WO1992007876A1

WO1992007876A1 - Ligand-carrierprotein-konjugat

Info

Publication number: WO1992007876A1
Application number: PCT/EP1991/002005
Authority: WO
Inventors: Shaul Kornfeld
Original assignee: Henning Berlin Gmbh Chemie- Und Pharmawerk
Priority date: 1990-10-24
Filing date: 1991-10-23
Publication date: 1992-05-14
Also published as: DE4033714A1; DE4033714C3; DE4033714C2

Abstract

Es wird ein Ligand-Carrierprotein-Konjugat beschrieben, wobei der Ligand kein Protein oder Polypeptid ist, und mit dem Protein über einen bifunktionellen Spacer verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand mindestens eine funktionelle Aminogruppe aufweist, das Protein mindestens eine Sulfhydryl (SH-Gruppe) aufweist, der bifunktionelle Spacer den Liganden über dessen Aminogruppe mit dem Protein über dessen SH-Gruppe verbindet. Dieses Ligand-Carrierprotein-Konjugat ist zur Herstellung eines Diagnostikums geeignet.

Description

"Liqand-Carrierprotein-Koniuqat"

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zunächst ein Ligand-Carrierprotein-Konjugat, wobei der Ligand kein Protein oder Polypeptid ist, und mit dem Protein über einen bifunktioneilen Spacer verbunden ist. Dieses Ligand- Carrierprotein-Konjugat ist als Komponente in einem Diag- nostikum zur Bestimmung eines Analyten, der mit dem Liganden des Ligand-Carrierprotein-Konjugats identisch sein kann, geeignet.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Her¬ stellung des Ligand-Carrierprotein-Konjugats mittels be¬ stimmter bifunktioneller Spacer. Auch die Verwendung eines anti-Hapten-Antikörper-Markerprotein-Konjugats in einem Diagnostikmittel gemäß der Erfindung wird beschrieben.

Unter Ligand versteht man bei der vorliegenden Erfindung ein kleineres Molekül (Größenordnung 100 bis 1500 Dalton) , das als isolierte Substanz nicht oder lediglich marginal immunogen wirkt. Dieser Ligand fungiert in der Regel erst nach Kopplung an ein Makromolekül als Epitop. Allerdings ist der Ligand als freies Molekül in der Lage, mit der Antigen-Bindungsstelle eines spezifischen Antikörpers zu reagieren.

Ligand-Carrierprotein-Konjugate können in verschiedenen Verfahren als Diagnostikmittel eingesetzt werden. Eine übersichtliche und verständliche Darstellung entsprechen¬ der Methoden, wie zum Beispiel RIA oder ELISA findet sich in "Humane monoclonale Antikörper" von D. Baron und U. Hartlaub, Stuttgart, New York: Fischer, 1987, insbesondere Seiten 65 - 86. Im Zentrum eines Diagnostikmittels auf Basis von immunologischen Reaktionen steht eine wirkungs¬ volle und effektive Antigen-Antikörper-Reaktion. In der Regel wird sich das Interesse auf die quantitative oder qualitative Bestimmung des Liganden richten. Allerdings kann sehr wohl auch eine entsprechende Bestimmung eines Liganden, der an einen Antikörper gebunden ist, von großem Interesse sein. Häufig verhält es sich auch so, daß gerade die Einzelkomponenten des Diagnostikums, wie zum Beispiel ein Ligand-Carrierprotein-Konjugat oder ein anti-Ligand- Antikörper-Enzym-Konjugat wechselseitig für die Herstel- lung derselben von Bedeutung sind. So wird zum Beispiel zur Produktion des anti-Ligand-Antiköpers in erster Linie bereits ein Ligand-Protein-Konjugat benötigt. Darüber hinaus ist das Ligand-Carrierprotein-Konjugat möglicher¬ weise wichtig bei der Aufarbeitung von, den anti-Ligand- Antikörper produzierenden, Zellinien. Umgekehrt kann wie¬ derum der anti-Ligand-Antikörper wertvolle Dienste bei der Isolierung und Konzentrierung eines Liganden leisten.

In der Regel ist die direkte Konjugation bzw. Kopplung eines Liganden an ein Makromolekül, wie zum Beispiel ein Protein, nicht möglich oder unerwünscht. Aus diesem Grun¬ de bedient man sich im Stand der Technik sogenannter Spacer. Dabei handelt -es sich um bifunktionale Moleküle kleineren Molekulargewichts, die sowohl mit reaktiven Gruppen des Liganden als auch des Carrierproteins reagie¬ ren können. In der Regel erweisen sich diese Kopplungen über Spacer als unerwartet schwierig. Darüber hinaus be¬ steht die Gefahr, daß durch die Reaktionen mit einem Spa¬ cer das Epitop soweit verändert wird, daß eine Eignung des Konjugats innerhalb eines Diagnostikums oder zur Im¬ munisierung (zwecks Herstellung eines anti-Ligand-Anti¬ körpers) nicht mehr gegeben ist.

Ähnliche Überlegungen gelten auch für die Bereitstellung eines anti-Ligand-Antikörper-Protein-Konjugats. Von über¬ wiegendem Interesse sind solche Konjugate, bei denen das Protein nicht nur als Träger, sondern vielmehr als radio¬ aktiv markiertes Tracer-Molekül oder Enzym wirksam werden kann. Im ersteren Fall eignet sich das Konjugat dann eher für einen RIA-, im letzteren eher für einen ELISA-Test. Wichtig ist dabei zum Beispiel auch, daß gegebenenfalls die Enzymaktivität nicht in Folge einer Kopplung verloren gegangen ist.

Kleinere als Ligand bezeichnete Moleküle, die mit Carrier- - oder Trägerproteinen konjugiert werden, können in viel¬ facher Weise zum Einsatz gelangen. Hervorzuheben sind die Einsatzbereiche Immunisierung, Herstellung von Festphasen- Matrizen, Affinitätssäulen, sogenannten Tracer-Molekülen, usw. Im allgemeinen sind solche Liganden von Interesse, die innerhalb eines lebenden Organismus qualitativ und/ oder quantitativ erfaßt werden sollen. Wegen der Vielzahl der möglichen Derivatisierung biochemischer Moleküle sei hier nur die Phosphorylierung und Oxidation, sowie Re- duktion, erwähnt.

Es ist darüber hinaus generell möglich, synthetische Mole¬ küle (vor allem wasserlösliche) in gleicher Weise analy¬ tisch zu bestimmen, wie das mit Substanzen^* der lebenden Materie möglich ist. Analytisch interessant in diesem Zusammenhang sind sicherlich auch kurzkettige Abbaupro¬ dukte von Kunststoffen etc.

Eine besondere Schwierigkeit bei der Bereitstellung von Ligand-Protein-Konjugaten besteht häufig darin, daß das Hapten bei den üblichen Kopplungsbedingungen, wie sie für Trägerproteine empfehlenswert sind, nicht oder nur schlecht löslich sind. Es versteht sich von selbst, daß die dann unter eher drastischen Bedingungen hergestellten Konjugate weder besonders gut zur Immunisierung noch als Tracer (zum Beispiel: Ligand-Enzym-Konjugat) zu gebrauchen sind. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich in erster Linie mit Liganden, die über eine Aminogruppe, gegebenenfalls unter Hinzuziehung eines weiteren Spacers, mit einem Pro¬ tein, Enzym und dergleichen konjugiert werden. Im besonde¬ ren Interesse stehen Pteridine und Pterine, wie Neopterin, Biopterin, etc. Diese Substanzklasse ist von besonderem Interesse, da die Bestimmung ihrer Konzentration inner¬ halb des menschlichen oder tierischen Organismus zur Früh¬ erkennung von malignen Tumoren und/oder viralen Er¬ krankungen wichtig ist. Grundlage der Bestimmung dieser Substanzen im Serum oder anderen Körperflüssigkeiten ist in der Regel ein kompetitives Testverfahren, bei dem die Testsubstanz in der spezifischen Antigen-Antikörper-Reak- tion mit dem gleichzeitig im Test vorhandenen Substanz- Protein-Konjugat konkurriert. Bei diesem Verfahren ist entweder der Antikörper oder der Ligand, gegebenenfalls als Konjugat vorliegend, an eine Oberfläche immobilisiert. Ein besonderes Problem bei der Herstellung von Pteridin- oder Pterin-Protein-Konjugaten besteht darin, daß Sub¬ stanzen wie Neopterin, Biopterin und dergleichen in Wasser nur geringfügig löslich sind. Lediglich bei sehr hohem (< 12) bzw. sehr niedrigem pH-Wert (pH < 2) ist eine aus¬ reichende Löslichkeit vorhanden. Dieses ungünstige Ver¬ halten führt dazu, daß Protein-Konjugate mit diesen Sub¬ stanzen nur schwer zugänglich sind. Führt man nämlich eine Konjugation bei entsprechenden höheren oder niederen pH-Werten durch, so resultiert eine Denaturierung oder Ausfällung der Proteine. Hohe Ausbeuten lassen sich mit den üblichen Verfahren zumindest nicht erzielen.

Aus der EP-B-0 012 444 sind ein Diagnostizierverfahren, insbesondere zur Früherkennung von malignen Tumoren und/ oder viralen Erkrankungen und Mittel zu seiner Durch¬ führung, bekannt, wobei eine dem tierischen oder mensch¬ lichen Organismus entnommene Körperflüssigkeit auf den Gehalt bestimmter Pteridine untersucht wird. Diese Patent¬ schrift erwähnt verschiedene Möglichkeiten der Konjugation von Pterinen mit Proteinen. Insbesondere wird auch die Möglichkeit einer Verknüpfung des Xanthopterins mit einem immunogenen Träger über die 2-Aminogruppe erwähnt. Durch eine Umsetzung des Xanthopterins mit Bernsteinsäure-An¬ hydrid in der Wärme ergibt sich zunächst ein Hemisuccinat, das in üblicher Weise mittels Carbodiimid zum Beispiel an Rinderserumalbumin konjugiert werden kann.

Die DE-A-30 25 226 beschreibt einen Radioimmunoassay zur Bestimmung von Pterinen und dafür verwendbare Pterinderi- vate. Auch diese Literaturstelle erwähnt die Möglichkeit einer Konjugation eines Pterins auf ähnlichem Wege.

In "Journal of Immunological Methods" 120, Seiten 133 bis 143, 1989, wird beschrieben, daß zur Steigerung der Im u- nogenität kleiner Peptide diese über bestimmte Spacer an größere Carrier-Proteine gebunden werden können. Als geeig¬ nete Spacer werden Succinylimidyl 6-(N-maleimido)-n-hexa- noat (MHS), Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane- 1-carboxylat (SMCC) und Succinimidyl-m-maleimidobenzoat (MBS) genannt. Als Kopplungsreagenz wird Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)proprionat (SPDP) benannt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Diagnostikmiteis, basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Diese Aufgabe kann aller¬ dings nicht gelöst werden, ohne daß die hier zu Grunde liegenden Probleme vorgängig gelöst werden. Demnach ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ligand-Carrierprotein-Konjugat bereitzustellen, das zum einen in hoher Ausbeute und zum anderen unter Beachtung der aufgezeigten Anforderungen anfällt. Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist in der Folge dann auch die Bereitstellung eines Ligand-Antikörpers und eines ent¬ sprechenden Konjugats, wobei zum einen die Probleme bei der Immunisierung und zum anderen bei der Markierung des Haptens (in einem Testsystem oder Diagnostizierverfahren) Beachtung finden sollen. Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Ligand-Carrierprotein- -Konjugat wobei der Ligand kein Protein oder Polypeptid ist, und mit dem Protein über einen bifunktionellen Spacer verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß

- der Ligand mindestens eine funktionelle Aminogruppe aufweist,

- das Protein mindestens eine Sulfhydryl (SH-Gruppe) aufweist

- der bifunktionelle Spacer den Liganden über dessen Aminogruppe mit dem Protein über dessen SH-Gruppe verbinde .

Eine Reihe von Liganden mit reaktiven Aminofunktionen können erfindungsgemäß verwendet werden. Dazu zählen Tyronine, wie T4, T3, T2, etc., Antibiotika, wie Tetra- zyklin, Neomycin, etc. , Pteridine und Pterine, wie Neopte¬ rin, Biopterin und dergleichen. Besonders bevorzugt ist allerdings das Neopterin bzw. dessen unmittelbare, in Organismen auftretenden biochemischen Derivate.

Als Spacer zwischen Liganden mit reaktiven Aminogruppen und Proteinen kommt die allgemeine Formel

o in Frage, wobei

a - Bindung zur Aminofunktion,

R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, b = Bindung an Protein bzw. weiteren an das Protein gebundenen Spacer.

Vorzugsweise hat b im Spacer die allgemeine Formel

O n

- R' - C, - P II,

wobei

R' = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,

P = Amino- oder A idogruppe des Proteins.

Das bevorzugte Molverhältnis Ligand zu Protein beträgt 1 : 1 bis 1 : 7.

Als Proteinkomponente wird vorzugsweise Rinderserumalbumin

(BSA) , Schafserumprotein oder Immunglobulm G (IgG) ver¬ wendet.

Für den Spacer zwischen einem anti-Ligand-Antikörper und beispielsweise einem Marker-Protein kommt vorzugsweise die allgemeine Formel

O

II

III d I - S - S - - c; - cL

in Frage, wobei

c = Bindung zum Protein oder anti-Hapten-Antikörper,

R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, d = Bindung zum anti-Ligand-Antikörper oder Protein.

Vorzugsweise ist das Molverhältnis anti-Ligand-Antikörper zu Protein etwa 1 : 1.

Der anti-Ligand-Antikörper ist vorzugsweise ein Immunglo- bulin G (IgG) . Dieser Antikörper kann sowohl poly- als auch monoclonal sein.

Die Proteinkomponente des anti-Ligand-Antikörper-Protein- Konjugats ist vorzugsweise ein Enzym, wie Peroxidase, Phosphatase, ß-Galaktosidase oder Urease. Besonders bevor¬ zugt ist die Peroxidase HRP (Horse Radish Peroxidase) .

Die einzelnen zuvor genannten Konjugate sind vorzugsweise als Teil eines ELISA-Kits verwendet (enzyme-linked im uno- sorbent assay) . Bei einem Kit zur Bestimmung eines Ligan¬ den als Analyten wird ein kompetitiver ELISA bevorzugt.

Bei dem erfindungsgemäßen Analytikum wird vorzugsweise das Ligand-Carrierprotein-Konjugat als Festphasenmatrix immobilisiert. Alternativ kann der anti-Ligand-Antikörper an eine feste Oberfläche immobilisiert werden. In beiden Fällen sind Kunststoffoberflächen wie aus Latex oder Poly¬ styrol oder auch Papieroberflächen bevorzugt.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein zur Herstellung eines Diagnostikums geeignetes Hapten aus dem Ligand-Carrierprotein-Konjugat, wie es oben beschrie¬ ben wurde. Ohne dieses Hapten wird es nämlich kaum möglich sein, entsprechende anti-Ligand-Antikörper in ausreichen¬ der Konzentration und mit den erfindungsgemäßen Vorteilen herzustellen. Dieses Konjugat dient dann zunächst zur Immunisierung und später zur Aufarbeitung der anti-Ligand- Antikörper mittels Affinitätschromatographie. Als erfin¬ dungsgemäße Konjugate haben sich insbesondere bewährt: - Neopterin-IgG-Konjugat (Kaninchen-IgG)

- Neopterin-Rinderserumalbumin-Konjugat

- Neopterin-Schafserumprotein-Konj gat.

In einem kompetitiven ELISA-System haben sich darüber hinaus Konjugate des Liganden mit Peroxidase, insbesondere HRP, bewährt.

Im Prinzip ist die Auswahl der Träger-Proteine für die Konjugate kaum beschränkt. Ein wichtiger Parameter für die Auswahl geeigneter Trägerproteine ist eine gute Bin¬ dung an die Festphasenmatrix, wie zum Beispiel eine Poly¬ styrol-KunststoffOberfläche. Für die Auswahl des mit dem Liganden (insbesondere Neopterin) vorgesehenen Enzyms spielt die Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität die entscheidende Rolle.

Ein weiterer Bestandteil des Diagnostikmittels gemäß der Erfindung ist ein anti-Ligand-Antikörper-Protein-Konjugat, wie zuvor beschrieben. Vorzugsweise wird der Antikörper zunächst mittels des erfindungsgemäßen Ligand-Protein-Kon- jugats bereitgestellt. Dabei kommt sowohl eine monoclonale als auch eine polyclonale Präparation in Frage. Bei der Herstellung des anti-Ligand-Antikörpers sowie des anti- Ligand-Antikörper-Protein-Konjugats sollte jeweils berück¬ sichtigt werden, daß die Proteinkomponente von derselben Spezies abstammt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Ligand-Protein-Konjugats, mit der Maßgabe, daß der Ligand mindestens eine reaktive Aminofunktion aufweist, wobei der Ligand vorzugsweise aus der Gruppe der Pteridine und Pterine gewählt ist, gekenn¬ zeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

1. Umsetzung des Liganden mit einem bifunktionalen Spacer, wobei eine funktioneile Gruppe des Spacers mit einer Aminogruppe des Haptens unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagiert und

weitere Umsetzung des gebildeten Produktes mit dem Carrier-Protein zum Ligand-Carrierprotein-Konjugat, wobei Sulfhydrylgruppen des Proteins oder des in vorgeschaltetem/en Reaktionsschritt/en entsprechend durch weitere Spacer modifizierten Proteins mit einer anderen funktioneilen Gruppen des Spacers reagieren.

Vorzugsweise hat der bifunktionale Spacer die all¬ gemeine Formel

o \j 0 - o - *

wobei

R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Der Spacer ist vorzugsweise N-gamma-Maleimidobutyrohypoxy- succinimid (GMBS) . Vorzugsweise wird die Reaktion zwischen Hapten und Spacer bei einem pH-Wert von 8 bis 9 durchge¬ führt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Di¬ rnethylformamid (DMF) als zusätzliches Lösungsmittel.

Gegebenenfalls ist es erforderlich in das Protein durch vorgelagerte Reaktionsschritte Sulfhydrylgruppen einzu¬ führen. Diese lassen sich in der Regel sehr leicht durch Behandlung mit Reduktionsmitteln erhalten. Bevorzugtes Reduktionsmittel ist ein Thiol. Besonders bevorzugt werden Mercapthoethanol (ME) , Dithiothreitol (DTT) oder Dithio- erythritol (DTE) eingesetzt. Die Reduktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 8 durchgeführt. Vorzugsweise werden 10 bis 15 mol Sulfhydrylgruppen pro mol Protein eingeführt.

Alternativ ist es möglich, in dem/den vorgeschalteten Reaktionsschritt/en Sulfhydrylgruppen mittels eines wei¬ teren Spacers in das Protein einzuführen. Vorzugsweise kann dieser weitere Spacer zunächst eine -S-S- oder -S- Gruppe enthalten, die erst durch eine weitere Reaktion, vorzugsweise mit Reduktionsmitteln, in eine Sulfhydryl- gruppe umgebildet wird. Besonders bevorzugt ist in einem solchen Fall ein Spacer der allgemeinen Formel

0 0 0

^~ - c ^~ s - R. - < - °^~ * v,

\ )

wobei

R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Als besonders bevorzugt gilt hierbei N-Succinimidyl-S- Acetylthioacetat (SATA) .

Ein weiterer bevorzugter Spacer hat die allgemeine Formel

o ιι

VI,

o

wobei R¹ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenwasserstoffatomen, aromatischer Kohlen¬ wasserstoff oder Heteroaromat,

R aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

^'Besonders bevorzugt ist als ein solcher Spacer Succini- midyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) .

Mittels der vorstehend genannten vorgeschalteten Reaktions¬ schritte werden vorzugsweise 10 bis 15 mol weiterer Spacer pro mol Protein eingeführt.

Die weitere Umsetzung des aus Ligand und bifunktionalem Spacer gebildeten Produkts mit einem Carrier-Protein zum Ligand-Carrierprotein-Konjugat wird vorzugsweise in einer auf den pH-Wert 7,5 bis 9 gepufferten Lösung ausgeführt. Es hat sich als günstig erwiesen, die nicht umgesetzten Sulfhydrylgruppen im Anschluß daran durch an sich bekannte Reagenzien zu blocken.

Vorzugsweise wird das Molverhältnis Ligand zu Carrierpro- tein auf Werte von 1 : 1 bis 1 : 7 eingestellt.

Die vorzugsweise eingesetzten Carrierproteine sind Rinder¬ serumalbumin (BSA) , Schafserumprotein oder Immunglobulin G (IgG) .

Das anti-Ligand-Antikörper-Protein-Konjugat zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Diagnostikmittel kann wie folgt hergestellt werden:

1. Umsetzung des anti-Ligand-Antikörpers oder des Pro¬ teins mit einem bifunktionalen Spacer, wobei eine funktioneile Gruppe des Spacers mit einer Amino- oder Amidogruppe des anti-Ligand-Antikörpers oder des Proteins unter Ausbildung einer kovalenten Bin¬ dung reagiert und

2. weitere Umsetzung des so gebildeten Produktes mit dem Protein oder dem anti-Ligand-Antikörper zum ge¬ wünschten Konjugat, wobei durch vorgeschaltete/n Reaktionsschritt/e in den noch nicht in Verfahrens¬ schritt 1) umgesetzten Reaktionspartner weitere bi¬ funktionale Spacer eingebracht wurden und eine andere funktioneile Gruppe des an den in Verfahrensschritt 1) an den einen Reaktionspartner gebundenen bifunkti¬ onalen Spacers mit dem/den weiteren bifunktionalen Spacer/n unter Ausbildung von -S-S-Gruppen reagiert.

Vorzugsweise entstammt der Antikörper selber einer Immu¬ nisierung mittels des erfindungsgemäßen Ligand-Carrierpro- tein-Konjugats.

Der bifunktionale und/oder weitere bifunktionale Spacer hat vorzugsweise die allgemeine Formel

0 0 0 v,

R - C ^~ S - k - - o -

wobei

R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Besonders bevorzugt ist hierbei der Spacer N-Succinimidyl- S-Acetylthioacetat (SATA) . Vorzugsweise kann der bifunktionale und/oder weitere bi¬ funktionale Spacer auch die allgemeine Formel

0 0

0

haben, wobei

R' = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwasser¬ stoff oder Heteroaromat,

R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Hierbei ist als Spacer Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio- acetat)propionat (SPDP) bevorzugt.

In an sich bekannter Weise kann der im Verfahrensschritt 1) umgesetzte Spacer mit Sulfhydrylgruppen versehen werden. Hierzu bietet sich insbesondere eine Umsetzung mit Hydroxylamin (im Falle, daß SATA der Spacer ist) oder Thiolen (im Falle, daß^'SPDP der Spacer ist) an.

Das Molverhältnis anti-Ligand-Antikörper zu Protein soll so gewählt werden, daß im Konjugat weder der Antikörper noch das Protein - im Falle, daß das Protein ein Enzym ist - seine Aktivität verliert.

Bevorzugte Proteine sind Enzyme wie Peroxidase, Phos- phatase, ß-Galaktosidase oder Urease. Besonders bevorzugt ist als Peroxidase die Horse Radish Peroxidase (HRP) .

Das bevorzugte Molverhältnis anti-Ligand-Antikörper zu Protein beträgt etwa 1 : 1. Das anti-Ligand-Antikörper-Serum kann vorzugsweise poly- oder monoclonal sein.

In bevorzugter Weise läßt sich im erfindungsgemäßen Ver¬ fahren als anti-Ligand-Antikörper eine Immunglobulin G-

_ Fraktion verwenden.

"Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Zwischenproduktes Ligand-Protein-Kon- jugat zur Immunisierung. 0

Darüber hinaus ist die Verwendung des anti-Ligand-Anti- körper-Protein-Konjugats zur Markierung von Liganden

(Analyten) Gegenstand der Erfindung.

₅ In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher er¬ läutert. Als Modellsubstanz der Erfindung dient im folgen¬ den Neopterin (2-Amino-6-(l,2,3-trihydroxypropyl)-4(3H)- pteridinon) .

0

I . Neopterin-Protein-Koniucrat

a) Kopplung des Spacers an das Neopterin

5 In einer ersten Reaktion wird ein Spacer mit dem Neopterin bei einem pH-Wert von 8 bis 9 umgesetzt. Die Löslichkeit des Neopterins bei diesem pH-Wert ist allerdings sehr gering. Deshalb wird Neopterin zunächst einmal bei einem höheren pH-Wert gelöst. Im _Q Anschluß daran wird Dimethylformamid zugegeben und der pH-Wert auf die gewünschte Höhe eingestellt. Schließlich wird zu dieser Lösung eine Lösung des Spacers (hier: GMBS) in DMF zugegeben. Bei der Reak¬ tion liegt das Neopterin im Überschuß vor. Nach etwa 4-stündiger Reaktionsdauer bei Raumtemperatur ist die Reaktion so gut wie abgeschlossen. Als Trägerproteine für das Neopterin kommen eine Reihe von Substanzen, wie

- Kaninchen-IgG

- (HRP) in Frage. In Abhängigkeit von dem gewählten Träger¬ protein ist es entweder möglich, aus diesem Sulf¬ hydrylgruppen freizusetzen oder durch Umsetzung mit weiteren Spacern entsprechende Gruppen in das Protein einzuführen.

Erzeugung von SH-Gruppen im Trägerprotein

Freie Sulhydrylgruppen können relativ leicht durch Reduktion von Disulfidbrücken mittels Reagenzien, wie Dithiothreitol und dergleichen, in Proteine ein¬ geführt werden. Diese Reduktion wird in der Regel in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8 durchgeführt. Die Generierung von SH-Gruppen läßt sich dadurch steuern, daß das Reduktionsmittel mit- tels Gelfiltrationschromatographie und dergleichen aus dem Reaktionsgemisch entfernt wird. Bei den an¬ gegebenen Bedingungen wurden etwa 10 bis 15 mol SH- Gruppen pro mol IgG oder BSA erzeugt.

Alternativ lassen sich auch mittels bekannter Methoden SH-Gruppen dadurch in das Trägerprotein einführen, daß Spacer, wie SATA oder SPDP, einge¬ führt werden. Auch bei dieser Reaktion, die in an sich bekannter Weise durchgeführt wird, sollen 10 bis 15 mol Spacer pro Trägerprotein eingeführt werden. In der Regel reagieren bei den oben genannten Spacern die Aminogruppen der Proteine mit den zu¬ letzt genannten. Die freien SH-Gruppen werden in der Regel durch Umsetzung mit Reduktionsmitteln (s. zu¬ vor) gewonne . c) Kopplung des Neopterin-Spacer-Konjugats an ein mit SH-Gruppen versehenes Protein

Diese Kopplungsreaktion wird bei pH-Werten zwischen 7,5 und 9 durchgeführt. Hierbei ist es sinnvoll, zunächst einen Teil des Dimethylformamids zu ent¬ fernen und schließlich die Neopterin-Spacer-Lösung in eine verdünnende Pufferlösung aufzunehmen. Nach Zugabe einer Lösung des modifizierten Proteins läßt man die Lösung über einen Zeitraum von etwa 24 Stun¬ den inkubieren. Nach Abschluß der Reaktion werden die nicht abreagierten SH-Gruppen mit z. B. Jodacet- amid blockiert. Die übrigen Reaktionsteilnehmer werden im Anschluß daran nach an sich bekannten Methoden aus der Lösung entfernt.

Bei der eben beschriebenen Methode, insbesondere bei Verwendung von IgG, BSA, Neopterin und GMBS als Spacer, wird ein Neopterin-Protein-Verhältnis von 1 bis 7 mol zu 1 mol erreicht.

II. Herstellung eines anti-Neopterin-Antikörper-HRP- Kon u ats

Mono- bzw. polyclonale^' anti-Neopterin-Antikörper werden in an sich bekannter Weise durch Verwendung der erfin¬ dungsgemäßen Neopterin-Protein-Konjugate gewonnen.

a) Kopplung von SPDP oder SATA an IgG

Gereinigte IgG-Fraktionen (anti-Neopterin-Antikörper) werden nach bekannten Methoden leicht mit Spacern versehen (beispielsweise SATA, SPDP) . Aus diesen Spacern werden dann auch leicht, durch zum Beispiel reduktive Umsetzung mit Mercapthoethanol, SH-Gruppen freigesetzt. b) Kopplung von SPDP oder SATA an HRP

In der zuvor beschriebenen Weise gelingt auch die

Umsetzung von Horse Radish Peroxidase (HRP) mit SPDP oder SATA.

c) Kopplung IgG-(SPDP oder SATA) an HRP-SPDP

HRP-SPDP koppelt unter milden Bedingungen an IgG- (SPDP oder SATA) . Typische Reaktionsausbeuten betragen 1 bis 3 mol HRP pro mol IgG.

Ein typischer Enzym-Immuno-Essay (ELISA) zur Bestimmung von Neopterin in Körperflüssigkeiten unter Verwendung von beschichteten Mithomikrotiterplatten wird im folgenden beschrieben: Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit Neopterin beschichtet. Im ersten Inkubationsschritt kon¬ kurriert das Neopterin aus den Patientenproben mit dem auf der Mikrotiterplatte gebundenen Neopterin um die Bin¬ dungsstellen des Antikörper-Enzym-Konjugats. Es entstehen antigen-Antikörper-Komplexe. Nicht gebundene Substanzen werden durch einen anschließenden Waschschritt entfernt. In der zweiten Inkubationsphase beginnt mit Zugabe der Substratlösung die Farbreaktion. Farbloses Tetramethyl- benzidin wird vom EnzymKonjugat (Peroxidase) in einen blauen Farbkomplex umgesetzt. Durch die Zugabe der Schwe¬ felsäure schlägt die blaue Farbe in Gelb um. Es bildet sich ein stabiler Farbkomplex durch pH-Änderung in den sauren Bereich. Das Adsorptionsmaximum liegt bei 450 nm. Bei konstanter Reaktionszeit ist die Farbintensität, ge¬ messen in optischer Dichte, von der Menge des gebundenen Enzym-Konjugats abhängig und umgekehrt proportional zur Neopterin-Konzentration der Patientenprobe. Hohe Neopte- rinwerte entsprechen also einer niedrigen optischen Dichte.

Die optische Dichte wird in einem Plattenphotometer bei 450 nm gemessen. Bei jedem Versuchsansatz wird über die optische Dichte der Standards ein Konzentrationsprofil (Standardkurve) ermittelt. Hieran kann die Neopterinkon- zentration der Patientenproben direkt abgelesen werden.

Ein typisches Diagnostikmittel gemäß der Erfindung ist als Kit im nachfolgenden beschrieben:

Der Reagenziensatz zur Bestimmung des Neopterins enthält folgende Komponenten in Mengen, ausreichend für 96 Einzel¬ bestimmungen:

A Mikrotiterplatte beschichtet mit Neopterin B Enzymkonjugat (Anti-Neopterin-Peroxidase) C Enzymkonjugatpuffer D Substrat (Tetramethylbenzidin) E Substratpuffer, wobei der Substratpuffer unmittelbar vor Gebrauch mit dem Substrat versetzt wird F eine Stopplösung aus 0,1 M Schwefelsäure G eine Waschlösung als Konzentrat, die vor Gebrauch mit destilliertem Wasser auf eine vorbestimmte Menge verdünnt werden muß, sowie Neopterin-Nullstandard,

'Neopterin-Standards in Humanserum in Konzentrationen von 6, 8, 12, 16, 32, 64 nmol/1, sowie Kontrollseren I und II in Humanserum.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. Ligand-Carrierprotein-Konjugat, wobei der Ligand kein Protein oder Polypeptid ist, und mit dem Protein über einen bifunktionellen Spacer verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß

- der Ligand mindestens eine funktioneile Aminogruppe aufweist,

- das Protein mindestens eine Sulfhydryl (SH-Gruppe) aufweist

- der bifunktionelle Spacer den Liganden über dessen Aminogruppe mit dem Protein über dessen SH-Gruppe verbindet.

Konjugat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer zwischen Ligand und Protein die allge¬ meine Formel

⁰ ° -b

0 hat, wobei

a = Bindung zur Aminofunktion,

R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,

b = Bindung an Protein bzw. weiteren an das Protein gebundenen Spacer. 3. Konjugat gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

b gleich die allgemeine Formel

0

II

- R' - - P

hat, wobei

10

R' = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,

P = Amino- oder A idogruppe des Proteins.

J.5

4. Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis Ligand zu Pro¬ tein 1 : 1 bis 1 : 7 beträgt.

5. Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch

20 gekennzeichnet, daß das Protein Rinderserumalbumin (BSA) , Schafserumprotein oder Im unglobulin G (IgG) ist.

6. Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Enzym, wie Per¬ oxidase, Phosphatase, ß-Galaktosidase oder Urease, ist.

7. Konjugat gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Peroxidase HRP (Horse Radish Peroxidase) ist.

8. Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es Teil eines ELISA-Kits (enzyme- linked immunosorbent assay) ist. 9. Konjugat gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit für einen ko petitiven ELISA zusammenge¬ stellt ist.

10. Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Ligand-Carrierprotein-Kon¬ jugat immobilisiert als Festphasenmatrix vorliegt.

11. Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der anti-Hapten-Antikörper immo¬ bilisiert als Festphasenmatrix vorliegt.

12. Konjugat gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Festphasenmatrix eine Kunststoff- Oberfläche wie Polystyrol ist.

13. Verfahren zur Herstellung eines Ligand-Carrierprotein- Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekenn¬ zeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

1. Umsetzung des Liganden mit einem bifunktionalen Spacer, wobei eine funktionelle Gruppe des Spacers mit einer Aminofunktion des Liganden unter Aus¬ bildung einer kovalenten Bindung reagiert und

2. weitere Umsetzung des gebildeten Produkts mit dem Carrierprotein zum Ligand-Carrierprotein-Konjugat, wobei Sulfhydrylgruppen des Proteins oder des in vorgeschaltetem/en Reaktionsschritt/en ent¬ sprechend durch weitere Spacer modifizierten Pro¬ teins mit einer anderen funktionellen Gruppe des Spacers reagieren. 14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der bifunktionale Spacer die allgemeine Formel

hat, wobei

0 R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der Spacer N-gamma-Maleimidobutyro- ₅ hypoxysuccinimid (GMBS) ist.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, da¬ durch gekennzeichnet, daß die Reaktion zwischen Ligand und Spacer bei einem pH-Wert von 8 bis 9 durch- o geführt wird.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß als zusätzliches Lösungsmittel Dimethylformamid (DMF) zugegeben wird.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, da¬ durch gekennzeichnet, daß in dem/den vorgeschalte- tem/en Reaktionsschritt/en in das Protein Sulfhy¬ drylgruppen eingeführt werden.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfhydrylgruppen durch Reduktion entspre¬ chender Precursorgruppen erzeugt werden. 20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß zur Reduktion Thiole eingesetzt werden, wie Mercapthoethanol (ME) , Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythritol (DTE) .

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, da¬ durch gekennzeichnet, daß in dem/den vorgeschalte- tem/en Reaktionsschritt/en Sulfhydrylgruppen mittels eines weiteren Spacers in das Protein eingeführt werden.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer zunächst eine -S-S- oder -S- Gruppe enthält, die erst durch eine weitere Reaktion, vorzugsweise mit Reduktionsmitteln, in eine Sulfhy- drylgruppe umgebildet wird.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer die allgemeine Formel

0 0 0

V

R -ζ - S - R - ^{~ 0 '} "

0

hat, wobei

R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer N-Succinimidyl-S-Acetylthio- acetat (SATA) ist. 25. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer die allgemeine Formel

hat, wobei

R'= aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,

R = aliphathische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer Succinimidyl-3-(2-pyridyl- dithio)propionat (SPDP) ist.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 26, da¬ durch gekennzeichnet, daß das Protein durch Ein¬ führung von 10 bis 15 mol weiterer Spacer pro mol Protein modifiziert wird.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 27, da¬ durch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis Ligand zu Protein auf Werte von 1 : 1 bis 1 : 7 eingestellt wird.

29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 28, da¬ durch gekennzeichnet, daß als Protein Rinderserum¬ albumin (BSA) , Schafserumalbumin oder Immunglobulin G (IgG) eingesetzt wird. 30. Diagnostikmittel mit einem Ligand-Carrierprotein-Kon¬ jugat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12.

31. Diagnostikmittel nach Anspruch 30 in Form eines Kits, der zusätzlich verschiedene Konzentrationen des zu

_ analysierenden Gegenstandes (Analyten) , Anti-Analyt- Antikörper sowie Hilfsreagenzien und eine Festphasen¬ matrix aufweist.

32. Anti-Ligand-Antikörper-Konjugat, gebunden über einen 0 bifunktionellen Spacer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3.

33. Hapten bestehend aus einem Ligand-Carrierprotein-Kon¬ jugat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12. 5

34. Verwendung eines anti-Ligand-Antikörper-Proteinkon-

_* jugats, wobei

- zwischen dem anti-Hapten-Antikörper und dem Protein ₀ mindestens ein bifunktionaler Spacer vorhanden ist, der r

- mit einer funktionellen Gruppe an eine Amino- oder Amidogruppe des Proteins oder anti-Hapten-Anti- 5 körpers gebunden ist und

- mit einer anderen funktioneilen Gruppe über Schwefel-Schwefel-Bindungen eine Verknüpfung zum jeweils anderen Teil des Konjugats, gegebenenfalls _Q unter Verwendung eines weiteren bifunktionalen Spacers, herstellt;

- das Protein die Funktion eines Träger-Moleküls, gegebenenfalls die eines Tracer-Moleküls, erfüllt,

zur Herstellung eines Diagnostikums nach einem der Ansprüche 30 bis 33.