PT1178824E

PT1178824E - Vacina de célula total contendo antígeno staphylococcus aureus

Info

Publication number: PT1178824E
Application number: PT00932194T
Authority: PT
Inventors: Ali I Fattom
Original assignee: Nabi Biopharmaceuticals
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 2000-05-10
Publication date: 2007-01-31
Also published as: WO2000067785A3; CA2372633C; ES2270835T3; EP1178824A2; NZ515394A; DK1178824T3; US6537559B2; WO2000067785A2; ATE337015T1; DE60030274D1; US6294177B1; DE60030274T2; EP1178824B1; JP2002544169A; BR0010478A; CY1105744T1; AU4995000A; MXPA01011507A; AU777218B2; CA2372633A1

Description

1

DESCRIÇÃO

VACINA DE CÉLULA TOTAL CONTENDO ANTÍGENO STAPHYLOCOCCUS

ATJREUS

Cruzamento com requerimentos relacionados

Este requerimento é um requerimento continuado, sobre o U.S.C. 35 sctn.120 do requerimento com o número de série 09/102214, efectuado em 22 de Junho de 1998, que é em parte continuação e prioritário sobre os direitos do requerimento com o número de série 08/712438, agora sob a patente n° US 5.770.208.

Histórico da descoberta A presente descoberta está relacionada com o novo antígeno Staphylococcus aureus, e com um método para obter e utilizar o antígeno. O S. aureus causa várias doenças nos animais e nos humanos através de mecanismos patogénicos. As mais graves e mais frequentes destas doenças são as bacteriemias e as suas complicações em pacientes hospitalizados. Em particular, o S. aureus pode provocar infecções em feridas e infecções relacionadas com cateteres e dispositivos de prótese. Infecções graves relacionadas com bacteriemias por S. aureus incluem osteomielite, endocardite invasiva e 2 septicemia, 0 problema é agravado pela resistência a múltiplos antibióticos nas estirpes hospitalares, o que limita grandemente a escolha da terapia. Adicionalmente, o S. aureus é a causa principal da mastite em gado leiteiro e de abate, onde as infecções provocam uma grande perda de rendimentos.

Uma vacina contra S. aureus apresentaria uma solução para o problema da resistência aos antibióticos. Pelo menos oito serotipos de S, aureus foram identificados utilizando anticorpos monoclonais e policlonais para polissacáridos capsulares (CPS). Karakawa et. al. J, Clin. Microbiol. 22:445 (1985). WO 98/10788 revela o antígeno S. aureus isolado, em vez da célula total, que se liga especificamente com anticorpos ao Staphylococcus Aureus Tipo 336 depositado no ATTC 55804.

No Am. J. Vet. Research (Volume 59, n°12, 12-1998, pp.153'7-1539) existe um estudo de quais os serotipos de S. aureus que estão relacionados com a infecção por S, aureus nas vacas. A conclusão do estudo é que os serotipos 5,8 e 336 contribuem para uma grande fracçâo dos casos de mastite investigados.

Os inquéritos mostraram que aproximadamente 85% a 90% dos isolados clínicos humanos, e uma percentagem comparável, mas de alguma forma mais baixa dos isolados clínicos animais, são polissacáridos capsulares do Tipo 5 ou Tipo 8. Um indivíduo vacinado com uma vacina contendo antígenos CPS 3 do Tipo 5 ou do Tipo 8 estaria protegido contra infecções de 85% a 90% das estirpes de S. aureus clinicamente significativas, mas um risco significativo de infecção ainda existiria. Uma vacina contendo antigenos dos outros seis tipos de serotipos poderia teoricamente oferecer 100% de protecção, mas seria necessária a produção e purificação dos outros seis componentes adicionais. Isto seria impraticável de um ponto de vista prático. Por outro lado, um antígeno comum aos isolados, não tipificado como Tipo 5 ou Tipo 8, possibilitaria a produção de uma vacina contendo apenas três antigenos.

Resumo da Descoberta

Uma das finalidades desta descoberta é então, fornecer uma vacina de célula total a partir de células que transportem um antígeno que seja comum a um grande número de estirpes clinicamente significativas de S. aureus, especialmente um que seja comum a estirpes associadas com infecções em animais, particularmente o gado. □ma das outras finalidades da descoberta é o fornecimento de uma vacina de célula total para prevenção ou tratamento de infecções em animais, particularmente a mastite no gado. Outra grande finalidade da invenção é fornecer uma composição de globulina hiper-imune que contenha anticorpos direccionados contra bactérias que transportem antigenos que sejam comuns a um grande número de estirpes clinicamente significativas de S, aureus, particularmente uma que seja comum a estirpes associadas a infecções em animais, particularmente no gado. 4 É ainda outra finalidade da descoberta fornecer uma composição de globulina hiper-imune que seja eficaz no tratamento de infecções em animais, particularmente a mastite.

De acordo com estas e outras finalidades em concordância com a descoberta, é fornecida uma vacina de célula total contendo células de uma estirpe de Staphylococcus aureus que transporta um antigeno que contém hexosamina β-ligada, que não contém grupos O-acetil detectáveis por ressonância magnética nuclear através de espectroscopia e que reage com anticorpos ao ATC 55804. É também fornecida uma composição que contém a vacina de célula total, e um estéril, logo é um transportador aceitável em termos farmacêuticos. A vacina pode ser administrada a indivíduos humanos ou animais para fornecer protecção contra infecções por S. aureus. É particularmente útil para prevenir a mastite em animais.

Um agente imunoterapêutico contra S. aureusr particularmente contra a mastite em animais, pode ser preparado imunizando alvos humanos ou animais com uma composição de acordo com a descoberta, recolhendo plasma de indivíduos imunizados, e colhendo uma globulina hiper-imune humana ou veterinária que contenha anticorpos direccionados contra S. aureus recolhidos do plasma. A globulina hiper-imune contém anticorpos direccionados contra o antigeno de hexosamina β-ligada. Um método de imunoterapia contém uma etapa de administração esta globulina hiper-imune a um indivíduo humano ou animal, especialmente um animal com mastite, para prevenir ou tratar a infecção.

Outras finalidades, características e vantagens da presente descoberta irão tornar-se aparentes a partir da descrição 5 detalhada seguinte. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, mesmo indicando as configurações preferidas da descoberta, são dadas a título de ilustração apenas.

Breve descrição das ilustrações

As figuras la, lb e lc mostram o espectro NMR para cada antígeno S. aureus 336, Tipo 8 e Tipo 5, respectivamente. A figura 2 é um gráfico de barras mostrando a capacidade do conjugado IgG 336 para mediar a opsono-fagocitose de uma estirpe representativa de S. aureus que transporta o antígeno 336. A figura 3 é um gráfico de barras mostrando a capacidade da célula total do IgG para mediar a opsono-fagocitose de um a estirpe representativa de S. aureus que transporta o antígeno 336. A figura 4 é um gráfico de barras mostrando o efeito da absorção com o antígeno T5 CPS ou o antígeno 336 na capacidade da célula total do IgG para mediar a opsono-fagocitose de um a estirpe representativa de S. aureus que transporta o antígeno 336.

Descrição das configurações preferidas

Foi descoberto que virtualmente todas as estirpes de S. aureus que não podem ser tipificadas como Tipo 5 ou Tipo 8 têm um antígeno comum, aqui denotado como o "antígeno 336". Quando combinado com antígenos Tipo 5 e Tipo 8, o antígeno 6 336 representa a base para uma vacina que fornece uma protecção quase completa contra infecções por isolados S. âureus clinicamente significativos. Neste contexto, um "isolado clinicamente significativo" é um isolado que é patogénico, tanto em humanos como em animais.

Mais particularmente, a tipificação dos isolados obtidos a partir de várias fontes mostrou que aproximadamente 60% dos isolados humanos são Tipo 8, aproximadamente 30% são tipo 5 e que a quase totalidade dos 10% de isolados restantes são Tipo 336, como mostrado na Tabela 1. Menos de 1% dos isolados não são tipificáveis como um destes três tipos. TABELA 1 Tipificação dos isolados clínicos humanos Fonte Total Tipo 5 Tipo 8 Tipo 336* Não tipificável Canadiano 350 109 206 34 1 (31.5%) (58.8%) (9.7%) (0.3%) Fibrose 147 29 92 19 - - Quistica (19.7%) (62.6%) (12.2%) *Uma estirpe representativa de S. aureus que transportam o antígeno 336 foi depositada no Tratado de Budapeste com a Colecção de Culturas de Tipo Americano, e foi-lhe atribuído o n° de Adesão 55804

Notavelmente, os inventores actuais obtiveram 27 isolados clínicos humanos que não puderam ser tipificados como estirpes de S, aureus de Tipo 5 ou Tipo 8, e que foram caracterizadas como sendo estirpes resistentes à meticilina, Todas as 27 estirpes reagiram fortemente com os soros conjugados com anticorpos do antígeno 336, e por isso foram tipificáveis como estirpes que continham o antígeno 336. 7 A tipificação dos isolados da mastite bovina obtidos a partir de várias fontes mostrou que aproximadamente 23% dos isolados humanos são Tipo 8, aproximadamente 22% são Tipo 5 e que 5-4% dos isolados são Tipo 336, como mostrado na Tabela 2. Logo, 97.5% dos isolados que anteriormente não eram tipificáveis são agora tipificáveis como Tipo 336. Menos de 2% dos isolados não são tipificáveis como um destes três tipos. Por isso, uma vacina de célula total trivalente do Tipo 5, Tipo 8 e 336 é particularmente indicada para o tratamento e prevenção das infecções veterinárias por S. aureus. TABELA. 2 Tipificação dos isolados da mastite bovina Fonte Total Tipo 5 Tipo 8 Tipo 336* Não Tipificáveis Europa 102 35 33 29 5 (34.3%) (32.4%) (28.4%) (4.9%) Estados Unidos 336 59 68 207 2 (17.6%) (20.2%) (61.6%) (0.6%) Total 438 94 101 236 7 (21.5%) (23%) (53.9%) (1.6%)

Os anticorpos para o antigeno 336 não se cruzam com os polissacáridos isolados de nenhum dos S. aureus do Tipo 5, Tipo 8, Tipo 4, K73 (um estirpe variante do Tipo 5) ou S, epidermídis. O antigeno 336 é por isso específico do tipo, isto é, produz um bastonete simples apenas com o antisoro do tipo homólogo. 0 antigeno 336 pode ser obtido em quantidades recuperáveis, a partir de certos isolados de S. aureus cultivados em conformidade com os protocolos descritos doravante, numa forma substancialmente pura. Em particular, o antigeno purificado contém menos de 1% de proteínas e menos de 1% de ácidos núcleicos. Uma quantidade "recuperável" significa neste aspecto que a quantidade isolada do antigeno é 8 detectável por uma metodologia menos sensível que a marcação rádio, como o imunoensaio, e pode ser sujeita a manipulações posteriores envolvendo a transferência do antígeno per se para a solução.

Para obter o antígeno 336, um isolado 336 de acordo com a descoberta é primeiro cultivado numa placa de ágar Columbia Broth complementada com MgCl2/CaCl2 e depois transferido para um balão de partida Columbia a 2% de NaCl. Um fermentador de 50 litros que contém o mesmo veículo é inoculado com o balão de partida. As células são fermentadas durante 16 a 24 horas. Seguidamente à fermentação , as células são eliminadas com uma concentração final de y °- í. Ό de f enol para etanol (1:1) e depois centrifugadas para separar as células do sobrenadante. 0 antígeno é extraído da pasta da célula. Algum antígeno 336 está presente no sobrenadante, mas a quantidade é insignificante quando comparada com a quantidade encontrada na pasta da célula. Devido ao baixo rendimento, e ao risco de contaminação da hexose a partir do meio, a extracção do sobrenadante não é preferida.

Os tratamentos enzimáticos da pasta da célula com lisostafina, Dnase, Rnase e protease, seguidos de precipitação sequencial com CaCl2/etanol frio a 25-75%, resultam numa extracção de antígeno em bruto. 0 material em bruto é novamente dissolvido em água, dialisado e líofilizado. 0 material liofilizado é dissolvido numa solução tampão e carregado para uma coluna de separação equilibrada com a mesma solução tampão. A coluna é lavada com uma solução tampão de 0.15 M Nacl e depois eluída com um gradiente de 0,15-0.4 M NaCl. A maioria do antígeno de acordo com a descoberta elui entre 0.32 e 0.35 M NaCl. As 9 partes que contém o antígeno são agrupadas, dialisadas, concentradas e liofilizadas. A separação pode ser repetida para obter uma melhor purificação. 0 antígeno em bruto é tratado com lisozima e purificado por tamanho numa coluna adequada e as fracções 336 positivas são então agrupadas, concentradas, dialisadas e liofilizadas. A análise do antígeno 336 purificado por cromatografia de gás liquefeito (GLC) mostra a presença da glucosamina como o componente glicosilado principal. Isto é confirmado pela análise do açúcar num sistema Dionex. A espectroscopia 1H-NMR do antígeno 336 indica a presença da hexosamina β-ligada como um componente principal dos carbohidratos. 0 antígeno contém adicionalmente um componente que é responsável por uma carga negativa observada, mostrada pelo antígeno 336.

Uma comparação dos espectros NMR para cada um dos antígenos S. aureus do Tipo 336, Tipo 5 e Tipo 8, como mostrado nas Figuras la, lb e lc, confirma que o antígeno 336 é quimicamente distinto de ambos os antígenos S. aureus do Tipo 8 e Tipo 5. As estruturas dos antígenos polissacáridos dos Tipos 5 e 8 foram elucidadas por Moreau et al., Carbohydr. Res. 201:285 (1990); e Fournier et al., Infect. Imm. 45:87 (1984). Ambas têm FucNacp na sua unidade de repetição assim como ManNacA que pode ser utilizado para introduzir um grupo sulfidril. As estruturas são as seguintes: 10

Tipo 5: -> 4)-β-D-ManNAcAp(1 4)-α-L-FucNAcp (1 -->3)-β-D-FucNAcp (1- 3

I OAc

Tipo 8: -> 3) -JB-D-ManNAcAp (1- ->3) -α-L-FucNAcp (1- ->3) -J3-D- FucNAcpd-4 OAc

Por contraste, o componente carbohidrato principal do antígeno 336 ê a hexosamina β-ligada. A indução da bacteriemia em animais de laboratório requer números ex.tremamente grandes de organismos ou alguma manobra prévia para diminuir a resistência do hospedeiro, A fagocitose in vitro, no entanto, pode ser estudada como uma correlação da imunidade protectora in vivo. Neste modelo, a capacidade dos anticorpos monoclonais e policlonais específicos do antígeno 336 para opsionízarem S. aureus in vitro é medida pela fagocitose, de acordo com o método descrito em Kojima e tal., Infect. Dis. Immun. 58:2367-2374 {1990) . 11

Os anticorpos induzidos por uma vacina com o antigeno 336 facilitam a fagocitose específica de tipo. Os ensaios de fagocitose in vitro indicam que os anticorpos para o antigeno 336 são protectores contra infecção por estirpes de S, aureus que transportem o antigeno 336, Vacinas baseadas em antigenos Tipo 5 e Tipo 8 mostraram anteriormente serem protectoras contra infecções por estirpes de Tipo 5 e Tipo 8 respectivamente, de S. aureus. Fattom et al.m Inf. and Iurni. 58:2367-2374 (1990) e loc. citr 64:1659-1665 (1996). Uma vacina baseada numa combinação de antigenos Tipo 5, Tipo 8 e 336 pode ser utilizada para protecção contra infecções da maioria das estirpes clinicas de S. aureus,

Preferivelmente, uma composição do antigeno 336 ou de células totais contendo o antigeno 336 de acordo com a presente descoberta "consiste essencialmente no" antigeno 336, ou células que contenham o antigeno 336. Neste contexto, a frase "consiste essencialmente em" significa que a composição não contém qualquer material que interfira com a elicitação de uma resposta imune ao antigeno 336 (e a outros antigenos, se presentes) quando a composição é administrada a um indivíduo como vacina, ou com o emparelhamento antígeno-anticorpo característico de um ensaio diagnóstico quando o antigeno é utilizado em diagnósticos. Numa configuração, a composição contém antigenos S. aureus Tipo 5, Tipo 8 e Tipo 336.

Os antigenos de acordo com a descoberta são úteis na produção de ensaios de diagnóstico para detectar a presença de antigenos S. aureus e/ou anticorpos S. aureus numa amostra. 0 antigeno S. aureus 336, ou o anticorpo específico ao antigeno S. aureus, sozinho ou em combinação 12 com o antígeno ou anticorpo para um ou ambos os antigenos S. aureus do Tipo 5 e do Tipo 8, é misturado com uma amostra suspeita de conter antigenos ou anticorpos S, aureus e monitorizado para verificar ligações antígeno-anticorpo,

Por exemplo, o antígeno ou anticorpo pode ser utilizado num ensaio imunoabsorvente com ligação enzimática (ELISA), em que ou o antígeno ou o anticorpo são ligados a uma fase sólida e um par enzima-anticorpo ou enzima-antígeno é utilizado para detectar e/ou quantificar os anticorpos ou antigenos presentes numa amostra. Alternativamente, um ensaio western blot pode ser utilizado onde um antígeno(s) separado e solubilizado é preso a papel nitrocelulósico. O anticorpo é então detectado por um enzima ou uma anti-" imunoglobulina (Ig) conjugada, tal como a peroxidase-Ig de rábano conjugada, incubando o papel de filtro na presença de um substrato precipitável ou detectável. Os ensaios western blot têm a vantagem de não requererem uma pureza maior que 50% para os antigenos desejados. Descrições das técnicas de ELISA e western blot encontram-se nos Capítulos 10 e 11 de Ausubel, et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (1988), sendo que os conteúdos integrais dos mesmos estão aqui integrados para referência.

Para utilização numa vacina, ou na estimulação da síntese de anticorpos específicos do tipo 336 em indivíduos imunizados, é preferível conjugar o antígeno 336 purificado com um imunotransportador, geralmente uma proteína ou um polipeptídeo, para melhorar a interacção entre as células T e B para a indução de uma resposta imune contra o antígeno. Isto é particularmente importante para vacinas destinadas à 13 utilização em pacientes com resistência reduzida. Um imunotransportador aumenta a imunogenicidade tanto para a imunização activa como para a preparação de antisoros altamente titerados em voluntários para imunização passiva. Imunotransportadores adequados de acordo com a presente descoberta incluem toxóide tetânico, toxóide diftérico, Exotoxina A Pseudomonas aeruginosa ou os seus derivados, estirpes mutantes não tóxicas com produção recombinada de exotoxina A, como descrito, por exemplo, em Fattom et al.f Inf. And Imm, 61:1023-1032 (1993), assim como outras proteínas geralmente utilizadas como imuno-transportadoras.

Preferivelmente, o antígeno ou antígeno conjugado é administrado sem um adjuvante de forma a evitar uma toxicidade induzida pelo adjuvante. Se for utilizado um adjuvante, é preferível utilizar um que promova os anticorpos IgC protectores dos sub-tipo 2. Os adjuvantes típicos incluem o adjuvante completo de Freund (CFA) e o adjuvante incompleto de Freund (IFA). O sulfato de dextrano tem sido mostrado como um potente estimulador do anticorpo IgC2 contra os antígenos estafilocócicos da superfície da célula, e é também adequado como adjuvante. A presente descoberta também se refere à utilização do antígeno 336 para a produção de anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais (ratos ou humanos) que se ligam às, ou neutralizam as estirpes de S, aureus que transportam o antígeno 336. Os protocolos para a produção destes anticorpos estão descritos em Ausubel, et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, NY). Chapter 11; em METHODS OF HYBRIDOMA FORMATION 257-271, Bartal & Hirshaut 14 (eds.), Humana Press, Clifton, NJ (1988); em Vitetta et al. , Immunol, Rev. 62:159-83 (1982); e em Raso, Immumol„ Rev. 62:93-117 (1982). 0 inoculo para a produção de anticorpos policlonais é tipicamente preparado através da dispersão do imuno-transportador do antígeno num diluente fisiologicamente tolerável do tipo salino, para formar uma composição aquosa. Uma quantidade imuno-estimuladora de inoculo, com ou sem adjuvante, é administrado a um mamífero e o mamífero inoculado é então mantido por um período de tempo suficiente para o antígeno induzir anticorpos protectores do antígeno anti-336. Doses aumentadas do imuno-transportador do antígeno podem ser utilizadas em indivíduos que ainda não estejam preparados para responder ao antígeno.

Os anticorpos podem incluir preparações de anticorpos a partir de uma variedade de animais geralmente utilizados, ex. , cabras, primatas, burros, suínos, coelhos, cavalos, porcos da Guiné, ratazanas e ratos, e mesmo anticorpos humanos após uma selecção, purificação e fraccionamento apropriados. Anti-soro animal também pode ser criado inoculando os animais com estirpes eliminadas com formalina de S. aureus 336, através de métodos convencionais, sangrando os animais e recuperando soro ou plasma para processamento posterior.

Os anticorpos induzidos desta forma podem ser colhidos e isolados dentro do limite desejado através de técnicas bem conhecidas, tal como o fraccionamento alcoólico e a cromatografia de coluna, ou através da cromatografia de imunoafinidade; isto é, ligando o antígeno a um conjunto de colunas cromatográficas como o Sephadex™, passando o anti- 15 soro pela coluna, retendo por isso os anticorpos específicos e separando as outras imunoglobulinas (IgG) e contaminantes, e depois recuperando os anticorpos purificados por elução com um agente caotrópico, seguido opcionalmente de purificação posterior, por exemplo, através da passagem por uma coluna de antígenos ligados pelo grupo sanguíneo ou outras espécies não patogénicas. Este procedimento poderá ser preferido quando se isolem os anticorpos desejados a partir do soro ou plasma de humanos que tenham desenvolvido uma titulação de anticorpos contra o patógeno em questão, logo assegurando a retenção de anticorpos que sejam capazes de ligar o antígeno, Podem ser utilizados em preparações para imunização passiva contra 336 estirpes de S. aureus.

Uma composição de anticorpos monoclonais contém, dentro dos limites detectáveis, apenas uma espécie de local de combinação de anticorpos capazes de efectivamente ligar ao antígeno 336, Os anticorpos adequados de forma monoclonal podem ser preparados utilizando tecnologia de hibridoma convencional,

Para formar hibridomas a partir dos quais, uma composição de anticorpos monoclonal da presente descoberta é formada, um mieloma ou outra linha celular auto-prevalecente é fundida com linfócitos obtidos a partir do sangue periférico, gânglios linfáticos ou do baço de um mamífero hiper-imunizado com o antígeno 336. É preferível que a linha celular do mieloma seja da mesma espécie que os linfócitos. Os esplenócítos são fundidos com as células do mieloma utilizando polietileno glicol 1500. Os híbridos fundidos são seleccionados pela sua sensibilidade ao ΗΛΤ (enzima). Os hibridomas que segregam as moléculas dos 16 anticorpos desta descoberta podem ser identificados utilizando um ensaio ELISA.

Um baço de rato Balb/C, sangue periférico humano, gânglios linfáticos ou esplenócitos são os materiais preferidos para utilização na preparação de murina ou hibridomas humanos. Mielomas de rato adequados para utilização na presente descoberta incluem as linhas celulares sensíveis HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina), sendo um rnieloma preferencial o P3X63-Ag8.653, 0 parceiro de fusão preferencial para a produção de anticorpos humanos monoclonais é o SHM-33, um heteromieloraa disponível a partir da ATTC, Rockville, fabricado sobre a designação de CRL 1668.

Uma composição de anticorpos monoclonais da presente descoberta pode ser produzida iniciando uma cultura monoclonal de hibridomas contendo um meio de nutrição que contenha um hibridoma que segregue as moléculas do anticorpo da especificidade apropriada. A cultura é mantida debaixo de condições e durante um período de tempo suficiente para o hibridoma segregar as moléculas do anticorpo para o meio. 0 meio contendo anticorpos é então recolhido. As moléculas do anticorpo podem ser posteriormente isoladas através de técnicas bem conhecidas. Os meios úteis para a preparação destas composições são ambos bem conhecidos na especialidade e estão disponíveis comercialmente, e incluem meios de cultura sintéticos, ratos geneticamente iguais e similares. Um meio sintético exemplar é o meio essencial Dulbecco Minimal complementado com 20% de soro fetal de vitela. Uma estirpe de ratos geneticamente iguais exemplar é a Balb/c. 17

Outros métodos para preparação de composições de monoclonais de anticorpos também estão contemplados, como as fusões inter-espécies, visto que é primariamente a especificidade do antígeno dos anticorpos que afecta a sua utilidade na presente descoberta. Os linfócitos humanos obtidos a partir de indivíduos infectados podem ser fundidos com uma linha celular do mieloma humano para produzir hibridomas que podem ser listados para a produção de anticorpos que reconheçam o antígeno 336. Mais desejável neste aspecto, no entanto, é um processo que não acarrete a utilização de uma amostra biológica de um indivíduo humano infectado. Por exemplo, um indivíduo imunizado com uma vacina como descrito doravante pode servir como fonte de anticorpos utilizados adequadamente na composição de anticorpos dentro da presente descoberta.

Numa configuração particularmente preferida, os anticorpos monoclonais são produzidos para o antígeno 336 utilizando métodos similares aos descritos para os anticorpos específicos-tipo para os S. aureus Tipo 5 e Tipo 8. Os anticorpos monoclonais purificados são caracterízados por ensaios de aglutinação bacteriana utilizando uma recolha de isolados clínicos.

As composições de anticorpos monoclonais e policlonais produzidas de acordo com a presente descrição podem ser utilizadas pela imunização passiva para induzir uma resposta imune para a prevenção ou tratamento de infecções por estirpes de S. aureus que transportem o antígeno 336. Neste contexto, a preparação do anticorpo pode ser uma composição policlonal. Esta preparação policlonal inclui anticorpos que se ligam ao antígeno 336, e adicionalmente pode incluir anticorpos que se liguem aos antígenos que 18 caracterizam as estirpes Tipo 5 e Tipo 8 de S. aureus. O componente do anticorpo policlonal pode ser um anti-soro policlonal, preferencialmente purificado por afinidade, de um animal que tenha sido posto à prova com o antigeno 336, e preferencialmente também com antigenos de Tipo 5 e Tipo 8, Alternativamente, uma mistura "oligoclonal fabricada" pode ser utilizada, que é uma mistura de anticorpos monoclonais para o antigeno 336, e anticorpos monoclonais para antigenos do Tipo 5 e/ou Tipo 8.

Em ambos os tipos de misturas, pode ser vantajoso ligar quimicamente anticorpos para formar uma molécula poli-específica simples capaz de se ligar ao antigeno 336 e, a um ou ambos os antigenos do Tipo 5 e Tipo 8, Uma forma de efectuar esta ligação é fazer fragmentos híbridos bivalentes F(ab")2 misturando dois fragmentos diferentes F(ab' )2 produzidos, por exemplo, pela digestão da pepsina de dois anticorpos diferentes, quebra redutora para formar uma mistura de fragmentos Fab', seguida de uma reformação oxidativa das ligações dissulfídicas para produzir uma mistura de fragmentos F(ab’)2 incluindo fragmentos híbridos contendo uma porção Fab' específica a cada um dos antigenos originais. Os métodos para a preparação de tais fragmentos híbridos de anticorpos estão descritos em Feteanu, LABELED ANTIBODIES IN BIOLOGY AND MEDICINE 321-23, McGraw-Hill Int' 1 Book Co. (1978); Nisonoff, et al.r Arch Biochem. Biophys. 93:470 (1961); e Hammerling, et al., J. Exp, Med. 128:1461 (1968); e na patente U.S n° 4.331.647.

Outros métodos conhecidos dentro da especialidade para fazer fragmentos bivalentes que são totalmente heteroespecíficos, por exemplo, a utilização de junções bi-funcionais para juntar fragmentos quebrados. As moléculas 19 recombinantes são conhecidas por incorporarem as cadeias leves e pesadas de um anticorpo, por exemplo, de acordo com o método de Boss et al„, patente U.S, n° 4.816.397. Métodos análogos para produção de moléculas de ligação sintéticas ou recombinantes tendo as caracterlsticas dos anticorpos, estão incluídos na presente descoberta. Mais de dois anticorpos mono-específicos ou fragmentos de anticorpos podem ser ligados utilizando vários conectores conhecidos pela especialidade.

Um componente de anticorpo produzido de acordo com a presente descoberta pode incluir anticorpos totais, fragmentos de anticorpos, ou sub-fragmentos. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas de qualquer classe, por exemplo, IgC, IgM, IgA, IgD, IgE, anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com antígenos duplos ou múltiplos ou epítopos específicos, ou fragmentos, por exemplo, F(ab')2, Fab', Fab e similares, incluindo fragmentos híbridos e adicionalmente incluem qualquer imunoglobulina ou qualquer proteína natural, sintética ou geneticamente modificada que se comporta como um anticorpo ligando-se a um antígeno específico para formar um complexo. Em particular, as moléculas Fab podem ser expressas e montadas num hospedeiro geneticamente modificado como E. coli. Um sistema vectorial lambda está então disponível para expressar uma população de Fab's com uma diversidade potencial igual a, ou excedendo a do indivíduo que originou o anticorpo predecessor. Veja Huse, W.D., et al., Science 246:1275-81 (1989).

De acordo com a presente descoberta o antígeno 336 pode ser o ingrediente activo numa composição, que contenha posteriormente um transportador farmaceuticamente aceitável 20 para o ingrediente activo, o qual pode ser utilizado como vacina para induzir uma resposta celular imune e/ou produção in vivo de anticorpos que combatam a infecção por S. aureus. Neste contexto, um transportador farmaceuticamente aceitável é urn material que possa ser utilizado como veículo para administração de um medicamento porque o material é inerte ou de outro modo aceitável na prática médica, sendo também compatível com o agente activo, no contexto da administração de vacinas. Adicionalmente a um excipiente adequado, um transportador farmaceuticamente aceitável pode conter aditivos de vacinas convencionais como agentes diluentes, adjuvantes, antioxidantes, preservantes e solubilizantes.

Numa configuração alternativa, as células que transportam o antígeno 336 são utilizadas numa vacina de célula total. Neste contexto, uma "vacina de célula total" inclui vacinas feitas eliminando a totalidade da bactéria, lisados bacterianos ou derivados da bactéria total. As células que transportam o antígeno 336 podem ser identificadas e seleccionadas para utilização na vacina de célula total, utilizando anticorpos para uma estirpe que se saiba que transporta o antígeno 336, e mais preferencialmente utilizando anticorpos monoclonais para o antígeno isolado como descrito doravante. Neste contexto, uma experiência de aglutinação em lâmina simples onde os anticorpos para o antígeno 336 misturados com as células podem ser utilizados. A estirpe depositada ATC.C 55804 é uma estirpe representativa do S. aureus que transporta o antígeno 336, e pode ser utilizada para produzir anticorpos úteis na identificação de outras estirpes que transportam o antígeno 21 336. Não é, no entanto, necessário utilizar a estirpe depositada de forma a produzir ou a vacina de célula total ou anticorpos úteis em tratamento ou prevenção de infecções por S, aureus ou em identificar outras células que transportem o antigeno 336. ATCC 55804 apenas fornece um meio imunológico de identificar essas células.

Como descrito para a vacina antígena purificada em cima, a vacina de célula total também contém um transportador farmaceuticamente aceitável. A vacina de célula total também pode conter opcionalmente aditivos de vacinas convencionais como agentes diluentes, adjuvantes, antioxidantes, preservantes e solubilizantes. Numa configuração preferida, a vacina de célula total contém células ou derivados de células que transportam o antigeno 336, em adição a células que transportam os antigenos Tipo 5 e Tipo 8.

As vacinas de acordo com a descoberta podem ser administradas a um indivíduo ainda não infectado com 5. aureus, induzindo por isso uma resposta imune protectora contra S. aureus (humoral ou celular), particularmente uma resposta mastite-protectora, nesse indivíduo. Alternativamente, as vacinas dentro da presente descoberta podem ser administradas a um indivíduo onde a infecção por S. aureus já tenha ocorrido mas está num estádio suficientemente precoce, para que a resposta imune produzida para a vacina iniba efectivamente um aumento posterior da infecção.

Numa configuração preferida, a vacina de célula total é administrada a uma fêmea animal para prevenir ou tratar a ocorrência de mastite. Neste contexto é administrada a fêmeas consideradas em risco de desenvolvimento de mastite, 22 por exemplo, a animais utilizados num programa de criação, e mais particularmente aos animais com uma história anterior de mastite. A vacina de célula total é particularmente útil na prevenção da mastite num animal de uma quinta, como uma vaca ou uma porca, estando no entanto também indicada para utilização em animais domésticos, como cadelas e gatas.

De outro ponto de vista, a vacina da presente descoberta pode ser administrada a um indivíduo que depois age como fonte de imunoglobulina, produzida em resposta ao desafio da vacina específica ("globulina hiper-imune"), que contém anticorpos dirigidos contra S. aureus, Um indivíduo então tratado doaria plasma de onde a globulina seria obtida, através da metodologia de fraccionamento do plasma, e administrada a outro indivíduo de modo a ganhar resistência contra ou, a tratar infecção por S. aureus. As globulinas hiper-imunes de acordo com a descoberta são particularmente úteis para indivíduos imuno-comprometidos, para indivíduos que estejam a fazer tratamentos invasivos ou onde o tempo não permita a um indivíduo produzir os seus próprios anticorpos em resposta à vacinação. As globulinas hiper-imunes produzidas para a vacina de célula total são particularmente úteis no tratamento de infecções por S. aureus.

Similarmente, os anticorpos monoclonais ou policlonais anti-S. aureus produzidos de acordo com a presente descoberta podem ser conjugados numa imunotoxina, e administrados a um indivíduo onde a infecção por S. aureus já tenha ocorrido mas não se tenha espalhado grandemente. Neste ponto, o material anticorpo produzido seguindo a 23 presente descrição seria administrado num transportador farmaceuticamente aceitável, como definido doravante. A presente descoberta é descrita a seguir com referência aos seguintes exemplos ilustrativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Fermentação de S. aureus

Uma estirpe de S, aureus que transporta o antígeno 336 foi cultivada numa mistura Columbia complementado com Nacl a 2% num fermentador de 80 litros contendo 60 litros de mistura veiculo a 37°. A fermentação começou com um litro de uma cultura de sementes com 16 horas de vida. As células foram criadas com agitação de 200 rotações por 24 horas, para um Aesonm de 20.

As células para serem usadas como uma vacina para preparar o anti-soro de célula total foram preparadas com formalina durante a noite à temperatura ambiente. As células para purificação do antígeno foram eliminadas adicionando uma solução fenol-etanol (1:1 vol/vol) ao fermentador para uma concentração final de 2%, e mexendo lentamente durante 2 horas a uma temperatura de 15-20°. Não foram detectadas células viáveis depois deste tratamento. As células foram então colhidas por centrifugação a 14.500 rotações por grama e guardadas a -70° até à sua utilização.

Aproximadamente 800-900 gramas de pasta celular (peso bruto) foram obtidos a partir da fermentação de 60 litros. Para preparação das células a serem usadas na preparação da vacina de célula total, estirpes de S. aureus que transportam o antígeno 336, o antígeno Tipo 5 e o antígeno 24

Tipo 8 foram separadamente cultivadas numa mistura Columbia complementada com MgCls/CaCla a 37° durante 18-20 horas, enquanto eram agitadas (200 rotações) , As células foram testadas por aglutinação laminar para reactividade negativa com o anti-soro da estirpe S. aureus Wood, e depois foram incubadas com formalina 3% durante 24 horas. AS células foram lavadas 3 vezes com PBS, tipificado com anticorpos específicos S.. aureus (T5, T8 ou 336) e anti-soro da estirpe Wood e ajustadas a OD apropriada a 540nm.

Exemplo 2: Preparação da Vacina de Célula Total e Anti-soro

As células preparadas com formalina do Exemplo 1 foram ajustadas a ODs4on.m=l e combinadas com salino fisiológico para produzir uma vacina. Não foi utilizado adjuvante. A vacina foi injectada por via intra-venosa em coelhos. Os coelhos foram picados em intervalos semanais e foi recolhido soro de célula total positivo e agrupado. A IgG foi purificada a partir do soro da célula total por uma coluna de afinidade da proteína G. 0 material purificado continha 23 mg/ml de IgG total (scan de 280UV) e substancialmente menos IgG específica do antígeno 336. Exemplo 3 : Purificação do Antígeno 336 A pasta celular foi suspensa com 0.5 g (peso molhado) por ml a 0.05 M Tris-2mM MgSo4, pH 7.5. Foi adicionada Lisostafina ( 100 a 150 pg/ml) e incubada a 37° durante 3 horas com mistura. Após isso, Dnase e Rnase foram adicionadas para concentrações finais de 50 pg/ml cada, e a 25 incubação foi continuada por mais 4 horas. A mistura da reacção foi precipitada sequencialmente com 25 e 75% de etanol na presença de 10 mM de CaCl2. O precipitado de 75% de etanol foi aglomerado por centrifugação a 12000 rotações por grama durante 30 minutos, ou a rotações mais baixas durante um período maior. 0 sobrenadante foi transferido para tubagem de diálise. A mistura da reacção foi filtrada através de uma membrana com poros de 0.45 pm e precipitada sequencialmente com 25 e 75% de etanol na presença de 10 mM de CaCl2. O precipitado de 75% de etanol foi dialisado extensivamente contra água a 3 e 8o C e foi seco por congelação. O pó foi dissolvido a 0.2 M NaCl/0.05 M Tris HC1, pH 7.0. O material em bruto resultante foi carregado para uma coluna Q Sepharose a 0.2 M NaCl/0.05 M Tris HCl, pH 7.0, e eluído com um gradiente linear de 0.2-0.4 NaCl. AS fracções que continham antígeno, detectadas por precipitação com anti-soro no Exemplo 2, foram agrupadas, dialisadas e secas por congelação. A maior parte do antígeno eluiu a 0.32-0.35 M NaCl/0.05 M Tris HCl. 0 antígeno bruto desta forma obtido foi tratado com lmg de lísozima por lOmg de antígeno bruto em 10 mM de CaCl2 para digerir qualquer contaminação residual por peptidoglicano. 0 antígeno bruto tratado com lisozima foi novamente purificado numa coluna de filtração por gel Sephacryl S-300 com 0.2 M NaCl/PBS Ix para obter um antígeno substancialmente puro. Todo o material reactivo foi filtrado utilizando o anti-soro total.

Exemplo 4 : Caracterização do Antígeno 26 A análise do antígeno 336 purificado através de cromatografia de gás liquefeito (GLC} revela a presença de glucosamina como um componente glicosilado principal. Isto é confirmado pela análise ao açúcar no sistema Dionex. A espectografia 1H-NMR do antígeno 336 mostra um protão anomérico a 4.751 ppm, correspondente à hexosamina β-ligada. Adicionalmente, o espectro NMR mostra sinais bem separados em 4.229 ppm {2h}, 3.649 ppm {Ih}, 3.571 ppm (2H) e 2.19 ppm (3h), Sinais correspondentes a grupos O-acetil não foram encontrados. Isto indica a ausência de 0™ acetilação, e é claramente distinguida dos 20™80% de 0~~ acetilação èncontrados em outros isolados S. aureus do Tipo 5 e do Tipo 8. 0 espectro 13C-NMR mostra um sinal na região anomérica em 102.396 ppm. Isto confirma a presença do monossacárido como componente principal. Outros sinais do espectro aparecem em 81,865, 76.641, 71.841, 71.051, 70,775, 67.665, 67.142, 61.716, 56.552, 50.355, 43.408, e 23,246 ppm respectivamente. A mobilidade do antígeno purificado em imuno-electroforese (IEF) indica a presença de grupos com carga negativa. O antígeno purificado não contém açucares neutros como detectado pelo ensaio com fenol sulfúrico. 0 Kd do antígeno purificado foi 0,3 em coluna Superose 12 HR, que é um material pequeno em comparação com o Tipo 5 (Kd de 0.017), Tipo 8 {Kd de 0.061) e ácido teicóico (Kd de 0.18).

Exemplo 5: Conjugados Antígeno - Imuno-transportador O antígeno purificado foi derivatizado com 0.5m de ácido adípico dihidrazido (ADH) 27

Usando 100 mM l-etíl-3- {3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) a pH 5.6. A percentagem de derivatízação foi alcançada entre 2% e 7% (w/w).Q antígeno purificado derivatizado foi conjugado para um estirpe mutante, não tóxica e recombinantemente produzida de Pseudomonas aeruginosa exotoxina A utilizando 50 mM EDC a 1:1 (antígeno: proteína) , como descrito em Fattom et al. , Inf. And Imm. 60: 584-589 (1992). 0 rendimento da conjugação foi de 50-70%, determinado pela medição da proteína. O Kd do conjugado foi 0.2 na coluna Superose 12 HR. O conjugado foi injectado em coelhos com adjuvante (CFA seguido de IFA) a um rácio de 1:1. Sangramentos positivos foram combinados e IgCs foram purificadas numa coluna de proteína G. O conjugado IgG criado mostrou identidade com anticorpos induzidos pela célula total IgG contra o antígeno num ensaio de imuno-difusão. O soro do conjugado IgG purificado mostrou conter 12.2 mg/ml de IgG total através de um scan de 280 nm UV e 0.7 mg/ml de IgG específica de antígeno através de ELISA. 0 soro de célula total, IgG de célula total e IgG conjugada foram utilizados em ensaios de opsono—fagocitose em modelos animais.

Exemplo 6: Ensaios de Opsono-Fagocitose in vitro com anticorpos para vacina conjugado/antígeno

Leucócitos polimorfo-nucleares (PMN) foram obtidos a partir de células HL-60 ajustadas a uma concentração de 1 x 107 células/ml em MEM complementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). S. aureus foi criado durante a noite numa 28 mistura Columbia complementada com MgCl2/CaCl2- A concentração de bactérias foi ajustada espectrofotometricamente a um OD de 0.02 a 540 nm {4 x 106 células/ml) depois ajustada a 1 x 106 células/ml em MEM complementado com 10% de soro fetal de bovino. O antigeno especifico purificado ou IgGs de controlo não reactivas foram adicionados para facilitar a opsonização por PMNs. Complemento de coelho bebé, diluído 1:8 em MEM complementado com 10% de FBS foi usado como controlo negativo. A mistura da reacção continha 25 μΐ de S. aureus {concentração lx 106 células/ml), 25 μΐ PMNs (concentração Ix 10' células/ml), 25 μΐ de complemento, 100 μΐ de soro ou anticorpos e MEM/10% FBS suficiente para trazer o volume total da reacção para 250 μΐ. À hora 0, hora 1 e hora 2, 25 μΐ da amostra foram diluídos em série. 25 μΐ das diluições de 10”2, 10 ~3,10 ~A e 10 ~5 foram colocadas em placas de ágar TSA, e incubadas durante a noite a 37°C.

Os resultados estão demonstrados na Figura 2, e mostram que o anticorpo a conjugar medeia a opsono-fagocitose de uma estirpe representativa de S. aureus que transporta o antigeno 336. Os resultados estão reportados em percentagem de eliminação por quantidades de antigeno 336 específico IgG variando entre 300 pg e 128 pg. Para comparação, a percentagem de eliminação por uma quantidade equivalente de IgG não reactiva também está reportada. PMNs mais complemento foi utilizado como controlo.

Exemplo 7: Ensaios de Opsono-Fagocitose in vitzo com Anticorpos para a Vacina de Célula Total 29

Para avaliar a eficácia da vacina de célula total contra S. aureus 336, as IgGs de célula total de S. aureus 336 foram testadas pelo seu papel na mediação da eliminação opsono-fagocitótica das estirpes de S. aureus 336 num ensaio opsono-fagocitótico de sangue total. As células de S. aureus 336 foram criadas e ajustadas para 2 x 106 cfu/ml, como descrito no Exemplo 1. Suspensão bacteriana (100 μΐ), salino (100 μΐ) e solução com anticorpo (100 μΐ) foram adicionados a 700 μΐ de sangue humano citrado. Depois de misturar, uma alíquota de 25 μΐ foi retirada e laminada para obter contagens bacterianas de tempo zero. A mistura foi então incubada com agitação a 37°C durante uma hora e laminada. Os resultados estão impressos na Figura 3, e mostram uma redução de 2 unidades na formação de colónias em presença de IgGs imunes em sangue total citrado, como comparado com IgGs não-imunes. A actividade das IgGs imunes foi a mesma até com uma diluição 1:4, indicando que a complementação com sangue total de coelho com anticorpos gerados contra o isolado de S. aureus 336 produziu um forte efeito opsono-fagocitócico contra estirpes de S. aureus 336.

Exemplo 8: Eliminação opsono-fagocítica in vitro mediada por anti-soro hiper-imune de célula inteira A importância dos anticorpos específicos para S, aureus 336 no anti-soro de coelho hiper-imune de célula total dos S, aureus 336 para mediar a eliminação opsono-fagocítica das bactérias S. aureus 336 foi testada pela absorção de anticorpos específicos 336 a partir do anti-soro de coelho 30 hiper-imune de célula total com antígeno 336 e antígeno T5 CPS. Soro de coelho não-imune foi usado como controlo. Grânulos congelados da estirpe S. aureus 336 (91-14) foram inoculados com 5 mL de mistura Columbia MgCl2/CaCl2 e incubados durante 16 horas a 37°C com agitação de 200 rotações. Para o ensaio, as células foram então ajustadas com salino para uma concentração aproximada de 2xl06 CFU/ml (OD540-2}. Foram usados PMNs (células HL-60) numa concentração de lxlO7 células/ml em meio de opsonização lx MEM [Mínimum Essential Médium, com sal de Earle, sem glutamato, GIBCO-BRL], complementado com 0.1% de gelatina [Sigma Chemicals], Soro de coelho diluído a 1:100 com meio de opsonização foi usado como fonte complementar. A absorção do anti-soro de célula total de S. aureus 336 (inactivo por calor durante 30 minutos a 56°C.) com antígeno S. aureus 336 e antígeno T5 CPS efectuou-se da seguinte forma. Os antígenos foram dissolvidos em dH20 a concentrações entre 250pg/mL e 15,6pg/mL. Soluções de antígeno (250 μ1) com concentrações diferentes dos antígenos foram misturadas com 250μ1 de anti-soro de célula total de S, aureus 336 diluído a 1:250. A mistura da reacção foi primeiro incubada durante 2 horas a 37°C e depois durante a noite a 4°C. As amostras foram depois centrifugadas a 14000 rotações por minuto numa centrifugadora Eppendorf 5415 â temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram então usados no ensaio de opsonização. Para iniciar o ensaio, 50μ1 de bactérias, 50μ1 de complemento diluído, 50μ1 de células HL-60 ajustadas e 50μ1 de anti-soro foram adicionados por poço em micro lâminas de titulação de fundo redondo em poliestireno (Corning Glass Works). Depois da mistura, uma alíquota de 25μ1 foi 31 retirada para determinação de contagens bacterianas de Tempo 0. A lâmina foi centrifugada durante 5 minutos a 1200 rotações por minuto a 37°C e incubada durante uma hora em CO2 a 5% numa incubadora. Uma aliquota de 25μ1 foi retirada para determinação do CFU/mL das bactérias à hora um (Ti) .

As suspensões bacterianas foram diluídas a 1:100, 1:500, 1:1000 e 1:2000 em água destilada, e 20μ1 das últimas quatro diluições foram laminados em lâminas de ágar ΤΞΑ. Colónias emergentes dessas lâminas foram usadas para quantificar a percentagem de sobrevivência pela seguinte fórmula: % mortes = CFU/ml em Ti x 100% CFU/ml em T0

Os resultados estão resumidos na Figura 4 e mostram que o soro hiper-imune aos S. aureus reduziu o crescimento das bactérias em mais de 90%, enquanto o anti-soro de coelho não imune não mediou as mortes opsono-fagociticas quando comparado com o controlo que nào continha anti-soro (complemento, PMNs e bactérias, denominado C+P+B). A pré-incubação do anti-soro com diferentes quantidades de antígeno S. aureus 336 e antígeno T5 CPS mostrou que a eliminação opsono-fagocítica do soro de célula total dos S, aureus 336 é mediada maioritariamente pelos anticorpos específicos 336PS. A absorção com antígeno T5 CPS não modificou a eliminação opsono-fagocítica do anti-soro de célula total 336, Por outro lado, existe uma redução da eliminação opsono-fagocítica seguidamente à absorção com o antígeno 336, como o grau de redução a estar correlacionado com a quantidade de antígeno 336 utilizado na absorção. A 32 inibição foi titulada a baixas quantidades de antígeno 336 adicionado, A imunização de célula total dos S. aureus 336 não induziu a formação de anticorpos específicos T5 CPS ou de cruzamento como mostrado pelo facto do T5 CPS não conseguir absorver a eliminação opsono-fagocítica, mesmo quando 62.5pg de T5 CPS foi utilizado para absorção.

Lisboa, 16/11/2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma preparação de célula total que contém (I) células, lisados celulares, ou derivatizações de células de Staphylococcus aureus que transportem um antigeno que (i) contenha uma hexosamina β-ligada, (ii) não contenha grupos O-acetil detectáveis por espectroscopia de ressonância magnética nuclear, e {iii} ligue especificamente com anticorpos ao Staphylococcus aureus depositado no ATCC 55804; (II) células, lisados celulares, ou derivatizações de células Staphylococcus aureus que transportem o antigeno Tipo 5; (III) células, lisados celulares, ou derivatizações de células Staphylococcus aureus que transportem o antigeno Tipo 8; para fabrico de um medicamento para o tratamento de um animal não humano que tenha, ou esteja em risco de desenvolver mastite. ?

2. Utilizar de acordo com a reivindicação 1, quando o dito animal for fêmea.

3. Utilizar de acordo com a reivindicação 2, quando o dito animal for uma vaca ou uma porca.

4. Utilizar de acordo com a reivindicação 3, quando o dito animal for uma vaca.

5. Utilizar de acordo com a reivindicação 2, quando a dita fêmea animal seja uma gata ou uma cadela.

6. Utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações, quando o dito animal tiver mastite.

7. Utilizar de acordo com as reivindicações 1-5, quando o dito animal estiver em risco de desenvolver mastite.

8. Utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, quando a dita preparação contiver um transportador farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 16/11/2006