WO2021085252A1 - 炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤 - Google Patents

炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤 Download PDF

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阪口　政清
豊岡　伸一
木下　理恵
恒太 荒木
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国立大学法人 岡山大学
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention is inflammatory, containing an antibody or antibody fragment having antigen-binding activity against a heterodimer of S100A8 protein (also simply referred to as "S100A8”) and S100A9 protein (also simply referred to as "S100A9”) as an active ingredient.
  • S100A8 also simply referred to as "S100A8”
  • S100A9 also simply referred to as "S100A9”
  • S100 protein is a calcium-binding protein that is expressed specifically in cell types and has two EF-hands, and 20 subfamilies have been confirmed so far.
  • S100A8 MRP8, calgranulin A
  • S100A9 MRP14, calgranulin B
  • S100A8 / A9 Calprotectin
  • RA rheumatoid arthritis
  • cystic fibrosis Crohn's disease
  • ulcerative colitis allergic dermatitis, and infection. It is thought to be involved in the development of chronic inflammatory diseases in humans.
  • S100A8 / A9 has the function of attracting distant cancer cells, which is secreted from the lungs, and the function of creating an immunosuppressive environment suitable for cancer cell colonization and proliferation in the lungs.
  • EMMPRIN Emprin
  • NPTN ⁇ Neuroroplastin- ⁇
  • NPTN ⁇ Neuron- ⁇
  • MCAM M-cell adhesion molecule
  • ALCAM Activated leukocyte cell adhesion molecule
  • Patent Document 1 shows that empurin is particularly a receptor for S100A9, and as a result of screening, it is disclosed that mugwort extract, angelica acutiloba extract, dead-nettle extract and the like inhibit the binding between empurin and S100A9.
  • Patent Document 2 discloses that as a result of screening, mugwort extract, licorice extract, carrot extract and the like inhibit the binding between NPTN and S100A8.
  • S100 inhibitors are useful for the treatment of cancer, autoimmune diseases, inflammatory diseases, neurodegenerative diseases and the like.
  • S100A9 has also been reported to be useful as a biomarker for inflammatory bowel disease (Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 1 reports that it binds to TLR4 and RAGE on the membrane of BV-2 microglial cells and stimulates NF- ⁇ B in BV-2 microglial cells via ERV and JNK to enhance its activity. (Non-Patent Document 1).
  • Inflammatory diseases in the lungs that is, diseases such as idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) and other idiopathic interstitial pneumonia (IIP) (hereinafter referred to as "inflammatory lung diseases").
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • IIP interstitial pneumonia
  • the number of patients suffering from.) Is steadily increasing.
  • idiopathic interstitial pneumonia idiopathic pulmonary fibrosis is a worldwide disease, in which steroids and immunosuppressants do not respond, and the average survival time after acute exacerbation is extremely within 2 months. Poor prognosis.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 Two types of molecular-targeted therapeutic agents (Pirfenidone and Nintedanib) are known as therapeutic agents for idiopathic pulmonary fibrosis (Non-Patent Documents 2 and 3), but both are symptomatic therapies. The fact is that it cannot be said to be a radical treatment because it cannot be expected to suppress or improve fibrosis.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2011-47932 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2014-59210 International Publication No. WO2015 / 177367 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-217956
  • An object of the present invention is to provide a drug capable of effectively preventing and / or treating inflammatory lung disease. More specifically, to provide a prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease containing an antibody or antibody fragment having antigen-binding activity as an active ingredient against S100A8 and / or S100A9 known as inflammation-related proteins. Is the subject.
  • S100A8 and / or S100A9 and its receptor group EMMPRIN, NPTN ⁇ , MCAM, ALCAM and RAGE
  • the present invention comprises the following. 1.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease containing an antibody or antibody fragment having antigen-binding activity against a heterodimer of S100A8 and S100A9 proteins as an active ingredient.
  • 3. The inflammatory lung disease according to the above item 1 or 2, wherein the antibody or antibody fragment has an antigen-binding activity against the heterodimer of S100A8 and S100A9, and does not have an antigen-binding activity with the S100A8 monomer and / or the S100A9 monomer.
  • Prophylactic and / or therapeutic agent 4. The prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease according to any one of the above items 1 to 3, wherein the antigen-binding activity has a neutralizing affinity. 5. The prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease according to any one of the above items 1 to 4, wherein the antibody or antibody fragment is a monoclonal antibody or a monoclonal antibody fragment. 6. The prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease according to item 5 above, wherein the subclass of the monoclonal antibody is one selected from IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 and IgG 4. 7.
  • the antibody or antibody fragment contains a heavy chain variable region 1 (CDR H1), a heavy chain variable region 2 (CDR H2), and a heavy chain variable region 3 (CDR H3), and a light chain variable region 1 (CDR H3).
  • the heavy chain variable region 1 (CDR H1) corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 19, or SEQ ID NO: 7, 10, 13, 16 or 19, respectively.
  • the heavy chain variable region 2 (CDR H2) is for each of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17 or 20, respectively. Contains any of the amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted.
  • the heavy chain variable region 3 (CDR H3) is for each of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 21, or SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18 or 21, respectively. Contains any of the amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted.
  • the light chain variable region 1 (CDR L1) is for each of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 34, or SEQ ID NO: 22, 25, 28, 31 or 34, respectively. Contains any of the amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted.
  • the light chain variable region 2 (CDR L2) is for each of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 35, or SEQ ID NO: 23, 26, 29, 32 or 35, respectively.
  • the inflammatory lung according to any one of 1 to 6 above, which comprises an antibody or an antibody fragment as an active ingredient, which comprises any of the amino acid sequences in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for the disease 8.
  • the heavy chain variable region 1 contains either SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the heavy chain variable region 2 contains either SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region 3 contains either SEQ ID NO: 9 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the light chain variable region 1 (CDR L1) comprises either SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22.
  • the light chain variable region 2 (CDR L2) comprises either SEQ ID NO: 23, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23.
  • the light chain variable region 3 (CDR L3) comprises either SEQ ID NO: 24, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24.
  • the heavy chain variable region 1 contains either SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the heavy chain variable region 2 contains either SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the heavy chain variable region 3 (CDR H3) contains either SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the light chain variable region 1 (CDR L1) comprises either SEQ ID NO: 25, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25.
  • the light chain variable region 2 (CDR L2) comprises either SEQ ID NO: 26, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
  • the light chain variable region 3 (CDR L3) comprises either SEQ ID NO: 27, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27.
  • the heavy chain variable region 1 (CDR H1) contains either SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • the heavy chain variable region 2 (CDR H2) contains either SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the heavy chain variable region 3 (CDR H3) contains either SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the light chain variable region 1 (CDR L1) comprises either SEQ ID NO: 28, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28.
  • the light chain variable region 2 (CDR L2) comprises either SEQ ID NO: 29, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29.
  • the light chain variable region 3 (CDR L3) comprises either SEQ ID NO: 30, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30.
  • the heavy chain variable region 1 (CDR H1) contains either SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the heavy chain variable region 2 (CDR H2) contains either SEQ ID NO: 17 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • the heavy chain variable region 3 (CDR H3) contains either SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18.
  • the light chain variable region 1 (CDR L1) comprises either SEQ ID NO: 31 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 31.
  • the light chain variable region 2 (CDR L2) comprises either SEQ ID NO: 32, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32.
  • the light chain variable region 3 (CDR L3) comprises either SEQ ID NO: 33, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 33.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease according to item 7 above. 12.
  • the heavy chain variable region 1 contains either SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • the heavy chain variable region 2 contains either SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • the heavy chain variable region 3 contains either SEQ ID NO: 21 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • the light chain variable region 1 comprises either SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34.
  • the light chain variable region 2 comprises either SEQ ID NO: 35, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 35.
  • the light chain variable region 3 (CDR L3) comprises either SEQ ID NO: 36, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease according to item 7 above. 13. Expression of NF- ⁇ B and pulmonary fibroblasts, which block the interaction between S100A8 and / or S100A9 and its receptor, RAGE, and induce the expression of inflammatory cytokines, which are transcription factors downstream of RAGE. Any of 1 to 12 above, which is characterized by suppressing the proliferation of activated fibroblasts, suppressing the proliferation of activated fibroblasts, and further suppressing the differentiation of activated fibroblasts into myofibroblasts.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease according to. 14. The prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease according to any one of the preceding paragraphs 1 to 13, as a prophylactic and / or therapeutic agent for COVID-19.
  • inflammatory lung disease is effective by blocking the interaction between S100A8 and / or S100A9 and RAGE, which is one of its receptors.
  • RAGE is a major receptor for S100A8 / A9 in the lung, is highly expressed in alveolar epithelial cells that cause inflammatory lung disease, and serves as a starting point for pathological conditions related to inflammatory lung disease.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention is a transcription factor that blocks the interaction between S100A8 and / or S100A9 and RAGE, which is one of its receptors, and is located downstream of RAGE.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention can effectively prevent and / or treat inflammatory lung disease.
  • thermodynamic stability about the purified S100A8 / A9 heterodimer, S100A8 monomer and S100A9 monomer.
  • Reference example 1 It is a figure which shows the result of having confirmed the neutralizing ability with respect to S100A8 / A9 heterodimer, S100A8 or S100A9 by the ELISA method about 10 clones selected from the hybridoma for anti-S100A8 / A9 antibody production.
  • Example 1 Using human keratinocytes in which inflammatory cytokines are strongly induced by S100A8 / A9, 10 clones selected from hybridomas for anti-S100A8 / A9 antibody production were subjected to TNF- ⁇ , IL-6 and IL-8 expression inhibitory effects. It is a figure which shows the confirmed result.
  • Example 2 It illustrates the Fab domain structure of the chimeric antibody by fusing human IgG 2 -Fc portions of anti-S100A8 / A9 monoclonal antibody (clone No.45).
  • Example 4 It is a figure which shows the proliferation enhancement of mouse fibroblast by S100A8 / A9.
  • Example 5 It is a figure which shows the proliferation enhancement of human fibroblast by S100A8 / A9.
  • Example 5 It is a figure which shows the evaluation result of S100A8 / A9-dependent NF- ⁇ B signal activation in fibroblast.
  • Example 6 It is a figure which shows the evaluation result of the NF- ⁇ B signal suppression by an anti-S100A8 / A9 antibody ( ⁇ -S100A8 / A9 antibody) in a fibroblast.
  • Example 6 It is a figure which shows the evaluation result of the expression induction of ⁇ -SMA by S100A8 / A9 in human lung fibroblast, and the ability of anti-S100A8 / A9 antibody ( ⁇ -S100A8 / A9 antibody) to suppress S100A8 / A9 inducible ⁇ -SMA expression. .. (Example 7) Induction of ⁇ -SMA and collagen expression by S100A8 / A9 in mouse fibroblasts and evaluation of S100A8 / A9-inducible ⁇ -SMA and collagen expression inhibitory ability by anti-S100A8 / A9 antibody ( ⁇ -S100A8 / A9 antibody) It is a figure which shows the result.
  • Example 7 It is a figure which shows the experimental protocol for confirming the lung injury suppression effect by the anti-S100A8 / A9 antibody using the bleomycin intratracheal administration pulmonary fibrosis model.
  • Example 8 It is a figure which shows the concentration-dependent weight loss suppression effect by administration of anti-S100A8 / A9 antibody in the bleomycin intratracheal administration pulmonary fibrosis model.
  • Example 8) It is a photographic figure which shows the CT scan result of the lung by the anti-S100A8 / A9 antibody administration in the bleomycin intratracheal administration pulmonary fibrosis model.
  • Example 8 It is a figure which shows the graph which quantified the high density area area of the lung by the anti-S100A8 / A9 antibody administration in the bleomycin intratracheal administration pulmonary fibrosis model.
  • Example 8 It is a figure which shows the survival rate of the mouse by the anti-S100A8 / A9 antibody administration in the bleomycin intratracheal administration pulmonary fibrosis model.
  • Example 8) It is a figure which shows the effect of the anti-S100A8 / A9 antibody to suppress the expression of TMPRSS2 in human lung cells.
  • Example 9 It is a figure which shows the graph which quantified the high density area area of the lung by the anti-S100A8 / A9 antibody administration in the bleomycin intratracheal administration pulmonary fibrosis model.
  • the present invention relates to a prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease, which contains an antibody or antibody fragment having antigen-binding activity against S100A8 / A9 as an active ingredient.
  • the "antibody having antigen-binding activity against S100A8 / A9” contained in the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention is referred to as "anti-S100A8 / A9 antibody", and is separately referred to as “antibody of the present invention”. It may also be called.
  • “S100A8 / A9” means a complex of S100A8 and S100A9, and may be referred to as "S100A8 / A9 heterodimer" in some cases.
  • the antibody of the present invention is an antibody prepared using the S100A8 / A9 heterodimer as an antigen, and has an antigen-binding activity against the S100A8 / A9 heterodimer.
  • the anti-S100A8 / A9 antibody preferably has a higher antigen-binding activity to the S100A8 / A9 heterodimer than the antigen-binding activity to the S100A8 monomer.
  • the anti-S100A8 / A9 antibodies those having an antigen-binding activity against the heterodimer of S100A8 and S100A9, and further having no antigen-binding activity with the S100A8 monomer and / or the S100A9 monomer are more preferable.
  • the antigen-binding activity may be any generally interpreted antigen-binding activity, and is not particularly limited, and examples thereof include neutralizing antibody affinity.
  • the anti-S100A8 / A9 antibody those having a higher neutralizing antibody affinity for the heterodimer of S100A8 and S100A9 than the neutralizing antibody affinity for the S100A8 monomer are preferable, and further, those having a higher neutralizing antibody affinity for the heterodimer of S100A8 and S100A9 are preferable. Those having a neutralizing antibody affinity for the heterodimer and not having a neutralizing antibody affinity with the S100A8 monomer and / or the S100A9 monomer are more preferable.
  • the antibody of the present invention is used in the broadest sense, and includes monoclonal antibody, polyclonal antibody, chimeric antibody and multispecific antibody as long as it exhibits the antigen-binding activity shown above.
  • the antibody of the present invention can contain a heavy chain variable region (VH-CDR) and / or a light chain variable region (VL-CDR) or a fragment thereof.
  • the class of antibody of the present invention refers to the type of constant domain or constant region provided in the heavy chain (H chain) of an antibody, and examples thereof include IgA, IgD, IgE, IgG and IgM.
  • the class of antibody in the present specification is not particularly limited, but IgG is most preferable. Examples of the IgG subclass include IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG 4, and the like, and IgG 1 or IgG 2 is preferable.
  • the "antibody fragment" of an antibody having antigen-binding activity against the S100A8 / A9 heterodimer has a portion of the antibody structure and retains the activity of the antibody of the present invention. Anything is fine.
  • the structure of the antibody fragment includes a fragment of the antigen binding site of the antibody, and examples thereof include a heavy chain variable region (VH-CDR) and / or a light chain variable region (VL-CDR) and a fragment thereof.
  • VH-CDR heavy chain variable region
  • VL-CDR light chain variable region
  • Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2 or a combination thereof can be exemplified.
  • the antibody of the present invention may be a human antibody, a humanized antibody, or a chimeric antibody.
  • Human antibody refers to an antibody having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of an antibody produced by humans or human cells, or an antibody derived from a non-human source using the human antibody repertoire or other human antibody coding sequences.
  • the amino acid sequence of VH-CDR and / or VL-CDR contained in the antibody of the present invention can include, for example, the amino acid sequence specified by the following SEQ ID NO:.
  • the heavy chain variable region 1 (CDRH1) can contain any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 19.
  • the heavy chain variable region 2 (CDR H2) can contain any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 20.
  • the heavy chain variable region 3 (CDR H3) can contain any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 21.
  • the light chain variable region 1 (CDR L1) can contain any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 34.
  • the light chain variable region 2 (CDR L2) region can contain any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 35.
  • the light chain variable region 3 can contain any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 36.
  • the amino acid sequence information of each of the above regions is also included in the scope of rights.
  • an anti-S100A8 / A9 antibody containing those amino acid sequences as long as it shows antigen-binding activity against the S100A8 / A9 heterodimer.
  • the antibody fragment is also included in the scope of rights of the present invention.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention can be prepared according to a conventional method using the above S100A8 / A9 heterodimer antigen.
  • the antibody of the present invention is a monoclonal antibody
  • a mammal such as a mouse or rat
  • lymphocytes are collected from the animal, and the hybridoma is fused with myeloma cells according to a conventional method.
  • Hybridomas can be prepared to produce anti-S100A8 / A9 antibodies.
  • Mammalian immunity can follow conventional methods.
  • a mixture of the above S100A8 / A9 heterodimer antigen and an adjuvant can be used as an immunogen to immunize an animal.
  • the adjuvant is not particularly limited, and examples thereof include Freund complete adjuvant and Freund incomplete adjuvant.
  • the method of administering the immunogen for immunization may be any of methods known per se, for example, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferable. Immunization may be performed once or multiple times at appropriate intervals, preferably multiple times at intervals of 1 to 5 weeks. It is possible to obtain the desired monoclonal antibody-producing cells by confirming the binding property of the culture supernatant of the prepared hybridoma to the S100A8 / A9 heterodimer by an ELISA method or the like and repeating the cloning operation of the antibody-producing hybridoma. it can. As a method for producing a humanized antibody, a method known per se can be applied.
  • Total RNA can be purified from hybridoma cells that produce antibodies according to a standard method, and subsequently cDNA can be synthesized.
  • Each gene fragment can be obtained by performing PCR on the antibody genes of the full length heavy chain (H chain) and light chain (L chain) from the obtained cDNA using the respective primers and amplifying them.
  • the gene for the antibody By ligating the obtained gene fragment to an expression vector, the gene for the antibody can be cloned.
  • the base sequence of the plasmid vector encoding them can be confirmed, and the amino acid sequence of the antibody can be determined based on the base sequence.
  • an antibody may be prepared by a gene recombination method or an antibody may be prepared by a synthetic method.
  • an antibody is produced by a gene recombination method, it can be produced, for example, by the method described in International Publication No. WO2017 / 061354.
  • amino acid sequence When producing an antibody by a gene recombination method, for example, genetic information encoding each amino acid that identifies CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2, and CDR L3 can be used.
  • amino acid sequence include any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 19 in CDR H1.
  • SEQ ID NO: 8 any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 20 can be mentioned.
  • any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: 21 can be mentioned.
  • any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 34 can be mentioned.
  • any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 35 can be mentioned.
  • the present invention also includes base sequence information encoding each amino acid that specifies the above-specified CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2, and CDR L3, and base sequence information of a complementary strand thereof.
  • the present invention has a base sequence in which the anti-S100A8 / A9 antibody of the present invention can be produced even if one or more nucleotides are substituted, deleted, added or inserted. Such base sequence information is also included in the scope of rights of the present invention.
  • the antibody screening method and antibody evaluation confirmation method of the present invention will be specifically described in Reference Examples, Examples and Experimental Examples described later, but the following methods can also be applied, for example.
  • hybridomas expressing multiple types of S100A8 / A9 neutralizing antibody candidates can be acclimated to serum-free culture and prepared in large quantities for in vitro and in vivo experiments.
  • the culture supernatant of each clone can be collected and the antibody can be purified.
  • a method known per se or any method developed in the future can be applied.
  • the antibody can be recovered by performing affinity chromatography. Specifically, affinity purification using Protein A / G is common, and a column suitable for each animal species and antibody subclass can be used. ..
  • the purity test of the purified antibody can be performed by a method known per se, for example, by CBB staining.
  • the S100A8 / A9 adsorptive decoy protein preparation (exEMMPRIN-Fc, exNPTN ⁇ -Fc, exMCAM-Fc, exRAGE-Fc, exALCAM-Fc), which is a receptor for S100A8 / A9, is used.
  • EMMPRIN-Fc exNPTN ⁇ -Fc
  • exMCAM-Fc exRAGE-Fc
  • exALCAM-Fc exALCAM-Fc
  • inflammatory lung disease refers to idiopathic / chronic inflammatory lung disease, bronchial asthma, which can be prevented and / or treated by the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention.
  • Means all inflammatory lung diseases such as interstitial pneumonia, for example, idiopathic interstitial pneumonia (IIP: idiopathic organizing pneumonia, non-specific interstitial) such as idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).
  • IIP idiopathic interstitial pneumonia
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention can effectively prevent and / or treat the inflammatory lung disease based on the mechanism of action described later.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention may be administered topically or systemically.
  • the antibody used in the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention has a pharmaceutically acceptable purity together with an optionally pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer. It is also possible to use it in combination with other antibodies other than the above antibody. It is also optional to use a lyophilized preparation or a water-soluble form for storage.
  • a pharmaceutically acceptable, sterile, aqueous or non-aqueous solution, diluent, suspension and It may contain an emulsion.
  • non-aqueous diluents examples include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil and organic ester compositions such as ethyloleate, which are suitable for injection.
  • the aqueous carrier may include water, an alcoholic aqueous solution, an emulsion, a suspension, a saline solution and a buffering medium.
  • Parenteral carriers may include sodium chloride solution, Ringer dextrose, dextrose and sodium chloride, Ringer lactic acid and binding oil.
  • Intravenous carriers may include, for example, liquid supplements, nutrients and electrolytes (eg, those based on Ringer dextrose).
  • the prophylactic and / or therapeutic agents for inflammatory lung disease of the present invention can further include preservatives and other additives such as antimicrobial compounds, antioxidants, chelating agents and inert gases.
  • preservatives and other additives such as antimicrobial compounds, antioxidants, chelating agents and inert gases.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention has one or more bioactive compounds, preferably complementary activities that do not adversely affect each other, as required, and is itself.
  • bioactive compounds preferably complementary activities that do not adversely affect each other, as required, and is itself.
  • one or more of other agents capable of reducing side effects can be used in combination.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention contains a therapeutically effective amount of anti-S100A8 / A9 antibody.
  • a therapeutically effective amount is an amount effective in achieving the desired therapeutic result at the required dose and duration.
  • the therapeutically effective amount may be set in consideration of the disease state, age, sex and body weight of the individual, and the efficacy of the drug that induces a desired reaction in the individual.
  • the prophylactic and / or therapeutic agents for inflammatory lung disease of the present invention are used in single or divided doses, usually every 24, 12, 8, 6, 4 or 2 hours or in any combination to initiate treatment. Later, usually 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, At least once on days 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40, or also 1, 2, 3, 4, Approximately 0.1 per day at least once in the 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th, 19th or 20th week, or any combination thereof.
  • ⁇ 100 mg / kg body weight for example 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 mg / kg body weight antibody amount It can be used as a daily dose.
  • the full-length S100A8 or the full-length S100A9 was incorporated into pET21, prepared from Escherichia coli by the same method as above, and purified (see Futami J. et al. (2016)).
  • the naturally occurring S100A8 / A9 heterodimer (simply abbreviated as “A8-A9 heterodimer”) is thermodynamically stable, but S100A8 (simply abbreviated as "A8") and S100A9 (simply abbreviated as "A8"). Since each of them forms a homodimer (abbreviated as "A9"), it is difficult to prepare a stable heterodimer of S100A8 / A9 even if S100A8 and S100A9 are mixed.
  • the S100A8 / A9 heterodimer prepared by the method of this reference example has high stability and can be used as the S100A8 / A9 heterodimer antigen prepared in the examples described later.
  • Example 1 Preparation of anti-S100A8 / A9 monoclonal antibody
  • preparation of the anti-S100A8 / A9 monoclonal antibody used in the following examples and experimental examples will be described.
  • the anti-S100A8 / A9 monoclonal antibody of this example was prepared using the S100A8 / A9 heterodimer prepared in the above (Reference Example 1) as an antigen.
  • the anti-S100A8 / A9 monoclonal antibody of this example uses the S100A8 / A9 heterodimer prepared in the above (Reference Example 1) as an antigen, and uses the monoclonal antibody contract service, Genostaff (Nippon Genetics). And made. Mice (BALB / c) were used as immunized animals, and Titer-MAX was used as an adjuvant for antigen immunization. According to the conventional method, the spleen of an immune animal and mouse myeloma cells (P3U1) were fused with polyethylene glycol (PEG1500) to prepare a hybridoma, and 160 clones were obtained.
  • PEG1500 polyethylene glycol
  • Example 2 Screening of neutralizing antibody
  • the effect of the monoclonal antibody produced from the 160 clone hybridomas prepared and selected in Example 1 on the production amount of S100A8 / A9-inducible inflammatory cytokines was exerted. confirmed.
  • human keratinocytes in which inflammatory cytokines are strongly induced by S100A8 / A9 the inhibitory effect of each antibody on the S100A8 / A9 signal was evaluated using the mRNA expression level of the inflammatory cytokines as an index.
  • each anti-S100A8 / A9 monoclonal antibody purified by Protein G column from 1 mL of the hybridoma culture supernatant of 30 ng / mL purified S100A8 / A9 and 160 clones was added to keratinocytes (Normal Human Keratinocytes: NHK).
  • the cells were collected after culturing at 37 ° C. for 3 hours, and the expression levels of TNF- ⁇ , IL-6, and IL-8 were analyzed by real-time quantitative PCR (qPCR).
  • qPCR Real-time quantitative PCR analysis was performed using the LightCycler rapid thermal cycler system (ABI 7900HT; Applied Biosystems). Measurements were made using forward (Fwd) and reverse (Rev) primers consisting of the following nucleotide sequences.
  • Fwd for TNF ⁇ measurement GACAAGCCTGTAGCCCATGT (SEQ ID NO: 1) Rev: TCTCAGCTCCACGCCATT (SEQ ID NO: 2)
  • IL-6 measurement Fwd: CTTCCCTGCCCCAGTACC (SEQ ID NO: 3) Rev: CTGAAGAGGTGAGTGGCTGTC (SEQ ID NO: 4)
  • IL-8 measurement Fwd: AGACAGCAGAGCACACAAGC (SEQ ID NO: 5) Rev: AGGAAGGCTGCCAAGAGAG (SEQ ID NO: 6)
  • Example 3 Amino acid sequence of variable region of selected antibody For five types of anti-S100A8 / A9 monoclonal antibodies (clone No .: 45, 85, 235, 258 and 260) selected from the above screening, heavy chain and light chain. The sequence of the variable region of was analyzed.
  • VH-CDR Clone No.45 CDR H1: SYWMQ (SEQ ID NO: 7) Clone No.45: CDR H2: AIYPGDGDTRDTQKFKG (SEQ ID NO: 8) Clone No.45: CDR H3: MAGYNYDNDY (SEQ ID NO: 9) Clone No.85: CDR H1: SGYNWH (SEQ ID NO: 10) Clone No.85: CDR H2: YIQYSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 11) Clone No.85: CDR H3: ALRYDYSWFAY (SEQ ID NO: 12) Clone No.235: CDR H1: NFWMN (SEQ ID NO: 13) Clone No.235: CDR H2: QIYPGKSDTNYNGKFKG (SEQ ID NO: 14) Clone No.235: CDR H3: WGAYYKYGGSYFDY (SEQ ID NO: 15) Clone No.258: CDR H1
  • Example 4 Preparation of anti-S100A8 / A9 chimeric antibody
  • a chimeric antibody was prepared by fusing a human IgG 2-Fc moiety to the Fab domain of an anti-S100A8 / A9 monoclonal antibody (clone No. 45). Sequence analysis and CDR analysis of the heavy chain and light chain variable regions of the anti-S100A8 / A9 monoclonal antibody (clone No. 45), and a stable expression vector for CHO cells incorporating the variable region of Human IgG 2 and the recombinant sequence was obtained.
  • the antibody was prepared and transduced into CHO cells by combining the genes of the human IgG 2- Fc moiety to stably prepare an anti-S100A8 / A9 chimeric antibody (see FIG. 7).
  • Antibodies were prepared by the method described in WO 2017/061354.
  • fibroblasts cultured in GIBCO (R) DMEM / F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) were placed in 6-well plates 2 ⁇ 10 5 each. Sown in cells / well. After 24 hours of culturing, the medium was replaced with a serum-free medium.
  • the medium was replaced with a medium containing 0.5% FBS, and S100A8 / A9 at each concentration was added.
  • EdU was added, and after 1 hour, the cells stained with EdU were confirmed under a microscope. As shown in FIGS. 8 and 9, the addition of S100A8 / A9 confirmed that the S100A8 / A9 concentration increased to 100 ng / mL, and the growth rate decreased at 1000 ng / mL.
  • Fibroblasts of B6 mice (WT) cultured in GIBCO (R) DMEM / F-12 medium containing 10% FBS were seeded in 5 ⁇ 10 5 cells in a 10 cm petri dish and replaced with serum-free medium 24 hours later. After culturing for another 6 hours, the cells were replaced with a medium containing 0.5% FBS, control buffer (PBS) or 100 ng / mL S100A8 / A9 was added, and after 0, 1, 6, 24, and 48 hours, the cells were washed with PBS and then collected. did. The cells were suspended in 100 ⁇ L of Thermo Scientific M-PER (Mammalian Protein Extraction Reagent) to prepare cell lysate.
  • Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent
  • Biotin-labeled NF- ⁇ B binding DNA probe (NF- ⁇ B consensus binding motif 5'-agttgaGGGGACTTTCCcaggc-3' (SEQ ID NO: 37)) and cell lysate are mixed, reacted on ice for 30 minutes, and then native gel electrophoresis (Native-). PAGE) was performed, the gel was transferred to a nitrocellulose membrane, cross-linked by UV irradiation, blocked, reacted with Avidin-HRP, and chemiluminescence was detected. As a result, it was confirmed that the activity of NF- ⁇ B was induced in a S100A8 / A9-dependent manner, and that the activity was maximized 6 hours after the addition (see FIG. 10).
  • a gel shift assay was performed using fetal fibroblasts (MEF) derived from B6 mice (WT) and RAGE knockout B6 mice (RAGE-/-) and fibroblasts derived from human normal fetal lung tissue (MRC-5).
  • MEF fetal fibroblasts
  • RAGE-/- RAGE knockout B6 mice
  • fibroblasts derived from human normal fetal lung tissue
  • control buffer 100 ng / mL S100A8 / A9, 1 ⁇ g / mL IgG (control), or 1 ⁇ g / mL anti-S100A8 / A9 antibody ( ⁇ -S100A8 / A9 antibody).
  • control buffer 100 ng / mL S100A8 / A9, 1 ⁇ g / mL IgG (control), or 1 ⁇ g / mL anti-S100A8 / A9 antibody ( ⁇ -S100A8 / A9 antibody).
  • NF- ⁇ B activity was observed in a system free of anti-S100A8 / A9 antibody.
  • suppression of NF- ⁇ B activity was confirmed in the system containing the anti-S100A8 / A9 antibody (see FIG. 11).
  • fetal fibroblasts (MEF) derived from RAGE knockout B6 mice (RAGE-/-) stimulation of the 100A8 / A9 complex was confirmed to slightly activate the NF- ⁇ B signal.
  • the slight activation of the NF- ⁇ B signal was considered to be due to receptors other than RAGE (EMMPRIN, NPTN ⁇ , MCAM, ALCAM identified by the present inventor as S100A8 / A9 receptors). Activation of the NF- ⁇ B signal was completely suppressed in the anti-S100A8 / A9 antibody.
  • ⁇ -S100A8 / A9 antibody means anti-S100A8 / A9 monoclonal antibody (clone No. 45), and IgG (control) means mouse IgG Isotype control. The same applies to the ⁇ -S100A8 / A9 antibody and IgG (control) shown in the following examples.
  • Example 7 Induction of expression of ⁇ -SMA and collagen (collagen) by S100A8 / A9 in fibrosis and evaluation of S100A8 / A9-inducible ⁇ -SMA and collagen expression inhibitory ability by anti-S100A8 / A9 antibody
  • the differentiation of activated fibrosis into myofibroblasts induces excessive deposition of collagen and extracellular matrix components, thereby exacerbating pulmonary fibrosis.
  • Nintedanib approved for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), inhibits fibroblast proliferation and differentiation into myofibroblasts.
  • ⁇ -SMA smooth muscle actin
  • FIGS. 12 and 13 After culturing for another 6 hours, the cells were replaced with a medium containing 0.5% FBS, and control buffer, 100 ng / mL S100A8 / A9, 1 ⁇ g / mL IgG (control) or 1 ⁇ g / mL anti-S100A8 / A9 antibody are shown in FIGS. 12 and 13. The cells were added in combination, and cell lysates were collected after 48 hours.
  • Fetal fibroblasts derived from B6 mice (WT) and RAGE knockout B6 mice (RAGE-/-) are specifically targeted for collagen chains denatured by anti- ⁇ -SMA monoclonal antibody, collagenase and mechanical damage to connective tissue. Proteins were detected using an anti-Tubulin antibody as a binding biolabeled probe and control.
  • S100A8 / A9 is a risk factor that induces the differentiation of fibroblasts into myofibroblasts. Then, the inhibitory effect of the anti-S100A8 / A9 antibody on the expression of ⁇ -SMA and collagen, which are markers of myofibroblasts, was confirmed (see FIGS. 12 and 13). These results suggest that the anti-S100A8 / A9 antibody has a preventive effect on pulmonary fibrosis.
  • Example 8 Intratracheal administration of bleomycin Pulmonary injury suppressing effect of anti-S100A8 / A9 antibody in pulmonary fibrosis model The pulmonary injury suppressing effect of anti-S100A8 / A9 antibody in bleomycin-induced pulmonary fibrosis model was confirmed. .. According to the protocol shown in FIG. 14, 50 ⁇ l of PBS containing 1.0 mg / kg bleomycin per mouse body weight was administered into the trachea of 7 C57BL / 6J females (8 weeks old) in each group to prepare lung injury model mice. .. One to two hours after the administration of bleomycin, PBS buffer (control group: 0 ⁇ g) or 200 ⁇ g and 500 ⁇ g of anti-S100A8 / A9 antibody was intravenously administered to the tail vein.
  • PBS buffer control group: 0 ⁇ g
  • 500 ⁇ g of anti-S100A8 / A9 antibody was intravenously administered to the tail vein.
  • FIG. 17 shows a graph in which the high-density area of the CT scan image (the region confirmed as white in the lung tissue of the CT scan image) is quantified by imaging.
  • the 500 ⁇ g administration group of anti-S100A8 / A9 antibody a significant inhibitory effect was observed on lung tissue injury and fibrosis 21 days after bleomycin administration.
  • the survival rate of mice in this experiment is shown in FIG.
  • mice No dead mice were confirmed in the 500 ⁇ g anti-S100A8 / A9 antibody group, but 5 out of 7 mice died in the antibody-non-antibody group.
  • the number "Number at risk” shown in the lower part of FIG. 18 indicates the number of surviving mice.
  • the anti-S100A8 / A9 antibody showed an excellent therapeutic effect on pulmonary fibrosis even in the in vivo system using the intratracheal administration pulmonary fibrosis model.
  • Example 9 Effect of anti-S100A8 / A9 antibody on suppressing TMPRSS2 expression in human lung cells As shown in Example 8, it was found that the anti-S100A8 / A9 antibody shows an excellent therapeutic effect on pulmonary fibrosis. Subsequently, while investigating the further pharmacological action of the anti-S100A8 / A9 antibody, TMPRSS2, which is one of the host proteolytic enzymes expressed in the respiratory epithelium, was found to be SARS-CoV-2. Focusing on one of the important proteins in the infection, we investigated the effect of anti-S100A8 / A9 antibody on TMPRSS2 expression.
  • the normal part of the lung tissue excised at the time of human lung cancer surgery was cut into pieces with a diameter of about 3 mm and treated with collagenase at 4 ° C. for 24 hours in a serum-free medium to disperse lung tissue-derived cells.
  • a serum-free medium After suspending the cells thus obtained in a serum-free medium, 1 ⁇ g / mL of purified S100A8 / A9 and 10 ⁇ g / mL anti-S100A8 / A9 antibody (clone No. 45) or 10 ⁇ g / mL control IgG was added. The cells were collected after culturing at 37 ° C.
  • TMPRSS2 can activate SARS-CoV-2 bound to the ACE2 receptor present on the cell surface and enhance the high rate of cell invasion (cleavage activation of Spike protein in the outer membrane of the virus). found.
  • S100A8 / A9 significantly induced the expression of TMPRSS2 in human lung cells, and the anti-S100A8 / A9 antibody was found. , It was found that the induced expression was remarkably suppressed.
  • the anti-S100A8 / A9 antibody not only suppresses cytokine storms induced by SARS-CoV-2 virus in the treatment of COVID-19, but also protects against SARS-CoV-2 infection by suppressing TMPRSS2 expression. It was suggested to be useful.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention is S100A8 / A9 whose expression is increased with inflammatory lung disease, and alveolar epithelial cells which are receptors thereof and are the origin of pathological conditions.
  • S100A8 / A9 whose expression is increased with inflammatory lung disease
  • alveolar epithelial cells which are receptors thereof and are the origin of pathological conditions.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for inflammatory lung disease of the present invention can also be suitably used for the prophylactic agent and / or treatment of COVID-19.
  • the industrial applicability of the present invention, which exerts such remarkable effects, is immeasurable.

Abstract

本発明は、炎症性肺疾患を効果的に予防及び／又は治療しうる炎症性肺疾患剤を提供するものであり、具体的には、S100A8/A9ヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する抗体又は抗体断片を有効成分として含む、炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤に関する。S100A8/A9とその受容体群との相互作用を遮断することにより、炎症性肺疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。詳細にはS100A8/A9とその受容体であるRAGEとの相互作用を遮断し、RAGEの下流にある転写因子であって、様々な炎症性サイトカインの発現を誘導するNF-κBの発現を抑制するとともに、活性化線維芽細胞の増殖を抑制し、更には、活性化線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を抑制することにより、炎症性肺疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。加えて、本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、COVID-19の予防及び／又は治療剤としても好適に用いることができる。

Description

炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤
　本発明は、S100A8タンパク質（単に「S100A8」ともいう。）及びS100A9タンパク質（単に「S100A9」ともいう。）のヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する抗体又は抗体断片を有効成分とする、炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１９－１９７２２２号優先権を請求する。
　S100タンパク質は細胞種特異的に発現し、2つのEF-handを持つカルシウム結合タンパク質であり、現在までに20種類のサブファミリーが確認されている。S100A8（MRP8、calgranulin A）はカルシウム結合タンパク質S100ファミリーの１つであり、通常はS100A9（MRP14、calgranulin B）と共発現する。S100A8とS100A9とのヘテロダイマーであるS100A8/A9（Calprotectin）は炎症時、体液に蓄積してリウマチ様関節炎（RA）、嚢胞性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、アレルギー性皮膚炎、感染などヒトの慢性炎症性疾患の発症に関与すると考えられている。
　S100A8/A9は、例えば肺から分泌され、遠隔のがん細胞を誘引する機能、そしてがん細胞の定着と増殖に適した免疫抑制の環境を肺につくる機能を有する。S100A8/A9の受容体群として、EMMPRIN（エンプリン）、 NPTNα（Neuroplastin-α）、NPTNβ、MCAM（M-cell adhesion molecule）、ALCAM（Activated leukocyte cell adhesion molecule）等が公知である。S100A8/A9の受容体のうち、エンプリンに着目した結合阻害による慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法について報告がある（特許文献１）。特許文献１では、エンプリンが特にS100A9の受容体であることが示されており、スクリーニングの結果、ヨモギエキス、トウキエキス、オドリコソウエキス等がエンプリンとS100A9の結合を阻害することが開示されている。S100A8/A9の受容体のうち、NPTNに着目した結合阻害による細胞増殖抑制のスクリーニング方法について報告がある（特許文献２）。特許文献２では、スクリーニングの結果、ヨモギエキス、カンゾウエキス、ニンジンエキス等がNPTNとS100A8の結合を阻害することが開示されている。S100阻害薬とされる化合物については、がん・自己免疫疾患・炎症性疾患及び神経変性疾患などの治療に有用であることが報告されている（特許文献３）。また、S100A9は炎症性腸疾患のバイオマーカーとしての有用性も報告されている（特許文献４）。
　さらに、S100A8/A9の受容体としてRAGE（Receptor for advanced glycation end product）も公知である（非特許文献１）。非特許文献１では、BV-2ミクログリア細胞の膜上でTLR4及びRAGEに結合し、ERV及びJNKを介してBV-2ミクログリア細胞内でのNF-κBを刺激し活性を増強させることが報告されている（非特許文献１）。
　肺における炎症性疾患、すなわち、特発性肺線維症（Idiopathic pulmonary fibrosis: IPF）をはじめとする特発性間質性肺炎（Idiopathic interstitial pneumonia: IIP）などの疾患（以下、「炎症性肺疾患」という。）に罹患した患者数は増加の一途を辿っている。特発性間質性肺炎の中でも特発性肺線維症は、全世界的にみられる疾患であり、ステロイドや免疫抑制剤が奏功せず、急性増悪後の平均生存期間は、２か月以内と極めて予後不良である。特発性肺線維症の治療薬として、２種類の分子標的治療薬（ピルフェニドン(Pirfenidone)及びニンテダニブ(Nintedanib)）が知られているが（非特許文献２、３）、いずれも対症療法であり、線維化の抑制や改善は期待できず、根本的治療とはいえないのが実情である。
特開2011-47932号公報 特開2014-59210号公報 国際公開第WO2015/177367号 特開2016-217956号公報
Li Ma et al., INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE (2017) 40: 31-38, DOI: 10.3892/ijmm.2017.2987 Margaritopoulos et al., BMC Pulmonary Medicine (2018) 18:177;　doi.org/10.1186/s12890-018-0736-z Lutz Wollin1 et al., European Respiratory Journal (2015); DOI: 10.1183/09031936.00174914
　本発明は、炎症性肺疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる薬剤を提供することを課題とする。より具体的には、炎症関連タンパク質として知られるS100A8及び／又はS100A9に対して、抗原結合活性を有する抗体又は抗体断片を有効成分として含む炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために、S100A8及び／又はS100A9とその受容体群（EMMPRIN、NPTNβ、MCAM、ALCAM及びRAGE）に着目し、鋭意研究を重ねた結果、S100A8及び／又はS100A9とその受容体群との相互作用を遮断することにより、炎症性肺疾患を効果的に予防及び／又は治療できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下よりなる。
１．S100A8及びS100A9タンパク質のヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する抗体又は抗体断片を有効成分として含む炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
２．抗体又は抗体断片が、S100A8モノマーに対する抗原結合活性よりも高い抗原結合活性を有することを特徴とする、前項１に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
３．抗体又は抗体断片が、S100A8及びS100A9のヘテロダイマーに対し、抗原結合活性を有し、S100A8モノマー及び／又はS100A9モノマーとは抗原結合活性を有さない、前項１又は２に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
４．抗原結合活性が中和親和性である、前項１～３のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
５．抗体又は抗体断片が、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片である、前項１～４のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
６．モノクローナル抗体のサブクラスが、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4より選択されるいずれかである、前項５に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
７．抗体又は抗体断片が、重鎖可変領域１（CDR H1）、重鎖可変領域２（CDR H2）及び重鎖可変領域３（CDR H3）を含む重鎖可変領域と、軽鎖可変領域１（CDR L1）、軽鎖可変領域２（CDR L2）及び軽鎖可変領域３（CDR L3）を含む軽鎖可変領域を含み、
重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６又は配列番号１９に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号７、１０、１３、１６又は１９それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７又は配列番号２０に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号８、１１、１４、１７又は２０それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８又は配列番号２１に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号９、１２、１５、１８又は２１それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１又は配列番号３４に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号２２、２５、２８、３１又は３４それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２又は配列番号３５に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号２３、２６、２９、３２又は３５それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３又は配列番号３６に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号２４、２７、３０、３３又は３６それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、抗体又は抗体断片を有効成分として含む、前項１～６のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
８．重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号７、あるいは配列番号７に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号８、あるいは配列番号８に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号９、あるいは配列番号９に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号２２、あるいは配列番号２２に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号２３、あるいは配列番号２３に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号２４、あるいは配列番号２４に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、前項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
９．重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号１０、あるいは配列番号１０に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号１１、あるいは配列番号１１に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号１２、あるいは配列番号１２に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号２５、あるいは配列番号２５に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号２６、あるいは配列番号２６に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号２７、あるいは配列番号２７に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、前項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療。
１０．重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号１３、あるいは配列番号１３に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号１４、あるいは配列番号１４に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号１５、あるいは配列番号１５に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号２８、あるいは配列番号２８に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号２９、あるいは配列番号２９に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号３０、あるいは配列番号３０に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、前項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
１１．重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号１６、あるいは配列番号１６に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号１７、あるいは配列番号１７に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号１８、あるいは配列番号１８に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号３１、あるいは配列番号３１に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号３２、あるいは配列番号３２に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号３３、あるいは配列番号３３に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、前項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
１２．重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号１９、あるいは配列番号１９に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号２０、あるいは配列番号２０に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号２１、あるいは配列番号２１に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号３４、あるいは配列番号３４に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号３５、あるいは配列番号３５に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号３６、あるいは配列番号３６に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、前項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
１３．S100A8及び／又はS100A9と、その受容体であるRAGEとの相互作用を遮断し、RAGEの下流にある転写因子であって、炎症性サイトカインの発現を誘導するNF-κBの発現及び肺線維芽細胞の増殖を抑制するとともに、活性化線維芽細胞の増殖を抑制し、更には、活性化線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を抑制することを特徴とする、前項１～１２のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
１４．COVID-19の予防及び／又は治療剤としての、前項１～１３のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
　本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤によれば、S100A8及び／又はS100A9と、その受容体の１種であるRAGEとの相互作用を遮断することにより、炎症性肺疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。ここにおいてRAGEはS100A8/A9の肺における主要な受容体であり、炎症性肺疾患を惹起する肺胞上皮細胞に高発現し、炎症性肺疾患に係る病態の起点となる。すなわち本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、S100A8及び／又はS100A9とその受容体の１種であるRAGEとの相互作用を遮断し、RAGEの下流にある転写因子であって、様々な炎症性サイトカインの発現を誘導するNF-κBの発現を抑制するとともに、活性化線維芽細胞の増殖を抑制し、更には、活性化線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を抑制する。前記作用メカニズムに基づき、本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、炎症性肺疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。
本発明の抗S100A8/A9抗体の作製用抗原としてのS100A8/A9ヘテロダイマー調製用発現ベクターの構造を示す図である。（参考例１） 精製したS100A8/A9ヘテロダイマー、S100A8モノマー及びS100A9モノマーについて、SDS-PAGEを行い、CBB染色した結果を示す写真図である。（参考例１） 精製したS100A8/A9ヘテロダイマー、S100A8モノマー及びS100A9モノマーについて、HPLC解析した結果を示す図である。（参考例１） 精製したS100A8/A9ヘテロダイマー、S100A8モノマー及びS100A9モノマーについて、熱力学的安定性を示す図である。（参考例１） 抗S100A8/A9抗体作製用ハイブリドーマから選抜した10クローンについて、S100A8/A9ヘテロダイマー、S100A8又はS100A9に対する中和能をELISA法にて確認した結果を示す図である。（実施例１） S100A8/A9により強く炎症性サイトカインが誘導されるヒトケラチノサイトを用いて、抗S100A8/A9抗体作製用ハイブリドーマから選抜した10クローンについて、TNF-α、IL-6及びIL-8の各発現抑制作用を確認した結果を示す図である。（実施例２） 抗S100A8/A9モノクローナル抗体（クローンNo.45）のFabドメインにヒト IgG2-Fc部分を融合させたキメラ抗体の構成を示す図である。（実施例４） S100A8/A9によるマウス線維芽細胞の増殖亢進を示す図である。（実施例５） S100A8/A9によるヒト線維芽細胞の増殖亢進を示す図である。（実施例５） 線維芽細胞におけるS100A8/A9依存的なNF-κBシグナル活性化の評価結果を示す図である。（実施例６） 線維芽細胞における抗S100A8/A9抗体（α-S100A8/A9 antibody）によるNF-κBシグナル抑制の評価結果を示す図である。（実施例６） ヒト肺線維芽細胞におけるS100A8/A9によるα-SMAの発現誘導及び抗S100A8/A9抗体（α-S100A8/A9 antibody）によるS100A8/A9誘導性α-SMA発現抑制能の評価結果を示す図である。（実施例７） マウス線維芽細胞におけるS100A8/A9によるα-SMA及びコラーゲン（collagen）の発現誘導及び抗S100A8/A9抗体（α-S100A8/A9 antibody）によるS100A8/A9誘導性α-SMA及びコラーゲン発現抑制能の評価結果を示す図である。（実施例７） ブレオマイシン気管内投与肺線維症モデルを用いた抗S100A8/A9抗体による肺傷害抑制効果確認のための実験プロトコールを示す図である。（実施例８） ブレオマイシン気管内投与肺線維症モデルにおける抗S100A8/A9抗体投与による濃度依存的体重減少抑制効果を示す図である。（実施例８） ブレオマイシン気管内投与肺線維症モデルにおける抗S100A8/A9抗体投与による肺のCTスキャン結果を示す写真図である。（実施例８） ブレオマイシン気管内投与肺線維症モデルにおける抗S100A8/A9抗体投与による肺の高密度エリア面積を定量化したグラフを示す図である。（実施例８） ブレオマイシン気管内投与肺線維症モデルにおける抗S100A8/A9抗体投与によるマウスの生存率を示す図である。（実施例８） 抗S100A8/A9抗体によるヒト肺細胞のTMPRSS2発現抑制効果を示す図である。（実施例９）
　本発明は、S100A8/A9に対して抗原結合活性を有する抗体又は抗体断片を有効成分として含有する、炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤に関する。本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤に含まれる「S100A8/A9に対して抗原結合活性を有する抗体」を「抗S100A8/A9抗体」といい、別途、「本発明の抗体」ともいう場合もある。本明細書において、「S100A8/A9」は、S100A8及びS100A9の複合体を意味し、場合によっては「S100A8/A9ヘテロダイマー」と称する場合もある。
　本明細書において、本発明の抗体は、S100A8/A9ヘテロダイマーを抗原として作製された抗体であって、S100A8/A9ヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する。前記抗S100A8/A9抗体は、好ましくはS100A8モノマーに対する抗原結合活性よりもS100A8/A9ヘテロダイマーに対して高い抗原結合活性を有する。前記抗S100A8/A9抗体の内、S100A8及びS100A9のヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有し、さらにはS100A8モノマー及び／又はS100A9モノマーとは抗原結合活性を有さないものがより好適である。上記において、抗原結合活性とは一般的に解釈される抗原結合活性であればよく、特に限定されないが、例えば中和抗体親和性を例示できる。更に、前記抗S100A8/A9抗体としては、S100A8モノマーに対する中和抗体親和性よりもS100A8及びS100A9のヘテロダイマーに対して高い中和抗体親和性を有するものが好適であり、更にはS100A8及びS100A9のヘテロダイマーに対して中和抗体親和性を有し、S100A8モノマー及び／又はS100A9モノマーとは中和抗体親和性を有さないものがより好適である。
　本明細書において、本発明の抗体は最も広い意味で使用され、上記に示す抗原結合活性を示す限りは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体や多重特異性抗体も含まれる。本発明の抗体は重鎖可変領域（VH-CDR）及び／又は軽鎖可変領域（VL-CDR）又はその断片を含むことができる。本発明の抗体のクラスは、抗体の重鎖（H鎖）に備わる定常ドメイン又は定常領域のタイプのことをいい、例えばIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが挙げられる。本明細書における抗体のクラスは特に限定されないがIgGが最も好適である。IgGのサブクラスとしては、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4などが挙げられ、好適にはIgG1又はIgG2である。
　本明細書において、S100A8/A9ヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する抗体の「抗体断片」は、抗体構造の部分を有し、上記本発明の抗体が有する活性を保持している抗体の断片であればよい。抗体断片の構造は、抗体の抗原結合部位の断片が挙げられ、例えば、重鎖可変領域（VH-CDR）及び／又は軽鎖可変領域（VL-CDR）やその断片が挙げられる。例えば、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2又はそれらの組合せを例示できる。
　本発明の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であってもよい。ヒト抗体は、ヒト又はヒト細胞によって産生された抗体、又はヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体をいう。
　本発明の抗体に含まれるVH-CDR及び／又はVL-CDRのアミノ酸配列は、例えば以下の配列番号で特定されるアミノ酸配列を含むことができる。例えば、重鎖可変領域１（CDR H1）には配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６又は配列番号１９に示すアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。重鎖可変領域２（CDR H2）には配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７又は配列番号２０に示すアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。重鎖可変領域３（CDR H3）には配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８又は配列番号２１に示すアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。例えば、軽鎖可変領域１（CDR L1）には配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１又は配列番号３４に示すアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。軽鎖可変領域２（CDR L2）領域には配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２又は配列番号３５に示すアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。軽鎖可変領域３（CDR L3）には配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３又は配列番号３６に示すアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。本発明は、上記各領域のアミノ酸配列情報も権利範囲に包含される。上記アミノ酸配列の他、各々について１～複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されていてもS100A8/A9ヘテロダイマーに対する抗原結合活性を示す限りはそれらアミノ酸配列を含む抗S100A8/A9抗体又は抗体断片も本発明の権利範囲に包含される。
　本発明の抗体や抗体断片は、上記S100A8/A9ヘテロダイマー抗原を使用して常法に従って作製することができる。
　本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合は、上記S100A8/A9ヘテロダイマー抗原でマウスやラット等の哺乳動物を免疫し、当該動物からリンパ細胞を採取し、常法に従い、ミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを作製し、抗S100A8/A9抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。哺乳動物の免疫は、常法に従うことができる。例えば上記S100A8/A9ヘテロダイマー抗原とアジュバントとを混合したものを免疫原として用いて動物を免疫することができる。アジュバントとしては、特に限定されないが、例えばフロイント完全アジュバント又はフロイント不完全アジュバント等が例示される。免疫の際の免疫原の投与法は、自体公知の方法、例えば皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回又は適宜の間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行なってもよい。上記作製したハイブリドーマについて、その培養上清をELISA法などでS100A8/A9ヘテロダイマーへの結合性を確認し、抗体産生ハイブリドーマのクローニング操作を繰り返すことにより、目的のモノクローナルな抗体産生細胞を得ることができる。ヒト化抗体の作製方法は、自体公知の方法等を適用することができる。
　抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、定法に従いTotal RNAを精製し、続いてcDNAを合成することができる。得られたcDNAより完全長の重鎖（H鎖）と軽鎖（L鎖）の抗体遺伝子をそれぞれのプライマーを用いてPCRを行ない増幅することによりそれぞれの遺伝子断片を取得することができる。得られた遺伝子断片を発現用ベクターにライゲーションすることにより、該抗体の遺伝子をクローニングすることができる。それら抗体のH鎖及びL鎖のアミノ酸配列は、それらをコードしているプラスミドベクターの塩基配列を確認し、それに基づいて該抗体のアミノ酸配列を決定することができる。得られたアミノ酸配列や塩基配列の情報を基にして、遺伝子組換えの手法により抗体を作製してもよいし、合成方法により抗体を作製してもよい。遺伝子組換えの手法により抗体を作製する場合は、例えば国際公開第WO2017/061354号に記載の方法により作製することができる。
　遺伝子組換えの手法により抗体を作製する場合は、例えばCDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2及びCDR L3を特定する各アミノ酸をコードする遺伝子情報を利用することができる。具体的なアミノ酸配列は、例えば、CDR H1では配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６又は配列番号１９に示すアミノ酸配列のいずれかが挙げられる。CDR H2では配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７又は配列番号２０に示すアミノ酸配列のいずれかが挙げられる。CDR H3では配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８又は配列番号２１に示すアミノ酸配列のいずれかが挙げられる。例えば、CDR L1では配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１又は配列番号３４に示すアミノ酸配列のいずれかが挙げられる。CDR L2では配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２又は配列番号３５に示すアミノ酸配列のいずれかが挙げられる。CDR L3では配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３又は配列番号３６に示すアミノ酸配列のいずれかが挙げられる。本発明は、上記特定されるCDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2及びCDR L3を特定する各アミノ酸をコードする塩基配列情報やその相補鎖の塩基配列情報も包含される。本発明は前記塩基配列情報の他、１～複数個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列であっても本発明の抗S100A8/A9抗体が作製可能な塩基配列である限りはそのような塩基配列情報も本発明の権利範囲に包含される。
　本発明の抗体のスクリーニング方法及び抗体評価の確認方法は、後述の参考例、実施例及び実験例等において具体的に説明するが、例えば以下の方法を適用することもできる。
　上記抗体産生ハイブリドーマから、複数種のS100A8/A9中和抗体候補を発現するハイブリドーマを無血清培養へ馴化し、in vitro, in vivo実験のために大量調製することができる。各クローンの培養上清を回収し、抗体の精製を行うことができる。抗体の精製は自体公知の方法や今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーを行って抗体を回収することができ、具体的にはProtein A/Gを使ったアフィニティー精製が一般的で、動物種や抗体サブクラスごとに適したカラムを使用することができる。精製した抗体の純度検定は、自体公知の方法によることができるが、例えばCBB染色によることができる。
　本発明の抗体又は抗体断片の評価のため、S100A8/A9の受容体であるS100A8/A9吸着性デコイタンパク質製剤（exEMMPRIN-Fc, exNPTNβ-Fc, exMCAM-Fc, exRAGE-Fc, exALCAM-Fc）は、適宜調製することができる。
　本明細書において「炎症性肺疾患」とは、本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤により、予防及び／又は治療することのできる、特発性／慢性炎症性肺疾患、気管支喘息、間質性肺炎などの炎症性の肺疾患全般を意味し、例えば、特発性肺線維症（IPF）をはじめとする特発性間質性肺炎（IIP：特発性器質化肺炎、非特異性間質性肺炎（NSIP）を含む）、特発性非特異性間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、過敏性肺炎、新型コロナウイルス感染症(COVID-19)などを例示できる。前記炎症性肺疾患の内、例えば、COPDと気管支喘息は近年急速に増加しており、昨今の統計データによれば、日本の全人口の3～6％が気管支喘息に罹患し、8.5％が COPD に罹患していると推定され、炎症性肺疾患がヒトの健康寿命に与える影響は大きく、社会経済、医療財政に与える損失は計り知れない。斯る炎症性肺疾患の病態において、活性化線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化及びそれに伴うコラーゲンや細胞外マトリックス成分の過剰発現、亢進、沈着は、肺線維化の悪化につながると考えられるところ、本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、後述する作用メカニズムに基づき、前記炎症性肺疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。
　本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、局所的に投与してもよいし、全身的に投与してもよい。本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤に使用される抗体は、任意選択で医薬上許容される担体、賦形剤や安定化剤とともに、医薬上許容される純度を有する本発明の抗体以外の他の抗体と併用することも可能である。また、保存のために凍結乾燥製剤又は水溶性の形態とすることも随意である。本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤を非経口投与の形態とする場合は、医薬上許容される、滅菌した、水性の、又は非水性の溶液、希釈剤、懸濁液及び乳濁液を含んでいてもよい。非水性希釈剤の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油及び有機エステル組成物、例えば、エチルオレエートであり、これらは注射用に適している。水性担体には、水、アルコール性水性溶液、乳濁液、懸濁液、食塩水及び緩衝化媒体が含まれていてもよい。非経口的担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、リンゲル乳酸及び結合油が含まれていてもよい。静脈内担体には、例えば、液体用補充物、栄養及び電解質（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）が含まれていてもよい。本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤はさらに、保存剤及び他の添加剤、例えば抗微生物化合物、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなどを含むことができる。以上に述べた、本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤における有効成分としての本発明の抗体以外の他の成分は、それらの１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
　本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、必要に応じて１種又は２種以上の生理活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものであり、自体公知の抗炎症剤、今後開発される抗炎症剤の他、例えば副作用を軽減可能な他の薬剤等の１種又は２種以上を併用して用いることができる。
　本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、治療上有効量の抗S100A8/A9抗体を含む。治療上有効量とは、必要な用量及び期間で、所望の治療結果を達成するのに有効な量をいう。治療上有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重や、個体において所望の反応を導く医薬の効能などを勘案して設定すればよい。
　本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、単回又は分割量を通常、24、12、8、6、4若しくは2時間ごとに又は任意の組合せで使用して、治療の開始後、通常、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39又は40日目に少なくとも１回、あるいはまた1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20週目に少なくとも１回、又はその任意の組合せで、一日当たり、約0.1～100 mg/kg体重、例えば0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90又は100 mg/kg体重の抗体量を一日当たりの用量として使用することができる。
　以下に、本発明を完成させるために行なった実験結果を参考例として示し、実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
（参考例１）抗S100A8/A9抗体作製用S100A8/A9ヘテロダイマーの調製
　本参考例では、以降の実施例で示す抗S100A8/A9抗体作製のための抗原としてのS100A8/A9ヘテロダイマーの調製について説明する。S100A8/A9ヘテロダイマーは、pET21へ全長S100A8及び全長S100A9を組みこんだ発現ベクター（図１参照）を用いて大腸菌により作製し、精製した（Futami J. et al., Biochem Biophys Rep., 19; 6: 94-100, (2016)参照）。比較例のために、全長S100A8又は全長S100A9をpET21へ組込み、上記と同手法により大腸菌により作製し、精製した（Futami J. et al. (2016)参照）。
　精製したS100A8/A9ヘテロダイマー及び比較例としてのS100A8モノマー、S100A9モノマーについてSDS-PAGEを行い、CBB染色した結果を図２に示した。S100A8/A9ヘテロダイマーについてはS100A8とS100A9がほぼ同量で、高純度に精製されたことが確認された。さらにS100A8/A9ヘテロダイマーについて、HPLC解析した。その結果、S100A8、S100A9及びS100A8/A9の構造を比較した結果、S100A8/A9のみモノマーの存在が確認されず大半がダイマー構造であった（図３参照）。一方、比較例として作製したS100A8及びS100A9はモノマーとダイマーの混合物であった（図３参照）。
　図４では、天然に発生したS100A8/A9ヘテロダイマー（単に、「A8-A9 heterodimer」と略記）は熱力学的に安定であるが、S100A8（単に、「A8」と略記）とS100A9（単に、「A9」と略記）は各々ホモダイマーを形成するため、S100A8とS100A9を混合しても安定的なS100A8/A9のヘテロダイマーを作製することが困難であることを示している。本参考例の方法により調製されたS100A8/A9ヘテロダイマーは、安定性が高く、後述する実施例で作製するS100A8/A9ヘテロダイマー抗原として使用可能である。
（実施例１）抗S100A8/A9モノクローナル抗体の作製
　本実施例では、以下の実施例及び実験例で使用する抗S100A8/A9モノクローナル抗体の作製について説明する。本実施例の抗S100A8/A9モノクローナル抗体は、上記（参考例１）で調製したS100A8/A9ヘテロダイマーを抗原として作製した。
（１）ハイブリドーマの作製
　本実施例の抗S100A8/A9モノクローナル抗体は、上記（参考例１）で調製したS100A8/A9ヘテロダイマーを抗原とし、モノクローナル抗体受託サービス、ジェノスタッフ（日本ジェネティクス）を利用して作製した。免疫動物はマウス（BALB/c）を用い、抗原の免疫にはTiter-MAXをアジュバンドとして用いた。従来法に従い免疫動物の脾臓とマウスミエローマ細胞（P3U1）を、ポリエチレングリコール（PEG1500）を用いて融合させ、ハイブリドーマを作製し、160クローンを得た。
（２）ハイブリドーマのクローニング及び抗体の作製
　上記得られた160クローンのハイブリドーマから、S100A8/A9ヘテロダイマー、S100A8又はS100A9を固相化してELISAスクリーニングを行ない、図５に示す10クローンを選抜した。選抜したS100A8/A9中和抗体（図５に示す「α-S100A8/A9 antibody」）候補を発現するハイブリドーマを無血清培養へ馴化し、in vitro及びin vivo実験のために大量調製した。各クローンの培養上清を回収し、Protein Gカラムにより精製を行い、すべてのクローンについて数ミリグラムのタンパク質を調製した。CBB染色による純度検定を行ったところ、目的タンパク質以外のバンドは全く検出されず、高純度で精製抗体が調製されていることを確認した。
（３）モノクローナル抗体の反応性
　上記（２）で選抜した10クローンについて、S100A8/A9ヘテロダイマー、S100A8又はS100A9に対する反応性及びサブクラスを確認し、表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
（実施例２）中和抗体のスクリーニング
　本実施例では実施例１で作製して選抜した160クローンのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体について、S100A8/A9誘導性炎症性サイトカインの産生量に及ぼす影響を確認した。S100A8/A9により強く炎症性サイトカインが誘導されるヒトケラチノサイトを用いて、各抗体のS100A8/A9シグナルの抑制効果を炎症性サイトカインのmRNA発現量を指標に評価した。具体的には、30 ng/mLの精製S100A8/A9と160クローンのハイブリドーマ培養上清1 mLからProtein Gカラムにより精製した各抗S100A8/A9モノクローナル抗体をケラチノサイト（Normal Human Keratinocytes: NHK）へ添加し、37℃、3時間培養後の細胞を回収し、TNF-α、IL-6、IL-8の各mRNA発現量をリアルタイム定量PCR（qPCR）解析を行った。
　リアルタイム定量PCR（qPCR）解析は、LightCycler rapid thermal cycler system（ABI 7900HT; Applied Biosystems社）を用いて行った。以下の塩基配列からなるフォワード（Fwd）及びリバース（Rev） プライマーを用いて測定した。
TNFα測定用 Fwd：GACAAGCCTGTAGCCCATGT（配列番号１）
　　　　　　Rev：TCTCAGCTCCACGCCATT（配列番号２）
IL-6測定用　Fwd：CTTCCCTGCCCCAGTACC（配列番号３）
　　　　　　Rev：CTGAAGAGGTGAGTGGCTGTC（配列番号４）
IL-8測定用　Fwd：AGACAGCAGAGCACACAAGC（配列番号５）
　　　　　　Rev：AGGAAGGCTGCCAAGAGAG（配列番号６）
　上記の結果、選抜した10クローン（クローンNo.：26，42，45，85，108，213，219，235，258及び260）存在下でのS100A8/A9（単に、「A8/A9」と略記）誘導性炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-6及びIL-8）の測定結果を図６に示した。その結果から特に抑制力の高い抗体5種（S100A8（単に、「A8」と略記）に反応する抗体1種、S100A9（単に、「A9」と略記）に反応する抗体2種、S100A8/A9複合体（単に、「A8/A9」と略記）にのみ反応する抗体2種）を選抜した。また、図６中の「α-S100A8/A9 antibody」は、抗S100A8/A9モノクローナル抗体を意味する。
（実施例３）選別した抗体の可変領域のアミノ酸配列
　上記スクリーニングより選別した５種の抗S100A8/A9モノクローナル抗体（クローンNo.：45，85，235，258及び260）について、重鎖及び軽鎖の可変領域の配列を解析した。
VH-CDR
クローンNo.45：CDR H1 :SYWMQ （配列番号７）
クローンNo.45：CDR H2 :AIYPGDGDTRDTQKFKG （配列番号８）
クローンNo.45：CDR H3 :MAGYNYDNDY（配列番号９）
クローンNo.85：CDR H1 :SGYNWH （配列番号１０）
クローンNo.85：CDR H2 :YIQYSGSTNYNPSLKS （配列番号１１）
クローンNo.85：CDR H3 :ALRYDYSWFAY（配列番号１２）
クローンNo.235：CDR H1 :NFWMN（配列番号１３）
クローンNo.235：CDR H2 :QIYPGKSDTNYNGKFKG （配列番号１４）
クローンNo.235：CDR H3 :WGAYYKYGGSYFDY（配列番号１５）
クローンNo.258：CDR H1 :TASMGVS （配列番号１６）
クローンNo.258：CDR H2 :HIYWDDDKRYNPSLKS （配列番号１７）
クローンNo.258：CDR H3 :RPLGYFDV（配列番号１８）
クローンNo.260：CDR H1 :NYGVH（配列番号１９）
クローンNo.260：CDR H2 :VVWAGGSTNYNSALMS （配列番号２０）
クローンNo.260：CDR H3 :ARDYYGYDGYFGA（配列番号２１）
VL-CDR
クローンNo.45：CDR L1 :KASQDINKYIA （配列番号２２）
クローンNo.45：CDR L2 :YTSTLQP （配列番号２３）
クローンNo.45：CDR L3 :LQYDNLRT（配列番号２４）
クローンNo.85：CDR L1 :KASQDVSTAVA （配列番号２５）
クローンNo.85：CDR L2 :SASYRYT （配列番号２６）
クローンNo.85：CDR L3 :QQHYSTPLT（配列番号２７）
クローンNo.235：CDR L1 :SASQGISNYLN（配列番号２８）
クローンNo.235：CDR L2 :YTSSLHS （配列番号２９）
クローンNo.235：CDR L3 :QQYSKFPYT（配列番号３０）
クローンNo.258：CDR L1 :KASQDINNYIS （配列番号３１）
クローンNo.258：CDR L2 :YTSTLQP （配列番号３２）
クローンNo.258：CDR L3 :LQYDNLLWT（配列番号３３）
クローンNo.260：CDR L1 :KASQDINSYLT （配列番号３４）
クローンNo.260：CDR L2 :RANRLVD （配列番号３５）
クローンNo.260：CDR L3 :LQYDEFPLT（配列番号３６）
（実施例４）抗S100A8/A9キメラ抗体の作製
　本実施例では、抗S100A8/A9モノクローナル抗体（クローンNo.45）のFabドメインにヒト IgG2-Fc部分を融合させたキメラ抗体を作製した。抗S100A8/A9モノクローナル抗体（クローンNo.45）の重鎖及び軽鎖の可変領域の配列解析・CDR解析し、Human IgG2の可変領域と組換えた配列を組み込んだCHO細胞用安定発現ベクターを作製し、ヒト IgG2-Fc部分の遺伝子を組み合わせてCHO細胞に形質導入し、安定的に抗S100A8/A9キメラ抗体を作製した（図７参照）。抗体は、国際公開第WO2017/061354号に記載の方法により作製した。
（実施例５）S100A8/A9による線維芽細胞の増殖亢進
　肺線維症の原因の一つとして、線維芽細胞の異常増殖があげられる。そこでS100A8/A9依存的な線維芽細胞の増殖について検討した。B6マウス（野生型：WT）及びS100A8/A9の肺での主要な受容体であるRAGEをノックアウトしたB6マウス（RAGE-/-）由来の胎児線維芽細胞（Mouse Embryo Fibroblasts: MEF）の、S100A8/A9添加による増殖亢進をEdU（5-ethynil-2'-deoxyuridine）染色法により確認した（図８参照）。ヒト胎児正常肺組織由来線維芽細胞（Human Lung Fibroblasts）MRC-5細胞の、S100A8/A9添加による増殖亢進を同様にEdU染色法により確認した（図９参照）。具体的には以下の方法で確認した。まず、10％ウシ胎児血清（FBS）含有GIBCO(R) DMEM/F-12（Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12）培地で培養した線維芽細胞を、各々6ウェルプレートへ2×105 cells/wellで播種した。培養24時間後に無血清培地に交換した。さらに24時間培養後、0.5％FBS含有培地に交換し、各濃度のS100A8/A9を添加した。さらに5時間培養後にEdUを添加し、1時間後にEdUで染色された細胞を顕微鏡で確認した。図８及び図９に示すとおり、S100A8/A9の添加により、S100A8/A9濃度が100 ng/mLまで増殖亢進が確認され、1000 ng/mLでは増殖速度が減弱した。
　上記の結果から、S100A8/A9は線維芽細胞に対して、増殖因子様の働きを示すことが確認された。一方、RAGEノックアウトB6マウス（RAGE-/-）由来細胞では、増殖亢進が確認されなかった。このことから、S100A8/A9は、線維芽細胞上の受容体であるRAGEを介して細胞増殖を促進することが示唆された。
（実施例６）線維芽細胞におけるS100A8/A9依存的なNF-κBシグナル活性化及び抗S100A8/A9抗体によるNF-κBシグナル抑制の評価
　S100A8/A9受容体であるRAGEの下流に存在する転写因子NF-κBは、その活性化により様々な炎症性サイトカインの発現を誘導する。線維芽細胞におけるS100A8/A9依存的なNF-κBシグナルの活性化を評価するため、NF-κBとBiotin標識NF-κB結合DNAプローブとの相互作用の検出をゲルシフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assay: EMSA）を用いて行った。次に、S100A8/A9で誘導されたNF-κBに対する抗S100A8/A9抗体の作用を、同様にゲルシフトアッセイにより確認した。
　具体的には以下の方法で確認した。10％FBS含有GIBCO(R) DMEM/F-12培地で培養したB6マウス（WT）の線維芽細胞を10 cmシャーレへ5×105個播種し、24時間後に無血清培地に交換した。さらに6時間培養後、0.5％FBS含有培地に交換し、コントロールバッファー（PBS）又は100 ng/mL S100A8/A9を添加し、0、1、6、24、48時間後に細胞をPBSで洗浄後回収した。細胞は、Thermo Scientific社のM-PER （Mammalian Protein Extraction Reagent）100μLで懸濁し、細胞ライセート（cell lysate）を調製した。Biotin標識NF-κB 結合DNAプローブ（NF-κB consensus binding motif 5'-agttgaGGGGACTTTCCcaggc-3'（配列番号３７））と細胞ライセートとを混合し、氷上で30分間反応後、ネイティヴゲル電気泳動（Native-PAGE）を行い、ゲルをニトロセルロース膜に転写し、UV照射によるクロスリンク後、ブロッキングし、Avidin-HRPと反応させ、化学発光検出を行った。その結果、S100A8/A9依存的にNF-κBの活性が誘導され、添加6時間後にその活性が最大になることを確認した（図１０参照）。
　次に、B6マウス（WT）及びRAGEノックアウトB6マウス（RAGE-/-）由来の胎児線維芽細胞（MEF）とヒト胎児正常肺組織由来の線維芽細胞（MRC-5）を用いて、ゲルシフトアッセイを行い、S100A8/A9で誘導されたNF-κBに対する抗S100A8/A9抗体の作用を確認した。10％FBS含有GIBCO(R) DMEM/F-12培地で培養したマウス由来の線維芽細胞をそれぞれ5×105個、MRC-5細胞を1.5×105個を各々10 cmシャーレへ播種し、24時間後に無血清培地に交換した。6時間培養後、0.5％FBS含有培地に交換し、コントロールバッファー、100 ng/mL S100A8/A9、1μg/mL IgG（コントロール）、又は1μg/mL 抗S100A8/A9抗体（α-S100A8/A9 antibody）を図１１に示す組み合わせで添加し、さらに6時間培養したのち、細胞ライセートを回収した。次いで、上記と同様の手法で実験を行った。その結果、B6マウス（WT）胎児線維芽細胞（MEF）及びヒト胎児正常肺組織由来の線維芽細胞MRC-5細胞において、抗S100A8/A9抗体を含まない系ではNF-κBの活性が認められたが、抗S100A8/A9抗体を含む系ではNF-κBの活性抑制が確認された（図１１参照）。RAGEノックアウトB6マウス（RAGE-/-）由来の胎児線維芽細胞（MEF）では100A8/A9複合体の刺激により、わずかにNF-κBシグナルが活性化することが確認された。ちなみにNF-κBシグナルのわずかな活性化は、RAGE以外の受容体（S100A8/A9受容体として本発明者が同定したEMMPRIN, NPTNβ, MCAM, ALCAM）によるものと考えられた。NF-κBシグナルの活性化は、抗S100A8/A9抗体において完全に抑制された。
　なお、抗S100A8/A9抗体に関し、図１１ではα-S100A8/A9 antibodyと明記した。α-S100A8/A9 antibodyは抗S100A8/A9モノクローナル抗体（クローンNo.45）を意味し、IgG（コントロール）は、マウスIgG Isotype controlを意味する。以下の実施例に示す各図のα-S100A8/A9 antibody及びIgG（コントロール）についても同様である。
（実施例７）線維芽細胞におけるS100A8/A9によるα-SMA及びコラーゲン（collagen）の発現誘導及び抗S100A8/A9抗体によるS100A8/A9誘導性α-SMA及びコラーゲン発現抑制能の評価
　肺線維症の病態において、活性化線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化は、それに伴いコラーゲンや細胞外マトリックス成分の過剰沈着を誘導し、肺線維化を悪化させる。特発性肺線維症（IPF）の治療薬として認可されているニンテダニブは、線維芽細胞の増殖及び筋線維芽細胞への分化を阻害する。そこでS100A8/A9が線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化を誘導するリスク因子であることを筋線維芽細胞のマーカーであるα-SMA（α-smooth muscle actin）の発現により確認し、α-SMA発現に対する抗S100A8/A9抗体の作用を確認した。
　具体的には以下の方法で確認した。10％FBS含有GIBCO(R)DMEM/F-12培地で培養したヒト胎児正常肺組織由来の線維芽細胞（MRC-5）を5×104個、及びB6マウス（WT）及びRAGEノックアウトB6マウス（RAGE-/-）由来の胎児線維芽細胞をそれぞれ3×105個、各々10 cmシャーレへ播種し、24時間後に無血清培地に交換した。さらに6時間培養後、0.5％FBS含有培地に交換し、コントロールバッファー、100 ng/mL S100A8/A9、1μg/mL IgG（コントロール）又は1μg/mL 抗S100A8/A9抗体を図１２、図１３に示す組み合わせで添加し、48時間後に細胞ライセートを回収した。
　上記回収した細胞ライセートについて、ウェスタンブロッティング（Western Blotting）を行い、タンパク質を検出した。ヒト胎児正常肺組織由来の線維芽細胞（MRC-5）については、抗α-SMAモノクローナル抗体及びコントロールとして抗Tubulin抗体を用いてタンパク質を検出した。MRC-5細胞において、S100A8/A9はα-SMAの発現を強く誘導し、その発現上昇は抗S100A8/A9抗体との共培養により、顕著に抑制された（図１２参照）。B6マウス（WT）及びRAGEノックアウトB6マウス（RAGE-/-）由来の胎児線維芽細胞については抗α-SMAモノクローナル抗体、コラゲナーゼや結合組織の機械的な損傷などにより変性したコラーゲン鎖に特異的に結合するビオチン標識プローブ及びコントロールとして抗Tubulin抗体を用いてタンパク質を検出した。
　B6マウス（WT）由来の胎児線維芽細胞において、S100A8/A9はα-SMAの発現及びコラーゲンの発現を強く誘導した。S100A8/A9により誘導されたα-SMA及びコラーゲンの発現上昇は、抗S100A8/A9抗体との共培養により顕著に抑制された（図１３参照）。一方、RAGEノックアウトB6マウス（RAGE-/-）由来の胎児線維芽細胞については、S100A8/A9によるα-SMA及びコラーゲンの発現量の上昇が確認されなかった。このことから、S100A8/A9は、線維芽細胞上の受容体であるRAGEを介してα-SMA及びコラーゲンの発現を誘導することが示唆された。
　上記により、S100A8/A9が線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化を誘導するリスク因子であることが確認された。そして、筋線維芽細胞のマーカーであるα-SMAやコラーゲンの発現に対して抗S100A8/A9抗体の抑制作用が確認された（図１２、図１３参照）。これらの結果から、抗S100A8/A9抗体による肺線維症に対する予防効果が示唆された。
（実施例８）ブレオマイシン（Bleomycin）の気管内投与肺線維症モデルにおける抗S100A8/A9抗体での肺傷害抑制効果
　ブレオマイシン誘発肺線維症モデルにおける抗S100A8/A9抗体での肺傷害抑制効果を確認した。図１４に示すプロトコールに従い、各群7匹のC57BL/6J雌（8週齢）の気管内へマウスの体重当たり1.0 mg/kgのブレオマイシンを含むPBSを50μl投与し、肺傷害モデルマウスを作製した。ブレオマイシン投与後1～2時間後にPBSバッファー（コントロール群：0μg）、又は200μg及び500μgの抗S100A8/A9抗体を尾静脈内投与した。
　ブレオマイシン投与後7日、14日及び21日経過時の、肺障害モデルマウスの体重の変化を観察したところ、7及び14日目には、コントロール群に対して抗S100A8/A9抗体の500μg投与群で、有意にマウスの体重減少抑制効果が認められた。21日目には、抗S100A8/A9抗体の200μg投与群及び500μg投与群のいずれについてもコントロール群に対して有意にマウスの体重減少抑制効果が認められた（図１５）。
　さらにブレオマイシン投与後21日目にCTスキャンにより、抗S100A8/A9抗体の肺障害抑制効果を確認した。代表的なCTスキャンの画像を図１６に示す。また、CTスキャンの画像の高密度エリア（CTスキャン画像の肺組織の中で白く確認される領域）をイメージングにより定量化したグラフを図１７に示す。抗S100A8/A9抗体の500μg投与群においてブレオマイシン投与後21日目の肺組織の傷害・線維化について有意な抑制効果が観察された。さらに、本実験におけるマウスの生存率を図１８に示した。抗S100A8/A9抗体の500μg投与群では、死亡したマウスは確認されなかったが、抗体未投与群においては、7匹中5匹のマウスの死亡が確認された。なお、図１８の下段に示す「Number at risk」の数字は、生存マウスの匹数を示す。
　上記により、抗S100A8/A9抗体は、気管内投与肺線維症モデルを用いたin vivoの系においても肺線維症に対して優れた治療効果を示した。
（実施例９）抗S100A8/A9抗体によるヒト肺細胞のTMPRSS2発現抑制効果
　実施例８に示すとおり、抗S100A8/A9抗体は、肺線維症に対して優れた治療効果を示す知見を得た。引き続き、本発明者らは抗S100A8/A9抗体の更なる薬理学的作用について検討する中、呼吸器上皮に発現している宿主のタンパク分解酵素の一つであるTMPRSS2が、SARS-CoV-2の感染において重要なタンパク質の1つであることに着眼し、抗S100A8/A9抗体がTMPRSS2発現に及ぼす影響について調べた。すなわち、ヒト肺細胞を用いて、S100A8/A9タンパク質依存的なTMPRSS2発現変化及び抗S100A8/A9抗体として抗S100A8/A9モノクローナル抗体（クローンNo.45）を用いて、抗S100A8/A9抗体がTMPRSS2発現に及ぼす影響について調べた。
　すなわち、ヒト肺がん手術時に切除した肺組織の正常な部分を直径約3 mm程度に切り分け、血清不含培地中、コラゲナーゼで4℃、24時間処理し、肺組織由来細胞を分散させた。斯くして得られた細胞を血清不含培地で懸濁した後、1μg/mLの精製S100A8/A9及び10μg/mL 抗S100A8/A9抗体（クローンNo.45）又は10μg/mL コントロールIgGを添加し、37℃、6時間培養後の細胞を回収し、 RNAを抽出し、TMPRESS2についてリアルタイム定量PCR（qPCR）解析を行った（図１９）。前記リアルタイム定量 PCR（qPCR）解析は、StepOnePlus Realtime PCR（Applied Biosystems社）を用いるとともに、以下の塩基配列からなるフォワード（Fwd）及びリバース（Rev）プライマーを用いて測定した。
TMPRSS2測定用プライマー配列
Fwd :　GATGACAGCGGATCCACCAG（配列番号３８）
Rev :　CCGCAGGCTATACAGCGTAA（配列番号３９）
　その結果、TMPRSS2は、細胞の表面に存在するACE2受容体に結合したSARS-CoV-2を活性化し、細胞への侵入高率を増強させる（ウイルス外膜のSpikeタンパク質の開裂活性化）ことが判明した。次いで、本発明者らは、ヒト肺細胞におけるTMPRSS2の発現に注目し、そのmRNA発現を解析したところ、S100A8/A9がヒト肺細胞のTMPRSS2の発現を有意に誘導し、抗S100A8/A9抗体は、その誘導発現を顕著に抑制することが判明した。
　前記知見に基づき、抗S100A8/A9抗体は、COVID-19の治療において、SARS-CoV-2ウイルスにより誘導されるサイトカインストームの抑制効果に加え、TMPRSS2発現抑制によるSARS-CoV-2感染防御にも有用であることが示唆された。
　以上述べたとおり、本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、炎症性肺疾患に伴い発現上昇するS100A8/A9と、その受容体であって病態の起点となる肺胞上皮細胞に高発現するRAGE及び肺線維芽細胞に発現する複数のS100A8/A9受容体との相互作用を遮断することにより、肺胞上皮細胞の炎症性サイトカイン放出及び肺線維芽細胞の増殖を抑制し、更には、活性化線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を抑制することにより、炎症性肺疾患を効果的に予防及び／又は治療することができる。加えて、本発明の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤は、COVID-19の予防剤及び／又は治療にも好適に用いることができる。斯くも顕著な作用効果を奏する本発明の産業上の有用性は、計り知れない。

Claims (14)

  1. S100A8及びS100A9タンパク質のヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する抗体又は抗体断片を有効成分として含む炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  2. 抗体又は抗体断片が、S100A8モノマーに対する抗原結合活性よりも高い抗原結合活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  3. 抗体又は抗体断片が、S100A8及びS100A9のヘテロダイマーに対し、抗原結合活性を有し、S100A8モノマー及び／又はS100A9モノマーとは抗原結合活性を有さない、請求項１又は２に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  4. 抗原結合活性が中和親和性である、請求項１～３のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  5. 抗体又は抗体断片が、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片である、請求項１～４のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  6. モノクローナル抗体のサブクラスが、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4より選択されるいずれかである、請求項５に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  7. 抗体又は抗体断片が、重鎖可変領域１（CDR H1）、重鎖可変領域２（CDR H2）及び重鎖可変領域３（CDR H3）を含む重鎖可変領域と、軽鎖可変領域１（CDR L1）、軽鎖可変領域２（CDR L2）及び軽鎖可変領域３（CDR L3）を含む軽鎖可変領域を含み、
    重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６又は配列番号１９に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号７、１０、１３、１６又は１９それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７又は配列番号２０に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号８、１１、１４、１７又は２０それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８又は配列番号２１に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号９、１２、１５、１８又は２１それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１又は配列番号３４に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号２２、２５、２８、３１又は３４それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２又は配列番号３５に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号２３、２６、２９、３２又は３５それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３又は配列番号３６に示すアミノ酸配列、あるいは配列番号２４、２７、３０、３３又は３６それぞれにつき、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、抗体又は抗体断片を有効成分として含む、請求項１～６のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  8. 重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号７、あるいは配列番号７に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号８、あるいは配列番号８に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号９、あるいは配列番号９に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号２２、あるいは配列番号２２に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号２３、あるいは配列番号２３に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号２４、あるいは配列番号２４に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、請求項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  9. 重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号１０、あるいは配列番号１０に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号１１、あるいは配列番号１１に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号１２、あるいは配列番号１２に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号２５、あるいは配列番号２５に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号２６、あるいは配列番号２６に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号２７、あるいは配列番号２７に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、請求項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療。
  10. 重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号１３、あるいは配列番号１３に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号１４、あるいは配列番号１４に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号１５、あるいは配列番号１５に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号２８、あるいは配列番号２８に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号２９、あるいは配列番号２９に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号３０、あるいは配列番号３０に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、請求項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  11. 重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号１６、あるいは配列番号１６に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号１７、あるいは配列番号１７に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号１８、あるいは配列番号１８に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号３１、あるいは配列番号３１に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号３２、あるいは配列番号３２に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号３３、あるいは配列番号３３に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、請求項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  12. 重鎖可変領域１（CDR H1）が、配列番号１９、あるいは配列番号１９に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域２（CDR H2）が、配列番号２０、あるいは配列番号２０に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    重鎖可変領域３（CDR H3）が、配列番号２１、あるいは配列番号２１に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域１（CDR L1）が、配列番号３４、あるいは配列番号３４に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域２（CDR L2）が、配列番号３５、あるいは配列番号３５に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含み、
    軽鎖可変領域３（CDR L3）が、配列番号３６、あるいは配列番号３６に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換、又は挿入されてなるアミノ酸配列のいずれかを含む、請求項７に記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  13. S100A8及び／又はS100A9と、その受容体であるRAGEとの相互作用を遮断し、RAGEの下流にある転写因子であって、炎症性サイトカインの発現を誘導するNF-κBの発現及び肺線維芽細胞の増殖を抑制するとともに、活性化線維芽細胞の増殖を抑制し、更には、活性化線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を抑制することを特徴とする、請求項１～１２のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
  14. COVID-19の予防及び／又は治療剤としての、請求項１～１３のいずれかに記載の炎症性肺疾患の予防及び／又は治療剤。
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