CN101375161A - 靶定金黄色葡萄球菌ORF0657n的抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明表征了与ORF0657n靶区域(SEQ ID NO：1)结合的抗原结合蛋白。ORF0657n是一种金黄色葡萄球菌蛋白。通过mAb 1G3.BD4、mAb 2H2.BE11、mAb 13C7. BC1和mAb 13G11.BF3结合位点提供ORF0657n靶区域。在致死模型攻击中，提供了mAb 2H2.BE11和mAb13C7.BC1，用于增加抗金黄色葡萄球菌感染的存活率。也在离体模型中用IgG1或IgG2b形式的mAb 2H2证明了保护作用；并且用mAb2H2.BE11在被动免疫鼠留置导管模型中证明了保护作用。

Description

靶定金黄色葡萄球菌ORF0657n的抗原结合蛋白
相关申请
本申请要求2006年1月27日提交的美国临时申请No.60/763,023的优先权，该申请在此引入作为参考。
发明背景
不承认本申请中引用的参考文献是要求保护的本发明的现有技术。
金黄色葡萄球菌是导致多种疾病和状况的病原体。由金黄色葡萄球菌导致的疾病和状况的实例包括菌血症、感染性心内膜炎、毛囊炎、疖、痈、天疱疮、大疱性天疱疮、蜂窝织炎、葡萄状菌病、毒性休克综合征、皮肤烫伤综合征、中枢神经系统感染、感染性和炎性眼病、骨髓炎以及关节和骨的其它感染，和呼吸道感染(The Staphylococci in HumanDisease，Crossley and Archer(eds.)，Churchill Livingstone Inc.1997)。
可以用基于免疫的策略控制金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌的传播。基于免疫的策略包括被动和主动免疫。被动免疫采用靶定金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白。主动免疫诱导抗金黄色葡萄球菌的免疫应答。
发明概述
本发明表征了结合ORF0657n靶区域(SEQ ID NO:1)的抗原结合蛋白。ORF0657n是一种金黄色葡萄球菌蛋白。ORF0657n靶区域由mAb1G3.BD4、mAb 2H2.BE11、mAb 13C7.BC1和mAb 13G11.BF3结合位点提供。在致死模型攻击中，mAb 2H2.BE11和mAb 13C7.BC1提供了抗金黄色葡萄球菌感染的增加的存活率。也用mAb 2H2的IgG1或IgG2b形式在离体模型中证明了保护作用；并且用mAb 2H2.BE11在被动免疫鼠留置导管模型中证明了保护作用。
按照布达佩斯条约，在2005年9月30日，将产生mAb 1G3.BD4、mAb 2H2.BE11、mAb 13C7.BC1和mAb 13G11.BF3的小鼠杂交瘤细胞系保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209。这些细胞系命名为:ATCC No.PTA-7124(产生mAb 2H2.BE11)，ATCC No.PTA-7125(产生mAb 13C7.BC1)，ATCCNo.PTA-7126(产生mAb 1G3.BD4)和ATCC No.PTA-7127(产生mAb13G11.BF3)。
因此，本发明的一方面表征了分离的抗原结合蛋白，其包含第一可变区和第二可变区。第一和第二可变区结合一个或多个选自下组的靶区域:mAb 1G3.BD4靶区域、mAb 2H2.BE11靶区域、mAb 13C7.BC1靶区域和mAb 13G11.BF3靶区域。
“分离的”表示与天然不同的形式。不同的形式可以是例如与天然不同的纯度和/或天然不存在的结构。天然不存在的结构包括重组结构，其中不同的区域组合在一起，例如，人源化抗体，其中一个或多个鼠互补决定区插入人构架区支架，或鼠抗体用新表面覆盖，以模拟人抗体的表面残基；杂合抗体，其中将来自一个抗原结合蛋白的一个或多个互补决定区插入不同的构架区支架；以及来源于天然人序列的抗体，其中将编码轻链可变区和重链可变区的基因随机组合在一起。
分离的蛋白优选基本不含血清蛋白。基本不含血清蛋白的蛋白存在于缺乏大多数或所有血清蛋白的环境中。
“可变区”具有来自重链或轻链的抗体可变区的结构。抗体重链和轻链可变区含有插入构架区上的三个互补决定区。互补决定区主要负责识别特定表位。
根据mAb 1G3.BD4、mAb 2H2.BE11、mAb 13C7.BC1或mAb13G11.BF3结合的ORF0657n区(SEQ ID NO:1)定义靶区域。例如，mAbIG3.BD4靶区域是mAb IG3.BD4结合的ORF0657n区。
结合鉴定的靶区域的蛋白与mAb 1G3.BD4、mAb 2H2.BE11、mAb13C7.BC1或mAb 13G11.BF3竞争结合靶区域。例如，与mAb 1G3.BD4竞争结合ORF0657n的蛋白结合于mAb 1G3.BD4靶区域。
当采用过量和等量竞争性蛋白和单克隆抗体时，与单克隆抗体mAb1G3.B3、mAb 2H2.B8、mAb 13C7.D12或mAb 13G11.C11竞争的蛋白使单克隆抗体与ORF0657n的结合减少至少约20％，优选至少约50％。
“蛋白”表明连续氨基酸序列，并且不提供最小或最大的大小限制。蛋白中存在的一个或多个氨基酸可以含有翻译后修饰，如糖基化或二硫键形成。
优选的抗原结合蛋白是单克隆抗体。“单克隆抗体”表明具有相同或基本相同的互补决定区和结合特异性的抗体的集合。抗体的变异是当从相同构建体生产抗体时将存在的变异。
例如，可以从特定杂交瘤和从含有一个或多个编码抗体的重组基因的重组细胞生产单克隆抗体。可以由一个以上重组基因编码抗体，其中，例如，一个基因编码重链，一个基因编码轻链。
本发明的另一方面描述含有重组基因的核酸，该基因包含编码抗体可变区的核苷酸序列。抗体可变区可以结合选自下组的靶区域:mAbIG3.BD4靶区域、mAb 2H2.BE11靶区域、mAb 13C7.BC1和mAb13G11.BF3靶区域。
重组基因含有编码蛋白的重组核酸和用于进行适当转录和加工的调节元件(其可以包括翻译和翻译后的元件)。重组核酸是序列和/或形式不会天然存在的核酸。重组核酸的实例包括纯化的核酸，组合到一起、提供与天然存在的不同的核酸的两个或更多个核酸区，和缺少一个或多个天然地彼此相关的核酸区(例如，上游或下游区)。
本发明的另一个方面描述了重组的细胞。该细胞包含一个或多个编码与选自下组的靶区域结合的抗体可变区的重组基因:mAb IG3.BD4靶区域、mAb 2H2.BE11靶区域、mAb 13C7.BC1和mAb 13G11.BF3靶区域。多种重组基因是有用的，例如，其中一个基因编码抗体重链或其含有Vh区的片段，另一个核酸编码抗体轻链或其含有Vl区的片段。
本发明的另一方面包括生产包含抗体可变区的蛋白的方法。该方法包含以下步骤:(a)在表达蛋白的条件下培养包含编码该蛋白的重组核苷酸的重组细胞；和(b)纯化蛋白。
本发明的另一方面描述了药物组合物。该组合物包含治疗有效量的抗原结合蛋白和药学可接受的载体。
治疗有效量是足够提供有用的治疗或预防作用的量。对于感染金黄色葡萄球菌的患者，有效量是足够实现以下一种或多种作用的量:降低金黄色葡萄球菌在患者中增殖的能力或减少患者中金黄色葡萄球菌的量。对于未感染金黄色葡萄球菌的患者，有效量是足够实现以下一种或多种作用的量:降低对金黄色葡萄球菌感染的易感性或感染性细菌建立慢性疾病的持续感染的能力。
本发明的另一方面描述了检测溶液中或细胞上OFR0657n抗原的存在的方法。该方法包括给溶液或细胞提供本文描述的结合蛋白，并且测量结合蛋白与溶液或细胞中的抗原结合的能力。测量可以是定量或定性的。
ORF0657n抗原包括全长ORF0657n或其具有被mAb 1G3.B3、mAb2H2.B8、mAb 13C7.D12或mAb 13G11.C11识别的表位的衍生物。衍生物的实例包括截短的形式；和包含一个或多个以下氨基酸改变的ORF0657n的全长或截短形式:一个或多个添加、一个或多个取代，和一个或多个缺失。
本发明的另一方面表征了对患者进行抗金黄色葡萄球菌感染治疗的方法。该方法包括给患者施用治疗有效量的本发明描述的抗原结合蛋白的步骤。治疗的患者可以是或不是金黄色葡萄球菌感染的。优选地，患者是人。
本发明的另一方面描述生产蛋白的细胞系，所述蛋白是mAb1G3.B3、mAb 2H2.B8、mAb 13C7.D12或mAb 13G11.C11，或与mAbIG3.B3、mAb 2H2.B8、mAb 13C7.D12或mAb 13G11.C11竞争结合ORF0657n。优选的细胞系是杂交瘤，和含有编码蛋白的重组核酸的重组细胞系。
开放式的术语如“包含”允许有额外的成分或步骤。有时用带有或不带有开放式术语的短语如“一个或多个”强调有额外的成分或步骤的可能性。
除非明确指出，术语如“一个”或“一种”不限于一个。例如，“一个细胞”不排除“多个细胞”。有时用短语如一个或多个强调存在多个的可能性。
本发明的其它特征和优点从此处提供的额外说明，包括不同实施例中可以显而易见。提供的实施例举例说明了用于实施本发明的不同成分和方法。实施例不限制要求保护的发明。基于本公开内容，本领域技术人员可以鉴定和使用其它成分和方法，用于实施本发明。
附图简述
图1描述了IgG分子的结构。“VL”是指轻链可变区。“VH”是指重链可变区。“CL”是指轻链恒定区。“CH1”、“CH2”和“CH3”是重链恒定区。虚线表示二硫键。
图2描述了逐对结合研究中概括不同单克隆抗体的反应性的矩阵。该组单克隆抗体通过
Figure A200780003623D00101
方法落入三个反应区。
图3A-3C:细菌攻击前20小时，通过腹膜内注射以下物质，处理各组BALB/c小鼠(n＝20):■，mAb 13C7.BC1；□，mAb 6G6.A8(同种型对照)；或○，PBS。通过静脉内注射，用金黄色葡萄球菌攻击小鼠，监测存活。图3A-0.49mg mAb 13C7.BC1；0.45mg mAb 6G6.A8；和9.8 x 108CFU金黄色葡萄球菌Becker。图3B-0.49mg mAb 13C7.BC1；0.45mgmAb 6G6.A8；和9.6 x 108CFU金黄色葡萄球菌Becker。图3C-0.50mgmAb13C7.BC1；0.45mg mAb 6G6；和9.9 x 108CFU金黄色葡萄球菌Becker。
图4A和4B:细菌攻击前20小时，通过腹膜内注射以下物质，处理各组BALB/c小鼠(n＝20):■，mAb 13C7.BC1(0.5mg)；□，mAb 6G6.A8(同种型对照)(0.5mg)；或○，PBS(0.5ml)。图4A描述了采用2.09 X 108CFU金黄色葡萄球菌UK58的结果。图4B描述了采用2.15 X 108金黄色葡萄球菌UK 58的结果。
图5A-5C:细菌攻击前20小时，通过腹膜内注射以下物质，处理各组BALB/c小鼠(n＝20):■，mAb 13C7.BC1；□，mAb 6G6.A8(同种型对照)；○，PBS。通过静脉内注射，用金黄色葡萄球菌攻击小鼠，监测存活。图5A-0.43mg mAb 2H2.BE11；0.5mg mAb 6G6.A8；和9.8 x 108CFU金黄色葡萄球菌Becker.图5B-0.43mg mAb 2H2.BE11；0.5mgmAb 6G6.A8；和8.3 x 108CFU金黄色葡萄球菌Becker.图5C-0.43mgmAb 2H2.BE11；0.5mg mAb 6G6.A8；和9.3 x 108CFU金黄色葡萄球菌Becker。
发明详述
ORF0657n是位于金黄色葡萄球菌外膜的金黄色葡萄球菌蛋白。发现ORF0657n在金黄色葡萄球菌的不同株中是非常保守的(Anderson等，国际公开号WO 2005/009379，国际公开日是2005年2月3日)。可以用不同的ORF0657n衍生物产生抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答(Anderson等，国际公开号WO 2005/009379，国际公开日2005年2月3日)。
由于识别ORF0657n的能力，本发明的抗原结合蛋白可以用于例如，作为生产、表征或研究基于ORF0657n的抗原的工具。识别合适的ORF0657n表位的抗原结合蛋白也可以用作治疗金黄色葡萄球菌感染的试剂。
I.抗原结合蛋白
抗原结合蛋白包含抗体可变区，其提供对表位的特异性结合。抗体可变区可以存在于例如完整抗体、抗体片段和抗体或抗体片段的重组衍生物中。
不同类型的抗体具有不同的结构。可以参照IgG(图1)说明不同的抗体区。IgG分子包含四个氨基酸链:两个较长的重链和两个较短的轻链。重链和轻链均含有恒定区和可变区。可变区中存在三个负责抗原特异性的高变区。(参见例如Breitling et al.，Recombinant Antibodies，John Wiley & Sons，Inc.and Spektrum Akademischer Verlag，1999；和Lewin，Genes IV，Oxford University Press and Cell Press，1990。)
高变区(也称作互补决定区)存在于更保守的侧翼区(也称作构架区)之间。与构架区和互补决定区相关的氨基酸可以按照Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国健康和人类服务部门，1991的描述进行编号并且进行比对。
两个重链羧基区是通过二硫键结合而连接产生Fc区的恒定区。Fc区对提供诸如补体和巨噬细胞激活的抗体生物活性是重要的。这两个重链的每一个都构成Fc区，该区通过铰链区延伸到不同的Fab区。
在高等脊椎动物中，存在两类轻链和5类重链。轻链是κ或λ。重链确定抗体类型，并且是α，δ，ε，γ或μ。对于不同类型的重链，也存在亚类，如人γ1，γ2，γ3，和γ4。重链给铰链区和尾区赋予独特构象。(Lewin，Genes IV，Oxford University Press and Cell Press，1990.)
含有抗体可变区的抗体片段包括Fv，Fab和Fab2区。每个Fab区包含由可变区和恒定区组成的轻链，以及含有可变区和恒定区的重链。由二硫键通过恒定区将轻链连接于重链。Fab区的轻链可变区和重链可变区提供了参与抗原结合的Fv区。
抗体可变区可以存在于重组衍生物中。重组衍生物的实例包括单链抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)和微抗体(miniantibody)。(Kipriyanov et al，Molecular Biotechnology26:39-60，2004.)
抗原结合蛋白可以包含一个或多个识别相同或不同表位的可变区。(Kipriyanov et al.，Molecular Biotechnology 26:39-60，2004.)
II.制备针对鉴定的靶区域的抗原结合蛋白
可以从各个单克隆抗体开始，制备针对mAb 1G3.BD4靶区域、mAb2H2.BE11靶区域、mAb 13C7.BC1靶区域或mAb 13G11.BF3靶区域的不同抗原结合蛋白。或者，由结合蛋白识别的表位可以用于选择额外的结合蛋白。
mAb 2H2.BE11靶区域似乎位于ORF0657n的大约氨基酸76-357。含有ORF0657n的氨基酸76-357的多肽或全长ORF0657n可以用作选择抗体的靶抗原。可以确定制备的抗体的靶区域。
可以用多种技术选择识别抗原的蛋白。所述技术的实例包括使用噬菌体展示技术和杂交瘤生产。可以用嵌合小鼠，如异种移植小鼠(XenoMouse)或转染色体小鼠(Trans-Chromo mouse)生产人抗体。(例如Azzazy et al.，Clinical Biochemistry 35:425-445，2002，Berger et al.，Am.J.Med.Sci.324(1):14-40，2002.)
单克隆抗体mAb 1G3.BD4、mAb 2H2.BE11、mAb 13C7.BC1和mAb13G11.BF3含有识别ORF0675n的可变区。可以基于抗体可变区生产其它识别ORF0657n的结合蛋白。其它结合蛋白可以例如通过修饰存在的单克隆抗体或通过使用可变区序列信息来生产。可以用重组核酸技术进行蛋白构建和序列操作。
单克隆抗体mAb 1G3.BD4、mAb 2H2.BE11、mAb 13C7.BC1和mAb13G11.BF3是鼠抗体。对于人类治疗应用，设计基于所述mAb的优选结合蛋白，用于减少识别鼠区域的人抗小鼠抗体的可能产生。
采用诸如鼠抗体人源化、脱免疫(de-immunization)和嵌合抗体生产的技术，可以减少人抗小鼠抗体的可能产生。(参见，例如Brien et al.，Humanization of Monoclonal Antibodies by CDR Grafting，p 81-100，FromMethods in Molecular Biology Vol.207:Recombinant antibodies forCancer Therapy:Methods and Protocols(Eds.Welschof and Krauss)Humana Press，Totowa，New Jersey，2003；Kipriyanov et al.，MolecularBiotechnology 26:39-60，2004；Gonzales et al.，Tumor Biol.26:31-43，2005，Presta，Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656，2006，Tsurushita etal.，Methods 36:69-83，2005，Roque et al.，Biotechnol.Prog.20:639-654，2004.)
可以用例如嫁接互补决定区到构架区或用新表面覆盖的技术，对鼠抗体进行人源化。用新表面覆盖(也称作表面装饰)包括修饰可变区，使得表面暴露的区域人源化。
嫁接互补决定区包括从例如鼠来源取出所述区域或所述区域的一部分，并且将该区域插入人可变区构架区。用于嫁接的人构建体可以基于与获得该区域的可变区(如鼠)的序列同源性而选择。与嫁接的互补决定区相关的关键构架区残基也应该在新构架区中提供。
脱免疫包括改变抗体中存在的可能的线性T细胞表位。可以基于已知人HLA I类和/或II类表位的生物信息学扫描，鉴定表位。(Presta，Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656，2006.)
嵌合抗体含有人恒定区以及来自不同生物，如小鼠的可变区。人恒定区提供Fc区。
改变的其它实例包括在例如单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体中提供可变区。(Kipriyanov et al.，Molecular Biotechnology26:39-60，2004.)抗原结合蛋白可以含有一个或多个识别相同或不同表位的可变区。(Id.)本发明的其它实施方案涉及针对mAb 1G3.BD4、mAb2H2.BE11、mAb 13C7.BC1或mAb 13G11.BF3结合位点的单链抗体、双抗体、三抗体。
III.针对mAb 2H2.BE11靶区域的结合蛋白
如下文实施例的描述，进一步表征mAb 2H2.BE11靶区域，并且确定可变区的氨基酸序列。鉴定的靶区域和序列信息促进获得针对mAb2H2.BE11靶区域的不同结合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述结合蛋白与SEQ ID NO:1的氨基酸76-357组成的多肽结合。优选地，结合蛋白是人抗体、人源化抗体、脱免疫的抗体或嵌合抗体。优选的抗体是分离的抗体和单克隆抗体。
mAb 2H2.BE11可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:20(Vh)和SEQID NO:21(Vl)提供。Vh内的互补决定区(CDR)鉴定在氨基酸36-45，50-65和98-107。Vl内的CDR鉴定在SEQ ID NO:21的氨基酸24-33，49-55和88-96。
在针对Vh区的不同实施方案中，结合蛋白与mAb 2H2.BE11靶区域结合，并且包含以下成分、由以下成分组成、或基本由以下成分组成:第一Vh CDR，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸36-45或与氨基酸36-45有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:20的氨基酸36-45或与氨基酸36-45有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:20的氨基酸36-45或与氨基酸36-45有一个氨基酸不同的序列组成；第二Vh CDR，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸50-65或与氨基酸50-65有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:20的氨基酸50-65或与氨基酸50-65有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:20的氨基酸50-65或与氨基酸50-65有一个氨基酸不同的序列组成；和第三Vh CDR，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸98-107或与氨基酸98-107有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:20的氨基酸98-107或与氨基酸98-107有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:20的氨基酸98-107或与氨基酸98-107有一个氨基酸不同的序列组成。
在针对Vl区的不同实施方案中，结合蛋白与mAb 2H2.BE11靶区域结合，并且包含以下成分、由以下成分组成、或基本由以下成分组成:第一VlCDR，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸24-33或与氨基酸24-33有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:21的氨基酸24-33或与氨基酸24-33有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:21的氨基酸24-33或与氨基酸24-33有一个氨基酸不同的序列组成；第二VlCDR，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸49-55或与氨基酸49-55有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:21的氨基酸49-55或与氨基酸49-55有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:21的氨基酸49-55或与氨基酸49-55有一个氨基酸不同的序列组成；第三Vl CDR，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸88-96或与氨基酸88-96有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:21的氨基酸88-96或与氨基酸88-96有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:21的氨基酸88-96或与氨基酸88-96有一个氨基酸不同的序列组成。
关于可变区、CDR区或抗体序列的“基本由...组成”表明可能存在一个或多个额外的氨基酸，其中所述氨基酸不显著减少与靶的结合。
氨基酸不同可以是氨基酸缺失、插入或取代。在取代氨基酸以保持活性的过程中，取代的氨基酸应该具有一种或多种相似的性质，如大约相同的电荷、大小、极性和/或疏水性。
优选地，氨基酸取代是保守取代。保守取代用具有相似性质的氨基酸取代另一氨基酸。表1提供了各组氨基酸的列表，其中该组的一个成员是另一成员的保守取代。
表1:保守取代
 
Ala，Val，Ile，Leu，Met
Ser，Thr，
Tyr，Trp
Asn，Gln
Asp，Glu
Lys，Arg，His
在另外的实施方案中，Vh区是SEQ ID NO:20、人源化的SEQ ID NO:20或脱免疫的SEQ ID NO:20；并且/或者Vl区是SEQ ID NO:21、人源化的SEQ ID NO:21或脱免疫的SEQ ID NO:21。
在针对抗体的不同实施方案中，抗体包含以下成分、由以下成分组成、或基本由以下成分组成:(a)重链，其包含此第III部分描述的Vh区和来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人铰链区、CH1区、CH2区和CH3区，和(b)轻链，其包含此第III部分描述的Vl区和人κCL或人λCL。在进一步的实施方案中，抗体包含以下成分、由以下成分组成、或基本由以下成分组成:(a)重链，其包含此第III部分描述的Vh区和来自IgG1或IgG2的人铰链区、CH1区、CH2区和CH3区，和(b)轻链，其包含此第III部分描述的Vl区和人κCL；并且所述重链基本由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成，并且/或者轻链基本由SEQ ID NO:23组成。
在另外的实施方案中，本文表述的抗原结合蛋白具有Vh和Vl区，它们提供与靶抗原的至少约100nM的KD，优选至少约30nM。可以按照实施例11的描述，用氨基酸42-486的ORF0657n片段确定与靶抗原的结合。
用于不同实施方案的优选结合蛋白是抗体。更优选地，抗体是分离的或单克隆抗体。
IV.蛋白生产
优选用重组核酸技术或通过使用杂交瘤来生产抗原结合蛋白。重组核酸技术包括构建用于蛋白合成的核酸模板。杂交瘤技术包括使用永生化的细胞系来生产抗原结合蛋白。合适的重组核酸和杂交瘤技术是本领域公知的。(参见例如Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley，2005，Harlow et al.，Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988.)。
可以在实际上作为编码的蛋白的制造厂的宿主细胞中表达编码抗原结合蛋白的重组核酸。重组核酸可以提供编码抗原结合蛋白的重组基因，其自主地存在于宿主基因组中或作为宿主细胞基因组的一部分。
重组基因含有编码蛋白的核酸和用于蛋白表达的调节元件。通常，存在于重组基因中的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和任选存在的操纵子。用于在真核细胞中加工的优选元件是聚腺苷酸化信号。也可以存在抗体相关的内含子。用于抗体或抗体片段生产的表达盒的实例是本领域公知的。(例如Persic et al.，Gene 187:9-18，1997，Boel et al.，J.Immunol.Methods 239:153-166，2000，Liang et al.，J.Immunol.Methods 247:119-130，2001，Tsurushita et al.，Methods 36:69-83，2005.)。
由于遗传密码的简并性，可以使用大量不同的编码核酸序列来编码特定的多肽。产生遗传密码的简并性的原因是，几乎所有的氨基酸都由不同组合的核苷酸三联体或“密码子”编码。由密码子编码的氨基酸如下:
A＝Ala＝丙氨酸:密码子GCA、GCC、GCG、GCU
C＝Cys＝半胱氨酸:密码子UGC、UGU
D＝Asp＝天冬氨酸:密码子GAC、GAU
E＝Glu＝谷氨酸:密码子GAA、GAG
F＝Phe＝苯丙氨酸:密码子UUC、UUU
G＝Gly＝甘氨酸:密码子GGA、GGC、GGG、GGU
H＝His＝组氨酸:密码子CAC、CAU
I＝Ile＝异亮氨酸:密码子AUA、AUC、AUU
K＝Lys＝赖氨酸:密码子AAA、AAG
L＝Leu＝亮氨酸:密码子UUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU
M＝Met＝甲硫氨酸:密码子AUG
N＝Asn＝天冬酰胺:密码子AAC、AAU
P＝Pro＝脯氨酸:密码子CCA、CCC、CCG、CCU
Q＝Gln＝谷氨酰胺:密码子CAA、CAG
R＝Arg＝精氨酸:密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU
S＝Ser＝丝氨酸:密码子AGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU
T＝Thr＝苏氨酸:密码子ACA、ACC、ACG、ACU
V＝Val＝缬氨酸:密码子GUA、GUC、GUG、GUU
W＝Trp＝色氨酸:密码子UGG
Y＝Tyr＝酪氨酸:密码子UAC、UAU
用表达载体促进重组基因在细胞中的表达。优选地，除重组基因外，表达载体还包含用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、选择标记、有限数目的有用限制酶位点，和高拷贝数目的潜能。用于抗体和抗体片段生产的表达载体的实例是本领域公知的。(例如Persic et al.，Gene187:9-18，1997，Boel et al.，J.Immunol.Methods 239:153-166，2000，Liangetal.，J.Immunol.Methods 247:119-130，2001，Tsurushita et al.，Methods36:69-83，2005.)
如果需要，编码抗体的核酸可以用本领域公知的技术整合到宿主染色体中。(例如，Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley，2005，Marks et al.，国际申请号WO 95/17516，国际公开日1995年6月29日)
多种不同的细胞系可以用于重组抗原结合蛋白表达，包括来自原核生物(如大肠杆菌、芽孢杆菌种和链霉菌种和真核生物(如酵母、杆状病毒和哺乳动物)的那些。(Breitling et al.，Recombinant Antibodies，JohnWiley & Sons，Inc.and Spektrum Akademischer Verlag，1999，Kipriyanovet al.，Molecular Biotechnology 26:39-60，2004，Tsurushita et al.，Methods36:69-83，2005.)
用于重组抗原结合蛋白表达的优选宿主提供哺乳动物翻译后修饰。翻译后修饰可以是化学修饰，如糖基化和二硫键形成。另一类型的翻译后修饰是信号肽切割。
合适的糖基化对于抗体功能可以是重要的。(Yoo et al.，Journal ofImmunological Methods 261:1-20，2002，Li et al.，Nature Biotechnology24(2):210-215，2006.)天然存在的抗体含有至少一个连接于重链的N-连接的碳水化合物。(Yoo et al.，Journal of Immunological Methods 261:1-20，2002.)其它N-连接的碳水化合物和O-连接的碳水化合物可以存在，并且对于抗体功能可能是重要的。(Id.)
不同类型的宿主细胞可以用于提供有效的翻译后修饰，包括哺乳动物宿主细胞和非哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的实例包括但不限于中国仓鼠卵巢(Cho)，HeLa，C6，PC12，人胚肾(HEK293)和骨髓瘤细胞。(Yoo et al.，Journal of Immunological Methods 261:1-20，2002，Persic et al.，Gene 187:9-18，1997.)非哺乳动物细胞可以经过修饰，用于复制人的糖基化。(Li et al.，Nature Biotechnology 24(2):210-215，2006.)糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母是所述修饰的非哺乳动物细胞的一个实例。(Li et al.，Nature Biotechnology 24(2):210-215，2006.)
优选的重组基因包含编码抗体可变区的核苷酸序列，所述可变区结合于选自下组的靶区域:mAb IG3.BD4靶区域、mAb 2H2.BE11靶区域、mAb 13C7.BC1和mAb 13G11.BF3靶区域。特定的重组基因可以编码含有一个可变区或Vh和Vl区这二者的蛋白。重组基因也可以编码抗体恒定区和铰链区。如果需要，可以用重组基因的组合生产抗体，其中一个基因编码轻链，第二个基因编码重链。
通过编码上文第II部分或第III部分描述的蛋白的核酸，提供了不同的实施方案。下文提供了所述实施方案的实例。
在针对Vh编码区的实施方案中，该核苷酸序列编码包含以下成分、由以下成分组成、或基本由以下成分组成的可变区:第一Vh CDR，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸36-45或与氨基酸36-45有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:20的氨基酸36-45或与氨基酸36-45有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:20的氨基酸36-45或与氨基酸36-45有一个氨基酸不同的序列组成；第二Vh CDR，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸50-65或与氨基酸50-65有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:20的氨基酸50-65或与氨基酸50-65有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:20的氨基酸50-65或与氨基酸50-65有一个氨基酸不同的序列组成；和第三Vh CDR，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸98-107或与氨基酸98-107有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:20的氨基酸98-107或与氨基酸98-107有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:20的氨基酸98-107或与氨基酸98-107有一个氨基酸不同的序列组成。
在针对Vl编码区的实施方案中，该核苷酸序列编码包含以下成分、由以下成分组成、或基本由以下成分组成的可变区:第一Vl CDR，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸24-33或与氨基酸24-33有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:21的氨基酸24-33或与氨基酸24-33有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:21的氨基酸24-33或与氨基酸24-33有一个氨基酸不同的序列组成；第二Vl CDR，其包含SEQID NO:21的氨基酸49-55或与氨基酸49-55有一个氨基酸不同的序列、由SEQ ID NO:21的氨基酸49-55或与氨基酸49-55有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:21的氨基酸49-55或与氨基酸49-55有一个氨基酸不同的序列组成；第三Vl CDR，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸88-96或与氨基酸88-96有一个氨基酸不同的序列、由SEQ IDNO:21的氨基酸88-96或与氨基酸88-96有一个氨基酸不同的序列组成、或基本由SEQ ID NO:21的氨基酸88-96或与氨基酸88-96有一个氨基酸不同的序列组成。
在另外的实施方案中，Vh区是SEQ ID NO:20、人源化的SEQ ID NO:20或脱免疫的SEQ ID NO:20；并且Vl区是SEQ ID NO:21、人源化的SEQ ID NO:21或脱免疫的SEQ ID NO:21。
在针对抗体重链和/或轻链的不同实施方案中，重组基因编码包含以下成分、由以下成分组成、或基本由以下成分组成的蛋白中的任意一种，或两者:(a)重链，其包含上文第III部分描述的Vh区和来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的人铰链区、CH1区、CH2区和CH3区，或(b)轻链，其包含上文第III部分提供的Vl区和人κCL或λCL。在进一步的实施方案中，所述重链基本由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成，轻链基本由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。
V.抗原结合蛋白的应用
含有某些ORF0657n区的抗原可以用于提供抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答。(Anderson et al.，国际公开号WO 2005/009379，国际公开日2005年2月3日)识别ORF0657n靶区域的抗原结合蛋白可以用于促进ORF0657n抗原和疫苗的生产、表征或研究。识别合适表位的抗原结合蛋白也可以具有治疗应用。
ORF0657n相关抗原和疫苗的生产、表征或研究的不同应用的实例包括:
1)例如通过蛋白印迹鉴定ORF0657n抗原的存在；
2)例如通过流式细胞术鉴定细胞表面ORF0657n抗原的存在。这可以用于例如确定金黄色葡萄球菌的多个菌株上的表达以及证实敲除突变体；
3)被动保护实验。抗体可以用于致死模型中，用于确定ORF0657n蛋白的特定区域是否赋予保护作用；
4)免疫测定。该测定可以用于监测抗原质量、产品生产和稳定性；
5)在小鼠效能测定中作为对照，用于监测抗原疫苗产物的免疫原性；和
6)血清学测定可以用竞争性形式利用单克隆抗体，用于鉴定ORF0657n来源的抗原接种的患者的免疫应答。
在靶蛋白的生产、表征或研究中利用抗原结合蛋白，如单克隆抗体的技术是本领域公知的。(参见，例如Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley，2005，Harlow et al.，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，Harlow et al.，Using Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999，Lipman et al.，ILARJournal 46:258-268，2005.)
在本发明的一种实施方案中，用抗原结合蛋白确定溶液中结合于微球体或细胞的ORF0657n抗原的存在。可以用不同的技术，如蛋白印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术和Luminex免疫测定来确定结合蛋白与溶液或细胞中存在的蛋白结合的能力。
VI.处理
可以用结合于合适靶区域的抗原结合蛋白对患者进行治疗性和预防性处理。在感染金黄色葡萄球菌的患者中进行治疗性处理。预防性处理可以在一般群体或一般群体的亚组中进行预防性处理。一般群体的优选亚组是金黄色葡萄球菌感染的风险增加的人。
“患者”是指能够受到金黄色葡萄球菌感染的哺乳动物。优选地，患者是人。但是，其它类型的哺乳动物，如牛、猪、绵羊、山羊、兔、马、狗、猫、猴、大鼠和小鼠，可以受到金黄色葡萄球菌的感染。非人患者的处理可以用于保护宠物和家畜，并且用于评估特定治疗的有效性。
金黄色葡萄球菌感染的风险增加的人包括健康护理工作者；住院患者；免疫系统减弱的患者；进行手术的患者；接受异物植入，如导管或血管装置植入的患者；面临导致免疫减弱的治疗的患者；和从事烧伤或创伤风险增加的职业的人。(The Staphylococci in Human Disease，Crossley and Archer(ed.)，Churchill Livingstone Inc.1997.)
在一种实施方案中，给患者联合施用抗原结合蛋白和手术或异物(foreign body)植入物。“手术或异物植入”包括提供或不提供异物植入的手术，和在手术或不手术的条件下提供异物植入。施用的时间可以设计用于实现预防性处理和/或治疗性处理。施用优选大约在手术或植入同时开始。
药物施用的指导通常提供于例如Remington′s PharmaceuticalSciences 20th Edition，Ed.Gennaro，Mack Publishing，2000；和ModernPharmaceutics 2nd Edition，Eds.Banker and Rhodes，Marcel Dekker，Inc.，1990。
药学可接受的载体促进抗原结合蛋白的储存或施用。用于稳定蛋白溶液制剂的物质包括碳水化合物、氨基酸和缓冲盐。(Middaugh et al.，Handbook of Experimental Pharmacology 137:33-58，1999.)
可以通过不同的途径施用抗原结合蛋白，如静脉内、皮下、肌内或粘膜。可以采用例如针头或喷射注射器进行皮下和肌内施用。粘膜送递，如鼻送递，可以涉及使用增强剂或粘膜粘附剂在吸附位点产生更长的保留时间。(Middaugh et al.，Handbook of Experimental Pharmacology137:33-58，1999.)
合适的施用方案优选考虑本领域公知的因素而确定，包括患者的年龄、体重、性别和医学状况；施用途径；需要的效果；和采用的特定化合物。预期有效剂量范围应该是约0.1mg/kg-20mg/kg或0.5mg/kg-5mg/kg。施用频率可以根据化合物的有效性和稳定性而改变。施用频率的实例包括每两周、每周、每月和每两月。
VII.实施例
下文提供了进一步说明本发明的不同特征的实施例。实施例也举例说明了用于实施本发明的有用的方法。这些实施例不限制要求保护的发明。
实施例1:制备ORF0657n的单克隆抗体
用ORF0657n-C/e(SEQ ID NO:2)或ORF0657n-H/y(SEQ ID NO:3)作为抗原制备针对ORF0657n(SEQ ID NO:1)的单克隆抗体。鉴定抗体，并且通过ELISA和流式细胞术表征。
小鼠和免疫:从Taconic(Germantown，N.Y.)购买4-5周龄的雌性BALB/c小鼠。在第0、7和21天，用配制在羟基磷酸铝佐剂上的20μg大肠杆菌产生的ORF0657n-C/e抗原或酵母表达的ORF0657n-H/y抗原肌内(i.m.)免疫小鼠。(Anderson et al.，国际公开号WO 2005/009379，国际公开日2005年2月3日.)融合前3天，给予小鼠20μg蛋白在磷酸缓冲液(PBS)中的最终静脉内注射(i.v.)。处死小鼠，取出脾，用于细胞融合。
MAb制备:通过聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)，将从脾制备的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤配偶体SP2/0-Ag14(ATCC 1581)以3:1的比例融合。将融合体铺板在96孔平底微量滴定板中的高葡萄糖、丙酮酸Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，该培养基含有20％胎牛血清、次黄嘌呤(10-4M)、胸苷(10-5M)，24小时后加入氨基喋呤(4 x 10-7M)。按照下文的描述，通过ELISA筛选来自生长中的杂交瘤的上清液与ORF0657n的反应性。通过有限稀释克隆阳性孔，并且重新测试ELISA反应性。用抗体同种型分析试剂盒(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)对单克隆抗体进行分类。
ELISA:2-8℃下用每孔50纳克溶于PBS中的大肠杆菌表达的SEQID NO:2将Costar培养基结合微量滴定板包被过夜。用PBS，0.05％Tween20将板洗涤3次，用1％牛血清白蛋白、PBS、0.05％ Tween20(测定稀释液)封闭至少1小时。按照上文洗涤平板，加入来自融合孔或克隆的杂交瘤的上清液，室温下温育2小时。按照上文洗涤平板，加入山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP缀合物(Zymed)(在测定稀释液中1:8000)，室温下温育1小时。用TMB底物使测定平板显色，用2.0N H2SO4终止反应，OD 450nm下在板读数器中读数。450nm下的光密度>1.0的孔认为是阳性的。
流式细胞术:制备的在不含铁条件下(在RPMI中)传代的金黄色葡萄球菌甘油储液用于评估mAb的ORF0657n结合。将冷冻的甘油储存细胞解冻，重悬于PBS；1％牛血清白蛋白；0.1％叠氮化钠，0.2％猪IgG(Sigma)(PAAG)中，达到5 X 107CFU/50ul的浓度。每个反应将细胞的50ul等分物置于1.5ml Eppendorf管中。在每个反应管中加入50微升杂交瘤培养物，室温下温育1小时。通过在试管中加入1mL磷酸缓冲液；1％牛血清白蛋白；0.1％叠氮化钠(PAA)，洗涤细胞。通过离心(5500rpm，5分钟)沉淀细胞。除去上清液，将细胞与1:100稀释于PAAG中的100μL第二抗体(FITC-标记的山羊抗小鼠Ig(BD Pharmingen)混合。室温下在暗处温育1小时。温育后，在反应混合物中加入1mL PAA，沉淀细胞(5500rpm，5分钟)，除去上清液。将沉淀物重悬于1mL PBS中，转移到12 x 75mm试管中进行FAC分析。
在对细菌细胞进行门控的BD-FACSCalibur流式细胞仪上操作试管，测量与细胞相关的FITC的量。在每个测定中操作已知与金黄色葡萄球菌的表面结合的标准抗体。阴性对照是单独的细胞和第二缀合物。如果几何平均值大约30，则认为杂交瘤细胞是阳性的。
两个独立的融合得到了一组12种单克隆抗体(mAb)。所有这些mAbs在ELISA中都是反应性的(表2)。这12种mAbs中的10种结合细菌的表面，这是通过流式细胞术证实的。采用野生型蛋白，通过蛋白印迹分析，发现所有这些mAbs都是阳性的。
表2
 
mAbs/细胞系融合#1 mAbs/细胞系融合#2
1)2H2.B8  IgG1
2)8H6.E11.H3  IgG2a*
3)7H2.C11  IgG1*
4)2E12.A8 IgG1
5)8A8.B4 IgG1
6)3G11.D5 IgG1
7)13G11.C11 IgG1
8)13C7.D12 IgG1
9)1G3.B3 IgG1
10)9H3.E4 IgG1
11)3B7.G8 IgG1
12)3G12.A4 IgG1
*在流式细胞术中不是反应性的。融合#1是从大肠杆菌产生的ORF0657n-C/e抗原建立的。融合#2是用酵母表达的ORF0657n-H/y抗原建立的。
实施例2:类型转换mAbs
所有结合于天然抗原的分离的mAbs是IgG1同种型的。通过选择转换变体，将这些抗体类型转换为IgG2b同种型(Spira et al，J.ofImmunogical Methods，74:307-315，1985)。用IgG2b缀合物对合适的免疫测定进行显色，以高密度将细胞系铺板。选择体细胞突变，富集，然后克隆。转换的mAb的结合位点保持与最初的mAb相同，但是转换为IgG2b亚型在被动保护研究中得到了更有利的同种型(起始补体级联)。
表3类型转换的mAbs
 
IgG1同种型 IgG2b同种型
2H2.B8 2H2.BE11
2E12.A8 2E12.BG1
8A8.B4 8A8.BF9
3G11.D5 3G11.BE5
13G11.C11 13G11.BF3
13C7.D12 13C7.BC1
1G3.B3 1G3.BD4
9H3.E4 9H3.BE4
实施例3:用天然抗原进行的结合抑制研究
根据制造商的说明书，采用mAb标记试剂盒(Molecular Probes)，用Alexafluor-488标记纯化的抗体。对标记和未标记的mAbs确定正好使RPMI上生长的细菌细胞表面饱和的mAb的量。表3(第1列)中的每种mAbs是在标记和未标记的条件下使用的。
通过首先用浓度可以使细胞表面饱和的未标记mAb温育5 X 107个细胞，进行抑制测定。将该反应在室温下温育1小时。该温育后，用1mlPAA洗涤反应，在微量离心机(Hermle)中以6,000RPM旋转5分钟。使上清液减少到大约50ul，将细胞重悬于100ul PAAG中，其中含有将正好使细胞表面饱和的量的直接标记的mAb。该温育后，用1ml PAA洗涤反应物，在微量离心机(Hermle)中以6,000RPM旋转5分钟。使上清液减少到大约50ul，将细胞重悬于1ml PBS中，并且转移到12 x 75mm试管中进行FAC分析。作为对照，用第二Alexafluor-488缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Molecular probes，1:400稀释于PAAG)测量具有未标记mAb的独立的反应，以确定该mAb结合于表面。也进行了阳性对照，其伴随细胞仅仅具有标记的mAb。如果未标记的mAb与标记的mAb结合相同的表位，则将没有或只有很低的与细胞相关的荧光反应性。如果未标记的mAb与标记的mAb结合不同的表位，则与表面相关的反应性的水平将与仅仅含有标记的mAb的对照细胞等同。
通过抑制研究，该组单克隆抗体落入四个反应组中:
表4
 
组I 组II 组III 组IV
2H2.B8 9H3.E4 13G11.C11 2E12.A8
8A8.B4 1G3.B3 13C7.D12
3G11.D5
实施例4:用变性抗原和改变的抗原进行的结合研究
将ORF0657n改变的蛋白用于进一步表征结合。最初将编码ORF0657n的核酸克隆到表达载体pET-28a(Novagen)中，并且在具有C末端6X组氨酸标记的大肠杆菌中表达(SEQ ID NO:2)。按照制造商的说明，用Stratagene的QuikChange XL定点诱变试剂盒使具有克隆的基因的表达载体进行诱变。用特定顺序的氨基酸改变，使基因突变。按照制造商的说明，将得到的质粒转化到Stratagene的XL10-Gold感受态细胞中。用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒，从转化体分离质粒。通过用ABI的310 DNA测序仪测序，筛选转化体。将来自具有最大数目碱基改变的转化体的质粒转化到表达宿主HMS174(DE3)(Novagen)中。按照Novagen的说明书表达转化体。
将不同的ORF0657n改变的蛋白用于确定ORF0657n mAbs(SEQIDs 4-19)的多样性。采用标准程序，用10种不同的mAbs在斑点印迹中筛选这些蛋白。采用标准程序，通过蛋白印迹证明阳性/阴性。通过该方法，根据结合谱对抗体分组。7种抗体分辨为3组；剩余的三种抗体(2H2.B8，8A8.E11.H3和13G11.C11)具有与彼此相似但不相同的谱(表5)。
表5:通过蛋白印迹检测的ORF0657n特异性mAbs与ORF0657n突变蛋白的结合
Figure A200780003623D00271
+，通过蛋白印迹检测的与蛋白结合的抗体；-，通过蛋白印迹检测的不与蛋白结合的抗体；W，通过蛋白印迹检测的与抗体弱结合。根据杂交谱对抗体分组。虚线用于表示获得了相似但不相同的谱。
实施例5:BAIcore研究
在BIAcore研究中，采用纯化的ORF0657n-H/y作为抗原，通过“足印分析”检验mAbs。用实时生物分子相互作用分析，通过
Figure A200780003623D00272
进行逐对结合实验。整合了微流体技术和表面等离子共振(SPR)，用于通过监测直接指向羧甲基右旋糖苷包被的(CM5)传感器芯片表面的偏振光的折射率，检测质量的改变。以反应单位测量的反应的改变，可以与结合的分析物(即抗原或抗体)的量相关。
抗葡萄球菌抗体(mAb 13C7.D12)共价结合(固定)在CM5传感器芯片的表面。首先将固定的Ab暴露于ORF0657n蛋白，随后以矩阵形式暴露于的一对抗体。在每轮ORF0657n蛋白+抗体对之后，用20mMHC1将传感器芯片的表面再生回到固定的mAb 13C7.D12。以矩阵形式测试抗ORF0657n蛋白的8种抗体，从而可以分析每对抗体的所有组合。用于本实施例的mAb对的矩阵设计概括于表6。
表6.以8 x 8矩阵测试的抗体的概括
为了对每轮中最初结合(捕获)的抗原量进行标准化，计算以下每种测试抗体/抗原复合物的比值:
Figure A200780003623D00291
或
Figure A200780003623D00292
可以如下对作图的抗体对计算每种抗体保留的可用表位百分比:
或
Figure A200780003623D00294
图2描述了概括逐对结合研究中单克隆抗体的反应性的矩阵。该组单克隆抗体通过
Figure A200780003623D00295
法落入三个反应区(参见表7)。
表7
 
组I 组II 组III
2H2.B8 13G11.C11 13C7.D12
8A8.B4 3G11.D5 2E12.A8
9H3.E4
1G3.B3
实施例6:用鼠脓毒症模型中的被动免疫进行的保护作用研究
测试单克隆抗体mAb 2H2.BE11和mAb 13C7.BC1提供抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用的能力。这些抗体识别ORF0657n蛋白上的不同表位。对照包括同种型匹配的mAb和单独的PBS。
在细菌攻击前20小时腹膜内(i.p.)施用mAbs或PBS。然后用金黄色葡萄球菌Becker的LD80-90剂量静脉内攻击小鼠，监测存活。每个实验用10或20只小鼠的各组重复3次，并且监测10天。未感染的BALB/c小鼠中的单克隆抗体的半衰期是大约8天。发现0.5mg的剂量是最优的。用两种单克隆抗体进行的实验的结果示于图3A-C，4A，4B和5A-C。
尽管在一个实验中mAb 13C7.BC1与对照相比在第10天显著改善了存活率，但在其它两次重复中，总体存活率与对照相似(图3A-3C)。但是，与对照相比，mAb 13C7.BC1处理的小鼠在该10天的阶段中死亡时间延迟了。在三次实验中的两次中也注意到了mAb 2H2.BE11处理的小鼠中相似的时间延迟趋势(图5A-5C)。
也用最近的金黄色葡萄球菌临床分离物UK58检验了mAb13C7.BC1的作用(图4A和4B)。该菌株从患者的脓肿部位的传播最少。在两次独立实验中，结果显示UK58攻击后死亡时间延迟。
由于死亡迅速，在LD80-90模型中不能评估抗体持续研究。因此，进行了亚致死剂量攻击。在亚致死模型中，攻击剂量是LD80-90模型使用的剂量的10％。在4小时的阶段中监测亚致死攻击模型。每组22只小鼠的各组在用5 X 107CFU的金黄色葡萄球菌Becker进行静脉内细菌攻击前20小时接受0.5mg剂量的mAb 13C7.BC1或同种型对照mAb(6G6)。在即将开始攻击前(T＝0)处死每组中的2只小鼠，确定攻击时的血清mAb水平。在攻击后2、24、48、72和96小时，处死每组的4只小鼠，确定血清mAb水平。
对于该亚致死攻击实验，估计金黄色葡萄球菌感染的小鼠中mAb13C7.BC1的半衰期是大约1天。相反，估计同种型对照mAb的半衰期大于4天(数据未示出)。这些数据指向金黄色葡萄球菌攻击的小鼠中mAb 13C7.BC1的特异性减少，这似乎在致死模型中在监测的10天阶段之前就早已耗尽。
在图3A-C，4A，4B和5A-C中说明的8个实验中的6个，在接受mAb施用的组中在大约3天中观察到了改进的存活率。这些结果提供了指示，表明所述mAbs对金黄色葡萄球菌攻击的小鼠的存活率具有正作用。
实施例7:在鼠留置导管模型中用被动免疫进行的保护作用研究
鼠留置导管模型中使用mAb 2H2.BE11。该模型中使用的金黄色葡萄球菌株是临床分离物MCL8538。该菌株选择为可以施用的较低剂量的接种物，同时仍然保留与鼠脓毒症模型中使用的菌株-金黄色葡萄球菌Becker相似的在导管中的可繁殖的集群。
ICR小鼠具有手术植入颈静脉的导管(PE50硅橡胶)，该导管用缝线固定，具有位于小鼠背部中线的端口。小鼠在手术后休息9-11天。攻击前24小时，通过单次腹膜内注射600mcg鼠单克隆抗体2H2.BE11，对小鼠进行被动免疫。第0天，用静脉内施用的金黄色葡萄球菌MCL8538攻击小鼠。接种剂量是100μl体积中的2-8 X 105CFU(实验1-3)。发现该低剂量在4天后自发从导管清除。因此，在攻击后24小时，评估导管中的细菌。此时，处死小鼠，收集导管。通过在TSA上培养整个导管，评估导管上细菌的存在。如果在板上观察到任何生长的迹象，则导管评价为培养物阳性。
在前三个实验中的两个中，与同种型对照抗体相比，培养物阴性导管的数目在用抗体2H2.BE11被动免疫的小鼠中显著更低。用更大的接种剂量进行了第四个实验。在该更强烈的攻击中，确定剂量是100％导管受到可繁殖感染的剂量之一，并且该感染不能被对照小鼠自发清除(在7天中监测)。在采用更大接种剂量的实验4中，与同种型对照抗体相比，在用2H2.BE11抗体注射的小鼠中仍然发现受感染的导管数目显著更少。这4个实验的结果概括于表8。
表8:在用鼠留置导管模型进行的4个独立的被动转移实验 中获得的培养物阴性导管的数目
Figure A200780003623D00311
实施例8:用抗ORF0657n的单克隆抗体2H2.B8(IgG1)、2H2.BE11(IgG2b) 或13C7.IgG2b或同种型匹配的对照mAbs进行的离体细菌预调理
为了测试ORF0657n的单克隆抗体是调理性的，进行了被动保护实验，其中用单克隆抗体2H2.B8、2H2.BE11或13C7.IgG2b或同种型匹配的对照单克隆抗体预调理致死剂量的金黄色葡萄球菌。然后给小鼠腹膜内施用预调理过的细菌。用于这些实验中的细菌是金黄色葡萄球菌RN4220(野生型)或RN4220.0657n。RN4220.0657n细菌经过工程化，在没有FUR盒的控制下表达ORF0657n。因此，它们可以在存在铁的条件下生长，并且仍然在它们的表面表达ORF0657n抗原。或者，RN4220(野生型)在低铁培养基RPMI中传代两次，诱导细菌表面0657n的表达。
用800μg IgG在4℃下将足够用于6只Balb/c小鼠(6 X LD100)的量温育1小时，同时轻柔摇动。然后使细菌沉淀，除去任何未结合的mAb。将抗体调理过的细菌重悬于2.4mL PBS中，将0.4mL(1 X LD100)注射到5只小鼠中的每一只。攻击后，通过铺板在TSA上，对每个接种物进行定量，以确保所有组的小鼠给予相同的CFU，并且mAbs不使细菌聚集。攻击后，监测存活率3天。由于细菌表面必须存在靶抗原，才能使该程序有效，小心确保调理前细菌上表达0657n。采用mAb 2H2.B8，通过流式细胞术监测ORF0657n表达。注射到每只小鼠中的调理过的细菌剂量是2-4 X 109CFU RN4220.0657n/小鼠，或1-2 X 10^9 CFURN4220(2X RPMI)/小鼠。
当用2H2.B8或2H2.BE11，但没有用同种型匹配的对照mAb预调理时，细菌受到保护，免受由于致死剂量的RN4220.0657n葡萄球菌导致的死亡。对IgG1同种型重复该实验两次，对IgG2b同种型，重复三次，得到相似结果(表9A)。
表9A:用抗0657n mAb的离体保护作用
 
单克隆抗体 实验1存活的小鼠 实验2存活的小鼠 实验3存活的小鼠 总数
2H2.BE11(IgG2b) 5 4 5 93％(14/15)
6G6.A8(IgG2b) 1 0 1 13％(2/15)
PBS 1 2 0 20％(3/15)
2H2.BE11(IgG1) ND 4 5 90％(9/10)
10B4.H4(IgG1) ND 1 1 20％(2/10)
每个实验用5只小鼠。攻击菌株RN4220.0657n.pYZ119。剂量:2-4 X 109CFU。测试mAbs:鼠抗-0657n 2H2.BE11(IgG2b)；2H2.B8(IgG1)。
当用任一种mAb 2H2.B8预调理，但没有用同种型匹配的对照mAb预调理时，细菌受到保护，免受由于致死剂量的RN4220(2X RPMI)葡萄球菌导致的死亡。实验重复6次，具有相似的结果(表9B)
表9B:用抗0657n mAb的离体保护作用
 
单克隆抗体 #测试 聚集 ％存活
2H2.B8 6 30/30 100％
10B4.IgG1同种型对照 6 2/30 7％
13C7.IgG2b 2 0/10 0％
6G6.IgG2b同种型对照 2 0/10 0％
在该致死模型中，鼠抗0657n 2H2在防止死亡方面非常有效。13C7mAb在该模型中无效(与图3-6所示的前面的描述相反)。所有(2H2.BE11，2H2.B8和13C7.IgG2b)抗0657n mAb都结合RN4220(如用流式细胞术所证明的)，并且在体外OPA测定中都具有调理活性。该模型反映了小鼠腹膜中用于增强存活的表位特异性的额外要求。
实施例8:用2H2mAb进行的表位作图研究
本实施例中描述的实验提供证据证明单克隆抗体2H2.BE11识别ORFO657n内的构象表位。定位于ORFO657n内的最小序列的该实验需要展示2H2 mAb识别的三维结构中的构象表位。此外，该实验鉴定了ORFO657n的最小序列内的独特赖氨酸残基，当2H2 mAb结合于ORFO657n时，其受到保护，避免与小分子反应。
用表位提取，研究2H2 mAb识别ORFO657n的序列内长度一般为9-14个氨基酸的线性表位的潜在能力，并且从SEQ ID NO:1的氨基酸42-氨基酸486的ORF0657n片段(＂ORF0657t＂)开始。具体地，通过化学交联将30ug 2H2 mAb固定于10mg溴化氰活化的琼脂糖凝胶(Amersham目录号17 0430 01)，从而进行每个表位提取实验。用GluC(Roche Applied Science目录号11 420 3997 001)、Asp-N(Roche AppliedScience目录号11 054 589 001)或糜蛋白酶(Roche Applied Science目录号11 418 467 001)进行ORF0657t的蛋白水解消化，并且通过1D/LC-MS/MS在线性离子阱(LTQ-Thermo Electron Inc)中表征。在三个独立的实验中，使8.4μg的表征的蛋白酶蛋白水解消化物与固定的抗体反应。从抗体交联珠上洗去未结合的肽。用低pH洗脱可能结合的肽，通过1D/LC-MS/MS表征。所有产生的蛋白水解肽都没有被2H2 mAb以高效率和特异性结合，提供了强烈的提示，即2H2 mAb不识别线性表位。
2H2 mAb不识别ORFO657n的线性序列的发现通过有限的化学裂解实验证实。用CNBr将ORF0657t化学裂解2小时。通过SDS-PAGE分析得到的裂解产物。SDS-PAGE分析显示5个主要的条带，分子量为大约42kDa，35kDa，25kDa，15kDa和10kDa。用2H2mAb进行的蛋白印迹分析显示2H2仅仅识别42kDa的条带。从SDS-PAGE切下所有条带，进行凝胶内消化，将通过串联质谱鉴定的得到的肽与ORF0657t中相应的序列匹配。主要条带的分析结果示于表10:
表10
Figure A200780003623D00341
通过表位切除，证实分子量为大约42kDa的片段的重要性。具体地，通过化学交联将210μg 2H2 mAb固定于50mg溴化氰活化的琼脂糖凝胶(Amersham目录号17 0430 01)上，用于每个表位切除实验。然后，使50μg完整的ORF0657t与固定的抗体结合，通过用磷酸缓冲液充分洗涤，洗去未结合的ORF0657t。在三个独立的实验中，在顺序组合中，将蛋白酶Glu-C、胰蛋白酶，以及GluC、AspN、胰蛋白酶、糜蛋白酶和羧基肽酶Y的顺序组合加入5小时或1小时/蛋白酶。彻底洗去温育过程中蛋白酶切除的肽，特异性结合于2H2 mAb的ORF0657t片段用SDS加样缓冲液释放。
通过SDS-PAGE分析特异性结合于2H2 mAb的片段。所有三个表位切除实验证明SDS-PAGE分析中仅有一个条带具有40-42kDa的分子量。通过蛋白印迹分析证实与2H2mAb结合的条带。对Glu-C蛋白酶重复表位切除实验。此时，用酸性条件释放特异性结合于2H2 mAb的ORF0657t片段，并且通过1D/LC-MS/MS在线性离子阱(LTQ，ThermoElectron)上分析。洗脱的样品显示的信号(总离子计数)在82-87分钟(40％-45％乙腈)和多电荷状态下([M+67H]67+-([M+30H]30+)的预期强度解卷积为42.628kDa。相应于该特定质量的ORFO657t的可能片段是ORFO657t的序列[012-382]，分子量为42.6kDa。
为了确定在与2H2mAb结合时ORFO657t的哪个赖氨酸残基受到保护而免受化学反应，用磺基-NHS-乙酸酯(Pierce目录号26777)，在2H2mAb存在或不存在的条件下用三个不同的实验条件进行化学标记实验。参见表11。
表11
 
实验 1 2 3
分子过量的2H2mAb 0或3 0或3 0或3
分子过量的磺基-NHS乙酸酯 25 500 75
反应温度℃ 室温 15 37
反应时间 1小时 30分钟 2小时
对于每个实验，用三种蛋白酶之一温育以0或3摩尔过量的2H2mAb产生的反应产物，得到2×9反应混合物。实验1采用GluC，AspN和胰蛋白酶。实验2和3采用GluC，AspN和糜蛋白酶。蛋白水解肽然后通过1D/LC-MS/MS进行分析。对于每个反应，基于各个肽的总离子计数(TIC)的曲线下面积，计算乙酰化和未乙酰化赖氨酸残基的比。然后在各对(具有或不具有2H2mAb)之间比较获得的比，得到相同的反应条件。对所有三个反应条件进行总体分析，鉴定ORF0657t内在ORF0657t与2H2 mAb结合时最大遮蔽的赖氨酸残基。上文描述的化学标记实验鉴定了K76、K257和可能的K442与2H2 mAb结合时受到最多的保护。抗化学标记的保护作用可能是由于直接结合。但是，所述保护作用可能是由于紧邻受保护位点的结合，或ORFO657nI内的大范围结构改变。
概言之，上文描述的实验提供了明确的证据，即ORF0657t内被2H2mAb识别的表位是构象表位。2H2 mAb识别的ORF0657t片段具有位于ORF0675t的氨基酸1-115之间的N末端，和位于ORF0657t的氨基酸323-357之间的羧基末端。尽管不能排除结合2H2 mAb时抗化学标记的保护作用受到大范围结构改变的影响，但很可能与赖氨酸76和赖氨酸275紧邻的区域参与直接的抗体相互作用。
实施例9:2H2 mAb序列鉴定
通过组合单链可变片段(scFv)组装物(Krebber et al.JIM 201(1):35-55，1997)的简并引物PCR/重叠延伸克隆过程，实现表达2H2 IgG的杂交瘤的可变轻链(Vl)和可变重链(Vh)序列的鉴定，其中通过Biacore进行与人κ轻链恒定区或scAb材料融合的可溶性scFv的高通量筛选。这使得能够通过简并引物方法建立对Vl构架区1，4和Vh构架区1，4中的突变的精密区分。
简言之，用标准方法，通过总DNA试剂盒(Total RNA KitTM(AmbionInc.))从杂交瘤细胞系纯化RNA材料。然后将该材料逆转录为cDNA，并且用作PCR中的模板，用于扩增可变区。Vl和Vh链的PCR扩增条件是基于Krebber et al.JIM 201(1):35-55，1997描述的方法。设计引物，使得能添加(Gly4Ser)4接头(SEQ ID NO:32)，其提供用于第三PCR反应的结构域，在该PCR反应中，Vl和Vh重叠，得到Vl-(Gly4Ser)4-Vh scFv。
在100μl体积中进行第一组PCR反应，用于单独扩增可变链，所述100μl体积中含有5μl cDNA反应，用于扩增Vl和Vh的正向和反向引物组各2μM，和高保真PCR主混合物。94℃下将反应变性4分钟，然后是30个循环的94℃下30秒，50℃下30秒，72℃下1分钟，并且在72℃下结束于5分钟的最终循环。凝胶纯化全长PCR产物。
为了构建全长产物，进行了第三PCR反应，以从扩增的Vh和Vl材料组装scFv。在100μl的体积中，94℃下使Vh和Vl DNA各大约20ng和高保真PCR主混合物变性5分钟，然后是3个循环的94℃下30秒，60℃下30秒，和在缺乏引物的条件下72℃下30秒。以1μM的终浓度加入修饰的PCR引物SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34，进行30个循环的94℃下30秒，60℃下1分钟，和72℃下1分钟，然后是72℃下7分钟。凝胶纯化预期的全长scFv PCR产物。
将扩增的scFv材料克隆到MP16可溶性表达载体中，进行scAb生产(Hayhurst et al.，JIM 276(1-2):185-196，2003)和序列分析。用Sfi1进行的单限制酶消耗用于定向克隆到MP16载体中。然后将具有表观全长可变重链和可变轻链的克隆在XL1-Blue细胞中表达为scAbs，并且用标准渗压休克程序从周质中纯化。简言之，使克隆在37℃下在含有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的生长培养基中以96孔形式生长过夜。将20μl过夜培养物转移到含0.1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的新培养基中，生长直到达到OD600为0.6。通过加入终浓度为0.5mM的IPTG，并且室温下以150rpm振荡下温育过夜，对细胞进行温育，从而进行scAb表达。用Qiagen Ni-NTA超速流动(superflow)自动机械程序，从细胞纯化scAbs。
为了分析每种scAb周质制剂与ORF0657t的结合活性，利用了Biacore3000表面等离子共振(SPR)仪器(Upsala，Sweden)。采用标准EDC/NHS偶联，将大约250个共振单位的0657t抗原直接固定到CM5传感器芯片的实验流动细胞表面。参照流动细胞表面在不与蛋白偶联的条件下活化和灭活。然后在表面上进行每次沉淀，测量scAb与抗原的缔合和解离。以20μl/分钟的流速单次注射10mM HCl 20秒，然后是2分钟的稳定阶段，在每次运行之间使表面再生。所有样品以双份测试，仅含缓冲液的测试用作对照。筛选95个克隆后，基于结合活性选择克隆。基于对ORF0657t的相似亲和力选择最终的2H2克隆，作为最初的杂交瘤制备的IgG材料，以及比较性序列分析。
2H2 Vh(SEQ ID NO:20)和Vl(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列如下:
2H2 Vh氨基酸序列(SEQ ID NO:20)
1   DVHLVESGPG LVAPSQNLSI TCTVSGFSLS RYGVHWVRQP PGKGLEWLGL
51  IWAGGVTIYN STLMSRLSIS KDSSKSQVFL KMNSLQIDDT AIYYCAREAS
101 RDHYFDYWGQ GTTLTVSS
2H2 Vl氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
1   DIVMTQSPAI MSASPGEKIT MTCSASSSVS YIYWYQQKSG TSPKRWIYDT
51  SKLASGVPFR FSGGGSGTSF SLTISSMEAE DAATYYCQQW SSNPLTFGAG
101 TKLEIK
加下划线的部分是CDR。基于Kabat定义鉴定CDR。编码核酸序列由SEQ ID NO:24(Vh)和SEQ ID NO:25(Vl)提供。
实施例10:2H2 IgG嵌合体表达
按照实施例9的描述，从小鼠杂交瘤克隆2H2 mAb的可变区。对可变区的序列进行PCR扩增，并且将编码重链可变区的DNA与编码IgG1恒定区的DNA符合读码框地融合，而编码轻链可变区的DNA与编码κ恒定区的DNA符合读码框地融合。下文描述了得到的抗体表达载体的克隆程序。
对可变区进行PCR扩增。在含有高保真PCR主混合物、模板体积1μl以及正向和反向引物各1μl的25μl体积中进行PCR反应。PCR条件是1个循环的94℃，2分钟，25个循环的94℃，1.5分钟；60℃，1.5分钟；72℃，1.5分钟和72℃，7分钟；4℃，直到去除并且用In-Fusion策略将前导序列符合读码框地克隆在5’末端，并且将恒定区克隆在3’末端。使用以下引物:轻链正向，5’-ACAGATGCCAGATGCGATATTGTGATGACCCAGTCT(SEQ ID NO:28)；轻链反向，5’-TGCAGCCACCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC(SEQ ID NO:29)；重链正向，5’-ACAGGTGTCCACTCGGATGTGCACCTGGTGGAGTCA(SEQ IDNO:30)；和重链反向，5’-GCCCTTGGTGGATGCCGAGGAGACTGTGAGAGTGGT(SEQ ID NO:31)。通过测序证实所有克隆的DNA序列。
从DNA序列推导的氨基酸序列是:
小鼠2H2可变区和人κ恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
1   DIVMTQSPAI MSASPGEKIT MTCSASSSVS YIYWYQQKSG TSPKRWIYDT
51  SKLASGVPFR FSGGGSGTSF SLTISSMEAE DAATYYCQQW SSNPLTFGAG
101 TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
201 SSPVTKSFNR GEC
小鼠2H2可变区和人IgG1恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:23)
1   DVHLVESGPG LVAPSQNLSI TCTVSGFSLS RYGVHWVRQP PGKGLEWLGL
51  IWAGGVTIYN STLMSRLSIS KDSSKSQVFL KMNSLQIDDT AIYYCAREAS
101 RDHYFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
可变区加下划线。
在293EBNA单层细胞中表达抗体。用基于PEI的转染试剂转染质粒。转染的细胞在Opti-MEM无血清培养基中温育，用蛋白A/G亲和层析从培养基纯化分泌的抗体。通过OD280nm确定纯化的抗体的浓度，通过LabChipTM毛细管电泳测量纯度。
通过人CMV启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号驱动轻链和重链的表达。(Shiver et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，772:198-208，1995.)前面的前导序列介导抗体分泌到培养基中。重链的前导序列是MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:26)，轻链的前导序列是MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(SEQ ID NO:27)。表达载体携带用于在293EBNA细胞中延长表达的来自EBV病毒基因组的oriP、卡那霉素选择标记的细菌序列，和大肠杆菌中的复制起点。
在293EBNA单层细胞中表达抗体。用基于PEI的转染试剂转染质粒。转染的细胞在Opti-MEM无血清培养基中温育，用蛋白A/G亲和层析从培养基纯化分泌的抗体。通过OD280nm确定纯化的抗体的浓度，通过LabChipTM毛细管电泳测量纯度。
实施例11:亲和力测定
对作为杂交瘤材料、scAb和嵌合抗体的2H2 mAb进行比较分析。克隆2H2 mAb Vh和Vl区，按照实施例10的描述表达为IgG嵌合体。将scAb克隆到MP16载体(实施例9)中，其产生具有与其融合的人K链标记的scFv。如下文的进一步描述，构建体之间的抗原亲和力没有显著差异。
为了测量结合域和抗原之间的1:1相互作用，根据是否分析了抗体片段或全长IgG，修改设立在Biacore上的实验。为了测量IgG，将IgG捕获在表面上作为配体，将ORF0657t作为分析物。为了进行抗体片段分析，将ORF0657t结合于表面，抗体片段作为分析物。这证明了最初的2H2mAb杂交瘤材料与ORF0657t抗原的亲和力在重组克隆时没有显示显著改变(表12)。通过表面等离子共振在Biacore 3000上采集数据；每种分析物以多种浓度运行，每个浓度重复两次。用BIAevaluation(Biacore，Inc.)分析数据，其中采用整个浓度系列的同时拟合。拟合参数列于表12。
表12
实施例12:基于ORF0657n的序列
存在于SEQ ID NOs:4-19中的强调的氨基酸(通过粗体和下划线表示)显示ORF0657n的氨基酸改变:
0657n(SEQ ID NO:1)
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKAVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNSRPIDFEMKKENGEQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQ
FWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTH
FNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTL
ERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
0657nC/e(SEQ ID NO:2)
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKAVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNSRPIDFEMKKENGEQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQ
FWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTH
FNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTL
ERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKNLEHHHHHH
0657nH/y(SEQ ID NO:3)
MAEETGGTNTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVE
APTSETKEAKEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKN
PAIKDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPE
IELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTK
AVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLA
PYKKAKTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKS
AITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTG
MLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPY
VEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQ
QDNSAKKEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKEND
ASSESGKDKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTT
KDVVQTSAGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKS
SEQ ID NO:4
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQ
FWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKEVKIVSSTH
FNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTL
ERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:5
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNWRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVEPARVIFTDSKPEIELGLQSG
QFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKEVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:6
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNWRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVEPARVIFTDSKPEIELGLQSG
QFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELEKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:7
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNWRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVEPARVIFTDSKPEIELGLQSG
QFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKEVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMVFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALAEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:8
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNWRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVEPARVIFTDSKPEIELGLQSG
QFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKEVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELEKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALAEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:9
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNWRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVEPARVIFTKSKPEIELGLQSG
QFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTDKDYAYIRFSVSNGTKEVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELEKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALAEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:10
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNWRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVEPARVIFTKSKPEIELGLQSG
STWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTDKDYAYIRFSVSNGTKEVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMVFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELEKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALAEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:11
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNWRPIDFEMKNDKGTQQFYHYASSVEPARVIFTKSKPIIELGLQSG
QFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTDKDYAYIRFSVSNGTKEVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMVFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELEKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALAEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:12
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNWRPIDFEMKNDKGTQQFYHYASSVEPARVIFTKSKPIIELGLQSG
QFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTDKDYAYIRFSVSNGTKEVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMVFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELEKIQDKLPEKLKAEYKKKLEOTKKALAEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDAHYVVYESVENSESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:13
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHS
APNWRPIDFEMKNDKGTQQFYHYASSVEPARVIFTKSKPIIELGLQSG
QFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTDKDYAYIRFSVSNGTKEVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMVFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELEKIQDKLPEKLKAEYKKKLEOTKKALAEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDAHYVVYESVENSESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGKRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKALY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:14
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKEHS
PNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQ
FWRKFEVYEGDKKLPVKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSST
HFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKT
LERQVYELNKLQEKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAVTEFQN
VQPTNDKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKK
YMVMETTNDDYWKDFMVEGQSVRTISKDAKNNTRTIIFPYIEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:15
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELRDAIKNPAIKDKEHS
APNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASTVKPARVIFTDTKPEIELGLQSG
QFWRKFEVYEGDKKLPVKLVSYDSVKDYAYIRFSVSNGTRAVKIVSST
HYNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKYKTEEDYKAEKLLAPYKKAK
TLERQVYELNKLQDKLPEKLKAEYKKKLDDTKKALDDQVKSAVTEF
QNVQPTNEKMTDLQDTKYVVFESVENNESVMDTFVKHPIKTGMLNG
KKYVVMETTNDDYWKDFIVEGQRVRTVSKDAKNNTRTIIFPYVEGKT
LYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSA
KKEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESG
KDKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQT
SAGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGE
ESNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:16
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
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KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIIDKDHS
APNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSGPEIELGLQSGQ
FWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFPVSNGTKAVKIVSSTH
FNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTL
ERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:17
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIIDKDHS
APNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSGPEIELGLQSGQ
FWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFPVSNGTKAVKIVSSTH
FNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTL
ERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESEENNESMMDTFVKHPIYTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:18
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIIDKDHS
APNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSGPEIELGLQSGQ
FWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFPVSNGTKAVKIVSSTH
FNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKDEEDYKAEKLLAPYKKAKTL
ERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNV
QPTNEKMTDLQDTKYVVYESEENNESMMDTFVKHPIYTGMLNGKKY
MVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLY
DAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAK
KEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGK
DKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTS
AGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEE
SNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
SEQ ID NO:19
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGT
NTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEA
KEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREGSEAIKNPAIKDK
DHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQ
SGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVS
STHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKA
KTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQ
NVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGK
KYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKT
LYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDVDKEAFTKANTDKSNKKEQQD
NSAKKEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASS
ESGKDKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDV
VQTSAGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQ
TGEESNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN
其它实施方案在以下权利要求的范围内。尽管显示和描述了一些实施方案，但可以进行多种修改，而不背离本发明的精神和范围。
序列表
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Claims (32)

1.分离的抗原结合蛋白，其包含第一可变区和第二可变区，其中所述结合蛋白结合于选自下组的靶区域：mAb 1G3.BD4靶区域、mAb2H2.BE11靶区域、mAb 13C7.BC1和mAb 13G11.BF3靶区域。
2.权利要求1的结合蛋白，其中所述靶区域是mAb 2H2.BE11靶区域，并且所述第一可变区是包含以下成分的Vh区：
第一Vh CDR，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸36-45或与氨基酸36-45有一个氨基酸不同的序列；
第二Vh CDR，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸50-65或与氨基酸50-65有一个氨基酸不同的序列；和
第三Vh CDR，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸98-107或与氨基酸98-107有一个氨基酸不同的序列。
3.权利要求2的结合蛋白，其中所述第二可变区是包含以下成分的V1区：
第一V1 CDR，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸24-33或与氨基酸24-33有一个氨基酸不同的序列；
第二V1 CDR，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸49-55或与氨基酸49-55有一个氨基酸不同的序列；和
第三V1 CDR，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸88-96或与氨基酸88-96有一个氨基酸不同的序列。
4.权利要求3的结合蛋白，其中所述结合蛋白是抗体。
5.权利要求4的结合蛋白，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.权利要求4的结合蛋白，其中所述Vh区是SEQ ID NO：20、人源化的SEQ ID NO：20或脱免疫的SEQ ID NO：20；并且所述V1区是SEQID NO：21、人源化的SEQ ID NO：21或脱免疫的SEQ ID NO：21。
7.权利要求6的结合蛋白，其中所述结合蛋白是包含以下成分的抗体：(a)重链，其包含所述Vh区和来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的人铰链区、CH1区、CH2区和CH3区，和(b)轻链，其包含所述V1区和人κ CL或人λCL。
8.权利要求3的结合蛋白，其中
所述Vh区包含：由SEQ ID NO：20的氨基酸36-45组成的所述第一Vh CDR，由SEQ ID NO：20的氨基酸50-65组成的所述第二VhCDR，和SEQ ID NO：20的氨基酸98-107组成的所述第三Vh CDR；
所述第一V1区包含：由SEQ ID NO：21的氨基酸24-33组成的所述第一V1CDR，由SEQ ID NO：21的氨基酸49-55组成的所述第二V1CDR，和由SEQ ID NO：21的氨基酸88-96组成的所述第三V1 CDR。
9.权利要求8的结合蛋白，其中所述结合蛋白是抗体。
10.权利要求9的结合蛋白，其中所述抗体是单克隆抗体。
11.权利要求9的结合蛋白，其中所述Vh区是SEQ ID NO：20、人源化的SEQ ID NO：20或脱免疫的SEQ ID NO：20；并且所述V1区是SEQID NO：21、人源化的SEQ ID NO：21或脱免疫的SEQ ID NO：21。
12.权利要求8的结合蛋白，其中所述结合蛋白是包含以下成分的抗体：(a)重链，其包含所述Vh区和来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的人铰链区、CH1区、CH2区和CH3区，和(b)轻链，其包含所述V1区和人κ CL或人λCL。
13.权利要求12的结合蛋白，其中所述重链基本由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成；并且所述轻链基本由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成。
14.包含重组基因的核酸，所述基因包含编码抗体可变区的核苷酸序列，所述抗体可变区结合于选自下组的靶区域：mAb IG3.BD4靶区域、mAb 2H2.BE11靶区域、mAb 13C7.BC1和mAb 13G11.BF3靶区域。
15.权利要求14的核酸，其中所述靶区域是mAb 2H2.BE11靶区域，并且所述可变区是包含以下成分的Vh区：
第一Vh CDR，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸36-45或与氨基酸36-45有一个氨基酸不同的序列；
第二Vh CDR，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸50-65或与氨基酸50-65有一个氨基酸不同的序列；和
第三Vh CDR，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸98-107或与氨基酸98-107有一个氨基酸不同的序列。
16.权利要求15的核酸，其中所述Vh区包含：由SEQ ID NO：20的氨基酸36-45组成的所述第一Vh CDR；由SEQ ID NO：20的氨基酸50-65组成的所述第二Vh CDR，和由SEQ ID NO：20的氨基酸98-107组成的所述第三Vh CDR。
17.权利要求14的核酸，其中所述可变区是SEQ ID NO：20、人源化的SEQ ID NO：20或脱免疫的SEQ ID NO：20。
18.权利要求17的核酸，其中所述重组基因编码抗体重链，所述重链包含所述可变区和来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的人铰链区、CH1区、CH2区和CH3区。
19.权利要求14的核酸，其中所述可变区是包含以下成分的V1区：
第一V1 CDR，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸24-33或与氨基酸24-33有一个氨基酸不同的序列；
第二V1 CDR，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸49-55或与氨基酸49-55有一个氨基酸不同的序列；和
第三V1 CDR，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸88-96或与氨基酸88-96有一个氨基酸不同的序列。
20.权利要求19的核酸，其中所述第一V1区包含：由SEQ ID NO：21的氨基酸24-33组成的所述第一V1CDR，由SEQ ID NO：21的氨基酸49-55组成的所述第二V1CDR，和由SEQ ID NO：21的氨基酸88-96组成的所述第三V1CDR。
21.权利要求14的核酸，其中所述可变区是SEQ ID NO：21、人源化的SEQ ID NO：21或脱免疫的SEQ ID NO：21。
22.权利要求17的核酸，其中所述重组基因编码抗体轻链，所述抗体轻链包含所述可变区和人κ或λCL。
23.重组细胞，包含一个或多个权利要求14-22的任一项的核酸。
24.权利要求23的重组细胞，其中所述细胞包含权利要求18的核酸和权利要求22的核酸。
25.生产包含抗体可变区的蛋白的方法，包括以下步骤：
a)在表达所述蛋白的条件下培养权利要求23的重组细胞；和
b)纯化所述蛋白。
26.生产包含抗体可变区的蛋白的方法，包括以下步骤：
a)在表达所述蛋白的条件下培养权利要求24的重组细胞；和
b)纯化所述蛋白。
27.药物组合物，包含权利要求1-13的任一项的结合蛋白和药学可接受的载体。
28.检测溶液中或细胞上OFR0657n抗原的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)给所述溶液或所述细胞提供权利要求1-13的任一项的结合蛋白；和(b)测量所述结合蛋白与所述溶液中存在的所述抗原或与所述细胞结合的能力。
29.对患者进行抗金黄色葡萄球菌感染治疗的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的权利要求1-13的任一项的结合蛋白的步骤。
30.权利要求29的方法，其中所述抗原结合蛋白与手术或异物植入联合施用。
31.生产蛋白的细胞系，所述蛋白是mAb 1G3.B3、mAb 2H2.B8、mAb 13C7.D12或mAb 13G11.C11，或与mAb IG3.B3、mAb 2H2.B8、mAb 13C7.D12或mAb 13G11.C11竞争结合ORF0657n。
32.权利要求31的细胞系，其中所述细胞系是ATCC No：PTA-7124、ATCC No：PTA-7125、ATCC No：PTA-7126或ATCC No：PTA-7127。
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