JP2987192B2 - Ｔｓ―２モノクロナール抗体とその製造方法 - Google Patents
Ｔｓ―２モノクロナール抗体とその製造方法Info
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- monoclonal antibody
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は溶連菌製剤OK−432に対する新規なモノクロ
ナール抗体であるTS−２抗体及びその製造方法に関す
る。
ナール抗体であるTS−２抗体及びその製造方法に関す
る。
溶連菌製剤であるOK−432は、インターフェロン（以
下IFNと略記する）やインターロイキン２などのサイト
カイン産生能を有し、ナチュラルキラー（以下NKと略記
する）細胞、マクロファージ或いは細胞障害性（Cytotx
ic）Ｔ細胞のような免疫担当細胞の誘導と活性化を介し
て抗腫瘍効果を発揮することが知られている。
下IFNと略記する）やインターロイキン２などのサイト
カイン産生能を有し、ナチュラルキラー（以下NKと略記
する）細胞、マクロファージ或いは細胞障害性（Cytotx
ic）Ｔ細胞のような免疫担当細胞の誘導と活性化を介し
て抗腫瘍効果を発揮することが知られている。
一方、IFNがマクロファージ、あるいはNK細胞を活性
化することも知られている。
化することも知られている。
本発明者らは先にOK−432に対するモノクロナール抗
体であるTS−１抗体の取得に成功し、これを用いてOK−
432の組織移行の解析研究を行い、IFNがOK432により誘
導、活性化されたマクロファージやNK細胞に発現される
ことを報告した（J.Biol.Response Mod.,Vol.7,No2.p21
2〜228（1988））。
体であるTS−１抗体の取得に成功し、これを用いてOK−
432の組織移行の解析研究を行い、IFNがOK432により誘
導、活性化されたマクロファージやNK細胞に発現される
ことを報告した（J.Biol.Response Mod.,Vol.7,No2.p21
2〜228（1988））。
しかしながら、上記TS−１抗体ではIFN誘導性が菌体
物であるOK−432のどのような分画に存在するかをつき
とめることができなかった。本発明の課題は、OK−432
のIFN産生を抑制し、NK及びLAK活性も抑制するような抗
体であって、OK−432のIFN誘導能を有する分画と反応す
るOK−432に対する新規なモノクロナール抗体を創製
し、該抗体を用いて、OK−432のより優れた製剤を開発
するとともに新規で有用な免疫賦活剤を探索するところ
にある。
物であるOK−432のどのような分画に存在するかをつき
とめることができなかった。本発明の課題は、OK−432
のIFN産生を抑制し、NK及びLAK活性も抑制するような抗
体であって、OK−432のIFN誘導能を有する分画と反応す
るOK−432に対する新規なモノクロナール抗体を創製
し、該抗体を用いて、OK−432のより優れた製剤を開発
するとともに新規で有用な免疫賦活剤を探索するところ
にある。
本発明者らは上記課題を解決するためOK−432に対す
るモノクロナール抗体について研究をさらに行った結
果、OK−432に対する新規なモノクロナール抗体であるT
S−２抗体の取得に成功し、この抗体が前記課題を解決
する諸特性を有することを見出し本発明に到達した。
るモノクロナール抗体について研究をさらに行った結
果、OK−432に対する新規なモノクロナール抗体であるT
S−２抗体の取得に成功し、この抗体が前記課題を解決
する諸特性を有することを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明は溶連菌製剤OK−432に対するモノ
クロナール抗体であって、IgMのクラス、サブクラスを
示し、OK−432の菌体表面の糖鎖抗原を認識し、且つOK
−432γ−インターフェロン誘導能を有する分画と反応
することを特徴とするTS−２モノクロナール抗体、及び
これを得るための、腹腔内にOK−432を投与免疫したマ
ウスより摘出した脾細胞とマウス由来ミエローマ細胞を
細胞融合し、ついで形成されたハイブリドーマからOK−
432に対する抗体産生能を有するハイブリドーマをスリ
ーニングした後、クローニングを行って得たハイブリド
ーマクローンを培養し、培養液上清から目的抗体を精製
するか又は該ハイブリドーマクローンをマウス腹腔内に
投与し、その腹水より目的抗体を精製することを特徴と
するTS−２モノクロナール抗体の製造方法を提供するも
のである。
クロナール抗体であって、IgMのクラス、サブクラスを
示し、OK−432の菌体表面の糖鎖抗原を認識し、且つOK
−432γ−インターフェロン誘導能を有する分画と反応
することを特徴とするTS−２モノクロナール抗体、及び
これを得るための、腹腔内にOK−432を投与免疫したマ
ウスより摘出した脾細胞とマウス由来ミエローマ細胞を
細胞融合し、ついで形成されたハイブリドーマからOK−
432に対する抗体産生能を有するハイブリドーマをスリ
ーニングした後、クローニングを行って得たハイブリド
ーマクローンを培養し、培養液上清から目的抗体を精製
するか又は該ハイブリドーマクローンをマウス腹腔内に
投与し、その腹水より目的抗体を精製することを特徴と
するTS−２モノクロナール抗体の製造方法を提供するも
のである。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明のTS−２抗体は溶連菌製造OK−432に対する新
規なモノクロナール抗体であり、IgMのクラス、サブク
ラスを示すものである。そして本発明者らによりこの抗
体はOK−432菌対表面の糖鎖抗原を認識することが後で
説明する方法により確認された。
規なモノクロナール抗体であり、IgMのクラス、サブク
ラスを示すものである。そして本発明者らによりこの抗
体はOK−432菌対表面の糖鎖抗原を認識することが後で
説明する方法により確認された。
又、該TS−２抗体はOK−432のγ−IFN産生をほぼ完全
に抑制、NK及びLAK（＝Lymphokine activated killer）
活性も抑制することがわかった。
に抑制、NK及びLAK（＝Lymphokine activated killer）
活性も抑制することがわかった。
さらに、後に述べるMorrisonの方法でOK−432より抽
出した糖脂質標品（OK−PS）が、IFN産生、NKおよびLAK
活性誘導能を有するのに対し、TS−２抗体の方はOK−PS
のIFN産生をほぼ完全に抑制し、NK及びLAK活性の誘導も
抑制することがわかった。一方、多糖体標品（Su−PS）
にはIFN産生、NK及びLAK活性誘導能が認められなかっ
た。
出した糖脂質標品（OK−PS）が、IFN産生、NKおよびLAK
活性誘導能を有するのに対し、TS−２抗体の方はOK−PS
のIFN産生をほぼ完全に抑制し、NK及びLAK活性の誘導も
抑制することがわかった。一方、多糖体標品（Su−PS）
にはIFN産生、NK及びLAK活性誘導能が認められなかっ
た。
これらの結果から、本発明のTS−２抗体はOK−432のI
FN、特にγ−IFNの誘導能を有する分画と反応すること
が確認された。
FN、特にγ−IFNの誘導能を有する分画と反応すること
が確認された。
次に、本発明のTS−２抗体の製造方法について説明す
る。
る。
まず、６週齢の雌のBalb/cマウスの腹腔内にOK−432
を５クリニカルユニット〔Klinische Einheit,以下KEと
略す、なおKEはOK−432の単位であり、1KEはその使用前
に0.2mlの生理的食塩水に懸濁させた0.1mgの乾燥球菌
（107−108）を含んでいる〕投与し免疫する。
を５クリニカルユニット〔Klinische Einheit,以下KEと
略す、なおKEはOK−432の単位であり、1KEはその使用前
に0.2mlの生理的食塩水に懸濁させた0.1mgの乾燥球菌
（107−108）を含んでいる〕投与し免疫する。
１週間後に、さらにこのマウスの腹腔内にOK−432を5
KE追加投与免疫し、この最終免疫の３日後に当該マウス
より無菌的に脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
KE追加投与免疫し、この最終免疫の３日後に当該マウス
より無菌的に脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
得られた脾細胞とBalb/cマウス由来ミエローマ細胞、
P3−NS−１−Ag4−１（以下NS−１と略す）〔Ｋhler
G.Milstein C.,Eur.J.Immunol.vol6.p511〜519（197
6）〕をポリエチレングリコール4000で常法（上記Ｋh
lerとMilsteinの方法）に従い細胞融合を行う。
P3−NS−１−Ag4−１（以下NS−１と略す）〔Ｋhler
G.Milstein C.,Eur.J.Immunol.vol6.p511〜519（197
6）〕をポリエチレングリコール4000で常法（上記Ｋh
lerとMilsteinの方法）に従い細胞融合を行う。
細胞融合後、形成したハイブリドーマのなかでOK−43
2に対する抗体産生能を有するものを酵素免疫測定法（E
LISAと略す）を用いてスクリーニングした。
2に対する抗体産生能を有するものを酵素免疫測定法（E
LISAと略す）を用いてスクリーニングした。
スクリーニング後、抗OK−432モノクロナール抗体を
産生するハイブリドーマに対し限界希釈法によるクロー
ニングを２〜３回行った。
産生するハイブリドーマに対し限界希釈法によるクロー
ニングを２〜３回行った。
なお、本発明においては、ELISA及び限界希釈法は通
常の方法、例えば岩崎、他著「単クローン抗体ハイブリ
ドーマとELISA」講談社発行（1983年）に記載されてい
る方法で行った。
常の方法、例えば岩崎、他著「単クローン抗体ハイブリ
ドーマとELISA」講談社発行（1983年）に記載されてい
る方法で行った。
その結果、得られたOK−432に対する抗体を産生する
ハイブリドーマがTS−２（微工研菌寄第11846号）であ
る。
ハイブリドーマがTS−２（微工研菌寄第11846号）であ
る。
このハイブリドーマの産生抗体のクラス、サブクラス
は、二次抗体にマウス免疫グロブリンクラス、サブクラ
ス特異的家兎免疫グロブリン（MoAb−Sub−Isotyping K
it;Bio−Rad）を用いたELISAで決定する。
は、二次抗体にマウス免疫グロブリンクラス、サブクラ
ス特異的家兎免疫グロブリン（MoAb−Sub−Isotyping K
it;Bio−Rad）を用いたELISAで決定する。
抗OK−432モノクロナール抗体の精製は、ハイブリド
ーマ培養上清或いはハイブリドーマをBalb/cマウス腹腔
内に投与し得た腹水より、20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.
0）を用いたSephacryl S−300（Phar−macia）カラムク
ロマトグラフィーで行う。
ーマ培養上清或いはハイブリドーマをBalb/cマウス腹腔
内に投与し得た腹水より、20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.
0）を用いたSephacryl S−300（Phar−macia）カラムク
ロマトグラフィーで行う。
次に本発明のTS−２抗体の機能、性質を確認するため
に用いた測定法について説明する。なお、担癌ヌードマ
ウスは６週齢、雄のBalb/cヌードマウス背部皮下に１×
107個のHSG細胞〔ヒト唾液腺癌細胞：白砂、佐藤等.Can
cer48P745〜752（1981）〕を移植し、移植後１ケ月で８
〜10mmの腫瘍を発生した。担癌ヌードマウスを使用し
た。
に用いた測定法について説明する。なお、担癌ヌードマ
ウスは６週齢、雄のBalb/cヌードマウス背部皮下に１×
107個のHSG細胞〔ヒト唾液腺癌細胞：白砂、佐藤等.Can
cer48P745〜752（1981）〕を移植し、移植後１ケ月で８
〜10mmの腫瘍を発生した。担癌ヌードマウスを使用し
た。
間接蛍光抗体法： OK−432（2.5KE）を担癌ヌードマウスの腫瘍内に投与
して得た腫瘍より凍結切片を作製し、OK−432と抗OK−4
32モノクロナール抗体の反応性を間接蛍光抗体法で検索
した。この場合、モノクロナール抗体はビオチン化した
ものを用い、二次抗体はFITC標識アビジンを用いた。
して得た腫瘍より凍結切片を作製し、OK−432と抗OK−4
32モノクロナール抗体の反応性を間接蛍光抗体法で検索
した。この場合、モノクロナール抗体はビオチン化した
ものを用い、二次抗体はFITC標識アビジンを用いた。
過ヨウ素酸及びプロナーゼ処理： 抗OK−432モノクロナール抗体の特異性の検索とし
て、OK−432投与ヌードマウスの腫瘍の凍結切片を過ヨ
ウ素酸或いはプロナーゼで処理し、間接蛍光抗体法を行
った。過ヨウ素酸処理は50mM過ヨウ素酸を含む10mM Tri
s−HCl緩衝液（pH7.4）で４℃、２時間反応させること
で行い、プロナーゼ処理ではタンパク量で0.1〜0.2mg/m
lのプロナーゼを含む200mM酢酸アンモニウム水溶液（pH
6.5）で37℃、１時間反応させた。
て、OK−432投与ヌードマウスの腫瘍の凍結切片を過ヨ
ウ素酸或いはプロナーゼで処理し、間接蛍光抗体法を行
った。過ヨウ素酸処理は50mM過ヨウ素酸を含む10mM Tri
s−HCl緩衝液（pH7.4）で４℃、２時間反応させること
で行い、プロナーゼ処理ではタンパク量で0.1〜0.2mg/m
lのプロナーゼを含む200mM酢酸アンモニウム水溶液（pH
6.5）で37℃、１時間反応させた。
免疫電顕： OK−432と抗OK−432モノクロナール抗体の反応性の検
索として、OK−432とビオチン化抗OK−432抗体とを反応
させ免疫沈降物を形成させた。この免疫沈降物にペルオ
キシダーゼ標識アビジンを反応後、ジメチルアミノアゾ
ベンゼン（DAB,和光純薬製）で発色させた。常法に従い
エポン包埋を行った後、超薄切片を作製し透過型電子顕
微鏡で観察した。
索として、OK−432とビオチン化抗OK−432抗体とを反応
させ免疫沈降物を形成させた。この免疫沈降物にペルオ
キシダーゼ標識アビジンを反応後、ジメチルアミノアゾ
ベンゼン（DAB,和光純薬製）で発色させた。常法に従い
エポン包埋を行った後、超薄切片を作製し透過型電子顕
微鏡で観察した。
IFN力価の測定法： ヒト末梢血単核球（PBMC）の調製とOK−432及び抗OK
−432モノクロナール抗体処理： PBMCはFicoll−Hypaqueを用いた比重遠心法で調製
し、１×10-6/mlの割合で10％牛胎児血清を含むRPMI164
0培地で24時間培養した。OK−432処理はOK−432 ０〜
0.1KE/mlを培地に添加することで行った。抗OK−432モ
ノクロナール抗体処理は、OK−432とMAb10μｇとを４
℃、１時間反応させた後、上記の割合で調製したPBMCを
加え、37℃で24時間培養した。この後、処理を行った培
養上清中のIFN力価と、次項に記す処理したPBMCのNK、L
AKを測定した。
−432モノクロナール抗体処理： PBMCはFicoll−Hypaqueを用いた比重遠心法で調製
し、１×10-6/mlの割合で10％牛胎児血清を含むRPMI164
0培地で24時間培養した。OK−432処理はOK−432 ０〜
0.1KE/mlを培地に添加することで行った。抗OK−432モ
ノクロナール抗体処理は、OK−432とMAb10μｇとを４
℃、１時間反応させた後、上記の割合で調製したPBMCを
加え、37℃で24時間培養した。この後、処理を行った培
養上清中のIFN力価と、次項に記す処理したPBMCのNK、L
AKを測定した。
IFN力価測定： IFN活性の測定はヒト羊膜由来細胞〔Fogh,Lund,Proc.
Soc.Exp.Biol.Med.,94.p532〜537（1957）;FL細胞〕と
水疱性口内炎ウイルス（VSV）を用いたプラーク減少法
で行った。IFNの型分類は、抗ヒトα−IFN抗体（Lee Bi
omolecular Research Inc.）、抗ヒトβ−IFN抗体（Lee
Biomolecular Research Inc.）、抗ヒトγ−IFN抗体
（ENDOGEN）を用いた中和試験により行った。すなわ
ち、中和活性で500U/mlに調製した抗ヒトα−IFN抗体と
抗ヒトβ−IFN抗体の混合抗体或いは抗ヒトγ−IFN抗体
200μｌを段階希釈したIFN標品である培養上清800μｌ
に加え、４℃、24時間反応させた。この後、残存するIF
N力価を測定した。
Soc.Exp.Biol.Med.,94.p532〜537（1957）;FL細胞〕と
水疱性口内炎ウイルス（VSV）を用いたプラーク減少法
で行った。IFNの型分類は、抗ヒトα−IFN抗体（Lee Bi
omolecular Research Inc.）、抗ヒトβ−IFN抗体（Lee
Biomolecular Research Inc.）、抗ヒトγ−IFN抗体
（ENDOGEN）を用いた中和試験により行った。すなわ
ち、中和活性で500U/mlに調製した抗ヒトα−IFN抗体と
抗ヒトβ−IFN抗体の混合抗体或いは抗ヒトγ−IFN抗体
200μｌを段階希釈したIFN標品である培養上清800μｌ
に加え、４℃、24時間反応させた。この後、残存するIF
N力価を測定した。
NK.LAK活性の測定法： OK−432及び抗OK−432MAbで処理したPBMCのNK、LAK活
性の測定は、標的細胞にNK活性測定にはヒト赤芽球性白
血病細胞〔Blood,45,p32（1975）:K−562細胞〕を、LAK
活性測定にはヒトバーキットリンパ腫由来細胞〔Cancer
Res.28,P1300〜1310（1968）:Daudi細胞〕を用いた51C
r遊出法で行った。すなわち、標的細胞106個を100μCiN
a2Cr51O4で37℃、90分間反応させて放射線標識をした
後、96穴マイクロタイタープレート中に１穴当り104個/
100μｌの割合で植込んだ。RPMI1640培養液で調製したP
BMCをエフェクター細胞として、２×105個/100μｌの割
合で加え、37℃で４時間培養した。
性の測定は、標的細胞にNK活性測定にはヒト赤芽球性白
血病細胞〔Blood,45,p32（1975）:K−562細胞〕を、LAK
活性測定にはヒトバーキットリンパ腫由来細胞〔Cancer
Res.28,P1300〜1310（1968）:Daudi細胞〕を用いた51C
r遊出法で行った。すなわち、標的細胞106個を100μCiN
a2Cr51O4で37℃、90分間反応させて放射線標識をした
後、96穴マイクロタイタープレート中に１穴当り104個/
100μｌの割合で植込んだ。RPMI1640培養液で調製したP
BMCをエフェクター細胞として、２×105個/100μｌの割
合で加え、37℃で４時間培養した。
NK、LAK活性は％障害能で表わし、下記の公式より算
出した。
出した。
OK−432の糖脂質分画と多糖体分画の抽出法： OK−432の糖脂質分画の抽出法はMorrisonの方法〔THE
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.250,NO8,P2911
〜2919（1975）〕に準じて行った。すなわち、生理食塩
水5mlに溶解したOK−432 50KEに１−ブタノール5mlを加
え混和した。この後35,000Xgで20分間遠心し、水溶液層
を採取した。この抽出溶液にプロナーゼ20μg/mlで加
え、37℃で24時間反応した。35,000Xgで20分間遠心した
後上清を採取した。この抽出標品をリン酸緩衝溶液〔PB
S（−）〕にて透析し、糖脂質標品（以下OK−PSとい
う）とした。多糖体分画はStreptococcus Pyogenes A−
3SU株よりSladeの方法〔JOURNAL OF BACTERIOLOGY,VOL.
90,NO3,P667（1965）〕に準じて抽出した多糖体標品
（以下Su−PSという；中外製薬製）を用いた。
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.250,NO8,P2911
〜2919（1975）〕に準じて行った。すなわち、生理食塩
水5mlに溶解したOK−432 50KEに１−ブタノール5mlを加
え混和した。この後35,000Xgで20分間遠心し、水溶液層
を採取した。この抽出溶液にプロナーゼ20μg/mlで加
え、37℃で24時間反応した。35,000Xgで20分間遠心した
後上清を採取した。この抽出標品をリン酸緩衝溶液〔PB
S（−）〕にて透析し、糖脂質標品（以下OK−PSとい
う）とした。多糖体分画はStreptococcus Pyogenes A−
3SU株よりSladeの方法〔JOURNAL OF BACTERIOLOGY,VOL.
90,NO3,P667（1965）〕に準じて抽出した多糖体標品
（以下Su−PSという；中外製薬製）を用いた。
以下実施例で本発明を説明する。
実施例１（ハイブリドーマTS−２の製造とモノクロナー
ル抗体TS−２の産生） 雌Balb/cマウス（６週齢）の腹腔内にOK−432（中外
製薬製）の5KEを投与免疫した。１週間後に、さらに腹
腔内にOK−432の5KEを追加免疫し、この最終免疫３日後
に該マウスより無菌的に脾臓を摘出し、脾細胞を調製し
た。この脾細胞と前出のTS−２抗体の製造方法の説明の
項で記載したNS−１細胞をKohlerとMilsteinの方法（文
献、前記の通り）に従い、ポリエチレングリコール4,00
0（和光純薬製）を用い、無血清RPM1 1640を培地中で細
胞融合を行った。その結果288個のハイブリドーマ上清
が得られた。このハイブリドーマ培養上清を用いてELIS
Aの検索を行った結果、OK−432に対する抗体を産生する
４個のハイブリドーマが得られた。このスクリーニング
された４このハイブリドーマに対し、限界希釈法による
クローニングを２〜３回行い、OK−432に対する抗体を
産生し、且つ安定な増殖を示すハイブリドーマクローン
を得た。該ハイブリドーマをTS−２と命名し、工業技術
院微生物工業技術研究所に受託番号、微工研菌寄第1184
6号（FERM Ｐ−11846）として寄託した。
ル抗体TS−２の産生） 雌Balb/cマウス（６週齢）の腹腔内にOK−432（中外
製薬製）の5KEを投与免疫した。１週間後に、さらに腹
腔内にOK−432の5KEを追加免疫し、この最終免疫３日後
に該マウスより無菌的に脾臓を摘出し、脾細胞を調製し
た。この脾細胞と前出のTS−２抗体の製造方法の説明の
項で記載したNS−１細胞をKohlerとMilsteinの方法（文
献、前記の通り）に従い、ポリエチレングリコール4,00
0（和光純薬製）を用い、無血清RPM1 1640を培地中で細
胞融合を行った。その結果288個のハイブリドーマ上清
が得られた。このハイブリドーマ培養上清を用いてELIS
Aの検索を行った結果、OK−432に対する抗体を産生する
４個のハイブリドーマが得られた。このスクリーニング
された４このハイブリドーマに対し、限界希釈法による
クローニングを２〜３回行い、OK−432に対する抗体を
産生し、且つ安定な増殖を示すハイブリドーマクローン
を得た。該ハイブリドーマをTS−２と命名し、工業技術
院微生物工業技術研究所に受託番号、微工研菌寄第1184
6号（FERM Ｐ−11846）として寄託した。
このTS−２より産生されるTS−２抗体のクラス、サブ
クラスを二次抗体に抗マウス免疫グロブリンクラス、サ
ブクラス特異的家兎免疫グロブリン（MoAb−Sub−Isoty
ping Kit:Bio−Rad）を用い、ELISAにて調べたところIg
Mであることが判明した。
クラスを二次抗体に抗マウス免疫グロブリンクラス、サ
ブクラス特異的家兎免疫グロブリン（MoAb−Sub−Isoty
ping Kit:Bio−Rad）を用い、ELISAにて調べたところIg
Mであることが判明した。
TS−２抗体の精製はハイブリドーマ培養上清或いはハ
イブリドーマをBalb/cマウス腹腔内に投与した腹水よ
り、20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）を用いたSephacryl
S−300（Pharmacia）カラムクロマトグラフィーで行っ
た。
イブリドーマをBalb/cマウス腹腔内に投与した腹水よ
り、20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）を用いたSephacryl
S−300（Pharmacia）カラムクロマトグラフィーで行っ
た。
実施例２（TS−２抗体及びそれにより認識される抗原の
性質） （１）TS−２抗体とOK−432との反応性： 2.5KEのOK−432を腫瘍内投与した担癌ヌードマウス腫
瘍の連結切片を用い、前述した間接蛍光抗体法で検索し
た。その結果TS−２抗体によりOK−432の存在が明らか
に観察された。
性質） （１）TS−２抗体とOK−432との反応性： 2.5KEのOK−432を腫瘍内投与した担癌ヌードマウス腫
瘍の連結切片を用い、前述した間接蛍光抗体法で検索し
た。その結果TS−２抗体によりOK−432の存在が明らか
に観察された。
なお、実験に用いた担癌ヌードマウスは６週齢、雌の
Balb/cのヌードマウスの背部皮下に１×107個のHSG細胞
を移植し、移植後約１ケ月で８〜10mmの腫瘍を発生せし
めたものを使用した。
Balb/cのヌードマウスの背部皮下に１×107個のHSG細胞
を移植し、移植後約１ケ月で８〜10mmの腫瘍を発生せし
めたものを使用した。
（２）TS−２抗体より認識される抗原の性質： 前記の過ヨウ素酸及びプロナーゼ処理の項で説明した
方法でOK−432を投与した腫瘍切片を過ヨウ素酸及びプ
ロナーゼで処理した後、間接蛍光抗体法でTS−２抗体の
反応性を検討した。その結果、過ヨウ素酸で処理した切
片ではTS−２抗体で認識されるOK−432の抗原は消失し
ていたが、プロナーゼ処理では影響を受けないことが判
明した。
方法でOK−432を投与した腫瘍切片を過ヨウ素酸及びプ
ロナーゼで処理した後、間接蛍光抗体法でTS−２抗体の
反応性を検討した。その結果、過ヨウ素酸で処理した切
片ではTS−２抗体で認識されるOK−432の抗原は消失し
ていたが、プロナーゼ処理では影響を受けないことが判
明した。
このことにより、TS−２抗体により認識される抗原は
糖鎖抗原であることが確認された。また、TS−２抗体を
用いた前述した免疫電顕を行うと、OK−432の菌体表面
に反応性を認め、TS−２抗体がOK−432の表面抗原を認
識していることがわかった。
糖鎖抗原であることが確認された。また、TS−２抗体を
用いた前述した免疫電顕を行うと、OK−432の菌体表面
に反応性を認め、TS−２抗体がOK−432の表面抗原を認
識していることがわかった。
実施例３（OK−432のIFN産生、NKおよびLAK活性に及ぼ
すTS−２抗体の影響） 前述したIFN力価の測定法、およびNK、LAK活性の測定
法により最終濃度０〜0.1KE/mlのOK−432を培地に添加
してPBMCを24時間培養し、培養上清中のIFN力価と処理
したPBMCのNK及びLAK活性を測定した。第１図及び第２
図に示すようにOK−432の添加濃度と共にIFN力価、NK及
びLAKを活性は上昇し、そのピークは0.01KE/mlであるこ
とがわかった。
すTS−２抗体の影響） 前述したIFN力価の測定法、およびNK、LAK活性の測定
法により最終濃度０〜0.1KE/mlのOK−432を培地に添加
してPBMCを24時間培養し、培養上清中のIFN力価と処理
したPBMCのNK及びLAK活性を測定した。第１図及び第２
図に示すようにOK−432の添加濃度と共にIFN力価、NK及
びLAKを活性は上昇し、そのピークは0.01KE/mlであるこ
とがわかった。
次にOK−432より誘導されたIFNの型決定を行うため
に、OK−432を処理したPBMCの培養上清を抗α／β−IFN
抗体及び抗γ−IFN抗体で処理を行った後、前述の方法
でIFN力価を測定すると、抗α／β−IFN抗体処理ではIF
N力価にほとんど影響を認めなかったが、抗γ−IFN抗体
処理では著明に低下を認めた。これらの結果を第１表に
示す。これらのことより、OK−432で処理したPBMCより
誘導されるIFNは主にγ−IFNであることが判明した。
に、OK−432を処理したPBMCの培養上清を抗α／β−IFN
抗体及び抗γ−IFN抗体で処理を行った後、前述の方法
でIFN力価を測定すると、抗α／β−IFN抗体処理ではIF
N力価にほとんど影響を認めなかったが、抗γ−IFN抗体
処理では著明に低下を認めた。これらの結果を第１表に
示す。これらのことより、OK−432で処理したPBMCより
誘導されるIFNは主にγ−IFNであることが判明した。
次いでOK−432により誘導されるγ−IFN、NK及びLAK
活性に及ぼすTS−２抗体の影響を検討した。すなわち、
あらかじめTS−２抗体を処理したOK−432でPBMCを24時
間培養し、培養上清中のIFN力価と、処理したPBMCのNK
及びLAK活性を前述の方法により測定した。その結果、
第２表に示すようにTS−２抗体処理によりOK−432より
誘導されるγ−IFNは、ほぼ完全に抑制され、NK及びLAK
活性も抑制が認められた。
活性に及ぼすTS−２抗体の影響を検討した。すなわち、
あらかじめTS−２抗体を処理したOK−432でPBMCを24時
間培養し、培養上清中のIFN力価と、処理したPBMCのNK
及びLAK活性を前述の方法により測定した。その結果、
第２表に示すようにTS−２抗体処理によりOK−432より
誘導されるγ−IFNは、ほぼ完全に抑制され、NK及びLAK
活性も抑制が認められた。
実施例４（OK−432より抽出したOK−PSのIFN産生、NK及
びLAK活性の誘導とそれに及ぼすTS−２抗体の影響） OK−432よりMorrisonの方法に準じて抽出したOK−PS
と、Sladeの方法に準じて抽出したSu−PSとTS−２抗体
との反応性をELISAにて検索すると、共に反応性を認め
た。次にOK−PSとSuPSのIFN産生、NK及びLAK活性の誘導
能について検討したところ、第３図〜第６図に示すよう
にOK−PSはIFN産生、NK及びLAK活性の誘導能を有してい
たが、Su−PSには全ての誘導能を認めなかった。さらに
KO−PSのIFN産生、NK及びLAK活性の誘導能に及ぼすTS−
２抗体の影響を検討したところ、第３表に示すようにIF
N産生は完全に抑制されNK、LAK活性も抑制されることが
わかった。
びLAK活性の誘導とそれに及ぼすTS−２抗体の影響） OK−432よりMorrisonの方法に準じて抽出したOK−PS
と、Sladeの方法に準じて抽出したSu−PSとTS−２抗体
との反応性をELISAにて検索すると、共に反応性を認め
た。次にOK−PSとSuPSのIFN産生、NK及びLAK活性の誘導
能について検討したところ、第３図〜第６図に示すよう
にOK−PSはIFN産生、NK及びLAK活性の誘導能を有してい
たが、Su−PSには全ての誘導能を認めなかった。さらに
KO−PSのIFN産生、NK及びLAK活性の誘導能に及ぼすTS−
２抗体の影響を検討したところ、第３表に示すようにIF
N産生は完全に抑制されNK、LAK活性も抑制されることが
わかった。
以上の結果を総合することにより、本発明のモノクロ
ナール抗体TS−２がOK−432のγ−IFN誘導能を有する分
画と反応することが判明した。
ナール抗体TS−２がOK−432のγ−IFN誘導能を有する分
画と反応することが判明した。
〔発明の効果〕 以上説明してきたように本発明のモノクロナール抗体
であるTS−２抗体は、溶連菌製剤OK−432に対する新規
なモノクロナール抗体であって、IgMのクラス、サブク
ラスを示し、OK−432の菌体表面の糖鎖抗原を確認する
ものである。そして該TS−２抗体はOK−432のγ−IFN誘
導能を有する分画と反応するものであるから、これを用
いてOK−432上のTS−２抗体により認識される抗原を解
析、精製することにより、OK−432由来のものより効果
の優れた製剤を得られる可能性があり、さらに新規でよ
り有効な免疫賦活剤も開発されることが期待できる。
であるTS−２抗体は、溶連菌製剤OK−432に対する新規
なモノクロナール抗体であって、IgMのクラス、サブク
ラスを示し、OK−432の菌体表面の糖鎖抗原を確認する
ものである。そして該TS−２抗体はOK−432のγ−IFN誘
導能を有する分画と反応するものであるから、これを用
いてOK−432上のTS−２抗体により認識される抗原を解
析、精製することにより、OK−432由来のものより効果
の優れた製剤を得られる可能性があり、さらに新規でよ
り有効な免疫賦活剤も開発されることが期待できる。
第１図はOK−432によるIFNの誘導を示すグラフであり、
第２図はOK−432によるNK、LAK活性の誘導を示すグラフ
である。 第３図はOK−PSによるIFNの誘導を示すグラフであり、
第４図はOK−PSによるNK、LAK活性の誘導を示すグラフ
であり、第５図はSu−PSによるIFNの誘導を示すグラフ
であり、第６図はSu−PSによるNK、LAK活性の誘導を示
すグラフである。
第２図はOK−432によるNK、LAK活性の誘導を示すグラフ
である。 第３図はOK−PSによるIFNの誘導を示すグラフであり、
第４図はOK−PSによるNK、LAK活性の誘導を示すグラフ
であり、第５図はSu−PSによるIFNの誘導を示すグラフ
であり、第６図はSu−PSによるNK、LAK活性の誘導を示
すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】溶連菌製剤OK−432に対するモノクロナー
ル抗体であって、IgMのクラス、サブクラスを示し、OK
−432の菌体表面の糖鎖抗原を認識し、且つOK−432のγ
−インターフェロン誘導能を有する分画と反応すること
を特徴とするTS−２モノクロナール抗体。 - 【請求項２】腹腔内にOK−432を投与免疫したマウスよ
り摘出した脾細胞とマウス由来ミエローマ細胞を細胞融
合し、ついで形成されたハイブリドーマからOK−432に
対する抗体産生能を有するハイブリドーマをスクリーニ
ングした後、クローニングを行って得たハイブリドーマ
クローンを培養し、培養液上清から目的抗体を精製する
か又は該ハイブリドーマクローンをマウス腹腔内に投与
し、その腹水より目的抗体を精製することを特徴とする
TS−２モノクロナール抗体の製造方法。 - 【請求項３】得られたハイブリドーマクローンがTS−２
微工研菌寄第11846号である請求項２記載のTS−２モノ
クロナール抗体の製造方法。 - 【請求項４】マウスがBalb/cマウスである請求項２記載
のTS−２モノクロナール抗体の製造方法。 - 【請求項５】マウス由来ミエローマ細胞がp3−NS−1Ag4
−１である請求項２記載のTS−２モノクロナール抗体の
製造方法。 - 【請求項６】スクリーニングを酵素免疫測定法（ELISA
法）で行い、クローニングを限界希釈法で行い、且つ精
製をカラムクロマトグラフィーで行うことを特徴とする
請求項２記載のTS−２モノクロナール抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2311441A JP2987192B2 (ja) | 1990-11-19 | 1990-11-19 | Ｔｓ―２モノクロナール抗体とその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2311441A JP2987192B2 (ja) | 1990-11-19 | 1990-11-19 | Ｔｓ―２モノクロナール抗体とその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04183398A JPH04183398A (ja) | 1992-06-30 |
| JP2987192B2 true JP2987192B2 (ja) | 1999-12-06 |
Family
ID=18017254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2311441A Expired - Fee Related JP2987192B2 (ja) | 1990-11-19 | 1990-11-19 | Ｔｓ―２モノクロナール抗体とその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2987192B2 (ja) |
-
1990
- 1990-11-19 JP JP2311441A patent/JP2987192B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04183398A (ja) | 1992-06-30 |
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