KR20080017025A

KR20080017025A - 약학적 용도의 리파제

Info

Publication number: KR20080017025A
Application number: KR1020077028887A
Authority: KR
Inventors: 알란 스벤센; 킴 보르크; 피터 콜린 그레고리
Original assignee: 노보자임스 에이/에스; 솔베이 파머슈티컬스 게엠베하
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2008-02-25
Also published as: BRPI0612274A2; US20090047266A1; EP1896577A2; NO20080437L; NZ563693A; CN101208429A; AR053634A1; WO2006136159A2; RU2007149045A; CA2612648A1; TW200738256A; WO2006136159A3; AU2006261442A1; ZA200710643B; JP2008546394A; IL187511A0; MX2007015472A

Abstract

본 발명은 임의선택적으로는 프로테아제 및/또는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 포함하는 Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa) 리파제 변이체에 관한 리파제의 약학적 용도에 관한 것이다. 대표적인 의학적 징후에는 다음과 같은 것이 있다: 소화장애, 췌장 외분비 부족증(PEI), 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병 및/또는 제2형 당뇨병의 치료. 본 발명의 리파제는 인 비보에서 개선된 효능을 가지며, 프로테아제로 인한 파괴에 안정하며, 그리고/또는 담즙 염의 존재하에 안정하다.

리파제, 프로테아제, 아밀라제, 췌장 외분비 부족증

Description

약학적 용도의 리파제{LIPASES FOR PHARMACEUTICAL USE}

본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 포함하는 Thermomyces lanuginosus (동의어: Humicola lanuginosa) 리파제 변이체에 관한 리파제의 약학적 용도에 관한 것이다. 리파제는 프로테아제 및/또는 아밀라제와 배합하여 사용될 수 있다. 대표적인 의학적 징후에는 다음과 같은 것이 있다: 소화장애, 췌장 외분비 부족증(PEI), 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병 및/또는 제2형 당뇨병의 치료.

췌장 외분비 부족증의 치료를 위한 췌장 효소 보충제 형태로 시판중인 몇가지 의약들이 공지되어 있다. 이러한 제품의 활성 성분은 소화 효소인데, 주로 아밀라제, 리파제 및 프로테아제로서, 이들은 정상적으로는 췌장에서 만들어져서 소장의 상부(십이지장)로 분비되는 것들이다. 이러한 의약에 사용되는 효소는 주로 소나 스와인의 췌장에서 유래하는 것들이지만, 미생물 효소를 사용하여 시중에 판매되는 제품도 있고, 이러한 것들로서 예를 들면, Rhizopus oryzae 유래 리파제, Aspergillus oryzae 유래 프로테아제, 및 Aspergillus oryzae 유래 아밀라제를 함유하는 제품 Nortase^®가 있다.

US 5614189 (EP 600868)는 췌장 효소 대체 치료에서, 예를 들면, 낭포성 섬유증을 앓고 있는 환자의 치료에서 Humicola lanuginosa 유래 리파제의 용도를 기술하고 있다. 이러한 리파제는 Humicola lanuginosa DSM 4109에서 유래하는 것이고, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 아미노산 서열을 갖는 것이다.

WO 00/54799는 제1형 및 제2형 당뇨병의 치료시 지방분해, 단백질분해 및 녹말분해 활성을 갖는 생리학적으로 수용가능한 효소 혼합물의 사용을 기술하고 있다.

WO 02/060474는 소화불량의 치료시 Rhizopus delemar 유래 농축된 리파제, Aspergillus melleus 유래 중성 프로테아제, 및 Aspergillus oryzae 유래 아밀라제의 사용을 기술하고 있다.

WO 01/62280는 포유류에서 위장 장애를 치료 또는 예방하기 위한, 다작용성 교차결합제로 교차결합된 비진균류 리파제 결정, 프로테아제, 및 아밀라제의 사용을 기술하고 있는데, 여기에서 리파제 결정은 약 2.0 내지 9.0 범위의 pH에서 활성인 것을 특징으로 하는 것이다. 바람직한 리파제는 Pseudomonas에서 유래한 것이고, 바람직한 아밀라제는 Bacillus 또는 Aspergillus에서 유래한 것이며, 바람직한 프로테아제는 브로멜라인(bromelain), 파파인(papain), 또는 피신(ficin)이다.

EP 0828509는 췌장 외분비 부족증의 치료에 있어, 임의선택적으로는 특정 산 안정성 리파제 및/또는 프로테아제와 배합하여 특정 산안정성 아밀라제를 사용하는 것을 기술하고 있다. 바람직한 아밀라제는 Aspergillus niger에서 유래한 것이고, 바람직한 리파제는 Rhizopus arrhizus 또는 Rhizopus javanicus에서 유래한 것이 다.

WO 00/60063는 다수의 Humicola lanuginosa 리파제 변이체와, 이들의 계면활성제에서의 용도를 기술하고 있다. 본원의 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 갖는 리파제를 구체적으로 기술하였지만, 이의 약학적 용도에 관해서는 기술한 바가 없다.

WO 04/111216 및 EP 1428874는 모두 SEQ ID NO: 1의 변이체를 포함하는 SEQ ID NO: 2의 변이체를 기술하고는 있지만, 이의 약학적 용도에 관해서는 기술한 바가 없다.

당업계에는 대안적인, 바람직하게는 개선된, 약학적 용도를 위한 효소가 요구되고 있는 실정이다.

발명의 개요

본 발명은 신규 리파제, 아밀라제 및 프로테아제 등의, 약학적 용도를 위한 대안적인, 바람직하게는 개선된 효소를 제공한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 용도를 위한 효소는, 개선된 인 비보(in vivo) 및/또는 인 비트로(in vitro)에서의 효능; 개선된 pH-안정성 프로파일; 개선된 pH-활성 프로파일을 가지고; 프로테아제에 의한 파괴에 대해 안정하며; 담즙염의 존재하에 안정하며; 그리고/또는 감소된 알레르기유발성을 가진다.

본 발명은 의약으로서 용도를 위한 리파제에 관한 것이고, 여기에서 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 90% 동일성을 가지되, 단 리파제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269는 아니다. 리파제는 프로테아제, 및/또는 아밀라제와 배합하여 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 소화장애, PEI, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위한 의약의 제조시 이러한 리파제의 용도에 관한 것인데, 이들은 임의선택적으로는 프로테아제 및/또는 아밀라제의 사용을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한, 이러한 리파제와 함께, 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부가 물질, 임의선택적으로는 프로테아제 및/또는 아밀라제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 이러한 리파제의 치료 유효량을, 임의선택적으로는 프로테아제 및/또는 아밀라제와 함께 투여함에 의한, 소화장애, PEI, 췌장염(급성 및/또는 만성), 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료 방법에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

효소

본 발명은 리파제의 약학적 용도에 관한 것이고, 여기에서 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 90% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지거나, 포함하되, 단 리파제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269는 아닌 것을 특징으로 한다.

하나의 구체예에서, a) 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 포함하거나, b) 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269의 변이체인데, 여기에서 변이체란 25개 이하의 아미노산이 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와는 상이한 것으로서, 이때 (i) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여, 적어도 하나의 보존적인 치환 및/또는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하고; 그리고/또는 (ii) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여, 적어도 하나의 작은 결실을 포함하며; 그리고/또는 (iii) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여, 적어도 하나의 작은 N-말단 또는 C-말단 연장을 포함하며; 그리고/또는 (iv) 변이체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파제의 대립유전자 변이체이며; 그리고/또는 (v) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파제의 단편이다.

본 발명은 또한, 소화장애, PEI, 췌장염 (급성 및/또는 만성), 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위한 의약의 제조시 이러한 리파제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 리파제와 함께, 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부가 물질을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며, 뿐만 아니라, 이러한 리파제의 치료 유효량을 투여하는 것에 의한, 상기 언급한 질병의 치료 방법에 관한 것이다. SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 포함하는 리파제는 Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) DSM 4109의 리파제의 변이체 그 자체이다(SEQ ID NO: 2).

하기에 기술하는 것에 있어, 본 발명의 조성물, 방법 및 용도에서의 리파제는 "본 발명의 리파제"로 언급하도록 하겠다.

본 명세서에서, 리파제는 카르복실 에스테르 하이드롤라제 EC 3.1.1.-을 의미하는 것으로, 예컨대 EC 3.1.1.3 트리아실글리세롤 리파제, EC 3.1.1.4 포스포리파제 A1, EC 3.1.1.5 리소포스포리파제, EC 3.1.1.26 갈락토리파제, EC 3.1.1.32 포스포리파제 A1, EC 3.1.1.73 페루로일 에스터라제 활성을 포함하는 것이다. 하나의 구체예에서, 리파제는 EC 3.1.1.3 트리아실-글리세롤 리파제이다. 효소의 EC 번호는 캘리포니아 샌디에고 소재 아카데믹 프레스출판사의 NC-IUBMB 1992년판 효소 명명법을 참고하여 매겨진 것으로서, 상기 문헌은 각각 Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; 및 Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650의 증보 1-5판을 포함하는 것이다. 명명법은 규칙적으로 증보판이 나오고 업데이트된다: 참조: 예를 들면 월드와이드웹 http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

상기 정의된 본 발명의 리파제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 갖는 리파제를 포함하지 않는다. SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열은 이중 치환 R231T+R233N 면에서 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269과는 상이하다. 문구 SEQ ID NO: 1에서의 "이중 치환 R231T+R233N"은 SEQ ID NO: 1의 변이체를 말하는 것인데, 즉 위치 231 및 233에서의 아르지닌 잔기(Arg, 또는 R) 각각이, 트레오닌(Thr, 또는 T) 및 아스파라진(Asn, 또는 N)으로 각각 대체되었거나 치환된 변이체를 말하는 것이다. 용어 "위치"는 서열 목록 중 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 번호의 위치를 말하는 것이다. 이러한 두개의 치환은 하기에서도 정의되는 바와 같이 보존적인 치환이 아니다(왜냐하면 두개의 염기성 아미노산이 두개의 극성 아미노산으로 치환되었기 때문이다).

그러므로 하나의 구체예에서, 본 발명의 리파제는, SEQ ID NO: 1에 이중 치환인 R231T+R233N이 이루어진 것에 해당하는 서열인, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269로 구성되는 아미노산 서열을 가지지 않는다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여 보존적인 치환, 삽입, 결실, N-말단 연장, 및/또는 C-말단 연장을 포함하는 리파제, 및 리파제 단편은 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 이러한 분자로부터 제조될 수 있으며, 상기의 방법에는 영역지정 돌연변이생성, 랜덤 돌연변이생성, 컨센서스 변이체화 과정(EP 897985), 및 유전자 셔플링(WO 95/22625, WO 96/00343) 등이 있다. 이러한 리파제는 혼성체일 수 있거나, 키메릭 효소일 수도 있다.

본 발명의 변이체 리파제는 당연히 리파제 활성을 가진다. 하나의 구체예에서, 변이체 리파제의 특이적 활성은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 갖는 리파제의 특이적 활성의 적어도 50%이다. 또하나의 구체예에서, 변이체 리파제의 특이적 활성은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 갖는 리파제의 특이적 활성의 적어도 60, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 적어도 95%이다. 특이적 활성은 본원에서의 실시예 1 중 임의의 리파제 분석법을 사용하여 측정할 수 있지만, 바람직한 것은 실시예 1의 LU-분석방법을 사용하여 LU/mg 효소 단백질 단위로 측정한 것이고, 실시예 5에 기술된 바와 같은 아미노산 분석에 의해 효소 단백질 함량을 측정한 것이다.

본 발명의 리파제 변이체에 대해 허용되는 아미노산 변화는 중요하지 않은 것인데, 달리 말하면 이는 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 상당한 영향을 미치지 않는 보존적인 아미노산 치환 또는 삽입, 바람직하게는 소수의 이러한 치환 또는 삽입; 작은 결실; 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메싸이오닌 잔기의 연장; 작은 링커 펩티드 연장; 또는 전체 전하나 다른 작용기를 변화시킴으로써 정제를 촉진하는 작은 연장, 예컨대 폴리-히스티딘 트랙트, 항원 에피토프, 또는 결합 도메인의 연장을 말하는 것이다.

상기의 문단에서, 용어 "작은"은 독립적으로 25개까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 바람직한 구체예에서, 용어 "작은"은 독립적으로 24, 23, 22, 21까지의, 또는 20까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 또하나의 바람직한 구체예에서, 용어 "작은"은 독립적으로 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11까지의, 또는 10까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 용어 "작은"은 독립적으로 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2까지의, 또는 1까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 다른 구체예에서, 용어 "작은"은 독립적으로 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26까지의, 또는 25까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다.

본 발명의 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와는 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 이하의, 또는 11 이하의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖거나; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 이하의, 또는 1 이하의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖는데; 상기의 두 경우에 있어, 바람직하게는 상기에 정의한 바와 같이 SEQ ID NO: 1에서의 이중 치환 R231T+R233N은 배제한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와는 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27 이하의, 또는 26 이하의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖는데, 바람직하게는 상기에 정의한 바와 같이 SEQ ID NO: 1에서의 이중 치환 R231T+R233N은 배제한다.

보존적 치환의 예는 염기성 아미노산군(아르지닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산군(글루탐산 및 아스파트산), 극성 아미노산군(세린, 트레오닌, 글루타민 및 아스파라진), 소수성 아미노산군(루신, 아이소루신 및 발린 및 알라닌), 방향족 아미노산군(페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신), 및 소형 아미노산군(글리신, 알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 메싸이오닌)내에서 일어난다.

대안적으로, 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산군(아르지닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산군(글루탐산 및 아스파트산), 극성 아미노산군(글루타민 및 아스파라진), 소수성 아미노산군(루신, 아이소루신 및 발린), 방향족 아미노산군(페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신), 및 소형 아미노산군(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메싸이오닌)내에서 일어난다. 일반적으로 특정 활성을 변경하지 않는 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌(H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In , The Proteins, Academic Press, New York)에 설명된다. 가장 흔하게 발생하는 변화는 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly이다.

보존적 치환(하나의 극성 아미노산이 다른 극성 아미노산으로 교환되는 것)을 포함하는 본 발명의 변이체 리파제의 대표적인 예는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269의 변이체 Asn33Gln (N33Q)이다. 이는 본 발명의 목적을 위한 SEQ ID NO: 1의 가장 효과적인 비당화된 변이체이다(실시예 5). 본 발명은 또한 상기와 같은 변이체 리파제, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 -5-269, -4-269, -3-269, 및 2-269의 이에 해당하는 치환된 변이체에 관한 것이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 변이체 리파제에서 각 치환은 보존적이다.

작은 N-말단 연장을 포함하는 본 발명의 변이체 리파제의 예는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 -5-269 (-5 내지 +269), -4-269 (-4 내지 +269), 및 -3-269 (-3 내지 +269)인데, 각각 SPI.., PIR.., 및 IRR..의 N-말단을 갖는 것들이다(실시예 5 참조).

본 발명의 리파제는 또한 바람직하게는 SEQ ID NO: 2에 이중 치환 T231R+N233R이 이루어진 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 갖는 리파제의 대립유전자 변이체일 수 있다(필요한 변경을 가하여, SEQ ID NO:1에 대해 상기 정의한 바와같다).

용어 "대립유전자 변이체"는 본원에서 동일한 염색체의 유전자좌를 차지하는 유전자의 두 개 이상의 대안 형태 중 어떤 것을 나타낸다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하며, 집단 내에 다형성을 야기할 수 있다. 유전자 변이는 침묵할 수 있거나(코딩된 폴리펩티드에 변화 없음) 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 폴리펩티드의 대립유전자 변이체는 유전자의 대립유전자 변이체에 의하여 코딩된 폴리펩티드이다. 본 발명의 리파제의 대립유전자 변이체의 예는 Humicola lanuginosa의 상이한 균주로부터 유래한 리파제이다.

본 발명의 리파제는 또한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 갖는 리파제의 단편일 수 있는데, 이 때 단편은 리파제 활성을 가지는 것이다. 용어 "단편"은 본원에서 SEQ ID NO: 1의, 바람직하게는 이의 성숙한 일부의(이의 아미노산 1-269의), 아미노 및/또는 카르복실 말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실된 폴리펩티드로서 정의된다. 바람직하게는 작은 수의 아미노산이 결실된 것인데, '작은'의 의미는 상기에 설명한 바와 같다. 더욱 바람직하게는, 단편은 적어도 244, 245, 246, 247, 248, 249, 또는 적어도 250 아미노산 잔기를 함유한다. 가장 바람직하게는, 단편은 적어도 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 또는 적어도 268 아미노산 잔기를 함유한다. 다른 구체예에서, 단편은 적어도 239, 240, 241, 242, 또는 적어도 243 아미노산 잔기를 함유한다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269의 단편인 본 발명의 변이체 리파제의 예는, N-말단에 VSQ를 갖는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 2-269 (+2 내지 +269)의 아미노산 서열을 갖는 변이체이다(실시예 5 참조).

본 발명은 또한, 하기 (a) 및 (b) 뿐 아니라, (a) 및 (b)의 리파제의 본 발명에 따른 해당 조성물, 방법 및 용도에 관한 것이다:

(a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 99.4% 동일성을 갖는, 의약으로서의 용도를 위한 리파제;

(b) 의약으로서의 용도를 위한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 포함하는 리파제, 또는 이의 변이체로서, 이때 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269과는 25개 이하의 아미노산이 상이한 것이고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여 변이체는

(i) 적어도 하나의 보존적 치환 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입; 및/또는

(ii) 적어도 하나의 작은 결실; 및/또는

(iii) 적어도 하나의 작은 N- 또는 C-말단 연장을 포함하는 것이며; 그리고/또는

변이체는

(iv) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 갖는 리파제의 대립유전자 변이체; 및/또는

(v) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 갖는 리파제의 단편이되, 단 변이체는 임의선택적으로 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269이지는 않은 것을 특징으로 하는 것이다. 동일성의 %는 하기에 기술되는 바와 같이 결정된다.

하기의 아미노산 서열을 갖는 리파제가 본 발명의 리파제의 바람직한 예이다: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 +1 내지 +269, (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 -5 내지 +269, (iii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 -4 내지 +269, (iv)SEQ ID NO: 1의 아미노산 -3 내지 +269, (v) SEQ ID NO: 1의 아미노산 -2 내지 +269; (vi) SEQ ID NO: 1의 아미노산 -1 내지 +269, (vii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 +2 내지 +269, 및 (viii) 상기 (i)-(vii)의 리파제 중 둘 이상의 임의의 혼합물. 하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 용도를 위한 리파제는 상기의 (i), (ii)의 리파제, 및 (i)과 (ii)의 임의의 혼합물 중에서 선택된다. 바람직한 (i)과 (ii)의 혼합물은 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%의 리파제 (i)를 포함하는데, 이 때 %는 실시예 5에 기술된 에드만 방법을 사용하여 N-말단 서열분석에 의해 결정된 것이다. 기타 바람직한 혼합물은 다음과 같다: (a) 35-75%, 바람직하게는 40-70%, 더욱 바람직하게는 45-65%의 리파제 (ii)를 포함하는 조성물; (b) 20-60%, 바람직하게는 25-55%, 더욱 바람직하게는 30-50%, 가장 바람직하게는 35-47%의 리파제 (i)를 포함하는 조성물; (c) 30% 이하, 바람직하게는 25% 이하, 더욱 바람직하게는 20% 이하, 가장 바람직하게는 16% 이하의 리파제 (vii)를 포함하는 조성물; 및 (d) (a), (b) 및/또는 (c)의 임의의 배합물, 예컨대 45-65%의 리파제 (ii), 35-47%의 리파제 (i), 16% 이하의 리파제 (vii)를 포함하는 조성물.

본 발명은 또한, 특히 본원에서 정의된 바와 같은 약학적 용도를 위한, 상기에 기술한 바와 같은 분리된 리파제 (ii)-(vii)와, 상기 언급된 리파제 혼합물 및 리파제 조성물 중 임의의 것에 관한 것이다.

또다른 구체예에서, 본 발명의 리파제는 추가적인 리파제와 배합하여 사용된다. 추가적인 리파제의 예는 포유류 리파제, 미생물 리파제가 있다. 바람직한 포유류 리파제는 예를 들면 스와인이나 소의 췌장효소와 같은 췌장추출물이다. 췌장효소는 코팅되지 않은(정제되지 않은) 생성물의 형태로 사용될 수 있거나, 제형된 제품의 형태로(위산에 대한 내성을 제공하기 위해 장코팅된 형태로) 사용될 수 있거나, 비작용적으로 코팅된(코팅되었지만 위산에 대한 내성을 제공하지는 않는) 형태로 사용될 수 있다. 췌장효소는 잠재적으로 췌장 프로테아제 및/또는 췌장 아밀라제와 같은 추가의 효소 활성 성분을 포함할 수도 있다. 미생물 리파제는 예를 들면 박테리아 또는 진균류 리파제에 기초하거나 이로부터 유래할 수 있다. 박테리아 리파제는 예를 들면 Bacillus 또는 Pseudomonas에서 유래할 수 있고, 진균류 리파제는 예를 들면 Rhizopus, Candida, 또는 Humicola 균주, 예컨대 Rhizopus delemar, Rhizopus javanicus , Rhizopus oryzae, 또는 Humicola lanuginosa에서 유래할 수 있으며, 특히 Amano Pharmaceuticals, Japan.에서 시판중인 제품인 리파제 D2^TM 또는 리파제 D Amano 2000^TM(리파제, EC 3.1.1.3)일 수 있다.

본 발명의 리파제는 하기에 기술되는 바와 같이, 아밀라제와 함께, 또는 아밀라제 없이, 프로테아제와 배합하여 사용될 수 있다. 용어 "프로테아제"는 본원에서 펩티드 결합을 가수분해하는 효소로서 정의된다. 여기에는 EC 3.4 효소군(이의 13개 하위군 각각을 포함하는 것으로, 이들 효소는 하기에서 "EC 3.4.-.- 군에 속하는" 것으로 언급된다)에 속하는 임의의 효소가 포함된다.

프로테아제의 예는 포유류 프로테아제, 및 미생물 프로테아제가 있다. 바람직한 포유류 프로테아제는 예를 들면 스와인이나 소의 췌장효소과 같은 췌장 추출물이다. 췌장효소는 코팅되지 않은(정제되지 않은) 생성물의 형태로 사용될 수 있거나, 제형된 제품의 형태로(장코팅된 형태 또는 비작용적으로 코팅된 형태) 사용될 수 있다. 췌장효소는 잠재적으로 췌장 리파제, BSSL(담즙염 자극 리파제) 및/또는 췌장 아밀라제와 같은 추가의 효소 활성 성분을 포함할 수도 있다.

미생물 프로테아제는 예를 들면 박테리아 또는 진균류 균주에 기초하거나 이로부터 유래된 것일 수 있다. 프로테아제는 특히 Aspergillus 균주, 예컨대 spergillus oryzae 또는 Aspergillus melleus로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 Amano Pharmaceuticals, Japan에서 시판중인 제품 Prozyme 6^TM(중성, 알칼리성 프로테아제 EC 3.4.21.63)일 수 있다. 박테리아 프로테아제의 예는 Bacillus 및 Nocardiopsis 유래 프로테아제, 예컨대 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274의 아미노산 서열을 갖는 Bacillus licheniformis 프로테아제, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188의 아미노산 서열을 갖는 Nocardiopsis sp. 프로테아제, 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188의 아미노산 서열을 갖는 Nocardiopsis dassonviellei subsp. dassonvillei 프로테아제이다. SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274의 프로테아제는 예를 들면, [덴마크 특허출원 번호 2005 00930, 발명의 명칭:"Proteases for Pharmaceutical Use", 출원일: 2005년6월24일, 출원인: 솔베이 파머슈티컬스 게엠베하 및 노보자임스 에이/에스]에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. SEQ ID NO: 4-5의 아미노산 1-188의 프로테아제는 예를 들면, WO 2001/58276, 또는 WO 2004/111224에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 프로테아제는 (i) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274, (ii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖거나, 포함하는 프로테아제와 적어도 70% 동일하다. 추가의 바람직한 (i),(ii), 또는 (iii)의 구체예에서, 동일성의 정도는 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%이다. 대안적인 (i), (ii), 또는 (iii)의 구체예에서, 동일성의 정도는 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 적어도 69%이다.

본 발명의 리파제는 상기 기술한 바와 같이 프로테아제와 함께 또는 프로테아제 없이, 아밀라제와 배합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 명세서에서, 아밀라제란 녹말 및 기타 선형 및 분지형 올리고당류 및 다당류의 엔도-가수분해를 촉매하는 효소를 말한다. 녹말의 아밀로스 부분에는 1,4-알파-글루코시딕 결합이 풍부하지만, 아밀로펙틴 부분에는 1,4-알파-뿐 아니라, 1,6-알파-글루코시딕 결합도 함유하는 측쇄가 훨씬 더 많다. 하나의 구체예에서, 아밀라제는 EC 3.2.1.1군에 속하는 효소이다.

하나의 구체예에서, 아밀라제는 포유류 아밀라제 또는 미생물 아밀라제이다. 포유류 아밀라제의 예는 예를 들면 스와인이나 소의 췌장효소과 같은 췌장 추출물이다. 췌장효소는 코팅되지 않은(정제되지 않은) 생성물의 형태로 사용될 수 있거나, 제형된 제품의 형태로(장코팅된 형태 또는 비작용적으로 코팅된 형태) 사용될 수 있다. 췌장효소는 잠재적으로 췌장 프로테아제 및/또는 췌장 리파제와 같은 추가의 효소 활성 성분을 포함할 수도 있다. 미생물 아밀라제는 박테리아 또는 진균류 균주, 예컨대 Bacillus , Pseudomonas , Aspergillus, 또는 Rhizopus에 기초하거나 이로부터 유래한 것일 수 있다.

아밀라제는 특히 Aspergillus 균주, 예를 들면 Aspergillus niger , Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus melleus 유래의 것일 수 있고, 예컨대 Amano Pharmaceuticals, Japan이 시판중인 제품인 Amylase A1^TM이거나, Extract-Chemie, Germany이 시판중인 제품인 Aspergillus melleus 유래 Amylase CE^TM일 수 있다.

바람직한 아밀라제는 (i) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481(예컨대 상기 서열의 아미노산 1-481, 1-484, 또는 1-486), SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481, 및/또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 포함하는 아밀라제이다. 바람직한 구체예에서, 아밀라제는 (i) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483 중 하나와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 포함하는 아밀라제이다. SEQ ID NO: 6-8의 아밀라제는 동시 계류중인 [덴마크 특허출원 번호 2005 00931, 발명의 명칭:"Amylases for Pharmaceutical Use", 출원일: 2005년6월24일, 출원인: 솔베이 파머슈티컬스 게엠베하 및 노보자임스 에이/에스]에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 추가의 바람직한 (i), (ii), 또는 (iii)의 구체예에서, 동일성의 정도는 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%이다. 다른 (i), (ii), 또는 (iii)의 구체예에서, 동일성의 정도는 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 적어도 69%이다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 프로테아제 및/또는 아밀라제와 배합한 리파제에 관한 것으로서, 여기에서 (i) 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 2-269를 포함하고; (ii) 프로테아제는 a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제, b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188를 갖는 프로테아제; 및 c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제로 구성된 군 중에서 선택되는 프로테아제이며; (iii) 아밀라제는 a) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제, b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제, 및 c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제로 구성되는 군 중에서 선택되는 아밀라제이다.

본 발명의 목적을 위해 특히 바람직한 효소의 배합은 다음과 같다: (i) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (ii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (iii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (iv) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 상기 서열의 아미노산 1-481, 1-484, 또는 1-486)와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (v) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (vi) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (vii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 상기 서열의 아미노산 1-481, 1-484, 또는 1-486)와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (viii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (ix) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (x) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제(예컨대 상기 서열의 아미노산 1-481, 1-484, 또는 1-486)와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (xi) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (xii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (xiii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 상기 서열의 아미노산 1-481, 1-484, 또는 1-486)와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (xiv) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; 및 (xv) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제.

다른 바람직한 효소의 배합은 다음과 같다: (i) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (ii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (iii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (iv) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (v) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (vi) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (vii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (viii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (ix) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (x) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (xi) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (xii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (xiii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (xiv) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; 및 (xv) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제. (i)-(xv)의 바람직한 구체예에서, 각 동일성의 정도는 독립적으로, 적어도 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%이다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 프로테아제 및/또는 아밀라제와 함께인 리파제의 효소 배합물에 관한 것으로서, 여기에서 (i) 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 단 리파제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269가 아니고; (ii) 프로테아제는 a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제, b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제, 및 c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제로 구성되는 군 중에서 선택되는 프로테아제와 적어도 70% 동일성을 갖는 것이고; 그리고/또는 (iii) 아밀라제는 a) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제, b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제, 및 c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제로 구성된 군 중에서 선택되는 아밀라제와 적어도 70% 동일성을 갖는 것이다. 이 구체예에서, 리파제는 바람직하게는 a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 포함하는 리파제, 또는 b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269의 변이체인 리파제인데, 여기에서 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와는 25개 이하의 아미노산이 상이한 것으로서, 이때 (i) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여, 적어도 하나의 보존적인 치환 및/또는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하고; 그리고/또는 (ii) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여, 적어도 하나의 작은 결실을 포함하며; 그리고/또는 (iii) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여, 적어도 하나의 작은 N-말단 또는 C-말단 연장을 포함하며; 그리고/또는 변이체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파제의 대립유전자 변이체이며; 그리고/또는 (v) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파제의 단편이다.

일반적으로, 리파제, 프로테아제 및 아밀라제 효소(이후부터는 "효소"로 통칭하며, 본 발명의 효소라 함)는 자연적 또는 야생형 효소(동물, 구체적으로는 포유류, 예를 들면 사람 또는 스와인 효소로부터 수득한 것, 식물로부터 수득한 것, 또는 미생물로부터 수득한 것)일 수 있지만, 희망하는 효소 활성을 보이는 상기 야생형 효소의 임의의 돌연변이, 변이체, 단편 등일 수 있을 뿐만 아니라, 셔플, 혼성화, 또는 키메릭 효소 및 컨센서스 효소와 같은 합성 효소일 수도 있다.

보다 구체적인 구체예에서, 효소는 사람을 포함한 동물에 노출된 경우 감소된 면역 반응을 불러일으키도록 고안된 저-알레르기유발성 변이체이다. 용어 "면역 반응"이란 효소에 노출된 동물의 면역계에 의한 임의의 반응으로서 이해되어야 한다. 면역 반응의 한 유형으로는 노출된 동물에서 증가된 수준의 IgE를 유도하는 알레르기 반응이 있다. 저-알레르기유발성 변이체는 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 면역 반응에 관여하는 효소의 일부 또는 에피토프를 감추는 중합체 잔기와 효소를 컨쥬게이팅할 수 있다. 중합체와의 컨쥬게이팅은 효소와 중합체의 인 비트로 화학적 커플링을 포함할 수 있는데, 예컨대 WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, 및/또는 WO 99/00489에 기술된 바와 같다. 컨쥬게이팅은 추가로 또는 대안적으로, 효소와 중합체와의 인 비보 커플링을 포함할 수 있다. 이러한 컨쥬게이팅은 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 유전자 조작하고, 효소내에 부가적인 당화 자리를 코딩하는 컨센서스 서열을 삽입한 뒤, 효소를 당화할 수 있는 숙주에서 효소를 발현시키는 것을 통해 달성할 수 있다. 참조: 예를 들면 WO 00/26354. 다른 저-알레르기유발성 변이체를 제조하는 방법은 효소가 스스로 올리고머화할 수 있도록 유발하게, 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 유전자 조작하는 것인데, 이렇게 하면, 효소 단량체가 다른 효소 단량체의 에피토프를 덮을 수 있어서, 결국은, 올리고머의 항원성을 낮추게 되는 효과가 발생한다. 이러한 생성물 및 이의 제조방법은 예를 들면 WO 96/16177에 기술되어 있다. 면역 반응에 관여하는 에피토프는 WO 00/26230 및 WO 01/83559에 기술되어 있는 파지 디스플레이 방법, 또는 EP 561907에 기술된 랜덤 어프로치 방법과 같은 다양한 방법에 의해 확인할 수 있다. 일단 에피토프를 확인한 후에는, 이의 아미노산 서열을 영역지정 돌연변이생성(예를 들면, WO 00/26230, WO 00/26354 및/또는 WO 00/22103 참조)과 같은 공지된 유전자 조작 기술에 의해 효소의 면역학적 성질을 변경시키도록 변화를 가할 수 있고 그리고/또는 중합체와 컨쥬게이팅시키면 에피토프를 감추기 위하여 중합체로 하여금 에피토프에 대해 충분한 근접성을 부여할 수 있다.

구체적인 예에서, 효소는 (i) pH 2-3에서, 바람직하게는 pH 3-7에서, 더욱 바람직하게는 pH 4-6에서 안정하고; (ii) pH 4-9에서, 바람직하게는 4-8에서 활성이며; (iii) 펩신 및 다른 소화 프로테아제(예컨대 췌장 프로테아제, 즉 주로 트립신 및 키모트립신)에 의한 파괴에 대해 안정하며; 및/또는 (iv) 담즙 염의 존재하에서 안정하고/안정하거나 활성이다.

본 발명의 리파제는 바람직하게는 담즙 염의 존재하에서 안정한데, 예를 들면, 0.1 내지 50 mM 담즙 염, 바람직하게는 0.5 내지 20 mM 담즙 염, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 mM 담즙 염의 존재하에서 안정하다. 담즙 염 존재하의 리파제의 안정성은 예를 들면, 담즙 염의 존재하에 인큐베이션 한 후의 잔류 리파제 활성으로서 측정할 수 있다. 담즙 염의 존재하에 리파제 안정성을 측정하기 위한 적당한 방법은 실시예 부분에 주어진다(1.8 mM 담즙 염의 존재하에 pH 6.5 및 25℃에서 60분간 측정). 바람직하게는, 본 발명의 리파제의 잔류 리파제 활성은, 분석방법을 바람직하게는 1.8 mM 담즙 염 존재하에 pH 6.5 및 25℃에서 60분간 인큐베이션함으로써 수행함에 의하면, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 대조 리파제의 해당 잔류 활성보다 적어도 1.1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6 또는 적어도 2.7 인자 더 높다.

본 발명의 리파제는 소화 프로테아제, 특히 펩신의 존재하에, 더욱 구체적으로는 pH 3.0에서 더욱더 바람직하게는 안정하다. pH 3.0에서, 그리고 포사인 펩신의 존재하에 리파제 안정성을 측정하기 위한 적당한 방법은 실시예 부분에 주어진다(pH 3.0 및 대기 온도, 75 ㎍/mL 포사인 펩신의 존재하에 3시간 동안 측정). 바람직하게는 본 발명의 리파제의 잔류 리파제 활성은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 대조 리파제의 해당 잔류 활성보다 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 또는 적어도 4.5 인자 더 높다.

용어 "배합된"은 리파제, 프로테아제 및/또는 아밀라제의 본 발명에 따른 배합 사용을 언급하는 것이다. 배합 사용은 동시에, 겹쳐서, 또는 순차적일 수 있는데, 상기 세가지 용어는 의사가 처방한 처방전에 따라 일반적으로 이해되는 것과 같은 용어이다.

용어 "동시에"는 효소들이 동시에 활성인 조건 하에 있는 것을 말하는데, 예를 들면 동시에 하나 이상의 별개의 약학적 제품으로서 투여되는 것을 말하거나, 또는 이들 성분이 하나의 동일한 약학적 조성물로 투여되는 것을 말한다.

용어 "순차적"은 하나 및/또는 두개의 효소가 먼저 작용한 다음, 두번째 및/또는 세번째 효소가 순차적으로 작용하는 경우를 말한다. 순차적인 작용은 예를 들면, 상이한 방출 시간을 수득하고, 개선된 제품 안정도를 제공하거나, 효소 용량을 최적화하기 위한 측면에서, 미지의 효소를 별개의 약학적 제형물로서 원하는 간격을 두고 투여함으로써, 또는 미지의 효소가 상이하게 제형되는(구획화되는) 하나의 약학적 조성물로서 투여함으로써 수득할 수 있다.

용어 "겹쳐서"는 효소 활동 기간이 완전히 동일한 것도 아니고 완전히 순차적인 것도 아닌, 즉 효소 중 두가지가, 또는 효소 모두가 활성인 특정한 기간이 존재하는 경우를 말한다.

단수의 표현은, 예를 들면 본 발명의 프로테아제, 리파제, 및/또는 아밀라제가 명세서에 사용될 때 복수의 개체를 의미한다. 구체예에서, "하나의"라는 표현은 "하나 이상의", 또는 "적어도 하나"를 의미하며, 이는 또다시 2, 3, 4, 5 등을 의미한다.

두 아미노산 서열 간 또는 두 뉴클레오티드 서열 간의 연관성은 매개변수 "동일성"으로 설명된다.

본 발명의 목적을 위해서, 두 아미노산 서열 간의 정렬은 EMBOSS 패키지 (http://emboss.org) 버전 2.8.0의 니들 프로그램을 사용하여 결정된다. 니들 프로그램은 문헌(Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453)에 설명된 글로벌 정렬 알고리즘을 실행한다. 사용된 치환 매트릭스는 BLOSUM62이고, 갭 오프닝 벌점은 10이며, 갭 연장 벌점은 0.5이다.

본 발명의 아미노산 서열("발명 서열"; 예를 들면 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269)과 다른 아미노산 서열("외래 서열"; 예를 들면 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269) 간의 동일성의 정도는 두 서열의 정렬에서 정확하게 일치된 것의 수를 가장 짧은 것이 어떤 것이든지 "발명 서열"의 길이 또는 "외래 서열"의 길이로 나누어 계산한다. 결과는 동일성 퍼센트로 표현된다.

정확한 일치는 "발명 서열"과 "외래 서열"이 오버랩의 동일한 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 가질 때 발생한다(하기 정렬 예에서 이것은 "｜"로 나타낸다). 서열의 길이는 서열의 아미노산 잔기의 수이다(예를 들면, SEQ ID NO: 1의 경우 269).

순수한 이론적인 하기 정렬 예에서, 오버랩은 서열 1의 아미노산 서열 "HTWGER-NL"; 또는 서열 2의 아미노산 서열 "HGWGEDANL"이다. 예에서, 갭은 "-"로 표시된다.

이론적인 정렬 예

따라서, 서열 1 및 서열 2의 동일성 %는 6/12=0.5로서, 50%에 해당한다.

하나의 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269을 갖는, 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269에 대한 폴리펩티드의 아미노산 서열의 동일성 %는 i) BLOSUM62 치환 매트릭스, 10의 갭 오프닝 벌점, 및 0.5의 갭 연장 벌점을 사용한 니들 프로그램을 사용하여, 두 아미노산 서열을 정렬하고; ii) 정렬에서 정확히 일치하는 것의 수를 센 다음; iii) 정확히 일치하는 것의 수를 두 아미노산 서열 중 짧은 것의 길이로 나눈 다음; iv) iii)의 몫을 %로 전환하는 단계에 의해 결정한다. 예컨대, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188과 같은 본 발명의 다른 서열에 대한, 또는 서열을 갖는 것에 대한 동일성 %는 동일한 방식으로 계산한다.

대안적으로 두 아미노산 서열 간의 동일성의 정도는 Needleman-Wunsch alignment(즉, 글로벌 정렬)인, 프로그램 "align"에 의해 결정할 수 있다. 디폴트 기록 매트릭스 BLOSUM50를 사용하여 프로그램에 의해 서열을 정렬한다. 처음 나타난 갭의 잔기에 대한 벌점은 12이고, 그 다음에 나타난 갭의 잔기에 대한 벌점은 2이다. Needleman-Wunsch 알고리즘은 [Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453]에 기재되어 있고, 정렬 프로그램은 [Myers and W. Miller in "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17]에 기재되어 있다. "Align"은 FASTA package version v20u6의 일부이다(참조: W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, 및 W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98).

본 발명의 임의의 효소의 샘플, 또는 시험, 서열과, 특정한 서열 간의 동일성의 정도는 다음과 같이 결정할 수 있다: 두 서열을 "align" 프로그램을 사용하여 정렬한다. 정렬에서 완전히 일치하는 것의 수("N-완전한 일치")를 결정한다(완전한 일치란 정렬의 동일한 위치에 동일한 아미노산 잔기가 있는 것을 의미한다). 두 정렬된 서열 중 일치하는 길이를 결정하는데, 즉, 존재하는 경우 정렬에 의해 발생된 트레일링 및 리딩 갭을 포함한 정렬내 총 아미노산 수("N-오버랩")도 결정한다. 동일성의 정도는 "N-완전한 일치" 및 "N-오버랩" 간의 비율로서 계산된다(동일성 %로 전환하기 위해서, 100을 곱한다).

본 발명의 임의의 효소의 샘플, 또는 시험, 서열과, 특정한 서열 간의 동일성의 정도는 다음과 같이 결정할 수 있다: 두 서열을 "align" 프로그램을 사용하여 정렬한다. 정렬에서 완전히 일치하는 것의 수("N-완전한 일치")를 결정한다(완전한 일치란 정렬의 동일한 위치에 동일한 아미노산 잔기가 있는 것을 의미한다). 샘플 서열의 길이(아미노산 잔기의 수)를 결정한다("N-샘플"). 동일성의 정도는 "N-완전한 일치" 및 "N-샘플" 간의 비율로서 계산된다(동일성 %로 전환하기 위해서, 100을 곱한다).

본 발명의 임의의 효소의 샘플, 또는 시험, 서열과, 특정한 서열 간의 동일성의 정도는 다음과 같이 결정할 수 있다: 두 서열을 "align" 프로그램을 사용하여 정렬한다. 정렬에서 완전히 일치하는 것의 수("N-완전한 일치")를 결정한다(완전한 일치란 정렬의 동일한 위치에 동일한 아미노산 잔기가 있는 것을 의미한다). 특정 서열의 길이(아미노산 잔기의 수)를 결정한다("N-특정서열"). 동일성의 정도는 "N-완전한 일치" 및 "N-특정서열" 간의 비율로서 계산된다(동일성 %로 전환하기 위해서, 100을 곱한다).

바람직하게는, 오버랩(상기 정의된 바와 같은 "N-오버랩"으로서, 상기 정의된 바와 같이 특정 서열의 아미노산 수("N-특정서열")로 나누고, 100을 곱한 것)은 특정 서열의 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%이다. 이것은 샘플 서열을 특정 서열에 대해 정렬했을 때, 특정 서열의 아미노산의 적어도 20% (바람직하게는 25-95%)가 오버랩에 포함된 채로 끝남을 의미한다.

또는 달리, 오버랩은 특정 서열의 적어도 20%(상기 정의된 바와 같은 "N-오버랩"으로서, 상기 정의된 바와 같이 "N-샘플"로 나누고, 100을 곱한 것), 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%이다. 이것은 특정 서열에 대해 정렬했을 때, 샘플 서열의 아미노산의 적어도 20% (바람직하게는 25-95%)가 오버랩에 포함된 채로 끝남을 의미한다.

본 발명의 효소의 활성은 적당한 임의의 분석방법을 사용하여 측정할 수 있다. 일반적으로는, 미지의 효소에 맞추어, pH-분석방법 및 온도-분석방법이 사용될수 있다. pH값 분석의 예는 pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12가 있다. 온도 분석의 예에는 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 또는 95℃가 있다. 바람직한 pH값 및 온도는 생체내 범위인데, 예컨대 4, 5, 6, 7, 또는 8의 pH값 및, 30, 35, 37, 또는 40℃의 온도가 그것이다.

적당한 효소 분석방법의 예들은 실시예 부분에 포함되어 있다. 다른 예로는 프로테아제 및 아밀라제 활성에 대한 방법으로 FIP 또는 Ph.Eur. 분석방법이 있다. 이들 분석방법들은, 예를 들면 각각 동시계류중인 덴마크 특허출원 DK 2005 00930 및 DK 2005 00931에 기술되어 있다.

의약

본 발명의 명세서에서, 용어 "의약"은 질병의 징후를 치료, 예방 및/또는 완화시키는, 바람직하게는 질병의 징후를 치료 및/또는 완화시키는 화합물, 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 의약은 전문의약품일 수도 있고, 일반의약품일 수도 있는 것이다.

약학적 조성물

본 발명의 효소의 분리, 정제 및 농축은 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 추출, 방사건조, 증발, 또는 침전을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상의 절차에 의해 발효액으로부터 효소를 회수할 수 있고, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크로마토포커싱, 및 크기 배제 크로마토그래피), 전기영동 절차(예를 들면, 예비 등전 포커싱(preparative isoelectric focusing)), 용해도차(예를 들면, 황산 암모늄 침전), SDS-PAGE, 또는 추출(참조: 예를 들면, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)을 포함하나 이에 제한되지 않는 공지된 각종 절차에 의해 효소를 추가로 정제할 수 있다.

그 예로, SEQ ID NO: 1의 리파제는 예를 들면, 미국특허 제5,869,438호(여기에서의 SEQ ID NO: 1은 본원의 SEQ ID NO: 2를 코딩하는 DNA 서열이다)를 근거로 하여 제조될 수 있는데, 즉 미국특허의 SEQ ID NO: 1의 변형인 DNA 서열을 적당한 숙주 세포내에서 재조합 발현시키는 것에 의해 제조될 수 있고, 상기 변형은 본원에서의 SEQ ID NO: 1과 2 간의 아미노산 차이를 반영하는 것이다. 이러한 변형은 당업계에 공지되어 있는 바와도 같이 영역지정 돌연변이생성으로 만들 수 있다.

하나의 구체예에서, 각 효소의 농축된 고체 또는 액체 제조물은 따로 제조된다. 이러한 농축물은 또한 적어도 일부는 하기에서 자세히 설명하는 바와 같이 따로 제형될 수 있다.

또다른 구체예에서, 효소는 고체 농축물의 형태로 본 발명의 약학적 조성물에 혼입된다. 효소는 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 각종 방법에 의해 고체 상태로 될 수 있다. 예를 들어, 고체 상태는 결정질, 즉 효소 분자가 매우 규칙적인 형태로 배열되어 있는 형태이거나, 침전물, 즉 효소 분자가 결정질 보다는 덜 규칙적인 상태로 배열되거나, 또는 불규칙적으로 배열된 형태일 수 있다.

결정화는 예를 들면, 효소의 pI 근처의 pH와, 저전도율에서, 예를 들면, EP 691982에도 기술되어 있는 바와 같이 10 mS/cm 또는 그 미만에서 수행할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 용도를 위한 리파제는 결정질 리파제인데, 이것은 EP 600868 B1의 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조될 수 있는 것이다. 리파제 결정은 WO 2006/044529에 기술되어 있는 바와 같이 추가로 교차결합될 수 있다.

염, 예컨대 황산 암모늄, 및/또는 황산 나트륨; 유기 용매, 예컨대 에탄올, 및/또는 이소프로판올; 또는 폴리머, 예컨대 PEG(폴리에틸렌글리콜)로 침전시키는 것을 포함하는 각종 침전법이 당업계에 공지되어 있다. 또는 달리, 효소는 당업계에 공지된 각종 방법, 예를 들면, 동결건조, 증발(예를 들면 감압하에서의 증발), 및/또는 방사건조에 의해 용매(전형적으로는 물)를 제거함으로써, 용액으로부터 침전시킬 수도 있다.

또다른 구체예에서, 효소 중의 고체 농축물은 고체 농축물 중 총 단백질 함량을 기준으로 적어도 50%(w/w)의 활성 효소 단백질 함량을 가진다. 또다른 구체예에서, 고체 농축물의 총 단백질 함량을 기준으로 활성 효소 단백질 함량은 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 적어도 95% (w/w)이다. 단백질 함량은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 측정할 수 있는데, 예를 들자면 BIO-RAD사의 GS-800 교정농도계를 사용하여 코마시-염색된 SDS-PAGE 겔을 농도계로 스캐닝함으로써; 그리고 Roche사가 시판하고 있는 상업적 키트인, 예컨대 Protein Assay ESL, order no. 1767003을 사용함으로써; 또는 WO 01/58276의 실시예 8에 기술된 바와 같은 방법을 기초로 하여 측정할 수 있다.

바람직하게는, 리파제 효소 단백질은, 코마시-염색된 SDS-PAGE 겔을 농도계로 스캐닝하여 측정한 결과, 본 발명에 따른 용도를 위한, 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 또는 적어도 97%의 고체 리파제 농축물의 단백질 스펙트럼으로 구성된다. Aspergillus에서 발현되고 실시예 5에서 설명되는 바와 같은 SEQ ID NO: 1의 여러가지 N-말단의 혼합물을 포함하는 리파제에 대해서는, SDS-PAGE 상의 해당 밴드는 34-40 kDa의 분자량에 상응하는 곳에 위치한다. SEQ ID NO: 1의 비당화된 변이체인 N33Q에 대해서는, 해당 밴드는 약 30 kDa에 위치한다.

본 발명의 약학적 조성물은, 효소, 바람직하게는 농축된 효소 제조물 형태, 더욱 바람직하게는 고체 농축물 형태의 효소를, 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부가 또는 보조 물질, 예컨대 (i) 적어도 하나의 담체 및/또는 부형제; 또는 (ii) 적어도 하나의 담체, 부형제, 희석제, 및/또는 보조제와 함께 포함한다. 임의선택적인 다른 성분의 비제한 적인 예로는, 모두 약학적으로 수용가능한 것으로, 붕해제, 윤활제, 완충제, 습윤제, 보존제, 향료, 용매, 용해제, 현탁제, 유화제, 안정제, 추진제, 및 베히클이 있다.

일반적으로, 문제되는 의학적 징후에 따라서, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 모든 투여 방식에 알맞게 디자인될 수 있는데, 바람직하게는 장내 투여(소화관을 통해)하는 것을 포함한다. 그러므로 조성물은 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태, 예를 들면 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 크림, 거품, 용액, 좌약, 주사, 흡입, 겔, 미소구체, 로션, 및 에어로졸일 수 있다. 의료업계 종사자라면 가장 적당한 투여 경로를 선택해야 할 것을 잘 알 것이고, 잠재적으로 위험하거나 달리 유리하지 않은 투여 경로는 피할 수 있을 것이다.

그러므로 하기의 방법 및 부가 물질은 또한 주로 예시적인 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키고자 하는 것은 아니다.

고체 경구용 제조물에 대해서, 효소는 단독으로, 또는 펠렛, 마이크로펠렛, 정제, 미세정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 만들기 위한 적당한 첨가제와 함께 사용될 수 있으며, 적당한 첨가제의 예를 들면 통상의 담체, 예컨대, 락토스, 만니톨, 옥수수 전분, 또는 감자 전분; 부형제 또는 결합제, 예컨대 결정질, 또는 미세결정질 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예컨대 카르노바 왁스, 화이트 왁스, 쉘락, 무수 콜로이드 실리카, 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 또한 마크로골이라고도 알려져 있음) 1500 내지 20000, 특히 PEG 4000, PEG 6000, PEG 8000, 포비돈, 탈크, 모노레인, 또는 마그네슘 스테아레이트; 그리고 원하는 경우, 희석제, 보조제, 완충제, 습윤제, 메틸파라하이드록시벤조에이트(E218)과 같은 보존제, 티타늄 다이옥사이드(E171)와 같은 착색제, 및 자당, 사카린, 오렌지 오일, 레몬 오일, 및 바닐린와 같은 향료가 있다. 경구용 제조물은 PEI의 의학적 징후를 치료하기 위한 바람직한 제조물의 예이다.

효소는 꽤 일반적으로는, 물과 같은 수성 용매에, 또는 식물유 또는 기타 유사한 오일, 합성 지방산 글리세리드, 고지방산의 에스테르, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 PEG 4000, 또는 저급 알콜, 예컨대 선형 또는 측쇄형 C1-C4 알콜, 예컨대 2-프로판올과 같은 비수성 용매에, 원하는 경우 통상의 보조물질 또는 첨가물, 예컨대 용해제, 보조제, 희석제, 등장화제, 현탁제, 유화제, 안정제, 및 보존제와 함께 용해, 현탁, 또는 유화함으로써, 액체 경구용 제조물로 제형될 수 있다.

또한, 효소는 일반적으로는 유화 염기 또는 수용성 염기와 같은 다양한 염기와 혼합하여 좌약으로 만들 수 있다. 좌약은 체온에서는 녹지만 실온에서는 응고되는 코코아 버터, 카보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 베히클을 포함할 수 있다.

전달 비히클로서 리포솜을 사용하는 것은 관심대상의 한 방법이다. 리포솜은 표적 부위의 세포와 융합하여 세포내로 루멘의 함유물을 전달한다. 리포솜은 분리, 결합제 등과 같은 접촉을 유지하는 다양한 수단을 사용하여 융합에 충분한 시간 동안 세포와 접촉하여 유지된다. 본 발명의 한 구체예에서, 리포솜은 폐 투여를 위하여 에어로졸화되도록 설계된다. 리포솜은 센다이 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 등과 같이, 막의 융합을 매개하는 정제된 단백질 또는 펩티드로 제조될 수 있다. 지질은 포스파티딜콜린과 같은 양이온 또는 쌍성이온 지질을 포함한 공지된 리포솜 형성 지질의 어떤 유용한 조합일 수 있다. 나머지 지질은 보통 콜레스테롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세롤 등과 같이 중성 또는 산성 지질일 것이다. 리포솜을 제조하기 위하여, Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361에 설명된 과정이 사용될 수 있다.

각 투여 단위, 예를 들면 티스푼, 테이블스푼의 정제 또는 좌약이 효소의 사전결정된 양을 함유한 시럽, 엑릭시르, 및 현탁액과 같은 경구 또는 직장 투여를 위한 단위 투여 형태가 제공될 수 있다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여를 위한 단위 투여 형태는 멸균수, 보통의 식염수, 또는 다른 약학적으로 허용되는 담체 중의 용액과 같은 조성물에 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단위 투여 형태"는 사람 및 동물 피험체에 대하여 단일 투여로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하는데, 각 단위는 희망하는 효과를 만들기에 충분한 양으로 계산된, 본 발명의 화합물의 사전결정된 양을 함유한다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 장내 투여를 위한 것이고, 바람직하게는 경구 투여를 위한 것이다.

추가의 구체예에서, 경구용 조성물은 (i) 효소의 결정을 함유하는 액체 조성물; (ii) (고도로) 정제된 효소의 침전물의 액체 현탁액; (iii) 고체 또는 용해된 형태의 효소를 함유하는 겔; (iv) 입자 등에 고정된 또는 흡착된 효소의 액체 현탁액; 또는 (v) 효소 함유 분말, 펠렛, 과립, 또는 미소구체 형태, 원하는 경우 정제, 캡슐 등의 형태의 고체 조성물로서, 임의 선택적으로는 예를 들면 산안정성 코팅된 것이다.

조성물의 또다른 구체예에서, 효소는 구획화되어 있는데, 즉 예를 들면, 분리 코팅에 의해 서로 분리되어 있다.

조성물의 또다른 구체예에서, 프로테아제는 조성물의 다른 효소 성분, 예컨대 리파제, 및/또는 아밀라제와는 분리되어 있다.

효소의 용량은 투여되어야 할 구체적인 효소, 투여 빈도, 투여 방식, 증상의 심한 정도, 및 피험체의 부작용에 대한 감수성 등에 따라 다양하다. 특정 효소 중 일부는 다른 것보다 더 효능이 있을 수 있다.

대표적인 본 발명의 효소의 고체 경구용 제조물은 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 90% 동일성을 갖는 본 발명의 리파제; (ii) a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제, b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제, 및 c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제로 구성된 군 중에서 선택된 프로테아제와 적어도 70% 동일성을 갖는 프로테아제; 및/또는 (iii) a) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제, b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제, 및 c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제로 구성되는 군 중에서 선택되는 아밀라제와 적어도 70% 동일성을 갖는 아밀라제;를 포함하고, 이때 바람직하게는 (i), (ii), 및 (iii)의 효소의 예상되는 1일 임상적 용량은(모두 체중 kg 당 효소 단백질 mg 단위), (i)의 리파제에 대해서는 0.01-1000, 0.05-500, 0.1-250, 또는 0.5-100 mg/kg 체중, (ii)의 아밀라제에 대해서는 0.001-250, 0.005-100, 0.01-50, 또는 0.05-10 mg/kg 체중, (iii)의 프로테아제에 대해서는 0.005-500, 0.01-250, 0.05-100, 또는 0.1-50 mg/kg 체중이다.

본 발명의 효소의 고체 경구용 제조물의 바람직한 예는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 2-269를 포함하는 리파제 (ii) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 포함하고, 바람직하게는 갖는 프로테아제를 포함한다.

(i), (ii), 및 (iii)의 효소의 예상되는 1일 임상적 용량의 예는 (모두 체중 kg 당 효소 단백질 mg 단위), (i)의 리파제에 대해서는 0.1-250, 0.5-100, 또는 1-50 mg/kg 체중; (ii)의 아밀라제에 대해서는 0.01-50, 0.05-10, 또는 0.1-5 mg/kg 체중; (iii)의 프로테아제에 대해서는 0.05-100, 0.1-50, 또는 0.5-25 mg/kg체중이다.

아미드 (펩티드) 결합, 아미노 및 카르복시 말단은 경구용 투여에 대해 더욱 큰 안정성을 가지도록 하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들면, 카르복시 말단은 아미드화될 수 있다.

소화장애, PEI, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위해 적당한, 본 발명의 약학적 조성물의 구체예는, 본 발명의 효소를 펠렛내에 혼입함으로서 제조할 수 있다. 펠렛은 일반적으로는 10-90%(w/w, 생성된 펠렛의 건조 중량에 대비한 것)의 생리학적으로 수용가능한 유기 폴리머, 10-90% (w/w, 생성된 펠렛의 건조 중량에 대비한 것)의 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체, 및 80-20% (w/w, 생성된 펠렛의 건조 중량에 대비한 것)의 효소를 포함할 수 있는데, 이때 유기 폴리머, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체 및 효소의 총량은 모든 경우 합해서 100%가 된다.

생리학적으로 수용가능한 유기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 1500, 폴리에틸렌 글리콜 2000, 폴리에틸렌 글리콜 3000, 폴리에틸렌 글리콜 4000, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 폴리에틸렌 글리콜 8000, 폴리에틸렌 글리콜 10000, 폴리에틸렌 글리콜 20000, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌의 공중합체 및 상기 유기 중합체의 혼합물로 구성되는 군 중에서 선택될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 4000이 생리학적으로 수용가능한 유기 중합체로서 바람직하다.

셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체는 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 지방산 에스테르, 셀룰로스 니트레이트, 셀룰로스 에테르, 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 메틸 에틸셀룰로스 및 메틸하이드록시프로필 셀룰로스 중에서 선택될 수 있다. 셀룰로스, 특히 미세결정질 셀룰로스가 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체로서 바람직하다.

생성된 펠렛은 적당한 장내 코팅, 다른 비작용성 코팅으로 코팅될 수 있거나, 이러한 코팅 없이 곧바로 사용될 수도 있다. 또한, 생성된 펠렛은 경질 젤라틴 캡슐과 같은 캡슐에 채워질 수 있거나, 상기에 자세히 언급한 질환이나 질병의 치료에 적합한 크기의 무젤라틴 캡슐에 채워질 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 상이한 효소 유형으로부터, 구체적으로는 리파제, 프로테아제 및/또는 아밀라제로부터 제조된 펠렛은 상기의 캡슐에 채워질 수 있다. 캡슐을 상이한 효소 유형으로 채울 것이지만, 각 효소 유형의 용량(즉, 리파제, 프로테아제, 또는 아밀라제)은 특정한 군이 필요로 하는 특정 요구에 따라, 또는 특정한 환자의 하위군에 따라, 리파제, 프로테아제 및/또는 아밀라제 중 임의의 특정한 양을 캡슐에 첨가함으로써 변형시킬 수 있는데, 즉 캡슐은 리파제: 프로테아제: 아밀라제의 특정 비율을 다양화하여 제조될 수 있다.

본 발명의 리파제의 바람직한 약학적 조성물은 WO 2005/092370에 기술되어 있는데, 특히 바람직한 경과를 포함하는 제형물이 기술되어 있다. 더욱 구체적인 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 모노-, 디- 및 트리- 아실글리세리드 및 지방산 C6-C22 카르복실산의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모노- 및 디-에스테르의 마이크로골글리세리드 혼합물을 포함하며, 또한 가능하게는 작은 비율의 글리세롤 및 유리 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

마크로골글리세리드 혼합물에 함유된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 바람직하게는 분자당 평균 6 내지 최대 40 에틸렌 옥사이드 단위체와, 200 내지 2000 사이의 분자량을 갖는 PEG이다.

본 발명의 추가의 측면은 표면활성제, 공동-표면활성제 및 친지질성 상으로 구성되는 시스템을 포함하기 위한, 본 발명의 효소의 약학적 조성물을 제공하는데, 이 시스템은 10 이상의 HLB값(친수성-친지질성 균형)을 갖고, 30℃ 이상의 융점을 갖는 시스템이다. 바람직한 구체예에서, 시스템은 10 내지 16, 바람직하게는 12 내지 15의 HLB 값을 가지며, 30 내지 600℃, 바람직하게는 40 내지 500℃의 융점을 가진다. 구체적으로는, HLB값 및 융점에 의해 특징지워지는 시스템은 8 내지 20개, 바람직하게는 8 내지 18개 탄소 원자를 갖는 지방산 카르복실산과, 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 모노- 및 디에스테르의 혼합물인데, 여기에서, 폴리에틸렌 글리콜은 바람직하게는 분자당 약 6 내지 32개의 에틸렌 옥사이드 유닛을 가지고, 시스템은 임의선택적으로는 유리 글리세린 및/또는 유리 폴리에틸렌 글리콜을 함유한다. 이러한 시스템의 HLB값은 바람직하게는 PEG의 사슬 길이를 통해 조절한다. 이러한 시스템의 융점은 지방산의 사슬 길이, PEG의 사슬 길이, 지방산 사슬의 포화도 정도를 통해, 즉 결과적으로 마크로골글리세리드 혼합물의 제조를 위한 출발 오일을 통해 조절한다.

"지방산 C8-C18 카르복실산"은 카프릴산(C8), 카프르산(C10), 라우르산(C12), 미리스트산(C14), 팔미트산(C16) 및 스테아르산(C18)이 상당량, 다양한 비율로 함유된 혼합물을 말하는 것이고, 이러한 산이 포화된 경우에는 해당하는 불포화 C8-C18 카르복실산을 말하는 것이다. 이러한 지방산의 비율은 출발 오일에 따라 다양할 수 있다.

이러한 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 모노- 및 디 디에스테르와, 8 내지 18 탄소 원자를 갖는 지방족 카르복실산의 혼합물은 예를 들면, 200 내지 1500 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 출발 오일과 반응시킴으로써 수득할 수 있으며, 출발 오일은 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산 및 리놀렌산 각각, 또는 이의 혼합물을 함유하는 군 중에서 선택된 지방산을 갖는 트리글리세리드 혼합물로 구성된다. 임의선택적으로는 이러한 반응 산물은 작은 비율의 글리세린 및 유리 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수도 있다.

이러한 혼합물은 예를 들면 Gelucire^®라는 상표명으로 시판중이다. 본 발명중 하나의 유리한 구체예에서는, 상표명 Gelucire^®로 알려진 제품 중에서도 특히"Gelucire^® 50/13" 및/또는 "Gelucire^® 44/14"가 본 발명에 따른 약학적 제조물에 사용하기에 적합한 대표적인 혼합물이다.

Gelucire^® 50/13은 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드 및 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르와 40 내지 50%, 및 48% 내지 58%의 팔미트산(C16) 및스테아르산(C18)을 포함하고, 각각은 결합한 지방산의 주요 비율을 구성한다. 카프릴산(C8) 및 카프르산(C10)의 비율은 각 경우에 3% 미만이고, 라우르산(C12) 및 미리스트산(C14)의 비율은 각 경우에 5% 미만이다.

Gelucire^® 44/14는 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드 및 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르의 혼합물인데, 팔미트산(C16)의 비율은 4 내지 25%, 스테아르산(C18)의 비율은 5 내지 35%, 카프릴산(C8)의 비율은 15% 미만, 카프르산(C10)의 비율은 12% 미만, 라우르산(C12)의 비율은 30 내지 50%, 및 미리스트산(C14)의 비율은 5 내지 25%이다. Gelucire^® 44/14는 예를 들면, 팜 커널 오일 및 폴리에틸렌 글리콜 1500을 사용하여 알콜분해/에스테르화 반응을 통해 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는 모노-, 디- 및 트리아실-글리세리드 및 지방족 C8-C18 카르복실산의 폴리에틸렌 글리콜 모노- 및 디에스테르, 및 가능하게는 작은 비율의 글리세린 및 유리 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물을 함유하는 시스템을 포함하는 본 발명의 효소의 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 시스템은 40 내지 55℃의 융점을 가지고, 12 내지 15 사이 범위의 HLB값을 가지는 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 시스템은 44 내지 50℃의 융점을 가지고, 13-14 범위의 HLB값을 가진다. 또는 달리, 시스템은 약 44℃의 융점을 가지고, 14의 HLB값을 가지거나, 또는 시스템은 약 50℃의 융점을 가지고 13의 HLB값을 가진다.

치료 방법

본 발명에 따른 용도를 위한 리파제, 임의선택적으로는 프로테아제 및/또는 아밀라제와 배합된 리파제(본 발명의 효소)는 동물의 각종 질병이나 질환의 치료적, 및/또는 예방적 치료에서 유용하다. 용어 "동물"은 모든 동물을 포함하는 것이고, 특히 인류를 포함하는 것이다. 동물의 예로는 비반추동물, 및 반추동물, 에컨대 양, 염소 및 소, 예를 들어 축우, 및 암소가 있다. 하나의 구체예에서, 동물은 비반추동물이다. 비반추동물에는 단위(mono-gastric) 동물, 예를 들어 말, 돼지(한정하는 것은 아니지만, 새끼돼지, 성장한 돼지 및 암퇘지 포함); 가금류, 에컨대 칠면조, 오리 및 닭(한정하는 것은 아니지만, 브로일러용 닭, 알낳는 닭 포함); 어린 송아지; 고양이 및 개와 같은 애완 동물; 및 물고기(한정하는 것은 아니지만 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어 포함); 및 갑각류(한정하는 것은 아니지만 새우 및 참새우 포함)가 있다. 하나의 구체예에서 동물은 포유류이고, 더욱 구체적으로는 인간이다.

예를 들어, 효소는, 일반적으로는 위나 췌장으로부터 보통 분비되는 소화 효소의 생성 결핍 및/또는 위장관으로의 분비에 의해 종종 유발되는 소화불량이나 소화불량증과 같은 소화장애의 치료에 유용하다.

또한, 효소는 특히 PEI의 치료에 유용하다. PEI는 Borgstrom 테스트(JOP. J Pancreas (Online) 2002; 3(5):116-125)를 사용하여 평가할 수 있는데, 이는 췌장암, 췌장 및/또는 위장 수술, 예를 들면, 췌장 전체 또는 일부 절제술, 위절제술, 후 위장우회술(예를 들면 Billroth II 위장절제술); 만성 췌장염; Shwachman Diamond 증후군; 췌장 또는 공통 담즙선의 폐색증(예를 들면, 종양으로부터의); 및/또는 낭포성 섬유증(두꺼운 근육이 췌장의 관을 막는 선천성 질병)과 같은 질병이나 증상에 의해 유발될 수 있다. 효소는 또한 급성 췌장염의 치료에도 유용할 수 있다.

소화장애에 대한 효소의 효과는 일반적으로는 EP　0600868에 기재된 바와 같이 측정할 수 있는데, 즉 이의 실시예 2는 위장내 조건하에 리파제 안정성을 측정하기 위한 인 비트로 소화능력 시험을 개시하고 있고, 이의 실시예 3은 담즙염의 존재하에 리파제 활성을 측정하기 위한 인 비트로 소화능력 시험을 개시하고 있다. 프로테아제 및 아밀라제에 대해서도 해당 시험을 구상할 수 있다. 또한 WO 02/060474는 예를 들면, (1) 스와인 시험용 사료내 지질 소화를 측정하기 위한 인 비트로 시험을, (2) 지방, 단백질 및 녹말의 소화능력을 측정하는 췌장 이상이 있는 스와인에 대한 인 비보 시험 등의 적당한 시험들을 개시하고 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 리파제의 효과는 완전한 실시예 2의 인 비보 소화능력 시험을 사용하여 측정할 수 있다.

다른 예로서, 효소는 제1형 및/또는 제2형 당뇨병의 치료, 특히 후기 복합증을 감소시키기 위한 측면에서, 이러한 질병에 보통 수반되는 소화장애의 당뇨병 치료에 있어 보조 치료를 위해 유용하다.

효소의 당뇨병에 대한 효과는 WO 00/54799에 기술된 하나 이상의 방법을 사용하여 결정할 수 있는데, 예를 들면, 당화 헤모글로빈의 수치, 혈액내 글루코스 수치, 저혈당 쇼크, 비타민 A, D 및 E와 같은 지용성 비타민의 수준, 하루에 요구되는 인슐린 양, 체중, 및 고혈당의 기간 등을 조절함으로써 가능하다.

본원에 개시하고 청구한 것은 본원에 기재된 특정한 구체예로 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아닌데, 왜냐하면 이러한 구체예들은 본 발명의 여러 측면들을 상세히 설명하고자 하는 것이기 때문이다. 임의의 동등한 구체예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 하고자 한다. 결국, 본원에 제시되고 설명된 것 뿐 아니라, 본 발명의 변형도 당업자라면 전술한 범위내에 속함을 명백히 알 것이다. 이러한 변형 또한 첨부되는 청구의 범위의 범위내에 속하는 것으로 의도하고자 한다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 개시를 참고해야 할 것이다.

본원에 언급된 각종 참고문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 인용되는 것이다.

실시예 1: 효소 분석

돼지 췌장효소의 리파제, 프로테아제 및 아밀라제 활성에 대한 분석은 FIP(Federation Internationale Pharmaceutique) 뿐만 아니라, the European Pharmacopoeia and the United States Pharmacopeia에 의해 공지되어 있다. 1 FIP-유닛 = 1 Ph.Eur.-유닛 (European Pharmacopoeia). 분석방법은 예를 들면, Federation Internationale Pharma-ceutique, Scientific Section: International Commission for the standardisation of pharma-ceutical enzymes. a) "Pharmaceutical enzymes", Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeia에 기술되어 있다. 참조: Deemester et al in Lauwers A, Scharpe S (eds): Pharmaceutical enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385. 적당한 효소 표준은 하기로부터 획득할 수 있다: International Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent.

리파제 FIP 분석 및 기타의 적당한 리파제, 프로테아제 및 아밀라제에 대한 분석방법은 하기에 기술하기로 한다.

리파제 FIP 분석방법

췌장효소의 지방분해 활성을 측정하기 위하여 European Pharmacopoeia 5.1에서 공지된 방법을 사용하였다. 별달리 언급하지 않는 한, 미생물 리파제의 지방분해 활성을 측정하기 위해서는, FIP에 의해 공지된 Rhizopus oryzae 리파제에 대한 분석방법을 사용하였다.

리파제 pNP 분석방법

기질: 파라-니트로-페닐 (pNP) 발레레이트

분석 pH: 7.7

분석 온도: 40℃

반응 시간: 25분

황색의 소화 산물은 405 nM에서 특징적인 흡광도를 가졌다. 그 양을 분광계로 측정하였다. 1 리파제 유닛은 소정의 분석 조건 하에서 1분당 1 마이크로몰의 적정가능한 부티르산을 방출하는 효소의 양을 말한다. 더욱 상세한 분석방법 설명서 AF95/6-GB은 요청시 덴마크 디케이-2880 박스에바르드 크록쇼이베이 36 소재, 노보자임스 에이/에스로부터 구할 수 있다.

리파제 LU 분석방법

본 분석방법에서, pH 7.00 및 30℃(+/- 1℃)에서 리파제로 촉매되는 0.16M 트리부티린(글리세롤 트리부티레이트, Merck 1.01958.000)의 파괴를, 0.025 M 탈기, CO₂가없는 수산화나트륨 (수산화나트륨 titrisol, Merck 9956)로 방출되는 부티르산을 pH-stat 적정하여 추적하였다. 적정제의 소모를 시간의 흐름에 따라 기록하였다.

기질을 0.6% w/v 아라비아 검 유화제로 유화하였다(20.0 g 아라비아 검, 89.5 g NaCl, 2.05 g KH₂PO₄,에 1.5ℓ까지 물을 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 그대로 두고, 2700 ml 글리세롤을 첨가하고, pH를 4.5까지 조정하였다. 90 ml의 트리부티린을 300 ml 아라비아 검 유화제 및 1410 ml 탈염수와 혼합한 뒤, 3분 동안 예를 들면 Silverson 유화기 L4RT을 사용하여, 7000 rpm으로 균질화한 다음에, pH를 4.75로 조정하였다.) 리파제-샘플을 0.1M 글리신 완충액 pH 10.8에 처음 희석시킨 다음에, 탈염수로 희석시켜, 활성 수치가 1.5-4.0 LU/ml이 되도록 한다. 15 ml의 유화된 기질 용액을 적정 용기에 붓는다. 1.0 ml의 샘플 용액을 첨가하고, 적정하는 동안에 pH를 7.0으로 유지한다. 일정한 pH를 유지하기 위해 분당 첨가되는 적정제의 양을 측정한다. 활성 검정은 적정 곡선이 직선인 범위의 평균 기울기를 기준으로 한다. 공지된 활성의 표준을 수치 확인으로서 사용할 수 있다.

1 LU(리파제 유닛)은 상기에 주어진 분석 조건 하에, 분당 1 마이크로몰의 적정가능한 부티르산을 방출하는 효소의 양이다. 1 kLU(킬로리파제 유닛)=1000 LU.

더욱 상세한 분석방법 설명서 EB-SM-0095.02은 요청시 덴마크 디케이-2880 박스에바르드 크록쇼이베이 36 소재, 노보자임스 에이/에스로부터 구할 수 있다.

리파제 pH stat 분석방법

본 분석방법은 0.65 mM 담즙 염의 존재하에 올리브 오일 유제로부터 리파제로 촉매되어 방출되는 지방산에 근거한 것이다. 유화제로서 아라비아 검을 사용하여 기질을 유화한다(630 ml 아라비아 검 용액(4000 ml 물 중에, 474.6 g 아라비아 검, 64 g 염화칼슘)으로 175 g 올리브 오일을 15분간 블렌더에서 유화하고; 그 후에 실온으로 냉각시키고, 4 M NaOH를 사용하여 pH 6.8-7.0으로 조정한다).

측정을 위하여, 19 ml의 유제 및 10 ml의 담즙 염 용액(492 mg 담즙 염이 물에 용해되고, 500 ml까지 채워진다)을 반응 용기 중에서 혼합하고, 36.9 내지 37.5℃로 가열한다. 1.0 ml의 효소 용액을 첨가하여 반응을 시작한다. 방출된 산을 총 5분간 0.1 M 수산화나트륨을 첨가함으로써 pH 7.0에서 자동 적정한다. 활성은 1분과 5분 사이의 적정 곡선의 기울기로부터 검정한다. 검정을 위해, 표준은 3가지 다른 활성 수치에서 측정한다.

프로테아제 Suc - AAPF - pNA 분석방법

기질: Suc-AAPF-pNA (Sigma S-7388).

분석 완충액: 100mM 숙신산, 100mM HEPES (Sigma H-3375), 100mM CHES (Sigma C-2885), 100mM CABS (Sigma C-5580), 1mM CaCl₂, 150mM KCl, HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH 9.0로 조정한 0.01% Triton X-100

분석 온도: 25℃

300㎕의 희석된 프로테아제 샘플을 1.5 ml의 분석 완충액과 혼합하고, 1.5 ml pNA 기질(1.0ml DMSO에 용해시킨 다음에, 0.01% TritonX-100로 45배 희석시킨 50 mg)을 첨가함으로서 활성 반응을 시작하며, 혼합한 다음에, A₄₀₅의 증가를 프로테아제 활성의 측정치로서 분광기를 통해 모니터링하였다. 분석에 대한 용량-반응의 곡선의 직선 부분내에 모든 활성 측정치가 들어가도록 하기 위해 활성을 측정하기 전에 먼저 프로테아제 샘플을 희석시켰다.

프로테아제 AU 분석방법

비변성 헤모글로빈(우레아 함유 6.7mM KH₂PO₄/NaOH 완충액 중의 0.65% (w/w))을 프로테아제에 의해 25℃에서 10분간 파괴한 다음에, 파괴되지 않은 헤모글로빈을 트리클로로아세트산(TCA)을 사용하여 침전시키고, 여과에 의해 제거하였다. 여과물 중의 TCA-용해성 헤모글로빈 파괴 산물을 Folin & Ciocalteu 페놀 시약(1 용적의 Folin & Ciocalteu 페놀 시약 Merck 9001.0500 대 2 용적의 탈염수)를 사용하여 측정하였는데, 상기 시약은 몇가지 아미노산에 의해 청색을 발한다(750 nm에서 측정됨). 활성 유닛(AU)을 측정하고, 표준에 대한 기준으로 결정한다. 비변성 헤모글로빈 기질을 다음과 같이 준비할 수 있다: 1154 g 우레아 (Harnstoff, Merck 8487)를 1000 ml 탈염수에 용해시키고, 240.3 g NaOH를 첨가한 다음에, 천천히 63.45 g 헤모글로빈(Merck 4300)을 첨가하고, 315.6 g KH₂PO₄를 첨가한 후, 3260 g의 탈염수를 첨가한다. pH는 7.63으로 조정한다. 더욱 상세한 사항 및 적당한 알칼 라제 표준은 요청시 덴마크 디케이-2880 박스에바르드 크록쇼이베이 36 소재, 노보자임스 에이/에스로부터 구할 수 있다 (assay no. EB-SM-0349.01).

아밀라제

기질: Phadebas 정제(Pharmacia Diagnostics; 교차결합된, 불용성의, 청색 녹말 폴리머, 이것은 소 혈청 알부민 및 완충액 기질과 혼합한 다음에, 정제로 제조한 것이다)

분석 온도: 37℃

분석 pH: 4.3 (또는 원하는 경우 7.0)

반응 시간: 20 분

물에 현탁시킨 다음에 녹말을 알파-아밀라제로 가수분해하면, 용해성의 청색 단편이 생긴다. 생성된 청색 용액의 620 nm에서 측정한 흡광도는 알파-아밀라제 활성의 함수가 된다. 1 진균류 알파-아밀라제 유닛(1 FAU)은 표준 분석 조건 하에 시간당 5.26 g 녹말(Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Batch 9947275)을 파괴하는 효소의 양이다. 더욱 상세한 분석 설명서 APTSMYQI-3207는 요청시 덴마크 디케이-2880 박스에바르드 크록쇼이베이 36 소재, 노보자임스 에이/에스에서 구할 수 있다.

실시예 2: 인 비보 소화능력 시험

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269을 갖는(SEQ ID NO: 1의 아미노산 -5-269를 포함하는 이의 변이체 소량과 함께) 정제된 Humicola lanuginosa 리파제 변이체를 암컷 Gottinggen 미니피그(Ellegaard)에서의 전체적인 소화능력 연구에서 시험하였 다. 효능은 SEQ ID NO: 2(US 5614189에 기재된 것)의 Humicola lanuginosa 리파제의 효능과 대조하였다. [Tabeling et al., J.1999, Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution, J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263; 및 Gregory et al., J. 1999. Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (SG Pierzynowski & R. Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393]에 기술된 바와 같이, 췌장관을 연결함으로써 미니피그에 췌장 외분비 부족증(PEI)을 유발시키고, 이들을 ileo-caecal re-entrant 캐뉼라에 장치한 다음, 할로탄 전신마취하였고, 체중은 약 25 kg이었다. 연구를 시작하기 전에, 적어도 4주간은 수술에서 회복되도록 하였다. 연구를 시작하기에 앞서, 도구 키모트립신 시험(Immundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Germany에서 판매하는 것으로서 카탈로그 번호 K 6990)을 통해 각 피그의 PEI 상태를 확인하였다.

연구 동안에, 피그들은 12:12 시간으로 밤낮 주기가 반복되는 펜스 안에서 물을 자유롭게 공급하고 하루 두끼의 급식을 하며 키웠다.

리파제 효능을 측정하기 위하여, 피그들은 하기를 함유하는 시험용 식사 250 g을 급식받았고: 180 g 이중분쇄된 규정식, 물 1리터와 혼합한 Altromin 902006 plus 70 g soya oil (Roth), 및 0.625 g Cr₂O₃ (크롬산화물 마커), 이 식사에는 급 식하기 직전에 하나 또는 다른 두종류의 리파제의 상이한 양을 혼합하였다. 투여된 각 리파제의 양은 표 1의 괄호에 제시하는데, 즉 FIP U 리파제/식사 (리파제 FIP 유닛, 실시예 1 참조) 단위의 활성이다. 시험용 식사는 13.6% 단백질, 28.9% 녹말 및 32.9% 지방을 함유하고, 피그에 대한 영양요구에 따라, 비타민, 무기질 및 미량의 원소를 포함한 것이었다. 각 효소 용량은 적어도 14일간 급식하였는데, 즉 피그에게 고지방식 + 각 신규 효소 용량을 9일간 급식한 뒤, 그 다음 5일간의 모든 배설물을 모아서 중량을 재고, -20℃에서 보관하였다.

각 피그로부터의 동결된 배설물을 건조시킨 다음에, 다시 중량을 재고 분쇄하였다. 5일간의 각 분쇄된 샘플의 분취액(매일 분비한 배설물에 따른 것)을 모으고 서로 혼합하였다; 이렇게 하면 효소의 각 용량에 대해서, 각 피그에 대한 하나의 모아진 샘플이 만들어진다. 각 모아진 샘플로부터, 건조 물질 및 조지방의 함량을 결정하였다(Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3. edition, VDLUFA-Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und For-schungs-anstalten). 동결건조시킨 다음 8시간 103℃에서 인큐베이션한 다음에 중량을 재어 고체 지방을 추정하고; 조지방은 30분 동안 농축 HCl에서 끓인 다음에, 페트롤 에테르로 6시간 동안 추출함으로써 중량 단위로 결정할 수 있으며; Cr₂O₃는 크롬산염으로 산화되고, 크롬 함량은 [Petry and Rapp in Zeitung fur Tierphysiologie (1970), vol. 27, p. 181-189. (Petry & Rapp 1970; Z. Tierphysiol. 27; 181-189)]에 기술된 바와 같이 365 nm에서의 흡광(분광기)을 통해 계산하였다.

소화능력 지수(지방흡수계수; CFA)를 다음 식에 따르는 마커 방법에 의해 계산하였다:

CFA (%) = 100 - [ 급식 중의 Cr ₂ O ₃ %. 배설물 중의 지방 % .100]

[ 배설물 중의 Cr₂O₃ % . 급식 중의 지방 % ]

CFA (지방흡수계수)에 대한 효소 보충제의 영향

효소 보충제	0	저	중	고
보충제 없음	29.2 ±7.6
Humicola lanuginosa 리파제 변이체 (SEQ ID NO: 1)		51.1 +/- 9.8 (155400 FIP U)	57.3 +/- 7.1 (388400 FIP U)	73.0 +/- 1.9 (1165510 FIP U)
Humicola lanuginosa 리파제 (SEQ ID NO: 2)		31.2 +/- 10.2 (112000 FIP U)	38.8 +/- 8.0 (280000 FIP U)	43.2 +/- 3.5 (840000 FIP U)

표 1의 결과로부터, SEQ ID NO: 1 의 리파제는 SEQ ID NO: 1의 공지된 리파제보다 훨씬 경과가 좋은 것이 명백하다. 특히, 지방 흡수량을 증가시키는 데에는 SEQ ID NO: 2의 공지된 리파제보다 더욱 효과적이다.

본 발명의 리파제는 지방 소화능력에서 매우 강하고 용량 의존적인 개선을 유발하였으며, 시험된 저용량에서 매우 효과적인 개선을 이미 보인 바 있다.

실시예 3: 약학적 조성물

(A) 고강도 펠렛

SEQ ID NO: 1의 아미노산 -5 내지 269를 갖는 리파제를 대략 59%, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 갖는 리파제를 36%, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 2-269를 갖는 리파제를 5% 포함하는 농축액을 제조하였다(N-말단 서열분석에 의해 결정하고, ESIMS(실시예 5에 기술된 바와 같은, 전기방사 이온화 질량분석기)로 확인한 것). 제조물은 SDS-PAGE에 의해 판별된 바로는 단백질 기준으로 대략 92% 순수한 것으로 측정되었는데, 즉 SEQ ID NO: 1의 세가지 변이체의 총량은 농축물 중에 단백질 총량의 대략 92%를 구성한다. 농축액을 방사건조시켰다. 방사건조된 분말 중 측정된 리파제 단백질 함량은 52.6%였다. 1145 g의 방사건조된 리파제 분말을 시중에서 판매되는 믹서기내에서 미세결정질 셀룰로스(458 g) 및 폴리에틸렌 글리콜 4000((Macrogol^TM4000; 687 g)과 함께 건식으로 미리혼합하였다. 이소프로필 알콜(460 g; 100%)을 첨가한 다음에, 생성된 축축한 덩어리를 실온에서 완전히 혼합될 때까지 계속 혼합하였다. 균질화된 덩어리를 이어서 시판되는 압출기에서 압출하는데, 이 압출기는 0.8 mm의 구멍 직경을 가지는 천공 다이를 가진 것으로 원통 모양의 펠렛을 형성하는 것이다. 압출되는 동안의 비드 온도는 50℃를 넘지 않게 하였다. 생성된 압출물을 시판되는 스페로나이저(spheronizer)를 사용하여 필요한 양만큼의 이소프로필 알콜 100%(87 g)을 첨가함으로써 구형 펠렛으로 둥글게 만들었다. 펠렛은 시판되는 진공 건조기(Voetsch사의 것)에서 대략 40℃의 생성 온도에서 건조시켰다. 생성 온도는 45℃를 넘지 않게 하였다. 이어서 건조된 펠렛을 0.7 내지 1.4 mm 체를 사용하여 기계적 체를 사용하여 분리하였다. 0.7 mm 및 1.4 mm 스크린의 체에 걸러내린 것을 모으고 크기 2의 캡슐에 각 펠렛 200 mg 중 일부를 채웠다. 생성된 건조 펠렛의 리파제 농도는 대략 26%(w/w)였다.

(B) 저강도 펠렛

상기 (A)에 제공된 실시예와 유사하게, 약물 물질로서 저함량의 리파제를 갖는 펠렛을, 450 g의 동일한 방사건조된 리파제 제조물, 미세결정질 셀룰로스 (1350 g), 폴리에틸렌 글리콜 4000(450 g), 습윤을 위한 이소프로필 알콜(750 g) 및 동그랗게 만들기 위한 이소프로필 알콜(119.5 g)을 사용하여 제조하였다. 생성된 건조 펠렛의 리파제 농도는 대략 11%(w/w)였다.

실시예 (A) 및 (B)로부터 생성된 펠렛을 실시예 1에 기술된 리파제 pH-stat 분석방법을 적용함으로써 지방분해 활성에 대해 시험하였다. 출발 물질인 분말형 리파제에 비해서, 각 경우의 펠렛의 지방분해 활성 손실은 없었다.

이어서 실시예 (A) 및 (B)로부터 생성된 펠렛을 Pharm. Eur. 2.9.1. (Section "Disintegration of tablets and capsules")에 따라 붕해에 대해 시험하였다. (시험 용액: 0.1 M 말론산, pH 6.0 - 500 mL, 37 ℃)

실시예 (A)로부터의 펠렛의 붕해는 4분 안에 완성되었고, 15-60분에서 발견된 활성은 초기 활성의 99 내지 101%였다.

실시예 (B)로부터의 펠렛의 붕해는 20분 안에 완성되었고, 15-60분에서 발견된 활성은 초기 활성의 101 내지 99%였다.

결과들은, 본 발명의 리파제를 리파제 활성의 손실 없이 필렛으로 제형할 수 있다는 것을 보여준다.

(C) Gelucire로 형성된 펠렛

용융 펠렛화 방법을 사용하여 펠렛을 만들었는데, 이 방법은 간단히 말하면 다음과 같다: 262.5 g Gelucire^® 44/14(Gattafosse) 및 262.5 g Gelucire^® 50/13(Gattafosse)을 대략 65℃의 온도에 있는 가열 챔버내에 있는 비커에서 용융시켰다. 상기 언급한 바와 같은 975g의 방사 건조된 리파제 분말을 48℃에서 듀얼-쟈켓 믹서내에 제공하였다. 그 이후에, 용융된 Gelucire를 첨가하고 상이한 속도를 사용하여 혼합한 다음에 최종적으로 냉각시켰다(즉, 용융 펠렛화).

실시예 4: 담즙 염의 존재하에 활성

실시예 2에서 사용한 것과 동일한 두개의 정제된 리파제를, 다음과 같이 담즙 염의 존재하에 활성에 대해 인 비트로에서 시험하였다(즉, 대조를 위해서 본 발명의 SEQ ID NO: 1, 및 SEQ ID NO: 2).

담즙 염(Sigma-Aldrich사의 Product no. B 3301)을 pH 6.5에서 0.1 M 완충액 (비스트리스-HCl 완충액)에 용해시켜서, 2mM 용액을 형성하였다. 기질로서 28 mg 올리브 오일 및 18.8 mg 파라-니트로페닐-팔미테이트((pNP-팔미테이트, 또는 pNPP) (올리브 오일: pNPP 몰비 2:1)를 100 ml 헥산에 용해시키고, 생성 용액 중 200 마이크로리터를 96-웰 마이크로적정플레이트의 웰로 피펫팅하였다. 마이크로적정 플레이트를 후드 아래에 두어, 헥산이 밤새 대략 25℃에서 증발되게 하여, 웰 내부에 코팅된 올리브 오일 및 pNPP가 남게 하였다. 리파제를 0.01 mg/ml로 희석하였다. 담즙염 용액의 200 마이크로리터 및 상기에 언급한 바와 같은 리파제 용액의 20 마이크로리터를, 지방으로 코팅된 마이크로적정 플레이트에 첨가/혼합하였고, 60분간 인큐베이팅하였다. 차감하기 위한 대조군으로서 효소가 없는 블랭크(blank)를 시험하였다.

파라-니트로페닐(pNP)이 리파제에 의해 촉매되어 기질로부터 유리된 결과로서 황색이 나타났다. 샘플의 리파제 활성의 측정법에 따라, 405 nm (A₄₀₅)에서의 흡광도를 측정하였다.

결과를 아래의 표 2에 제시하였다. 숫자는 3회 측정한 것의 평균에서 효소가 없는 블랭크를 차감한 것으로서 계산하였다.

효소	A ₄₀₅
본 발명의 리파제 (SEQ ID NO: 1)	0.19 +/- 15%
대조 리파제 (SEQ ID NO: 2)	0.07 +/- 22%

표 2의 결과는, 본 발명의 리파제는 대조 리파제보다 담즙 염의 존재하에 더욱 안정함을 보여준다.

실시예 5: 정제 및 특징분석

SEQ ID NO: 1의 리파제를 Aspergillus oryzae에서 발현시켰고, US 특허 제5,869,438호의 실시예 22 및 23에 기술된 바와 같이 발효액으로부터 정제하였다. 정제된 리파제의 다수 배치를 SDS-PAGE로 분석하였고, 리파제를 34-40 kDa에서의 주요 단백질 밴드로서 확인하였다. 코마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 농도계 스캐닝한 결과, 이 밴드는 92-97%의 단백질 스펙트럼으로 구성된 것으로 밝혀졌다. 농도계는 BIO-RAD사의 GS-800 교정 농도계였다.

하지만, 하기의 SEQ ID NO: 1의 약간 상이한 N-말단 형태를 이 주요 단백질 밴드의 N-말단 서열분석에 의해 확인하였는데, 이것들에 대해서는 빈도에 따라 하기에 제시하였다. 여러가지 형태의 양은 에드만 분해의 첫번째 사이클에서 상이한 형태의 초기 생성물을 대조함으로써, N-말단 서열분석하여 결정하였다. 샘플중의 5개의 N-말단 형태의 생성물은 다음과 같이 표시된다:

#1 SPIRREVSQDLF... (SEQ ID NO: 1의 아미노산 -5-269) 45-65%

#2 EVSQDLF... (SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269) 35-47%

#3 VSQDLF... (SEQ ID NO: 1의 아미노산 2-269) <1% 내지 16%

#4 PIRREVSQDLF... (SEQ ID NO: 1의 아미노산 -4-269) <1%

#5 IRREVSQDLF... (SEQ ID NO: 1의 아미노산 -3-269) <1%

두가지 주요 형태인 #1 및 #2를 모든 배치에서 발견하였지만, 형태 #3은 일부 배치에서는 없었고, 형태 #4 및 #5는 일부 배치에서 매우 소량 존재하였다(검출 한계 근처이거나 그 아래).

이들 변이체는 내생성 Aspergillus 숙주 프로테아제로 인한 절단의 결과로서 형성된 것이다. 예를 들면, #2는 KexB 프로테아제로 인한 #1의 절단으로 인해 형성된 것으로 보이고, #3은 KexB로 인한 절단 이후에 아미노펩티다제에 의해 형성된 것으로 보이며, #4 및 #5는 아미노펩티다제에 의한 절단으로 인해 형성된 것으로 보인다.

N-말단 서열분석에 기초한 양을 ESIMS(전기방사 이온화 질량분석기)로 확인하였고, 이에 의하면 질량분석기 강도와 일치함을 보여주었다.

#1, #2, 및 #3 간의 차이는 각각 5.45, 5.11, 및 5.23의 상이한 이론적 pI 값을 발생시켰다. 따라서, 이러한 세가지 형태는 pH 3-7 IEF 겔 상에서 IEF(등전위 포커싱)에 의해 분리하였다. 블롯팅된 IEF 겔의 N-말단 서열분석으로 밴드를 확인하였다. 즉 IEF는 SEQ ID NO: 1의 형태 #1, #2, 및 #3의 신속간편한 검출 및 정량 방법이다.

SEQ ID NO: 1의 형태 #1 및 #2는 LU/mg 효소 단백질 단위의 동일한 특이적 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 특이적인 리파제 활성을 측정하기 위해서, 순수한 제조물의 LU/ml 단위의 리파제 활성을 실시예 1의 LU-분석방법을 사용하여 측정하였다. 특정 리파제의 단백질 함량(효소 단백질 mg/ml)을 하기에 기술하는 바와 같은 아미노산 분석방법에 의해 측정하고, 활성 (LU/ml) / AAA (mg/ml)으로서 특이적 활성(LU/mg)을 계산하였다.

아미노산 분석 ( AAA )/( mg / ml ): 리파제 샘플의 펩티드 결합을 산 가수분해되게 하고, 방출된 아미노산을, 제조업자의 지시에 따라, Bie & Berntsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Denmark사에서 시판중인 Biochrom 20 Plus Amino Acid Analyser로 분리하고 정량분석하였다. 각 개별적인 아미노산의 양을 닌히드린과의 반응에 의해 결정하였다.

여러가지 리파제 배치(batch)의 ESIMS 데이터는 또한 하나의 6탄당에 해당하는 분자량에 의해 분리된 다수개의 질량분석상의 피크를 가지는 고 만노스 당화에 해당하는 복합체 당화 패턴을 보였다.

SEQ ID NO:1은 하나의 추정되는 N-당화 자리(NIT)를 포함하며, N은 SEQ ID NO: 1의 잔기 번호 33이다. 진균류 발현 숙주에서, N-아세틸글루코사민 잔기는 해독후 변형의 결과로서 NIT-서열내의 N-잔기에 연결될 것이며, 여러개의 만노스 단량체(5 내지 21)는 이번에는 N-아세틸글루코사민 잔기에 연결될 것이다. 이렇게 되면 개개의 당화 분자의 분자량에 큰 변화를 불러일으킨다. ESIMS에 의하면 분자량 범위는 대략 30-34 kDa이다. 당화되지 않은 #1 및 #2의 이론적 분자량은 각각 30.2 kDa 및 29.6 kDa이다. 이것은 비당화 숙주에서 발현될 때 SDS-PAGE 상의 주요 밴드는 더 좁고 해당되는 분자량은 대략 30 kDa임을 의미하는 것이다.

SEQ ID NO: 1의 변이체 N33Q (보존적 치환)은 진균류 숙주에서 발현되는 경우라고 해도 당화되지 않을 것이다. SEQ ID NO: 1의 비당화된 N33Q 변이체는 인 비보 리파제 스크리닝 시험에서 SEQ ID NO:1과 동일한 효과를 보였다.

실시예 6: 프로테아제 존재하에 인 비보에서 안정성 및 효능

프로테아제 존재하에 SEQ ID NO: 1의 Humicola lanuginosa 리파제 변이체의 안정성 및 효과를 다음과 같이 시험하였다:

실시예 2에서 기술된 바와 같은 정제된 리파제를 실시예 2에 개괄적으로 기술된 바와 같지만, 단 췌장 FIP 분석에서 측정된 리파제 유닛에 따른다는 것만 제외하고 이와 같이, 인비보 시험에서 테스트하였다. 소화능력 지수(지방흡수계수; CFA)를 실시예 2에 기술된 바와 같이 측정하였다.

리파제 단독으로, 그리고 프로테아제와 배합하여, 여러가지 용량을 복합적으로 사용하여 시험하였다. 사용된 프로테아제는 SEQ ID NO: 3의 Bacillus licheniformis 프로테아제였다. 프로테아제 활성은 췌장효소 FIP 분석방법(실시예 1 참조)을 사용하여 측정하였다.

결과들은 하기의 표 3에 제시하였으며, 이 때 평균 CFA(%) 지수와 표준 편차(sd)를 표시하여 나타내었다.

처리	리파제 용량 ( 식사당 췌장효소 FIP 유닛)	프로테아제 용량 ( 식사당 췌장효소 FIP 유닛)	CFA (%)	sd
처리하지 않은 PEI (대조군)	0	0	21.7	4.5
리파제 단독	107200	0	59.2	4.7
리파제 + 프로테아제	107200	1200	55.6	6.7
리파제 + 프로테아제	107200	2400	58.7	5.1
리파제 단독	780892	0	75.6	4.7
리파제 + 프로테아제	780892	9000	81.4	4.0
리파제 + 프로테아제	780892	18000	76.0	3.2

시험된 두가지 리파제 용량 각각에 대해, 상이한 용량에서 프로테아제가 있거나 없는 것에 대한 결과 간에는 그다지 차이가 없었다. 그러므로, 프로테아제는 인 비보에서 리파제에 대한 부작용을 발생시키지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.

실시예 7: 소화효소 프로테아제의 존재하에서 안정성

주요 소화효소 중 하나인 프로테아제의 존재하에, 그리고 생리학적으로 적당한 pH에서, 인 비트로에서 본 발명의 정제된 리파제의 안정성을, SEQ ID NO: 2의 공지된 리파제와 대조하여, 하기와 같이 측정하였다.

pH 3.0에서 돼지 펩신으로 처리한 다음의 잔류 활성으로서, 안정성을 측정하였다.

각 리파제 샘플을 75 ㎍/ml 돼지 펩신, 2 mM 염화칼슘, 25 mM 시트르산염 완충액, pH 3.0 (최종 처리 조건)중의 0.01% Triton X-100으로 처리하였다. 각 희석된 샘플의 일부(희석액 = 10 mM NaCl, 0.01% Triton X-100)를 처리 용액 일부에 첨가한 다음에, 일부 희석액에 일부 희석된 샘플을 첨가함으로써 비처리된 샘플(대조군)을 만들었다. 모든 처리된 샘플 및 비처리된 샘플을 대기 온도(20-25℃)에서 3시간 동안 인큐베이팅한 다음에, 잔류 활성에 대해 분석하였다.

활성 분석은, 100 mM 트리스 완충액, pH 8.0 중의 기질인 1 mM 4-니트로페놀 팔미테이트 및 1.2% Triton X-100, 4 mM 염화칼슘으로 실시하였다. 분석방법은 처리된 샘플에 대해서, 10부의 기질이 1부의 처리된 샘플 및 1부의 희석액(0.01% Triton X-100, 10 mM NaCl)에 첨가되도록 하는 방식으로 수행하였다. 처리되지 않은 샘플에 대해서는 10부의 기질이 희석액내 1부의 샘플 및 1부의 pH 3.0 처리 용액에 첨가되도록 하였다. OD는 405 nm에서 판독하였고, 이는 샘플의 리파제 활성의 척도이다.

잔류 활성의 결과적 %(%RA)를 비처리된 샘플에 대한 분석 결과에 대비하여, 처리된 샘플에 대한 분석 결과로서 계산하였다. 결과를 하기 표 4에 제시하였다. C.V.는 분산계수를 나타내고, n은 반복 횟수이다.

효소	잔류 활성 %	%C.V.	n
본 발명의 리파제 (SEQ ID NO: 1)	9.7	40.0	13
대조 리파제 (SEQ ID NO: 2)	2.3	20.7	8

표 4는 본 발명의 리파제가 공지된 리파제에 대비하여 돼지 펩신의 존재하에서 및 pH 3.0에서 더욱 안정함을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Solvay Pharmaceuticals GmbH Novozymes A/S <120> Lipases for Pharmaceutical Use <130> 10787.204-WO <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 274 <212> PRT <213> Humicola lanuginosa <220> <221> VARIANT <222> (1)..(274) <220> <221> mat_peptide <222> (6)..(274) <400> 1 Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn -5 -1 1 5 10 Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp 15 20 25 Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu 30 35 40 Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly 45 50 55 Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu 60 65 70 75 Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly 80 85 90 Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys 95 100 105 Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr 110 115 120 Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg 125 130 135 Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala 140 145 150 155 Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr 160 165 170 Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val 175 180 185 Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val 190 195 200 Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu 205 210 215 Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile 220 225 230 235 Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn 240 245 250 Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr 255 260 265 Cys Leu <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Humicola lanuginosa <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(269) <400> 2 Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr 20 25 30 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp 35 40 45 Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr 50 55 60 Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe 65 70 75 80 Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly 100 105 110 Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val 115 120 125 Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly 130 135 140 His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val 165 170 175 Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr 180 185 190 Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro 195 200 205 Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser 210 215 220 Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly 225 230 235 240 Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro 245 250 255 Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu 260 265 <210> 3 <211> 274 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(274) <400> 3 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val 1 5 10 15 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 50 55 60 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp 100 105 110 Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala 115 120 125 Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg 130 135 140 Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn 145 150 155 160 Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val 165 170 175 Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly 180 185 190 Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr 195 200 205 Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro 210 215 220 His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu 225 230 235 240 Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu 245 250 255 Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala 260 265 270 Ala Gln <210> 4 <211> 188 <212> PRT <213> Nocardiopsis sp. <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 4 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 5 <211> 188 <212> PRT <213> Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 5 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Thr Gly Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala 85 90 95 Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val 115 120 125 Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly Val Arg Ile Arg Thr 180 185 <210> 6 <211> 513 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <220> <221> VARIANT <222> (1)..(513) <400> 6 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160 Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu 195 200 205 Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr 210 215 220 Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser 225 230 235 240 Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro 245 250 255 Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His 260 265 270 Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro 275 280 285 Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp 290 295 300 Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu 305 310 315 320 Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu 325 330 335 Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr 355 360 365 Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro 370 375 380 Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu 405 410 415 Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr 435 440 445 Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro 465 470 475 480 Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr Arg Pro 485 490 495 Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp 500 505 510 Pro <210> 7 <211> 481 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> VARIANT <222> (1)..(481) <400> 7 Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp 1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser 35 40 45 Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser 115 120 125 Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg 130 135 140 Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly 145 150 155 160 Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln 165 170 175 Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp 180 185 190 Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala 195 200 205 Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp 210 215 220 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg 225 230 235 240 Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr 245 250 255 Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu 260 265 270 Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr 275 280 285 Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys 290 295 300 Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr 305 310 315 320 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr 325 330 335 Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg 340 345 350 Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys 355 360 365 Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro 370 375 380 Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser 405 410 415 Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His 435 440 445 Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln 465 470 475 480 Arg <210> 8 <211> 483 <212> PRT <213> Bacillus sp. <220> <221> VARIANT <222> (1)..(483) <400> 8 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Lys Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly 245 250 255 Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn 290 295 300 Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro 305 310 315 320 Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu 325 330 335 Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala 420 425 430 Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp 465 470 475 480 Val Asn Lys

Claims

의약으로서의 용도를 위한 리파제로서, 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 적어도 90% 동일성을 가지되, 단 리파제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269는 아닌 것을 특징으로 하는 리파제.
제 1 항에 있어서,

a) 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 포함하거나,

b) 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269의 변이체인데, 여기에서 변이체란 25개 이하의 아미노산이 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와는 상이한 것으로서, 이때

(i) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여, 적어도 하나의 보존적인 치환 및/또는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하고; 그리고/또는

(ii) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여, 적어도 하나의 작은 결실을 포함하며; 그리고/또는

(iii) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269와 대조하여, 적어도 하나의 작은 N-말단 또는 C-말단 연장을 포함하며; 그리고/또는

(iv) 변이체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파제의 대립유전자 변이체이며; 그리고/또는

(v) 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-269를 가지는 리파제의 단편인 것 을 특징으로 하는 리파제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 의약으로서의 용도를 위한, 프로테아제 또는 아밀라제와 배합된 리파제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 의약으로서의 용도를 위한, 프로테아제 및 아밀라제와 배합된 리파제.
제 3 항 또는 제 4 항에 따른 프로테아제 및/또는 아밀라제와 배합된 리파제로서,

(i) 프로테아제는 하기 a) 내지 c):

a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제, 및

b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제,

c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제로 구성되는 군 중에서 선택되는 프로테아제와 적어도 70% 동일성을 갖고

(ii) 아밀라제는 하기 a) 내지 c):

a) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제,

b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제, 및

c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제로 구성되는 군 중에서 선택되는 아밀라제와 적어도 70% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 리파제.
제 3 항 또는 제 4 항에 따른 프로테아제 및/또는 아밀라제와 배합된 리파제로서,

(i) 리파제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 2-269를 포함하고

(ii) 프로테아제는 하기 a) 내지 c):

a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제,

b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제,

c)SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제로 구성되는 군 중에서 선택되는 프로테아제이며,

(iii) 아밀라제는 하기 a) 내지 c):

a) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제,

b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제, 및

c) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제로 구성되는 군 중에서 선택되는 아밀라제인 것을 특징으로 하는 리파제.
제 1 항 또는 제 2 항에서 정의된 바와 같은 리파제 또는 리파제의 혼합물의, 소화장애, 췌장 외분비 부족증, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 용도.
제 7 항에 있어서, 프로테아제 또는 아밀라제를 사용하는 것을 추가로 포함 하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 7 항에 있어서, 프로테아제 및 아밀라제를 사용하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라제는 제 5 항 또는 제 6 항에 정의된 바와 같은 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 리파제 또는 리파제 혼합물과, 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부가 물질을 함께 포함하는 약학적 조성물.
제 11 항에 있어서, 프로테아제 또는 아밀라제를 추가로 포함하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 프로테아제 및 아밀라제를 추가로 포함하는 조성물.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라제는 제 5 항 또는 제 6 항에서 정의된 바와 같은 것인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에서 정의된 바와 같은 리파제 또는 리파제 혼합물의 치료 유효량을 투여함에 의한, 소화장애, 췌장 외분비 부족증, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료 방법.
제 15 항에 있어서, 프로테아제 또는 아밀라제 치료 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 15 항에 있어서, 프로테아제 및 아밀라제 치료 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 프로테아제 및/또는 아밀라제는 제 5 항 또는 제 6 항에서 정의된 바와 같은 것인 것을 특징으로 하는 방법.