CN114555119A - 炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂 - Google Patents

炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种能够有效地预防和/或治疗炎症性肺疾病的炎症性肺疾病剂，具体而言，涉及包含对S100A8/A9异型二聚体具有抗原结合活性的抗体或抗体片段作为有效成分的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂。通过阻断S100A8/A9与其受体群的相互作用，能够有效地预防和/或治疗炎症性肺疾病。详细而言，通过阻断S100A8/A9与作为其受体的RAGE的相互作用，抑制作为处于RAGE的下游的转录因子而诱导各种炎症性细胞因子的表达的NF‑κB的表达，并且抑制活化成纤维细胞的增殖，进一步地，通过抑制活化成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，能够有效地预防和/或治疗炎症性肺疾病。除此之外，本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂也能够适宜地用作COVID‑19的预防和/或治疗剂。

Description

炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂
技术领域
本发明涉及以对S100A8蛋白质(也简称为“S100A8”)和S100A9蛋白质(也简称为“S100A9”)的异型二聚体具有抗原结合活性的抗体或抗体片段作为有效成分的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂。
本申请要求通过参照而引用于此的日本专利申请特愿2019-197222号的优先权。
背景技术
S100蛋白质是细胞类型特异性表达且具有两个EF-hand的钙结合蛋白质，到目前为止确认了20种亚家族。S100A8(MRP8，calgranulin A，钙粒蛋白A)是钙结合蛋白S100家族中的一种，通常与S100A9(MRP14，calgranulin B，钙粒蛋白B)共表达。据认为作为S100A8与S100A9的异型二聚体的S100A8/A9(Calprotectin，钙卫蛋白)在炎症时积蓄于体液中而参与风湿性关节炎(RA)、囊肿性纤维化、克罗恩病、溃疡性大肠炎、过敏性皮炎、感染等人的慢性炎症性疾病的发病。
S100A8/A9例如从肺部分泌，具有引诱远处的癌细胞的功能，并且具有在肺部创造适于癌细胞的定植和增殖的免疫抑制环境的功能。作为S100A8/A9的受体群，已知有EMMPRIN(细胞外基质金属蛋白酶诱导因子)、NPTNα(Neuroplastin-α，神经丝束蛋白α)、NPTNβ、MCAM(M-cell adhesion molecule，M细胞黏附分子)、ALCAM(Activated leukocytecell adhesion molecule，活化白细胞黏附分子)等。报道了在S100A8/A9的受体中着眼于EMMPRIN的基于结合阻碍的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法(专利文献1)。在专利文献1中，公开了如下内容：EMMPRIN特别显示出是S100A9的受体，作为筛选的结果，艾蒿提取物、当归提取物、野芝麻提取物等阻碍EMMPRIN与S100A9的结合。报道了在S100A8/A9的受体中着眼于NPTN的基于结合阻碍的细胞增殖抑制的筛选方法(专利文献2)。在专利文献2中，公开了如下内容：作为筛选的结果，艾蒿提取物、甘草提取物、人参提取物等阻碍NPTN与S100A8的结合。关于作为S100阻碍药物的化合物，报道了对癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病以及神经变性疾病等的治疗是有用的(专利文献3)。另外，还报道了S100A9作为炎症性肠病的生物标志物的有用性(专利文献4)。
进一步地，作为S100A8/A9的受体，还已知有RAGE(Receptor for advancedglycation end product，晚期糖基化终产物)(非专利文献1)。在非专利文献1中，报道了在BV-2小胶质细胞的膜上S100A8/A9与TLR4以及RAGE结合，经由ERV以及JNK对BV-2小胶质细胞内的NF-κB进行刺激而使其活性增强(非专利文献1)。
患有肺部的炎症性疾病、即以特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonaryfibrosis：IPF)为首的特发性间质性肺炎(Idiopathic interstitial pneumonia：IIP)等疾病(以下，称为“炎症性肺疾病”。)的患者数不断增加。在特发性间质性肺炎中，特发性肺纤维化是全世界范围内可见的疾病，类固醇、免疫抑制剂不起效，急性恶化后的平均生存期为两个月以内，预后极其不良。作为特发性肺纤维化的治疗药物，已知有两种分子靶向治疗药物(吡非尼酮(Pirfenidone)以及尼达尼布(Nintedanib))(非专利文献2、3)，但实际情况是均为对症疗法，不能期待纤维化的抑制、改善，不能说是根本性的治疗。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-47932号公报
专利文献2：日本特开2014-59210号公报
专利文献3：国际公开第WO2015/177367号
专利文献4：日本特开2016-217956号公报
非专利文献
非专利文献1：Li Ma et al.,INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE(2017)40：31-38,DOI：10.3892/ijmm.2017.2987
非专利文献2：Margaritopoulos et al.,BMC Pulmonary Medicine(2018)18：177；doi.org/10.1186/s12890-018-0736-z
非专利文献3：Lutz Wollin1 et al.,European Respiratory Journal(2015)；DOI：10.1183/09031936.00174914
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的问题在于提供一种能够有效地预防和/或治疗炎症性肺疾病的药剂。更具体而言，其问题在于，提供包含针对作为炎症相关蛋白质已知的S100A8和/或S100A9而具有抗原结合活性的抗体或抗体片段作为有效成分的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂。
用于解决问题的手段
本发明的发明人为了解决上述问题，着眼于S100A8和/或S100A9及其受体群(EMMPRIN、NPTNβ、MCAM、ALCAM以及RAGE)，反复进行了深入研究的结果是发现通过阻断S100A8和/或S100A9与其受体群的相互作用，能够有效地预防和/或治疗炎症性肺疾病，从而完成了本发明。
即，本发明由以下内容构成。
1、一种炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其包含对S100A8和S100A9蛋白质的异型二聚体具有抗原结合活性的抗体或抗体片段作为有效成分。
2、根据前项1所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，抗体或抗体片段具有比针对S100A8单体的抗原结合活性更高的抗原结合活性。
3、根据前项1或2所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，抗体或抗体片段针对S100A8和S100A9的异型二聚体具有抗原结合活性，针对S100A8单体和/或S100A9单体不具有抗原结合活性。
4、根据前项1～3中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，抗原结合活性为中和亲和性。
5、根据前项1～4中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，抗体或抗体片段为单克隆抗体或单克隆抗体片段。
6、根据前项5所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，单克隆抗体的亚类为选自IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4中的任一种。
7、根据前项1～6中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，所述炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂包含以下抗体或抗体片段作为有效成分，
所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链可变区1(CDR H1)、重链可变区2(CDR H2)以及重链可变区3(CDR H3)，所述轻链可变区包含轻链可变区1(CDR L1)、轻链可变区2(CDR L2)以及轻链可变区3(CDR L3)，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号7、序列号10、序列号13、序列号16或序列号19所示的氨基酸序列、或者对序列号7、10、13、16或19分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号8、序列号11、序列号14、序列号17或序列号20所示的氨基酸序列、或者对序列号8、11、14、17或20分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号9、序列号12、序列号15、序列号18或序列号21所示的氨基酸序列、或者对序列号9、12、15、18或21分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号22、序列号25、序列号28、序列号31或序列号34所示的氨基酸序列、或者对序列号22、25、28、31或34分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号23、序列号26、序列号29、序列号32或序列号35所示的氨基酸序列、或者对序列号23、26、29、32或35分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号24、序列号27、序列号30、序列号33或序列号36所示的氨基酸序列、或者对序列号24、27、30、33或36分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
8、根据前项7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号7、或者在序列号7所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号8、或者在序列号8所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号9、或者在序列号9所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号22、或者在序列号22所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号23、或者在序列号23所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号24、或者在序列号24所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
9、根据前项7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号10、或者在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号11、或者在序列号11所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号12、或者在序列号12所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号25、或者在序列号25所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号26、或者在序列号26所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号27、或者在序列号27所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
10、根据前项7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号13、或者在序列号13所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号14、或者在序列号14所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号15、或者在序列号15所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号28、或者在序列号28所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号29、或者在序列号29所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号30、或者在序列号30所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
11、根据前项7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号16、或者在序列号16所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号17、或者在序列号17所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号18、或者在序列号18所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号31、或者在序列号31所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号32、或者在序列号32所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号33、或者在序列号33所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
12、根据前项7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号19、或者在序列号19所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号20、或者在序列号20所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号21、或者在序列号21所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号34、或者在序列号34所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号35、或者在序列号35所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号36、或者在序列号36所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
13、根据前项1～12中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂阻断S100A8和/或S100A9与作为其受体的RAGE的相互作用，抑制作为处于RAGE的下游的转录因子而诱导炎症性细胞因子的表达的NF-κB的表达以及肺成纤维细胞的增殖，并且抑制活化成纤维细胞的增殖，进一步地抑制活化成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。
14、根据前项1～13中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其中，所述炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂作为COVID-19的预防和/或治疗剂。
发明效果
根据本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，通过阻断S100A8和/或S100A9与作为其受体的一种的RAGE的相互作用，能够有效地预防和/或治疗炎症性肺疾病。在此，RAGE是S100A8/A9在肺部中的主要受体，在引起炎症性肺疾病的肺泡上皮细胞中高表达，成为与炎症性肺疾病相关的病态的起点。即，本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂阻断S100A8和/或S100A9与作为其受体的一种的RAGE的相互作用，抑制作为处于RAGE的下游的转录因子而诱导各种炎症性细胞因子的表达的NF-κB的表达，并且抑制活化成纤维细胞的增殖，进一步地抑制活化成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。基于上述作用机理，本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂能够有效地预防和/或治疗炎症性肺疾病。
附图说明
图1是表示作为本发明的抗S100A8/A9抗体制作用抗原的S100A8/A9异型二聚体的制备用表达载体的结构的图。(参考例1)
图2是表示对纯化后的S100A8/A9异型二聚体、S100A8单体以及S100A9单体进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)并进行CBB(考马斯亮蓝)染色而得到的结果的照片图。(参考例1)
图3是表示对纯化后的S100A8/A9异型二聚体、S100A8单体以及S100A9单体进行HPLC(高效液相色谱法)分析而得到的结果的图。(参考例1)
图4是表示纯化后的S100A8/A9异型二聚体、S100A8单体以及S100A9单体的热力学稳定性的图。(参考例1)
图5是表示对于从抗S100A8/A9抗体制作用杂交瘤中选择出的十个克隆，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)法，确认其对S100A8/A9异型二聚体、S100A8或S100A9的中和能力而得到的结果的图。(实施例1)
图6是表示使用被S100A8/A9强烈地诱导出炎症性细胞因子的人角质细胞，对于从抗S100A8/A9抗体制作用杂交瘤中选择出的十个克隆，确认TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-6(白细胞介素-6)以及IL-8(白细胞介素-8)的各表达抑制作用而得到的结果的图。(实施例2)
图7是表示使人IgG2-Fc部分与抗S100A8/A9单克隆抗体(克隆No.45)的Fab结构域融合而成的嵌合抗体的结构的图。(实施例4)
图8是表示由S100A8/A9引起的小鼠成纤维细胞的增殖亢进的图。(实施例5)
图9是表示由S100A8/A9引起的人成纤维细胞的增殖亢进的图。(实施例5)
图10是表示成纤维细胞中的依赖于S100A8/A9的NF-κB信号活化的评价结果的图。(实施例6)
图11是表示成纤维细胞中的基于抗S100A8/A9抗体(α-S100A8/A9 antibody)的NF-κB信号抑制的评价结果的图。(实施例6)
图12是表示人肺成纤维细胞中的基于S100A8/A9的α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)的表达诱导以及基于抗S100A8/A9抗体(α-S100A8/A9 antibody)的S100A8/A9诱导性α-SMA表达抑制能力的评价结果的图。(实施例7)
图13是表示小鼠成纤维细胞中的基于S100A8/A9的α-SMA以及胶原蛋白(collagen)的表达诱导以及基于抗S100A8/A9抗体(α-S100A8/A9 antibody)的S100A8/A9诱导性α-SMA以及胶原蛋白表达抑制能力的评价结果的图。(实施例7)
图14是表示使用博来霉素气管内给药肺纤维化模型的用于确认基于抗S100A8/A9抗体的肺损伤抑制效果的实验方案的图。(实施例8)
图15是表示博来霉素气管内给药肺纤维化模型中的基于抗S100A8/A9抗体给药的依赖于浓度的体重减少抑制效果的图。(实施例8)
图16是表示博来霉素气管内给药肺纤维化模型中的基于抗S100A8/A9抗体给药的肺部的CT扫描结果的照片图。(实施例8)
图17是表示将博来霉素气管内给药肺纤维化模型中的基于抗S100A8/A9抗体给药的肺部的高密度区域面积定量化而得到的图表的图。(实施例8)
图18是表示博来霉素气管内给药肺纤维化模型中的基于抗S100A8/A9抗体给药的小鼠存活率的图。(实施例8)
图19是表示基于抗S100A8/A9抗体的人肺细胞的TMPRSS2表达抑制效果的图。(实施例9)
具体实施方式
本发明涉及含有对S100A8/A9具有抗原结合活性的抗体或抗体片段作为有效成分的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂。将本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂中所含的“对S100A8/A9具有抗原结合活性的抗体”称为“抗S100A8/A9抗体”，有时也另外称为“本发明的抗体”。在本说明书中，“S100A8/A9”是指S100A8和S100A9的复合体，根据情况有时也称为“S100A8/A9异型二聚体”。
在本说明书中，本发明的抗体是以S100A8/A9异型二聚体为抗原而制作的抗体，对S100A8/A9异型二聚体具有抗原结合活性。上述抗S100A8/A9抗体优选对S100A8/A9异型二聚体具有比对S100A8单体的抗原结合活性更高的抗原结合活性。在上述抗S100A8/A9抗体中，更优选对S100A8和S100A9的异型二聚体具有抗原结合活性、进一步地对S100A8单体和/或S100A9单体不具有抗原结合活性。在上述中，抗原结合活性只要是一般解释的抗原结合活性即可，没有特别限定，例如可以举例示出为中和抗体亲和性。进一步地，作为上述抗S100A8/A9抗体，优选为对S100A8和S100A9的异型二聚体具有比对S100A8单体的中和抗体亲和性更高的中和抗体亲和性的抗体，进一步更优选为对S100A8和S100A9的异型二聚体具有中和抗体亲和性、对S100A8单体和/或S100A9单体不具有中和抗体亲和性的抗体。
在本说明书中，本发明的抗体以最广泛的含义使用，只要显示出上述所示的抗原结合活性，则还包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多重特异性抗体。本发明的抗体可以包含重链可变区(VH-CDR)和/或轻链可变区(VL-CDR)或其片段。本发明的抗体的类是指抗体的重链(H链)所具备的恒定结构域或恒定区的类型，例如可列举为IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM。本说明书中的抗体的类没有特别限定，但IgG是最优选的。作为IgG的亚类，例如可列举为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等，优选为IgG1或IgG2。
在本说明书中，对S100A8/A9异型二聚体具有抗原结合活性的抗体的“抗体片段”只要是具有抗体结构的部分、且保持上述本发明的抗体所具有的活性的抗体的片段即可。抗体片段的结构可列举为抗体的抗原结合部位的片段，例如可列举为重链可变区(VH-CDR)和/或轻链可变区(VL-CDR)、其片段。例如，可以举例示出为Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2或它们的组合。
本发明的抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。人抗体是指由人或人细胞产生的抗体、或具备与来源于使用人抗体库或其他的人抗体编码序列的非人供给源的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。
本发明的抗体中所含的VH-CDR和/或VL-CDR的氨基酸序列例如可以包含由以下的序列号确定的氨基酸序列。例如，在重链可变区1(CDR H1)中可以包含序列号7、序列号10、序列号13、序列号16或序列号19所示的氨基酸序列中的任一个。在重链可变区2(CDR H2)中可以包含序列号8、序列号11、序列号14、序列号17或序列号20所示的氨基酸序列中的任一个。在重链可变区3(CDR H3)中可以包含序列号9、序列号12、序列号15、序列号18或序列号21所示的氨基酸序列中的任一个。例如，在轻链可变区1(CDR L1)中可以包含序列号22、序列号25、序列号28、序列号31或序列号34所示的氨基酸序列中的任一个。在轻链可变区2(CDR L2)中可以包含序列号23、序列号26、序列号29、序列号32或序列号35所示的氨基酸序列中的任一个。在轻链可变区3(CDR L3)中可以包含序列号24、序列号27、序列号30、序列号33或序列号36所示的氨基酸序列中的任一个。本发明的上述各区域的氨基酸序列信息也包含在权利范围内。除了上述氨基酸序列以外，即使对各氨基酸序列分别取代、缺失、附加或插入有一个至多个氨基酸，只要显示出针对S100A8/A9异型二聚体的抗原结合活性，则包含这些氨基酸序列的抗S100A8/A9抗体或抗体片段也包含在本发明的权利范围内。
本发明的抗体、抗体片段可以使用上述S100A8/A9异型二聚体抗原按照常规方法来进行制作。
在本发明的抗体为单克隆抗体的情况下，可以利用上述S100A8/A9异型二聚体抗原使小鼠、大鼠等哺乳动物免疫，从该动物中采集淋巴细胞，按照常规方法，与骨髓瘤细胞融合来制作杂交瘤，从而得到产生抗S100A8/A9抗体的杂交瘤。哺乳动物的免疫可以按照常规方法来进行。例如，可以将上述S100A8/A9异型二聚体抗原和佐剂混合后的物质用作免疫原对动物进行免疫。作为佐剂，没有特别限定，例如可举例示出为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等。进行免疫时的免疫原的给药方法可以是原本公知的方法，例如可以是皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、肌肉内注射中的任一种，优选为皮下注射或腹腔内注射。免疫可以进行一次或以适当的间隔进行多次，优选以一周至五周的间隔进行多次。对于上述所制作的杂交瘤，通过ELISA法等确认其培养上清液与S100A8/A9异型二聚体的结合性，重复进行抗体产生杂交瘤的克隆操作，由此能够得到目标的单克隆抗体产生细胞。人源化抗体的制作方法可以应用原本公知的方法等。
可以按照常规方法从产生抗体的杂交瘤细胞中对总RNA(Total RNA)进行纯化，然后合成cDNA。使用各自的引物由得到的cDNA对完整长度的重链(H链)和轻链(L链)的抗体基因进行PCR(聚合酶链式反应)使其扩增，由此能够获得各自的基因片段。通过将得到的基因片段与表达用载体连接，能够对该抗体的基因进行克隆。关于这些抗体的H链以及L链的氨基酸序列，可以对编码它们的质粒载体的碱基序列进行确认，并基于此决定该抗体的氨基酸序列。以得到的氨基酸序列、碱基序列的信息为基础，可以通过基因重组的方法制作抗体，也可以通过合成方法制作抗体。在通过基因重组的方法制作抗体的情况下，例如可以通过国际公开WO2017/061354号中记载的方法来制作。
在通过基因重组的方法制作抗体的情况下，例如可以利用对确定CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2以及CDR L3的各氨基酸进行编码的基因信息。作为具体的氨基酸序列，例如在CDR H1中可列举为序列号7、序列号10、序列号13、序列号16或序列号19所示的氨基酸序列中的任一个。在CDR H2中，可列举为序列号8、序列号11、序列号14、序列号17或序列号20所示的氨基酸序列中的任一个。在CDR H3中，可列举为序列号9、序列号12、序列号15、序列号18或序列号21所示的氨基酸序列中的任一个。例如，在CDR L1中，可列举为序列号22、序列号25、序列号28、序列号31或序列号34所示的氨基酸序列中的任一个。在CDR L2中，可列举为序列号23、序列号26、序列号29、序列号32或序列号35所示的氨基酸序列中的任一个。在CDR L3中，可列举为序列号24、序列号27、序列号30、序列号33或序列号36所示的氨基酸序列中的任一个。本发明还包含对确定上述所确定的CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDRL1、CDR L2以及CDR L3的各氨基酸进行编码的碱基序列信息、其互补链的碱基序列信息。在本发明中，除了上述碱基序列信息以外，即使是被取代、缺失、附加或插入一个至多个核苷酸后的碱基序列，只要是能够制作本发明的抗S100A8/A9抗体的碱基序列，则这样的碱基序列信息也包含在本发明的权利范围内。
本发明的抗体的筛选方法以及抗体评价的确认方法在后述的参考例、实施例以及实验例等中具体进行说明，但例如也可以应用以下的方法。
从上述抗体产生杂交瘤中，将表达多种S100A8/A9中和抗体候选物的杂交瘤向无血清培养进行驯化，从而能够为了进行体外、体内实验而进行大量制备。可以对各个克隆的培养上清液进行回收，并进行抗体的纯化。抗体的纯化可以应用原本公知的方法、今后开发的所有方法。例如，可以进行亲和层析对抗体进行回收，具体而言，一般为使用Protein A/G的亲和纯化，可以使用适合于每个动物种类、抗体亚类的亲和柱。纯化后的抗体的纯度检验可以通过原本公知的方法来进行，例如可以通过CBB染色来进行。
为了对本发明的抗体或抗体片段进行评价，可以适当制备作为S100A8/A9的受体的S100A8/A9吸附性诱饵蛋白制剂(exEMMPRIN-Fc、exNPTNβ-Fc、exMCAM-Fc、exRAGE-Fc、exALCAM-Fc)。
在本说明书中，“炎症性肺疾病”是指能够通过本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂来预防和/或治疗的、特发性/慢性炎症性肺疾病、支气管哮喘、间质性肺炎等炎症性肺疾病的全体，例如可以举例示出为以特发性肺纤维化(IPF)为首的特发性间质性肺炎(IIP：包括特发性器质化肺炎、非特异性间质性肺炎(NSIP))、特发性非特异性间质性肺炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、过敏性肺炎、新型冠状病毒感染症(COVID-19)等。在上述炎症性肺疾病中，例如COPD和支气管哮喘近年来迅速增加，根据最新的统计数据，推测日本的全部人口的3～6％患有支气管哮喘，8.5％患有COPD，炎症性肺疾病对人的健康寿命造成的影响很大，对社会经济、医疗财政造成的损失不可估算。据认为在这样的炎症性肺疾病的病态中，活化成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化以及与其相伴的胶原蛋白、细胞外基质成分的过度表达、亢进、沉积会导致肺纤维化的恶化，本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂基于后述的作用机理，能够有效地预防和/或治疗上述炎症性肺疾病。
本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂可以局部给药，也可以全身给药。本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂中使用的抗体也可以任选地与医药上所容许的载体、赋形剂、稳定剂一起与具有医药上所容许的纯度的本发明的抗体以外的其他抗体并用。另外，为了保存而制成冷冻干燥制剂或水溶性的形态也是随意的。在将本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂设为非经口给药的形态的情况下，也可以包含医药上所容许的、灭菌后的水性或非水性的溶液、稀释剂、悬浊液以及乳浊液。作为非水性稀释剂的例子，可列举为丙二醇、聚乙二醇、植物油，例如橄榄油、以及有机酯组合物，例如油酸乙酯，它们适合用于注射。在水性载体中可以含有水、醇性水性溶液、乳浊液、悬浊液、食盐水以及缓冲介质。在非口服载体中，可以含有氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、林格氏乳酸以及结合油。在静脉内载体中，例如可以含有液体用补充物、营养物以及电解质(例如，基于林格氏葡萄糖的电解质)。本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂还可以含有保存剂以及其他添加剂，例如抗微生物化合物、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。以上所述的作为本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂中的有效成分的本发明的抗体以外的其他成分可以适当组合使用它们中的一种或两种以上。
本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂根据需要为一种或两种以上的生理活性化合物，优选具有彼此不产生不良影响的互补活性，除了原本公知的抗炎剂、今后开发的抗炎剂以外，还可以并用地使用例如能够减轻副作用的其他药剂等的一种或两种以上。
本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂包含治疗有效量的抗S100A8/A9抗体。治疗有效量是指在必要的用量以及期间内对于实现所期望的治疗结果而有效的量。治疗有效量考虑到个体的疾病状态、年龄、性别以及体重、在个体中引导所希望的反应的医药的效能等来设定即可。
本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，通常以每24、12、8、6、4或2小时或者任意的组合使用单剂量或分剂量，在治疗开始后，通常在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天以至少一次、或者在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周以至少一次、或者以它们的任意的组合，每天以约0.1～100mg/kg体重，例如以0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg体重的抗体量作为每天的用量来使用。
【实施例】
以下，将为了完成本发明而进行的实验的结果作为参考例示出，在实施例中对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定于此，在不脱离本发明的技术思想的范围内可以进行各种应用。
(参考例1)抗S100A8/A9抗体制作用S100A8/A9异型二聚体的制备
在本参考例中，对作为用于制作之后的实施例所示的抗S100A8/A9抗体的抗原的S100A8/A9异型二聚体的制备进行说明。使用将全长S100A8以及全长S100A9组入于pET21而得到的表达载体(参照图1)通过大肠杆菌来制作S100A8/A9异型二聚体，并进行纯化(参照Futami J.et al.,Biochem Biophys Rep.,19；6：94-100，(2016))。作为比较例，将全长S100A8或全长S100A9组入于pET21，按照与上述相同的方法通过大肠杆菌进行制作，并进行纯化(参照Futami J.et al.(2016))。
对纯化后的S100A8/A9异型二聚体以及作为比较例的S100A8单体、S100A9单体进行SDS-PAGE，并进行CBB染色，将结果示于图2。对于S100A8/A9异型二聚体，确认了S100A8和S100A9大致等量，且纯化为高纯度。进一步地，对S100A8/A9异型二聚体进行HPLC分析。其结果是，对S100A8、S100A9以及S100A8/A9的结构进行比较的结果是，仅S100A8/A9未确认到单体的存在且大部分为二聚体结构(参照图3)。另一方面，作为比较例制作的S100A8以及S100A9为单体和二聚体的混合物(参照图3)。
在图4中，示出了如下内容：天然产生的S100A8/A9异型二聚体(简称为“A8-A9异型二聚体”)在热力学上是稳定的，但是S100A8(简称为“A8”)和S100A9(简称为“A9”)分别形成同型二聚体，因此即使将S100A8和S100A9混合也难以制作稳定的S100A8/A9的异型二聚体。通过本参考例的方法制备的S100A8/A9异型二聚体的稳定性较高，能够用作在之后的实施例中制作的S100A8/A9异型二聚体抗原。
(实施例1)抗S100A8/A9单克隆抗体的制作
在本实施例中，对在以下的实施例以及实验例中使用的抗S100A8/A9单克隆抗体的制作进行说明。本实施例的抗S100A8/A9单克隆抗体，以在上述(参考例1)中制备的S100A8/A9异型二聚体为抗原来进行制作。
(1)杂交瘤的制作
本实施例的抗S100A8/A9单克隆抗体，以在上述(参考例1)中制备的S100A8/A9异型二聚体为抗原，利用单克隆抗体定制服务、Genostaff(日本Genetics)来进行制作。免疫动物使用小鼠(Balb/c)，在抗原的免疫中使用Titer-MAX作为佐剂。按照现有方法，使用聚乙二醇(PEG1500)使免疫动物的脾脏和小鼠骨髓瘤细胞(P3U1)融合，制作杂交瘤，得到160个克隆。
(2)杂交瘤的克隆以及抗体的制作
从上述得到的160个克隆的杂交瘤中，使S100A8/A9异型二聚体、S100A8或S100A9固相化，进行ELISA筛选，选择出图5所示的十个克隆。将选择出的表达S100A8/A9中和抗体(图5所示的“α-S100A8/A9抗体”)候选物的杂交瘤向无血清培养进行驯化，从而能够为了进行体外以及体内实验而进行大量制备。对各个克隆的培养上清液进行回收，通过Protein G柱进行纯化，针对全部的克隆制备几毫克的蛋白质。在进行基于CBB染色的纯度检测时，完全没有检测出目标蛋白质以外的条带，确认以高纯度制备了纯化抗体。
(3)单克隆抗体的反应性
对于在上述(2)中选择出的十个克隆，确认针对S100A8/A9异型二聚体、S100A8或S100A9的反应性以及亚类，并示于表1。
【表1】
Figure BDA0003593302000000151
(实施例2)中和抗体的筛选
在本实施例中，对于由在实施例1中制作并选择出的160个克隆的杂交瘤产生的单克隆抗体，确认其对S100A8/A9诱导性炎症性细胞因子的产生量带来的影响。使用通过S100A8/A9强烈地诱导出炎症性细胞因子的人角质形成细胞，以炎症性细胞因子的mRNA表达量为指标，对各抗体的S100A8/A9信号的抑制效果进行评价。具体而言，将30ng/mL的纯化S100A8/A9和从1mL的160个克隆的杂交瘤培养上清液中通过Protein G柱进行纯化而得到的各抗S100A8/A9单克隆抗体添加到角质形成细胞(Normal Human Keratinocytes：NHK)中，对以37℃培养3小时后的细胞进行回收，对TNF-α、IL-6、IL-8的各mRNA表达量进行实时定量PCR(qPCR)分析。
使用LightCycler rapid thermal cycler system(ABI 7900HT；AppliedBiosystems公司)进行实时定量PCR(qPCR)分析。使用由以下碱基序列构成的正向(Fwd)以及反向(Rev)引物进行测定。
TNFα测定用Fwd：GACAAGCCTGTAGCCCATGT(序列号1)
Rev：TCTCAGCTCCACGCCATT(序列号2)
IL-6测定用Fwd：CTTCCCTGCCCCAGTACC(序列号3)
Rev：CTGAAGAGGTGAGTGGCTGTC(序列号4)
IL-8测定用Fwd：AGACAGCAGAGCACACAAGC(序列号5)
Rev：AGGAAGGCTGCCAAGAGAG(序列号6)
作为上述的结果，将存在所选择出的十个克隆(克隆No.：26、42、45、85、108、213、219、235、258以及260)的情况下的S100A8/A9(简称为“A8/A9”)诱导性炎症性细胞因子(TNF-α、IL-6以及IL-8)的测定结果示于图6。从该结果中选择出抑制力特别高的五种抗体(与S100A8(简称为“A8”)反应的一种抗体、与S100A9(简称为“A9”)反应的两种抗体、仅与S100A8/A9复合体(简称为“A8/A9”)反应的两种抗体)。另外，图6中的“α-S100A8/A9抗体”表示抗S100A8/A9单克隆抗体。
(实施例3)分选出的抗体的可变区的氨基酸序列
对于通过上述筛选而分选出的五种抗S100A8/A9单克隆抗体(克隆No.：45、85、235、258以及260)，对重链以及轻链的可变区的序列进行分析。
VH-CDR
克隆No.45：CDR H1：SYWMQ(序列号7)
克隆No.45：CDR H2：AIYPGDGDTRDTQKFKG(序列号8)
克隆No.45：CDR H3：MAGYNYDNDY(序列号9)
克隆No.85：CDR H1：SGYNWH(序列号10)
克隆No.85：CDR H2：YIQYSGSTNYNPSLKS(序列号11)
克隆No.85：CDR H3：ALRYDYSWFAY(序列号12)
克隆No.235：CDR H1：NFWMN(序列号13)
克隆No.235：CDR H2：QIYPGKSDTNYNGKFKG(序列号14)
克隆No.235：CDR H3：WGAYYKYGGSYFDY(序列号15)
克隆No.258：CDR H1：TASMGVS(序列号16)
克隆No.258：CDR H2：HIYWDDDKRYNPSLKS(序列号17)
克隆No.258：CDR H3：RPLGYFDV(序列号18)
克隆No.260：CDR H1：NYGVH(序列号19)
克隆No.260：CDR H2：VVWAGGSTNYNSALMS(序列号20)
克隆No.260：CDR H3：ARDYYGYDGYFGA(序列号21)
VL-CDR
克隆No.45：CDR L1：KASQDINKYIA(序列号22)
克隆No.45：CDR L2：YTSTLQP(序列号23)
克隆No.45：CDR L3：LQYDNLRT(序列号24)
克隆No.85：CDR L1：KASQDVSTAVA(序列号25)
克隆No.85：CDR L2：SASYRYT(序列号26)
克隆No.85：CDR L3：QQHYSTPLT(序列号27)
克隆No.235：CDR L1：SASQGISNYLN(序列号28)
克隆No.235：CDR L2：YTSSLHS(序列号29)
克隆No.235：CDR L3：QQYSKFPYT(序列号30)
克隆No.258：CDR L1：KASQDINNYIS(序列号31)
克隆No.258：CDR L2：YTSTLQP(序列号32)
克隆No.258：CDR L3：LQYDNLLWT(序列号33)
克隆No.260：CDR L1：KASQDINSYLT(序列号34)
克隆No.260：CDR L2：RANRLVD(序列号35)
克隆No.260：CDR L3：LQYDEFPLT(序列号36)
(实施例4)抗S100A8/A9嵌合抗体的制作
在本实施例中，制作使人IgG2-Fc部分与抗S100A8/A9单克隆抗体(克隆No.45)的Fab结构域融合而成的嵌合抗体。进行抗S100A8/A9单克隆抗体(克隆No.45)的重链以及轻链的可变区的序列分析、CDR分析，制作组入有与人IgG2的可变区重组后的序列的CHO细胞用稳定表达载体，将人IgG2-Fc部分的基因组合并转导至CHO细胞，稳定地制作抗S100A8/A9嵌合抗体(参照图7)。抗体通过国际公开第WO2017/061354号中记载的方法来制作。
(实施例5)由S100A8/A9引起的成纤维细胞的增殖亢进
作为肺纤维化的原因之一，可列举为成纤维细胞的异常增殖。因此，对依赖于S100A8/A9的成纤维细胞的增殖进行了研究。通过EdU(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)染色法确认来源于B6小鼠(野生型：WT)以及将作为S100A8/A9在肺部的主要受体的RAGE敲除后的B6小鼠(RAGE-/-)的胚胎成纤维细胞(Mouse Embryo Fibroblasts：MEF)的因添加S100A8/A9而引起的增殖亢进(参照图8)。同样地通过EdU染色法确认来源于人胚胎正常肺组织的成纤维细胞(Human Lung Fibroblasts)MRC-5细胞的因添加S100A8/A9而引起的增殖亢进(参照图9)。具体而言，通过以下的方法进行确认。首先，将在含有10％胎牛血清(FBS)的GIBCO(R)DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)培养基中培养的成纤维细胞分别以2×105cells/well接种到6孔板中。在培养24小时后更换为无血清培养基。进一步培养24小时后，更换为含有0.5％FBS的培养基，添加各浓度的S100A8/A9。进一步培养5小时后添加EdU，1小时后通过显微镜对利用EdU染色后的细胞进行确认。如图8以及图9所示，通过添加S100A8/A9，在S100A8/A9浓度达到100ng/mL为止确认到增殖亢进，在达到1000ng/mL时，增殖速度减弱。
由上述结果确认，S100A8/A9对成纤维细胞显示出类似生长因子的作用。另一方面，在来源于RAGE敲除B6小鼠(RAGE-/-)的细胞中，未确认到增殖亢进。由此可知，S100A8/A9经由作为成纤维细胞上的受体的RAGE来促进细胞增殖。
(实施例6)成纤维细胞中的依赖于S100A8/A9的NF-κB信号活化以及基于抗S100A8/A9抗体的NF-κB信号抑制的评价
存在于作为S100A8/A9受体的RAGE的下游的转录因子NF-κB通过其活化而诱导各种炎症性细胞因子的表达。为了对成纤维细胞中的依赖于S100A8/A9的NF-κB信号的活化进行评价，使用凝胶迁移试验(electrophoretic mobility shift assay：EMSA)进行NF-κB与生物素标记NF-κB结合DNA探针的相互作用的检测。接着，同样地通过凝胶迁移试验确认抗S100A8/A9抗体对由S100A8/A9诱导的NF-κB的作用。
具体而言，通过以下的方法进行确认。在10cm培养皿中接种5×105个在含有10％FBS的GIBCO(R)DMEM/F-12培养基中培养的B6小鼠(WT)的成纤维细胞，24小时后更换为无血清培养基。进一步培养6小时后，更换为含有0.5％FBS的培养基，添加对照缓冲液(PBS)或100ng/mL的S100A8/A9，在0、1、6、24、48小时后用PBS洗涤细胞后回收。利用ThermoScientific公司的100μL的M-PER(Mammalian Protein Extraction Reagent，哺乳动物蛋白抽提试剂)使细胞悬浊，制备细胞裂解产物(cell lysate)。将生物素标记NF-κB结合DNA探针(NF-κBconsensus binding motif5'-agttgaGGGGACTTTCCcaggc-3'(序列号37))与细胞裂解产物混合，在冰上反应30分钟后，进行天然凝胶电泳(Native-PAGE)，将凝胶转印到硝酸纤维素膜上，通过UV照射进行交联后，进行封闭，与HRP标记亲和素(Avidin-HRP)反应，进行化学发光检测。其结果是，确认了NF-κB的活性依赖于S100A8/A9而被诱导，在添加6小时后其活性达到最大(参照图10)。
接着，使用来源于B6小鼠(WT)以及RAGE敲除B6小鼠(RAGE-/-)的胚胎成纤维细胞(MEF)和来源于人胚胎正常肺组织的成纤维细胞(MRC-5)，进行凝胶迁移测定，确认抗S100A8/A9抗体对由S100A8/A9诱导的NF-κB的作用。在各10cm培养皿中分别接种5×105个在含有10％FBS的GIBCO(R)DMEM/F-12培养基中培养的来源于小鼠的成纤维细胞、1.5×105个MRC-5细胞，24小时后更换为无血清培养基。培养6小时后，更换为含有0.5％FBS的培养基，按照图11所示的组合添加对照缓冲液、100ng/mL的S100A8/A9、1μg/mL的IgG(对照)、或1μg/m L的抗S100A8/A9抗体(α-S100A8/A9抗体)，进一步培养6小时后，回收细胞裂解产物。接着，通过与上述同样的方法进行实验。其结果是，在B6小鼠(WT)胚胎成纤维细胞(MEF)以及来源于人胚胎正常肺组织的成纤维细胞MRC-5细胞中，在不含有抗S100A8/A9抗体的体系中确认到NF-κB的活性，但在含有抗S100A8/A9抗体的体系中确认到NF-κB的活性抑制(参照图11)。确认了在来源于RAGE敲除B6小鼠(RAGE-/-)的胚胎成纤维细胞(MEF)中，通过100A8/A9复合体的刺激，NF-κB信号稍微活化。顺便一提，NF-κB信号的稍微活化被认为是由RAGE以外的受体(作为S100A8/A9受体而由本发明的发明人鉴定的EMMPRIN、NPTNβ、MCAM、ALCAM)引起的。NF-κB信号的活化在抗S100A8/A9抗体中被完全抑制。
此外，关于抗S100A8/A9抗体，在图11中明确记载为α-S100A8/A9抗体。α-S100A8/A9抗体是指抗S100A8/A9单克隆抗体(克隆No.45)，IgG(对照)是指小鼠IgG同型对照(Isotype control)。对于以下的实施例所示的各图的α-S100A8/A9抗体以及IgG(对照)而言也是同样的。
(实施例7)成纤维细胞中的基于S100A8/A9的α-SMA以及胶原蛋白(collagen)的表达诱导以及基于抗S100A8/A9抗体的S100A8/A9诱导性α-SMA以及胶原蛋白表达抑制能力的评价
在肺纤维化的病态中，伴随着活化成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，诱导胶原蛋白、细胞外基质成分的过度沉积，从而使肺纤维化恶化。作为特发性肺纤维化(IPF)的治疗药而被认可的尼达尼布阻碍成纤维细胞的增殖以及向肌成纤维细胞的分化。因此，通过作为肌成纤维细胞的标记物的α-SMA(α-smooth muscle actin)的表达来确认S100A8/A9是诱导从成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化的风险因子，确认抗S100A8/A9抗体对α-SMA表达的作用。
具体而言，通过以下的方法进行确认。在各10cm培养皿中分别接种5×104个在含有10％FBS的GIBCO(R)DMEM/F-12培养基中培养的来源于人胚胎正常肺组织的成纤维细胞(MRC-5)、以及3×105个来源于B6小鼠(WT)和RAGE敲除B6小鼠(RAGE-/-)的胚胎成纤维细胞，24小时后更换为无血清培养基。进一步培养6小时后，更换为含有0.5％FBS的培养基，按照图12、图13所示的组合添加对照缓冲液、100ng/mL的S100A8/A9、1μg/mL的IgG(对照)或1μg/mL的抗S100A8/A9抗体，在48小时后回收细胞裂解产物。
对上述回收的细胞裂解产物进行蛋白免疫印迹(Western Blotting)，对蛋白质进行检测。对于来源于人胚胎正常肺组织的成纤维细胞(MRC-5)，使用抗α-SMA单克隆抗体以及作为对照的抗微管蛋白(Tubulin)抗体对蛋白质进行检测。在MRC-5细胞中，S100A8/A9强烈地诱导α-SMA的表达，其表达上升通过与抗S100A8/A9抗体的共培养而被显著抑制(参照图12)。对于来源于B6小鼠(WT)以及RAGE敲除B6小鼠(RAGE-/-)的胚胎成纤维细胞，使用抗α-SMA单克隆抗体、与通过胶原蛋白酶、结缔组织的机械损伤等而变性后的胶原蛋白链特异性结合的生物素标记探针以及作为对照的抗微管蛋白抗体，对蛋白质进行检测。
在来源于B6小鼠(WT)的胚胎成纤维细胞中，S100A8/A9强烈地诱导了α-SMA的表达以及胶原蛋白的表达。由S100A8/A9诱导的α-SMA以及胶原蛋白的表达上升通过与抗S100A8/A9抗体的共培养而被显著抑制(参照图13)。另一方面，对于来源于RAGE敲除B6小鼠(RAGE-/-)的胚胎成纤维细胞，未确认到由S100A8/A9引起的α-SMA以及胶原蛋白的表达量的上升。由此启示了S100A8/A9经由作为成纤维细胞上的受体的RAGE而诱导α-SMA以及胶原蛋白的表达。
如上所述，确认了S100A8/A9是诱导从成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的风险因子。而且，确认了抗S100A8/A9抗体对作为肌成纤维细胞的标记物的α-SMA、胶原蛋白的表达的抑制作用(参照图12、图13)。由这些结果启示了抗S100A8/A9抗体对肺纤维化的预防效果。
(实施例8)博来霉素(Bleomycin)的气管内给药肺纤维化模型中的抗S100A8/A9抗体的肺损伤抑制效果
确认了博来霉素诱发肺纤维化模型中的抗S100A8/A9抗体的肺损伤抑制效果。按照图14所示的方案，向各组为七只的C57BL/6J雌性(8周龄)小鼠的气管内给药50μl的含有小鼠每单位体重为1.0mg/kg博来霉素的PBS，制作肺损伤模型小鼠。在给药博来霉素后的1～2小时后，尾静脉内给药PBS缓冲液(对照组：0μg)、或者200μg和500μg的抗S100A8/A9抗体。
在观察给药博来霉素后经过七天、十四天以及二十一天时的肺损伤模型小鼠的体重变化时，在第七天以及第十四天，相对于对照组，在抗S100A8/A9抗体的500μg给药组中，确认到显著的小鼠的体重减少抑制效果。在第二十一天，针对抗S100A8/A9抗体的200μg给药组以及500μg给药组中的任一者，相对于对照组均确认到显著的小鼠的体重减少抑制效果(图15)。
进一步在给药博来霉素后第二十一天，通过CT扫描确认抗S100A8/A9抗体的肺损伤抑制效果。图16表示代表性的CT扫描图像。另外，图17表示通过成像对CT扫描图像的高密度区域(在CT扫描图像的肺组织中被确认为白色的区域)进行定量化而得到的图表。在抗S100A8/A9抗体的500μg给药组中，对于给药博来霉素后第二十一天的肺组织的损伤、纤维化观察到显著的抑制效果。进一步地，将本实验中的小鼠的生存率示于图18。在抗S100A8/A9抗体的500μg给药组中，未确认到死亡的小鼠，但在抗体未给药组中，在七只中确认到五只小鼠的死亡。此外，图18的下段所示的“处于风险数(Number at risk)”的数字表示生存小鼠的只数。
根据上述内容，抗S100A8/A9抗体在使用了气管内给药肺纤维化模型的体内系统中也对肺纤维化显示出优异的治疗效果。
(实施例9)基于抗S100A8/A9抗体的人肺细胞的TMPRSS2表达抑制效果
如实施例8所示，得到了抗S100A8/A9抗体对肺纤维化显示出优异的治疗效果的见解。接着，本发明的发明人在对于抗S100A8/A9抗体的进一步的药理学作用进行研究的过程中，着眼于作为在呼吸器官上皮中表达的宿主的蛋白分解酶之一的TMPRSS2是在SARS-CoV-2的感染中重要的蛋白质之一，对于抗S100A8/A9抗体对TMPRSS2表达产生的影响进行了调查。即，使用人肺细胞，调查了依赖于S100A8/A9蛋白质的TMPRSS2表达变化，以及使用抗S100A8/A9单克隆抗体(克隆No.45)作为抗S100A8/A9抗体，调查了抗S100A8/A9抗体对TMPRSS2表达产生的影响。
即，将人肺癌手术时切除的肺部组织的正常部分切割成直径约为3mm左右，在不含有血清的培养基中，利用胶原蛋白酶在4℃下处理24小时，使来源于肺部组织的细胞分散。将这样得到的细胞在不含有血清的培养基中悬浊后，添加1μg/mL的纯化S100A8/A9以及10μg/mL的抗S100A8/A9抗体(克隆No.45)或者10μg/m L的对照IgG，回收以37℃培养6小时后的细胞，提取RNA，对TMPRESS2进行实时定量PCR(qPCR)分析(图19)。上述实时定量PCR(qPCR)分析使用StepOnePlus Realtime PC(Applied Biosystems公司)，并且使用由以下碱基序列构成的正向(Fwd)以及反向(Rev)引物来进行测定。
TMPRSS2测定用引物序列
Fwd：GATGACAGCGGATCCACCAG(序列号38)
Rev：CCGCAGGCTATACAGCGTAA(序列号39)
其结果判明，TMPRSS2使与存在于细胞的表面的ACE2受体结合的SARS-CoV-2活化，使其向细胞的侵入概率增强(病毒外膜的Spike蛋白质的裂解活化)。接着，本发明的发明人关注于人肺细胞中的TMPRSS2的表达，在对其mRNA表达进行分析时，判明了S100A8/A9显著地诱导了人肺细胞的TMPRSS2的表达，抗S100A8/A9抗体显著抑制该诱导表达。
基于上述见解，启示了抗S100A8/A9抗体在COVID-19的治疗中，除了对由SARS-CoV-2病毒诱导的细胞因子风暴的抑制效果以外，对基于TMPRSS2表达抑制的SARS-CoV-2感染防御也是有用的。
工业实用性
如上所述，本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂通过阻断伴随着炎症性肺疾病而表达上升的S100A8/A9与作为其受体且成为病态的起点的在肺泡上皮细胞中高表达的RAGE以及在肺成纤维细胞中表达的多个S100A8/A9受体的相互作用，从而抑制肺泡上皮细胞的炎症性细胞因子的释放以及肺成纤维细胞的增殖，进一步地，通过抑制活化成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，能够有效地预防和/或治疗炎症性肺疾病。除此之外，本发明的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂也能够适宜地用于COVID-19的预防剂和/或治疗剂。起到这样显著的作用效果的本发明在工业上的有用性不可估量。
SEQUENCE LISTING
<110> 国立大学法人 冈山大学
<120> 炎症性疾病的预防剂和/或治疗剂
<130> GP20-1005PCT
<150> JP P2019-197222
<151> 2019-10-30
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<170> PatentIn version 3.5
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ctgaagaggt gagtggctgt c 21
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Gly
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Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr
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<212> DNA
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<223> NF-kB 共有结合基序
<400> 37
agttgagggg actttcccag gc 22
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<223> 用于TMPRSS2的正向引物
<400> 38
gatgacagcg gatccaccag 20
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<211> 20
<212> DNA
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<223> 用于TMPRSS2的反向引物
<400> 39
ccgcaggcta tacagcgtaa 20

Claims (14)

1.一种炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂包含对S100A8和S100A9蛋白质的异型二聚体具有抗原结合活性的抗体或抗体片段作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，抗体或抗体片段具有比针对S100A8单体的抗原结合活性更高的抗原结合活性。
3.根据权利要求1或2所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，抗体或抗体片段针对S100A8和S100A9的异型二聚体具有抗原结合活性，针对S100A8单体和/或S100A9单体不具有抗原结合活性。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，抗原结合活性为中和亲和性。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，抗体或抗体片段为单克隆抗体或单克隆抗体片段。
6.根据权利要求5所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，单克隆抗体的亚类为选自IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4中的任一种。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂包含以下抗体或抗体片段作为有效成分，
所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链可变区1(CDR H1)、重链可变区2(CDR H2)以及重链可变区3(CDR H3)，所述轻链可变区包含轻链可变区1(CDR L1)、轻链可变区2(CDR L2)以及轻链可变区3(CDR L3)，
重链可变区1(CDRH1)包含序列号7、序列号10、序列号13、序列号16或序列号19所示的氨基酸序列、或者对序列号7、10、13、16或19分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDRH2)包含序列号8、序列号11、序列号14、序列号17或序列号20所示的氨基酸序列、或者对序列号8、11、14、17或20分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDRH3)包含序列号9、序列号12、序列号15、序列号18或序列号21所示的氨基酸序列、或者对序列号9、12、15、18或21分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号22、序列号25、序列号28、序列号31或序列号34所示的氨基酸序列、或者对序列号22、25、28、31或34分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号23、序列号26、序列号29、序列号32或序列号35所示的氨基酸序列、或者对序列号23、26、29、32或35分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号24、序列号27、序列号30、序列号33或序列号36所示的氨基酸序列、或者对序列号24、27、30、33或36分别缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
8.根据权利要求7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号7、或者在序列号7所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号8、或者在序列号8所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号9、或者在序列号9所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号22、或者在序列号22所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号23、或者在序列号23所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号24、或者在序列号24所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
9.根据权利要求7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号10、或者在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号11、或者在序列号11所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号12、或者在序列号12所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号25、或者在序列号25所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号26、或者在序列号26所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号27、或者在序列号27所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
10.根据权利要求7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号13、或者在序列号13所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号14、或者在序列号14所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号15、或者在序列号15所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号28、或者在序列号28所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号29、或者在序列号29所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号30、或者在序列号30所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
11.根据权利要求7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号16、或者在序列号16所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号17、或者在序列号17所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号18、或者在序列号18所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号31、或者在序列号31所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区2(CDR L2)包含序列号32、或者在序列号32所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区3(CDR L3)包含序列号33、或者在序列号33所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
12.根据权利要求7所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，
重链可变区1(CDR H1)包含序列号19、或者在序列号19所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区2(CDR H2)包含序列号20、或者在序列号20所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
重链可变区3(CDR H3)包含序列号21、或者在序列号21所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
轻链可变区1(CDR L1)包含序列号34、或者在序列号34所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个，
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轻链可变区3(CDR L3)包含序列号36、或者在序列号36所示的氨基酸序列中缺失、附加、取代或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任一个。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂阻断S100A8和/或S100A9与作为其受体的RAGE的相互作用，抑制作为处于RAGE的下游的转录因子而诱导炎症性细胞因子的表达的NF-κB的表达以及肺成纤维细胞的增殖，并且抑制活化成纤维细胞的增殖，进一步地抑制活化成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述炎症性肺疾病的预防和/或治疗剂作为COVID-19的预防和/或治疗剂。
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