DE2321951B1 - Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-VaccineInfo
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Description
- Für die Gewinnung der bekannten Diphtherie-Impfstoffe werden in der Regel bei der Züchtung der Diphtherie-Bakterien Rinderbouillon enthaltende Nährböden verwendet, die bei der Inaktivierung mit Formaldehyd Anaphylaxie hervorrufende Bestandteile erzeugen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entstehen solche Produkte nicht.
- Es wurden ein Diphtherietoxoid des Standes der Technik in einer Dosierung von 100 Lf und ein Verfahrensprodukt in einer Dosierung von 400 Lf pro Tier an jeweils 10 Meerschweinchen auf Verträglichkeit geprüft. Die Injektion wurde subkutan vorgenommen. Drei Wochen nach der Injektion erhielten alle Tiere 0,25 ml Rinderserum intravenös. Dabei zeigten alle Tiere, die mit dem herkömmlichen Diphtherietoxoid immunisiert worden waren, einen anaphylaktischen Schock. Demgegenüber wiesen die Tiere, die mit dem Verfahrensprodukt immunisiert worden waren, keine Anapbyiaxie-Erscheinungen auf.
- Die Wirksamkeit des Produktes wird wie folgt bestimmt: Fünf Meerschweinchen werden subkutan mit 25 Lf des erfindungsgemäß hergestellten Diphtherie-Fluid-Impfstoffes immunisiert. In einem Parallel-Ansatz werden fünf Meerschweinchen mit Al(OH)3 enthaltenden Adsorbatimpfstoff immunisiert. Nach vier Wochen erhalten alle immunisierten Meerschweinchen eine Belastungsdosis von 10 dlm Diphtherie-Toxin, wobei dlm die Dosis letalis minima bedeutet.
- Sämtliche Tiere bleiben während der tieobachtungszeit von 10 Tagen gesund. zwei Kontrolltiere, die nicht immunisiert waren, erhalten zur gleichen Zeit Diphtherie-Toxin in einer Dosierung von 1 dlm pro Tier. Sie starben an Diphtherieintoxokation innerhalb von vier Tagen.
- In einem zweiten Versuch wird die Wirksamkeit mit einem bekannten Diphtherie-lmpfstoff verglichen. Eine Gruppe A von zehn Meerschweinchen wird mit 25 Lf des gemäß Beispiel 1 als Adsorbatimpfstoff hergestellten Produktes immunisiert. Gleichzeitig wird eine zweite Gruppe B mit 25 Lf eines im Handel erhältlichen, herkömmlichen Diphtherie-Impfstoffes - ebenfalls ein Adsorbatimpfstoff - immunisiert. Nach vier Wochen erhalten die Tiere der beiden Gruppen eine Boosterinjektion, und zwar jedes Tier der Gruppe A 5 Lf des gemäß der Erfindung ohne Adjuvans als Fluidimpfstoff hergestellten Produktes und jedes Tier der Gruppe B 5 Lf Fluidimpfstoff herkömmlicher Art.
- Nach weiteren 10 Tagen wird den Tieren Blut entnommen und im Serum werden die Antikörper ausgewertet.
- Dabei ergeben die Tiere der Gruppe A, die mit dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkt immunisiert worden waren, einen Diphtherieantitoxintiter von über 80 IE/ml Serum, während das Serum in Tieren der Gruppe B einen Antitoxintiter zwischen 50 und 65 IE/ml enthält.
- Die Daten zeigen, daß die Wirksamkeit des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkts derjenigen der bekannten Impfstoffe überlegen ist.
- Eine Internationale Einheit (IE) entspricht der schützenden Wirksamkeit, die in 0,0628 mg des Diphtherie-Antitoxin-Standards der World Health Organization (WHO) enthaltenist(Ref. Biological Substances, WHO Publication, Genf [1972], S. 14).
- Beispiel 1 102 mg Nikotinamid-adenin-dinukleotid und 60 mg Natriumperjodat werden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach 20 Minuten Stehen bei 20 C werden 5 ml eines Diphtherie-Toxins, das 20 000 Lfiml enthält (somit insgesamt 100000 Lf), mit 10 ml einer zeigen wäßrigen Natriumcarbonatlösung vom pH-Wert 9,5 versetzt. hinzugefügt.
- Nach 50 Minuten Stehen bei 20C werden 100 mg Natriumborhydrid zugefügt. Nach weiterem i4stündigem Stehen bei 4 C wird das Reaktionsgemisch gegen 0.15 molares Natriumchlorid dialysiert, auf 50 Lf/ ml verdünnt und mit Aluminiumhydroxid versetzt. Die Ausbeute beträgt 74000 Lf, somit 74%. Die spezifische Flockungsaktivität ist gleich der des A.usgangstoxins.
- In einem Parallel versuch wird die Isolierung des Reaktionsproduktes anstatt durch Dialyse durch Chromatographie auf einer Säule (5 100 cm! mit vernetztem Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen Sephadex G-lOO erhältlich ist, vorgenommen.
- Die entgifteten, von Nebenprodukten befreiten Immunogene werden auf 50 Lf/ml verdünnt, sterilfiltriert und mit soviel Aluminiumhydroxyid versetzt, daß dessen Konzentration 0,2 ovo beträgt.
- Zehn Meerschweinchen werden mit 0,5 ml (50 Lf/ml) der auf diese Weise hergestellten Vaccine immunisiert.
- Nach vier Wochen werden sie mit 10 dlm Diphtherie-Toxin belastet. Sämtliche Tiere blieben gesund.
- Zur Kontrolle erhalten zehn nicht-immunisierte Meerschweinchen 1 dlm Diphtherie-Toxin, sie starben innerhalb von vier Tagen durch Diphtherie-lntoxikation.
- Beispiel 2 50 mgAdenosin-monophosphat und 30 mg Natriumperjodat werden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst.
- Nach 20 Minuten Stehen bei Zimmertemperatur werden 5 ml eines Diphtherie-Toxins, das 20000 Lf/ml enthält (somit insgesamt 100 000 Lf), mit 10 ml einer 5, jgen wäßrigen Natriumcarbonatlösung vom pH 9,5 versetzt, hinzugefügt.
- Die Reduktion mit Natriumborhydrid, die Chromatographie und anschließende Aufarbeitung zur Vaccine wird gemäß Beispiel 1 ausgeführt.
- Die Ausbeute beträgt 74 000 Lf. Die spezifische Flockungsaktivität ist gleich der des Ausgangstoxins.
- Zehn Meerschweinchen werden mit 0,5 ml (50 Lf/ml) der auf diese Weise hergestellten Vaccine immunisiert.
- Nach vier Wochen werden sie mit 10 dlm Diphtherie-Toxin belastet. Sämtliche Tiere blieben gesund. Zur Kontrolle erhalten zehn nicht-immunisierte Meerschweinchen 1 dlm Diphtherie-Toxin, sie starben innerhalb von vier Tagen durch Diphtherie-Intoxikation.
- Beispiel 3 102 mg Nikotinamid-adenin-dinukleotid und 90 mg Natriumperjodat werden in 5 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach 20 Minuten Stehen bei 20° C werden 0,3 ml Glycerin zugesetzt. Nach weiteren 5 Minuten Stehen bei 20 C werden 10 ml eines Diphtherie-Toxins, das 10 000 Lf/ml enthält (somit insgesamt 100 000 Lf) und das mit 200 mg Dithiothreitol während 30 Minuten bei Zimmertemperatur behandelt worden ist, mit 10 ml einer 5 zeigen wäßrigen Natriumcarbonatlösung vom pH-Wert 9,5 versetzt und der Nukleotid-perjodatlösung hinzugefügt. Die weiteren Schritte erfolgen gemäß Beispiel 1. Die Ausbeute beträgt 80 000 Lf, somit 80 %.
Claims (1)
1. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet. daß das Diphtherie-Toxin
,-on der Lnisetzung mit einem Disulfid-Brücken spahenden Reagenz behandelt wird.
Die bekannten Diphtherie-Vaccinen enthalten mit Formaldehyd inaktiviertes
Diphtherie-Toxin. Ein Nachteil dieser Vaccinen ist. daß die Inaktivierung des Toxins
bis zu drei Nionaten beansprucht. Auch läßt die Verträglichkeit der Diphtherie-Impfstoffe
bei äheren lmpflingen manchmal zu wünschen übrig.
Es wurde nun zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine mit verbesserter
Verträglichkeit ein neuer Weg zur Entgiftung des Toxins beschritten. der im Prinzip
daraus besteht, daß man das Diphtherie-Toxin (1) mit einem Entgiftungsmittel aus
(a) Nikotinamid-adenindinukleotid oder Adenosin-monophosphat und (b) einem Perjodat,
zur Reaktion bringt. (2) einen Überschuß eines Borhydrids hinzufügt und (3) das
Reaktionsprodukt reinigt und zu einer Vaccine aufarbeitet.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer
Diphtherie-Vaccine, gekennzeichnet durch die im Patentanspruch 1 angegebenen Maßnahmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist neu. Es kann in einem Tag ausgeführt
werden. Das Verfahrensprodukt ist gut verträglich und frei von Agregatbildungen,
die bei den mit Formaldehyd inaktivierten Impfstoffen Ursache von Unverträglichkeiten
sein können.
Als Ausgangsmaterial für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
dient Diphtherie-Toxin.
das durch Züchten von Diphtherie-Bakterien und anschließende Isolierung
aus dem Kulturfiltrat gewonnen wird.
Die spezifische Flockungsaktivität des als Ausgangsmaterial dienenden
Diphtherie-Toxins beträgt in der Regel 2500 bis 3400 Lfjmg Stickstoff-Toxin, wobei
Lf für Limes floculationis verwandt wird. Man versteht darunter diejenige Menge
Antigen, die eine Einheit »Standard Diphtherie Antitoxin for Flocculation Test«
ausflockt (Bull. W. H. O. 12, 945, 1955). Das Molgewicht des Toxins beträgt in der
Regel etwa 62 000.
Die Ausbeute des Verfahrens kann verbessert werden, wenn das Toxin
vor Umsetzung mit dem Entgiftungsmittel mit Reagenzien behandelt wird, welche Disulfidbrücken
spalten. Als geeignete Reagenzien dieser Art kommen insbesondere Dithiothreitol
oder Dithiocrythritol (CH2Sh-CHOH-CHOH-CH2SH) in Betracht.
Zur Durchführung des Verfahrens wird zunächst eine wäßrige Lösung
von Nikotinamid-adenin-dinukieotid oder Adenosin-monophosphat mit einer - auf Ribose
bezogen - mindestens äquivalenten Menge Perjodat oxydiert. (1 N4ol Nikotinamid-adenin-dinukleotid
mit mindestens 2 Mol Perjodat: Mol Adenosin-monophosphat mit mindestens 1~Mol Perjodat@.
Es empfiehlt sich keinen selr großer. Überschluß an Perjodat zu verwenden. Überschüssiges
Perjodat wird zweckmäßigerweise vor dem Zusatz des Diphtherie-Toxins zum Entgiftungsmittel
durch Umsetzung mit Dialkoholen oder Polyalkoholen (z. B. Glycerin) oder auf andere
geeignete Weise zerstört. Anschließend wird das so erhaltene Entgiftungsmittel bei
pH S.5 bis 10,0, vorzugsweise 9.5, mit Diphtherie-Toxin umgesetzt.
trm eine ausreichende Wirkung zu gewährleisten, muß das mit Perjodat
oxydierte Nikotinamid-adenindinukleotid oder das Adenosin-monophosphat im Reaktionsgemisch
gegenüber Diphtherie-Toxin im Überschuß. mindestens im Molverhältnis 20:1, angewandt
werden. Höhere Molverhältnisse beispielsweise 100:1, sind zulässig. Das Toxin wird
zweckmäßig in 1° giger Lösung - bezogen auf Eiweiß den1 Entgiftungsmittel zugesetzt.
Bei dieser Konzentration ergeben sich etwa gleiche Volumen für beide Lösungen.
Um dem Reaktionsgemisch ausreichend Zeit zur Umsetzung zu lassen
läßt man e, zweckmäßig einige Zeit, etwa ½ Stunde bis 3 Stunden, vorzugsweise 1
Stunde. bei Raumtemperatur (10 bis 30°C) stehen.
Danach wird ein Borhydrid im Überschluß, z. B. in der 10- bis 20 fachen
molaren Menge. - bezogen auf das Entgiftungsmittel - zugefügt. Wiederum empfiehlt
es sich, das Gemisch zur l Umsetzung einige Zeit stehen zu lassen. Nach etwa 12
bis 30 Stunden, vorzugsweise 15 Stunden, werden die Nebenprodukte durch geeignete
Maßnahmen entfernt. Hierzu kann eine Dialyse, z. B. gegen physiologische Kochsalzlösung,
dienen oder eine Gelchromatographie, z. B. in einer Säule (5 100 cm) mit unter dem
geschützten Warenzeichen Sephadex G-lOO erhältlichen vernetzten Dextran. Es empfiehlt
sich, das Produkt anschließend steril zu filtrieren. Nach Einstellung der Konzentration
durch Verdünnung mit steriler physiologischer Kochsalzlösung kann es als Fluidimpfstoff
verwendet werden.
Das erfindungsgemäße inaktivierte Diphtherie-Toxin kann aber auch
mit einem Adjuvans, z. B. Aluminiumhydroxid, versetzt und nach entsprechender Verdünnung
als Adsorbatimpfstoff verwendet werden.
Als Perjodate eignen sich für die Durchführung des Verfahrens alle
Salze der Perjodsäure, die. wasserlöslich sind und ein nicht-toxisches Kation besitzen.
In erster Linie kommen die Alkalisalze der Perjodsäure in Frage, z. B. Natrium-
oder Kaliumperjodat.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Borhydride müssen ebenfalls wasserlöslich
und nicht-toxisch sein.
Auch hier eignen sich in erster Linie Alkali-Borhydride wie Natrium-
oder Kaliumborhydrid.
Die Toxizität wird wie folgt geprüft: Gruppen von jeweils 5 Meerschweinchen
erhalten 0.5 ml des Produktes subkutan injiziert, und zwar in Verdünnungen entsprechend
25 Lf, 50 Lf, 100 Lf, 200 Lf und 300 Lflml.
Die Tiere werden 28 Tage beobachtet, sie bleiben gesund und zeigen
eine normale Gewichtszunahme. Das Produkt ist somit ungiftig und gut verträglich.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19732321951 DE2321951C2 (de) | 1973-05-02 | 1973-05-02 | Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19732321951 DE2321951C2 (de) | 1973-05-02 | 1973-05-02 | Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2321951B1 true DE2321951B1 (de) | 1974-08-29 |
DE2321951C2 DE2321951C2 (de) | 1975-05-07 |
Family
ID=5879754
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19732321951 Expired DE2321951C2 (de) | 1973-05-02 | 1973-05-02 | Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2321951C2 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0514199A2 (de) * | 1991-05-17 | 1992-11-19 | Retroscreen Limited | Impfstoffe und Verfahren zur Herstellung |
-
1973
- 1973-05-02 DE DE19732321951 patent/DE2321951C2/de not_active Expired
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0514199A2 (de) * | 1991-05-17 | 1992-11-19 | Retroscreen Limited | Impfstoffe und Verfahren zur Herstellung |
EP0514199A3 (en) * | 1991-05-17 | 1993-11-10 | Retroscreen Ltd | Vaccines and methods for their production |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2321951C2 (de) | 1975-05-07 |
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