RS56093B1 - Postupci za identifikovanje antitela sa smanjenom imunogenošću - Google Patents

Description

Opis

1. UKRŠTENA REFERENCA PREMA SRODNIM PRIJAVAMA

2. SPISAK SEKVENCI

Ova prijava sadrži Spisak sekvenci koji je podnesen u ASCII formatu preko EFS-Web-a. Navedena ASCII kopija, urađena 17. septembra 2013., označena je sa 381493-721WO(118133)_SL.txt, a veličina joj je 6,980 bajtova.

3. STANJE TEHNIKE

Epitopi B-ćelija su položaji na molekulima koje prepoznaju antitela imunog sistema. Identifikovanje B-ćelijskih epitopa na terapeutskim proteinima može biti od koristi u dizajniranju varijanti koje ne podstiču imuni odgovor kada se primenjuju pacijentima.

B-ćelijski epitopi se mogu identifikovati posredstvom pojedinačnog mutiranja aminokiselina proteina, obično sa alaninom (alaninsko skeniranje), i određivanja efekta svake mutacije na vezivanje antitela (Onda et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. 108(14):5742-7). Narušavanje protein-antitelo vezivanja nakon mutageneze pokazuje da je mutirani ostatak deo B-ćelijskog epitopa, koji se prepoznaje od strane antitela. Utvrđeno je da čak i jedna mutacija na B-ćelijskom epitopu može eliminisati vezivanje za panel antitela, usmerenih prema proteinu, i da imunogenost proteina može biti smanjena uvođenjem mutacija u epitop B-ćelija (Nagata i Pastan, 2009, Advanced Drug Delivery Reviews 61:977-985). Međutim, ovaj pristup, isto tako zahteva utrošak vremena i intenzivan rad. Pored toga, skeniranjem alanina se ne identifikuju uvek mutacije koje bi mogle obezbediti najveće smanjenje imunogenosti.

Sledstveno tome, postoji potreba za jednostavnim postupkom, koji ne zahteva veliki napor, već predstavlja sveobuhatan postupak koji omogućuje identifikovanje i eliminisanje B-ćelijskih epitopa.

Gonzales i saradnici (2005) opisuju genetske pristupe koji su korišćeni za humanizovanje mišjih antitela.

4. IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

Ovaj pronalazak obezbeđuje sistem koji omogućuje da doprinos imunogenosti svake i svih aminokiselina u okviru područja od značaja u referentnom antitelu bude razjašnjen. Izlaganje obezbeđuje da aminokiselinski ostatak na bilo kojim, nekim ili na svim pozicijama referentnog antitela može biti mutiran u nekim ili u svim drugim od 19 aminokiselina i da uticaj te mutacije na imunogenost antitela bude evaluiran. Isto tako može biti utvrđen efekat mutacija na nivoe ekspresije i/ili vezivanje antitela za ciljne molekule, čime se omogućuje identifikovanja varijanti antitela u kojima su regioni imunogenosti eliminisani ili umanjeni, pri čemu se još zadržavaju povoljne karakteristike (npr., pogodni nivoi ekspresije, vezivanje za ciljni molekul). Sledstveno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za smanjivanje imunogenosti antitela. Postupci su zasnovani na skriniranju i identifikovanju varijanti antitela sa redukovanim vezivanjem za anti-idiotipska antitela. Smanjivanje vezivanja za anti-idiotipska antitela korelira sa smanjenom in vivo imunogenošću (vidi, npr., Nagata i Pastan, 2009, Advanced Drug Delivers Reviews 61:977-985).

Postupci izlaganja uopšteno obuhvataju korake (a) dovođenja u kontakt biblioteke domaćinskih ćelija sa anti-idiotipskim antitelom koje se specifično vezuje sa referentnim antitelom, pri čemu je referentno antitelo monoklonsko antitelo koje se vezuje sa ciljnim molekulom, a biblioteka domaćinskih ćelija sadrži ćelije domaćina sisara, od kojih svaka na ćelijskoj površini vrši ekspresiju varijante antitela koje se od referentnog antitela razlikuju po tačkastoj mutaciji jedne aminokiseline; (b) identifikovanja populacije ćelija u navedenoj biblioteci domaćinskih ćelija, koje ekspresuju varijante antitela koje ispoljavaju smanjeno vezivanje za anti-idiotipsko antitelo u odnosu na referentno antitelo; i (c) identifikovanje varijante antitela koja je zastupljenija u populaciji, čime se identifikuje varijanta referentnog antitela sa redukovanom imunogenošću. U određenim aspektima, postupci zahtevaju podvrgavanje biblioteke ćelija domaćina protočnoj citometriji, i razvrstavanje populacije iz biblioteke domaćinskih ćelija korišćenjem, na primer, fluorescencijom-aktiviranog sortiranja ćelija (FACS).

U određenim aspektima, postupci, dalje, obuhvataju korak utvrđivanja da li se varijanta antitela koja ima smanjenu imunogenost, vezuje za ciljni molekul na nivou koji je suštinski jednak ili bolji od vezivanja referentnog antitela i/ili se ekspresuje na nivou koji je suštinski jednak ili je bolji od nivoa ekspresije referentnog antitela. U specifičnim ostvarenjima, vezivanje i ekspresija se utvrđuju posredstvom protočne citometrije, sortiranja magnetskim zrncima, BIAcore testa, FACS-a, ELISA, AlphaLisa ili KinExA testa, a određuju se pre, istovremeno ili nakon identifikovanja varijanti antitela koje imaju redukovanu imunogenost.

Ovde opisani postupci primenjuju se na anti-TNF-α antitelo D2E7 (poznato, takođe, kao adalimumab). Identifikovane su varijante D2E7 sa smanjenim vezivanjem za jedno, dva ili tri različita anti-idiotipska antitela. Tekuće izlaganje obezbeđuje anti-TNF-α antitela sa CDR sekvencama sličnim onim kod D2E7, ali koje imaju najmanje jednu supstituciju kojom se smanjuje vezivanje za anti-Id antitela. Takve varijante se, ponekad, označavaju kao varijante sa "smanjenom imunogenošću".

Anti-TNF-α antitela pronalaska sadrže šest CDR-a koji imaju aminokiselinske sekvence koje odgovaraju SEQ ID NO:5 (CDR-H1), SEQ ID NO:6 (CDR-H2), SEQ ID NO:7 (CDR-H3), SEQ ID NO:8 (CDR-L1), SEQ ID NO:9 (CDR-L2) i SEQ ID NO:10 (CDR-L3), i poseduju najmanje jednu supstituciju, odabranu od: G5F u CDR-L1, G51 u CDR-L1, G5V u CDR-L1, G5W u CDR-L1, G5Y u CDR-L1, R71 u CDR-L1, R7T u CDR-L1, R7V u CDR-L1, N8A u CDR-L1, N8D u CDR-L1, N8E u CDR-L1, N8G u CDR-L1, N8L u CDR-L1, N8M u CDR-L1, N8Q u CDR-L1, N8R u CDR-L1, N8T u CDR-L1, A1I u CDR-L2, A1T u CDR-L2, A1V u CDR-L2, T4D u CDR-L2, R2G u CDR-L3, N4F u CDR-L3, N4M u CDR-L3, N4W u CDR-L3, N4Y u CDR-L3, R5L u CDR-L3, R5N u CDR-L3, R5W u CDR-L3, R5Y u CDR-L3, T9Y u CDR-L3, D1S u CDR-H1, Y2A u CDR-H1, Y2C u CDR-H1, Y2K u CDR-H1, Y2M u CDR-H1, Y2R u CDR-H1, Y2S u CDR-H1, Y2V u CDR-H1, H5C u CDR-H1, H5D u CDR-H1, H5E u CDR-H1, H5S u CDR-H1, H5T u CDR-H1, T3A u CDR-H2, T3G u CDR-H2, T3N u CDR-H2, W4A u CDR-H2, W4F u CDR-H2, W4H u CDR-H2, W4L u CDR-H2, W4M u CDR-H2, W4V u CDR-H2, N5G u CDR-H2, S6D u CDR-H2, S6L u CDR-H2, I9K u CDR-H2, D10L u CDR-H2, Y11A u CDR-H2, Y11C u CDR-H2, Y11E u CDR-H2, Y11F u CDR-H2, Y11G u CDR-H2, Y11H u CDR-H2, Y111 u CDR-H2, Y11K u CDR-H2, Y11L u CDR-H2, Y11M u CDR-H2, Y11N u CDR-H2, Y11Q u CDR-H2, Y11R u CDR-H2, Y11S u CDR-H2, Y11V u CDR-H2, YIIW u CDR-H2, A12Y u CDR-H2, D13N u CDR-H2, V15D u CDR-H2, V15L u CDR-H2, V15M u CDR-H2, V15Q u CDR-H2, V15T u CDR-H2, E16F u CDR-H2, E16H u CDR-H2, E16K u CDR-H2, E16R u CDR-H2, E16T u CDR-H2, E16W u CDR-H2, G17A u CDR-H2, G17C u CDR-H2, G17E u CDR-H2, G17H u CDR-H2, G17I u CDR-H2, G17K u CDR-H2, G17L u CDR-H2, G17M u CDR-H2, G17N u CDR-H2, G17P u CDR-H2, G17Q u CDR-H2, G17R u CDR-H2, G17S u CDR-H2, G17T u CDR-H2, G17Y u CDR-H2, V1G u CDR-H3, V1R u CDR-H3, V1W u CDR-H3, L4T u CDR-H3, L4V u CDR-H3, T6V u CDR-H3, S9K u CDR-H3, S9W u CDR-H3, S9Y u CDR-H3 i D11V u CDR-H3. Šest CDR-a, svi zajedno mogu imati do 8, do 7, do 6, do 5 ili do 4 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa CDR sekvencama adalimumaba. U određenim aspektima, svaki CDR može imati do 4, do 3 ili do 2 supstitucije u poređenju sa CDR-ima adalimumaba. U specifičnim ostvarenjima, anti-TNF-α antitela pronalaska imaju jednu ili više kombinacija aminokiselinskih supstitucija, pri čemu supstitucija(supstitucije) teškog lanca, ukoliko je prisutna, uključuje najmanje jednu od supstitucija (a) Y2K u CDR-H1; (b) Y2M u CDR-H1; (c) Y2K u CDRH1 i T6V u CDR-H3; (d) Y2K u CDR-H1, V1G u CDR-H3 i T6V u CDR-H3; (e) V1W u CDR-H3 i (f) V1G u CDR-H3 i T6V u CDR-H3, i pri čemu supstitucija(supstitucije) lakog lanca, ukoliko je prisutna, uključuje najmanje jednu od supstitucija (a) G5S u CDR-L1 i A11S u CDR-L1; (b) R7I u CDR-L1; (c) G5S u CDR-L1, R7T u CDR-L1 i A11S u CDR-L1; i (d) G5S u CDR-L1, R71 u CDR-L1 i A11S u CDR-L1. U specifičnim ostvarenjima, antitela izlaganja sadrže kombinaciju aminokiselinskih supstitucija, odabranu od onih koje su prikazane na SLICI 22.

Anti-TNF-α antitela izlaganja poželjno ispoljavaju smanjeno vezivanje za jedno, dva, tri, četiri, pet ili za svih šest adalimumab anti-idiotipskih antitela 5A1, 10F8, 7A11, 1H11, 6A11 i 10B7.

Ovaj pronalazak se, dalje, odnosi na molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju anti-TNF-α antitela izlaganja i ćelije domaćina koje ih sadrže.

Ovo izlaganje se, dalje, odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-TNF-α antitela izlaganja i na postupke lečenja humanog pacijenta koji boluje od imunog poremećaja, putem primene anti-TNF-α antitela ili farmaceutskih kompozicija koje ih sadrže. U određenim aspektima, imuni poremećaj koji se leči je: reumatoidni artritis (RA) (uključujući blagi do ozbiljnog RA kod odraslih), juvenilni idiopatski artritis (JIA) (uključujući blagi do ozbiljnog poliartikularnog JIA kod pacijenata starosti 4 godine i više), psorijazni artritis (PsA) (uključujući PsA kod odraslih), ankilozirajući spondilitis (AS) (uključujući AS kod odraslih), Kronova bolest (CD) (uključujući blagu ili ozbiljnu CD kod odraslih), hronična plak psorijaza (Ps) (uključujući blagu do ozbiljne hronične plak psorijaze kod odraslih) ili aksijalni spondiloartritis (axSpA) (uključujući ozbiljni axSpA kod odraslih pacijenata koji nemaju dokaz strukturnog oštećenja dobijen snimanjem X-zracima). U jednom ostvarenju ovog pronalaska, obezbeđana je varijanta referentnog anti-TNF-α antitela ili vezujućeg fragmenta referentnog anti-TNF-α antitela, pri čemu referentno antitelo ili vezujući fragment sadrži šest regiona koji određuju komplementarnost ("CDR-i") (hipervarijabilne sekvence) koji poseduju aminokiselinske sekvence koje odgovaraju: SEQ ID NO:5 (CDR-H1), SEQ ID NO:6 (CDR-H2), SEQ ID NO:7 (CDR-H3), SEQ ID NO:8 (CDR-L1), SEQ ID NO:9 (CDR-L2) i SEQ ID NO: 10 (CDR-L3), pri čemu varijanta uključuju supstitucije Y2K u CDR-H1 i R7T ili R7I u CDR-L1, i pri čemu šest CDR-a, svi zajedno, imaju do 8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa CDR sekvencama referentnog antitela ili vezujućeg fragmenta.

ATAK OPIS SLIKA

SLIKE 1A-1C: SLIKA 1A pruža translatirane aminiokiselinske sekvence fragmenata varijabilnog teškog (VH) i varijabilnog lakog (VL) lanca sintetskog D2E7 (adalimumab, HUMIRA). SLIKA 1B prikazuje aminokiselinske sekvence VHi VLfragmenata CDR-a D2E7. SLIKA 1C prikazuje nukleotidne sekvence VHfragmenta D2E7 i VLfragmenta D2E7 (SEQ ID NO: 1, odnosno SEQ ID NO:3).

SLIKA 2: pruža spisak povoljnih mutacija u D2E7- VLkoje će dovesti do neutralnog vezivanja za TNF-α i smanjenog vezivanja za anti-Id 5A1 (a), 10F8 (b) ili 7A11 (c). Položaji aminokiselina su dati i u okviru pojedinačnih CDR-a i prema Kabat brojčanom označavanju. SLIKA 2 prikazuje SEQ ID NO.:8-10, prema redosledu pojavljivanja.

SLIKE 3A-3B: SLIKA 3A pruža spisak povoljnih mutacija u CDR-H1 i CDR-H2 D2E7- VHkoje će dovesti do neutralnog vezivanja za TNF-α i smanjenog vezivanja za anti-Id 1H11 (d), 6A11 (e) ili 10B7 (f). SLIKA 3B pruža spisak povoljnih mutacija u CDR3-H3 D2E7- VHkoje će dovesti do neutralnog vezivanja za TNF-α i smanjenog vezivanja za anti-Id 1H11 (d), 6A11 (e) ili 10B7 (f). Pozicije aminokiselina su date i u okviru pojedinačnih CDR-a i prema Kabat brojčanom označavanju. SLIKA 3A prikazuje SEQ ID NO.:5-6, prema redosledu pojavljivanja. SLIKA 3B prikazuje SEQ ID NO:7.

SLIKA 4 prikazuje strukturu D2E7 u vektorima pYA206 i pCW600.

SLIKA 5 prikazuje titracionu krivu humanog TNF-α na Fab D2E7 WT ekspresovanog na ćelijskoj površini.

SLIKA 6 prikazuje titracionu krivu vezivanja anti-idiotipova (anti-Id) za Fab WT-D2E7 ekspresovan na ćelijskoj površini.

SLIKE 7A-7B: SLIKA 7A prikazuje profile FACS sortiranja za D2E7 divljeg tipa obojenog sa TNF-a. SLIKA 7B prikazuje profile FACS sortiranja za biblioteku tačkastih mutacija VHuz bojenje sa TNF-a.

SLIKE 8A-8B prikazuju profile FACS sortiranja za D2E7 divljeg tipa i biblioteku tačkastih mutacija VHuz bojenja sa 1H11.

SLIKA 9 prikazuje odnose uvećanja ili "enrichment ratio" tihe kodon mutacije D2E7 prema poziciji. Aminokiselinske pozicije su date u okviru pojedinačnih CDR-a.

SLIKA 10 prikazuje mapu ploče sub-biblioteka D2E7. Pozicije aminokiselina su date i u okviru pojedinačnih CDR-a i prema Kabat brojčanom označavanju. SLIKA 10 prikazuje SEQ ID NO.:8-10 i 5-7, od vrha do dna, odnosno s leva na desno, prema redosledu pojavljivanja.

SLIKA 11 prikazuje FACS profile sub-biblioteka D2E7 mutanata i kontrola divljeg tipa. SLIKA 12 prikazuje FACS profile sub-biblioteka D2E7 mutanata i kontrola divljeg tipa. SLIKE 13A-13D prikazuju model popunjavanja površina varijabilnih regiona teškog lanca D2E7. Paneli A, B i C prikazuju CDR 1, 2, odnosno 3 lakog lanca sivom bojom. Panel D prikazuje anti-Id epitop anti-Id 1H11 sivom bojom. U sekvenci VH(SEQ ID NO:2) kako je prikazana u nastavku prikazani su potcrtani CDR-i, a položaji koji su značajni za vezivanje za anti-Id 1H11 prikazani su podebljanim, dvostruko potcrtanim tekstom. Svakom od tri CDR-a doprinose jedna ili više aminokiselina epitopa.

SLIKE 14A-14D prikazuju model popunjavanja površina varijabilnih regiona lakog lanca D2E7. Paneli A, B i C prikazuju CDR 1, 2, odnosno 3, lakog lanca sivom bojom. Panel D prikazuje epitop anti-Id 5A1 i 10F8 sivom bojom. U sekvenci VL(SEQ ID NO:4) kako je prikazana u nastavku prikazani su potcrtani CDR-i, a položaji koji su značajni za vezivanje za anti-Id 5A1 i 10F8 prikazani su podebljanim, dvostruko potcrtanim tekstom. Svakom od tri CDR-a doprinose jedna ili više aminokiselina epitopa.

SLIKA 15 prikazuje ʺone-pointʺ FACS analizu CDR1-2 mutanata D2E7- VH.

SLIKA 16 prikazuje reprezentativnu pozicionu analizu D2E7.

SLIKA 17 prikazuje prosečne odnose uvećanja ili "enrichment ratio" 1H11 prema položaju.

SLIKA 18 prikazuje prosečne odnose uvećanja ili "enrichment ratio" 5A1 prema položaju.

SLIKA 19 prikazuje prosečne odnose uvećanja ili "enrichment ratio" 10F8 prema položaju.

SLIKE 20A-20B prikazuju uticaj mutacija na anti-TNF-α antitelu na vezivanje za antiadalimumab antitela u uzorcima seruma od četiri komercijalna davaoca. Pozicije aminokiselina su date prema Kabat brojčanom označavanju. VL-SS se odnosi na VL koji imaju supstitucije G28S i A34S u CDR-L1 (brojčano označavanje po Kabatu), koji odgovaraju kombinaciji G5S A11S u CDR-L1.

SLIKE 21A-21B pokazuju varijante anti-TNF-a antitela sa najvećim redukcijama vezivanja za anti-adalimumab antitela. VL-SS se odnosi na VL koji imaju supstitucije G28S i A34S u CDR-L1 (brojčano označavanje po Kabatu), koje odgovaraju kombinaciji G5S A11S u CDR-L1.

SLIKA 22 prikazuje podatke o vezivanju za varijante sa višestrukim aminokiselinskim supstitucijama. VL-SS se odnosi na VL koji imaju supstitucije G28S i A34S u CDR-L1 (brojčano označavanje po Kabatu), koje odgovaraju kombinaciji G5S A11S u CDR-L1.

6. DETALJAN OPIS

6.1. Postupci identifikovanja antitela sa smanjenom imunogenošću

Ovo izlaganje, dalje, obezbeđuje sistem koji omogućuje razjašnjavanje imunogenog doprinosa svake i svih aminokiselina u području od značaja u okviru antitela od značaja (referentno antitelo). Postupci zahtevaju da se referentno antitelo podvrgava opsežnoj mutagenezi u jednom ili više regiona (npr., jedan ili više od: CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, FR-L1, FR-L2, FR-L3, FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4), i da se evaluira efekat mutacija na vezivanje za anti-idiotipsko antitelo ("anti-Id"). Ovde opisani postupci doveli su do identifikovanja, prethodno opisane, varijante anti-TNF-a antitela sa smanjenom imunogenošću.

Dizajn i konstruisanje biblioteke: Biblioteka antitela se dizajnira tako da sadrži svaku moguću pojedinačnu aminokiselinsku supstituciju na svakom mogućem položaju u željenom regionu ili domenu referentnog antitela za identifikovanje efekta (dobar, loš ili neutralan) mutacije na vezivanje za anti-Id antitelo. Nakon toga se konstruiše biblioteka varijanti antitela, na primer, korišćenjem "nasumičnih NNK kodona", da bi se proizvele pojedinačne aminokiselinske varijante, pri čemu se "N" odnosi na bilo koju bazu (npr., A, C, G ili T), a "K" se odnosi na G ili T. Šemom nasumičnih NNK mogu se kodirati 32 različita kodona koji pokrivaju svih 20 aminokiselina koje postoje u prirodi. Aminokiselinski ostaci na svakom položaju antitela mogu biti mutirani u bilo koju od 19 aminokiselina koje se razlikuju od aminokiseline divljeg tipa na istoj poziciji, što dovodi do tačkaste mutacije pojedinačne aminokiseline antitela. Krajnji rezultat je biblioteka varijanti antitela koja obuhvata grupe sa više antitela, koja poseduju jedan ostatak koji se razlikuje od člana do člana u biblioteci. Sveukupna kompleksnost biblioteke može biti između približno 50-10,000 članova (npr., 50, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500 ili 10,000 članova), između približno 1000-5000 članova ili oko 1000 članova, na osnovu broja aminokiselina koje su ciljevi mutacije. Bez obzira na veličinu i kompleksnost biblioteke, ovde opisani postupci omogućuju simultano skriniranje i simultano sekvenciranje svih članova biblioteke.

Kao ne-ograničavajući primer, da bi se identifikovale specifične varijante antitela sa smanjenom imunogenošću u poređenju sa referentnim antitelom, aminokiselinski ostaci u regionima koji određuju komplementarnost (CDR-i) su potencijalne mete za mutaciju. Odstranjivanjem ili smanjivanjem B-ćelijskog epitopa može se proizvesti antitelo sa smanjenom imunogenošću. Uobičajeno, oko 50 do 60 aminokiselinskih položaja CDR-a može biti razmotreno i identifikovano za mutiranje. Može biti dizajniran i konstruisan set sintetskih fragmenata DNK, koji kodiraju matične VHili VLdivljeg tipa i sve moguće varijante antitela sa jednom aminokiselinom. Nasumični NNK kodoni, koji su prethodno opisani, mogu biti korišćeni za proizvodnju varijanti antitela sa pojedinačnom aminokiselinom. Sledstveno tome, ostaci aminokiselina na svakoj poziciji unutar okvira CDR-a mogu biti mutirani, čime se stvaraju tačkaste mutacije pojedinačne aminokiseline duž odabranog regiona CDR-a. Krajnji rezultat je biblioteka varijanti antitela koja obuhvata grupe od više antitela, koja poseduju jedan ostatak koji se razlikuje od člana do člana u biblioteci. U ovom primeru, biblioteka ima približno 1000-1300 članova, pri čemu je svaki od 50 do 60 ili 65 položaja aminokiselina CDR-a u odabranom regionu supstituisan sa jednom od 19 aminokiselina koje postoje u prirodi od ukupno 20 različitih aminokiselina na svakom datom položaju (t.j., 50 x 20 = 1000; 60 x 20 = 1200 ili 65 x 20 = 1300).

Ekspresija varijanti antitela:

Nakon konstruisanja biblioteke, drugi korak jeste da se izvrši ekspresija biblioteke varijanti antitela zbog sortiranja posredstvom izloženosti ćelijske površine. Biblioteka varijanti može biti ekspresovana korišćenjem postupaka na bazi izloženosti, kao što je, na primer, izloženost faga, izloženost gljivica, izloženost bakterija i izloženost ribosoma, a ekspresija se, poželjno, vrši u ćelijama sisara, da bi se obezbedilo ispravno savijanje i post-translacijsko modifikovanje ekspresovanih varijanti.

Za ekspresiju kod sisara, transmembranski domeni, koji se koriste za spajanje i izlaganje tetramernih imunoglobulinskih molekula na ćelijskoj površini, mogu biti bilo koji transmembranski domeni koje je moguće odstraniti posredstvom enzimskog, hemijskog ili fotolitičkog cepanja. U nekim ostvarenjima, transmembranski domen je okružen položajima otcepljivanja, koje prepoznaje i otcepljuje enzim za cepanje. Na primer, enzim otcepljivanja može biti lipaza, esteraza, fosfataza, glikozidaza ili karboksipeptidaza. U nekim ostvarenjima, transmembranski domen sadrži oligonukleotid ili oligonukleotidni analog koji poseduje sekvencu koja se prepoznaje i otcepljuje od strane nukleaze, kao što je ribonukleaza (RNaze) ili deoksiribonukleaze (DNaze). U nekim ostvarenjima, transmembranski domen sadrži peptid ili analog peptida koji prepoznaje i otcepljuje proteaza.

U nekim ostvarenjima, mRNK spajanje može biti korišćeno za proizvodnju imunoglobulina sa ili bez transmembranskog domena (vidi, npr., U.S. Patent Br.7,947,495).

U drugim ostvarenjima, transmembranski domen je zaposednut položajima prepoznavanja rekombinaze, koji se prepoznaju od strane rekombinaze. Primeri položaja prepoznavanja rekombinaze uključuju, ali bez ograničavanja na njih, lox položaje, att položaje, dif položaje i frt položaje. Za prikaze rekombinaza, vidite, npr., Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotech.

5:521-527; Landy, 1993, Curr. Opin. Biotech. 3:699-707; Sadowski, 1993, FASEB 7:760-767 i U.S. Patent Publication No.20040115814.

Transmembranski domeni za korišćenje u kompozicijama i postupcima, koji su ovde opisani, mogu biti dobijeni iz membranskih proteina tipa I, tipa II i tipa III (vidi, npr., Chesnut et al., 1996, J. Imm. Methods, 193:17-27; Wahlberg et al., 1997, J.Cell Biol., 137:555-562; Liao, 2001, Biotech. and Bioeng., 73:313-323 i U.S. Patent Nos. 5,264,357 i 6,686,168). Transmembranski domeni, koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni za proizvodnju fuzionih proteina imunoglobulin-transmembranski domen koji sadrže antitela pune dužine (npr., IgG) ili njihove fragmente, koji se spajaju i izlažu na površini ćelija koje ekspresuju fuzione proteine.

Transmembranski domeni koji su posebno korisni u, ovde opisanim, kompozicijama i postupcima, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, transmembranski domen receptora faktora rasta dobijenog iz trombocita (PDGF-R) (vidi, npr., Chesnut et al., 1996, J. Imm. Methods, 193:17-27), B7-1 transmembranski domen (vidi, npr., Chou et al., 1999, Biotech. & Bioeng., 65(2):160-169) i transmembranski domen receptora asialoglikoproteina (ASGPR) (vidi, npr., Liao, 2001, Biotech. & Bioeng., 73:313-323). U nekim ostvarenjima, domen spajanja ćelijske površine odnosi se na GPI signalnu sekvencu, koja usmerava pričvršćivanje imunoglobulina za ćelijsku površinu posredstvom glikozidilfosfatidilinozitol (GPI) linkera (vidi, npr., Medof et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2007-2011 i U.S. Patent Nos. 5,109,133 i 5,264,357). U određenim slučajevima, GPI signalna sekvenca je iz humanog faktora ubrzavanja raspada (DAF). U ostalim ostvarenjima, pričvršćujući deo transmembranskog dela ćelijske površine potiče od imunoglobulinskog proteina.

Izlažući vektori sisara mogu biti korišćeni za izlaganje intaktnih antitela, premda, isto tako, mogu biti izloženi i fragmenti antitela, kao što su, na primer, Fc, Fab’, F(ab)’2i jednolančani Fv. I teški i laki lanci mogu biti kodirani kao jedan transkript posredstvom korišćenja elementa internog ribosomskog ulaznog položaja (IRES), koji spaja polinukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilne i konstantne lake lance sa polinukleotidom koji kodira varijabilne i konstantne teške lance.

U ostvarenju, izlažući vektori sisara sadrže GPI pričvršćujući deo koji je moguće ukloniti, koji je spojen sa C-krajem konstantnog regiona teškog lanca, da bi se olakšalo izolovanje antitela sa željenim karakteristikama vezivanja i biološkim aktivnostima. Kada je prisutan, GPI pričvršćujući deo omogućuje imunoglobulinskim molekulima da budu izloženi na površini domaćinskih ćelija sisara. Odstranjivanje GPI pričvršćujućeg dela putem digestije sa odgovarajućim restrikcionim endonukleazama omogućuje konverziju od membranski-vezanih do rastvorljivih imunoglobulinskih molekula.

Primeri pogodnih domaćinskih ćelija sisara uključuju, ali bez ograničavanja na njih, HeLa ćelije (HeLa S3 ćelije, ATCC CCL2.2), Jurkat ćelije, Raji ćelije, Daudi ćelije, humane embrionalne ćelije bubrega (293-HEK; ATCC 293c18, ATCC CRL 1573), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (CV-1; Vero; ATCC CRL 1587), SV40-transformisane ćelije bubrega majmuna (COS-1; ATCC CRL 1650), ćelije bubrega psa (MDCK; ATCC CCL 34), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., 1986, Som Cell Molec Genet, 12, 555)) i druge ćelijske nizove glodara, kao što su: NSO, SP2/O, GH1 (ATCC CCL82), H-4-II-E (ATCC CRL 1548) i NIH-3T3 (ATCC CRL 1658).

U jednom ostvarenju, mogu biti korišćeni postupci i vektori koji su opisani u U.S. Patentu No. 7,947,495. Sistem izlaganja površine ćelija sisara uključuje samo-replikujuće vektore i ćelije sisara. Samo-replikujući vektori sisara obično uključuju: (1) samo-replikujući izvor replikacije; (2) najmanje jedan eukariotski promoter; (3) fiksni ili uklonjivi transmembranski domen; (4) konstantni region lakog lanca; (5) konstantni region teškog lanca; (6) restrikcione položaje za umetanje varijabilnih regiona lakog i teškog lanca; (7) interni ribosomski ulazni položaj (IRES) i (8) najmanje jedan marker za selekciju. Pored toga, vektori mogu sadržavati prokariotski izvor replikacije, transkripcioni terminator, poliadenilacijske signalne i/ili lider sekvence, kao i druge sekvence, koje su neophodne za ekspresiju u eukariotskim domaćinskim ćelijama. Čim se transformišu, ćelije domaćina se inkubiraju pod uslovima koji omogućuju ekspresiju antitela. Dobijeni plazmidi lako mogu biti povraćeni iz ćelija, kao što je opisano (vidi, npr., Hirt, 1967, J. Mol. Biol., 26, 365-369).

Pored prethodno navedenih tehnika, biblioteka izloženih površina kvasaca može biti korišćena za izlaganje ćelijske površine biblioteka varijanti antitela. Tehnologija izlaganja površine kvasaca (koju su prikazali Boder i Wittrup, 2000, u Methods in Enzymology 328:430-444), omogućuje ekspresiju biblioteka antitela u ćelijskom zidu kvasaca u formi, koja je pristupačna za interakciju sa obeleženim molekulom za analize u postupcima sortiranja ćelija. U jednom ostvarenju, varijante se ekspresuju kao fuzioni proteini sa svim ili samo sa delom AGA2 proteina kvasca, koji postaju izloženi na površini ćelijskog zida kvasaca, za sortiranje u skladu sa, u nastavku opisanim, postupcima. Vidi, npr., Boder et al., 1997, Nat. Biotechnol.15:553-557 i Feldhaus et al., 2003, Nat. Biotechnol.21:163-170.

Takođe se može koristiti izlaganje varijanti antitela u fagima. Lanci antitela mogu biti ekspresovani kao fuzioni proteini sa omotačkim proteinom faga sa spoljne površine faga. Nakon toga, izloženi paketi mogu biti podvrgnuti skriningu na izložena antitela koja se vezuju za metu. U jednom ostvarenju, varijante antitela su izložene na monovalentni način iz čestica filamentoznih faga, kao fuzione forme sa genskim III proizvodom M13 pakovanim u okviru svake čestice i ekspresovanim na spoljnoj površini faga. Postupci izlaganja faga antitela poznati su stručnjacima u ovoj oblasti, a opisani su, na primer, u Hoogenboom, "Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications," iz Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 (O’Brien i Aitken, eds., Human Press, Totowa, N.J.).

U drugom ostvarenju, tehnologija izlaganja ribosoma (vidi Hanes et al., 2000, Meth. Enzymol. 328: 403-430; Pluckthun et al., 2000, Adv. Prot. Chem. 55:367-403; Lipovsek i Pluckthun, 2004, J. Immunological Methods 290:51-67) je korišćena za ekspresovanje varijanti antitela. Tehnologija izlaganja ribosoma obuhvata in vitro translaciju i kovalentno ili nekovalentno povezivanje između genotipa, kao što je RNK, i kodiranog fenotipa, kao što je varijanta antitela, da bi se izvršila selekcija varijanti antitela koje ispoljavaju smanjeno vezivanje za anti-Id antitela. Biblioteka je izrađena putem sintetisanja pula DNK različitih sekvenci koje se nakon toga, transkribuju, da bi se proizveo pul mRNK-a. In vitro translacija je korišćena da bi se proizveli izloženi kodirani polipeptidi ili proteini, a poželjne vezujuće interakcije su odabrane korišćenjem imobilisanog vezujućeg partnera. mRNK koja kodira vezujuće entitete, može biti korišćena za izradu cDNK, koja, zatim, može biti amplifikovana, a postupak može biti ponovljen, da bi se uvećala populacija za gene koji kodiraju varijante antitela sa željenim karakteristikama.

Odabrani proteini mogu biti identifikovani putem kloniranja pojedinačnih kodirajućih sekvenci i DNK sekvenciranja.

Sistem izloženosti bakterija takođe može biti korišćen za ekspresiju varijanti antitela. Vidi, npr., Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1041; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Harvey et al., 2004, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 101(25):9193-9198 i Mazor et al., 2007, Nat. Biotechnol.25(5):563-565.

Sortiranje biblioteke:

Ćelije domaćina sa izloženim ekspresovanim varijantama antitela mogu biti sortirane korišćenjem testova uvećavanja na bazi afiniteta. Varijante antitela mogu biti razvrstane na osnovu njihovih karakteristika (1) izostajanja vezivanja za anti-Id, (2) opciono, održavanja vezivanja za ciljni antigen i (3) opciono, ekspresionih nivoa. Anti-Id su antitela usmerena prema varijabilnim regionima drugih antitela. Iz tog razloga, antigen-vezujući položaj anti-Id može biti sličan ciljnom molekulu, vezanom od strane antitela, prepoznatog od strane anti-Id. Postupci izrade anti-Id poznati su u ovoj oblasti, i uopšteno povlače za sobom korišćenje antitela od značaja (npr., referentno antitelo) kao imunogena za proizvodnju antitela korišćenjem tradicionalnih načina, kao što su oni koji su opisani u nastavku za referentno antitelo. Anti-Id antitela mogu biti monoklonska i humanog ili životinjskog porekla.

Primeri testova, koji su pogodni za korišćenje u sortiranju varijanti antitela, uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, fluorescencijom-aktivirano sortiranje ćelija (FACS), sortiranje magnetskim zrncima, CellSpot™ tehnologiju sortiranja antitela od Trellis Bioscience, Inc. (South San Francisco, CA) i/ili ClonePix FL aparat za skriniranje klonova ćelija sisara od Genetix Ltd. (Hampshire, Velika Britanija).

Za FACS sortiranje, ćelije se inkubiraju sa fluorescentno-obeleženim antitelom (npr., anti-Id ili antitelo koje detektuje zajednički epitop u ne-mutagenizovanim delovima varijanti) ili ciljnim antigenom u koncentraciji blizu konstante disocijacije (KD) za afinitet referentnog antitela, za maksimalno diferenciranje između referentnog antitela i varijanti sa sličnim afinitetima. Obojene ćelije se sortiraju na jednu ili više subpopulacija, na takav način da su učestalosti varijanti sa karakteristikom od značaja ili povećane ili smanjene u relevantnoj subpopulaciji.

Razvrstavanje anti-Id vezivanja može se izvršiti korišćenjem bilo kog od, prethodno opisanih, postupaka. Uopšteno, ćelije koje ekspresuju varijante antitela inkubiraju se sa anti-Id i razvrstavaju se prema količini vezanog anti-Id. Bazalna vrednost vezivanja može biti dobijena od ćelija koje ekspresuju referentno antitelo, a ćelije koje ispoljavaju smanjeno vezivanje za anti-Id mogu biti identifikovane putem razvrstavanja ćelija u subpopulacije koje imaju vezano anti-Id antitelo iznad ili ispod bazalne vrednosti.

Opciono, ćelije koje ekspresuju varijante antitela, takođe se razvrstavaju na osnovu nivoa ekspresije. Ukupna količina fluorescentnog antitela ili antigena vezanog za ćeliju koja ekspresuje varijantu antitela tokom, npr., FACS-a, dovedena je u relaciju sa afinitetom vezivanja i ukupnom količinom izložene varijante antitela. Količina izložene varijante antitela može varirati od klona do klona. Sledstveno tome, u određenim slučajevima, ćelije koje ekspresuju varijante antitela od značaja, npr., IgG antitelo pune dužine, koje je povezano za ćelijsku površinu preko pričvršćujućeg dela transmembranskog domena, mogu biti sortirane upotrebom FACS-a, uz korišćenje fluorescentno obeleženog antitela prema imunoglobulinu (npr., anti-IgG antitelo) (pored razvrstavanja prema vezivanju za anti-Id). Različita antitela, koja su korišćena za detektovanje različitih karakteristika, npr., anti-Id i anti-IgG antitelo, korišćena za određivanje ekspresionih nivoa, obično se obeležavaju sa fluoroforima koji imaju različite ekscitacione i/ili emisione spektre, obezbeđujući na taj način detekcioni sistem u dve boje.

Ćelije mogu, isto tako, biti razvrstane prema metama vezivanja. Uobičajeno, biće poželjno da se odabere varijanta antitela koja zadržava vezivanje za metu, npr., varijanta sa približno jednakim ili većim vezivanjem za ciljni molekul u poređenju sa referentnim antitelom. Biblioteke, uporedo bojene sa anti-Id i ciljnim molekulom, mogu biti razvrstane posredstvom FACS-a u dve subpopulacije: prvu populaciju koja je iznad određenog praga za ciljno vezivanje i drugu populaciju koja je dvostruko sortirana prema ciljnom vezivanju i prema smanjenom vezivanjuu za anti-idiotip. Različiti molekuli, koji su korišćeni za detektovanje različitih karakteristika, npr., anti-Id i ciljni molekul, obično se obeležavaju sa fluoroforima koji imaju različite ekscitacione i/ili emisione spektre, obezbeđujući na taj način detekcioni sistem u dve boje.

U nekim drugim ostvarenjima, ćelije mogu biti razvrstane prema vezivanju za anti-Id, ekspresionim nivoima i ciljnom vezivanju. U ovim ostvarenjima, može biti korišćen detekcioni sistem u tri boje, uz korišćenje tri obeleživača za razlikovanje.

Kada se dvostruko ili trostruko bojenje koristi za simultano razvrstavanje prema vezivanju anti-Id, nivoima ekspresije i/ili ciljanom vezivanju, obeležena meta i obeležena antitela obično se obeležavaju sa fluoroforima koji imaju različite ekscitacione i/ili emisione spektre, čime se obezbeđuje detekcioni sistem u dve boje ili tri boje. Razvrstavanje u različite populacije može, isto tako, biti izvršeno serijski. Na primer, ćelije koje su svrstane u subpopulaciju koja ima smanjeno vezivanje za anti-Id, mogu biti razvrstane u dalje subpopulacije na osnovu ciljanog vezivanja i nivoa ekspresije, pri čemu se sortiranje na osnovu ciljanog vezivanja i ekspresionih nivoa odvija simultano ili uzastopno. U drugim ostvarenjima, varijante koje su identifikovane tokom razvrstavanja prema vezivanju anti-idiotipskog antitela (i ćelije domaćina koje ih ekspresuju) karakterisane su prema ciljanom vezivanju korišćenjem nezavisnih postupaka validacije, koji su opisani u nastavku.

Analiza sortiranih populacija:

Nakon razvrstavanja u subpopulacije, učestalost svake varijante antitela u svakoj subpopulaciji može se utvrditi sekvenciranjem plazmida koji kodiraju varijante. Poželjni postupak sekvenciranja DNK ovog pronalaska jeste "masivno paralelno sekvenciranje" ili "masivno paralelno pirosekvenciranje" (vidi, npr., U.S. Patent No. 6,787,308; 6,833,246; 6,897,023; 6,956,114; 7,057,026; 7,115,400, 7,211,390 i 7,232,656). Ovaj postupak omogućuje brzo i jeftino sekvenciranje DNK i ubrzavanje identifikacije specifičnih varijanti anitela sa željenom aktivnošću ili karakteristikama.

Nakon sekvenciranja, može biti izvršena statistička analiza sekvenci da bi se identifikovale željene varijante. Takva analiza može uključiti kompjutersku analizu sirovih sekvenci DNK. Sirove DNK sekvence mogu biti translatovane u proteinsku sekvencu, poravnate i upoređene sa referentnim antitelom, da bi se identifikovale mutacije. Učestalost svake aminokiseline koja se zapaža na svakoj poziciji može biti tabelarno prikazana prema tipu kategorije (npr., smanjena imunogenost i povećana, smanjena ili neutralna ekspresija ili afinitet za ciljni molekul) i upoređena sa referentnim antitelom. Varijante sa željenom aktivnošću, kao što su, npr., one sa smanjenom imunogenošću, zadržanom ekspresijom i/ili zadržanim vezivanjem za ciljni molekul, biće uvećane u odabranoj populaciji, dok će varijante sa nepoželjnim aktivnostima biti ispražnjene u odabranoj populaciji.

Za svaku varijantu može biti izračunat odnos uvećanja ili "enrichment ratio (ER)", koji prikazuje meru obima uvećanja ili smanjenja varijante u populaciji u poređenju sa drugim varijantama i/ili referentnim antitelom. U ostvarenjima u kojima su ćelije sortirane na osnovu (a) nivoa ekspresije koji su iznad određenog praga i (b) slabog vezivanja za anti-idiotip ("sortirana" populacija), broj koji pokazuje koliko puta je mutacija utvrđena na datom položaju, normalizovan je na broj koji pokazuje koliko puta je ta pozicija sekvencirana i ekspresovana, kao učestalost iste na 1000 sekvenci. Nakon toga je učestalost mutacije u sortiranoj populaciji podeljena sa učestalošću u ekspresovanoj populaciji, da bi se dobio odnos uvećanja ili "enrichment ratio (ER)", koji pokazuje da li je mutacija uvećana ili ispražnjena u sortiranoj populaciji u poređenju sa ekspresovanom populacijom, i do kog stepena. Mutacije koje su uvećane u sortiranoj populaciji dovodiće do smanjenog vezivanja za anti-idiotip, dok će mutacije koje su ispražnjene dovoditi do povećanog vezivanja za anti-idiotip. Na sličan način, odnosi uvećanja ili "enrichment ratio" mogu biti izračunati za svaku sortiranu varijantu prema uvećanom, smanjenom ili sličnom (neutralnom) afinitetu za metu.

U ostvarenjima u kojima se ćelije sortiraju samo na osnovu smanjenog vezivanja za anti-idiotip, npr., kada se ćelije ne razvrstavaju simultano prema nivoima ekspresije, odnos uvećanja ili ʺenrichment ratioʺ može biti određen deljenjem učestalosti u subpopulaciji mutacije koja dovodi do vezivanja anti-idiotipa koje je ispod bazalne vrednosti dobijene od ćelija koje ekspresuju referentno antitelo, sa učestalošću u subpopulaciji mutacije koja dovodi do vezivanja anti-idiotipa na nivou ili iznad nivoa bazalne vrednosti.

Validacija pojedinačnih varijanti:

Vezujuće karakteristike zasebno ekspresovanih polipeptida varijanti mogu biti analizirane korišćenjem različitih postupaka da bi se potvrdilo njihovo ponašanje u okviru biblioteke. Ovi postupci uključuju: BIAcore, FACS, ELISA, AlphaLisa i KinExA testove. BIAcore testovima se određuje vezivanje korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR), optičkog fenomena koji omogućuje detektovanje neobeleženih učesnika interakcije, i koji može biti korišćen za utvrđivanje afiniteta vezivanja pojedinačnih varijanti antitela (npr., U.S. Pat. App. No. 2008/0274114; i Che et al., 2009, J. Pharm. and Biomed. Analysis 50(2):183-188). AlphaLISA test može biti korišćen za utvrđivanje afiniteta vezivanja pojedinačnih varijanti za ciljni molekul (vidi, na primer, Ullman et al., 1996, Clinical Chemistry, 42(9):1518-1526; i Hideharu et al., 2007, Cancer Science 98(8):1275-1280). KinExA testom (kinetički test sa isključivanjem) meri se koncentracija receptorskog (R) molekula koji nije vezan u kompleks u mešavini receptora, liganda (L) i LR kompleksa. Koncentracija R koja nije u kompleksu meri se posredstvom izlaganja mešavine faze rastvora imobilisanom L čvrste faze tokom vrlo kratkog vremenskog perioda. "Vreme kontakta" između mešavine faze rastvora i imobilisanog L čvrste faze održava se toliko kratkim da je disocijacija LR kompleksa beznačajna. Kada se mogućnost značajne disocijacije LR kompleksa kinetički isključi, samo se R koji nije vezan u kompleks ("slobodni") može vezati za čvrstu fazu. Količina slobodnog R koji se vezuje za čvrstu fazu (izmeren posredstvom emisije fluorescencije iz sekundarnog obeleživača) je direktno proporcionalna koncentraciji slobodnog R u uzorku faze rastvora. KinExA test može, isto tako, biti korišćen za određivanje afiniteta vezivanja pojedinačnih varijanti za ciljni molekul (vidi, na primer, U.S. Pat. App. No.2008/0274114; i Darling et al., 2004, ASSAY and Drug Development Technologies 2:647-657).

6.2. Varijante anti-TNF-α antitela

Prethodno opisani postupci primenjeni su na anti-TNF-α antitelo D2E7, poznato takođe kao adalimumab, da bi se identifikovale varijante sa smanjenim afinitetom za antiidiotipsko antitelo u poređenju sa D2E7. Varijante koje ispoljavaju smanjeni afinitet za antiidiotipska antitela označavaju se kao varijante "smanjene imunogenosti".

U određenim aspektima, ovo izlaganje obezbeđuje anti-TNF-α antitela koja poseduju smanjenu imunogenost u poređenju sa D2E7. Anti-TNF-α antitela izlaganja obično poseduju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u svojim CDR-ima u poređenju sa CDR-ima D2E7, pri čemu navedena najmanje jedna ili više supstitucija smanjuje imunogenost antitela u poređenju sa D2E7. U određenim ostvarenjima, smanjena imunogenost proističe iz odstranjivanja ili umanjivanja jednog ili više B-ćelijskih epitopa.

Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca D2E7 predstavljene su sa SEQ ID NO:2, odnosno SEQ ID NO:4, a kodirane su od strane SEQ ID NO:1, odnosno SEQ ID NO:3. Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, takođe su prikazane na SLICI 1A. Aminokiselinske sekvence CDR-a D2E7, i njihove odgovarajuće identifikacione oznake, predstavljene su na SLICI 1B. Nukleotidne sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca D2E7, kako su publikovane u U.S. Patentu No.

6,090,382, prikazane su na SLICI 1C. Bilo koje druge nukleotidne sekvence koje kodiraju SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4 mogu biti korišćene u kompozicijama i postupcima ovog izlaganja umesto publikovanih sekvenci.

U određenim aspektima, anti-TNF-α antitela izlaganja koja poseduju smanjenu imunogenost ispoljavaju uporedivo ili poboljšano vezivanje za TNF-α u odnosu na D2E7. Afinitet se može testirati, na primer, validiranjem postupaka, koji su opisani u Poglavlju 6.1.

Primerne supstitucije, kojima se proizvode anti-TNF-α antitela sa odstranjenim ili smanjenim B-ćelijskim epitopima i koja ispoljavaju manju imunogenost u poređenju sa D2E7, navedene su na SLIKAMA 2 i 3 (t.j., SLIKE 3A-3B). Pogodne supstitucije uključuju: G5F u CDR-L1, G5I u CDR-L1, G5V u CDR-L1, G5W u CDR-L1, G5Y u CDR-L1, R7I u CDR-L1, R7T u CDR-L1, R7V u CDR-L1, N8A u CDR-L1, N8D u CDR-L1, N8E u CDR-L1, N8L u CDR-L1, N8M u CDR-L1, N8Q u CDR-L1, N8R u CDR-L1, A1I u CDR-L2, A1T u CDR-L2, A1V u CDR-L2, T4D u CDR-L2, R2G u CDR-L3, N4F u CDR-L3, N4M u CDR-L3, N4W u CDR-L3, N4Y u CDRL3, R5L u CDR-L3, R5N u CDR-L3, R5W u CDR-L3, R5Y u CDR-L3, D1S u CDR-H1, Y2A u CDR-H1, Y2C u CDR-H1, Y2K u CDR-H1, Y2M u CDR-H1, Y2R u CDR-H1, Y2S u CDRH1, Y2V u CDR-H1, H5C u CDR-H1, H5D u CDR-H1, H5E u CDR-H1, H5S u CDR-H1, H5T u CDR-H1, T3A u CDR-H2, T3G u CDR-H2, W4A u CDR-H2, W4F u CDR-H2, W4H u CDR-H2, W4L u CDR-H2, W4M u CDR-H2, W4V u CDR-H2, N5G u CDR-H2, S6D u CDR-H2, S6L u CDR-H2, I9K u CDR-H2, D10L u CDR-H2, Y11A u CDR-H2, Y11C u CDR-H2, Y11E u CDR-H2, Y11F u CDR-H2, Y11G u CDR-H2, Y11H u CDR-H2, Y111 u CDR-H2, Y11K u CDR-H2, Y11L u CDR-H2, Y11M u CDR-H2, Y11N u CDR-H2, Y11Q u CDR-H2, Y11R u CDR-H2, Y11S u CDR-H2, Y11V u CDR-H2, Y11W u CDR-H2, A12Y u CDR-H2, D13N u CDR-H2, V15D u CDR-H2, V15L u CDR-H2, V15M u CDR-H2, V15Q u CDR-H2, V15T u CDR-H2, E16F u CDR-H2, E16H u CDR-H2, E16K u CDR-H2, E16T u CDR-H2, E16W u CDR-H2, G17A u CDR-H2, G17C u CDR-H2, G17E u CDR-H2, G17H u CDR-H2, G171 u CDR-H2, G17K u CDR-H2, G17L u CDR-H2, G17M u CDR-H2, G17P u CDR-H2, G17Q u CDR-H2, G17R u CDR-H2, G17S u CDR-H2, G17T u CDR-H2, G17Y u CDR-H2, V1G u CDR-H3, V1R u CDR-H3, V1W u CDR-H3, L4T u CDR-H3, L4V u CDR-H3, T6V u CDR-H3, S9K u CDR-H3, S9W u CDR-H3, S9Y u CDR-H3 i D11V u CDR-H3.

Anti-TNF-α antitela izlaganja mogu sadržavati bilo koju od supstitucija, koje su navedene na SLIKAMA 2 i 3, samu ili u kombinaciji, i, opciono, jednu ili više dodatnih supstitucija. Primerne supstitucije CDR-L1, kojima se proizvode antitela sa odstranjenim ili smanjenim epitopima T ćelija i koja ispoljavaju manju imunogenost u poređenju sa D2E7, navedene su u Tabeli 11 U.S. Publication No. 2010/0266613 A1 i PCT International Publication No. 2010/121140.

Pogodne supstitucije i kombinacije supstitucija u CDR-L1 obuhvataju: R7Q; A11S; R7Q A11S; N8T; N8T A11S; I6T; A11G; I6T A11G; Q4G; Q4G A11S; Q4G A11G; Q4H; Q4H A11S; Q4R; Q4R A11S; G5S; G5S A11S; N8S A11S; I6T A11S i N8T A11G.

Primerne supstitucije, kojima se proizvode antitela sa povećanim afinitetom prema TNF-a u poređenju sa D2E7, navedene su u Tabelama 12 i 25 U.S. Publication No.

2010/0266613 A1 i PCT International Publication No. 2010/121140. Pogodne supstitucije obuhvataju: S3K u CDR-L2, S3R u CDR-L2, S3N u CDR-L2, T4H u CDR-L2, T4Q u CDR-L2, T4V u CDR-L2, T4F u CDR-L2, T4W u CDR-L2, T4Y u CDR-L2; L5R u CDR-L2, L5K u CDR-L2, Q6K u CDR-L2, Q6R u CDR-L2, D1G u CDR-H1, Y2H u CDR-H1, A3G u CDR-H1 i T3N u CDR-H2.

Antitela izlaganja mogu da sadrže jednu ili više supstitucija, koje su opisane u Tabelama 11-25 U.S. Publication No. 2010/0266613 A1 i PCT International Publication No.

2010/121140.

Anti-TNF-α antitela izlaganja mogu biti monoklonska antitela, antitela podvrgnuta genetskom inženjeringu i drugi modifikovani oblici antitela, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, himerična antitela, humanizovana antitela, heterokonjugate antitela (npr., bispecifična antitela, diatela, triatela i tetratela), i antigen-vezujuće fragmente antitela, uključujući, npr., Fab’, F(ab’)2, Fab, Fv, rIgG i scFv fragmente. Pored toga, ukoliko nije drugačije naznačeno, naziv "monoklonsko antitelo" (mAt) je utvrđen kako bi uključio intaktne molekule, kao i fragmente antitela (kao što su, na primer, Fab, Fab’, F(ab’)2i Fv fragmenti), koji se mogu specifično vezivati za protein.

Fab i F(ab’)2fragmenti nemaju Fc fragment intaktnog antitela, mnogo brže se odstranjuju iz cirkulacije životinje ili biljke, i mogu ispoljavati manje ne-specifičnog tkivnog vezivanja nego intaktno antitelo (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316). Fab fragment sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po dodavanju nekoliko ostataka na karboksil kraju CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. F(ab’) fragmenti se proizvode putem otcepljivanja disulfidne veze na cisteinima zgloba F(ab’)2proizvoda pepsinske digestije. "Fv" fragment je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletni položaj prepoznavanja mete i vezivanja. Ovaj region se sastoji od dimera od varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, ne-kovalentnoj vezi (VH-VLdimer). "Jedno-lančani Fv" ili "scFv" fragmenti antitela sadrže VHi VLdomene antitela u jednom polipeptidnom lancu, i takođe se nalaze unutar okvira izlaganja. Ostala antitela koja su obuhvaćena izlaganjem uključuju "antitela sa jednim domenom", koja su sastavljena od jednog VHili VLdomena koji ispoljavaju dovoljan afinitet prema ciljnom molekulu. U specifičnom ostvarenju, antitelo sa jednim domenom je antitelo kamelida (vidi, npr., Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).

Anti-TNF-α antitela izlaganja su poželjno monoklonska antitela. Naziv "monoklonsko antitelo", kako je ovde korišćen, nije ograničen na antitela koja su proizvedena putem hibridoma tehnologije. Naziv "monoklonsko antitelo" odnosi se na antitelo koje je dobijeno iz jednog klona, uključujući bilo koji klon eukariota, prokariota ili faga, a ne na postupak kojim je isti proizveden. Monoklonska antitela, koja su od koristi u vezi sa ovim izlaganjem, mogu biti izrađena korišćenjem velikog broja različitih tehnika, poznatih u ovoj oblasti, uključujući korišćenje hibridoma tehnika, rekombinantnih tehnologija i tehnologija izloženih faga, ili njihove kombinacije. Antitela izlaganja uključuju: himerična, primatizovana, humanizovana ili humana antitela.

Anti-TNF-α antitela izlaganja mogu biti bispecifična antitela. Bispecifična antitela su monoklonska, često humana ili humanizovana, antitela koja poseduju specifičnosti vezivanja prema najmanje dva različita antigena. U ovom izlaganju, jedna od vezujućih specifičnosti može biti usmerena prema bilo koja dva antigena, kao što su: protein ćelijske površine, receptor, receptorska subjedinica, tkivno-specifični antigen, protein dobijen iz virusa, protein omotača kodiran od strane virusa, protein dobijen iz bakterija ili protein bakterijske površine, itd..

Anti-TNF-α antitela izlaganja uključuju derivatizovana antitela. Na primer, derivatizovana antitela su uobičajeno, ali bez ograničavanja, modifikovana posredstvom glikozilacije, acetilacije, pegilacije, fosforilacije, amidacije, derivatizacije uz pomoć poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog otcepljivanja, povezivanja sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinom, itd.. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može biti izvršena posredstvom poznatih tehnika, koje uključuju, ali bez ograničavanja na njih, specifično hemijsko otcepljivanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd.. Pored toga, derivat može da sadrži jednu ili više aminokiselina koje ne postoje u prirodi, npr., korišćenjem ambrx tehnologije (Vidi, npr., Wolfson, 2006, Chem. Biol.13(10):1011-2).

U jednom drugom ostvarenju pronalaska, anti-TNF-α antitela mogu biti antitela čija je sekvenca modifikovana da bi se izmenila najmanje jedna biološka efektorska funkcija posredovana konstantnim regionom, ako se uporedi sa odgovarajućom sekvencom divljeg tipa. Na primer, u nekim ostvarenjima, referentna antitela i/ili varijante antitela ovog izlaganja mogu biti modifikovani da bi se smanjila najmanje jedna biološka efektorska funkcija posredovana konstantnim regionom u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr., smanjeno vezivanje za Fc receptor (FcγR). Vezivanje za FcγR može biti smanjeno posredstvom mutacije segmenta imunoglobulinskog konstantnog regiona antitela na posebnim regionima koji su neophodni za interakcije sa FcγR (Vidi, npr., Canfield i Morrison, 1991, J. Exp. Med.173:1483-1491; i Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). Smanjivanjem sposobnosti antitela da se vezuje sa FcγR takođe se mogu redukovati druge efektorske funkcije koje se oslanjaju na interakcije sa FcγR, kao što su opsonizacija, fagocizoza i ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena ("ADCC").

U drugim ostvarenjima izlaganja, referentno antitelo i/ili varijanta antitela mogu biti modifikovani da bi se stekla ili poboljšala najmanje jedna biološka efektorska funkcija posredovana konstantnim regionom, ako se uporedi sa nemodifikovanim antitelom, npr., da bi se povećale interakcije sa FcγR (Vidi, npr., US 2006/0134709). Na primer, referentno antitelo i/ili varijante antitela izlaganja mogu posedovati konstantni region koji se vezuje sa FcγRIIA, FcγRIIB i/ili FcγRIIIA sa većim afinitetom nego odgovarajući konstantni region divljeg tipa.

Sledstveno tome, anti-TNF-α antitela pronalaska mogu imati izmenjene biološke aktivnosti, koje dovode do povećane ili smanjene opsonizacije, fagocitoze ili ADCC-a. Takve izmene su poznate u struci. Na primer, modifikacije na antitelima koje smanjuju ADCC aktivnost opisane su u U.S. Patentu No. 5,834,597. Primerna varijanta, koja snižava ADCC, odgovara "mutantu 3" (prikazan na SLICI 4 U.S. Patenta No.5,834,597), u kome je ostatak 236 izbrisan, a ostaci 234, 235 i 237 (korišćenjem EU brojčanog označavanja) su supstituisani sa alaninima.

U nekim ostvarenjima, anti-TNF-α antitela izlaganja imaju male količine fukoze ili ne poseduju fukozu. Antitela koja nemaju fukozu dovedena su u korelaciju sa povećanom ADCC aktivnošću, posebno pri niskim dozama antitela. Vidi, Shields et al., 2002, J. Biol. Chem.

277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73. Postupci izrade antitela bez fukoze uključuju uzgajanje na YB2/0 ćelijama mijeloma pacova (ATCC CRL 1662). YB2/0 ćelije ekspresuju niske nivoe mRNK FUT8, koja kodira α-1,6-fukoziltransferazu, enzim koji je neophodan za fukozilaciju polipeptida.

U jednom drugom aspektu, anti-TNF-α antitela mogu biti antitela koja su modifikovana da bi se povećali ili smanjili njihovi afiniteti vezivanja za fetalni Fc receptor, FcRn, na primer, posredstvom mutacija segmenta konstantnog regiona imunoglobulina na određenim regionima koji su uključeni u interakcije sa FcRn (Vidi, npr., WO 2005/123780). U određenim ostvarenjima, referentno antitelo i/ili varijanta antitela klase IgG je mutirano na takav način da je najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka 250, 314 i 428 konstantnog regiona teškog lanca supstituisan sam ili u bilo kojim njihovim kombinacijama, kao na primer na pozicijama 250 i 428, ili na pozicijama 250 i 314, ili na pozicijama 314 i 428, ili na pozicijama 250, 314 i 428, sa specifičnom kombinacijom pozicija 250 i 428. Za poziciju 250, aminokiselinski ostatak za supstituisanje može biti bilo koji aminokiselinski ostatak koji nije treonin, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, valin, triptofan ili tirozin. Za poziciju 314, aminokiselinski ostatak za supstituisanje može biti bilo koji aminokiselinski ostatak koji nije leucin, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Za poziciju 428, aminokiselinski ostatak za supstituisanje može biti bilo koji aminokiselinski ostatak koji nije metionin, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Takve mutacije povećavaju vezivanje antitela za FcRn, čime se antitelo štiti od razgradnje i produžava se njegov polu-život.

U nekim drugim aspektima, referentno antitelo i/ili varijanta antitela imaju jednu ili više aminokiselina, umetnutih u jedan ili više njihovih hipervarijabilnih regiona, kao što je, na primer, opisano u Jung i Plückthun, 1997, Protein Engineering 10:9, 959-966; Yazaki et al., 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9. Epub 2004 Aug 17; i U.S. Pat. App. No.

2007/0280931.

Anti-TNF-α antitela pronalaska uključuju konjugate antitela, koji su modifikovani, npr., putem kovalentnog povezivanja molekula bilo kog tipa za antitelo, na takav način da kovalentno povezivanje ne interferira sa vezivanjem za TNF-α.

U određenim aspektima, anti-TNF-α antitelo izlaganja može biti konjugovano za efektorski deo ili obeleživač. Naziv "efektorski deo", kako je ovde korišćen, uključuje, na primer, antineoplastična sredstva, lekove, toksine, biološki aktivne proteine, na primer enzime, drugo antitelo ili fragmente antitela, sintetske polimere ili polimere koji postoje u prirodi, nukleinske kiseline (npr., DNK i RNK), radionuklide, posebno radioaktivni jodid, radioizotope, helatizirajuće metale, nanočestice i reporter grupe, kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja mogu biti detektovana uz pomoć NMR ili ESR spektroskopije.

U jednom primeru, anti-TNF-α antitela mogu biti konjugovana sa efektorskim delom, kao što je citotoksično sredstvo, radionuklid ili deo leka, da bi se modifikovao dati biološki odgovor. Efektorski deo može biti protein ili polipeptid, kao što je, na primer, bez ograničavanja, toksin (kao što je abrin, ricin A, egzotoksin Pseudomonasa ili toksin Diphtherie), signalizacijski molekul (kao što je α-interferon, β-interferon, nervni faktor rasta, faktor rasta dobijen iz trombocita ili tkivni aktivator plazminogena), trombotsko sredstvo ili anti-angiogeno sredstvo (npr., angiostatin ili endostatin) ili sredstvo za modifikovanje biološkog odgovora, kao što je citokin ili faktor rasta (npr., interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), granulocitni faktor koji stimuliše kolonije makrofaga (GM-CSF), granulocitni faktor koji stimuliše kolonije (G-CSF) ili nervni faktor rasta (NGF)).

U drugom primeru, efektorski delovi mogu biti citotoksini ili citotoksična sredstva. Primeri citotoksina i citotoksičnih sredstava uključuju: taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge ili homologe.

Efektorski delovi takođe uključuju, ali bez ograničavanja na njih, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilacijska sredstva (npr., mehloretamin, tiotepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C5 i cisdihlorodiamin platinum (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, antramicin (AMC), kaliheamicini ili duokarmicini) i anti-mitotska sredstva (npr., vinkristin i vinblastin).

Ostali efektorski delovi mogu uključiti radionuklide, kao što su, ali bez ograničavanja na njih,<111>In i<90>Y,<177>Lu, bizmut<213>, kalifornijum<252>, iridijum<192>i volfram<18s>/renijum<188>i lekove, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, alkilfosfoholini, inhibitori topoizomeraze I, taksoidi i suramin.

Postupci za konjugovanje takvih efektorskih delova za antitela dobro su poznati u struci (Vidi, npr., Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2. ed., na pp. 623-53 (Robinson et al., eds., 1987)); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58 i Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).

U određenim aspektima, anti-TNF-α antitelo se konjuguje sa toksinom malog molekula. U određenim primernim ostvarenjima, anti-TNF-α antitelo pronalaska se konjuguje sa dolastatinom ili sa peptidnim analozima ili derivatima dolostatina, npr., auristatinom (U.S. Pat. Nos. 5,635,483 i 5,780,588). Deo leka dolastatina ili auristatina može biti povezan na antitelo preko njegovog N (amino) kraja ili C (karboksil) kraja (WO 02/088172). Primeri auristatinskih ostvarenja uključuju delove monometilauristatinskog leka DE i DF, koji su vezani za N-kraj, kao što je izloženo u U.S. Patentu No.7,498,298. (koji prikazuje, npr., linkere i postupke izrade monometilvalinskih jedinjenja, kao što su MMAE i MMAF konjugovani na linkere).

U drugim primernim ostvarenjima, toksini malih molekula uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, kaliheamicin, majtanzin (U.S. Patent No. 5,208,020), trihoten i CC1065. U jednom ostvarenju izlaganja, antitelo se konjuguje za jedan ili više molekula majtanzina (npr., oko 1 do oko molekula 10 majtanzina po molekulu antitela). Majtanzin može, na primer, biti konvertovan u May-SS-Me, koji može biti redukovan u May-SH3 i reagovati sa antitelom (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131), da bi se proizveo konjugat majtanzinoid-antitelo ili majtanzinoid-Fc fuzioni konjugat. Strukturni analozi kaliheamicina koji, takođe, mogu biti korišćeni, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, γ1<1>, γ3<1>, N-acetil-γ1<1>, PSAG i θ1<1>, (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928; U.S. Patent No. 5,714,586; U.S. Patent No. 5,712,374; U.S. Patent No.

5,264,586; U.S. Patent No.5,773,001).

Antitela pronalaska mogu, isto tako, biti konjugovana sa liposomima za ciljano oslobađanje (Vidi, npr., Park et al., 1997, Adv. Pharmacol. 40:399-435; Marty & Schwendener, 2004, Methods in Molecular Medicine 109:389-401).

Izraz "obeleživač", kada se ovde koristi, odnosi se na detektibilno jedinjenje ili kompoziciju koji mogu biti konjugovani, direktno ili indirektno, na anti-TNF-α antitelo pronalaska. Obeleživač može biti detektibilan sam po sebi (npr., radioizotopski obeleživači ili fluorescentni obeleživači) ili, u slučaju enzimskog obeleživača, može katalizirati hemijsku izmenu supstratnog jedinjenja ili kompozicije, koji su detektibilni. Korisni fluorescentni delovi uključuju, ali bez ograničavanja na njih, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-1-naftalensulfonil hlorid, fikoeritrin i slična sredstva. Korisni enzimski obeleživači uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, alkalnu fosfatazu, peroksidazu rena, glukoza oksidazu i slična sredstva.

6.3. Nukleinske kiseline i ekspresioni sistemi

Anti-TNF-α antitelo pronalaska može biti pripremljeno rekombinantnom ekspresijom gena lakog i teškog lanca imunoglobulina u ćeliji domaćina. Da bi se antitelo ekspresovalo na rekombinantni način, ćelija domaćina se transfektuje sa jednim ili više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose fragmente DNK koji kodiraju imunoglobulinske lake i teške lance antitela na takav način da se laki i teški lanci ekspresuju u ćeliji domaćina i, opciono, sekretuju u medijum u kome se ćelije domaćina kultiviraju, pri čemu se iz tog medijuma antitela mogu povratiti. Da bi se dobili geni teškog i lakog lanca antitela, ti geni inkorporirali u rekombinantne ekspresione vektore i vektori uveli u ćelije domaćina, korišćene su standardne metodologije rekombinovanja DNK, kao što su one koje su opisane u Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Drugo izdanje (Sambrook, Fritsch i Maniatis (eds.), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Green Publishing Associates, 1989) i u U.S. Patentu No.4,816,397.

Moguće je da se antitela pronalaska ekspresuju u prokariotskim ili eukariotskim domaćinskim ćelijama. U određenim ostvarenjima, ekspresija antitela se vrši u eukariotskim ćelijama, npr., domaćinskim ćelijama sisara, za optimalnu sekreciju ispravno savijenog i imunološki aktivnog antitela. Primeri domaćinskih ćelija sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela pronalaska uključuju: ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući DHFR<->CHO ćelije koje su opisane u Urlaub i Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, koje su korišćene sa DHFR selektivnim markerom, npr., kao što je opisano u Kaufman i Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), NS0 ćelije mijeloma, COS ćelije, 293 ćelije i SP2/0 ćelije. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedu u domaćinske ćelije sisara, antitela se proizvode kultiviranjem ćelija domaćina tokom dovoljno dugog vremenskog perioda da bi se omogućila ekspresija antitela u ćelijama domaćina ili sekrecija antitela u medijum kulture u kome se ćelije domaćina uzgajaju.

Ćelije domaćina mogu, isto tako, biti korišćene za proizvodnju delova intaktnih antitela, kao što su Fab fragmenti ili scFv molekuli. Rekombinantna DNK tehnologija može, isto tako, biti korišćena za odstranjivanje nekih ili svih DNK koje kodiraju ili jedan ili oba od lakih i teških lanaca, koji nisu neophodni za vezivanje sa TNF-α. Molekuli koje ekspresuju takvi skraćeni molekuli DNK takođe su obuhvaćeni pod antitelima pronalaska.

Za rekombinantnu ekspresiju anti-TNF-α antitela pronalaska, ćelija domaćina može biti ko-transfektovana sa dva ekspresiona vektora pronalaska, pri čemu prvi vektor kodira polipeptid, koji je dobijen iz teškog lanca, a drugi vektor kodira polipeptid koji je dobijen iz lakog lanca. Uobičajeno, svaki od dva vektora sadrži zaseban selektivni marker. Alternativno, može biti korišćen jedan vektor koji kodira polipeptide i teškog i lakog lanca.

Čim je proizvedena nukleinska kiselina koja kodira jedan ili više delova D2E7 ili anti-TNF-α antitela sa CDR sekvencama koje su srodne sekvencama CDR-a D2E7, mogu biti uvedene dalje izmene ili mutacije u kodirajuću sekvencu, da bi se, na primer, proizvele nukleinske kiseline koje kodiraju antitela sa različitim CDR sekvencama, antitela sa smanjenim afinitetom za Fc receptor ili antitela različitih subklasa.

Čim je rekombinantnom ekspresijom proizvedno anti-TNF-α antitelo pronalaska, ono može biti povraćeno i prečišćeno posredstvom bilo kog, u struci poznatog, postupka za prečišćavanje imunoglobulinskog molekula, na primer, posredstvom hromatografije (npr., jonizmenjivačke i afinitetne hromatografije, posebno prema afinitetu za TNF-α nakon selekcije sa Proteinom A ili Proteinom G, i hromatografije na koloni sa isključivanjem prema veličini), uz pomoć centrifugiranja, diferencijalne rastvorljivosti ili posredstvom bilo koje druge standardne tehnike za prečišćavanje proteina. Pored toga, anti-TNF-α antitela ovog pronalaska ili njihovi fragmenti mogu biti spojeni sa heterolognim polipeptidnim sekvencama, koje su ovde opisane, ili drugim, u struci poznatim, načinom za olakšavanje prečišćavanja.

Čim se izdvoji, anti-TNF-α antitelo može biti, ukoliko je to poželjno, dalje prečišćeno, npr., posredstvom tečne hromatografije visokih performansi (Vidi, npr., Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work i Burdon, eds., Elsevier, 1980)), ili uz pomoć gel filtracione hromatografije na Superdex™ 75 koloni (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švedska).

6.4. Terapeutska korišćenja

TNF-α antitela ovog pronalaska od koristi su za lečenje poremećaja ili simptoma raznih imunih i autoimunih patologija, kao i inflamatornih bolesti.

Patološka stanja i bolesti povezani sa TNF-α, koji se mogu lečiti sa anti-TNF-α antitelima pronalaska, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, sledeće:

• Akutna i hronična imuna i autoimuna patološka stanja, kao što su: sistemski lupus eritematozus, reumatoidni artritis, tiroidoza, bolest grafta protiv domaćina, sklerodermija, šećerna bolest, Grave-ova bolest, i slična stanja;

• Infekcije, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, septični sindrom, kaheksiju, cirkulatorni kolaps i šok, koji je proistekao iz akutne ili hronične bakterijske infekcije, akutne i hronične parazitske i/ili bakterijske, virusne ili gljivične infektivne bolesti, kao što je AIDS (uključujući sekvele, kao što su kaheksija, autoimuni poremećaji, kompleks AIDS-demencija i infekcije);

• Inflamatorne bolesti, kao što su hronična inflamatorna patološka stanja i vaskularna inflamatorna patološka stanja, uključujući hronične inflamatorne patologije kao što su: sarkoidoza, hronična inflamatorna bolest creva, ulcerozni kolitis i Crohnova patološka stanja i vaskularna inflamatorna patološka stanja, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, diseminovana intravaskularna koagulacija, ateroskleroza i Kawasaki-jeva patološka stanja;

• Neurodegenerativne bolesti, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, demijelinizirajuće bolesti, kao što je multipla skleroza i akutni transverzni mijelitis; ekstrapiramidalne i cerebelarne poremećaje, kao što su lezije kortikospinalnog sistema; poremećaje bazalnih ganglija ili cerebelarne poremećaje; hiperkinetičke poremećaje kretanja, kao što su Huntingtonova horea i senilna horea, lekovima indukovani poremećaje kretanja, kao što su poremećaji koji su izazvani lekovima koji blokiraju CNS, dopaminske receptore; hipokinetičke poremećaje kretanja, kao što je Parkinsonova bolest; progresivnu supranuklearnu paralizu, cerebelarne i spinocerebelarne poremećaje, kao što su astrukturalne lezije cerebeluma; spinocerebelarne degeneracije (spinalna ataksija, Friedreich-ova ataksija, cerebelarne kortikalne degeneracije, multiple sistemske degeneracije (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager i Machado-Joseph); i sistemske poremećaje (Refsumova bolest, abetalipoprotemija, ataksija, telangiektazija i mitohondrijalni multi-sistemski poremećaj); poremećaje demijelinizacije jezgra, kao što je multipla skleroza, akutni transverzni mijelitis; poremećaje motorne jedinice, kao što su neurogene muskularne atrofije (degeneracija ćelija anteriornog roga, kao što je amiotrofična lateralna skleroza, infantilna spinalna muskularna atrofija i juvenilna spinalna muskularna atrofija); Alzheimerovu bolest; Downov sindrom u srednjim godinama; difuznu bolest Lewy tela; senilnu demenciju tipa Lewy tela, Wernicke-Korsakoff sindrom; hronični alkoholizam; Creutzfeldt-Jakob bolest; subakutni sklerozirajući panencefalitis, Hallerrorden-Spatz bolest i demenciju pugilistiku, ili bilo koju njihovu podgrupu;

• Maligna patološka stanja koja uključuju TNF-α sekretujuće tumore ili druge malignitete koji obuhvataju TNF-α, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, leukemije (akutna, hronična mijelocitna, hronična limfocitna i/ili mijelodisplazni sindrom); limfome (Hodgkinovi i non-Hodgkinovi limfomi, kao što su maligni limfomi (Burkitt-ov limfom ili Mycosis fungoides), i

• Hepatitis izazvan alkoholom.

U određenim specifičnim ostvarenjima, antitela pronalaska se koriste za lečenje bilo kojih indikacija za koje je odobrena upotreba adalimumaba, npr., reumatoidni artritis (RA) (uključujući blagi do ozbiljnog RA kod odraslih), poliartikularni juvenilni idiopatski artritis (JIA) (uključujući blagi do ozbiljnog JIA kod pacijenata starosti 4 godine i više), psorijazni artritis (PsA) (uključujući PsA kod odraslih), ankilozirajući spondilitis (AS) (uključujući AS kod odraslih), Kronova bolest (CD) (uključujući blagu ili ozbiljnu CD kod odraslih), psorijaza, npr., hronična plak psorijaza (Ps) (uključujući blagu do ozbiljne hronične plak psorijaze kod odraslih) i aksijalni spondiloartritis (axSpA) (uključujući ozbiljni axSpA kod odraslih pacijenata koji nemaju dokaz strukturnog oštećenja na snimku X-zracima).

Sledstveno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke lečenja bilo koje od prethodno-pomenutih bolesti kod pacijenta kome je to potrebno, koji obuhvataju primenu pacijentu anti-TNF-α antitela pronalaska. Opciono, navedena primena se ponavlja, npr., nakon jednog dana, dva dana, tri dana, pet dana, nedelju dana, dve nedelje ili mesec dana. Ponovljena primena može biti izvršena u istoj dozi ili u različitoj dozi. Primena se može ponavljati jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta, šest puta, sedam puta, osam puta, devet puta, deset puta ili više. Na primer, u skladu sa određenim režimima doziranja, pacijent prima anti-TNF-α terapiju tokom produženog vremenskog trajanja, npr., 6 meseci, 1 godinu ili više. Količina anti-TNF-α antitela koja se primenjuje pacijentu je, u određenim ostvarenjima, terapeutski efektivna količina. Kako je ovde korišćena, "terapeutski efektivna" količina TNF-α antitela može biti primenjena kao jedna doza ili tokom trajanja terapeutskog režima, npr., tokom perioda od nedelju dana, dve nedelje, tri nedelje, mesec dana, tri meseca, šest meseci, godinu dana ili duže. Uobičajena dozaža će zavisiti od pacijenta i ozbiljnosti bolesti, ali se obično kreće u rasponu od 10 mg do 160 mg (npr., 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 140 mg ili 160 mg). U specifičnim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-TNF-α antitelo ili postupak lečenja jednog ili više poremećaja, koji su ovde izloženi, u rasponima doziranja koji su omeđeni bilo kojom od prethodno-navedenih vrednosti. Terapeutski režim u kom se koristi anti-TNF-α antitelo pronalaska variraće u zavisnosti od starosti i težine pacijenta i stanja bolesti. Terapeutski režim može biti nastavljen tokom 2 nedelje do neodređenog trajanja. U specifičnim ostvarenjima, terapeutski režim se nastavlja tokom 2 nedelje do 6 meseci, od 3 meseca do 5 godina, od 6 meseci do 1 ili 2 godine, od 8 meseci do 18 meseci, ili tokom sličnog perioda. Pacijent kome se primenjuje anti-TNF-α antitelo pronalaska poželjno je humani pacijent. U određenim aspektima, humani pacijent je pedijatrijski pacijent. U drugim aspektima, humani pacijent je adultni pacijent.

Anti-TNF-α antitela pronalaska mogu biti primenjena u kombinaciji sa najmanje jednim drugim terapeutskim sredstvom ("drugo terapeutsko sredstvo"). Anti-TNF-α antitelo i drugo terapeutsko sredstvo mogu biti primenjeni istovremeno (ili simultano ili uzastopno) ili zasebno.

U određenim aspektima, drugo terapeutsko sredstvo je anti-reumatski lek, antiinflamatorno sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo, radioterapeutik, imunosupresivno sredstvo ili citotoksični lek.

Anti-reumatski lekovi uključuju, ali bez ograničavanja na njih, auranofin, azatioprin, hlorohin, D-penicilamin, zlatni natrijum tiomalat hidroksihlorohin, miokrizin i sulfasalazin metotreksat.

Anti-inflamatorna sredstva uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, deksametazon, pentazu, mesalazin, asakol, kodein fosfat, benorilat, fenbufen, naprozin, diklofenak, etodolak i indometacin, aspirin i ibuprofen.

Hemoterapeutska sredstva uključuju, ali bez ograničavanja na njih, radioaktivne molekule, toksine, koji se, takođe, označavaju kao citotoksini ili citotoksična sredstva, koji uključuju bilo koje sredstvo koje je štetnog dejstva na održivost ćelija, agense i liposome ili druge vezikule koje sadrže hemoterapeutska jedinjenja. Primeri pogodnih hemoterapeutskih sredstava uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, 1-dehidrotestosteron, 5-fluorouracil dekarbazin, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, aktinomicin D, adriamicin, aldesleukin, alkilacijska sredstva, alopurinol natrijum, altretamin, amifostin, anastrozol, antramicin (AMC)), anti-mitotska sredstva, cis-dihlorodiamin platinu (II) (DDP) cisplatin), diamino dihloro platinu, antracikline, antibiotike, antimetabolite, asparaginazu, BCG živi (intravezikalni), betametazon natrijum fosfat i betametazon acetat, bikalutamid, bleomicin sulfat, busulfan, kalcijum leukovorin, kaliheamicin, kapecitabin, karboplatin, lomustin (CCNU), karmustin (BSNU), hlorambucil, cisplatin, kladribin, kolhicin, konjugovane estrogene, ciklofosfamid, ciklotosfamid, citarabin, citarabin, citohalazin B, citoksan, dakarbazin, daktinomicin, daktinomicin (ranije aktinomicin), daunirubicin HCL, daunorubicin citrat, denileukin diftitoks, deksrazoksan, dibromomanitol, dihidroksi antracin dion, docetaksel, dolasetron mezilat, doksorubicin HCL, dronabinol, L-asparaginazu E. coli, emetin, epoetin-α, L-asparaginazu Erwinie, esterifikovane estrogene, estradiol, estramustin fosfat natrijum, etidijum bromid, etinil estradiol, etidronat, etopozid citrovorum faktor, etopozid fosfat, filgrastim, floksuridin, flukonazol, fludarabin fosfat, fluorouracil, flutamid, folinsku kiselinu, gemcitabin HCL, glukokortikoide, goserelin acetat, gramicidin D, granisetron HCL, hidroksiureu, idarubicin HCL, ifosfamid, interferon α-2b, irinotekan HCL, letrozol, leukovorin kalcijum, leuprolid acetat, levamisol HCL, lidokain, lomustin, majtanzinoid, mehloretamin HCL, medroksiprogesteron acetat, megestrol acetat, melfalan HCL, merkaptopurin, mesnu, metotreksat, metiltestosteron, mitramicin, mitomicin C, mitotan, mitoksantron, nilutamid, oktreotid acetat, ondansetron HCL, paklitaksel, pamidronat dinatrijum, pentostatin, pilokarpin HCL, plimicin, polifeprosan 20 sa karmustin implantom, porfimer natrijum, prokain, prokarbazin HCL, propranolol, rituksimab, sargramostim, streptozotocin, tamoksifen, taksol, tenipozid, tenopozid, testolakton, tetraksin, tioepa hlorambucil, tiogvanin, tiotepu, topotekan HCL, toremifen citrat, D2E7, tretinoin, valrubicin, vinblastin sulfat, vinkristin sulfat i vinorelbin tartarat.

U nekim drugim aspektima pronalaska, drugo terapeutsko sredstvo je antagonist TNF-α, koji nije anti-TNF-α antitelo pronalaska. Primeri takvih antagonista TNF-α uključuju, ali bez ograničavanja na njih, rastvorljive TNF-α receptore; etanercept (ENBREL; Immunex) ili njegov fragment, derivat ili analog; infliksimab (REMICADE; Centacor) ili njegov derivat, analog ili antigen-vezujući fragment; IL-10, za koga se zna da blokira proizvodnju TNF-α posredstvom interferon-γ-aktiviranih makrofaga (Oswald et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8676-8680), TNFR-IgG (Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539); mišji proizvod TBP-1 (Serono/Yeda); vakcinu CytoTAb (Protherics); antisens molekul 104838 (ISIS); peptid RDP-58 (SangStat); talidomid (Celgene); CDC-801 (Celgene); DPC-333 (Dupont); VX-745 (Vertex); AGIX-4207 (AtheroGenics); ITF-2357 (Italfarmaco); NPI-13021-31 (Nereus); SCIO-469 (Scios); TACE targetar (Immunix/AHP); CLX-120500 (Calyx); tiazolopirim (Dynavax); auranofin (Ridaura) (SmithKline Beecham Pharmaceuticals); kvinakrin (mepakrin dihlorohidrat); tenidap (Enablex); melanin (Large Scale Biological) i anti-p38 MAPK sredstva od Uriach-a.

Dodatna druga terapeutska sredstva koja su korisna u kombinaciji sa anti-TNF-α antitelom i pojedine indikacije za koje je od koristi kombinovana terapija sa drugim terapeutskim sredstvima, izloženi su u WO 2004/004633.

6.5. Farmaceutske kompozicije i farmaceutska primena

Anti-TNF-α antitela pronalaska mogu biti uključena u farmaceutske kompozicije koje su pogodne za primenu pacijentu. Uobičajeno, farmaceutska kompozicija sadrži anti-TNF-α antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako je ovde korišćen, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koje i sve rastvarače, disperzivne medijume, sredstva za oblaganje, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije i slična sredstva koja su fiziološki kompatibilna. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju jedno ili više od sledećih sredstava: voda, slani rastvor, slani rastvor puferisan fosfatnim puferom, dekstroza, glicerol, etanol i slično, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, biće poželjno da su izotonična sredstva, na primer, šećeri, polialkoholi, kao što je manitol i sorbitol, ili natrijum hlorid, uključe u kompoziciju. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu, dalje, da sadrže manje količine pomoćnih supstanci, kao što su sredstva za vlaženje ili emulzivna sredstva, konzervansi ili puferi, koji produžavaju rok trajanja ili efikasnost antitela ili dela antitela.

Kompozicije ovog pronalaska mogu postojati u različitim oblicima. Oni uključuju, na primer, tečne, polu-čvrste i čvrste dozne oblike, kao što su tečni rastvori (npr., injekcioni i infuzioni rastvori), disperzije ili suspenzije, i praškovi. Poželjni oblik zavisi od nameravanog načina primene i terapeutske aplikacije. Uobičajene poželjne kompozicije su u obliku njekcionih ili infuzionih rastvora. Poželjni način primene je parenteralna primena (npr., intravenska, subkutana, intraperitonealna, intramuskularna). U poželjnom ostvarenju, anti-TNF-α antitelo se primenjuje putem intravenske infuzije ili injekcije. U drugom poželjnom ostvarenju, anti-TNF-α antitelo se primenjuje uz pomoć intramuskularne ili subkutane injekcije.

Anti-TNF-α antitela pronalaska mogu biti obezbeđena u farmaceutskim kitovima. Farmaceutski kit je pakovanje koje sadrži anti-TNF-α antitelo pronalaska (npr., u liofilizovanom obliku ili u vidu vodenog rastvora) i, opciono, jedno ili više od sledećih sredstava: drugo terapeutsko sredstvo, kao što je, na primer, prethodno opisano; sredstvo za primenu anti-TNF-α antitela, na primer, penkalo, igla i/ili špric; i voda ili pufer farmaceutskog stepena za resuspendovanje antitela ukoliko je antitelo u liofilizovanom obliku.

U određenim aspektima, svaka jedinica doze anti-TNF-α antitela je zasebno zapakovana, a kit može da sadrži jednu ili više jedinica doze (npr., dve jedinice doze, tri jedinice doze, četiri jedinice doze, pet jedinica doze, osam jedinica doze, deset jedinica doze ili više). U specifičnom ostvarenju, svaka od jedne ili više jedinica doze nalazi se u špricu ili penkalu. Uobičajena jedinica doze sadrži 10 mg do 160 mg anti-TNF-α antitela (npr., 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 140 mg ili 160 mg). U specifičnim ostvarenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinicu doze koja sadrži anti-TNF-α antitelo u rasponu omeđenom bilo kojom od prethodno-pomenutih vrednosti.

Pored toga, mogu biti uključeni i drugi aditivi, kao što su stabilizatori, puferi (npr., pufer za blokiranje ili pufer za liziranje) i slično. U specifičnom ostvarenju, antitelo i jedan ili više aditiva mogu biti obezbeđeni (pojedinačno ili kombinovano) u vidu suvih praškova, uglavnom liofilizovanih, uključujući ekscipijense, a čijim rastvaranjem će se dobiti rastvor koji ima odgovarajuću koncentraciju.

7. PRIMERI

7.1. Primer 1: Vektori za ekspresiju i izlaganje ćelijske površine.

Sintetski varijabilni laki (VL) i varijabilni teški (VH) domeni za D2E7 (adalimumab) konstruisani su uz pomoć komercijalnog snabdevača za gensku sintezu (DNA 2.0 Inc., Menlo Park, CA). SLIKE 1A-1C prikazuju sekvence DNK, translatovane aminokiselinske sekvence, restriktivne položaje koji ih zaposedaju sa strane i CDR-e VHi VLfragmenata sintetskog D2E7. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR-i) su označeni podebljanim potcrtanim tekstom. VHi VLsintetskog D2E7 klonirani su u vektor pYA206, epizomalni vektor dobijen iz Epstein-Barr virusa, za ekspresovanje i izlaganja antitela na površini ćelija sisara. pYA206 je derivat plazmida pYA104 (Akamatsu et al., J. Immunol Methods, 2007 Okt 31;327(1-2):40-52) sa sledećim modifikacijama: 1) humani C lambda konstantni domen je zamenjen humanim C kapa konstantnim domenom, 2) glikozidilfosfatidilinozitol-povezujući signal (GPI sidro) je zamenjen transmembranskim domenom receptora faktora rasta dobijenog iz trombocita (PDGF-R), 3) jedinstveni NotI i XhoI položaji su ushodno od C kapa domena za kloniranje VLdomena u okviru sa C kapa, i 4) jedinstveni NgoMIV i SacI položaji su ushodno od IgG1za kloniranje VHdomena u okviru sa konstantnim regionima IgG1.

pCW600 je derivat plazmida pYA206, pri čemu je CH gen zamenjen sa Fab. VHfragment D2E7 je svaren sa NgoMIV i SacI, a VLfragment D2E7 je svaren sa NotI i Xhol. Oba fragmenta su klonirana u plazmid pYA206, da bi se kreirao plazmid pYA206-D2E7. SLIKA 4 pokazuje strukturu pYA206-D2E7. Ovaj plazmid sadrži EBNA-1 gen i oriP iz Epstein Barr virusa, čime se omogućuje replikacija u ćelijama sisara u vidu epizoma. pUC izvor replikacije i ampicilin-rezistentni gen omogućuju da se plazmid umnoži u E. coli. Transformanti ćelija sisara se odabiru sa puromicin-rezistentnim genom pod kontrolom SV40 promotera. CMV promoter i interni ribosomski ulazni položaj (IRES) omogućuju ekspresiju izloženih teških i lakih lanaca antitela. Ekspresovano antitelo je spojeno sa ćelijskom membranom preko PDGF-R transmembranskog domena koji je spojen sa krajem konstantnog domena IgG1.

VHfragment D2E7 je svaren sa NgoMIV i SacI, VLfragment D2E7 je svaren sa NotI i XhoI, a oba fragmenta su klonirana u plazmid pCW600, da bi se stvorio plazmid pCW600-D2E7. SLIKA 4 prikazuje strukturu pCW600-D2E7. Ovaj plazmid sadrži EBNA-1 gen i oriP iz Epstein Barr virusa, čime se omogućuje replikacija u ćelijama sisara u vidu epizoma. pUC izvor replikacije i ampicilin-rezistentni gen omogućuju da se plazmid umnoži u E. coli. Transformanti ćelija sisara se odabiru sa puromicin-rezistentnim genom pod kontrolom SV40 promotera. CMV promoter i interni ribosomski ulazni položaj (IRES) omogućuju ekspresiju izloženih Fab teških i lakih lanaca. Ekspresovani Fab je spojen sa ćelijskom membranom preko PDGF-R transmembranskog domena koji je spojen sa krajem konstantnog domena IgG1.

7.2. Primer 2: Izlaganje površine i FACS titracioni test D2E7

293c18 ćelije (American Type Culture Collection, Manassas, VA), koje ekspresuju EBNA-1 protein, transformisane su sa pYA206-D2E7. 293c18 ćelije su kultivisane u DMEM medijima, dopunjenim sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 0.25 mg/ml G418. 0.125 µg pYA206-D2E7 ili pCW600-D2E7 plazmida pomešano je u odnosu 1:200 sa 25 µg pUC19 kao nosača plazmida plus 60 µl lipofektamina (Invitrogen, CA) i dodato je u 2x10<7>293c18 ćelija.

Višak nosača plazmida od 200 puta primenjen je da bi se osiguralo da je svaka ćelija transformisana sa plazmidom koji sadrži najviše jedan D2E7. Nakon 48 sati, transformisane ćelije su odabrane putem dodavanja puromicina, nakon čega su kultivisane tokom dodatnih 18 dana pre FACS analize.

Humani TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN) je obeležen sa obeleživačem Alexa Fluor 647 (Invitrogen, CA). 1 mg humanog TNF-α reagovao je sa 84 ug reagensa Alexa Flour 647 tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a nakon toga je izvršeno prečišćavanje iz nereagovanog reagensa korišćenjem gel filtracione kolone. 293c18 ćelije, transfektovane sa pCW600-D2E7, dvostruko su obojene sa PE-obeleženim anti-humanim IgG (Southern Biotech) u razblaženju 1/200 i raznim koncentracijama Alexa Fluor 647-obeleženog TNF-α na ledu tokom jednog sata, isprane su sa FACS puferom (slani rastvor puferisan fosfatnim puferom (PBS) plus 0.5% goveđeg serumskog albumina (BSA)) i analizirane su na FacsCalibur-u (BD). Titraciona kriva je izrađena sa koncentracijama Alexa Fluor 647-obeleženog TNF-α u rasponu od 20 nM do 0.26 nM. Srednja tačka svake krive, u kojoj se dešava polovina maksimalnog vezivanja, definiše EC50za kompleks antitelo/antigen. Rezultati za D2E7 divljeg tipa prikazani su na SLICI 5. U ovom testu površinski izložen Fab D2E7 vezuje se za TNF-α sa EC50od 0.15 nM.

Anti-D2E7 antitela 1H11, 5A1 i 10F8 (anti-idiotipovi, anti-Id-i) konjugovana su sa biotinom. 1 mg svakog anti-Id reagovao je sa 43 µg reagensa sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce), tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Višak biotina je odstranjen centrifugiranjem na Amicon mikrocentrifuškom filteru. 293c18 ćelije, transfektovane sa pCW600-D2E7, dvostruko su obojene sa PE-obeleženim anti-humanim IgG (Southern Biotech) u razblaženju 1/200 i biotinilizovanim anti-Id tokom 1 sata, isprane su sa FACS puferom (slani rastvor puferisan fosfatnim puferom (PBS) plus 0.5% goveđeg serumskog albumina (BSA)), nakon čega su obojene sa streptavidin-APC u razblaženju 1/200. Titraciona kriva je izrađena sa koncentracijama anti-Id-a u rasponu od 20 nM do 0.26 nM. Srednja tačka svake krive, u kojoj se odvija polovina maksimalnog vezivanja, definiše EC50za kompleks anti-Id/D2E7. Rezultat za svaki anti-idiotip D2E7 prikazan je na SLICI 6. U ovom testu površinski izložen Fab D2E7 vezuje se za anti-Id 1H11, 5A1 i 10F8 sa EC50od 0.77 nM, 0.37 nM, odnosno 1.28 nM.

7.3. Primer 3: Konstruisanje biblioteka D2E7 mutanata sa jednom aminokiselinom

Svaka aminokiselinska pozicija CDR-a D2E7 (potcrtana na SLICI 1A) - ukupno 34 pozicije VHi 27 pozicija VL– postavljena je kao meta za NNK randomizaciju. Korišćena je NNK šema kodiranja (u kojoj N = A, C, G ili T, a K = G ili T) zbog toga što 1) potrebna su samo 32 kodona za kodiranje svih 20 aminokiselina koje postoje u prirodi, 2) samo jedan stop kodon (TAG) je uključen u 32 kodona, i 3) maksimalna degeneracija (broj različitih kodona koji kodiraju jednu aminokiselinu) je 3, pre nego maksimum od 6-puta veće degeneracije koja se odvija u kompletnom genetskom kodu od 64 kodona.

61 različiti fragment DNK, svaki sa NNK degeneracijom na različitoj poziciji CDR-a, sintetisan je uz posredstvo komercijalnog dobavljača sintetskih gena (DNA 2.0, Menlo Park, CA). Ovi fragmenti su amplifikovani posredstvom PCR-a sa prajmerima D2E7reampFwd (5’-CTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCAG - 3’) (SEQ ID NO:11) i D2E7reampRev (5’-TGGTAGTGTGGGGACTC -3’) (SEQ ID NO:12). PCR proizvodi su prečišćeni, nakon čega su fragmenti VHsvareni sa NgoMIV i SacI, a fragmenti VLsu svareni sa NotI i XhoI. Svi fragmenti su obrađeni na agaroza gelu, prečišćeni su i subklonirani u plazmid pCW600-D2E7, koji nosi suprotne fragmente varijabilnog regiona divljeg tipa. Dobijeni plazmidi su zasebno transformisani u Top 10 ćelijama E. coli (Invitrogen, CA), da bi se obrazovala sub-biblioteka transformanata za svaki od 61 različitog fragmenta DNK. Transformacije su izvršene na takav način da se dobije najmanje 10 puta više transformanata E. coli od ukupnog broja mogućih kodona u svakoj sub-biblioteci. Dobijene sub-biblioteke za VHi VLpulovane su da bi se kreirale dve konačne biblioteke – biblioteka VHD2E7, koja sadrži 34 pozicije i 1088 različitih kodona, i biblioteka VLD2E7, koja sadrži 27 pozicija i ukupno 864 različita kodona.

7.4. Primer 4: FACS bojanje i 4-struko sortiranje biblioteka VHD2E7 i VLFab tačkastih mutanata za vezivanje TNF-α

Biblioteke VHi VLD2E7 transfektovane su u 293c18 ćelije sa 0.5 µg plazmida biblioteke, 100 µg pUC19 nosača plazmida i 250 µl lipofektamina, odabrane su sa 0.8 µg/ml puromicina nakon 2 dana, i kultivisane su tokom dodatnih 18 dana pre podvrgavanja FACS sortiranju. Ćelije su obojene sa 0.15 nanomola Alexa Fluor 647-TNF-α i 1:200 PE-obeleženih anti-IgG (Southern Biotech), a razvrstavanje je urađeno na MoFlo FACS mašini (Dako North America Inc., Carpinteria, CA). Profili FACS sortiranja za biblioteke D2E7 divljeg tipa i tačkasto mutiranih VHprikazani su na SLIKAMA 7A-7B. Panel A prikazuje FACS profil za ćelije koje su transformisane sa ekspresionim plazmidom pCW600 Fab D2E7 divljeg tipa; x-osa pokazuje bojanje sa PE-anti-IgG, a y-osa pokazuje bojanje sa Alexa Fluor 647-TNF-α. Budući da je ekspresija antitela heterogena u ćelijskoj populaciji, FACS profil prikazuje tačke za pojedinačne podatke koji su grubo raspoređeni duž dijagonalne linije koja se tačkasto prikazuje prema gornjem desnom kvadrantu.

TNF-α-obojene ćelije biblioteke VHsa tačkastom mutacijom razvrstane su u 4 subpopulacije na osnovu FACS prolaza (SLIKE 7A-7B, panel B). Ponašanje antitela divljeg tipa pod sličnim uslovima FACS testa korišćeno je za postavljanje prolaza za razvrstavanje ćelija u populaciju visokog afiniteta (H) (R4), populaciju neutralnog ili ’srednjeg’ afiniteta (M) (R5), populaciju niskog afiniteta (L) (R6) i populaciju bez ekspresije IgG (Z) (R3). Osa x prikazuje anti-IgG-PE bojenje, a y-osa prikazuje bojanje sa humani-TNF-α-AF647.

7.5. Primer 5: FACS bojenje i 2-struko sortiranje biblioteka VHD2E7 i VLFab tačkastih mutanata za vezivanje sa anti-ld

Ćelije koje ekspresuju D2E7 uporedo su obojene sa 0.15 nanomola Alexa Fluor 647-TNF-α i biotinilizovanim anti-idiotipovima mAt pri EC50(1H11 pri 0.77 nM, 5A1 pri 0.37 nM i 10F8 pri 1.28 nM), nakon čega su inkubirane tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Ćelije su, zatim, isprane i inkubirane sa streptavidin-APC i anti-humani IgG kapa-FITC tokom jednog sata na 4° C. Ćelije su isprane, a nakon toga su sortirane na MoFlo FACS mašini (Dako North America Inc., Carpinteria, CA). Profili FACS sortiranja za biblioteku D2E7 divljeg tipa i VHobojenih sa 1H11 prikazani su na SLIKAMA 8A-8B. Bojenje sa anti-IgG-PE prikazano je na xosi, bojenje sa anti-Id1H11-APC prikazano je na y-osi. Izvršeno je 2-struko sortiranje, čime je sakupljeno minimalno dva miliona ćelija u "sortiranom" prolazu (ćelije sa slabim vezivanjem za anti-idiotip) i "ekspresionom" prolazu (ćelije koje su pozitivne na anti-humani IgG kapa FITC).

Budući da je ekspresija antitela heterogena u ćelijskoj populaciji, FACS profil prikazuje tačke za pojedinačne podatke koji su približno raspoređeni duž dijagonalne linije koja se tačkasto prikazuje prema gornjem desnom kvadrantu. FACS profili za biblioteku D2E7 WT i tačkastih mutacija VH prikazani su na SLICI 8, paneli A, odnosno B. Da bi se sakupila referentna ćelijska populacija za svaku biblioteku koja sadrži sve ekspresovane tačkaste mutacije sa njihovim odgovarajućim učestalostima u biblioteci, izvučeni su prolazi pri čemu je levi kraj paralelan sa y-osom; razvrstavanjem prema ovim prolazima sakupljaju se sve ćelije koje ekspresuju IgG iznad utvrđenog nivoa, nezavisno od toga koliko dobro se izložena antitela vezuju za anti-Id. Oni se označavaju kao "ekspresioni prolazi" i "ekspresovane populacije" (panel B "R4"). Ostala razvrstavanja su izvršena sa vrhom prolaza, izvučenog približno paralelno sa i direktno ispod glavne dijagonale za populaciju divljeg tipa; ovi prolazi su dizajnirani da bi se sakupile ćelije koje su ekspresovale antitela sa smanjenim afinitetom vezivanja za anti-idiotip, nezavisno od njihovog ukupnog nivoa ekspresije IgG. Ovi prolazi i populacije označeni su kao "sorirani prolazi" i "sortirane populacije" (panel B "R3"). Približno 2,000,000 ćelija sakupljeno je u oba prolaza, "sortiranom" i "ekspresionom".

7.6. Primer 6: Masivno parelelno sekvenciranje "ekspresovanih" i "sortiranih" populacija

Iz "ekspresovanih" i "sortiranih" ćelijskih populacija povraćeni su plazmidi, a amplifikacija posredstvom PCR-a izvršena je kako bi se izradili kratki amplikoni, koji su pogodni za masivno paralelno sekvenciranje. Korišćeni su PCR prajmeri koji se odmah temperiraju izvan CDR1 i CDR3 regiona VHi VLdomena D2E7. Prajmeri su bili: prednji prajmer VHD2E7_VH_ CDR_for 5’-TTAGTTGTGCTGCATCAGGTTT-3’ (SEQ ID NO:13); reverzni prajmer VHD2E7_VH_CDR3_rev 5’- GGTCACCAGTGTTCCCTGAC -3’ (SEQ ID NO:14); prednji prajmer VLD2E7_VL_CDR1_for 5’-GTAGGCGACAGGGTCACAAT-3’ (SEQ ID NO:15) i reverzni prajmer VLD2E7_VL_CDR3_rev 5’-AGTCCGTTTGATCTCGACCTT-3’ (SEQ ID NO: 16). Sledstveno tome, svaki amplikon je sadržavao kompletne CDR1, CDR2 i CDR3 regione za lociranje i tabelarno prikazivanje svih tačkastih mutacija, ali je izostavljen veliki deo okvirnih regiona 1 i 4. "Sortirani" i "ekspresovani" amplikoni biblioteke VHi VLD2E7 nakon toga su sekvencirani korišćenjem genom sekvenatora FLX prema instrukcijama proizvođača. (454 Life Sciences, Branford, CT).

Kompjuterski program je korišćen za ispitivanje sekvenci i tabelarni prikaz koliki broj puta je svaka tačkasta mutacija nađena u "ekspresovanim" i "sortiranim" populacijama. Kompjuterski program najpre očitava i tabelarno prikazuje svaki kodon. Za aminokiseline sa više od jednog kodona, programski se dodaje pojavljivanje različitih kodona za svaku aminokiselinu zajedno, da bi se dobio ukupni sažeti prikaz ponašanja date varijante aminokiseline u svakoj subpopulaciji.

Za 4-struko sortiranje biblioteka D2E7 da bi se procenilo vezivanje za TNF-α, dat je skor odnosa uvećanja ili "enrichment ratio (ER)" za svaku varijantu kodona. ER označava sa koliko puta većom ili manjom učestalošću je varijanta nađena u H populaciji u poređenju sa njenom ukupnom učestalošću. Na sličan način, odnosi uvećanja ili "enrichment ratio" mogu biti izračunati za svaku varijantu u svakoj od populacija M, L i Z. Očekivano je da varijante većeg afiniteta budu uvećane u H populaciji (ER>1) i umanjene (ER<1) u L populaciji. Suprotno tome, očekivano je da mutanti slabijeg afiniteta budu umanjeni u H populaciji (ER<1) i uvećani u L populaciji (ER>1). Identifikovanje varijanti sa višim, nižim i neutralnim afinitetom moguće je samo na osnovu pregleda odnosa uvećanja ili "enrichment ratio" za H populaciju.

U 2-strukoj FACS analizi za procenu vezivanja biblioteka D2E7 za anti-idiotipove, "sortirana" populacija sadrži varijante koje se slabije vezuju sa anti-idiotipom. U ovom slučaju, veći ER sortiranih varijanti označava smanjeno vezivanje za anti-idiotip.

7.7. Primer 7: Identifikovanje tačkastih mutanata sa željenim karakteristikama

Da bi se analizirali podaci, broj koji pokazuje koliko puta je mutacija utvrđena na datoj poziciji normalizovan je za broj koji pokazuje koliko puta je ta pozicija sekvencirana i ekspresovana, izražen kao učestalost na 1000 sekvenci. Nakon toga je učestalost mutacije u sortiranoj populaciji podeljena sa učestalošću u ekspresovanoj populaciji, da bi se dobio odnos uvećanja ili "enrichment ratio (ER)", koji pokazuje da li je mutacija uvećana ili smanjena u sortiranoj populaciji u poređenju sa ekspresovanom populacijom, i do kog stepena. Mutacije koje su uvećane u sortiranoj populaciji dovešće do povećanog vezivanja za TNF-α, dok će mutacije koje su umanjene dovesti do smanjenog vezivanja. Na sličan način, sortirane ćelije koje su ispoljavale smanjeno vezivanje za anti-idiotipove imaće visoki odnos uvećanja ili "enrichment ratio" za pojedini anti-idiotip.

7.8. Primer 8: Analiza tihog kodona divljeg tipa

U određivanju da li su varijante u biblioteci uvećane ili umanjene u sortiranoj subpopulaciji, korisno je da se izvrši poređenje ponašanja varijanti sa ponašanjem proteina divljeg tipa pod istim eksperimentalnim uslovima. Ovo se može jednostavno izvršiti praćenjem ponašanja tihih WT kodona - varijanti DNK sekvenci koje kodiraju WT protein, ali koje sadrže tihu promenu kodona, koja je proistekla iz NNK randomizacije. Na primer, na poziciji u biblioteci gde je kodon divljeg tipa GGG (glicin), NNK randomizacijom će se proizvesti GGT kodon, koji, isto tako, kodira glicin, ali koji se može pratiti u, ovde opisanim, postupcima sortiranja i statističke analize, kao i bilo koja druga varijanta. U zavisnosti od polaznog kodona, na bilo kojoj poziciji se može pojaviti bilo koji broj od nula do tri tiha kodona divljeg tipa; u praksi se na ovaj način osigurava da će nekoliko količina od dvanaest tihih kodona divljeg tipa biti raspoloživo u uobičajenoj biblioteci CDR-a, koja pokriva 50-65 različitih pozicija. Prosečna vrednost odnosa uvećanja ili ʺenrichment ratioʺ ovih tihih kodona divljeg tipa može biti korišćena za utvrđivanje srednje tačke eksperimenta; varijante sa poboljšanim afinitetom naći će se iznad ove srednje tačke, varijante sa slabijim afinitetom će se naći ispod ove srednje tačke, a neutralne varijante će se naći u blizini srednje tačke. SLIKA 9 prikazuje rezultate analize tihih kodona divljeg tipa.

Povoljne mutacije (t.j., one sa smanjenim vezivanjem za anti-idiotip 1H11 i neutralnim vezivanjem za TNF-α) imale bi 1H11-ER veći od 0.25 (srednja vrednost 1SD) i TNF-α-ER između 1.21 i 1.59 (srednja vrednost /- 1SD).

7.9. Primer 9: FASC analiza u jednoj tački

Da bi se pretpostavilo koje bi pozicije u CDR-u dovodile do smanjenog vezivanja za anti-idiotipove, 293c18 ćelije, postavljene na ploče sa 96 reakcionih čašica, transfektovane su sa sub-bibliotekama sa mutiranom samo jednom pozicijom od 32 moguća kodona (SLIKA 10). Nakon dva dana kultivacije, ćelije su sakupljene i obojene sa anti-idiotipovima pri EC50i konjugovane su sa PE i TNF-α-647 pri EC50. FACS analiza je pokazala pozicije sa velikom populacijom ćelija sa slabim vezivanjem za anti-idiotip. SLIKA 11 pokazuje da neke pozicije (zaokružene) u VHmogu biti mutirane da bi se smanjilo vezivanje za 1H11 i da nema pozicija u VLkoje mogu dovesti do sličnog efekta. Na sličan način, SLIKA 12 pokazuje da vezivanje od strane anti-idiotipova 5A1 i 10F8 može biti smanjeno postojanjem mutacija na određenim pozicijama u VLlancu. Mutacije u VHlancu ne smanjuju vezivanje za 5A1 i 10F8.

Pymol model D2E7 sa pozicijama u VHza koje se pretpostavlja da su značajne za vezivanje 1H11 koje su izdvojene sivom bojom, prikazane su na SLIKAMA 13A-13D. Za pretpostavljeni epitop se pokazuje da, premda su pozicije rasute između tri CDR-a, one su susedne na modelu i obrazuju konformacijski i diskontinuiran epitop. Na sličan način, SLIKE 14A-14D pokazuju da pozicije u VLkoje su značajne za vezivanje 5A1 i 10F8 obrazuju konformacijski ili diskontinuirani epitop.

Da bi se potvrdilo smanjeno vezivanje za anti-idiotip, IgG pune dužine sa jednom mutacijom ekspresuje se na ćelijskoj površini, nakon čega se boji sa anti-idiotipom, konjugovanim sa AF647 pri EC50i anti-IgG-PE. Da bi se potvrdilo neutralno vezivanje za metu, IgG pune dužine na površini ćelije boji se sa TNF-α-AF647pri EC50i anti-IgG-PE.

CDR1-2 VH(Y32) je mutiran od Y u K, R, S, T ili V. SLIKA 15 prikazuje FASC analizu mutanata u jednoj tački. FACS bojenje sa anti-idiotipom 1H11 potvrđuje smanjeno vezivanje svih varijanti. TNF-α bojenje pokazuje neutralno vezivanje za sve mutante, izuzev za T, što je u korelaciji sa nižim ER ovog mutanta na SLICI 16. Povoljne mutacije na VLD2E7, koje su prikazane na SLICI 16, odabrane su kao one sa smanjenim vezivanjem za 1H11 (1H11-ER veći od 0.25) i neutralnim vezivanjem za TNF-α (TNF-α-ER od 1.21-1.60). Neželjene mutacije su označene sivom bojom.

SLIKA 17 prikazuje prosečne odnose uvećanja ili ʺenrichment ratioʺ 1H11 prema poziciji. Pozicije u VHD2E7 sa visokim prosečnim ER imaju više mogućih aminokiselinskih supstitucija koje dovode do antitela sa smanjenim vezivanjem za anti-Id 1H11.

SLIKA 18 prikazuje prosečne odnose uvećanja ili ʺenrichment ratioʺ 5A1 prema poziciji. Pozicije u VLD2E7 sa visokim prosečnim ER imaju više mogućih aminokiselinskih supstitucija koje dovode do antitela sa smanjenim vezivanjem za anti-idiotip 5A1.

SLIKA19 prikazuje prosečne odnose uvećanja ili ʺenrichment ratioʺ 10F8 prema poziciji. Pozicije u VLD2E7 sa visokim prosečnim ER imaju više mogućih aminokiselinskih supstitucija koje dovode do antitela sa smanjenim vezivanjem za anti-idiotip 10F8.

7.10. Primer 10: Test premoštavanja D2E7

Test premoštavanja D2E7 razvijen je kako bi se vizuelno prikazalo vezivanje D2E7 za anti-adalimumab antitela (ADAt), dobijena do humanih davalaca. Immobilon ELISA ploče visokog vezivanja obložene su sa 0.5 µg/ml D2E7 antitela divljeg tipa u PBMS na 4°C preko noći. Sledećeg dana ploče se ispiru sa PBS koji sadrži 0.1% Tween-20 (PBS/Tween). Ploče su blokirane sa 1% humanim AB serumom u PBS (huAB/PBS) na sobnoj temperaturi tokom 1-2 sata. Uzorci humanog seruma (Bioreclamation, NY) su razblaženi u huAB/PBS i dodati su na ELISA ploče. Na kraju, biotinilizovano D2E7 antitelo divljeg tipa dodato je do završne koncentracije od 15 ng/ml. Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Sledećeg dana, ploče su isprane u PBS/Tween-u. Streptavidin-HRPO (MABTECH) je, prema preporukama proizvođača, razblažen u odnosu 1:1000 u huAB/PBS i na ploče je dodata količina od 100 µl po reakcionoj čašici. Ploče su inkubirane tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega su jednom isprane sa PBS/Tween-om i dva puta sa destilovanom vodom. Dodat je jedno-komponentni TMB (BioFX Laboratories), a razvijanje boje je trajalo 15 minuta. Ploče su očitane na 650 nm. Uključena je pozitivna kontrola (mišje monoklonsko antitelo protiv humanog D2E7).

7.11. Primer 11: Inhibicioni test za validiranje tačkastih mutanata VHi VLD2E7

Komercijalno dostupni uzorci seruma humanih davalaca, sa navodima o primanju adalimumaba, ali ne i metotreksata, kao leka, na obrascima o njihovom pristanku, skrinirani su na prisustvo anti-adalimumab antitela ("ADAt"), korišćenjem testa premoštavanja iz Primera 10. Davaoci, kod kojih je dokazano prisustvo ADAt, odabrani su za dalje ispitivanje. Specifičnost ADAt je potvrđena izvođenjem testova inhibicije, uz korišćenje pozitivnih i negativnih kontrola, kao što je opisano u nastavku. Odabrana ADAt davalaca bila su specifična za Fab fragment D2E7.

Varijante antitela, za koje je utvrđeno da imaju smanjeno vezivanje za mišja antiidiotipska antitela u poređenju sa D2E7, skrinirane su na inhibiciju testom premoštavanja D2E7. U testu premoštavanja inhibicija od strane varijanti antitela pokazala je da je varijanta još u stanju da se vezuje sa AD antitelima iz seruma pacijenta. Sledstveno tome, varijante koje ne interferiraju sa testom premoštavanja, ne pokazuju unakrsnu reakciju sa AD antitelom i tako predstavljaju mutacije u okviru antitelo-vezujućeg epitopa D2E7.

Immobilon ELISA ploče su obložene preko noći, sa 0.5 µg/ml D2E7 divljeg tipa, isprane su i blokirane. Na zasebnoj ploči sa 96 reakcionih čašica, varijante D2E7 antitela su razblažene u huAb/PBS do koncentracije od 10 µg/ml. Svaka varijanta je testirana u duplikatu. Herceptin i DP10, IgG1 antitela, koja nisu povezana sa D2E7, korišćena su kao negativne kontrole za vezivanje anti-adalimumab antitela. D2E7 antitelo divljeg tipa korišćeno je kao pozitivna kontrola za inhibiciju. Fab fragmenti DP10 i D2E7 takođe su korišćeni kao negativne, odnosno pozitivne kontrole. Serumi davalaca koji ispoljavaju imuni odgovor prema adalimumabu, razblaženi su do 1:25 u huAB/PBS, a 100 µl je dodato u reakcione čašice koje sadrže varijante i kontrole. Konačna koncentracija seruma davaoca bila je 1:50. 100 µl razblaženog seruma sa dodatim varijantama i kontrolama preneseno je na ploče, obložene sa D2E7. 100 µl biotinilizovanog D2E7 u koncentraciji od 30 ng/ml u huAB/PBS odmah je dodato na ploče. Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Sledećeg dana, ploče su isprane i dodat je razblaženi streptavidin-HRPO. Ploče su isprane jednom sa PBS/Tween-40, dodat je jednokomponentni TMB (BioFX Laboratories), a razvijanje boje je trajalo 15 minuta. Ploče su očitane na 650 nm.

Nesrodno antitelo DP10 je uključeno kao kontrola u sve testove i nije imalo uticaja na vezivanje ADAt za D2E7 na pločama. Procenat inhibicije vezivanja ADAt za DP10 bio je prosečno 88 /- 12%. Test inhibicije je izvršen sa ADAt pozitivnim uzorcima seruma od četiri komercijalna davaoca. U najvećem broju, rezultati su se preklapali za svih četvoro davalaca, pri čemu su izmene na VHCDR3 imale najveći uticaj na vezivanje ADAt (SLIKE 20A-20B). Poželjne varijante su odabrane na dva načina: SLIKA 21A prikazuje spisak svih varijanti koje su imale procenat inhibicije veći od 2 standardne devijacije iznad srednje vrednosti za sve testirane varijante. SLIKA 21B prikazuje sve varijante koje su imale bilo kakvu značajnu aktivnost kod bilo kog od četiri davaoca. Najbolja identifikovana tačkasta mutacija bila je T100V sa procentom inhibicije od 53 /- 10%. Druga najbolja mutacija je bila V95W sa prosekom od 47%. Najbolja varijanta izvan VHCDR3 je bila VLR30 sa dve aminokiselinske supstitucije varijanti sa srednjom vrednošću proseka od 23%.

Kombinovane varijante su kreirane na osnovu podataka za pojedinačne varijante. Konstruisane su kombinacije koje su sadržavale izmene i u VH i u VL, koje su u nekim slučajevima, uključivale supstitucije u varijanti VL koja poseduje supstitucije G28S i A34S u CDR-L1 (brojčano označavanje po Kabatu), koje odgovaraju kombinaciji G5S A11S u CDR-L1, koja je najpre opisana u WO 2010/121140. Varijanta osnove konstrukcije VL sa G5S A11S supstitucijama označena je ovde kao VL-SS. Varijante antitela su ekspresovane, prečišćene i ispitane u ADAt inhibicionom testu, i testovima afiniteta vezivanja TNF-α. Rezultati za vezivanje ADAt dati su kao srednja vrednost od 2 davaoca. Vezivanje je procenjeno korišćenjem testa površinske plazmonske rezonance (Biacore). Rezultati su prikazani na Slici 22. Varijante Y32K/SS-R30T i Y32K/SS-R30I su predstavljale najbolju kombinaciju za smanjivanje vezivanja ADA, i zadržavale su afinitet za anti-TNF alfa.

SPISAK SEKVENCI

<110> ABBVIE BIOTHERAPEUTICS INC.

<120> POSTUPCI ZA IDENTIFIKOVANJE ANTITELA SA SMANJENOM IMUNOGENOŠĆU

<130> 381493-721WO (118133)

<140>

<141>

<150> 61/703,170

<151> 2012-09-19

<160> 16

<170> Patentna verzija 3.5

<210> 1

<211> 363

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski polinukleotid"

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski polipeptid"

<400> 2

<210> 3

<211> 321

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski polinukleotid"

<400> 3

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski polipeptid"

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski peptid" <400> 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski peptid" <400> 6

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski peptid" <400> 7

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski peptid" <400> 8

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski peptid" <400> 9

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski peptid" <400> 10

<210> 11

<211> 26

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski prajmer" <400> 11

ctcgaaaata ataaagggaa aatcag 26

<210> 12

<211> 17

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski prajmer" <400> 12

tggtagtgtg gggactc 17

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski prajmer"

<400> 13

ttagttgtgc tgcatcaggt tt 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski prajmer"

<400> 14

ggtcaccagt gttccctgac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski prajmer"

<400> 15

gtaggcgaca gggtcacaat 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<221> izvor

<223> /napomena = "Opis veštačke sekvence: sintetski prajmer"

<400> 16

agtccgtttg atctcgacct t 21

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Varijanta referentnog anti-TNF-α antitela ili vezujućeg fragmenta referentnog anti-TNF-α antitela, naznačena time, što referentno antitelo ili vezujući fragment sadrži šest regiona hipervarijabilne sekvence ("CDR-i") koji imaju aminokiselinske sekvence koje odgovaraju SEQ ID NO:5 (CDR-H1), SEQ ID NO:6 (CDR-H2), SEQ ID NO:7 (CDR-H3), SEQ ID NO:8 (CDR-L1), SEQ ID NO:9 (CDR-L2) i SEQ ID NO:10 (CDR-L3), pri čemu varijanta sadrži supstituciju Y2K u CDR-H1, pri čemu svih šest CDR-a zajedno sadrže do 8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa sekvencama CDR-a referentnog antitela ili vezujućeg fragmenta.

2. Varijanta iz zahteva 1, naznačena time, što varijanta dalje sadrži najmanje jednu od supstitucija teškog lanca (i) T6V u CDR-H3 i (ii) V1G u CDR-H3 i T6V u CDR-H3.

3. Varijanta iz zahteva 1 ili 2, naznačena time, što varijanta dalje sadrži najmanje jednu od supstitucija lakog lanca (i) G5S u CDR-L1 i A11S u CDR-L1, (ii) R7I u CDR-L1, (iii) G5S u CDR-L1, R7T u CDR-L1 i A11S u CDR-L1, i (iv) G5S u CDR-L1, R7I u CDR-L1 i A11S u CDR-L1.

4. Varijanta iz zahteva 1, naznačena time, što varijanta dalje sadrži najmanje jednu od supstitucija lakog lanca (i) R7I u CDR-L1 i (ii) R7T u CDR-L1.

5. Varijanta iz zahteva 1, naznačena time, što varijanta dalje sadrži najmanje jednu od supstitucija lakog lanca (i) G5S u CDR-L1, R7T u CDR-L1 i A11S u CDR-L1 i (ii) G5S u CDR-L1, R7I u CDR-L1 i A11S u CDR-L1.

6. Varijanta iz bilo kog od prethodnih zahteva, naznačena time, što referentno anti-TNF-α antitelo ili vezujući fragment referentnog anti-TNF-α sadrži fragment varijabilnog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:2 i fragment varijabilnog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:4.

7. Molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantu iz bilo kog od zahteva 1-6.

8. Ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantu iz bilo kog od zahteva 1-6.

9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži varijantu iz bilo kog od zahteva 1-6 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

10. Varijanta prema bilo kom od zahteva 1-6 za upotrebu u postupku lečenja imunskog poremećaja kod humanog pacijenta, pri čemu postupak obuhvata davanje pacijentu terapeutski efektivne količine varijante.

11. Varijanta za upotrebu prema zahtevu 10, naznačena time, što je imunski poremećaj odabran od: reumatoidnog artritisa, juvenilnog idiopatskog artritisa, psorijaznog artritisa, ankilozirajućeg spondilitisa, Kronove bolesti, plak psorijaze i aksijalnog spondiloartritisa.