VACUNA CELULAR COMPLETA QUE CONTIENE EL ANTÍGENO STAPHYLOCCOCUS AUREUS
Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud es una solicitud de continuación, bajo 35 U.S.C. ?120, de la Solicitud No. de Serie 09/102,214, presentada el 22 de Junio de 1998, que es una continuación en parte de y reclama prioridad a la Solicitud No. de Serie 08/712,438, ahora la Patente de E.U. No. 5,770,208.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un antígeno Staphylococcus aureus nuevo, y a un método para obtener y utilizar el antígeno. El S. aureus origina varias enfermedades en animales y en humanos mediante diversos mecanismos patogénicos. La más frecuente y seria de estas enfermedades son la bacteremia y sus complicaciones en> los paciente hospitalizados. En particular, el S. aureus puede originar infecciones de herida e infecciones asociadas con catéteres y dispositivos prostéticos. Serias infecciones asociadas con la bacteremia de S. aureus incluyen osteomielitis, endocarditis invasora y septicemia. El problema se compone por resistencia antibiótica múltiple en cepas de hospital, la cual limita la elección de terapia. Además, el S. aureus es una causa principal de mastitis en el ganado de ordeño y vacuno, en donde la infección origina una pérdida mayor de ganancias. Una vacuna de S. aureus podría proporcionar una solución para el problema de resistencia antibiótica. Al menos ocho diferentes serotipos de S. aureus se han identificado utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales en polisacárido capsular (CPS). Karakawa eí al. , J. Clin. Microbiol. 22:445 (1985). Los contenidos de este documento y todos los otros listados en la presente se incorporan en la presente para referencia. Las investigaciones han mostrado que aproximadamente 85- 90% de aislamientos clínicos de humano, y un comparable, a pesar de algún porcentaje inferior de aislamientos clínicos de animal, son polisacáridos capsulares Tipo 5 o Tipo 8. Un individuo vacunado con una vacuna que contiene Tipo 5 y Tipo 8 de antígenos CPS podría protegerse de la infección por 85-90% de cepas de S. aureus clínicamente significativas, pero podría existir todavía un riesgo significativo de infección. Una vacuna que contiene antígenos de los otros seis serotipos teóricamente pueden proporcionar 100% de protección, pero podrían requerir la producción y purificación de seis componentes adicionales. Esto podría ser insostenible desde un punto de vista práctico. Por el otro lado, el Tipo 8 podría permitir la producción de una vacuna que contiene solamente tres antígenos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna celular completa de células que llevan un antígeno que es común en un gran número de cepas de S. aureus clínicamente significativas, particularmente una que es común en cepas asociadas con infecciones en animales, particularmente ganado. Un objeto más de la presente invención es proporcionar una
vacuna celular completa para la prevención o tratamiento de infecciones en animales, particularmente la mastitis en ganado. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición de globulina hiperinmune que contiene anticuerpos dirigidos contra las bacterias que llevan un antígeno que es común en un gran número de cepas de S. aureus clínicamente significativas, particularmente una que es común en cepas asociadas con infecciones en animales, particularmente ganado. Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición de globulina hiperinmune que es eficaz en el tratamiento de infecciones en animales, particularmente mastitis. De acuerdo con estos y otros objetos de acuerdo a la invención, se proporciona una vacuna celular completa que comprende células de una cepa de Staphylococcus aureus que lleva un antígeno que comprende hexosamina ß-enlazada, que no contiene grupos O-acetilo detectables por la espectroscopia de resonancia magnética nuclear y que reacciona con anticuerpos en ATCC 55804. También lo proporcionado es una composición que comprende la vacuna celular completa, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, estéril de la misma. La vacuna puede administrarse a un sujeto humano o animal para proporcionar protección contra la infección de S. aureus. Es particularmente útil en la prevención de mastitis en animales. Un agente inmunoterapeútico contra la infección de S. aureus, particularmente contra la mastitis en animales, puede prepararse al inmunizar sujetos humanos o animales con una composición de acuerdo a
*.t~?iA áh*,...«toil. i« ..é^i^ .£Mfe¡¿3, A*» «a»jkJ^-^~-fljfl]|¡_ la invención, colectando el plasma de los sujetos inmunizados, y recolectando la globulina hiperinmune veterinaria o humana que contiene anticuerpos dirigidos contra el S. aureus desde el plasma colectado. La globulina hiperinmune contiene anticuerpos dirigidos contra el antígeno de hexosamina ß-enlazada. Un método de inmunoterapia comprende una etapa de administración de esta globulina hiperinmune a un sujeto humano o animal, especialmente un animal con mastitis, para prevenir o tratar la infección. Otros objetos, características y ventajas de la presente invención llegarán a ser aparentes de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debería entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras se indican modalidades preferidas de la invención, solamente se dan a manera de ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención llegarán a ser aparentes a aquellos expertos en la materia de esta descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1 a, 1 b y 1 c muestran que los espectros NMR para cada uno de 336, antígenos Tipo 8 y Tipo 5 de S. aureus, respectivamente. La Figura 2 es un gráfico de barras que muestra la habilidad de IgG conjugado de 336 para mediar la opsonofagocitosis de una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336. La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra la habilidad de IgG de célula completa 336 para mediar la opsonofagocitosis de una
*iaM **J"t1f tt1'''Jj'*-' --^i^tt»i^^«»^ cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336. La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra el efecto de absorción con antígeno CPS T5 o antígeno 336 en la habilidad de IgG de célula completa 336 para mediar la opsonofagocitosis de una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336.
DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Se ha descubierto que virtualmente todas las cepas de S. aureus que no son de tipo como el Tipo 5 o el Tipo 8 tienen en común un antígeno, señalado aquí "el antígeno 336". Cuando se combina con los antígenos de Tipo 5 y Tipo 8, el antígeno 336 representa la base para una vacuna que proporciona casi la protección completa contra la infección por los aislamientos de S. aureus clínicamente significativos. En este aspecto, uro aislamiento "clínicamente significativo" es un aislamiento que es patogénico, ya sea en humanos o en animales. Más particularmente, la representación de aislamiento obtenida de diversas fuentes ha mostrado que aproximadamente 60% de aislamientos de humano son de Tipo 8, aproximadamente 30% son de Tipo 5 y que casi todo el 10% restante de aislamientos son de Tipo 336, según se muestra en la Tabla 1 Menos de 1 % de los aislamiento no son de tipo como uno de estos tres tipos. Tabla 1 Re resentación de aislamientos clí nicos de humano
Una cepa representativa de S aureus que lleva el antlgeno 336 se ha depositado bajo el Tratado de Budapest con la Colección de Cultivo Tipo Americano, y se ha dado el No de Acceso 55804
flotablemente, los presentes inventores obtuvieron 27 aislamientos clínicos de humano que no fueron de tipo ya sea como las cepas de Tipo 5 o Tipo 8 de S. aureus, y que se caracterizaron por ser cepas resistente a la meticilina. Todas las 27 cepas reaccionaron muy fuertemente con los sueros de anticuerpo del conjugado de antígeno 336, y de esta manera fueron tipo como las cepas que contienen antígeno 336. La representación de aislamientos de mastitis de bovino obtenida de diversas fuentes ha mostrado que aproximadamente 23% de aislamientos de humano son de Tipo 8, aproximadamente 22% son de Tipo 5 y que 54% de aislamientos son de Tipo 336, según se muestra en la Tabla 2. De esta manera, 97.5% de aislamientos que anteriormente no ueronr de tipo son tipo como el Tipo 336. Menos del 2% de los aislamientos^ no son de tipo como> uno* de estos tres tipos. Por lo tanto, una vacuna celular completa trivalente de Tipo 5, Tipo 8 y 336 se indica particularmente para el tratamiento y prevención de infecciones de S. aureus veterinarias. Tabla 1 Re resentación de aislamientos de mastitis de bovino
Los anticuerpos en el antígeno 336 no reaccionan con los polisacáridos aislados de cualquiera del Tipo 5, Tipo 8, Tipo 4, K73 (una cepa variante de Tipo 5) de S. aureus o S. epidermidis. Por lo tanto, el antígeno es tipo específico, es decir, produce una banda única con solamente el antisuero de tipo homólogo.
^m^ flitfiHKtr 'i- n ., ...A titi iüa^ ia^a^^ El antígeno 336 puede obtenerse en cantidad recuperable, de ciertos aislamientos de S. aureus cultivados conforme a los protocolos descritos en la presente, en forma sustancialmente pura. En particular, el antígeno purificado contiene menos de 1 % de proteína y menos de 1 % de ácidos nucleicos. Una cantidad "recuperable" en este aspecto significa que la cantidad aislada del antígeno es detectable por una metodología menos sensible que el radiomarcado, tal como el inmunoensayo, y puede someterse a más manipulaciones que incluyen la transferencia del antígeno per se en la solución. Para obtener et antígeno 336, un aislamiento 336 de acuerdo a la invención primero crece en un plato de agar de caldo Colombia complementado con MgC^/CaC^ y se transfiere así a un 2% de WaCI/maíraz de arranque Colombia. Un fermentador de 50 litros que contiene el mismo medio se inocula con el matraz de arranque. Las células se fermentan por 16-24 horas. Siguiente a la fermentación, las células mueren con 2% de concentración final de fenol a etanol (1 : 1 ) y se centrifugan así para separar las células del sobrenadante. El antígeno se extrae de la pasta de célufa. Algún antígeno 336 se presenta en el. sobrenadante, pero la cantidad es insignificante según se compara a la cantidad encontrada en la pasta de célula. Debido a la baja producción, y el riesgo de la contaminación de hexosa de los medios, no se prefiere la extracción del sobrenadante. Los tratamientos de enzima de la pasta de célula con lisostafina, DNasa, RNasa y proteasa, seguidos por la precipitación secuencial con 25-75% de etanol frío/CaCI2, da como resultado una
fc traecí?n dte antígeno crudo. El material crudo se vuelve a disolver en a§tia, $|4 faliza y se liofiliza. El material liofilizado se disuelve en el regulador y se carga en una columna separada equilibrada con el mismo regulador. La eolumna se lava con 0.15 M de NaCl del regulador de carga y se eluye así con un gradiente de 0.15-0.4 M de NaCl. La mayoría del antígeno de acuerdo a la invención se eluye a 0.32 a 0.35 M de NaCl. Las partes que contienen antígeno se combinan, dializan, concentran, y se liofilizan. La separación puede repetirse para obtener mejor purificación. El antígeno crudo se trata con lisozima y se purifica por tamaño en una columna y las partes positivas 336 se combinan así, concentran, dializan y se liofilizan. El análisis del antígeno 336 purificado por la cromatografía de liquido de gas (GLC) muestra la presencia de glucosamina como un mayor componente de glicosilo. Esto se confirma por el análisis de azúcar en un sistema Dionex. La espectroscopia 1 H-NMR del antígeno 336 indica la presencia de hexosamina ß-enlazada como un componente principal de carbohidrato. El antígeno comprende adicionalmenfe un componente que es responsable para una carga negativa observada mostrada por el antígeno 336. Una comparación de los espectros NMR para cada uno de los
336, antígenos Tipo 5 y Tipo 8 de S. aureus, según se muestra en las Figuras 1 a, 1 b y 1 c confirma que el antígeno 336 es químicamente distinto tanto de los antígenos Tipo 5 como del Tipo 8 de S. aureus. Las estructuras de los antígenos Tipo 5 y Tipo 8 de S. aureus se han aclarado por Moreu eí al. , Carbohydr. Res. 201 :285 (1990); y Fournier eí al. , Infect.
45:87 (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad repetida así como también ManNAca que puede utilizarse para introducir un grupo sulfihidrilo. Las estructura son como sigue: Tipo 5: ->4)-/?-D-ManNAcAp(1 «>4)-a-L-FucNAcp(1 -->3)-^-D-FucNacp(1 - 3 I
OAc Tipo 8: ->3)-/?-D-ManNAcAp(1 ~>3)-a-L-FucNAcp(1 -->3)- ?-D-FucNacp(1 - 4 I
OAc Por contraste, el componente de carbohidrato principal del arofígeno 336 es una hexosamina ß-enlazada. La inducción de ta bacteremia en los animales de laboratorio requiere números extremadamente altos de organismos o alguna maniobra anterior para reducir la resistencia huésped. Sin embargo, fa fagocitosis in vitro, puede estudiarse como un correlacionado de la inmunidad protectora in vivo. En este modelo, la habilidad de los anticuerpos monoclonafes y policlonales específicos de antígeno 336 se mide por la fagocitosis, de acuerdo al método descrito en Kojima eí al. , Infect. Dis. Immun. 58:23T7- 2374 (1990). Los anticuerpos inducidos por una vacuna de antígeno 336 facilitan la fagocitosis del tipo específico. Los ensayos de fagocitosis in vitro indican de esta manera que los anticuerpos en el antígeno 336 son protectores contra la infección por las cepas de S. aureus que llevan el antígeno 336. Las vacunas en base a los antígenos Tipo 5 y Tipo 8 han mostrado previamente a ser protectoras contra la infección por las cepas de Tipo ?f Tipo 8 de S. aureus, respectivamente. Fattom eí al. , Inf. And Imm. 58:2367-2374 (1990) y loe. Cit. 64: 1659-1665 (1996). Una vacuna en base a una combinación de Tipo 5, Tipo 8 y antígeno 336 puede utilizarse para protegerse contra la infección de la mayoría de las cepas de S. aureus clínico. Preferentemente, una composición del antígeno 336 o de las células completas que contienen el antígeno 336 de acuerdo a la presente invención "consiste esencialmente del" antígeno 336, o células que contienen el antígeno 336. En este contexto, la frase "consiste esencialmente" del medio que la composición no contiene cualquier materiaí que interfiere con la elicitación de una respuesta inmune al antígeno 336 (y a los otros antígenos, si se presenta) cuando la composición se administra a un sujeto como una vacuna, o con la característica de acoplamiento de anticuerpo de antígeno de un ensayo de diagnóstico cuando el antígeno se utiliza en la diagnosis. En una modalidad, la composición contiene antígenos de Tipo 336, Tipo 5 y Tipo 8 de S. aureus. Los antígenos de acuerdo a la invención son útiles en la producción de ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de antígeno de S. aureus y/o anticuerpo de anti- S. aureus en una muestra. El antígeno 336 de S. aureus, o anticuerpo específico en el antígeno de S. aureus, solo o en combinación con el antígeno o anticuerpo a uno o ambos antígenos de Tipo 5 y Tipo 8 de S. aureus, se mezcla con una muestra presunta de contener antígeno de S. aureus o anticuerpo y se monitorea
^..^^cc^^^^Jt?A?.? para la unión antígeno-anticuerpo. El antígeno o anticuerpo se marca con un radioactivo o marca de enzima. En una modalidad preferida, el antígeno o anticuerpo se inmoviliza en un aglomerante sólido de tal forma que el antígeno o anticuerpo son accesibles en ef anticuerpo o antígeno complementario que contacta una superficie del aglomerante. La muestra se trae así en contacto con la superficie del aglomerante, y la superficie se monitorea para la unión de antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, el antígeno o anticuerpo puede utilizarse en un ensayo inmunoabsorbente unido de enzima (ELIS), en el cual el antígeno o, anticuerpo se unen en una fase sólida y un anticuerpo de enzima o conjugado de antígeno de enzima en una muestra. Alternativamente, puede utilizarse un ensayo Western blot en el cual el (los) antígeno (s)
Sóftubilizado (s) y separado (s) se une (n) al papel de nitrocelutosa. El anticuerpo se detecta así por una enzima o antiinmunoglobulina (tg) conjugada de marca, tal como el conjugado de Ig de peroxidasa de ráband picante al incubar el papel filtro en la presencia de un sustrato precipitable o detectable. Los ensayos Western blot tienen la ventaja de no requerir pureza mayor a 50% para el (los) antígeno (s) deseado (s). Las descripciones de ELISA y las técnicas Western blot se encuentran en los Capítulos 10 y 1 1 de Ausubel, eí al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (1988), los contenidos enteros de los cuales se incorporan en la presente para referencia. Para utilizarse en una vacuna, o en la estimulación de la 1 síntesis de los anticuerpos específicos de tipo 336 en los sujetos inmunizados, es preferible conjugar el antígeno 336 purificado en un
a< iJ^Jutt— ^-^^a£?AAfea^'^^^^^"^-A'dt''í .a ar ,??-tt^'"-- í- -*« » -*f* -* - * * * iwiunovehículo, usualmente un polipéptido o proteína, para mejorar la ieraeción entre las células T y B para la inducción de una respuesta inmune contra el antígeno. Esto es particularmente importante para las vacunas pretendidas para utilizarse en pacientes con resistencia reducida. Un inmunovehículo permite la inmunogenicidad tanto para la inmunización activo como para preparar los antisueros altamente concentrados en voluntarios para la inmunización pasiva. Los inmunovehículos adecuados de acuerdo a la presente invención incluyen toxoide tetánico, toxoide de difteria, Exotoxina A de Pseudonomas aeruginosa o sus derivados, cepas mufantes no tóxicas producidas recombinantemente de exotoxina A, según se describe, por ejemplo, en Fattom eí al. , Inf. and lmm<. 61: 1023-1032 (1993), asi como también otras proteínas comúnmente utilizadas como ínmunovehíeufos. Preferentemente, el antígeno o conjugado de antígeno se administra sin un adyuvante a finí de evitar fa toxicidad inducida por adyuvante. Si un adyuvante se utiliza, ST prefiere utilizar uno que promueva los anticuerpos de subtipo 2 IgG protector. Los adyuvantes típicos incluyen adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA). Et sulfato de dextrano ha mostrado que es un estimulador potente del anticuerpo lgG2 contra los antígenos de superficie de célula stafilococal, y también es adecuado como un adyuvante. La presente invención también se refiere al uso del antígeno
336 para producir anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales
(ratón o humano) que se unen a o neutralizan las cepas de S. aureus que llevan el antígeno 336. Los protocolos para producir estos anticuerpos se
f*r ' r ,?ff^tf~" A""' " T ' Ausubel, eí al. , (eds). , Molecular Cloning: A Laboratorv
Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, NY).,
Capítulo 1 1 ; en METHODS OF HYBRIDOMA FORMATION 257-271 , Bartat
& Hirshaut (eds). , Humana Press, Clifton, NJ (1988); en Vitteta et al. , Immunol. Rev. 62: 159-83 (1 982); y en Raso, Immunol. Rev. 62:93-1 17
(1982). El inoculo para la producción del anticuerpo policlonal típicamente se prepara al distribuir el inmunovehículo de antígeno en un difuyente fisiológicamente tolerable tal como la salina, para formar una composición acuosa. Una cantidad inmunoestimulatoria de inoculo, con o sin adyuvante, se administra a un mamífero y el mamífero inoculado se mantiene así por un período de tiempo suficiente para que el antígeno induzca fa protección de los anticuerpos de antígeno anti-336. Las dosis5 impulsadoras del inmunovehículo de antígeno pueden utilizarse en individuos que no todavía no se preparan para responder at antígeno, Los anticuerpos pueden incluir preparaciones de una variedad de animales comúnmente utilizados, por ejemplo, cabras, primates, monos, cerdo, conejos, caballos, gallinas, cobayos, ratas, y ratones, y aún anticuerpos de humano después de la selección adecuada, fraccionamiento y purificación. Los antisueros de animal también pueden alcanzarse al inocular los animales con ias cepas 336 muertas por formalina de S. aureus, mediante métodos convencionales, sangrando los animales y recuperando el suero o plasma para más procesamiento. Los anticuerpos inducidos en esta forma pueden recolectarse y aislarse en el grado deseado mediante las técnicas bien conocidas, tal
t.tX?.. ~mm.J»-'- - - .^*^^ ^fm-¿Í ^?-f í^*¡?*..*~éB=m f. tá. , Jí ÉÉ Tio mediante el fraccionamiento de alcohol y la cromatografía de columna, o por la cromatografía de inmunoafinidad; es decir, al unir el antígeno a un empaque de columna cromatográfica como Sephadex™, pasando el antisuero a través de la columna, reteniendo de tal modo los anticuerpos específicos y separando otras inmunoglobulinas (IgGs) y contaminantes, y recuperando los anticuerpos purificados mediante la elución con un agente caotrópico, opcionalmente seguido por más purificación, por ejemplo, mediante el paso a través de una columna de antígenos de grupo sanguíneo unido u otras especies no patógenas. Este procedimiento puede preferirse cuando se aislan los anticuerpos deseados de los sueros o el plasma de humanos que han desarrollado una concentración de anticuerpo contra el patógeno en cuestión, asegurando de taf manera la retención de anticuerpos que son capaces de unirse al antígeno. Pueden utilizarse así en preparaciones para la inmunización pasiva contra las cepas 336 de S. aureus. Una composición de anticuerpo monoelona? contiene, dentro de los límites detecfables, solamente uno de las especies de anticuerpo combinando el sitio capaz de unirse eficazmente al antfgeno 336. Los anticuerpos adecuados en la forma monoclonal pueden prepararse utilizando la tecnología de hibridoma convencional. Para formar los hibridromas de los cuales una composición de anticuerpo monoclonal de la presente invención se produce, un mieloma u otro estirpe de célula autocontinúa se fusiona con linfocitos obtenidos de la sangre periférica, nodulos linfáticos o el bazo de un mamífero hiperinmunizado con el antígeno 336. Se prefiere que el estirpe de célula
la misma especie como los linfocitos. Los típicamente con las células de mieloma utilizando el glicol de polietileno 1 500. Los híbridos fusionados se seleccionan por su sensitividad a HAT. Los hibridomas que secretan las moléculas de anticuerpo de esta invención pueden identificarse utilizando una ELISA. Un bazo de ratón Balb/C, sangre periférica humana, nodulos linfáticos o esplenocitos son los materiales preferidos para utilizarse en la preparación de murina o hibridomas de humano. Los mielomas de ratón adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen los estirpes de célula de hipoxantina-aminopterin-timidina-sensitiva (HAT), siendo un mietoma preferido P3X63-Ag8.653. El patrón de fusión preferido para la producción de anticuerpo monoclonal de humano es SHM- 33, un heíeromieloma disponible de ATCC, Rockvitle, Md. Bajo ta designación CRL 1 668. Una composición de anticuerpo monocfonal de la presente invención puede producirse al iniciar un cultivo de hibridoma monocfonal que comprende un medio nutriente conteniendo un hibridoma que secreta fas moléculas de anticuerpo de la especificidad adecuada. El cultivo se mantiene bajo condiciones y por un período de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo en el medio. El medio que contiene el anticuerpo se colecta así. Las moléculas de anticuerpo pueden aislarse así mediante técnicas bien conocidas. Los medios útiles para la preparación de estas composiciones se conocen bien en la materia y son comercialmente disponibles, e incluyen medios de cultivo sintético, ratones innatos y lo similar. Un medio sintétteo «femplos es el medio esencial Mínimo de Dulbecco complertiütado con 20% de suero de becerro fetal. Una cepa de ratón innato ejemplar es ia Balb/c. Otros métodos para preparar las composiciones de anticuerpo monoclonal también se contemplan, tal como las fusiones de Interespecies, ya que es principalmente la especificidad del antígeno de los anticuerpos que afecta su utilidad en la presente invención. Los linfocitos de humano obtenidos de los individuos infectados pueden fusionarse con un estirpe de célula de mieloma humano para producir hibridomas que pueden protegerse para la producción de anticuerpos que reconocen el antígeno 336. Más preferible en este aspectos, sin embargo, es un proceso que no lleva consigo) el uso de una muestra biológica de un sujeto humano infectado. Por ejemplo, un sujeto inmunizado con la vacuna según se describe en la presente puede servir como una fuente para fos anticuerpos adecuadamente utilizados en una composición de anticuerpo dentro de la presente invención». En una modalidad particularmente preferida, los anticuerpos monoclonales se producen en el antígeno 336 utilizando métodos similares a aquellos descritos para los anticuerpos de tipo específico en el S. aureus de Tipo 5 y Tipo 8. Los anticuerpos monoclonales purificados se caracterizan por los ensayos de aglutinación bacteriana utilizando una colección de aislamientos clínicos. Las composiciones de anticuerpo monoclonal y policlonal producidas de acuerdo a la presente descripción pueden utilizarse mediante la inmunización pasiva para inducir una respuesta inmune para la prevencióh o tratamiento de infección por las cepas de S. aureus que llevan el antígeno 336. En este aspecto, la preparación de anticuerpo puede ser una composición policlonal. Tal composición policlonal incluye los anticuerpos que se unen al antígeno 336, y adicionalmente pueden incluir los anticuerpos que se unen a los antígenos que caracterizan las cepas Tipo 5 y Tipo 8 de S. aureus. El componente de anticuerpo policlonal puede ser un antisuero policlonal, preferentemente afinidad purificada, de un animal que ha cambiado con el antígeno 336, y preferentemente también con los antígenos Tipo 5 y Tipo 8. Alternativamente, puede utilizarse una mezcla "oligoclonat realizada", que es una mezcla de anticuerpos monoclonales en el antígeno 336, y los aptí'genos Tipo 5 y o« Tipo 8 de anticuerpos monocfonales. En ambos tipos de mezclas, puede ser ventajoso para unir tos anticuerpos juntos químicamente para formar una molécula poliespecífica única capaz de unirse al antígeno 336 y uno o> ambos antigenos de Tipo § y Tipo 8. Una manera de efectuar tal enlace es elaborar los fragmentos) híbridos F(ab')2 al mezclar dos diferentes fragmentos F(ab')2 producidos, por ejemplo, por la digestión de pepsina de dos diferentes anticuerpos, división reductora para formar una mezcla de fragmentos F(ab')2, seguidos por la reformación oxidativa de los enlaces de disulfuro para producir una mezcla de fragmentos F(ab')2 incluyendo fragmentos híbridos que contienen una parte de Fab' específica en cada uno de los antígenos originales. Los métodos para preparar tales fragmentos de anticuerpo híbrido se describen en McGraw-Hill Int'l Book Co. (1978); Nisonoff, eí al. , Arch Biochem Biophys. 93:470 (1 961 ); y Hammerling, eí al. , J. Exp. Med.
¿áíÁ fttt álll*ÉHrt,t.<É».?.- . ??É?tt***. — ? .—».., -^.^^A^^.^ ¿gtßß: 1461 (1968); y en la Patente de E.U. No. 4,331 ,647. Otros métodos se conocen en la materia para elaborar fragmentos bivalentes que son completamente heteroespecíficos, por ejemplo, el uso de enlazadores bifuncionales para unir los fragmentos penetrados. Las moléculas recombinante se conoce que incorporan las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo, por ejemplo, de acuerdo al método de Boss eí al. , Patente de E. U. No, 4,816,397. Los métodos análogos para producir moléculas de unión recombinante o sintéticas que tienen las características de anticuerpos se incluyen en la presente invención. Más de dos diferentes anticuerpos monoespecíficos o fragmentos de anticuerpo pueden unirse utilizando diversos enlazadores conocidos en la materia. Un componente de anticuerpo producido) de acuerdo con la presente invención puede incluir anticuerpos completos» fragmentos de anticuerpo y subfragmentos. Los anticuerpos pueden! seí ínmunoglobuli a total de cualquier cfase, poF ejemplo, Igß, 1'gMi, IgA, IgD, IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con antígeno dual o múltiple o especificidades de epitopo, o fragmentos, por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab y lo similar, incluyendo fragmentos híbridos, y adicionatmente incluye cualquier inmunoglobulina o cualquier proteína natural, sintética o genéticamente elaborada que actúa como un anticuerpo para unirse a un antígeno específico a fin de forma un complejo. En particular, las moléculas Fab pueden expresarse e instalarse en un huésped genéticamente transformado como E. coli. Un sistema de vector lamda se encuentra disponible de esta manera para expresar una población de Fab's
con una fttfrsidad potencial igual a o excedente a aquella del sujeto que genera el anticuerpo predecesor. Ver Huse, W.D. , eí al. , Science 246: 1275-81 (1989). El antígeno 336 de acuerdo a la presente invención puede ser el ingrediente activo en una composición, comprendiendo además un vehículo farmacéuticamente aceptable para el ingrediente activo, que puede utilizarse como una vacuna para inducir una respuesta inmune celular y/o producción in vivo de anticuerpos que combaten la infección de S. aureus. En este aspecto, un vehículo farmacéuticamente aceptable es un material que puede utilizarse como un vehículo para administrar un medicamento debido a que el material es inerte o de otra forma médicamente aceptable, así como también compatible con el agente activo, en ei contexto de la administración de vacuna Además dé un excipiente adecuado, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener aditivos de vacuna convencional como difuyentes, adyuvantes, antioxidantes, conservadores y agentes solubilizantes. En un modalidad alternativa, las célufas que llevan el antígeno 336 se utilizan en una vacuna celular completa. En este aspecto, una "vacuna celular completa" incluye vacunas elaboradas utilizando bacterias completas muertas, lisatos bacterianos, o derivados de bacterias completas. Las células que levan el antígeno 336 puede identificarse y seleccionarse para utilizarse en la vacuna celular completa al utilizar anticuerpos en una cepa conocida para llevar el antígeno 336, y más preferentemente al utilizar anticuerpos monoclonales en antígeno aislado según se describe en la presente. En este aspecto, un experimento de
aglutinación de deslizamiento simple en el cual los anticuerpos en el antígeno 336 se mezcla con células, puede utilizarse. La cepa depositada ATCC 55804 es una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336, y puede utilizarse para producir anticuerpos útiles en la identificación otras cepas que llevan el antígeno 336. Sin embargo, no es necesario, utilizar la cepa depositada a fin de producir ya sea la vacuna celular completa o los anticuerpos útiles en el tratamiento o prevención de infecciones de S. aureus o en la identificación de otras células que llevan el antígeno 336. La ATCC 55804 meramente proporciona un medio inmunológico para identificar tales células. Según se describe por la vacuna de antígena purificada anterior, la vacuna celular completa también comprende un, vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna celular completa también puede contener opcíonalmente aditivos de vacuna convencional como diluyentes, adyuvantes, antioxidantes, conservadores y agentes sofubilizantes En una modalidad preferida, la vacuna celular completa confiene células o derivados de células que llevan el antígeno 336, además de células o derivados de células que llevan los antígenos Tipo 5 y Tipo 8. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden administrarse en un sujeto todavía sin infectarse con S. aureus, para inducir de tal modo una respuesta inmune protectora a S aureus (humoral o celular), particularmente una respuesta protectora a mastitis, en aquel sujeto. Alternativamente, las vacunas dentro de la presente invención pueden administrarse en un sujeto en el cual la infección de S. aureus ya ha ocurrido pero se encuentra en una etapa suficientemente temprana que la
"á¡?|pgpUesta inmune producida en la vacuna inhibe eficazmente más propagación de infección. En una modalidad preferida, la vacuna celular completa se administra en una animal hembra para prevenir o tratar el caso de mastitis. En este aspecto, se administra a animales hembra consideradas que son un riesgo para el desarrollo de mastitis, es decir, en animales utilizados en un programa de crianza, y más particularmente en aquellos animales con una historia anterior de mastitis. La vacuna celular completa es particularmente útil en la prevención de mastitis en un animal de granja, tal como una vaca o un lobo, a pesar de que se indica también para utilizarse en animales mascota, tales como perros y gatos. Por otro procedimiento, una vacuna de la presente invención puede administrarse a un sujeto que actúa así como una fuente para fnw*unogfobulina, producida en respuesta al cambio de la vacuna específica ("globulina hiperinmune"), que contiene anticuerpos dirigidos csrotra S. aureus. Un sujeto tratado de esta manera podría donar plasma- de! cual la globulina hiperinmune podría obtenerse así, por medio de la metodología de fraccionamiento de plasma convencional, y se administra a otro sujeto a fin de impartir resistencia contra o para tratar la infección de S. aureus. Las globulinas hiperinmunes de acuerdo a la invención son particularmente útiles para los individuos comprometidos inmunes, para individuos que superan los procedimientos invasores o cuando el tiempo no permite al individuo producir sus propios anticuerpos en respuesta a la vacunación. Las globulinas hiperinmunes producidas en la vacuna celular completa son particularmente útiles en el tratamiento de la infección de S.
aure s, 1 De igual forma, los anticuerpos monoclonales o policlonales de anti- S. aureus producidos de acuerdo a la presente invención pueden conjugarse en una inmunotoxina, y administrarse en un sujeto en quien la infección de S. aureus ya ha ocurrido pero no ha llegado a expandirse ampliamente. En este término, el material de anticuerpo producido conforme a la presente descripción puede administrarse en un vehículo farmacéuticamente aceptable, según se define en la presente. La presente invención se describe más para referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Fermentación de S. aureus Una cepa de S. aureus que lleva el antígeno 336 se cultivé en cafdo Colombia complementado con 2% de NaCI en un fermentador de 80 litros que contiene 60 litros de eafdo medio a 37°. La fermentación) se inició con un litro de un cultivo de semilla vieja de 16 horas. Las células crecieron con agitación a 200 rpm por 24 horas, en un A650nm de 20.Q-. Las células a utilizarse como una vacuna para preparar los antisueros de célula completa fueron formalina fija durante la noche a temperatura ambiente. Las células para la purificación de antígeno se mataron al agregar fenol-etanol (1 : 1 , vol/vol) al fermentador en una concentración final de 2%, y mezclando lentamente por 2 horas a 15-20°C. No se detectaron células viables después de este tratamiento. Las células se recolectaron así mediante centrifugación a 14,500 x g y se almacenaron
a -70°C h sta utilizarse. Aproximadamente 800-900 gramos de pasta de Í célula (peso neto) se obtuvo de una fermentación de 60 litros. Para la preparación de células a utilizarse en la preparación de una vacuna celular completa, las cepas de S. aureus que llevan el antígeno 336, el antígeno Tipo 5 y el antígeno Tipo 8 se cultivaron por separado en el caldo Colombia complementado con MgCI2/CaCI2 a 37° por
18-20 horas, mientras se agitaron (200 rpm). Las células se probaron mediante la aglutinación de desplazamiento para la reactividad negativa con antisuero de cepa de Madera de S. aureus, y se incubaron así con 3% de formalina por 24 horas. Las células se lavaron 3 veces con PBS, se representaron con anticuerpos específicos de S. aureus (15, T8 o 336) y el antisuero de cepa de Madera y se ajustaron a OD adecuado a 540 nm. E emplo 2: Preparación de Vacuna celular completa v Anti uero Las células fijas de formalina del Ejemplo 1 se ajustaron a y se combinaron! con salina fisiológica para producir unat vacuna. No se utilizó ningún adyuvante. La vacuna se inyecta intravenosamente en conejos. Los conejos sangraron en intervalos por semanas y el suero de célula total positiva se colectó y se combinó. El IgG se purificó de suero de célula completa por una columna de afinidad de proteína G. El material purificado contuvo 23 mg/ml de IgG total (280 UV exploración) y sustancialmente menos IgG específico de antígeno 336. Ejemplo 3- Purificación del Antígeno 336 La pasta de célula se suspendió a 0.5 g (peso húmedo) por ml en 0.05 M de Tris-2mM MgSo4, pH 7.5. La lisostafina (100 á 150 µg/ml) se agregó y se incubó a 37°C por 3 horas con mezcla. De allí en adelante, la
^ &m^^g^z^^ ^!^^ WaSF y Rttasa se agregaron a las concentraciones finales de 50 µg/ml * i cada una, y la incubación se continuó por unas 4 horas adicionales. La mezcla de reacción se precipitó secuencialmente con 25 y 75% de etanol en la presencia de 10 mM de CaCI2. El 75% de precipitado de etanol se aglomeró mediante la centrifugación a 12,000 x g por 30 minutos, o a una rpm inferior por un tiempo más largo. El sobrenadante se transfirió al entubamiento por diálisis. La mezcla de reacción se filtró a través de una membrana de tamaño de poro de 0.45 µm y se precipitó secuencialmente con 25 y 75% de efanol en la presencia de 1 0 mM de CaCI2. El 75% de precipitado de efanol se dializó extensivamente contra agua a 3 a &°C y se l?ofB?zó». Ef polvo se disolvió en 0.2 M' de NaCI/0.05 M de Tris HCf, pH 7.0. El material crudo» resultante se cargó en una columna de Sefarosa Q en 0.2 Mt de NaCI/0.05 M de Tris HCl, pH 7.0, y se etuyó con un gradiente lineal de 0.2- 0.4 M' de NaCt. Las partes que contuvieron antígepo, según se detecta por la precipitación capilar con antisueros def EjempFo 2, se combinaron, se dializaron, y se liofilizaron. La mayoría del antígeno se efuyó a 0.32-0.35 M de NaCI/0.05 M de Tris HCl. El antígeno crudo obtenido de esta manera se trató con 1 mg de lisozima por 10 mg de antígeno crudo en 10 mM de CaCI2 para digerir la contaminación de peptidoglican residual. El antígeno crudo tratado de lisozima después se purificó más en una columna de filtración por gel de Sefacrilo S-300. Todo el material reactivo se seleccionó utilizando antisuero completo. Ejemplo 4: Caracterización del Antígeno
Et análisis de antígeno 336 purificado mediante lai ? ., cromatografía líquida por gas (GLC) muestra la presencia de glucosamina como un componente principal de glicosilo. Esto se confirma por el análisis de azúcar en el sistema Dionex. La espectroscopia de 1 H-NMR del antígeno 336 muestra un protón anomérico a 4.751 ppm, correspondiente a la hexosamina ß-enlazada. Además, el espectro de NMR muestra señales bien separadas a 4.229 ppm (2H), 3.649 (1 H), 3.571 ppm (2H), 2.19 ppm (3H). Las señales correspondientes a grupos O-acetilo no se encuentran. Esto indica la ausencia de acetilación O, y se distingue claramente del 20-80% de acetilación O encontrado, en otros aislamientos dé típ© de S. aureus, tal como ef Tipo) & y/ Tipa 8. El espectro 1 3C-NMR muestra una señal en fa región, anomérfca a 102. $ 0 ? M*- s>io confirma la presencia de monosacárido como un componen!© prineípal. Otras señales del espectro1 C13-NMR aparecen a 8 .S65, 7d.?41, 74,950, 71 841 , 71.051 , 70.775, 67.665, 67 142, 61.716, 9ß.&52, 00.$ß 4&4Q8 y 23 246 ppm,, re s )^etiv ámenle. La movilidad de antígeno purificado en inmunoelectroforesis (IEF) indica la presencia de grupos negativamente cargados. El antígeno purificado no contiene azúcares neutrales según se detecta por el ensayo sulfúrico de fenol. El Kd de antígeno purificado fue 0.3 en columna de HR Superosa 1 , que es un material de tamaño molecular más pequeño en comparación con Tipo 5 (Kd de 0.017), Tipo 8 (Kd de 0.061 ) y ácido teicoico (Kd de 0.18). Ejemplo 5: Conjugados de Inmunovehículo de Antígeno El antígeno purificado se derivó con 0.5 M de dihidrácido de
^J^fa?tjM^^BfaJia..^ ácido ' ! adípico (ADH) utilizando 100 mM de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) en pH 5.6. La derivación se logró en el rango de 2 a 7% (p/p). El antígeno purificado derivado se conjugo en cepa mutante no tóxica, producida recombinantemente de exotoxina A de Pseudonomas de aeuroginosa utilizando 50 mM de EDAC a 1 : 1 (antígeno: proteína), según se describe en Fattom eí al. , Inf. and Imm. 60:584-589 (1992). La producción de conjugación fue de 50-70% determinado por la medida de proteína. El Kd del conjugado fue de 0.2 en la columna de 12 HR de Sefarosa. El conjugad® se inyectó en conejos con adyuvante (CFA seguido por IFA) en una proporción 1: 1. Los sangrados ostlí^Q^ §@ combinaron y los IgGs se purificaron en una columna de profefna 0. El IgG de conjugado alcanzado mostró identidad con anticuerpos inducidos por IgG de célula completa contra el antígeno en un ensayo- de inmunodifusión. El IgG de suero de conjugado purificado se mostró que contiene 12.2 mg/mg de Ig? total por un 280 nm UV pf0 a^i#^ f ty t mg/'mf de IgG espeeífic? ^ aroífgen© por ELISA. Los sueros de eéiuia completa, IgG de céluta completa, e IgG conjugado se utilizaron en ensayos de opsonofagocitosis y modelos de animal. Ejemplo 6: Ensayos de Opsonofagocitosis In vitro con Anticuerpos en Vacuna de Conjugado/Antígeno Los leucocitos polimorfonucleares (PMNs) se obtuvieron de las células HL-60 ajustadas en una concentración de 1 .0 x 107 células por ml en MEM complementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS). El S. aureus creció durante la noche en caldo Colombia complementado con MgCl2/CaClfc. La concentración de bacterias se ajustó espectrofotométricamente en una OD de 0.02 a 540 nm (4 x 106 células/ml) ajustadas así a 1 x 106 células/ml en MEM complementado con 10% de
FBS. Los IgGs de antigeno específico purificado o no reactivo de control se agregaron para facilitar la opsonización por PMNs. El complemento de conejo bebé, diluido 1 :8 en MEM complementado con 10% de FBS se utilizó como el control negativo. La mezcla de reacción contuvo 25 µl de S. aureus
(concentración 1 x 106 células/ml), 25 µl PMNs (concentración 1 x 107 células/ml), 25 µl de complemento, 100 µl de sueros o anticuerpos, y suficiente MEM/10% de FBS para traer el volumen de reacción total a 250 µl. A 0 horas, 1 hora y 2 horas, 25 µl de muestra se diluyeron en serie. Se laminaron 25 µl de las diluciones 10~2, 10~3, 10"4 y 10"s en platos de agar TSA, y se incubaron durante la noche a 37°C. Los resultados se muestran en la Figura 2, y muestran que el anticuerpo para conjugar media la opsonofagocitosis de una cepa representativa de S. aureus que lleva el antígeno 336. Los resultados se reportan como por ciento de muerte mediante cantidades de IgG de antígeno específico 336 de 300 µg a 128 µg. Para comparación, el por ciento de muerte por una cantidad equivalente de IgG no reactivo también se reporta. Los PMNs más complemento se utilizó como un control. Ejemplo 7: Ensayos de Opsonofagocitosis In vitro con Anticuerpos en Vacuna celular completa
Para evaluar ia eficacia de la vacuna celular completa de S.
aureus 336, los IgGs de célula completa de S. aureus 336 en un ensayf { de opsorfofagocítico de sangre total. Las células de S. aureus 336 crecieron y se ajustaron a 2 x 106 cfu/ml, según se describe en el Ejemplo 1 . La suspensión bacteriana (100 µl), salina (100 µl) y la solución de anticuerpo (100 µl) se agregaron a 700 µl de sangre humana de citrato. Después de la mezcla, una alícuota de 25 µl se tomó y se laminó para obtener cuentas bacterianas en tiempo cero. La mezcla se incubó así con agitación a 37°C por una hora y se laminó. Los resultados se localizaron en¡ la Figura 3, y mostraron una reducción de 2 logaritmos de unidades de formación de colonia en la presencia de IgGs inmunes en sangre total de citrato, según se compara en las IgGs no inmunes. La actividad de las IgGs inmunes fue la misma aún en una dilución 1 :4, indicando que lá eomplementación de sangre total de conejo con anticuerpos generado^ contra el aislamiento de S. aureus 336 produjo un efecto opsonofagocífieo fuerte contra las cepas de S. aureus 336. Etemplo 3: Muerte opsonofaflocHUea tn vitro mediada por I s antisueros hiperinmunes de célula completa
La importancia de anticuerpos específicos de S aureus 336 en el antisuero de conejo hiperinmune derivado de célula completa de S. aureus 336 para mediar la muerte opsonofagocítica de las bacterias de S. aureus 336 se probó mediante la absorción de anticuerpos específicos 336 del antisuero de conejo hiperinmune de célula completa de S. aureus 336 con antígeno 336 y antígeno T5 CPS. El suero de conejo no inmune se utilizó como un control.
Las perlas congeladas de una cepa de S. aureus 336 (91 -14) se inoculó a 5 mL de caldo Colombia de Mg/CaCI2 y se incubó por 16 horas a 37°C con 200 rpm de agitación. Para el ensayo, las células se ajustaron así con salina en una concentración aproximada de 2x106 CFU/ml (OD540=0.02). Los PMNs (HL-60 células) se utilizaron en concentración de 1 x107 células/mL en 1 x MEM medio de opsonización [Medio Mínimo Esencial, con sal de Earle, sin glutamato, GIBCO-BRL], complementado con 0.1 % de gelatina [Sigma Chemicals]. El suero de conejeo diluido 1 : 100 con medio de opsonización se utilizó como una fuente de complemento. La absorción de antisuero de célula completa de S. aureus 336 (calor inactivado por 30 minutos a 56°C) con antígeno de S. aureus 336 y anfígeno T5 CPS se realizó como sigue. Los antígenos se disolvieron en dB2O en concentraciones que varían desde 250 ug/mL a 15.6 ug/mL. Las soluciones de antígeno (250 uL) con diferentes concentraciones de los antígenos se mezclaron con 250 uL del antisuero de célula completa d© S. aureus 336 diluido a 1 :250. La mezcla de reacción se incubó primero por 2 horas a 37°C y después durante la noche a 4°C. Las muestras se centrifugaron así a 14,000 rpm en un centrífugo Eppendorf 5415 a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se utilizaron así en el ensayo de opsonización. Para iniciar el ensayo, 50 µl de bacterias, 50 µl de complemento diluido, 50 µl de células H-60 ajustadas y 50 µl de antisuero se agregaron por cavidad en láminas de micro concentración de parte inferior redonda de poliestireno (Corning Glass Works). Siguiente a la
tifia alícuota de 25 µl se tomó para la determinación de Tiempo 0 en cuentas bacterianas. La lámina se centrífugo por 5 minutos a 1200 rpm a 37°C y se incubó por una hora en 5% de CO2 en una incubadora. Una alícuota de 25 ul se tomó para la determinación de CFU/mL de bacterias Las suspensiones bacterianas se diluyeron 1 : 10, 1 : 100, 1 :500,
1 : 1 ,000 y 1 :2,000 en agua destilada, y 20 µl de las últimas cuatro diluciones se laminaron en platos de agar TSA. Las colonias emergentes de estos platos se utilizaron para cuantificar la supervivencia por las siguiente fórmula: % de muerte = CFU/mL a Ti x 100% CFU/mL a T0
Los resultados se resumen en la Figura 4 y muestran que el suero hiperinmune de S. aureus 336 redujo el crecimiento bacteriano más del 90%, mientras que el antisuero de conejo antiinmune no medió la muerte opsonofagocítica según se compara al control que no contiene antisuero (complemento, PMNs y bacterias, señaladas C+P+B). La preincubación de antisuero con diferentes cantidades de antígeno S. aureus 336 y antígeno T5 CPS mostró que la muerte opsonofagocítica del suero de célula completa de S. aureus 336 se medió mayormente por los anticuerpos específicos de 336PS. La absorción con antígeno T5 CPS no cambió la muerte opsonofagocítica de antisuero de célula completa 336. Por el otro lado, existe una reducción en la muerte opsonofagocítica siguiente a la absorción con antígeno 336, con el g rado de reducción
eweladifRád© a la cantidad de antígeno 336 utilizado en la absorción. La inhibieran se concentró en bajas cantidades de antígeno 336 agregado. La inmunización de célula completa de S. aureus 336 no indujo la formación de los anticuerpos de reacción cruzada o de T5 CPS específico según se muestra por el hecho de que el T5 CPS no podría absorber la muerte opsonofagocítica, aún cuando 62.5 ug de T5 CPS se utilizó para la absorción.