DD286822A5 - Verfahren zur herstellung muriner monoklonaler antikoerper gegen das hauptstrukturprotein p24 des humanen immundefekt virus (hiv) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung muriner monoklonaler Antikoerper gegen das p24-Core-Protein des Humanen Immundefekt Virus (HIV, Erreger der Immunschwaechekrankheit AIDS). Die monoklonalen Antikoerper CB-mp24-1 bis -8, die z. T. verschiedenen Maus-IgG-Isotypen angehoeren und verschiedene Epitope des p24-Proteins erfassen, werden von den Zellinien H-CB-mp24-1 bis -8 (ZIM-0461 bis -0468) produziert. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{Antikoerper; murine monoklonale Antikoerper; Humanes Immundefekt Virus; HIV; AIDS; Strukturproteine; Core-Proteine p24; Medizin; Diagnostik}

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das Core-Protein ρ 24 des HIV. Anwendungsgebiete der Eifindung sind die medizinische Diagnostik und die Therapie der HIV-Infektion.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, monoklonal Antikörper herzustellen. Erstmalig haben Köhler und Milstein (Nature, 1975,256,495) durch somatische Fusion von murinen Antikörper-bildenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinie Hybridoma erzeugt, die nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonale Antikörper von der Maus gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzierten. Mit dieser prinzipiellen biotechnologischen Lösung sind bereits auch monoklonale Antikörper gegen Strukturprotei.ie des HIV erzeugt worden, auch gegen das Hauptstrukturprotein ρ 24 (Chassag. e, J., Vereile, P., Klatzmann, D., Montagnier, L., Dionet, C, Gluckman, J.C: WO 86/04336; Minassian, A.A., Kalyanaraman, V. S., GaIIo, R. C, Popovic, M.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85 (1988) 6939-6943; Evans, L. A., Homsy, J. M., Morrow, W. J. W., Gaston, I., Sooy, C. D., Levy, J.Α.: J. Immunol., 140 (19881 941-943.)

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, der medizinischen Diagnostik monoklonale Antikörper zur Verfügung zu stellen, die zum Aufbau eines Testsystems zum Nachweis von p24-Antigen des HIV und zur Erkennung bestimmter Epitope des p24 geeignet sind. Die Antikörper sollen eine protektive Wirkung gegen ?ine HIV-Infektion besitzen und eignen sich damit prinzipiell auch als Bestandteil einerTherapie der HIV-Infektion.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst effektiv Hybridomzeliinien erzeugt werden können, von denen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper mit ve. schiedsnen Isotypen und Idiotypen gegen differante Epitnne des p24 Coie-Proteins des HIV isoliert werden können. Die Hybridomzellinien sollen mit ökonomisch günstigem Aufwand in vitro und ir vivo kultivierbar sein und für eine Reinigung ausreichend hohe Mengen an monoklonalen Antikörpern sezernieren.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß zunächst Mäuse vom Stamm Balb/c mit einem hochgereinigten rekombinanten p24-Protein nach einem bestimmten, erfinderischen Schema immunisiert wurden. Vorteilhaft ist die Verwendung von 8-10 Wochen alten weiblichen Mäusen. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Mäuse zunächst ca. alle 6 Wochen eine Dosis von 50 |ig des gereinigten ρ 24 in koi .iplettem Freundschen Adjuvanz intraperitoneal über einen Zeitraum von 8-12 Monaten appliziert bekamen. Die letzte Immunisierung erfolgte intravenös mit 100-150^g des Antigens in Phosphatpuffer. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse wurde 5 Tage nach der letzten Immunisierung in an sich bekannter Weise eine Zellsuspension hergestellt.

Als Fusionspartner für diese Zellen wurden Mausmyelomzellen der Linie P3 X63 Ag 8/653 (Kearney et al., J. Immunol., 1979,123, 1548-1550) verwendet, die in einem Zellzuchtmedium RPM11640, supplementiert mit 10% fetalem Kälberserum (FKS), kultiviert wurden.

Die Zelllusion wird nach Vermischen beider Fusionspartner und ihrer Sedimentation unter Verwendung von Polyethylenglykol induziert. Anschließend werden die Zellen in eine Vielzahl von separaten 200-μ-Ι Kulturen aufgeteilt. In einem Zellkulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthält (Littlefield, Science, 1964,145,709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzeilen abgetrennt und erfindungsgemäß Klone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren. Die Detektion dieser Klone erfolgt dadurch, daß in dem zellfreien Überstand der angelegten Zellkulturen durch ein geeignetes Verfahren, z. B. einem spezifischen Enzymimmunoassay (EIA), sezernierte Antikörper gegen Antigene des HIV nachgewiesen werden. Die Primärzellkulturen mit spezifischer Antikörperproduktion werden kloniert und so oft rekloniert, bis monoklonale Subklone erhalten werden, die stabil und in hohen Quantitäten Antikörper gegen ρ 24 sezernieren. Die Spezifität der monoklonalen Antikörper wird im Westernblot unter Verwendung von elektrophoretisch aufgetrennten HIV-Proteinen und in der Immunflucioszenz unter Ve- vendung von HlV-infizierten Zellinien bestimmt. Die Isotypen werden mit spezifischen EIA nachgewiesen. Mit Hilfe von HIV-spezifischen rekombinanten Antigenen und Peptiden wird das Epitopmapping der Antikörper durchgeführt.

Die Hy br idome werden als H-CB-mp24 bezeichnet. Besonders geeignet sind die Zellkultu'en H-CB-mp24-1, -2, -3, -4,-5, -6, -7 und •8. Diese acht Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Buch, unter folgenden Nummern registriert:

H-CB-mp 24-1 als ZIM-0461 H-CB-mp24-2 als ZIM-0462 H-CB-mp24-3 als ZIM-0463 H-CB-mp 24-4 als ZIM-0464 H-CB-mp 24-5 als ZIM-0465 H-CB-mp 24-6 als ZIM-0466 H-CB-mp24-7alsZIM-0467 H-CB-mp 24-8 als ZIM-0468.

Die Hybridomzelikulturen eigi.^.i sich für eine Massenproduktir. von monoklonalen Antikörpern in vitro und in vivo.

Im ersten Fall werden die Zellen kontinuierlich durch Erweiterung des Zellkulturvolumens bis zu einer Menge vermehrt, die als Inokulom für einen geeigneten Bioreaktor ausreichend ist. So hat sich die Zellkulturvergrößervng über Rollerflaschenkulturen und die Verwondung eines Air-lift-Bioreaktors als günstig erwiesen. Hierbei können im Zellkulturu^rstand Antikörper in Konzentrationen bis zu 300pg/ml erreicht werden.

Im zweiten Fall werden die Zellen aus der Zellkultur auf eine Konzentration von 2-10 χ 10°/ml gebracht und in Pristanvorbehandelte Mäuse intraperitoneal nach bekanntem Verfahren appliziert. Nach ca. 8-24 Tagen lassen sich durch Punktion bis zu 10ml Aszitesflüssigkeit gewinnen, die bis zu 20mg/ml spezifischen Antikörper enthalten.

Auf diese Weise werden aus den genannten Hybridomen dio monoklonalen Antikörper CB-mp24-1, CB-mp24-2, CB-mp24-3, CB-mp24-4, CB-mp24-5, CB-mp24-6, CB-mp24-7 und CB-mp24-8 gewonnen.

Durch verschiedene biochemische bzw. immunchemische Verfahren lassen sich die Antikörper bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren können die Antikörper mit Enzymen (z. B. mit Peroxidaso) markiert werden. Sie können außerdem biotiniliert oder für Reinigungsverfahren an Trägermaterialien gekoppelt v/erden.

Es ist erstmals gelungen, mit den erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörpern gegen das p24-Protein des HIV in vitro eine protektive Wirkung gegenüber einer HIV-Infektion nachzuweisen. Zum Beispiel wird die Infektionsausbreitung in einer Zellkultur, die initial aus 99% nicht-infizierten und 1 % HlV-infizierten Zellen besteht, mit den anti-p24 monoklonalen Antikörpern gehemmt.

Es ist weite-hin mit dieson Antikörpern erstmalig gelungen, bestimmte immundominante Epitope des p24-Proteins zu identifizieren (s. Tab. 2).

Die Antikörper können in einem Testbesteck zum Nachweis von p24-Antigen verwendet werden, das aus a) fester Phase, gekoppelt mit anti-p24 Antikörpern, b) Untersuchungsprobe, c) Peroxidase-markierten anti-p24-Antikörpern, d) einem Substratgemisch zum Nachweis von Peroxidase, e) einem Stoppreagens für die Peroxidasereaktion und f) aus Puffersystemen als Verdünnungs- und Waschmedien besteht.

Ausführungsbolsplolo

1. Immunisierung und Etablierung spezifischer Hybridoma

Über einen Zeitraum von 6 Monaten werden 5 Mäuse mit jeweils 50pg/ml gereinigtem rekombinanten p24-Protein in komplettem Freundschen Adjuvanz immunisiert. Die Boosterungen erfolgen alle 6 Wochen. Nach der letzten Immunisierung mit 150pg/ml Antigen intravenös werden 2 x 1Ü⁸ Milzzellen isoliert. Diese werden durch Polyethylenglykol 1 500 mit 4 χ 10⁵ Myelomzeilen P3 X63Ag8/653 fusioniert. Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96-woll-Zellkulturplatten mit 10⁵ Zellen/well in ΙΟΟμΙ ausplattiert. Das Standardzellkulturmedium besteht aus RPMI 1640 mit 10% FKS.

Am nächsten Tag werden 10OuI des doppelt konzentrierten HAT-Mediums zugesetzt. Nach einer woche werden 50 ul IIAT-Medium pro well zugegeben. Nach 14 Tagen werden die Primärkulturen mit einem hochspezifischen EIA hinsichtlich HIV-spezifischer Antikörper geprüft. Nach dem angegebenen Verfahren können bis zu 100% der Primärkulturen spezifische Antikörper gegen p24-Proteine des HIV produzieren ab (Tab. 1). Die Spezifität der Antikörper wird in einem HIV-spezifischen Westernblot bestimmt. Die positiven Primärkulturen werden auf Peritonealmakrophagen von der Maus (lOVwell) n.ich dem Grenzverdünnungsverfahren Moniert und rekloniert. Auf diese Weise werden monoklonal Zellinien mit spezifischer anti-p24 Antikörperproduktion erhalten.

2. In-vitro-Produktlon der monoklonalen Antikörper

Die Monierten Zellinien mit spezifische. Antikörperproduktion gegen HIV-p24 werden im Standardkulturmedium gezüchtet in einer feuchten Atmosphäre mit einem Anteil von 5% CO₂. Durch schrittweise Adaptation lassen sich diese Zellen auch in Medien mit 2-5% FKS-Anteii züchten. Diese Zellen werden in Zellkulturflaschen vermehrt. Mit Verdünnungsraten von 1:10 kann das Zellkulturvolumen erweitert werden. Die Massenproduktion der An'-körper erfolgt in Rollerflaschen mit einem Volumen von 500ml oder anschließend in einem Air-lift-Bioreaktor mit Volumin jis zu 151.

3. In-vivo-Produktlon der monoklonalen Antikörper

In Zellkulturflaschen (Volumen 250ml, NUNC) werden die monoklonalen Hybridome auf eine Zellmenge von 10⁷-2,5 χ 10⁷ gezüchtet. Die Zellen werden zweimal in isotonischer Phosphatpufferlösung gewaschen und anschließend in 5 ml der gleichen Lösung aufgenommen. JeImI der Zellsuspension wird in 8 Tage vorher mit 1 ml Pristau-behandelte Mäuse (Balb/c) i. p. appliziert. Nach ca. 0-14 Tagen wird die Aszitesproduktion anhand der Bauchschwellung bei den Mäusen sichtbar. 3-20ml Aszitesflüssigkoit mit einem spezifischen Antikörpergehalt von 2-20 mg/ml können pro Maus gewonnen werden. Die Reinigung der Antikörper erfolgt nach bekannten Verfahren.

4. Charakterisierung der Zellkulturen

Nach dem beschriebenen Schema wurden Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen HIV-p24 gewonnen, die mit H-CB-mp24-1 bis -81 ezeichnet wurden. Als Beispiele werden die Wachstums- und Antikörperproduktionskinetiken von H-CB-mp24-1 und H-CB-mp24-2 aufgeführt (Abb. 1, Abb.2).

5. Charakterisierung der monoklonalen Antikörper

Die Isotypen und, soweit bekannt, Epitopspezifitäten der durch die genannten Zellinien produzierten Antikörper sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Bestimmung der Isotypen erfolgte in einem spezifischen Enzymimmunoassay. Die Spezifität der Antikörper wurde mit df-m HIV-spezifischen Westernblot und dem HIV-spezifischen Immunfluoreszenztest festgelegt. Die Identifizierung der Epitope erfolgte zunächst durch Einengung der Bindungsstellen mit verschiedenen rekombinanten p24-Antigonsequenzen und anschließend durch die Bindung an entsprechende Peptide (Soutschek, E., Modrow, S., Motz, M., Grunow, R., vonBaohr, R., Wolf, H.: Immunological characterization and epitope fine mapping of monoclonal antibodies against core protein (p 24) of the Human Immunodeficiency Virus, in Vorbereitung).

β. Enzymimmunoassay»

Für das Screening der antikörperhaltigen Zellkulturüberctände werden elektronenmikroskopisch reine HIV-Partikeln aus Zellysat von HlV-infizierten H9-Zeilen in einer Proteinkonzentration von 10pg/ml an Flachboden-iViikrotiterplatten aus Polystyren adsorbiert. Im Fall des Epitopmappings werden die rekombinanten Antigene bzw. _">e Peptide im Sättigungsbereich an die Mikrotiterplatten gebunden. Für die Bestimmung der Isotypen wurden im Sättigungsbereich spezifische anti-Maus-lgG-lsotypen Antikörper adsorbiert. 50μΙ der zu untersuchenden Probe werden in den Antigen-beschichte'.en Platten über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen werden 50μΙ einer Lösung von Peroxidasokonjugierten Antikörpern, spezifisch gerichtet gegen Fc-Teile dos Maus-lgG, dazugegeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubier(. Das gebundene Konjugat wird dur .h die Substratreaktion mit Wasserstoffperoxid und o-Phenylendiamin bichromatisch bei 492 und 690nm mit einem MULTISCAN Vertikalphotometer gemessen.

7. Immunoblottlng

Das gereinigte Virusmaterial wird denaturiert und mit 2,5% Sodium Dodecylsulfat (SDS) und 5y% 2-Merkaptoethanol bei 90'C für 5 min reduziert und danach in einem 10%igen Polyacrylamid-Slabgel elektrophoretisch getrennt. Die Proteinbanden werden ai.f Nitrozellulosepapier elektrotransferiert. Nach dein Blocken mit 5% Trockenmilch werden die Streifen in 5ml 1:2 verdünntem Zellkulturüberstand bzw. die zu untersuchende Probe über Nacht eingetaucht. Die gebundenen Antikörper werden mit Peroxidasemarkierter anti-Maus-lgG-Antikörpern und Fa.bung mit Diaminobenzidin (0,1 % NiCI₂) nachgewiesen.

8. Immunofluoreszenztest

H9- oder K37-Zellen, die eine hohe Infektionsrate mit HIV aufweisen, werden auf 10-Feld-Objektträger aus dem Sediment aufgeschwemmt und luftgetrocknet. Die Zellen werden mit eiskaltem Azeton für 10 min fixiert und die Zellkulturüberstände bzw. die zu untersuchenden Proben auf die Präparate für 2 h bei 37⁰C gegeben. Nach dem Auswaschen der überschüssigen Antikörper wird für 45min mit einem FITC-konjugierten anti-Maus-lgG-Antikörper inkubiert und deren Bindung nach dem Waschen mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Parallel werden nicht-infizierte H9- oder K37-Zellen gleichermaßen untersucht, um Antikörper gegen zelluläre Bestandteile auszuschließen.

9. Infektionstest in vitro

Die protektive Wirkung der Antikörper wurde in einem Infektionsmodell in vitro geprüft. Dazu wurde eine Kokultur angelegt, die initial aus 99% K37-Zellen, die nicht HIV-infi?iert waren, und 1 % HlV-infizierter K37-Zellen bestand. Diese Ansätze wurden mit Zusatz der monoklonalen Antikörper gegen ρ24 bzw. eines unspezifischen Kontrollantikörpers in gleicher Konzentration (optimal

50pg/ml) unter Standardbedingungon kultiviert. Mit Hilfe des Immunfluoreszenztests wurden alle 2-3 Tage die HIV-Infektionsraten (% infizierte Zellen) in diesen Kulturen bestimmt. Es zeigte sich durch die monoklonaleri Antikörper eine konzentrationsabhängige Hemmung der infbktionsausbreitung in den Zellkulturen (Abb.3).

Tabelle 1: Prlmfirscraenlngderantip24Fusion

Zellkulturen

angelegt Wachstum spezifischen anti-HIV-Antikörper IgM-HgG' IgG²

η ' 756 756 756 468

% 100 100 100 61

1 Im Enzymimmunoassay wurden als Konjugat POO-markierte Antikörper verwendet, die spezifisch für Maus-lgG und -IgM wan n.

2 Im Enzymimmunoassay wurden als Konjugat POD-markierte Antikörper verwendet, die spezifisch für Maus-lgG waren.

Tabelle 2: Charakterisierung der murinen monoklonalen Antikörper CB-mp24-1 bis -8

Bezeichnung	Isotyp	Westernblot-	Epitop
		reaktivität
CB-mp24-1{12/1)	IgGI	ρ 55, ρ 24	133-158
CB-mp 24-2 (13/5)	IgGI	ρ 55, ρ 24	133-158
CB-mp 24-3 (16/1)	IgGI	ρ 55, ρ 24	307-336
CB-mp 24-4 (16/4/2)	IgGi	ρ 55, ρ 24	307-336
CB-mp 24-5(4/1/1 F6)	IgG 2 a	ρ 55, ρ 24	unbekannt
CB-mp 24-6 (4/1/1 E 9)	IgG 2 a	ρ 55, ρ 24	unbekannt
Cb-mp 24-7 (37/2)	IgG 2 b	ρ 55, ρ 24	unbekannt
CB-mp 24-8 (4/2/D 7)	IgG 2 a	ρ 55, ρ 24	unbekannt

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung muriner monoklonaler Antikörper, die verschiedene Epitope des p24-Cc re-Proteins des HIV erkennen, dadurch gekennzeichnet, daß Mäuse des Stammes Balb/c mit rekombinantem p24-Protein immunisiert werden, die Milzzellen gewonnen und mit Mausmyelomzellen fusioniert und solche Hybridomzellen selektiert werden, die mit H-CB-mp24-1 (ZIN-0461), H-CB-mp24-2 (ZIM-0462), H-CB-mp24-3 (2IM-0463), H-CB-mp24-4 (ZIM-0464), H-CB-mp24-5 (ZIM-0465), H-CB-mp24-6 (ZIM-0466), H-CB-mp24-7 (ZIM-0467) und H-CB-mp24-8 (ZIM-0467) be; lehnet werden, zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand die murinen monoklonalenAntikörperCB-mp24-i,CB-mp24-2,CB-rnp24-3,CB-rr p24-4,CB~mp24-5,CB-mp24-6, CB-mp24-7 und CB-mp 24-8 isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzlymphozyten eifolgt, nachdem als Antigen gereinigtes rekombinantes p24-Protein des HIV derart verwendet wird, daß an 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen alle 6 Wochen über einen Zeitraum von 8 bis 12 Monaten Boosterungen durch Gabe von 50Mg Antigen erfolgen und die letzte Immunisierung, die zu einer Hyperirnmunisierung führt, mit 10C bis 150Mg Antigen 5 Tage vor Entnahme der Milzlymphozyten vorgenommen wind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper mit Enzymen, z. B. Peroxidase, markiert, biotiniliert oder an Trägermaterialien gekoppelt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper in vitro eine protektive Wirkung gegenüber einer HIV-Infektion besitzen.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper mit Phamaka oder Toxinen gekoppelt werden.

6. Testbesteck zum Nachweis von p24-Antigen unter Verwendung der Antikörper nach Anspruch 1, bestehend ausa) fester Phase, gekoppelt mit anti-p24 Antikörpern, b) Untersuchungsprobe, ei Peroxidase-markierten anti-p 24-Antikörpern, d) einem Substratgemisch zum Nachweis von Poroxidase, e) einem Stoppreagens für die Peroxidasereaktion und e) Puffersystemen als Verdünnungs- und Waschrr.edien.