HU205630B - Process for producing monoclonal antibodys inhibiting exotoxine and toxic effect of pseudomonas aeruginosa and specific for them, celle lines producing them and pharmaceutical compositions - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás Pseudomonas aeruginosa exotoxin A toxikus hatását gátló és arra specifikus monoklonális antitestek, az azokat termelő sejtvonalak és gyógyászati készítmények előállítására.

A jelen találmány általánosságban a monoklonális antitest-technológia alkalmazásával foglalkozik a bakterilális fertőzésekkel társult problémákhoz emberekben, részletesebben a Pseudomonas aeruginosa exotoxin A toxikus hatásainak semlegesítésére képes fajlagos humán monoklonális antitestek előállításához alkalmas sejtvonalak izolálásával foglalkozik.

Az elmúlt három évtizedben az olyan bakteriális fertőzések előfordulása, melyek végzetessé válhatnak emberekben, drámai módon változott, nyilvánvalóan az új antimikrobiális szerek felfedezése és széleskörű alakalmazása következményeként. A Pseudomonas aeruginosa által okozott fertőzések előfordulása főleg az immunrendszerében veszélyeztetett emberi betegek problémája, azaz azoké, akiknek hematológiai károsodásai, szilárd tumorjai, kiterjedt égési sebei, stb. vannak. Valójában bármelyik kórházi beteg, aki széles spektrumú antibiotikumokat kap, vagy kortikoszteroidokkal, citotoxikus szerekkel vagy az emberi védekező mechanizmusra károsan ható más szerekkel végzett kezelésen esett át, fogékony a Pseudomonas bakterémíára. A Pseudomonas-fertőzések folyamatosan fennmaradó gyakorisága és súlyossága a jele a jelenleg rendelkezésre álló kezelési rendszer korlátozott hatékonyságának [lásd Andriole V.: J. Láb. Clin. Med. 94, 196-199 (1979)].

A Pseudomonas aeruginosa-val társult fertőzőképesség egy sor bakteriális tennék eredményének tűnik. A külső sejtmembrán lipopoliszacharidot tartalmaz, amely a toxikus tulajdonságok egész sorozatát mutatja. Ezek a baktériumok termelnek egy sor extracelluláris terméket is, amelyek közreműködhetnek a baktériumok patogenicitásában, ezek között találjuk a hemolizineket, proteázokat és más extracelluláris enzimeket.

Ezek közül az extracelluláris enzimek közül kettőről, az exotoxin A-ról és az exoenzim S-ről kimutatták, hogy adenozin difoszfát ribozil-transzferáz aktivitást mutatva az eukarióta fehérjeszintézis gátlását okozza, hasonlóképpen ahhoz, amelyet korábban találtak a diftéria-toxin A fragmensnél. Részletesebben a Pseudomonas aeruginosa exotoxin A-ról kimutatták, hogy katalizálja a nikotinamid adenin dinukleotid adenozin 5’-difoszfát ribozil részének átvitelét a 2. meghosszabbítható faktorra (EF-2) a következő reakció szerint:

exotoxin A

NAD + EF-2 , * ADPR-EF-2 + nikorinamid ahol NAD = nikotinamid adenin dinukleotid

EF-2 = a fehérjeszintézis 2. meghosszabbító faktora

ADPR = adenozin difoszfát ribozil-rész

Az így létrejövő ADPR-EF-2 komplex tovább már nem működik megfelelően (azaz úgy, mint a natív EF-2) az eukarióta fehérjeszintézisben. Mivel az EF-2 kulcsszerepet játszik a fehérjeszintézisben a polipeptid-összeállítás meghosszabbítási lépésében működve, az eukarióta fehérjeszintézis ilyen formában hatásosan gátolt [lásd Iglewski B. és Kábát D.: „NAD-Dependent Inhibition of Protein Synthesis by Pseudomonas aeruginosa Toxin” (A fehérjeszintézis NAD-függő gátlása Pseudomonas aeruginosa toxin által), Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 72,2284-2288(1975)].

A kutatás kimutatta, hogy már 60 ng tisztított exotoxin A is halálos egerekre, és megfelelően kis mennyiség halálos más emlősöknél ugyanígy [Pollack M. és munkatársai: „Neutralizing to Pseudomonas aeruginosa Exotoxin in Humán Sera: Evidence fór In Vivő Toxin Production During Infections” (Pseudomonas aeruginosa exotoxin semlegesítése humán szérumban: Bizonyíték az in vivő toxintermelésre a fertőzés során), Infect. Immun. 14, 942-947 (1976)]. Az exotoxin A termelését mutatták ki a humán fertőzésekből izolált klinikai Pseudomonas aeruginosa törzsek 85-90%ában is [Bjom M. és munkatársai: „Incidence of Exotoxin Production by Pseudomonas Species” (A Pseudomonas törzsek által végzett exotoxintermelés gyakorisága). Infect Immun. 16, 362-366 (1977)]. Ezenkívül exotoxin A-ellenes aktivitást is figyeltek meg emberek és állatok szérumában, amelyek átestek P. aeruginosa fertőzésen [Pollack M. és munkatársai (1966)]. Ezenkívül nagy akut szérum antitoxin titerek kapcsolódtak P. aeruginosa fertőzéseket túlélt emberekhez [Pollack M. és Young L. „Protective Activity of Antibodies to Exotoxin A and Lipopolysaccharide at the Onset of Pseudomonas aeruginosa Septicemia in Mán” (Az exotoxin A és lipopoliszacharid elleni antitestek védő aktivitása a Pseudomonas aeruginosa szepszis kitörésénél emberekben), J. Clin. Invest. 63,276-286 (1979)].

Ezekből az okokból és további okokból az exotoxin A-ról feltételezhető, hogy központi szerepet játszik az emberi Pseudomonas aeruginosa fertőzésekben. így az exotoxin A hatásai semlegesítésének in vivő módszereit tanulmányozták, mint lehetséges eszközt az ilyen fertőzések szabályozásában.

Az exotoxin A-semlegesítés egyik módszere lehet fajlagos antitestek alkalmazása. A nyúl antiexotoxin A passzív védőhatását tanulmányozták egérmodellen, ahol az egerek súlyosan égettek és ezt követően halálos P. aeruginosa fertőzésnek kitettek voltak. Az adatok azt sugallták, hogy az exotoxin A hozzájárult az égett, fertőzött egerek mortalitásához, és hogy a túlélés növekedett a nyúl antitoxin szérum passzív beadásával [Pavlovskis 0. és munkatársai: „Passive Protection by Antiexotoxin A in Experimental Pseudomonas aeruginosa Bum Infection” (Anti-enterotoxin A által nyújtott passzív védelem kísérleti Pseudomonas aeruginosa égési fertőzésekben), Infect. Immun. 19, 596-607 (1977)]

Exotoxin A-val reaktív rágcsáló monoklonális antitesteket készítettek és vizsgáltak állatokban Galloway D. és munkatársai [„Production and Characterization of Monoclonal Antibodies to Exotoxin A írom Pseudomonas aeruginosa” (A Pseudomonas aeruginosából eredő exotoxin A elleni monoklonális antitestek előállítása és jellemzése), Infect. Immun. 44, 262-267 (1984)]. Néhány egér monoklonális antitestről ebben a közleményben leírták, hogy képes volt semlegesíteni

HU 205 630 Β az exotoxin A-t in vitro, és állítólag közvetett módon megnövekedett túlélésről is számoltak be az égett, P. aeruginosával fertőzött egérmodelleken.

Természetesen egy egér monoklonális antitest, miközben valószínűleg hasznos egerek kezelésében, nagyobb problémát jelent az emberi alkalmazásnál. A humán immunrendszertől elvárható, hogy általában bármiféle egér monoklonális antitestet idegen anyagként ismer fel. Ez a felismerés legalábbis az egér antitest meggyorsított kiürítéséhez vezet, csökkentve terápiás potenciálját [lásd Levy R. és Miller R. „Tumor Therapy with Monoclonal Antibodies” (Tumor-terápia monoklonális antitestekkel), Fed. Proc. 42, 2650-2656 (1983)]. Súlyosabb esetekben a rágcsáló-fehéijére adott immunválasz sokkot, vagy akár halált is eredményezhet, amelyet többek között egy „szérumbetegség”gel analóg allergiás reakció okoz. A klinikai tapasztalatok azt mutatják, hogy az ilyen humán immunrendszer-válaszok az egér mokolonális antitesteket kapott betegek mintegy felében korlátozzák az egér monklonális antitestek hatékonyságát [Sears H. és munkatársai: Phase I Clinical Trial of Monoclonal Antibody in Treatment of Gastrointestinal Tumor” (Monoklonális antitestek klinikai kipróbálásának első fázisa gyomorbél tumor kezelésében), Láncét, 1, Ί62-Ί6Α (1982); és Miller R. A. és munkatársai: „Monoclonal Antibody Therapeutic Trials in Seven Patients with T-cell Lymphoma” (Monoklonális antitest-terápiás kísérletek hét, T-sejt limfómában szemvédő betegben), Blood, 62, 988-995 (1983)]. A rágcsáló monoklonális antitestek ezért minimális hasznosításra számíthatnak a passzív immunizáláshoz emberekben.

így igény van olyan monoklonális antitestekre, amelyek képesek kötődni exotoxin A-hoz és semlegesíteni azt, valamint olyan antitestekre, amelyek csak minimális mértékben immunogének emberekre. Szükség van ilyen monoklonális antitestek és P. aeruginosa fertőzések kezelésében használható kompozíciók előállítására szolgáló eljárásokra. A jelen találmány kielégeti ezeket az igényeket.

Röviden összefoglalva a jelen találmány olyan humán monoklonális antitesteket nyújt, amelyek képesek semlegesíteni a Pseudomonas aeruginosa exotoxin A toxikus hatásait, valamint eljárásokat nyújt ilyen antitestek előállítására. Ezek a humán monoklonális antitestek használhatók a Pseudomonas aeruginosa fertőzések elleni passzív immunizálásban.

Részletesebben a találmány eljárást nyújt bakterémiára és/vagy szeptikémiára fogékony emberek kezeléséhez olyan kompozíció megelőző vagy terápiás mennyiségének beadásával, amely kompozíció legalább egy, az exotoxin A-val fajlagosan reakcióba lépni és azt semlegesíteni képes humán monoklonális antitestet tartalmaz; ez a komozíció előnyösen magába foglal fiziológiásán elfogadható hordozót is. Ezenkívül, csak a példa kedvéért és nem korlátozás céljából említve, a kompozíció tartalmazhat még egy vagy több anyagot az alábbiak közül: egy második humán monoklonáEs antitest, amely képes reagálni a Pseudomonas aeruginosa lipopolíszacharid molekuláján levő szerotípus determinánssal; gamma-globulin frakció humán vérplazmából, ahol a plazmát olyan emberből nyerjük, aki Pseudomonas aeruginosa-val és/vagy termékeivel reaktív immunglobulinok emelt szintjeit mutatja; és egy vagy több antimikrobiális szer.

A jelen találmány szerinti humán monoklonáEs antitesteket sejtvonallal lehet előállítani, pl. Epstein-Barr vírus transzformációval immortalizált humán limfocita sejtvonallal. Az ilyen sejteket ezután lehet tenyészteni, és ezekből a humán monoklonális antitesteket kinyerni bármelyik jól ismert eljárással.

A találmány egyéb vonásai és előnyei nyilvánvalóvá válnak az ezután következő részletes leírásból, amely példák útján írja le a jelen találmányt.

Az alábbiakban megadjuk az ábrák rövid leírását.

Az 1. ábra két különböző, jelen találmány szerinti humán monoklonális antitest immunfoltelemzése, és azt mutatja be, hogy ezek az antitestek felismerik az exotoxin A-t, amint ezt egy 71000 daltonos molekulához való kötődésük igazolja, amelyet a fajlagos nyúl antiexotoxin A antitest is felismer.

A 2. ábra immunfolt, amely azt mutatja be, hogy a jelen találmány szerinti két humán monoklonális antitest reagál a Pseudomonas aeruginosa mind a hét Fischer-féle immuntípusa által termelt exotoxin A-val.

Az alábbiakban a részletesebben ismertetjük az eljárás speciáhs kiviteE módjait.

A jelen találmánnyal összhangban eljárást nyújtunk a Pseudomonas aeruginosa exotoxin A-ra fajlagos és ennek toxikus hatásainak semlegesítésére képes humán monoklonális antitestek termeléséhez és alkalmazásához, A „semlegesítés” kifejezést a továbbiakban olyan reakciók eredményeire alkalmazzuk (antitest-, kEnikai, fizikai és más reakciók), amelyek az exotoxin A toxikus hatásainak csökkentését vagy kívánatos megszüntetését eredményezik, amint ezt pl. citotoxicitás-gátlási mérésekkel, az emlősök védelmével az exotoxin A halálos dózisa ellen, stb. bizonyítjuk. A humán monoklonális antitestet passzív immunizáláshoz olyan emberi gazdaszervezetekbe adhatjuk be, akik a bakterémiára és/vagy szeptikémiára való fogékonyság tüneteit mutatják. Az ilyen kezeléseknél a monoklonális antitestek főleg összetett terápiában hasznosíthatók, azaz Pseudomonas aeruginosa vagy más gram-negatív baktériumok Epopoliszacharid molekuláin levő szerotípus determinánsokra fajlagos humán monoklonális antitestekkel; humán vérplazmából származó gamma-globulin frakcióval (főleg amikor a plazmát olyan emberből kapjuk, aki Pseudomonas aeruginosa-val reaktív immunglobulinok emelt szintjét mutatja); valamint különböző antimikrobiális szerekkel együtt.

A humán monoklonális antitesteket előnyösen olyan humán donorokból kapott B-limfocita sejtekkel termeljük, amely donorok Pseudomonas aeruginosa fertőzésnek voltak kitéve, és akik erős immunválaszt fejtettek ki a fertőzésre. Egy másik módszer szerint egy emberi gazdaszervezetet érzékenyítünk exotoxin A-val vagy más megfelelő antigénekkel jól ismert technikák szerint [lásd pl. Jones R. és munkatársai: „Control Trial of Pseudomonas Immunoglobulin and Vaccine in Bum

HU 205 630 Β

Patients” (Pseudomonas immunglobulin és vakcina szabályozási kísérlete égett betegekben), The Láncét, 1263-1265 (1980)], és vérüket gyűjtjük. Tipikus módszer szerint a gazdaszervezetet szubkután vakcináljuk eegy hetes időközökben és az utolsó injekció után három héttel vért veszünk tőle. Ha kívánatos, a gazdaszervezetet újravakcináljuk szubkután emlékeztető injekcióval, és három héttel később újra vért veszünk tőle.

Mononukleáris sejteket kaphatunk perifériális vérből, lépből, csontvelőből vagy nyirokcsomókból, és az ezekben levő egyéb komponensektől ismert módszerekkel különíthetjük el, pl. Ficoll-Paque-on át. AT-sejteket elkülöníthetjük bármilyen kényelmes technikával, pl. tömeges E-rozetta képzéssel.

A mononukleáris sejtek elkészítésében az ezt követő immortalizálásához különböző változatok is lehetségesek, ezek között találjuk az el nem különített lépsejtek alkalmazását a T-sejtben kimerült lépsejtekkel szemben, a mutagénnel stimulált sejtek alkalmazását a nem stimulált sejtekkel szemben és egyéb hasonló eljárásokat. Az alkalmazott technika természetesen változik az alkalmazott nem pusztaiévá tételi folyamat sikerétől függően.

A jelen találmány szerinti monoklonális antitesteket előnyösen a B-limfocita sejtek sejthajtott Epstein-Barr vírus (EB V) transzformációjával állíthatjuk elő. Az így előllított transzformált sejteket úgy jellemezzük, mint olyan folyamatosan növekvő-limfoblasztoid sejteket, amelyek diploid kariotípusúak, Epstein-Barr nukleáris antigén pozitívak, és IgG, IgM, IgAvagy IgD izotípusú mononukleáris antitesteket választanak ki, beleértve az IgGl, IgG2, IgG3 és IgG4 altípusokat. A sejt-hajtott transzformációs eljárás maga Lostrom Μ. E. találmánya, aki a jelen találmány egyik feltalálója; ez az eljárás részletesen le van írva a 4 464 465 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amely ebbe a bejelentésbe referenciaként van beépítve.

Egy másik módszer szerint a limfocitákat lehet EBV-vel transzformálni olyan módon, hogy nem pusztuló limfoblasztoid sejtek keletkezzenek, amelyeket lehet alkalmazni egy ezt követő fúzióban egy fúziós partnerrel [lásd pl. Brown és Miller J. Immunoi. 728,24-29 (1982)].

A fúziós partnerek széles választékát lehet alkalmazni, amelyek a fentebb leírt különböző immuntípusú humán immunglobulinok kiválasztását szolgáltatják. A fúziós partner lehet egér mielóma vonal; heteromielóma vonal vagy humán melóma-, vagy más nem pusztalóvá tett vonal, mint pl. amelyeket a következő irodalmi helyek leírnak: 81-00957 számú PCT bejelentés; Schlom és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77, 6841-6845 (1980); és Croce és munkatársai: Natúré 288,488-489 (1980).

A fúziós partner kívánatos jellenzői: a fúzió nagy hatékonysága, hogy az immunglobulin-termelő hibridómák nagy hányadát nyújtsuk; a szóban forgó immunglobulinnal nem társult egyedi láncok vagy immunglobulinok termelésének a hiánya és a kívánt immunglobulin folyamatos kiválasztási képességének fenntartása hosszú időtartamon át. A fúziót általában nemionos detergens jelenlétében hajtjuk végre normális esetben polietilénglikol jelenlétében rövid időtartamon át, a detergenst eltávolítjuk és a sejteket olyan szelektív körülmények hatásának tesszük ki, amelyek a szülősejtekre citotoxikusak, de a fúzionált sejtekre nem (pl. HAT, HAT és ouabain stb.).

A hibridsejteket, amelyek a szelektív tápközegekből kinőnek, egyedi üregekbe oltjuk és átvizsgáljuk bármilyen alkalmas technikával a szóban forgó monoklonális antitestekre. Előnyösen azonban az átvizsgálást funkcionális vizsgálatokat alkalmazva hajtjuk végre, mint pl. citotoxicitásgátlás-méréssel, hogy növekedjék annak valószínűsége, hogy az izolált kiónok képesek lesznek semlegesítő antitesteket előállítani.

A megfelelő nomoklonális antitesteket kiválasztó sejteket azután határhígítási eljárással klónozzuk, és a fajlagos antitest magasabb szintjeit termelő kiónokat ezután szaporítjuk. Amikor szükséges, az antitesteket lehet tovább jellemezni osztályonként és alosztályonként.

Az antitesteket bármilyen alkalmas technikával lehet tisztítani, pl. kromatográfiával, elektroforézissel, kicsapással és extrahálással vagy hasonló módszerekkel.

Az antitesteket azután további változtatás nélkül alkalmazhatjuk tisztítás után, vagy módosíthatjuk különböző méretű ffagmensekre (pl. F/ab’/2’ Fab, Fv vagy hasonlók) való csökkentéssel. Bizonyos esetekben kívánatos az antitesteket összekapcsolni más anyagokkal (pl. citotoxikus szerek, jelzések stb.) egyes célzott eredmények elérésére. Részletesebben, az antitesteket lehet összekapcsolni különböző olyan konjugátamrészekkel, amelyek képesek a komjugátam félélettartamát szabályozni a szérumban a humán gazdaszervezetbe való injekció után.

A jelen találmány szerinti sejtvonalak alkalmazást találhatnak más területen is, nemcsak a humán monoklonális antitestek közvetlen termelésében. A sejtvonalakat lehet fúzionálni más sejtekkel is a monoklonális antitestek kifejezését nyújtó gének átvitelével, így szolgáltatva új hibridómákat. Egy más módszer szerint a sejtvonalakat fel lehet használni az immunglobulinokat kódoló kromoszómák forrásaiként, amelyeket a fúziótól eltérő technikákkal lehet izolálni és sejtekbe átvinni. Ezenkívül a monoklonális antitesteket kódoló géneket lehet izolálni és alkalmazni a rekombináns DNStechnikákkal összhangban a fajlagos immunglobulinok termeléséhez gazdaszervezetek széles választékában. Főleg a hírvivő RNS-ből cDNS-könyvtár készítésével az immunglobulint kódoló és intronoktól mentes egyedi cDNS-kónokat lehet izolálni és megfelelő prokarióta vagy eukarióta kifejeződő vektorokba helyezni, majd ezt követően ezeket a vektorokat valamely gazdaszervezetbe lehet transzformálni a befejeződő tömegtermeléshez.

Az exotoxin A-ra fajlagos monoklonális antitestek hasznosítást nyerhetnek számos kutatási, termelési és diagnosztikai alkalmazásban, jól ismert technikákkal

HU 205 630 Β összhangban [lásd általában: „Immunological methods” (Immunológiai módszerek), I. és II. kötet, szerkesztették: Lefkovics I. és Pemis B., Academic Press, New York, New York (1979 és 1981); valamint „Handbook of Experimental Immunology” (A kísérleti immunológia kézikönyve); szerkesztette: WeirD., Blackwell Scientific Publications, St. Louis, Missouri (1978)]. így pl. ezeket a monoklonális antitesteket a sejtvonalfelülúszóból meg lehet tisztítani és szilárd rögzítőanyagra kötni (pl. cianogén-bromiddal aktivált Sepharose 4B, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey), ezt az anyagot lehet alkalmazni exotoxin A affinitáskromatográfiás tisztításához, főleg módosított vagy fragmentált formában vakcinákhoz.

A jelen találmány szerinti monoklonális antitesteket be lehet építeni komponensként olyan gyógyászati kompozíciókba, amelyek ilyen antitestek legalább egyikének terápiás vagy megelőző mennyiségét tartalmazzák gyógyászatilag hatásos hordozóval együtt. Gyógyászati hordozó lehet bármilyen összeférhető, nem toxikus anyag, amely alkalmas arra, hogy a monoklonális antitesteket átadja a betegnek. Steril víz, alkohol, zsírok, viaszok és közömbös szilárd anyagok alkalmazhatók hordozóként. Gyógyászatilag elfogadott adjuvánsokat (pufferolószerek, diszpergálószerek) szintén be lehet építeni a gyógyászati kompozícióba. Ilyen komozíciók tartalmazhatnak csak egyedi monoklonális antitestet is, amely csupán az exotoxin A-ra fajlagos,

Egy más módszer szerint a gyógyászati kompozíciók tartalmazhatnak két vág több monoklonális antitestet, „koktél”-t képezve. Példaként egy Pseudomonas aeruginosa fertőzésekhez alkalmas koktél, amely az emberi betegségekben legelterjedtebb immuntípusú vagy szeretípusú lipopoliszacharidok elleni egy vagy több humánmonoklonális antitestet tartalmaz, kombinálva lehet egy vagy több, exotoxin A-t semlegesíteni képes humán monoklonális antitesttel. Az ilyen monoklonális antitesteket (Anti-LPS Monoclonals) termelő példának alkalmas sejtvonal, amely ebből a szempontból használható, előállítását a 614 184 sorozatszámú és 734 624 sorozatszámu amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben írják le, amelyeket ebbe a bejelentésbe referenciaként építünk be. Egy ilyen kombináció növelheti az aktivitást a legtöbb baktériumtörzs ellen.

A jelen találmány szerinti humán monoklonális antitesteket lehet meglevő vérplazmakészítményekkel kombinálva alkalmazni, pl. kereskedelmi forgalomban levő gamma-globulinokkal vagy a P. aeruginosa vagy más gram-negatív bakteriális betegségek emberekben való megelőző vagy terápiás kezelésében széles körben használt immunglobulin-termékekkel kombinálva. Előnyösen az immunglobulinokhoz a plazmát olyan humán donoroktól kapjuk, akik a P. aeruginosával (pl. endotoxinok exotoxinok, stb.) reaktív immunglobulinok emelt szintjeit mutatják. Lásd általában az „Intravenons Immuné Globulin and the Compromised Hőst” (Intravénás immunglobulin és a veszélyeztetett gazdaszervezet) című kivonatot [Amer. J. Med. 76 (3a), 1984. március 30,1-231. oldal], amely ebbe a bejelentésbe referenciaként van beépítve.

A jelen találmány szerinti monoklonális antitesteket lehet alkalmazni külön beadott olyan komozícióként, amely antibiotikumokkal vagy amtimikrobiális szerekkel van összekapcsolva. Tipikusan az antimikrobiális szerek között találunk egy Pseudomonas ellenes penicillint (pl. karbenicillint) egy aminoglükoziddal (pl. gentanicin, tobramicin stb.) együtt, de számos további szer (pl. cefalosporin), amely jól ismert azok számára, akik a szakterületen jártasak, szintén alkalmazható. Lehetséges hatásos kombinációs kezelések vagy koktélok lehetnek pl. a következők: Anti-exotoxin A + anti -LPS monoklorális antitestek + antibiotikumok;

Anti-exotoxin A + anti-LPS monoklonális antittestek;

Anti-exotoxin A + antibiotikumok;

Anti-exotoxin A + gamma-globulin + antibiotikumok;

Anti-exotoxin A + immun-globulin;

Anti-exotoxin A + immun-globulin + antibiotikumok;

Anti-exotoxin A + gamma globulin.

A jelen találmány szerinti humán monoklonális antitestek különösen alkalmasak orális, helyi vagy parenterális beadáshoz. A gyógyászati kompozíciókat előnyösen be lehet adni parenterálisan, azaz szubkután, intramuszkulárisan vagy intravénásán. így egy előnyös kiviteli formában a jelen találmány kompozíciót nyújt parenterális beadáshoz, a kompozíció egy vagy több humán monoklonális antitest oldatát tartalmazza megfelelő hordozóban, általában vizes hordozóban oldva. Vizes hordozók széles választéka alkalmazható, pl. víz, pufferolt víz, 0,4%-os sóoldat, 0,3%-os glicinoldat és hasonlók. Ezek az oldatok sterilek, és általában mentesek szilárd részecskéktől. Ezeket a kompozíciókat hagyományos, jól ismert technikákkal lehet sterilezni. A kompozíciók tartalmazhatnak gyógyászatilag elfogadható járulékos anyagokat, ha szükséges, hogy közelebb kerüljünk a megfelelő fiziológiai körülményekhez, ilyenek lehetnek pl. a pH-beállító és pufferolószerek, toxicitás beállító szerek és hasonlók, pl. nátrium-acetát, nátrium-klorid, kálium-klorid, kalcium-klorid, nátrium-laktát stb. A jelen találmány szerinti antitestek koncentrációja ezekben a kiszerelésekben széles határok között változhat, pl. kevesebb, mint 1%-tól egészen 15-20 tömeg%-ig, és a koncentrációt elsősorban a folyadéktérfogatokra, viszkozitásra stb. alapozva választják meg, előnyösen a választott beadás adott módjához.

így ^egy tipikus gyógyászati kompozíciót intravénás infúzióhoz lehet készíteni, amely 250 ml steril Ringeroldatot és 50 mg monoklonális antitestet tartalmaz. Parenterálisan beadható kompozíciókhoz tartozó aktuális módszerek ismeretesek vagy nyilvánvalóak azok számára, akik a szakterületen jártasak, ilyenek pl. részletesen le vannak írva a következő irodalmi helyen: Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary; Mack Publishing Company kiadása, Easton, Pennsylvania (1980); ez az irodalmi hely referenciaként van beépítve ebbe a bejelentésbe.

A monoklonális antitesteket lehet liofilezni tárolás5

HU 205 630 Β hoz, és helyreállítani megfelelő hordozóban használat előtt. Ezt a technikát hatásosnak mutatták be hagyományos immunglobulinokkal, és különböző jól ismert liofilezési és helyreállítási technikát lehet alkalmazni. Azok, akik a szakterületen jártasak, méltányolni tudják, hogy a liofilezés és helyreállítás az antitestaktivitás változó mértékű elvesztéséhez vezethet, és hogy a használati szinteket be lehet állítani ennek a kiegyensúlyozására.

A jelen humán monoklonális antitesteket vagy koktéljaikat tartalmazó kompozíciókkal be lehet adni Pseudomonas aeruginosa bakteriális betegség megelőzéséhez és/vagy terápiás kezeléséhez. A terápiás alkalmazásban a kompozíciókat olyan betegeknek adjuk be, akik már Pseudomonas aeruginosa-val fertőzöttek, és a kompozíciókat olyan mennyiségben adjuk be, amely elegendő a gyógyuláshoz vagy legalábbis a fertőzésnek és komplikációinak részleges leküzdéséhez. Azt a mennyiséget, amely megfelel ennek a célnak a teljesítéséhez, „terápiásán hatásos dózisaként határozzuk meg. Az ehhez az alkalmazáshoz hatásos mennyiség függ a fertőzés súlyosságától és a beteg saját immunrendszerének általános helyzetétől, de általában az 1200 mg antitest/testsúlykilogram tartományban 5-25 mg/kg-os adagokban a leggyakrabban alkalmazott. Figyelembe kell venni, hogy a jelen találmány szerinti anyagokat általában súlyos betegségi állapotokban is lehet alkalmazni, beleértve az életveszélyes és lehetségesen életveszélyes helyzeteket, különösen a bakterémiát és toxémiát. Ilyen esetekben az „idegen anyag” miatti aggályok azok tulajdonképpeni teljes távolléte miatt elvethetők, hiszen a jelen találmány szerinti monoklonális antitestekkel elérjük ezt az állapotot, így lehetséges és kívánatosnak is érezhető a kezelőorvos számára, hogy ezeknek az antitesteknek jelentős fölöslegét adja be.

A megelőző kezelésekben a jelen találmány szerinti monoklonális antitesteket vagy koktéljaikat tartalmazó kompozíciókat olyan személyeknek adjuk, akikről bár úgy ítéljük meg, hogy P. aeruginosa súlyos fertőzése megszerzésének kockázata áll fenn, de még nincsenek fertőzve ezzel a baktériummal. Egy ilyen mennyiséget „megelőzéshez hatásos adag”-nak határozzuk meg. Ennek alkalmazásában a pontos mennyiség ismét függ a beteg egészségi állapotától és immunitásának általános szintjétől, de általában ez a menyiség a 0,1-2,5 mg/kg, elsősorban a 0,5-2,5 mg/kg tartományban van.

A kompozíciók egyszeri vagy többszöri beadását a megfelelő dőzisszintek és típusok beállításával hajthatjuk végre, ezt a kezelő orvos választja meg. Mindenesetre a gyógyászati kiszereléseknek olyan mennyiségű, jelen találmány szerinti antitesteket kell szolgáltatniok, amely elegendő a betegség és ezáltal a beteg hatásos kezeléséhez.

A továbbiakban bemutatjuk a Pseudomonas aeruginosa exotoxin A elleni humán monoklonális antitesteket kiválasztó humán sejtvonalak előállítására szolgáló módszereket, továbbá bemutatjuk az említett antitestek in vivő védő aktivitását exotoxin A halálos kihívása ellen.

A) Megfelelő humán sejtek kinyerése

Humán B-sejteket (limfocitákat) izolálunk cisztás fibrózisban szenvedő betegek perifériás vérmintáiból, amely betegekről tudjuk, hogy krónikus Pseudomonas aeruginosa fertőzésük van. A B-sejteket tartalmazó mononukleáris sejtfrakciókat elkülönítjük a vérből, a Ficoll-Paque-n át végzett standard centrifugálási technikát alkalmazva [Bayum A.: „Isolation of Mononuclear Cells and Granulocystes from Humán Blood” (Mononukleáris sejtek és granulociták izolálása emberi vérből), Scand. J. Clin. Láb. Invest. 21, 97. kiegészítés, 77-89 (1968)]. A felületről begyűjtött monomunkleáris sejteket kétszer mossuk növesztő tápközeggel [Iscove által módosított Dulbecco tápközeg (Gibco N° 4302200), 15% (térf/térf.) hővel aktivált borjúembriószérummal, 2 mmól/l L-glutaminnal, 100 mg/ml streptomicinnel és 100 nemzetközi egység/ml penicillinnel kiegészítve], (Ezt a kiszerelést ezentúl Iscove-tápközegnek nevezzük.) A mosott sejteket megszámoljuk és életképességüket triptonkék életképesség-vizsgáló festék segítségével hemacitométerben megbecsüljük standard technikát alkalmazva. Két különböző humán donorból nyert sejtmintákat készítünk ilyen módon.

B) B-sejtek sejthajtott transzformálása

Az lA2-nek nevezett transzformáló sejtvonal (ATCC CRL 8119) Epstein-Barr nukleáris antigén (EBNA) pozitív humán limfoblasztoid sejtvonal, amely a GM1500 limfoblasztoid sejtvonal etil-metánszulfonátos (EMS) mutageneziséből származik, amelyet 30 mikrogramm/ml 6-tio-guanin jelenlétében végzett altenyésztés követ, hogy a túlélő sejt a hipoxantin-guanin foszforibozil-transzferáz enzimben hiányos legyen, és így HAT-tal (lxl0'⁴mól/l hipoxantin, 4xl0'⁷ mól/1 aminopterin és l,6xl0'⁵ mól/1 timidin) kiegészített növesztő tápközegre érzékeny legyen,

1. Transzformálás

Logaritmikus növekedési fázisban levő 1 A2-sejteket összekeverünk az (A) lépésből származó mosott, perifériás vér mononukleáris sejtekkel 8: 1 arányban. Mintegy 10 000 mononukleáris sejtet és 80 000 1A2 sejtet helyezünk el 96 üreges lemez (Costar 3799) egy-egy kerek fenekű üregébe 200 μΐ, HAT-tal és 0,5 mikrogramm/ml ciklosporin A-val (Sandoz) kiegészített Iscove-tápközegben. A ciklosporin A-t arra használjuk, hogy gátolja a T-limfocíta funkciót. A tenyészeteket először a 6. napon tápláljuk a tenyésztőfolyadék térfogata felének eltávolításával és HAT-tal, valamint ciklosporin A-val kiegészített friss Iscove-tápközeggel való helyettesítésével. A 10., 12. és 13. napokon a tenyésztőfolyadék térfogata felét, illetve háromnegyedét és ismét hátomnegyedét eltávolítjuk és HT-vel (aminopterin nélkül), valamint ciklosporin A-val kiegészített friss Iscove-tápközeg megfelelő térfogatával helyettesítjük. Az EB V-vel transzformált B-sejtek növekedése mikroszóposan vizsgálva nyilvánvalóan látható az ebben a kísérletben alkalmazott tíz 96 üreges lemez üregeinek mindegyikében.

2. Transzformálás

Logaritmikus növekedési fázisban levő 1 A2-sejteket összekeverünk egy második és eltérő donorból szárma6

HU 205 630 Β zó, mosott perifériás vér mononukleáris sejtekkel 3 : 1 arányban. Mintegy 73 000 lA2-sejtet és 24 000 PBL-t helyezünk el tíz 96 üreges lemez egy-egy üregébe, 200 μΙ/üreg, HAT-tal és ciklosporin A-val kiegészített Iscove-tápközegben, amint ezt korábban az 1. transzformálásnál leírtuk. A tenyészeteket a 6., 8., 10. és 13. napon (a kiindulástól számítva) tápláljuk az üregben levő tenyésztőfolyadék-térfogat 50%-ának eltávolításával és HT-vel (aminopterin nélkül), valamint ciklosporin A-val kiegészített Iscove-tápközeggel való helyettesítésével. Az EBV-vel transzformált B-sejtek növekedése mikroszkóposán nyilvánvalóan látható az összes, lemezen levő üregben.

C) Fajlagos antitesteket kiválasztó sejtek kimutatása

A tenyészet felülúszók vizsgálatát az anti-exotoxin A antitestek jelenlétére az 1. transzformálásnál a 15., a 2, transzformálásnál a 17. napon végezzük el. A viszgálat cítotoxicitás-gátlási mérés, amelyet az alábbi módon hajtunk végre.

Indikátorsejteket (egér kötőszövet, L-törzs klón, ATCC CCL1) növesztünk rögzített sejttenyészetként RPMI 1640 (Gbico) tápközegben, amely 15% (térf/térf) hővel inaktivált borjúembrió-szérummal, 1 mmól/1 nátrium-piruváttal, 2 mmól/1 L-glutaminnal, 100 mikrogramm/ml streptomicinnel és 100 nemzetközi egység penicillinnel van kiegészítve (ezt a kiszerelést a továbbiakban RPMI-nek nevezzük). A vizsgálatokhoz az indikátorsejteket lXl0⁴/üreg mennyiségben lemezre helyezzük, egy 96 üreges lapos fenekű lemez (Costar 3596) üregeibe RPMI-ben, és mintegy 48 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten nedves kamrában, 6% CO₂-vel kiegészített környezeti levegőben

Exotoxin A-t részlegesen tisztítunk P. aeruginosa PA103 (ATCC 29260) törzs kimerült tenyészközegéből az Iglewski B. és munkatársai által leírt módszerekkel [„Toxin Inhibitors of Protein Synthesis: Production, Purification and Assay of Pseudomonas aeruginosa Toxin A”(A fehérjeszintézis toxininhibitorai: A Pseudomonasa aerginosa toxin A termelése, tisztítása és vizsgálata], Methods in Enzimology, 60, 780-793, (1979), Academic Press, Inc., New York]. A részben tisztított exotoxin A RPMI-vel képzett hígításait a fentebb leírt módon készített L-sejteket tartalmazó üregekben inkubáljuk. Ezekből a titrálásokból az exotoxinkészítmények egyik hígítását választjuk ki a további vizsgálatokhoz. Ez a hígítás az a legkisebb exotoxinkoncentráciő, amely reprodukálható 100%-os citotoxikus hatást vált ki az L-sejtekben.

Az 1. és 2. transzformációkból származó humán antitesttartalmú felülúszók mérését a következőképpen hajtjuk végre. Mintegy 150 pl RPMI növesztő tápközeget távolítunk el az indikátor sejttenyészetek mindegyik üregéből és félretesszük. A transzformált B-sejttenyészetek (a B részből) mindegyik üregéből vett felülúszó folyadékokat (40 pl) összekeverünk exotoxin A egy 100%-os citotoxicitású adagjával (20 pl-ben), amint erről fentebb már írtunk. Független keverékeket készítünk a transzformált B-sejttenyészet lemeze 96 üregének mindegyikéből. Az így létrejött keverékeket átvisszük indikátorsejtek külön-külön üregeibe, majd °C hőmérsékleten indubáljuk 6% CO₂ jelenlétében.

óra múlva 100 mikroliter Iscove-tápközeget adunk minden egyes üreghez. A lemezeket visszahelyezzük azonos inkubációs körülmények közé, és további 4872 órán át megfigyeljük.

Ha exotoxin A-ra fajlagos, semlegesítő antitest van jelen a transzformált B-sejtek tenyésztőfolyadékában, akkor az indikátor L-sejtekre a toxindózis hatástalan, és így növekszik a 48-72 órás vizsgálati időtartam során. Ha azonban a vizsgált felülúszó nem tartalmaz toxint semlegesítő antitestet, az indikátorsejtek elpusztulnak. Ezek a hatások az egyes üregek mikroszkópos - értékelésével nyilvánvalóak, a sejtnövekedés vagy sejtpusztulás bizonyítékaival az indikátor sejtek számában és/vagy morfológiájában történt változások révén, összehasonlítva a kontrollt tatalmazó üregekkel, amelyek egyedül csak anti-exotoxin A antiszérumot vagy Iscove-tápközeget tartalmaznak. Ezt a vizsgálatot alkalmazva az egyik üregből, amelyet 8B9-nek nevezünk, kapott felülúszóról azonosítjuk, hogy az 1. transzformálásból toxinsemlegesítő aktivitást tartalmaz, és egy másik üregről, amelyet 4A4-nek nevezünk, hasonló toxinsemlegesítő aktivitást állapítunk meg a 2. transzformálásból.

D) Fajlagos antltesttermelő törzsek klónozása 8B9ből és 4A4-ből

A 8B9 és 4A4 üregekből származó sejteket függetlenül egymástól számos (általában három) menet határhígítású klónozásnak vetjük alá, amíg mindegyik vizsgált klónozott felülúszó pozitív reakciót ad. A klónozásokat 96 üreges kerek fenekű lemezeken hajtjuk végre, tápláló sejtekként lxlO⁵ besugárzott (2400 Rád) humán perifériás vér limfocitával (PBL) üregenként. Hét nappal később további lxlO⁵ besugárzott PBL-sejtet adunk mindegyik üreghez. Az így létrejött klónozott sejtvonalakat, amelyek anti-exotoxin A humán sejtvonalakat hoznak létre, 8B9-nek és 4A4-nek nevezzük.

A jelen bejelentés benyújtása előtt az itt leírt 8B9 sejtvonalat és a 4A4 sejtvonalat letétbe helyeztük az American Type Culture Collection-nál, ahol ezek a következő jelöléseket kapták:

8B9: ATCC CRL 8833

4A4: ATCC CRL 8834.

Ε) A 4A4 és 8B9 monoklonális antitestek jellemzése

A 4A4 és 8B9 monoklonális antitestek izotípusa,

A 4A4 és 8B9 monoklonális antitestek izotípusát egy enzimmel kapcsolt immunszorbens mérés (ELISA) alkalmazásával határozzuk meg. Részben tisztított exotoxin A-t hígítunk 1 : 50 arányban PBS-sel, és ebből az anyagból 60 pl-t helyezünk egy 96 üreges lapos fenekű mikrotitráló lemez üregeibe. Egy éjszakán át végzett inkubálást követően a nem abszorbeált antigént leszívjuk és az üregeket egyszer mossuk mosü pufferral [0,9% NaCL + 0,05% (térf/térf) Tween 20]. A 4A4 vagy 8B9 monoklonális antitesteket tartalmazó elhasznált tenyészet felülúszót 1 : 1 arányban hígítjuk PBS-sel (pH 7,2), amely 0,1% Twen 20-at és 0,2% (tömeg/térfogat) szarvasmarhaszérum-albumint (BSA) is tartalmaz, és 50 pl hígított antitestet adunk külön-külön az egyes üregekbe. A lemezt 25 °C hőmérsékleten

HU 205 630 Β inkubáljuk 30 percen át, amely után a felülúszókat eltávolítjuk, az üregeket háromszor mosópufferral öblítjük, és 50 μΐ, kecske antihumán immunglobulin G-vel (IgG), (American Qualex International, N° A1114) vagy antihumán immunglobulin M-mel (IgM) (AQIN° A1124) konjugált tormaperoxidázt adunk minden egyes üreghez. A HRP-kecske anti-IgG-t és HRP-kecske anti-IgM-et 1:5000 illetve 1: 3000 arányban hígítjuk PBS-ben (pH 7,2), amely még 0,05% Twen 20-at és 0,1% BSA-t is tartalmaz. 30 perces 30 °C hőmérsékleten végzett inkubálást követően az enzimkonjugált kecske antitesteket eltávolítjuk, az üregeket háromszor öblítjük mosópufferral, és 100 mikroliter szubsztrátumot [0,8 mg/ml orto-fenilin diamin-dihidroklorid 100 mmól/1 citrátpufferban (pH 5,0), + 0,03% H₂O₂ íonmentesített vízben egyenlő arányban öszekeverve közvetlenül a lemezre helyezés előtt] adunk mindegyik üreghez. A lemezt 30 percig inkubáljuk sötétben, amikor is a reakciót 50 μΐ 3n H₂SO₄-nek az egyes üregekbe való beadásával leállítjuk. Ezekben a kísérletekben pozitív színkifejlődést csak akkor figyelünk meg 4A4 és 8B9 monoklonális antitestekkel, amiokor antihumán IgG reagenst alkalmazunk egyenként a második lépésben, ezáltal azt demonstráljuk, hogy mindkét monoklonáb's antitest IgG izotípusú.

A monoklonális antitestek hatása az ADP ribozilezésre.

A monoklonális anti-exotoxin A-t tartalmazó sejtfelülűszók hatását az exotoxin A ADP-ribouzilezési aktivitásának gátlására a fleülúszónak azzal a képességével becsüljük meg, hogy csökkenti-e vagy meggátolja-e az (adenin-¹⁴C) NAD-ból származó radioaktivitás beépülését a triklór-ecetsavval kicsapható anyagba nyers EF-2 jelenlétében a következő reakcióvázlat szerint:

NAD⁺ +EF-2. exotoxin A. ADP-ribóz-EF-2 + niktotinamid + H⁺

Az EF-2 és az exotoxin előállítására szolgáló részletes módszereket már korábban idéztük itt. Méltányolni kell azonban, hogy jelentős változások történhetnek ezeknek a komponenseknek az egyes készítményei között. Elvileg az (adenin-¹⁴C) NAD és az EF-2 fölösleges mennyiségben van jelen, hogy támogassák a fenti reakciót abban, hogy balról jobbra menjen végbe az exotoxin A jelenlétében. Az exotoxin A, EF-2 és (adenin-¹⁴C) NAD mennyiségét titráljuk, hogy az (adenin¹⁴C) NAD megfelelő átvitelét (beépülés) biztosítsuk a konjugált formájú (adenin-^I4C) ADP-ribóz-EF-2-be; a teljes beépülés a radioaktív ¹⁴C bemenő szám/perc (cpm) 40-60%-a. Az antitest által közvetített gátlási méréseknél fontos a fenti reakcióban az exotoxin Akoncentráciőt úgy beállítani, hogy a toxin ne legyen olyan nagy feleslegben jelen, amely akadályozza a gátlás kimutatását a pozitív kontroll anti-exotoxin A antitestekkel.

A jelen példában részlegesen tisztítót exotoxin A készítményt (a fenti C. fejezetben leírt módon előállítva, de -20 °C hőmérsékleten fagyasztva tárolva) felengedjük, hogy az exotoxin A ADPP-transzferáz aktivitását potencírozzuk [Vasil M. és munkatársai: „StructureActivity Relationships of an Exotoxin of Pseudomonas aeruginosa” (Pseudomonas aeruginosa egyik exotoxinjának szerkezetaktivitás-összefüggései), Infect. Immun. 16, 353-361 (1977)]. Ezt a készítményt azután 1:133 arányban hígítjuk 1. pufferban (50 mmól trisHCL, pH 7,5) és 20 μΐ-t előinkubálunk 2 μΐ kontroll nyúl anti-exotoxin A szérummal (Bjom, fentebb idézett munka) vagy monoklonális antitestet tartalmazó felülúszóval 1 ml-es polipropiléncsőben 1 órán át 25 °C hőmérsékleten. Az inkubálás után búzacsírából származó, részben tisztított EF-2-t [ChungD. és CollierR.: „Enzymatically Active Peptide írom the Adenosine Diphosphate-Ribosylating Toxin of Pseudomonas aeruginosa” (Enzimesen aktív peptid a Pseudomonas aeruginosa adenozin-difoszfát ribozilező toxinjából), Infect. Immun. 16,832-841 (1977)] hígítunk 2: 3 arányban 100 mmól trisz-HCL-t, 0,2 mmól/1 EDTA-t és 100 mmól/1 ditiotreitolt tartalmazó oldattal (pH 8,2), és ebből a hígításból 15 μΐ-t adunk a reakciócsőbe. Ezt azonnal követi 1 μΐ (0,01 pCi) (adenin-¹⁴C)NAD hozzáadása, majd a csövet 1 órán át 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A második inkubálási lépést követően a reakciót leállítjuk az egyes reakciókeverékek ráhelyezésével Whatman 3MM papírra (6,45 cm²), amelyet előzőleg 10%-os triklór-ecetsavval (TCA) impregnáltunk [Ballum F.: „Filter Paper Disk Techniqes fór Assaying Radioactive Macromolecules” (Szűrőpapírkorong-technikák radioaktív makromolekulák vizsgálatához). Methode in Enzymology, 12 B, 169-173 (1968)]. A TCA-oldható anyagot a papímégyzetekről eltávolítjuk három egymást követő 30 perces mosással 10%-os TCA-val. A papímégyzeteket azután röviden mossuk egyszer acetonnal, levegőn szárítjuk, és egyenként csövekbe helyezzük, amelyek 3 ml szcintillácíós folyadékot tartalmaznak.

A TCA-val kicsapható radioaktivitást Beckman LS 70 000 Liquid Scintillation System berendezésen mérjük; az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat

Keze- lés	Antitest	Toxin	EF-2	14C- NAD	CPMa
Ib	1. puffer	+	4-	+	9202
2C	1. puffer	-	4-	4*	116
3	Nyúl antitoxind	+	+	4-	328
4	MAb 6Flle	4-	4-	4-	9120
5	MAb 4A4	+	+	+	7770
6	MAb 8B9	+	+	+	104

a TCA-ban oldahatatlan radioaktivitás szám/perc b A maximális beépítést képviseli -2ml 1. puffer antitest helyett c A minimális beépítést képviseli -22ml 1. puffer antitest és toxin helyeit d Nyúl anti-exotoxin A-t hígítunk 1: 10 arányban 1. puferrel e A6F11 (ATCC CRL 8562) humán monoklonális antitest (MAb) a P. aeruginosa Físher-féle 2-imuntípusű lipopoliszacharid ellen irányul

Az 1. táblázatban bemutatott eredményekből nyilvánvaló, hogy a 8B9 monoklonális antitest nagyon hatásosan gátolja in vitro az exotoxin A ADP-ribozilező aktivitását,

HU 205 630 Β míg a 4A4 monoklonális antitest viszonylag elhanyagolható hatást mutat. A két antitest közötti különbség az in vitro gátlásban azt jelzi, hogy a két antitest az exotoxin A molekulán levő eltérő epitópra irányul. Mivel az exotoxin A ADP-ribozilező aktivitását a 8B9 monoklonális antitest teljesen meggátolja, lehetséges, hogy ez az antitest az exotoxin A molekula enzimhelyén levő epitópra vagy az enzimhely közvetlen szomszédságában levő epitópra irányul. Az utóbbi esetben az antitest és a toxin közti kötés még térbelileg gátolja a molekula enzimes funkcióját. Összehasonlítva viszont a 4A4 monoklonális antitest valószínűleg olyan epitóp ellen irányul a molekulán, amely valamiképpen eltávolodott az enzimhelytől, és antitoxikus aktivitását az exotoxin A molekulának azzal a részével reagálva fejti ki, amely a toxinreceptorhoz kötődik a fogékony sejtfelületeken (Vasil, fentebb idézett munka).

Humán monoklonális anti-exotoxin A antitestek immunfoltelemzése

A 4A4 és 8B9 monoklonális antitestek, mint antiexotoxin A antitestek fajlagosságának igazolását immunfoltelemzéssel hajtjuk végre. Ebből a célból a P. aeruginosa PA-103 törzsből származó, részben tisztított exotoxin A-t (amelyet a fentebb leírtak szerint készítettünk) először 1: 15 arányban hígítunk PBS-ben. Négy azonos mintát készítünk az alábbi módon. 30μ1 hígított exotoxin A-t egyesítünk 5μ1 disszociációs pufferral [0,3125 mól/1 trisz-hidroklorid (pH 6,8), 25% SDS és 1,72 mól/1 ditiotreitol], 5 percen át 100 °C hőmérsékleten melegítjük, szobahőmérsékletre lehűtjük, majd egyesítjük 20μ1 oldattal, amely 75% glicerinből és 25% 0,25%-os brómfenolkék törzsoldatból áll. Mindegyik mintát nátrium-dodecil-szulfát—poliakrilamid gél elektrofórézisnek vetjük alá (SDS-PAGE) 10%-os gélen, Laemmli U. módszere szerint [„Cleavage of Structural Protein During The Assembly of the Head of Bacteriophage T4”(Struktúrfehérje hasítása a T4 bakteriofág fejének összeállítása során), Natúré, 227, 680685 (1970)]. Az elkülönített molekulafajtákat a gélről nitrocellulóz szűrőre visszük át (NCM), amint ezt Towbin H. és munkatársai leírták [„Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedúra and Somé Applications” (Fehérjék elektroforetikus átvitele poliakrilamid gélről nitrocellulóz lapokra: Eljárás és néhány alkalmazás) Proc. Natl. Acad.. Sci, 76, 4350-4354 (1979)], és az NCM foltot rögzítjük két órán át PBS-Tween-ben [Batteiger B. és munkatársai: „The Use of Tween 21 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Proteins Transferred to Nitrocellulose Membranes” (Tween 20 alkalmazása rögzítőszerként a nitrocellulóz membránra átvitt fehérjék immunológiai kimutatásában). J. Immunoi. Meth. 55, 297-307 (1982)]. Egyedi nyomokat vágunk ki az NCM foltból és külön-külön inkubáljuk ezeket 1 órán át 25 °C hőmérsékleten 40 ml nyúl antiexotoxin A-val (amelyet Bjorn fentebb idézett közleménye alapján készítettünk], amelyet előzőleg 1 : 1000 arányban PBS-Tween-nel hígítottunk, vagy humán monoklonális antitestekkel, amelyeket előzőleg 1 : 10 arányban PBS-Tween-nel hígítottunk. PBS-Twen-nel végzett 5 perces mosást követően az NCM foltok mindegyikét 1 órán át inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten kecske anti-humán IgG+IgA+IgM-mel konjugált alkalikus foszfatáz 1: 100 arányú hígításával (megjegyezendő, hogy ennek a Zymed cégtől származó reagensnek erőteljes keresztreaktivitása van nyúl immunglobulinokra). Ezeknek a foltoknak mindegyikét 5 perces mosásnak vetjük alá PBS-Twen-ben, amely idő után antigén-antitest köcsönhatást teszünk láthatóvá a foltokat 20-30 percen át 25 °C hőmérsékleten 30 ml nitro-tetrazólium-kék/5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát (NBT-BCIP) szubsztrátumban inkubálva, amint ezt Leary és munkatársai leírták [„Rapid and Sensitive Colorimetric Method fór Visualizing Biotin-Labeled DNA Probes Hybridized to DNA or RNA Immobilized on Nitrocellulose: Bio-Blots” (Gyors és érzékeny kolorimetriás módszer nitrocellulózon immobilizált DNShez vagy RNS-hez hibridizált, biotinnal jelzett DNSvizsgáló minták láthatóvá tételére: Bio-foltok), Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 4045-4059 (1983]. A színkifejlődést a foltok többszöri átöblítésével állítjuk le ionmentesített vízzel.

Amint az 1. ábrában látható, a 4A4 és 8B9 monoklonális antitestek reakciómintái csaknem azonosak egy fajlagos nyúl anti-exotoxin A antitest reakciómintával. A reakciómintákban mindhárom esetben egy 71000 daltonos molekula felismerhetően uralkodik, amely a natív exotoxin A polipeptidet képviseli (Vasil, fentebb említett munka) azt mutatva, hogy a 4A4 és 8B9 monoklonális antitestek az exotoxin A ellen irányulnak. Ennek a fajlagosságnak további bizonyítékát nyújtja az a tény, hogy egy kontroll humán monoklonális antitest (C5B7) nem reagál az exotoxin A készítménnyel.

Szintén figyelemre méltó a foltokban a 8B9 monoklonális antitest reakciója számos kisebb molekulatömegű exotoxin A bomlástermékkel, amelyet a 4A4 monoklonális antitest láthatóan nem ismer fel. Ez ismét csak támogatja azt az elképzelést, hogy a két monoklonális antitest különböző epitópokat ismer fel az exotoxin A molekuláin.

Az immunfoltelemzés hasznosítható annak demonstrálására is, hogy a 4A4 és 8B9 monoklonális antitestek reagálnak a P. aeruginosa hét Fisher-féle immuntípusának bármelyike által termelt exotoxin Aval [Fisher M. W. és munkatársai: „New Immunotype Scheme fór Pseudomonas aerginosa Based on Protective Antigens” (Védő antigéneken alapuló új immuntípusséma Pseudomonas aeruginosa-hoz), J. Bacteriol. 98, 835-836 (1969)]. Ezekhez a kísérletekhez exotoxin A nyers preparátumait készítjük el a P. aeruginosa hét Fisher-féle immuntípusának mindegyikéből és a PA103 törzsből. A P. aeruginosa hét immuntípusának és a PA-103 törzsnek a tenyészlevéből baktériummentes tenyészet felülúszót állítunk elő, amint ezt Bjorn és munkatársai leírták [„Effect of írón on Yields of Exotoxin A in Culture of Pseudomonas aeruginosa PA-103 „(Avas hatása az exotoxin a termelésére Pseudomonos aeruginosa PA = 103 tenyészetében). Infect. Immun. 19, 785-791 (1978)]. Az (összesen 8) exotoxin A-tartalmú felülúszó mindegyikének kis térfogatát ezután mintegy nyolcadára koncentráljuk Amicon Centricon-30 mikro9

HU 205 630 Β koncentrátorban (Amicon 4208) a gyártó útmutatásai szerint. Az SDS-PAGE-hoz való mintakészítést úgy hatjuk végre, amint ezt fentebb leírtuk, de a következő módosításokkal: Az egyes nyers exotoxinkészítmények 190 μΐ = ét disszociáció pufferral, és hőkezelés után 50 μΐ glicerin/festék puffért adunk hozzá. 50 mikroliter mintát elektroforézisnek vetünk alá minden egyes preparátumból. Az immunfolteljárás további részét úgy hajtjuk végre, amint fentebb leírtuk, azzal a kivétellel, hogy mind a nyolc koncentrált nyers exotoxin felülúszót a 4A4 vagy 8B9 monoklonális antitesteknek teszszük ki hígítatlan koncentrációban egy NCM folton és nem egyedi nyomokon. Amint ezt a 2. ábrában bemutatjuk, a 4A4 és 8B9 monoklonális antitestek reagálnak mind a hét Fisher-féle immuntípusú törzs és a PA-103 törzs által termelt 71000 daltonos exotoxin A molekulával. Ezek az adatok azt sugallják, hogy a 8B9 és 4A4 monoklonális antitestek reagálhatnak lényegében az összes olyan P. aeruginosa törzs exotoxin A-jával, amely törzsek ezt a toxint termelik. F. A védőhatás tanulmányozása monoklonális antitestekkel

Azokat a kísérleteket, amelyek a 4A4 és 8B9 monoklonális antitesteknek az exotoxin A toxikus hatásai semlegesítésére való képességének becslésére szolgálnak, a következőképpen hajtjuk végre. Mindkét antitestet először koncentráljuk a felhasznált tenyészet felülúszóból telített ammónium-szulfáttal végzett kicsapással (50% végső koncentráció) [Good A. és munkatársai: „Purification of Immunoglobulins and Thei Fragments” (Immunglobulinok és fragmenseik tisztítása), a Selected Methods in Cellular Immunology c. kiadványban, szerkesztők: Mishell B. és Shiigi S., W. H. Freman and Company, San Francisco, Kalifornia 279-286 (1980)]. A kicsapott anyagot PBS-ben helyreállítjuk, erőteljesen dializáljuk PBS ellen, és sterilre szűrjük. Humán monoklonális antitestet (C5B7), amely a Fisher-féle 1. immuntípusú P. aeruginosa lipopoliszacharídja ellen irányul, hasonló módon kezelünk. Nyers exotoxin A készítményt állítunk elő a korábban leírt módon immunfoltelemzéshez, azzal a kivitellel, hogy a baktériumok eltávolítása után a tenyészetből az exotoxin A tartalmú felülúszót először 1: 4 arányban hígítjuk 4 °C hőmérsékleten ionmentesített vízzel. Ezt azután mintegy 120-ad részére koncentráljuk i.( telített ammónium-szulfáttal végzett kicsapással (75% végső koncentráció; ii.) a csapadék szolubilizálásával 0,01 mól/l trisz. HCL-t (pH 9,0) és 2 mmól/1 béta-merkapto-etanolt tartalmazó oldatban; és iii.) erőteljes dialízissel azonos pufferral szemben. Ezt az anyagot-70 °C hőmérsékleten lefagyasztjuk, és frissen felengedtetve alkalmazzuk a védőhatás tanulmányozásához.

Nőstény, 20-22 gramm testsúlyú BALB/c egereket három csoportba osztunk, mindegyik csoport 10 egérből áll. Az egyik csoportot intraperitoneálisan (i.p.) inokuláljuk 0,5 ml koncentrált 8B9 vagy 4A4 antitesttel, míg a következő csoport 0,5 ml koncentrált C5B7 antitestet kap negatív kontrollként. Az utolsó csoport semmit sem kap. Négy órával később mindegyik állat 0,3 ml fiziológiás sóoldatban hígított nyers exotoxin A készítményt kap i.p., amely 2-3 LD₅₀ dózist képviselő kihívást jelent. Az állatokat öt napos időtartamon át figyeljük. A kísérletben az öszes állat, amely nem kapott, 36 órán belül elpusztul. Azok közül az állatok közül, amelyek 8B9 antitestet kaptak, egy kivételével mindegyik életben van a 36. óra végén, és teljesen gyógyultak a megfigyelési időtartam végére. Hasonlóképpen a 4A4-gyel végzett kísérletekben az összes állat, amely 4A4 antitestet kapott, életben van a 36. óra végén, és teljesen gyógyult a megfigyelési időtartam végén. Ezek a kísérletek azt demonstrálják, hogy mind a 8B9 mind a 4A4 anti-exotoxin A antitestek képesek hatékonyan semlegesíteni az exotoxin A egyébként halálos kihívását.

Az előzőekből méltányolható, hogy a jelen találmány szerinti humán monoklonális antitestek gyakorlati eszközt jelentenek az exotoxin A toxikus hatásainak semlegesítésében. Fontos, hogy ezek az antitestek csak minimálisan immunogének emberekre, és alkalmasak terápiás vagy megelőzési célra vagy egyedül, vagy más szerekkel együtt. Ezenkívül ezek az antitestek könnyen és gazdaságosan előállíthatók sejtvonalakból, pl. szövettenyészetből.

Bár a jelen találmányt az előzőekben részleteiben ismertettük a jobb bemutatás és példaszerű kitanítás érdekében, nyilvánvaló, hogy különböző változtatások és módosítások lehetségesek az eljárásban anélkül, hogy eltérnénk a mellékelt igénypontok oltalmi körétől és szellemétől.

Két jelen tanulmány szerinti nem pusztuló humán limfocita sejtvonalat, a 8B9 és 4A4 jelűeket, letétbe helyeztünk az ATCC-nél 1985 június 4-én, ahol azok az ATCC CRL 8833, illetve ATCC CRL 8834 letéti számot kapták.

Claims (7)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás Pseudomonas aeruginosa exotoxin A toxikus hatását gátló és arra specifikus monoklonális antitesteket termelő immortalízált sejtvonal előállítására,azzal jellemezve, hogy az endotoxin hatásának kitett humán donorokból származó B-limfocitákat immortalizálunk, és az így' nyert, fenti monoklonális antitesteket termelő sejtvonalakat Pseudomonas aeruginosa exotoxin A-citotoxicitást gátló hatás alapján szelektáljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B-iimfocitákat Epstein-Barr vírussal történő transzformálással immortalizáljuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális antitesteket termelő sejtvonalak közül az ATCC CRL 8833 vagy ATCC CRL 8834 sejtvonalakkal megegyező tulajdonságú sejtvonalakat szelektáljuk.
4. 4. Eljárás Pseudomonas aeruginosa exotoxin A toxikus hatását gátló és arra specifikus humán monoklonális antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított humán monoklonális antitesteket termelő immortalízált sejtvonalat táp10

   HU 205 630 Β közegben tenyésztünk, és a termelt antitesteket elválasztjuk.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immortalizált sejtvonalként az ATCC CRL 8833 vagy ATCC CRL 8834 sejtvonalat tenyésztjük, 5
6. 6. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerint előállított humán monoklonális antitesteket legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal keverjük.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATCC CRL 8833 és ATCC CRL 8834 sejtvonalak által termelt humán monoklonális antitesteket alkalmazzuk.