JPWO2005035574A1 - ＩｇＭ高濃度安定化溶液 - Google Patents

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Abstract

塩化マグネシウムや塩酸アルギニン等の多価カチオン性のイオンを含む化合物を添加物として用いることによって、溶液におけるＩｇＭの会合化を抑制し、ＩｇＭの安定な高濃度溶液を調製しうることを見出した。

Description

本発明は、ＩｇＭ高濃度安定化溶液およびその製造に関する。
多くの高等動物の免疫グロブリンには、５種類の異なったクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在する。各クラスの免疫グロブリンは、大きさ、電荷、アミノ酸組成、糖含量等の性状が異なっている。これらのクラスの中で、ＩｇＭは血漿免疫グロブリン全体の約１０％を占めている。ＩｇＭは、複雑な抗原性を持つ細胞膜抗原、感染性微生物、あるいは溶解性抗原に対して産生される初期抗体の主成分である。
ヒトＩｇＭは、通常、５量体構造を有している。ＩｇＭの５量体構造を構成する５つのサブユニットは、ＩｇＧに類似した４本鎖構造からなっている。ＩｇＭのＨ鎖であるμ鎖はＩｇＧのＨ鎖であるγ鎖とアミノ酸配列が異なる以外にも次のような相違を有する。
・μ鎖は、定常領域のドメインを、γ鎖よりも一つ余分に持っている。
・μ鎖は、オリゴ糖鎖の数がγ鎖と比較して４箇所多い。
ＩｇＭは、ＩｇＧには見られないＪ鎖と呼ばれるポリペプチド鎖を有する。Ｊ鎖は、ＩｇＭが抗体産生細胞から分泌される前に、μ鎖の会合を補助すると考えられている。
近年、モノクローナル抗体技術および組換えＤＮＡ技術の発展により、純粋な免疫グロブリンを大量に生産することが可能になった。更に遺伝子組み換え技術は、キメラ抗体やヒト化抗体生産を可能にした。キメラ抗体とは、可変領域を異なる種に由来する可変領域に組み換えた構造を有する抗体である。たとえば、ヒト以外の動物種の可変領域とヒト抗体の定常領域を有する「キメラ抗体」（非特許文献１／Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９８４）８１：６８５１）が公知である。更に、他の動物種の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲ）をヒトイムノグロブリンに移植したヒト化抗体も公知である（非特許文献２／Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５２１）。
実際に、抗腫瘍抗体に関して列挙すると、抗ＣＤ２０ヒトキメラ抗体であるリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ：ＩＤＥＣ社）や抗ＨＥＲ２／ｎｅｕヒト化抗体であるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ：Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）が臨床試験を終了し、既に承認・販売されている。ＩｇＧおよびＩｇＭのエフェクター機能として抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）や補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）が知られている。ＩｇＭのＣＤＣ活性はＩｇＧと比較して高いことから、ＣＤＣ活性を主薬効とする抗腫瘍抗体となる可能性が極めて高いと思われる。しかし上述のとおり、ＩｇＭはＩｇＧと異なり多量体を形成する。そのため、組換え体ＩｇＭを工業的規模で生産することは困難であると考えられていた。
また、ＩｇＭは、ＩｇＧに比べて極めて不安定であり、また溶解度が低いことから、ＩｇＭの高濃度且つ安定な溶液を作製することは困難である。例えば、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２００１，３（３），２３３−２４２（非特許文献５）は、ＩｇＭの−２０℃保存においても溶解時にＩｇＭの沈殿および活性低下が起こったことを報告している。また、同文献には、ＩｇＭは保存時に会合化および沈殿を起こしやすいことが記載されている。特に、ＩｇＭについては、緩衝液種とｐＨの最適化のみでは、医薬品としての使用に耐えうる安定性を確保するのは困難であった。
そこで、緩衝液種とｐＨの最適化以外で、抗体を安定化させる種々の試みがなされている。例えば、ＷＯ２００２／０９６４５７（特許文献１）においては、酸性成分を含有する抗体高濃度安定製剤が開示され、抗体の安定化のためにＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２を添加剤として使用している。しかし、該公報における抗体安定化は、ＩｇＧ製剤に関するものであって、ＩｇＭへの言及はない。上述したようにＩｇＭはＩｇＧと異なり多量体として存在し、本来的に安定なＩｇＧとは異なり会合しやすいために高濃度化が極めて困難であるという特有の課題がある。
また、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．２０００；３８（８）：７５９−７６４（非特許文献３）およびＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１１（１９８８）１７−２３（非特許文献５）で、ＩｇＭは低塩濃度下で沈殿し、リン酸緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液の弱アルカリ性緩衝液かつ高塩濃度下で再溶解することが報告されている。Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．２０００；３８（８）：７５９−７６４（非特許文献３）においては、ｐＨ５付近ではＩｇＭは沈殿しやすく取扱が困難なことが述べられ、弱酸性側の緩衝液においてＩｇＭ溶液に対しては悲観的であることが示唆されており、したがって、ＩｇＭの高濃度溶液を医薬品あるいはその原薬として提供できる可能性については何ら示されていない。また、本文献では、ＩｇＭを高濃度で含有するヒト血清を水で希釈するとｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ沈殿として不溶性の凝集体が生じて濁度が上昇するが、ＮａＣｌ、Ａｒｇｉｎｉｎｅ等の添加により塩濃度を上げるとｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ沈殿が再溶解することが報告されている。しかし、本文献はｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ沈殿の再溶解に関するものであり、ＩｇＭの水溶性会合体の増加抑制に関しては何ら開示されていない。さらに、本文献では患者血清を精製せずに用いており種々の血清タンパク質が存在するため、生じる不溶性の凝集体にはＩｇＭ以外のタンパク質が含まれる可能性があり、他のタンパク質非存在下でのＩｇＭ溶液に対する効果については示されていない。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１１（１９８８）１７−２３（非特許文献５）では、ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ沈殿の再溶解に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８の緩衝液が用いられているが、ＩｇＭの回収率は抗体あるいはバッチによって４０％から＞９０％の範囲であり再現性が低いと記述されている。また、方法の項で４℃および−２０℃において５−１０ｍｇ／ｍＬの精製抗体を保存したことが記述されているが、結果の項では−２０℃において数ヶ月間、機能低下なく保存できたことのみ記述されており、通常、安定性の確保が困難な４℃あるいはそれ以上の保存温度については何ら記載されていない。したがって、本文献では、ＩｇＭの高濃度溶液を医薬品あるいはその原薬として提供するためには、沈殿再溶解の再現性の困難さと保存安定性の確保の困難さが示されている。
また、ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ １９９３，１１，５１２−５１５（非特許文献４）およびＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１１（１９８８）１７−２３（非特許文献５）においても、ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ沈殿である抗体の不溶性凝集体の再溶解について記載されているが、その溶解度は１０ｍｇ／ｍＬ以下であり、ＩｇＭの溶解度は低い。また、水溶性の会合体の安定化については何ら記載されていない。
さらに、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９４，１１（５），６２４−６３２（非特許文献６）においては、ＰＶＰ添加によるＩｇＭの安定化が開示されているが、高濃度の抗体の安定化ではなく、また、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９５，１８１（１），３７−４３．（非特許文献７）においては、トレハロース添加による凍結乾燥製剤が開示されているが、抗体の安定性不十分であり、高濃度の抗体の安定化に関する記載はない。
ＷＯ２００２／０９６４５７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９８４）８１：６８５１） Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５２１） Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．２０００；３８（８）：７５９−７６４ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ １９９３，１１，５１２−５１５ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１１（１９８８），１７−２３ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９４，１１（５），６２４−６３２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９５，１８１，３７−４３ Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２００１，３（３），２３３−２４２
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高濃度のＩｇＭを溶液中にて安定化させることにある。より詳しくは、本発明は、高濃度のＩｇＭを安定化する方法、高濃度のＩｇＭが安定化された溶液およびその製法を提供することを目的とする。
高濃度のＩｇＭが安定化された溶液の好ましい態様においては、水溶性の会合体増加が抑制されている水溶液を提供する。他の好ましい態様においては、医薬品としての使用に耐えうる安定性を有するＩｇＭ高濃度製剤を提供する。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、塩化マグネシウムや塩酸アルギニン等の多価カチオン性のイオンを含む化合物を添加物として用いることによって、溶液におけるＩｇＭの会合化を抑制し、ＩｇＭの安定な高濃度溶液を調製しうることを見出した。
即ち、本発明は、高濃度のＩｇＭを安定化する方法、高濃度のＩｇＭが安定化された溶液およびその製法に関し、より詳しくは、下記発明を提供するものである。
（１） 高濃度の免疫グロブリンが安定化された溶液であって、免疫グロブリンがＩｇＭである溶液。
（２） ＩｇＭを１ｍｇ／ｍＬより高濃度で含有する、（１）に記載の溶液。
（３） 水性溶液である、（１）に記載の溶液。
（４） 医薬品製剤である、（１）に記載の溶液。
（５） 多価カチオン性イオンを含有する、（１）に記載の溶液。
（６） 多価カチオン性イオンを１ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度で含有する、（５）に記載の溶液。
（７） 多価カチオン性イオンが、Ｍｇイオン又はＡｒｇイオンである、（５）に記載の溶液。
（８） さらに糖類を含有する、（５）に記載の溶液。
（９） ｐＨが５〜８である、（１）に記載の溶液。
（１０） ＩｇＭ以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、（１）に記載の溶液。
（１１） ＩｇＭ以外のタンパク質を本質的に含有しない、（１）に記載の溶液。
（１２） （１）から（１１）に記載の溶液を凍結又は凍結乾燥して得られる医薬品製剤。
（１３） 高濃度の免疫グロブリンを含有する溶液を安定化する方法であって、免疫グロブリンがＩｇＭであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。
（１４） 溶液がＩｇＭを１ｍｇ／ｍＬより高濃度で含有する、（１３）に記載の方法。
（１５） 溶液が水性溶液である、（１３）に記載の方法。
（１６） 溶液が医薬品製剤である、（１３）に記載の方法。
（１７） 多価カチオン性イオンを１ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度で含有するように、溶液に多価カチオン性イオンを添加する、（１３）に記載の方法。
（１８） 多価カチオン性イオンが、Ｍｇイオン又はＡｒｇイオンである、（１３）に記載の方法。
（１９） さらに糖類を添加する、（１３）に記載の方法。
（２０） 溶液のｐＨが５〜８である、（１３）に記載の方法。
（２１） 溶液が、ＩｇＭ以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、（１３）に記載の方法。
（２２） 溶液が、ＩｇＭ以外のタンパク質を本質的に含有しない、（１３）に記載の方法。
（２３）（ａ）（１３）から（２２）のいずれかの方法を実施する工程、
（ｂ）工程（ａ）により安定化された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医薬品製剤の安定化方法。
（２４） 高濃度の免疫グロブリンが安定化された溶液を製造する方法であって、免疫グロブリンがＩｇＭであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。
（２５） 溶液がＩｇＭを１ｍｇ／ｍＬより高濃度で含有する、（２４）に記載の方法。
（２６） 溶液が水性溶液である、（２４）に記載の方法。
（２７） 溶液が医薬品製剤である、（２４）に記載の方法。
（２８） 多価カチオン性イオンを１ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度で含有するように、溶液に多価カチオン性イオンを添加する、（２４）に記載の方法。
（２９） 多価カチオン性イオンが、Ｍｇイオン又はＡｒｇイオンである、（２４）に記載の方法。
（３０） さらに糖類を添加する、（２４）に記載の方法。
（３１） 溶液のｐＨが５〜８である、（２４）に記載の方法。
（３２） 溶液が、ＩｇＭ以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、（２４）に記載の方法。
（３３） 溶液が、ＩｇＭ以外のタンパク質を本質的に含有しない、（２４）に記載の方法。
（３４） （２４）から（３３）のいずれかの方法により製造された溶液。
（３５）（ａ）（２４）から（３３）のいずれかの方法を実施する工程、
（ｂ）工程（ａ）により製造された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医薬品製剤の製造方法。
各サンプルにおける２５℃−１ヶ月、及び、２５℃−２ヶ月の会合体含有率から初期状態における会合体含有率を差し引いた値をΔａｇｇｒｅｇａｔｅとして示す図である。 各サンプルの初期状態、４℃−３ヶ月における会合体含有率を示す図である。 各サンプルの初期状態、４℃−４ヶ月、２５℃−４ヶ月における会合体含有率を示す図である。 各サンプルの初期状態、液体／４０℃−８日、液体／４０℃−８日＋４℃−３日、凍結乾燥／４０℃−８日、凍結乾燥／４０℃−８日＋４℃−３日、凍結乾燥／４０℃−８日＋４℃−３日＋再凍結乾燥／５０℃−８日におけるＳＥＣ会合体含有率％を示す図である。 各サンプルの初期状態、凍結乾燥／４０℃−２ヶ月におけるＳＥＣ会合体含有率％を示す図である。 ＭＡＢＯＮ−０１のＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ分析により得られたクロマトグラムおよび算出された分子量を示す図である。
本発明において「ＩｇＭ」とはＨ鎖の定常領域としてμ鎖の定常領域を有し、かつ５量体または６量体の構造を持つイムノグロブリンを言う。一方、本発明におけるＩｇＭを構成する可変領域の由来は限定されない。したがって、μ鎖由来の可変領域に加えて、ＩｇＧ由来の可変領域やその部分構造を含むことができる。可変領域の部分構造としては、フレームワークやＣＤＲを示すことができる。なお本発明におけるＩｇＭは、形質転換細胞に導入された外来性のＩｇＭ遺伝子の発現産物を言う。
さらに、本発明のＩｇＭを構成する定常領域が由来する動物種も限定されない。つまり本発明のＩｇＭは、ＩｇＭタイプのイムノグロブリンを有するあらゆる動物種に由来するＩｇＭ定常領域を含む。ＩｇＭを体内への投与に用いる場合には、少なくともその定常領域は、投与対象となる種と同じ種に由来することが望ましい。したがって、ヒトへの投与を目的とする場合には、少なくとも定常領域がヒト由来であることが望ましい。ヒト由来の定常領域と、他の動物種、あるいはヒト由来であるが他の個体に由来する可変領域とで構成されるＩｇＭは、キメラ抗体と呼ばれる。定常領域に加えて、可変領域のフレームワークもヒト由来としたＩｇＭは、ヒトへの投与用のＩｇＭとして更に好ましいＩｇＭである。可変領域のフレームワークの構造を維持し、ＣＤＲのみを他の動物種の抗体と組み換えられた抗体は、ヒト化抗体と呼ばれている。
本発明において「高濃度の免疫グロブリン（ＩｇＭ）」とは、溶液中のＩｇＭの含有量が１ｍｇ／ｍＬより高濃度であることを意味する。本発明の溶液は、ＩｇＭの含量が１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。本発明によれば、１０ｍｇ／ｍＬより高濃度（例えば、２０ｍｇ／ｍＬ以上、２５ｍｇ／ｍＬ以上、４０ｍｇ／ｍＬ以上、５０ｍｇ／ｍＬ以上）であっても、ＩｇＭの安定化を図ることができる。
本発明において、水溶性会合体の増加を抑制する場合は、多価カチオン性イオンを添加することが好ましい。本発明において使用できる「多価カチオン性イオン」は、２価以上のカチオン性イオンであり、例えば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｆｅ＋＋、塩基性アミノ酸等を使用することができる。塩基性アミノ酸としては、例えば、Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｌｙｓｉｎｅ、Ｌ−リジンＬ−グルタミン酸塩（Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、Ｌ−アルギニンＬ−グルタミン酸塩（Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）等を使用することができる。好ましい多価カチオン性イオンとしては、Ｍｇ＋＋又はＡｒｇｉｎｉｎｅが挙げられる。本発明において使用できる「多価カチオン性イオン」を除くカチオン性イオンとしては、１価のカチオン性イオンであり、例えばＮａ＋、Ｋ＋が挙げられる。
溶液に添加されるカチオン性イオンあるいは多価カチオン性イオンの濃度は、通常、１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭであり、さらに好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭである。
本発明の溶液は、カチオン性イオンあるいは多価カチオン性イオンに加えて、糖類を含有してもよい。好ましい糖類としては、トレハロース、スクロース、ソルビト−ルを挙げることができる。
本発明において使用できる緩衝液種としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液が挙げられる。
本発明における「安定化」とは、保存中に生じる水溶性のＩｇＭ会合体の増加を抑制すること、及び／又は、保存中に生じる不溶性のＩｇＭ会合体（沈殿物）の増加を抑制すること及び／又は、水溶性のＩｇＭの機能を保持していることをいい、好ましくは、保存中に生じる水溶性のＩｇＭ会合体の増加を抑制することをいう。
本発明における「水溶性の会合体」とは、ＩｇＭの２量体、３量体などの多量体で水溶性のものをいう。水溶性の会合体は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーで検出することができる。ＩｇＭ高濃度溶液の安定化は、例えば、次の式により求まる会合体増加抑制率により測定することができる。
会合体増加抑制率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
Ａ：多価カチオン性イオンを添加しないＩｇＭ高濃度溶液（コントロール）の会合体増加率
Ｂ：多価カチオン性イオンを添加したＩｇＭ高濃度溶液（被験試料）の会合体増加率
本発明の溶液は、高濃度のＩｇＭを含有する溶液に多価カチオン性イオンを添加してから１ヶ月後の会合体増加抑制率が、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上、更に好ましくは８０％以上のものである。
本発明の溶液は、ＩｇＭ以外のヒト由来の他のタンパク質を含有しない溶液であることが好ましい。さらに好ましくは、ＩｇＭ以外のタンパク質であって、安定化剤としての効果を示し得る量以上のタンパク質を含有しない溶液である。本願の溶液が医薬品製剤である場合は、ＩｇＭ以外のヒト由来のタンパク質であって、医薬品の原薬及び／又は医薬品として許容される量以上のタンパク質を含有しない溶液であることが好ましい。
本発明の医薬品製剤の剤形に特に限定はなく、任意の剤形とすることが可能である。剤形としては、例えば、溶液製剤、凍結乾燥製剤を挙げることができる。また、溶液製剤としては、冷所保存製剤、常温保存製剤、凍結製剤などが挙げられる。また、本発明の医薬品製剤の投与ルートにも限定はなく、任意の投与ルートを用いることが可能である。したがって、医薬品製剤の使用目的に応じて、経口、非経口投与のいずれでもありうる。
非経口投与のための具体的な剤型として、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などを示すことができる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
本発明の方法により、安定化したＩｇＭは、それ自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与することもできる。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように調節することができる。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液などが利用される。補助剤には、具体的には、例えば、スクロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等を利用することができる。医薬組成物には、適当な溶解補助剤を加えることもできる。例えばアルコールや非イオン性界面活性剤は、溶解補助剤として好ましい。アルコールとしては、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を示すことができる。また非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー１８８、あるいはＨＣＯ−５０などを用いることができる。また、塩化ベンザルコニウム等の陽イオン性界面活性剤も使用できる。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なバイアルあるいはアンプルに充填される。
本発明の溶液を医薬品製剤とする場合は、ｐＨ５〜８であることが好ましく、特に好ましくはｐＨ５〜７である。
医薬品製剤は、対象疾患、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することができる。例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の医薬品製剤はこれらの投与量に制限されるものではない。その他、本発明の溶液製剤等の調製に関しては、ＷＯ２００２／０９６４５７を参照のこと。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
以下の実施例では、ＩｇＭとして、参考例１で作製した組換え型抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体（以下、「ＭＡＢＯＮ−０１」という）を使用した。ＭＡＢＯＮ−０１溶液を濃縮し、約９ｍｇ／ｍＬの高濃度溶液を調製した。これを透析膜ＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＺＥＲ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ １００００ＭＷＣＯ（ＰＩＥＲＣＥ）により透析を行い、以下の１．〜６．の緩衝液に透析し、緩衝液置換を行った。
１．２０ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０／酢酸塩ｐＨ５．０１．
２．２０ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５／酢酸塩ｐＨ５．５２．
３．２０ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０／酢酸塩ｐＨ６．０３．
４．２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０／クエン酸塩ｐＨ５．０４．
５．２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５／クエン酸塩ｐＨ５．５５．
６．２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０／クエン酸塩ｐＨ６．０１．
得られた溶液を回収し、各サンプルのＭＡＢＯＮ−０１の濃度を８．４ｍｇ／ｍＬに統一し、保存容器Ｍｕｌｔｉｐｌｙ−Ｓａｆｅｃｕｐ ０．１ｍｌ Ｂｉｏｓｐｈ．（ＳＡＲＳＴＥＤＴ）に充填した。これらのサンプルの安定性試験を４℃で実施した。サンプルは初期状態、４℃−２ヶ月で評価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる単量体残存率の変化により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、Ｇ４０００ＳＷｘｌ（ＴＯＳＯＨ）を用いた。５０ｍＭリン酸ナトリウム，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の単量体残存率を算出した。各サンプルの初期状態における単量体残存率を１００％とし、４℃−２ヶ月の単量体残存率を表１に示した。
Figure 2005035574
これより、３００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ５．０〜ｐＨ６．０のクエン酸あるいは酢酸緩衝液において、安定な高濃度ＭＡＢＯＮ−０１溶液を調製することができた。
以下の実施例において、クエン酸緩衝液を用いたｐＨ５．５の溶液に多価カチオンを添加することでさらに水溶性の会合体の増加を抑制し安定化した高濃度ＭＡＢＯＮ−０１溶液を示す。
［実施例２］
ＭＡＢＯＮ−０１溶液を濃縮し、約１８ｍｇ／ｍＬの高濃度溶液を調製した。これを透析膜ＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＺＥＲ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ １００００ＭＷＣＯ（ＰＩＥＲＣＥ）により透析を行い、２０ｍＭクエン酸，３００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．５の溶液に緩衝液置換を行った（添加物なしの状態では、緩衝液種、ｐＨを最適化してある）。この高濃度ＭＡＢＯＮ−０１溶液を以下の１．〜９．の緩衝液に透析ＥａｓｙＳｅｐ（ＴＯＭＹ）を用いて透析し、緩衝液置換を行った。
１．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．５／なし
２．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，９００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．５／ＮａＣｌ
３．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ５．５／ＭｇＣｌ２
４．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４，ｐＨ５．５／Ｎａ２ＳＯ４
５．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩，ｐＨ５．５／Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩
６．２０ｍＭクエン酸ナトリウム３００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩，ｐＨ５．５／Ｌ−アルギニン塩酸塩
７．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム塩，ｐＨ５．５／Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム塩
８．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ尿素，ｐＨ５．５／尿素
９．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭトレハロース，ｐＨ５．５／トレハロース
得られた溶液を回収し、各サンプルのＭＡＢＯＮ−０１の濃度を１８．５ｍｇ／ｍＬに統一し、保存容器Ｍｕｌｔｉｐｌｙ−Ｓａｆｅｃｕｐ ０．１ｍｌ Ｂｉｏｓｐｈ．（ＳＡＲＳＴＥＤＴ）に充填した。これらのサンプルの安定性試験を２５℃で実施した。サンプルは初期状態、２５℃−１ヶ月、及び、２５℃−２ヶ月で評価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含有率の変化（増加）により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、Ｇ４０００ＳＷｘｌ（ＴＯＳＯＨ）を用いた。５０ｍＭリン酸ナトリウム，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の会合体含有率を算出した。各サンプルの２５℃−１ヶ月、及び、２５℃−２ヶ月の会合体含有率から初期状態における会合体含有率を差し引いた値をΔａｇｇｒｅｇａｔｅとして、図１に示した。
その結果、１．なし（３００ｍＭ ＮａＣｌを含む）に比べて、２．ＮａＣｌ（９００ｍＭ ＮａＣｌを含む）は会合体の増加が抑制された。これより、ＮａＣｌ濃度を高くすることによって、会合体の増加を抑制できることが分かった。
一方、２．ＮａＣｌ（９００ｍＭ ＮａＣｌを含む）、３．ＭｇＣｌ２（３００ｍＭ ＮａＣｌ＋２００ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）、４．Ｎａ２ＳＯ４（３００ｍＭ ＮａＣｌ＋２００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４を含む）において、これらは同じイオン強度（いずれもイオン強度０．９Ｍ）であるにも関わらず、２価のカチオンを含むＭｇＣｌ２は著しい安定化効果が認められ、２価のアニオンを含む４．Ｎａ２ＳＯ４の安定化効果は２．ＮａＣｌと同程度であった。
また、同じイオン性のアミノ酸であるＬ−グルタミン酸ナトリウム塩を含む５．Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩では安定化効果が認められないにも関わらず、２価のカチオンであるＬ−アルギニン塩酸塩を含む６．Ｌ−アルギニン塩酸塩では、３．ＭｇＣｌ２と同等の安定化効果が認められた。
このような結果から、ＮａＣｌ等の塩を加えイオン強度を高くすることによって、会合体を抑制できることが分かった。さらに、同じイオン強度においても、２価のカチオンであるマグネシウムイオンやアルギニンを用いることによってさらに高い会合体抑制効果が得られることが分かった。一方、２価のアニオンである硫酸イオンやグルタミン酸では高い会合体抑制効果が得られない。すなわち、マグネシウムイオンやアルギニン等の２価のカチオンがＭＡＢＯＮ−０１と相互作用することで、ＭＡＢＯＮ−０１の会合化を著しく抑制し、安定な高濃度溶液を調製することが出来た。
［実施例３］
ＭＡＢＯＮ−０１溶液を濃縮し、約１９ｍｇ／ｍＬのＭＡＢＯＮ−０１高濃度溶液を調製した。これを以下の１．〜９．の緩衝液に透析膜ＥａｓｙＳｅｐ（ＴＯＭＹ）を用いて透析し、緩衝液置換を行った。
１．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．５１．
２．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ５．５２．
３．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ５．５３．
４．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ５．５４．
５．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭトレハロース，ｐＨ５．５５．
６．２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩、ｐＨ５．５６．
７．２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩、ｐＨ５．５７．
８．２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩、ｐＨ５．５８．
９．２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩、１００ｍＭトレハロース、ｐＨ５．５
得られた溶液を回収し、各サンプルのＭＡＢＯＮ−０１の濃度を１８．９ｍｇ／ｍＬに統一し、保存容器Ｍｕｌｔｉｐｌｙ−Ｓａｆｅｃｕｐ ０．１ｍｌ Ｂｉｏｓｐｈ．（ＳＡＲＳＴＥＤＴ）に充填した。これらのサンプルの安定性試験を実施した。サンプルは初期状態、４℃−３ヶ月で評価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含有率の変化（増加）により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、Ｇ４０００ＳＷｘｌ（ＴＯＳＯＨ）を用いた。５０ｍＭリン酸ナトリウム，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の会合体含有率を算出した。各サンプルの初期状態、４℃−３ヶ月における会合体含有率を図２に示した。
その結果、ＭｇＣｌ２とＬ−アルギニン塩酸塩の濃度依存的に会合体抑制効果が見られた。すなわち、ＭｇＣｌ２とＬ−アルギニン塩酸塩の濃度を高くすることによって、大きな安定化効果が得られた。さらに、トレハロース単独では安定化効果がないものの（実施例２及び実施例４）２００ｍＭ ＭｇＣｌ２あるいは１００ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩存在下に１００ｍＭ ｔｒｅｈａｌｏｓｅを添加することによって、安定化効果が得られた。
［実施例４］
ＭＡＢＯＮ−０１溶液を濃縮し、より高濃度の約２７ｍｇ／ｍＬのＭＡＢＯＮ−０１高濃度溶液を調製した。これを以下の１．〜３．の緩衝液に透析膜ＥａｓｙＳｅｐ（ＴＯＭＹ）を用いて透析し、緩衝液置換を行った。
１．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．５／なし
２．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ５．５／ＭｇＣｌ２
３．２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭトレハロース，ｐＨ５．５／トレハロース
得られた溶液を回収し、各サンプルのＭＡＢＯＮ−０１の濃度を２６．８ｍｇ／ｍＬに統一し、保存容器Ｍｕｌｔｉｐｌｙ−Ｓａｆｅｃｕｐ ０．１ｍｌ Ｂｉｏｓｐｈ．（ＳＡＲＳＴＥＤＴ）に充填した。これらのサンプルの安定性試験を実施した。サンプルは初期状態、４℃−４ヶ月および２５℃−４ヶ月で評価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含有率の変化（増加）により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、Ｇ４０００ＳＷｘｌ（ＴＯＳＯＨ）を用いた。５０ｍＭリン酸ナトリウム，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の会合体含有率を算出した。各サンプルの初期状態、４℃−４ヶ月および２５℃−４ヶ月における会合体含有率を図３に示した。
その結果、４℃と２５℃において、ともにＭｇＣｌ２の安定化効果が認められた。一方、一般的なタンパク質の安定化剤として知られ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９５，１８１（１），３７−４３において凍結乾燥時のＩｇＭの安定化効果が認められているｔｒｅｈａｌｏｓｅに関しては、ほとんど効果が認められなかった（図３）。
［実施例５］
＜準備＞
「５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５、５％スクロース」または「５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＡｒｇＨＣｌ、ｐＨ５．５、５％スクロース」または「５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ５．５、５％スクロース」においてＭＡＢＯＮ−０１の大規模な透析を行った。透析後、フィルター遠心法によって溶液を濃縮した。ＶＩＶＡＳＰＩＮ６５０００ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ、ＶＳ０６１）を用いて、ｈｉｍａｃ ＣＦ８ＤＬ（Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｎｏ．ＳＺＧＥＱ０５４）により３０００ｒｐｍで遠心を行った。濃縮および回収後、ＵＶ吸光度（ε＝１．４０）で濃度を測定した。次いで、緩衝液を用いてサンプルを４８．４ｍｇ／ｍＬに希釈した。さらに１％ポリソルベート８０溶液を加え、０．０１％ポリソルベート製剤を得た。上記サンプルをそれぞれ５００μＬずつ５ｍＬガラスバイアルに充填し、それぞれ３０μＬずつＭｕｌｔｉｐｌｙ−Ｓａｆｅｃｕｐ ０．１ｍｌ Ｂｉｏｓｐｈ．（ＳＡＲＳＴＥＤＴ）に充填した。下記の条件において、５ｍＬガラスバイアルを凍結乾燥した。初期サンプルとして１ｍｇ／ｍＬ ＭＡＢＯＮ−０１を使用し、分析時まで４℃で保管した。
Figure 2005035574
＜実験の条件＞
″５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５、５％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０″
″５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＡｒｇＨＣｌ、ｐＨ５．５、５％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０″
″５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ５．５、５％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０″
ＭＡＢＯＮ−０１：４８．４ｍｇ／ｍＬ
溶液／４０℃−８日
溶液／４０℃−８日＋４℃−３日
凍結乾燥／４０℃−８日
凍結乾燥／４０℃−８日＋４℃−３日（再溶解後）
凍結乾燥／４０℃−８日＋４℃−３日（再溶解後）＋再凍結乾燥／５０℃−８日
＜分析＞
インキュベーション後、希釈溶液（１／５０希釈溶液：４＋２９６μＬ）から〜１ｍｇ／ｍＬを用いてＳＥＣによって１０μＬを分析した。「５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４」を移動相（流量０．３ｍｌ／分、２８０ｎｍまたは２２０ｎｍで検出）として使用し、Ｇ４０００ＳＷｘｌ（ＴＯＳＯＨ）によってＳＥＣ分析を行った（図４）。
同濃度のＮａＣｌに比べて、ＡｒｇＨＣｌおよびＭｇＣｌ２は、５０℃でインキュベーションされている間も、凍結乾燥の安定化効果が高かった。
［実施例６］
＜準備＞
「５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５、５％スクロース」または「５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＡｒｇＨＣｌ、ｐＨ５．５、５％スクロース」においてＭＡＢＯＮ−０１の大規模な透析を行った。透析後、フィルター遠心法によって溶液を濃縮した。ＶＩＶＡＳＰＩＮ６ ５０００ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ、ＶＳ０６１）を用いて、ｈｉｍａｃ ＣＦ８ＤＬ（Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｎｏ．ＳＺＧＥＱ０５４）により３０００ｒｐｍで遠心を行った。濃縮および回収後、ＵＶ吸光度（ε＝１．４０）で濃度を測定した。さらに、１％ポリソルベート８０溶液を加え、０．０１％ポリソルベート製剤を得た。また、サンプルを希釈し、５０ｍｇ／ｍＬ製剤を得た。上記のサンプルをそれぞれ３００μＬ、３本の５ｍＬガラスバイアルに充填した。下記の条件において５ｍＬガラスバイアルを凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は初期サンプルとして、分析時まで４℃で保管した。
Figure 2005035574
＜実験の条件＞
″５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５、５％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０″
″５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＡｒｇＨＣｌ、ｐＨ５．５、５％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０″
ＭＡＢＯＮ−０１：５０ｍｇ／ｍＬ
凍結乾燥／４０℃−２ヶ月
＜分析＞
インキュベーション後、希釈溶液（１／５０希釈溶液：４＋２９６μＬ）から〜１ｍｇ／ｍＬを用いてＳＥＣによって１０μＬを分析した。「５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４」を移動相（流量０．３ｍｌ／分、２８０ｎｍまたは２２０ｎｍで検出）として使用し、Ｇ４０００ＳＷｘｌ（ＴＯＳＯＨ）によってＳＥＣ分析を行った（図５）。
４０℃−２ヶ月の長期加速試験でも、同濃度のＮａＣｌに比べて、ＡｒｇＨＣｌは高い安定化効果を示した。
［参考例１］ガングリオシドＧＭ３に対する組換え型ヒト抗体の作製
１．１ 抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子の構築
ガングリオシドＧＭ３に結合するヒト抗体のＨ鎖をコードする遺伝子は、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスで形質転換されたヒトＢ細胞（以下、抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体発現Ｂ細胞と表記する）より抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて１×１０７細胞の抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体発現Ｂ細胞より抽出した。Ｈｏｏｎらが報告している抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体遺伝子の塩基配列（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３；５３：５２４４−５２５０）に基づいて、２本のオリゴヌクレオチド（ＬＭＨ−ｆ３、ＬＭＨ−ｒ３）を設計した。ＬＭＨ−ｆ３（配列番号：７）はセンス方向で、ＬＭＨ−ｒ３（配列番号：８）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。１μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い５’末端側と３’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。５’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｒ３を用い、３’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆ３を用いた。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ、
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆ３またはＬＭＨ−ｒ３
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。塩基配列決定の後、５’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）及びＳａｃＩＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約１．１ｋｂｐの断片、および３’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）及びＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約１．１ｋｂｐの断片を混合し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋ベクター（東洋紡社製）へクローニングし、完全長抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子を得た。
動物細胞発現用ベクターへクローニングするために、合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆｘｈｏ、ＬＭＨ−ｒｓａｌを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。ＬＭＨ−ｆｘｈｏ（配列番号：１１）は前方プライマーで抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子の５’末端にハイブリダイズし、かつＸｈｏＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またＬＭＨ−ｒｓａｌ（配列番号：１２）は後方プライマーで抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子の３’末端にハイブリダイズし、ＳａｌＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
１ｍＭ ＭｇＳＯ４、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１ユニットのＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）、
１０ｎｇの完全長抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋ベクター、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆｘｈｏ、ＬＭＨ−ｒｓａｌ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて２分間、
９４℃／１５秒間、６０℃／３０秒間、６８℃／２分間のサイクルを３０回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＵＣＡＧの制限酵素ＸｈｏＩ部位に連結し、クローニングした。本ベクターｐＵＣＡＧは、ｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ １９９１；１０８：１９３−２００）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化して得られる２．６ｋｂｐの断片をｐＵＣ１９ベクター（東洋紡社製）の制限酵素ＢａｍＨＩ部位に連結し、クローニングしたベクターである。完成したプラスミドをｐＵＣＡＧ／Ｌ６１２Ｈと命名した。本プラスミドに含まれる抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｈ鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号：１及び配列番号：２に示す。
１．２ 抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｌ鎖遺伝子の構築
抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体のＬ鎖をコードする遺伝子は抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体発現Ｂ細胞より抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、上記と同様にして抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体発現Ｂ細胞より抽出した。Ｈｏｏｎらが報告している抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体遺伝子の塩基配列（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３；５３：５２４４−５２５０）に基づいて、２本のオリゴヌクレオチド（ＬＭＬ−ｆ１、ＬＭＬ−ｒ１）を設計した。ＬＭＬ−ｆ１（配列番号：９）はセンス方向で、ＬＭＬ−ｒ１（配列番号：１０）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。
１μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い５’末端側と３’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。５’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｒ１を用い、３’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆ１を用いた。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆ１またはＬＭＬ−ｒ１
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復、
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。塩基配列決定の後、５’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約０．７ｋｂｐの断片、および３’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約０．９ｋｂｐの断片を混合し、合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆｅｃｏ、ＬＭＬ−ｒｎｏｔを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。ＬＭＬ−ｆｅｃｏ（配列番号：１３）は前方プライマーで抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｌ鎖遺伝子の５’末端にハイブリダイズし、かつＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またＬＭＬ−ｒｎｏｔ（配列番号：１４）は後方プライマーで抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｌ鎖遺伝子の３’末端にハイブリダイズし、ＮｏｔＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
１ｍＭ ＭｇＳＯ４、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１ユニットのＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）
５’末端側遺伝子断片、
３’末端側遺伝子断片、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆｅｃｏ、ＬＭＬ−ｒｎｏｔ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて２分間
９４℃／１５秒間、６０℃／３０秒間、６８℃／２分間のサイクルを３０回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＣＸＮＤ３の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ切断部位に連結し、クローニングした。
本ベクターｐＣＸＮＤ３の構築の流れについて、以下に述べる。ＤＨＦＲ−ΔＥ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）の抗体Ｈ鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）をクローニングした。このベクターをｐＣＨＯＩと命名した。
ｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位をｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ １９９１；１０８：１９３−２００）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしたベクターをｐＣＸＮＤ３と命名した。また、Ｌ鎖遺伝子断片をｐＣＸＮＤ３にクローニングし、完成したプラスミドをｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２Ｌと命名した。本プラスミドに含まれる抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｌ鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：３および配列番号：４に示す。
１．３ 抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体の発現ベクターの構築
抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体発現ベクターを作製するために、ｐＵＣＡＧ／Ｌ６１２Ｈを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約４．０ｋｂｐの断片をｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２Ｌの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体遺伝子を発現する。
１．４ 抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｊ鎖遺伝子および発現ベクターの構築
抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体のＪ鎖をコードする遺伝子は抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体発現Ｂ細胞より抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、上記と同様にして抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体発現Ｂ細胞より抽出した。ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒト抗体Ｊ鎖遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号：Ｍ１２７５９）に基づいて、２本のオリゴヌクレオチド（Ｊ−ｆ１、Ｊ−ｒ１）を設計し、合成した。Ｊ−ｆ１（配列番号：１５）はセンス方向でヒト抗体Ｊ鎖遺伝子Ｅｘｏｎ３にハイブリダイズし、Ｊ−ｒ１（配列番号：１６）はアンチセンス方向でヒト抗体Ｊ鎖遺伝子Ｅｘｏｎ４にハイブリダイズする。
１μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い５’末端側と３’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。５’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＪ−ｒ１を用い、３’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＪ−ｆ１を用いた。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＪ−ｆ１またはＪ−ｒ１
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。
塩基配列決定の後、５’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約０．５ｋｂｐの断片、および３’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約１．０ｋｂｐの断片を混合し合成オリゴヌクレオチドＪ−ｆｅｃｏ、Ｊ−ｒｘｂａを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。
Ｊ−ｆｅｃｏ（配列番号：１７）は前方プライマーで抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｊ鎖遺伝子の５’末端にハイブリダイズし、かつＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またＪ−ｒｘｂａ（配列番号：１８）は後方プライマーで抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｊ鎖遺伝子の３’末端にハイブリダイズし、ＸｂａＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
１ｍＭ ＭｇＳＯ４、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１ユニットのＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）
５’末端側遺伝子断片、
３’末端側遺伝子断片、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＪ−ｆｅｃｏ、Ｊ−ｒｘｂａ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて２分間
９４℃／１５秒間、６０℃／３０秒間、６８℃／２分間のサイクルを３０回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏの制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ切断部位に連結し、クローニングした。
本ベクターｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏは、上述のｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位を除去し、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子発現部位をクローニングしたベクターである。完成したプラスミドをｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏ／Ｊ ｃｈａｉｎと命名した。本プラスミドに含まれる抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｊ鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：５および配列番号：６に示す。
１．５ 動物細胞を用いた抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体の発現
ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。
Ｊ鎖を発現しない細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体発現ベクターｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭ（２５μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４０ｍＬに懸濁した。同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して２週間培養した。
Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のＩｇＭ量について参考例１．６に示す濃度定量法で測定した。抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体高発現細胞株を順次拡大培養し、抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体安定発現細胞株ＣＡ０２、ＣＡ１５、ＣＡ１９、ＣＡ２０、およびＣＡ２４を得た。
また、Ｊ鎖を発現する細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体発現ベクターｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭ（２５μｇ）およびＪ鎖発現ベクターｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏ／Ｊ ｃｈａｉｎ（２０μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４０ｍＬに懸濁した。
同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および０．６ｍｇ／ｍＬ濃度のＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加して２週間培養した。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｚｅｏｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のＩｇＭ量について参考例１．６に示す濃度定量法で測定した。抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体高発現細胞株を順次拡大培養し、抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体安定発現細胞株（ＣＪ１５、ＣＪ２５、ＣＪ３８、ＣＪ４５、ＣＪ６７）を得た。
１．６ 培養上清中のＩｇＭ濃度の測定
培養上清中のＩｇＭ濃度の測定は以下のように行った。Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ（ＢＩＯＳＯＲＣＥ社製）を１μｇ／ｍｌになるようにＣｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．０２％ＮａＮ３）で希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ウェルで加え、４℃で２４時間以上反応させ、コーティングを行った。
さらに、Ｒｉｎｓｅ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後に、２００μＬ／ウェルのＤｉｌｕｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒを加え、室温で１時間以上反応させ、ブロッキングした。Ｒｉｎｓｅ ＢｕｆｆｅｒおよびＤｉｌｕｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒの組成はそれぞれ次のとおりである。
Ｒｉｎｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ：
ＰＢＳ（−）、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ ＭｇＣｌ２、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、
０．０２％ ＮａＮ３、
１％ ＢＳＡ
その後、Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒで適当に希釈した培養上清を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。Ｒｉｎｓｅ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後に、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＢＩＯＳＯＲＣＥ社製）をＤｉｌｕｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒで４０００倍に希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。最後にＲｉｎｓｅ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後にアルカリフォスファターゼ基質（ＳＩＧＭＡ社製）を加え、吸光光度計Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、測定波長４０５ｎｍ、対照波長６５５ｎｍの吸光度を測定した。ＩｇＭ濃度は抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体精製品（Ｈｏｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３；５３：５２４４−５２５０）との比較で算出した。
各種抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体安定発現細胞株を７５ｃｍ２培養フラスコ内で初発細胞密度２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養し、培養上清中のＩｇＭ濃度を上記の方法で測定した。結果を表４に示す。ＩｇＭ産生量は培養３日目で約２０ｍｇ／Ｌ、培養７日目で約５０ｍｇ／Ｌであり、単一細胞が産生する能力を示す産生能は５〜１９ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙであった。ＩｇＭはイムノグロブリンの中でも多量体を形成するために、組換え体は発現量が低く、大量に調製することが困難であるとされていたが、今回の結果より、ＣＨＯ細胞において高い産生量の組換え型ＩｇＭ発現細胞が作製できることが明らかになった。
Figure 2005035574
［参考例２］ 会合体の測定（１）
以下の緩衝液を移動相として用いて、ＭＡＢＯＮ−０１のゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った。何れの分析でもカラムはＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬを用い、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎ、検出は２８０ｎｍにおける吸光度、試料注入量は１０μｇとした。
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．２１．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．５２．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．８３．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．１４．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４５．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．５６．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４７．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．５８．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４９．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．５１０．
１．５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４１１．
得られたクロマトグラムの会合体ピーク面積値と単量体ピーク面積値（ピークの帰属は別途行った）を表５に示す。
Figure 2005035574
各セルの上段に全ピーク面積値、下段左に会合体面積値、下段右に単量体面積値を示した。
また、全ピーク面積値に対する会合体ピーク面積比率ならびに単量体ピーク面積比率を算出した結果を表６に示す。
Figure 2005035574
各セルの左に会合体ピーク面積比率、単量体ピーク面積比率を示した。
これらの結果から、全ピーク面積値ならびに会合体ピーク面積比率、何れに関しても、ｐＨ６．２−７．１の移動相緩衝液を用いた分析に比べてｐＨ７．４の移動相緩衝液を用いた時に塩種ならびに塩濃度の影響が抑えられ、またＫＣｌ、ＮａＣｌ何れの塩を含む移動相緩衝液でも塩濃度が３００ｍＭの移動相緩衝液に比べて５００ｍＭの時にｐＨの影響が抑えられ、更にＮａＣｌを含む移動相緩衝液に比べてＫＣｌを含む移動相緩衝液を用いた時に塩濃度もしくは移動相ｐＨの影響が抑えられることがわかった。以上から、ＭＡＢＯＮ−０１のゲル濾過クロマトグラフィー分析の移動相条件を、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４と設定した。
［参考例３］ 会合体の測定（２）
ＭＡＢＯＮ−０１のＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ分析を行い、各ピークの分子量を測定した。移動相は５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４の緩衝液を、カラムはＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬを用いた。流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎ、検出は２８０ｎｍにおける吸光度、試料注入量は１１３μｇとした。得られた結果からＤｅｂｙｅ法によって分子量を算出した。
得られたクロマトグラムおよび算出された分子量を重ねて図６に示す。また、図中ピーク１ならびにピーク２の平均分子量と、ＭＡＢＯＮ−０１のアミノ酸配列から算出した理論分子量を表７に示す。
Figure 2005035574
尚、ピーク２は２１．５−２２．０分、ピーク１は２４．５−２５．０分の分子量を平均し、平均分子量とした。ピーク１ならびにピーク２の平均分子量がそれぞれ単量体ならびに二量体の理論分子量に近いこと、またピーク２の平均分子量がピーク１の平均分子量の約２倍であることから、ピーク１にはＭＡＢＯＮ−０１単量体が、ピーク２には二量体が含まれることがわかった。
本発明により、高濃度のＩｇＭを溶液中にて安定化することが可能となった。本発明によれば、ＩｇＭを有効成分とする医薬製剤を長期間安定に保存することが可能であるため、本発明は特に抗体製剤の調製に大きく貢献しうるものである。

Claims (35)

  1. 高濃度の免疫グロブリンが安定化された溶液であって、免疫グロブリンがＩｇＭである溶液。
  2. ＩｇＭを１ｍｇ／ｍＬより高濃度で含有する、請求項１に記載の溶液。
  3. 水性溶液である、請求項１に記載の溶液。
  4. 医薬品製剤である、請求項１に記載の溶液。
  5. 多価カチオン性イオンを含有する、請求項１に記載の溶液。
  6. 多価カチオン性イオンを１ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度で含有する、請求項５に記載の溶液。
  7. 多価カチオン性イオンが、Ｍｇイオン又はＡｒｇイオンである、請求項５に記載の溶液。
  8. さらに糖類を含有する、請求項５に記載の溶液。
  9. ｐＨが５〜８である、請求項１に記載の溶液。
  10. ＩｇＭ以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、請求項１に記載の溶液。
  11. ＩｇＭ以外のタンパク質を本質的に含有しない、請求項１に記載の溶液。
  12. 請求項１から１１に記載の溶液を凍結又は凍結乾燥して得られる医薬品製剤。
  13. 高濃度の免疫グロブリンを含有する溶液を安定化する方法であって、免疫グロブリンがＩｇＭであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。
  14. 溶液がＩｇＭを１ｍｇ／ｍＬより高濃度で含有する、請求項１３に記載の方法。
  15. 溶液が水性溶液である、請求項１３に記載の方法。
  16. 溶液が医薬品製剤である、請求項１３に記載の方法。
  17. 多価カチオン性イオンを１ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度で含有するように、溶液に多価カチオン性イオンを添加する、請求項１３に記載の方法。
  18. 多価カチオン性イオンが、Ｍｇイオン又はＡｒｇイオンである、請求項１３に記載の方法。
  19. さらに糖類を添加する、請求項１３に記載の方法。
  20. 溶液のｐＨが５〜８である、請求項１３に記載の方法。
  21. 溶液が、ＩｇＭ以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、請求項１３に記載の方法。
  22. 溶液が、ＩｇＭ以外のタンパク質を本質的に含有しない、請求項１３に記載の方法。
  23. （ａ）請求項１３から２２のいずれかの方法を実施する工程、
    （ｂ）工程（ａ）により安定化された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医薬品製剤の安定化方法。
  24. 高濃度の免疫グロブリンが安定化された溶液を製造する方法であって、免疫グロブリンがＩｇＭであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。
  25. 溶液がＩｇＭを１ｍｇ／ｍＬより高濃度で含有する、請求項２４に記載の方法。
  26. 溶液が水性溶液である、請求項２４に記載の方法。
  27. 溶液が医薬品製剤である、請求項２４に記載の方法。
  28. 多価カチオン性イオンを１ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度で含有するように、溶液に多価カチオン性イオンを添加する、請求項２４に記載の方法。
  29. 多価カチオン性イオンが、Ｍｇイオン又はＡｒｇイオンである、請求項２４に記載の方法。
  30. さらに糖類を添加する、請求項２４に記載の方法。
  31. 溶液のｐＨが５〜８である、請求項２４に記載の方法。
  32. 溶液が、ＩｇＭ以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、請求項２４に記載の方法。
  33. 溶液が、ＩｇＭ以外のタンパク質を本質的に含有しない、請求項２４に記載の方法。
  34. 請求項２４から３３のいずれかの方法により製造された溶液。
  35. （ａ）請求項２４から３３のいずれかの方法を実施する工程、
    （ｂ）工程（ａ）により製造された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医薬品製剤の製造方法。
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