeから入手(Department
of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School、ボストン、MA
、米国))も試験した。これらのデータは、CP5-EPAバイオコンジュゲートに対して生じた
抗体は、文献によるとオプソニン活性を持つCP5抗体(Thakker, M.、J.-S. Park、V. Care
y、及びJ. C. Leeの論文、1998、「食作用阻止性であり且つマウス菌血症モデルにおいて
細菌病原性を増強する黄色ブドウ球菌5型血清型莢膜多糖(Staphylococcus aureus seroty
pe 5 capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacterial virulence
in a murine bacteremia model)」、Infect Immun、66:5183-5189)に匹敵する、莢膜に囲
まれた黄色ブドウ球菌に対するオプソニン活性を示したことを示している。
CP5-EPAに対する抗体のオプソニン活性を、CP5-EPAのMRSA株USA100に対して試験した。
図16Bは、CP5+分離株であり、NRS382と称される、黄色ブドウ球菌USA100株に対して試験
したIgG及びC'のオプソニン活性の結果を表している。示したデータは、2〜5回の実験の
平均である。グラフに記した全ての試料は、モルモット血清C'を含有し、C'が存在しない
場合には死滅は認められなかった。図16Bに示されたように、USA100接種材料の〜60％は
、0.5％モルモット補体及び100〜1μg/mlの範囲の濃度のCP5-EPA IgGと一緒にインキュベ
ーションしたPMNにより死滅した。最小死滅は、PMNが存在しない場合又はIgGがアッセイ
から省かれた場合に認められた。O1-EPAコンジュゲートワクチンに対して生じたIgGがPMN
＋C'に添加された場合には、死滅は達成されなかった(この試料中で細菌は増殖した)。黄
色ブドウ球菌がC'単独又はPMNを含まない抗体とC'によりオプソニン化された場合には、
ほとんど死滅は認められなかった。従って、CP5-EPA抗体は、濃度範囲100〜1μg/mlでオ
プソニン性であるのに対し、O1-EPA抗体は、100μg/mlでほとんどオプソニン活性を示さ
なかった。この実験は、CP5-EPA抗体は、MSSA株及びMRSA株の両方に対しオプソニン活性
を発揮することを示す。
(インビボ活性)
バイオコンジュゲートCP5-EPAワクチンに対して生じたIgGのオプソニン活性が、ブドウ
球菌感染症のマウスモデルにおいて防御すると予想できるかどうかを決定するために、受
動免疫実験を行った。最初の研究において、Swiss-Webster雄のマウス(〜6週齢)に、CP5-
EPA又は赤痢菌O1-EPAで免疫付与したウサギ由来のIgGの1.4〜2mgをIV注射した(尾静脈)。
24時間後、マウスを、黄色ブドウ球菌Reynolds株〜3.6×107 CFUにより腹腔内(IP)経路で
チャレンジした。菌血症レベルは、チャレンジ後2時間で測定し、菌血症の抗体が媒介し
たクリアランスを評価した。培養物の検出下限は、5 CFU/ml血液であった。図17Aは、結
果の菌血症レベルを示している。各点は、細菌接種の2時間後に、個々のマウスにおいて
尾静脈穿刺により実行された定量的血液培養物を表す。水平線は、CFU/ml中央値を表す。
白丸は、抗CP5-EPA抗体を得たマウス由来の血液試料であり、黒丸は、異なるグリカン(志
賀赤痢菌(S. dysenteriae)O1)にコンジュゲートされたEPAに対して生じた対照抗体調製品
を得た動物からの試料である。図17Aの結果は、CP5抗体を与えたマウスは、O1-特異的抗
体が与えられたマウスと比べ、菌血症レベルの有意な(マン・ホイットニー検定P＝0.0006
)減少を示したことを表している。実際、CFU/ml血液の低下は、O1-EPA IgG投与マウスに
対し、CP5-EPA により受動免疫されたマウスにおいて98％であった。
引き続きの受動免疫実験において、マウスを、黄色ブドウ球菌Reynolds株のより少ない
接種材料(〜5.5×106 CFU/マウス)でIPチャレンジした。CP5-EPA抗体による受動免疫を、
5〜6×106 CFU黄色ブドウ球菌Reynolds株でIPチャレンジしたマウスにおいて試験した。
マウスには、細菌チャレンジの24時間前に、2mg CP5-EPA IgG又はO1-EPA IgGを静脈内注
射した(IV)。図17Bは、結果の菌血症レベルを示している。各点は、細菌接種の2時間後に
、個々のマウスにおいて尾静脈穿刺により実行された定量的血液培養物を表す。水平線は
、CFU/ml中央値を表す。白丸は、抗CP5-EPA抗体を得たマウス由来の血液試料であり、黒
丸は、異なるグリカン(志賀赤痢菌O1)にコンジュゲートされたEPAに対して生じた対照抗
体調製品を得た動物からの試料である。図17Bに示したように、2mg CP5-EPA IgGを受け取
ったマウスは、2mgのO1-EPA IgGを受け取った動物と比べ、有意に(マン・ホイットニー検
定P＜0.0001)低い菌血症レベルを有した。実際、CP5-EPA抗体で受動免疫したマウス7匹の
うち6匹は、無菌の血液培養物を有した(検出下限6〜30 CFU/ml血液、各マウスから採取さ
れ且つ播種された血液の容積によって左右される)。CP5抗体が原因である菌血症レベルの
低下は、O1-EPA IgG投与対照マウスと比べ、98％であった。
菌血症に対する防御が、低レベルのIgGで付与されるかどうかを決定するために、引き
続きの実験を行い、ここではマウスを、300μgのCP5-EPA又はO1-EPA IgGにより、IV経路
で受動免疫した。24時間後、マウスに、6×106 CFU黄色ブドウ球菌Reynolds株をIP接種し
た。培養による検出下限は、13〜67 CFU/ml血液であった。図17Bは、結果の菌血症レベル
を示している。各点は、細菌接種の2時間後に、個々のマウスにおいて尾静脈穿刺により
実行された定量的血液培養物を表す。水平線は、CFU/ml中央値を表す。白丸は、抗CP5-EP
A抗体を得たマウス由来の血液試料であり、黒丸は、異なるグリカン(志賀赤痢菌O1)にコ
ンジュゲートされたEPAに対して生じた対照抗体調製品を得た動物からの試料である。図1
7Bに示したように、図17Cの結果は、菌血症に対するCP5抗体が媒介した防御は、この低い
抗体投与量で達成されたことを示している。菌血症レベルの98％の低下が、CP5バイオコ
ンジュゲートワクチンにより誘発された抗体により達成され、9匹のマウス中8匹は、無菌
の血液培養物を有し、これは赤痢菌O1-EPA抗体投与マウスでは8匹中0匹であった。
(実施例9：マウスにおける能動免疫)
バイオコンジュゲートCP5-EPAによるマウスのワクチン接種は、受動免疫アッセイのよ
うに細菌チャレンジに対する防御を媒介することを示すために、能動免疫試験を行った。
CP5-EPAバイオコンジュゲートは、キメラCP5遺伝子クラスター(配列番号:3)、プラスミ
ドpEXT21由来のPglB(配列番号:27)及び別のプラスミド由来のEPA(2つのグリコシル化部位
を含む、配列番号:13)の同時発現により、大腸菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzE::catにおいて生
成した。細胞は、バイオリアクター内で、グリセロール、ペプトン及びC源として酵母エ
キスを含有する半限定培地において、出発容積7Lで増殖した。細胞を、バッチ又はパルス
バッチモードで、OD600nm＝30まで増殖し、PglB及びEPAの発現を、1mM IPTG及び10％アラ
ビノースの添加により誘導した。誘導後、細胞を更に、流加バッチモードで、酸素-制限
条件下、15時間培養し、遠心分離により収集した。細胞を洗浄し、25％ショ糖緩衝液中に
OD600nm＝200に再懸濁し、ペレットとし、浸透圧ショックにより溶解した。スフェロプラ
ストを遠心分離によりペレットとし、ペリプラズムのタンパク質を、Ni2+アフィニティク
ロマトグラフィーに装加した。グリコシル化及び非グリコシル化EPAを、0.5Mイミダゾー
ルによりアフィニティカラムから溶離し、SourceQ陰イオン交換カラムに装加した。NaCl
濃度を増加する勾配を適用することにより、グリコシル化EPAは、非グリコシル化EPAから
分離された。
CP5-EPAは、CP5黄色ブドウ球菌株に対する防御のためのコンジュゲートワクチンとして
使用されることが意図されている。そのような能動免疫が機能するかどうかを試験するた
めに、本発明者らは、CP5-EPAの3つの異なる投与量により、雌のSwiss Websterマウスの
異なる群を免疫付与し、この免疫付与を菌血症モデルを用い分析した。3つの投与量は、0
、14及び28日目に皮下注射した。図18に示したように、マウスは、42日目に黄色ブドウ球
菌株JL278により腹腔内チャレンジした。5群のマウスを、X軸の下側に記したように、3つ
の異なる投与量のCP5-EPAにより免疫付与した(点付き丸；白丸；及び丸に右下がり線)。2
つの対照群は、アジュバント(丸に右上がり線)又はPBS(黒丸)単独のいずれかを受け取っ
た。各点は、1匹のマウスからの血液試料を表している。最も低いワクチン投与量(0.2μg
)は、その群の全てのマウスにおいて防御を誘発した。チャレンジの2時間後、血液試料を
、cfu形成について、及びコーティングのためにポリ-L-リシン改変されたCP5を使用するE
LISAにより抗CP5抗体について分析した(Grayらの論文、(1979))。CP5-EPAで免疫付与した
全ての群において、血液中のcfuの平均減少が認められた。しかし、ワクチンの最低投与
量を受け取った群においてのみ、5匹のマウス全てにおいて菌血症の全体的防御が存在し
た。抗CP5抗体に関する血液の分析は、異なるマウス群において、防御と平均ELISA力価の
正の相関を生じた。図18に示した結果は、この抗体は、免疫付与したマウスにおいて菌血
症の防御を誘発したことを指摘している。
これらの研究は、CP5-EPAバイオコンジュゲートワクチンは、黄色ブドウ球菌をヒトPMN
による食作用死滅に関してオプソニン化し、且つポジティブな能動免疫試験において菌血
症に対しマウスを防御する抗体を誘発したことを指摘している。これらのデータは、示さ
れたバイオコンジュゲートは、複数の黄色ブドウ球菌株により引き起こされた疾患に対し
防御するであろうことの強力な証拠を提示している。
本発明は、それらの実施態様を参照し特に示され且つ説明されているが、請求項により
包含される本発明の精神から逸脱しないそれらの形態及び詳細における様々な変更を行う
ことができることは当業者には明らかであろう。
本発明は加えて、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24)を含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；及び、該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌などの細菌に由来する少なくとも1種のオリゴ糖又は多糖：を含む、組換えN-グリコシル化タンパク質を指向している。
本発明は更に、哺乳動物においてグラム陽性菌及び他の細菌により引き起こされた感染症に対し免疫反応を誘導する方法を指向している。一実施態様において、本方法は、該哺乳動物へ、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24)を含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；並びに、該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の1種以上のオリゴ糖又は多糖であって、この1種以上のオリゴ糖又は多糖が、該1種以上のオリゴ糖又は多糖のうちの他のものと同じか又は異なる、前記1種以上のオリゴ糖又は多糖：を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む。
図13Bは、本発明の実施態様に従うO-アセチル化されたRU質量にN-グリコシド結合されたトリプシン処理されたペプチド
Figure 2017036303
 中のグリコシル化部位に関して認められたM/Z質量(m/z=2088([M+H]+))を図示している。差込図は、このペプチドに結合されたRU構造を図示している。
図13Cは、本発明の実施態様に従うO-アセチル化されたRU質量にN-グリコシル化により結合されたトリプシン処理されたペプチド
Figure 2017036303
 中のグリコシル化部位に関して認められたM/Z質量(m/z=1165 ([M+H]+))を図示している。差込図は、このペプチドに結合されたRU構造を図示している。
配列番号:24は、X及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい、タンパク質コンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24)を示している。
コンセンサス配列とは、その配列内に、N-結合型糖タンパク質への炭水化物結合部位が認められる、アミノ酸の配列-D/E-X-N-Z-S/T-(配列番号：24)をいい、ここでX及びZはプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい。
本発明の実施態様は、C.ジェジュニは原核生物では一般的でない特徴である全般的N-結合型タンパク質グリコシル化システムを持っているという発見を、少なくとも一部基にしている。C.ジェジュニの様々なタンパク質は、七糖により改変されることが示されている。この七糖は、特異的グリコシル転移酵素により触媒されるヌクレオチド活性化された単糖の段階的付加により、内膜の細胞質側において、キャリア脂質であるUndPP上に集成される。次に脂質-結合されたオリゴ糖は、例えばPglKなどのフリッパーゼにより細胞膜周辺腔へとフリッピングされる(すなわち横断的に拡散する)。N-結合型タンパク質グリコシル化の最終段階において、OTase(例えば、PglB)は、オリゴ糖の、キャリア脂質からコンセンサス配列Asp/Glu-Xaa-Asn-Zaa-Ser/Thr(配列番号：24) (すなわちD/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24))内のAsn残基への転移を触媒し、ここでXaa及びZaaは、Pro以外の任意のアミノ酸であることができる。本発明者らは、七糖のためのグリコシル化クラスターを大腸菌へと巧く転移させることができ、且つカンピロバクターのN-結合型糖タンパク質を生成することができた。
従って本発明の一実施態様において、第一のグラム陰性種の細菌を改変する方法は、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌を標的として同定する工程；少なくとも3つのモノマーを含む該グラム陽性菌により生成された多糖の第一の反復単位を同定する工程；該第一の反復単位と同じモノマーを少なくとも2つ含む第二の反復単位を含む第二のグラム陰性種の細菌により生成された多糖を同定する工程；a)該第二の反復単位；及び、b)該第二の反復単位には存在しない該第一の反復単位のモノマー：を含む、三糖を集成するグリコシル転移酵素をコードしている1種以上のヌクレオチド配列を、該第一のグラム陰性種の細菌に挿入する工程；少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24)を含むタンパク質であり、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいものなどのタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程；並びに、OTaseをコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程：を含む。
本発明は加えて、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24)であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；及び、該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の少なくとも1つのオリゴ糖又は多糖：を含む、組換えN-グリコシル化タンパク質を指向している。別の実施態様において、この組換えN-グリコシル化タンパク質は、該挿入されたコンセンサス配列を2種以上含む。更に追加の実施態様において、組換えN-グリコシル化タンパク質は、該黄色ブドウ球菌のオリゴ糖又は多糖を2つ以上含む。また更なる実施態様において、組換えN-グリコシル化タンパク質は、2種以上の該挿入されたコンセンサス配列、並びに例えば黄色ブドウ球菌莢膜多糖5型株及び莢膜多糖8型株など異なる黄色ブドウ球菌株由来のオリゴ糖又は多糖を含む。
本発明の実施態様は、天然にグリコシル化されたタンパク質を含む。そのような天然にグリコシル化されたタンパク質(例えばC.ジェジュニタンパク質)は、天然のコンセンサス配列を含むが、任意の追加の(すなわち導入された)最適化されたコンセンサス配列は含まない。天然のグリコシル化されたタンパク質は、原核生物及び真核生物のタンパク質を含む。本発明の実施態様は、更に以下のN-グリコシル化された部分アミノ酸配列を1種以上含む組換えN-グリコシル化タンパク質を含む：D/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24)(最適化されたコンセンサス配列)、ここでX及びZはPro以外の任意の天然のアミノ酸であってよく、且つここで該N-グリコシル化された部分アミノ酸配列の少なくとも1種が導入されている。特異的部分アミノ酸配列(最適化されたコンセンサス配列)のタンパク質への導入は、導入部位での、例えばカンピロバクター種由来のOTaseなど、例としてC.ジェジュニ由来のOTaseなどのOTaseにより効率的にN-グリコシル化されるタンパク質につながる。
EPAのアミノ酸配列は、本発明の実施態様において2つのグリコシル化部位を含む様に改変された場合、配列番号:13(シグナル配列あり)及び配列番号:14(シグナル配列なし)として提供される。配列番号:13のグリコシル化部位は、
Figure 2017036303
 での
Figure 2017036303
 である。配列番号:14のグリコシル化部位は、
Figure 2017036303
 での
Figure 2017036303
 である。
EPAなどのキャリアタンパク質は、N-グリコシル化部位が細菌性バイオコンジュゲートの製造において追加され得るタンパク質である。N-グリコシル化部位は、先に考察したコンセンサス配列の導入、すなわちD/E-X-N-Z-S/T配列(配列番号：24)の挿入を必要とし、ここでX及びZはプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい。本発明者らは、そのようなコンセンサス配列は、突然変異、及び追加的に挿入されたフランキング残基の使用による、及びN-グリコシル化部位の機能を最適化するためのフランキング残基の突然変異によるよりは、挿入により表面ループへ導入されることが好ましいことを発見した。
本発明の実施態様は加えて、例えばヒトなどの哺乳動物においてグラム陽性菌及び他の細菌により引き起こされた感染症に対し免疫反応を誘導する方法を指向している。一実施態様において、本方法は、該哺乳動物へ、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24)を含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；並びに、該コンセンサス配列に結合されたグラム陽性菌由来の1種以上のオリゴ糖又は多糖であって、この1種以上のオリゴ糖又は多糖が、該1種以上のオリゴ糖又は多糖のうちの他のものと同じか又は異なる、前記1種以上のオリゴ糖又は多糖：を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む。更なる本発明の実施態様は、哺乳動物へ、挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24)であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；CP5多糖などの少なくとも1種の黄色ブドウ球菌オリゴ糖又は多糖；並びに、医薬として許容し得るアジュバント：を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、該哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導する方法を含む。別の本発明の実施態様は、哺乳動物へ、挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/T(配列番号：24)を含むタンパク質であって、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよいもの；少なくとも1種の黄色ブドウ球菌CP8多糖；並びに、医薬として許容し得るアジュバント：を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、該哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導することを指向している。より更なる実施態様は、2種以上のコンセンサス配列を伴うタンパク質、並びに異なるグラム陽性菌株由来のオリゴ糖又は多糖を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導することを指向している。なお更なる実施態様は、2種以上のコンセンサス配列を伴うタンパク質、並びに黄色ブドウ球菌CP5及び黄色ブドウ球菌CP8を含む多糖を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物において黄色ブドウ球菌により引き起こされた感染症に対する免疫反応を誘導することを指向している。
図13Aに示されるように、精製されたグリコシル化EPA(CP5-EPA)は、SDS PAGEにより分離し、且つクマシーにより染色するか(左側レーン)、又はニトロセルロースメンブレンに転写し、抗CP5抗体(中央レーン)又は抗EPA抗体(右側レーン)のいずれかと一緒にインキュベーションした。精製されたバイオコンジュゲートは、EPA-特異的抗体(右側レーン)、更にはCP5-特異的ポリクローナル抗血清(中央レーン)により認識された。矢印は、そこから切り出され、トリプシン処理され、且つMALDI-MS/MSにより糖ペプチド分析を施した切片の、ゲルでの位置を示している。図13Bは、O-アセチル化されたRU質量(m/z=2088([M+H]+))にN-グリコシド結合されたトリプシン処理されたペプチド
Figure 2017036303
 中のグリコシル化部位に関して認められたM/Z質量のMALDI-MS/MSを表している。m/z=2088のMS/MS分析は、指摘したような糖部分の部分的断片化を示している。差込図は、図13Aからの精製されたCP5-EPAのトリプシン処理から誘導されたペプチドに結合されたRU構造を図示している。ManNAcA(HexNAcA、217Da)及びアセチル化されたFucNAc(dHexNAc(OAc)、229Da)の逐次喪失は、予想されたグリカン構造を裏付けている。図13Cは、O-アセチル化されたRU質量(m/z=1165([M+H]+))にN-グリコシド結合されたトリプシン処理されたペプチド
Figure 2017036303
 中のグリコシル化部位に関して認められたM/Z質量のMALDI-MS/MSを表している。m/z=1165のMS/MS分析は、CP5 RU構造と一致する完全Y-イオンの一連の断片イオンを示している。差込図は、図13Aからの精製されたCP5-EPAのトリプシン処理から誘導されたペプチドに結合されたRU構造を図示している。ManNAcA(HexNAcA、217Da)、アセチル化FucNAc (dHexNAc(OAc)、229Da)、及びFucNAc(dHexNAc、187Da)の逐次喪失は、ペプチド
Figure 2017036303
 (m/z=532Da([M+H+]))上の予想されたグリカン構造を裏付けている。

Claims (38)

  1. 黄色ブドウ球菌ワクチンであって：
    挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tを含むタンパク質であって、ここでX及びZ
    がプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい前記タンパク質；
    該コンセンサス配列に結合された少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖；及び
    任意に医薬として許容し得る担体又はアジュバント：を含有する、前記黄色ブドウ球菌
    ワクチン。
  2. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖5型を含む、請求項1記載の黄色
    ブドウ球菌ワクチン。
  3. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖8型を含む、請求項1記載の黄色
    ブドウ球菌ワクチン。
  4. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、メチシリン-耐性耐性黄色ブドウ球菌株を
    標的化する、請求項1〜3のいずれか一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。
  5. 前記タンパク質が、緑膿菌外毒素である、請求項1〜4のいずれか一項記載の黄色ブドウ
    球菌ワクチン。
  6. 前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌α溶血素である、請求項1〜4のいずれか一項記載の
    黄色ブドウ球菌ワクチン。
  7. 前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌クランピング因子Aである、請求項1〜4のいずれか
    一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。
  8. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、下記構造を含む、請求項5〜7のいずれか
    一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン:
    Figure 2017036303
     。
  9. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、下記構造を含む、請求項5〜7のいずれか
    一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン：
    Figure 2017036303
     。
  10. 前記挿入されたコンセンサス配列を2種以上及び前記黄色ブドウ球菌多糖を2種以上含む
    、請求項1〜7のいずれか一項記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。
  11. 前記黄色ブドウ球菌多糖が、異なる黄色ブドウ球菌株を標的化する多糖を含む、請求項
    10記載の黄色ブドウ球菌ワクチン。
  12. 前記黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖5型及び莢膜多糖8型を含む、請求項11記載の黄色
    ブドウ球菌ワクチン。
  13. 組換えN-グリコシル化タンパク質であって：
    少なくとも1つの挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tを含むタンパク質であって
    、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい前記タンパク質；及
    び
    該コンセンサス配列に結合された少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖：を含む、前記
    組換えN-グリコシル化タンパク質。
  14. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖5型を含む、請求項13記載の組換
    えN-グリコシル化タンパク質。
  15. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖8型を含む、請求項13記載の組換
    えN-グリコシル化タンパク質。
  16. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、メチシリン-耐性耐性黄色ブドウ球菌株を
    標的化する、請求項13〜15のいずれか一項記載の組換えN-グリコシル化タンパク質。
  17. 前記タンパク質が、緑膿菌外毒素である、請求項13〜16のいずれか一項記載の組換えN-
    グリコシル化タンパク質。
  18. 前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌α溶血素である、請求項13〜16のいずれか一項記載
    の組換えN-グリコシル化タンパク質。
  19. 前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌クランピング因子Aである、請求項13〜16のいずれ
    か一項記載の組換えN-グリコシル化タンパク質。
  20. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、下記構造を含む、請求項17〜19のいずれ
    か一項記載の組換えN-グリコシル化タンパク質：
    Figure 2017036303
     。
  21. 前記少なくとも1種の黄色ブドウ球菌多糖が、下記構造を含む、請求項17〜19のいずれ
    か一項記載の組換えN-グリコシル化タンパク質：
    Figure 2017036303
     。
  22. 前記挿入されたコンセンサス配列を2種以上及び前記黄色ブドウ球菌多糖を2種以上含む
    、請求項13〜19のいずれか一項記載の組換えN-グリコシル化タンパク質。
  23. 前記黄色ブドウ球菌多糖が、異なる黄色ブドウ球菌株を標的化する多糖を含む、請求項
    22記載の組換えN-グリコシル化タンパク質。
  24. 前記黄色ブドウ球菌多糖が、莢膜多糖5型及び莢膜多糖8型を含む、請求項23記載の組換
    えN-グリコシル化タンパク質。
  25. グラム陽性菌由来の少なくとも1種のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチ
    ド配列；
    グラム陰性菌由来の少なくとも1種のグリコシル転移酵素をコードしているヌクレオチ
    ド配列；
    タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；及び
    オリゴ糖転移酵素をコードしているヌクレオチド配列：を含む、グラム陰性宿主原核生
    物。
  26. 前記グラム陽性菌が、黄色ブドウ球菌である、請求項25記載の宿主原核生物。
  27. 前記グラム陰性菌が、緑膿菌である、請求項25又は26のいずれか一項記載の宿主原核生
    物。
  28. 前記黄色ブドウ球菌が、莢膜多糖5型株である、請求項25〜27のいずれか一項記載の宿
    主原核生物。
  29. 前記黄色ブドウ球菌が、莢膜多糖8型株である、請求項25〜27のいずれか一項記載の宿
    主原核生物。
  30. 前記黄色ブドウ球菌が、メチシリン-耐性株である、請求項25〜29のいずれか一項記載
    の宿主原核生物。
  31. 異なるグラム陽性菌株由来の少なくとも2種のグリコシル転移酵素を含む、請求項25〜3
    0のいずれか一項記載の宿主原核生物。
  32. 前記タンパク質が、緑膿菌外毒素である、請求項25〜31のいずれか一項記載の宿主原核
    生物。
  33. 前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌α溶血素である、請求項25〜31のいずれか一項記載
    の宿主原核生物。
  34. 前記タンパク質が、黄色ブドウ球菌クランピング因子Aである、請求項25〜31のいずれ
    か一項記載の宿主原核生物。
  35. 前記宿主生物が、大腸菌である、請求項25〜34のいずれか一項記載の宿主原核生物。
  36. 第一のグラム陰性種の細菌を改変する方法であって：
    標的としてグラム陽性菌を選択する工程；
    少なくとも3つのモノマーを含む、該グラム陽性菌により生成された多糖の第一の反復
    単位を同定する工程；
    該第一の反復単位と同じモノマーを少なくとも2つ含む第二の反復単位を含む第二のグ
    ラム陰性種の細菌により生成された多糖を同定する工程；
    該第一のグラム陰性種の細菌へ、
    a)該第二の反復単位；及び
    b)該第二の反復単位には存在しない該第一の反復単位のモノマー：を含む三糖を集成
    するグリコシル転移酵素をコードしている1種以上のヌクレオチド配列を挿入する工程：
    タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程；並びに
    オリゴ糖転移酵素をコードしているヌクレオチド配列を挿入する工程：を含む、前記方
    法。
  37. 前記タンパク質が、少なくとも1種の挿入されたコンセンサス配列D/E-X-N-Z-S/Tを含み
    、ここでX及びZがプロリン以外の任意の天然のアミノ酸であってよい、請求項36記載の方
    法。
  38. 前記グラム陽性菌が、黄色ブドウ球菌である、請求項36又は37記載の方法。
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